Effect of organic exudates of Phaeodactylum tricornutum on the Fe(II) oxidation rate constant

Ciencias Marinas (2012), 38(1B): 245–261 245 C M INTRODUCTION Iron is a key element in natural waters due to its consumption as a micronutrient by microorganisms and the central role it plays in nitrogen assimilation (Sunda and Huntsman 1997). The biogeochemical cycle of iron, especially in the case of Fe(II), has not been totally defined. Fe(II) can reach the ocean via various different sources: wet deposition (Faust and Zeep 1993, Millero et al. 1995, Kieber et al. 2001), photochemical reduction (Wells et al. 1991, Johnson et al. 1994), and direct biological production (Maldonado and Price 2001, Kustka et al. 2005, Rose et al. 2005). Once in surface waters, Fe(II) should be rapidly oxidized into Fe(III). Previous work has studied the oxidation of Fe(II) (Stumm and Lee 1961; Ghost 1974; Kester et al. 1975; Tamura et al. 1976; Sung and Morgan 1980; Davison and Seed 1983; Millero et al. 1987; Millero and INTRODUCCIÓN El hierro es un elemento esencial en las aguas naturales debido a su utilización como micronutriente por los microorganismos y al papel fundamental que desempeña en la asimilación del nitrógeno (Sunda y Huntsman 1997). El ciclo biogeoquímico del hierro aún no se ha definido totalmente, especialmente en el caso del Fe(II). El Fe(II) puede llegar al océano desde diferentes fuentes: deposición húmeda (Faust y Zeep 1993, Millero et al. 1995, Kieber et al. 2001), reducción fotoquímica (Wells et al. 1991, Johnson et al. 1994) y producción biológica directa (Maldonado y Price 2001, Kustka et al. 2005, Rose et al. 2005). Una vez que se encuentra en aguas superficiales, el Fe(II) debería oxidarse rápida-mente a Fe(III). Trabajos previos han estudiado la oxidación del Fe(II) (Stumm y Lee 1961; Ghost 1974; Kester et al. 1975; Tamura et al. 1976; Sung y Morgan 1980; Davison y Seed Effect of organic exudates of Phaeodactylum tricornutum on the Fe(II) oxidation rate constant Efecto de los exudados orgánicos de Phaeodactylum tricornutum en la constante de velocidad de oxidación del Fe(II) AG González, JM Santana-Casiano*, M González-Dávila, N Pérez Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Departamento de Química, Facultad de Ciencias del Mar, Campus de Tafira, 35017 Las Palmas, Spain. * Corresponding author. E-mail: [email protected] ABSTRACT. Fe(II) oxidation kinetics were studied in seawater and in seawater enriched with exudates excreted by Phaeodactylum tricornutum as an organic ligand model. The exudates produced after 2, 4, and 8 days of culture at 6.21 °107, 2.29 °108, and 4.98 °108 cell L–1 were selected. The effects of pH (7.2–8.2), temperature (5–35 ºC), and salinity (10–36.72) on the Fe(II) oxidation rate were studied. All the data were compared with the results for seawater without exudates (control). The Fe(II) rate constant decreased as a function of culture time and cell concentration in the culture at different pH, temperature, and salinity. All the experimental data obtained in this study were fitted to a polynomial function in order to quantify the fractional contribution of the organic exudates from the diatoms to the Fe(II) oxidation rate in natural seawater. Experimental results showed that the organic exudates excreted by P. tricornutum affect Fe(II) oxidation, increasing the lifetime of Fe(II) in seawater. A kinetic model approach was carried out to account for the speciation of each Fe(II) type together with its contribution to the overall rate. Key words: Fe(II), oxidation, organic exudates, diatom, oxygen. RESUMEN. Se estudió la cinética de oxidación del Fe(II) en agua de mar y en agua de mar enriquecida con exudados excretados por Phaeodactylum tricornutum como modelo de ligando orgánico. Se seleccionaron los exudados producidos después de 2, 4 y 8 días de cultivo, correspondientes a 6.21 °107, 2.29 °108 y 4.98 °108 células L–1. Se estudió el efecto del pH (7.2–8.2), la temperatura (5–35 ºC) y la salinidad (10–36.72) en la velocidad de oxidación del Fe(II). Todos los datos se compararon con los resultados obtenidos en agua de mar sin exudados (control). La constante de velocidad de oxidación del Fe(II) disminuyó en función del tiempo de cultivo y la concentración de células a diferentes valores de pH, temperatura y salinidad. Todos los datos experimentales obtenidos en este estudio se ajustaron a una función polinómica con el objetivo de cuantificar la contribución parcial de los exudados orgánicos de diatomeas a la velocidad de oxidación del Fe(II) en agua de mar. Los resultados experimentales mostraron que los exudados orgánicos excretados por P. tricornutum afectan a la oxidación del Fe(II) incrementando su tiempo de vida media en agua de mar. Se aplicó un modelo cinético para calcular la especiación de Fe(II) y la contribución de cada especie a la velocidad total del proceso de oxidación. Palabras clave: Fe(II), oxidación, exudados orgánicos, diatomeas, oxígeno. Ciencias Marinas, Vol. 38, No. 1B, 2012 246 Sotolongo 1989; King et al. 1995; Emennegger et al. 1998; Santana-Casiano et al. 2000, 2004, 2005; Gunnars et al. 2002; Rose and Waite 2002; González-Dávila et al. 2005, 2006; Roy et al. 2008) in order to characterize the chemistry of Fe(II) in natural waters. The most accepted mechanism for Fe(II) oxidation in natural waters is the Haber-Weiss mechanism: (1) (2) (3) (4) where the Fe(II) species, FeOH+ and Fe(OH)2, contribute largely towards the Fe(II) oxidation process as a function of pH (Millero et al. 1987). In addition, carbonate in seawater reacts with Fe(II), forming FeCO3, FeHCO3+, and Fe(CO3)22– (Millero and Izaguirre 1989). The Fe(II) oxidation rate is strongly affected by the formation of Fe(CO3)22– (King 1998). The effect of H2O2 on the Fe(II) rate constant has also been studied at micromolar (Millero and Sotolongo 1989, Millero et al. 1991) and nanomolar concentrations (González-Dávila et al. 2005, 2006). The presence of organic matter affects the Fe(II) oxidation kinetics, accelerating or retarding the oxidation rate (Theis and Singer 1974; Santana-Casiano et al. 2000, 2004; Rose and Waite 2003). In addition, evidence of Fe(II) organic complexes exists in oceanic waters (Rue and Bruland 1997, Croot et al. 2001). Persistent Fe(II) concentrations have been measured in surface seawater (Croot et al. 2001, 2005) several days after iron enrichment experiments in the Southern Ocean (SOIREX and EisenEX), by monitoring nanomolar concentration of Fe(II) in surface waters. Roy et al. (2008), in the subarctic Pacific, measured a surface maximum of Fe(II) (40 pM). In these studies, the presence of Fe(II) was attributed to reactions with organic ligands, possibly originated by microalgae. In this sense, the speciation of trace metals, such as iron, in seawater is controlled by the presence of organic ligands (Gledhill and van den Berg 1994, Rue and Bruland 1995, van den Berg 1995, Santana-Casiano et al. 2000, Vasconcelos et al. 2002). Most work related to the complexation of iron in the ocean has been carried out on Fe(III) (Rue and Bruland 1995, Kuma et al. 1996, Witter and Luther 1998, Vasconcelos et al. 2002, Chen et al. 2003, Gerringa et al. 2007, Hirose 2007, Laglera and van den Berg 2007, Fujii et al. 2008, Rijkenberg et al. 2008); however, few studies have considered the effect of exudates on the oxidation of Fe(II) (Steigenberger et al. 2010). A mixture of organic compounds produced by microorganisms and different microalgae is found in natural Fe II() O2Fe III()O2 •– +→+ 2H+ Fe II() O2 •– Fe III()H2O2 + + Fe II() H2O2Fe III()OH•OH– ++→+ Fe II() OH•Fe III()OH– +→+ 1983; Millero et al. 1987; Millero y Sotolongo 1989; King et al. 1995; Emennegger et al. 1998; Santana-Casiano et al. 2000, 2004, 2005; Gunnars et al. 2002; Rose y Waite 2002; González-Dávila et al. 2005, 2006; Roy et al. 2008) para caracterizar la química del Fe(II) en aguas naturales. El mecanismo de oxidación del Fe(II) más aceptado en aguas naturales es el de Haber-Weiss: (1) (2) (3) (4) donde las especies de Fe(II), FeOH+ y Fe(OH)2 son las que más contribuyen al proceso de oxidación del Fe(II) en función del pH (Millero et al. 1987). Además, los carbonatos presentes en el agua de mar reaccionan con el Fe(II) formando FeCO3, FeHCO3+, Fe(CO3)22– (Millero e Izaguirre 1989). La velocidad de oxidación del Fe(II) está fuertemente afectada por la formación de Fe(CO3)22– (King 1998). También se ha estudiado el efecto del H2O2 en la constante de velocidad de oxidación del Fe(II) a concentraciones micromolares (Millero y Sotolongo 1989, Millero et al. 1991) y nanomolares (González-Dávila et al. 2005, 2006). La presencia de material orgánico afecta a la cinética de oxidación del Fe(II), acelerando o retardando la velocidad de oxidación (Theis y Singer 1974; Santana-Casiano et al. 2000, 2004; Rose y Waite 2003). Existen evidencias de la presencia de complejos orgánicos de Fe(II) en aguas oceánicas (Rue y Bruland 1997, Croot et al. 2001). Monitoreando concentraciones nanomolares de Fe(II) en aguas superficiales, se han medido concentraciones persistentes de esta especie en aguas superficiales (Croot et al. 2001, 2005) varios días después de experimentos de enriquecimiento con hierro en el océano del Sur (SOIREX y EisenEX). Roy et al. (2008), en el Pacífico subártico, midieron un máximo superficial de Fe(II) de 40 pM. En estos estudios la presencia de Fe(II) se atribuyó a las reacciones con ligandos orgánicos, posiblemente originados por microalgas. En este sentido, la especiación de los metales traza, como el hierro, en el agua de mar está controlada por la presencia de ligandos orgánicos (Gledhill y van den Berg 1994, Rue y Bruland 1995, van den Berg 1995, Santana-Casiano et al. 2000, Vasconcelos et al. 2002). La mayoría de los trabajos relacionados con la complejación de hierro en el océano se han llevado a cabo para el Fe(III) (Rue y Bruland 1995, Kuma et al. 1996, Witter y Luther 1998, Vasconcelos et al. 2002, Chen et al. 2003, Gerringa et al. 2007, Hirose 2007, Laglera y van den Berg 2007, Fujii et al. 2008, Rijkenberg et al. 2008). Sin embargo, pocos trabajos han considerado el efecto de los exudados en la oxidación del Fe(II) (Steigenberger et al. 2010). Fe II() O2Fe III()O2 •– +→+ 2H+ Fe II() O2 •– Fe III()H2O2 + + Fe II() H2O2Fe III()OH•OH– ++→+ Fe II() OH•Fe III()OH– +→+ González et al.: Fe(II) oxidation with diatom organic exudates 247 waters. In order to elucidate the influence of the various organic ligands excreted by these organisms, studies of individual microalgal species are required. This study thus analyzes the effect of exudates from an individual microalga, the diatom Phaeodactylum tricornutum, on the rate of Fe(II) oxidation, as a function of pH (7.2–8.2), temperature (5–35 ºC), and salinity (10–36.72). The experiments were carried out at different growth stages. This diatom species was selected because of its wide variety of habitats and because it is one of the most abundant photosynthetic organisms in marine waters. MATERIAL AND METHODS Chemicals The seawater used in this study was collected off the coast of Gran Canaria (September 2009). The stock solution of Fe(II) (4 × 10–4 M) was prepared using ammonium Fe(II) sulphate hexahydrate (Sigma), acidified at a pH of 2 with Suprapur HCl (Sigma) in NaCl (0.7 M). The initial concentration of Fe(II) was 25 nM. All solutions were prepared with Milli-Q water (18 MQ) and filtered through a 0.1-μm filter. All chemicals used for the Fe(II) determination were of analytical grade. The f/2 medium nutrients were prepared following Guillard (1975). The stock solutions of nutrients were prepared using sodium nitrate (Sigma) (0.88 M), potassium hydrogen phosphate (Sigma) (0.03 M), and sodium silicate (Sigma) (0.14 M). For the different physicochemical conditions of this study, the concentration of NO3–, HPO42–, and SiO32– was kept constant at 8.83 × 10–4, 2.93 × 10–5, and 1.42 × 10–4 M, respectively. pH measurements The pH was measured in the free hydrogen ion concentration scale, pHF = –log[H+], using an Orion pH-meter and calibrating the combination electrode (ROSS Combination, glass body) with Tris-(hydroximethyl)aminomethane(Tris)- artificial seawater buffers (Millero 1986). The buffers were prepared in 0.005 mol kg–1 Tris and Tris-HCl in artificial seawater. The effect of temperature and salinity on the pK* of the Tris-buffers was considered in this study. Algal cultures Phaeodactylum tricornutum was the phytoplankton species selected to study the effect of its exudates on the Fe(II) oxidation rate constant. This diatom was supplied by the Spanish Algae Bank at Taliarte (Gran Canaria). The axenic cultures were maintained in f/2 medium (Guillard 1975), in a culture chamber (Friocell, FC111). Cells were counted daily under a light microscope (MicroBioTests Inc.) using a hemacytometer and by measuring the absorbance (640 nm) with a spectrophotometer (USB4000). En aguas naturales existe una mezcla de compuestos orgánicos producidos por microorganismos y diferentes microalgas. Para elucidar la influencia de los diferentes ligandos orgánicos excretados por estos organismos se requieren estudios con especies individuales de microalgas. En este trabajo se estudió el efecto de los exudados producidos por una especie en particular, la diatomea Phaeodactylum tricornutum, en la velocidad de oxidación del Fe(II), en función del pH (7.2–8.2), la temperatura (5–35 ºC) y la salinidad (10–36.72). Los experimentos se llevaron a cabo para distintas fases de crecimiento. Se ha seleccionado esta especie de diatomea debido a su amplia variedad de hábitats y porque es considerada uno de los organismos fotosintéticos más abundantes en el medio marino. MATERIALES Y MÉTODOS Reactivos El agua de mar utilizada en este estudio procede de una zona frente a la costa de Gran Canaria (septiembre de 2009). La disolución patrón de Fe(II) (4 × 10–4 M) se preparó a partir de sulfato de Fe(II) amónico hexahidratado (Sigma), acidificado a pH 2 con HCl Suprapuro (Sigma) en NaCl (0.7 M). La concentración inicial de Fe(II) en los estudios fue 25 nM. Todas las disoluciones fueron preparadas con agua Milli-Q (18 MQ) y filtradas por 0.1 μm. Los reactivos empleados para la determinación de Fe(II) eran de grado analítico traza. Los nutrientes del medio de cultivo f/2 se prepararon de acuerdo con Guillard (1975). Las disoluciones estándares de nutrientes se prepararon a partir de nitrato de sodio (Sigma) (0.88 M), hidrógeno fosfato de potasio (Sigma) (0.03 M) y silicato de sodio (Sigma) (0.14 M). Para las diversas condiciones fisicoquímicas de este estudio, la concentración de NO3–, HPO42– y SiO32– se mantuvo constante en 8.83 × 10–4, 2.93 × 10–5 y 1.42 × 10–4 M, respectivamente. Medidas de pH El pH se midió en escala libre de ión hidrógeno, pHF= –log[H+], haciendo uso de un potenciómetro Orion y calibrando el electrodo combinado (ROSS Combination, glass body) con la disolución tampón Tris-(hidroximetil)aminometano(Tris)-agua de mar artificial (Millero 1986). La disolución tampón se preparó en 0.005 mol kg–1 Tris y TrisHCl en agua de mar artificial. En este estudio se consideró el efecto de la temperatura y la salinidad en el pK* del Tris de agua de mar. Cultivos de algas Se seleccionó P. tricornutum como la especie de fitoplancton para estudiar el efecto de los exudados en la constante de velocidad de oxidación del Fe(II). Esta diatomea fue suministrada por el Banco Español de Algas (BEA) de Ciencias Marinas, Vol. 38, No. 1B, 2012 248 Algae were cultured in 0.45-μm filtered seawater enriched with nutrients from the f/2 medium. The initial cell concentration was always 107 cell L–1. The temperature was kept constant at 24 ºC under permanent illumination (24 h). The cultures reached the stationary phase at a density of 4.98 × 108 cell L–1 after 8 days (fig. 1). Before each experiment, the cultures were filtered in two steps, first by gravity with a 1.2-μm filter and second by vacuum using a 0.1-μm filter in order to avoid rupturing the cells. All the filters used in this study were previously washed with HCl solution (10% in Milli-Q water). The control seawater was prepared using seawater enriched with the same f/2 nutrient concentrations and filtered through a 0.1-µm filter. The method is summarized in figure 2. Oxidation experiments The oxidation experiments were carried out in a thermostated, double-jacketed glass vessel (250 mL) for the temperature range of 5–35 ºC, using an AG-2 bath (±0.02 ºC). The samples were stirred with a teflon-coated magnetic stirrer. The rate of Fe(II) oxidation was studied in the control seawater and in the seawater enriched with exudates under airsaturated conditions, by bubbling the solution with pure air for 1 h prior to and during the experiments. The pH was adjusted to the desired value (±0.01) with small additions of Suprapur HCl 0.1 M using an automatic titrator system (Titrino 719S, Methrom). The addition of Fe(II) (25 nM) to Taliarte (Gran Canaria). Los cultivos axénicos se mantuvieron con el medio f/2 (Guillard 1975) en una cámara de cultivo (Friocell, FC111). Las células fueron contadas diariamente haciendo uso de un microscopio (MicroBioTests Inc.) con un hemocitómetro y midiendo la absorbancia (640 nm) con un espectrofotómetro (USB4000). Las algas se cultivaron en agua de mar (filtrada por 0.45 μm) enriquecida con los nutrientes del medio de cultivo f/2. La concentración de células inicial siempre fue 107 cél L–1. La temperatura se mantuvo constante a 24 ºC, bajo iluminación permanente (24 h). Los cultivos alcanzaron la fase estacionaria a una densidad de 4.98 × 108 cél L–1, después de 8 días de crecimiento (fig. 1). Antes de cada experimento, los cultivos se filtraron en dos etapas, la primera por gravedad, con un filtro de 1.2 μm, y la segunda al vacío, utilizando un filtro de 0.1 μm para evitar la ruptura de células. Todos los filtros utilizados en este estudio fueron previamente lavados con HCl (10% en agua Milli-Q). El agua de mar control se preparó a partir de agua de mar con la misma concentración de nutrientes f/2, también filtrada por 0.1 μm. El método se resume en la figura 2. Experimentos de oxidación Los estudios de oxidación del Fe(II) se llevaron a cabo en un matraz de reacción de vidrio de doble camisa, termostatizado (250 mL) usando un baño AG-2 (±0.02 ºC), para un rango de temperatura entre 5 y 35 ºC. Las muestras fueron agitadas con un agitador magnético recubierto de teflón. La velocidad de oxidación del Fe(II) se estudió en el agua de mar control y en el agua de mar enriquecida con exudados orgánicos en condiciones de saturación de aire, burbujeando la disolución con aire puro durante una hora, antes del estudio y durante el mismo. El pH se ajustó al valor deseado (±0.01) con pequeñas adiciones de HCl suprapuro 0.1 M, a través de un sistema valorador automático (Titrino 719S, Methrom). La adición de Fe(II) (25 nM) a la muestra correspondió con el tiempo cero de reacción. La salinidad del agua de mar, 36.72, se determinó con un salinómetro (Portasal 8410A). El efecto de la salinidad se estudió diluyendo la muestra original con agua Milli-Q y el efecto del bicarbonato se corrigió de acuerdo con Santana-Casiano et al. (2005). Análisis del Fe(II) La concentración del Fe(II) se determinó espectrofotométricamente con el método de la ferrozina (Violler et al. 2000). La ferrozina y el Fe(II) muestran un máximo de absorción a 562 nm. Cada 30 segundos se añadieron 10 mL de muestra a un matraz de vidrio de 25 mL que contenía ferrozina (50 μL de 0.01 M), disolución tampón de acetato (2 mL, pH 5.5) y NaF (50 μL de 7.1 × 10–4 M). Cuando el NaF se emplea con una disolución tampón de acetato y ferrozina, la absorbancia Figure 1. Growth curve of Phaeodactylum tricornutum under experimental conditions: f/2 nutrients ([NO3–] = 8.83 × 10–4 M, [HPO42–] = 2.93 × 10–5 M, and [SiO32–] = 1.42 × 10–4 M), illumination for 24 h and 24 ºC. Figura 1. Curva de crecimiento de Phaeodactylum tricornutum en las condiciones experimentales: nutrientes f/2 ([NO3–] = 8.83 × 10–4 M, [HPO42–] = 2.93 × 10 –5 M y [SiO32–] = 1.42 × 10–4 M), con iluminación las 24 h y a 24 ºC. 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 Time (days) 02468 González et al.: Fe(II) oxidation with diatom organic exudates 249 the sample corresponded to reaction time zero. The salinity of the seawater, 36.72, was determined using a salinometer (Portasal, 8410A). The effect of salinity was studied by diluting the samples with Milli-Q water and the effect of bicarbonate was corrected according to Santana-Casiano et al. (2005). Fe(II) analysis The Fe(II) concentration was determined spectrophotometrically using the ferrozine method (Violler et al. 2000). The ferrozine and Fe(II) formed a peak at 562 nm. Every 30 seconds, 10 mL of sample were added to a 25-mL glass flask containing ferrozine (50 μL of 0.01 M), acetate buffer (2 mL, pH 5.5), and NaF (50 μL of 7.1 × 10–4 M). When the NaF was used with an acetate buffer and the ferrozine solution, a stable absorbance reading was observed for over 30 min (González-Dávila et al. 2005). A 5-m-long waveguide capillary flow cell (World Precision Instruments) connected to a UV-Vis detector (Ocean Optics, USB2000) was used to measure Fe(II) at nanomolar concentrations. The light used was a halogen light source (Mikropack HL-2000-FHSA). The capillary flow cell and the UV detector were connected using optical fiber. The spectra were recorded using the OOIBase32 software by Ocean Optics. The sample was introduced into the column permanece estable después de 30 min (González-Dávila et al. 2005). Se utilizó una columna capilar de 5 m de paso de luz (World Precision Instruments) conectada a un detector UVVis USB2000 (Ocean Optics) que permite medir concentraciones nanomolares de Fe(II). La luz empleada fue de una fuente halógena (HL-2000-FHSA de Mikropack). La cubeta de flujo y el detector UV-Vis estaban conectados con fibra óptica. El espectro se registró directamente a través del programa OOIBase32 de Ocean Optics. La muestra se introdujo en la cubeta con una bomba peristáltica (EXPETEC Perimax 12) a un flujo de 1 mL min–1. La constante aparente de velocidad de oxidación, kapp (kg mol–1 min–1), se determinó considerando (5) donde, en condiciones saturadas de aire, kapp = k′/[O2]. Los valores de [O2] se determinaron a partir de la ecuación de solubilidad (Benson y Krause 1984). La constante de velocidad de pseudo-primer orden, k′, se determinó a partir de la regresión lineal del ln[Fe(II)] frente al tiempo, para tiempos superiores al tiempo de vida medio (t1/2), y el coeficiente de regresión R2 siempre fue ≥ 0.98. A concentraciones micromolares de Fe(II) se consideró una estequiometría de oxídación dFeII()[]dt⁄k′Fe II()[]–= Figure 2. Diagram of the experimental method applied in this study to collect organic exudates of Phaeodactylum tricornutum. Figura 2. Diagrama del método experimental aplicado en este estudio para recolectar los exudados orgánicos de Phaeodactylum tricornutum. Seawater Filtered (0.45 m)μ Seawater enriched Control Kinetic experiments Seawater enriched with organic exudates [NaNO ] = 883.10 M 3 -6 [Na SiO ] = 142.10 M 3 -6 2 [K HPO ] = 29.3 M 42 .10 -6 Filtrate (1.2 m gravity and ) μ μ0.1 m vacuum T=24 C Illuminated 24 h ° Phaeodactylum tricornutum [cell] =1 x 10 cell L 0 7 -1 Ciencias Marinas, Vol. 38, No. 1B, 2012 250 using a peristaltic pump (EXPETEC Perimax 12) at a flux of 1 mL min–1. The apparent rate constant, kapp (kg mol–1 min–1), was computed considering: (5) where, under air-saturated conditions, kapp = k′/[O2]. The values of [O2] were determined from the solubility equation (Benson and Krause 1984). The pseudo-first-order kinetic rate constant, k′, was determined from the linear regression of ln[Fe(II)] vs time, for times over half-life time (t1/2), where the regressions were R2 ≥ 0.98. At micromolar concentrations of Fe(II), a 4:1 stoichiometry of Fe(II) oxidation by oxygen was considered, but at nanomolar levels this stoichiometry is no longer valid (Santana-Casiano et al. 2005). RESULTS AND DISCUSSION Effect of cell concentration In seawater with only f/2 medium nutrients added, P. tricornutum showed an exponential growth phase (day 2 = 6.21 × 107 cell L–1, day 4 = 2.29 × 108 cell L–1) and a stationary phase (day 8 = 4.98 × 108 cell L–1) (fig. 1), similar to the results obtained in previous studies (Vasconcelos et al. 2002, Vasconcelos and Leal 2008). We studied the effect of the organic exudates excreted by P. tricornutum cultured at different growth phases and at different cell concentrations (107 – 4.98 × 108 cell L–1) (fig. 3). The apparent Fe(II) oxidation rate constant decreased in the exudate medium as the cell concentration increased with time of growth (fig. 3). The major differences were observed in dFeII()[]dt⁄k′Fe II()[]–= de 4:1 para esta especie por el oxígeno, pero a niveles nanomolares ésta proporción ya no es valida (Santana-Casiano et el. 2005). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Efecto de la concentración de células La figura 1 muestra que en el agua de mar donde sólo se añadieron nutrientes del medio de cultivo f/2, P. tricornutum creció con una fase exponencial (2º día = 6.21 × 107 cél L–1, 4º día = 2.29 × 108 cél L–1) y una estacionaria (8º día = 4.98 × 108 cél L–1), de manera similar a resultados obtenidos previamente (Vasconcelos et al. 2002, Vasconcelos y Leal 2008). Se estudió el efecto de los exudados orgánicos excretados por P. tricornutum cultivada en diferentes fases de crecimiento y diversas concentraciones de células (107 – 4.98 × 108 cél L–1) (fig. 3). La constante aparente de oxidación del Fe(II) disminuyó en el medio con exudados al aumentar la concentración de células productoras o el tiempo de crecimiento (fig. 3). Las mayores diferencias se observaron en los casos de exudados correspondientes a 4.98 × 108 cél L–1. El log kapp para 4.98 × 108 cél L–1 fue 2.82 ± 0.02 kg mol–1 min–1, 0.22 unidades menor que en agua de mar enriquecida con nutrientes del medio f/2 (log kapp = 3.04 ± 0.01 kg mol–1 min–1), una diferencia total de 436 kg mol–1 min–1 en kapp. Por lo tanto, la diferencia máxima en términos de kapp entre el agua de mar control y el agua de mar con exudados orgánicos añadidos de cultivos de P. tricornutum, a pH = 8.0 y T = 25 ºC, fue un 60% menor. Los resultados experimentales se Figure 3. Fe(II) oxidation rate constant in seawater enriched with exudates (a) as a function of the growth stage and (b) as a function of the cell concentration. The dashes represent the reference value for seawater (with f/2 nutrients). The solid lines show the fitted values obtained from equation 6. Figura 3. Constante de velocidad de oxidación del Fe(II) en agua de mar enriquecida con exudados (a) en función de la fase de crecimiento y (b) en función de la concentración de células. La línea punteada representa el valor de referencia para el agua de mar (con nutrientes f/2). Las líneas sólidas muestran los valores del ajuste a partir de la ecuación 6. a 3.10 3.05 3.00 2.95 2.90 2.80 2.85 2.75 seawater + exudates seawater with nutrients Time (days) 024680 1e+8 2e+8 3e+8 4e+8 5e+8 b González et al.: Fe(II) oxidation with diatom organic exudates 251 the case of exudates produced at 4.98 × 108 cell L–1. Log kapp at 4.98 × 108 cell L–1 was 2.82 ± 0.02 kg mol–1 min–1, 0.22 units lower than in seawater enriched with nutrients (log kapp = 3.04 ± 0.01 kg mol–1 min–1), a total difference of 436 kg mol–1 min–1 in kapp. Therefore, the maximum difference in kapp between the control seawater and seawater with extra organic exudates from the P. tricornutum cultures was 60% less, at pH 8.0 and temperature of 25 ºC. The experimental data were fitted to a polynomial function (equation 6) as a function of the cell concentration (cell L–1), where R2=0.99. (6) The decrease in the Fe(II) oxidation rate in the presence of the organic exudates from P. tricornutum resulted in an increase in the half-life time (t1/2), from 3.0 min (seawater) to 3.4 min (6.21 × 107 cell L–1), 4.0 min (2.29 × 108 cell L–1), and 5.1 min (4.98 × 108 cell L–1), at pH 8.0 and temperature of 25 ºC (table 1). This result showed that t1/2 was almost double when the seawater was enriched with exudates excreted from 4.98 × 108 cell L–1 of P. tricornutum, allowing Fe(II) to remain in solution for a longer period of time. The linear decrease of log kapp as a function of cell concentration in the culture showed that the type of organic ligands that were interacting with Fe(II) either did not change over time or, if changes took place, they behaved in a similar way. The observed effect presented in this paper is due to the wide spectrum of exudates excreted by P. tricornutum. Some recent studies have analyzed the exudates produced by P. tricornutum in seawater enriched with nutrients (Vasconcelos et al. 2002, Vasconcelos and Leal 2008) under similar growth conditions. It was established that thiolic compounds were major contributors to the organic ligands released by eukaryotic algae, such as P. tricornutum. The concentration of cysteine and glutathione (as thiolic compounds) increases as the cell concentration increases in the culture. Cysteine was found to be the most important ligand excreted. The regeneration of Fe(II) in the presence of cysteine has also been demonstrated (Santana-Casiano et al. 2000). In addition, free cysteine and compounds identified as glutathione (c-glutamylcysteinylglycine) have been found in natural seawater (van den Berg et al. 1988, Le Gall and van den Berg 1993). Therefore, considering the mix of exudates excreted by P. tricornutum, thiolic compounds should be responsible for the Fe(II) oxidation. More studies are planned to account for this behavior. Effect of pH, temperature, and salinity The effect of pH, within the range of 7.2 to 8.2, on the Fe(II) oxidation rate constant was studied in seawater enriched with exudates from P. tricornutum cultures (fig. 4), considering the three different growth phases, as shown in figure 1. Log kapp was dependent on pH and the cell densities kapp cell[], log 3.028 4.258 10 10– ×cell[]–= ajustaron a una ecuación polinómica (ecuación 6) en función de la concentración de células ([cél L–1]), donde R2 = 0.99. (6) La disminución de la velocidad de oxidación del Fe(II) en presencia de exudados orgánicos de P. tricornutum incrementó el tiempo de vida media (t1/2) de 3.0 min (agua de mar) a 3.4 min (6.21 × 107 cél L–1), 4.0 min (2.29 × 108 cél L–1) y 5.1 min (4.98 × 108 cél L–1), a pH 8.0 y T = 25 ºC (tabla 1). El hecho de que t1/2 fuese casi el doble cuando el agua de mar se enriqueció con exudados orgánicos excretados por 4.98 × 108 cél L–1 de P. tricornutum, permite que el Fe(II) permanezca en disolución por más tiempo. El decrecimiento lineal de log kapp en función de la concentración de células del cultivo indicó que el tipo de ligandos orgánicos que interactúan con Fe(II), o bien no cambiaron en el tiempo, o si cambiaron, se comportaron de la misma manera. El efecto observado y presentado en este trabajo es debido al amplio espectro de exudados excretados por P. tricornutum. Algunos trabajos recientes han estudiado los exudados producidos por P. tricornutum en agua de mar enriquecida con nutrientes (Vasconcelos et al. 2002, Vasconcelos y Leal 2008) bajo condiciones similares de crecimiento. Así, se estableció que los compuestos tiólicos eran los mayores contribuyentes a los ligandos orgánicos liberados por algas eucariotas como P. tricornutum. La concentración de cisteína y glutatión (como compuestos tiólicos) incrementa con la concentración celular en los cultivos. Se encontró que la cisteína es el ligando excretado más importante. Por otra parte, también se ha demostrado la regeneración de Fe(II) en presencia de cisteína (Santana-Casiano et al. 2000). Además, en agua de mar natural se han encontrado cisteína libre y compuestos identificados como glutatión (c-glutamilcisteinilglicina) (van den Berg et al. 1988, Le Gall y van den Berg 1993). Por lo tanto, considerando la mezcla de exudados excretados por P. tricornutum, los compuestos tiólicos podrían ser responsables de la oxidación del Fe(II). Se han planificado más estudios para conocer este comportamiento. Efecto del pH, la temperatura y la salinidad Se estudió el efecto del pH, en un rango entre 7.2 y 8.2, en la constante de oxidación del Fe(II) (fig. 4) en agua de mar enriquecida con exudados de cultivos de P. tricornutum, considerando las tres fases de crecimiento que se muestran en la figura 1. El log kapp depende del pH y de la densidad celular en los cultivos. Las diferencias entre el log kapp obtenido en agua de mar enriquecida con nutrientes y agua de mar enriquecida con exudados orgánicos fueron más significativas a pHs bajos. Además, estas diferencias fueron más kapp cell[], log 3.028 4.258 10 10– ×cell[]–= Ciencias Marinas, Vol. 38, No. 1B, 2012 252 Table 1. Half-life time estimated from the pseudo-first-order kinetic rate constant for Fe(II) in seawater and in seawater enriched with organic exudates produced by Phaeodactylum tricornutum, as a function of pH, temperature, and salinity. Tabla 1. Tiempo de vida medio estimado para la constante de velocidad de oxidación de pseudo-primer orden del Fe(II) en agua de mar y agua de mar enriquecida con exudados orgánicos producidos por Phaeodactylum tricornutum, en función del pH, la temperatura y la salinidad. Medium pH Temperature (ºC) Salinity log kapp (kg mol–1 min–1) t1/2 (min) Seawater (control) 7.2 7.5 7.8 8.0 8.2 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 25 25 25 25 25 5 15 35 25 25 25 36.72 36.72 36.72 36.72 36.72 36.72 36.72 36.72 10.00 20.00 30.00 2.23 2.41 2.76 3.04 3.22 1.92 2.39 3.45 3.36 3.23 3.12 19.9 13.2 5.9 3.0 2.0 27.6 11.5 1.4 1.3 1.8 2.5 Seawater enriched with exudates after 2 days of culture (6.21 × 107 cell L–1) 7.2 7.5 8.0 8.2 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 25 25 25 25 5 15 35 25 25 25 36.72 36.72 36.72 36.72 36.72 36.72 36.72 10.00 20.00 30.00 2.13 2.44 3.00 3.18 1.91 2.45 3.33 3.12 3.03 3.00 25.3 12.4 3.4 2.3 28.2 10.1 1.3 2.2 2.9 3.3 Seawater enriched with exudates after 4 days of culture (2.29 × 108 cell L–1) 7.2 7.5 8.0 8.2 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 25 25 25 25 5 15 35 25 25 25 36.72 36.72 36.72 36.72 36.72 36.72 36.72 10.00 20.00 30.00 1.96 2.40 2.93 3.33 1.75 2.28 3.40 3.08 2.99 2.94 37.1 13.6 4.0 1.6 40.3 14.8 1.6 2.4 3.2 3.8 Seawater enriched with exudates after 8 days of culture (4.98 × 108 cell L–1) 7.2 7.5 8.0 8.2 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 25 25 25 25 5 15 35 25 25 25 36.72 36.72 36.72 36.72 36.72 36.72 36.72 10.00 20.00 30.00 1.83 2.20 2.82 3.26 1.71 2.24 3.31 3.05 2.91 2.84 50.6 21.3 5.1 1.9 44.2 16.3 2.0 2.6 3.8 4.7 González et al.: Fe(II) oxidation with diatom organic exudates 253 in the cultures. The differences between log kapp obtained from seawater enriched with nutrients and seawater enriched with organic exudates were more significant at lower pH. In addition, these differences were more pronounced when the culture was in the stationary phase (4.98 × 108 cell L–1). Here, ∆log k = 0.41 kg mol–1 min–1 at pH 7.2. In fact, the Fe(II) oxidation rate for pH 7.2 was 60.2% slower in the presence of exudates, and negligible at pH 8.2. The decrease in log kapp as a function of pH for the different growth stages showed that t1/2 for Fe(II) increased from 19.9 min (seawater enriched with nutrients) to 50.6 min (4.98 × 108 cell L–1) at pH 7.2, confirming the important role played by the organic exudates from P. tricornutum in the Fe(II) oxidation rate in seawater as a function of pH. The Fe(II) oxidation rate as a function of pH (fig. 4) was fitted to a second order polynomial function (equation 7), as in other previous studies (Santana-Casiano et al. 2004, 2005; González-Dávila et al. 2006): where R2 was 0.99 and the standard error of estimation in log kapp was 0.08. In addition, the effect of the organic exudates from P. tricornutum was computed by subtracting the dependence of pH in the control seawater and the seawater enriched with exudates (equation 8), where R2 was 0.98 and the standard error of estimation in log kapp was 0.12. The effect of pH on the oxidation of Fe(II) is significant because it can control the contribution of each species to the overall rate constant of Fe(II) in natural waters (SantanaCasiano et al. 2005), and the speciation of both, Fe(II) and organic ligands present in the solution. The effect of temperature on the Fe(II) oxidation rate constant was studied between 5 and 35 ºC (fig. 5) in the presence of organic exudates. The Fe(II) rate constant increased with temperature and decreased as the cell concentration increased. The experimental results were fitted to the following linear equation: where R2 was 0.99 and the standard error of estimation in log kapp was 0.059; T corresponds to temperature in Kelvin. The effect of the exudates was also computed for temperature dependence, by subtraction from the control seawater (equation 10), where R2 was 0.99 and the standard error of estimation in log kapp was 0.12. pronunciadas cuando los cultivos se encontraban en la fase estacionaria (4.98 × 108 cél L–1). Aquí, ∆log k resultó igual a 0.41 kg mol–1 min–1 a pH = 7.2; de hecho, la velocidad de oxidación del Fe(II) a este pH (7.2) fue 60.2% menor en presencia de exudados, siendo despreciable a un pH de 8.2. La disminución de log kapp en función del pH, para las distintas fases de crecimiento, mostró que el t1/2 del Fe(II) aumentó de 19.9 min (agua de mar enriquecida con nutrientes) a 50.6 min (4.98 × 108 cél L–1) a pH 7.2, confirmando el importante papel que juegan los exudados orgánicos de P. tricornutum en la velocidad de oxidación del Fe(II) en agua de mar en función del pH. La constante de velocidad de oxidación del Fe(II) en función del pH (fig. 4) se ajustó a una ecuación polinómica de segundo orden (ecuación 7), como se ha hecho en trabajos previos (Santana-Casiano et al. 2004, 2005; González-Dávila et al. 2006): donde R2 fue 0.99 y el error estándar de determinación en log kapp fue 0.08. Además, el efecto de los exudados orgánicos de P. tricornutum se estimó sustrayendo la dependencia del pH en agua de mar control y el agua de mar enriquecida con exudados (ecuación 8), donde R2 fue 0.98 y el error estándar de determinación en log kapp fue 0.12. El efecto del pH en la oxidación del Fe(II) es significativo debido a que puede controlar la contribución de cada especie a la constante global de oxidación del Fe(II) en aguas naturales (Santana-Casiano et al. 2005) y la especiación de ambos, Fe(II) y ligandos orgánicos presentes en la solución. El efecto de la temperatura en la constante de velocidad de oxidación del Fe(II) se estudió entre 5 y 35 ºC (fig. 5) en presencia de exudados orgánicos. La constante de velocidad de oxidación del Fe(II) aumentó con la temperatura y disminuyó con el incremento en la concentración de células. Los resultados experimentales se ajustaron a una ecuación lineal: donde R2 fue 0.99, el error estándar de determinación en log kapp fue 0.059 y T la temperatura en grados Kelvin. El efecto debido sólo a los exudados también fue estimado en función de la temperatura, sustrayendo el efecto en el agua de mar control (ecuación 10), dando como resultado un R2 de 0.99 y un error estándar de determinación de 0.12 en log kapp. kapp pH, log 9.4 0.1±()2.94 0.03±()pH–0.270.02±()pH23.7 10 10– ×0.1 10 10– ×±()cell[]–+= (7) Δkapp pH, log 17 2±()– 3.6 0.5±()pH 0.16 0.03±()pH2 –1.810 9– ×0.2 10 9– ×±()cell[]++= (8) kapp T, log 18.1 0.4±()4498 130±()T⁄–3.510 10– ×0.7 10 10– ×±()cell[]–= (9) Δkapp T, log 17.1 0.9±()4577 263±()T1.8+⁄10 9– ×0.2 10 9– ×±()cell[]–= (10) Ciencias Marinas, Vol. 38, No. 1B, 2012 260 Chen M, Dei RCH, Wang WX, Guo L. 2003. Marine diatom uptake of iron bound with natural colloids of different origins. Mar. Chem. 81: 177–189. Croot PL, Bowie AR, Frew RD, Maldonado MT, Hall JA, Safi KA, La Roche J, Boyd PW, Law CS. 2001. Retention of dissolved iron and Fe(II) in an iron induced Southern Ocean phytoplankton bloom. Geophys. Res. Lett. 28: 3425–3428. 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