Desenvolvimento de uma plataforma microfluídica para contagem de espécies de fitoplâncton tóxico
Abstract
O ciclo de nutrientes e o fluxo de energia nos ecossistemas marinhos está fortemente relacionado com a população de fitoplâncton, uma vez que este se encontra na base da cadeia alimentar marinha. No entanto, em certas condições ambientais pode ocorrer a proliferação de algumas espécies de fitoplâncton produtoras de toxinas, chamadas de florescimento de algas nocivas, as quais podem afetar a cadeia alimentar marinha e, consequentemente, a saúde humana quando são consumidos produtos contaminados provenientes da aquacultura e pesca. Apesar de já existirem várias técnicas sensíveis para a identificação de espécies de fitoplâncton, especialmente a citometria de fluxo, estas ainda não permitem análises rotineiras, in-situ, de baixo custo e de forma automatizada. Assim, o objetivo desta dissertação assenta no desenvolvimento de uma plataforma Lab-on-a-chip para contagem de células de fitoplâncton de uma forma automatizada, a qual será futuramente integrada num citómetro microfluídico. A plataforma desenvolvida compreende um canal microfluídico para passagem individual das células pela zona de deteção, no qual está integrado um sensor de impedância fabricado com microeléctrodos em filme fino. O princípio de deteção deste sensor é baseado na tecnologia Resistive Pulse Sensing (RPS), onde a identificação de células é obtida a partir das variações da tensão provocadas pela passagem destas sobre os microeléctrodos. A melhor geometria e configuração dos microeléctrodos bem como dos microcanais foram estudadas através de simulações numéricas utilizando o software COMSOL Multiphysics. As configurações com melhores resultados foram fabricadas com recurso às microtecnologias e validadas experimentalmente. Para além disso, foi também implementada a eletrónica de atuação e leitura necessária para efetuar as medições elétricas, que compreende um circuito de excitação e um de amplificação. Os resultados experimentais permitiram observar alterações distintas na tensão com a passagem de partículas de diferentes tamanhos bem como com a passagem de diferentes células de fitoplâncton, demonstrando assim a viabilidade desta plataforma para ser integrada com um citómetro microfluídico.
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Ângela Sofia Faria Meireles Desenvolvimento de uma plataforma microfluídica para contagem de espécies de fitoplâncton tóxico Janeiro de 2021 Desenvolvimento de uma plataforma microfluídica para contagem de espécies de fitoplâncton tóxico Uminho | 2021 Ângela Sofia Faria Meireles
Ângela Sofia Faria Meireles Desenvolvimento de uma plataforma microfluídica para contagem de espécies de fitoplâncton tóxico Dissertação de Mestrado Mestrado Integrado em Engenharia Eletrónica Industrial e Computadores Trabalho efetuado sob a orientação do Doutor Paulo Jorge Teixeira de Sousa Janeiro de 2021
ii DIREITOS DE AUTOR E CONDIÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO TRABALHO POR TERCEIROS Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Licença concedida aos utilizadores deste trabalho Atribuição-NãoComercial-SemDerivações CC BY-NC-ND https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ Universidade do Minho, _____/_____/_________ Assinatura: 12 01 2021
iii Este trabalho resultou do projeto FoodSens co-financiado pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) através do Programa Interreg V-A Espanha-Portugal (POCTEP) 2014-2020. Projeto nº 0591_FOODSENS_1_E.
iv AGRADECIMENTOS A realização desta dissertação é o fechar de um dos melhores capítulos da minha vida, que fica marcada por momentos que guardarei para sempre na minha memória. Em primeiro lugar gostava de deixar um grande agradecimento à minha equipa de orientação. Ao meu orientador, Doutor Paulo Sousa e à professor Vânia Pinto, por todo o apoio e por todo o conhecimento que me passaram durante este ano e por toda a paciência que tiveram comigo. Ao Professor Luís Gonçalves, pela paciência, pela amizade e pelas oportunidades ao longo destes anos. Agradeço também a disponibilidade dada por parte do Vítor Hugo Magalhães na parte das simulações e por fim, um agradecimento ao professor Rui Lima, por todo o material disponibilizado. Deixo aqui uma palavra de agradecimento aos funcionários das oficinas de eletrónica, em particular ao Senhor Carlos e ao Senhor Paulo por estarem sempre disponíveis a ajudar. A todo o pessoal do laboratório, em particular à Camila Maria Penso e ao João Rocha, por todo o apoio em todos os momentos. Ao longo destes anos, fiz amizades incríveis e conheci pessoas que é impossível encontrar palavras, que os descrevam. João Fernandes, Jorge Rafael Novais, Francisco Machado, Carlos Silva, Carolina Rua, Dimitri Santos, Ana Rita Fonseca, Gabriel Vilas Boas, João Martins, Sofia Paiva, Miguel Arrepia, Inês Ribeiro, João Macedo, Helder Peixoto, Diogo Martins, Zé Oliveira Martins, Luís Silva, Inês Garcia, Tiago Ribeiro, Joana Campos, Cátia Carneiro, Inês Pires, Gabriela Viana e Rafaela Sá, obrigada por todos os momentos partilhados, por todos os conselhos e por serem os parceiros de todas as horas que levarei sempre comigo. Obrigada por me terem deixado fazer parte da vossa história. Deixo também um agradecimento especial à minha melhor amiga, Carolina Queirós, que me acompanhou desde o infantário e que fez questão de estar sempre presente até agora. E como os últimos são sempre os primeiros, deixo aqui o agradecimento mais especial de todos para o meu pai, a minha mãe e o meu irmão, por toda a paciência, por todo o apoio, por toda a amizade e carinho. Tanto esta dissertação como tudo o que consegui até agora, são dedicados a vós que sóis a minha maior fonte de inspiração e a minha maior força. A todos vós MUITO OBRIGADA… Vemo-nos por aí!
v DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. Universidade do Minho, _____/_____/_________ Assinatura: 12 01 2021
vi RESUMO O ciclo de nutrientes e o fluxo de energia nos ecossistemas marinhos está fortemente relacionado com a população de fitoplâncton, uma vez que este se encontra na base da cadeia alimentar marinha. No entanto, em certas condições ambientais pode ocorrer a proliferação de algumas espécies de fitoplâncton produtoras de toxinas, chamadas de florescimento de algas nocivas, as quais podem afetar a cadeia alimentar marinha e, consequentemente, a saúde humana quando são consumidos produtos contaminados provenientes da aquacultura e pesca. Apesar de já existirem várias técnicas sensíveis para a identificação de espécies de fitoplâncton, especialmente a citometria de fluxo, estas ainda não permitem análises rotineiras, in-situ , de baixo custo e de forma automatizada. Assim, o objetivo desta dissertação assenta no desenvolvimento de uma plataforma Lab-on-a-chip para contagem de células de fitoplâncton de uma forma automatizada, a qual será futuramente integrada num citómetro microfluídico. A plataforma desenvolvida compreende um canal microfluídico para passagem individual das células pela zona de deteção, no qual está integrado um sensor de impedância fabricado com microeléctrodos em filme fino. O princípio de deteção deste sensor é baseado na tecnologia Resistive Pulse Sensing (RPS), onde a identificação de células é obtida a partir das variações da tensão provocadas pela passagem destas sobre os microeléctrodos. A melhor geometria e configuração dos microeléctrodos bem como dos microcanais foram estudadas através de simulações numéricas utilizando o software COMSOL Multiphysics . As configurações com melhores resultados foram fabricadas com recurso às microtecnologias e validadas experimentalmente. Para além disso, foi também implementada a eletrónica de atuação e leitura necessária para efetuar as medições elétricas, que compreende um circuito de excitação e um de amplificação. Os resultados experimentais permitiram observar alterações distintas na tensão com a passagem de partículas de diferentes tamanhos bem como com a passagem de diferentes células de fitoplâncton, demonstrando assim a viabilidade desta plataforma para ser integrada com um citómetro microfluídico. Palavras Chave: Espectroscopia de Impedância (EIS), Fitoplâncton tóxico, microfabricação, microfluídica, Resistive pulse sensing (RPS).
vii ABSTRACT The nutrient cycle and energy flow on marine ecosystems are strongly related to the phytoplankton population since they are the base of the marine food chain. However, under certain environmental conditions, the proliferation of some toxin-producing phytoplankton species may occur, called harmful algae blooms, which can affect the marine food chain and consequently, human health when contaminated products from aquaculture and fishing are consumed. Although there are already several sensitive techniques for the identification of phytoplankton species, especially flow cytometry, they still do not allow routine, in-situ, low-cost and automated analyses. Thus, the objective of this dissertation is to develop a Lab-on-a-chip platform for automated counting of phytoplankton cells, which in the future will be integrated with a microfluidic cytometer. The developed platform comprises a microfluidic channel for individual passage of cells through the detection zone, in which an impedance sensor made with thin film microelectrodes is integrated. The detection principle of this sensor is based on Resistive Pulse Sensing (RPS) technology, where the identification of cells is obtained from variations in electrical tension caused by their passage through microelectrodes. The best geometry and configuration of the microelectrodes as well as the microchannels, were studied by numerical simulations using the COMSOL Multiphysics software. The configurations with the best results were fabricated by microtechnologies and validated experimentally. In addition, the actuation and readout electronics necessary to perform the electrical measurements were also implemented, which comprises an excitation and an amplification circuit. The experimental results allowed to observe different changes in the tension with the passage of particles of different sizes as well as with the passage of different cells of the phytoplankton, demonstrating the viability of this platform to be integrated with a microfluidic cytometer. Keywords: Impedance Spectroscopy (EIS), Toxic phytoplankton, microfabrication, microfluidic, Resistive Pulse Sensing (RPS).
viii ÍNDICE 1.1 Enquadramento ................................................................................................................ 17 Técnicas microscópicas ............................................................................................. 18 Técnicas moleculares ................................................................................................ 19 Técnicas de HPLC ..................................................................................................... 20 Citometria de fluxo ..................................................................................................... 21 1.2 Motivação ......................................................................................................................... 21 1.3 Objetivos ........................................................................................................................... 22 1.4 Contribuições desta dissertação ........................................................................................ 23 1.5 Organização da dissertação ............................................................................................... 23 2.1 Plataformas microfluídicas para deteção de fitoplâncton .................................................... 25 2.2 Citómetro microfluídico ..................................................................................................... 26 2.3 Métodos de quantificação de células em dispositivos microfluídicos ................................... 26 Métodos magnéticos .................................................................................................. 27 Métodos óticos .......................................................................................................... 28 Métodos elétricos ...................................................................................................... 30 2.4 Conclusões ....................................................................................................................... 41 3.1 Constituição da plataforma microfluídica............................................................................ 44 3.2 Geometria e disposição dos elétrodos na plataforma microfluídica ..................................... 45 3.3 Simulações numéricas ...................................................................................................... 48
xv LISTA DE TABELAS Tabela 1. Diferentes métodos de deteção implementados na citometria de fluxo microfluídica (adaptado de [23, 27]) ...................................................................................................................................... 27 Tabela 2. Parâmetros utilizados nas simulações numéricas com dois elétrodos. .............................. 48 Tabela 3. Parâmetros utilizados nas simulações numéricas com três elétrodos. .............................. 52 Tabela 4. Parâmetros utilizados nas simulações numéricas com quatro elétrodos. .......................... 54
xvi LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E ACRÓNIMOS AC – Alternating Current (Corrente Alternada) ADC - Analogue-to-Digital Converter ADN - Ácido Desoxirribonucleico ARN - Ácido Ribonucleico Au – Ouro CAD – Computer-aided Design CCD – Charge - Coupled Device CMOS - Complementary Metal Oxide Semiconductor Cr – Crómio DC – Direct Corrent (Corrente Continua) EIS - Espectroscopia de Impedância Elétrica GMR - Giant Magneto-Resistive HABs - Harmful Algae Blooms HPLC - High Performance Liquid Chromatography IPMA - Instituto Português do Mar e da Atmosfera LOC - Lab-on-a-chip PCR - Polymerase Chain Reaction PDMS – Polidimetilsiloxano PIV - Particle Image Velocimetry PVD – Physical vapor deposition RC – Circuito Resistência – Condensador RPS – Resistive Pulse Sensing SU-8 - Éter glicídico de bisfenol A UV – Luz Ultra-Violeta
17 Capítulo 1 – Introdução INTRODUÇÃO Neste capítulo apresenta-se o enquadramento do presente trabalho, onde se evidencia a necessidade de sensores para a quantificação de células de fitoplâncton. Para além disso descrevem-se de forma sucinta os objetivos do trabalho proposto bem como a motivação para os alcançar. Por fim, são apresentadas as principais contribuições e a organização desta dissertação. 1.1 Enquadramento O fitoplâncton compreende um conjunto de organismos microscópicos aquáticos (tradicionalmente designados por algas) com um papel importante no ecossistema marinho, uma vez que são a base da cadeia alimentar marinha. Para além disso, são responsáveis por praticamente metade da produção de oxigénio ocorrida em todo o planeta sendo vital para manter o equilíbrio ambiental destes ecossistemas, contribuindo assim para que os organismos que nele habitam sobrevivam e se desenvolvam [1]. O fitoplâncton é composto por microrganismos unicelulares autotróficos com capacidade fotossintética que vivem em suspensão na coluna de água dos rios e oceanos, existindo numa ampla gama de tamanhos e com características variadas [2]. Devido à dependência da luz solar habitam na zona eufótica (zona superior da coluna de água), utilizando diversas estruturas ou mecanismos como flagelos, vacúolos de gás, aumento da relação área superfície/volume. O fitoplâncton abrange um conjunto de algas e cianobactérias diversificado do ponto de vista taxonómico, morfológico e fisiológico. A sua identificação taxonómica é complexa sendo baseada na morfologia celular, ornamentação, cor, reservas e pigmentos fotossintéticos. Existem milhares de espécies de fitoplâncton reconhecidas, mas apenas algumas dezenas possuem capacidade de produzir toxinas,
18 Capítulo 1 – Introdução sendo o grupo das diatomáceas e dos dinoflagelados os de maior relevância. Estas espécies, sob determinadas condições ambientais podem levar a um crescimento excessivo e atingir elevadas densidades provocando um fenómeno designado por florescimento de algas nocivas (do inglês Harmful Algae Blooms - HABs). As toxinas produzidas por estes grupos podem acumular-se em certos organismos, como peixes e moluscos, representando um elevado risco para a saúde humana, especialmente pelo consumo de produtos contaminados derivados das atividades de aquacultura ou piscatória [3]. Para além disso, contribuem para perdas económicas significativas, visto que ao ocorrer estes tipos de distúrbios, as autoridades proíbem a captura de espécies marinhas para consumo humano, prejudicando os setores marinhos (por exemplo aquacultura moluscos e peixes). Este tipo de ocorrências também acarreta prejuízos significativos no turismo e nas atividades relacionadas com a zona costeira. Por este motivo, a identificação e quantificação do fitoplâncton é essencial para salvaguardar a saúde humana bem como garantir o bom funcionamento das atividades marinhas. Assim, as técnicas de monitorização de fitoplâncton são uma grande necessidade para o estudo dos ecossistemas marinhos, de forma a ser possível desenvolver estratégias para compreender, prevenir e mitigar os impactos ambientais e económicos destas ocorrências [4, 5]. Diversos métodos têm sido utilizados para monitorização de fitoplâncton, tais como técnicas baseadas em microscopia, técnicas moleculares, cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC do inglês high performance liquid chromatography ) e citometria de fluxo. Técnicas microscópicas As técnicas microscópicas são os métodos mais utilizados para a identificação e enumeração de células de fitoplâncton, devido em grande parte, à sua simplicidade uma vez que esta técnica apenas requer um microscópio de alta qualidade. A quantificação de fitoplâncton através do uso do microscópio é feita pela contagem manual do número de células individuais de cada táxon de um determinado volume de amostra utilizando uma câmara de contagem colocada sob o microscópio. A identificação de espécies de fitoplâncton usando o microscópio é baseada em informações morfológicas e outros critérios visíveis, tais como: ornamentação, cor, reservas alimentares e pigmentos fotossintéticos, permitindo a sua identificação pelo taxonomista [3, 6]. As técnicas microscópicas podem ser complementadas pela utilização da florescência natural das espécies de fitoplâncton, utilização de marcadores de células ou dos seus organelos, bem como utilizando técnicas de análise de imagem para auxiliar a identificação das espécies de fitoplâncton. A
19 Capítulo 1 – Introdução fluorescência natural, produzida a partir dos pigmentos fotossintéticos, permite identificar por exemplo clorofila a, peridina, fucoxantina ou ficoeritrinas utilizando filtros de excitação e emissão característicos de cada pigmento permitindo assim a sua distinção. Para realizar esta técnica é essencial a utilização de um microscópio de alta qualidade que esteja equipado com uma fonte de luz, um conjunto de filtros óticos e objetivas apropriadas para a fluorescência [7]. A análise manual das espécies de fitoplâncton através do microscópio é demorada e por isso, têm sido desenvolvidas técnicas automatizadas para análise de imagens utilizando padrões de reconhecimento que permitem a identificação automática de algumas espécies [7]. Uma das grandes limitações das técnicas de microscopia é a necessidade de taxonomistas com elevado grau de conhecimento e experiência na identificação das espécies, e por isso esta técnica é muito suscetível à ocorrência de erros provenientes da má interpretação humana. Para além disso, utiliza procedimentos demorados desde a recolha, preservação e transporte da amostra até ao laboratório, bem como exige longos tempos de análise. Esta demora pode ser uma grande desvantagem, especialmente quando são necessárias medidas preventivas para reduzir atempadamente o impacto dos HABs. A contagem microscópica normalmente requer um mínimo de 500 células de uma única amostra, o que se traduz num processo de contagem com duração de várias horas. Devido ao longo tempo de análise, é necessário que as amostras sejam preservadas para análise posterior, o que pode levar a ocorrência de artefactos ou perda de pigmentos que poderiam ser úteis na identificação de espécies. Esta técnica em termos de resolução não é muito adequada para espécies que tenham tamanho inferior a 3 µm. Para além disso, a utilização desta técnica está restrita apenas para utilização em laboratório [8, 9]. Técnicas moleculares Devido a algumas dificuldades e limitações das técnicas de identificação morfológica foram desenvolvidos métodos alternativos para o estudo de fitoplâncton, tais como as técnicas moleculares. Estas técnicas apresentam potencial para análises mais rápidas e precisas, explorando as diferenças genéticas das espécies, em vez das diferenças morfológicas [7, 10]. Métodos de hibridação in-situ [utilização de oligonucleóticos de ácido desoxirribonucleico (ADN) ou de ácido ribonucleico (ARN)] e ensaios baseados em reação em cadeia da polimerase (PCR) têm sido abordagens moleculares utilizadas na identificação de espécies de fitoplâncton. Os oligonucleóticos e os primers de PCR são fragmentos curtos de ADN ou ARN sintéticos que são complementares ao ADN/ARN do fitoplâncton. A sequenciação molecular de células de fitoplâncton dá informações sobre as sequências
20 Capítulo 1 – Introdução de ADN específicas de muitas espécies de todo o mundo, permitindo assim a conceção de sondas de oligonucleóticos e primers de PCR específicas e que permitem a identificação das espécies de fitoplâncton. Por norma as sondas de oligonucleóticos que hibridizam com ADN ou ARN complementar possuem marcadores fluorescentes, permitindo a identificação direta por microscopia de florescência. A especificidade dos primers utilizados em PCR permitem a amplificação de sequências de ADN/ARN específicas das células de fitoplâncton. Os fragmentos de ADN amplificados são quantificados, indicando assim a concentração de fitoplâncton de cada espécie [7]. As análises moleculares mostraram ser bastante precisas e permitem uma identificação ao nível da espécie, mas requerem equipamentos, pessoas e laboratórios especializados, e para além disso, exigem um conhecimento elevado da diversidade genética de fitoplâncton de uma certa região. Técnicas de HPLC A técnica de cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC) é utilizada na separação, identificação e quantificação de pigmentos fotossintéticos fornecendo informações relativamente à biomassa, composição e ao estado fisiológico do fitoplâncton. A técnica de HPLC não fornece informação taxonómica com a precisão da técnica microscópia, mas é mais rápida e produz resultados extremamente reprodutíveis. Para além disso, deteta grupos taxonómicos de fitoplâncton com dimensões reduzidas. Este método inicia-se com um processo de extração dos pigmentos fotossintéticos presentes no fitoplâncton seguido por um passo de filtração para remover os restantes detritos celulares. Os pigmentos extraídos são separados por cromatografia e identificados a partir dos espetros de absorção ou de fluorescência e dos respetivos tempos de retenção. A concentração de cada pigmento é calculada a partir de sinais obtidos pelos fotodetetores comparando com pigmentos standards . Esta técnica requer processos de calibração complexos que são feitos em duas fases. Na primeira fase é feita a otimização do ensaio e obtenção dos tempos de retenção de cada pigmento a ser analisado. Na segunda fase é feita a calibração da resposta do fotodetetor (absorção e fluorescência) utilizando pigmentos standards . Estes processos de calibração são também limitados pelos pigmentos fotossintéticos standards que estão disponíveis comercialmente e para além disso só pode ser realizado em laboratórios com pessoal altamente qualificado [7, 10–12].
21 Capítulo 1 – Introdução Citometria de fluxo A técnica de citometria de fluxo permite a quantificação e discriminação de células de fitoplâncton com elevada precisão de uma forma rápida e automática. Esta técnica baseia-se na medição dos sinais de fluorescência (natural ou induzida) e da dispersão da luz de uma célula de fitoplâncton em suspensão que passa individualmente através da zona de deteção (inclui fonte de luz normalmente composta por um ou vários lasers). As informações fornecidas por esta técnica (sinais de fluorescência e da luz dispersa), permitem indicar simultaneamente a composição intrínseca de pigmentos bem como o tamanho, forma e complexidade das células. Esta tecnologia é bastante robusta para identificar populações de fitoplâncton com medidas < 2 μm, que são muito difíceis de identificar por técnicas convencionais [2, 7]. Com o objetivo de obter instrumentos automáticos de classificação e identificação de fitoplâncton, os citómetros convencionais foram combinados com tecnologias de imagem para analisar características morfológicas, características gray scale (intensidade, transparência, informações de cor, etc) e características espectrais (área e largura do pico de fluorescência). Ao mesmo tempo, têm sido desenvolvidos softwares de análise de imagem para combinar toda a informação e identificar automaticamente as células de fitoplâncton. Alguns dispositivos de citometria de imagem, desenvolvidos para identificação in-situ de fitoplâncton, são os FlowCamTM ( Fluid Imaging Technologies ), CytoSense/CytoSub (CytoBuoy b.v., NL) e FlowCytobot ( McLane Research Laboratories ). No entanto estes dispositivos ainda são muito pesados e muito caros, o que limita bastante a sua utilização rotineira [13]. 1.2 Motivação A monitorização de fitoplâncton (abundância, composição e diversidade da comunidade) é essencial para proteção da saúde dos ecossistemas aquáticos, para garantir a segurança alimentar e para proteger a saúde humana. Apesar de existirem vários métodos para a identificação de fitoplâncton com elevada sensibilidade, estes ainda não permitem utilização em programas de monitorização rotineira devido ao seu elevado custo, elevado consumo de tempo e reagentes e de necessitarem de recursos humanas altamente treinados. Assim surgiu a ideia de criar versões miniaturizadas dos citómetros de fluxo com possibilidade de serem transportados em boias marinhas ou em veículos subaquáticos.
22 Capítulo 1 – Introdução Embora tenham superado a lacuna de análises in situ , ainda são limitadas pela disponibilidade, tamanho, custo e complexidade dos equipamentos. Nos últimos anos, os avanços verificados nas tecnologias de microfabricação [14] e microfluídica levaram ao desenvolvimento de plataformas lab-on-a-chip (LOC) sofisticadas, portáteis e baratas com reduzido consumo de reagentes e energia, e capazes de operar autonomamente em qualquer ambiente. Para além disso, podem facilmente integrar vários métodos de deteção, permitindo analisar um elevado número de amostras num reduzido período e sem necessidade de pessoal altamente especializado. As vantagens destas tecnologias podem ajudar a colmatar algumas das limitações mencionadas anteriormente e permitir desenvolver uma plataforma LOC portátil, precisa e pequena, para identificação e quantificação de fitoplâncton, capaz de operar autonomamente em áreas remotas e submersas por vários meses, fornecendo análise em tempo real dos ecossistemas. O desenvolvimento de um LOC baseado nas tecnologias da citometria de fluxo com microeletrónica de controlo e leitura, promete uma plataforma de monitorização de fitoplâncton com enorme impacto em várias áreas, especialmente na segurança alimentar, gestão sustentável, controlo da poluição e de qualidade da água, entre outros. Estes avanços, levaram ao desenvolvimento de detetores à microescala integrados em citómetros microfluídicos que têm sido aplicados na contagem de células bem como na identificação de diferentes tipos de células sem necessidade de qualquer marcação. Apesar destes avanços, estas tecnologias ainda não fornecem plataformas baratas, portáteis, automatizadas e de fácil integração. Assim estas limitações motivaram o trabalho desta dissertação, que consiste no desenvolvimento de uma plataforma LOC portátil e eficaz para a quantificação de células de fitoplâncton, fornecendo um benefício considerável na análise em tempo real do ecossistema [15]. Esta funcionalidade irá futuramente ser integrada num citómetro microfluídico com múltiplas funcionalidades que vão desde a contagem com o sistema desenvolvido à análise ótica dos principais pigmentos fotossintéticos presentes no fitoplâncton. A combinação das informações fornecidas por ambas as tecnologias (elétricas e óticas) permitirão identificar fitoplâncton ao nível da espécie, com indicação da presença ou ausência de espécies tóxicas. 1.3 Objetivos Esta dissertação tem como principal objetivo o desenvolvimento de um LOC para quantificar células de fitoplâncton, o qual será futuramente incluído num citómetro microfluídico para identificação de espécies de fitoplâncton. O dispositivo proposto será capaz de fornecer informações sobre o tamanho da célula de fitoplâncton a partir das medições elétricas, quando estas passam individualmente pela
23 Capítulo 1 – Introdução zona de deteção no canal microfluídico. O princípio de medição baseia-se na tecnologia Resistance Pulse Sensor (RPS) utilizando microeléctrodos em filme fino. Para além disso, esta dissertação tem como objetivo a realização de simulações numéricas para encontrar as geometrias ótimas dos microcanais e dos microeléctrodos a serem integrados na plataforma microfluídica, de forma a obter a máxima sensibilidade para a gama de tamanho normalmente encontrada nas espécies de fitoplâncton (com comprimentos compreendidos entre os 2 µm e os 160 µm e larguras entre os 0,5 µm e os 60 µm). Nesta dissertação também tem como objetivo implementar a eletrónica de atuação e leitura para o sistema de contagem a ser integrado no LOC. 1.4 Contribuições desta dissertação Este trabalho pretende incrementar as funcionalidades dos sistemas de monitorização de fitoplâncton, especialmente na capacidade de quantificar células de tamanho reduzido com um dispositivo sensível e de baixo custo. Esta funcionalidade irá complementar as informações fornecidas pelos citómetros microfluídico e para além disso, podem funcionar como um sistema on/off de baixo consumo para ativar as tecnologias mais exigentes (aquisição de imagem ou medições óticas) e evitar que estejam continuamente ligadas. 1.5 Organização da dissertação A presente dissertação encontra-se divida da seguinte forma: • Capítulo 1 resume os principais objetivos e motivações do presente trabalho bem como o seu enquadramento. • Capítulo 2 apresenta um levantamento bibliográfico dos principais conceitos que envolvem o desenvolvimento desta dissertação, passando pela exploração dos métodos de contagem de células, com especial enfâse nos sistemas integrados em dispositivos microfluídicos. • Capítulo 3 inclui as simulações numéricas desenvolvidas para encontrar a melhor configuração dos microeléctrodos bem como do canal microfluídico. Apresenta ainda o processo de fabrico detalhado de toda a plataforma microfluídica. • Capítulo 4 descreve a eletrónica de atuação e leitura desenvolvida.
24 Capítulo 1 – Introdução • Capítulo 5 descreve os testes experimentais para validação da plataforma, os resultados obtidos e sua discussão. • Capítulo 6 apresenta as principais conclusões bem como algumas sugestões para o desenvolvimento de trabalho futuro.
31 Capítulo 2 – Revisão da Literatura Figura 4. Ilustração de um contador capacitivo integrado em dispositivos microfluídicos (adaptado de [23]). Este tipo de tecnologia é bastante útil para detetar partículas em soluções de baixa condutividade elétrica dado que a alteração da resistência elétrica provocada pela passagem de partícula em meios de baixa condutividade é difícil de detetar. Por outro lado, em meios com elevada condutividade, como o meio marinho, a medição de impedância é o método mais indicado [23]. 2.3.3.2 Resistive pulse sensing (RPS) RPS é o termo genérico dado à tecnologia que é utilizada na contagem e dimensionamento de partículas baseada no princípio de Coulter . Este princípio foi descoberto por Wallace H. Coulter e seu irmão no final da década de 1940, desenvolvendo uma tecnologia para contar e dimensionar partículas através da medição das variações de corrente elétrica. A tecnologia foi desenvolvida principalmente para contar células sanguíneas de uma forma rápida através da medição das mudanças na condutividade elétrica, à medida que as células suspensas num fluido condutor passam por um pequeno orifício [32], sendo esta a aplicação mais bem-sucedida e importante do princípio de Coulter . A técnica tem sido utilizada para diagnosticar uma variedade de doenças, sendo o método de referência para contagem de glóbulos vermelhos e leucócitos. O princípio de Coulter tem a capacidade de produzir um perfil detalhado das células do sangue dos pacientes com capacidade para discriminar e contar células com diâmetros de aproximadamente 6 a 10 µm [33]. Para além disso, este método também se mostra como o método de laboratório mais confiável para a contagem de uma grande variedade de células: bactérias (< 1 µm de tamanho), células de gordura (aproximadamente 400 µm), agregados de células vegetais (> aproximadamente 1200 µm) e células tronco (aproximadamente 900 µm) [33–35]. O sucesso desta tecnologia fez com que o principio de Coulter fosse adaptado à micro e nanoescala em combinação com canais micro e nanofluídicos [36–38]. A técnica RPS, encontra-se amplamente na indústria [21], para efetuar a contagem e o dimensionamento de partículas. A deteção baseia-se na passagem de partículas através de um canal
32 Capítulo 2 – Revisão da Literatura onde se aplica uma tensão elétrica constante, como pode ser visualizado na figura 5 a). O movimento da partícula sobre os elétrodos, bloqueia o fluxo de corrente causando uma variação cuja intensidade é proporcional ao volume da partícula que atravessa o canal. As partículas que atravessam o canal são más condutoras, alterando as propriedades de condução elétrica. Se estas partículas forem menos condutoras que o líquido circundante (eletrolítico), a resistência elétrica aumenta, fazendo com que a intensidade de corrente elétrica diminua. O número de pulsos detetados durante a medição corresponde ao número de partículas e a amplitude do pulso é proporcional ao tamanho de partículas, como se pode comprovar pela figura 5 b) [33, 35, 39]. Figura 5. (a) Representação esquemático do método RPS. (b) Pulsos da corrente elétrica, causados pela passagem das partículas (adaptado de [39]). A técnica RPS só é possível ser aplicada se forem cumpridos alguns requisitos, nomeadamente, as partículas devem ser suspensas num líquido condutor, o campo elétrico deve ser fisicamente restrito para que o movimento de partículas cause mudanças detetáveis na corrente e por último, as partículas devem estar suficientemente diluídas e distribuídas pelo canal, para que apenas uma partícula passe pela zona de deteção, impedindo a coincidência de pulsos elétricos [35, 39]. As primeiras experiências com RPS foram realizadas em corrente continua (DC do inglês direct current ) mas essa configuração foi recentemente substituída por AC de baixa frequência de forma a minimizar efeitos eletroquímicos adversos, nomeadamente a alteração do pH, geração de bolhas de gás por eletrólise e polarização de elétrodos. A polarização dos elétrodos pode provocar o aumento da resistência elétrica no canal provocando problemas ao nível da sensibilidade [36, 38]. Assim, a medição em AC melhora significativamente o método RPS, diminuindo a resistência de polarização dos elétrodos, e suprimindo todos os problemas mencionados nas medições em DC [36, 38].
33 Capítulo 2 – Revisão da Literatura O sistema de medição AC tem de ter no mínimo dois elétrodos, um elétrodo é responsável pela excitação, através de uma tensão AC, e o outro elétrodo é o de gravação, utilizado para medir as alterações de corrente. Com esta configuração é possível obter sinais unipolares (Figura 6 a)) [21]. Já numa configuração em que existe dois elétrodos de gravação e um elétrodo de excitação, ou seja três elétrodos, é possível obter sinais bipolares (Figura 6 b)) [21]. Figura 6. Abordagens típicas de medição elétricas em AC. (a) Medições em AC com dois elétrodos. (b) Medições com três elétrodos em AC (adaptado de [21]). Os sinais bipolares são fornecidos por um amplificador diferencial que subtrai os sinais dos elétrodos. O sinal obtido é mais seguro na deteção de partículas, acontecendo menos deteções falsas, em comparação com o caso dos sinais unipolares. Se as partículas forem expostas a uma frequência AC baixa e média, a propriedade isolante da membrana celular e o comportamento resistivo, manifestamse para frequências abaixo de 1 MHz, sendo possível obter informações sobre o tamanho e volume da célula [40]. Para frequências acima de 1 MHz, a corrente começa a penetrar na membrana da célula e a condutividade do citoplasma começa a dominar, sendo indicado para investigar a permeabilidade e espessura das membranas celulares, condutividade do citoplasma e organelos celulares, informações que normalmente não são obtidas pelo o método de deteção RPS tradicional [40, 41]. Assim sendo, a frequência deve ser cuidadosamente determinada, tendo em conta o design do chip e para que finalidade este servirá, uma vez que diferentes frequências geram diferentes informações. Os elétrodos utilizados nestes sistemas podem ser dispostos de várias formas no dispositivo microfluídico, nomeadamente em configurações coplanares ou paralelas em diferentes planos. As configurações de face paralela têm elétrodos na parte superior e inferior do canal, exigindo assim elétrodos em dois substratos separados e que a ligação seja alinhada [42]. Por outro lado, as configurações coplanares são atraentes, pois podem ser facilmente modelados para dimensões mais
34 Capítulo 2 – Revisão da Literatura pequenas, produzindo dispositivos miniaturizados e de baixo custo, para além de serem mais simples de fabricar [42]. O número de elétrodos e o tipo de tensão (AC/DC) que deve ser aplicada, também são parâmetros a considerar. Deste modo, a combinação de três elétrodos coplanares e a aplicação de uma tensão AC no elétrodo central com medição nos elétrodos laterais (Figura 7), apresenta-se como o sistema de medição mais robusto [36–38]. Dessa robustez faz parte a facilidade em discriminar os pulsos que representam a passagem de células e facilidade do fabrico dos elétrodos, sendo capaz de fornecer uma boa resposta. Figura 7. (a) Deteção Típica por RPS numa plataforma microfluídica. (b) Distribuição das linhas do campo elétrico. (c) Esquemático de três elétrodos (adaptado de [21]). A passagem de uma partícula é registada por um par de picos opostos. A corrente diferencial (IDiff) atinge a sua variação máxima quando a partícula está aproximadamente a meio entre o elétrodo da esquerda e o elétrodo central (Figura 7 b), Figura 8), onde o campo elétrico é superior [42]. Figura 8. Sinais gerados por uma partícula que passa pela zona de deteção do dispositivo em três alturas diferentes: próximo aos elétrodos (curva 1), pelo meio do canal (curva 2) e próximo do topo do canal (curva 3) (adaptado de [42]). A amplitude do sinal é uma medida influenciada pelo volume da partícula, no entanto, a intensidade do campo elétrico diminui com a distância das partículas aos elétrodos (Figura 8). Assim, partículas idênticas ao deslocarem-se próximas aos elétrodos (curva 1), no meio do canal (curva 2) ou
35 Capítulo 2 – Revisão da Literatura próximo do topo do canal (curva 3), produzem picos de amplitude mais altos, médios ou baixos, respetivamente (Figura 8) [42]. Para ajustar os sinais diferenciais foi utilizado um modelo gaussiano bipolar (𝑠(𝑡)) (Figura 9), que permite extrair as amplitudes dos pulsos, obtendo o modelo: Com, 𝑔 ± (𝑡)=−(𝑡 − (𝑡𝑐±(𝛿/2) ))2 2𝜎2 (2) Este modelo depende de alguns parâmetros: pulsos gaussianos, 𝑔(𝑡); tempo central, 𝑡𝑐; tempo de transição, δ; largura do pulso, σ; e a amplitude do pico, a (Figura 9). A raiz cúbica do valor de amplitude do pico, dá uma estimativa do diâmetro da partícula (D): 𝐷 = 𝐺√𝑎 3 (3) onde G é o fator de ganho que depende da geometria do chip , da condutividade do buffer e da impedância dos elétrodos, no caso da figura 7 a) e figura 7 b) o G = 10.5 µm/µA1/3. No entanto, a estimativa D (referida como “diâmetro elétrico”) sofre uma questão de dependência posicional, tornam-se maior para a curva 1 do que para as curvas 2 e 3 (Figura 7 a) e Figura 8) [42, 43]. Figura 9. Modelo Gaussiano Bipolar usado para ajustar os sinais diferenciais (adaptado de [42]). O tempo de transição δ, pode ser usado para estimar a velocidade da partícula , ou também conhecida por “velocidade elétrica”[43]: 𝑠(𝑡)= 𝑎[𝑒𝑔+(𝑡)− 𝑒𝑔−(𝑡)] , (1)
36 Capítulo 2 – Revisão da Literatura 𝑣 = 𝐿 𝛿 , (4) onde L é a distância pico a pico dos sinais diferenciais (Figura 8), compreendendo o espaçamento de um elétrodo ao outro elétrodo (Figura 7 b)). As velocidades das partículas refletem a posição da partícula no canal, ou seja, uma partícula que viaja próxima aos elétrodos, vai-se mover muito mais lentamente do que uma partícula que viaje no centro. Isto acontece, porque a partícula ao viajar próxima dos elétrodos está mais sujeita à existência de atrito entre a partícula e a parede do canal onde se encontram os elétrodos, levando a uma diminuição da velocidade, situação que não acontece quando a partícula flui no meio do canal. As partículas que viajam próximas dos elétrodos produzem pulsos mais estreitos do que as partículas que viajam longe dos elétrodos. Isto sugere que o parâmetro de forma (σ/δ) , ou seja, o controlo da largura do pulso (σ) pelo tempo de transição (δ), pode levar à determinação exata da posição da partícula no canal [42]. O comportamento enunciado anteriormente é contrário em relação ao que acontece com o diâmetro da partícula (Figura 7 a), Figura 7 b) e Figura 8), isto porque quanto maior for a partícula menor vai ser a velocidade que ela vai ter dentro do canal, podendo ser um dos influenciadores desta [42]. O trabalho realizado por Vito Errico et al. (2017) [42] permitiu demonstrar que a posição da partícula no canal pode ser determinada. Para isso, foi utilizada uma esfera de poliestireno com dimensões de 6 µm suspensa numa solução salina. A esfera foi passando pela zona de deteção, para que fosse detetado o seu comportamento, tal como se encontra representado na figura 10 nas três posições do canal [no topo do canal (figura 10 a)), no meio do canal (figura 10 b)) e próximo dos elétrodos (figura 10 c))] [42]. Os eventos a), b) e c) representados na figura 10 para a esfera de 6 µm, apresentam um diâmetro elétrico de 5,1, 7,2 e 8,3 µm respetivamente, e o parâmetro de forma (σ/δ) é de 0,26, 0,23 e 0,20 respetivamente. Assim sendo, a posição da partícula no canal pode influenciar negativamente a determinação exata do tamanho da partícula. No gráfico da figura 10 d) é possível confirmar que a correta determinação das dimensões da partícula (para um diâmetro elétrico de 6 µm), implica que estas apresentem um parâmetro de forma entre os 0,25 e os 0,27, situação que é verificada quando a partícula passa mais próxima do topo do canal [evento a) com um parâmetro de forma de 0.26]. Quando a partícula passa na zona intermédia do canal ou na zona mais próxima aos elétrodos, apresenta um diâmetro elétrico de 7,2 e 8,3 µm e o seu parâmetro de forma já deve ser 0,23 ou 0,2, respetivamente. A aplicação desta metodologia permite compensar os erros provenientes da distância da partícula aos elétrodos.
37 Capítulo 2 – Revisão da Literatura Figura 10. (a), (b) e (c) Comportamento da esfera de 6 µm nas três posições do canal. (d) Comparação do diâmetro elétrico e do parâmetro de forma para a esfera de 6 µm (adaptado de [42]). Um outro trabalho descrito por Yongxin Song et al. (2017) [36], mostra a influência da condutividade do meio na resposta do sensor, onde constatou que na presença de soluções iónicas com elevada condutividade são obtidos pulsos de amplitude maior quando comparado com soluções iónicas de baixa condutividade (figura 11) [36]. Figura 11. Exemplo de um sistema microfluídico com RPS (adaptado de [36]). Para além disso, este estudo demonstrou que o comprimento e largura das partículas também influenciam o campo elétrico onde a partícula passa, originando pulsos resistivos maiores ou menores, dependendo da capacidade que a partícula tem para interromper o campo elétrico circundante [36]. A interferência que existe entre a partícula e o eletrólito vai influenciar a magnitude e a duração do sinal de
38 Capítulo 2 – Revisão da Literatura RPS detetado. Na figura 12 é evidenciada a interferência da partícula no campo elétrico a que esta é submetida [36]. Figura 12. Interferência da partícula no campo elétrico (adaptado de [36]). Com as informações apresentadas anteriormente, pode-se afirmar que a posição das partículas no canal, a sua geometria e a condutividade do meio são parâmetros a considerar para que a técnica RPS seja capaz de dar informações sobre o número de partículas ou células bem como do seu tamanho de uma forma precisa e confiável. Das técnicas descritas anteriormente, o RPS têm sido o mais utilizada em citómetros de fluxo microfluídicos devido a sua simplicidade de implementação e integração, custo reduzido, pequenas dimensões e não necessita de pessoas altamente qualificadas para o seu manuseamento. Assim sendo, devido às vantagens apresentadas anteriormente, nesta dissertação será integrado o método de deteção elétrico por RPS, levando a criação de um dispositivo RPS de excitação AC. 2.3.3.3 Espectroscopia de impedância elétrica Recentemente, a técnica RPS têm sido implementada com a aplicação de tensão AC nos elétrodos, sendo normalmente designada de EIS (Espectroscopia de Impedância Elétrica). Os princípios por detrás desta técnica são muito semelhantes ao RPS, distinguindo-se apenas na aplicação de tensões de excitação AC em múltiplas frequências para ser possível realizar a monotorização simultânea da impedância numa medição de alta resolução e de alta qualidade de sinal [41, 44, 45]. Esta técnica, apesar de ser mais complexa, é mais segura para efetuar as medições das propriedades das células, visto que a probabilidade de ocorrência de erros nas medições é mais baixa. Futuramente pretende-se combinar esta técnica com o dispositivo que será desenvolvido. Na figura 13 está representada a forma como são realizadas as medições das propriedades eletrofisiológicas das células, quando estas passam pela zona de deteção.
39 Capítulo 2 – Revisão da Literatura Figura 13. Representação esquemática das propriedades elétricas envolvidas na medição por EIS (adaptado de [48]). Tal como na técnica RPS, para efetuar a EIS, é necessário aplicar várias frequências de excitação AC a um par de elétrodos, o que faz com que a corrente flua entre eles. A mudança de corrente provocada pela passagem da célula ou partícula entre os elétrodos é medida e analisada para determinar as propriedades das células. As frequências que devem ser aplicadas são na gama dos kHz a MHz [46, 47]. Na figura 13, 𝑍𝑒𝑙, 𝑍𝑟𝑒𝑓𝑒𝑙, e 𝑍𝑠𝑜𝑙𝑛 representam respetivamente, a impedância que existe entre o elétrodo e o eletrólito, a impedância do elétrodo de referência e a resistividade do eletrólito [48–50]. A impedância pode ser obtida através da razão entre a tensão aplicada aos elétrodos para estimulação, 𝑉𝑠𝑡𝑖𝑚, e a corrente de deteção que flui através do elétrodo, 𝐼𝑠𝑒𝑛𝑠𝑒, segundo a equação 5: A corrente de deteção, 𝐼𝑠𝑒𝑛𝑠𝑒, é influenciada por três correntes diferentes, 𝐼𝑐𝑒𝑙𝑙, 𝐼𝑠𝑒𝑎𝑙 e 𝐼𝑠𝑝𝑟𝑒𝑎𝑑 (figura 13). A corrente 𝐼𝑐𝑒𝑙𝑙, é a que passa através da célula até ao elétrodo. A impedância deste caminho pode ser modelada através da utilização de um paralelo entre um condensador e uma resistência de carga, localizada entre a superfície da membrana da célula (𝐶𝑚1 e 𝑅𝑐ℎ1) em série com outra combinação paralela (𝐶𝑚2 e 𝑅𝑐ℎ2), que faz a ligação para o resto da membrana celular que está em contacto com solução. A corrente 𝐼𝑠𝑒𝑎𝑙, é a corrente que passa entre o espaço livre entre a célula e o elétrodo. Quando |𝑍|=|𝑉𝑠𝑡𝑖𝑚| |𝐼𝑠𝑒𝑛𝑠𝑒| (5)
40 Capítulo 2 – Revisão da Literatura a célula se encontra sobre a superfície do elétrodo esta corrente diminui, e todas as correntes de deteção passam pela célula. Por fim, a corrente 𝐼𝑠𝑝𝑟𝑒𝑎𝑑, é a corrente que se espalha através do eletrólito a partir do elétrodo de referência até á área do elétrodo de medição que não é coberta pela célula. Se a célula cobrir completamente o elétrodo está corrente vai tender para zero [48, 50]. Figura 14. Esquemático da eletrónica implementada para leitura dos valores de impedância (adaptado de [48]). Na figura 14 está representada a eletrónica que foi implementada para efetuar a medição dos valores da impedância em magnitude e fase. Estes são obtidas recorrendo a um Lock-in amplifier , dado que conseguem detetar impedâncias numa gama de frequências de 1Hz a 1 MHz, em simultâneo. O sinal de corrente, 𝐼𝑠𝑒𝑛𝑠𝑒, obtido é convertido em tensão através de um amplificador de transimpedância e misturado, com recurso ao Lock-in amplifier , com sinais de referência aplicados pelo gerador de sinais. No final, o sinal é filtrado usando um filtro passa baixo para desmodular o sinal e retirar todas as componentes do sinal que tem ordem superior [47, 49]. O trabalho desenvolvido por Tao Sun et al (2010) [35] (figura 15) demonstrou com sucesso a aplicação da tecnologia EIS para determinar o tamanho de células dentro de canais microfluídicos [34, 35].
47 Capítulo 3 – Otimização e fabrico da plataforma microfluídica os elétrodos e ainda a posição da partícula no canal. É visível que estes fatores alteram as formas das curvas, e consequentemente alteram a forma de deteção. A principal vantagem da utilização do COMSOL Multiphysics é justificada pela facilidade de implementação de vários fenómenos, conseguindo sempre aproximar o modelo daquilo que se pretende desenvolver. A simulação realizada iniciou-se com a seleção da melhor geometria dos microeléctrodos e do canal bem como pela definição dos materiais para cada parte da estrutura. Os materiais definidos na simulação foram: polidimetilsiloxano (PDMS) para o canal microfluídico, vidro para o substrato e filme fino de crómio/ouro (Cr/Au) para os elétrodos, dado que são os materiais utilizados na microfabricação do dispositivo. Para além disso, foi ainda adicionado ao canal microfluídico água salgada, fazendo-se assim uma aproximação daquilo que se pretende ter na prática, visto que as partículas/espécies vão estar em ambiente marinho. Para isso, foi definido no COMSOL Multiphysics a condutividade elétrica do fluído de 5,3 S/m [52], correspondendo a condutividade típica da água do mar para uma concentração de sal de aproximadamente 35g/L [53]. A condutividade elétrica pode sofrer alterações devido ao número de iões dissolvidos e com a mobilidade destes bem como com variações de temperatura. Apesar disso, considerou-se que a concentração de sal se mantém constante e que não existe variações de temperaturas relevantes. Também foi alterada a permeabilidade relativa para 80% [51], tornando a solução altamente condutora. Na simulação foram ainda incluídos os microeléctrodos de ouro com espessura de 120 nm e as partículas de poliestireno com raios de 6 e 9 µm, para assim ser possível o estudo do comportamento global do sistema. As simulações foram realizadas com dois, três e quatro elétrodos. Para efetuar estas simulações tiveram de ser definas físicas que nos ajudassem a registar os resultados. Os módulos de física simulados foram o Laminar Flow , que basicamente define os limites por onde vai circular o fluído a uma velocidade constante de 10 µm/s, e a Electric Currents que é utilizada para definir todo o potencial elétrico que existia ao longo da estrutura. De forma a minimizar os problemas inerentes à corrente contínua (polarização dos elétrodos, acumulação de iões, formação de capacidade entre os elétrodos e o meio que podem levar à rutura dos elétrodos), foi aplicada uma tensão AC. Para além disso, a frequência bem como o valor de tensão elétrica aplicada são dois fatores muito importantes no funcionamento do dispositivo. Normalmente para soluções com baixa condutividade utilizam-se baixas frequências, entre os 100 Hz e os 10 kHz, e para altas condutividades utilizam-se frequências mais elevadas, entre 1 kHz e 1MHz. Desta forma, na definição da física dos elétrodos foi atribuída uma onda sinusoidal de tensão AC de 1,5V a uma frequência de 80 kHz. Em relação às partículas, o COMSOL Multiphysics disponibiliza na definição das físicas, a possibilidade de colocar partículas a passar no fluído. Essa física foi aplicada, mas os resultados obtidos
48 Capítulo 3 – Otimização e fabrico da plataforma microfluídica não foram os melhores. A solução encontrada para este problema foi o desenho da própria partícula, definindo-se a sua geometria (esfera), com uma membrana isolante de condutividade elétrica de 2 µS/m com uma permeabilidade relativa de 5 % e um interior com uma condutividade elétrica de 0,0015 µS/m e permeabilidade relativa de 2,55 %, de forma a fazer-se uma aproximação às partículas utilizadas na prática [51]. 3.3 Simulações numéricas De acordo com o que foi mencionado anteriormente, foram realizadas simulações para estudar os fatores que influenciam a interação de uma partícula com os elétrodos nomeadamente, o espaçamento entre os elétrodos bem como a sua largura, tamanho e posição da partícula no canal. O espaçamento escolhido para colocar entre os elétrodos foi de 10 e 20 µm, a largura foi de 20 e 30 µm, o tamanho da partícula variou entre 6 e 9 µm de raio (tamanho aproximado à maioria das células de algas) e a posição da partícula foi de 1 e 2 µm em relação aos elétrodos. Foram realizadas várias simulações, mas apenas foram apresentadas as com melhores resultados. Simulação com dois elétrodos Na tabela 2 estão representados os parâmetros que foram estudados por simulação para a configuração com dois elétrodos. As que apresentaram o melhor desempenho encontram-se destacadas a vermelho. Tabela 2. Parâmetros utilizados nas simulações numéricas com dois elétrodos. Parâmetros Dois Elétrodos Partícula de 6 µm de raio Dimensões dos Elétrodos (largura/espaçamento) 30/10 µm 30/10 µm 30/20 µm 30/20 µm Posição da Partícula 1 µm 2 µm 1 µm 2 µm Partícula de 9 µm de raio Dimensões dos Elétrodos (largura/espaçamento) 30/10 µm 30/10 µm 30/20 µm 30/20 µm Posição da Partícula 1 µm 2 µm 1 µm 2 µm
49 Capítulo 3 – Otimização e fabrico da plataforma microfluídica Figura 21. Interface gráfica com dois elétrodos e a partícula de 6 µm de raio, posicionada a 1 µm de distância dos elétrodos. As simulações iniciaram-se com dois elétrodos onde um dos elétrodos foi alimentado com uma tensão AC de 1,5V e outro foi definido como ground . Na figura 21 está representada a interface gráfica com uma das configurações simuladas que inclui dois elétrodos com 30 µm de largura e um espaçamento de 10 µm. É importante frisar que o canal microfluídico tem uma altura de 25 µm (comum em todas as simulações), a partícula tem um raio de 6 µm e está a passar no canal microfluídico a uma distância de 1 µm dos elétrodos. Após a definição das físicas necessárias, que neste caso foi colocar o fluido a passar no canal microfluídico com a velocidade constante (10 µm/s) ( Laminar Flow ) e colocar potencial nos elétrodos ( Electric Currents ), foram feitos estudos estacionários onde se interligaram as físicas, de forma conseguirse estudar o comportamento de toda a plataforma microfluídica, depois de lhe serem atribuídas condições semelhantes as que irão ocorrer num ambiente real. O COMSOL Multiphysics disponibiliza ferramentas poderosas de visualização e pós-processamento apresentando os resultados de uma forma interativa, ou seja, é possível visualizar praticamente qualquer variável de interesse relacionada com os resultados da simulação. Estes recursos de visualização incluem, por exemplo, a geração de gráficos que se torna muito interessante para o caso, visto que o que se pretende visualizar são as variações de tensão, corrente e impedância, que acontecem quando a partícula atravessa o líquido condutor e passa sobre os elétrodos. Na figura 22 estão representados os gráficos da tensão obtidos pela simulação quando a partícula que flui no canal microfluídico passa pelos dois elétrodos.
50 Capítulo 3 – Otimização e fabrico da plataforma microfluídica Figura 22. Resultados da simulação da tensão gerada com dois elétrodos de: (a) 30/10 µm com a partícula 6 µm de raio a 1 µm dos elétrodos; (b) 30/20 µm com a partícula 6 µm de raio a 2 µm dos elétrodos; (c) 30/10 µm com a partícula de 9 µm de raio a 1 µm dos elétrodos e (d) 30/20 µm com a partícula de 9 µm de raio a 2 µm dos elétrodos. No gráfico da figura 22 a) apenas é verificado um único pulso de tensão, devendo-se à diferença de potencial que existe entre os elétrodos, um deles com uma tensão AC de 1,5V (figura 21 - Elétrodo 1) e o outro com ground (figura 21 - Elétrodo 2). Inicialmente há um aumento da tensão, passando depois para um momento de tensão constante visto que a partícula se encontra na região do espaçamento de 10 µm entre os elétrodos, por fim a tensão começa a diminuir uma vez que a partícula se está a aproximar do elétrodo que representa o ground (0 V). No gráfico da figura 22 b), esta estabilização não é tão evidente porque o espaçamento entre os elétrodos é maior (20 µm) apesar da partícula passar sobre os elétrodos a uma distância de 2 µm. Com o aumento do tamanho da partícula verifica-se um aumento dos valores de tensão, figura 22 a) e c), algo que já era esperado. Por outro lado, com o aumento do espaçamento entre os elétrodos os valores de tensão diminuem, figura 22 b) e 22 d), podendo haver aqui um indício de que o aumento do espaçamento pode prejudicar a discriminação de partículas com esta gama de tamanhos. Para além disso, analisando os gráficos de tensão é possível concluir que pulsos com uma largura de base maior são obtidos quando os elétrodos estão mais espaçados bem como partículas maiores provocam maiores amplitude na tensão. Na figura 23 estão representados os gráficos da corrente obtidos pela simulação para as mesmas condições apresentados no estudo anterior. Figura 23. Resultados da simulação da densidade de corrente gerada com dois elétrodos de: (a) 30/10 µm com a partícula 6 µm a 1 µm dos elétrodos; (b) 30/20 µm com a partícula 6 µm de raio a 2 µm dos elétrodos; (c) 30/10 µm com a partícula de 9 µm de raio a 1 µm dos elétrodos e (d) 30/20 µm com a partícula de 9 µm de raio a 2 µm dos elétrodos.
51 Capítulo 3 – Otimização e fabrico da plataforma microfluídica Os gráficos de corrente são muito semelhantes aos que foram obtidos na tensão. Tal como nas anteriores o pico da figura 23 b) é mais largo que o da figura 23 a) influenciado pelo aumento do espaçamento entre os elétrodos. Ao aumentar a dimensão da partícula (figura 23 c)), a corrente diminui em relação aos anteriores, algo normal visto que se aumentou a partícula para 9 µm de raio. Tal como aconteceu nos gráficos da tensão, os valores de corrente no gráfico da figura 23 d) aumentaram ligeiramente, em comparação aos da figura 23 c), mas como se aumentou o espaçamento entre os elétrodos, o campo elétrico aumentou, e a partícula interferiu de uma forma mais significativa no campo elétrico, por isso é que houve um ligeiro aumento, tal como já tinha acontecido nos gráficos de tensão. Na figura 24 estão exibidos os gráficos da impedância para esta mesma simulação, sendo determinados pela razão entre a tensão e a corrente, figuras 22 e 23. Figura 24. Resultados da simulação da impedância gerada com dois elétrodos de: (a) 30/10 µm com a partícula 6 µm a 1 µm dos elétrodos; (b) 30/20 µm com a partícula 6 µm de raio a 2 µm dos elétrodos; (c) 30/10 µm com a partícula de 9 µm de raio a 1 µm dos elétrodos e (d) 30/20 µm com a partícula de 9 µm de raio a 2 µm dos elétrodos. No caso da figura 24 b), acontece um comportamento muito parecido com o da figura 24 a), mas os valores de impedância diminuem ligeiramente, o que vai de encontro aos gráficos da tensão e corrente representados. Ao aumentar a dimensão da partícula a impedância aumentou, figura 24 c) e figura 24 d), devendo-se ao facto de a partícula ser maior e interferir com uma maior área do campo elétrico, em comparação com os das figuras 24 a) e 24 b). Concluiu-se assim a partir desta simulação, que ocorre um pulso de corrente e um de tensão e dois pulsos de impedância por cada par de elétrodos (um por cada elétrodo). Comparando estes resultados com aqueles que foram previamente estudados [51]), verifica-se alguma convergência (figura 20).
52 Capítulo 3 – Otimização e fabrico da plataforma microfluídica Simulação com três elétrodos Numa segunda fase, foram aplicados três elétrodos para perceber se os sinais detetados tornavam a discriminação mais fácil. Tal como no subcapítulo anterior, apenas foram selecionadas as simulações que tiverem os melhores resultados, as quais estão destacadas na tabela 3. Tabela 3. Parâmetros utilizados nas simulações numéricas com três elétrodos. Parâmetros Três Elétrodos Partícula de 6 µm de raio Dimensões dos Elétrodos (largura/espaçamento) 30/10 µm 30/10 µm 30/20 µm 30/20 µm Posição da Partícula 1 µm 2 µm 1 µm 2 µm Partícula de 9 µm de raio Dimensões dos Elétrodos (largura/espaçamento) 30/10 µm 30/10 µm 30/20 µm 30/20 µm Posição da Partícula 1 µm 2 µm 1 µm 2 µm Figura 25. Interface gráfica com três elétrodos e a partícula de 6 µm de raio posicionada a 2 µm dos elétrodos. Na figura 25, está representado a interface gráfica realizada para uma das simulações com três elétrodos, onde os elétrodos têm um tamanho de 30 µm com um espaçamento entre eles de 10 µm. Nos elétrodos das extremidades foi aplicada uma tensão AC de 1,5V e o elétrodo central foi definido como ground . Nas figuras seguintes estão apresentados os gráficos de tensão, corrente e impedância, respetivamente, gerados pela passagem da partícula.
53 Capítulo 3 – Otimização e fabrico da plataforma microfluídica Figura 26. Resultados da simulação da tensão gerada com três elétrodos de: (a) 30/10 µm com a partícula 6 µm de raio a 2 µm dos elétrodos; (b) 30/20 µm com a partícula 6 µm de raio a 2 µm dos elétrodos; (c) 30/10 µm com a partícula de 9 µm de raio a 1 µm dos elétrodos e (d) 30/20 µm com a partícula de 9 µm de raio a 1 µm dos elétrodos. Figura 27. Resultados da simulação da densidade de corrente gerada com três elétrodos de: (a) 30/10 µm com a partícula 6 µm de raio a 2 µm dos elétrodos; (b) 30/20 µm com a partícula 6 µm de raio a 2 µm dos elétrodos; (c) 30/10 µm com a partícula de 9 µm de raio a 1 µm dos elétrodos e (d) 30/20 µm com a partícula de 9 µm de raio a 1 µm dos elétrodos. Figura 28. Resultados da simulação da impedância gerada com três elétrodos de: (a) 30/10 µm com a partícula 6 µm de raio a 2 µm dos elétrodos; (b) 30/20 µm com a partícula 6 µm de raio a 2 µm dos elétrodos; (c) 30/10 µm com a partícula de 9 µm de raio a 1 µm dos elétrodos e (d) 30/20 µm com a partícula de 9 µm de raio a 1 µm dos elétrodos.
54 Capítulo 3 – Otimização e fabrico da plataforma microfluídica Como era de esperar nos gráficos da tensão e nos gráficos de corrente representados nas figuras 26 e 27, são obtidos 2 pulsos, ou seja, 1 pulso por cada par de elétrodos (um pulso do Elétrodo 1 para o Elétrodo 2 e outro pulso do Elétrodo 2 para o Elétrodo 3 – figura 25). Na figura 28 estão representados os gráficos da impedância, no qual se verificam a ocorrência de três pulsos. Ao fazermos uma comparação dos valores de tensão e de corrente obtidos com aqueles que foram obtidos nas simulações com dois elétrodos, é notável um aumento dos valores de tensão e de corrente. Apesar disso, estas simulações apresentaram um comportamento semelhante ao de dois elétrodos, nomeadamente, o aumento da dimensão da partícula provoca um aumento da tensão e, diminuição da corrente e consequentemente o aumento da impedância. Para além disso, confirmou-se que o aumento do espaçamento entre os elétrodos continua a prejudicar a determinação do tamanho da partícula visto que os valores de impedância tendem a diminuir. Simulação com quatro elétrodos Por fim foram realizadas simulações com uma configuração de quatro elétrodos para perceber qual era o impacto destas no sistema. Tal como nos subcapítulos anteriores, foram selecionadas as simulações que tiverem os melhores resultados, as quais se encontram destacadas na tabela 4. Tabela 4. Parâmetros utilizados nas simulações numéricas com quatro elétrodos. Parâmetros Quatro Elétrodos Partícula de 6 µm de raio Dimensões dos Elétrodos (largura/espaçamento) 30/10 µm 30/10 µm 30/20 µm 30/20 µm Posição da Partícula 1 µm 2 µm 1 µm 2 µm Partícula de 9 µm de raio Dimensões dos Elétrodos (largura/espaçamento) 30/10 µm 30/10 µm 30/20 µm 30/20 µm Posição da Partícula 1 µm 2 µm 1 µm 2 µm
55 Capítulo 3 – Otimização e fabrico da plataforma microfluídica Figura 29. Interface gráfica com quatro elétrodos e a partícula de 6 µm de raio, posicionada a 2 µm dos elétrodos. Na figura 29, está representado a interface gráfica realizada para uma das simulações com quatro elétrodos, onde os elétrodos têm um tamanho de 30 µm com um espaçamento de 10 µm. Nos dois elétrodos das extremidades (1 e 4) foi aplicada uma tensão AC de 1,5V e nos elétrodos centrais (2 e 3) foram definidos como ground . Os resultados desta simulação estão apresentados nas figuras 30, 31 e 32. Figura 30. Resultados da simulação da tensão gerada com quatro elétrodos de: (a) 30/10 µm com a partícula 6 µm de raio a 2 µm dos elétrodos; (b) 30/20 µm com a partícula 9 µm de raio a 1 µm dos elétrodos. Figura 31. Resultados da simulação da densidade de corrente gerada com quatro elétrodos de: (a) 30/10 µm com a partícula 6 µm de raio a 2 µm dos elétrodos; (b) 30/20 µm com a partícula 9 µm de raio a 1 µm dos elétrodos. Figura 32. Resultados da simulação da impedância gerada com quatro elétrodos de: (a) 30/10 µm com a partícula 6 µm de raio a 2 µm dos elétrodos; (b) 30/20 µm com a partícula 9 µm de raio a 1 µm dos elétrodos. Ao comparar os gráficos de tensão e corrente obtidos com três elétrodos com o que foi obtido nesta simulação da figura 30 e 31 percebemos que existem 2 pulsos, mas existe um afundamento dos valores muito superior quando a partícula se encontra a passar pelos dois elétrodos (Elétrodo 2 e Elétrodo
56 Capítulo 3 – Otimização e fabrico da plataforma microfluídica 3) carregados com ground . Apesar disso, as simulações voltaram a apresentar um aumento dos valores de tensão e de corrente, em relação as outras simulações, isto porque foi acrescentado mais um elétrodo, o que alargou o campo elétrico gerado, levando ao aumento dos valores. As curvas de tensão, corrente e da impedância estavam de acordo com o previsto, confirmandose um aumento da tensão, uma diminuição da corrente e um aumento do valor de impedância com o aumento do tamanho da partícula. Para além disso, foi ainda verificado que espaçamento entre os elétrodos apresentam uma influência considerável na impedância, evidenciando apenas dois pulsos dado que o centro apresenta um potencial próximo do ground . 3.4 Conclusões das simulações Nas seções anteriores foram estudadas por simulação diversas geometrias dos microeléctrodos para perceber qual a configuração que fornecia os melhores resultados. Os principais parâmetros estudados incluíram o tamanho dos microeléctrodos e o seu espaçamento bem como o raio da partícula e a altura a que esta passa sobre os elétrodos. O estudo do espaçamento permitiu evidenciar que quanto maior o espaçamento, mais elevado seria o campo elétrico formado, o que permitia abranger uma maior área dentro do microcanal. Quando a partícula passa sobre os elétrodos mais espaçados, os valores de tensão foram mais baixos e os valores de corrente mais elevados, uma vez que a partícula interrompe durante mais tempo o campo elétrico e consequentemente a impedância diminui ligeiramente. Neste capítulo estudou-se também a influência do tamanho da partícula, utilizando partículas com raio de 6 e 9 μm e foi possível concluir que os valores de impedância aumentam com o aumento do tamanho da partícula, confirmando assim a possibilidade de utilizar esta tecnologia para discriminar partículas de diferentes tamanhos. Os valores de impedância só não aumentaram quando era aumentado o espaçamento entre os elétrodos, concluindo-se que o espaçamento entre os elétrodos deve ser mínimo, para garantir um bom dimensionamento das partículas. Os resultados das simulações também permitiram confirmar que as partículas devem passar o mais próximo dos elétrodos de forma a perturbar o campo elétrico de uma forma mais percetível e não induzir erros na indicação do tamanho. A nível prático, será muito importante garantir que a altura dos microcanais deverá ser compatível com o tamanho das partículas a detetar. Abordagens alternativas de focagem de partículas poderão ser utilizadas apesar de aumentarem a complexidade do sistema. Soluções de focagem acústica poderão ser integradas nas plataformas microfluídicas para garantir esta funcionalidade [54].
63 Capítulo 3 – Otimização e fabrico da plataforma microfluídica e) Para finalizar introduziu-se a estrutura numa solução de revelação de SU-8 durante 10 minutos para remover o SU-8 não exposto. Por fim lavou-se com água destilada e secou-se com fluxo de azoto (figura 38 e)). Figura 38. Representação esquemática do processo de fotolitografia da resina fotossensível SU-8 utilizada no fabrico do molde do canal microfluídico. Após a obtenção do molde necessário para o fabrico do canal microfluídico procedeu-se à preparação do PDMS (figura 39) [56], conforme descrito de seguida: a) Iniciou-se com a pesagem dos dois componentes do PDMS (base do pré-polímero e agente de cura) na proporção de 10:1 a partir do kit comercial ( Sylgard 184, dow corning ). Para isso, pesou-se 2 g de agente de cura e 20 g da base do pré-polímero. As quantidades devem ser calculadas, tendo em conta o molde e a espessura que se deseja. Começou-se por misturar a solução o que leva ao aparecimento de uma enorme quantidade de bolhas de ar na mistura. Foi então necessário realizar a desgaseificação num sistema de vácuo, de forma a retirar todas a bolhas, obtendo-se uma solução transparente (figura 39 a));
64 Capítulo 3 – Otimização e fabrico da plataforma microfluídica b) Depois de se obter a mistura sem bolhas, verte-se a solução sobre o molde. É importante que o derramamento do material seja feito no centro do molde e a baixa altitude, evitando novamente o aparecimento de bolhas de ar (figura 39 b)); c) Seguidamente realizou-se o processo de cura do PDMS numa hot plate durante 30 minutos a 100°C (figura 39 c)); d) Por fim retirou-se da hot plate , cortou-se o PDMS ao redor do molde e destacou-se a estrutura em PDMS que contém o canal microfluídico. Por fim, efetuaram-se os orifícios de entrada e saída com o auxílio de uma ferramenta de perfuração (figura 39 d)). Figura 39. Representação esquemática do processo de preparação do PDMS. Integração dos microeletrodos com o microcanal O processo final do fabrico da plataforma microfluídica inclui a ligação da lâmina de vidro com os elétrodos à estrutura em PDMS com os microcanais. O processo de ligação foi feito recorrendo a um
65 Capítulo 3 – Otimização e fabrico da plataforma microfluídica processo de plasma de oxigénio durante 30s utilizando o equipamento 100 W Plasma Systems ZEPTO, Diener electronic . Após este período, as duas superfícies expostas são colocadas em contacto fazendo uma ligação irreversível (figura 40). Figura 40. Plataforma microfluídica fabricada (a) vista de cima e (b) vista ao microscópio.
66 Capítulo 4 – Eletrónica de atuação e leitura para a caracterização de espécies ELETRÓNICA DE ATUAÇÃO E DE LEITURA PARA A CARACTERIZAÇÃO DE ESPÉCIES Neste capítulo é descrita a eletrónica necessária para que os elétrodos sejam capazes de efetuar as medições elétricas e determinar as características das células/partículas. A eletrónica foi validada inicialmente nos programas de simulação (PSIM). De forma a validar o princípio de medição, os testes práticos iniciaram-se com um teste simples em DC para verificar se existia a deteção de partículas. Após esta validação com sucesso, avançou-se para a caracterização em AC que, apesar de ser mais complexa quer na implementação quer na leitura, produz sinais mais confiáveis na deteção, para além de evitar os problemas de polarização e degradação dos elétrodos verificados em DC. 4.1 Caracterização da impedância dos microelétrodos Os microelétrodos (exemplo representado na figura 41) são os elementos fundamentais da plataforma microfluídica para realizar as medições elétricas necessárias para a caracterização das células/partículas. Figura 41. Representação esquemática dos microelétrodos.
67 Capítulo 4 – Eletrónica de atuação e leitura para a caracterização de espécies Tal com já foi referido anteriormente, os elétrodos foram integrados com o canal microfluídico, onde vão circular as células/partículas dissolvidas numa solução salina com uma concentração de 35 g/L. Esta solução é fundamental para a aquisição dos valores de tensão, corrente e impedância. Quando se coloca um elétrodo imerso numa solução com substâncias iónicas (ou seja, num eletrólito), as reações de oxidação-redução que vão acontecer entre o elétrodo e o eletrólito, modificam as concentrações destas substâncias nas zonas próximas dos elétrodos. Embora a neutralidade das cargas na solução se mantenha, o eletrólito que rodeia o elétrodo vai adquirir um potencial elétrico diferente devido as diferentes concentrações iónicas. Assim sendo, na interface elétrodo – eletrólito estabelece-se uma diferença de potencial designada por potencial de dupla camada ou também conhecido por half-cell potencial . Esta diferença de potencial depende do metal que constitui o elétrodo, da concentração de iões que existe na solução e da temperatura. A diferença de potencial é afetada quando existe uma corrente a fluir entre o elétrodo e o eletrólito. As diferenças de potencial provocadas pelas diferentes correntes e tensões que ocorrem entre o elétrodo e o eletrólito, variam com a frequência dos sinais de excitação e na maior parte das vezes não são lineares. Desta forma, é possível determinar os valores de impedância da interface elétrodo-eletrólitoelétrodo recorrendo à utilização das técnicas de EIS. Está técnica consiste em colocar o eletrólito (solução salina com células/partículas) a fluir entre os elétrodos, aplicar um estímulo elétrico e verificar a resposta resultante. Normalmente esse estímulo é uma tensão alternada do tipo sinusoidal e mede-se as partes reais e imaginárias da impedância complexa em função da frequência de excitação. Os gráficos da parte real e da parte imaginaria da impedância em função da frequência compõem o espectro da impedância do elétrodo e do eletrólito que estamos a medir. Os valores de impedância medidos neste tipo de tecnologia permitem concluir que os elétrodos podem ser representados por um circuito RC em série, como o que está presente na figura 42, visto que a partir do valor de impedância podemos saber o valor da resistência e do condensador. Figura 42. Circuito equivalente dos elétrodos. A impedância, 𝑍, determina-se pela seguinte equação, onde 𝑋𝐿 representa a reactância indutiva e 𝑋𝐶 representa a reactância capacitiva: 𝑍 = 𝑅 + (𝑋𝐿− 𝑋𝐶) (6) Visto que não existe uma indutância, a equação da impedância pode ser simplificada a:
68 Capítulo 4 – Eletrónica de atuação e leitura para a caracterização de espécies 𝑍 = 𝑅 − 𝑋𝐶 (7) Os valores de impedância dos elétrodos dentro da plataforma microfluídica foram medidos experimentalmente por EIS utilizando o equipamento Gamry Reference 600TM potentiostat/galvanostat . A montagem experimental utilizada para realizar esta caracterização está apresentada na figura 43 e inclui um sistema de bombeamento para introduzir as soluções na plataforma microfluídica e o sistema de medição de impedância. Figura 43. Montagem experimental utilizada para caracterização dos valores de impedância. As configurações simuladas no capítulo 3 foram fabricadas, mas os testes experimentais apresentaram vários problemas que impediram a caracterização destas estruturas. Na maioria dos testes, ocorria a degradação do elétrodo positivo devido à corrente aplicada (figura 44 a). Para além disso, o canal microfluídico ficava obstruído ao fim de algum tempo de teste (figura 44 b). As plataformas fabricadas eram fechadas de forma permanente por plasma de oxigénio e sempre que ocorria alguns destes problemas, a plataforma tornava-se obsoleta. Apesar de ser terem fabricado diversas plataformas microfluídicas com esta configuração, o seu teste foi muito difícil. Desta forma, percebeu-se que os parâmetros utilizados na simulação numérica, nomeadamente a aplicação de uma onda sinusoidal de tensão AC de 1,5V entre os elétrodos a uma frequência de 80 kHz, eram incompatíveis com o teste prático, uma vez que a corrente extremamente elevada levava ao rompimento dos elétrodos. O COMSOL não permite a análise do limite do elétrodo, apresentando sempre os valores teóricos de tensão e corrente em condições ideais e, por isso não era possível prever a degradação que se verificou experimentalmente.
69 Capítulo 4 – Eletrónica de atuação e leitura para a caracterização de espécies Para superar estes problemas e conseguir validar a tecnologia, fizeram-se algumas adaptações, nomeadamente, a utilização de canais e elétrodos de dimensões maiores, fabricou-se um adaptador em acrílico de forma a pressionar o canal microfluídico sobre os elétrodos e aplicou-se tensões mais baixas. Para além disso, este adaptador permitiu que sempre que ocorresse a degradação do elétrodo ou obstrução do canal, fosse possível abrir e limpar, permitindo a sua reutilização. Assim, a caracterização EIS foi realizada apenas para esta plataforma (figura 45). Figura 44. Fotografias dos problemas verificados durante o teste prático: (a) danificação dos elétrodos e (b) obstrução do canal. Figura 45. Plataforma microfluídica otimizada para realização dos testes experimentais. Os valores de impedância foram medidos com água do mar e água do mar com uma partícula entre os elétrodos. As medições foram efetuadas para dois tamanhos de partículas (250 e 350 μm). Na figura 46 está apresentada uma das situações medidas, onde se verifica que a partícula de 350 μm de diâmetro ocupa a posição entre os elétrodos. Os resultados foram analisados pelo software Gamry Echem
70 Capítulo 4 – Eletrónica de atuação e leitura para a caracterização de espécies Analyst , o qual permitiu visualizar os gráficos de impedância em função da frequência, presentes na figura 47. Figura 46. Fotografia de microscópia ótica da partícula posicionada entre os elétrodos para realização da caracterização EIS. Figura 47. Variação dos valores de impedância registados com GAMRY com e sem partículas na plataforma microfluídica. Pela análise dos gráficos, verifica-se que a impedância torna-se praticamente constante para frequências acima de 100 kHz e por isso foi escolhida a frequência de excitação de 300 kHz. A curva
71 Capítulo 4 – Eletrónica de atuação e leitura para a caracterização de espécies laranja representa a impedância dos elétrodos para uma partícula de 350 µm com um 𝑍 = 1,1 × 104 Ω (𝑓=300 kHz), a cinzento está representada a impedância dos elétrodos para uma partícula mais pequena (250 µm) com um 𝑍 = 5,79 ×103 Ω, a vermelho está representada a impedância dos elétrodos para uma partícula de 250 µm em cima de um elétrodo com um 𝑍 = 3,72 ×103 Ω e a azul está representada a impedância nos elétrodos para a água do mar com um 𝑍 = 2,63 ×103Ω. É de notar que quando há partículas sobre os elétrodos, a impedância é muito maior em relação à impedância da água do mar sem partículas. Também é observável que quanto maior o tamanho da partícula maior é o valor de impedância, tal como se encontra representado na curva laranja e cinzenta. A curva vermelha representa uma interferência menor no campo elétrico, uma vez que a partícula encontra-se por cima do elétrodo e como consequência, o valor de valor de impedância é mais próximo do valor de impedância da água do mar. Assim, para a realização dos cálculos para determinar o valor da resistência e do condensador que representa os elétrodos, foi utilizado o maior valor de impedância medido correspondente à partícula maior, 1,1 × 104 Ω, ou seja: 𝑍 = 𝑅 − 𝑋𝐶 (8) Assumindo 𝑅 = 11,5 kΩ, 1,1 × 104=11,5 × 103− 𝑋𝐶 𝑋𝐶=500 Ω Visto que, 𝑋𝐶=1 2𝜋𝑓𝐶 (9) 𝐶 = 1 2𝜋 ∗ 300𝑘 ∗ 500 𝐶 ≈ 1 nF Os cálculos apresentados anteriormente, permitiram conhecer os valores da resistência e do condensador que representam os elétrodos. Esta caracterização foi importante para definir os parâmetros essenciais na implementação do circuito de excitação AC (secção 4.2.1).
72 Capítulo 4 – Eletrónica de atuação e leitura para a caracterização de espécies 4.2 Implementação da eletrónica em DC O princípio de medição da tecnologia RPS em canais microfluídico foi inicialmente validado em DC, de forma a compreender melhor o funcionamento desta tecnologia. A implementação foi baseada na configuração básica do princípio de Coulter [59], a qual foi adaptada para o canal microfluídico (figura 48). Para isso, aplicou-se uma tensão de 9 V com recurso a uma pilha e colocou-se uma resistência em série de 18 MΩ, de forma a permitir que apenas uma corrente de 0,1 μA passe pelos elétrodos evitando que se danifiquem. A nível prático, foi observado que correntes superiores (por exemplo 100 μA) degradam rapidamente o microeléctrodo com potencial positivo. A pilha foi utilizada para evitar o ruído proveniente da fonte de alimentação, especialmente fontes ligadas à rede elétrica, o qual poderia comprometer os resultados das medições. As alterações da tensão foram medidas na resistência (devido a uma maior variação de tensão) com recurso a um multímetro ( Agilent 34401A) e os valores ao longo do tempo foram registados através de um software implementado em LabVIEW . Figura 48. Implementação DC na plataforma microfluídica. 4.3 Implementação da eletrónica em AC Após validação dos resultados em DC passou-se para a implementação em AC. Na figura 49. estão apresentados os principais módulos eletrónicos necessários para este tipo de deteção que incluem: circuitos de excitação, amplificação e finalmente aquisição do sinal. A excitação é necessária para estimular os elétrodos aplicando um sinal AC inicial. Este sinal vai sofrer perturbações com a passagem do fluido e partículas/células, produzindo sinais de baixa amplitude, os quais são difíceis de detetar diretamente. Desta forma, é necessário implementar um amplificador para tornar os sinais detetáveis. Os valores foram adquiridos por um osciloscópio digital.
79 Capítulo 5– Resultados Experimentais Figura 55. Gráficos de (a) tensão, (b) de densidade de corrente e (c) impedância obtidos por simulação relativamente à plataforma adaptada. 5.2 Validação da plataforma microfluídica com deteção em DC Os testes para deteção em DC foram realizados utilizando a montagem experimental apresentada na figura 56. Figura 56. Montagem experimental utilizada para as medições em DC. Os resultados dos testes em DC para a água do mar e para partículas de 20 e 60 µm estão apresentados na figura 57 e 58, respetivamente. Como as partículas eram mais pequenas que o canal
80 Capítulo 5– Resultados Experimentais microfluídico (dimensão de 500 µm em altura e largura), inseriu-se dentro do canal uma partícula estática (cerca de 350 µm) de forma a forçar a passagem das partículas mais pequenas junto dos elétrodos, produzindo alterações na tensão mais percetíveis. Os sinais de tensão obtidos com a água do mar (figura 57) a fluir dentro da plataforma microfluídica apresentam uma tendência constante sem apresentar picos significativos. Por outro lado, nos testes com as partículas de 60 µm (figura 58 a)), a tensão na resistência em série com os elétrodos apresenta um comportamento mais ou menos constante por volta dos 7,7V e quando é detetada a passagem da partícula, a tensão desce para os 7,45 V (variação máxima de 0,3 V). No caso das partículas de 20 µm (figura 58 b)), a tensão desceu dos 7,7 V para os 7 V (variação máxima de 0,7 V). Os valores foram medidos na resistência porque sofre uma maior variação sendo que uma maior variação da tensão na resistência corresponde a uma menor variação nos elétrodos, ou seja, quanto menor a partícula, menor a variação nos elétrodos e consequentemente maior variação na resistência. Assim, comparando as variações da tensão e os gráficos obtidos é visível que as partículas de 20 µm provocam uma maior variação de tensão na resistência do que as partículas de 60 µm. Portanto, estes resultados vão de encontro aquilo que foi referido anteriormente nesta dissertação relativamente à técnica RPS, validando com sucesso os testes em DC realizados com a plataforma microfluídica. Apesar desta validação, durante os testes práticos foram ocorrendo problemas nomeadamente a danificação dos elétrodos quando se aplicava uma corrente de 100 µA. Rapidamente se visualizava a remoção do material do elétrodo positivo e por isso foi-se reduzindo a corrente até um valor de 0,1 µA, onde se confirmou que o elétrodo permanecia estável e permitia realizar as medições. Figura 57. Valores de tensão registados com a passagem de água do mar pela plataforma microfluídica.
81 Capítulo 5– Resultados Experimentais Figura 58. Valores de tensão registados com a passagem das partículas de (a) 60 µm e (b) 20 µm pela plataforma microfluídica. 5.3 Validação da plataforma microfluídica com deteção em AC Após a validação em DC, avançou-se para os testes em AC com a utilização da eletrónica projetada no capitulo 4. Na figura 59 está apresentada a montagem experimental utilizada neste teste, a qual compreende um gerador de sinais que nos permite modular a onda de excitação, uma fonte de tensão para alimentar o circuito para excitação, circuito de leitura dos sinais dos elétrodos, a plataforma microfluídica onde fluem as partículas, um sistema de bombeamento, um microscópio para confirmar a passagem de partículas e um osciloscópio para apresentação dos sinais. Figura 59. Montagem experimental utilizada para realização dos testes em AC. Tal como foi feito nas deteções em DC, realizou-se em primeiro lugar a deteção da água do mar para ser possível perceber qual era a resposta que as partículas provocavam na tensão durante a sua
82 Capítulo 5– Resultados Experimentais passagem pela plataforma microfluídica. Para isso, colocou-se água do mar a fluir dentro da plataforma microfluídica com a ajuda da bomba de seringa com um caudal de 0.10 ml/mim. Os valores de tensão correspondentes à água do mar estão apresentados no gráfico da figura 60. Após este teste, procedeuse à introdução de água do mar com partículas de 20 e 60 µm e registaram-se os valores de tensão (figura 61). Tal como nas deteções em DC, manteve-se a partícula de 350 µm dentro do canal, de forma a provocar uma obstrução na zona dos elétrodos, para que as partículas passem mais próximas da superfície dos elétrodos. Figura 60. Valores de tensão AC registados durante a passagem de água do mar na plataforma microfluídica. Figura 61. Valores de tensão AC da passagem de partículas de 60 e 20 µm na plataforma microfluídica.
83 Capítulo 5– Resultados Experimentais Tal como nas deteções em DC, os valores de tensão para a água do mar (figura 60), tendem a ser muito mais constantes (entre 0,1 e 0,2 V) do que os valores de tensão da água do mar com partículas. No gráfico da figura 61 são notórias pequenas variações de tensão, para além da linha base de tensão que é formada pela água do mar. Na figura 61 a azul estão representadas as variações de tensão resultantes da passagem das partículas de 60 µm. A maior parte destas variações ocorrem até aos 0,3 V e 0,5 V, onde a maioria é superior a 0,4 V. Na figura 61 a vermelho estão representadas as variações da tensão para as partículas de 20 µm, onde os seus maiores picos de tensão são até aos 0,4 V, onde a maior parte destes ocorre entre os 0,2 V e os 0,3 V. Assim, é possível afirmar que a plataforma microfluídica consegue detetar a passagem de partículas e para além disso permite discriminar diferentes tamanhos. Foi ainda realizado um teste com algas de fitoplâncton tóxico utilizando as espécies Alexandrium Tamarense e Alexandrium Minutum . Figura 62. Variações da tensão com a passagem das algas Alexandrium Tamarense e Alexandrium Minutum na plataforma microfluídica. Os dados da figura 62 apresentam as variações da tensão provocadas pela passagem das células de fitoplâncton. Tal como era de prever, a contagem mostrou um número muito reduzido de células devido à baixa concentração da cultura, uma vez que a sua cultura em laboratório é muito difícil e o seu crescimento é muito lento, e com variações semelhantes às das partículas de 20 μm. Na Alexandrium Tamarense (representado a azul na figura 62) as variações rodam os 0,3 e os 0,35 V e na Alexandrium Minutum (representada a vermelho na figura ) as variações rodam os 0,35 e
84 Capítulo 5– Resultados Experimentais 0,36 V. Estes valores são semelhantes porque estes dois tipos de algas tem tamanhos semelhantes, sendo a Alexandrium Minutum ligeiramente maior com um comprimento compreendido entre os 28 µm e os 35 µm e uma largura entre os 20 µm e os 30 µm, e a Alexandrium Tamarense com um comprimento entre os 22 µm e os 51 µm e uma largura entre os 17 µm e os 44 µm, como se pode comprovar pelo o anexo I. Apesar das variações da tensão serem baixas, consegue-se verificar a geração de pulsos de diferentes amplitudes com a a passagem de células com tamanho diferente pela zona de deteção. 5.4 Conclusão O intuito deste capítulo foi validar o comportamento da plataforma microfluídica utilizando a eletrónica implementada no capítulo 4. Os testes realizados permitiram confirmar a viabilidade da tecnologia RPS integrada em canais microfluídica para contagem e discriminação de células por tamanhos. Apesar da deteção DC e AC terem sido capazes de indicar a passagem de partículas, a deteção AC mostrou uma melhor sensibilidade para além de evitar os problemas de polarização direta. A deteção só foi conseguida em ambos os casos, quando se utilizou a abordagem da partícula estática para estrangular o canal na zona sobre os elétrodos. Desta forma, a altura e largura do canal deveriam ser reduzidas para serem apropriadas ao tamanho das células que se pretendiam caracterizar. Para além disso, seria desejável realizar mais testes de forma a fazer uma calibração entre a resposta da plataforma em função de diferentes tamanhos de células/partículas. No entanto a disponibilidade limitada de partículas com diferentes tamanhos bem como os problemas verificados na plataforma microfluídica impediram esta caracterização mais detalhada.
85 Capítulo 6– Conclusão CONCLUSÃO Neste capítulo são apresentadas as principais conclusões do trabalho realizado assim com sugestões para trabalhos futuros. 6.1 Conclusões finais Esta dissertação descreve todo o processo de otimização, fabrico e caracterização experimental de uma plataforma microfluídica com deteção RPS para discriminação de células de fitoplâncton. Esta plataforma compreende um canal microfluídico que permite a passagem das partículas/células pela zona de deteção, na qual está integrado um sensor de impedância fabricado com microeléctrodos em filme fino. O princípio de deteção baseia-se na tecnologia RPS, onde um campo elétrico gerado entre elétrodos é perturbado pelo movimento da partícula/célula que bloqueia o fluxo de corrente, provocando uma variação de tensão cuja intensidade é proporcional ao volume da partícula que atravessa o canal. A partir desta variação, a plataforma é capaz de dar informações do número de células bem como do seu tamanho. O trabalho desenvolvido foi dividido em duas fases: a simulação numérica da plataforma microfluídica e o fabrico e teste experimental da mesma. Na primeira fase, foram realizadas simulações numéricas com o programa COMSOL Multiphysics, para avaliar qual a configuração com melhor desempenho na resposta do sensor RPS, facilitando a escolha da solução mais viável para o fabrico da plataforma microfluídica. Os principais parâmetros estudados pela simulação incluíram o estudo do número de elétrodos bem como a sua largura e espaçamento. Para além disso, foi estudada a influência do tamanho da partícula na resposta do sensor. Os resultados da simulação permitiram identificar que o espaçamento entre os elétrodos é o
86 Capítulo 6– Conclusão fator que apresenta maior influência na deteção da partícula. Um menor espaçamento garante que o campo elétrico fica mais concentrado, tornando mais facilmente detetadas as variações de corrente e de tensão, provocadas pela passagem das partículas. Para além disso, foi possível confirmar que quanto maior fosse a partícula, menor a corrente que percorre os elétrodos e consequentemente maior tensão e impedância. O mesmo estudo indicou que a passagem da partícula provoca uma maior influência quando passa o mais próximo dos elétrodos, o que demonstra que a geometria do microcanal deve ser adequada ao tamanho da partícula. Por fim, as simulações mostraram ainda que a configuração de três e quatro elétrodos apresentavam uma melhor discriminação. Apesar da amplitude dos pulsos ser semelhante nas duas situações, a distinção de dois pulsos é mais clara na configuração de quatro elétrodos uma vez que apresenta dois elétrodos ground , e por isso os pulsos são mais espaçados. No caso de três elétrodos, verifica-se uma zona central onde ocorre a sobreposição dos pulsos e por isso a sua distinção não é tão fácil. Na fabricação optou-se pelo fabrico da configuração com quatro elétrodos, visto que permitia realizar testes com todas as configurações. A segunda fase consistiu no fabrico e caracterização da plataforma microfluídica, tendo por base todas as conclusões retiradas nas simulações numéricas. Para além disso, incluiu a implementação da eletrónica de atuação e leitura necessária para deteção das partículas. Contudo, a validação experimental da plataforma fabricada apresentou alguns problemas, nomeadamente a rápida degradação dos microelétrodos quando se excitavam os elétrodos com uma onda sinusoidal de 1,5 V com uma frequência de 80 kHz. Este problema não foi previsto nas simulações porque a ferramenta utilizada não considera os limites do elétrodo, apresentando sempre os valores teóricos de tensão e corrente em condições ideais. De forma a ultrapassar este problema, foi simulada e fabricada uma nova plataforma com dimensões superiores dos elétrodos, microcanais e mesmo nas partículas utilizadas na validação, de forma a provar o conceito destas tecnologias. Para além disso, a tensão de excitação foi significativamente reduzida para permitir a passagem de uma corrente de 13,6 µA, a qual não provocou qualquer alteração nos elétrodos ao mesmo tempo que permitia obter variações detetáveis após amplificação. A plataforma foi validade experimentalmente em DC e AC, no entanto a deteção AC mostrou ser a mais adequada dado que evita os problemas de polarização direta, nomeadamente a alteração de pH, eletrólise da água do mar e geração de bolhas bem como a degradação dos elétrodos. Os resultados experimentais permitiram observar alterações distintas na tensão com a passagem de partículas de diferentes tamanhos, indo de encontro ao que se verificou na simulação, nomeadamente foram detetados picos de tensão maiores para partículas de tamanho maiores. Para além disso, com a deteção AC foi possível confirmar que a plataforma microfluídica conseguiu discriminar dois tipos de fitoplâncton
87 Capítulo 6– Conclusão tóxico ( Alexandrium Tamarense e da Alexandrium Minutum ). Apesar destas espécies apresentarem tamanhos muito idênticos, a plataforma microfluídica apresentou picos de tensão diferentes demonstrando que a Alexandrium Minutum é ligeiramente maior que a Alexandrium Tamarense . A validação com sucesso da plataforma microfluídica permitiu confirmar que a tecnologia desenvolvida tem viabilidade para ser integrada num citómetro microfluídico para quantificação de células de fitoplâncton tóxico. 6.2 Trabalho futuro Como trabalho futuro é sugerido melhorar as dimensões do canal microfluídico bem como dos microeléctrodos de forma a tornar a plataforma microfluídica sensível a partículas ou células mais pequenas, especialmente para a gama de tamanhos do fitoplâncton tóxico. De forma a tornar a plataforma viável para uma maior gama de tamanhos, soluções baseadas em focagem hidrodinâmica ou acústicas podem ser integradas com o canal microfluídico para garantir que as partículas mantenham uma trajetória uniforme e passem individualmente pela zona de deteção. A deteção de tamanhos menores também implicará a otimização dos circuitos de excitação e leitura desenvolvidos. Tal como se verificou na prática, a corrente a aplicar sobre os elétrodos menores deve ser muito baixa para evitar a sua degradação. Esta condição, irá exigir que o ganho no amplificador de instrumentação seja aumentado de forma a detetar as variações de tensão menores. Para além disso, torna-se necessário desenvolver o circuito de leitura para contabilizar automaticamente o número de partículas em cada gama de tamanhos. Para isto, é necessário realizar testes de forma a fazer uma calibração e relacionar os picos de tensão com os tamanhos de células/partículas. Uma das possíveis soluções poderá ser a implementação de um lock-in amplifier que desmodulasse a onda gerada através da comparação com a onda de entrada. Após esta comparação, é necessário efetuar a leitura e extrair os valores produzidos pelos elétrodos através de um conversor analógico – digital (ADC), para que estes possam ser lidos e armazenados por exemplo num cartão de memória ou apresentados num display. Por fim, e tal como indicado no capítulo 1, esta tecnologia poderá ser integrada num citómetro de fluxo microfluídico para complementar as informações fornecidas pelas técnicas óticas e fazer uma caracterização morfológica e espectral completa de espécies de fitoplâncton em função do tamanho, forma, complexidade e seus pigmentos fotossintéticos. A combinação de todas estas funcionalidades numa plataforma LOC única oferece a possibilidade de criar dispositivos mais baratos, rápidos e confiáveis que podem ser utilizadas em monitorização submersa durante vários meses.
88 Capítulo 7 – Referências Bibliográficas REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1] “What are phytoplankton?” [Online]. Available: https://oceanservice.noaa.gov/facts/phyto.html. [Accessed: 10-Feb-2020]. [2] S. Smith, “Analytical electric field and sensitivity analysis for two microfluidic impedance cytometer designs,” IET Nanobiotechnol. , vol. Vol.1, pp. 69–79. [3] I. IP, Manual para a avaliação da qualidade biológica da água em lagos e albufeiras segundo a directiva quadro da água . Ministério do Ambiente, do Ordenamento do Território e do Desenvolvimento Regional. Instituto da Água, I.P.l, 2009. [4] Diana Filipa Pereira Manita, “Bioacessibilidade in vitro das biotoxinas marinhas ácido ocadaico , dinofisistoxina -2 e seus derivados em bivalves crus e cozinhados.,” Universidade de Lisboa, 2017. [5] Sistema Nacional de Monitorização de Moluscos Bivalves, “Valores de referência utilizados pelo Laboratório de Fitoplâncton (IPMA) para avaliação da concentração de risco de espécies de fitoplâncton tóxico na água.,” 2017. [6] J.-Y. Liu, L.-H. Zeng, and Z.-H. Ren, “Recent application of spectroscopy for the detection of microalgae life information: A review,” Appl. Spectrosc. Rev. , 2019. [7] B. Karlson, C. Cusack, and E. Bresnan, Metodos microscopicos y moleculares para el analisis cuantitativo del fitoplancton . 2010. [8] H. S. Kim, T. P. Devarenne, and A. Han, “Microfluidic systems for microalgal biotechnology: A review,” Algal Res. , vol. 30, no. July 2017, pp. 149–161, 2018. [9] S. Dunker, “Hidden Secrets Behind Dots: Improved Phytoplankton Taxonomic Resolution Using High‐Throughput Imaging Flow Cytometry,” Cytom. Part A , 2019. [10] Z. I. Johnson and A. C. Martiny, “Techniques for Quantifying Phytoplankton Biodiversity,” Ann. Rev. Mar. Sci. , no. 1, 2015. [11] M. C. Cerón-García, C. V. González-López, J. Camacho-Rodríguez, L. López-Rosales, F. GarcíaCamacho, and E. Molina-Grima, “Maximizing carotenoid extraction from microalgae used as food additives and determined by liquid chromatography (HPLC),” Food Chem. , vol. 257, 2018. [12] L. Schlüter, T. L. Lauridsen, G. Krogh, and T. Jørgensen, “Identification and quantification of phytoplankton groups in lakes using new pigment ratios - A comparison between pigment analysis by HPLC and microscopy,” Freshw. Biol. , vol. 51, 2006. [13] Z. Gӧrӧcs et al. , “A deep learning-enabled portable imaging flow cytometer for cost-effective, highthroughput, and label-free analysis of natural water samples,” Light Sci. Appl. , vol. 7, no. 1, 2018. [14] N. Convery and N. Gadegaard, “30 Years of Microfluidics,” Micro Nano Eng. , vol. 2, 2019. [15] A. M. Schaap, “Integrating optics and microfluidics to automatically identify algae species,” Technische Universiteit Eindhoven, 2015. [16] Y. H. Lin, T. M. Pan, M. H. Wu, A. K. Miri, and D. Nieto, “Microfluidic technology and its biological applications,” Compr. Biotechnol. , vol. 5, no. October 2018, pp. 62–80, 2019. [17] M. Linsenmeier, M. R. G. Kopp, S. Stavrakis, A. de Mello, and P. Arosio, “Analysis of biomolecular condensates and protein phase separation with microfluidic technology,” Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. , vol. 1868, no. 1, p. 118823, 2021. [18] W. Jung, J. Han, J. W. Choi, and C. H. Ahn, “Point-of-care testing (POCT) diagnostic systems using microfluidic lab-on-a-chip technologies,” Microelectron. Eng. , vol. 132, pp. 46–57, 2015. [19] L. Dai et al. , “Microfluidics-based microwave sensor,” Sensors Actuators, A Phys. , vol. 309, p. 111910, 2020.
95 Anexos Espécie Dinophysis acuminata [76], [77] Dinophysis ovum [76], [78] Dinophysis fortii [79] Prorocentrum lima [80], [81] Prorocentrum cordatum [82], [83] Descrição Classificação Dinoflagelado Dinoflagelado Dinoflagelado Dinoflagelado Dinoflagelado Forma Em forma de concha (Oval) Forma de ovo Em forma de concha Oval Coração Tamanho Comprimento: 30 µm - 35 µm Diâmetro: 38 µm - 58 µm Comprimento: 32 µm - 42 µm Diâmetro: 22,5 µm - 32 µm Comprimento: 62 µm - 66 µm Largura: 41 µm - 58 µm Comprimento: 32 µm - 50 µm Largura: 20 µm - 28 µm Comprimento: 6,6 µm - 20 µm Largura: 5 µm - 16 µm Cor CastanhoAvemelhado Dourada Castanho - Vermelho Dourado – Castanho Dourado – Castanho Comportamento Estilo de Vida É um dinoflagelado fotossintético e quimiossintético. Reproduz-se assexuada por fissão binária. É um dinoflagelado fotossintético e quimiossintético. Reproduz-se assexuada por fissão binária. É um dinoflagelado fotossintético. Reproduz-se assexuada por fissão binária. É um dinoflagelado fotossintético. Reproduz-se assexuada por fissão binária. É um dinoflagelado fotossintético e quimiossintético. Reproduz-se assexuada por fissão binária. Florescimento Em áreas protegidas e fechadas Em zonas costeiras com temperatura temperada Muito abundante no Verão Em climas temperados e tropicais Normalmente em Estuários Efeitos Tóxicos Produz ácido ocadáico, dinofisitoxinas + pectenotoxinas (DSP) Produz ácido ocadáico, dinofisitoxinas + pectenotoxinas (DSP) Produz ácido ocadáico, dinofisitoxinas + pectenotoxinas (DSP) Produz ácido ocadáico, dinofisitoxinas + pectenotoxinas (DSP) Produz ácido ocadáico, dinofisitoxinas + pectenotoxinas (DSP) Distribuição Habitat E zonas neríticas Em zonas costeiras Em zonas neríticas e nos oceanos Zonas neríticas Estuários Estuários Águas Costeiras Águas Salobras Geográfico Em temperadas quentes e frias por todo o mundo Galiza Grécia Texas Águas mornas e tropicais de todo o mundo Por todo o mundo Por todo o mundo Estação Final da Primavera até o Verão Da Primavera ao Outono Primavera tardia até ao Verão Verão Verão Condições de Crescimento Temperatura 12⁰C – 22⁰C ≈12⁰C – 22⁰C ≈ 13⁰C ≈ 24⁰C 20⁰C - 24⁰C Salinidade 28 ppt – 34,5 ppt 28 ppt – 34,5 ppt ≈ 34 ppt ≈ 19 ppt 10 ppt – 16 ppt Identidade
96 Anexos Espécie Alexandrium Tamarense [84] Alexandrium Minutum [85] Azadinium spinozum [86]–[88] Dinophysis acuta [76], [89] Descrição Classificação Dinoflagelado Dinoflagelado Dinoflagelado Dinoflagelado Forma Esférica Esférica e pequenas Em forma de concha Esférica Tamanho Comprimento: 22µm - 51µm Largura: 17µm - 44µm Comprimento: 28µm - 35µm Largura: 20µm - 30µm Comprimento: 54 µm - 94 µm Diâmetro: 43 µm - 60 µm Comprimento: 12 µm - 16 µm Largura: 7 µm - 11 µm Cor Laranja - castanho Verde - castanho Laranja – avermelhado - Castanho Verde – Amarelo Comportamento Estilo de Vida É um dinoflagelado fotossintético. Reproduz-se assexuadamente por fissão binária e sexualmente através da união de gametas diferentes. É um dinoflagelado fotossintético. Reproduz-se assexuadamente por fissão binária e sexualmente através da união de gametas diferentes. É um dinoflagelado fotossintético. Reproduz-se assexuada por fissão binária. É um dinoflagelado fotossintético Florescimento Em águas costeiras salgadas e em grandes estuários. Em águas quentes temperadas e em águas doces. Nos verões quentes, Invernos secos e fortes primaveras. Em águas costeiras Efeitos Tóxicos Produz toxinas paralisantes (PSP) Produz toxinas paralisantes (PSP) Produz ácido ocadáico, dinofisitoxinas + pectenotoxinas (DSP) Produz azaspirácidos (AZP) Distribuição Habitat Águas Costeiras frias Estuários Baias Restritas Lagoas Estuários Oceano Em águas costeiras Geográfico Norte da América Europa Japão Ásia África Norte da América América Central e Caribe Europa Oceânia Águas frias em todo o mundo Europa Africa América do Sul Japão Estação Verão (Julho – Agosto) Primavera Primavera e Verão Verão Condições de Crescimento Temperatura -2⁰C - 28⁰C 15⁰C - 25⁰C --- ≈ 18⁰C Salinidade 20,8 ppt – 29,5ppt 15 ppt – 35ppt --- 30 ppt–40ppt Identidade
97 Anexos ANEXO II – CAMPOS ELÉTRICOS E LINHAS DE CORRENTE FORMADOS PELA PASSAGEM DA PARTÍCULA Dois Elétrodos 30 µm de largura espaçados de 10 µm Partícula de 6 µm de raio Campo Elétrico Linhas de Corrente Partícula de 9 µm de raio Campo Elétrico
98 Anexos Linhas de Corrente 30 µm de largura espaçados de 20 µm Partícula de 6 µm de raio Campo Elétrico Linhas de Corrente Partícula de 9 µm de raio Campo Elétrico
99 Anexos Linhas de Corrente Três Elétrodos 30 µm de largura espaçados de 10 µm Partícula de 6 µm de raio Campo Elétrico Linhas de Corrente Partícula de 9 µm de raio Campo Elétrico
100 Anexos Linhas de Corrente 30 µm de largura espaçados de 20 µm Partícula de 6 µm de raio Campo Elétrico Linhas de Corrente Partícula de 9 µm de raio Campo Elétrico
101 Anexos Linhas de Corrente Quatro Elétrodos 30 µm de largura espaçados de 10 µm Partícula de 6 µm de raio Campo Elétrico Linhas de Corrente Partícula de 9 µm de raio Campo Elétrico
102 Anexos Linhas de Corrente
103 Anexos ANEXO III – SIMULAÇÕES COM MAIS PARTÍCULAS Dois Elétrodos 30 µm de largura espaçados de 10 µm
104 Anexos 30 µm de largura espaçados de 20 µm