Caracterización del papel de las poblaciones inflamatorias en el infarto revascularizado y sus implicaciones en el remodelado adverso

I I CARACTERIZACIÓN DEL PAPEL DE LAS POBLACIONES INFLAMATORIAS EN EL INFARTO REVASCULARIZADO Y SUS IMPLICACIONES EN EL REMODELADO ADVERSO Trabajo de investigación presentado por Elisa Bevilacqua Para optar al Grado de Doctor por la Universidad de Sevilla Sevilla 2023 II III III PRESENTACIÓN TESIS FIRMADA POR DIRECTORES El Dr. Tarik Smani Hajami, Catedrático de la Universidad de Sevilla adscrito al Departamento de Fisiología Médica y Biofísica e Investigador Responsable del Grupo de Fisiopatología Cardiovascular del Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), y la Dra. Raquel del Toro Esteves, Profesora Titular de la Universidad de Sevilla adscrita al Departamento de Fisiología Médica y Biofísica e Investigadora del Grupo de Fisiopatología Cardiovascular del Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS) certifican que Dña. Elisa Bevilacqua, graduada en Scienze e Tecnologie Biologiche (classe L-2 delle Lauree in Biotecnologie) por la Università degli Studi di Trieste con Máster en Biotecnologie Mediche por la Università degli Studi di Trieste, ha realizado bajo su supervisión y dirección el trabajo titulado: “CARACTERIZACIÓN DEL PAPEL DE LAS POBLACIONES INFLAMATORIAS EN EL INFARTO REVASCULARIZADO Y SUS IMPLICACIONES EN EL REMODELADO ADVERSO” que presenta para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. Y para que así conste, firma el presente documento en Sevilla 25 de mayo del 2023 Fdo. Tarik Smani Hajami Fdo. Raquel del Toro Estevez IV V V DIVUNGACION CIENTÍFICA Durante esta tesis doctoral, parte de los resultados obtenidos han dado lugar a publicaciones en revistas internacionales y comunicaciones en congresos. ARTICULOS EN REVISTAS PEER REVIEW (*co-primer autor) ▪Aleksova A*, Beltrami AP, Bevilacqua E, Padoan L, Santon D, Biondi F, Barbati G, Stenner E, Gortan Cappellari G, Barazzoni R, Ziberna F, Zwas DR, Avraham Y, Agostoni P, Not T, Livi U, Sinagra G. Ghrelin Derangements in Idiopathic Dilated Cardiomyopathy: Impact of Myocardial Disease Duration and Left Ventricular Ejection Fraction. J Clin Med. 2019 Aug 1;8(8):1152. doi: 10.3390/jcm8081152. PMID: 31375017; PMCID: PMC6723091. ▪Del Toro R*, Galeano-Otero I*, Bevilacqua E*, Guerrero-Márquez F, Falcon D, Guisado-Rasco A, Díaz-de la Llera L, Barón-Esquivias G, Smani T, Ordóñez-Fernández A. Predicted Value of MicroRNAs, Vascular Endothelial Growth Factor, and Intermediate Monocytes in the Left Adverse Ventricular Remodeling in Revascularized ST-Segment Elevation Myocardial Infarction Patients. Front Cardiovasc Med. 2022 Mar 24;9:777717. doi: 10.3389/fcvm.2022.777717. PMID: 35402537; PMCID: PMC8987717. ▪Mayoral I*, Bevilacqua E*, Gómez G, Hmadcha A, González-Loscertales I, Reina E, Sotelo J, Domínguez A, Pérez-Alcántara P, Smani Y, González-Puertas P, Mendez A, Uribe S, Smani T, Ordoñez A, Valverde I. Tissue engineered in-vitro vascular patch fabrication using hybrid 3D printing and electrospinning. Mater Today Bio. 2022 Apr 14;14:100252. doi: 10.1016/j.mtbio.2022.100252. PMID: 35509864; PMCID: PMC9059085. CAPÍTULOS DE LIBRO Marta Martín-Bórnez*, Elisa Bevilacqua*, Débora Falcón*, Tarik Smani. Remodelado vascular: nuevos conceptos sobre el papel de los canales de calcio regulados por los reservorios. Nuevas tendencias de investigación en la señalización celular: fisiopatologías relevantes en la era post-covid. Sociedad Mexicana de Bioquímica ARTÍCULOS EN REDACCION/ REVISIÓN ▪Caballero-Valderrama M*, Calderon- Sanchez E, Bevilacqua E, Dominguez-Cano J, Diaz- Gutierrez J., Salvador Bofill J, Smani T, Ordoñez A, Lopez Haldon J. Early detection of anthracycline-induced myocardial damage in low-risk patients and study of myocardial fibrosis in an animal model of cardiotoxicity. En revisión. VI Bevilacqua E*, Débora Falcon*, Ordóñez-Fernández A, Smani T, Raquel del Toro. Analysis of proinflammatory monocyte subsets and their inflammatory intermediates in an acute and ischemia/reperfusion myocardial infarction rat model. En redacción. COMUNICACIONES A CONGRESOS ▪Bevilacqua E., Mayoral I., Gómez G., Hmadcha A., González-Loscertales I., Reina E., Sotelo J., Domínguez A., Pérez-Alcántara P., González-Puertas P., Mendez A., Uribe S., Smani T., Ordoñez A., Valverde I.; Tissue engineered vascular patch fabrication using hybrid 3D printing and electrospinning. Frontiers in CardioVascular Biomedicine 2022. European Accreditation Council for Continuing Medical Education. 2022. Hungría. ▪Bevilacqua E; Galeano-Otero I.; Guerrero-Márquez F.; Falcón D.; Barón-Esquivias G.; Smani T.; Ordóñez-Fernández A.; Del Toro R.; Inflammatory mediators to predict left adverse ventricular remodelling in revascularized STEMI patients. Frontiers in CardioVascular Biomedicine 2022. European Accreditation Council for Continuing Medical Education. 2022. Hungría. ▪Bevilacqua E., Falcón D., Ordóñez-Fernández A., Smani T., del Toro R.; Analysis of pro-inflammatory monocyte subsets and their inflammatory intermediates in an acute and ischemia/reperfusion myocardial infarction rat model. SECF 2022. SECF 2022. España. PREMIOS ▪1º Premio Ateneo de Sevilla para Jóvenes Investigadores sobre Enfermedades Cardiovasculares 2022, Ateneo de Sevilla, Febrero 2023. VII VII FINANCIACIÓN El trabajo de investigación ha sido llevado a cabo en el laboratorio de Fisiopatología Cardiovascular del instituto de Biomedicina con los siguientes proyectos de investigación concedidos: ▪ Detección precoz de cardiotoxicidad por antraciclinas: imagen y marcadores circulantes para la detección precoz del daño miocárdico (2019-2021). Junta de Andalucía. PI-0193-2018. Categoría: Técnico. Investigador principal: Eva Calderón Sánchez ▪ Bioimpresión 3D de implantes aórticos personalizados y biocompatibles (3D- Bioprint) (2017-2020). Instituto Carlos III. REF:00400200101320. Categoría: Investigadora. IP: Israel Valverde Pérez. ▪ Plataformas ISCIII de apoyo a la I+D+I en Biomedicina y Ciencias de la Salud de la Acción Estratégica en Salud; Soporte para la investigación clínica. (07/04/2021-31/12/2023). Instituto de Salud Carlos III. PT20/00069. Categoría: Técnico. IP: Israel Valverde Pérez. ▪ Proyecto. Caracterización de la contribución de células progenitoras de fibroblastos a la insuficiencia cardíaca (02/12/2022-31/12/2025). Junta de Andalucía. PROYEXCEL_00530. Categoría: Investigadora. IP: Raquel del Toro Estévez. ▪ Proyecto. Caracterización del papel de las células nestina+ en el miocardio infartado. Implicación en inflamación y fibrosis (01/01/2022- 31/05/2023). Junta de Andalucía. US-1381135 Categoría: Investigadora. IP: Raquel del Toro Estévez. VIII 1 INDICE INDICE __________________________________________________________________________________ 1 ÍNDICE FIGURAS ___________________________________________________________________________ 5 ÍNDICE TABLAS____________________________________________________________________________ 9 ABREVIATURAS __________________________________________________________________________ 11 RESUMEN ______________________________________________________________________________ 13 1. INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________________________ 15 1.1 INFARTO AGUDO DE MIOCARDIO ____________________________________________________________ 17 1.1.1 EPIDEMIOLOGIA Y FISIOPATOLOGÍA DEL INFARTO AGUDO DE MIOCARDIO _________________________________ 17 1.1.2 TRATAMIENTO DEL INFARTO AGUDO DE MIOCARDIO ______________________________________________ 19 Tratamiento por reperfusión: angioplastia primaria _____________________________________________ 19 Tratamiento antitrombótico ________________________________________________________________ 20 1.2 REMODELADO ADVERSO VENTRICULAR E INSUFICIENCIA CARDIACA _____________________________________ 21 1.3 PAPEL DE LA INFLAMACIÓN EN LA CARDIOPATÍA ISQUÉMICA __________________________________________ 23 1.3.1 COMUNICACIÓN CRUZADA DE LOS LEUCOCITOS EN EL INFARTO Y PAPEL DIFERENCIAL DE LOS GRANULOCITOS __________ 24 Neutrófilos ______________________________________________________________________________ 25 Monocitos y subtipos _____________________________________________________________________ 26 Macrófagos y subtipos ____________________________________________________________________ 31 1.4 CITOQUINAS Y QUIMIOQUINAS Y OTROS MARCADORES _____________________________________________ 35 1.4.1 MEDIADORES CLÁSICOS DE LA INFLAMACIÓN ___________________________________________________ 37 1.4.2 NUEVOS MARCADORES INFLAMATORIOS: PAPEL EMERGENTE DE LOS RNAS NO CODIFICANTES ___________________ 39 Formación de miRNAs y papel biológico _______________________________________________________ 40 microRNAs en patologías cardiovasculares ____________________________________________________ 42 2. HIPÓTESIS DE TRABAJO __________________________________________________________________________ 43 3. OBJETIVOS _______________________________________________________________________________________ 47 4. MATERIALES Y MÉTODOS _________________________________________________________________________ 51 4.5 MODELO EN CLÍNICA HUMANA _____________________________________________________________ 53 4.5.1 CRITERIOS DE INCLUSIÓN Y EXCLUSIÓN DE LOS PACIENTES ___________________________________________ 53 4.5.2 PROTOCOLO TEMPORAL DEL ESTUDIO EN LA CLÍNICA HUMANA _______________________________________ 53 4.5.3 TÉCNICAS DE IMAGEN POR ULTRASONIDOS Y MEDICINA NUCLEAR ______________________________________ 54 4.6 MODELO ANIMAL ______________________________________________________________________ 55 4.6.1 PROTOCOLO TEMPORAL DEL ESTUDIO DEL MODELO ANIMAL _________________________________________ 55 4.6.2 MODELO ANIMAL DE IAM Y I/R ___________________________________________________________ 56 4.7 CULTIVO CELULAR ______________________________________________________________________ 57 4.7.1 CULTIVO DE POBLACIONES MIOCÁRDICAS DE RATA CON CÉLULAS INFLAMATORIAS ___________________________ 57 Obtención de neutrófilos y monocitos de ratas operadas __________________________________________ 57 Obtención de fibroblastos y cardiomiocitos de ratas sanas por dispersión ____________________________ 57 Cultivo de poblaciones miocárdicas de rata con sobrenadante procedente de células inflamatorias ________ 58 4.7.2 LÍNEA CELULAR HUMANA DE MONOCITO: THP-1 ________________________________________________ 59 4.8 TÉCNICAS HISTOLÓGICAS _________________________________________________________________ 61 4.8.1 TINCIÓN TRICRÓMICA DE MASSON Y CUANTIFICACIÓN DE LA FIBROSIS ___________________________________ 61 4.8.2 INMUNOFLUORESCENCIA ________________________________________________________________ 62 Inmunofluorescencia de cortes histológicos ____________________________________________________ 62 Inmunofluorescencia de células _____________________________________________________________ 63 4.9 TÉCNICAS DE DETECCIÓN DE CÉLULAS: CITOMETRÍA DE FLUJO _________________________________________ 64 8 Figura 73. Expresión de microRNA-29a-3p en neutrófilos y monocitos CD43high His48low y monocitos CD43low His48high de rata. Figura 74. Análisis PCA de los microRNAs en los grupos experimentales. Figura 75. Volcano plot, scatter plot y heat map de la expresión de los microRNAs en ratas SHAM e I/R. Figura 76. Principales genes de inflamación dianas de microRNAs y relativos fold change. Figura 77. Principales genes de fibrosis diana de microRNAs y relativos fold change. Figura 78. Principales genes de apoptosis diana de microRNAs y relativos fold change. Figura 79. Perfil de expresión de microRNAs dianas en los monocitos CD43high His48low de rata a las 24h. Figura 80. Perfil de expresión de microRNAs dianas en los monocitos CD43low His48high de rata a las 24h. Figura 81. Comparación entre las mediciones de VTDVI y del VTSVI por ecocardiografía y por resonancia magnética en pacientes STEMI. ANEXO Figura A1. Volcano plot, scatter plot y heat map de la expresión génica en los dos subtipos de monocitos de rata. Figura A2. Análisis de enriquecimiento de los genes en común entre los dos subtipos de monocitos con Gene Ontology. Figura A3. Análisis de enriquecimiento de los genes de los monocitos CD43high His48low con Gene Ontology. Figura A4. Volcano plot, scatter plot y heat map de la expresión de los microRNAs en los dos subtipos de monocitos de rata. 9 9 ÍNDICE TABLAS INTRODUCCIÓN Tabla 1. Subpoblaciones de monocitos en las diferentes especies. MATERIALES Y MÉTODOS Tabla 2. Anticuerpos primarios y secundarios usados en inmunofluorescencia. Tabla 3. Panel de anticuerpos acoplados a fluoróforos para identificar en humano las diferentes poblaciones sanguíneas de neutrófilos, eosinófilos y tres subtipos de monocitos. Tabla 4. Caracterización fenotípica de las poblaciones inflamatorias humanas en sangre periférica. Tabla 5. Panel de anticuerpos para la citometría de flujo de rata. Tabla 6. Kit de ELISAs realizados y especificaciones técnicas. Tabla 7. Reactivos utilizados para el kit miScript RT. Tabla 8. Reactivos utilizados para el kit iScript™ Advanced cDNA Synthesis Kit. Tabla 9. Reactivos utilizados para el kit iScript cDNA Synthesis Kit. Tabla 10. Reactivos utilizados para el kit miRCURY. Tabla 11. Lista de los primers utilizados en la qPCR de microRNAs en humano. Tabla 12. Reactivos utilizados para la qPCR de microRNAs en humano. Tabla 13. Reactivos utilizados para la prime qPCR de genes en humano. Tabla 14. Lista de primers (con secuencia forward y reverse) para amplificar genes de rata y humano. Tabla 15. Reactivos utilizados para la qPCR de genes en rata y humano. Tabla 16. Reactivos utilizados en la qPCR de microRNAs en rata. Tabla 17. Protocolos de retrotranscripción y qPCR en el termociclador (para la retrotranscripción) y en el ViiA7 (para la qPCR). RESULTADOS Tabla 18. Tabla demográfica de la cohorte en estudio y factores de riesgo cardiovascular. 10 Tabla 19. Tabla demográfica de los pacientes STEMI con y sin remodelado adverso del ventrículo. Tabla 20. Análisis multivariado de diferentes parámetros (edad, sexo, nivel de creatina quinasa y de troponina T) con monocitos intermedios, clásicos y no clásicos a las 0 y 6h. Tabla 21. Análisis de Bioplex posibles quimioquinas relacionadas con el remodelado en pacientes con y sin remodelado adverso a los 6 meses. Tabla 22. Posibles microRNAs implicados en la regulación de la secreción de quimioquinas proinflamatorias. Tabla 23. Rangos de marcadores y asignación del score individual para el score total. Tabla 24. microRNAs en común entre los monocitos sorteados de rata y células mononucleadas de humano. ANEXO Tabla A1. Estudio in silico de genes dianas de los miR-16, miR-21 y miR-29. Tabla A2. Genes diferentemente expresados en los monocitos CD43high His48low. Tabla A3. Genes diferentemente expresados en los monocitos CD43low His48high. Tabla A4. Vías de señalización implicadas en monocitos CD43lhigh His48low (no clásicos). Tabla A5. Vías de señalización implicadas en monocitos CD43low His48high (clásicos). Tabla A6. Análisis de interacción de microRNAs y genes dianas diferentemente expresados en los monocitos CD43high His48low de rata aislados por FACS. Tabla A7. Análisis de interacción de microRNAs y genes dianas diferentemente expresados en los monocitos CD43low His48high de rata aislados por FACS. Tabla A8. microRNAs diferentemente expresados en los monocitos de rata aislados por FACS. Tabla A9. microRNAs diferentemente expresados en los monocitos sorteados de rata que pueden regular los genes de inflamación o fibrosis. Tabla A10. microRNAs diferentemente expresados en los monocitos sorteados de rata que pueden regular los genes de apoptosis. 11 ABREVIATURAS ACC: American College of Cardiology ACTP: Angioplastia coronaria transluminal percutánea AKT: Serina-treonina quinasa ANOVA: Analysis of Variance APAF1: Apoptosis Protease-Activating Factor-1 AUC: Area under the curve, área bajo la curva BCL2: B-cell leukemia/lymphoma 2 protein CCR: C–C chemokine receptor cDNA: Doble cadena de DNA complementaria al RNA CK: Creatin quinasa COL: Colágeno CPR: C-reactive protein, proteína C reactiva CT: Cycle threshold cTnI/T: Troponina cardiaca I o T CTRL: Controles sanos CV: Cardiovascular DAMPs: Dangerassociated molecular patterns DMSO: Dimetilsulfóxido ECG: Electrocardiograma ECV: Enfermedades cardiovasculares ES: Enrichment score ESC: European Society of Cardiology FACS: Fluorescence-activated cell sorting FEVI: Fracción de eyección de ventrículo izquierdo FGF: Fibroblast growth factor FSC: Forward Scatter Gal3: Galectina- 3 G-CSF: Granulocyte Colony-Stimulating Factor GDF-15: Growth differentiation factor-15 GM-CSF: Granulocyte-Macrophage Colony- Stimulating Factor GSEA: Gene Set Enrichment Analysis HDL: High density lipoprotein HIF-1  : Hipoxiainducible factor 1 alpha protein HMOX1: Hemeoxigenasa-1 HR: Hipoxia/ reperfusión HSCs: Hematopoyetic stem cells, células madres hematopoyéticas hs-cTnT: Troponina cardiaca T altamente sensible I/R: Isquemiareperfusión, IAM: Infarto agudo de miocardio IC: Insuficiencia cardiaca IFN-γ: Interferón γ IL: Interleuquina IL-1R: Receptor de IL-1 IL-1RA: Antagonista del receptor de IL-1 KO: Knock out lncRNAs: Long non-coding RNA M1: Macrófagos M1 M2: Macrófagos M2 MAPKs: Proteínas quinasas activadas por mitógenos MCP-1: Monocyte chemoattractant protein-1 MHC II: Complejo de histocompatibilidad de tipo II MIP: Macrophage inflammatory protein miR: MicroRNA MNCs: Células mononucleadas 12 mRNA: RNA mensajero MYC: Cellular myelocytomatosis oncogene MΦ: Macrófagos activados ncRNAs: RNAs no codificantes NES: Normalized enrichment score NETs: Neutrophil extracelular traps NF-Κb: Nuclear factor de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas NK: Células natural killers NLRs: Nucleotidebinding oligomerization domain NSTEMI: Non-ST-segment elevation myocardial infarction NT-proBNP: N-terminal prohormone brain natriuretic peptide OR: Odd Ratio PAMPs: Pathogenassociated molecular patterns PCA: Principal Component Analysis PDGF: Platelet-derived growth factor PHD2: Prolyl hydroxylase domain protein 2 PMA: Phorbol 12-myristate 13-acetate, Forbol-12- miristato Acetato PRR: Pattern recognition receptors RIN: RNA Integrity Number número de integridad de RNA RISC: RNA-induced silencing complex ROC: Receiver operating characteristic) RPMI: Medio Roswell Park Memorial Institute RT: Retrotranscripción RT-qPCR: Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction sc-RNA-seq: Singlecell RNA sequencing SEM: standard error mean SII: Immune-inflammation indexcuenta plaquetaria*(neutrófilos/linfocitos) SIRI: Systemic inflammatory response indexneutrófilos*monocitos/linfocitos siRNAs: Short interfering RNAs Smad3: Small mother against decapentaplegic SSC: Side Scatter SST2: Soluble suppression of tumorigenicity 2 STEMI: ST-segment elevation myocardial infarction TAMs: Tumor associated macrophages Th1/2: Linfocitos T helper 1 o 2 TIMI: Thrombolysis In Myocardial Infarction TLR: Tool like receptor TNF: Tumor necrosis factor TRBP: Transactivation response RNA binding protein VEGF: Vascular endotelial growth factor factor VTDVI: Volumen telediastólicos del ventrículo izquierdo VTSVI: Volumen telesistólicos del ventrículo izquierdo 13 RESUMEN La revascularización temprana después del infarto permite reestablecer el flujo sanguíneo a la zona infartada del corazón, limitando el daño producido durante la isquemia. Sin embargo, la revascularización miocárdica desencadena una respuesta inflamatoria potente que estaría implicada en la estimulación de las células cardiacas y en la aparición de fibrosis intersticial por deposito excesivo de colágeno, y muerte por apoptosis. Dicha fibrosis afecta a la función cardiaca y se asocia con el remodelado cardiaco adverso, aunque no todos los pacientes sometidos a angioplastia primaria lo desarrollen. Por ello, se hipotetizó que durante la respuesta inflamatoria haya una participación diferencial de las poblaciones inflamatorias en los pacientes infartados, como los neutrófilos y las subpoblaciones de monocitos que regulan la liberación de citoquinas y microRNAs implicados en la fibrosis intersticial. Por lo tanto, el cambio en los niveles de las células inflamatorias podría predecir el remodelado adverso del miocardio en los pacientes con STEMI. En este trabajo se incluyó de manera prospectiva una cohorte de pacientes con infarto agudo de miocardio con elevación del ST y revascularizados con angioplastia primaria. Durante el seguimiento de la evolución de los pacientes, se realizó una ecografía cardíaca y eventualmente una resonancia magnética, para evaluar el posible remodelado adverso. Asimismo, se muestras sanguíneas para su posterior análisis. En el modelo animal de rata, se realizaron infarto sin reperfusión (IAM) e infarto con reperfusión (I/R) y se extrajo sangre periférica, bazo, médula y corazón a los diferentes tiempos experimentales. Nuestros resultados muestran que en el grupo de pacientes STEMI con remodelado adverso un aumento significativo de monocitos intermedios a las 0 y 6 horas, y de clásicos a las 6 horas después de la intervención, en comparación con los pacientes sin remodelado adverso. Los monocitos intermedios fueron capaces de predecir independientemente el remodelado adverso a las 6 horas después de la angioplastia. Asimismo, se detectó mayores niveles de VEGF y microRNAs, miR-16-5p, miR-21-5p y miR-29a-3p en pacientes remodelados en comparación con los no remodelados. A continuación, la combinación en un score de los marcadores tradicionales, troponina- T y creatina quinasa, con los niveles de monocitos intermedios, VEGF y los tres microRNAs, miR-16-5p, miR-21-5p y miR-29a-3p, predijo de una manera más precisa el remodelado adverso en pacientes STEMI. El análisis de genes asociados a fibrosis y apoptosis demostró una alteración de expresión de varios genes apoptóticos, AKT2, HMOX1, MYC y NFKB1 en las células mononucleadas entre los pacientes con y sin remodelado. Por otra parte, la caracterización de la respuesta inflamatoria en el modelo de rata infartadas determinó un aumento significativo de neutrófilos, monocitos no clásicos CD43high His48low, y clásicos CD43low His48high. El estudio de la infiltración de los monocitos en el corazón durante el evento isquémico determinó un aumento temprano de los macrófagos M1/ CD68+ en el miocardio de ratas I/R e IAM. Los neutrófilos aislados 14 de la sangre periférica de ratas infartadas regulan la expresión de los genes apoptótico APAF1 y BCL2, así como el gen fibrótico TGFB1 en los cardiomiocitos y fibroblastos. Los monocitos de ratas infartadas regulan la expresión tanto de BCL2 como de COL1 y COL3 en cardiomiocitos y fibroblastos, sugiriendo que los monocitos sean la población responsable de inducir la fibrosis. De los 5 microRNAs expresados en común tanto en los monocitos de ratas isquémicas como de las células mononucleadas de pacientes, destacamos la expresión a la baja del miR-194-5p en los monocitos CD43high His48low de las ratas I/R, que estaría implicado en la regulación de la expresión de la IL-6, APAF1, y CYCS. En resumen, en esta tesis doctoral se ha dilucidado la participación diferencial de las poblaciones inflamatorias en los pacientes infartados, como los neutrófilos y las subpoblaciones de monocitos que regulan la liberación de citoquinas y los microRNAs implicados en la fibrosis intersticial. El cambio en los niveles de los monocitos intermedios es capaz de predecir el remodelado adverso del ventrículo izquierdo en los pacientes con STEMI. 15 INTRODUCCIÓN 1. INTRODUCCIÓN 16 17 INTRODUCCIÓN 1.1 INFARTO AGUDO DE MIOCARDIO Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son hoy en día la primera causa de muerte (49%); entre ellas el infarto de miocardio y el ictus son la primera y la segunda causa de muerte, representando respectivamente el 16% y 11% (World Health Organization, 2022a). El coste que conllevan las ECV en la Unión Europea alcanza los 106 mil millones de euros anuales, siendo casi el 10% del gasto en sanidad (Piepoli et al., 2016b). La primera descripción en una autopsia de una posible relación entre el infarto agudo de miocardio (IAM) y la oclusión de una arteria coronaria por un trombo se remonta a finales del siglo XIX; sin embargo, no fue hasta el principio del siglo XX cuando aparecieron las primeras descripciones clínicas que establecieron la conexión entre la formación del trombo en las arterias coronarias y los síntomas asociados al infarto (Herrick J, 1912.) . Una isquemia aguda de miocardio implica una reducción parcial o total del riego sanguíneo al miocardio, situación que perjudica la supervivencia y la funcionalidad de los cardiomiocitos, llevando al infarto agudo de miocardio si el flujo no es reestablecido (Schirone et al., 2022). La European Society of Cardiology (ESC) y el American College of Cardiology (ACC) rediseñaron la definición del IAM resaltando la importancia del enfoque clínico y bioquímico con la introducción de nuevos biomarcadores. El IAM, por lo tanto, se define por la aparición de daño miocárdico agudo, detectado por anomalías en los biomarcadores cardiacos, en concreto una elevación de los valores de la troponina cardiaca al menos un valor por encima del percentil 99 de normalidad, cuando hay evidencia de isquemia aguda de miocardio (Ibáñez et al., 2018). 1.1.1 EPIDEMIOLOGIA Y FISIOPATOLOGÍA DEL INFARTO AGUDO DE MIOCARDIO En todo el mundo, la cardiopatía isquémica es la causa de muerte individual más común y su frecuencia está aumentando. No obstante, en las últimas tres décadas, ha habido una tendencia global en la reducción de la mortalidad en Europa. La cardiopatía isquémica causa más de 1.8 millones de muertes al año a nivel mundial, aunque hay variación en los porcentajes entre los diferentes países (World Health Organization, 2022a). Los IAM se pueden clasificar por clínica o diferencias pronósticas o patología, pero existen principalmente dos tipos de infartos agudo de miocardio: IAM con elevación del segmento ST (STEMI, del inglés ST-segment elevation myocardial infarction) e IAM sin elevación del segmento ST (NSTEMI, non-ST- segment elevation myocardial infarction). La mortalidad en los pacientes STEMI está influenciada por diferentes factores: la edad avanzada, la clase de Killip- Kimball, que se establece al ingreso hospitalario, en función de si el paciente tiene o no síntomas de IC (insuficiencia cardiaca) y la gravedad de dichos síntomas de IC, y permite predecir la mortalidad a 30 días, el tiempo ocurrido hasta la reperfusión, el historial de infarto de miocardio, diabetes mellitus, insuficiencia renal, el número de arterias coronarias afectadas y la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (Thygesen et al., 2018). 24 En el tejido inflamado, las células activan unas rutas de señalización tal como las MAPKs (proteínas quinasas activadas por mitógenos) y el NFκB (factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas, complejo proteico que controla la transcripción del DNA). Estas vías de señalización conllevan la expresión de muchos genes proinflamatorios, incluyendo citoquinas proinflamatorias TNF- (Tumor necrosis factor α); interleuquinas (IL-1, IL-6, IL-18), quimioquinas CXC (contenientes el motivo acido glutámicoleucina- arginina, quimioatractor de los neutrófilos), quimioquinas atrayentes linfocitos T y monocitos, moléculas de adhesión (selectinas) y el factor B del complemento. La llegada de leucocitos hace que se liberen aún más DAMPs y esto hace que se estimule la eferocitosis (fagocitosis de células apoptóticas) y la degradación del tejido dañado gracias a proteasas y oxidasas (Prabhu & Frangogiannis, 2016). La respuesta inflamatoria tras el infarto es heterogénea pero esta cascada consta principalmente de varias fases: los neutrófilos y macrófagos eliminan los residuos celulares debido a la necrosis por la isquemia, se deposita la matriz extracelular para reemplazar las células muertas, se liberan factores de crecimiento y finalmente, se transforma el tejido necrótico en cicatriz (Chalise et al., 2022; de Couto et al., 2015). 1.3.1 COMUNICACIÓN CRUZADA DE LOS LEUCOCITOS EN EL INFARTO Y PAPEL DIFERENCIAL DE LOS GRANULOCITOS Cada vez más, resulta más evidente que existe una comunicación cruzada entre las células inmunes y las células cardiacas. Esta es fundamental en reprogramar las células inflamatorias y resolver la inflamación. Los cardiomiocitos, fibroblastos, células vasculares, monocitos y neutrófilos son las células principalmente implicadas en la respuesta inflamatoria necesaria para la reparación de un corazón infartado. Sin embargo, dilucidar el rol de cada población en activar una especifica cascada inflamatoria es algo complicado y los roles específicos quedan inciertos (Marelli-Berg & Aksentijevic, 2019). Los leucocitos maduros circulantes son células presentes en el torrente sanguíneo y comprenden diferentes tipos celulares. Se originan de precursore hematopoyéticos de la medula ósea presente en las epífisis de los huesos largos, pelvis, cráneo y costillas. En la primera fase de diferenciación de las células madres hematopoyéticas se originan dos líneas, una mieloide y una linfoide. Del progenitor común mieloide deriva el progenitor granulocito monocito (células dendríticas, neutrófilos, mastocitos, basófilos, eosinófilos, monocitos), el progenitor megacariocito (del que se originaran luego las plaquetas) y el progenitor eritroide, que da lugar a los eritrocitos; del progenitor común linfoide se originan las NK, los linfocitos B y T (Gianluigi Castoldi, 2013). Todas estas poblaciones están implicadas en el infarto en el cual participan de manera sinérgica en la reparación del daño isquémico. En los modelos murinos, estas poblaciones han sido bien caracterizada en cada estadio del IAM y su consiguiente reparación a nivel local. En el miocardio, en condiciones fisiológicas por un lado están los macrófagos residentes de origen fetal CCR2-, presentes también en el tejido sano, cuya abundancia disminuye en caso de daño isquémico haciendo prevaler los 25 INTRODUCCIÓN macrófagos derivados de monocitos CCR2+ proveniente de precursores de la medula ósea, que se infiltran en el miocardio (Dick et al., 2019; Steffens et al., 2022). En los diferentes estadios de cicatrización tras un infarto, intervienen también diferentes subpoblaciones de neutrófilos circulantes que se infiltran en el miocardio (Steffens et al., 2022; Vafadarnejad et al., 2020). Muy ignorados durante muchos años, los basófilos, conocidos principalmente por su rol en las alergias y de protección frente a los helmintos, recientemente han adquirido importancia ya que pueden producir rápidamente IL-4 y IL-13, interviniendo en el equilibrio entre monocitos proinflamatorio y reparativos (Sicklinger et al., 2021) aunque su rol en aumento o disminución de riesgo de remodelado queda incierto (Peterson et al., 2022; Shiyovich et al., 2017). Los eosinófilos en condiciones fisiológicas son un porcentaje muy limitado de las células inmunes presente en sangre, pero participan en diferentes procesos biológicos, como la liberación de gránulos tóxicos con RNAsas frente al ataque de bacterias, virus y helmintos, o gránulos con citoquinas (IL-5, IL-4, con un rol esencial en la diferenciación de los macrófagos al fenotipo M2), quimioquinas, factores de crecimiento (TGF- α- transforming growth factor- TGF-β, PDGF- platelet-derived growth factor, y VEGF- vascular endotelial growth factor) lípidos y enzimas para favorecer el remodelado del tejido y la fibrosis (Kologrivova et al., 2021; Peterson et al., 2022). Neutrófilos Los neutrófilos son la población más abundante de células polimorfonucleadas en sangre. En humano pueden distinguirse por citometría de flujo por epítopos de membrana y se inmunodefinen como una población es CD11b+ CD16+ CD62L+ (Kologrivova et al., 2021). Estos leucocitos patrulleros son los primeros en infiltrarse en el miocardio tras un IAM en respuesta a citoquinas (IL-1), quimioquinas (MIP1- Macrophage inflammatory protein-, CXCL1, CXCL2), DAMPs (S100A8, S100A9), y otras moléculas como histamina, factores del complemento, prostaglandina E2 y leucotrieno B4. Los neutrófilos tienen capacidad infiltrante con moléculas de adhesión (L- selectina) presentes en la membrana plasmática que permiten interaccionar con su ligando presente en la superficie de las células endoteliales, deteniendo la diapédesis del neutrófilo (Chalise et al., 2021). Llegados al sitio de interés, son capaces de formar unas NETs (neutrophil extracelular traps), unas redes extracelulares constituidas por componentes nucleicos de los proprios neutrófilos (histonas y DNA) en las que hay gránulos primarios (contenientes mieloperoxidasa, catepsina G, elastasa neutrofílica, defensina), secundarios (lactoferrina, NADPH oxidasa, lisozima), y terciarios (MMP-9, metaloproteinasa 9) (Heusch et al., 2014; Jaillon et al., 2013; Kologrivova et al., 2021). Estas NETs son capaces de atrapar patógenos y células necróticas y degradar la matriz extracelular para permitir la infiltración de leucocitos. En condiciones de hipoxia, se observa una menor formación de NETs, mediada por HIF-1 debido al aumento de la transcripción de NFκB, prolongando la supervivencia de la célula y su capacidad fagocítica. Por lo tanto, la 26 falta de formación de NETs en el IAM contribuye a prolongar el daño miocárdico (Dölling et al., 2022). Últimamente, ha emergido el rol fundamental que desempeñan los neutrófilos en la reparación de la zona infartadas. Los neutrófilos adquieren un fenotipo reparativo: ya que provocan la polarización de los macrófagos hacia un fenotipo antinflamatorio e inducen la diferenciación de los fibroblastos a miofibroblastos para la deposición de colágeno (Chalise et al., 2021; Piccolo et al., 2022) Monocitos y subtipos Los monocitos y los macrófagos son las principales células fagocíticas del sistema inmunitario junto a las células dendríticas, forman parte de la inmunidad innata. Los monocitos circulantes, descritos por primera vez en 1939 por Ebert y Florey, constituyen entre un 5 y 10% de todos los leucocitos y son morfológicamente heterogéneos ya que pueden tener diferentes tamaños y presentar más o menos granulosidad, lo que conlleva a que esto fagocitos puedan ser confundidos con neutrófilos, linfocitos, células NK o células dendríticas. Los monocitos circulantes se originan de un progenitor común a los neutrófilos en la medula ósea y son liberados al torrente sanguíneo en el que permanecen en circulación varios días antes de infiltrar, en caso de daño, en un tejido para reabastecer el tejido de macrófagos (Ebert & Florey, 1939). Cuando se produce una inflamación local en un tejido, los monocitos denominados inflamatorios presentes en sangre periférica son capaces de activarse, infiltrarse en el tejido y transformarse en macrófagos. Los monocitos, al igual que los neutrófilos, tienen capacidad infiltrante con moléculas de adhesión presentes en la membrana plasmática que les permite adherir a las células endoteliales (Chalise et al., 2021). En una primera fase de rolling de los monocitos en la pared vascular, las quimioquinas atraen a su receptor a los monocitos, induciendo un cambio conformacional de las integrinas presente en su membrana. Esto crea una interacción más fuerte entre el monocito y la célula endotelial y hace que el rodamiento se pare. El monocito se desliza entre las uniones celulares, pasa la lámina basal en los sitios con menor densidad proteica y pasa entre los pericitos por las brechas, aumentadas en tamaño por la inflamación (Prabhu & Frangogiannis, 2016). Una vez infiltrado, se producen modificaciones por las cuales se transforma en macrófago MΦ y posteriormente a fenotipos más proinflamatorios o reparativos característicos de los macrófagos (Figura 4) (Gordon & Taylor, 2005). 27 INTRODUCCIÓN Figura 4. Esquema del proceso de infiltración de los monocitos en el tejido isquémico. Creado con Biorender. Los monocitos y los macrófagos desempeñan funciones relacionadas con la homeostasis, la defensa inmunitaria, la reparación de ellos tejidos (R van Furth, 1968). En humano, los monocitos primero fueron clasificados en base a su morfología y ya con el adviento con la citometría de flujo gracias a los marcadores de superficie. Se identificaron el CD14 (receptor para el lipopolisacárido) y el CD16 (también conocido como FcγRIII) (Randolph et al., 2002). Por lo tanto y dependiendo de la expresión diferencial de estos marcadores se distinguen al menos tres poblaciones distintas de monocitos (Passlick et al., 1989; Ziegler-Heitbrock et al., 2010). Los monocitos clásicos, que expresan altos niveles de CD14, pero no CD16 (CD14++ CD16-), los intermedios, con altos niveles de CD14 y bajos de CD16 (CD14++ CD16+) y los no clásicos, con bajos niveles de CD14 y altos niveles de CD16 (CD14+ CD16++) (Ziegler-Heitbrock et al., 2010). La subpoblación con elevada expresión de CD16, los monocitos no clásicos, presenta por ejemplo una mayor expresión del complejo de histocompatibilidad de tipo II (MHC II- del inglés major histocompatibility complex class II- Figura 5) (Belge et al., 2002; Tapp et al., 2013). 28 De todas las poblaciones de monocitos, la subpoblación más representada es la CD16- constituyendo alrededor de un 90% de todos los monocitos totales en condiciones fisiológicas. En caso de un evento inflamatorio importante como una sepsis u un proceso tumoral la población CD16+, más proinflamatoria, puede alcanzar casi un 50% (Fingerle et al., 1993; Ziegler-Heitbrock, 2007). Figura 5. Caracterización de las subpoblaciones de monocitos en humano por citometría de flujo. Modificado de (Ziegler-Heitbrock & Hofer, 2013). Al igual que en humano, en ratón también se pueden distinguir 3 subpoblaciones de monocitos gracias a dos marcadores Ly6C y CD43: los monocitos clásicos (Ly6C++ CD43+), los monocitos intermedios (Ly6C++ CD43++) y los monocitos no clásicos (Ly6C+ CD43++) (Sunderkötter et al., 2004; Ziegler-Heitbrock, 2014). En rata, modelo animal cuyas poblaciones inmunes están menos descritas, se han clasificado dos poblaciones, los monocitos CD43high His48low y los monocitos CD43low His48high, como se puede ver resumido en la Tabla 1 (Ahuja V et al., 1995; Barnett-Vanes et al., 2016a; Gordon & Taylor, 2005). Varios grupos han estudiado las diferencias funcionales entre los tres subgrupos (Cros et al., 2010; Hofer et al., 2015; Shantsila et al., 2011; Zawada et al., 2011, 2017). El papel diferencial y la proporción de los distintos tipos de monocitos aun no es claro, aunque los análisis transcriptómicos (Wong Loon W et al., 2010; Zawada et al., 2017) y de sc-RNA-seq (el singlecell RNA sequencing) han revolucionado en los últimos años la posibilidad de comprender la heterogeneidad de las células inmunes, permitiendo conocer en profundidad la diferente expresión génica de estos tipos celulares (Mulder et al., 2021). 29 INTRODUCCIÓN Tabla 1. Subpoblaciones de monocitos en las diferentes especies. Marcadores de membrana de monocitos clásicos, intermedios y no clásicos en humano, rata y ratón. Los monocitos clásicos o fagocíticos son las células inmunes destinada principalmente a la fagocitosis, a la respuesta inmune tras la detección de un patógeno y la migración; los monocitos intermedios o proinflamatorios son células presentadoras de antígeno, implicadas en la producción y secreción de citoquinas y en la regulación de la apoptosis de otras células; por ultimo los no clásicos o patrulleros están implicados en la fagocitosis mediada por el complemento y en la adhesión (Figura 6) (Zawada et al., 2017). Concretamente y como se puede observar en la Figura 6 los monocitos clásicos son capaces de migrar gracias a gradientes de CCL2 y CCL3 y son más eficientes que los intermedios en la producción de ROS. En humano los CD14+ expresan más receptores para las quimioquinas (CCR1, CCR2, CCR5, CXCR1, and CXCR2), permitiendo la migración a tejidos dañados o inflamados y también liberan citoquinas proinflamatorias como IL-6, IL-8, CCL2, CCL3, and CCL5 (Cros et al., 2010; Weber et al., 2000; Wong Loon W et al., 2010). Por otro lado, los monocitos intermedios son la subpoblación que más expresa moléculas de presentación de antígeno y que, tras la estimulación vía TLR, libera más TNF-α, IL-1β, IL-6 y CCL3 (Belge et al., 2002; Cros et al., 2010; Wong Loon W et al., 2010). El fenotipo CD16+ expresa más CCR5 respecto a los monocitos clásicos (Ellery et al., 2007). Los monocitos no clásicos, como los monocitos intermedios, son capaces de presentar el antígeno, pero principalmente son conocidos por su rol en reparación de herida. Se contraponen a los monocitos clásicos, ya que liberando TNF-α permiten la adhesión de los neutrófilos al endotelio y no llegan a producir citoquinas proinflamatorias como los clásicos (Figura 6) (Schmidl et al., 2014). Tipo de monocitos Humano Rata Ratón Clásicos CD14++ CD16- CD43low His48high Ly6C++ CD43+ Intermedios CD14++ CD16+ - Ly6C++ CD43++ No clásicos CD14+ CD16++ CD43high His48low Ly6C+ CD43++ 30 Figura 6. Subtipos de monocitos en humano en condiciones fisiológicas y respectivos marcadores y funciones. Tomado de (Kapellos et al., 2019). Varios estudios clínicos refieren un aumento de monocitos intermedios en diferentes patologías. Están descritas alteraciones de los monocitos en caso de enfermedades cardiovasculares como en la IC (Wrigley et al., 2013; Ziegler-Heitbrock, 2014). Cuando se produce una obstrucción en las arterias coronarias con consecuente isquemia, los monocitos son reclutados rápidamente de la médula o de los reservorios del bazo hacia el tejido cardiaco donde se infiltran y se transforman en macrófagos. El infarto activa una señal adrenérgica que advierte, en la medula ósea, los nichos de las células madres. Estas reducen la producción de factores de retención de las células madres hematopoyéticas (HSCs, hematopoyetic stem cells), permitiendo a las HSCs de egresar de la medula y dirigirse al bazo. Este evento desencadena la hematopoyesis extramedular y por lo tanto la producción de monocitos. 24 horas tras el infarto, se libera el reservorio de monocitos del bazo al torrente sanguíneo, mientras que a los 4 días los reservorios de monocitos se reestablecen gracias a la proliferación y a la diferenciación de las HSCs. IL-1β, IL-3 y GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor) regulan la producción de monocitos a partir de HSC en el bazo (Dutta P & Nahrendorf M, 2015; Swirski et al., 2009). Primero, los monocitos invaden la zona perinfartada (en humano desde las primeras horas tras el IAM hasta los 5 días) y sucesivamente invaden la zona isquémica (desde el día 5 hasta el 14) (Peterson et al., 2022; 31 INTRODUCCIÓN van der Laan Anja et al., 2014). Se ha observado que 30 minutos tras el IAM hay un reclutamiento monocitario en la zona infartada en los modelos murinos, al que le siguen de una manera rápida los neutrófilos, sugiriendo un rol quimioatractor por parte de los monocitos (Jung et al., 2013; W. Li et al., 2016). En ratón tras el infarto, en las fases iniciales los monocitos predominantes son los Ly6Chigh igual que los macrófagos Ly6Chigh; entre el día 5-7 empiezan a prevaler, infiltrados en el miocardio, los macrófagos Ly6Clow derivados de los Ly6Chigh, sugiriendo la importancia del ambiente alrededor del daño en orquestar y modular la inflamación (Hilgendorf et al., 2014). En humano, los monocitos siguen el mismo patrón de infiltración ya que en tejido cardiaco obtenido de muestras post mortem se ha observado predominar monocitos CD16- en la fase inflamatoria comparados con la fase reparativa (van der Laan AM et al., 2014). Se ha descrito que el aumento de monocitos totales está asociado al remodelado adverso (Maekawa et al., 2002) llevando a la hipótesis que la excesiva infiltración de monocitos fuese perjudicial; no obstante, gracias a liposomas con condronato (molécula proapoptótica usada en tratamientos oncológicos) se ha realizado una depleción selectiva de los monocitos circulantes tras el infarto, tanto en la primera fase proinflamatoria como en la más tardía , reparativa, y se ha observado un aumento de células necróticas y de debris, una reducción de la deposición de colágeno y de la angiogénesis, sugiriendo el rol importante de los monocitos y macrófagos tras IAM (Nahrendorf et al., 2007a). Macrófagos y subtipos Los macrófagos son una población bastante diversa y heterogénea. Se distinguen dos grandes grupos según la procedencia embrionaria. Durante el desarrollo, pueden originarse a partir de las HSCs de la medula ósea o proceder del saco vitelino con origen materno; muchas de estas células progenitoras dan lugar a linajes de macrófagos residentes en diferentes tejidos (Gomez Perdiguero et al., 2015). Durante la etapa adulta, se diferencian por su localización: pueden ser residentes en el tejido como la microglía, macrófagos esplénicos y células de Kupffer, o derivados de monocitos que se infiltran en los tejidos (Gordon & Taylor, 2005).. Los macrófagos residentes, además de jugar un papel fundamental en procesos como la eferocitosis (la remoción por fagocitosis de células cardiacas apoptóticas), la conducción cardiaca, el desarrollo y maduración de coronarias, son responsables del remodelado cardiaco ya que guían la deposición de colágeno. Gracias a TGF-β1 y Smad3 (small mother against decapentaplegic) activan los fibroblastos cardiacos a miofibroblastos, potenciando la producción de IL-6 que aumenta la fibrosis (Ma et al., 2012). La activación de los fibroblastos cardiacos a un fenotipo secretorio y contráctil (miofibroblastos) a través de la transdiferenciación hace que se deposite matrix extracelular, evento clave en la fibrosis tras el evento isquémico. La modulación de esta respuesta fibrótica por los macrófagos es compleja y depende del contexto. Los macrófagos pueden alterar la matriz extracelular de diferentes formas: alteran las estructuras cardiacas con su actividad fagocítica, produciendo citoquinas y quimioquinas, entre ellas el TGF- β y el PDGF 32 y son capaces de regular el equilibrio de diferentes metaloproteinasas (Hulsmans et al., 2016). La transdiferenciación a miofibroblastos, la fibrosis no adaptativa y la mayor rigidez del miocardio tras la angiotensina II, inducen la MCP-1 (Monocyte chemoattractant protein-1), pone la atención a la contribución de los monocitos en la respuesta fibrótica (Haudek et al., 2010; Ren et al., 2011). Los monocitos circulantes una vez infiltrados están sometidos a modificaciones transcripcionales y se transforman en macrófagos MΦ. Este fenotipo puede ser más proinflamatorios o reparativos dependiendo del estímulo que recibe. Se ha descrito que esta transformación se puede comenzar gracias al estimulo clásico del IFN-γ (interferón-γ) en caso de un patógeno; sin embrago la estimulación con IL-4, IL-10, IL-13 o TGF-β hace que el macrófago tienda a un fenotipo reparativo capaz de regular y suprimir la inflamación (Gordon & Taylor, 2005). Los M1 son los macrófagos clásicos activados y son proinflamatorios y por lo tanto están implicados en las fases iniciales de la inflamación, mientras que el fenotipo M2 o alternativo son macrófagos activados (MΦ) antinflamatorios que participan en la resolución del proceso inflamatorio. Sin embargo, en el envejecimiento se ha observado que una depleción de macrófagos M1 disminuye la inflamación por la menor liberación de citoquinas y mejora la disfunción del tejido, favoreciendo una polarización y mayor presencia de M2 (van Beek et al., 2019). En el caso de infarto de miocardio se observa una reducción del número de macrófagos residentes, lo que hace que los macrófagos CCR2+ derivados de monocitos sigan múltiples destinos, incluso acaban siendo indistinguibles de los residentes (Dick et al., 2019; Heidt et al., 2014). La forma alternativa de macrófagos, M2, se identificó hace tres décadas in vitro gracias a la exposición a IL-4 y de allí se abrió un panorama nuevo sobre la plasticidad de los fagocitos (Stein et al., 1992). Los macrófagos M1 y M2 se nombraron siguiendo los linfocitos Th1 y Th2; los macrófagos MΦ activan a M1 tras un estímulo de IFN-γ, LPS, TNFα y GM-CSF, y a M2 con IL-4 e IL-13 pero también IL-33 amplía el efecto de esta última; se pueden polarizar a un estado M2-like o M2B gracias a IL-10 (Gordon, 2003). Los macrófagos polarizados M2 tienen una diferente regulación de la vía de IL-1 con bajos niveles de IL-1β, alto IL-1RA y baja caspasa 1 y participan en la respuesta mediada por Th2 (Dinarello, 2005). En cuanto al perfil de expresión de citoquinas, también difieren, ya que los M1 normalmente expresan las moléculas quimioatractoras para los linfocitos Th1 (CXCL9 y CXCL10) y los M2 principalmente CCL17, CCL22 y CCL24 (Locati et al., 2013). 33 INTRODUCCIÓN La polarización de los macrófagos es regulada por moléculas de señal, factores de transcripción, mecanismos epigenéticos y postranscripcionales. Principalmente en el caso de los M1 gracias a IFN-γ y TLR se activa la vía canónica IRF/STAT vía STAT1, mientras que en los M2 vía STAT6, pero se han dilucidado más vías implicadas. NF-κB activado por los TLRs activa la producción de mediadores proinflamatorios típicos de los M2, pero se ha visto también ser capaz de regular la resolución de la inflamación (Figura 7) (Bonizzi & Karin, 2004; Sica A & Mantovani A, 2012). Figura 7. Heterogeneidad de macrófagos durante la inflamación. CD200R, CD200 receptor; iNOS, inducible nitricoxide synthase; LPS, lipopolisacárido; LTA, lipoteichoic acid; PGE2, prostaglandin E2; PGN, peptidoglycan; TLR, Toll-like receptor; TNF, tumour-necrosis factor. Modificado de (Gordon & Taylor, 2005). La infiltración de los macrófagos también es una característica distintiva de la inflamación crónica. En el cáncer, los TAM (tumor associated macrophages) pueden tener un papel dual ya que ejercen una actividad pro y anti inflamatoria dependiendo del balance entre citoquinas, quimioquinas y anticuerpos (Biswas et al., 2013). Este complejo balance es presente también en las placas de ateromas y un desbalance hacia macrófagos M1 hace que progrese la aterosclerosis llegando a la progresión de la enfermedad coronaria (Mantovani et al., 2009; Yunna et al., 2020). En el proceso de reparación tanto en corazón isquémico como en patologías renales hay mucho dinamismo en la polarización de los macrófagos: los MΦ pasan por diferentes cambios dinámicos: al principio de la respuesta inflamatoria son los M1 que inician el proceso de inflamación, pero tras las primeras fases los macrófagos infiltrantes expresan más de un fenotipo M2 (Figura 8) (Lambert et al., 2008; Mantovani et al., 2013; Troidl et al., 2009). 40 los últimos años se está evidenciando su rol en varias patologías humanas, desde el cáncer, a las patologías cardiovasculares. Los ncRNAs se definen en base a la longitud de su transcrito como small ncRNAs (con longitud inferior a las 200 bpares de bases-), que comprenden los microRNAs y los short interfering RNAs (siRNAs) y los long non-coding RNA (lncRNAs) cuyo tamaño está comprendido entre 0.2 2 kb (Thum & Condorelli, 2015). Se calcula que alrededor del 98% del genoma humano está constituido por regiones no codificantes y el 80% de estas se trascribe a RNAs. Como las regiones que codifican por las proteínas, está emergiendo que las regiones no codificantes desempeñan un papel fundamental en el desarrollo, en la diferenciación, en la expresión de genes, con una regulación tanto a nivel transcripcional como traslacional. Los ncRNAs están implicados en la regulación de las células endoteliales, en las células musculares lisas, en el metabolismo cardiaco, en la isquemia, en la inflamación y en muchos procesos del sistema cardiovascular (Mushtaq I et al., 2018). Por ello es fundamental caracterizar el rol de ncRNAs que participan en estos eventos tanto como para estratificar el riesgo de pacientes de tener una evolución negativa tras el infarto por ejemplo (remodelado o reestenosis) como para poder identificar unas dianas terapéuticas biológicas para modular una respuesta temprana. Formación de miRNAs y papel biológico Los microRNAs son moléculas altamente conservadas de aproximadamente 22 nucleótidos (12-25 nt) capaces de ejercer efectos postranscripcionales sobre la expresión de genes. Como se indica en el repositorio online miRBase (versión 22.1; www.mirbase.org) se han determinado 1917 microRNAs maduros en el genoma humano, 1234 en ratón y sólo 496 en rata. Su papel fundamental es conjugarse a un mRNA (RNA mensajero) codificante para una proteína formando un RNA de doble cadena gracias a su corta secuencia complementaria, rápidamente destruida por la maquinaria celular. Como consecuencia, se ha una disminución de la expresión de este mRNA. Se calcula que los miRNAs modulan alrededor de un 30% de los genes codificantes para proteínas humanas creando una red de múltiples interacciones ya que un microRNA puede tener diferentes genes dianas y un mismo gen puede estar regulado por diferentes microRNAs pertenecientes o no al mismo grupo (Gabriel A, 2020). En su biogénesis, los microRNAs son sintetizados por la RNA polimerasa de tipo II y este transcrito se le denomina pri-miRNA. Luego el complejo compuesto por la RNasa de tipo III Drosha y su cofactor DGCR8 procesan este constructo reduciéndolo a unos 70 nt de longitud. El pre-miRNA creado es transportado por una proteína llamada Exportina- 5 y allí el complejo RNasa de tipo III DICER y su cofactor TRBP (transactivation response RNA binding protein) cortan ulteriormente el constructo, hasta llegar a una longitud de entre 19 y 41 INTRODUCCIÓN 25 nt. Finalmente, el complejo RISC (RNA-induced silencing complex) selecciona los microRNAs maduros. En este proceso participan las proteínas Argonauta, como Ago2, responsable de la regulación negativa de los miRNAs sobre los mRNAs, pero también otras enzimas que primero remueven el cap al mRNA y lo deacetilan para luego degradarlo (Figura 12) (Ha & Kim, 2014; Huntzinger & Izaurralde, 2011; Smani T et al., 2020). Los microRNAs pueden regular la expresión génica a través de RISC mediante la degradación del mRNAs diana o la represión traduccional. Este mecanismo depende del grado de la complementariedad entre microRNA y mRNA diana. Cuando la complementariedad es total se produce la degradación del mRNA, pero cuando es parcial solo habrá una represión de la traducción (Bartel, 2004). Dado que los microRNAs maduros se localizan en los cuerpos P, unos organelos que se funden con los endolisosomas, los microRNAs pueden ser liberados al espacio extracelular y en circulación a través de unas pequeñas vesículas llamadas exosomas, por simple extrusión de la membrana plasmática. En los últimos años los miRNAs se han evidenciado como buenos marcadores en cáncer, pero está emergiendo cada día más su importancia en ser unos biomarcadores en las enfermedades cardiovasculares (Hulsmans & Holvoet, 2013; Thum & Condorelli, 2015). Figura 12. Biogénesis de los microRNAs. XP05: Exportina- 5; TRBP: trans-activation response RNA binding protein; RISC: RNA-induced silencing complex. Modificado de Biorender. 42 microRNAs en patologías cardiovasculares Crecientes evidencias relacionan el papel de los RNAs no codificantes con la patogénesis de la IC y con los estadios que preceden a su desarrollo. Los microRNAs tienen potencial para ser dianas terapéuticas y buenos predictores pronósticos en las enfermedades cardiovasculares. Sin embargo, el camino del estudio para una identificación clara de RNAs no codificantes beneficiosos para el remodelado adverso y la IC es todavía largo y se necesitan estudios más profundos de las rutas de señalización implicadas en estos procesos. Recientemente se han descrito unos patrones de microRNAs circulantes en pacientes con IAM (Dai et al., 2022; Garcia et al., 2019b; Harada et al., 2018). Se sabe que los microRNAs regulan la expresión de proteínas fundamentales en el infarto, sin embargo, la asociación entre ellos y la expresión de citoquinas y otros mediadores inflamatorios en el IAM queda poco estudiada. Existen pocos estudios que identificaron los microRNAs como marcadores pronósticos para el desarrollo de remodelado adverso (X. tong Dai et al., 2022; Garcia et al., 2019a; H. Wang et al., 2020). En esta tesis doctoral se estudia la expresión de diferentes microRNAs, su curso temporal tras el IAM y su valor predictivo de remodelado adverso del ventrículo izquierdo. 43 HIPÓTESIS DE TRABAJO 2. HIPÓTESIS DE TRABAJO 44 45 HIPÓTESIS DE TRABAJO La revascularización temprana después del infarto permite reestablecer el flujo sanguíneo a la zona infartada del corazón limitando el daño producido durante la isquemia. Sin embargo, se sabe que la revascularización miocárdica desencadena una respuesta inflamatoria potente acompañada por muerte celular que estaría implicada en la estimulación de las células cardiacas y en la aparición de fibrosis intersticial por deposito excesivo de colágeno. Dicha fibrosis afecta de manera determinada a la función cardiaca y se asocia con el remodelado cardiaco. No obstante, no todos los pacientes sometidos a angioplastia primaria desarrollan el remodelado adverso del corazón. Por ello, hipotetizamos que durante la respuesta inflamatoria hay una participación diferencial de las poblaciones inflamatorias en los pacientes infartados, como los neutrófilos y las subpoblaciones de monocitos que regulan la liberación de citoquinas y microRNAs implicados en la fibrosis intersticial. Por lo tanto, el cambio en los niveles de las células inflamatorias podría predecir el remodelado adverso del miocardio en los pacientes con STEMI. 46 47 OBJETIVOS 3. OBJETIVOS 48 49 OBJETIVOS El objetivo general de esta tesis doctoral es caracterizar el papel de las células inflamatorias, citoquinas y microRNAs en el infarto revascularizado y sus implicaciones en el remodelado adverso. Por ello, los objetivos específicos son: 1. La caracterización de las poblaciones inflamatorias y su posible correlación con la aparición de remodelado adverso del ventrículo izquierdo en pacientes STEMI revascularizados mediante angioplastia primaria 2. La identificación de citoquinas y microRNAs expresados por los monocitos que predijeran el remodelado adverso en pacientes con STEMI 3. El análisis del papel de las poblaciones inflamatorias que participan en infarto con y sin reperfusión en el modelo animal, centrándose en la fibrosis como marcador de remodelado 4. La identificación el papel causal de citoquinas y microRNAs en expresados por los monocitos en la fibrosis y apoptosis en el modelo animal 56 reperfusión (IAM), infarto con reperfusión (modelo de isquemiareperfusión, I/R) y SHAM como ya se describió por el grupo. Se extrajo sangre periférica, bazo, médula y corazón a los diferentes tiempos experimentales (24 h, 72 h, 1 semana, 2 semanas, y 4 semanas) (Figura 16). Figura 16. Protocolo temporal de estudio en el modelo animal. Se han representado con flecha intermitente los tiempos de toma de las muestras, de citometría de flujo y FACS (fluorescence-activated cell sorting). Esquema creado con Biorender. 4.6.2 MODELO ANIMAL DE IAM Y I/R Se utilizaron ratas macho Wistars de 250-300g. Los modelos experimentales utilizados fueron de ligadura reversible (I/R) e irreversible (IAM) de la arteria coronaria descendente anterior. Como control (SHAM) se realizó una intervención en la que solo se realizó la toracotomía sin tocar el corazón, permitiendo eliminar el sesgo producido por la inflamación basal debida a la operación. Las ratas se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina– xilacina (50mg/kg y 8 mg/kg respectivamente), y fueron intubadas y conectadas a un respirador con O2 (Harvard Apparatus, USA) y se mantuvieron anestesiadas con sevofluorano al 2% hasta el final de la operación. También, se controló de manera continua la temperatura corporal gracias a una manta eléctrica a 37ºC, y se vigilaron las constantes vitales gracias a un electrocardiograma (ECG). Primero, se realizó una toracotomía izquierda entre la tercera y quinta costilla para acceder a corazón. Seguidamente, se procedió a la ligadura de la arteria coronaria izquierda con un hilo 6-0 Prolene (Ethicon, USA). Para permitir que la ligadura fuese reversible, se empleó un tubo auxiliar sobre el que se realizó el punto de sutura. Se confirmó que se había bloqueado el flujo sanguíneo por la elevación del segmento ST en el ECG y por la conversión de la zona del infarto en cianótica. A los 40min se cortó el punto de sutura encima del tubo y se liberó así el hilo para permitir la reperfusión y se procedió a 57 MATERIALES Y MÉTODOS cerrar el tórax. En el caso del modelo de infarto, el punto de sutura sobre la arteria coronaria fue irreversible. A continuación, se cerró el tórax, cociendo las costillas y los músculos pectorales por planos de toracotomía. Se mantuvo la anestesia gaseosa hasta la recuperación de los reflejos y se subministró un analgésico por vía subcutánea (Meloxicam a 1mg/kg). La supervivencia a la intervención fue >97%. Las ratas se sacrificaron a 24h, 72h, una y cuatro semanas con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (100 mg/kg). Se extrajeron sangre periférica, bazo, médula del fémur y corazón para los experimentos descritos a seguir en diferentes tiempos experimentales (24h, 72h, 1 semana, 2 semanas y 4 semanas). La sangre se extrajo en los tiempos intermedios de la vena yugular y al sacrificio con punción cardiaca. 4.7 CULTIVO CELULAR 4.7.1 CULTIVO DE POBLACIONES MIOCÁRDICAS DE RATA CON CÉLULAS INFLAMATORIAS Obtención de neutrófilos y monocitos de ratas operadas Para la obtención de neutrófilos y monocitos se sacó la cantidad máxima posible por punción cardiaca (5-6 ml), se medió el volumen adquirido y se puso dextrano 10% (preparado en PBS 1X estéril) con una proporción de 2:15 (675 μl para 5 ml de sangre). Se mezcló por inversión del tubo y se dejó decantar con el tapón abierto durante alrededor de 30min, se recolectó el sobrenadante y se medió el volumen del sobrenadante. Sobre el Ficoll se depositó lentamente el sobrenadante para crear dos fases. Se centrifugó a 1500 rpm (revolución por minuto) durante 20min a Tamb. Se recogió el halo de monocitos depositado encima de la fase de Ficoll mientras que los neutrófilos se encontraban en el pellet. Finalmente se lavaron ambas poblaciones en PBS 1X y se centrifugaron a 1800 rpm durante 5min. Obtención de fibroblastos y cardiomiocitos de ratas sanas por dispersión Las poblaciones miocárdicas (cardiomiocitos y los fibroblastos) se obtuvieron con el sistema Langendorff mediante digestión enzimática con colagenasa de tipo II (280 IU/mL; Worthington Biochemical, USA), como descrito anteriormente por el laboratorio (Domínguez-Rodríguez et al., 2018). Luego las células fueron filtradas y centrifugadas y resuspendidas en solución Tyrode, conteniente 130 mM de NaCl, 1 mM de CaCl2, 0.5 mM de MgCl2, 5.4 mM de KCl, 22 mM de glucosa, 25 de mM HEPES, 0.4 mM de NaH2PO4 y 5 mM de NaHCO3 con pH 7.4. Se extrajo el corazón de la rata anestesiada, procurando obtener una longitud suficiente de aorta para su posterior canalización. Una vez limpio de tejidos adyacentes, se conectó este a una cánula que a su vez estaba conectada a la jeringuilla y se aseguró la unión del corazón y la cánula haciendo un nudo con un hilo 58 de sutura. Se colocó la solución de enzima en el baño a 37ºC. Pasados 7min, el corazón se desconectó del sistema a través de la escisión por debajo de las aurículas. A continuación, en la placa donde se recogió el corazón se añadió un poco de la solución de enzima y se cortó en trozos más pequeños, removiendo a través de pipeteo a fin de disgregar lo máximo posible. A continuación, se pasó todo el contenido del tubo a través de un filtro (tela tul) y se recogió el contenido en un Falcon. El filtrado recolectado se centrifugó a 200 rpm durante 1min. Los cardiomiocitos remanentes debido a su tamaño y peso se depositaron al fondo en forma de pellet. Se recogió el sobrenadante en un nuevo tubo Falcon y se centrifugó a 1600 rpm durante 7-8min para recoger los fibroblastos. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el pellet en PBS (400-500 µl). Tanto los fibroblastos como los cardiomiocitos se sembraron en placas pretratadas con laminina (L2020, Sigma, USA). Las células se cultivaron en una solución control 1.8 mM de CaCl2 en DMEM (42430082, Gibco, USA). Cultivo de poblaciones miocárdicas de rata con sobrenadante procedente de células inflamatorias Se estudiaron in vitro las tres distintas poblaciones de células inflamatorias aisladas de la sangre periférica del modelo animal (rata) de SHAM, I/R e IAM a 72 horas (72h) del evento isquémico. Para ello los granulocitos de las ratas operadas se obtuvieron utilizando Ficoll (1692254, Lymphosep- Lymphocyte Separation Medium, USA) complementado con dextrano (31394, Sigma, USA). A continuación, se cultivaron las dos poblaciones de granulocitos durante 72h con medio RPMI 1640 (RPMI- Roswell Park Memorial Institute, 5515-040-CV, Corning, USA) con FBS 5% (35-079-CV, Corning, USA), Estreptomicina- Penicilina 10% (10.000 unidades, PS- B, Capricorn Scientific, USA) y L- glutamina 10% (200mM, G7513, Sigma, USA). Luego se recolectó el sobrenadante y se añadió a las placas con medio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, 42430082, Gibco, USA) en las que previamente se habían sembrado durante 24h los cardiomiocitos y fibroblastos obtenidos por dispersión, siguiendo el esquema descrito en la Figura 17. A las 24h se recogieron las placas de las dos poblaciones para su sucesiva medida de expresión génica. Figura 17. Diseño experimental del ensayo de cultivo. Creado con Biorender. 59 MATERIALES Y MÉTODOS 4.7.2 LÍNEA CELULAR HUMANA DE MONOCITO: THP-1 La línea La THP-1 (TIB-202, ATCC, USA) es una línea celular de monocitos humano de leucemia aislada por Tsuchiya (Tsuchiya et al., 1980). Las células THP-1 se asemejan a los monocitos primarios y a los macrófagos por morfología y propiedades de diferenciación. Las THP-1 pueden ser diferenciadas a macrófagos tras la exposición con PMA (del inglés Phorbol 12-myristate 13-acetate, Forbol-12-miristato Acetato, P1585, Sigma, USA) pasan de ser un cultivo de células en suspensión a células adherentes. El bagaje genético de las THP-1 es homogéneo con respecto a los cultivos primarios de monocitos, lo cual minimiza el grado de variabilidad del fenotipo celular de los macrófagos. Esta línea celular se cultivó con medio RPMI 1640 con FBS 10%, Estreptomicina- Penicilina 10% y L- glutamina 10%. Se realizó el cambio de medio cada 3 días o cuando las condiciones experimentales lo requerían. Los pases celulares se realizaron centrifugando las células a 1800 rpm durante 7min y congelando en crioviales con DMSO (Dimetilsulfóxido, 41640, Sigma, USA) al 10%. Para simular la transformación de monocitos a macrófagos infiltrados en el corazón se trataron las células con PMA 20ng/ml (en DMSO) durante 48h y luego se cultivaron en medio normal. Se comprobó la viabilidad celular tras una incubación con Calcein- AM Solution (C1359, 4mM en DMSO), un compuesto permeable que es hidrolizado rápidamente por las esterasas intracelulares de las células vivas y que emite fluorescencia en longitudes de onda correspondiente al verde. Para averiguar la viabilidad tras el tratamiento y en todos los pasos de diferenciación y ensayos de hipoxia y reoxigenación se tomaron fotos al microscopio invertido de fluorescencia Olympus BX71 (Japón) (Figura 18). Para estudiar la transformación de los monocitos a macrófagos MΦ, se realizó primero un periodo de priming (incubación para transformación a macrófagos) de 24h con PMA 2.5 ng/ml y las células adquiriendo una forma más aplanada, adherente a la placa. Luego se dejaron en cultivo en un periodo de reposo durante 72h para a continuación someterlas a una polarización a M1, M2a y M2b con citoquinas durante 48h más. Los MΦ se diferenciaron a M1 con IFN-γ (20 ng/ml, Peprotech) y LPS (250 ng/ml, Sigma), a M2a con IL-4 (20 ng/ml, Peprotech) y a M2b con IL-10 (20 ng/ml, Peprotech). Tras la polarización se realizó un protocolo de hipoxia y reoxigenación con 24h en la cámara de hipoxia 1% O2 5% CO2 y 24h de reoxigenación en condiciones de normoxia. Se recolectaron las células en varios tiempos experimentales (Figura 19) según las condiciones a continuación: - THP-1 sin tratar (monocitos) - THP-1 H y THP-1 HR: monocitos con 24h de hipoxia (H) y 24h de reoxigenación tras la hipoxia (HR) - THP-1- MΦ: con PMA 2.5 ng/ml durante 24h y periodo de reposo (macrófagos derivados de monocitos) 60 - THP-1- M1, THP-1- M2a, THP-1- M2b: con PMA y periodo de polarización (macrófagos derivados de monocitos polarizados a M1, M2a, M2b) - THP-1- M1 H, THP-1- M2a H, THP-1- M2b H: con PMA, polarización y 24h de hipoxia (macrófagos derivados de monocitos polarizados a M1, M2a, M2b con tratamiento de 24h de hipoxia- H-) - THP-1- M1 HR, THP-1- M2a HR, THP-1- M2b HR: con PMA, polarización y 24h de hipoxia (macrófagos derivados de monocitos polarizados a M1, M2a, M2b con tratamiento de 24h de hipoxia y 24h de reoxigenación). Figura 18. Ensayo de viabilidad con calceina en THP-1. Viabilidad celular tras una incubación con Calcein- AM Solution, compuesto que es hidrolizado rápidamente las esterasas intracelulares de células vivas y que relaja fluorescencia visible al microscopio. La escala en blanco corresponde a 100 µm. 61 MATERIALES Y MÉTODOS Figura 19. Planteamiento experimental del cultivo celular con THP-1. Se han representado con flecha intermitente los timing de toma de las muestras de RNA. Creado con Biorender. RPMI: medio Roswell Park Memorial Institute, PMA: Forbol-12-miristato Acetato, H: hipoxia, HR: hipoxiareoxigenación; priming: incubación para transformación a macrófagos. 4.8 TÉCNICAS HISTOLÓGICAS 4.8.1 TINCIÓN TRICRÓMICA DE MASSON Y CUANTIFICACIÓN DE LA FIBROSIS Los corazones de rata se fijaron en formalina (252931.1315, Panreac AppliChem, USA) 24h y se incluyeron en parafina. Se cortaron al micrótomo monotorizado (RM2255, LEICA, Alemania) en secciones trasversales de 6 µm de grosor y se tiñeron con el protocolo de tricrómico de Masson en el Servicio de Histología del IBiS, sucesivamente. De manera breve, los portaobjetos con las secciones se desparafinaron utilizando una escala de alcoholes (2x10min en xilol, 2x10min en etanol 100º, 10min en etanol 96º, 10min en etanol 80º, 10min en etanol 50º, 5min en H2O destilada). Seguidamente, se añadió hematoxilina férrica de Weigert durante 5min y se lavó 5min en agua corriente para permitir el viraje de color. Luego se tiñeron las muestras con fucsinaescarlata durante 5min, 2min de lavado en H2O destilada y 15min en ácido fosfomolíbdico al 5% en agua destilada. Los pasos siguientes fueron 10min en azul de anilina y 3min de diferenciación con ácido acético al 1% en H2O destilada y finalmente se realizó un deshidratado rápido (siguiendo la escala de alcoholes al contrario de la primera fase de hidratación) y montaje con cubreobjetos. Las imágenes se adquirieron con el microscopio directo Olympus BX 61 (Olympus, Japón) y mediante el Thunder (Leica, Alemania) en bright field. La fibrosis, que con esa tinción aparece en azul intenso, se cuantificó con el programa Cell Profiler 4.0 con un pipeline (programación que permite analizar de forma 62 automática la fibrosis presente en las fotos de los cortes histológicos) creada ad hoc para distinguir entre los pixeles rojos y azules como se puede observar en la Figura 20. Figura 20. Ejemplo del análisis de la fibrosis con Cell Profiler. En los cortes histológicos de ápice del corazón (A- C) y parte central del corazón a la base de los músculos papilares (D-F) de los corazones SHAM, I/R e IAM se realizó la tinción de tricrómico de Masson que tiñe en azul el colágeno, marcador de fibrosis, presente en un tejido. El programa Cell Profiler es capaz de identificar en cada foto todos los pixeles azules y rojos y crea dos fotos cuya presencia de rojo (B y E) o azul (C y F) es transformada binariamente en puntos. 4.8.2 INMUNOFLUORESCENCIA Inmunofluorescencia de cortes histológicos Los corazones se extrajeron y se incluyeron frescos en Tissue-Tek® O.C.T. Compound (Sakura Finetek, USA) y se guardaron hasta su corte a -80ºC. Usando el criostato (CM1950, Leica, Alemania) se cortaron secciones trasversales tanto apicales como de la parte central del corazón a la base se los músculos papilares, despreciando 700 µm entre ellas. El grosor de las rodajas cortadas fue de 6 µm y se colocaron en portas Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides (J1800AMNZ, Empredia, ThermoFisher, USA). Al ser tejido sin fijar se tuvo mucha precaución en guardar inmediatamente los portaobjetos con las secciones a -20ºC hasta su tinción. Para la inmunofluorescencia de tejido congelado se fijó el tejido con formalina 30min a temperatura ambiente (Tamb). Luego se lavaron dos veces con PBS 1X durante 10min. Después se procedió con la permeabilización para que los anticuerpos puedan entrar en el tejido y con el bloqueo del tejido con proteínas sérica para evitar marcaje aspecífico. Primero se permeabilizó 15min con PBS 1X- 0.3% Triton 63 MATERIALES Y MÉTODOS (1001524777, Triton X100, Sigma), luego 2 veces durante 10min con PBS 1X- 0.1% Triton. Posteriormente cada porta se incubó 200 µl de la solución de bloqueo [PBS 1X- 0.1% Triton- Goat serum 10% (16210064, Gibco, USA)- BSA 1% (BSA, Bovine Serum Albumin, A2153-100G, Sigma, USA)] utilizando un cubre especial de incubación (Incubation chamber 200 µl, 70324-20, VWR, USA) durante 1h a Tamb. Luego se preparó el anticuerpo primario en la solución de bloqueo a la dilución adecuada para cada anticuerpo utilizado como reflejado en la Tabla 2. Tabla 2. Anticuerpos primarios y secundarios usados en inmunofluorescencia. Las muestras se incubaron con los anticuerpos primarios en cámara fría +4°C durante toda la noche. Al día siguiente se lavaron los portaobjetos tres veces durante 5min con PBS 1X- 0.1% Triton y 4 veces durante 10min con la solución de bloqueo. Se añadieron los anticuerpos secundarios a la concentración adecuada (Tabla 2) y se incubaron protegidos de la luz a Tamb durante 4h. Luego se lavó durante 5min cuatro veces con PBS 1X- Triton 0.1% y dos con PBS 1X. Por ultimo las muestras se incubaron con DAPI (4',6-diamidin-2- fenilindolo, 268298, Sigma, USA) para marcar los núcleos a una dilución 1:1000 en PBS 1X 5min a Tamb protegidas de la luz. Se eliminó el exceso de DAPI con PBS 1X y se montaron los portaobjetos con DAKO Fluorescence Mounting Medium (S3023, Dako, USA) y con cubreobjetos (631-1339, Menzel-Gläser, Alemania). Inmunofluorescencia de células Además de la inmunofluorescencia en tejido, se realizó inmunofluorescencia de células provenientes de cultivo. Por ello se sembraron las células en placas con cubres previamente puestos en ellas para que se pudieran sacar de la placa fácilmente para la tinción. Tras fijar las células con formalina durante 20min, se lavó con la solución de permeabilización (PBS 1X- 0.5% Triton) durante 20min para luego lavar tres veces durante 5min con la solución de bloqueo [PBS 1X- 1% BSA- 0.5% TWEEN 20 (P1379, Sigma, USA)] y bloquear Anticuerpo Tipo Clon Dilución Referencia CD163 Monoclonal de ratón ED2 1:100 Biorad, USA, MCA342GA CD68 Monoclonal de ratón ED1 1:100 Biorad, USA MCA341GA Alexa Fluor 488 goat anti-mouse, IgG Policlonal 1:400 ThermoFisher Scientific, USA A11029 Alexa Fluor 594 goat anti-mouse, IgG Policlonal 1:400 ThermoFisher Scientific, USA, A11032 64 durante 30min. Seguidamente se añadió el anticuerpo primario (ver Tabla 2) en solución de bloqueo en un volumen de 40 µl por cubre q se incubó a Tamb durante 2h. Se lavó tres veces con solución de bloqueo y se puso el anticuerpo secundario (ver Tabla 2) que se incubó protegido de la luz durante 40min. Se lavó de nuevo para posteriormente incubar con DAPI 1:1000 en PBS1X durante 5min y se lavó una vez con PBS 1X y dos con agua. Finalmente se montaron los cubres en los portaobjetos con 6 µl de DAKO y las fotos se adquirieron con el microscopio Olympus BX61 (Olympus, Japón). 4.9 TÉCNICAS DE DETECCIÓN DE CÉLULAS: CITOMETRÍA DE FLUJO 4.9.1 CITOMETRÍA DE FLUJO DE MUESTRAS HUMANAS De la sangre periférica extraída en los diferentes tiempos (0 y 6h, 1 y 6 meses) se utilizaron 100 µl y se incubaron con anticuerpos contra proteínas de membrana de células inmunes, CD11b, CD14, CD16 y CD66b (Tabla 3). Tabla 3. Panel de anticuerpos acoplados a fluoróforos para identificar en humano las diferentes poblaciones sanguíneas de neutrófilos, eosinófilos y tres subtipos de monocitos. Anticuerpo Emisión Tipo Clon Dilución Referencia CD11b/Mac-1 APC 620 nm Monoclonal de ratón ICRF44 1:10 (10 µl por muestra) BD Biosciences, USA, 550019 CD14 FITC 488 nm Monoclonal de ratón M5E2 1:10 (10 µl por muestra) BD Biosciences, USA, 555397 CD16 PE 540 nm Monoclonal de ratón 3G8 1:10 (10 µl por muestra) BD Biosciences, USA, 555407 CD66b PerCP- Cy5.5 640 nm Monoclonal de ratón G10F5 1:40 (2.5 µl por muestra) BD Biosciences, USA, 562254 Las muestras fueron incubadas 30min a Tamb protegidos de la luz. Seguidamente, se lisaron los eritrocitos con 2 ml de solución lisis 1X (FACS Lysing Solution 10X, 349202, BD Biosciences, USA) durante 10mina Tamb. Tras neutralizar la lisis con PBS 1X, se centrifugaron 7- 8min a 1800 rpm a Tamb, se resuspendió el pellet con 300 µl de PBS 1X y se transfirió a un tubo de citometría para analizar las poblaciones sanguíneas al citómetro Canto II (BD Biosciences, USA). Los datos se cuantificaron con el programa DIVA II. Se identificaron primero las poblaciones según: 65 MATERIALES Y MÉTODOS - tamaño celular (medido por difracción de la luz entre 0,5º y 2º, índice de tamaño celular y refracción, medido entre 2º y 15º, que informa sobre la estructura celular externa; estos índices, combinados dan la medida llamada Forward Scatter, FSC) - complejidad (o granulosidad celular, medida a través de la luz dispersada lateralmente a 90º o Side Scatter, SSC) Posteriormente, se eliminaron los dobletes y, gracias a la detección de la fluorescencia emitida por los anticuerpos acoplados, se cuantificaron las distintas poblaciones granulocíticas con el siguiente inmunofenotipo celular (Tabla 4 y Figura 21). Tabla 4. Caracterización fenotípica de las poblaciones inflamatorias humanas en sangre periférica. Figura 21. Gráficas representativas de una citometría sanguínea humana. A. Distribución de las poblaciones sanguíneas por complejidad (SSC-A) y tamaño (FSC-A). B y C. Exclusión de dobletes. D. distribución de la NEUTRÓFILOS CD11B+ CD66B+ CD16++ EOSINOFILOS CD11B+ CD66B- CD16- MONOCITOS NO CLÁSICOS patrulleros CD11B+ CD66B- CD14+ CD16++ MONOCITOS INTERMEDIOS proinflamatorios CD11B+ CD66B- CD14++ CD16+ MONOCITOS CLÁSICOS fagocíticos CD11B+ CD66B- CD14++ CD16- 72 para el estudio de genes de fibrosis y apoptosis, mientras que el iScript cDNA Synthesis Kit (1708891, Biorad, USA) fue el kit utilizado para los genes (Tabla 9). Tabla 7. Reactivos utilizados para el kit miScript RT. 5x miScript HiSpec Buffer 4μl 10x miScript Nucleics Mix 2μl miScript Reverse Transcriptase Mix 1μl Agua libre de RNAsas Variable cDNA Variable, depende de la concentración medida por el Qubit (700 ng) Tabla 8. Reactivos utilizados para el kit iScript™ Advanced cDNA Synthesis Kit. 5x iScript advanced Reaction mix 4μl iScript Reverse Transcriptase 1μl Agua libre de RNAsas Variable cDNA Variable, depende de la concentración medida por el Qubit (1000 ng) Tabla 9. Reactivos utilizados para el kit iScript cDNA Synthesis Kit. hiScript HiSpec Buffer 4μl iScript Reverse Transcriptase 1μl Agua libre de RNAsas Variable cDNA Variable, depende de la concentración medida por el Qubit (1000 ng) Retrotranscripción en rata Para realizar la RT de microRNAs del modelo animal se utilizó el kit miRCURY LNA RT Kit (339340, Qiagen, Alemania). Por cada muestra se añadieron los siguientes reactivos representados en la Tabla 10. Tabla 10. Reactivos utilizados para el kit miRCURY. 5x miRCURY SYBR Green RT reaction buffer 2 μl Agua libre de RNAsas 5 μl 10x miRCURY RT Enzyme Mix 1 μl cDNA a 5ng/μl 2 μl (300ng) 73 MATERIALES Y MÉTODOS 4.11.4 QPCR PARA MICRORNAS Y GENES DIANAS qPCR en pacientes En el caso de la cuantificación de los microRNAs, las muestras humanas se diluyeron 1:10 para cargar la placa 384 (FrameStar 394 Well PCR Plate (4attitude, USA). Todas las muestras, por cada microRNA a cuantificar, se cargaron en la placa por triplicado. Se utilizaron el iTAQ universal Sybr Green Supermix (1725124, Biorad, USA), miScript Primer Assay (Qiagen, Alemania) y 10x miScript Universal Primer (Qiagen, Alemania) (Tabla 11). Tabla 11. Lista de los primers utilizados en la qPCR de microRNAs en humano. Hs_miR-16_2 MS00031493 Rn-miR-21_2 MS00013216 Rn-miR-29a_2 MS00033397 Hs_miR-1246_2 MS00043491 Hs_miR5189_1 MS00038619 Hs_miR-143_1 MS00003514 SNORD95 MS00033726 Ctrl_RTC1_1 MS00000001 Se prepararon los mixes por cada oligo de microRNAs, considerando los siguientes volúmenes por pocillo en la tabla a continuación (Tabla 12). Tabla 12. Reactivos utilizados para la qPCR de microRNAs en humano. SYBR 5 μl Primer microRNA 0.5 μl Universal primer 0.3 μl Agua libre de RNAsas 1.7 μl cDNA 2.5 μl (diluido 1:10) Para la cuantificación de genes humanos, primero se utilizó una placa prediseñada PrimePCR 384 (Apoptosis and survival Tier 1 H384, 10040258, Biorad, USA) con su kit recomendado por el fabricante (SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix, 1725270EDU, Biorad, USA) para el estudio de genes de fibrosis y apoptosis (Tabla 13) y sucesivamente se validaron con iTAQ universal Sybr Green Supermix (1725124, Biorad, USA) (Tabla 15). 74 Tabla 13. Reactivos utilizados para la prime qPCR de genes en humano. Sso Advanced universal SYBR Green 5 μl cDNA 2 μl (diluido 1:10) Agua libre de RNAsas 3 μl Se trata de una placa formada por 4 placas repetidas de 96 pocillos en las cuales hay sondas para la cuantificación de varios genes implicados en rutas de señalización como las de apoptosis, fibrosis y supervivencia celular (Figura 23). Figura 23. Diseño de la placa de Prime PCR de humano. Ya que las muestras de pacientes están sujetas a más variabilidad que el modelo animal, se decidió utilizar la placa como un Array, poniendo por cada una de las placas de 96 un pool formado por cuatro muestras de pacientes del mismo grupo y con características parecidas. Se analizaron un total de 6 grupos de pacientes, así divididos: 75 MATERIALES Y MÉTODOS • Controles sanos (C) • Pacientes que no remodelan a las 0h (NR0h) • Pacientes que no remodelan a las 6h (NR6h) • Pacientes que remodelan a las 0h (R0h) • Pacientes remodelan a las 6h (R6h) • Pacientes remodelados a los 6 meses (R6m) Los genes cuyos niveles de expresión fueron estadísticamente significativos entre los grupos de pacientes, se validaron por qPCR de manera individual. Las sondas (Tabla 14) se diseñaron utilizando el software Primer Express (Applied Biosystems, USA) y seguidamente se comprobó que la homología de secuencia con el gen diana en BLAST fuese del 100%. Se prepararon los mixes por cada gen, considerando los volúmenes por pocillo en la Tabla 15. Tabla 14. Lista de primers (con secuencia forward y reverse) para amplificar genes de rata y humano. Human AKT2 Forward CATCCTCATGGAAGAGATCCGC Human AKT2 Reverse GAGGAAGAACCTGTGCTCCATG Human AKT3 Forward CGGAAAGATTGTGTACCGTGATC Human AKT3 Reverse CTTCATGGTGGCTGCATCTGTG Human CDKN1A Forward ACTCTCAGGGTCGAAAACGG Human CDKN1A Reverse GATGTAGAGCGGGCCTTTGA Human HMOX1 Forward CCAGGCAGAGAATGCTGAGTTC Human HMOX1 Reverse AAGACTGGGCTCTCCTTGTTGC Human IFNG Forward TGTCGCCAGCAGCTAAAACA Human IFNG Reverse TGCAGGCAGGACAACCATTA Human IL1B Forward TCGAGGCACAAGGCACAACAGG Human IL1B Reverse GCCATGGCTGCTTCAGACACTTGA Human IL6 Forward TTCACCAGGCAAGTCTCCTCA Human IL6 Reverse CCTGAACCTTCCAAGATGGC Human JAK2 Forward CCAGATGGAAACTGTTCGCTCAG Human JAK2 Reverse GAGGTTGGTACATCAGAAACACC Human MYC Forward TCAAGAGGCGAACACCAAC Human MYC Reverse GGCCTTTTCATTGTTTTCCA Human NFKB1 Forward GCAGCACTACTTCTTGACCACC Human NFKB1 Reverse TCTGCTCCTGAGCATTGACGTC Human PTEN Forward TGGATTCGACTTAGACTTGACCT Human PTEN Reverse TTTGGCGGTGTCATAATGTCTT Human RAF1 Forward CAGCCCTGTCCAGTAGC Human RAF1 Reverse GCGTGACTTTACTGTTGC Human TNFA Forward CCCAGGCAGTCAGATCATCTTC Human TNFA Reverse AGCTGCCCCTCAGCTTGA Rat COL1 Forward TTCACCTACAGCACGCTTGT Rat COL1 Reverse TTTGGGATGGAGGGAGTTTAC Rat COL3 Forward GGTCACTTTCACTGGTTGACGA 76 Rat COL3 Reverse TTGAATATCAAACACGCAAGGC Rat TGFB1 Forward ATTCCTGGCGTTACCTTGG Rat TGFB1 Reverse AGCCCTGTATTCCGTCTCCT Rat APAF1 Forward TCCAGCGGCAAGGACACAGACG Rat APAF1 Reverse CAACCGCGTGCAAAGATTCTGCA Rat BCL2 Forward TTCGGGATGGAGTAAACTGG Rat BCL2 Reverse AAGGCTCTAGGTGGTCATTCAG Rat CYCS Forward CAAAAGTGTGCCCAGTGCCA Rat CYCS Reverse CAGCAGCCTGGCCTGTCTTC Rat HMOX1 Forward AGGCTAAGACCGCCTTCCT Rat HMOX1 Reverse TGTGTTCCTCTGTCAGCATCA 18S Forward AACGAGACTCTGGCATGCTAA 18S Reverse GCCACTTGTCCCTCTAAGAAGT Tabla 15. Reactivos utilizados para la qPCR de genes en rata y humano. 5x SYBR Green 5 μl Forward Primer (100 μM) 0.5 μl Reverse Primer (100 μM) 0.5 μl cDNA 2.5 μl (diluido 1:10) Agua libre de RNAsas 1.5 μl qPCR de microRNAs En el caso de las muestras de rata, para los genes se usó el kit iScript (Biorad descrito en el apartado anterior), mientras que para los microRNAs se usó el kit miRCURY LNA SYBR Green PCR kit (Tabla 16), ya que el sistema anteriormente empleado se había descatalogado. Se utilizaron los siguientes miRCURY LNA miRNA PCR Assay (339306, Qiagen, Alemania): miR16-5p, miR-21-5p, miR29a-3p, miR27a-3p, miR29b-3p, miR30e-5p, miR194-5p, miR-222-3p. Tabla 16. Reactivos utilizados en la qPCR de microRNAs en rata. 2x miRCURY SYBR Green Master Mix 5 μl miRCURY LNA miRNA PCR Assay 1 μl cDNA 3 μl (diluido 1:20) Agua libre de RNAsas 1 μl En todas las reacciones de qPCR después de haber cargado la placa, esta se agitó en un vortex específico para placa y se centrifugó durante 1min a 3000 rpm. La reacción se llevó a cabo utilizando un termociclador ViiA7 real- Time PCR (Thermofisher, USA) (Tabla 17). 77 MATERIALES Y MÉTODOS Tabla 17. Protocolos de retrotranscripción y qPCR en el termociclador (para la retrotranscripción) y en el ViiA7 (para la qPCR). Tipo De Kit Retrotranscripción qPCR microRNAs en rata (miRCURY) 1h a 42ºC 5min a 95ºC 20s a 95ºC 1s a 95ªC 20s a 60ºC Por 40 ciclos microRNAs en humano (Qiagen) 1h a 37ºC 5min a 95ºC Genes en rata y humano (Biorad) 5min a 25ºC 20min a 46ºC 1min a 95ºC Genes en humano (primePCR Biorad) 20min a 46ºC 1min a 95ºC 2min a 95ºC 5s a 95ºC 30s a 60ºC Por 40 ciclos 4.11.5 CUANTIFICACIÓN RELATIVA DE LA QPCR Los datos obtenidos se analizaron según cuantificación relativa (Schmittgen & Livak, 2008). Según este método es posible normalizar el ciclo umbral (CT- Cycle threshold) del gen en cuestión, al endógeno. En el caso de las muestras humanas se utilizó como RNA endógeno el SNORD95, mientras que para las muestras de rata se utilizó el RNA ribosómico 18S. Entre los triplicados se analizó la desviación estándar y si esta era mayor de 0.6 ciclos se eliminaba el valor de la muestra más alejado de los otros. Seguidamente se utilizó para la cuantificación de la expresión el método del ΔΔCT. Este consiste en calcular la variación del CT entre el microRNA/ gen objeto del estudio y el CT del endógeno elegido en cada caso. ΔCT microRNA= CT microRNA PROBLEMA – CT endógeno (RTC1 o SNORD95) Para observar la desviación del microRNA en la muestra se calculó el Δ ΔCT. ΔΔCT= ΔCT medio muestra – ΔCT medio controles Para representar cuanto varía la expresión, se utilizó el Fold Change (taso de cambio) y finalmente los datos se expresaron con logaritmo. Fold Change=2^ (- ΔΔCT) 78 4.12 ARRAYS Y ANÁLISIS DE DATOS En estas tesis doctorales se analizó la expresión de microRNAs y genes mediante 3 Arrays: - Un estudio de expresión de microRNAs en pacientes tras un infarto agudo de miocardio - Un estudio de expresión de microRNAs en ratas tras una intervención de I/R - Un estudio de expresión de genes en ratas tras una intervención de I/R Los Arrays se realizaron por el Servicio de Genómica y se emplearon los siguientes kits: GeneChip™ miRNA 4.0 Array (902411, Thermofisher) y Clariom S Assay Rat (902935, Thermofisher, USA). El Array permite comparar los perfiles de expresión de dos muestras diferentes (control frente a la condición experimental). Para ello hay cuatros pasos principales: 1. La preparación de la muestra que consiste en la extracción de la muestra y en la medición de su cantidad y calidad con el Bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent, USA). Se emplearon solo las muestras con número de integridad de RNA (RIN; del inglés, RNA Integrity Number) superior a 7. 2. Síntesis de bibliotecas de cDNA: se retrotrascribe el RNA extraído y se amplifica y se marca con sondas 3. La hibridación: el cDNA, tanto control como experimental, marcado con las sondas se incuba en el chip que contiene las secuencias complementarias representativas de todos los microRNAs y genes de la especie del estudio. En este paso se genera una hélice de doble cadena de DNA estable. A continuación, se lava el chip para eliminar el posible DNA que no se haya unido. 4. Escaneo del chip: se analiza la información de fluorescencia del chip gracias al programa Affymetrix Expression Console™ 1.3.1 (Thermofisher, USA) que escanea el chip. El programa es capaz de interpretar la intensidad de fluorescencia en cada punto y establece las diferencias de expresión del miRNA o gen en cuestión entre los dos grupos en análisis. Tras la realización del microArray se analizan con el software TAC 4.0 (Transcriptome Analysis Console, Thermofisher, USA) y luego se estudió in silico como reflejado en el apartado 4.8 Análisis bioinformático in silico). 4.12.1 ARRAY DE MICRORNAS DE PACIENTES EN AGUDO De entre los pacientes reclutados, se seleccionaron los que tras seis meses de seguimiento clínico no habían desarrollado ningún signo de remodelado cardíaco (n=5) y otros que exhibían remodelado cardíaco (n=5). Asimismo, se seleccionaron 5 pacientes sanos como grupo control. Se compararon las poblaciones inflamatorias en los pacientes a las 0h, antes de abrir la arteria y a las 6h después del procedimiento de los 79 MATERIALES Y MÉTODOS pacientes con y sin remodelado. Se miró la expresión de microRNAs transversal (entre las poblaciones de monocitos) y horizontal (entre los grupos de pacientes y los tiempos). Se comparó el nivel de los microRNAs expresados en las células mononucleadas en los pacientes sanos y los pacientes seleccionados que habían sufrido un STEMI (0h) pacientes que remodelan y pacientes que no remodelan. Seguidamente se compararon los microRNAs expresados en las poblaciones de monocitos de los pacientes que presentaron ecocardiografía normal con las poblaciones de monocitos de los pacientes que tras 6 meses de seguimiento clínico presentaron remodelado adverso de ventrículo. Los microRNAs que presenten diferencias en su nivel de expresión o los que se expresen diferentemente entre los dos grupos de pacientes y que fuesen posibles microRNAs reguladores de las citoquinas y quimioquinas analizadas por el Bioplex fueron los candidatos implicados en el remodelado adverso, centrándose en la fibrosis y en la inflamación que se validaron por RT-qPCR (ver apartado 4.7.4 qPCR para microRNAs y genes dianas). 4.12.2 ARRAY DE MICRORNAS Y GENES DE RATAS I/R Y SHAM Se realizó un Array de microRNAs y genes en ratas intervenidas (SHAM e I/R) y sacrificadas a las 24h de la operación. Las muestras utilizadas fueron las dos clases de monocitos aisladas por FACS, CD43high His48low y CD43low His48high por cada tipo de condición experimental. 4.13 ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO IN SILICO Los microRNAs diferentemente expresados en los grupos experimentales con el mejor Fold Change y posibles reguladores de la expresión de las citoquinas previamente analizadas por el Bioplex se estudiaron mediante el programa bioinformático TAC. Primero se comprobaron los posibles genes dianas en dos bases de datos online, en miRDB (www.mirdb.org) y en TargetScan (www.targetscan.org). Seguidamente, la lista de posibles genes dianas se filtró por GeneVenn (www.genevenn.sourceforge.net) y se eligieron para continuar el estudio solo los genes en común en las dos bases de datos. A continuación, los genes implicados en las vías de señalización se estudiaron utilizando Panther (www.pantherdb.org/) y Gene Ontology (www.geneontology.org). Ya identificados los posibles genes dianas in silico, se validaron por RT-qPCR como está reflejado en el apartado 4.7.4 qPCR para microRNAs y genes dianas. 4.13.1 ONTOLOGÍA DE GENES CON GSEA EN EL MODELO ANIMAL Tras el estudio in silico de los posibles genes dianas que estuvieran diferentemente expresados en las dos condiciones experimentales con plataformas como Panther Gene o Gene Onthology, se quiso establecer 80 en los dos tipos de monocitos sorteados de rata, cuales vías de señalización o funciones celulares estuvieran diferentemente expresadas respecto a la condición control. Se utilizó el programa GSEA 4.3.2 (Gene Set Enrichment Analysis)(Mootha et al., 2003; Subramanian et al., 2005), (Mootha et al., 2003; Subramanian et al., 2005) que permite analizar cambios sutiles de expresión no solo en un gen del Array sino en un set de genes implicados en la misma ruta. Para ello en GSEA se utilizó una librería Biological Processes C5 versión 6.2 que cuenta con 825 categorías de genes. El programa tiene una estadística muy potente y compara los genes del Array con la librería seleccionada y proporciona un valor de enriquecimiento (ES, enrichment score) a cada set de genes que se normaliza a NES (normalized ES) por varios parámetros como por ejemplo por el tamaño de genes. 4.14 ANÁLISIS ESTADÍSTICOS Todos los análisis estadísticos realizados en esta tesis doctoral se llevaron a cabo con los programas IBM SSPS Statistics 26 (IBM, USA) y GraphPad Prism 9 (GraphPad Software, USA). Se comprobó la normalidad con el test de Shapiro- Wilk en todos los grupos de estudio y se identificó la existencia de outliers (datos atípicos) en los datos. En el caso de datos con distribución normal o gaussiana se realizó un t-test para comparar dos grupos y test ANOVA (del inglés, Analysis of Variance, con o sin corrección de LSD de Fisher) para comparaciones entre tres o más grupos. En cuanto a datos con distribución no gaussiana se realizaron pruebas no paramétricas: el test de Mann- Whitney entre dos grupos y el test de Kurskall- Wallis para más de tres grupos. Se realizaron curvas de especificidad y sensibilidad ROC (del inglés, Receiver operating characteristic) y de regresión linear múltiple. Además, se llevaron a cabo análisis multivariados de interdependencia y se calcularon los Odd Ratio (OR). Los resultados se expresaron con media y media del error estándar de la media (SEM, Standard error mean); se consideraron diferencias significativas los valores de pvalue < 0.05. En las gráficas * indica significancia de p< 0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 y **** p<0,0001. 81 RESULTADOS 5. RESULTADOS 88 aumentadas en los pacientes que mostraron remodelado, podía ser un buen predictor para la aparición del remodelado adverso del ventrículo. Para ello se realizaron análisis de regresión logística multivariada. Se calculó el Odd Ratio (OR) de las diferentes variables (edad, sexo, creatina quinasa, troponina- T) comparadas con los niveles de los monocitos intermedios y clásicos. Los análisis multivariados evidenciaron que solo los monocitos intermedios como predictor independiente de remodelado adverso sobre todo a las 6h después de la angioplastia (p=0,03), y con tendencia a la significancia a las 0h (p = 0,061), sin que haya sesgo de edad, sexo, creatina quinasa y troponina T como se puede ver reflejado en la Tabla 20. Tabla 20. Análisis multivariado de diferentes parámetros (edad, sexo, nivel de creatina quinasa y de troponina T) con monocitos intermedios, clásicos y no clásicos a las 0 y 6h. Se analizaron si variables como edad, sexo, creatina quinasa y troponina T con el subtipo de monocitos eran variables independientes (n=38). OR: Odd Ratio. * indica significancia de p< 0,05. Factor OR 95% Intervalo de confidencia pvalue Monocitos intermedios 0h 1,018 0,999-1,037 0,061 Edad 1,064 0,952-1,190 0,275 Sexo 1,467 0,011-0,137 0,877 Creatina Quinasa 1,000 1,000-1,001 0,482 Troponina T 1,000 1,000-1,000 0,482 Factor OR 95% Intervalo de confidencia pvalue Monocitos intermedios 6h 1,018 0,999-1,037 0,061 Edad 1,073 0,955-1,204 0,235 Sexo 0,151 0,007-3,158 0,223 Creatina Quinasa 1,000 1,000-1,001 0,213 Troponina T 1,000 1,000-1,000 0,681 Factor OR 95% Intervalo de confidencia pvalue Monocitos clásicos 0h 1,001 0,998-1,004 0,453 Edad 1,032 0,936-1,138 0,522 Sexo 0,509 0,025-10,383 0,661 Creatina Quinasa 1,000 1,000-1,001 0,311 Troponina- T 1,000 1,000-1,000 0,281 Factor OR 95% Intervalo de confidencia pvalue Monocitos clásicos 6h 1,003 1,000-1,005 0,094 Edad 1,055 0,947-1,176 0,330 Sexo 0,230 0,011-4,691 0,340 Creatina Quinasa 1,000 1,000-1,001 0,155 Troponina T 1,000 1,000-1,000 0,474 Factor OR 95% Intervalo de confidencia pvalue Monocitos no clásicos 0h 1,026 0,990-1,063 0,153 Edad 1,045 0,925-1,180 0,481 Sexo 1,394 0,012-165,55 0,892 Creatina Quinasa 1,001 1,000-1,001 0,084 89 RESULTADOS Factor OR 95% Intervalo de confidencia pvalue Monocitos no clásicos 6h 1,038 1,004-1,074 0,028* Edad 1,074 0,936-1,233 0,308 Sexo 0,080 0,002-2,740 0,161 Creatina Quinasa 1,001 1,000-1,001 0,034* El resultado de estos análisis multivariados mostró que el nivel de los monocitos clásicos no eran un buen predictor independiente de remodelado adverso dado que el OR no era significativo ni a las 0 ni a las 6h (Tabla 20). A continuación, la Figura 28 muestra el análisis de regresión lineal de los cambios en los niveles de los monocitos intermedios en relación con cambios en el porcentaje del VTDVI, demostrando que los niveles de los monocitos intermedios a las 0h (r=0,616, p<0.001) (Figura 28 A) y a las 6h (Figura 28 C) (r=0,498, p=0,002) después de la angioplastia correlacionaban significativamente con cambios en porcentaje del volumen telediastólico del ventrículo izquierdo. Además, las curvas ROC de los monocitos intermedios a las 0 (Figura 28 B) y 6h (Figura 28 D) muestran una AUC (area under the curve, área bajo la curva) superiores a 0,7 con pvalue significativo, indicando una alta sensibilidad y especificidad para predecir el remodelado adverso del ventrículo. 90 Figura 28. Regresión lineal y curvas ROC de los monocitos intermedios. Análisis del poder predictivo de los monocitos intermedios a las 0 y 6h en cambios del volumen telediastólico del ventrículo izquierdo con regresión lineal (A, 0h; C, 6h) y curva ROC (B, 0h; D 6h). En rojo se representan los pacientes con remodelado (n=12), y en azul los pacientes sin remodelado (n=26)) a la revisión de los 6 meses. IAM: infarto agudo de miocardio; VTDVI: volumen telediastólico del ventrículo izquierdo; AUC: area under the curve, área bajo la curva. Se analizaron también los otros dos subtipos de monocitos. A diferencia de los intermedios, las curvas de regresión de los monocitos clásicos presentaron una peor asociación con los cambios en porcentaje del volumen telediastólico del ventrículo izquierdo con una r<0,30 a las 0h y 6h (Figura 29 A, C). De manera similar, la curva ROC de los monocitos clásicos a las 0h mostró una baja sensibilidad y especificidad para predecir el remodelado adverso del ventrículo; sin embargo, la AUC de la curva ROC de los monocitos 91 RESULTADOS clásicos a las 6h era superior a 0,7 con pvalue de 0,02 (Figura 29 B, D). Figura 29. Regresión lineal y curvas ROC de los monocitos clásicos. Análisis del poder predictivo de los monocitos clásicos a 0 y 6h en cambios del volumen telediastólico del ventrículo izquierdo, con regresión lineal (A, 0h; C, 6h) y curva ROC (B, 0h; D 6h). En rojo los pacientes con remodelado (n=12), y en azul los pacientes sin remodelado (n=26) a la revisión de los 6 meses. IAM: infarto agudo de miocardio; VTDVI: volumen telediastólico del ventrículo izquierdo; AUC: area under the curve, área bajo la curva. Para completar el estudio estadístico se realizaron las curvas de regresión de los monocitos no clásicos, aunque no hubiese diferencias significativas en sus niveles entre pacientes con y sin remodelado. Las curvas de regresión presentaban una peor asociación de los monocitos no clásicos con los cambios en porcentaje 92 del volumen telediastólico del ventrículo izquierdo, con una r<0,6 a las 0h y r<0,4 a las 6h (Figura 30 A, C). De manera similar, la curva ROC de los monocitos no clásicos a las 0h mostró una baja sensibilidad y especificidad para predecir el remodelado adverso del ventrículo con una AUC era inferior a 0,7 a las 6h con pvalue no significativo (Figura 30 B, D). Figura 30. Regresión lineal y curvas ROC de los monocitos no clásicos. Análisis del poder predictivo de los monocitos no clásicos a 0 y 6h en cambios del volumen telediastólico del ventrículo izquierdo, con regresión lineal (A, 0h; C, 6h) y curva ROC (B, 0h; D 6h). En rojo los pacientes con remodelado (n=12), y en azul los pacientes sin remodelado (n=26) a la revisión de los 6 meses. IAM: infarto agudo de miocardio; VTDVI: volumen telediastólico del ventrículo izquierdo; AUC: area under the curve, área bajo la curva. Asimismo, se calcularon las curvas ROC de otros parámetros clásicos antes y después de la revascularización, como el tiempo trascurrido hasta la revascularización, la elevación del segmento ST, la edad, la creatina quinasa, la troponina- T. Se encontró que las AUC de tiempo trascurrido hasta la revascularización (Figura 31 A), la elevación del segmento ST (Figura 31 B), la edad eran inferiores a 0,70 o no evidenciaron significancia estadística (Figura 31 C). 93 RESULTADOS Figura 31. Curvas ROC de tiempo con infarto, elevación del segmento ST y edad. Análisis de sensibilidad y especificidad de diferentes factores de predicción del remodelado adverso del ventrículo: tiempo con infarto (A), elevación del ST (B) y edad (C) en pacientes IAM (n=38). IAM: infarto agudo de miocardio; AUC: area under the curve, área bajo la curva. En cuanto al resto de parámetros, se evidenció que las AUC de los niveles de creatina quinasa (Figura 32 B) y troponina-T (Figura 32 D) a las 0h eran superiores a 0,70 con un pvalue significativo, aunque el análisis multivariado mostró que no eran variables independientes para la predicción de remodelado (Figura 32 A, C). 94 Figura 32. Regresión lineal y curvas ROC de troponina- T y creatina quinasa a las 0h. Análisis del poder predictivo de la creatina quinasa y de la troponina- T a las 0h en cambios del volumen telediastólico del ventrículo izquierdo mediante regresión lineal (A, creatina quinasa; C, troponina T) y curvas ROC (B, creatina quinasa; D, troponina T) en pacientes con IAM (n=38). En rojo los pacientes con remodelado (n=12), y en azul los pacientes sin remodelado (n=26) a la revisión de los 6 meses. IAM: infarto agudo de miocardio; LVEDV: del inglés left ventricular end-diastolic volume, volumen telediastólico del ventrículo izquierdo; AUC: area under the curve, área bajo la curva. Considerando estos datos en su conjunto, estos resultados confirmaron que el nivel de monocitos intermedios en la sangre de los pacientes es un parámetro fiable para predecir la aparición del remodelado adverso del ventrículo tras la revascularización. 5.1.3 ANÁLISIS Y CUANTIFICACIÓN DE QUIMIOQUINAS INFLAMATORIAS Y PROFIBRÓTICAS IMPLICADAS EN EL REMODELADO ADVERSO Análisis comparativo del perfil de quimioquinas expresadas en el suero de pacientes Los principales efectores de la inflamación son las citoquinas y la quimioquinas expresados y secretados por las células inflamatorias en los tejidos en los que se infiltran. Además de cuantificar las poblaciones de células inflamatorias en la sangre de los pacientes, se midieron en suero los niveles de las citoquinas proinflamatorias. El objetivo fue encontrar citoquinas proinflamatorias cuyos niveles pudieran correlacionar con la aparición de remodelado adverso. Para ello se realizó un Bioplex de 27 citoquinas proinflamatorias en el suero de 13 pacientes (10 no remodelados y 3 con remodelado), tanto a las 0h antes de la apertura de la arteria mediante angioplastia y 6-12h después de la revascularización. Se observó un aumento significativo a las 0h del GM-CSF (del inglés, granulocyte macrophage colony stimulating factor), y a las 6h de la interleuquina 1β (IL-1β), del interferón γ (IFN-γ), de la interleuquina 17 (IL-17), del VEGF y una tendencia de aumento de TNF-α. Por lo contrario, no se evidenciaron diferencias significativas en otras 12 quimioquinas como Eotaxina, FGF basic, G-CSF, IL-1ra, IL-4, IL-8, IL-9, IP-10, MIP-1α, MIP-1β, PDGF-BB, TNF-α (Tabla 21). Por último, no se detectaron en suero de los pacientes las, IL-2 IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, MCP-1, RANTES. 95 RESULTADOS Tabla 21. Análisis de Bioplex posibles quimioquinas relacionadas con el remodelado en pacientes con y sin remodelado adverso a los 6 meses. Están representados los valores de las quimioquinas en los dos grupos de pacientes a las 0h, 6h y al mes. n=13. FGF basic: fibroblast growth factor basic; G-CSF: granulocyte colony stimulating factor; GM-CSF: granulocyte macrophage colony stimulating factor; IFN-γ: interferón γ; IL: interleuquina; IL-1Ra: interleukin 1 receptor antagonist; IP-10: interferon γ– inducible protein; MIP-1α: macrophage inflammatory protein 1 α; MIP-1β; macrophage inflammatory protein 1 β; PDGF-BB: plateletderived growth factor BB. n=13. * indica significancia de p< 0,05. Citoquina (pg/ml) 0 h 6 h 1 mes No remodelado Remodelado p-value No remodelado Remodelado p-value No remodelado Remodelado p-value Eotaxina 73,13±42,50 91,25±28,70 0,9244 80,10±48,86 88,45±49,58 0,9916 94,18±59,00 85,72±29,48 0,9913 FGF-basic 38,73±19,45 54,71±20,12 0,3838 38,95±9,76 47,86±36,60 0,8003 32,95±6,97 25,89±9,84 0,8878 G-CSF 52,50±20,07 70,06±36,91 0,5367 60,94±22,57 82,72±35,76 0,3546 64,61±11,45 11,45±2,32 0,8507 GM-CSF 23,70±19,52 69,64±23,80 0,0438* 12,23±26,52 51,45±60,24 0,1686 13,41±24,12 1,49±1,77 0,8773 IFN-γ 53,38±20,71 96,46±43,41 0,3037 76,59±38,08 164,65±17,75 0,0193* 93,72±49,53 52,17±27,26 0,3051 IL-17 36,85±17,50 53,63±49,42 0,7356 61,87±29,03 119,50±0,71 0,0291* 64,35±25,04 44,23±20,28 0,6147 IL-1β 1,10±0,55 2,93±2,96 0,147 2,18±0,79 5,74±0,84 0,005* 2,04±1,52 1,71±0,34 0,9835 IL-1Ra 22,26±14,60 75,08±44,15 0,4287 64,34±91,75 68,18±77,28 0,9995 34,14±33,89 32,81±25,17 >0,9999 IL-4 6,10±2,00 7,10±1,87 0,9162 9,57±2,62 10,20±4,26 0,9764 9,36±2,75 8,20±1,71 0,8777 IL-8 12,52±6,43 12,33±2,08 >0,9999 21,81±15,11 18,33±6,66 0,9204 13,93±3,32 16,67±4,93 0,9602 IL-9 62,44±20,93 64,67±44,38 0,9996 118,67±41,06 108,33±62,14 0,9628 112,11±30,69 84,33±30,01 0,5795 IP-10 1033±1106 991,33±561,91 >0,9999 1111,00±1813,00 1209±1112 0,999 646,44±246,85 1135±289,99 0,8959 MIP-1α 3,30±1,03 4,31±2,22 0,563 3,35±0,73 5,04±3,02 0,1569 3,95±0,94 2,66±0,49 0,3638 MIP-1β 142,74±85,86 144,82±64,15 >0,9999 224,73±210,45 141,46±75,95 0,6756 126,78±27,22 145,98±51,26 0,9936 PDGF-BB 593,07±398,74 1210,82±855,15 0,6756 1364,00±1055,00 2267,00±1825,00 0,3718 1063,00±818,90 870,26±619,44 0,9844 TNF-α 53,50±9,01 85,62±38,86 0,0503 71,64±10,99 102,85±48,27 0,0593 70,47±11,92 64,33±15,55 0,9506 VEGF 6,35±2,83 149,90 - 28,01±16,98 94,34±76,91 0,0108* 15,09±10,95 52,79±36,07 0,1705 96 Validación de la expresión de las quimioquinas mediante ELISAs en todos los pacientes Las quimioquinas y citoquinas, cuya expresión fue significativa en el ensayo de Bioplex, se cuantificaron en el suero de todos los pacientes y controles mediante kits ELISA en el momento de su máxima secreción (6h para de TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-17, y VEGF, 0h para GM-CSF). Como se puede observar en las Figura 33 y Figura 34, tras la cuantificación del nivel de estas citoquinas en todas las cohortes de pacientes solo el nivel de VEGF aumentó significativamente en los pacientes remodelados (Figura 33 C, D). Se observó también una tendencia al alza, pero no significativa en el nivel de IL-1β (Figura 34 E, F). GM-CSF no salió detectable en la mayoría de las muestras y no permitió efectuar el análisis estadístico (datos no mostrados). Figura 33. Niveles plasmáticos y curvas ROC correspondientes de IL-17 y VEGF en pacientes con y sin remodelado adverso a las 6h de la revascularización. Niveles de los marcadores IL-17 (A) y VEGF (C) medidos mediante kit ELISA en suero de pacientes con remodelado (en rojo, n=12) y sin remodelado (en azul, n=26) a las 6h sus curvas ROC correspondientes (B, IL-17; D, VEGF). IAM: infarto agudo de miocardio; AUC: area under the curve, área bajo la curva. * indica significancia de p< 0,05. 97 RESULTADOS Figura 34. Niveles plasmáticos y curvas ROC correspondientes de TNFα, IFN-γ e IL-1β en pacientes con y sin remodelado adverso a las 6h de la revascularización. Niveles de los marcadores, TNF-α (A), IFN-γ (C) e IL-1β (E) medidos mediante kit ELISA en suero de pacientes con remodelado (en rojo, n=12) y sin remodelado (en azul, n=26) a las 6h sus curvas ROC correspondientes (B, D y F). IAM: infarto agudo de miocardio; AUC: area under the curve, área bajo la curva. * indica significancia de p< 0,05. Asimismo, se realizaron las curvas ROC de las citoquinas estudiadas. La Figura 33 D muestra que solo la AUC de VEGF fue superior a 0,7 y con un p< 0,05. A continuación, se analizó el poder de predicción del VEGF a las 6h en cambios del VTDVI, marcador de remodelado cardiaco adverso. El análisis de la regresión 104 Tabla 23. Rangos de marcadores y asignación del score individual para el score total. La tabla enseña cómo se asignaron los scores de 1 a 4 a los valores de monocitos intermedios, creatina quinasa, troponina- T, VEGF y microRNAs (miR-16, miR-21, miR-29) a las 6h de la revascularización. Rangos del SCORE 1 2 3 4 Monocitos intermedios (células/µl) de 24,11 a 102,01 de 102,02 a 179,91 de 179,92 a 257,81 de 257,82 a 335,72 Creatina quinasa (mg/dl) de 271,00 a 2071,25 de 2071,26 a 3871,50 de 3871,51 a 5671,75 de 5671,76 a 7472,00 Troponina- T (ng/ml) de 1376,00 a 5276,75 de 5276,76 a 9177,50 de 9177,51 a 13078,25 de 13078,26 a 16979,00 VEGF (pg/ml) de 78,75 a 337,39 de 337,40 a 683,25 de 683,26 a 1029,10 de 1029,11 a 1374,96 Hsa-miR-16-5p (log Fold Change) de -0,7784 a -0,1586 de -0,1587 a 0,4613 de 0,4614 a 1,0812 de 1,0813 a 1,7010 Hsa-miR-21-5p (log Fold Change) de -1,0658 a -0,5204 de -0,5205 a 0,0250 de 0,0251 a 0,5704 de 0,5705 a 1,1159 Hsa-miR-29a-3p (log Fold Change) de -0,8199 a -0,4301 de -0,4302 a -0,0402 de -0,0403 a 0,3496 de 0,3497 a 0,739487 Se realizó un primer estudio con la combinación del score para marcadores tradicionales, troponina- T y creatina quinasa a las 0h. El score obtenido para cada paciente fue significativamente más elevado en los pacientes con remodelado en comparación con los no remodelados (Figura 41 A). Además, se calculó la curva ROC para comprobar la especificad y sensibilidad de la combinación de ambos marcadores para predecir el remodelado adverso. Como muestra la Figura 41 B, la AUC obtenida fue de 0,76 con p-value significativo, indicando que la medida de ambos marcadores podría predecir mejor el remodelado adverso que los dos marcadores por separado (como descrito anteriormente en la Figura 32). 105 RESULTADOS Figura 41. Análisis de score de marcadores clásicos y su curva ROC en la predicción de remodelado. A. Análisis de los scores de marcadores clásicos (creatina quinasa y troponina- T) en pacientes con IAM; en ella los puntos azules representan los scores de los pacientes sin remodelado (n=20), mientras que los rojos los pacientes con remodelado (n=9). B. Análisis del poder predictivo del score aplicado mediante curva ROC. IAM: infarto agudo de miocardio; CK: creatina quinasa; TnT: troponina- T. * indica significancia de p< 0,05. El siguiente paso fue comprobar si el poder de predicción podía mejorar la medida de los scores individuales en nuestra cohorte de pacientes al añadir a los marcadores analizados en la Figura 41 (CK, TnT) los niveles de monocitos intermedios y VEGF. El score obtenido para cada paciente representó una diferencia significativa aún mejor que la anterior. Como en el caso anterior, se calculó la curva ROC y se observó que el AUC mejoraba a 0,85 (Figura 42). Figura 42. Análisis del score combinado de predicción de remodelado. A. Análisis de los scores de marcadores clásicos y más innovadores (VEGF y monocitos intermedios); en ella los puntos azules representan los scores 106 de los pacientes sin remodelado (n=20), mientras que los rojos los pacientes con remodelado (n=9). B. Análisis del poder predictivo del score aplicado mediante curva ROC, en el que se indica la capacidad del score de los varios marcadores de predecir el remodelado. IAM: infarto agudo de miocardio; CK: creatina quinasa; TnT: troponina- T; AUC: area under the curve, área bajo la curva. ** indica significancia de p<0,01. Por último, se estudió la combinación de todos los marcadores estudiados (Tabla 24), los marcadores clásicos (CK y troponina- T), el nivel de monocitos intermedios, VEGF y los tres microRNAs predictores de remodelado. Como se muestra en la Figura 43 A, los pacientes con remodelado obtuvieron un score mucho más elevado en comparación con los pacientes sin remodelado adverso. Además, la curva ROC mostró una AUC de 0,9111 y pvalue de 0,0005 (Figura 43 B), indicando que la aplicación del score total, donde se incorporaron los valores de todos los parámetros estudiados, permitía definir mucho mejor los pacientes que iban a padecer remodelado adverso del ventrículo izquierdo a los seis meses de la revascularización. Figura 43. Análisis del score total de predicción de remodelado. A. Análisis de los scores combinados de marcadores clásicos y más innovadores; en ella los puntos azules representan los scores de los pacientes sin remodelado (n=20), mientras que los rojos los pacientes con remodelado (n=9). B. Análisis del poder predictivo del score aplicado mediante curva ROC. IAM: infarto agudo de miocardio; AUC: area under the curve, área bajo la curva. **** indica significancia de p<0,0001. 5.1.6 ANÁLISIS DE LOS GENES EXPRESADOS EN LAS CÉLULAS MONONUCLEADAS Estudio del perfil de genes de inflamación, apoptosis y fibrosis en monocitos de pacientes con prime PCR De las células mononucleadas extraídas de pacientes y controles, se realizó una Prime PCR de 75 genes implicados en procesos de apoptosis, fibrosis e inflamación (para el listado de genes analizados, ver Figura 107 RESULTADOS 23 en Materiales y Métodos, apartado 4.7.4 qPCR para microRNAs y genes dianas). A las 0h, tanto en los pacientes con y sin remodelado (Figura 44 A y Figura 45 A), había una mayor diferencia de expresión de genes (fold change más elevado). A las 6h, los pacientes sin remodelado tenían menos genes expresados con fold change inferior (Figura 44 B), mientras que los pacientes con remodelado (Figura 45 B) tenían un mayor número de genes relacionados con fibrosis y apoptosis sobre expresados que seguían aumentados también a los 6 meses (Figura 45 C), indicando una mayor expresión de genes con la progresión de la enfermedad en los remodelados. Figura 44. Representación de los genes de fibrosis e inflamación en la Prime PCR en los pacientes sin remodelado a las 0h y 6h. Variación de expresión en los diferentes grupos normalizados al control (n=4) mediante Prime PCR: A, pacientes sin remodelado a las 0h (n=4); B, pacientes sin remodelado a las 6h (n=4). Los datos están ordenados de manera decreciente y están expresados en logaritmo de Fold change. 108 Figura 45. Representación de los genes de fibrosis e inflamación en la prime PCR en los pacientes con remodelado a las 0h, 6h y 6 meses. Variación de expresión en los diferentes grupos normalizados al control (n=4) mediante Prime PCR: A, pacientes con remodelado a las 0h (n=4); B, pacientes con remodelado a las 6h 109 RESULTADOS (n=4). C. Pacientes con remodelado a los 6 meses (n=4). Los datos están ordenados de manera decreciente y están expresados en logaritmo de Fold change. Para identificar los genes relacionados con la aparición del remodelado, se decidió centrarse en los genes dianas de los microRNAs que se habían estudiado anteriormente como factores predictores del remodelado, en concreto los miR-16, miR-21 y miR-29a. El análisis in silico de los genes dianas de cada microRNA se pueden ver reflejados en la Tabla A1 del Anexo. A continuación, se estudiaron las rutas de señalización en las que estaban implicados los genes dianas de los miR-16-5p, miR-21-5p y miR-29a-3p en Panther Gene, centrándose sobre todo en las vías de señalización de fibrosis, inflamación y apoptosis (Figura 46). Figura 46. Representación de las vías de señalización implicadas en los posibles genes dianas de los miR-16, miR-21 y miR-29a. Vías de señalización (de los genes dianas de los microRNAs candidatos) relacionadas con la apoptosis, con la fibrosis y con la inflamación mediada por quimioquinas y citoquinas. Las gráficas fueron elaboradas en la plataforma online Panther Gene. Para acotar el número de genes, se compararon los genes analizados por Prime PCR y los genes candidatos determinados por el estudio in silico, entre ellos AKT2, AKT3, CDKN1A, IFNG, IL1B, JAK2, MYC, NFKB1, PTEN, RAF1, TNFA. Estudio de la expresión los posibles genes diana en línea celular de monocitos humanos bajo hipoxia y reoxigenación De los datos obtenidos, se observó que los monocitos intermedios, y sus mediadores inflamatorios, están implicados en el remodelado adverso del ventrículo en humanos. Debido a que no es posible estudiar cómo 110 actúan los monocitos in situ en el miocardio de pacientes con STEMI se utilizó una línea celular de monocitos humanos, la THP-1 que transformamos en macrófagos para estudiar que genes se expresan y que mediadores inflamatorios los regularían. Así para crear un modelo de estudio lo más parecido a la clínica se estimuló la línea THP-1 con PMA para inducir su cambio a macrófagos MΦ. Posteriormente, estas células se diferenciaron a M1, M2a, M2b y se sometieron un protocolo de hipoxia y reoxigenación (descrito en Materiales y Métodos, apartado 4.3.2 Línea celular humana de monocito: THP-1, Figura 19) para simular la isquemia y la reperfusión a la que se ven sometidas estas células en el miocardio tras su infiltración. Después de analizar los genes de la placa prediseñada de Prime PCR de los pacientes remodelados, se utilizó este modelo celular para validar por qRT-PCR la expresión de algunos de estos genes diferentemente expresados. Se habían seleccionado y analizado, en la línea celular THP-1, la expresión de los genes AKT2, AKT3, CDKN1A, IFNG, IL1B, JAK2, MYC, NFKB1, PTEN, RAF1, TNFA relacionados con las rutas de apoptosis, inflamación y fibrosis, además de ser genes dianas de los miR-16, miR-21 y miR-29a bajo diferentes condiciones experimentales como se detalla en el apartado de Materiales y Métodos, apartado 4.3.2 Línea celular humana de monocito: THP-1) Los genes analizados, además de estar diferentemente expresados en la placa de Prime PCR en los pacientes que remodelaron, aparecieron en común con los genes regulados por los miR-16, miR-21 y miR- 29a, microRNAs predictores de remodelado adverso del ventrículo izquierdo tras el infarto. Tras el análisis por RT-qPCR de todos los genes en todas las condiciones experimentales descritas anteriormente, solo el nivel de MYC (ANOVA, p=0,0088), mostró un aumento en su expresión en macrófagos tras el periodo de hipoxia y reoxigenación, especialmente observando los macrófagos M2 sometidos a hipoxia (Figura 47). M0 M0 HR M1 M1 HR M2 M2 HR 0 2 4 6 8 10 Expresión mRNA MYC (fold change normalizado a Mϕ) ✱ ✱ ✱✱ 111 RESULTADOS Figura 47. Expresión génica de MYC en THP-1. Gráfica de barra representantes los niveles de expresión de MYC en la línea celular THP-1 macrófagos MΦ, M1 y M2 y tras la hipoxia y reoxigenación. Los datos están expresados en fold change y el valor de expresión se normalizó al valor de expresión de la condición MΦ de cada cultivo (n=4-7). Los macrófagos M2a y M2b tuvieron el mismo nivel de expresión de MYC y por ello y sus datos se unieron como M2. MΦ: macrófagos derivados de monocitos; HR: hipoxia/ reperfusión. * indica significancia de p< 0,05; ** p<0,01. Tras esta observación se analizó la expresión de estos genes en las células mononucleadas de pacientes infartados. Como se puede observar en la Figura 48, había un aumento significativo de la expresión de AKT2 (p= 0,012; Figura 48 A), HMOX1 (p= 0,0002; Figura 48 C), MYC (p=0,044; Figura 48 E) y NFKB1 (p= 0,023; Figura 48 F) y en las celulas monucleadas procedentes de pacientes con infarto y consecuente angioplastia (6h) frente a las celulas de controles sanos, mientras no se ha observado diferencias significativas en la expresión de AKT3 y JAK2. Figura 48. Expresión génica de AKT2, AKT3, HMOX1, JAK2, MYC, NFKB1 en células mononucleadas de pacientes con infarto revascularizados. Gráfica de barra representantes los niveles de expresión de AKT2 (A), AKT3 (B), HMOX1 (C), JAK2 (D), MYC (E), NFKB1 (F) en las células mononucleadas procedentes de controles sanos (n=8) 112 y pacientes con IAM a las 6h (n=28). Los datos están expresados en fold change y el valor de expresión se normalizó al valor de expresión de los controles sanos. CTRL: controles sanos; IAM: infarto agudo de miocardio. * indica significancia de p<0,05; ** p<0,01 y *** p<0,001. Por ùltimo comprobamos si hubiera una variavión de expresion de estos genes en las celulas monucleadas de pacientes con y sin remodelado, pero no se observó diferencia significativa entre los dos grupos (Figura 49). Figura 49. Expresión génica de AKT2, AKT3, HMOX1, JAK2, MYC, NFKB1 en células mononucleadas de pacientes con y sin remodelado a las 6h de la revascularización. Gráfica de barra representantes los niveles de expresión de AKT2 (A), AKT3 (B), HMOX1 (C), JAK2 (D), MYC (E), NFKB1 (F) en las células mononucleadas procedentes de pacientes con IAM a las 6h, con (n=8) y sin remodelado adverso (n=18). Los datos están expresados en fold change y el valor de expresión se normalizó al valor de expresión de los controles sanos. NR: pacientes sin remodelado; R: pacientes con remodelado. 113 RESULTADOS 5.2 ESTUDIO DEL PAPEL DE LAS POBLACIONES INFLAMATORIAS EN RATA INFARTADAS Se realizó un modelo animal de cirugía cardiaca que simulara el infarto en pacientes, para estudiar el mecanismo de acción de las poblaciones inflamatorias en el corazón infartado. Para ello se utilizaron ratas no intervenidas (control), ratas intervenidas sin someter el corazón a isquemia (SHAM), ratas sometidas a isquemia y reperfusión (I/R) y también ratas sometidas a un infarto sin reperfusión (IAM). Este último caso no es representativo de las cohortes humanas en estudio, pero es necesario para poder observar cambios más extremos que no fuesen tan evidentes en I/R. En primer lugar y debido a que la fibrosis postinfarto es unos de los indicadores más importantes del remodelado adverso, se comprobó la presencia de fibrosis mediante tinciones con tricrómico de Masson, tras las operaciones tanto en el ápice como en la parte mediana del corazón a nivel de la base de los músculos papilares en SHAM, I/R, y IAM (Figura 50 A). Se observó, más fibrosis en corazones procedentes de ratas con IAM con respecto a los de ratas sometidas a I/R. El porcentaje de fibrosis en el corazón de las ratas SHAM fue pequeño (Figura 49 B). Figura 50. Presencia de fibrosis en el miocardio de rata operadas. A. Imágenes representativas con tinción de Tricrómico de Masson en cortes histológicos de la parte apical (ápice) y de la base de los músculos papilares (medio) de corazones de ratas SHAM, I/R e IAM 72h después de la operación. En azul se marcan las zonas con presencia de colágeno. La escala abajo a la derecha corresponde a 1 mm. B. Cuantificación del porcentaje de fibrosis en cortes histológicos de ratas SHAM (negro), I/R (amarillo) e IAM (azul) con tinción de Tricrómico de Masson a las 72h en ápice (A) y en la zona mediana del corazón a la altura de la base de los músculos papilares (M). Las imágenes obtenidas al microscopio se analizaron con Cell Profiler con un pipeline ad hoc capaz de distinguir los pixeles rojos (músculo cardiaco) de los azules (colágeno). I/R: isquemia/ reperfusión; IAM: Infarto agudo de miocardio. 120 Figura 58. Inmunofluorescencia de macrófagos M1 en corazón de ratas operadas por inmunofluorescencia. Inmunofluorescencia de CD68 (en verde) para detectar la presencia de macrófagos M1 proinflamatorios en el miocardio en la parte central a nivel de la base de los músculos papilares en los cortes histológicos de corazón de ratas operadas SHAM, I/R, IAM. Los núcleos se tiñeron con DAPI (en azul). Las imágenes fueron adquiridas con el aumento 10X y la escala equivale a 1 mm. I/R: isquemia/ reperfusión; IAM: Infarto agudo de miocardio. La cuantificación confirma que, tras el evento isquémico, a las 72h y la semana hubo un aumento significativo del nivel de las células CD68+ infiltradas en el miocardio en la zona del infarto en las ratas sometidas a I/R e IAM con respecto a las ratas SHAM (Figura 59 A, B). A las 4 semanas tras el evento isquémico, el nivel de macrófagos M1 disminuyó, tanto en las ratas sometidas a I/R como las en las ratas sometidas a un IAM, no encontrándose diferencias significativas en el porcentaje de este tipo celular con respecto a las ratas SHAM (Figura 59 C). 121 RESULTADOS Figura 59. Cuantificación de macrófagos M1 en miocardio de rata. Cuantificación del porcentaje de células CD68+ (M1) en corazón a las 72h (A), una (B) y cuatro semanas (C) tras la intervención en ratas SHAM (en azul, n=3-14), I/R (en morado, n=5-16) e IAM (buganvilla, n=6-15, n=10). I/R: isquemia/ reperfusión; IAM: Infarto agudo de miocardio. * indica significancia de p< 0,05; ** p<0,01. A continuación, se analizó el nivel de macrófagos M2 en el miocardio de las ratas operadas mediante inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo contra el marcador de membrana CD163 (Figura 60 A). En las imágenes representativas de la misma zona de miocardio se puede observar que los macrófagos M2 se distribuyen de manera homogénea por todo el miocardio, no sólo en la zona infartada. Esta distribución se detectó a lo largo de todas las zonas del corazón, en todos los grupos de ratas operadas, incluido en las ratas SHAM, y a todos los tiempos analizados. En el mismo sentido, la cuantificación muestra que no se encontraron diferencias significativas en el nivel de macrófagos M2, solo una tendencia no significativa en las ratas IAM a las 4 semanas (Figura 60 B). 122 Figura 60. Inmunofluorescencia de macrófagos M2 y su cuantificación en corazón de ratas operadas. A. Inmunofluorescencia de CD163 (en verde) para detectar la presencia de macrófagos M1 proinflamatorios en el miocardio en los cortes histológicos de ratas SHAM, I/R, IAM. Los núcleos están teñidos con DAPI en azul. Las imágenes se sacaron al 10X y la escala en blanco equivale a 500 μm. B. Cuantificación del porcentaje de células CD163+ (M2) en corazón a las 72h, una y cuatro semanas en ratas SHAM (en azul, n=4-7), I/R (en morado, n=5-7) e IAM (buganvilla, n=3-5). I/R: isquemia/ reperfusión; IAM: Infarto agudo de miocardio. 5.2.2 IMPACTO DE LAS CÉLULAS INFLAMATORIAS SOBRE LAS CÉLULAS DEL MIOCARDIO DE RATA Cocultivo de los cardiomiocitos y fibroblastos con las distintas poblaciones de monocitos y análisis de genes de fibrosis y apoptosis Para determinar la acción de las células inflamatorias sobre las células colindantes se investigó el efecto del sobrenadante de neutrófilos y monocitos aislados de ratas operadas, SHAM, I/R e IAM tras 72h de la intervención y cultivados durante 24h, sobre las células del miocardio de ratas sanas, aisladas por dispersión (poblaciones enriquecidas de fibroblastos y cardiomiocitos), con la hipótesis que el sobrenadante proinflamatorio de estas células influyera en el transcriptoma de las células miocárdicas. De esta forma se analizó el cambio de expresión de genes relacionados con la apoptosis y la fibrosis tras la exposición de estas células miocárdicas a los intermediarios inflamatorios secretados por neutrófilos y monocitos. Por ello se estudiaron por qPCR genes asociados con la fibrosis (COL1, COL3, TGFB1) y con la apoptosis (APAF1, antiapoptótico, BCL2, proapoptótico, CYCS, antiapoptótico) en fibroblastos y cardiomiocitos. En la Figura 61, se puede observar como el sobrenadante procedente de neutrófilos de ratas I/R e IAM no estimuló cambio en la expresión de genes relacionados con la fibrosis en los cardiomiocitos. Sin embargo, el sobrenadante 123 RESULTADOS de los monocitos de ratas con I/R, pero no con IAM, aumentaba significativamente la expresión del COL1 y COL3 en lo cardiomiocitos. Figura 61. Expresión de genes de fibrosis inducidos por monocitos y neutrófilos en cardiomiocitos. Cuantificación de la expresión de COL1, COL3, TGFB1 en cardiomiocitos tratados con sobrenadante de neutrófilos o monocitos en ratas SHAM (n=6-7), I/R (n=5-7) e IAM (n=6-7). Los datos están normalizados al control y expresados en Fold change. I/R: Isquemia/ reperfusión; IAM: Infarto agudo de miocardio. * indica significancia de p< 0,05. En cuanto a la expresión de genes relacionados con la apoptosis, La expresión de BCL2 y CYCS no mostró variaciones significativas en los cardiomiocitos estimulados con sobrenadante de ambas células inflamatorias de ratas I/R e IAM. Mientras que el sobrenadante proveniente de neutrófilos de ratas I/R e IAM influyó en una disminución significativa de APAF1 en los cardiomiocitos comparadas con el control (Figura 62). 124 Figura 62. Expresión de genes de apoptosis inducidos por monocitos y neutrófilos en cardiomiocitos. Cuantificación de la expresión de APAF1, BCL2, CYS en cardiomiocitos tratados con sobrenadante de neutrófilos o monocitos en ratas SHAM (n=6-7), I/R (n=5-7) e IAM (n=6-7). Los datos están normalizados al control y expresados en Fold change. I/R: Isquemia/ reperfusión; IAM: Infarto agudo de miocardio. * indica significancia de p< 0,05. Se realizó el mismo análisis en los fibroblastos procedentes de ratas sanas cultivados con el sobrenadante de los monocitos y neutrófilos obtenidos de ratas SHAM, I/R e IAM (Figura 63). En cuanto a la fibrosis, el sobrenadante procedente de los neutrófilos no causó ninguna variación de expresión de los genes COL1 y COL3 en los dos grupos experimentales en comparación con SHAM, pero se evidenció que el sobrenadante de los neutrófilos de las ratas I/R aumentaba significativamente la expresión del TGFB1 en los fibroblastos comparados con SHAM. En el caso de los fibroblastos de ratas sanas tratados con sobrenadante procedente de los monocitos de ratas IAM se observó un aumento significativo en la expresión de COL1 y COL3 frente a las células tratadas con sobrenadante procedente de ratas SHAM o I/R. Sin embargo, no varió la expresión de TGFB1 en los fibroblastos tratados con monocitos de ratas I/R o IAM. 125 RESULTADOS Figura 63. Expresión de genes de fibrosis inducidos por monocitos y neutrófilos en fibroblastos. Cuantificación de la expresión de COL1, COL3, TGFB1 en fibroblastos tratados con sobrenadante de neutrófilos o monocitos en ratas SHAM (n=6-7), I/R (n=6-7) e IAM (n=6-7). Los datos están normalizados al control y expresados en Fold change. I/R: Isquemia/ reperfusión; IAM: Infarto agudo de miocardio. * indica significancia de p< 0,05; ** p<0,01. En cuanto a los genes apoptóticos, se observó que en los fibroblastos tratados con el sobrenadante procedente de neutrófilos de ratas I/R, había un aumento significativo de APAF1 frente a las células tratadas con sobrenadante procedente de ratas SHAM o IAM. Mientras que en el caso de los fibroblastos tratados con sobrenadante procedente de monocitos de IAM solo se evidenció una disminución de BCL2 en comparación con SHAM (Figura 64). En resumen, se observó que los neutrófilos de ratas operadas podían regular la expresión de APAF1 tanto en fibroblastos como en cardiomiocitos y que solo aumentaban la expresión de TGFB1 en los fibroblastos, mientras que los monocitos se evidenciaron como población más responsable con la aparición de fibrosis ya que podían regular la expresión tanto del COL1 y COL3 en fibroblastos y cardiomiocitos. El BCL2 se vio regulado por tanto por los neutrófilos como los monocitos en los fibroblastos. 126 Figura 64. Expresión de genes de apoptosis inducidos por monocitos y neutrófilos en fibroblastos. Cuantificación de la expresión de APAF1, BCL2, CYCS en fibroblastos tratados con sobrenadante de neutrófilos o monocitos en ratas SHAM (n=6-7), I/R (n=6-7) e IAM (n=6-7). Los datos están normalizados al control y expresados en Fold change. I/R: Isquemia/ reperfusión; IAM: Infarto agudo de miocardio. * indica significancia de p< 0,05; ** p<0,01. 5.2.3 ANÁLISIS DE GENES Y MICRORNAS EXPRESADOS EN MONOCITOS DE RATA AISLADOS POR FACS Seguidamente, para estudiar en profundidad los microRNAs y sus genes dianas que podrían estar implicados en la respuesta inflamatoria tras un evento isquémico, se realizó un array de genes y microRNAs en las poblaciones de monocitos estudiados. Para ello se aislaron las dos poblaciones de monocitos no clásicos, CD43high His48low y clásicos, CD43low His48high, en ratas SHAM y ratas sometidas a I/R a las 24h de las operaciones. Además, se eligió analizar el modelo de I/R sobre el de IAM para simular la cohorte de pacientes ya estudiados. Análisis del perfil genético expresados por los monocitos sorteados de rata Se realizó con el array de genes en un grupo de rata controles SHAM (n=4) y un grupo de ratas sometidas a I/R (n=4). Primero se realizó un análisis de PCA (Principal Component Analysis) que permite observar la variabilidad entre las muestras y el agrupamiento de ellas en cada grupo de estudio. Las muestras aparecieron muy agrupadas dentro de cada grupo experimental, y como se puede apreciar en la Figura 65, los puntos representantes los monocitos CD43high His48low (no clásicos) y CD43low His48high (clásicos) se distribuyeron en los márgenes opuestos, indicando una gran diferencia de expresión entre las dos 127 RESULTADOS poblaciones. Figura 65. Análisis PCA de los genes en los grupos experimentales. Control de calidad que permite observar la variabilidad entre las muestras y el agrupamiento de ellas en cada grupo de estudio. En rojo se pueden observar las muestras I/R (n=4) y en morado las SHAM (n=4) de los monocitos CD43high His48low. En el lado opuesto, bien separado, aparecen en azul las ratas I/R (n=4) y en verde las SHAM (n=4). I/R: isquemia/ reperfusión. Para acotar los datos y poder identificar microRNAs y genes candidatos implicados en los monocitos tras el infarto, se estableció un fold change de  2.0 y un pvalue <0.05. Se observó que la mayor variación de expresión era entre las dos poblaciones de monocitos: En el caso de las ratas SHAM se observaron 662 genes upregulados y 708 downregulados en los monocitos CD43high His48low (no clásicos) frente a los CD43low His48high (clásicos), mientras que en las ratas I/R se encontraron 627 genes upregulados y 680 los downregulados en las dos poblaciones monocitarias (Figura A1 del Anexo). A continuación, comparando las ratas SHAM frente a las ratas I/R, en los monocitos CD43high His48low (no clásicos) se observaron 132 genes diferentemente expresados, 84 upregulados y 48 downregulados, mientras que en los monocitos CD43low His48high (clásicos) fueron 87 los genes diferentemente expresados, de los cuales 61 estaban upregulados y 26 downregulados (Figura 66). 128 Figura 66. Volcano plots, scatter plots y heat maps de la expresión génica en ratas SHAM e I/R. Representación de fold change de la diferencia de expresión génica en los monocitos CD43high His48low (A-C) y CD43high His48low (D-F) en las ratas SHAM versus ratas I/R. A, D. Volcano plost. B, E. Scatter plots. C, F. Heat maps. En los volcano plots (A y D) y en los scatter plots (B y E) los genes cuyos niveles disminuyen aparecen como puntos verdes, mientras que en rojo los que se sobreexpresan. En C y F están representados los heatmaps de los clústeres jerárquicos de las ratas SHAM e I/R en los que se evidencia la buena agrupación de las muestras dentro de cada grupo. Las ratas SHAM aparecen en amarillo (n=4), mientras que las ratas I/R en verde (n=4). Scale bar: genes downregulados en azul y upregulados en rojo. I/R: isquemia/ reperfusión. Los genes diferentemente expresados en los monocitos CD43high His48low (no clásicos) y CD43low His48high (clásicos) se encuentran reflejados en la Tabla A2 y A3 del Anexo respectivamente. Los genes comunes entre estos dos subtipos de monocitos en los dos grupos experimentales, fueron 55, que están implicados en el ciclo celular, inflamación y apoptosis mediada por p53 como se puede observar en la Figura 67. 129 RESULTADOS Figura 67. Representación de las vías de señalización en común entre los dos subtipos de monocitos de ratas SHAM e I/R. La gráfica se elaboró en la plataforma online Panther Gene. Seguidamente se analizaron, usando Panther Gene, las principales vías de señalización implicadas en los dos tipos de monocitos, principalmente relacionadas con apoptosis e inflamación en los CD43high His48low y con la angiogénesis y las interleuquinas en los monocitos CD43low His48high. Posteriormente se realizó un análisis de enriquecimiento en Gene Ontology con la plataforma online para poder identificar genes pertenecientes a las mismas vías de señalización que pudieran estar diferentemente expresados por los monocitos. De los genes común entre las 2 poblaciones de monocitos se identificaron seis vías de señalización relacionadas con la homeostasis y desarrollo de eritrocitos y de las células mieloides (Figura A2 del Anexo). El análisis por separado de los 132 genes de los monocitos CD43high His48low determinó vías de señalización implicadas en la respuesta inmunitaria, en la homeostasis de la hemoglobina y eritrocitos (Figura A3 del Anexo). Cuando se analizaron los 87 genes exclusivos de los monocitos CD43high His48low se identificaron vías de señalización implicadas en la respuesta inmunitaria y de respuesta a patógenos e insultos tóxicos (Figura 68). En cuanto a los monocitos CD43low His48high, de los 87 genes se concretaron 666 vías de señalización (datos no mostrados), pero el análisis determinó que solo 32 genes específicos esta población de monocitos, pero no se consiguió asociarlos a ninguna vía de señalización con Gene Ontology. 136 Figura 75. Volcano plot, scatter plot y heat map de la expresión de los microRNAs en ratas SHAM e I/R. Representación de fold change de la diferencia de expresión génica en los monocitos CD43high His48low (A-C) y CD43high His48low (D-F) en las ratas SHAM y en las ratas I/R. A, D. Volcano plost. B, E. Scatter plots. C, F. Heat maps. En los volcano plots (A, D) y en los scatter plots (B, E) los microRNAs cuyos niveles disminuyen aparecen como puntos verdes, mientras que en rojos los que se sobreexpresan. En C, F están representados los heatmaps de los clústeres jerárquicos de las ratas SHAM e I/R en los que se evidencia la buena agrupación de las muestras dentro de cada grupo. Las ratas SHAM aparecen en amarillo (n=4), mientras que las ratas I/R en verde (n=4). Scale bar: microRNAs downregulados en azul y upregulados en rojo. I/R: isquemia/ reperfusión. A continuación, se compararon los datos proporcionados por el Array realizado con muestras humanas tras el infarto y angioplastia con el Array realizado en rata para encontrar microRNAs comunes entre los dos experimentos. Se observó que en los monocitos CD43low His48high de rata y en las células mononucleadas de humano tanto a las 0h como a las 6h estaban sobreexpresados el miR-4449 y el miR-4793-3p. En los monocitos CD43high His48low de rata y en las células mononucleadas de humano a las 6h se encontró el miR- 194-5p en común, mientras que a las 0h no se identificó ningún microRNAs (Tabla 24). 137 RESULTADOS Tabla 24. microRNAs en común entre los monocitos sorteados de rata y células mononucleadas de humano. Rata Humano Grupo microRNAs Fold change pvalue Fold change pvalue Monocitos CD43low His48high de rata vs células mononucleadas a las 0h miR-4449 3,77 0,0046 3,02 0,0005 miR-4793-3p 2,17 0,001 2,69 0,0069 Monocitos CD43high His48low de rata vs células mononucleadas a las 0h - - - - - Monocitos CD43low His48high de rata vs células mononucleadas a las 6h miR-4449 3,77 0,0046 2,18 0,0129 miR-4793-3p 2,17 0,001 2,71 0,0064 Monocitos CD43high His48low de rata vs células mononucleadas a las 6h miR-194-5p -2,67 0,0026 -6,92 0,0053 Relación entre microRNAs de distintas poblaciones de monocitos y sus genes dianas en células miocárdicas (cardiomiocitos y fibroblastos) Tras determinar los genes altamente expresados en el cocultivo se realizó un análisis in silico con el programa TAC para determinar los microRNAs que tienen como diana los genes de inflamación (Figura 76), fibrosis (Figura 77) y apoptosis (Figura 78) (Tabla A9 y Tabla A10 del Anexo). Figura 76. Principales genes de inflamación dianas de microRNAs y relativos fold change. En el centro en color amarillo el gen diana. En rojo están representados los microRNAs con fold change de valor >1.5 y en verde los microRNAs con valor negativo <-1.5. Los valores de fold change están reflejado en la Tabla A9 del Anexo. IL1B miR- 30e-5p miR- 28-3p miR- 603 miR- 16a miR- 23b miR- 758-3p IL6 miR-221 miR- 222 miR- 498 miR- 27a-3p miR- 181b-5p miR-16a miR- 194-5p miR- 139-5p miR- 190a-5p miR- 181c-5p miR-129 miR-15b IFNG miR- 27a-3p miR- 181b-5p miR- 29b-3p miR- 376b-5p miR- 181c-5p miR- 15b-5p IL17 miR- 322-3p miR- 520c-3p miR- 494-3p 138 Figura 77. Principales genes de fibrosis diana de microRNAs y relativos fold change. En el centro en color amarillo el gen diana. En rojo están representados los microRNAs con fold change con valor positivo >1.5 y en verde los microRNAs con fold change <-1.5. Los valores de fold change están reflejado en la Tabla A9 del Anexo. COL3 miR- 29b-3p miR- 29b-2- 5p miR- 563 TGFB1 miR- 130b-3p miR- 23a-5p miR- 34a-5p miR- 29b-3p miR-30b miR-730 miR- 540-3p miR- 541-3p miR- 877-5p miR-210 COL1 miR- 222a miR-498 miR- 29b-3p miR- 532-3p miR- 4800-5p miR- 146b-5p let-7d miR-563 miR- 540-3p miR-140 miR-22a 139 RESULTADOS Figura 78. Principales genes de apoptosis diana de microRNAs y relativos fold change. En el centro en color amarillo el gen diana. En rojo están representados los microRNAs con fold change con valor positivo >1.5 y en verde los microRNAs con fold change <-1.5. Los valores de fold change están reflejado en la Tabla A10 del Anexo. El análisis in silico sugiere que los microRNAs podrían regular los genes relacionados con la inflamación CYCS miR-221 miR-222 miR-498 miR- 6814-5p miR- 6840-3p miR-212- 5p miR-194 miR- 532-3p miR- 6808-5p miR- 5589-5p miR- 4695-5p miR-3918 miR- 520c-3p miR- 494-3p miR- 488-3p hsa-miR- 7977 BCL2 miR-27c miR-27a miR- 181b-5p miR- 34a-5p miR-27a miR- 29b-3p miR-193 miR- 345-5p miR- 30b-5p miR-730 miR- 181c-5p miR- 494-3p miR- 15b-5p APAF1 miR-221- 3p miR-27a- 3p miR- 200c-3p miR-222- 3p miR-27a- 3p miR- 181b-5p miR- 6840-3p miR-27a miR-193 miR-29b miR-194- 5p miR- 301a-3p miR-345- 5p miR-23b miR- 1228-3p miR- 6808-5p miR-30b miR-730 miR-216 miR-18b- 5p miR-7977 140 (IL1B, IL6, IFNG, IL17), con la fibrosis (COL1, COL3, TGFB) y con la apoptosis (APAF1, BCL2, CYCS), por ello se eligieron unos microRNA candidatos de regular la expresión de esos genes para validar su expresión en las dos poblaciones de monocitos sorteados de rata. Se estudió el perfil de expresión del miR-27a-3p, miR-29b- 3p, miR-30e-5p, miR-194-5p, miR-222-3p a las 24h de la intervención. En los monocitos no clásicos, los CD43high His48low, se observó una disminución significativa de la expresión del miR-194-5p (p= 0,0331) en las ratas I/R comparado con SHAM (Figura 79 D)., mientras se observó una tendencia de disminución de expresión en el resto de microRNAs analizados en las ratas sometidas a I/R con respecto a las SHAM (Figura 79 A-E). Figura 79. Perfil de expresión de microRNAs dianas en los monocitos CD43high His48low de rata a las 24h. En morado se muestran los SHAM (n=4), en azul aparecen las I/R (n=3-4). Los datos de expresión corresponden al log de fold change normalizado a SHAM. * indica significancia de p< 0,05. Por otra parte, en los monocitos clásicos, los CD43low His48high, se observó una tendencia de aumento en las ratas sometidas a I/R con respecto a las SHAM en los miR-27a-3p (Figura 80 A) y miR-194-5p (Figura 80 D), mientras la expresión del miR-29b-3p, miR-30e-5p y miR-222-3p disminuyo de manera no significativa en las ratas I/R con respecto a las ratas SHAM (Figura 80 A, C, E). Figura 80. Perfil de expresión de microRNAs dianas en los monocitos CD43low His48high de rata a las 24h. En morado se muestran los SHAM (n=4), en azul aparecen las I/R (n=3-4). Los datos de expresión corresponden al log de fold change normalizado a SHAM. * indica significancia de p< 0,05. Como observado en las Figura 76, 77 78, el miR-194-5p puede regular APAF1, CYCS e IL6, pudiendo tener un rol en inflamación y apoptosis. 141 DISCUSIÓN 6. DISCUSIÓN 142 143 DISCUSIÓN Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son la primera causa de muerte en el mundo, alcanzando casi la mitad del total. La cardiopatía isquémica es la primera causa de muerte dentro de las ECV y el gasto sanitario para hacer frente a estas enfermedades, solo en la UE, alcanza el 10% del gasto público (Piepoli et al., 2016a; World Health Organization, 2022b). La revascularización temprana tras el IAM permite reestablecer el flujo en las zonas isquémicas tras el infarto y es un proceso que ha mostrado ser fundamental para mejorar el pronóstico del paciente. Sin embargo, aunque la reperfusión haya sido exitosa, alrededor de un tercio de los pacientes, sufre remodelado adverso del ventrículo izquierdo (Cha et al., 2019b). La incidencia del remodelado adverso del ventrículo izquierdo y su consecuente IC tienen una tendencia en aumento, por lo tanto, es imprescindible investigar en marcadores que sea capaces de identificar de manera temprana a los pacientes que, en igualdad de factores de riesgo y éxito en la intervención, vayan a sufrir remodelado adverso. En esta tesis doctoral se ha dilucidado la participación diferencial de las poblaciones inflamatorias en los pacientes infartados, como los neutrófilos y las subpoblaciones de monocitos que regulan la liberación de citoquinas y los microRNAs implicados en la fibrosis intersticial. El cambio en los niveles de los monocitos intermedios es capaz de predecir el remodelado adverso del ventrículo izquierdo en los pacientes con STEMI. 6.1 BIOMARCADORES CLÁSICOS DEL REMODELADO ADVERSO POSTINFARTO En la cohorte de pacientes de este estudio, los criterios de inclusión y exclusión fueron muy rigorosos con el fin de trabajar con una población la más homogénea posible. Estos estrictos criterios, por un lado, no permitieron reclutar un grupo numeroso a pesar de la elevada incidencia del IAM en la población, pero garantizaron estudiar en sujetos homogéneos, el papel de la inflamación en la revascularización, en particular en las células inflamatorias, en las citoquinas y microRNAs liberados por estas células. La incidencia de aparición de remodelado adverso del ventrículo izquierdo a los 6 meses de seguimiento en nuestra cohorte fue del 32%, un porcentaje cercano al 25% descrito por Cha et al. en un grupo más amplio de pacientes (Cha et al., 2019c). Desde el punto de vista clínico, estos investigadores demostraron que la resonancia magnética cardiaca es el método gold standard para identificar el remodelado adverso. Al inicio de nuestro estudio, realizamos resonancia magnética cardiaca en 18 pacientes para efectuar un seguimiento del desarrollo del remodelado adverso, y comparamos las mediciones de algunos parámetros cardiovasculares mediante ecocardiografía y resonancia magnética. Como se muestra en la Figura 81, los valores del VTDVI y del VTSVI medidos por ecocardiografía y por resonancia magnética, no presentaron diferencias estadísticamente significativas al alta de los pacientes y 6 meses después. Desafortunadamente, debido al coste de la técnica y al alto riesgo de abandono del paciente hospitalizado, nos vimos obligados 144 a descartar el uso de la resonancia magnética cardiaca y nos centramos en el uso de la ecocardiografía para evaluar el VTDVI a los 6 meses del STEMI. Figura 81. Comparación entre las mediciones de VTDVI y del VTSVI por ecocardiografía y por resonancia magnética en pacientes STEMI. VTDVI (A) y del VTSVI (B) medidos por ecocardiografía (en azul) y por resonancia magnética (en rojo) al reclutamiento de los pacientes y a los 6 meses. LVEDV: left-ventricular end-diastolic volumen, volumen telediastólico del ventrículo izquierdo (VTDVI); LVESV: left-ventricular end-systolic volumen, volumen telesistólico del ventrículo izquierdo (VTSVI); MRI: Magnetic Resonance Imaging. Por otra parte, es de gran interés clínico establecer marcadores tempranos que puedan identificar los pacientes con un riesgo elevado de padecer remodelado adverso y poder así proporcionarles un seguimiento más estricto con técnicas de imagen (ecocardiografía y resonancia magnética cardiaca) y un tratamiento médico temprano adecuado. Recientemente, en clínica se están utilizando otros marcadores, no empleados para el diagnóstico del IAM, como predictores de remodelado adverso e IC, como la CKMB, una isoforma de la enzima CK presente en las células cardiacas y en menor cantidad en los músculos esqueléticos. En caso de daño cardiaco, la CK es liberada al torrente sanguíneo unas 6 horas tras el evento isquémico, alcanzando el pico a las 24 horas (entre 48 y 72h se restablecen sus valores). Se ha observado que aumentos en los valores de CK asociados a lesión de la arteria descendente anterior son predictores de remodelado e IC (Gho et al., 2017; Hendriks et al., 2017; Y. Yang et al., 2022). En nuestro estudio hemos demostrado que los pacientes que desarrollaron remodelado adverso tenían niveles significativamente más elevados de marcadores clásicamente empleados en clínica (CK y TnT) que los pacientes que no remodelaron, como se ha descrito en otros estudios (Cha et al., 2019). Acorde a cuanto, descrito en literatura, en nuestra cohorte observamos la elevación de CK en pacientes con remodelado, sin embargo, el análisis multivariado indica que los marcadores clásicos (CK y TnT) no son buenos predictores de desarrollo de remodelado adverso tras la revascularización. En literatura se han estudiado múltiples posibles marcadores, desde los clásicos factores de riesgo 145 DISCUSIÓN cardiovascular como es la dislipemia, hasta las células inmunes que participan en la inflamación y las combinaciones de los anteriores. Por ejemplo, una ratio más elevada de monocitos- HDL se relacionó con una mayor aparición de remodelado adverso del ventrículo (Eyyupkoca et al., 2022). También, se ha visto que una ratio neutrófilos- HDL más elevada en pacientes con STEMI es capaz de predecir eventos adversos, aunque sin una buena AUC (0.61, con sensibilidad de 47% y sensibilidad del 77%) (Chen et al., 2022). Sin embargo, aunque casi la mitad de nuestra cohorte de pacientes padeciera dislipemia, no encontramos diferencias significativas en los niveles de lípidos entre pacientes que remodelaron y los que no. Por todo ello, sigue siendo necesario la búsqueda de un buen biomarcador capaz de predecir que un paciente tras el infarto padezca remodelado adverso o eventos cardiovasculares (definidos como muerte cardiovascular, ictus de origen isquémico no fatal, infarto de miocardio recurrente, necesidad de una nueva revascularización, ingreso por insuficiencia cardiaca). De allí la aparición en los últimos años de un abanico de propuestas de nuevos marcadores asociados a la aparición de otros eventos cardiovasculares o a un riesgo aumentado a desarrollar remodelado adverso tras el infarto o a una mayor mortalidad (Loguinova et al., 2018), incluyendo las poblaciones inflamatorias, citoquinas o microRNAs. 6.2 POBLACIONES INFLAMATORIAS COMO BIOMARCADORES DE REMODELADO ADVERSO La inflamación también ha sido objeto de estudio en pacientes con IAM, tanto a nivel de poblaciones inflamatorias que participan en el infarto, como a nivel de mediadores solubles liberados al torrente sanguíneo. Se ha puesto el foco de atención en las poblaciones inflamatorias por separado o en combinación creando ratios para estratificar el riesgo de padecer remodelado o un aumento de la mortalidad, como descrito a seguir. En nuestra cohorte encontramos una neutrofilia acusada en pacientes con STEMI comparados con los individuos controles antes de la ACTP y a las 6h, al mes y a los 6 meses después de la intervención. Estos datos apoyan datos previamente publicados en pacientes con IAM (Nahrendorf et al., 2007), sin embargo, no se ha establecido si los neutrófilos pudieran predecir el remodelado adverso. Recientemente se ha dilucidado la relación entre neutrófilos y eosinófilos y se ha descrito que se puede limitar el remodelado adverso tras IAM gracias a unas nanopartículas (NM-NPIL-5) en un modelo in vivo de ratón. Estas partículas, formadas por membrana de neutrófilos, contienen IL-5, una citoquina antiinflamatoria que juega un papel esencial en el desarrollo de los eosinófilos, beneficiando en la resolución de la inflamación (Liu et al., 2020). El suministro intravenoso de estas partículas hizo que sirvieran de señuelo para absorber y neutralizar las citoquinas elevadas producidas por los neutrófilos. Además, a la vez con la liberación de IL-5 se promovió el acumulo de eosinófilos en el miocardio y la angiogénesis en la zona perinfartada (D. Han et al., 2023).