Identificación y síntesis de metabolitos secundarios aislados de plantas y hongos de Canarias, norte de Africa y Sudamérica

Biocáncer 5, 2011 IDENTIFICACIÓN Y SÍNTESIS DE METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS DE PLANTAS Y HONGOS DE CANARIAS, NORTE DE AFRICA Y SUDAMÉRICA. Jaime Bermejo1,2, Francisco Léon1 , Ignacio Brouard1, Juan C. Hernández1, Jorge Triana2,3, Mariana López2,3, José L. Eiroa2,3, Francisco J. Pérez2,3, Francisco Estévez2,4, José Quintana2,4, Samir Benayache5, Fadila Benayache5 1 Instituto de Productos Naturales y Agrobiología CSICInstituto Universitario de Bio-Orgánica “A. González”, Avda. Astrofísico Francisco Sánchez 3, 38206, La Laguna, Tenerife 2 Instituto Canario de Investigación del Cáncer ICIC, Tenerife, Spain 3 Departamento de Química, Unidad Asociada al CSIC, Instituto Canario de Investigación del Cáncer, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, 35017 Las Palmas de Gran Canaria, Spain 4 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Unidad Asociada al CSIC, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Plaza Dr. Pasteur s/n, 35016 Las Palmas de Gran Canaria, Spain 5 Laboratoire de Valorisation des Ressources Naturelles et Synthese de Substances Bioactives, Equipe Associee a` l’A.N.D.R.S., Universite´ Mentouri, Route de Aïn El Bey, 25 000 Constantine, Algeria ___________________________________ ÍNDICE: 1. INTRODUCCIÓN 2. ESTUDIO DE ESPECIES ENDÉMICAS DE CANARIAS 2.1. Dracaena draco 2.2. Asteraceae endémicas de Canarias 3. ESTUDIO DE ESPECIES PROCEDENTES DEL NORTE DE ÁFRICA 4. ESTUDIO DE MACROMICETOS PROCEDENTES DE COLOMBIA 5. CONCLUSIONES 6. REFERENCIAS __________________________________ Jaime Bermejo, Francisco Léon, Ignacio Brouard, Juan C. Hernández, Jorge Triana, Mariana López, Jose L. Eiroa, Francisco J. Pérez, Francisco Estévez, José Quintana, Samir Benayache, Fadila Benayache - 197 - 1. INTRODUCCIÓN La investigación de los productos naturales se asocia de forma común con el estudio de las sustancias que se aíslan de organismos vivos en aspectos que van desde los más convencionales, como los relacionados con la elucidación de su estructura y su síntesis química, hasta otros que, abarcan su biosíntesis, degradación y papel fisiológico. El ámbito de actuación de esta rama de la química se centra preferentemente en el estudio de las moléculas del metabolismo secundario, que podemos definir como aquellos que se generan en rutas metabólicas aparentemente no esenciales para la supervivencia del organismo. Por su propia naturaleza, estos metabolitos secundarios resultan ser con frecuencia particulares para la especie biológica investigada y, aunque en muchos casos se desconoce su función fisiológica, la singularidad de estas sustancias particulariza en ciertas especies formas específicas de acción biológica que pueden, y de hecho son, del más amplio interés (Bohlin 1998). Actualmente, la química de Productos Naturales posee una gran importancia, ya que nuevas sustancias, más o menos complicadas se descubren e investigan constantemente. La industria farmacéutica en la actualidad dirige grandes esfuerzos hacia el hallazgo de nuevos compuestos con actividades biológicas específicas, mediante la evaluación de extractos directos de distintos organismos vivos. La investigación en este campo pone énfasis en disponer de una buena y extensa colección de material de partida, fundamentalmente extractos, que cubran la mayor diversidad de géneros, especies y ecosistemas, de manera que puedan encontrar una amplia expresión de todo tipo de metabolitos secundarios, asegurando de esta forma una gran variedad estructural (Koehn and Newman 2009). En esta área se encuentra el Instituto de Producto Naturales y Agrobiología del Consejo Superior de Investigaciones Científicas CSIC (Tenerife)- Instituto Universitario de Bio-Orgánica “Antonio González”, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria y el Instituto Canario de Investigación del Cáncer ICIC, que vienen desarrollando desde hace años diversos programas de investigación sobre sustancias procedentes de plantas superiores, hongos, líquenes, helechos, etc., a través de los cuales se han aislado y determinado las estructuras de muchos centenares de metabolitos secundarios nuevos, así como, la funcionalización y síntesis de ellos o análogos, algunos con significativa actividad farmacológica. Nuestro grupo de investigación, en particular tiene como objetivo, el descubrimiento de nuevos agentes farmacológicos en especial quimioterapéuticos, procedentes de diferentes fuentes endémicas de Canarias, del Norte de África y Sudamérica. Con la intención de profundizar en los resultados, mencionaremos los principales hallazgos encontrados, en nuestro grupo de investigación, de los que han surgido una serie de publicaciones internacionales que comentaremos a continuación. Identificación y síntesis de metabolitos secundarios aislados de plantas y hongos de Canarias, norte de África y Sudamérica - 198 - 2. ESTUDIO DE ESPECIES ENDÉMICAS DE CANARIAS 2.1 Dracaena draco El grupo de los dragos está constituido por el taxón arborescente del género Dracaena , los cuales presentan una distribución diferente entre el oeste y el este de África, incluyendo los archipiélagos adyacentes. En el oeste se encuentran dos especies: D. draco , con la subespecie draco en los archipiélagos de Madeira, Cabo Verde, y Canarias y la subespecie ajgal en el norte de Marruecos, y la especie D. tamaranae restringida a la isla de Gran Canaria. En el este de África encontramos las especies D. cinnabari en la isla de Socotora y algunas especies continentales como: D. schizantha , D. ombet , D. serratula (Marrero et al 1998; Sánchez-Pinto 2001). El D. draco spp draco es uno de los arboles emblemáticos de la flora Canaria, es un árbol de porte variable, crece en zonas cálidas preferentemente en lugares expuestos a la humedad de los vientos alisios a una altitud de entre 100-600 metros. En la antigüedad la resina que exuda el árbol denominada “Sangre de drago” fue un producto muy apreciado por sus propiedades medicinales e industriales (Santos 1979). Desde el punto de vista fitoquímico se habían aislado saponinas de tipo dracogenina y flavonoides tipo flavans, homoisoflavans, flavonoles, entre otros. En el curso de nuestras investigaciones en este tema en particular, hemos estudiado la sangre de drago de las especies presente en el oeste de África ( D. draco spp draco ; D. draco spp ajgal y D. tamaranae ) para determinar el patrón de flavonoides presentes en cada una de ellas, concluyendo que si bien se veían ciertas diferencias entre la subespecie draco y ajgal , no llegaban a ser significativas, en cambio, al compararlas con D. tamaranae , esta última no presentaba por lo menos tres sustancias encontradas en los D. draco . Lo anterior nos permitió observar la diferencia química entre estas dos especies y sirvió como soporte para poder establecer D. tamaranae como una especie taxonómicamente diferente (González et al 2004). De la raíz de D. draco spp draco , se han podido aislar e identificar veintitrés sustancias, veintidós de ellas conocidas (saponinas esteroidales y flavonoides) y una nueva saponina esteroidal de tipo furostanol denominada icogenina 1 (figura 1), esta mostró un extraordinario efecto antiproliferativo frente a células de leucemia humana HL-60, induciendo apoptosis correlacionada con el aumento del rompimiento proteolítico de la poli ADP ribosa polimerasa-1, verificándose esto último, por medio de western blot con el fragmento a 85 KDa (Hernández et al 2004). De las hojas de D. draco spp draco , mediante técnicas cromatográficas convencionales, hemos podido separar y determinar las estructuras de diecinueve sustancias, de ellas diecisiete conocidas (flavonoides, saponinas esteroidales, esteroles) y dos nuevos metabolitos: una Jaime Bermejo, Francisco Léon, Ignacio Brouard, Juan C. Hernández, Jorge Triana, Mariana López, Jose L. Eiroa, Francisco J. Pérez, Francisco Estévez, José Quintana, Samir Benayache, Fadila Benayache - 199 - saponina esteroidal denominada icodesida (2) y un flavonoide tipo homoisoflavonoide denominado dracol (3) (figura 1). Se evaluó la actividad citotóxica de 2 y 3, frente a células tumorales HL-60, A-431, HeLa, SK-OV3. Observándose que únicamente 2 fue activo frente a HL-60 y A-431 con un IC50 de 9 y 16 µM, respectivamente. El compuesto 3 fue inactivo (Hernández et al 2006). O O O C H 3 OH O HO HO OO O HO HO OH O OH HO HO HO 1 O HO O HO OO HO OH OH O O O O OAc AcO AcO OH HO 2 O O O OH OH O 3 O HO O 4 Figura 1. Compuestos aislados de Dracaena draco . Con el fin de profundizar en la actividad de las saponinas esteroidales, se ha desarrollado una metodología sintética, manteniendo el núcleo de la diosgenina (4) (figura 1), una saponina esteroidal muy habitual en D. draco , y que presenta una apreciada actividad citotóxica. Los análogos se sintetizaron con un derivado común la 3-β-glucosa-diosgenina convenientemente protegida, a la cual se le fueron uniendo distintos monosacáridos en la posición 2 de la glucosa (glucosa, galactosa, manosa, xilosa, ramnosa, arabinosa y fucosa). Ver tabla 1. Una vez obtenidos los análogos de saponinas se evaluó la citotoxicidad frente a tres líneas celulares tumorales HL-60, U937 y SK-MEL-1, no todos los análogos fueron igualmente citotóxicos, se observó que el más activo fue el que poseía la ramnosa unida en la posición 2 de la glucosa, así se hicieron dos derivados acetilados: un mono acetilado en la posición 6 de la glucosa y un di acetilado en la posiciones 6 de la glucosa y 4 de la ramnosa, estos derivados fueron sintetizados mediante una enzima específica para acetilar, la novoenzima 435. Estos derivados fueron los más citotóxicos frente a todas las líneas ensayadas con un IC50 promedio de entre 4 a 30 µM. Observamos que dichos compuestos inducen daño en el ADN en la fase G2/M (como es el caso de la mayoría de agentes de daño al ADN). La apoptosis fue precedida por una rápida liberación del citocromo c de la mitocondria al citosol y subsecuente activación de caspasas involucrando la caspasa-9 y la caspasa-3. Estos datos podrían contribuir al diseño Identificación y síntesis de metabolitos secundarios aislados de plantas y hongos de Canarias, norte de África y Sudamérica - 200 - de fármacos como posible agente quimioterapéutico o quimiopreventivo (Hernández et al 2008). Tabla 1. Productos de acoplamiento. donor acceptor product product Yield (%) O PivO HO O O Ph Od 4 O AcO AcO AcO A c O O PivO O O O Ph O-diosg e 12 O HO HO HO H O O HO O H O HO O-diosgeni n 19 (77) “ O OAc AcO A c O OAc O PivO O O O P h O-diosge n 13 O OH HO H O OH O HO O H O HO O-diosgeni n 20 (50) “ O PivO O O O Ph O-diosgeni n 14 O A c O AcO AcO OAc O HO O HO HO O-diosgeni n 21 O H O HO HO OH (52) “ O PivO O O O Ph O-diosge n 15 O AcO AcO A c O O HO O H O HO O-diosgeni n 22 O HO HO H O (64) “ O AcO A c O OAc O PivO O O O P h O-diosgeni n 16 O HO H O OH O HO O H O HO O-diosgeni n 23 (56) “ O PivO O O O P h O-diosgeni n 17 O O A c OAc OAc O HO O H O HO O-diosgeni n 24 O O H OH OH (58) “ O PivO O O O Ph O-diosgeni n 18 O O A c AcO AcO O HO O H O HO O-diosgeni n 25 O O H HO HO (49) Jaime Bermejo, Francisco Léon, Ignacio Brouard, Juan C. Hernández, Jorge Triana, Mariana López, Jose L. Eiroa, Francisco J. Pérez, Francisco Estévez, José Quintana, Samir Benayache, Fadila Benayache - 201 - 2.2 Asteraceas endémicas de Canarias. Las islas Canarias al igual que la gran mayoría de islas de origen volcánico se suelen caracterizar por la existencia de paisajes vegetales muy diversos, así como de la existencia de una gran variedad de nichos ecológicos que tienen como resultado distintas especies vegetales, con un gran número de endemismos que pueden variar incluso de una isla a otra y que son el resultado de una serie de procesos de evolución vegetal, como es el caso de las plantas vasculares, de las aproximadamente 1900 especies presentes de manera salvaje en Canarias siendo casi el 30 % endémicas. Una de las familias que más endemismos agrupa en Canarias son las Asteraceae (Compuestas), con unos 32 géneros presentes en Canarias de los cuales podemos resaltar: Tanacetum , Pulicaria , Gonospemum , Lugoa , etc, (Kunkel et al 1992). Nuestro grupo de investigación tiene amplia experiencia en el estudio de los metabolitos secundarios presentes en Compuestas, a continuación mencionaremos una serie de trabajos que se han desarrollado en parte con el apoyo económico del ICIC. El género Pulicaria está representado en las Islas Canarias por tres especies: Pulicaria crispa , P. burchardii y P. canariensis , las dos últimas son endémicas, la P. canariensis está representada por dos subespecies la lanata y canariensis . Del extracto etanólico de la parte aérea de la P. canariensis spp canariensis hemos podido aislar y determinar las estructuras de veinte compuestos trece de ellos nuevos en la bibliografía científica: pulicadienos A (5), B (6) y C (7); pulicanona (8); pulicanol (9); pulicanarales A (10), B (11) y C (12); pulicanadienales A (13) y B (14); pulicanadienol (15), pulioplopanonas A (16) y B (17). Se realizaron actividades citotóxicas frente a células de leucemia humana HL-60 a los productos nuevos y algunos de sus derivados acetilados y/ó metilados (ver figura 2), observándose que el compuesto 8a fue el más activo y su citotoxicidad fue causada por inducción de apoptosis mediante activación de caspasas (Triana et al 2005). Identificación y síntesis de metabolitos secundarios aislados de plantas y hongos de Canarias, norte de África y Sudamérica - 202 - OAc R OAc 5, R = COOH 5a, R = COOMe 6, R = CHO 7, R = CH 2 OH 1 357 9 11 14 15 OR OR O OR 8, R = H 8a, R = Ac OAc OR OR O 9, R = H 9a, R = Ac OAc CHO OAc O 10 OAc CHO OR O O 11, R = Ac 12, R = H R OH CHO 13, R = OH 14, R = OAc 15 H H HO O H H HO O OH 16 17 OH OH OH 1 3 4 57 9 11 14 15 Figura 2. Compuestos nuevos aislados de Pulicaria canariensis spp canariensis . La subtribu de la Gonosperminae es una de las doce tribus reconocidas de la Anthemideae (Asteraceae), proporcionan uno de los ejemplos de distribución discontinua entre las Islas Canarias y el continente Africano específicamente en Sudáfrica. La distribución geográfica de los miembros de esta subtribu parecía apoyar en principio un enlace durante el periodo terciario, entre la flora Canaria y la flora Rand de Sudáfrica. Gonosperminae está compuesta por dos géneros endémicos de las islas Canarias, el Gonospermum (cuatro especies), Lugoa (una especie) y el Inulanthera constituido por diez especies presentes en el Noreste de Sudáfrica (Bremer and Humpries 1993). Nuestras investigaciones basadas en el estudio sistemático de diferentes especies de Gonospermum recolectadas en distintas Islas Canarias, nos apoyan la propuesta de segregación del género Inulanthera del grupo Gonosperminae tomando como base el predominio de las lactonas tipo germacrano y eudesmano presente en las especies de las Islas Canarias, frente al predominio de las lactonas tipo guayanolida presentes en las especies africanas ( Inulanthera ), estas últimas presentan una mejor relación con los géneros europeo-asiáticos, debido no sólo al hecho de la presencia de las mismas lactonas, sino al mismo patrón de compuestos biogenéticamente similares, argumento indispensable desde el punto de vista quimiotaxonómico. Estos estudios junto con los bibliográficos han mostrado que el género Tanacetum vendrá a estar mucho más relacionado con Gonosperminae que el Inulanthera , y que Tanacetum , Lugoa y Gonospermum podrían ser agrupados en un único taxón endémico de las Islas Canarias (Oberprieler et al 2007). Las anteriores conclusiones fueron generadas por un estudio sistemático como se comentó anteriormente de las Gonosperminae presentes en Canarias, de las cuales hemos resaltado tres trabajos realizados con el apoyo del ICIC. Del extracto etanólico de la parte aérea de Jaime Bermejo, Francisco Léon, Ignacio Brouard, Juan C. Hernández, Jorge Triana, Mariana López, Jose L. Eiroa, Francisco J. Pérez, Francisco Estévez, José Quintana, Samir Benayache, Fadila Benayache - 203 - OR OR 18 R= H 18a R = Ac O OR OR O 19 R= H 19a R = Ac RO O OO OR RO OO OR OO OR 20 R= H 20a R = Ac 21 R= H 21a R = Ac Gonospermum elegans , hemos podido aislar e identificar diecinueve compuestos cuatro de ellos nuevos, un sesquiterpeno: eleganodiol (18) y tres lactonas sesquiterpénicas: eleganolactona A (19), B (20) y elegaina (21), (figura 3) las estructuras de los nuevos compuestos fueron elucidadas por un amplio estudio espectroscópico, siendo la estructura de 20 determinada mediante difracción de rayos X de su derivado acetilado 20a. También se evaluó la actividad citotóxica de este tipo de sustancias frente a células tumorales HL-60, observándose que el compuesto 19a y 20a fueron los más activos con un IC50 de 0,25 y 5,3 µM, respectivamente (Triana et al 2003). Figura 3. Compuestos nuevos aislados de Gonospermum elegans . De la parte aérea de G. gomerae y G. fructicosum recolectados en la isla de la Gomera (figura 4), haciendo uso de diferentes métodos cromatográficos hemos podido identificar cinco nuevos compuestos. De G. gomerae dos nuevas lactonas sesquiterpénicas (22) y (23), mientras que de G. friucticosum las dos lactonas (24 y 25), y un sesquiterpeno lineal (26). Sus estructuras fueron determinadas por análisis espectroscópico, incluyendo RMN mono y bidimensional y masas (HR-EI-MS). También obtuvimos veinte compuestos conocidos, la estructura de estos fue confirmada por comparación de sus propiedades espectroscópicas con los datos publicados en la bibliografía. Así mismo, estábamos interesados en determinar si estas sustancias mostraban propiedades citotóxicas de una forma específica en la células, examinamos los efectos de varios sesquiterpenos aislados frente al crecimiento de cuatro líneas celulares tumorales humanas (HL-60, U-937, A549 y SK-MEL-1), los resultados mostraron que el compuesto 22a fue el más activo frente a HL-60 y U937 con un IC50 de aproximadamente 10 µM. La línea celular A549 fue la más resistente frente a todos los compuestos evaluados. La inhibición de crecimiento celular en HL-60 fue asociada con alteraciones en la progresión del ciclo celular y apoptosis a través de un mecanismo dependiente de caspasas (Triana et al 2008). Identificación y síntesis de metabolitos secundarios aislados de plantas y hongos de Canarias, norte de África y Sudamérica - 204 - 23 OO OAng OO OR OTig OR RO 22 R = H 22a R = Ac OO OR O 24 R = H 24a R = Ac OO OTig RO 25 R = H 25a R = Ac OH OH OAc 26 Figura 4. Compuestos nuevos aislados de Gonospermum gomerae y G. fructicosum . El G. fructicosum está presente además de en la Isla de La Gomera, en Tenerife y el Hierro. Por tal motivo nos planteamos el estudio de varias poblaciones de G. fructicosum , con la finalidad de encontrar el tipo estructural y patrón de compuestos aislados. Así, estudiamos dos poblaciones en Tenerife y una en la Isla de El Hierro. Las poblaciones en Tenerife fueron recolectadas en Anaga y en Güimar, del estudio del extracto etanólico de la parte aérea de la G. fructicosum recolectado en Anaga (Tenerife) hemos podido aislar seis compuestos uno de ellos un sesquiterpeno nuevo en la bibliografía (27) (figura 5); de la recolectada en Güimar (Tenerife) aislamos e identificamos ocho compuestos, cuatro de ellos novedosos, todos sesquiterpenos del tipo del eudesmano (27-30) (figura 5) y del G. fructicosum recolectado en El Hierro pudimos aislar una nueva lactona sesquiterpénica (31) (figura 5), junto con siete compuestos conocidos. Todas las sustancias fueron identificadas mediante métodos espectroscópicos, principalmente RMN 1D y 2D, IR, y masas de alta resolución, desde el punto de vista químico hay que resaltar el hecho que únicamente hemos encontrado lactonas sesquiterpénicas en la población procedente de El Hierro, ya que se puede evaluar la colonización inter-islas y la radiación insular en esta especie en particular. Además se evaluó la citotoxicidad de los compuestos nuevos frente a tres líneas tumorales humanas la HL-60, U937 y SK-MEL-1, obteniéndose una baja actividad en las sustancias ensayadas (Triana et al 2010). Jaime Bermejo, Francisco Léon, Ignacio Brouard, Juan C. Hernández, Jorge Triana, Mariana López, Jose L. Eiroa, Francisco J. Pérez, Francisco Estévez, José Quintana, Samir Benayache, Fadila Benayache - 211 - identificados, se les ha evaluado su actividad citotóxica frente a distintas líneas tumorales humanas (HL-60, SK-MEL-1, etc). Resaltamos los estudios realizados de Asteraceae presentes en Canarias, reforzando la propuesta de conformar un género con especies endémicas de Canarias, como consecuencia de los resultados de estudios fitoquímicos de Gonospermum entre otros géneros. En cuanto a la actividad citotóxica las ceramidas 43a-d, presentaron unos IC50, con buen potencial. Nos proponemos continuar sintetizando algunos derivados o estudiando hongos del mismo género y procedencia. Ponemos también de manifiesto en nuestros trabajos la estrecha relación que mantenemos con el personal de distintas Universidades, como la de Las Palmas de Gran Canaria, Nacional de Colombia y Mentouri en Argelia. Nos proponemos continuar dicha colaboración. Identificación y síntesis de metabolitos secundarios aislados de plantas y hongos de Canarias, norte de África y Sudamérica - 212 - 6. 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