Parâmetros térmicos D e z-value para Cadophora fastigiata e discussão de um caso prático

Universidade do Minho Escola de Engenharia Bruno Emanuel Castro Pereira de Macedo outubro de 2019 Parâmetros térmicos D e z-value para Cadophora fastigiata e discussão de um caso prático Bruno Emanuel Castro Pereira de Macedo outubro de 2019 Parâmetros térmicos D e z-value para Cadophora fastigiata e discussão de um caso prático Trabalho efetuado sob a orientação do Professor Doutor Armando Albino Dias Venâncio e do Professor Doutor Nelson Manuel Viana da Silva Lima Dissertação de Mestrado Mestrado em Biotecnologia Universidade do Minho Escola de Engenharia ii DIREITOS DE AUTOR E CONDIÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO TRABALHO POR TERCEIROS Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Atribuição-NãoComercial-CompartilhaIgual CC BY-NC-SA https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ iii Agradecimentos Enquanto pretendo manter os meus agradecimentos sumários seria impossível evitar a menção de certas pessoas sem as quais não poderia aqui estar. Primeiramente gostaria de agradecer aos meus colegas que me auxiliaram durante a minha estadia no laboratório AMG, fizeram-me sentir em casa e potenciaram o meu crescimento. Na mesma linha de pensamento, gostaria de agradecer a ambos o Professor Doutor Armando Venâncio e ao Professor Doutor Nelson Lima, pela sua disponibilidade e por cultivarem novas aptidões em mim. Noutra faceta mais pessoal, gostaria de agradecer à minha família, particularmente à minha progenitora, pelo suporte que me prestou ao longo dos anos. Tenho ainda a destacar a incrível pessoa que o meu avô, Alberto Lopes Pereira, é. Mesmo durante a sua luta corrente contra o cancro mostrouse como um magnânimo pilar de força e auxílio. A todos gostaria de expressar a minha mais sincera gratidão, muito obrigado pelo vosso interesse e dedicação. iv DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. v Parâmetros térmicos D e z-value para Cadophora fastigiata e discussão de um caso prático Resumo No tempo corrente há um incremental desejo por parte da população global de obter o mais variadíssimo tipo de alimentos, sem que estes acarretem qualquer risco. Esta tarefa vê-se dificultada, uma vez que, ainda que haja uma exigência por alimentos seguros, há também uma pressão contra vários tipos de tratamentos e métodos de conservação. Um dos métodos de conservação usados com enorme frequência hoje em dia é o tratamento térmico, que tem vindo a ser usado desde que Louis Pasteur o criou a meio do século XIX. Enquanto este tipo de tratamento é eficaz, é necessário otimizá-lo para os organismos e matriz alimentar em causa, permitindo a destruição microbiana sem comprometer as propriedades organoléticas dos alimentos. Uma fonte externa descobriu, após tratamento térmico, uma contaminação por parte do fungo Cadophora fastigiata nos seus produtos. Devido à falta de informação sobre este fungo filamentoso, tomase em causa este caso prático como ímpeto para levar a cabo um estudo térmico sobre este fungo, determinando os seus valores de D e z e apontando se estes parâmetros se mostram de tal forma insólitos que justifiquem a contaminação. No final do estudo, obtiveram-se os valores de 0,69 minutos para a inativação de 90% dos esporos a 70 ºC para uma amostra de água destilada a pH 6,5. Assim como, valores de D de 9,19 e 9,60 minutos, a 55 ºC, respetivamente para amostras a pH 4 de solução de sacarose a 20% e de água acidificada. Adicionalmente os valores de z obtidos para todas as amostras variaram entre 7,8 ºC e 10,6 ºC, tornando desta forma improvável uma contaminação fúngica por parte deste fungo após o devido tratamento térmico. Palavras-chave: Cadophora fastigiata ; fator de resistência térmica (z); micologia alimentar; processamento térmico; tempo de redução decimal (D) vi Thermal parameters of D and z-value for Cadophora fastigiata and a practical case discussion Abstract In current times there is a growing desire by the global population to obtain the most varied sorts of foods, without any associated risks. This task sees itself hardened by the fact that, although there is a demand for safe products, there is also a pressure of sorts against a lot of the treatments and methods used for food preservation. One of the preservation methods used with vast frequency nowadays is the thermal processing, this method has been used since Louis Pasteur created it in the middle of the 19th century. While this type of treatment is very effective, it is necessary to optimize it depending on the organisms and food matrix at hand, in order to allow for microbial destruction without jeopardizing the products’ organoleptic proprieties. An external source has discovered, after thermal processing of their products a contamination by Cadophora fastigiata . Due to the lack of information regarding this filamentous fungus, this practical case is used as a throttle to start off a series of thermal studies on this fungus, in order to determine its D and z values and highlighting whether these parameters are so outlandish that they are able to justify the contaminations found. By the end of this study, we obtained the value of 0.69 minutes for the inactivation of 90% of the spores at 70 ºC, for a distilled water sample at pH 6.5. Aside from these, we also found D values of 9.19 and 9.60 minutes, at 55 ºC, respectively for the samples of 20% sucrose and acidified water both at a pH of 4. Additionally, the z values obtained for all samples varied between 7.8 ºC and 10,6 ºC, making it unlikely for a fungal contamination by this species to take place with the proper thermal treatments. Keywords: Cadophora fastigiata ; Decimal reduction time (D); Food mycology; Thermal processing; Thermal resistance factor (z) vii Índice 1.Introdução ................................................................................................................................... 1 1.1 Introdução teórica ..................................................................................................................... 2 1.2 Objetivos .................................................................................................................................. 3 2. Revisão bibliográfica ....................................................................................................................... 4 2.1 Fungos ..................................................................................................................................... 5 2.1.1 O que são fungos? ............................................................................................................. 5 2.1.2 Taxonomia básica dos fungos ............................................................................................ 5 2.1.2.1 Fungos filamentosos ....................................................................................................... 7 2.1.2.2 Genus Cadophora e Phialophora ..................................................................................... 7 2.1.2.3 Cadophora fastigiata ....................................................................................................... 9 2.1.2.3.2 Descrição do crescimento em vários meios ................................................................ 10 2.1.2.3.2.1 Características da colonia a 20 – 22ºC após 3 semanas de acordo com Lagerberg . 10 2.1.2.3.2.2 Descrição de microscopia de espécime crescido em PDA a 20 – 22ºC entre 1 a 3 semanas ................................................................................................................................... 10 2.1.3 Clamidósporos................................................................................................................. 11 2.1.4 Condições ambientais e crescimento fúngico ................................................................... 11 2.1.4.1 Necessidades específicas e vias alternativas.................................................................. 11 2.1.4.2 Atividade de água (aw) ................................................................................................... 12 2.1.4.3 Concentração de iões de hidrogénio e pH ..................................................................... 12 2.1.4.4 Temperatura................................................................................................................. 12 2.1.4.5 Tensão de gás .............................................................................................................. 13 2.1.4.6 Matriz alimentar ........................................................................................................... 13 2.2 Preservação de alimentos ao longo da história .................................................................... 13 2.2.1 Processamento térmico ................................................................................................... 15 3. Metodologia .................................................................................................................................. 18 3.1 Material biológico ................................................................................................................... 19 3.1.1 Providência ...................................................................................................................... 19 3.1.2 Crescimento do fungo ...................................................................................................... 19 3.1.3 Crescimento de clamidósporos ........................................................................................ 19 3.1.3.1 Meio NB ....................................................................................................................... 19 3.1.3.2 Meio PCA ..................................................................................................................... 20 3.1.4 Observações e colheita dos esporos ................................................................................. 20 3.2 Tratamento térmico ................................................................................................................ 21 3.3 Coloração vital com diacetato de fluoresceína (FDA) ................................................................ 21 3.4 Contagem dos esporos totais e viáveis .................................................................................... 22 3.5 Amostras utilizadas ................................................................................................................. 22 3.5.1 Água destilada; pH 6,5 .................................................................................................... 22 3.5.2 Solução de sacarose 20%; pH 4 ....................................................................................... 23 3.5.3 Água acidificada; pH 4 ..................................................................................................... 23 3.6 Tratamento dos dados ............................................................................................................ 23 3.6.1 Cálculo do tempo de redução decimal D e fator de resistência térmica z ........................... 24 4. Resultados e discussão ................................................................................................................. 25 4.2 Coloração FDA........................................................................................................................ 27 4.3 Contagens de esporos ............................................................................................................ 28 4.3.1 Amostra água destilada; pH 6,5 ....................................................................................... 29 viii 4.3.2 Amostra solução de sacarose 20%; pH 4 .......................................................................... 29 4.3.3 Amostra água acidificada; pH 4 ........................................................................................ 29 4.4 Proporção de esporos viáveis pelos binómios de temperatura/tempo ...................................... 29 4.4.2 Amostra solução de sacarose 20%; pH 4 .......................................................................... 31 4.4.3 Amostra água acidificada; pH 4 ....................................................................................... 32 4.5 Cálculo de D ........................................................................................................................... 33 4.5 Cálculo de z ............................................................................................................................ 37 4.7 Caso prático ........................................................................................................................... 39 5. Conclusão e considerações futuras ............................................................................................... 41 5.1 Conclusão .............................................................................................................................. 42 5.2 Considerações futuras ............................................................................................................ 42 Referências bibliográficas ................................................................................................................. 43 Anexo I ................................................................................................................................................. i 4 2. Revisão bibliográfica 5 2.1 Fungos 2.1.1 O que são fungos? Há cerca de 120000 espécies de fungos identificados neste momento (Hawksworth and Lücking 2017), contudo, ainda não começamos nem a arranhar a superfície no que toca à descoberta e descrição destes organismos. Classicamente estimava-se a existência de 1,5 milhões de espécies fúngicas no nosso planeta, com estimativas mais recentes inflacionando ainda mais esse número até aos 2,2 a 3,8 milhões de espécies (Hawksworth and Lücking 2017). Pondo isto em perspetiva, pensamos já ter descoberto cerca de 80% de espécies de plantas existentes (Chapman 2009), mas temos ainda mais de 90% de espécies de fungos existentes para descobrir! O Reino dos fungos é notoriamente difícil de delimitar devido às grandes diferenças encontradas entre os seus elementos, todavia, possuem geralmente certas caraterísticas em comum (Webster and Weber 2007).  São organismos heterotróficos, não fazem fotossíntese e obtém energia através de absorção;  Possuem estado vegetativo no substrato, no estado de micélio não motor, no entanto, podem ocorrer estados reprodutivos móveis;  Tipicamente têm parede celular, usualmente de glucanos e quitina;  Eucarióticos, com um ou vários núcleos, com o talo a ser homo ou heterocariótico, haploide, dicariótico ou diploide;  Ciclos de vida usualmente complexos, mas ocasionalmente simples;  Reprodução sexuada, com fusão dos núcleos e meiose, parassexuada, envolvendo fusão dos núcleos e desdiploidização gradual, e finalmente assexuada, com unicamente divisão mitótica;  Propágulos geralmente na forma de pequenos esporos produzidos em altos números;  Esporocarpos macro ou microscópicos, com formas características;  Geralmente cosmopolita, universalmente presentes em habitats terrestres e de água doce, regista-se presença diminuta em ambientes marinhos. 2.1.2 Taxonomia básica dos fungos A taxonomia é uma ciência de classificação, tendo o propósito de classificar e ordenar organismos através do conjunto das suas características. Apesar de ser uma ciência, a taxonomia é por 6 vezes um tanto arbitrária, uma vez que os conceitos criados para ela são estabelecidos pelo ser humano (Webster and Weber 2007). Esta peculiaridade destaca-se ainda mais na taxonomia clássica, na qual se procura e decide entre uma série de caracteres macro e microscópicos; no entanto, mesmo com métodos mais modernos ainda é detetada. No caso dos fungos em particular, a taxonomia parece estar em constante mudança e mesmo existindo um acordo geral em relação às clades existentes, existe mesmo assim discordância a níveis de nomenclatura, sendo por exemplo, um grupo nomeado Ascomycetes em Dictionary of the Fungi e Pezizomycotina em Myconet (Hibbett, Binder et al. 2007) . Exemplos deste tipo são frequentes, e levam a maior dificuldade e confusão no que toca a uma classificação na sua natureza volátil. Não obstante, a utilidade da taxonomia não pode ser de modo algum negada, e as vantagens de conseguir agrupar os seres e saber quais os tipos de relação de proximidade entre eles é imprescindível. Assim, uma das correntes representações da taxonomia fúngica é a que segue na Figura 1. Figura 1 Filogenia e classificação dos Fungos. Fungos basais e Dikarya. Cumprimento dos ramos não proporcional a distâncias genéticas. Adaptado de Hibbett et al. (2007). 7 2.1.2.1 Fungos filamentosos Fungos filamentosos são assim chamados pois a sua unidade de crescimento vegetativo consiste na hifa, a qual é composta por tubos com parede, que se estendem numa das pontas por incorporação de novo material de parede celular (Weber and Pitt 2001). Estas estruturas representam a principal ferramenta que permite aos fungos assumirem um papel chave na maioria dos ecossistemas. Esta e outras características, tais como, a capacidade de ter um ápex extensível capaz de produzir exoenzimas, a formação de “ramos” e a translocação de nutrientes entre segmentos de hifa maduros, tornam os fungos filamentosos em colonizadores do solo de tal forma superiores (Smith and Read 2002) que uma grande parte das plantas terrestres os tem como parceiros micorrizais, com forma a facilitar a colonização do solo e expansão da área que ocupam neste. Esta associação entre fungos micorrizais e plantas terrestres verifica-se desde há cerca de 400 milhões de anos (Simon, Bousquet et al. 1993, Remy, Taylor et al. 1994); no entanto, com o avanço da ciência a sua utilidade não termina aí. Como previamente mencionado, estes tem a capacidade de produzir vastas quantidades de enzimas extracelulares (Peberdy 1994), tornando-os em organismos de interesse para processos biotecnológicos. 2.1.2.2 Géneros Cadophora e Phialophora O género Cadophora foi criado por Lagerberg e Melin em 1927, este género foi inicialmente criado em volta de uma única espécie (Lagerberg, Lundberg et al. 1927), tendo-a como a espécie tipo do género. A espécie em questão era Cadophora fastigiata . Os traços característicos a que Lagerberg e Melin deram enfase e que especializavam este género eram a produção de conídios endógenos das fiálides, tendo uma abertura em forma de colarete (Lagerberg, Lundberg et al. 1927). Mais tarde, em 1934, Melin e Nannfeldt adicionaram quatro espécies novas ao género, todas provenientes de madeira com contaminações que davam origem a manchas (Melin and Nannfeldt 1934). Anteriormente a isto, Medlar, a 1915, tinha proposto o nome genérico Phialophora para a única espécie que havia sido encontrada do género, esta foi isolada de uma infeção de pele crónica num ser humano e mais tarde foi nomeada Phialophora verrucosa (Medlar 1915). O nome Phialophora foi registado devido à célula que dá origem aos conídeos ser segundo Medlar um “pequeno e superficial copeiro” – ou seja – esta estrutura reprodutiva era um fiálides com um colarete bem desenvolvido (Medlar 1915). 8 Mais tarde, em 1937, Conant teve uma peculiar consideração. Perguntou-se se as espécies de fungos patogénicas no Homem teriam que ocorrer como saprófitas ou parasitas noutro habitat (Conant 1937). Aí começou a sua pesquisa e comparou oito espécies de Cadophora com Phialophora verrucosa e considerou-as congéneres, adicionando sete das espécies de Cadophora para o género Phialophora (Conant 1937). Esta denotação de Conant, tal como a de que existe a possibilidade de polimorfismo entre a espécie atirou ambos os géneros Cadophora e Phialophora para uma discussão confusa durante anos (Cole and Kendrick 1973). Autores sugeriam classificações diferentes dando enfase a características diferentes, o que incorria que não houvesse concordância final quanto a ambos os géneros. Recentemente usando tecnologias mais inovadoras, através da análise de sequências ITS e 28S de rRNA, foi determinado que o género Cadophora é anamorfo dos Helotiales (Discomycetes) e distinto do género morfologicamente semelhante Phialophora (Figura 2) (Harrington and McNew 2003). Figura 2 Uma das 8 árvores com maior parsimonia baseada em sequências de parte da grande subunidade de rDNA de espécies parecidas a Phialophora e outros ascomicetos. A raiz da árvore é o basidiomiceto Bulleromyces albus. Adaptado de Harrington e McNew (2003). 9 2.1.2.3 Cadophora fastigiata Cadophora fastigiata é a espécie tipo do género Cadophora . Enquanto durante algum tempo, devido à desordem que existia nas classificações entre Cadophora e Phialophora , esta deteve ambos os nomes de Cadophora fastigiata e Phialophora fastigiata (Harrington and McNew 2003) , verificando-se o último obsoleto no tempo corrente. Como mencionado previamente, as espécies do género Cadophora são geralmente encontradas no solo e em plantas, onde causam a sua decomposição, deixando manchas de várias colorações. O mesmo se aplica a Cadophora fastigiata (Melin and Nannfeldt 1934) , apesar dos seus muito escassos relatos, a ultima vez que foi encontrada foi no início do século, em cabanas de madeira que tinham sido construídas entre 1901 e 1911 no Ártico (Blanchette, Held et al. 2004). 2.1.2.3.1 Descrição Colónia com crescimento tardio, parte central de cor ocrácea forte, com margens laterais difusas imersas numa cor acastanhada. Vista de trás tem um aspeto fuliginoso. Hifas vegetativas ramificadas, septadas, subhialinas, com cor castanha 0,7 – 3 micrómetros de grossura. Conidióforo tem origem perpendicular a hifa vegetativa por um ramo simples estreito, obcláveo, cilíndrico, de cor ligeiramente castanha. Ápice com fasciculo com fiálides ou esterigmas da mesma forma. Fiálides com forma de lança, 5–12 x 2,5–3,5 µm, castanho claro, ligeiramente escuro. Conídeos elipsoidais ou obovoides 3–5 x 2–3 µm, castanho claros (Conant 1937). Este fungo é microscopicamente reconhecido pela presença de colaretes, que circundam as pontas dos fiálides, onde se encontram conídios viscosos. A sua associação à decomposição de madeiras deve-se à sua capacidade de degradar lenhina, celulose e pectinas, causando por vezes uma coloração azul nas madeiras contaminadas (Melin and Nannfeldt 1934). 10 2.1.2.3.2 Descrição do crescimento em vários meios 2.1.2.3.2.1 Características da colónia a 20 – 22 ºC após 3 semanas Crescimento em potato dextrose agar (PDA) 1,5 mm por dia, plano, flocoso no centro, aveludado, castanho acinzentado; margem suave e branco maculado. Exsudato sem cor, abundante no centro que diminui para a margem; margem inteira, Reverso concolor (Lagerberg, Lundberg et al. 1927). Crescimento em plate count agar (PCA) 1,7 mm por dia, plano, suave a ligeiramente flocoso, laranja acinzentado, vai ficando cinzento acastanhado junto até junto à margem, onde fica quase transparente. Sem exsudado; Margem inteira; Reverso concolor (Lagerberg, Lundberg et al. 1927). Crescimento em oatmeal agar (OA) 1,4 mm por dia, plano, pulverulento com algumas hifas aéreas no centro, suave em direção à margem, cinzento acastanhado com zona marginal castanho acinzentado. Sem exsudado; Margem inteira; Reverso concolor (Lagerberg, Lundberg et al. 1927). Crescimento em malt extract agar (MEA) 1,3 mm por dia, pequeno convexo, fofo com hifas levantadas no centro, branco maculado. Zona marginal suave, cor branco alaranjado a transparente na borda. Sem exsudado; margem inteira. Reverso amarelo dourado no centro, nos outros locais amarelo alaranjado (Lagerberg, Lundberg et al. 1927). 2.1.2.3.2.2 Descrição de microscopia de espécime crescido em PDA a 20 – 22 ºC entre 1 a 3 semanas Hifas aéreas regulares, suaves e de paredes finas, 2,5 µm de largura, com pigmentos oliváceos pálidos, com septos finos, hifas laterais hialinas, maioritariamente a crescer a quase anglos retos. Material extracelular acastanhado junto ao centro. Fiálides sesseis ou em células de suporte cilíndricas com ate 13 µm de comprimento e 3 µm de largura, todos inseridos a ângulos quase retos em hifas indiferenciadas. Fiálides sesseis frequentemente não apresentam septo basal. Células de suporte laterais, caso presentes, apresentam 1 a 4 fiálides em arranjos menos densos, com ocasionalmente fiálides a abrir no dorso de outros fiálides. Fiálides com até 15 x 2 µm, amplamente pontiagudo, com parte basal arredondada com até 3 µm em comprimento e pescoço cilíndrico com cerca de 1,5 µm de largura e 3 µm de comprimento. Conídios produzidos em aglomerados viscosos, hialinos, suaves e de paredes finas, ovoides a elipsoidais com 3,0-5,5 por 1,5-2,5 µm. Sem clamidósporos. Temperatura mínima 4 ºC; Temperatura máxima 30 – 33 ºC; Temperatura ótima 21 a 24 ºC, isolado de madeira de 11 Picea abies na Bélgica (Lagerberg, Lundberg et al. 1927). 2.1.3 Clamidósporos Clamidósporos são formados por várias espécies fúngicas e apresentam-se como células vegetativas de tamanho superior e paredes mais grossas, com formas variadas e citoplasma condensado, eles formam-se no interior ou nas pontas das hifas (Lin and Heitman 2005). A produção e a utilidade dos clamidósporos parece variar entre as espécies a que pertencem (Lin and Heitman 2005), no entanto, parecem ocorrer em condições ambientais muito específicas e ter na maioria das vezes uma função mais ligada à sobrevivência que à disseminação (Paraud, Hoste et al. 2005); (Grønvold, Nansen et al. 2009), ao contrário dos esporos habituais. 2.1.4 Condições ambientais e crescimento fúngico Enquanto geralmente não olhamos para os alimentos como um ecossistema, para um vasto leque de espécies fúngicas é exatamente isso que eles representam. Os alimentos, sendo por sua natureza nutritivos, apresentam-se como um habitat rico para a proliferação fúngica. No entanto, há muitos outros fatores nos alimentos para além do quão nutritivos são, que os apontam como um alvo ideal para a propagação de espécies fúngicas. 2.1.4.1 Necessidades específicas e vias alternativas Apesar de os alimentos serem uma rica fonte de nutrientes, não são adequados para o crescimento de qualquer tipo de fungos. Verifica-se a existência de algumas espécies fúngicas com necessidades nutricionais específicas, assim como, algumas com capacidade de usar outros solutos devido a vias específicas e por vezes mais eficiente. Não obstante, o metabolismo fúngico parece preferir substratos ricos em hidratos de carbono. 12 2.1.4.2 Atividade de água (aw) A atividade de água dispõe-se como o valor de água não ligada existente, isto é, a quantidade de água livre que se encontra disponível no alimento, cujo microrganismo pode usar para o seu crescimento. Este valor pode ser definido pela equação: aw=ρ/ρ0, (1) onde, ρ é a pressão parcial de vapor de água no material e ρ0 é a pressão do vapor de saturação de água pura nas mesmas condições, indicando assim que os valores possíveis de aw podem teoricamente variar entre 0 e 1; no entanto, para a vida como a conhecemos encontram-se confinados ao intervalo entre 0,6 e 0,99(9). Na maioria das situações reais, a atividade de água desempenha o papel mais importante para determinar a segurança ou deterioração do alimento face às ameaças fúngicas. Dito isto, apesar da maior parte dos organismos necessitar de valores muito altos de aw para o seu crescimento (os animais são virtualmente apenas capazes de crescimento entre valores de 0,99 a 1,0 aw), os fungos pertencentes ao filo Ascomycota são capazes de crescer a aw abaixo de 0,9, com alguns fungos xerófilos capazes ainda de crescer em aw abaixo de 0,85 em algumas condições. 2.1.4.3 Concentração de iões de hidrogénio e pH Quando a valores altos de aw os fungos encontram nas bactérias um competidor para acomodar o nicho que ocupam na degradação dos alimentos. Em pH neutro, as bactérias prosperam e os fungos não conseguem competir com elas. No entanto, quando o pH chega a valores abaixo de 5, este manifesta-se como um condicionante que torna o desenvolvimento bacteriano cada vez mais improvável, enquanto ao mesmo tempo afeta apenas ligeiramente os fungos, os quais, geralmente são pouco perturbados por valores de pH entre 3 a 8. 2.1.4.4 Temperatura A temperatura mostra-se distintivamente relevante em duas etapas diferentes, isto é, na etapa de processamento e na de conservação. Durante o processamento fungos resistentes a altas temperaturas podem sobreviver a processos de pasteurização em condições acídicas. Porém, pouco se sabe da sua resistência a altas temperaturas, 13 exceto no que convém a algumas espécies em particular. Todavia, parece verificar-se geralmente, que altos níveis de açúcar parecem exercer ações protetivas sobre os esporos, sendo necessária uma maior temperatura ou mais longa exposição para a sua inativação. Ao passo que, níveis de pH baixos e uso de elementos preservadores parecem além de aumentar o efeito do calor na inativação de propágulos fúngicos, dificultar a regeneração de estruturas danificadas. No que toca à conservação dos alimentos, é necessário que estes se encontrem preservados a temperaturas de -10 ºC ou inferiores, uma vez que estas parecem inibir a atividade microbiológica. Quanto à refrigeração que encontramos em arcas refrigeradoras ou frigoríficos domésticos, esta ronda os cerca de 5 ºC, o que se verifica como suficiente para estender o tempo de vida de alguns alimentos, mas incapaz de impedir o crescimento de espécies de Fusarium , Cladosporium e Penicillium . 2.1.4.5 Tensão de gás Fungos responsáveis pela deterioração dos alimentos, tal como quase todos os outros fungos filamentosos, tem uma necessidade por oxigénio. Para muitos destes fungos a concentração de oxigénio dissolvida no substrato tem muito maior influência que a pressão de oxigénio atmosférico. Muitas espécies encontram-se suscetíveis a altos níveis de dióxido de carbono e baixos níveis de oxigénio, no entanto, isto não se aplica ao conjunto integral destes organismos, visto que alguns, tais como Penicillium roqueforti são capazes de crescimento mesmo a níveis de 80% de dióxido de carbono e 4,2% de oxigénio. 2.1.4.6 Matriz alimentar A matriz alimentar é um dos fatores capaz de influenciar a degradação dos alimentos. No que toca a fungos, uma matriz liquida auxiliaria a propagação de leveduras, uma vez que estes são organismos unicelulares e assim mais facilmente capazes de se dispersar sobre um meio liquido e teriam acesso às condições anaeróbicas que procuram para a fermentação. Por outro lado, fungos filamentosos preferem substratos firmes, com fácil acesso a oxigénio. 2.2 Preservação de alimentos ao longo da história Desde a infância da humanidade houve uma necessidade de encontrar maneiras de preservar os alimentos. Enquanto durante a pré-história os alimentos eram recolhidos (ou mortos) numa base 20 solução de esporos de C. fastigiata que ficou a incubar cerca de 72 horas a 25 ºC, após este tempo ficou em crescimento a temperatura ambiente durante cerca de um mês e meio, com observações feitas a períodos regulares. Os restantes 10 mL de meio NB foram homogeneizados num Erlenmeyer com 90 mL de meio PDA estéril, deixou-se este arrefecer um pouco e depois procedeu-se ao seu plaqueamento numa câmara de classe 2, mantendo condições assépticas. Aquando do arrefecimento do meio nas placas, estas foram inoculadas com uma solução de esporos de C. fastigiata com o auxílio de um espalhador. Estas placas foram postas em crescimento numa incubadora a 25 ºC, durante um período de cerca de um mês e meio, com observações feitas a períodos regulares. 3.1.3.2 Meio PCA Após a incorporação de B. subtilis em 100 mL de meio PCA estéril, este meio é plaqueado. As placas resultantes são posteriormente incubadas a 35 ºC durante um período de cerca de 48 horas. Subsequentemente produziu-se 50 mL de meio PDA e aquando da sua conclusão verter uma pequena camada sobre as placas de PCA. Ao verificar-se a solidificação deste, inoculou-se com uma solução de C. fastigiata com o auxílio de um espalhador. Estas placas foram depois incubadas a 25 ºC durante um período de cerca de mês e meio, com observações feitas a períodos regulares. 3.1.4 Observações e colheita dos esporos Ao longo do período de crescimento do fungo até à data esperada de obtenção de clamidósporos foram efetuadas observações regulares do seu crescimento. Cerca de duas semanas após plaquear o fungo foram ocasionalmente retiradas pequenas porções deste para observação. Com auxílio de uma agulha estéril, colocou-se cada porção numa lâmina de microscopia, com uma gota de água. Espalhou-se o material biológico na lâmina, de modo a permitir mais fácil análise, aplicou-se uma lamela sobre este material com vista a completar a preparação e procedeu-se à visualização num microscópio ótico composto numa ampliação de 400x. Cerca 45 dias após o início do crescimento, adicionou-se entre 5 a 10 mL de água destilada às placas e com um espalhador esfregou-se levemente de modo a soltar as estruturas fúngicas do meio sólido. Prontamente soltas as estruturas, verteu-se a água que as contem por um funil contendo 6 21 camadas de gaze, para um falcon de 15 mL, pode-se desta forma separar a maior parte do micélio de forma a obter a solução de esporos. Estas soluções foram depois armazenadas a 4 ºC. 3.2 Tratamento térmico Para propósitos de tratamento térmico selecionou-se primeiramente a solução de esporos a utilizar, tendo todas as soluções utilizadas concentrações na ordem de 1x106. Uma vez selecionada a solução de esporos retirou-se 50 µL desta para cada Eppendorf de 0,5 mL. O tratamento térmico realizou-se num banho-maria, no qual os tubos Eppendorf , permaneciam maioritariamente submersos, por reforço de um suporte. Imediatamente após a saída do banho a cada intervalo de tempo respetivo, colocou-se os tubos Eppendorf num suporte à temperatura de -20 ºC de modo a impedir que o calor residual continuasse a inativa-los. 3.3 Coloração vital com diacetato de fluoresceína (FDA) Preparou-se uma solução “ stock ” de FDA [0,001% w/v] ao dissolver-se 25 mg de cristais de diacetato de fluoresceína (Sigma, F 7378) em algumas gotas de acetona, verteu-se esta solução para um balão volumétrico e perfez-se um volume de 25 mL com metanol. Este foi armazenado a -20 ºC até necessário. Posteriormente ao tratamento térmico e arrefecimento das amostras injetou-se 5 µL em cada Eppendorf e deixou-se repousar por 5 minutos, no final deste intervalo homogeneizou-se a solução e retirou-se 10 µL para uma lâmina e sobrepôs-se com uma lamela. Usou-se seguidamente o microscópio OLYMPUS BX51 com um filtro FITC 470 – 490 nm e observou-se os esporos viáveis, os quais mostram fluorescência devido à hidrólise de FDA, na ampliação de 400x. Por forma a verificar a fidelidade do método executou-se vários tipos de controlo, para isto, autoclavou-se 300 µL de amostra e procedeu-se a criar a seguinte ordem de tubos Eppendorf , em duplicado, para validar a metodologia referente à coloração vital com diacetato de fluoresceína e à contagem dos esporos totais e viáveis. Dividiu-se a amostra autoclavada e não tratada pelos tubos Eppendorf nas seguintes proporções: 1 – 100% autoclavada, 0% não tratada (controlo negativo); 2 – 0% autoclavada, 100% não tratada (controlo positivo); 3 – 90% autoclavada, 10% não tratada; 4 – 10% autoclavada, 90% não tratada; 5 –50% autoclavada, 50% não tratada. 22 3.4 Contagem dos esporos totais e viáveis Seguiu-se o procedimento indicado em 3.3, no entanto, ao invés de usar uma lâmina de microscopia usou-se uma câmara de Neubauer ou hemocitómetro. Procedeu-se à contagem do número de esporos viáveis com o filtro FITC e o número de esporos total em cada quadrado, contando-se os esporos presentes em 3 quadrados, como exemplificado na Figura 3. Figura 3 Câmara de Neubauer com as áreas de contagem destacadas, adaptado de (Giri) 3.5 Amostras utilizadas 3.5.1 Água destilada; pH 6,5 O pH das soluções de esporos foi medido com papel medidor de pH. Procedeu-se à colocação dos tubos Eppendorf com 50 µL de solução de esporos no banho-maria. Os tubos Eppendorf encontravam-se em duplicado, existindo 2 deles para cada intervalo de temperatura e tempo. Usaram-se as temperaturas de 50, 55, 60, 65 e 70 ºC. Os intervalos de tempo 23 utilizados a estas temperaturas foram de 0, 5, 10, 15 e 20 minutos, verificando-se o uso de intervalos adicionais quando adequado. 3.5.2 Solução de sacarose 20%; pH 4 De forma a simular mais realisticamente as condições da ocorrência da contaminação por ação deste fungo formulou-se uma solução de esporos com 20% de sacarose, seguidamente mediu-se o pH desta. Uma vez concluídos estes passos executou-se o mesmo método para tratamento térmico que aplicado no ponto 3.5.1, divergindo apenas no intervalo de temperaturas utilizado, sendo este constituído pelos valores de 45, 50 e 55 ºC. 3.5.3 Água acidificada; pH 4 Com forma a obter uma melhor comparação com os dados da solução de sacarose criou-se uma solução de esporos em água acidificada a pH 4. Esta solução obteve-se através da centrifugação de uma solução de esporos a pH 6,5 e separação e descarte do sobrenadante. Este sobrenadante foi substituído em igual volume por água acidificada a pH 4. Quanto ao tratamento térmico em si, este tomou lugar seguindo a metodologia assinalada em 3.5.1, no entanto, utilizaram-se apenas as temperaturas de 50 e 55 ºC. 3.6 Tratamento dos dados Introduziu-se os números obtidos pela contagem dos esporos viáveis e inviáveis no software de folha de cálculo Excel, utilizou-se este em todas as fases que respeitam ao tratamento de dados. Calculou-se a proporção de viáveis ao dividir o número de viáveis pelo número total de esporos. Utilizou-se depois este número para produzir os gráficos que demonstram a proporção do número de viáveis por cada binómio de tempo/temperatura, assim como, para o cálculo do tempo de redução decimal D e o fator de resistência térmica z e execução dos respetivos gráficos. 24 3.6.1 Cálculo do tempo de redução decimal D e fator de resistência térmica z Com vista a obter D , multiplicaram-se todas as percentagens de viabilidade obtidas por um número estático, neste caso 1000. Seguidamente, utilizou-se a função LOG10, para obter o logaritmo de base 10 de cada um destes números. O resultado obtido desta função foi traçado em função do tempo. A partir dos pontos obtidos traçou-se uma linha de tendência e obteve-se a equação desta reta no formato y=mx+b. Ao dividir-se 1 por valor absoluto do declive de cada reta (|m|) é possível obter o valor de D em minutos. Tencionando obter z , utilizou-se novamente a função LOG10 em cada D . O resultado obtido desta função foi traçado em função do tempo. Obteve-se um gráfico cujos pontos foram usados para traçar uma linha de tendência. Retirou-se desta reta a sua equação e tal como para inferir o D utilizou-se o declive da reta. Dividiu-se 1 pelo valor absoluto declive da reta, obtendo-se assim o valor de z em graus Celcius. 25 4. Resultados e Discussão 26 4.1 Crescimento fúngico e obtenção de clamidósporos Verificou-se o crescimento fúngico de C. fastigiata em todos os meios utilizados, no entanto, visto que se pretendia a obtenção de um número vasto de clamidósporos, cada amostra era analisada microscopicamente com uma frequência máxima de uma semana. 4.1.1 Meios SNA, SGA-MI 0.5 %, Czapek com celobiose e CMA Nestes meios verificou-se o crescimento do fungo, com a colónia a apresentar um aspeto tufado entre a segunda e terceira semanas. Em qualquer um destes o crescimento de C. fastigiata foi verificado; no entanto, não se atestou o aparecimento de clamidósporos. Aquando da marca de um mês e meio após o plaqueamento, confirmou-se o aparecimento de clamidósporos em algumas das placas. É de notar que a esta altura já se verificava uma desidratação do meio, possibilitando que o stresse hídrico verificado pelo fungo levasse à geração de clamidósporos (embora em números reduzidos). 4.1.2 Meio PDA + PCA Neste meio verificou-se um crescimento normal do fungo, este apresentava novamente um aspeto macroscópico tufado a partir da 2 ou 3 semana, o qual cobria completamente a placa pela quarta semana. A partir da quarta semana começaram-se a distinguir clamidósporos, os quais eram vastamente mais frequentes pela sexta semana, como se pode verificar na Figura 4. É de inferir que a produção de clamidósporos nestas placas foi potenciada pelo composto 10M (Li, Qu et al. 2005) resultante da atividade de Bacillus subtilis , visto que este composto tem propriedades antifúngicas, resultando numa produção exagerada de clamidósporos, quando comparada com o seu crescimento habitual. Este efeito foi ainda amplificado pelo stress hídrico que se verificou nas últimas semanas da cultura. 27 Figura 4 Crescimento fúngico com presença de clamidósporos. 4.2 Coloração FDA A aplicação do método de FDA permitiu a distinção dos esporos viáveis, uma vez que se verificava a sua fluorescência quando submetidos a luz no espectro de 470 - 490 nm (Figura 5). Figura 5 Esporos viáveis a apresentar fluorescência no campo de 470 – 490nm devido a FDA. 28 Desta forma, ao contar o número de esporos que apresentavam fluorescência e ao dividi-lo pelo número total de esporos contável sobre o espectro visível é possível extrapolar a percentagem ou proporção de esporos viáveis na amostra. Para verificar a fidelidade do método de FDA, usaram-se várias amostras, sendo estas: 1 – 0% autoclavada, 100% não tratada (controlo negativo); 2 – 100% autoclavada, 0% não tratada (controlo positivo); 3 – 90% autoclavada, 10% não tratada; 4 – 10% autoclavada, 90% não tratada. Fez-se posteriormente à aplicação do FDA a contagem de cada uma destas obtendo os números encontrados na Tabela 1, a partir destes obtém-se as percentagens de viabilidade respetivamente de: 1 – 0%; 2 – 64%; 3 – 18%; 4 – 68%. Uma vez que contagens em câmara de Neubauer tem um erro considerável associado admitiu-se que as proporções de viabilidade obtidas para cada amostra reputavam o método como fidedigno. Tabela 1 Contagem dos esporos totais e viáveis de quatro amostras diferentes, somatório e proporção de viáveis encontram-se respetivamente no final da tabela. NT – Não submetidas a tratamento térmico; A – autoclavadas 50(NT)/0(A) 0(NT)/50(A) 5(NT)/45(A) 45(NT)/5(A) Totais Viáveis Totais Viáveis Totais Viáveis Totais Viáveis Área 1 30 23 55 0 63 11 66 42 Área 2 46 32 80 0 66 14 44 29 Área 3 51 26 82 0 68 11 54 39 Somatório 127 81 217 0 197 36 164 110 Proporção de viáveis 0,64 0 0,18 0,67 4.3 Contagens de esporos As contagens de esporos obtidas sobre o método FDA podem ser verificadas na sua totalidade nas tabelas que seguem, estas são pertinentes às três amostras diferentes, sendo estas, uma amostra de água destilada, a pH 6,5; uma amostra de solução de sacarose a 20%, a pH 4; e uma amostra de água acidificada, a pH 4. São utilizadas proporções ao invés dos números concretos, uma vez que esta metodologia é afetada de maneira muito mais ligeira por oscilações no número de esporos observados, providenciando conclusões menos falaciosas. Infelizmente apesar do uso do meio PCA com B. subtilis + PDA, o qual, devido à produção de 10M, induz a produção de clamidósporos, verificou-se um aumento 29 significativo de clamidósporos em relação aos outros meios, mas não de grandeza suficiente para ser viavelmente quantificado pela metodologia utilizada. 4.3.1 Amostra água destilada; pH 6,5 Para a amostra em água destilada a pH 6,5, foram efetuadas contagens a temperaturas de 50, 55, 60, 65 e 70 ºC, expostos na Tabela 2. Os intervalos de tempo standard usados inicialmente foram de 0; 5; 10; 15; 20 minutos, estes foram ajustados, adicionando-se e retirando medições dependendo do necessário, os números obtidos podem ser encontrados no Anexo I. 4.3.2 Amostra solução de sacarose 20 %; pH 4 Para a amostra de solução de sacarose a 20 % a pH 4 foram efetuadas contagens às temperaturas de 45, 50 e 55 ºC. Nas temperaturas de 45 e 50 ºC foram efetuadas medições para os tempos de 0, 5, 10, 15 e 20 minutos. Por outro lado, para a temperatura de 55 ºC foram apenas registadas medições para os tempos de 0, 5 e 10 minutos, uma vez que após estes tempos não se observaram esporos viáveis. Os números obtidos podem ser observados no Anexo I. 4.3.3 Amostra água acidificada; pH 4 Para a amostra de água acidificada a pH 4 foram efetuadas apenas contagens à temperatura de 50 ºC a 0, 5, 8, 10, 12, 14, 15 minutos; adicionalmente foram também realizadas contagens à temperatura de 55 ºC, para os tempos de 1, 2, 3 e 4 minutos. Os números obtidos podem ser observados como segue no Anexo I. 4.4 Proporção de esporos viáveis pelos binómios de temperatura/tempo Através das contagens de esporos obtidas é possível calcular a proporção de esporos viáveis para cada binómio de temperatura/tempo. Para uma mais fácil visualização e posterior cálculo estas proporções foram multiplicadas por um número estático, neste caso 1000. Podem ser ilustradas como segue nas Figuras 6 – 8. 36 Para a amostra de água destilada a pH 6,5 podemos ver, na Tabela 2, que os valores de D decrescem com a temperatura, como deveriam, uma vez que D representa o tempo necessário de modo a reduzir uma população em 90%. Assim, os valores indicam que a 50 ºC a amostra necessitaria de 66 minutos, e a 70 ºC apenas 0,69 minutos. Ainda que alguns destes sejam mais práticos de aplicar que outros estes binómios de temperatura/tempo permitiriam um processamento térmico capaz de inativar 90% dos esporos, tornando um alimento seguro sem comprometer as suas caraterísticas organoléticas. Tabela 3 Tabela para cálculo de D a partir de m para as várias temperaturas utilizadas no tratamento térmico da amostra de solução de sacarose 20%, pH 4. Cálculo de D Temperatura (ºC) m D (min) LOG (D) 45 0,0056 178,57 2,25 50 0,026 39,06 (±8,52) 1,59 55 0,109 9,19 (±11,6) 0,96 A amostra de sacarose a 20% a pH 4 é aquela que tem condições mais próximas das encontradas num fruto, no entanto apresenta também mais fatores que possam alterar os valores de variabilidade obtidos. Verifica-se, na Tabela 3, que para a temperatura de 45 ºC o valor de D é de 179 minutos, este valor além de pouco prático, é mais suscetível de ser irrealista devido às tendências erráticas observadas aquando dos ensaios a baixas temperaturas, assim como, devido à falta de suporte estatístico resultante do seu baixo valor de R2. Para as temperaturas de 50 e 55 ºC encontramos já valores de 39 e 9 minutos respetivamente, os quais são aptos de ser aplicados a nível industrial. Tabela 4 Tabela para cálculo de D a partir de m para as várias temperaturas utilizadas no tratamento térmico da amostra de água acidificada, pH 4. Cálculo de D Temperatura (ºC) m D (min) LOG (D) 50 0,026 37,88 (±9,7) 1,58 55 0,105 9,56 (±11,2) 0,98 Na amostra referente à água acidificada a pH 4, presente na Tabela 4, apenas encontramos dois valores, estes mostram D a decrescer com a temperatura como devia. É de destacar que para a temperatura de 55 ºC tem um D de 9,56 minutos, este valor é bastante próximo do valor obtido para as mesmas condições de tempo/temperatura da amostra de sacarose 20% a pH 4, mais uma vez reforçando que o pH a nível terá precedência em comparação a uma concentração de sacarose ao grau 37 utilizado. Estes valores são ainda enfatizados quando comparados com o valor de D para as mesmas condições da primeira amostra, sendo este de 43 minutos em contraste, mostrando uma diferença de cerca de 36 minutos, muito provavelmente devido ao pH da amostra. Cálculo de z Com o intuito de obter agora z, utilizou-se os valores de LOG (D) obtidos previamente nas Tabelas 2 – 4 para as amostras de água destilada, solução de sacarose 20% e água acidificada, respetivamente. Foi necessário ilustrar o valor do logaritmo de D pelas temperaturas utilizadas, pediu-se depois a linha de tendência com forma a obter os valores de m para cada uma das amostras, como se pode verificar nas Figuras 12 – 14. Podemos ver na Figura 12, a ilustração do LOG (D) pela temperatura, tal como anteriormente, pretende-se obter os valores de m e é de destacar igualmente os valores de R2. Nesta amostra verificase um declive de 0,09 e um valor de R2 de aproximadamente 0,92, revelando uma forte ligação entre o tempo necessário para inativar os esporos e a temperatura usada. Figura 12 Gráfico de LOG (D) por temperatura (em Celsius), para a amostra de água destilada, pH 6,5 A Figura 13, exibe um muito alto valor de R2, no entanto, deve-se ter em conta que o baixo número de pontos utilizado contribui significativamente para este facto. Verificamos para a reta ilustrada um valor de R2 de 0,99 e um declive de 0,13. y = -0,0948x + 6,7298 R² = 0,921 -0,50 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 010 20 30 40 50 60 70 80 LOG (D) Temperatura (ºC) 38 Figura 13 Gráfico de LOG (D) por temperatura (em Celsius), para a amostra de solução de sacarose, pH4. O gráfico concernente à amostra de água acidificada a pH 4 não é disposto, uma vez que a sua reta resulta apenas da existência de apenas dois pontos. O seu valor de declive é de 0,12. Com forma a obter z calculou-se o inverso do módulo deste do declive, na ordem previamente utilizada para as amostras de água destilada, solução de sacarose 20% e água acidificada, como disposto na Tabela 5. Tabela 5 Tabela com valores de z para as diferentes amostras Cálculo de z m z Água destilada pH 6,5 0,09 10,55 Solução de sacarose pH 4 0,13 7,76 Água acidificada pH 4 0,12 8,36 O fator de resistência térmica para a amostra de água destilada a pH 6,5, segundo a Tabela 14, é de aproximadamente 10,6 ºC. Ou seja, é necessário um aumento de 10,6 ºC para reduzir o valor de D por 10 vezes. Apesar de se esperar uma ação protetora da sacarose sobre os esporos, a solução de sacarose apresenta o menor z a 7,76 ºC. Este valor está bastante próximo do valor de z obtido para a amostra de água acidificada, a qual apresenta um z de 8,36 ºC. Entre estas amostras é ainda mais surpreendente y = -0,1288x + 8,0445 R² = 0,9998 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 010 20 30 40 50 60 LOG (D) Temperatura (ºC) 39 o facto de a solução de sacarose apresentar o menor z, uma vez que a água acidificada foi conseguida através do uso de ácido acético, o qual demonstra por vezes atividade antifúngica. Dito isto, é necessário ter em conta que a metodologia utilizada deixa grande margem para melhoramento, uma vez que tem erros consideráveis, podendo ser esta a razão pela qual a amostra de sacarose se encontra mais suscetível ao calor que a de água acidificada. É, no entanto, indubitável que o pH se mostra como um dos fatores de maior impacto no ensaio presente. 4.7 Caso prático Foi requisitado da MUM que providenciasse a sua perícia em relação a uma contaminação por parte de Cadophora fastigiata em matrizes alimentares de origem frutífera. A 54 ºC e pH 4,5, condições semelhantes às utilizadas durante alguns dos ensaios, verificou-se na literatura os valores de D descritos para várias estirpes das seguintes bactérias: STEC 23,4 min – 30,4 min: Salmonela 8,2 min – 12,2 min; L. monocytogenes 12,6 min – 17,2 min (Dufort, Sogin et al. 2017). Comparativamente com os valores de D obtidos neste estudo para C. fastigiata , 9,19 min e 9,6 min em pH 4, estas bactérias mostram-se mais resistentes. Do mesmo modo, para Aspergillus pseudoglaucus e Aspergillus fischeri , em condições de pH 6, verificaram-se valores de D de 1,63 min a 78 ºC e 9,29 min a 90 ºC respetivamente para cada uma das espécies de Aspergillus . Em condições semelhantes de pH (6,5) os ensaios com C. fastigiata revelaram um valor de D de 0,69 min a 70 ºC, mostrando-se significativamente mais frágil que estas espécies de Aspergillus, como se pode averiguar na Tabela 6 (Buerman, Worobo et al. 2019) . Desta forma, de acordo com os valores de D obtidos para as temperaturas utilizadas, pode-se inferir que no caso do aparecimento de contaminações por parte de C. fastigiata , estas não ocorreriam isoladamente, da mesma forma, com os habituais parâmetros de processamento industrial HTLT (temperatura acima de 80 ºC com tempo acima de 30 segundos) (Petruzzi, Campaniello et al. 2017) é garantida uma redução de pelo menos 90% da carga de esporos viáveis. Sugere-se desta forma, que a ocorrência de uma contaminação enquanto se mantém parâmetros normais de pasteurização seja devida a uma contaminação cruzada e não à sobrevivência de uma quantidade considerável de propágulos fúngicos na matriz alimentar. 40 Tabela 6 Valores de D e z para as várias condições de C. fastigiata em comparação com outras espécies de contaminantes alimentares ESPÉCIE CONDIÇÕES D (MIN) Z (ºC) FONTE C. FASTIGIATA 55 ºC; pH 4 9,19 7,76 N/A C. FASTIGIATA 55 ºC; pH 4 9,6 8,36 N/A STEC 54 ºC; pH 4,5 23,4 – 30,4 6,75 (Dufort, Sogin et al. 2017) SALMONELA 54 ºC; pH 4,5 8,2 – 12,2 6,60 (Dufort, Sogin et al. 2017) L. MONOCYTOGENES 54 ºC; pH 4,5 12,6 – 17,2 7,77 (Dufort, Sogin et al. 2017) C. FASTIGIATA 70 ºC; pH 6,5 0,69 10,55 N/A ASPERGILLUS PSEUDOGLAUCUS 78 ºC; pH 6 1,63 8,1 (Buerman, Worobo et al. 2019) ASPERGILLUS FISCHERI 90 ºC; pH 6 9,29 6,3 (Buerman, Worobo et al. 2019) 41 5. Conclusão e Considerações Futuras 42 5.1 Conclusão Cadophora fastigiata é um fungo identificado quase há uma centena de anos, as suas aparições são invulgares no geral e relatórios de contaminações alimentares por parte deste são extremamente escassas. Enquanto possível uma contaminação alimentar por parte deste, provavelmente resultaria por contaminação cruzada devido ao contato com alguma madeira contaminada. Ao passo que se encontraram alguns valores discordantes na obtenção dos valores de z e D, nas condições experimentais verificou-se que para condições de água destilada e pH 6,5 a uma temperatura de 70 ºC seria necessário 0,69 minutos para a inativação de 90% dos esporos. Adicionalmente, nas outras condições de pH verificou-se que em 9,6 minutos a 55 ºC haveria uma diminuição logarítmica do número de esporos viáveis, e a 60 ºC não foram encontrados esporos viáveis após 5 minutos. Em suma, aquando do fim dos estudos térmicos efetuados com este fungo, parece que qualquer contaminação ativa por parte deste numa matriz alimentar após o devido tratamento térmico seja factualmente insuportável, podendo apenas ocorrer por ação de contaminação cruzada ou de más práticas. 5.2 Considerações futuras Ainda que se tenham obtido desta forma valores base do binómio de z e D para este organismo, os métodos utilizados foram de certa forma rudimentares e deixaram uma vasta margem para otimização. Apesar de ser improvável a sua contaminação de matrizes alimentares, há a hipótese de contaminações cruzadas por contato com madeiras contaminadas, daí sugere-se um aprimoramento dos valores obtidos neste estudo. Por último, recomenda-se um mais profundo estudo sobre clamidósporos, uma vez que apesar de se ter conseguido a sua indução, não foi em números significativamente grandes. Seria de significativa importância perceber propriamente o mecanismo da sua produção, assim como, conduzir estudos térmicos neles. 43 Referências bibliográficas A Gock, M., A. D Hocking, J. Pitt and P. Poulos (2003). "Influence of temperature, water activity and pH on growth of some xerophilic fungi." International journal of food microbiology 81: 11-19. Bigelow, W. D. (1921). "The logarithmic nature of thermal death time curves." The Journal of Infectious Diseases 29(5): 528-536. Blanchette, R. A., B. W. Held, J. A. Jurgens, D. L. McNew, T. C. Harrington, S. M. Duncan and R. L. Farrell (2004). "Wood-destroying soft rot fungi in the historic expedition huts of Antarctica." Applied and environmental microbiology 70(3): 1328-1335. Block, S. S. (1991). Disinfection, sterilization, and preservation. Philadelphia, Lea & Febiger. Buerman, E. C., R. W. Worobo and O. I. Padilla-Zakour (2019). "Thermal Resistance of Xerophilic Fungi in Low-Water-Activity (0.70 to 0.80) Confectionery Model Foods." Journal of Food Protection 82(3): 390-394. Chapman, A. (2009). Numbers of Living Species in Australia and the World 2nd edn. Cole, G. T. and B. Kendrick (1973). "Taxonomic Studies of Phialophora." Mycologia 65(3): 661-688. Conant, N. F. (1937). "The Occurrence of a Human Pathogenic Fungus as a Saprophyte in Nature." Mycologia 29(5): 597-598. Dufort, E. L., J. Sogin, M. R. Etzel and B. H. Ingham (2017). "Inactivation Kinetics of Pathogens during Thermal Processing in Acidified Broth and Tomato Purée (pH 4.5)." Journal of Food Protection 80(12): 2014-2021. Giri, D. Grønvold, J., P. Nansen, S. A. Henriksen, M. Larsen, J. Wolstrup, J. Bresciani, H. Rawat and L. Fribert (2009). "Induction of traps by Ostertagia ostertagi larvae, chlamydospore production and growth rate in the nematode-trapping fungus Duddingtonia flagrans." Journal of Helminthology 70(4): 291-297. Harrington, T. and D. McNew (2003). "Phylogenetic analysis places the Phialophora-like anamorph genus Cadophora in the Helotiales." Mycotaxon -Ithaca Ny87: 141-151. Hawksworth, D. L. and R. Lücking (2017). "Fungal Diversity Revisited: 2.2 to 3.8 Million Species." Microbiology Spectrum 5(4). Hibbett, D., M. Binder, J. Bischoff, M. Blackwell, P. Cannon, O. E Eriksson, S. M. Huhndorf, T. Y. James, P. Kirk, R. Lücking, T. Lumbsch, F. Lutzoni, P. Brandon Matheny, D. J McLaughlin, M. Powell, S. Redhead, C. Schoch, J. Spatafora, J. Stalpers and N. Zhang (2007). "A Higher-Level Phylogenetic Classification of the Fungi." Mycological research 111: 509-547. Katzin, L. I., L. A. Sandholzer and M. E. Strong (1943). "Application of the Decimal Reduction Time Principle to a Study of the Resistance of Coliform Bacteria to Pasteurization." Journal of bacteriology 45(3): 265-272. Lagerberg, T., G. Lundberg and E. Melin (1927). "Biological and practical researches into Blueing in Pine and Spruce." Svenska Skogsvårdsföreningens Tidskrift 2(2-4): 127. Li, L., Q. Qu, B. Tian and K. Q. Zhang (2005). "Induction of Chlamydospores in Trichoderma harzianum and Gliocladium roseum by Antifungal Compounds Produced by Bacillus subtilis C2." Journal of Phytopathology 153: 686-693. Lin, X. and J. Heitman (2005). "Chlamydospore Formation during Hyphal Growth in <em>Cryptococcus neoformans</em>." Eukaryotic Cell 4(10): 1746-1754. Mafart, P., I. Leguérinel, O. Couvert and L. Coroller (2010). "Quantification of spore resistance for assessment and optimization of heating processes: A never-ending story." Food Microbiology 27(5): 568-572. McElhatton, A. and R. J. Marshall (2007). "Food safety : a practical and case study approach." Medlar, E. M. (1915). "A New Fungus, Phialophora verrucosa, Pathogenic for Man." Mycologia 7(4): 200-203. Melin, E. and J. A. Nannfeldt (1934). Researches into the blueing of ground wood-pulp: 397-616 pp. 44 Paraud, C., H. Hoste, Y. Lefrileux, A. Pommaret, V. Paolini, I. Pors and C. Chartier (2005). "Administration of Duddingtonia flagrans chlamydospores to goats to control gastro-intestinal nematodes: dose trials." Vet. Res. 36(2): 157-166. Peberdy, J. F. (1994). "Protein secretion in filamentous fungi — trying to understand a highly productive black box." Trends in Biotechnology 12(2): 50-57. Petruzzi, L., D. Campaniello, B. Speranza, M. R. Corbo, M. Sinigaglia and A. Bevilacqua (2017). "Thermal Treatments for Fruit and Vegetable Juices and Beverages: A Literature Overview." Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 16(4): 668-691. Remy, W., T. N. Taylor, H. Hass and H. Kerp (1994). "Four hundred-million-year-old vesicular arbuscular mycorrhizae." Proceedings of the National Academy of Sciences 91(25): 11841-11843. Santos, I., A. Venâncio and N. Lima (1998). "Fungos Contaminantes na Indústria Alimentar." Simon, L., J. Bousquet, R. C. Lévesque and M. Lalonde (1993). "Origin and diversification of endomycorrhizal fungi and coincidence with vascular land plants." Nature 363(6424): 67-69. Simpson, R. (2009). "Engineering aspects of thermal food processing." Singh, R. P. (2008). Computer applications in food technology : use of spreadsheets in graphical, statistical, and process analyses. San Diego, Academic Press. Smelt, J. and S. Brul (2014). "Thermal Inactivation of Microorganisms." Critical reviews in food science and nutrition 54: 1371-1385. Smith, S. E. and D. J. Read (2002). INTRODUCTION. Mycorrhizal Symbiosis (Second Edition). S. E. Smith and D. J. Read. London, Academic Press: 1-8. Sperber, W. H. (2009). Introduction to the Microbiological Spoilage of Foods and Beverages. Compendium of the Microbiological Spoilage of Foods and Beverages. W. H. Sperber and M. P. Doyle. New York, NY, Springer New York: 1-40. Troller, J. A. (1993). Sanitation in Food Processing (Second Edition). J. A. Troller. London, Academic Press: 1-5. Vojir, F., E. Schübl and I. Elmadfa (2012). "The Origins of a Global Standard for Food Quality and Safety: Codex Alimentarius Austriacus and FAO/WHO Codex Alimentarius." International Journal for Vitamin and Nutrition Research 82(3): 223-227. Wallace, C. and S. Mortimore (2013). HACCP A practical Approach, 3rd Edition. Weber, R. W. S. and D. Pitt (2001). Filamentous fungi — growth and physiology. Applied Mycology and Biotechnology. G. G. Khachatourians and D. K. Arora, Elsevier. 1: 13-54. Webster, J. and R. Weber (2007). Introduction to Fungi, Cambridge University Press. i Anexo I Tabela A 1 Contagem dos esporos da amostra 50 A, para água destilada a pH 6,5 Tabela A 2 Contagem dos esporos da amostra 50 B, para água destilada a pH 6,5 Tabela A 3 Contagem dos esporos da amostra 55 A, para água destilada a pH 6,5 Tabela A 4 Contagem dos esporos da amostra 55 B, para água destilada a pH 6,5 Tabela A 5 Contagem dos esporos da amostra 60 A, para água destilada a pH 6,5 Tabela A 6 Contagem dos esporos da amostra 60 B, para água destilada a pH 6,5 Temperatura Tempo (min) Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Área 1 139 130 60 35 81 19 51 18 50 32 Área 2 204 139 58 27 86 27 56 17 39 28 Área 3 234 155 69 31 85 28 68 21 56 40 Somatório 577 424 187 93 252 74 175 56 145 100 0 5 10 15 20 50ºC Temperatura Tempo (min) Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Área 1 72 47 24 10 34 25 21 17 33 27 Área 2 61 41 23 14 28 20 41 13 44 30 Área 3 62 38 23 11 42 17 40 19 50 32 Somatório 195 126 70 35 104 62 102 49 127 89 0 5 10 15 20 50ºC Temperatura Tempo (min) Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Área 1 78 43 35 329 13 33 968 8 Área 2 77 49 61 12 52 17 59 13 75 13 Área 3 73 37 50 16 54 21 51 15 65 8 Somatório 228 129 146 31 135 51 143 37 208 29 0 5 10 15 20 55ºC Temperatura Tempo (min) Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Área 1 75 41 69 20 71 12 62 15 58 11 Área 2 73 37 82 28 74 971 32 86 17 Área 3 71 45 95 32 76 10 85 20 67 15 Somatório 219 123 246 80 221 31 218 67 211 43 0 5 10 15 20 55ºC Temperatura Tempo (min) Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Área 1 139 130 36 19 27 13 48 11 45 6 Área 2 204 139 46 27 47 441 445 2 Área 3 234 155 57 27 45 11 53 754 3 Somatório 577 424 139 73 119 28 142 22 144 11 Tempo (min) Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Área 1 30 434 118 132 1 Área 2 47 231 019 035 0 Área 3 50 038 040 337 0 Somatório 127 6103 177 4104 1 8 10 15 20 0 2 4 5 6 60ºC Temperatura Tempo (min) Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Área 1 72 47 63 12 27 13 31 867 6 Área 2 61 41 73 18 47 443 14 65 7 Área 3 62 38 72 14 45 11 42 964 6 Somatório 195 126 208 44 119 28 116 31 196 19 Tempo (min) Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Esporos totais Esporos viáveis Área 1 56 345 552 234 0 Área 2 81 253 862 142 0 Área 3 61 151 948 359 1 Somatório 198 6149 22 162 6135 1 8 10 15 20 0 2 4 5 6 60ºC