Influencia de la radiación solar y del amonio sobre la acumulación de sustancias antioxidantes en macroalgas marinas cultivadas en un sistema de biofiltración

D/Da Juan Luis Gómez Pinchetti SECRETARIO/A DEL DEPARTAMENTO DE Biología DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA, CERTIFICA, Que el Consejo de Doctores del Departamento en sesión extraordinaria tomó el acuerdo de dar el consentimiento para su tramitación, a la tesis doctoral titulada “Influencia de la radiación solar y del amonio sobre la acumulación de sustancias antioxidantes en macroalgas marinas cultivadas en un sistema de biofiltración” presentada por el/la doctorando/a D/Da Leyre Güenaga Unzetabarrenechea y dirigida por el Dr. Juan Luis Gómez Pinchetti y el Dr. Félix López Figueroa. Y para que así conste, y a efectos de lo previsto en el Artº 73.2 del Reglamento de Estudios de Doctorado de esta Universidad, firmo la presente en Las Palmas de Gran Canaria, a 19 de Mayo de 2011 Las Palmas de Gran Canaria a 19 de Mayo de 2011 Programa de doctorado de Gestión de recursos vivos marinos y medioambiente Bienio 2001-2003. Título de la Tesis: “Influencia de la radiación solar y del amonio sobre la acumulación de sustancias antioxidantes en macroalgas marinas cultivadas en un sistema de biofiltración” Tesis Doctoral presentada por Da Leyre Güenaga Unzetabarrenechea para obtener el grado de Doctor por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Dirigida por el Dr. Juan Luis Gómez Pinchetti y el Dr. Félix López Figueroa El/la Director/a El/la Director/a El/la Doctorando/a AGRADECIMIENTOS “Los hombres no se diferencian mucho en cuanto a intelecto -decía el naturalista Charles Darwinsólo en ahínco y trabajo duro”. Este trabajo de investigación es la suma del esfuerzo de muchas personas que directa o indirectamente han participado dando ánimos, apoyándome a enfrentar los retos sin miedo, siendo críticos, pero sobre todo ayudándome a levantar tantas veces que me he caído. De manera unánime expreso mi más sincero agradecimiento por todos los consejos que con tanto cariño he recibido a lo largo de todos estos años. A todos vosotros, que habéis estado a mi lado, GRACIAS. Al Dr. Guillermo García Reina Blairsy, por abrirme las puertas del Centro de Biotecnología Marina y el apoyo logístico prestado para la realización de este trabajo. A la financiación recibida de la Fundación BBK para los inicios y del Ministerio de Educación y Ciencia a través del proyecto BIFARO, que ha colaborado en su fin. A mis directores el Dr. Juan Luis Gómez Pinchetti y el Dr. Félix López Figueroa, por lo más importante, depositar vuestra confianza en mí y creer que este proyecto podía salir adelante. Por transmitirme de manera entusiasta vuestros conocimientos y poner a mi alcance todos los medios posibles. Por ser un ejemplo de tesón y disciplina, de personas que disfrutan dedicándose a la ciencia. Nunca podré agradeceros los suficiente el crecimiento profesional y personal que ha supuesto esta etapa en mi vida. A los “Buenos días” hacia la perspectiva de un nuevo día, por parte de los pescadores y trabajadores del muelle de Taliarte. Por supuesto, gracias por adentrarme a Juan Luis, al Grupo de Algología, a los que expreso todo mi cariño, en especial a la época que llamamos ¡Aquellos Maravillosos Años! A Sonia, mi compañera de labo y apoyo incondicional. Por implicarte durante tanto tiempo con interés y esfuerzo en este trabajo. Por tu generosidad al compartir conmigo tu experiencia, dedicación y mimo hacia los cultivos de algas, por tantos momentos, ensayos diurnos y nocturnos, trabajo de campo, risas y lágrimas, por las ricas horas de playa, por tu eterna paciencia. Me has enseñado que “Puedes llegar a cualquier parte, siempre que andes lo suficiente”- Lewis Carroll. Agradezco de corazón tus puntos de vista siempre tan enriquecedores y correcciones en la fase de elaboración del manuscrito. Por inculcarme el sentido de las cosas bien hechas. A Flo guapo, por los brincos de alegría contagiosa. Por tantos ratos de Skype desde tu nueva etapa. Gracias Amiga. Eres maravillosa. Estoy muy agradecida por los consejos, conocimiento, ánimos y cariño recibidos de Antera todos estos años. A Raquel, por pintar los días de color. A Fernando, por ayudarme con su eterna sonrisa a escapar de tantos obstáculos que surgían con los equipos y en los invernaderos. A Elena, siempre dispuesta a escucharme, por todas tus atenciones expresadas siempre desde el cariño. A Emilio, por involucrarte en la taxonomía de este trabajo, por las imágenes. Gracias a Mayalen, Amiga, tu estancia en el centro supuso el empuje definitivo, por tu asesoramiento en los protocolos y por compartir conmigo tu amplia experiencia en el campo de los antioxidantes. Por las cenas gastronómicas que preparaba Nacho y tertulias al son de buena música. A Yolanda, por tu disponibilidad, por esos desayunos tan ricos. Ana, gracias por contagiarme en mis finales tu frescura y entusiasmo de los comienzos. Eres el gran relevo. Nere Eneko, beti laguntza emateko prest, eskerrik asko. ¡Realmente pasamos instantes entrañables e inolvidables en Algología! Gracias a la hospitalidad con la que he sido recibida en la Universidad de Málaga de la mano de Félix y la aportación tan importante que han supuesto a este trabajo, los experimentos desarrollados durante mis estancias en el laboratorio CIMES y en los laboratorios del SCAI en colaboración con el Grupo de Fotobiología. Recibiendo el conocimiento y experiencia con tanta dedicación del Dr. Pepe Aguilera, de la Dra. Natalie Korbee y del Dr. Roberto Abdala. Gracias por vuestros numerosos consejos y ánimos. Agradezco al Dr. Luisjo Alemán del Departamento de Química y su equipo el asesoramiento metodológico e interpretativo en los análisis infrarrojos. A Paqui. Cristina, Celia, Maria Eugenia, Rosa y Bea gracias por guiarme en vuestros laboratorios, facilitarme con tanto cariño las estancias y las comidas al sol de Málaga. Gracias al Dr. Erwan Ar Gall de la Universidad de Brest por su interés y colaboración en la identificación de los fenoles. En la última etapa, en el Departamento de Biología de la facultad de Ciencias del Mar, he tenido la gran suerte de recibir el apoyo, asesoramiento y buenos ratos brindados por Andrea, Miguel, Edna, Javi, Isa, Pep, Fede, Minerva. Claire, gracias por estar ahí. Gracias a Rafa y Pili, Pascual, Nandi y Javier, Carmen Mari, Jóse y Pedro. A Carmen. De corazón, gracias a todos por vuestra amabilidad y por hacerme sentir en casa. Che, Dra. Galmozzi, por tu amistad, tus balances, esos mails y sms cargados de sabios consejos siempre en el momento justo. Pero sobre todo, por no marcharte nunca de mi lado. Belinda, mi amiga del alma, que haría yo sin ti! “Cuando tu corazón está centrado en un punto, entonces nada es imposible para ti”- Buda. Gracias por mantener la calma y recordarme la parte positiva en el camino. Antonio, por ser tan buen amigo. Urda y Gemma, gracias amigos por rescatarme una y otra vez, por estar conmigo en todos los “marrones” como dice Urda. A Cori, por tu amistad, por tu arranque y apoyo constante. “El mundo entero se aparta cuando ve pasar a alguien que sabe a donde va” decía el autor de “El principito”, Antoine de Saint-Exupéry. Así eres tú. Boni, mil gracias por tu aportación en el diseño de la portada. A Belén, por ser como eres. A mis amigas de siempre, Myriam, Edurne, Maria, Aina, Rebeca, Isabella, Esther, Maya, mujeres fuertes que no se rinden ante nada, emprendedoras de grandes aventuras, flexibles, cariñosas, pero por encima de todo Amigas. A Nana, mi madre canaria, por tantas conversaciones a la orilla del mar. Por la fuerza, ejemplo de lucha y coraje que representas para mí. A Jacinto, por ponerle la mejor banda sonora a todos estos momentos vividos, por ser mi hombro y apoyo en momentos de flaqueza, pero sobre todo por transmitirme la virtud de la nobleza y lealtad por encima de cualquier circunstancia. A toda mi familia, aume eta atxitxe siempre en mi corazón, a mi amama, por tu dulzura, por ser el mejor ejemplo a tus 100 años, a mis tíos y primos, a Miri, mi hermana pequeña. A Carlos, Maria y la Niña, mi familia de Las Palmas. A Voyou de mis amores, “Ser como tú, surcando el infinito, tigre de luz”- Soseki. A mis padres, las personas más importantes de mi vida, por guiarme en el buen camino y cuidar de mí siempre con tanto cariño, por darme la oportunidad de recibir una buena educación, por inculcarme el sentido del deber y la virtud de la constancia por ser el mejor cobijo ante mi fragilidad por apoyar esta elección siempre, “Serás libre, no cuando tus días no tengan preocupaciones, ni tus noches penas o necesidades, sino cuando todo ello aprisione tu vida y sin embargo tú logres sobrevolar desnuda y sin ataduras”. INDICE Lista de abreviaturas y símbolos i Resumen ii Introducción 1.1. Consideraciones generales 1 1.2. Las macroalgas como recurso para la obtención de sustancias funcionales y bioactivas 5 1.3. Función de los antioxidantes en las algas 13 1.3.1. Estrés oxidativo y defensas antioxidantes 13 1.3.2. Metodología para determinar actividad antioxidante 26 1.4. Cultivo de macroalgas en sistemas intensivos. Biofiltración de aguas residuales 27 1.4.1. Generalidades de los sistemas de cultivo de macroalgas 27 1.4.2. Acuicultura integrada: sistemas de cultivo multitróficos (IMTA) 28 1.4.3. Valoración y aplicaciones de la biomasa obtenida en sistemas IMTA 35 1.5. Bibliografía 37 Capítulo I. Actividad antioxidante en macroalgas recolectadas en el sistema intermareal 1.1.Introducción 57 1.2. Objetivos 61 1.3. Material y métodos 62 1.3.1. Material biológico 62 1.3.1.1. Recolección de las especies 62 1.3.1.2. Descripción de las especies 64 1.3.2. Preparación de los extractos 67 1.3.3. Determinación de la actividad antioxidante 69 1.3.3.1. Estudio de la actividad antirradical (Ensayo DPPH) 69 1.3.3.2. Poder reductor 70 1.3.4. Determinación de compuestos fenólicos totales 71 1.3.5. Extracción y cuantificación de pigmentos 72 1.3.5.1. Obtención de los extractos 72 1.3.5.2. Determinación de pigmentos liposolubles 73 1.3.5.3. Determinación de pigmentos hidrosolubles 74 1.3.6. Determinación de la relación peso seco/peso fresco 74 1.3.7. Análisis de carbono y nitrógeno 75 1.3.8. Análisis estadístico 75 1.4. Resultados 75 1.4.1. Determinación de la actividad antioxidante 75 1.4.1.1. Ensayo DPPH 75 1.4.1.2. Poder reductor 79 1.4.2. Estudio de los componentes antioxidantes de las algas 80 1.4.2.1. Determinación de compuestos fenólicos totales 80 1.4.2.2. Cuantificación de pigmentos 81 1.4.2.2.1.Pigmentos liposolubles: clorofila a, b, carotenoides 81 1.4.2.2.2. Pigmentos hidrosolubles: ficoeritrina 82 1.4.3.Correlaciones entre la actividad antioxidante detectada y las sustancias cuantificadas 82 1.4.5. Relación carbono y nitrógeno 85 1.5. Discusión 86 1.6. Bibliografía 94 Capítulo II. Actividad antioxidante en macroalgas cultivadas en un sistema de biofiltración con alta disponibilidad de nitrógeno 2.1. Introducción 105 2.2. Objetivos 109 2.3. Material y métodos 110 2.3.1. Material biológico 110 2.3.1.1. Especies cultivadas 110 2.3.2. Condiciones de cultivo 110 2.3.2.1. Sistema de biofiltración 110 2.3.2.2. Sistemas de cultivo de macroalgas y diseño experimental 112 2.3.2.3. Biofiltración de N-amonio 114 2.3.2.3.1. Análisis de amonio 114 2.3.2.3.2. Tasas de biofiltración y velocidad de absorción de amonio 115 2.3.3. Determinación de la actividad antioxidante (Capitulo I) 2.3.3.1. Estudio de la actividad antirradical (Ensayo DPPH) 2.3.3.2. Poder reductor 2.3.4. Determinación de compuestos fenólicos totales (Capitulo I) 2.3.5. Extracción y cuantificación de pigmentos 2.3.5.1. Obtención de los extractos 2.3.5.2. Determinación de pigmentos liposolubles 2.3.5.3. Determinación de pigmentos hidrosolubles 2.3.6. Análisis de carbono y nitrógeno 2.3.7. Análisis estadístico 116 2.4. Resultados 116 2.4.1. Respuesta de las especies ensayadas a las condiciones de cultivo 116 2.4.2. Estudio de biofiltración de las especies 118 2.4.3. Determinación de la actividad antioxidante 120 2.4.3.1. Ensayo DPPH 120 2.4.3.2. Poder reductor 123 2.4.4. Estudio de los componentes antioxidantes de las algas 124 2.4.4.1. Determinación de compuestos fenólicos totales 124 2.4.4.2. Cuantificación de pigmentos 125 2.4.4.2.1.Pigmentos liposolubles: Clorofila a, b y carotenoides 125 2.4.4.2.2. Pigmentos hidrosolubles: ficoeritrina 126 2.4.5. Correlaciones entre la actividad antioxidante detectada y las sustancias cuantificadas 127 2.4.6. Relación carbono y nitrógeno 129 2.5. Discusión 131 2.6. Bibliografía 137 Capítulo III. Cultivo intensivo de Halopithys incurva en sistemas de biofiltración. Efecto del aporte de nutrientes y la irradiancia y calidad espectral sobre la actividad antioxidante 3.1. Introducción 147 3.2. Objetivos 153 3.3. Material y métodos 155 3.3.1. Material biológico 155 3.3.2. Sistema de cultivo y cosechado 155 3.3.3. Diseños experimentales para el cultivo de Halopithys incurva 156 3.3.4. Determinación de la producción y la tasa de crecimiento 160 3.3.5. Biofiltración de amonio y fosfato 160 3.3.6. Medidas de radiación y otros parámetros de interés 161 3.3.7. Determinación del rendimiento cuántico óptimo (Fv/Fm) 161 3.3.8. Determinación del contenido en ficoeritrina 161 3.3.9. Determinación del contenido de carbono y nitrógeno interno 164 3.3.10. Evaluación de la actividad antioxidante 165 3.3.10.1. Estudio de la actividad antirradical (Ensayo DPPH) 3.3.10.2. Ensayo ferrilmioglobina/ ABTS 165 3.3.10.3. Ensayo de decoloración de beta-caroteno 166 3.3.10.4. Ensayo de secuestro de radical superóxido (O-2 ·) 167 3.3.11. Análisis estadístico 3.4. Resultados 168 3.3.1. Cultivo de Halopithys incurva en tanques SCT con adición de N-amonio por pulsos 168 3.3.2. Cultivo de Halopithys incurva en tanques distribuídos en cascada 169 3.3.3. Co-cultivo de Halopithys incurva y Jania adhaerens 172 3.3.4. Evaluación de la actividad antioxidante 176 3.5. Discusión 179 3.6. Bibliografía 192 Capítulo IV. Caracterización de la actividad antioxidante en Halopithys incurva: polifenoles, micosporinas y polisacáridos 4.1. Introducción 203 4.2. Objetivos 209 4.3. Material y métodos 210 4.3.1. Material biológico y diseño experimental 210 4.3.2. Preparación de los extractos para el estudio de fenoles 211 4.3.3. Extracción, fraccionamiento y purificación de polisacáridos ácidos 212 4.3.4. Extracción y análisis de MAAs 214 4.3.5. Cuantificación de polifenoles 4.3.6.Caracterización de polifenoles 215 4.3.7.Caracterización de los polisacáridos 216 4.3.8. Análisis estadístico 217 4.4. Resultados 218 4.4.1. Cuantificación de fenoles totales 218 4.4.2. Identificación y caracterización de polifenoles 218 4.4.3. Contenido en polisacáridos ácidos 222 4.4.4. Análisis Infrarrojo de polisacáridos ácidos 224 4.4.5. Composición de aminoácidos tipo micosporina (MAAs) 227 4.4.6. Análisis de correlación 230 4.5. Discusión 231 4.6. Bibliografía 240 Discusión general 243 Conclusiones 255 LISTA DE SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS . Indica decimal en sustitución a “,” IMTA: Sistemas de cultivos mutitróficos ABTS•+: Radical catión del ácido 2,2’- azinobis-3-etilbenzotiazolin sulfónico MAAs: Aminoácidos tipo micosporina ABTS: Ácido 2, 2’-diazino-di-(3etilbenzotiazolín) sulfónico METOH Extracto metanólico ADN: Ácido desoxirribonucleico N: Nitrógeno AMTI: Acuicultura Multi-Trófica Integrada NH4+: Amonio ANOVA: Análisis de la varianza NADH: Nicotinamida adenina dinucleótido (forma reducida) ARN: Ácido ribonucleico NADP+: Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (forma oxidada) ATP: Adenosina trifosfato NBT Azul de nitro tetrazolio BHA: Butil hidroxianisol NO•: Radical óxido nítrico BHT: Butil hidroxitolueno NO2•: Radical dióxido de nitrógeno C: Carbono NUE: Eficiencia de eliminación de amonio CAT: Catalasa NUR: Tasa de asimilación de amonio C:N : Relación entre el contenido interno de carbono y nitrógeno O2-: Superóxido CSIC Consejo superior de investigaciones científicas 1O2: Oxígeno singlete Cla: Clorofila a -OH: Grupo hidroxilo Clb: Clorofila b PSI: Fotosistema I DPPH•: Radical 1,1-difenil-2-picril hidrazilo PSII: Fotosistema II DPPH: 1,1-difenil-2-picril hidrazilo PA: Polisacáridos ácidos E-320: Butil hidroxianisol PAR: Radiación fotosintéticamente activa E-321: Butil hidroxitolueno PF: Peso fresco EC50: Concentración inhibitoria del 50 % PS: Peso seco EDTA: Ácido etilendiaminopentaácetico PSs Polisacáridos sulfatados EROs: Especies reactivas del oxígeno PVPP: Polivinilpirrolidona ETOH50 Extracto hidroalcohólico RL: Radicales libres FAO: Food and Agriculture Organization RNM Resonancia nuclear magnética FC: Folin Ciocalteau RO•: Radical alcoxilo FT-IR: Fourier transform infrared spectroscopy ROO•: Radical peroxilo Fv/Fm: Rendimiento cuántico óptimo ROOH: Hidroperóxido GPX: Glutatión peroxidase SIDA: Sindrome de inmunodeficiencia adquirida GR: Glutatión reductasa SD: Desviación típica GSH: Glutatión reducido SOD: Superóxido dismutasa GSSG: Glutatión oxidado VCEAC: Actividad antioxidante en equivalentes de ácido ascórbico GTP: Transaminasa glutámico pirúvica VPEAC: Actividad antioxidante en equivalentes de pirogalol H +: Protón UI: Unidades internacionales H2O2: Peróxido de hidrógeno UV: Ultravioleta HOO•: Radical hidroperoxilo UVA: Ultravioleta A HPLC: High Performance Liquid Cromatography UVB: Ultravioleta B I+D: Investigación y desarrollo UV-VIS: Ultravioleta -Visible RESUMEN/ SUMMARY RESUMEN El presente trabajo aborda el estudio de la acumulación de sustancias antioxidantes en macroalgas tanto recolectadas del medio natural como cultivadas, de forma intensiva, en un sistema de biofiltración de efluentes provenientes del cultivo de peces (IMTA). Se analizaron los efectos de las condiciones de cultivo, principalmente relacionadas con la radiación solar y el aporte de nutrientes, sobre el crecimiento y la calidad de la biomasa de las diferentes especies producidas. La biomasa obtenida de las diferentes fuentes y condiciones de cultivo fue utilizada en la preparación y caracterización de extractos para la evaluación de la actividad antioxidante mediante el uso de modelos experimentales in vitro. Los experimentos iniciales (Capítulos I y II), fueron realizados con especies de macroalgas de las Divisiones Chlorophyta, Rhodophyta y Phaeophyta, recolectadas en la zona intermareal de la costa de la isla de Gran Canaria (Islas Canarias, España) y cultivadas bajo condiciones de invernadero y alto aporte de N-amonio. Los extractos metanólicos (METOH) e hidroalcohólicos (ETOH50) obtenidos presentaban la habilidad de donar protones, característica de los compuestos antioxidantes, tal y como fue determinado por los ensayos del DPPH y del poder reductor. Las mayores actividades, superiores al 90% de barrido de radical libre, se detectaron en el alga roja Halopithys incurva y en las pardas Fucus spiralis y Cystoseira abies-marina. Los valores obtenidos por el método del poder reductor, indicaron la mayor actividad en H. incurva, con una actividad equivalente a 53.15 µg AA mg-1. Al expresar el % de barrido de radicales libres como EC50 (índice de oxidación), C. abies-marina (en ambos tipos de extractos) y el alga verde Caulerpa racemosa (en extractos ETOH50) exhibieron las mayores actividades, con EC50 de 1.97±0.03, 2.03±0.01 y 1.88±0.03 mg·ml -1 respectivamente. Otras especies de algas pardas, F. spiralis y rojas, H. incurva y Laurencia majuscula, exhibieron valores de EC50 cercanos a los anteriores (2.21±0.02; 2.47±0.01 y 2.48±0.01 mg·ml-1, respectivamente). Bajo las condiciones de cultivo ensayadas con este primer grupo de especies, durante un periodo experimental de un mes con aporte continuo de N-amonio, se observaron variaciones en los valores de acumulación de sustancias tanto de naturaleza liposoluble (clorofila a y carotenoides) e hidrosoluble (polifenoles y ficoeritrina) que fueron relacionadas directamente con la actividad antioxidante de los extractos, especialmente los polifenoles. La relación C:N disminuyó en algas 1.1. CONSIDERACIONES GENERALES El manejo sustentable de los recursos naturales junto con la necesidad de obtención de nuevas fuentes de materia prima ha despertado en la actualidad un creciente interés por la optimización y mejora de las técnicas de cultivo de los vegetales marinos, ya que éstos constituyen una fuente importante de recursos, no sólo por su utilización directa, sino por la cantidad de productos derivados que se obtienen a partir de ellos. Además, el cultivo de algas ofrece servicios medioambientales como es el caso de la depuración y biofiltración de efluentes. El cultivo de macroalgas tiene varios siglos de antigüedad en las culturas orientales (Tseng y Fei, 1987), pero la mayoría de las especies de macroalgas de interés industrial han sido explotadas fundamentalmente a partir de sus poblaciones naturales. Ha sido en los últimos 50 años cuando se han establecido las bases científicas para el desarrollo de la Agronomía Marina, tanto en Oriente como en otros lugares del mundo (Santelices, 1989). Más recientemente se han desarrollado las bases de la Acuicultura Multi-trófica Integrada (AMTI) que consiste en la incorporación de especies de diferentes niveles tróficos en el mismo sistema de cultivo. Estos sistemas han sido propuestos como alternativa para prácticas acuícolas respetuosas con el medioambiente buscando alcanzar una aproximación a un ecosistema en equilibrio reduciendo así los impactos negativos sobre el medio costero (Chopin et al., 2001). De esta forma, se logra la conversión de nutrientes particulados y solubles que se originan a partir del metabolismo de los organismos alimentados y sus desechos, en biomasa de organismos biofiltradores, reduciendo así los procesos de eutrofización a los que pueda dar lugar el vertido de este tipo de residuos (FAO, 2008). En este tipo de sistemas las macroalgas juegan un papel importante, actuando como auténticas “trampas” de nutrientes disueltos en los sistemas de biofiltración, donde además se genera biomasa de interés a bajo coste con la posibilidad de modificar las características de las especies tanto desde un punto de vista morfológico como fitoquimíco mediante su cultivo controlado. La selección de la especie de macroalga a utilizar como biofiltro depende de dos aspectos fundamentales: el interés comercial de su biomasa o de los productos derivados de ella y su capacidad fisiológica para crecer en las condiciones de cultivo con niveles altos de nutrientes, especialmente amonio (Buschmann et al., 2001; Chopin et al., 2001). El objetivo del estudio que se plantea es doble, por un lado se busca identificar macroalgas como fuente de moléculas antioxidantes y, por otro el responder con eficiencia a los requerimientos que exige el cultivo en base a las ventajas que ofrece la Introducción acuicultura multi-trófica integrada generando así biomasa de alto valor añadido a bajo coste. Esto permitirá desarrollar futuros estudios para responder a la demanda actual de manera que la obtención de los productos derivados de las algas no se realice con un alto coste ambiental sino al contrario, reduciendo el impacto ambiental al biofiltrar los nutrientes vertidos en el medio costero por diversas actividades humanas (acuicultura, plantas depuradoras de agua y actividades ganaderas entre otras). Hace algunos años, el término antioxidante se asociaba automáticamente con compuestos tales como la vitamina C (ácido ascórbico), la vitamina E (tocoferoles α, β, δ y γ) y eventualmente con la vitamina A y su precursor de origen vegetal, el β-caroteno (Auroma, 1998; Wang y Quinn, 1999; Young y Lowe, 2001). Sin embargo, en los últimos tiempos este concepto se ha extendido a una serie de sustancias que se encuentran dentro de un grupo fitoquímicamente conocido como los “polifenoles”. En realidad, hace mucho tiempo que se reconoce en el entorno científico a estos “nuevos” antioxidantes como responsables en gran medida de una enorme variedad de propiedades biológicas atribuidas desde siempre a frutas, verduras y plantas, o productos obtenidos a partir de las mismas. Entre estas propiedades destacan la capacidad antioxidante y su posible efecto en la prevención de diferentes enfermedades crónicas que incluyen en su origen el estrés oxidativo (Rice-Evans, 2001). El mercado de los antioxidantes funcionales aumenta año tras año y según un informe reciente,la presión de los consumidores y la legislación revisada están causando un cambio en las tendencias a su utilización. Desde el año 2000 al 2009, el mercado total de antioxidantes en Europa creció apenas un 1.7%, mientras que los antioxidantes naturales han experimentado una tasa de crecimiento anual del 35% (http:// www.frost.com). Para que este crecimiento sea sostenible, es muy importante desarrollar herramientas que permitan distinguir los productos que son verdaderamente efectivos como antioxidantes, es decir que estén bio-disponibles y cuyo mecanismo de acción farmacológico esté claramente dilucidado. Por ello, existe un interés por la búsqueda de especies vegetales cuyo alto contenido en antioxidantes (o fito-complejo antioxidante) signifique un aporte en el tratamiento y prevención de patologías ligadas a la oxidación de moléculas biológicas. Esto último está avalado por la gran cantidad de información generada por los estudios en el vino, el té verde, y diferentes frutas ricas en antocianos y carotenoides principalmente (Frankel et al., 1993; Halliwell, 1996; Wang et al.,1997; Rietveld y Wiseman, 2003). Los avances tanto en la investigación básica como en la investigación clínica, han conducido a una comprensión más profunda de los mecanismos producidos por la toxicidad del oxígeno y han permitido Introducción entender que ésta constituye un problema de una envergadura muy superior a la que se le atribuía hace unos años. Esto se debe al enorme abanico de actividades demostradas que se atribuyen a las propiedades antioxidantes y a su capacidad de captar radicales libres (Heim et al., 2002). Recientemente existe una tendencia dirigida al consumo de productos de origen natural frente a los obtenidos de forma sintética. Por este motivo interesa encontrar fuentes naturales de antioxidantes para ser usados como aditivos alimentarios y cosméticos, que puedan reemplazar total o parcialmente a alternativas sintéticas como el BHT (butilhidroxitolueno), también conocido como E-321, y BHA (butilhidroxianisol) o E-320 (Branen et al., 1975; Ito et al., 1983). El empleo de antióxidantes sintéticos con fines terapeúticos ha sido cuestionada por su comprobada genotoxicidad y actividad carcinogénica (Gordon, 1996). Esto ha llevado a que muchos países de la Unión Europea hayan decidido reemplazarlos por productos más inocuos (Yen et al.1998; Wichi et al., 1998), aunque éstos tendrían que llegar a ser tan eficaces como los citados y con costes bajos. En este contexto, ha ganado interés la búsqueda y utilización de compuestos antioxidantes de origen natural, ya que se consideran más seguros que los sintéticos pues pueden poseer implícitamente efectos beneficiosos para la salud. Hay así una clara tendencia mundial actual sobre el uso de fuentes naturales para la obtención de fármacos efectivos que prevengan patologías ligadas a la oxidación de moléculas biológicas (Frankel et al., 1993; Raskin et al., 2002). Los compuestos fenólicos constituyen uno de los grupos de micronutrientes presentes en el Reino Vegetal, siendo parte importante de la dieta tanto humana como animal. El término genérico de polifenoles incluye distintos grupos en relación a su estructura que incluye flavonoides y taninos hidrolizables tales como glucósidos del ácido gálico (Manach, 2004). Constituyen un amplio grupo de sustancias químicas, considerados metabolitos secundarios de las plantas, con diferentes estructuras químicas y actividad, y que engloba más de 8.000 compuestos distintos. Sus principales funciones en las células vegetales son: actuar como metabolitos esenciales para el crecimiento y la reproducción, y como agentes protectores frente a la acción de patógenos, siendo excretados como mecanismo de defensa (Zern y Fernández, 2005). Estos compuestos tradicionalmente han sido considerados como anti-nutrientes, debido al efecto adverso de uno de sus componentes mayoritarios, los taninos, sobre la digestibilidad de las proteínas. Sin embargo, los aspectos nutricionales de los polifenoles también son motivo de investigación en la actualidad debido a sus propiedades antioxidantes y sus posibles implicaciones beneficiosas para la salud humana, en el tratamiento y la prevención del cáncer y las enfermedades Introducción cardiovasculares. Geleijnse y Hollman, (2008) destacan el aporte de las flavononas a los efectos beneficiosos de los polifenoles. Estos investigadores estimaron que mientras una dieta normalmente saludable aportaría unos 100 mg/día de los antioxidantes “tradicionales”, es decir beta-caroteno, vitamina C y E, se podría ingerir alrededor de 1 g/día de flavonoides totales. El consumo de otra familia de antioxidantes, los carotenoides, está ligado sustancialmente a la disminución de la incidencia de cáncer (Kopas–Lane et al., 1995). Además representan una fuente de provitamina A, no son tóxicos y presentan actividad antioxidante en la propia célula, participando en la desactivación de los radicales libres producidos en el metabolismo celular (Rouseff et al., 1994). En España se comercializa desde abril del 2009, Revidox, un complemento alimenticio de última generación desarrollado por Actafarma en colaboración con el CSIC, compuesto por un concentrado de activos antioxidantes extraídos de la uva y de la granada y que presenta activadores de las sirtuínas, comúnmente conocidas como “gen de la longevidad”. Dentro de las fuentes naturales, las algas constituyen opciones para la búsqueda de nuevos productos bioactivos, especialmente antioxidantes, lo que se justifica por diversas razones. Un estudio reciente realizado por investigadores franceses usando una serie de ensayos de antioxidantes que incluyen el DPPH, el poder reductor y el método del β-caroteno sobre extractos de 24 algas encontraron una "relación significativa entre la capacidad antioxidante y el contenido total en fenoles totales, lo que indica que son los compuestos fenólicos los principales contribuyentes de las propiedades antioxidantes de estos vegetales marinos” (Zubia et al., 2009). Desde un punto de vista más amplio se ha demostrado que las algas son fuente de compuestos bioactivos que tienen un carácter renovable y son fácilmente obtenibles. A esto se suma la posibilidad de su cultivo a bajo coste dentro de un sistema de policultivo integrado (Gómez Pinchetti et al., 2002). A su vez, son considerados en general poco tóxicos (Grabley y Thiericke, 1999). Su alto consumo en los países asiáticos se ha asociado a una variedad de efectos beneficiosos sobre la salud, por ejemplo la reducción de la incidencia de algunos tipos de cáncer (Funahashi et al., 1999, Hiqashi et al., 1999). Ello por tanto sugiere que las algas contienen compuestos biológicamente activos capaces de modular diferentes funciones fisiológicas del organismo. 1.2. LAS MACROALGAS COMO RECURSO PARA LA OBTENCIÓN DE SUSTANCIAS FUNCIONALES Y BIOACTIVAS Introducción Las algas en general, y las macroalgas en particular, son consideradas una importante fuente de sustancias con potencial bioactivo. Entre la gran diversidad de organismos marinos, se consideran una de las mayores fuentes de productos naturales biológicamente activos, ya sean compuestos extraídos del tejido o metabolitos secundarios de distinta naturaleza biológica producidos por los mismos (Fenical, 1982). En Occidente, en contraste con lo que sucede en los países asiáticos, el uso de las algas aún es reducido, aunque su interés va en aumento debido a las numerosas investigaciones que evidencian sus propiedades para la prevención de diversas patologías, usos terapéuticos, aplicaciones en el campo de la biomedicina, su composición de alto valor nutricional así como la eficiencia del uso de sus extractos en la agricultura (Guiry y Blunden, 1991). Otro campo de interés actual es el de los productos dermocosméticos y relacionados (Radmer, 1996). La búsqueda de nuevos compuestos químicos es de importancia estratégica para estas industrias. Gracias al conocimiento de la diversidad marina, de las peculiaridades que lo caracterizan, así como a los avances en tecnología, en la actualidad, una parte importante de la investigación se desvía y centra en los recursos del mar (Jensen, 1993; Norton et al.; 1996). Concretamente, en los últimos años se han estudiado nuevas fuentes de sustancias naturales, entre ellas organismos marinos, con aproximadamente 300 patentes provenientes de productos naturales marinos entre 1969 y 1999 (Fusetani, 2000). En este sentido, numerosas revisiones señalan a las macroalgas como uno de los principales productores de este tipo de compuestos (Bhakuni y Silva, 1974; Stein y Borden, 1984; Glombitza y Koch, 1989; Hay, 1996; González y Silva, 2001). Los estudios sobre la química de productos naturales marinos han sido dirigidos principalmente al descubrimiento de nuevas sustancias con valor farmacéutico (Figura I.1), bioquímico, bactericida, antiviral, fungicida, antitumoral, antioxidante, antiinflamatorio e insecticida (Blunden y Carabot, 1995). A pesar de que el número de especies de macroalgas estudiadas únicamente alcanza alrededor de un 2% del total de las conocidas, en la actualidad los compuestos químicos caracterizados son aproximadamente 2000, pero solamente en algunos de ellos se ha podido establecer claramente el mecanismo de acción (González y Silva, 2001). Introducción Figura I.1. Diversas aplicaciones de las sustancias extraídas de macroalgas. La producción de metabolitos secundarios de especial interés por parte de los organismos marinos es fruto de una serie de adaptaciones evolutivas que la presión selectiva ha obligado a adquirir en respuesta a funciones tan importantes como la reproducción o los mecanismos de defensa y protección contra los herbívoros, dando lugar a productos con importantes propiedades biológicas (Hay et al., 1987a, 1987b; Paul et al., 1987; Pereira et al., 1994). Estos metabolitos también están asociados a la disminución de epífitos, inhibiendo el desarrollo de los organismos competidores y patógenos microbianos (Hay, 1996; Vlachos et al., 1997). Además, la composición de los metabolitos secundarios marinos a diferencia de los vegetales terrestres puede ser significativamente modificada en virtud de la disponibilidad de los elementos en agua de mar tanto en el medio marino como en cultivo. Esta diversidad metabólica, que responde a las necesidades especiales de los hábitats marinos, convierte a las algas en una fuente natural de producción de metabolitos secundarios con características estructurales y propiedades ausentes en las formas terrestres. Por tanto, no es de extrañar que produzcan sustancias de diversas características en abundancia, con Introducción mayor o menor eficiencia debido a los mecanismos de adaptación o aclimatación de las macroalgas para utilizar los nutrientes disponibles en el medio (Kanno et al., 1990). Los trabajos publicados al respecto datan en su mayoría de las tres últimas décadas (Tabla I.1), los resultados publicados permiten afirmar que especies pertenecientes a los Phylum Chlorophyta, Rhodophyta y Phaeophyta, son productoras de sustancias bioactivas. Además muestran que la concentración y actividad de estas sustancias (antibióticas, antimicrobianas, antioxidantes, antitumorales y antivirales entre otras) están directamente influenciadas por la localización geográfica (Hay y Fenical, 1988; Van Alstyne, 1988; Steinberg y Paul, 1990 ; Steinberg y van Altena 1992) y otros factores medioambientales como la salinidad ( Ragan y Glombitza, 1986), disponibilidad de nutrientes (Ilvessalo y Tuomi, 1989), estacionalidad (Ragan y Jensen,1977; Ragan y Glombitza, 1986) y factores intrínsecos de la planta como el tamaño (Denton et al. 1990), la edad (Pedersen,1984) y el tipo de tejido (Steinberg, 1984; Steinberg, 1986; Tugwell y Branch, 1989). La actividad antibacterial puede ser considerada como un indicador de la capacidad del alga marina para sintetizar compuestos bioactivos de interés terapéutico, aunque esta actividad puede depender tanto de la especie como de la extracción eficiente de los diferentes compuestos bioactivos (González et al. 2001, LimaFilho et al., 2002). Las especies pertenecientes al phylum Chlorophyta constituyen un gran grupo de macroalgas de interés farmacológico. Productos provenientes de algunas especies han demostrado propiedades antiinflamatorias o actividad frente al virus del SIDA. Extractos de distinta polaridad de especies de Ulva, Enteromorpha y Codium han sido descritos como antimicrobianos (Ballantine et al., 1987; Febles., 2006). Otra especie que presentó actividad sobre Staphyloccocus. aureus fue Caulerpa spp. (Freile et al., 2001), siendo el caulerpín y la caulerpicina los compuestos responsables de dicha actividad sobre las bacterias Gram (+). A partir de Codium pungniformis se purificaron polisacáridos con propiedades anticoagulantes, determinándose que ejercen su acción a través de la inhibición de la trombina y la potenciación de antitrombina III. Derivados glicosilados de esteroles obtenidos de Ulva lactuca han evidenciado actividad antiinflamatoria en estudios in vivo, aunque resta determinar el/los mecanismos de acción para tal efecto. Caulerpenina es un compuesto de naturaleza sesquiterpénica que ha sido aislado de Caulerpa taxifolia que presenta propiedades antitumorales debidas a través de la inhibición del ensamblado del microtúbulo y agregación de la tubulina, demostrando potencialidad como agente multifuncional ya que interactúa con la síntesis de ADN y con los mecanismos de transducción de las señales. También algunas especies de algas verdes sintetizan derivados fenólicos halogenados que han evidenciado Introducción propiedades antioxidantes. A partir de Ulva lactuca se han aislado bromofenoles y derivados, y se ha determinado actividad bromoperoxidasa. Estudios de otras propiedades biológicas han demostrado que los extractos de Enteromorpha inhiben la respuesta a la IgE, por lo que se proponen como potencialmente útiles para el tratamiento de enfermedades alérgicas (Venkata Raman et al., 2004). Las algas rojas sobresalen como productoras de metabolitos halogenados que pertenecen a un gran número de clases químicas como, cetonas simples, bromofenoles, acetogeninas y terpenos (Fenical, 1975). Este grupo de macroalgas se caracteriza como productora de polisacáridos de extensa aplicación industrial (carragenanos, agaranos), como gelificantes, espesantes y estabilizantes. Los polisacáridos mencionados (y otros como los glucanos y xilanos) han demostrado propiedades farmacológicas interesantes, como son: actividades anticoagulante, antiviral, antibacteriana y antioxidante (Chattopadhay et al., 2007). También se ha demostrado que los carragenanos y otros polisacáridos sulfatados bloquean las infecciones por el virus del SIDA por distintos mecanismos, efectuándose estudios para ser utilizados por ejemplo en productos de uso vaginal (Pistorius et al., 2004). A partir de especies de algas rojas se han aislado otros metabolitos de distinta naturaleza química con actividad biológica, que los transforma en compuestos potencialmente utilizables. Caben destacar los aminoácidos tipo micosporina, péptidos y proteínas esteroides, terpenos, lípidos y fenoles. Algunos grupos químicos mencionados son importantes porque actúan como captadores de radicales libres (base de la actividad antioxidante) previniendo a las células y tejidos de los efectos negativos provocados por la radiación UV. Otros poseen actividades antiinflamatoria, antibacteriana, antitumoral, antialérgica, inmunomoduladora o antiviral entre otras. En el género Gigartina, se identificó un potente inhibidor de la DNA polimerasa y de la HIV transcriptasa reversa tipo 1 (Carlucci et al.,1997). Estudios efectuados con Jania rubens permitieron aislar un derivado de los diterpenos bromados con propiedades citotóxicas (Nagwa, 2004). Otro ejemplo lo constituyen la obtención de dihidrotirsiferol, un triterpeno anticancerígeno aislado de la especie Laurencia viridis (Zubia et al., 2009b). Por otra parte, los pigmentos denominados ficobiliproteínas, que desarrollan un papel importante en la fotosíntesis, poseen además propiedades antioxidantes con aplicaciones en cosmetología, medicina y en la industria alimentaria (Romay et al., 2003). En algas pardas también se han identificado gran número de sustancias de interés biológico, como son los polisacáridos de importancia diversa: los alginatos, productos gelificantes de gran importancia industrial. En los últimos años se han profundizado los estudios de los fucoidanos producidos por este grupo, ya que en Introducción estos compuestos se han detectado propiedades tales como anticoagulantes, antitrombóticas, antivirales, antitumorales, antimicrobianas (Feldman et al., 1999; Ponce et al.; 2003). Géneros como Ascophyllum, Scytosiphon, Fucus y Laminaria, son algunos ejemplos de algas pardas en las que han evidenciado propiedades anticoagulantes debido a los fucanos (Colliec et al., 1991). Los fucoidanos también han mostrado propiedades frente a los virus del Herpes y al virus del sida (Anh et al., 2002; Lee et al.; 2004). Además de los compuestos relacionados con los hidratos de carbono, también producen metabolitos de otra naturaleza. Entre ellos, florotaninos, a los que se les ha atribuído capacidad antioxidante más recientemente (Connan et al., 2006). También se han identificado fenoles halogenados; terpenos y otras sustancias con actividad antibacteriana y fucoesteroles con actividad antitumoral. Tal y como se expone, la biodiversidad de las especies de algas marinas, junto a la diversidad química encontrada en cada especie, constituye un recurso prácticamente ilimitado que puede ser utilizado de forma beneficiosa, para el desarrollo de biofármacos, antibióticos, antioxidantes, antitumorales y antivirales (TablaI.1.) Introducción Tabla I.1. Tabla resumen de las principales actividades biológicas y compuestos identificados en macroalgas pertenecientes al grupo Chlorophyta, Rhodophyta y Phaeophyta. En los casos que se muestra (-) en la casilla corresponden a sustancias no identificadas. Actividad Naturaleza del compuesto/virus inhibido Origen (phylum, especie) Referencia Antibiótica Ácido acrilíco Chlorophyta Ulva lactuca Glombitza, 1970; Hornsey y Hide, 1974 Diterpeno Chlorophyta Halimeda copiosa Fenical y Paul, 1984 Laurencienine (isoprenoide no cíclico ether) Rhodophyta Laurencia obtusa Caccamese et al., 1980 - Rhodophyta Ceramium nitens Freile et al., 2004 - Rhodophyta Asparagopsis taxiformis Ballantine et al., 1987 Chonalgina Rhodophyta Chondria littoralis Martinez Nadal et al., 1963 Florotaninos Phaeophyta Ecklonia kurome Nagayama et al., 2002 Dioctyl phthalate Phaeophyta Sargassum wightii Sastri y Rao, 1995 Sarganina Phaeophyta Sargassum natans Martinez Nadal et al., 1963 Crinitol Phaeophyta Sargassum tortile Kubo et al., 1992 Antimicrobiana Ácido acrílico Chlorophyta Ulva lactuca Glombitza, 1970; Biard et al.,1980 5’hidroxi-iso avrainvilleol Chlorophyta Caulerpa spp Ballantine et al., 1987; Rao y Parekh, 1981; Hornsey y Hide, 1974 Compuestos bromados Rhodophyta Gracilaria corticata Hornsey y Hide, 1974 Introducción El principal sistema de defensa contra los radicales libres lo constituyen las proteínas antioxidantes enzimáticas que incluyen la enzima superoxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT) y glutation peroxidasa (GPx), (Betteridge 2000; Fang et al., 2002) (Figura I.3; Tabla I.3.). La eficacia de esta triada enzimática reside en una triple acción defensiva al disminuir la producción de las especies oxigénicas e impedir la interacción de estas entre sí, para dar lugar a especies más estables de menor reactividad y evitar la peroxidación de las macromoléculas. Hay otros enzimas importantes que participan en el sistema de defensa, incluidos en las reacciones de la regeneración del Glutation (GSH), como la GHS reductasa o NADPH-quinona oxidoreductasa. La exposición a altas concentraciones de metales pesados puede ocasionar la sobreproducción de especies reactivas de oxígeno induciendo la síntesis de enzimas antioxidantes como la catalasa. Se sabe que la catalasa juega un rol importante en la reducción del estrés oxidativo catalizando la oxidación del peróxido de hidrógeno (H2O2), por lo que el incremento en la actividad de esta enzima por efecto del cobre sugiere el aumento de la producción de H2O2 y un marcado aumento de los niveles de catalasa y otras enzimas. Esto ha sido demostrado en especies de microalgas como Pavlova viridis (Valavanidis et al., 2006). El estudio de las macroalgas como antioxidantes se encuentra estrechamente ligado a su composición química y en la actualidad es un importante campo dentro de las investigaciones con productos naturales por su potencialidad como nuevas fuentes de antioxidantes naturales. En concreto, en la última década son numerosos los trabajos publicados que han puesto de manifiesto el poder antioxidante de las macroalgas, tanto rojas, pardas como verdes y sus extractos. Estos trabajos han demostrado que los extractos de algas marinas presentan actividad antioxidante a través de varios mecanismos de acción; entre estos se encuentran la capacidad atrapadora de radicales libres, la quelación de metales pro-oxidantes, los mecanismos de donación y aceptación de electrones y la capacidad de interrupción de la peroxidación lipídica (Jimenez-Escrig et al., 2001; Lim et al, 2002; Fayaz et al., 2005; Chen et al., 2006). Las algas pueden adoptar diferentes estrategias de control del estrés oxidativo relacionads con los nutrientes (cantidad y disponibilidad). Así con bajas concentraciones de N pueden utilizar ascorbato (p.e., Mastocarpus stellatus en el supralitoral), y los que tienen suficiente N, preferentemente utilizan glutatión para controlar el estrés oxidativo (p.e. Chondrus crispus) (Collen y Davison, 1999a). Estos autores consideran que la disponibilidad de nitrógeno también influye en el contenido y la actividad de diferentes enzimas antioxidantes. Collen y Davison (1999c) observaron Introducción Figura 1.3. Sistemas de enzimas antioxidantes en el interior de una célula con la formación de O2 fotosintético. Las reacciones tienen lugar dentro de los cloroplastos (la región con el fondo verde) en la porción del estroma, en el interior del lumen tilacoidal y también en la región citoplasmática. El ciclo ascorbato-glutatión se indica con un fondo amarillo. SOD, superóxido dismutasa, APX, ascorbato peroxidasa, MDA, monodehidroascorbato; MDAR, reductasa monodehidroascorbato; DHASC, dehidroascorbato; Dhar, reductasa dehidroascorbato, GSSG, el glutatión oxidado, GSH, glutatión reducido, los recursos genéticos, glutatión reductasa, PSI, fotosistema I, Fd, ferredoxina; PSII, fotosistema II, V, violaxanthin; A, anteraxanthin; Z, zeaxantina, VdEP, violaxanthin de-epoxidasa (Bonomi, 2010). que los valores en la relación glutatión:ascorbato de algas pardas del género Fucus fueron bajos en respuesta a la adaptación a una situación de limitación de N. Además se observó que el estrés oxidativo en dos especies de algas verdes (Cladophora glomerata y Enteromorpha ahlneriana) aumentó el déficit de carbono cuando fueron expuestas a luz de alta intensidad y bajas temperaturas (Choo et al., 2004). Sin embargo, estas especies respondieron de manera diferente aumentando la tolerancia (con una mayor actividad CAT y APX) en el caso de Cladophora glomerata o siendo más vulnerable a los daños en el caso de Enteromorpha ahlneriana. Esta segunda Introducción especie también mostró una mayor liberación de H2O2 al medio a bajas temperaturas, una estrategia que puede estar relacionada con la posibilidad de evitar la acción de los herbívoros o las especies epífitas (Choo et al., 2004). El efecto de la radiación UV sobre los sistemas antioxidantes en macroalgas está relacionado directamente con la actividad enzimática (Aguilera et al., 2002). Estos autores encontraron mayor actividad de las enzimas antioxidantes en algas creciendo en las zonas supray mesolitoral en comparación con las características del infralitoral. Esta respuesta indica que las algas expuestas a condiciones de estrés tienen un sistema bioquímico de defensa más eficaz. Además, las algas verdes tuvieron mayor actividad de las enzimas antioxidantes y un mayor contenido de el ácido ascórbico que las especies de algas rojas o pardas (Aguilera et al., 2002). Aparte de los mecanismos enzimáticos mencionados, la célula vegetal dispone de un conjunto de sistemas no enzimáticos que permiten regular y contrarrestar la agresión oxidativa (Tabla I.3.). Estos compuestos neutralizan los radicales libres cediendo un electrón y dando lugar a la formación de especies no reactivas. Para comprender mejor la actividad fisiológica de estos compuestos se debe tener en cuenta que la capacidad antioxidante de los extractos varía en función del grupo del compuesto estudiado y de su solubilidad en la fase acuosa o lipídica. A excepción de las sustancias purificadas, en muchos casos es difícil determinar qué compuestos son los responsables de la actividad antioxidante y en algunos casos ésta puede deberse a un sinergismo entre varios compuestos. Al analizar muchos de los trabajos publicados sobre actividad antioxidante en algas, se puede observar que en la mayoría se emplean extractos crudos. Por otra parte, en la composición química de las algas existen diferentes metabolitos que están relacionados en mayor o menor medida con sus propiedades antioxidantes. De esta manera se hace evidente, que cuando se analiza la actividad antioxidante de un extracto crudo, que pudiera ser explicada por la presencia de una o varias moléculas, a su vez pudiera existir un posible efecto cooperativo o sinérgico entre ellas. Este hecho explicaría los diferentes mecanismos antioxidantes observados para una determinada especie. Le Tutour et al. (1998) estudiaron la actividad antioxidante y pro-oxidante de varias especies de algas pardas (Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, Fucus serratus y Ascophyllum nodosum) aplicando diferentes métodos in vitro, así como su contenido en alfa-tocoferoles, afirmando que la actividad antioxidante de los extractos estudiados no se debía sólo al contenido en alfa-tocoferoles, sino principalmente a la acción sinérgica de este compuesto con metabolitos aislados de estas especies. Los compuestos identificados con efecto sinérgico más potentes fueron los pigmentos no Introducción polares, especialmente clorofila a y compuestos liposolubles. Estos resultados, sugieren el uso de los extractos crudos de estas especies sin el empleo de técnicas adicionales de purificación (Le Tutour et al.1998). Otros trabajos, a pesar de no estudiar el efecto sinérgico de los metabolitos constituyentes de las algas, explican las propiedades antioxidantes por la presencia de varias moléculas en conjunto (Santoso et al., 2004). Wang et al. (2008) atribuyen la actividad antioxidante de Laminaria japonica, al conjunto de compuestos polifenólicos, clorofila a, ácido ascórbico, así como a otras enzimas antioxidantes. Esto evidencia el carácter complejo y los diferentes mecanismos de la actividad antioxidante determinada. En las algas, al igual que en las células de los vegetales vasculares terrestres, existen varios compuestos, tanto de naturaleza hidrosoluble como liposoluble, que cumplen esta propiedad (Tabla I.3.). Los compuestos liposolubles con actividad antioxidante más estudiados son los carotenoides, clorofila a, vitamina E y metabolitos secundarios como terpenoides y sus derivados. Entre los compuestos hidrosolubles más estudiados están los polifenoles, y son numerosos los trabajos que muestran la capacidad antioxidante de las macroalgas relacionado con el contenido en polifenoles (Zubia et al., 2007; Vidal et al., 2001). Estos autores, atribuyen a la presencia de diferentes polifenoles las diferencias en la actividad antioxidante detectada en las especies estudiadas. ANTIOXIDANTES DE NATURALEZA HIDROSOLUBLE Compuestos fenólicos, generalmente todos los vegetales, como producto de su metabolismo, son capaces de sintetizar un elevado número de compuestos fenólicos, algunos de los cuales son indispensables para sus funciones fisiológicas y otros de utilidad para defenderse ante situaciones de estrés, lo que se conoce como defensa química. Se ha destacado el importante papel fisiológico que juegan los polifenoles en las algas, principalmente en las pardas (Deslandes et al., 2003; Connan et al., 2006). Además de poseer diferentes actividades biológicas siendo su capacidad antioxidante la más importante (Prior et al. 1998), presentan una estabilidad mayor que la del ácido ascórbico (Miller y Rice-Evans, 1997). Se clasifican dependiendo de la estructura y clase de subcomponentes fenólicos, dependiendo del número y posición de grupos hidroxilo y la presencia de otros constituyentes. Estos compuestos fitofenólicos se han asociado con la acción antioxidante en sistemas biológicos actuando como captadores de radicales libres (Rice-Evans et al., 1995; Jorgensen et al., 1999). Introducción La efectividad de su capacidad antioxidante va a depender de su estabilidad en los diferentes sistemas, así como también del número y localización de grupos hidroxilo. En muchos estudios in vitro los compuestos fenólicos han mostrado alta actividad antioxidante, incluso mayor que la presentada por vitaminas y carotenoides (Vinson et al.,1995, Re et al., 1999;). Muchos de estos trabajos han enfatizado el papel beneficioso de fenoles de plantas superiores en la salud humana y en la acción frente al cáncer (Setchell et al., 1981; Paganda et al., 1999). Aunque ya se ha indicado que las algas, en general, son una fuente potencial de antioxidantes naturales (Pratt, 1992), diversos estudios han profundizado en el papel que juegan los compuestos fenólicos en relación a la actividad antioxidante (Foti et al., 1994). También se han realizado estudios que demuestran la capacidad de los compuestos fenólicos en el bloqueo de la radiación ultravioleta (UV), inductora de algunos procesos relacionados con la carcinogénesis (Huang y Farraro, 1992). Más concretamente, la actividad química de los polifenoles en términos de sus propiedades como donadores de hidrógeno o agentes donadores de electrones, predicen su potencial para actuar como captadores de radicales libres (antioxidantes) y su acción como antioxidante está relacionada no sólo con su estructura química sino también con su localización (Rice-Evans et al., 1997). Las macroalgas pertenecientes al grupo de algas pardas (Phaeophyta) presentan un alto contenido en compuestos polifenólicos o florotaninos (Ragan y Glombitza, 1986; Van Alstyne, 1988; Steinberg, 1992). La relación de sustancias fenólicas con moléculas de floroglucinol en las algas pardas, se mencionó por primera vez por Crato (1893). La mayoría de los metabolitos secundarios algales se han aislado de especies tropicales (Faulkner, 1992) y hasta los años 90 se consideraba que la producción de las defensas químicas respondía a una interesante pauta biogeográfica . Esta diversidad química concretamente en compuestos fenólicos, presumiblemente es un reflejo de la mayor actividad herbívora de los trópicos (Gaines y Lubchenco, 1982). Sin embargo estudios posteriores han demostrado que las concentraciones de compuestos fenólicos en algas pardas de latitudes templadas son sustancialmente superiores a las cuantificadas en especies similares de latitudes tropicales (Steinberg, 1992). Muchas algas pardas en Australia y Nueva Zelanda tienen 2 y 3 veces mayor contenido en compuestos fenólicos que especies similares del Pacífico Norte (Steinberg 1989, 1992). Estes y Steinberg (1988) sugirieron que estas diferencias entre las dos regiones están relacionadas con los diferentes perfiles de presión herbívora siendo mayor en el Pacífico Sur lo que permitió que las algas pardas desarrollaran altos contenidos en polifenoles. Introducción Paralelamente (Targett et al., 1992) muestran que algas pardas tropicales de los órdenes Fucales y Dictyotales presentan niveles tan altos como los encontrados en zonas templadas. Las diferencias en el nivel de polifenoles en algas pardas a nivel mundial no se puede explicar únicamente por la variación latitudinal y la presión herbívora. A este respecto se ha demostrado que los polifenoles actúan con mayores actividades específicas que las sugeridas inicialmente (Hagerman y Butler, 1991; Ayres et al., 1997). Así, la reactividad de los polifenoles es afectada por el medio químico de los sistemas digestivos de los herbívoros (Hay y Steinberg 1992; Appel, 1993; Boettcher and Targett, 1993; Targett et al., 1995) y la variación espaciotemporal junto con otros parámetros (nutrientes, irradiancia, diferenciación en el talo) que afectan a los niveles de florotaninos (Arnold et al., 1995; Cronin y Hay, 1996; Peckol et al., 1996). En este último sentido, tratando de entender estas variaciones intraespecíficas, diferentes estudios han demostrado que un incremento de la radiación UV induce a cambios en la producción de polifenoles en el alga parda Ascophyllum nodosum (Pavia et al., 1997; Pavia et al., 1999; Pavia y Brock, 2000). Según estos resultados los florotaninos pueden actuar como pantalla frente a los efectos dañinos de la radiación UV. Incluso aunque la absorción máxima de los florotaninos sea a una longitud de onda entre 260 y 280 nm, menor que la radiación UV incidente. Abdala et al. (2003) demostraron que los polifenoles en el alga parda Cystoseira tamariscifolia presentan una variación estacional con valores máximos en los periodos de mayor radiación solar (primavera -verano), pero también presentan ciclos de variación diario con máximos en las horas centrales del día excepto en verano donde el contenido cae al mediodía como consecuencia de una mayor excreción al medio. La disponibilidad de nutrientes es otro factor ambiental al que se encuentran comúnmente sometidas las algas que influye en el contenido de florotaninos (Amsler y Fairhead, 2006). Ficobiliproteínas, son los principales pigmentos accesorios captadores de la energía luminosa en algas rojas y cianobacterias. Se ha encontrado que c-ficocianiana presenta actividad antioxidante con una marcada actividad antiinflamatoria y neuroprotectora (Romay et al., 2003). Es por esto que han despertado interés en relación a una posible utilización para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas causadas por el estrés oxidativo (Alzheimer, Parkinson), tratamiento de las úlceras gástricas y el cáncer de colon. La administración de Introducción Tabla I.3. Tabla resumen de las defensas antioxidantes enzimáticas y compuestos antioxidantes de las algas, similares a las encontradas en los vegetales terrestres, aisladas a partir de extractos tanto lipofílicos como hidrofílicos (Le Tutour et al., 1998; Algorythme 52, 2000; Naguib, 2000). ficoeritrina en ratas diabéticas aumento la situación general antioxidante por el SISTEMAS DE DEFENSA ANTIOXIDANTE EN ALGAS Proceso Especie Superóxido dismutasa Produce la dismutación del superóxido y genera H2O2. Fucus, Cystoseira, Sargassum, Ulva Catalasa Reduce el peróxido de hidrógeno a H2O y O2. Localizada principalmente en los peroxisomas. Porphyra sp, Scytosiphon lomentaria Glutatión peroxidasa Cataliza la trasformación de peróxidos orgánicos y de hidrógeno a expensas de la transformación de glutatión reducido (GSH) en su forma oxidada (GSSG). Porphyra ENZIMÁTICOS GSSG reductasa Regenera la forma reducida del glutatión y los equivalentes de reducción los proporciona el NADPH. Porphyra Compuestos fenólicos Atrapan especies reactivas de oxígeno debido a su propiedad como donadores de electrones. La efectividad de su capacidad antioxidante va a depender del número y localización de grupos hidroxilo. Eisenia bicyclis, Fucus spiralis, Ascophyllum nodosun, Cystoseira tamariscifolia, Ecklonia kurome Clorofila y derivados Actúa como captador de radicales libres y tiene la capacidad de actuar sinérgicamente con el tocoferol Enteromorpha sp., Eisenia bicyclis Polisacáridos Muchos de ellos con grupos sulfatos con demostradas propiedades como atrapadores de radicales libres. Porphyra, Ulva, Ecklonia, Laminaria japonica Fosfolípidos El principal agente antioxidante es el fosfatl inositol. Muestra efecto sinergético junto a la vitamina E. Porphyra tenera, Eisenia bicyclis Fucus spp, Ascophyllum Ficobiliproteínas La bilina funciona como captador de radicales libres. Porphyra, Phormidium, Spirulina Vitamina C Reduce directamente radicales libres libres y genera el radical ascorbato, que desaparece vía transformación en ascorbato y deshidroascorbato. Fucus spp, Ascophyllum, Chondrus crispus Vitamina E Secuestra radicales peróxido, lo que impide la reacción de propagación, oxidándose a radical α-tocoferilo y finalmente, a la forma quinónica Fucus spp, Ascophyllum nodosum, Laminaria digitata, Palmaria palmata Carotenoides Interacciona con especies excitadas y exhibe una buena actividad bloqueante de radicales a bajas presiones de O2 Cystoseira abiesmarina, Laminaria digitata, Chondrus crispus Micosporinas La capacidad de actuar como captador de radicales libres Porphyra NO ENZIMÁTICOS Glutatión El balance GSH/GSSG influye en el funcionamiento del sistema GSH peroxidasa/GSSG reductasa Ulva fastiata Enteromorpha spp Introducción aumento de bilirrubina, superóxido dismutasa, catalasa, las concentraciones de glutatión peroxidada y los antioxidantes no enzimáticos del sistema (Soni et al., 2009). Recientemente un nuevo trabajo ha sugerido que la proteína de ficoeritrina es fácilmente digerida para liberar el compuesto ficoeritrobilina durante el proceso de la digestión gastrointestinal en mamíferos, el cual mostró la capacidad de captación de radicales peróxidos, concluyendo que diversas actividades terapéuticas de la ficoeritrina parecen estar asociados con el compuesto ficoeritrobilina (Yabuta et al., 2010). Amino ácidos tipo micosporina (MAAs), diversos estudios sugieren una función fotoprotectora para los MAAs ya que poseen alta capacidad de absorción de la radiación UV y capacidad de actuar como antioxidante (Dunlap & Yamamoto, 1995; Nakayama, 1999; de la Coba et al., 2009) aunque son muchas las funciones que se les ha atribuido a este tipo de metabolitos como osmolito orgánico (Portwich y GarcíaPichel ,1999), precursor de algunos pigmentos (Price y Forrest, 1969; Shibata, 1969), papel reproductor en algunos organismos, etc. El papel fotoprotector frente a la radiación UV es el más aceptado y el más documentado (Wood, 1989; García–Pichel et al 1993; Post y Larkum, 1993; Lesser, 1996; Neale et al., 1998; Sinha et al., 2000; Misonou et al., 2003), especialmente por su capacidad para absorber longitudes de onda corta unido a su alta fotoestabilidad tanto in vivo (Adams y Shick, 2001) como in vitro (Conde et al., 2000, 2004). Algunos autores también han descrito el papel antioxidante de la micosporina-glicina en ensayos de inhibición de la peroxidación lipídica (Dunlap y Yamamoto, 1995; Nakayama et al., 1999) y como secuestrador de radicales 1O2 generados bajo la acción de ciertos fotosensibilizadores (Suh et al., 2003). En la actualidad la actividad antioxidante de las imino-MAAs está escasamente investigada y, los pocos trabajos que existen, valoran la capacidad antioxidante de los extractos algales (Dunlap y Yamamoto, 1995; De la Coba et al., 2099) o de una mezcla de MAAs (Kim et al., 2001). La capacidad antioxidante en medio acuoso o lipídico de imino-MAAs como tales, es decir, purificadas o aisladas en un alto grado de pureza no se conoce, al igual que tampoco su comportamiento a nivel de secuestro de radicales superóxido y peróxido de hidrógeno. Polisacáridos, las algas marinas tienen un alto contenido de polisacáridos, muchos de ellos con grupos sulfatos con demostradas propiedades como atrapadores de radicales libres y antioxidantes para la prevención del daño oxidativo en organismos vivos (Qi et al., 2005). Las algas rojas se caracterizan por tener principalmente Introducción galactanos: agar y carragenatos (Painter, 1983; Craigie, 1990). El agar es un biopolímero con una amplia variedad de aplicaciones en los alimentos, la biotecnología y la medicina, principalmente como agente gelificante (Usov et al., 2002). El agar químicamente está constituido por fracciones polisacáridas de agarosa y la agaropectina. La agarosa es el componente principal del mismo, presenta alrededor del 70% del total. Tanto la agarosa como la agaropectina tienen la misma estructura básica constituida por unidades alternas de galactosa y 3,6-anhidrogalactosa, ambas en forma piranosa. Las unidades se enlazan por uniones αL(1→3) y βD (1→4), también en forma alternada (Araki, 1966). La heterogeneidad en esta estructura proviene de la sustitución con sulfato de hemiesteres, esteres de metilo y cetales piruvato en varias posiciones. A diferencia de la agarosa, la agaropectina posee un alto contenido en sulfato y piruvato (Lahaye et al., 1985; Armisen y Galatas, 1987). La variación en posición y el grado de influencia de sustitución con grupos sulfato produce geles de menor fuerza, es decir, geles más suaves. Las algas pertenecientes a los órdenes Gracilariales (Gracilaria, Gracilariopsis y Hydropuntia) y Gelidiales (Gelidium, Pterocladiella y, Gelidiella) son un claro ejemplo de productoras de agar, tal y como lo demuestra la industria de hidrocoloides creada en países como EEUU y Chile, donde se comercializa principalmente como materia prima para la producción como agente gelificante (McHugh, 1991; Armisen, 1995). Las algas pertenecientes al orden Gigartinales (Gigartina, Kappaphycus, Euchema e Hypnea) se caracterizan por contener principalmente carragenatos. Estos constituyen toda una familia química de polisacáridos complejos derivados de la galactosa, los cuales presentan un esqueleto lineal de unidades alternantes de β-D-galactopiranosa unido glicosídicamente a través de las posiciones 1 y 3 y uno de α-Dgalactopiranosa unido a través de las posiciones 1 y 4 (Painter, 1983). Estos polímeros presentan al contrario que otros ficocoloides un alto contenido en sales y sulfatos. Se clasifican en familias de acuerdo al grado y patrón de sulfatación de las unidades de galactosa. La familia kappase caracteriza por la gran cantidad de grupos sulfatos (20-24% frente al 4-6% del agar). Algunas algas rojas contienen polisacáridos estructuralmente híbridos (Bellion et al., 1981; Correa-Díaz et al., 1990). Un ejemplo es el de las algas Corallina pilulifera y Georgiella confluens de donde se han obtenido xilogalactanos denominados agaranos (Usov et al., 1997; Kolender y Matulewicz, 2002). Diferentes autores han demostrado que los polisacáridos sulfatados de las algas, Fucus vesiculosus, Laminaria japonica y Porphyra haitanensis entre otros, presentan una fuerte actividad antioxidante, que se atribuye a su capacidad atrapadora de ERO (Hu et al., 2001; Xue et al., 2001). Introducción ANTIOXIDANTES DE NATURALEZA LIPOSOLUBLE Carotenoides, existen más de seiscientos tipos de carotenoides, de los cuales cerca de 50 son precursores de la vitamina A o retinol. Los carotenoides se dividen en dos grupos: los carotenos y las xantofilas. Los carotenos como el α o β-carotenos o el licopeno contienen solo átomos de carbono e hidrógeno, mientras que las xantofilas como la luteína tienen al menos un átomo de oxígeno en su estructura. Los carotenoides y en particular los 4-oxo derivados tales como la astaxantina son los responsables de actuar como neutralizadores de radicales libres y de otras especies reactivas del oxígeno (Olmedilla et al. 2001). Son eficientes antioxidantes contra el oxígeno singlete y los radicales peróxido, contribuyendo de este modo al sistema de defensa lipofílico de los organismos.La especie Laurencia obtusa (Orden Ceramiales) posee un contenido en carotenos que la hacen una fuente importante de antioxidantes, al igual la microalga verde Dunaliella salina. Esta microalga, en condiciones de alta irradiación y alta salinidad, produce importantes cantidades de β-caroteno, pigmento que le da la característica coloración rojiza y que tiene un alto poder antioxidante. Sin embargo, la astaxantina producida por otra microalga verde, Haematococcus pluvialis, posee una actividad antioxidante diez veces superior a la del β-caroteno producido por Dunaliella salina. La astaxantina protege contra los efectos de los rayos UV, generación de manchas en la piel y cánceres quimioinducidos entre otros (Tanaka, 1994). Clorofila y sus derivados, contenidos en la fracción de los lípidos neutros son capaces de actuar como antioxidantes en oscuridad, aunque a la luz participen en la fotosíntesis (Endo et al.,1985) . La feofitina a y la pirofeofitina a han sido identificados como responsables de la actividad antioxidante del alga verde Enteromorpha y del alga parda Eisenia bicyclis, respectivamente (Nishibori y Namiki, 1988). Estos compuestos muestran un efecto sinérgico con la vitamina E. 1.3.2. METODOLOGÍA PARA DETERMINAR ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Para analizar los antioxidantes presentes en cualquier material vegetal, se utilizan gran diversidad de metodologías. Las características esenciales de cualquier prueba de Introducción Chondrus crispus; Gracilaria bursa pastoris; Palmaria palmata – Dicentrarchus labrax; Scophthalmus maximus Tanques outdoor; cascada Alta biofiltración y crecimiento estacional Matos et al., 2006 Kappaphysuc alvarezii – Litopenaeus vannamei Co-cultivo en jaulas flotantes Crecimiento normal Lombardi et al., 2006 Gracilaria sp.; Rizhopora sp. (mangle) – Crassostrea iredalei; langostino Estanques Alta biofiltración Shimoda et al., 2006 Ulva pertusa - Apostichopus japonicus Sistema a escala comercial de recirculación en flujo discontinuo Efectividad de eliminación de nitrógeno >60 % Wang et al., 2007 Ulva pertusa - Pagrus major Sistema de poli-cultivo integrado Peces con mejor color Hirata et al., 2007 Kappaphycus spp. – Chanos chanos Acuarios Biofiltración media Rodrigueza y Montaño, 2007 Codium fragile – Virtual Escala laboratorio Alta biofiltración; estacional Kang et al., 2008 Kappaphycus alvarezii – Trachinotus carolinus Tanques con recirculación Alta biofiltración; baja tasa de crecimiento Hayashi et al., 2008 Ulva lactuca - Haliotis midae Sistema de recirculación Optimizar tasa de recirculación Robertson-Andersson et al., 2008 Porphyra yezoensis – No indicado Redes en mar abierto Alta biofiltración y producción He et al., 2008 Macrocystis; Gracilaria – Salmón Lineas; mar abierto Alta biofiltración; alto crecimiento Buschmann et al., 2008 Ulva clathrata – No indicado A escala piloto; flujo de agua (continuo y estacionario) Buena candidata; ciclo vital corto Copertino, 2009 Gracilaria caudata - Litopenaeus vabbamei Laguna, cajas y redes Biofiltración media; crecimiento bajo Marinho-Soriano et al., 2009 Introducción Gracilaria lemaneiformis - Chlamys farreri Sistema de acuicultura multitrófica integrada Biofiltración y producción de biomasa Mao et al., 2009 Asparagopsis armata; Ulva rigida – No indicado Tanques Alta biofiltración amonio; altas producciones Mata et al., 2010 Ulva clathrata – Litopenaeus vabbamei Tanques outdoor – co-cultivo Beneficio crecimiento langostinos Cruz-Suárez et al., 2010 Gracilaria; Laminaria - Lateolabra japonicus; Pseudosciaena crocea Jaulas flotantes Estrategia biorremediación Jiang et al., 2010 Introducción Figura I.4. Esquema general de un sistema integrado a escala piloto en el que se incluyen diferentes niveles tróficos 1. Bomba que impulsa el agua de mar. 2 y 3. Tanques de peces. 4. Flujo entrada en los tanques de macroalgas.5. Invernadero 1. 6. Invernadero 2. SW entrada: entrada de agua de mar, SW salida: salida de agua de mar, S: sedimentación POM: materia orgánica particulada, DIM: materia inorgánica disuelta. Introducción 1.4.3. VALORACIÓN Y APLICACIONES DE LA BIOMASA OBTENIDA EN SISTEMAS IMTA Se han propuesto diversas aplicaciones para la biomasa de macroalgas (Tabla I.5) producida en sistemas de acuicultura integrada tales como su uso para alimento de peces, la preparación de biofertilizantes de uso agrícola o la obtención de sustancias de interés comercial (Schramm, 1991a, 1991b ; Neori et al., 1998, 2000, 2004) como biliproteínas, utilizadas como marcadores de fluorescencia (Luiten et al., 2003), polisacáridos, de aplicación en la industria alimentaria y farmacéutica (Indergaard y Østgaard, 1991) o los amino ácidos tipo micosporina (MAAs), de gran interés debido a sus propiedades fotoprotectoras y antioxidantes (Figueroa et al., 2008). Tabla I.5. Revisión de las diferentes aplicaciones de la biomasa de algas producida en sistemas de acuicultura integrada. Macroalga cultivada en biofiltro Aplicación biomasa algas Referencia Gracilaria chilensis Valoración agar Chow et al., 2001 Ulva lactuca Alimento abalón y erizo Schuenhoff et al., 2003 Palmaria mollis Alimento abalón Demetropoulos y Langdon, 2004b Chondrus crispus; Gracilaria bursa pastoris; Palmaria palmata Adición piensos Matos et al., 2006 Ulva pertusa Alimento para los adultos de erizo Wang et al., 2007 Ulva pertusa Procesada para alimento de peces Hirata et al., 2007 Kappaphycus spp. Valoración carragenato Rodrigueza y Montaño, 2007 Kappaphycus alvarezii Valoración carragenato Hayashi et al., 2008 Ulva lactuca Alimento abalón Robertson-Andersson et al., 2008 Macrocystis; Gracilaria Alimento abalón Buschmann et al., 2008 Gracilaria lemaneiformis Uso no especificado; valoración de agar Mao et al., 2009 Gracilaria; Laminaria Biorremediación Jiang et al., 2010 Introducción Teniendo en cuenta que en los últimos años, algunos de los proyectos de investigación desarrollados en el Centro de Biotecnología Marina (ULPGC), en colaboración con el Grupo de Fotobiología (UMA), han estado orientados al efecto que la dinámica del aporte de nutrientes (principalmente N-amonio y P-fosfato y su relación con el metabolismo del carbono) y otros parámetros tienen sobre la biomasa cultivada de forma intensiva y algunos de sus productos, p.e. polisacáridos o aminoácidos tipo micosporina (MAA’s); la valoración de lípidos y sus componentes (p.e. triglicéridos y ácidos grasos) y la posibilidad de su modificación a través de los cambios en las condiciones de cultivo, fueron considerados como un objetivo interesante a la hora de plantear el presente trabajo. Introducción 1.5. BIBLIOGRAFÍA Ackefors, H. and Enell, M. 1990. Discharge of nutrients from Swedish fish farming to adjacent sea areas. Ambio 19(1): 28–35. Adams, N.L. and Shick J.M. 2001. Mycosporine-like amino acids prevent UVB-induced abnormalities during development of the green sea urchin Strongylocentrotus droebachiensis. Marine Biology 138: 267-280. Aguilera, J., Bischof, K., Karsten, U., Hanelt, D. 2002. Seasonal variation in ecophysiological patterns in macroalgae from an Arctic fjord. II. Pigment accumulation and biochemical defence Systems against high light stress. Marine Biology 140: 1087–1095. Amsler, C.D. and Fairhead V.A. 2006. Defensive and sensory chemical ecology of brown algae. Advances. Botanical Research 43: 1-91. Anggadiredja, J., Andyani, R., and Hayati, M. 1997. Antioxidant activity of Sargassum polycystum (Phaeophyta) and Laurencia obtuse (Rhodophyta) from Seribu Islands. J. Appl. Phycol 9: 477-479. Ahn MJ, Yoon KD, Kim CY. 2002. 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Introducción CAPITULO I ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN MACROALGAS RECOLECTADAS EN EL SISTEMA INTERMAREAL Capítulo I! ! llevó a cabo durante la primera bajamar del día a las 7:30 de la mañana, con el fin de que no estuvieran afectadas por factores como alta irradiación y desecación. Se recolectaron un total de diez especies, tres pertenecientes al phylum de las Chlorophytas, cinco pertenecientes al Phylum de las Rhodophytas y 2 al phylum de las Phaeophytas. Figura 1.2. Situación geográfica de las Islas Canarias y puntos de muestreo en la isla de Gran Canaria. A continuación se transportaron hasta el laboratorio en una nevera en oscuridad, donde se procedió a su limpieza, principalmente de epífitos y arena. Tras la identificación taxonómica de las especies, una parte de la biomasa se inoculó para iniciar el proceso de adaptación y posterior cultivo mientras que el resto de la biomasa Capítulo I ! se utilizó para análisis tanto en fresco como en seco. En este último caso, la biomasa fue congelada para su posterior liofilización. Figura 1.3. Representación esquemática de una rasa eulitoral, en la cual se ha situado el lugar de recogida de las especies estudiadas. Siendo, Fs : Fucus spiralis, Hs: Hypnea spinella, Ci: Codium intertextum, Pc: Pterocladiella capillacea, Ur: Ulva rigida, Gd:Grateloupia dichotoma, Ca: Cystoseira abies-marina,Lm:Laurencia majuscula, Hi: Halopithys incurva, Cr: Caulerpa racemosa 1.3.1.2. Descripción de las especies A continuación se muestra una breve clasificación y una descripción de las características vegetativas y hábitat de las especies (Tabla1.3). Capítulo I Tabla 1.3. Descripción taxonómica, vegetativa, habitat e imagen de las especies estudiadas en este trabajo. (Haroun et al., 2003; Mshigeni y Chapman,1987; Cremades et al., 1998). ! ! ! Género y especie División Orden Familia Características vegetativas y habitat Imagen Ulva rigida Ulvales Ulvaceae Alga de color verde oscuro, se caracteriza por presentar talos laminares, de forma orbicular o alargada, con la base gruesa, cartilaginosa y coriácea, en su margen posee abundantes denticulaciones. Se caracteriza por presentar un crecimiento parenquimatoso. Frecuente en el eulitoral y presente en el sublitoral. Abundante en lugares eutrofizados, indicadora de exceso de compuestos nitrogenados. Codium intertextum Bryopsidales Codiaceae Talo costroso, de color verde oscuro, de 3-10 mm de grosor, adherido al sustrato pero con márgenes libres, de consistencia compacta y con crestas cerebriformes a modo de excrecencias orbiculares. Cubre grandes extensiones rocosas y paredes verticales de ambientes poco iluminados. Caulerpa racemosa Chlorophyta Bryopsidales Caulerpaceae Talo con ejes postrados y ramas erectas ramificadas, con estolón bien desarrollado hasta 3mm de diámetro; de color verde se fija al sustrato por numerosos rizoides. Existen variedades y formas para Caulerpa racemosa (Caulerpa racemosa var. peltata (J.V.Larouroux) Eubank ; Caulerpa racemosa var. cylindracea (Solder) Weber van Bosse. Se distinguen por las ramulas, la primera presenta reducidas a pequeños discos y la segunda clavadas. Pterocladiella capillacea Rhodophyta Gelidiales Gelidiaceae Talo erecto,ramificado, de morfología variable y hasta 290cm de longitud; de color rojo oscuro, fijo al sustrato. El talo está compuestos por numerosos ejes y ramificación opuesta. Este taxon, de morfología variable en ocasiones puede confudirse con especies de Gelidium con quien comparte situaciones fotofilas en el límite de la marea. También en charcos del nivel inferior del eulitoral. Capítulo I ! ! ! Grateloupia dichotoma Cryptonemiales Cryptonemiaceae Aplanada con talo erecto de un color rojo pardo de contorno lauceolado, con proliferaciones e irregularmente dicótomas. Las dicotomías apicales son divergentes. Las divisiones basales son más anchas que las apicales. Su estructura es multiaxial y presenta una textura mucilaginosa pero firme. Crece en grietas y paredes del sublitoral. Hypnea spinella Gigartinales Hypneaceae Las algas son tupidas o copetudas. Talo flexible, ejes abundantes e irregularmente ramificados, cilindricos de 1 a 2mm de diámetro frecuentemente con aspecto cervicorne. Ramas y rámulas siempre subcilíndricas., de color claro en la desecación. En charcos del eulitoral y primeros metros del sublitoral. Halopithys incurva Ceramiales Rodhomelaceae Se trata de un alga de consistencia cartilaginosa y frágil, que forma matas muy características, de color rojo oscuro casi negro. Talo de 10-20 cm de longitud. Constituido por ejes cilíndricos, de 1mm de diámetro, provisto de ramas secundarias cortas, del mismo grosor y encurvadas en forma de báculo en el ápice. Se caracteriza por su olor fuerte y peculiar. Sobre sustrato rocoso o pedregoso formando poblaciones densas. Laurencia majuscula Ceramiales Rodhomelaceae Talo erecto, ramificado de 5-7 cm, de color rosado a rojizo, presenta coloración verdosa en algunas partes del talo, principalmente en ápices y partes terminales. Se fija al sustrato por un disco basal; ramificación irregularmente alterna, a veces espiralada, con densa ramificación de último orden. En el litoral inferior y sublitoral. Fucus spiralis Fucales Fucaceae Talo acintado, ramificado dicotómicamente, con nervio patente fijo al sustrato por un disco cónico de 5-25 cm de alto de color marrón oscuro. En sus talos presentan unos abultamientos generalmente terminales (receptáculos) y en su interior desarrollan las células encargadas de la reproducción. Se caracteriza por su ciclo de vida monogenético, es decir, sólo tiene una generación aparente. Formas una franja bien definida en el eulitoral superior. Cytoseira abiesmarina Phaeophyta Fucales Cystoseiraceae Talo cespitoso, espiniscente, ramificado de hasta 50 cm de alto. De color amarillento, sin disco basal de fijación pero con estirpe rastrero marrón, flexible, con ramificaciones recurvadas. Se extiende formando densas praderas desde el comienzo de sublitoral hasta los 8-10m. Capítulo I ! 1.3.2. PREPARACION DE LOS EXTRACTOS El material limpio y fresco se secó entre pliegos de papel para eliminar el exceso de humedad antes de preparar los extractos (Rao y Parekh, 1981). Para cada extracto se utilizaron 10 g de peso fresco de alga, empleando piezas de talo enteras. Los talos se trocearon y trituraron en un mortero con 150 ml de solvente orgánico metanol puro (extractos metanólicos) y etanol 50%(extractos hidroalcohólicos), en cámara fría y a continuación fueron macerados en recipientes de vidrio forrados con papel de plata en un baño termostático (Grant Instruments Ltd SS40-2). El proceso se llevó a cabo en oscuridad, a 38 ± 2 º C de temperatura y con agitación constante, durante 3 horas (Fig. 1.5.). Transcurrido este tiempo, los extractos fueron filtrados por una malla de 50 micras y a continuación se centrifugaron (Beckman GS-15 R) durante 10 min a 4 ºCa 4000 rpm. Por último el sobrenadante obtenido fue concentrado en un rotavapora una temperatura constante de 38ºC (Büchi R-210 conectado a una bomba de vacío Büchi V-700) (Fig.1.4.) hasta llegar a una concentración 1:10. Finalmente los extractos obtenidos fueron almacenados en frascos de color ámbar en un congelador a -20 º C hasta su utilización en los análisis correspondientes. Figura 1.4. Equipo utilizado para preparar los extractos, Rotavapor Büchi V-700 y extractos obtenidos de Halopithys incurva. Capítulo I! ! Figura 1.5. Esquema del procedimiento de preparación de extractos Capítulo I ! 1.3.3. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE 1.3.3.1. Estudio de la actividad antiradical (Ensayo DPPH) El DPPH• o 1,1-difenil-2-picrilhidracil es un radical libre estable aceptante de hidrógeno. Los compuestos antioxidantes presentes en los extractos de alga que pueden donar un hidrógeno reducirán el DPPH. El modelo que explica la actividad de un compuesto como antiradical se muestra con la siguiente ecuación: DPPH • + AH DPPH-H + A • Donde AH es un antioxidante que actúa como antirradical donando átomos de hidrógeno, dando como resultado radicales con estructuras moleculares estables que detendrán la reacción de oxidación en cadena. El nuevo radical formado A • puede interactuar con otro radical para formar moléculas estables (DPPH-A, A-A). La reacción entre el DPPH· y un compuesto depende de la conformación estructural del mismo, por lo que las comparaciones cuantitativas no siempre son indicativas. El radical DPPH tiene una coloración púrpura con un máximo de absorbancia a 517 nm y genera un producto amarillo pudiendo llegar a incoloro cuando una molécula antioxidante reacciona con el radical proporcionándole átomos de hidrógeno o electrones. Protocolo El barrido de radicales libres de los extractos de macroalgas se determinó utilizando el método basado en la reducción del radical libre estable DPPH, según el método de Blois (1958) tal y como se detalla a continuación (Fig. 1.6.). Se preparó una solución de DPPH (0.36mM) en metanol al 90% y a continuación se le añadieron 300µl del extracto de macroalgas. Antes de la lectura de absorbancia 517nm se utilizó un periodo de incubación de 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. Todas las pruebas y análisis se realizaron por triplicado. Como referencia, se emplearon cinco los compuestos antioxidantes comerciales BHT, la vitamina E, ácido ascórbico, floroglucinol y el propil galato proporcionados por Sigma. El porcentaje de radicales libres atrapados por los extractos de las algas o inhibición de DPPH se calculó mediante la ecuación siguiente: Capítulo I! ! % Inhibición = (1-(absorbancia (muestra) / absorbancia (control))*100 Con los porcentajes de inhibición y la concentración se calculó la concentración inhibitoria del 50% (EC 50), expresada como mg·ml-1 de los extractos y de los antioxidantes comerciales ácido ascórbico y propil galato (1-0.1 mM). Figura 1.6. Protocolo del Ensayo DPPH. 1.3.3.2. Poder reductor La determinación del poder reductor permite estudiar la capacidad que tienen ciertas biomoléculas de actuar como donadores de electrones (y protones) en reacciones metabólicas de óxido-reducción. El poder reductor se fundamenta en la reducción del ferricianuro a ferrocianuro y en la posterior formación del ferricianuro ferrico en medio ácido. El método se basa en la capacidad de una sustancia antioxidante para reducir mediante la formación de un complejo azul. El aumento de la absorbancia de la mezcla de reacción a 700nm indica un aumento del poder reductor. Protocolo La determinación del poder reductor de los extractos se realizó según Yen y Chen (1995) con algunas modificaciones (Fig. 1.7.). Se homogeneizaron 1 ml de la muestra a analizar con 2.5 ml de tampón fosfato 0.2 M, pH 6.6 y 2.5 ml ferricianuro potásico 1%. A continuación se incubó la mezcla de reacción a 50 ºC durante 30 minutos, en un baño termostático. Trascurrido este tiempo y un vez alcanzada la temperatura ambiente, se añadieron 2.5 ml de ácido tricloroacético (TCA) 10% (p/v) y Capítulo I ! se centrifugó la mezcla a 3000 rpm durante 10 min. Por último, se homogeneizaron 2.5 ml del sobrenadante con 2.5 ml de agua destilada y 0.5 ml de cloruro férrico 0.1%. La absorbancia fue medida a 700 nm. Como estándar se utilizó ácido ascórbico (AA). La actividad reductora de los extractos se expresó como equivalentes de ácido ascórbico mediante una curva de calibración. Figura 1.7. Protocolo del método del poder reductor. 1.3.4.DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS TOTALES La determinación del contenido en polifenoles se realizó en extractos hidroalcohólicos de las diez especies mediante el método colorimétrico de FolinCiocalteu (1927). El reactivo de Folin-Ciocalteu reacciona con los ciclos aromáticos de los compuestos fenólicos. En presencia de compuestos fenólicos y tras la reacción, produce una coloración azul cuya absorbancia se mide al espectrofotómetro a 700 nm. Los extractos de macroalgas (100µl) se diluyeron en 650 µl de agua destilada. A continuación se añadieron 50 µl de reactivo de FolinCiocalteu y Na2CO3 4% (p/v). La reacción se mantuvo a 70ºC con agitación durante 10 min. Antes de la lectura a 700nm se esperó a que enfriaran y se homogeneizaron las muestras. La concentración del extracto en compuestos fenólicos totales se determinó a continuación en comparación con una curva patrón de floroglucinol (0 a 20 µl.ml-1) y se expresó en porcentaje de masa seca (Fig. 1.8.). El contenido de polifenoles se determinó también utilizando este método, pero tratando previamente las muestras con el polímero insoluble PVPP que se une específicamente a los compuestos polifenólicos disueltos en medio ácido, quedando la mayoría de los fenoles simples en solución (Yates y Peckol, 1993). Este tratamiento proporciona un medio para medir con exactitud la concentración de polifenoles, ya que el reactivo Folin-Ciocalteu reacciona con otros compuestos además de los polifenoles, como son aminoácidos y proteínas. Por tanto midiendo la concentración de polifenoles Capítulo I! ! por el método colorimétrico Folin-Ciocalteuantes y después del tratamiento con PVPP se obtiene la concentración de polifenoles por diferencia. Figura 1.8. Protocolo del método Folin-Ciocalteau. 1.3.5. EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PIGMENTOS 1.3.5.1. Obtención de los extractos La extracción de clorofila a, b (dependiendo de la especie) y carotenoides se realizó homogeneizando 0.1 g de tejido en 4 ml de metanol 100%. El extracto se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 min y se cuantificó el sobrenadante espectrofotométricamente. Se prepararon extractos por triplicado para cada especie (Fig. 1.9.). Capítulo I ! Los extractos de las especies rojas H.incurva (en ambos extractos) y L. majuscula exhibieron también una alta actividad de barrido de radicales libres 2.47 ± 0.01, 2.62 ± 0.02 y 2.48 ± 0.01 mg·ml -1 respectivamente. Los antioxidantes comerciales mostraron una actividad significativamente superior (p<0.05, ANOVA, test de Tukey B) que las especies de algas. Con valores de EC50 muy baja, en el caso del ácido ascórbico 0.06 ± 0.01 mg·ml -1 seguido del propil galato 0.15 ± 0.19 mg·ml -1. p<0.05, ANOVA, test de Tukey B). 1.4.1.2. Poder reductor En la Tabla 1.6. se presenta, de modo resumido, los valores de poder reductor obtenidos para de las especies estudiadas en los diferentes extractos preparados, metanólicos e hidroalcohólicos, referidos a equivalentes de acido ascórbico. Los resultados muestran las mayores actividades antioxidantes, evaluadas mediante el método poder reductor, corresponden a los extractos hidroalcohólicos de H. incurva, con una actividad equivante a 53.15 µg AA mg-1. Estos valores son significativamente superiores a los encontrados para las especies pardas C. abies marina y Fucus spiralis, cuyas actividades fueron un 53% y un 63% menores respectivamente. Tabla 1.6. Resultados obtenidos mediante el método poder reductor en los extractos (metanólicos e hidroalcohólicos) correspondientes a las especies estudiadas (media ± desv, n=3). Las letras indican las diferencias significativas (p<0.05, ANOVA, test de Tukey B). Especies Poder reductor (µg AA mg-1) Metanólicos Hidroalcohólicos C. intertextum 0.28 ± 0.01 a 3.04 ± 0.09 d C. racemosa 1.53 ± 0.01 c 3.77 ± 0.09 d U. rigida 1.40 ± 0.10 c 5.31 ± 0.04 e P. capillacea 0.37 ± 0.04 b 1.03 ± 0.01 a H. spinella 0.39 ± 0.06 b 1.25 ± 0.01 a G. dichotoma 0.19 ± 0.01 a 2.49 ±0.02 c H.incurva 24.28 ± 0.024 f 53.15 ± 1.68 h L. majuscula 1.69 ± 0.07 c 1.74 ± 0.01 b F. spiralis 4.12 ± 0.45 e 19.82 ± 0.42 f C. abies-marina 2.72 ± 0.28 d 24.80 ± 0.25 g La actividad antioxidante detectada en los extractos hidroalcohólicos del resto de las especies fue muy baja comparada con los valores mencionados, con valores máximos de 5.31 µg AA mg-1 de equivalentes del AA para la especie U.rigida (Tabla Capítulo I! ! 1.6). Los extractos metanólicos de C. intertextum y G. Dichotoma resultaron ser significativamente inferiores (p<0.05). En los extractos metanólicos el patrón de actividad fue similar al de extractos hidroalcohólicos, aunque los valores encontrados fueron significativamente inferiores, encontrando máximos de 24.28 µg mg1equivalente al AA para H. incurva, seguidos de 4.12 y 2.72 para F.spiralis y C.abiesmarina, respectivamente. 1.4.2. ESTUDIO DE LOS COMPONENTES ANTIOXIDANTES DE LAS ALGAS 1.4.2.1. Determinación de compuestos fenólicos totales Los resultados anteriores (1.3.1), dieron pie a la búsqueda de los componentes de los extractos posiblemente responsables de las propiedades antioxidantes detectadas. Así, este ensayo muestra que las diez especies estudiadas en los ensayos de actividad antioxidante, mostraron diferencias significativas (p<0.05) en el contenido de compuestos fenólicos totales mediante el método Folin-Ciocalteu. De todas las especies estudiadas Halopithys incurva presentó el contenido más alto en compuestos fenólicos totales, 4.86 % de su peso seco, mientras que los valores más bajos entre las especies recolectadas se observaron en Grateloupia dichotoma 0.73 % (Tabla 1.7.). Tabla 1.7. Contenido de polifenoles totales valorado mediante el método FC y con el tratamiento PVPP ambos valorados mediante el método FC en los extractos de las diez especies de macroalgas expresado como % de peso seco y expresado(–)no detectado (media ± desv, n=3). Las letras indican las diferencias significativas (p<0.05, ANOVA, test de Tukey B). Especies Compuestos fenólicos totales (% peso seco) Compuestos fenólicos totales (% peso seco) PVPP C.intertextum 1.10 ± 0.01 c - C.racemosa 2.26 ± 0.04 e - U.rigida 1.07 ± 0.00 c - P.capillacea 0.84 ± 0.00 b - H.spinella 0.75 ± 0.00 a - G.dichotoma 0.73 ± 0.02 a - H.incurva 4.86 ± 0.00 h 1.46 ± 0.00a L.majuscula 1.52 ± 0.01 d - F.spiralis 3.07 ± 0.00 f 2.19 ± 0.00b C.abies-marina 3.90 ± 0.00 g 3.15 ± 0.00c Capítulo I ! También destacan los valores encontrados en las especies pardas F.spiralis y C.abies-marina, 3.07 ± 0.00 y 3.90 ± 0.00 % de peso seco respectivamente. Entre las especies de algas verdes C.racemosa presentó el contenido más alto 2.26 ± 0.04 % de peso seco. Al añadír PVPP a los extractos, sólo en las especies pardas (Fucus y Cystoseira) y una especie roja (Halopithys) se detectó contenido en compuestos fenólicos. Siendo la especie parda Cystoseira abies-marina la que mostró el contenido más alto en polifenoles aplicando el tratamiento con PVPP, 3.15% de su peso seco. 1.4.2.2. Cuantificación de pigmentos 1.4.2.2.1. Pigmentos liposolubles: Clorofila a, b y carotenoides La cuantificación de los pigmentos liposolubles, clorofila a, b y carotenoides totales, expresados como mg·g PS-1 (Tabla 1.8). Las cuales presentaron diferencias significativas (p<0.05), siendo las algas pardas las que destacan con mayor concentración de clorofila a y carotenoides totales. La concentración máxima de clorofila a entre todas las especies recolectadas fue en Cystoseira abies marina 0.13 mg·g PS-1 mientras que la concentración más baja se detectó en la especie verde Caulerpa racemosa 0.01 mg·g PS-1. Las algas rojas presentaron valores máximos de 0.12 mg·g PS-1y mínimos de 0.02 mg·g PS-1 éste último correspondiente a Pterocladiella capillacea y Laurencia majuscula. Tabla 1.8. Contenido de pigmentos liposolubles, clorofilas y carotenoides, expresados como mg·g PS-1 en las diez especies de macroalgas (media ± desv, n=3). Las letras indican las diferencias significativas (p<0.05, ANOVA, test de Tukey B). S Especies Cl a (mg · g PS-1) Cl b (mg · g PS-1) Carotenoides totales (mg · g PS-1) C.intertextum 0.02 ± 0.01 a 0.01 ± 0.00 a 0.01± 0.00 a C.racemosa 0.01 ± 0.00 a 0.03 ± 0.00 b - U.rígida 0.05 ± 0.00 b 0.03 ± 0.00 b 0.01± 0.00 a P.capillacea 0.12 ± 0.01 d 0.03± 0.00 b H.spinella 0.05 ± 0.00 b 0.01± 0.00 a G.dichotoma 0.07 ± 0.00 c 0.01± 0.00 a H.incurva 0.08 ± 0.00 c 0.03± 0.00 b L.majuscula 0.02 ± 0.00 a 0.01± 0.00 a F.spiralis 0.11 ± 0.00 d 0.05 ± 0.00 c C.abies-marina 0.13 ± 0.00 d 0.05 ± 0.00 c Capítulo I! ! iendo las algas pardas las que destacan con mayor concentración de clorofila a. Y en la misma línea se muestran los carotenoides totales, en general bastante bajos a excepción de las especies pardas nuevamente, donde se detectaron valores de 0.05 mg·g PS-1 en ambas, Fucus spiralis y Cystoseira abies-marina. Siendo además significativamente diferentes (p<0.05). 1.4.2.2.2. Pigmentos hidrosolubles: ficoeritrina Los niveles de ficoeritrina extraídos y cuantificados exclusivamente en algas rojas muestran diferencias significativas (Tabla 1.9). Se observa una clara diferencia entre las cinco especies analizadas (p<0.05). La especie que destacó por su mayor contenido es Pterocladiella capillacea con un valor de 0.08 mg·g PS-1 significativamente superior al resto de las especies. Mientras que las concentraciones significativamente más bajas (p<0.05), fueron detectadas en orden decreciente Grateloupia dichotoma, Halopithys incurva, e Hypnea spinella, siendo 0.04mg · g PS-1, 0.03mg · g PS-1 y 0.02 mg · g PS-1 respectivamente. Tabla 1.9. Contenido de ficoeritrina (media ± desv, n=3) en las especies de macroalgas rojas expresado como mg·g PS-1. Las letras indican las diferencias significativas (p<0.05, ANOVA, test de Tukey B). 1.4.3. CORRELACIONES ENTRE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DETECTADA Y LAS SUSTANCIAS CUANTIFICADAS En la Tabla 1.10. se muestran los resultados del coeficiente de correlación (R2) obtenido entre la actividad antioxidante detectada mediante el ensayo DPPH y el poder reductor con el contenido en fenoles totales así como en pigmentos liposolubles e hidrosolubles de las especies de macroalgas ensayadas. Especies FE ( mg · g PS-1) Pterocladiella capillacea 0.13 ± 0.00 c Hypnea spinella 0.02 ± 0.00 a Grateloupia dichotoma 0.04 ± 0.00 a Halopithys incurva 0.03 ± 0.00 a Laurencia majuscula 0.08 ± 0.00 b Capítulo I ! Tabla 1.10. Resultados de R2 de las correlaciones realizadas, entre la actividad antioxidante detectadamediante el ensayo DPPH en (%) y el método del poder reductor (µg AA mg-1) y los polifenoles valorados mediante dos métodos y pigmentos liposolubles (clorofila a y carotenoides totales) e hidrosolubles (ficoeritrina). Tanto la correlación entre la actividad antioxidante de los extractos metanólicos e hidroalcohólicos obtenida con el método del DPPH con el contenido en polifenoles ( sin y con PVPP) mostraron una buena correlación (R2 = 0.771) y (R2 =0.718) sin el tratamiento PVPP y (R2 = 0.796) y (R2 =0.785) con el tratamiento PVPP respectivamente. Sin embargo, el análisis de correlación realizado entre el método del poder reductor mostró la mejor correlación polifenoles sin tratamiento PVPP extracto hidroalcohólico (R2 = 0.857) pero el resto de las correlaciones realizadas con la actividad antioxidante detectada mediante este método fueron muy bajas. Concretamente, se obtuvieron en la actividad antioxidante detectada en los extractos metanólicos con clorofila (R2 =0.347), con carotenoides( R2 =0.696),con el contenido en ficoeritrina (R2 =0.121),y con el contenido en polifenoles con el tratamiento PVPP (R2=0.131). En la actividad antioxidante detectada en los extractos hidroalcohólicos con clorofilas (R2=0.167), con carotenoides (R2=0.189), con el contenido en ficoeritrina (R2=0.159),y con el contenido en polifenoles con el tratamiento PVPP (R2 =0.462). Los resultados de las correlaciones entre la actividad antioxidante detectada mediante el ensayo DPPH y el contenido en clorofilas y carotenoides fueron significativos, siendo en extractos metanólicos (R2=0.482) y (R2=0.629) respectivamente y en hidroalcohólicos (R2=0.485) y (R2 =0.616) respectivamente. El análisis de correlación con el contenido en ficoeritrina fue casi insignificante con ambos extractos, con valores de (R2=0.144) en los metanólicos y (R2=0.035) en los hidroalcohólicos. REGRESION LINEAL (R2) Ensayo DPPH (% Barrido radicales libres) Poder reductor (µg AA mg-1) Biomoléculas Extracto METOH Extracto ETOH50 Extracto METOH Extracto ETOH50 Clorofilas (mg · g PS-1) 0.347 0.443 0.032 0.173 Carotenoides (mg · g PS-1) 0.696 0.157 0.085 0.327 Ficoeritrina (mg · g PS-1) 0.041 0.010 0.129 0.145 Polifenoles (%) 0.771 0.718 0.606 0.857 Polifenoles PVPP (%) 0.796 0.785 0.131 0.462 Capítulo I! ! ! ! ! ! Figura 1.15. Representación gráfica de los análisis de correlación más significativos entre la actividad antioxidante detectada mediante el ensayo DPPH con extractos metanólicos (●Clorofitas●Rodofitas●Feofitas) y con extractos hidroalcohólicos (■Clorofitas■Rodofitas ■Feofitas) y el contenido en polifenoles (% peso seco) (R2=0.771) y (R2=0.718) respectivamente. La correlación con el contenido en carotenoides (R2=0.629) también fue alta. El análisis de correlación más significativo entre la actividad antioxidante detectada mediante el poder reductor exhibió con extractos hidroalcohólicos (■Clorofitas■Rodofitas ■Feofitas) y al contenido en polifenoles (% peso seco) (R2=0.857). ! Capítulo I ! 1.4.5. RELACIÓN CARBONO Y NITRÓGENO Los resultados de los análisis en relación al contenido C:N de las diez especies se muestran en la Figura 1.19. mostrando diferencias significativas tanto entre los tres phylum como dentro de cada uno de ellos (p<0.05). El contenido de N (mg N· g PS-1) mostró diferencias significativas (p<0.05) dependiente del phylum. Las variaciones en el contenido de carbono fueron significativamente notorias en el caso de Fucus spiralis. Entre las algas verdes Ulva rigida es la que muestra mayor contenido de relación C/N siendo éste de 15.63 %. Codium intertextum y Caulerpa racemosa muestran valores de 12.24 y 11.10% respectivamente. Entre las algas rojas la relación C:N máxima se detectó en Laurencia majuscula y la mínima en Halopithys incurva siendo estos valores de 11.34 y 8.65 % respectivamente. Entre las algas pardas, se observó una mayor relación respecto a los datos anteriores, en Fucus spiralis de 18.64 respecto a la relación C/N encontrada en 17.29 Cystoseira abies-marina. Figura 1.19. Relación C/N en las diez especies de macroalgas estudiadas (media ± desv, n=3). Capítulo I! ! Tabla 1.11. Contenido en N (mg N· g PS-1) y en C (mg C · g PS-1) en las de macroalgas estudiadas (media ± desv, n=3). 1.5. DISCUSIÓN El análisis realizado con el objeto de evaluar la actividad antioxidante de los extractos metanólicos e hidroalcohólicos de las 10 especies de macroalgas fue realizada mediante dos métodos. Primero, utilizando una solución metanólica del radical libre estable DPPH, el cual presenta la ventaja de ser inalterado por ciertas reacciones como la quelación de iones metálicos y la inhibición enzimática provocadas por algunas sustancias presentes en matrices complejas (Amarowicz et al., 2004) y permite estudiar compuestos hidrosolubles y liposolubles. Mediante una segunda metodología se puedo determinar el potencial antioxidante fundamentado en la reducción del ferricianuro a ferrocianuro y en la posterior formación de ferrocianuro férrico denominado método del poder reductor. Estos resultados sugieren que hay diferencias significativas entre las especies representativas de los phylum estudiados, Chlorophyta, Rhodophyta y Phaeophyta, además estas las diferencias encontradas están influenciadas por el solvente de extracción. Mientras que todos los extractos hidroalcohólicos de las algas mostraron actividad en el ensayo de barrido de radicales libres mediante el ensayo DPPH, sólo seis mostraron en extracto metanólico. El alga roja Halophytis incurva y las algas pardas Fucus spiralis y Cystoseira abies-marina, según estos resultados son las que mayor actividad antioxidante muestran en ambos tipos de extracto y metodología aplicada. Los resultados del poder reductor muestran nuevamente mayores actividades en las especies mencionadas, con una diferencia significativa respecto a las demás. En general, la literatura muestra diferencias Especies (mg N· g PS-1) (mg C · g PS-1) C.intertextum 22.14 ± 0.76 270.93 ± 9.50 C.racemosa 19.81 ± 0.41 219.86 ± 6.06 U.rigida 17.27 ± 0.13 269.99 ± 1.19 P.capillacea 28.75 ± 3.00 297.71 ± 26.14 H.spinella 26.65 ± 0.82 231.74 ± 4.84 G.dichotoma 29.33 ± 1.63 289.24 ± 2.64 H.incurva 19.72 ± 0.05 277.67 ± 5.61 H.incurva 19.65 ± 0.81 222.80 ± 6.62 F.spiralis 17.44 ± 0.47 324.81 ± 4.84 C.abies-marina 15.29 ± 0.36 264.35 ± 8.35 Capítulo I ! significativas en la actividad antioxidante detectada en los tres phylum. Al expresar % de barrido de radicales libres como EC50 (también llamado índice de oxidación) Cystoseira abies-marina (en ambos extractos) y Caulerpa racemosa (en extracto ETOH 50%) exhibieron la mayor actividad con una EC50 muy baja 1.97 ± 0.03, 2.03 ± 0.01 y 1.88 ± 0.03 mg·ml -1 respectivamente. En estudios anteriores los extractos de Caulerpa cupressoides y Caulerpa paspaloides exhibieron actividades con el DPPH inferiores a nuestros resultados (6.17 ± 0.10, 6.35 ± 0.15 y 7.36 ± 0.16 mg mL-1, respectivamente) (Zubia et al., 2007). Los extractos de F. spiralis mostraron un EC50 de 2.21 ± 0.02 y 2.22 ± 0.00 mg·ml -1 respectivamente. Los extractos de las especies rojas (Orden Ceramiales) H.incurva (en ambos extractos) y L. majuscula exhibieron también una alta actividad de barrido de radicales libres 2.47 ± 0.01, 2.62 ± 0.02 y 2.48 ± 0.01 mg·ml -1 respectivamente. Los antioxidantes comerciales expresados como % de barrido de radicales libres, mostraron que el propilo galato y el ácido ascórbico tienen una alta actividad 95.68 % y 96.44 % respectivamente, equivalente a la encontrada para las especies H. incurva, F. spiralis y C. abies-marina, seguido de el floroglucinol, 69.34%. En cambio la vitamina E y el antioxidante commercial BHT muestran valores más bajos, 37.73% y 28.7 % respectivamente. Los valores de actividad antioxidante medidos en estos dos compuestos comerciales son similares o incluso inferiores a los detectados en los extractos hidroalcohólicos de la mayoría de las especies analizadas. En cambio al expresar la actividad en el radical DPPH como EC50, exhibieron actividades más altas 0.06 ± 0.01 mg·ml -1 el ácido ascórbico seguido del propil galato 0.15 ± 0.19 mg·ml -1. Estudios previos han reportado una alta actividad antioxidante en el género Halimeda (Al Fallarero et al., 2003) y Caulerpa (Santoso et al.,2004; Cavas y Yurdakoc 2005). Entre las rojas destacan los géneros (Polysiphonia, Heterosiphonia, y Bryothamnion) pertenecientes al Orden Ceramiales los resultados expresados como EC50, Brongniartella byssoides (0.14 ± 0.01 mg ml-1) y Polysiphonia lanosa (2.71 ± 0.01 mg ml-1) y una especie perteneciente al orden Gigartinales, Furcellaria fastigiata (1.39± 0.04 mg ml-1) (Zubia et al., 2009). Entre las pardas géneros pertenecientes al Orden de las Fucales (Cystoseira, Fucus, Sargassum) (Yan et al., 1998; Kim et al., 2005; Zubia et al., 2007). Avalado por otros trabajos dirigidos a evaluar el potencial antioxidante de extractos de algas (Matsukawa et al., 1997; Le Tutour et al.,1998), se confirma que el tipo de extracto y proceso de extracción influye en su composición y en consecuencia también en sus propiedades. La preparación de los extractos varía según los autores, aunque todos comparten una metodología básica. Tal y como se indica en el apartado de material y métodos los extractos estudiados se han llevado a cabo empleando muestras de homogenizados Capítulo I! ! de piezas de talo enteras liofilizadas y se han preparado con solventes de diferente polaridad. La liofilización es uno de los procedimientos más fiables para mantener las propiedades en un tejído, ya que durante el secado la temperatura puede afectar a la estabilidad de los compuestos activos debido a la degradación química y enzimática, por volatilización o por descomposición térmica. Además este segundo mecanismo puede afectar la reducción del contenido en polifenoles de los extractos (Larrauri et al., 1997). Las algas marinas, especialmente las algas comestibles, se deshidratan tradicionalmente al sol o secado al aire. Por lo general, el secado a alta temperatura (como el horno de secado) causa la degradación física y las pérdidas de compuestos volátiles en el material vegetal. Es por ello, que a pesar del coste económico la liofilización parece conservar de manera eficiente compuestos termosensibles (Wong y Cheung, 2001).Durante la extracción y concentración también se tuvo en cuenta este parámetro ya que incluso los fenoles pueden reaccionar con otros componentes impidiendo su extracción (Prior y Cao, 1999). Los extractos preparados en metanol, son utilizados ya que han demostrado alta actividad antioxidante en muchas algas especies (Yan et al., 1999). Pero el estudio de los extractos etanólicos y acuosos es más interesantes, debido a su inocuidad, y porque los solventes apolares son los que mayor rendimiento en polifenoles ofrecen (Moure et al., 2001). En este sentido, nuestros resultados en cuanto a las diferencias encontradas entre extractos metanólicos e hidroalcohólicos respecto a su actividad antioxidante coinciden con observaciones previas de otros autores indicando que esta diferencia en la polaridad afecta a la actividad antioxidante (Marinova y Yanishlieva 1997; Duffy y Power, 2001). Rupérez et al., (2002) prepararon diferentes extractos de Fucus vesiculosus y encontraron diferencias significativas en cuanto a su capacidad antioxidante. Pero por otro lado se hace complicado comparar la actividad antioxidante detectada en las diferentes macroalgas estudiadas con anterioridad, porque cada autor utiliza protocolos de extracción diferente lo que dificulta las comparaciones (Zubia et al., 2007). Además la cualidad de los extractos así como la capacidad antioxidante que muestran no sólo depende del tipo de extracción y características especificas de la especie sino también de la situación geográficas, condiciones fisiológicas de donde proceden las muestras, tal y como han señalado algunos autores al confirmar que la desecación causa estrés oxidativo en trabajos realizados con las macroalgas Fucus spp., Mastocarpus stellatus y Chondrus crispus (Collen y Davison 1999a), y la especie Stictophonia arbuscula (Burrit et al., 2002). En relación al contenido en compuestos fenólicos de las algas pertenecientes a las divisiones Rhodophyta, Phaeophyta y Chorofita oscila generalmente entre 0 y 5% del peso seco, aunque hay estudios que Capítulo I ! photosynthetic and xanthophylls cycle pigments in the intertidal green alga Ulva lactuca. Planta 215: 502-509. Bischof, K., Gómez, I., Molis, M., Hanelt, D., Karsten, U., Lüder, U., Roleda, M.Y., Zacher, K., Wiencke, C. 2006. 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Tal y como ha sido expuesto en el Capitulo I, son numerosos los trabajos publicados que hacen referencia a la actividad antioxidante de algunas especies de macroalgas en modelos experimentales in vitro o in vivo bajo múltiples y variadas condiciones medioambientales (Fujimoto, 1990; Matsukawa et al., 1997; Le Tutour et al., 1998; Connan et al., 2007; Zubia et al., 2007; De la Coba et al., 2009). Sin embargo, la utilización de extractos obtenidos a partir de algas cultivadas como fuente de sustancias antioxidantes naturales ha sido escasamente abordada. Una limitación importante para la obtención y ensayo de productos derivados de las algas es la propia dificultad para la producción sostenible de biomasa con características estables o reproducibles. Esta limitación ha sido superada con el desarrollo de las técnicas para el cultivo de macroalgas en sistemas intensivos bajo un alto grado de control (Bidwell et al., 1985; Friedlander y Levy, 1995). Las condiciones controladas permiten, en algunos casos, dirigir el metabolismo hacia la síntesis de sustancias de interés aplicado, bien asociadas al metabolismo primario (carbohidratos, proteínas o pigmentos), bien asociadas al metabolismo secundario (lípidos, carotenoides y otro tipo de compuestos bioactivos) (Friedlander et al.,1995; GómezPinchetti et al., 1998; Neori et al., 2004). El cultivo intensivo de macroalgas creciendo de forma libre (sin necesidad de un sustrato) es realizado en tanques en los que se establece un sistema de agitación del medio y la biomasa. En estos sistemas la producción de biomasa por unidad de superficie o volumen cultivado es elevada, en contraste con su principal desventaja, los altos costes de producción relacionados, fundamentalmente, con los elevados costes de bombeo de agua, agitación del medio y en ocasiones el enriquecimiento extra de CO2 (Friedlander y Levy, 1995). El control de las variables físicas, químicas y biológicas, sus interrelaciones y su efecto sobre la calidad de la biomasa en estos sistemas de cultivo, ha sido ampliamente estudiado a través del desarrollo, hasta la escala comercial, del cultivo de especies de interés industrial, principalmente de los géneros Gracilaria y Chondrus (Bidwell et al., 1985; Friedlander y Levy, 1995; Braud, 2006). La importancia de factores como el diseño del tanque, el bombeo y movimiento/agitación del agua/medio de cultivo, la irradiación, la temperatura, el Capítulo II 2.3.2.2. Sistemas de cultivo de macroalgas y diseño experimental Para el cultivo de macroalgas a la escala de planta piloto se han utilizado fotobiorreactores de metacrilato (FBR) con volumen de 30 L y superficie de 0,07m2. La aireación se inyectó mediante una bomba soplante (SIEMENS Elmo-G) desde la base con el objetivo de crear una turbulencia (Fig. 2.2.) y agitación permanente. La salida de aire por tubos perforados en el fondo de los FBR originó un burbujeo que permitió que las algas crecieran mantenidas en la columna de agua. Figura 2.3. Imágenes de tres especies cultivadas en el biofiltro Caulerpa racemosa, Grateloupia dichotoma y Laurencia majuscula. Los experimentos se llevaron a cabo los meses de Agosto y Septiembre del 2004. Las especies estuvieron en cultivo un total de cuatro semanas con aporte de efluente de piscifactoría en circuito abierto. La densidad de algas al inicio del cultivo fue de 18 g l -1 y la tasa de renovación de 8.5 vol d-1. Fig. 2.2. Esquema experimental del FBR condiciones de cultivo. Capítulo II Las condiciones de luz del sistema de cultivo, determinadas por la localización del cultivo bajo invernadero, recibieron una irradiación máxima de 60 Wm-2 PAR (400700nm) y radiaciones UV-A y UV-B nulas. Estas medidas de irradiación solar fueron obtenidas mediante el equipo ELDONET(European Ligh Dosimeter NETwork) instalado en el CBM (Fig.2.4). Es un radiómetro de banda ancha que mide la radiación solar incidente en tres bandas espectrales: PAR (400 nm – 700 nm), UV-A (315 nm – 400 nm) y UV-B (280 nm – 315 nm). Utiliza una esfera integradora de 10 cm para recoger tanto la radiación directa como indirecta cuya apertura está protegida por una esfera de cuarzo. El software WinDose 2000 integra las medidas de radiación (W m-2) a lo largo del tiempo y las almacena en un fichero de datos diario. Figura 2.4. Equipo de trabajo con el cual se midió la irradiación solar recibida en las diferentes localizaciones de los cultivos de macroalgas: receptor del sensor Eldonet (European Ligh Dosimeter NETwork), que aporta medidas continuas de la radiación solar incidente (PAR; UVA; UV-B) (W m-2). La absorción de radiación PAR del FBR de metacrilato era del 6.5 %, y la medida se realizó con un fotómetro-radiómetro cuántico LICOR (Li-1400), un datalogger (almacenamiento de datos) preparado para la adquisición de datos de diferentes tipos de sensores de radiación PAR. Las medidas se tomaron acoplando un sensor esférico PAR (SPQA-2770). Las medidas de radiación de este equipo se toman en las unidades: µmoles de fotones m-2 s-1. Todas las medidas de pH se llevaron a cabo con pH-metro 507 (CRISON). Las medidas de la concentración de oxígeno disuelto (DO) y temperatura tanto para el tanque de peces como para los tanques de algas fueron obtenidas con un oxigenómetro DO100 (Cole-Palmer). Además se utilizó un oxigenómetro Oximatic 700 (WTW) para realizar medidas en continuo. Capítulo II Figura 2.5. Equipo de trabajo (datalogger , adaptador, sensor esférico) con el cual se midió la radiación PAR que recibían las macroalgas en el fotobiorreactor. Las medidas de radiación de este equipo se toman en las unidades: µmoles de fotones m-2 s-1. 2.3.2.3. Biofiltración de N-amonio Semanalmente, durante el periodo experimental se realizaron análisis para la determinación de la capacidad de biofiltración de N-amonio de las especies ensayadas. Después de ajustar la densidad de la biomasa de cada FBR. Se determinaron las eficacias de eliminación (NUE) y asimilación (NUR) de N-amonio en un periodo no superior a 24 horas. Las muestras analizadas se tomaron de los tanques de peces, flujo de entrada y de la salida de cada FBR. También se tomaron muestras de agua de marcomo control. 2.3.2.3.1. Análisis de amonio La concentración de amonio fue determinada espectrofotométricamente de acuerdo con el método de (Patton y Crouch, 1977). Las muestras fueron tratadasen presencia de fenol, un donador de cloro (hipoclorito de sodio) y un agente complejante (citrato alcalino) cuya misión es evitar la precipitación de hidróxidos metálicos y otros compuestos, el nitroprusiato actúa como catalizador. El resultado de esta reacción es la formación de un compuesto coloreado indofenólico de color azul y es medido a una longitud de onda de 660nm. Protocolo Para la realización de este ensayo inicialmente se prepararon las siguientes disoluciones, a las concentraciones indicadas: disolución de fenol (DF): 0.1g/ml en alcohol etílico 95%, disolución nitroprusiato (DN): 5 · 10 -3 g/ml en agua destilada, disolución alcalina (DA): 0.2 g/ml de citrato de sodio y 0,01 g/ml de hidróxido de sodio en agua destilada, disolución de hipoclorito de sodio (DH): 1.5 N y la disolución Capítulo II oxidante (DO): mezcla (DA) con (DH) en proporción 4:1. A 10 ml de muestra, por triplicado, se añadieron 400 µl de la disolución de fenol, 400 µl de la disolución de nitroprusiato y 1 ml de la disolución oxidante. Se agitaron bien los tubos tras la adición de cada disolución. Los tubos tapados, se incubaron a temperatura ambiente (20-24 ºC) y sin luz directa durante una hora. Paralelamente se preparó una curva patrón con cloruro de amonio a concentraciones entre 10-90 µM. Como blanco se empleó agua de mar. Posteriormente, se midió la absorbancia a 640 nm. Figura 2.6. Protocolo análisis de amonio (Patton y Crouch, 1977). 2.3.2.3.2. Tasas de biofiltración y velocidad de absorción de amonio La tasa de biofiltración es el porcentaje reducción de la concentración de amonio y refleja la eficacia con la que las algas son capaces de eliminar el amonio presente en el medio. La eficiencia de biofiltración (NUE) fue calculada como: NUE = 100- (Cs/Ce * 100) donde Cs es la concentración en la salida del fotobioreactor y Ce es la concentración en la entrada. La velocidad de asimilación de amonio NUR expresado en µmol l-1 h-1 fue calculada como: NUR = Fi * (Ce-Cs) / L siendo, Fi el flujo de entrada, Cs(µmol l-1 h -1) la concentración en la salida del fotobioreactor y Ce (µmol l-1 h-1)la concentración en el flujo de entrada y L, volumen del fotobiorreactor. Capítulo II 2.3.3. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE (Capítulo I) 2.3.3.1. Estudio de la actividad antiradical (Ensayo DPPH) 2.3.3.2. Poder reductor 2.3.4. DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS TOTALES(Capítulo I) 2.3.5. EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PIGMENTOS (Capítulo I) 2.3.5.1. Obtención de los extractos 2.3.5.2. Determinación de pigmentos liposolubles 2.3.5.3. Determinación de pigmentos hidrosolubles 2.3.6. ANÁLISIS DE CARBONO Y NITRÓGENO (Capítulo I) La metodología utilizada para estas determinaciones (Desde 2.3.3. hasta 2.3.6) es descrita en profundidad en el Capítulo I. 2.3.7. ANÁLISIS ESTADISTICO Todos los valores representados corresponden a valores medios±el error estándar de las réplicas realizadas para cada ensayo. Se realizó un contraste de medias mediante una prueba de análisis de varianzas (ANOVA). Algunos resultados además se analizaron aplicando la comparación de medias mediante en test de Tukey B. El nivel de significación fue del 95% (α=0.95) en todos los casos. El análisis de correlación de Pearson se realizó con intervalos de confianza del 95 y 99%. Los análisis estadísticos se realizaron con el programa informático SPSS para MAC OS X. 2.4. RESULTADOS 2.4.1. RESPUESTA DE LAS ESPECIES ENSAYADAS A LAS CONDICIONES DE CULTIVO Las especies ensayadas respondieron en general positivamente a las condiciones de cultivo descritas, mostrando en algunos casos adaptaciones morfológicas representativas de la dinámica de los FBR. La rotación permanente del sistema de cultivo induce a que las especies cultivadas no presenten estructuras de fijación y al desarrollo de morfologías pseudo-esféricas (en las especies no foliosas, y sobre todo en las especies de estructura ramificada de crecimiento apical). A continuación se muestran las imágenes más representativas (Fig. 2.7., 2.8., 2.9). El orden de adaptación al sistema y condiciones de cultivo observado durante el ensayo fue, Caulerpa racemosa, Ulva rigida, Hypnea spinella >Codium intertextum, Grateloupia dichotoma, Laurencia majuscula >Pterocladiella capillacea, Halopithys incurva >Cystoseira abies-marina >Fucus spiralis (Tabla 2.2.). Capítulo II Tabla 2.2. Resumen comparativo de las especies ensayadas en el sistema de cultivo, indicado de mayor a menor adaptación (++++,+++,+ -). Figura 2.7. Cambio de morfología de Caulerpa racemosa en cultivo en fotobiorreactor. Las imágenes de la parte interior fueron observadas a la lupa, corresponden al interior de la morfología “bola”observada tras el cultivo durante cuatro semanas en fotobiorreactor. Especies Adaptación a las condiciones de cultivo C. intertextum +++ C. racemosa ++++ U. rigida ++++ P. capillacea ++ H. spinella ++++ G. dichotoma +++ H. incurva ++ L. majuscula +++ F. spiralis - C. abies-marina + Capítulo II En el cultivo de Caulerpa racemosa se pudo observar la formación paulatina de una especie de “bolas” provocado por el hidrodinamismo del sistema de cultivo que alcanzaron una media de 5 cm transcurrido el mes de ensayo. Pero al observar el interior de estas “bolas” a la lupa, se pudo comprobar el sombreado que producía esta morfología a la parte interior de la misma (Fig 2.8.). Las algas rojas junto con las verdes son las que presentaron mejor adaptación. A modo de ejemplo, se muestra el cambio de aspecto que se observó en Pterocladiella capillaceae (Fig 2.8.) la cual presenta un color oscuro y brillante cultivada en alto contenido de N-amonio que carece en la naturaleza. Por el contrario, la adaptación de las especies pardas cultivadas en el ensayo no fue positiva, observando una decadencia en el tejído de Fucus spiralis (Fig. 2.9) y coloración turbia del agua. Figura 2.8. Cambio de morfología observada en Pterocladiella capillaceae (imágenes superiores) y Fucus spiralis (imágenes inferiores) en cultivo en fotobiorreactor. A: día 0, B: después de un mes. 2.4.2. ESTUDIO DE BIOFILTRACIÓN DE LAS ESPECIES Un control semanal permitió el cálculo del amonio biofiltrado por las especies de macroalgas así como la velocidad de absorción a lo largo de las cuatro semanas en las que transcurrió el experimento. Los valores mostraron diferencias significativas (p<0.05). Durante el periodo de ensayo la concentración de NH4+ en la entrada de los fotobiorreactores fue de 81.5 (± 23.4) µM. Capítulo II La biofiltración es el porcentaje de amonio eliminado del total que entra en cada sistema de cultivo. Por ello, los resultados responden al número de tasas de renovación y la capacidad de absorción de cada especie dentro del sistema. La capacidad biofiltradora (NUE) y velocidades de absorción de amonio (NUR) de las especies, fue alta en general tal y como se resume en la Tabla 2.3., siendo las algas pardas Fucus spiralis y Cystoseira abies-marina las que mostraron resultados más bajos, no pudiendo terminar el ensayo de cultivo por su falta de adaptación al sistema de cultivo planteado en el experimento. Fucus spiralis, se cosechó la semana 2 y Cystoseira abies-marinala semana 3. La eficiencia media de eliminación máxima fue del 61 % y el valor mínimo fue cercano al 17% observados ambos en la especie roja P. capillaceae. Las especies Codium intertextum, Caulerpa racemosa y Ulva rIgida presentaron valores máximos cercanos al 48 % y mínimos de 23, 32 y 43 % respectivamente. Tabla 2.3.Resumen comparativo de la eficiencia de asimilación de amonio NUE (%) y velocidades de absorción NUR (µmol l-1h-1 ) de las especies de macroalgas estudiadas (media ± desv, n=4). En paréntesis se señala la semana en la que se obtuvo el máximo y mínimo de asimilación de amonio. La reducción del los niveles de NH4+ en el efluente por parte de las algas pardas fueron en general los más bajos, siendo estos valores de 20 y 27 % correspondientes Especies NUE (%) NUE Máx-Min NUR (µmol l-1h-1) C. intertextum 36 47(S2)-23(S1) 6.6 ± 2.6 C. racemosa 42 48(S2)-32 (S4) 9.44 ± 2.3 U. rigida 45 47(S1)-43(S2) 10.49 ± 2.8 P. capillacea 36 61(S4)-17(S1) 8.00 ± 4.5 H. spinella 37 31(S2)-47(S4) 11.31 ± 3.45 G. dichotoma 50 54(S3)-42(S4) 11.41 ± 2.8 H.incurva 33 39(S3)-30(S1) 7.47 ± 1.3 L. majuscula 48 55(S4)-42(S3) 8.68 ± 3.2 F. spiralis 27 33(S1)-20(S2) 7.23 ± 2.3 C. abies-marina 20 21(S1)-19(S3) 4.57 ± 1.5 Capítulo II a F. spiralis y a C. abies-marina respectivamente. La tasa de incorporación de NH4+(NUR) presentó diferencias significativas entre las diferentes especies ensayadas, encontrando los valores más altos entre las especies H. musciformis, G. dichotoma y U. rigida 11.31(± 3.45) µmol l-1h-1, 11.41(± 2.8) µmol l-1h-1 , 10.49 (± 2.8) µmol l-1h-1 , respectivamente. El principal efecto de la tasa de recambio es la cantidad de amonio suministrado a las algas por unidad de tiempo, de modo que con una tasa de renovación de 8.5 vol d-1 la media en general fue de 8.5 (± 0.9) µmol l-1h-1. 2.4.3. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE 2.4.3.1. Ensayo DPPH La actividad antioxidante mostrada (Fig. 2.10, 2.11) corresponde a extractos de macroalgas cultivadas durante un mes dentro del sistema de policultivo integrado (SPI) en alto contenido de N-amonio. Estos resultados, muestran diferencias significativas (p<0.05) en la actividad detectada en las tres divisiones Chlorophyta, Rhodophyta y Phaeophyta mediante el ensayo DPPH, extractos metanólicos (Fig. 2.10) e hidroalcohólicos (Fig. 2.11) donde se han representado los valores medios (n=9) y desviaciones. Figura 2.10. Actividad antioxidante (% barrido del radical libre) detectado en extractos metanólicos de macroalgas cultivadas (media ± desv, n=9). Las especies se representan mediante las siguientes iniciales,Ci: Codium intertextum,Cr: Caulerpa racemosa, Ur: Ulva rígida,Pc: Pterocladiella capillacea,Hs: Hypnea spinella, Gd: Grateloupia dichotoma,Hi : Halopithys incurva,Lm: Laurencia majuscula, Fs : Fucus spiralis,Ca: Cystoseira abies-marina. Capítulo II De todos los extractos estudiados, los valores encontrados varían entre máximos de 90.36 % de barrido de radical libre en H. incurva y mínimos de 9.84 % en Hypnea spinella detectados ambos en los extractos metanólicos. En estas comparativas no se ha incluido la ausencia de actividad del extracto metanólico de Ulva rigida. Entre los extractos metanólicos de las especieS de la División Chlorophyta la actividad antioxidante disminuye de Caulerpa racemosa> Codium intertextum >Ulva rigida (que no muestra actividad) y el orden de la actividad detectada en los extractos hidroalcohólicos fue el mismo. Todos los extractos metanólicos e hidroalcohólicos de las especies de algas rojas mostraron actividad antioxidante. Estos valores en los extractos metanólicos disminuyen H.incurva > L.flexilis> P. Capillacea > G.dichotoma> H. spinella . Figura 2.11. Actividad antioxidante (% barrido del radical libre ) detectado en extractos hidroalcoholicos de macroalgas cultivadas (media ± desv, n=9). Las especies se representan mediante las siguientes iniciales,Ci: Codium intertextum,Cr: Caulerpa racemosa, Ur: Ulva rígida,Pc: Pterocladiella capillacea,Hs: Hypnea spinella, Gd: Grateloupia dichotoma,Hi : Halopithys incurva,Lm: Laurencia majuscula, Fs : Fucus spiralis,Ca: Cystoseira abies-marina. En cuanto a los resultados obtenidos de los extractos hidroalcohólicos el orden varía significativamente, H.incurva> G.dichotoma> P. capillacea> L.flexilis> H. spinella. Entre los resultados de las especies pardas, destacar la alta actividad detectada en ambas siendo muy similar en ambas pero significativamente superior el detectado en los extractos hidroalcohólicos. Capítulo II Figura 2.13. Representación gráfica del análisis de correlación entre la actividad antioxidante detectada entre el ensayo DPPH (% barrido de radicales libres) respecto a los extractos metanólicos(●Clorofitas●Rodofitas●Feofitas) (R2 = 0.641) y (R2 = 0.519) respecto a los extractos hidroalcohólicos (■Clorofitas■Rodofitas ■Feofitas). En la parte inferior de la figura se representan los resultados de correlación entre el poder reductor (µg AA mg-1) y el contenido en polifenoles (% peso seco) (R2=0.652) con extractos metanólicos (●Clorofitas●Rodofitas●Feofitas) y (R2=0.769) con extractos hidroalcohólicos (■Clorofitas■Rodofitas ■Feofitas) respectivamente. El resultado de la correlación de Pearson mostró una correlación positiva entre el extracto metanólico y actividad antioxidante (tanto en el ensayo DPPH como en el poder reductor) pero presentó una correlación negativa tanto con la eficiencia de biofiltración (NUE) de las especies como respecto a la tasa de incorporación de nitrógeno (NUR) . En un nivel de significancia de (p<0.01) respecto a la biofiltración (NUE) y un nivel de significancia de (p<0.05) respecto a la velocidad de incorporación de nitrógeno (NUR). La correlación del contenido en nitrógeno de las especies (mg N· g PS-1) con respecto a la biofiltración (NUE) y tasa de absorción de nitrógeno (NUR) relativamente baja también. Y respecto a la actividad antioxidante (tanto en el ensayo DPPH como en el poder reductor) fue negativa en ambos extractos (EM y EH). Capítulo II Tabla 2.10. Se muestran los coeficientes de correlación de Pearson para las variables D-EM, la actividad antioxidante detectada mediante el ensayo DPPH con extractos metanólicos; D-EH, la actividad antioxidante detectada mediante el ensayo DPPH con extractos hidroalcohólicos; P-EM, actividad antioxidante detectada mediante el poder reductor con extractos metanólicos; P-EH, actividad antioxidante detectada mediante el poder reductor con extractos hidroalcohólicos; N, contenido en nitrógeno ; C, contenido en carbono; C:N, relación carbono nitrógeno; NUE, biofiltración de N-amonio; NUR, velocidad de absorción de N-amonio. 2.4.6. CONTENIDO EN CARBONO Y NITRÓGENO La relación C:N de las especies cultivadas (Fig. 2.14) mostraron diferencias significativas tanto entre los tres phylum como dentro de cada uno de ellos (p<0.05). Entre las algas verdes Codium intertextum es la que mostró menor relación C:N siendo este valor de 6.6%. Ulva rigida y Caulerpa racemosa muestran valores de 13.5 % y 8.04% respectivamente. Entre las algas rojas cultivadas, la relación C:N máxima se detectó en Halopithys incurva 8.65 % seguida en orden decreciente de Grateloupia dichotoma y Laurencia majuscula 8.42 % y 7.41%. La relación más baja dentro de este phylum correspondió a Pterocladiella capillacea e Hypnea spinella 6.91 y 6.29 % respectivamente. Entre las algas pardas, Fucus spiralis se detectó una relación de 10.8 % y en Cystoseira abies-marinade 15.8 %. El contenido de N mostró diferencias significativas entre las especies cultivadas (p<0.05). El bajo contenido Ulva rigida fue significativamente inferior en comparación a las algas verdes del ensayo. D-EM D-EH P-EM P-EH N C C:N NUE NUR D-EM 1 D-EH 0.780** 1 P-EM 0.647* 0.577 1 P-EM 0.722* 0.777** 0.951** 1 N -0.150 -0.575 -0.193 -0.411 1 C 0.039 -0.219 -0.128 -0.275 0.730* 1 C/N 0.228 0.552 0.039 0.260 -0.831** -0.332 1 NUE -0.805** -0.832** -0.294 -0.518 0.385 0.120 -0.549 1 NUR -0.716* -0.736* -0.265 -0.481 0.322 0.182 -0.442 0.954** 1 **. La correlación es significativa al nivel 0.01 (bilateral). *. La correlación es significante al nivel 0.05 (bilateral). Capítulo II Figura 2.14. Relación C:N en las diez especies de macroalgas cultivadas (media ± desv, n=3) En cambio, entre las algas rojas el contenido en N fue significativamente superior en Pterocladiella capillacea. Entre las algas pardas también se detectaron diferencias significativas entre ambas especies. Tabla 1.10. Contenido en N (mg g PS-1) y C (mg g PS-1) en las especies cultivadas. Especies (mg N· g PS-1) (mg C · g PS-1) C.intertextum 35.47 ± 0.20 236.22 ± 0.8 C.racemosa 30.75 ± 0.65 247.26 ± 4.78 U.rigida 19.45 ± 0.14 262,46 ± 0.78 P.capillacea 57.35 ± 0.75 396.27 ± 0.82 H.spinella 44.00 ± 0.33 276.80 ± 6.81 G.dichotoma 37.14 ± 0.55 312.83 ± 0.89 H.incurva 31.42 ± 1.28 271.83 ± 6.80 L.majuscula 39.07 ± 0.95 289.24 ± 2.64 F.spiralis 27.81 ± 1.79 302.75 ± 20.36 C.abies-marina 15.30 ± 0.08 243.89 ±3.73 Capítulo II 2.5. DISCUSIÓN Los trabajos dirigidos a evaluar el potencial antioxidante de los extractos de algas informan, en su gran mayoría, han sido realizados en macroalgas recolectadas de la naturaleza (Kuda et al., 2005; Santoso et al., 2004; Zhang et al., 2007; Zubia et al., 2007, 2009). El presente estudio, a nuestro conocimiento, es el primero en evaluar la actividad antioxidante de los extractos obtenidos a partir de macroalgas cultivadas en un biofiltro en el que la fuente de nutrientes con un alto contenido en N-amonio proviene de los efluentes de un sistema de cultivo de dorada (Sparus aurata). La disponibilidad de nitrógeno, como nutriente esencial, es uno de los factores importantes para evaluar los estados fisiológico y bioquímico, y sus respuestas, de las macroalgas crecidas en sistemas de cultivo intensivo. Dada la importancia industrial de las algas agarófitas, el efecto de la adición y limitación de nitrógeno sobre los cambios en los componentes bioquímicos en especies del género Gracilaria cultivadas en sistemas intensivos durante periodos de tiempo prolongados, han sido investigados ampliamente (Bird et al. 1981; 1982; Lapointe 1981; Lapointe y Duke, 1984; Levy y Friedlander, 1990; Friedlander et al., 1991; Haglund y Pedersen, 1993). Sin embargo, existe poca información sobre los procesos bioquímicos que la disponibilidad de N tiene sobre la activación de las defensas antioxidantes. Los resultados obtenidos en los ensayos descritos en el presente capítulo sugieren que la fuente y la concentración de nitrógeno han mostrado un efecto directo sobre los cambios en las actividades antioxidantes detectadas, principalmente debido a los cambios en la composición bioquímica de las especies estudiadas. La capacidad de adaptación al sistema de cultivo establecido de la mayoría de las especies ensayadas y los porcentajes de biofiltración de amonio determinados, muestran que durante periodos experimentales cortos, no superiores a un mes, estas especies son capaces de responder a situaciones de vida libre en la columna de agua bajo elevadas concentraciones de nutrientes, funcionando como trampas de N-amonio y eliminando la carga de nutrientes provenientes de los efluentes, tal y como anteriormente ha sido descrito en otros trabajos con diferentes especies (Neori et al., 1991; Shpigel et al., 1993; Jiménez del Río et al., 1996; Neori, 1996). Las especies que son morfológicamente más simples y que presentan altas relaciones superficie/volumen muestran una tasa de absorción de amonio mayor (Wallentinus, 1984: Hein et al., 1995; Taylor et al., 1998), lo que queda demostrado con especies como Ulva rigida (División Chlorophyta) y Grateloupia dichotoma (División Rhodophyta), con eficiencias de biofiltración medias cercanas al 50% en las condiciones ensayadas. No ocurrió así con las especies Capítulo II pertenecientes a la División Phaeophyta, que mostraron poca adaptación a la dinámica del sistema con valores de eficiencia de eliminación de amonio entre el 17 y el 27%, poco representativos en comparación a los obtenidos con el resto de especies. Estos resultados obtenidos con algas pardas concuerdan con los obtenidos en otros experimentos en los que especies no pertenecientes a los géneros conocidos como kelps (Laminaria, Undaria, Macrocystis), muestran poca capacidad de adaptación a los sistemas de cultivo en los que las condiciones de estrés a las que son sometidas (rotación libre en la columna agua con desarrollo de morfologías pseudo-esféricas, ausencia de estructuras de fijación, altas irradiaciones o elevada disponibilidad de nutrientes) conducen a la excreción de metabolitos que producen el colapso del sistema (Pedersen et al., 1996). Las morfologías esféricas, fundamentalmente en las especies no foliosas o ramificadas de crecimiento apical, son comunes y muestran diámetros que varían entre 1 y 25 cm dependiendo de la plasticidad de cada especie y la hidrodinamismo del sistema (Robledo y García-Reina, 1993). En nuestro estudio, este tipo de adaptaciones fueron encontradas en la especie Caulerpa racemosa cuyos individuos llegaron a alcanzar diámetros de hasta 5 cm. Una vez alcanzados estos tamaños, se detectó una disminución del crecimiento probablemente debido al autosombreado que se produce sobre las células interiores de la morfología generada, no favoreciendo la captación de energía luminosa y por lo tanto el crecimiento de la planta. Este tipo de crecimiento responde además a la disponibilidad de nutrientes, principalmente nitrógeno, que presentan los efluentes de piscifactoría. La morfología esférica aumenta las relaciones superficie-volumen del alga, aumentando la capacidad de incorporación de nutrientes como se ha observado en otras especies como Asparagopsis armata (Falkenbergia rufolanosa) cultivada en este tipo de efluentes (Figueroa et al., 2008; Mata et al., 2010). Estudios más recientes, en los que se compara la capacidad de asimilación de nitrógeno inorgánico disuelto (DIN) de diferentes especies de macroalgas, demuestran como especies con características de crecimiento oportunista como Ulva pertusa, muestran mayor afinidad por el nitrógeno disponible que otro tipo de especies morfológicamente más complejas como Gracilaria lemaneiformis, Undaria pinnatifida e Hizikia fusiforme (Liu et al., 2006). La actividad antioxidante medida como porcentaje de barrido antirradical en los extractos metanólicos e hidroalcohólicos obtenidos de las especies ensayadas previamente cultivadas en condiciones de alto aporte de N-amonio, mostraron diferencias significativas. Resultados similares fueron obtenidos mediante el ensayo del poder reductor. Pero hay una falta de información publicada sobre la capacidad Capítulo II antioxidante en especies de macroalgas procedentes de cultivo. Nuestro estudio sugiere una alta capacidad en las especies cultivadas y que los mecanismos antioxidantes que desempeñan estos extractos se basan principalmente en el barrido de radical. Los valores máximos se detectaron en las especies Halopithys incurva, Fucus spiralis y Cystosira abies-marina, resultado similar al estudio del capítulo I. Especies pertenecientes a estos órdenes pero recolectados de la naturaleza, han sido señalados por diversos autores como especies con alta capacidad antioxidante la actividad de las mismas en la naturaleza (Connan et al., 2007; Zubia et al., 2009). La variación en la actividad de los diferentes extractos es atribuída a la polaridad de los compuestos diferentes presentes en cada especie (Matanjun et al., 2008). Estos resultados eran esperados, considerando que la polaridad intermedia del metanol, permite la extracción de compuestos que presentan ciertas características hidrofóbicas (anillos aromáticos o cadenas laterales de hidrocarburos) con grupos funcionales y sustituyentes polares (grupos hidroxilo y carboxilo, azúcares, etc.) en la misma molécula a diferencia de los extractos hidroalcohólicos. De manera resumida, el orden de actividad antioxidante decreciente detectada mediante el ensayo DPPH en extractos metanólicos fue H.incurva >Fucus spiralis>Cystosira abies-marina> L.flexilis> P. Capillacea >Caulerpa racemosa> Codium intertextum G.dichotoma> H. spinella>Ulva rigida. En extractos hidroalcohólicos el orden decreciente fue, Cystoseira abies-marina>Fucus spiralis> H.incurva>Caulerpa racemosa> Codium intertextum> G.dichotoma> P. Capillacea >Ulva rigida> L.flexilis>H. spinella. La actividad del barrido del radical DPPH, expresada como EC50 (mg·ml -1), en las especies cultivadas pertenecientes a los phylum Chlorophyta, Phaeophyta y Rhodophyta mostraron también diferencias significativas entre los distintos extractos (p<0.05). Caulerpa racemosa (en ambos extractos) exhibió la mayor actividad con una EC50 muy baja 1.87 ± 0.12 mg·ml-1 (extracto metanólico) y 1.45 ± 0.01 mg·ml-1 (extracto hidroalcohólico). El extracto metanólico de la especie roja L. majuscula exhibió también una alta actividad de barrido de radicales libres 1.56 ± 0.11 mg·ml-1seguida dentro de este phylum de H. incurva (en ambos extractos) 2.54 ± 0.01 mg·ml-1 (extracto metabólico) y 2.66 ± 0.04 mg·ml-1 (extracto hidroalcohólico). Los siguientes datos más representativos correspondieron a los extractos de las algas pardas F. spiralis y Cystoseira abies-marina (en ambos extractos) con valores similares a H.incurva. En ningún caso estos extractos fueron similares a los antioxidantes comerciales, que mostraron una EC50 muy baja en el caso del ácido ascórbico 0.06 ± 0.01 mg·ml -1 seguido del propil galato 0.15 ± 0.19 mg·ml -1. Capítulo II Considerando los resultados obtenidos para el contenido en compuestos fenólicos totales, se observó una variación significativa entre todas las especies analizadas. Sin embargo, contrariamente a lo que cabría esperar, las especies recolectadas de la naturaleza (Capítulo I) presentaron contenidos en polifenoles mayores que los obtenidos con las especies cultivadas, aunque las correlaciones realizadas indican que la actividad antioxidante superior en las especies cultivadas está directamente relacionada con el contenido de este grupo de sustancias. El contenido de polifenoles en algas está directamente influenciado por la disponibilidad de nutrientes, factores ambientales como la salinidad, la irradiación, la radiación ultravioleta y la intensidad de la herbivoría (Targett y Arnold, 1998; Amsler y Fairhead, 2006; Jormalainen y Honkanen, 2008). La variación en el contenido en polifenoles puede ser la respuesta a cambios ambientales e incluso a la divergencia genética entre las poblaciones naturales, como ha sido descrito en Fucus vesiculosus (Jormalainen y Honkanen, 2004). Otros factores que influyen en la acumulación de compuestos fenólicos están relacionados con la estacionalidad o la localización de estos elementos en la planta (Connan et al., 2006; Abdala et al., 2011). Como ha sido discutido previamente, las situaciones de estrés bajo las condiciones de cultivo establecidas podrían explicar la síntesis, acumulación y exudación al medio de este tipo de elementos, como fue observado en el alga roja Halopithys incurva, y como también ha sido en el caso de trihidroxicumarina en algas verdes en ambientes variables como los charcos intermareales (Pérez-Rodríguez et al., 2003). Además los parámetros de cultivo y la disponibilidad de N-amonio durante el periodo de cultivo provocaron la acumulación de compuestos nitrogenados en la biomasa producida, fuente de los extractos ensayados. Esta observación se confirma con los resultados obtenidos para la concentración de pigmentos liposolubles (clorofila y carotenoides) e hidrosolubles (ficoeritrina), en función de la especie analizada, así como las relaciones C:N, que disminuyeron sustancialmente respecto a los resultados obtenidos en las mismas especies provenientes de la naturaleza. Varios autores han descrito en trabajos anteriores que el contenido de la ficoeritrina en algas rojas, y clorofila a en general, está positivamente correlacionado con el aporte de nitrógeno y los niveles de radiación (Lapointe, 1981; Bird et al.,1982; Vergara y Niell, 1993). Este hecho parece responder a un mecanismo de almacenamiento de nitrógeno en los periodos de disponibilidad de nitrógeno. Entre las especies ensayadas, Ulva rigida mostró las mayores concentraciones de clorofila a y carotenoides (0.27 ± 0.01 mg·g PS-1 y 0.07 ± 0.01 mg·g PS -1 respectivamente). Se ha demostrado que la concentración de pigmentos responde al resultados de los cambios en las Capítulo II concentraciones de las distintas formas orgánicas e inorgánicas de N (Bird et al.,1982; Horrocks, 1993). Sin embargo, cabe señalar que los extractos metanólicos de esta especie no mostraron actividad antioxidante en el ensayo de DPPH contrariamente a los resultados obtenidos mediante el ensayo del poder reductor donde se cuantificaron valores de 1.60 ± 0.20 equivalentes de acido ascórbico. La síntesis de ficobiliproteínas en algas rojas (tanto R-ficoeritrina como R-ficocianina) se produce a niveles bajos de irradiancia y cuando la disponibilidad de N es suficiente (Lapointe, 1981). La luz constituye un factor fundamental en el crecimiento de las algas bajo condiciones de cultivo, tanto como fuente de energía para la fotosíntesis, como por sus interrelaciones con otros parámetros. Sin embargo, una cantidad excesiva de irradiación puede ocasionar la disminución de la tasa fotosintética y, si se prolonga en el tiempo, producir daños en el aparato fotosintético. La alta densidad de las algas en el sistema, que alcanzó valores de 18 g l-1 en los fotobiorreactores, en combinación con el movimiento rotatorio que mantienen las algas en los cultivos como consecuencia de la aireación forzada, produce que los individuos queden expuestos a la luz durante cortos periodos de tiempo (efecto flash), lo que está igualmente relacionado con la plasticidad y el contenido en polisacáridos estructurales constituyentes de cada especie, y la afinidad por los nutrientes (Lobban et al., 1985 ).Todos estos factores influyeron positivamente en la concentración de ficoeritrina cuantificada en las cinco especies de algas rojas cultivadas, encontrándose valores máximos de 0.88 mg·g PS-1 en Pterocladiella capillaceae. El aumento del color rojo y el brillo de la biomasa han sido descritas anteriormente en cultivos de Gracilaria spp. (Lapointe et al., 1976). Gracilaria conferta crecida en efluentes de piscifactoría y radiación PAR + UVR, incrementó el contenido en biliproteínas unas 90% veces respecto a los controles crecidos en agua de mar (Figueroa et al., 2010) lo que fue observado igualmente en las especies de rodofitas ensayadas en nuestro estudio. La concentración de ficobiliproteínas detectada en algas en agua de mar es mucho menor a la hallada en las cultivadas en efluentes ricos en NH4+. Vergara y Niell (1993) demostraron que Corallina elongata mostró una proporción de proteínas pigmentadas y no pigmentadas variable en función del aporte de distintas concentraciones de N y la disponibilidad de luz. Esto parece funcionar como un mecanismo para el almacenamiento de N para los períodos siguientes, cuando los nutrientes son limitantes. De esta forma, cuando los organismos tienen limitación de algún nutriente esencial tal como el N se produce la degradación de los ficobilisomas para proporcionar el nutriente deficitario (Aráoz & Häder, 1997). Entre las sustancias identificadas con poder antioxidante en macroalgas también han sido descritas las Capítulo II ficobiliproteinas ficocianina (Romay et al., 1998) y ficoeritrina. La administración de ficoeritrina en ratas diabéticas aumento la situación general antioxidante por el aumento de bilirrubina, superóxido dismutasa, catalasa, las concentraciones de glutatión peroxidada y los antioxidantes no enzimáticos del sistema (Soni et al., 2009). Los resultados de otro trabajo, sugirieron que la proteína de ficoeritrina es fácilmente digerida para liberar el compuesto ficoeritrobilina durante el proceso de la digestión gastrointestinal en mamíferos, el cual mostró la capacidad de captación de radicales peróxidos, concluyendo que diversas actividades terapéuticas de la ficoeritrina parecen estar asociados con el compuesto ficoeritrobilina (Yabuta et al., 2010). Las especies de algas verdes Ulva rigida, Codium intertextum y Caulerpa racemosa presentaron un color verde intenso y un brillo metálico como puede ser observado en la biomasa cosechada. Debido a la alta capacidad de asimilación de amonio de estas especies, el contenido interno de nitrógeno aumentó de manera significativa como indicaron los bajos valores observados en las relaciones C:N. La relación C: N es un índice del estado fisiológico de las macroalgas (Duarte , 1992; Vergara et al., 1993). La relación en general muestra valores bajos cuando N fue abundante y aumenta cuando el aporte de N es limitado (ver resultados Capítulo I). La relación C:N con valores cercanos a 10 se ha descrito como óptimo o normal para el estado de nitrógeno de las algas y una proporción superior a 10 indica limitación de N (Lapointe y Ryther, 1979). En el presente estudio las relaciones C:N obtenidas en las especies cultivadas bajo alta disponibilidad de amonio mostraron disminuciones, en algunos casos hasta del 50%, respecto a las macroalgas provenientes de la naturaleza (creciendo bajo limitación de nutrientes). Este resultado, en los que la relación C:N disminuye con la mayor disponibilidad de nitrógeno, ha sido descrito en numerosos trabajos (Lapointe et al., 1976; Jackson, 1977; Hanisak, 1979; Lapointe y Tenore, 1981). El resultado de la correlación de Pearson mostró una correlación positiva entre el extracto metanólico y actividad antioxidante (tanto en el ensayo DPPH como en el poder reductor) pero presentó una correlación negativa tanto con la eficiencia de biofiltración (NUE) de las especies como respecto a la tasa de incorporación de nitrógeno (NUR) . En un nivel de significancia de (p<0.01) respecto a la biofiltración (NUE) y un nivel de significancia de (p<0.05) respecto a la velocidad de incorporación de nitrógeno (NUR) . La correlación del contenido en nitrógeno de las especies (mg N· g PS-1) con respecto a la biofiltración (NUE) y tasa de absorción de nitrógeno (NUR) relativamente baja también. Y respecto a la actividad antioxidante (tanto en el ensayo DPPH como en el poder reductor) fue negativa en ambos extractos (EM y EH). Estos resultados, no llevan a concluir que las especies con mayor Capítulo II capacidad de biofiltración muestran una menor actividad antioxidante. En las condiciones de cultivo ensayadas para las diferentes especies, el almacenamiento de nitrógeno podría estar también relacionado con la acumulación de otro tipo de metabolitos. La capacidad antioxidante de las macroalgas depende de la naturaleza y concentración de los antioxidantes naturales presentes en cada especie que pueden ser modificadas bajo condiciones de crecimiento controladas. Al analizar los resultados en su conjunto podemos destacar que los extractos, tanto metanólicos como hidroalcohólicos, obtenidos a partir de las especies Halopithys incurva, Fucus spiralis y Cystoseira abies-marina cultivadas en alta disponibilidad de nitrógeno mostraron actividades significativamente superiores a los obtenidos con otras especies y permiten establecer las bases para profundizar en las modificaciones que sobre las características de la biomasa y por tanto las moléculas constituyentes podrían ser obtenidas bajo condiciones de cultivo. Considerando los pobres resultados obtenidos con las especies de algas pardas, en cuanto a la capacidad biofiltradora se refiere, en los siguientes ensayos planteados nos centramos en el estudio exhaustivo de la asimilación de nutrientes, el cultivo y la actividad antioxidante del alga roja Halopithys incurva. 2.6. BIBLIOGRAFíA Abalde, J., Cid, A., Hidalgo, J.P., Torres, E., Herrero, C. 1995. Microalgas: Cultivo y aplicaciones. Primera ed. Monografías Nº26. Universidad da Coruña. A Coruña. 210 pag. Ackefors, H., Enel, M. 1990. Discharge of nutrients from swedish fish farming to adjacent sea areas. Ambio. 19:29-35. Afonso, J., Sansón, M. 1999. Algas, hongos y fanerógamas marinas de las Islas Canarias. Primera ed. Universidad de La Laguna. Santa cruz de Tenerife. 254 pág. Amsler, C.D., Fairhead, V.A. 2006. Defensive and sensory chemical ecology of brown algae. Adv Bot Res 43:1-91. Araoz, R., Häder, D.P. 1997. 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Entidad titular: Universidad de Málaga 3.-Inventores (p.o. de firma): De la Coba Luque, Francisca; Aguilera Arjona, José; López Figueroa, Félix.Título: Aminoácido tipo Micosporina (porphyra 334) como antioxidante . N. de solicitud: P200502161. País de prioridad: España Fecha de prioridad: 31 de agosto de 2005. Entidad titular: Universidad de Málaga 4.-Inventores (p.o. de firma): De la Coba Luque, Francisca; Aguilera Arjona, José; López Figueroa, Félix.Título: Aminoácido tipo Micosporina (M-gly) como antioxidante . N. de solicitud: P200502162. País de prioridad: España. Fecha de prioridad: 31 de agosto de 2005.Entidad titular: Universidad de Málaga 5.-Inventores (p.o. de firma): López Figueroa, Félix; Aguilera Arjona, José, De la Coba Luque, Francisca, Korbee Peinado, Nathalie.Título:Composición para protección solar a base de extractos de algas y líquenes .N. de solicitud: P200601662. País de prioridad: España. Fecha de prioridad: 6 de julio de 2006.Entidad titular: Universidad de Málaga 6.-Inventores (p.o. de firma): De la Coba Luque, F., Aguilera, Arjona, López Figueroa, F. Título: Uso de aminoácidos tipo micosporina (Shinorine para la prevención y tratamiento de estado anímicos N. de solicitud: P200701521País de prioridad: España. Fecha de prioridad: 1 de junio de 2007. Entidad titular: Universidad de Málaga 7.-Inventores (p.o. de firma): De la Coba Luque, F., Aguilera, Arjona, López Figueroa, F. Título:Uso de aminoácidos tipo micosporine (Shinorine) para la prevención de cataratas. N. de solicitud: P200701522 País de prioridad: España Fecha de prioridad: 1 de junio de 2007. Entidad titular: Universidad de Málaga 8.-Inventores (p.o. de firma): De la Coba Luque, F., Aguilera, Arjona, López Figueroa, F. Título:Uso de aminoácidos tipo micosporina (Shinorine) para la prevención y tratamiento de eritema actínico, fotocarcinogénesis y fotoenvejecimiento. N. de solicitud: P200701523 País de prioridad: España. Fecha de prioridad: 1 de junio de 2007. Entidad titular: Universidad de Málaga 9.-Inventores (p.o. de firma): De la Coba Luque, F., Aguilera, Arjona, López Figueroa, F. Título:Uso de aminoácidos tipo micosporina (Shinorine) como antioxidante o aditivo en productos alimentarios.N. de solicitud: P200701524.País de prioridad: España. Fecha de prioridad: 1 de junio de 2007. Entidad titular: Universidad de Málaga !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! Capítulo IV ! 10.-Inventores (p.o. de firma): De la Coba Luque, F., Aguilera, Arjona, López Figueroa, F. Título:Uso de aminoácidos tipo micosporina (Shinorine) para la prevención de la oxidación de productos cosméticos y farmaceúticos. N. de solicitud: P200701525. País de prioridad: España Fecha de prioridad: 1 de junio de 2007. Entidad titular:Universidad de Málaga 11.-Inventores (p.o. de firma): De la Coba Luque, F., Aguilera, Arjona, López Figueroa, F. Título:Uso de aminoácidos tipo micosporina (Porfira 334) en productos para la prevención de procesos carcinogénicos. N. de solicitud: P200702942 País de prioridad: España Fecha de prioridad: 7 de noviembre de 2007. Entidad titular:Universidad de Málaga 12.-Inventores (p.o. de firma): De la Coba Luque, F., Aguilera, Arjona, López Figueroa, F. Título:Uso de aminoácidos tipo micosporina (Porfira 334) en productos para la prevención y tratamiento terapéutico de Parkinson y Alzheimer.N. de solicitud: P200702943 País de prioridad: España Fecha de prioridad: 7 de noviembre de 2007Entidad titular: Universidad de Málaga 13.-Inventores (p.o. de firma): De la Coba Luque, F., Aguilera, Arjona, López Figueroa, F. Título:Uso de aminoácidos tipo micosporina (Porfira 334) en productos para la prevención de cataratas. N. de solicitud: P200702944. País de prioridad: España Fecha de prioridad: 7 de noviembre de 2007. Entidad titular: Universidad de Málaga 14.-Inventores (p.o. de firma): De la Coba Luque, F., Aguilera, Arjona, López Figueroa, F. Título: Uso de aminoácidos tipo micosporina (Porfira 334) en productos para la prevención y tratamiento del eritema actínico, fotocarcinogénesis y fotoenvejecimiento. N. de solicitud: P200702945País de prioridad: España Fecha de prioridad: 7 de noviembre de 2007. Entidad titular: Universidad de Málaga 15.-Inventores (p.o. de firma): De la Coba Luque, F., Aguilera, Arjona, López Figueroa, F. Título: Uso de aminoácidos tipo micosporina (Porfira 334) como antioxidante o aditivo en productos alimentarios. N. de solicitud: P200702946. País de prioridad: España Fecha de prioridad: 7 de noviembre de 2007. Entidad titular: Universidad de Málaga 16.- Inventores (p.o. de firma): De la Coba Luque, F., Aguilera, Arjona, López Figueroa, F. Título: Uso de aminoácidos tipo micosporina (Porfira 334) en la prevención de la oxidación de productos cosméticos y farmaceúticos. N. de solicitud: P200702947 País de prioridad: España. Fecha de prioridad: 7 de noviembre de 2007. Entidad titular: Universidad de Málaga. 17.-Inventores (p.o. de firma): De la Coba Luque, F., Aguilera, Arjona, López Figueroa, F. Título: Uso de a una mezcla purificada de aminoácidos tipo micosporina (asterina330 + palatina en productos para la prevención de procesos carcinogénicos. N. de solicitud: P200702948 País de prioridad: España Fecha de prioridad: 1 de junio de 2007. Entidad titular: Universidad de Málaga 18.-Inventores (p.o. de firma): De la Coba Luque, F., Aguilera, Arjona, López Figueroa, F. Título: Uso de a una mezcla purificada de aminoácidos tipo micosporina (asterina330 + palatina)en productos para la prevención y tratamiento terapeútico de Parkinson y Alzheimer. N. de solicitud: P200702949 País de prioridad: España.Fecha de prioridad: 7 de noviembre de 2007. Entidad titular: Universidad de Málaga 19.-Inventores (p.o. de firma): De la Coba Luque, F., Aguilera, Arjona, López Figueroa, F. Título: Uso de a una mezcla purificada de aminoácidos tipo micosporina (asterina330 + palatina)en productos para la prevención de cataratas.N. de solicitud: P200702950 País de prioridad: España Fecha de prioridad: 7 de noviembre de 2007. Entidad titular: Universidad de Málaga 20.-Inventores (p.o. de firma): De la Coba Luque, F., Aguilera, Arjona, López Figueroa, F. Título: Uso de a una mezcla purificada de aminoácidos tipo micosporina (asterina330 + palatina)en productos para la prevención y tratamiento de eritema actínico, fotocarcinogénesis y fotoenvejecimiento. N. de solicitud: P200702951 País de prioridad: España Fecha de prioridad: 7 de noviembre de 2007. Entidad titular: Universidad de Málaga Capítulo IV ! ! 21.- Inventores (p.o. de firma): De la Coba Luque, F., Aguilera, Arjona, López Figueroa, F. m Título: Uso de a una mezcla purificada de aminoácidos tipo micosporina (asterina-330 + palatina)Como antioxidante o aditivo en productos alimentarios . N. de solicitud: P200702952. País de prioridad: España Fecha de prioridad: 7 denoviembre de 2007. Entidad titular: Universidad de Málaga 22.- Inventores (p.o. de firma): De la Coba Luque, F., Aguilera, Arjona, López Figueroa, F. Título: Uso de a una mezcla purificada de aminoácidos tipo micosporina (asterina330 + palatina)En la prevención de oxidación de productos cosméticos y farmaceúticos. N. de solicitud: P200702953. País de prioridad: España Fecha de prioridad: 1 de junio de 2007. Entidad titular: Universidad de Málaga 23.- Inventores (p.o. de firma): De la Coba Luque, F., Aguilera, Arjona, López Figueroa, F.Título: Uso de aminoácido tipo micosporina (M-Gly) en la prevención de oxidación de productos cosméticos y farmaceúticos. N. de solicitud: P200702954. País de prioridad: EspañaFecha de prioridad: 7 de noviembre de 2007. Entidad titular: Universidad de Málaga 24.- Inventores (p.o. de firma): De la Coba Luque, F., Aguilera, Arjona, López Figueroa, F. Título: Uso de aminoácido tipo micosporina (M-Gly) como antioxidante o aditivo en productos alimentarios. N. de solicitud: P200702955País de prioridad: España Fecha de prioridad: 7 de noviembre de 2007. Entidad titular: Universidad de Málaga 25.- Inventores (p.o. de firma): De la Coba Luque, F., Aguilera, Arjona, López Figueroa, F. Título: Uso de aminoácido tipo micosporina (M-Gly) para la prevención y tratamiento de eritema actínico, fotocarcinogénesis y fotoenvejecimiento. N. de solicitud: P200702956 País de prioridad: España. Fecha de prioridad: 7 de noviembre de 2007. Entidad titular: Universidad de Málaga. De la Coba F, Aguilera J, Figueroa FL, de Gálvez MV, Herrera E. 2009. Antioxidant activity of mycosporine-like amino acids isolated form three red macroalgae and one marine lichen. J Appl Phycol 21:161-169 Doty, M.S and Santos, G.A.1978. Carrageenan from tetrasporic and cystocarpic Eucheuma species.Aquat. Bot., 4:143 Duarte, M. E. R.; Cauduro, J. P.; Noseda, D. G.; Noseda, M. D.; Gonc.alves, A. G.; Pujol, C. A.; Damonte, E. B.;Cerezo, A. S. 2004. The structure of the agaran sulfate from Acanthophora spicifera (Rhodomelaceae, Ceramiales) and its antiviral activity. Relation between structure and antiviral activity in agarans.Carbohydr. Res. 339, 335-347 Dunlap, W. C. & Shick, J. M. 1998. UV radiation absorbing mycosporine-like amino acids in coral reef organisms: abiochemical and environmental perspective. J. Phycol. 34:418–30. Dunlap, W. 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Entre las rojas destacan géneros (Polysiphonia, Heterosiphonia, y Bryothamnion) pertenecientes al Orden Ceramiales y entre las pardas géneros pertenecientes al Orden de las Fucales (Cystoseira, Fucus, Sargassum)(Yan et al., 1998; Zubia et al., 2007). En algas rojas los resultados más revelantes han sido descritos en dos especies pertenecientes al Orden Ceramiales, Brongniartella byssoides (0.14 ± 0.01 mg ml-1) y Polysiphonia lanosa (2.71 ± 0.01 mg ml-1) y una especie perteneciente al orden Gigartinales, Furcellaria fastigiata (1.39± 0.04 mg ml-1) (Zubia et al., 2009). En cambio no existe información sobre la capacidad antioxidante en especies de macroalgas cultivadas en efluentes de piscifactrorías (sistemas IMTA). Nuestro estudio sugiere una alta capacidad en las especies cultivadas y que los mecanismos antioxidantes que desempeñan estos extractos se basan principalmente en el barrido de radical. Una vez evaluadas las propiedades antioxidantes de los extracto de macroalgas procedentes tanto de la naturaleza como cultivadas dentro de un sistema de policultivo, actuando como biofiltros, el trabajo fue dirigido hacia el estudio de sus componentes químicos, que podrían ser responsables del potencial antioxidante evaluado. Los parámetros de cultivo y la disponibilidad de N-amonio tras un mes en cultivo provocaron cambios en la acumulación de compuestos en la biomasa producida, fuente de los extractos ensayados. Esta observación se confirmó con los resultados obtenidos de los componentes químicos con actividad antioxidante de naturaleza liposoluble (clorofila a y carotenoides) e hidrosoluble (polifenoles y ficoeritrina), así como las relaciones C:N, que disminuyeron sustancialmente respecto a los resultados obtenidos en especies provenientes de la naturaleza. El contenido de clorofila a en la naturaleza frente a las especies cultivadas es acusadamente menor en todas las especies excepto en las algas pardas, Fucus spiralis y Cystoseira abies marina, donde se observó una disminución de la concentración de clorofila a en cultivo de aprox. 20 % y 2 % respectivamente. La especie U. rigida mostró el mayor aumento en la concentración de pigmentos liposolubles tras el cultivo, la clorofila a aumentó un 81 % y los carotenoides un 85 % respecto a la detectada en el medio natural. Los resultados mostraron que las diez especies contenían compuestos fenólicos. H. incurva mostró el contenido más alto (4.86 % de su peso seco), mientras que los valores más bajos se observaron en G. dichotoma (0.73 %) (Capítulo I, Tabla 1.7). Tras un mes en cultivo con alto aporte de N-amonio y baja irradiación (PAR), el contenido en compuestos fenólicos totales varió significativamente entre todas las especies analizadas, llegando a disminuir un 27 % en H.incurva, 28% en C. abies marina y Discusión general! ! 246 63 % en F.spiralis, en comparación al contenido exhibido en el medio natural. En general, los niveles medios determinados en todas las especies fueron bajos, inferiores a 1.52 % exceptuando (Halopithys incurva, Fucus spiralis y Cystoseira abies-marina) y sólo en estas tres especies de la naturaleza se detectaron niveles interesantes (4.86%, 3.07% y 3.90% respectivamente). En la variante del ensayo con la adición de PVPP, polímero específico de los compuestos polifenólicos disueltos en medio ácido, sólo se cuantificaron polifenoles en las especies de algas pardas (F. spiralis y C. abies-marina) y la especie de alga roja (H. incurva) con concentraciones de 2.19%, 3.15% y 1.46% de su peso seco, respectivamente. Estos resultados disminuyeron tras el cultivo un 37 % en H. incurva, un 35 % C. abies-marina y un 88 % en F. spiralis. Además, confirmaron la sobreestimación sugerida por diversos autores al analizar en contenido mediante el método de Folin Ciocalteu, por la posible reacción con todos los compuestos oxidantes con un ciclo aromático (fenilalanina, tirosina, triptófano, ácido ascórbico) (Ragan y Glombitza, 1986). El contenido en compuestos fenólicos de las algas pertenecientes a la división Rhodophyta, Phaeophyta y Chlorophyta oscila generalmente entre 0 y 5% del peso seco, aunque hay estudios que muestran niveles de hasta 15-20% para las algas pertenecientes a la división Phaeophyta (Ragan y Jensen, 1977; Geiselman, 1980; Anderson y Velimirov, 1982; Steinberg, 1985, 1986; Ragan y Glombitza, 1986). En general los valores obtenidos en este trabajo son comparables a los de las algas pardas clasificadas como pobres en compuestos fenólicos (0-2% del peso seco) (Stein 1985,1986; Targett et al, 1992). El extracto de Fucus spiralis mostró un contenido en compuestos fenólicos inferior al valor publicado por Denton et al. (1990) para esta misma especie (8.14%) recolectada en Nova Scotia (Canadá). Sin embargo, ejemplares de Cystoseira abies-marina de la isla de Gran Canaria recolectados en una zona diferente, presentaron un contenido medio menor 0.5%, (Granado, 1996) que el obtenido en este trabajo siendo, 3.90 % en algas recolectadas y 2.80 % en cultivadas. Los valores para éste género van desde 0.3% en Cystoseira trinodis del norte australiano (Steinberg y Paul, 1990) hasta 4.4% en C. osmundacea recolectada en California (Steinberg, 1985). Las referencias en algas rojas indican contenidos en Polysiphonia lanosa, Brongniartella byssoides, Heterosiphonia plumosa y Furcellaria fastigiata, (5.73 % PS, 3.64 % PS, 3.45 % PS, 3.29 % PS, 3.25 % PS, respectivamente)(Zubia et al., 2009). La variación en el contenido en polifenoles puede ser la respuesta a cambios ambientales e incluso a la divergencia genética entre las poblaciones naturales, como ha sido descrito en Fucus vesiculosus (Jormalainen y Honkanen, 2004). Discusión general! ! 247 Otros factores que influyen en la acumulación de compuestos fenólicos están relacionados con la estacionalidad o la localización de estos elementos en la planta (Conan et al., 2007; Abdala et al., 2011). Como ha sido discutido previamente, las situaciones de estrés bajo las condiciones de cultivo establecidas podrían explicar la síntesis, acumulación y exudación al medio de este tipo de elementos, como fue observado en el alga roja Halopithys incurva, y como también ha sido observado en el caso de algas verdes en ambientes variables como los charcos intermareales, donde se ha descrito la presencia de trihidroxicumarina (Pérez-Rodríguez et al., 2003). El aumento más significativo en el contenido de ficoeritrina se midió en H. incurva (92 %). Este hecho ha sido descrito trabajos anteriores, apuntando que el contenido de la ficoeritrina en algas rojas, está positivamente correlacionado con el aporte de nitrógeno y la cantidd y calidad de la radiación (Lapointe, 1981; Bird et al.,1982; Vergara y Niell, 1993; Figueroa et al., 1995). Los análisis estadísticos revelaron que los factores (especies, naturaleza, cultivo y solvente) afectan de manera significativa (p<0.05) a los resultados de la actividad antioxidante de los extractos. Además, el coeficiente de correlación (R2) indicó que la actividad antioxidante en las especies está directamente relacionada con el contenido en polifenoles. No hay referencias sobre el contenido de fenoles totales en algas cultivadas en alto contenido de N-amonio, pero los resultados muestran una disminución en su contenido frente a las recolectadas en la naturaleza, lo que indica que las condiciones de cultivo en el sistema de biofiltración influyen en su síntesis. Las propiedades antioxidantes de estos compuestos, tanto en lo referido al atrapamiento de radicales libres como a la quelación de Fe2+, han sido bien documentadas (Rice-Evans et al., 1995; 1996; Bravo, 1998). De hecho, entre todos los componentes antioxidantes que fueron referidos anteriormente, los compuestos fenólicos han sido ampliamente relacionados con las propiedades antioxidantes de las macroalgas (Fujimoto y Kaneda, 1984; Yan et al., 1996; Zubia et al, 2007,2009). La capacidad de adaptación al sistema de cultivo establecido de la mayoría de las especies ensayadas y los porcentajes de biofiltración de amonio determinados, muestran que durante periodos experimentales cortos, no superiores a un mes, estas especies son capaces de responder a situaciones de cultivo libre (sin fijación a ninguna estructura) en la columna de agua bajo elevadas concentraciones de nutrientes, funcionando como trampas de N-amonio y eliminando la carga de nutrientes proveniente de los efluentes, tal y como anteriormente ha sido descrito en otros trabajos con diferentes especies (Neori et Discusión general! ! 248 al., 1991; Shpigel et al., 1993; Jiménez del Río et al., 1996; Neori, 1996). Las especies que son morfológicamente más simples y que presentan altas relaciones superficie/volumen muestran una tasa de absorción de amonio mayor (Wallentinus, 1984: Hein et al., 1995; Taylor et al., 1998), lo que queda demostrado con especies como Ulva rigida (Chlorophyta) y Grateloupia dichotoma (Rhodophyta), con eficiencias de biofiltración medias cercanas al 50% en las condiciones ensayadas. No ocurrió así con las especies pertenecientes a la División Phaeophyta, que mostraron poca adaptación a la hidrodinámica del sistema con valores de eficiencia de eliminación de amonio entre el 17 y el 27%, poco representativos en comparación a los obtenidos con el resto de especies. Estos resultados obtenidos con algas pardas concuerdan con los obtenidos en otros experimentos en los que especies no pertenecientes a los géneros conocidos como kelps (Laminaria, Undaria, Macrocystis), muestran poca capacidad de adaptación a los sistemas de cultivo en los que las condiciones de estrés a las que son sometidas (rotación libre en la columna agua con desarrollo de morfologías pseudo-esféricas, ausencia de estructuras de fijación, altas irradiaciones o elevada disponibilidad de nutrientes) conducen a la excreción de metabolitos que producen el colapso del sistema (Pedersen et al., 1996). Al analizar los resultados de los Capítulos I y II en su conjunto, podemos destacar que los extractos, los metanólicos e hidroalcohólicos, obtenidos a partir de las especies Halopithys incurva, Fucus spiralis y Cystoseira abies-marina fueron los más activos. Considerando los pobres resultados obtenidos con las especies de algas pardas, en cuanto a la capacidad biofiltradora se refiere, en los siguientes ensayos planteados nos centramos en el estudio exhaustivo de la asimilación de nutrientes, el cultivo y la actividad antioxidante del alga roja Halopithys incurva. Estos ensayos se llevaron a cabo bajo diferentes condiciones de radiación (PAR, PAR+UV) dentro de un sistema IMTA simple, peces-algas. La combinación de tanques, densidades de cultivo y tasas de renovación en los sistemas de cultivo en cascada permitieron maximizar la calidad de los efluentes, sin reducir los valores de producción de la especie cultivada. Los resultados tras la aplicación de N-NH4+ en forma de pulsos (Capítulo III, experimento 1), revelaron incrementos tanto en la producción como en la tasa de crecimiento a mayores concentraciones de Namonio tras un periodo prolongado de cultivo, alcanzando valores medios de 9.08 ± 1.90 g PS m-2 d-1 y 3.30 ± 0.60 % d-1 respectivamente. El aporte de pulsos de NH4+, afectó las relaciones C:N que mostraron una disminución fundamentalmente por el incremento de Nitróegeno interno.. En cambio los valores del contenido interno de Discusión general! ! 249 C no mostraron diferencias significativas entre los tratamientos a excepción de las algas que recibieron pulsos de NH4+ de 60 µM, indicando que en los tanques de cultivo siempre tienen carbono disponible, mientras el N está sujeto al aporte externo. Los resultados del cultivo de Halopithys incurva en tanques dispuestos en cascada (Capítulo III, experimento 2), permitieron la optimización de la depuración de efluentes de cultivo de Sparus aurata, al tiempo que reduce los costes del cultivo en cuanto a bombeo de agua. La elección de tanques de volumen decreciente para los niveles más bajos de la cascada permitió aumentar la frecuencia de renovación del agua, reduciendo el riesgo de limitación por nutrientes y manteniendo los valores de producción. El cultivo en cascada de Halopithys incurva el flujo de agua procedente del primer nivel de la cascada (nivel 1) no produjo ningún tipo de limitación por nutrientes de la producción y tasa de crecimiento en los cultivos del nivel 2 (Capítulo III, Tabla 3.3.). La mayor tasa de crecimiento obtenida en este nivel (3.3 % d -1), fue probablemente resultado de una mayor eficiencia en la utilización de la luz condicionada por el diseño del tanque de cultivo ya que los tanques semicirculares (SCT) empleados para el cultivo en el 2º nivel tienen una mayor relación superficie:volumen que los circulares (CPT), y la mitad de profundidad que éstos. Las mayores eficiencias de eliminación de amonio (NUE) se obtuvieron en el primer nivel del sistema siendo este valor de 45.9 %. Esto se explica porque al ser menor la tasa de renovación en este tanque, aumenta el tiempo de residencia del agua, lo que facilita el consumo de un mayor % de NH4+. Por el contrario la NUE se reduce en el 2º nivel del BF. Los cultivos de este nivel reciben una menor concentración de amonio, y en principio un flujo de agua limitado en nutrientes de forma general (principalmente nitrógeno y fósforo) al proceder del 1er nivel del BF, sin embargo la mayor tasa de renovación de agua aumenta la disponibilidad de nutrientes para el crecimiento de las algas. Es un hecho ampliamente demostrado que el aumento de la tasa de renovación incrementa la producción de biomasa (Lapointe y Ryther, 1978; Friedlander y BenAmotz, 1991). Los resultados obtenidos para la tasas de consumo de NH4+ (NUR) muestran un patrón contrario, obteniéndose mayores valores para los cultivos de 2º nivel del sistema. La relación inversa que existe entre la NUE y la tasa de renovación así como la directa entre la NUR y la tasas de renovación han sido descritas anteriormente en sistemas de cultivo de macroalgas (Jiménez del Río, et al., 1994; Muñoz y Varas, 1998; Buschmann et al., 2001; Hernández et al., 2002; Schuenhoff et al., 2006). Discusión general! ! 250 El co-cultivo de Halopithys incurva y Jania adhaerens (Capítulo III, experimento 3) en el sistema de biofiltración bajo las condiciones ensayadas, irradiación y aporte de nutrientes, confirmó la capacidad de adaptación y respuesta de ambas especies al crecimiento conjunto sin competencia. Las producciones más altas se obtuvieron en condiciones de alta irradiación (PAR+UV) con y sin aporte de nutrientes, obteniéndose en estas últimas condiciones, valores de producción cercanos a 54.5 (± 22.2) g PS m-2 d -1. La producción en condiciones de baja irradiación fue significativamente inferior, resultado que corrobora la importancia que juega la luz en los sistemas de cultivo de macroalgas (Lobban y Harrison, 1997; Lüning, 1990) junto con la temperatura. Aunque en nuestros experimentos, este último parámetro no es determinante debido a sus estrechas variaciones, de 19 a 24 º C, uno de los primeros trabajos al respecto, mostró una relación positiva entre la tasa de crecimiento y la temperatura en cultivo en tanques de Gracilaria tenuistipitata (Haglund y Pedersen, 1993). La capacidad de H. incurva para sostener el crecimiento quedo reflejada en la tasa de crecimiento experimentada a lo largo de las 6 semanas de duración del ensayo. Una vez más, las mayores tasas de crecimiento se relacionan de forma directa con la cantidad de luz (PAR+UV) que reciben los cultivos. H. incurva presentó tasas de crecimiento 3.6 % d-1 (con aporte de nutrientes) y 3.2 % d-1 (sin aporte de nutrientes). Los resultados de este experimento muestran que H. incurva puede actuar como un eficiente biofiltrador de los efluentes procedentes del cultivo intensivo de dorada, con valores de NUE del 100 % a los flujos de NH4+ ensayados (4.5 ± 2.6 mmoles h-1). Al igual que con otras especies de algas rojas ensayadas durante el desarrollo del proyecto Bifaro, como Gracilaria cornea o Hypnea spinella, se han mostrado eficiencias de biofiltración de hasta el 90 % (Gil Jeréz, 2010) similares a las obtenidas en sistemas integrados combinados de animales y macroalgas (Chow et al., 2001). La biomasa producida se evaluó empleando diferentes métodos in vitro, con el fin de completar el conocimiento de su potencial como fuente de antioxidantes. Los extractos empleados en estos ensayos fueron hidroalcohólicos (ETOH50) ya que es menos tóxico que el metanol resultando una opción mejor para la extracción de compuestos con fines alimentarios, nutracéuticos o funcionales (Hamburger et al., 2004). Los porcentajes de inhibición antirradical del ensayo DPPH fueron mayores que las del ensayo ABTS•+. El extracto más activo en ambos métodos fue el de H. incurva crecidas durante cuatro semanas bajo radiación PAR y aporte de N-amonio (Capítulo III, Ver tabla 3.9 y 3.10). La capacidad de los extractos de H. incurva para reducir el radical DPPH mediante la Discusión general! ! 251 donación de un átomo de hidrógeno o electrones ha sido entre aproximadamente 2 y 22 veces más débil que el ácido ascórbico y el propil galato. La concentración EC50 (índice de oxidación) del extracto de H. incurva fue aproximadamente 97.5 y 94 veces mayor que la requerida para el ácido ascórbico y el propil galato, respectivamente. El valor más bajo (2.42 ± 0.01 mg ml-1) correspondió a la biomasa de H. incurva obtenida tras cuatro semanas en cultivo bajo radiación PAR y aporte de N-amonio. Los resultados de EC50 más relevantes en algas rojas han sido descritos para dos especies pertenecientes al Orden Ceramiales, Brongniartella byssoides (0.14 ± 0.01 mg ml-1) y Polysiphonia lanosa (2.71 ± 0.01 mg ml-1) y una especie perteneciente al orden Gigartinales, Furcellaria fastigiata (1.39 ± 0.04 mg ml-1) (Zubia et al., 2010). La disponibilidad de nitrógeno, como nutriente esencial, es uno de los factores importantes para evaluar los estados fisiológico y bioquímico de las macroalgas crecidas en sistemas de cultivo intensivo. El efecto de la adición y limitación de nitrógeno sobre los cambios en los componentes de especies del género Gracilaria cultivadas en sistemas intensivos durante periodos de tiempo prolongados, han sido investigados ampliamente (Bird et al. 1981; 1982; Lapointe 1981; Lapointe y Duke, 1984; Levy y Friedlander, 1990; Friedlander et al., 1991; Haglund y Pedersen, 1993). Sin embargo, existe poca información sobre los procesos bioquímicos que la disponibilidad de N tiene sobre la activación de las defensas antioxidantes. Los resultados obtenidos en los ensayos descritos sugieren que la fuente y la concentración de nitrógeno han mostrado un efecto directo sobre los cambios en las actividades antioxidantes detectadas, principalmente debido a los cambios en la composición bioquímica de las especies estudiadas. Los extractos hidroalcohólicos de H. incurva mostraron escasa capacidad antioxidante a nivel de inhibición de peroxidación lipídica (Capítulo III, Figura 3.14) presentando un comportamiento similar al control. La oxidación del β-caroteno se completó a los 15 min de comenzar la reacción a diferencia de los resultados del control positivo, vitamina E (a concentraciones de 1 µM y 10 µM). La capacidad para atrapar el radical superóxido en el sistema PMS/NADH-NBT fue negativa y poco reproducible. Trabajos previos han indicado una fuerte actividad en varias especies de algas pardas (Siriwardhana et al., 2003.; Kim et al., 2005; Kuda et al., 2005; Zubia et al., 2007). Trabajos posteriores describieron actividades de captación de radicales aniones bajos (<5%) para diversos extractos de algas Rhodophytas (Kim et al., 2005). Una vez estudiadas las propiedades antioxidantes de los extracto de H. Discusión general! ! 252 incurva procedentes de diferentes condiciones de radiación y el aporte de Namonio, los ensayos se dirigieron hacia el estudio de los componentes químicos que podrían ser responsables de las propiedades detectadas en la biomasa procedente de los experimentos de co-cultivo. Los procedimientos empleados para la cuantificación y caracterización del extracto de H. incurva permitieron determinar la concentración de polifenoles que osciló entre 30.6 y 62.2 mg g-1 PS en condiciones PAR y bajo aporte de N-amonio. Del análisis cromatográfico para su caracterización, realizado por HPLC, pudo concluirse que la actividad antioxidante de H. incurva, está relacionada, al menos parcialmente, con la presencia de pirogalol. Las concentraciones detectadas, dependiendo de la procedencia del tratamiento de cultivo, oscilaron entre 3.6 y 24.9 mg de pirogalol g-1 PS, lo cual nos indica que hay una parte del contenido de polifenoles sin identificar en las muestras analizadas. Aparentemente, los tipos y cantidades de los ácidos fenólicos en las algas dependen de la especie en cuestión (Whitfield et al., 1999). López et al. (2010) observaron resultados similares al analizar los polifenoles de S. scoparium. Algunos compuestos pueden permanecer sin ser detectados o insuficientemente representados en la cromatografía líquida de alta afinidad, como ya se ha discutido, debido a su baja respuesta a la radiación UV en relación a la concentración, la estructura molecular, la superposición de isómeros, o una polaridad inadecuada para la determinación cromatográfica (Adamson et al, 1999;. Lázaro et al, 1999). Hasta el momento existen pocos trabajos disponibles en la caracterización de polifenoles mediante técnicas de HPLC a partir de algas en general, y tampoco hemos encontrado trabajos sobre algas rojas al respecto para comparar los resultados obtenidos. El presente análisis no mostró la presencia de moléculas de florotaninos en nuestras muestras. Este hallazgo apoya la sugerencia hecha por Ragan y Glombitza (1986) de que los florotaninos son un grupo fenólico exclusivo en las algas pardas. Entre las principales clases estructurales de compuestos fenólicos marinos aislados hasta el momento en la División Rhodophyta, podemos citar los bromofenoles (Ragan y Glombitza, 1986), compuestos estructuralmente diferentes a los taninos en algas verdes y pardas. El bromofenol C-7-hidroxílico ha sido detectado exclusivamente en especies del orden Ceramiales. El más distribuido en todos ellos es el 2,3-dibromo4,5dihidroxibenzyl alcohol (lanosol) que también ha sido detectado en algas pardas. Los métodos químicos para el análisis de polifenoles en estudios ecológicos fueron revisados hace dos décadas (Ragan y Glombitza, 1986). A partir Discusión general! ! 253 de entonces, rara vez han sido publicados métodos químicos adicionales para investigar este tipo de compuestos. En relación a los polisacáridos ácidos, el cese de los aportes de NH4+ a los 28 días de cultivo no dio lugar a un aumento significativo de la concentración de polisacáridos aunque el hecho de que disminuyera en condiciones de menor irradiancia y ausencia de UV (dentro del invernadero) y se mantuviera en algas crecidas fuera del invernadero (PAR+UVR) sugiere que tienden hacia la ruta del carbono en ausencia de nutrientes, presencia de UV y dosis más altas de PAR. Mientras que el contenido en polisacáridos ácidos de las algas cultivadas fuera del invernadero (PAR+UVR) se mantuvo similar tanto en muestras cultivadas en agua de mar como en las producidas con las aguas de los efluentes (ricas en amonio). Los polisacáridos ácidos se acumularon drásticamente a los 42 días (PAR+UV) aumentando de manera significativa un 59.1 % respecto al muestreo del día 7 de cultivo. Este comportamiento es diferente al descrito en otras algas rojas, ya que cuando existe crecimiento rápido se espera una baja acumulación, atribuible a que en un medio rico en nutrientes, el carbono producido en la fotosíntesis y que entra al ciclo de Krebs, es destinado principalmente a la síntesis de compuestos precursores de aminoácidos y en menor medida a la biosíntesis de carbohidratos (Raven, 1974; Neish et al. 1977, DeBoer, 1979). No obstante el hecho de que el contenido de polisacáridos sea mayor en algas cultivadas fuera del invernadero nos puede indicar que la radiación UV puede estar provocando situaciones de estrés que conducen a una disminución de la actividad fotosintética y en consecuencia a una acumulación de carbohidratos a costa de disminuir la tasa de crecimiento. Algunos trabajos en algas carragenofitas apuntan a una variación estacional en el rendimiento atribuida a condiciones ambientales tales como la temperatura y la salinidad (Fogg 1964; Neish y Shacklocck, 1971; Dawes et al., 1977a; ZertucheGonzalez, 1988). La caracterización de los espectros de éstos, mediante FT-IR, no mostraron diferencias significativas entre los distintos tratamientos de cultivo (p<0.05). Recientemente se ha identificado, mediante la comparación con los datos de la biblioteca de Thermo Fischer que la fracción de polisacáridos de Halopithys incurva tuvo el mayor porcentaje de similitud con P800 Pullulan (86%)(Abdala et al., 2011). Pullulan es una α(1-6) maltotriosa, polímero soluble en agua obtenido a partir del almidón por fermentación. Su uso más importante es para la fabricación de películas comestibles y cápsulas para la industria farmacéutica y nutracéutica. Los fotoprotectores y sustancias antioxidantes amino ácidos tipo micosporina Discusión general! ! 254 (MAAs) incrementaron con la disponibilidad de nitrógeno como previamente se ha demostrado en distintas especie del género Porphyra (Korbee et al., 2005), Grateloupia lanceola (Huovinen et al., 2006), Asparagopsis armata (Figueroa et al., 2008) y Gracilaria tenuistipitata (Barufi Bonomi et al., 2011). El análisis del contenido e identificación de amino ácidos tipo micosporina (MAAs) mostró un comportamiento antagonista en las concentraciones de shinorine y porphyra-334 en biomasa producida con N-amonio, existiendo una correlación negativa entre ambas. En ausencia de este nutriente y presencia de radiación UV son las concentraciones de palythine y porphyra-334 las que muestran una correlación negativa, produciéndose un aumento de la concentración de palythine en detrimento de la porphyra-334. Se ha demostrado que las especies de algas rojas acumulan más MAAs que las especies de algas verdes y pardas (Singh et al., 2008). Estas mismas relaciones entre los tipos de MAAs ya fueron descritas en Porphyra leucosticta (Korbee, 2004) aunque no fueron detectadas en la especie Grateloupia lanceola (Houvinen et al., 2006). El aumento de un determinado amino ácido tipo micosporina y el aumento concomitante de otro ha sido relacionado con procesos de interconvesión de unos MAAs por otros debido a condiciones ambientales (Dunlap y Shick, 1998; Conde et al., 2004) pero se desconoce con exactitud la ruta de síntesis e interconversión de todos los MAAs. Los cambios en composición de MAAs detectados en este estudio, puede relacionarse por cambios en las condiciones de cultivo. De la Coba et al. (2009) presentan que los extractos purificados a partir de las especies de algas rojas Porphyra y Gelidium contienen distintas micosporinas (Porphyra 334, shinorine, palythine y asterina 330) que presentan actividad antioxidante a nivel de inhibición de la peroxidación lipídica siendo estos dos últimos los que ofrecen mejores resultados. Un factor que contribuye a este hecho es la acidez relativa de estos compuestos y su grado de disociación en solución. Ciertamente, la determinación de un modo de acción es particularmente compleja en el caso de un extracto crudo natural como el extracto hidroalcohólico de Halopithys incurva, y a pesar de mostrar una correlación alta en relación al contenido en polifenoles no se descarta que su efecto antioxidante pueda ser el resultado de la acción conjunta de sus componentes. Tras una extensa revisión de la literatura, no se han encontrado estudios similares al presente trabajo en lo que concierne al contenido en polifenoles de Halophytis incurva ni, en consiguiente, tampoco ha sido abordado el estudio sobre la capacidad antioxidante de los mismos. Además se desconocen estudios sobre la actividad antioxidante de algas