Influencia de la adición al suelo de residuos de almazara en el comportamiento de herbicidas utilizados en el cultivo del olivar

INFLUENCIA DE LA ADICIÓN AL SUELO DE RESIDUOS DE ALMAZARA EN EL COMPORTAMIENTO DE HERBICIDAS UTILIZADOS EN EL CULTIVO DEL OLIVAR Sevilla, Octubre de 2008 Memoria que presenta Mª Alegría Cabrera Mesa para optar al título de Doctor por la Universidad de Sevilla INFLUENCIA DE LA ADICIÓN AL SUELO DE RESIDUOS DE ALMAZARA EN EL COMPORTAMIENTO DE HERBICIDAS UTILIZADOS EN EL CULTIVO DEL OLIVAR Visado en Sevilla, a 10 de Octubre de 2008 LOS DIRECTORES EL TUTOR Dr D. Lucía Cox Meana Investigador Científico Dr. D. Juan Cornejo Suero Profesor de Investigación Dr. D. Rafael Ruiz Contreras Catedrático de Escuela Universitaria Escuela Universitaria de Ingeniería Técnica Agrícola Memoria que presenta Mª Alegría Cabrera Mesa para optar al título de Doctor por la Universidad de Sevilla DOCTOR D. LUIS CLEMENTE SALAS, DIRECTOR DEL INSTITUTO DE RECURSOS NATURALES Y AGROBIOLOGÍA DE SEVILLA DEL CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS Certifica: Que la presente Memoria de Investigación titulada “Influencia de la adición al suelo de residuos de almazara en el comportamiento de herbicidas utilizados en el cultivo del olivar”, presentada por D. Mª Alegría Cabrera Mesa para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla, ha sido realizada en el Departamento de Cristalografía, Mineralogía y Química Agrícola, bajo la dirección del Prof. D. Juan Cornejo Suero y la Dra. Dña. Lucía Cox Meana, reuniendo todas las condiciones exigidas a los trabajos de Tesis Doctorales. En Sevilla, a 10 de Octubre de 2008 El presente trabajo se ha realizado en el marco del proyecto AGL2004-05818-C02-01 del Plan Nacional de I +D (CYCIT), dentro del Programa Nacional de Formación de Personal Investigador. AGRADECIMIENTOS Agradezco a todas las personas que han contribuido al desarrollo de esta tesis, tanto en el plano laboral, como en el personal. En primer lugar quiero agradecer a mis directores de tesis, el Prof. D. Juan Cornejo Suero y la Dra. Dña. Lucía Cox Meana, por su trabajo, consejos y correcciones, gracias a los cuales ha sido posible realizar y finalizar esta tesis doctoral. Gracias por ofrecerme la oportunidad de hacer esta tesis y haberos preocupado por mí y mi futuro profesional. Al Prof. D. Rafael Ruiz Contreras del Departamento de Cristalografía, Mineralogía y Química Agrícola por haber aceptado la tutoría de los cursos de doctorado y de esta memoria. Al Prof. D. William C. Koskinen de la Universidad de Minnesota, donde realicé estancias breves en los años 2006 y 2007, gracias por su bienvenida, hospitalidad y dedicación al trabajo que allí realicé y que corresponde al capítulo de disponibilidad y biodisponibilidad de este trabajo y ha dado lugar a una publicación. Al Prof. D. Damiá Barceló y la Dra. Dña. Mª Jesús López de Alda por aceptar que realizara una estancia breve en el IIQMB (CSIC) en el año 2008, donde se midieron y analizaron las muestras de amitrol. A la Prof. Dña. Mª Carmen Hermosín y el Dr. Rafael Celis por sus sugerencias en la puesta en común de los resultados de este trabajo de tesis. A la Prof. Dña. Celia Maqueda y la Dra. Dña. Esmeralda Morillo por haberme dado la oportunidad de comenzar en esta "aventura" de la investigación. A mis compañeros de Departamento, Pili y Chari, muchas gracias por toda vuestra ayuda en el trabajo de laboratorio y amistad, a Mª Jesús por resolver tantas dudas con el HPLC, a Ana, Miguel y Felipe por brindarme vuestra ayuda en los temas que menos domino, como son la estadística y la informática y vosotros sois todos unos expertos y a Anabel, Bea, Carmen, Cristina y Gracia por vuestro compañerismo. A mis anteriores compañeros que me ayudaron en trabajos previos, María, Fátima, Jaime y Tomás. A personas que han sido compañeros, pero ya no están en este centro: Agüi, Isa, Mª Trini, Marisa, Oliva, Patricia, Rocío, Rosa, Sete y Antonio. A Jose Mª, José Luis y Jorge, por ayudarme con las dudas burocráticas de las estancias y la tesis. A otros compañeros, con los que no he trabajado, pero hacen la convivencia más agradable: Miriam, Rosa, Mercedes, Ángeles y Mª Ángeles. A mis compañeros de Facultad, "los ministros" Flora y Emilio, sé que siempre estareis ahí, tanto en los buenos momentos como en los no tan buenos. A Rut, Inma, Mª Ángeles y Lole. Al personal del ICMAN, especialmente a Mari, Isa y Juan Bosco. A todos los compañeros que he tenido en las estancias breves y que me han ayudado y enseñado tantas cosas. A mis padres, Juan y Estrella, a ellos les agradezco todo el amor y cariño recibido y la educación y enseñanzas que me han dado. A mi hermana Estrella y mi hermano Juan Pablo porque me apoyáis en todo lo que emprendo y siempre podré contar con vosotros. A Juanmi, la persona que me aguanta y soporta, gracias por hacerme mejor persona y por los buenos momentos vividos. Agradezco también al antiguo Ministerio de Educación y Ciencia la concesión de una beca Predoctoral del Plan Nacional de Formación de Personal Investigador dentro del Proyecto AGL2004-05818-C02-01. Y finalmente a las personas no mencionadas que han sido un apoyo y estímulo para este trabajo y han sido importantes en mi vida. RESUMEN En este trabajo de tesis doctoral se han estudiado los procesos de adsorción-desorción, disipación y lixiviación de cuatro herbicidas utilizados ampliamente en el cultivo del olivar (diurón, terbutilazina, MCPA y amitrol) en dos suelos con distintas características, un suelo arcillo limoso, procedente de Mengíbar (Jaén) y otro suelo clasificado como franco arenoso de Coria del Río (Sevilla), así como la influencia que la adición de residuos de almazara (alperujo y compost de alperujo) como enmiendas orgánicas del suelo tiene sobre los procesos estudiados. Se ha estudiado además la mineralización de los herbicidas diurón y terbutilazina y el efecto que tiene sobre ella la adición de alperujo. Lo más novedoso de este trabajo ha sido el estudio del efecto de la aplicación de los residuos de almazara en el estudio de la persistencia de ambos herbicidas en condiciones reales de campo. Los estudios de adsorción-desorción en los suelos no enmendados mostraron mayor adsorción del herbicida diurón, seguido de terbutilazina, amitrol y MCPA. La aplicación de la enmienda al suelo en los estudios de laboratorio propició un aumento de la adsorción de los herbicidas, debido al aumento en materia orgánica que proporcionan los residuos de almazara, excepto en los suelos enmendados en el campo, debido probablemente a la menor cantidad de enmienda añadida y menor homogeneidad de la enmienda en el suelo que en los suelos enmendados en el laboratorio. Con la adición de las enmiendas al suelo también se ha observado un aumento en la irreversibilidad del proceso de adsorción de los herbicidas. De acuerdo en lo observado en los estudios de disipación, la vida media de los herbicidas varía según el tipo de suelo, aumentando en el suelo más arcilloso en el siguiente orden: amitrol, terbutilazina, diurón y MCPA, mientras que en el suelo arenoso el orden es al contrario: MCPA, diurón y terbutilazina. El efecto de la enmienda consistió en un aumento de la vida media de los herbicidas. Respecto a la lixiviación de los herbicidas, ha sido MCPA el herbicida del que se ha recuperado mayor cantidad en los lixivados, lo cual concuerda con su menor adsorción, seguido del herbicida terbutilazina en el suelo arcillo limoso. En el suelo arenoso se detectó también diurón en los lixivados, hecho que no ocurría en el suelo arcilloso. La adición de alperujo y alperujo compostado ha reducido la lixiviación de los herbicidas estudiados. Se ha estudiado también la disponibilidad y biodisponibilidad de terbutilazina y atrazina en dos suelos arenosos de distinto origen, uno de Coria del Río (Sevilla) y otro de Becker (Minnesota), y el efecto de la adición de enmienda y del envejecimiento del herbicida en el suelo. Estos estudios han puesto de manifiesto el aumento de la adsorción de los herbicidas con el aumento del tiempo de incubación en los suelos no enmendados y en el caso de terbutilazina en los suelos enmendados con alperujo. El estudio de biodisponibilidad se ha realizado utilizando la bacteria Pseudomons sp. cepa ADP que es específica en la mineralización de atrazina. La mineralización de atrazina y terbutilazina ha sido baja, debido probablemente a que la bacteria ha usado el C y N del suelo y de la enmienda, en vez del C y N del herbicida. La adición de alperujo ha disminuido la mineralización de los herbicidas en comparación con la mineralización en el suelo no enmendado. Índice 3 3.4.5.- Estudios de lixiviación .............................................................. 109 3.4.6.- Estudios de disponibilidad y biodisponibilidad ......................... 111 3.5.- Estudios de campo ......................................................................... 116 3.5.1- Estudios de persistencia .............................................................. 117 3.6.- Técnicas analíticas ......................................................................... 119 4.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................... 123 4.1.- Estudios de adsorción-desorción .................................................. 123 4.1.1.- Diurón ........................................................................................ 123 4.1.1. a) Isotermas de adsorción ........................................................ 123 4.1.1. b) Estudios de desorción .......................................................... 130 4.1.2.- Terbutilazina .............................................................................. 134 4.1.2. a) Isotermas de adsorción ........................................................ 134 4.1.2. b) Estudios de desorción .......................................................... 139 4.1.3.- MCPA ........................................................................................ 143 4.1.3. a) Isotermas de adsorción ........................................................ 143 4.1.3. b) Estudios de desorción .......................................................... 147 4.1.4.- Amitrol ...................................................................................... 149 4.1.4. a) Isotermas de adsorción ........................................................ 149 4.1.4. b) Estudios de desorción .......................................................... 152 4.2.- Estudios de disipación ................................................................... 155 4.2.1.- Diurón ........................................................................................ 155 4.2.2.- Terbutilazina .............................................................................. 158 4.2.3.- Estudios de mineralización de diurón y terbutilazina ................ 161 4.2.3. a) Diurón .................................................................................. 161 4.2.3. b) Terbutilazina........................................................................ 165 4.2.4.- MCPA ........................................................................................ 169 4 4.2.5.- Amitrol ...................................................................................... 172 4.3.- Estudios de lixiviación ................................................................... 175 4.3.1.- Diurón ....................................................................................... 175 4.3.2.- Terbutilazina ............................................................................. 183 4.3.3.- MCPA ....................................................................................... 190 4.3.4.- Amitrol ...................................................................................... 193 4.4. Estudio de la aplicación de alperujo en la disponibilidad de atrazina y terbutilazina en suelos ......................................................... 197 4.4.1.- Estudio de la disponibilidad mediante extracciones con disolventes acuosos y orgánicos ........................................................... 197 4.4.2.- Estudio de la biodisponibilidad mediante la bacteria Pseudomonas sp. cepa ADP ................................................................. 205 4.5.- Estudios de persistencia de diurón y terbutilazina en parcelas experimentales ....................................................................................... 209 4.6.- Influencia de la adición de alperujo en la producción del olivo 225 5.- CONCLUSIONES ............................................................................... 231 6.- BIBLIOGRAFÍA ................................................................................. 237 7.- PUBLICACIONES .............................................................................. 271 5 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1.1. Clasificación de los procesos que determinan la dinámica de los plaguicidas en el suelo ..................................................................... 21 Tabla 1.2. Características físico-químicas del alperujo (Alburquerque et al., 2004) .................................................................................................. 75 Tabla 1.3. Características físico-químicas del alperujo compostado (Cegarra et al., 2006, Alburquerque et al., 2006a, Alburquerque et al., 2006b, Cayuela et al., 2006, Alfano et al., 2008) ........................................ 84 Tabla 3.1. Propiedades físico-químicas de los suelos originales y los suelos enmendados. ................................................................................... 101 Tabla 3.2. Propiedades físico-químicas de las enmiendas orgánicas aplicadas, alperujo fresco y alperujo compostado. ..................................... 103 Tabla 3.3. Contenido en M.O y C.O. de los suelos de las parcelas donde se realizó el estudio de persistencia. T: suelo testigo, no enmendado; AF: enmendado con alperujo fresco; AC: enmendado con alperujo compostado. .................................................................................. 118 Tabla 3.4. Condiciones utilizadas para el análisis de los herbicidas por HPLC con detector de fotodiodos. .............................................................. 119 Tabla 4.1. Parámetros de Freundlich de adsorción de diurón y valores de Koc.......................................................................................................... 123 Tabla 4.2. Parámetros de Freundlich de adsorción de diurón coaplicado con terbutilazina y valores de Koc. ........................................... 129 Tabla 4.3. Parámetros de Freundlich de desorción de diurón y porcentajes de histéresis y de desorción. ........................................................ 131 Tabla 4.4. Parámetros de Freundlich de desorción de diurón coaplicado con terbutilazina y porcentajes de histéresis y de desorción .... 134 Tabla 4.5. Parámetros de Freundlich de adsorción de terbutilazina y valores de Koc. ............................................................................................ 135 Tabla 4.6. Parámetros de Freundlich de adsorción de terbutilazina coaplicada con diurón y valores de Koc. ..................................................... 139 6 Tabla 4.7. Parámetros de Freundlich de desorción de terbutilazina y porcentajes de histéresis y de desorción .................................................... 141 Tabla 4.8. Parámetros de Freundlich de desorción de terbutilazina aplicada junto a diurón y porcentajes de histéresis y de desorción ........... 142 Tabla 4.9. Parámetros de Freundlich de adsorción de MCPA y valores de Koc. ........................................................................................................ 145 Tabla 4.10. Parámetros de Freundlich de desorción de MCPA y porcentajes de histéresis y de desorción. ................................................... 149 Tabla 4.11. Parámetros de Freundlich de adsorción de amitrol y valores de Koc ............................................................................................ 151 Tabla 4.12. Parámetros de Freundlich de desorción de amitrol y porcentajes de histéresis y de desorción. ................................................... 153 Tabla 4.13. Vida media de diuron en los suelos originales y enmendados y cuadrado del coeficiente de regresión del ajuste lineal de una cinética de 1er orden realizado en Octubre de 2005. ...................... 155 Tabla 4.14. Vida media de terbutilazina en los suelos originales y enmendados estudiados, realizado en Octubre de 2005. .......................... 158 Tabla 4.15. Porcentaje de 14C diurón mineralizado, tras 20 semanas desde su aplicación al suelo, extraído tras el estudio de mineralización y determinado por oxidación del suelo, así como diurón total y principales metabolitos analizados por HPLC. La cantidad de diurón inicialmente aplicada fue de 75 µg g-1. ....................................................... 162 Tabla 4.16. Porcentaje de 14C terbutilazina mineralizado transcurridas 40 semanas desde su aplicación al suelo, extraído tras el estudio de mineralización y determinado por oxidación del suelo. .............................. 168 Tabla 4.17. Vida media de MCPA en los suelos originales y enmendados con alperujo fresco o compostado y cuadrado del coeficiente de regresión del ajuste lineal .................................................... 171 Tabla 4.18. Vida media de amitrol en el suelo original y enmendado calculada del ajuste lineal a una cinética de 1er orden y cuadrado del coeficiente de regresión de la recta ............................................................ 173 Índice de tablas 7 Tabla 4.19. Porcentajes de diurón extraído cada 5 cm de profundidad y eluído, extraído y recuperado total de columnas de suelo empaquetadas manualmente ...................................................................... 178 Tabla 4.20. Porcentaje de diurón extraído, eluído y recuperado en columnas de suelo empaquetadas manualmente respecto a la cantidad inicial de herbicida aplicado, cuando se aplicó terbutilazina conjuntamente ............................................................................................. 182 Tabla 4.21. Porcentajes de terbutilazina eluídos y extraídos en cada fragmento de columna de suelo empaquetada a mano .............................. 187 Tabla 4.22. Porcentajes de terbutilazina eluído, extraído y recuperado de columnas de suelo empaquetadas a mano cuando se aplicó junto con diurón en el suelo original BJ y enmendado con alperujo .................... 190 Tabla 4.23. Porcentaje de MCPA total eluido, extraído y recuperado en las columnas de suelo empaquetadas manualmente con los suelos sin enmendar y los mismos suelos enmendados con alperujo ................... 192 Tabla 4.24. Porcentaje de amitrol extraído, eluído y recuperado respecto a la cantidad inicial de herbicida aplicado en columnas de suelo empaquetadas a mano ...................................................................... 194 Tabla 4.25. Coeficientes de adsorción Kd y Koc calculados en suelos P2 y MN sin enmienda y enmendados con alperujo a distintos tiempos de incubación .............................................................................................. 203 Tabla 4.26. Porcentaje de 14C herbicida mineralizado por Pseudomonas sp. cepa ADP en los suelos P2 y MN no enmendados y enmendados con alperujo durante un periodo de incubación de 28 días .............................................................................................................. 207 Tabla 4.27. Cantidad de diurón extraído (expresado en µg g-1) de las muestras de suelo tomadas en Mengíbar (Jaén) durante la campaña 05/06 ............................................................................................................ 209 Tabla 4.28. Cantidad de DCPMU extraído (expresado en µg g-1) de las muestras de suelo tomadas en Mengíbar (Jaén) durante la campaña 05/06 ............................................................................................................ 213 Tabla 4.29. Cantidad de terbutilazina extraído (expresado en µg g-1) de las muestras de suelo tomadas en Mengíbar (Jaén) durante la campaña 05/06 ............................................................................................ 216 8 Tabla 4.30. Cantidad de diurón (expresada en µg g-1) extraído de las muestras de campo durante la temporada 06/07 ....................................... 219 Tabla 4.31. Cantidad de DCPMU (expresada en µg g-1) extraído de las muestras de campo durante la temporada 06/07 ................................. 221 Tabla 4.32. Cantidad de terbutilazina (expresada en µg g-1) extraída de las muestras de campo durante la temporada 06/07 ............................ 222 Tabla 4.33. Producción de los olivos de las parcelas sin enmienda (T1, T2, T3); enmendadas con alperujo fresco (AF1, AF2, AF3); enmendadas con alperujo compostado (AC1, AC2, AC3) ......................... 228 9 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1.1. Procesos que determinan la dinámica de los plaguicidas en el suelo ................................................................................................... 22 Figura 1.2. Tipos de isotermas de adsorción según Giles et al. (1960) ..... 31 Fig. 3.1. Estructura molecular de los herbicidas a) diurón, b) terbutilazina, c) MCPA y d) amitrol .............................................................. 95 Figura 3.2. Esquema del proceso de adsorción de los herbicidas en las muestras de suelo .................................................................................. 104 Figura 3.3. Dibujo de las columnas de suelo empaquetadas a mano y utilizadas para el estudio de lixiviación de los plaguicidas .......................... 110 Figura 3.4. Esquema del olivar en Mengíbar (Jaén) de donde se tomaron las muestras de suelo para el estudio de campo. En azul las parcelas sin enmienda, en rojo las parcelas donde se aplicó alperujo fresco y en amarillo donde se aplicó alperujo compostado ........................ 116 Figura 4.1. a) Isotermas de adsorción de diurón aplicado en los suelos originales y enmendados con alperujo. b) Ajuste lineal de las isotermas de adsorción ............................................................................... 124 Figura 4.2. a) Isotermas de adsorción de diurón aplicado junto con terbutilazina en el suelo original BJ y el mismo suelo enmendado con alperujo. b) Ajuste lineal de las isotermas de diurón coaplicado con terbutilazina ................................................................................................. 128 Figura 4.3. Isotermas de adsorción-desorción de diurón en los suelor originales y enmendados con alperujo ........................................................ 132 Figura 4.4. Isotermas de adsorción desorción de diurón aplicado con terbutilazina en el suelo BJ sin enmendar y enmendado con alperujo ....... 133 Figura 4.5. a) Isotermas de adsorción de terbutilazina en los suelos sin enmendar y enmendados con alperujo. b) Ajuste lineal de las isotermas de adsorción de terbutilazina ...................................................... 136 Figura 4.6. a) Isotermas de adsorción de terbutilazina aplicado con diurón en el suelo BJ original y enmendado con alperujo. b) Ajuste lineal de las isotermas de adsorción de terbutilazina coaplicado con diurón ........................................................................................................... 138 10 Figura 4.7. Isotermas de adsorción-desorción de terbutilazina en los suelos originales y enmendados con alperujo ............................................ 140 Figura 4.8. Isotermas de adsorción-desorción de terbutilazina aplicado con diurón en el suelo original BJ y el mismo suelo enmendado con alperujo ....................................................................................................... 143 Figura 4.9. a) Isotermas de adsorción de MCPA en los suelos sin enmendar y enmedados con alperujo. b) Ajuste lineal de las isotermas de adsorción de MCPA en los mismos suelos ........................................... 144 Figura 4.10. Isotermas de adsorción-desorción de MCPA en los suelos originales y enmendados ................................................................ 148 Figura 4.11. a) Isotermas de adsorción de amitrol en el suelo BJ sin enmendar y enmendado con alperujo fresco y compostado. b) Ajuste lineal de los datos obtenidos de las isotermas de adsorción de amitrol .... 150 Figura 4.12. Isotermas de adsorción-desorción de amitrol en el suelo BJ sin enmendar y enmendado con alperujo compostado ......................... 152 Figura 4.13. Representación de los porcentajes de diurón extraídos respecto al aplicado inicialmente en el estudio de disipación realizado en Octubre de 2005. a) Suelo BJ no enmendado y enmendado b) Suelo P2 no enmendado y enmendado ..................................................... 156 Figura 4.14. Representación del porcentaje de terbutilazina extraído en los estudios de disipación. a) En el suelo BJ no enmendado y enmendado. b) en el suelo P2 sin enmendar y con enmienda .................. 159 Figura 4.15. Porcentaje acumulado de diurón mineralizado, respecto a la cantidad inicialmente aplicada, tras 20 semanas de estudio .................. 163 Figura 4.16. Porcentaje acumulativo de terbutilazina mineralizado en el suelo original y enmendado, tras 40 semanas de estudio ...................... 166 Figura 4.17. Curvas de disipación de MCPA en los estudios de incubación en los suelos originales y enmendados con alperujo. a) En los suelos BJ sin enmendar y con enmienda. b) En los suelos P2 no enmendado y enmendados ........................................................................ 170 Figura 4.18. Curvas de disipación de amitrol en el suelo sin enmendar y enmendado con alperujo fresco y compostado ....................................... 174 Índice de figuras 11 Figura 4.19. Lixiviación de diurón en columnas de suelo empaquetadas manualmente. a) Curva de elución relativa de diurón en el suelo P2. b) Curva de elución acumulativa de diurón en el suelo sin enmendar P2 ......................................................................................... 176 Figura 4.20. Porcentaje de diurón extraído de las columnas de suelo tras el estudio de elución en los suelos sin enmendar y enmendado con alperujo ................................................................................................. 179 Figura 4.21. Porcentaje de diurón extraído de los distintos fragmentos de las columnas de suelo tras finalizar el estudio de elución y cuando se coaplicó con terbutilazina ....................................................................... 183 Figura 4.22. Lixiviación de terbutilazina en columnas de suelo empaquetadas a mano. a) Curva de elución relativa de terbutilazina en los suelos originales y enmendados b) Curva de elución acumulada de terbutilazina ................................................................................................. 184 Figura 4.23. Porcentaje de terbutilazina extraído de cada fragmento de las columnas de suelo empaquetadas manualmente tras el estudio de elución .................................................................................................... 188 Figura 4.24. Elución de terbutilazina a) relativa y b) acumulativa en las columnas de suelo empaquetadas manualmente y en las que se coaplicó terbutilazina junto con diurón ........................................................ 189 Figura 4.25. a) Curva de elución relativa de MCPA en las columnas empaquetadas manualmente con los suelos originales y enmendado; b) Curva de elución acumulativa de MCPA en las mismas columnas ........ 191 Figura 4.26. a) Detalle de la curva 4.25 a) en la que se ha representado sólo la elución relativa del suelo original BJ y el mismo suelo enmendado con alperujo; b) Curva de elución acumulativa del suelo original BJ y enmendado con alperujo............................................... 191 Figura 4.27. Porcentaje de amitrol extraído de las columnas de suelo tras el estudio de elución en el suelo no enmendado y enmendado con alperujo fresco o compostado ..................................................................... 195 Figura 4.28. a) Porcentaje de terbutilazina extraído. Porcentaje total extraído en el suelo P2, porcentaje total extraído en el suelo (P2+AF)L, extracto acuoso del suelo P2, extracto orgánico del suelo P2, extracto acuoso del suelo (P2+AF)L y extracto orgánico del suelo (P2+AF)L. b) 12 Porcentaje total de 14C terbutilazina recuperado del inicialmente aplicado en el suelo P2, en el suelo (P2+AF)L, porcentaje extraído en el suelo P2, porcentaje no extraíble en el suelo P2, porcentaje extraído en el suelo (P2+AF)L y porcentaje no extraíble en el suelo (P2+AF)L ..................................................................................................... 199 Figura 4.29. a) Porcentaje de atrazina extraído. Porcentaje total extraído en el suelo P2, porcentaje total extraído en el suelo (P2+AF)L, extracto acuoso del suelo P2, extracto orgánico del suelo P2, extracto acuoso del suelo (P2+AF)L y extracto orgánico del suelo (P2+AF)L. b) Porcentaje total de 14C atrazina recuperado del inicialmente aplicado en el suelo P2, en el suelo (P2+AF)L, porcentaje extraído en el suelo P2, porcentaje no extraíble en el suelo P2, porcentaje extraído en el suelo (P2+AF)L y porcentaje no extraíble en el suelo (P2+AF)L ................. 200 Figura 4.30. a) Porcentaje de atrazina extraído. Porcentaje total extraído en el suelo MN, porcentaje total extraído en el suelo (MN+AF)L, extracto acuoso del suelo MN, extracto orgánico del suelo MN, extracto acuoso del suelo (MN+AF)L y extracto orgánico del suelo (MN+AF)L. b) Porcentaje total de 14C terbutilazina recuperado del inicialmente aplicado en el suelo MN, en el suelo (MN+AF)L, porcentaje extraído en el suelo MN, porcentaje no extraíble en el suelo MN, porcentaje extraído en el suelo (MN+AF)L y porcentaje no extraíble en el suelo (MN+AF)L ................................................................... 201 Figura 4.31. Datos de pluviometría y cantidad de herbicida a) diurón y b) terbutilazina extraído de las muestras de suelo del olivar experimental de Mengíbar (Jaén) a distintos días desde la aplicación del herbicida y a distintas profundidades en la campaña 05/06 ................. 212 Figura 4.32. Fotografía del perfil del suelo del olivar experimental de Mengíbar (Jaén) donde pueden apreciarse grietas, responsables del fenómeno de flujo preferencial.................................................................... 213 Figura 4.33. Datos de pluviometría y cantidad de herbicida a) diurón y b) terbutilazina extraído de las muestras de suelo de cada subparcela del olivar experimental de Mengíbar, tomadas a distintos días desde la aplicación del herbicida y a distinta profundidad, durante la campaña 06/07 ........................................................................................................... 220 Figura 4.34. Fotografía del suelo de una de las parcelas donde se realizó el estudio de persistencia de los herbicidas en condiciones de campo, donde puede observarse la enorme cantidad de piedras y hojas presentes en el suelo ........................................................................ 224 20 muy variadas. Entre las estudiadas que afectan al comportamiento de plaguicidas en suelo se encuentran: compost de residuos sólidos urbanos (Sánchez-Camazano et al.; 1996, Barriuso et al.; 1997, Cox et al.; 2001, Morillo et al., 2002), lodos de depuradora (Celis et al., 1998a; Sluszny et al., 1999; Perrin-Garnier et al., 2001), restos de paja (Azam et al., 1988; Houot et al., 1998), bioproductos de la fermentación de maíz, serrín, compost de residuos de jardines municipales, abono de ganado madurado (Moorman et al., 2001), turba (Arienzo et al., 1994; Romero et al., 1998; Si et al., 2006), restos de madera (Menasseri et al., 2004), residuos líquidos de almazara (Cox et al., 1997a y 2001; Morillo et al., 2002; Fernandes et al., 2006) y recientemente se han publicado trabajos sobre el uso de residuos sólidos de almazara utilizados como enmiendas orgánicas en suelos (Albarrán et al., 2003 y 2004; Fernandes et al., 2006; Delgado Moreno y Peña, 2007; Delgado Moreno et al., 2007; Cabrera et al., 2007 y 2008). En este trabajo de tesis hemos estudiado el efecto de la adición de residuos sólidos de almazara (alperujo y alperujo compostado) como enmiendas orgánicas al suelo, en el comportamiento de plaguicidas utilizados en el cultivo del olivar, comparándolo con el comportamiento de dichos plaguicidas en los mismos suelos no enmendados. Gran parte de los estudios han sido realizados en laboratorio, sin embargo se ha incluido un estudio de campo para conocer el efecto que la aplicación periódica de los residuos de almazara tiene en la persistencia y movilidad de los plaguicidas. Este último estudio aporta el grado de innovación a esta tesis, pues no nos consta la existencia de estudios previos del efecto de la aplicación de estos residuos en campo en el comportamiento de plaguicidas. Introducción 21 A continuación se describen los procesos más importantes que afectan a los plaguicidas en los suelos tras su aplicación y se hará una introducción sobre el cultivo del olivar, producción de aceite de oliva y características del residuo sólido generado en almazaras por el proceso de centrifugación en dos fases (alperujo) que hacen que este residuo sea considerado como enmienda orgánica de suelos agrícolas. 1.1 Dinámica de plaguicidas en suelos El origen de los plaguicidas en los suelos puede ser variado, siendo el principal la aplicación directa al suelo o bien a las partes aéreas de las plantas, llegando a alcanzar el suelo por caída o por ser arrastrado por acción del viento o de agua de riego o de lluvia. Los plaguicidas también pueden llegar al suelo por restos vegetales que quedan en el suelo después de la recolección de la cosecha o que se desprenden durante el tratamiento. Tabla 1.1. Clasificación de los procesos que determinan la dinámica de los plaguicidas en el suelo Transferencia o transporte Transformación o degradación Adsorción-desorción Degradación química Lixiviación Biodegradación Escorrentía Fotodegradación Volatilización Absorción Una vez que el plaguicida está en el suelo, éste sufre una serie de procesos que determinan su dinámica (Figura 1.1) y se dividen en dos grandes Dinámica de plaguicidas 22 grupos: 1. Procesos de transferencia o transporte y 2. Procesos de transformación o degradación (Tabla 1.1). Los procesos de transferencia son aquellos en los que el plaguicida se mueve de una fase a otra del suelo o dentro de una misma fase, sin que se produzca ninguna transformación química, mientras que los procesos de transformación implican un cambio en la estructura del plaguicida (Cornejo y Moreno, 1998) dando lugar a la transformación o degradación del herbicida en otros compuestos que pueden ser de igual, mayor o menor toxicidad. Figura 1.1. Procesos que determinan la dinámica de los plaguicidas en el suelo De todos los procesos de transferencia son los procesos de adsorcióndesorción los más importantes en la dinámica de los plaguicidas (Navarro Blaya, 1986), pues influyen en todos los demás (Bailey y White, 1970; Cornejo y Jamet, 2000), por ejemplo, los procesos de volatilización, lixiviación y biodisponibilidad disminuyen generalmente con la adsorción (Day et al., 1968; Guenzi y Beard 1974; Ferreira et al., 2002), mientras que la degradación NIVEL FREATICO ESCORRENTIA FOTODEGRADACION L LIXIVIACION ADSORCION VOLATILIZACIÓN DEGRADACION QUIMICA BIODEGRADACION ABSORCION Y EXUDACION DESORCION INFILTRACION INFILTRACION CAPILARIDAD CAPILARIDAD Introducción 23 química o el transporte por partículas en suspensión pueden verse favorecidos (Armstrong et al., 1967; McCarthy y Zachara, 1989). Como consecuencia de los procesos implicados en la dinámica de los plaguicidas en el suelo se produce una pérdida de eficacia de estos compuestos orgánicos y algunos procesos dan lugar a que estos plaguicidas o sus productos de degradación produzcan contaminación del suelo, aguas superficiales y subterráneas, incluso lejos del lugar donde se aplicaron. Resulta por tanto necesario conocer estos procesos para conseguir la máxima eficacia del plaguicida con el menor impacto ambiental y si es necesario establecer las estrategias de prevención y remediación más adecuadas. 1.1.1 Procesos de transferencia 1.1.1.1 Proceso de adsorción-desorción El proceso de adsorción se define como el paso de un soluto desde una fase líquida o gaseosa a la superficie de una fase sólida sin producir cambios en esta misma (Osgerby, 1970). Los procesos de adsorción ocurren con mayor frecuencia entre la disolución del suelo y la fase sólida del suelo, ya que ésta está siempre rodeada de una fina capa de agua y sólo en casos de extrema aridez se produciría la adsorción sólido-gas (Pignatello, 1989). El proceso de adsorción se debe a la atracción o repulsión entre la superficie del adsorbente (macroporos y microporos del suelo) y las moléculas o iones del adsorbato (plaguicida) (Calvet, 1989). Los procesos de adsorción vienen determinados en gran parte por la cantidad de superficie de contacto del sólido, que es inversamente proporcional al tamaño. Son por tanto las fracciones más finas del Dinámica de plaguicidas 24 suelo, tanto orgánicas como inorgánicas, los principales componentes del mismo en la adsorción de plaguicidas (Bailey y White, 1970). La desorción es el proceso inverso a la adsorción y se caracteriza porque las sustancias adsorbidas a la fase sólida del suelo vuelven a la disolución del suelo o a su fase gaseosa. En caso de desorción total de las moléculas adsorbidas se habla de adsorción reversible (Wauchope y Myers, 1985; Monkiedje y Spiteller, 2002), pero si las moléculas adsorbidas se desorben parcialmente se habla entonces de adsorción irreversible (Cox et al., 1995a; Fogg et al., 2003). La irreversibilidad o histéresis es un fenómeno importante ya que en gran medida determina la biodisponibilidad del plaguicida en el suelo. Cuando el plaguicida se encuentra adsorbido a la fase sólida del suelo no está disponible para su transporte o biodegradación, mientras que la desorción provoca el efecto contrario. 1.1.1.1 a) Mecanismos de adsorción La adsorción y retención de plaguicidas en la fase sólida del suelo se debe a una serie de mecanismos que implican fuerzas de atracción. Normalmente no se da un único mecanismo, ya que en la mayoría de los casos la retención de los plaguicidas se produce por una variedad de fuerzas y factores. Según Cornejo y Hermosín (1996) hay mecanismos favorecidos por cambios de entalpía y otros en los que la adsorción produce cambios de entropía, como son las interacciones hidrofóbicas. Entre los mecanismos relacionados con cambios de entalpía se encuentran el enlace iónico, el enlace Introducción 25 covalente, fuerzas de Van der Waals, puente de H, transferencia de carga y cambio de ligando. Interacciones hidrofóbicas La adsorción hidrofóbica fue propuesta como el principal mecanismo de retención de plaguicidas no polares a los sitios activos hidrofóbicos de las sustancias húmicas o de las arcillas del suelo. Los sitios hidrofóbicos activos incluyen cadenas laterales alifáticas o porciones lipídicas y derivados de grupos funcionales de lignina con alto contenido en carbono y bajo número de grupos polares de la macromoléculas de las sustancias húmicas (Senesi, 1992). Las moléculas de agua no compiten con las moléculas hidrofóbicas por los lugares activos. La adsorción hidrofóbica es un mecanismo importante para los plaguicidas ionizables, como prometrina (Khan, 1982), pentaclorofenol (Lee et al., 1990), DDT e insecticidas organoclorados (Senesi, 1993), imazaquin (Ferreira et al., 2002), atrazina y simazina (Herwig et al., 2001). La adsorción hidrofóbica se ha considerado generalmente como un mecanismo independiente del pH, pero Li et al. (2001) observaron que las interacciones hidrofóbicas aumentaban con el aumento del pH de la disolución. Enlace iónico Los compuestos orgánicos iónicos son atraídos electrostáticamente por las superficies de carga opuesta de los componentes del suelo, implica tanto formas aniónicas como catiónicas de los plaguicidas. Plaguicidas que están en forma catiónica en disolución o que pueden aceptar un protón se adsorben por Dinámica de plaguicidas 26 este mecanismo a las superficies con carga negativa de los minerales de la arcilla y de la materia orgánica (Li et al., 2001). Por este mecanismo se adsorben triazinas (Piccolo et al., 1998; Roy et al., 2000; Herwig et al., 2001). Este mecanismo puede verse afectado por impedimento estérico en casos de moléculas de gran tamaño (Senesi, 1992). Las superficies de los óxidos y oxihidróxidos metálicos cargados positivamente atraen a los aniones orgánicos (Cornejo et al., 2000). La adsorción de aniones orgánicos por los suelos mediante enlace iónico no es muy frecuente en climas templados, pues las arcillas y materia orgánica están negativamente cargadas o bien en forma neutra, siendo este tipo de interacción más frecuente en suelos de climas tropicales que contienen cantidades significativas de superficies de adsorción cargadas positivamente en forma de óxidos e hidróxidos de hierro. En este tipo de interacción el pH del medio tiene un papel fundamental ya que puede determinar la existencia de carga en el compuesto orgánico o en la superficie de los coloides del suelo (Celis et al., 1999a y Li et al., 2001). Enlace covalente La formación de enlaces covalentes entre compuestos orgánicos y las sustancias húmicas del suelo, viene ayudada con frecuencia por procesos de catálisis química, fotoquímica o enzimática. Los plaguicidas con tendencia a participar en este tipo de interacciones son aquellos que en su estructura contienen grupos funcionales similares a los componentes del humus (Bollag y Myers, 1992; Bollag et al., 1992; Senesi, 1992). Además, plaguicidas con estructura semejante a los compuestos fenólicos pueden unirse covalentemente al humus. Introducción 27 Fuerzas de Van der Waals Las fuerzas de van der Waals consisten en atracciones débiles, de pequeño alcance, entre dipolo-dipolo o dipolo-dipolo inducido, que pueden verse aumentadas por el efecto hidrofóbico. Las interacciones entre plaguicidas no polares y no iónicos y moléculas de ácidos húmicos son de particular relevancia. Son relativamente débiles y disminuyen rápidamente con la distancia. No obstante, al ser estas fuerzas aditivas (Senesi, 1992), su contribución aumenta con el mayor tamaño de la molécula que interacciona y su capacidad de adaptación a la superficie del adsorbente. La adsorción de picloran a sustancias húmicas parece que tiene lugar por este mecanismo (Nearpass, 1976). En el estudio de los mecanismos de adsorción de dietilftalato a ácidos húmicos, Schulten et al. (2001) sugirieron interacciones dipolo-dipolo entre grupos funcionales del tipo carboxílico y estructuras no cargadas como los anillos aromáticos. Este mecanismo también se ha propuesto que contribuye a la adsorción de imazetapir (Senesi et al., 1997) y fluoridona (Weber et al., 1986). Puente de hidrógeno Este mecanismo consiste en una interacción intra o intermolecular dipolo-dipolo más fuerte que las fuerzas de Van der Waals. El átomo de hidrógeno actúa de puente entre dos átomos electronegativos. Uno de los enlaces es covalente mientras que el otro se hace por fuerzas electrostáticas. Las sustancias húmicas, con muchos grupos funcionales que contienen oxígeno o nitrógeno, forman puentes de hidrógeno con grupos complementarios de las moléculas de plaguicida. Se puede producir competencia con las moléculas de agua por los sitios de adsorción (Senesi, 1992). Numerosos estudios han puesto de manifiesto la importancia de los enlaces de hidrógeno en la adsorción de Dinámica de plaguicidas 28 compuestos como 2,4-D (Johnson et al., 1995), tiazafluron (Cox et al., 1995b) e imazaquin (Ferreira et al., 2002). Transferencia de carga La presencia en las sustancias húmicas tanto de estructuras deficientes en electrones, como las quinonas y estructuras ricas en electrones, como los difenoles, sugiere la posible formación de complejos de transferencia de carga por mecanismos donador-aceptor de electrones. Hay plaguicidas que pueden actuar como donadores de electrones, por ejemplo los grupos amino o los átomos de nitrógeno de heterociclos de las s-triazinas, piridinas e imidazolinonas, o bien como aceptores de electrones, como el anillo bipiridílico desactivado de atrazina (Senesi, 1992). La transferencia de carga implica el solapamiento de los orbitales moleculares y un intercambio parcial de la densidad de electrones (Von Oepen et al., 1991). Senesi et al. (1987) observaron la formación de complejos de transferencia de carga entre centros aceptores de ácidos húmicos y ureas sustituidas y s-triazinas, con capacidad de donar electrones. Cambio de ligando La adsorción por cambio de ligando implica la sustitución de uno o más ligandos del adsorbente por la molécula orgánica, la cual debe ser un agente quelante más fuerte que los ligandos desplazados. Un ejemplo son las moléculas de agua que parcialmente atraen a los cationes polivalentes asociados a la materia orgánica, que son sustituidas por moléculas de adsorbentes como las striazinas y plaguicidas aniónicos (Nearpass, 1976; Senesi, 1992). Dubus et al. (2001) sugirieron que el cambio de ligando en superficies con óxidos es el principal mecanismo de adsorción de clofencet a los suelos estudiados. El Introducción 29 cambio de ligando también se ha propuesto como mecanismo de retención para compuestos iónicos bipolares o zwitteriones como imazaquin en suelos tropicales (Regitano et al., 2000) y glifosato en goetita (Sheals et al., 2002). 1.1.1.1 b) Medida de la adsorción La medida y caracterización de la adsorción permite investigar los mecanismos de este tipo de interacción y obtener resultados comparativos, tanto entre adsorbatos (plaguicidas) como entre adsorbentes (suelos) diferentes y en diversas condiciones (Beck et al., 1993). La adsorción al suelo se caracteriza normalmente por una constante de reparto K, con el subíndice d para indicar distribución. Se define como la proporción entre la cantidad de moléculas adsorbidas y la cantidad de moléculas en disolución en el equilibrio. Ce Cs Donde, Ce es la concentración de soluto en equilibrio con el suelo y Cs es la cantidad adsorbida por unidad de masa del sólido. Frecuentemente se asume que Cs depende linealmente de Ce y se define un coeficiente de distribución, Kd, como: Kd = Cs/Ce No obstante, en la mayoría de los casos la relación entre la cantidad adsorbida y la cantidad en disolución no es lineal por lo que el valor de Kd depende de la concentración a la que se evalúe. Dinámica de plaguicidas 36 por tanto irreversiblemente adsorbido a los coloides del suelo. (Wauchope y Myers, 1985). 1.1.1.1 c) Factores que influyen en la adsorción-desorción Los factores que influyen en los procesos de adsorción desorción pueden agruparse en: - Propiedades físico-químicas del plaguicida - Composición coloidal del suelo - Características de la disolución del suelo - Otros factores: temperatura, humedad Propiedades físico-químicas del plaguicida Las características físico-químicas del plaguicida pueden indicarnos su comportamiento en la adsorción. Entre las características más determinantes destacan la estructura, carga y tamaño molecular, además de su solubilidad en agua. Según Bailey y White (1970), los factores estructurales que determinan el carácter químico de los plaguicidas, y por tanto, su influencia en la adsorción son: la naturaleza de los grupos funcionales del compuesto orgánico, la naturaleza y posición de los grupos sustituyentes respecto al grupo funcional y la presencia y magnitud de insaturaciones en la molécula que puede afectar al balance hidrofílico-hidrofóbico. La carga molecular del plaguicida y su distribución son factores a tener en cuenta en el proceso de adsorción. Los compuestos que existen en disolución Introducción 37 como cationes son rápidamente atraídos por las superficies con carga negativa de los minerales de la arcilla y de las sustancias húmicas. Los plaguicidas aniónicos son repelidos por estos constituyentes, aunque son atraídos por las superficies de carga positiva como los óxidos metálicos. En el caso de que existan electrones π, la naturaleza y posición de los grupos funcionales determina la deslocalización de la carga en la molécula, lo que puede afectar en gran medida a otros mecanismos de interacción tales como los enlace de H o los enlaces por transferencia de carga (Calvet,1989). En algunos casos la carga puede ser débil, produciéndose entonces una simple polaridad de la molécula y la interacción con la superficie adsorbente puede darse entre dipolos inducidos o permanentes. En disolución acusosa los plaguicidas con baja polaridad tienen gran dificultad en competir con las moléculas de agua por las superficies polares y, por ello, las interacciones hidrofóbicas parecen jugar un papel fundamental en la adsorción. El tamaño de la molécula de plaguicida puede influir en la adsorción por diferentes razones. Por una parte tiene una relación directa con las fuerzas de van der Waals, por lo que en moléculas voluminosas este tipo de interacción puede ser importante en la adsorción. Por otro lado, el mayor tamaño puede impedir que la molécula llegue a los microporos de los óxidos metálicos, minerales de la arcilla y otros componentes del suelo. Además, el tamaño molecular influye en la solubilidad en agua (a mayor tamaño menor solubilidad) y, por tanto, de una forma indirecta en la magnitud de la adsorción. De acuerdo con Calvet (1989), parece haber una correlación negativa entre la solubilidad de los plaguicidas en agua y la adsorción a suelos, Dinámica de plaguicidas 38 especialmente para moléculas apolares o de escasa polaridad. Por otro lado, Bailey y White (1970) y Bailey et al. (1968) encontraron una relación directa entre la solubilidad en agua y la adsorción de s-triazinas y ureas sustituidas a Na-montmorillonita, aunque no observaron el mismo comportamiento en el caso de anilinas, fenilcarbamatos, anilida y amidas. Para una familia de plaguicidas, muchos factores pueden interactuar para determinar si hay o no una relación directa entre adsorción y solubilidad; éstos pueden incluir propiedades tales como la acidez de la superficie y la polaridad. Composición coloidal del suelo De los distintos componentes del suelo, los minerales de la arcilla, los óxidos metálicos y la materia orgánica (componentes coloidales del suelo) aportan gran parte de la superficie involucrada en los procesos de adsorción. La importancia relativa de cada uno de estos componentes depende en gran medida de las características de carga del compuesto a adsorber. La fracción coloidal o arcilla del suelo se define como aquella que engloba las partículas de diámetro inferior a 2 µm. Por su elevada superficie específica y reactividad superficial, se considera a los componentes de la fracción arcilla como los principales responsables de las interacciones que tienen lugar entre la fase sólida del suelo y los compuestos orgánicos e inorgánicos que a él llegan, principalmente cuando están en disolución. Por eso es conocido también como la fracción activa del suelo y está formada por dos tipos de componentes: los componentes inorgánicos o minerales y los componentes orgánicos. Componentes inorgánicos La fracción coloidal inorgánica del suelo está compuesta en su mayoría por minerales de la arcilla o filosilicatos y por óxidos, hidróxidos y Introducción 39 oxihidróxidos metálicos, fundamentalmente de Fe, Al y Si. El término arcilla se refiere generalmente al material inorgánico de tamaño inferior a 2 µm, mientras que mineral de la arcilla se refiere a un tipo específico de minerales que se encuentran en la fracción de tamaño arcilla (< 2µm) de los suelos (Moore y Reinolds, 1987). Los minerales de la arcilla están constituidos por láminas de unidades estructurales sobrepuestas, constituyendo los iones un retículo regular en el que figuran las dos unidades siguientes: octaedro, constituido por un ión metálico (Al3+, Mg2+, Fe2+) en el centro y en los vértices por iones O2- o OH- y el tetraedro formado por un ión Si4+ que ocupa el centro y los vértices ocupados por iones O2- o excepcionalmente OH-. Estas unidades se repiten formando unas capas octaédricas o tetraédricas, respectivamente. Las unidades estructurales (láminas) están en general formadas por la conexión de dos o tres capas (una o dos tetraédricas, respectivamente, y una octaédrica). La estructura global de los minerales resulta del apilamiento de láminas tridimensionales, existiendo entre ellas lo que se define como el espacio interlaminar, que contribuye a la elevada superficie específica de estos minerales. Entre dos láminas adyacentes pueden intervenir fuerzas de van der Waals o fuerzas electrostáticas. En diversos minerales de la arcilla, la estructura está desequilibrada electrostáticamente como resultado de la sustitución de iones durante la formación de los minerales, sin alterar sus dimensiones. Estas alteraciones son denominadas sustituciones isomórficas. Es el caso de la sustitución del ión Si4+ por el ión Al3+, del Al3+ por Fe2+ o Mg2+, que originan un exceso de cargas negativas permanente. Este desequilibrio queda compensado por cationes, hidratados o no. Cuando en la disolución del suelo existen otros Dinámica de plaguicidas 40 cationes se da el cambio de los que existen en la fase interlaminar por los que existen en la disolución hasta llegar a un equilibrio, esta propiedad se denomina capacidad de cambio catiónico (CCC). Como la montmorillonita y la vermiculita tienen mayor superficie específica y CCC, su capacidad de adsorción de compuestos orgánicos es mayor que en el caso de otros minerales de la arcilla no expansibles (Cox et al., 1993; Hermosín et al., 1993). Según Green (1974), el grado en que estas superficies adsorben moléculas orgánicas depende principalmente de la naturaleza de los cationes de cambio, del grado de hidratación de la arcilla y de las propiedades de la molécula orgánica en cuestión. La adsorción de plaguicidas a los minerales de la arcilla puede ocurrir fundamentalmente en los cationes de cambio (bien directamente o por medio de moléculas de agua coordinadas a los cationes de cambio) o por interacción con los grupos OH basales de la caolinita y los de los bordes de las láminas de los silicatos (Calvet, 1989). Laird (1996) y Celis et al. (1997a), pusieron de manifiesto la existencia de micrositios hidrófobos situados entre las cargas de los espacios interlaminares que pueden adsorber moléculas orgánicas neutras por simple interacción hidrofóbica. También en este espacio interlaminar, los plaguicidas se pueden adsorber por interacción donador-aceptor de electrones (Hederlain y Schwarzernbech, 1993). Los óxidos metálicos coloidales que incluyen hidróxidos, oxihidróxidos y óxidos propiamente dichos son componentes muy importantes de la arcilla, siendo los de aluminio, silicio y sobre todo los de hierro especialmente abundante (Schwertamann y Taylor, 1989). En estos minerales los centros Introducción 41 activos de adsorción son los hidroxilos superficiales que, según el pH del medio en que se encuentren, se pueden comportar como aceptores o donadores de electrones, es decir, tienen cargas dependientes del pH (Hingston et al., 1972). En suspensión acuosa, los átomos metálicos terminales del óxido completan su esfera de coordinación con grupos hidroxilos y moléculas de agua que adsorben H+ o OH- dependiendo del pH de la disolución. El pH al cual las cantidades adsorbidas de H+ y OH- es la misma se denomina punto de carga cero del óxido. Los óxidos y oxihidróxidos poseen una elevada superficie específica, lo que significa que pueden ser buenos adsorbentes de compuestos orgánicos, fundamentalmente aniónicos (Hermosín y Cornejo, 1991; Madrid y Díaz Barrientos, 1991; Celis et al., 1999b; Dubus et al., 2001). En general los compuestos orgánicos de baja polaridad no son capaces de competir con las moléculas de agua, que solvatan las superficies hidrofóbicas de los coloides minerales, por posibles sitios de adsorción. Además, la concentración del compuesto orgánico en la disolución del suelo suele ser demasiado pequeña, para competir eficazmente con las moléculas de agua por los sitios de adsorción (Calvet, 1989). Por ello, frecuentemente se considera que los coloides minerales tienen un papel secundario en la adsorción de plaguicidas no iónicos salvo en el caso de suelos de muy bajo contenido en carbono orgánico. Para estos compuestos muy hidrofóbicos y en suelos con un contenido en materia orgánica mayor que el 2%, la adsorción ocurre fundamentalmente debido a la materia orgánica (Senesi, 1992; Schulten et al., 2001; Nemeth- Konda et al., 2002). Dinámica de plaguicidas 42 Muchos autores han puesto de manifiesto las limitaciones de considerar a la materia orgánica como la única responsable de la adsorción en el caso de compuestos polares (Weber et al., 1986; Reddy y Gambrell, 1987; Calvet, 1989; Hermosín y Cornejo, 1991; Cox et al., 1995a y b; Cox et al., 1996a; Wauchope et al., 2002; Fernandes et al., 2003). En muchos casos se ha encontrado una mayor correlación entre la adsorción y el contenido de arcilla de los suelos que con el de materia orgánica (Hermosín et al., 1991; Hermosín y Cornejo, 1991; Cox et al., 1993; Cox et al., 1994; Aguer et al., 2000; Hermosín et al., 2000). En estos casos el compuesto orgánico considerado tenía siempre características polares, iónicas o ionizables. Para estas condiciones Hermosín y Cornejo (1994) proponen el uso de un coeficiente de adsorción normalizado al contenido de arcilla, Kclay, similar al coeficiente de adsorción normalizado al contenido de carbono orgánico, KOC, que resalta la importancia de los coloides minerales en la adsorción y reduce la variabilidad en la adsorción. Componentes orgánicos La fracción orgánica en el suelo está compuesta por organismos vivos y sus restos no descompuestos, parcialmente descompuestos y completamente descompuestos. La materia orgánica en el suelo es la terminología usada para referirse más específicamente a los componentes no vivos, siendo una mezcla heterogénea compuesta de un gran número de productos resultantes de las transformaciones químicas y microbianas de desechos orgánicos. Esta transformación, conocida en su conjunto como “proceso de humificación,” origina el humus, una mezcla de sustancias que posee resistencia a ataques posteriores de microorganismos (Hayes y Swift, 1978). La materia orgánica del suelo puede ser separada en dos grupos mayoritarios: I) material inalterado, que incluye desechos frescos y componentes no transformados de desechos más Introducción 43 antiguos; II) productos transformados, o humus, muy diferentes a las estructuras de las que derivan. Estos compuestos transformados son usualmente referidos como productos humificados, aunque en realidad están constituidos por sustancias húmicas y no húmicas (Kononova, 1966). Los productos humificados o humus constituyen la fracción coloidal orgánica del suelo y se dividen en sustancias no húmicas y sustancias húmicas. Sustancias no húmicas Son compuestos pertenecientes a los polisacáridos, polipéptidos, ácidos grasos y otros compuestos de bajo peso molecular procedentes de restos animales y vegetales y para los que es posible asignar una fórmula molecular precisa de las subunidades que los componen. Son, en general, fácilmente atacados o degradados por los microorganismos, lo que hace que el tiempo de vida media de estas sustancias en el suelo sea relativamente corto (Khan, 1980). Sustancias húmicas Grupo de compuestos orgánicos que se forma a partir de las sustancias no húmicas a través de procesos de biodegradación y de síntesis. Son mucho más estables, por lo que constituyen el grueso de la materia orgánica de la mayoría de los suelos (Khan, 1980). Las sustancias húmicas se caracterizan por tener una estructura química compleja y amorfa, carácter ácido, color oscuro y elevado peso molecular. Se considera que están formadas por un esqueleto fundamentalmente aromático, a base de heterociclos nitrogenados, quinonas, fenoles y ácidos benzoicos, con cadenas alifáticas laterales. Más que polímeros tridimensionales, las sustancias Dinámica de plaguicidas 44 húmicas son predominantemente lineales con puentes de unión entre diferentes puntos de los tramos lineales (Oades, 1989). Según su solubilidad las sustancias húmicas se dividen en tres grupos (Aiken et al., 1985): a) huminas, fracción de las sustancias húmicas que es insoluble en agua a cualquier pH; b) ácidos húmicos, fracción de sustancias húmicas que es insoluble en ácido, pero soluble a pH más elevados; c) ácidos fúlvicos, fracción que es soluble en cualquier pH. Estructuralmente los ácidos húmicos y los ácidos fúlvicos son muy similares, diferenciándose sólo en el peso molecular y en el contenido en grupos funcionales. Las huminas pueden consistir, según Stevenson (1985), en: (i) ácidos húmicos íntimamente ligados a la fracción mineral que no pueden ser separados, y (ii) materia húmica altamente condensada con un contenido elevado en carbono (>60%) y por eso insoluble en álcalis. Se supone que todos los suelos contienen un largo espectro de sustancias húmicas, sin embargo, el patrón de distribución varía espacialmente: de suelo en suelo (Zech et al., 1994a) y con la profundidad en el perfil del suelo (Zsolnay y Steindl, 1991; Zech et al., 1994b; Kalbitz et al., 1997; Xing y Pignatello, 1997; Zysset y Berggren, 2001) y temporalmente (Zsolnay, 2003). El contenido de materia orgánica del suelo es diferente en suelos considerados naturales (bajo bosque, poco o nada labrados) y en suelos alterados por la actividad humana (agricultura) según el cultivo y el grado de mecanización Introducción 45 aplicado. En los primeros, el porcentaje de materia orgánica es en general mayor que en los segundos dado que el continuo laboreo origina un aumento de la mineralización de la materia orgánica y cantidades más o menos grandes, son sustraídas del ciclo natural del Carbono en forma de cosecha útil para el hombre (Gallardo Lancho, 1982). Los grupos funcionales presentes en las sustancias húmicas son muy numerosos y variados. Incluyen grupos carboxilos, carbonilos, hidroxilos, sulfhidrilos, aminos, sulfónicos, etc. Los grupos carboxilos e hidroxilos son los principales responsables de su elevada capacidad de intercambio catiónico (CCC), dependiente del pH, así como de su capacidad para complejar metales. Se considera que los grupos hidroxilos y carboxilos están directamente implicados en la interacción con compuestos orgánicos catiónicos y otros componentes como los óxidos metálicos y los minerales de la arcilla (Theng, 1974; Cornejo y Hermosín, 1996). Por su naturaleza aromática y contenido en grupos funcionales polares, las sustancias húmicas tienen un doble carácter hidrófobo e hidrófilo. Así, las estructuras lineales pueden adoptar en disolución acuosa una conformación esférica de forma que las regiones hidrófobas quedan hacia el interior mientras que la mayoría de los grupos polares quedan próximos a la periferia (Wershaw, 1986; Oades, 1989). Los grupos periféricos polares son los responsables del hinchamiento de las sustancias húmicas en disolución acuosa, donde pueden llegar a adsorber de 2 a 6 veces su propio peso de agua (Ahlrichs, 1972). Existen, no obstante, grupos internos responsables de una cierta capacidad de cambio iónico que ocurre lentamente en comparación con los grupos periféricos (Oades, 1989). Dinámica de plaguicidas 52 debido a su baja adsortividad. Los herbicidas no iónicos, poco solubles en agua, como la trifluralina, son muy poco móviles en disolución, debido a su baja solubilidad (Calderón et al., 1999), pero pueden ser móviles en estado gaseoso debido a su alta presión de vapor, lo cual conlleva pérdidas por volatilización (Glotfelty y Caro, 1975). Los herbicidas muy solubles, como la hexazinona y el fenurón (Bouchard y Lavi, 1985) son muy móviles por su baja adsortividad. Estructura del suelo El suelo posee un conjunto de características estructurales denominadas macroporos, donde están incluidos los conductos animales, canales de raíces, roturas y fisuras que se forman por el efecto del agua o por expansión y contracción del suelo, congelamiento y deshielo y conductos formados por la acción erosiva del agua, y que pueden existir a profundidades considerables del perfil del suelo. El movimiento de plaguicidas en el suelo se ve influenciado por la presencia de esos macroporos, originando flujos preferenciales sin pasar por la masa del suelo (Beven y Germann, 1981; Larsson et al., 1999). En este caso se habla de transporte hidrodinámico, mientras que el movimiento del plaguicida a través de la masa del suelo se da por difusión. En sistemas con macroporos de gran diámetro y longitud, una gran parte del soluto puede ser transportado a lo largo del perfil del suelo sin entrar en contacto con la masa del suelo. De este modo, plaguicidas de muy baja solubilidad en agua que se adsorben fuertemente y en grandes cantidades en el suelo, pueden llegar a contaminar aguas subterráneas (White et al., 1986). Introducción 53 En los microporos del suelo el movimiento vertical de los plaguicidas en el suelo ocurre lentamente y predominan los procesos de difusión, adsorción y degradación. Se ha demostrado que un mismo compuesto puede comportarse de forma diferente en suelos con distinta porosidad (Cox et al., 1997). Intensidad y frecuencia de lluvia y/o riego El aporte de agua al suelo, ya sea procedente de lluvia o de agua de riego, es un factor de gran importancia en lo que se refiere a la persistencia y lixiviación de plaguicidas en suelos. La intensidad, frecuencia, distribución y estacionalidad del agua aplicada afectan enormemente al movimiento y distribución de los plaguicidas en el suelo. La retención de plaguicidas en el suelo aumenta progresivamente con el tiempo tras su aplicación (Pignatello et al., 1993), por tanto las lluvias al principio de la aplicación tendrán gran influencia en la cantidad de herbicida lavada (Wauchope, 1978) y, consecuentemente, en la contaminación. Así, cuando se aplican plaguicidas en el otoño, el riesgo de lavado es mayor que si se aplica en primavera, ya que en este último caso, el plaguicida permanecerá más tiempo en el horizonte superficial donde su degradación se verá favorecida por las altas temperaturas (Nicholls, 1988). Prácticas culturales Las prácticas culturales tienen un efecto directo en la lixiviación de plaguicidas por distintos aspectos, la presencia de rutas preferenciales, la naturaleza y actividad microbiana del suelo y en la estructura del suelo. Dinámica de plaguicidas 54 En lo que se refiere a la existencia de rutas de flujo preferencial y, por lo tanto, al riesgo de contaminación por plaguicidas de aguas subterráneas, se sabe que el laboreo convencional tiende a destruir los canales y macroporos conectados con las superficies (Ehlers, 1975). Por otra parte, la utilización de un mínimo laboreo aumenta la microfauna y microflora del suelo, con lo que puede favorecer la biodegradación y, consecuentemente, una disminución en el riesgo de contaminación al reducirse la cantidad de plaguicida en la solución del suelo (Cox et al., 1996b; Calderón et al., 1999; Cox et al., 1999a). Estos efectos son inversos, y el alcance de cada uno de ellos depende de las características del compuesto en sí, del suelo y de las condiciones climáticas (Gish et al., 1995; Cox et al., 1999a). También se ha encontrado que en laboreo de conservación la materia orgánica en los primeros milímetros del suelo es mayor que en suelos con laboreo convencional (Calderón et al., 1999), por lo que la adsorción se puede ver favorecida y la lixiviación reducida. Otro aspecto a considerar es la adición de enmiendas orgánicas al suelo de cultivo. Este procedimiento, además de aumentar el contenido en materia orgánica, también conlleva una alteración de la estructura del suelo. Por una parte, el aumento en materia orgánica del suelo tras la enmienda podría llevar a un aumento de adsorción de plaguicidas y/o a una mayor degradación dando lugar a una menor lixiviación (Guo et al., 1993; Cox et al., 2000b). Por otra parte, el cambio en la estructura del suelo puede dificultar o favorecer el desplazamiento del plaguicida (Sánchez-Camazano et al., 1996; Cox et al, 1997a). También puede haber un transporte facilitado del plaguicida cuando está adsorbido a los coloides (Cox et al., 2000b; Williams et al., 2002). Worrall et al. (2001), al estudiar el efecto de la adición de materia orgánica en la reducción de lixiviación de carbofurano, encontraron que la histéresis tiene un Introducción 55 papel más importante que la presencia de coloides orgánicos para la disminución del plaguicida en los lixiviados a largo plazo. 1.1.1.3 Otros procesos de transporte Otros procesos de transporte que pueden tener una gran importancia en la dinámica y comportamiento de los plaguicidas en el medio ambiente en determinadas circunstancias son los procesos de volatilización, de escorrentía y la adsorción por plantas y microorganismos. 1.1.1.3 a) Volatilización La volatilización es el proceso físico-químico por el cual un compuesto es transferido a la fase gaseosa. Puede resultar de la evaporación de la fase líquida, sublimación de la fase sólida, evaporación de una solución acuosa o desorción de la matriz del suelo (Bedos et al., 2002). La transferencia de los compuestos de un compartimento (suelo o planta) hacia la atmósfera conlleva distintos pasos, incluyendo no sólo la transformación de fase sino también los procesos de transporte. Los factores que influyen en la volatilización son: propiedades físico-químicas del plaguicida, las características del suelo, las condiciones climáticas y las prácticas de cultivo (Bedos et al., 2002). Las características físico-químicas del compuesto juegan un papel fundamental en la determinación del comportamiento del plaguicida después de su aplicación. La presión de vapor, solubilidad en agua (y, consecuentemente, el coeficiente de Henry, o coeficiente de reparto entre la fase gaseosa y la fase acuosa) y el coeficiente de adsorción son los más relevantes. La importancia de Dinámica de plaguicidas 56 estos factores puede ser predicha por medio del modelo de monitorización desarrollado por Jury et al. (1983). Según estos autores, la duración y la intensidad del proceso de volatilización en suelos húmedos depende mayoritariamente de la constante de la ley de Henry, Kh. La alta temperatura favorece la volatilización, porque la presión de vapor de un compuesto en una disolución acuosa depende exponencialmente de la temperatura. Sin embargo, la combinación temperatura del suelo y humedad puede limitar este efecto. La velocidad del viento y la humedad también afectan a la velocidad de volatilización. Según Grass et al. (1994), al estudiar la influencia del viento, temperatura y humedad del aire en la volatilización de trifluralina del suelo observaron que la menor tasa de volatilización tenía lugar en condiciones climáticas intermedias (temperatura de 21 ºC, velocidad del viento de 1.0 m s-1 y 49% de humedad relativa). La temperatura, la humedad y las características del suelo también influyen en la volatilización. A un incremento en la temperatura del suelo, se espera un aumento de la volatilización. Sin embargo, este comportamiento está limitado por la sequía del suelo, ya que se puede favorecer la adsorción del plaguicida a la matriz del suelo, limitando así el transporte hacía la superficie del suelo. Álvarez-Benedi et al. (1999), al estudiar la volatilización de terbutrina en dos suelos diferentes (arenoso y arcilloso) y a dos temperaturas (15 y 25 ºC) en una cámara de volatilización, encontraron que la tasa de volatilización aumentó con el incremento de temperatura y que a 25 ºC la evaporación fue mayor en los suelos arenosos que en los suelos arcillosos, debido a la mayor adsorción del plaguicida en este último suelo. Introducción 57 Las prácticas de cultivo, en lo que concierne a la fecha y dosis de aplicación, la elección de la formulación, el tamaño de la gota del spray, la irrigación, la incorporación del plaguicida y el tipo de laboreo también influyen en la volatilización. Wienhold y Gish (1994), al estudiar el efecto del laboreo y de la formulación en la volatilización de atrazina y alacloro, observaron que el laboreo de conservación conlleva una menor pérdida de ambos plaguicidas y que con la formulación encapsulada hay una menor pérdida del plaguicida en los dos sistemas de laboreo. 1.1.1.3 b) Escorrentía El proceso de escorrentía tiene lugar cuando la precipitación o el riego superan la tasa de infiltración de agua en el suelo. Según Wauchope (1978), las pérdidas de plaguicidas por escorrentía tienen lugar en disolución en el caso de plaguicidas relativamente solubles en agua, plaguicidas con solubilidades mayores de 2 mg L-1, o con el plaguicida adsorbido a los coloides del suelo para plaguicidas con solubilidades inferior a 2 mg L-1. Los factores más importantes que determinan las pérdidas por escorrentía son las condiciones climáticas, las características del suelo y del plaguicida y las prácticas culturales. La presencia de plaguicidas en las aguas superficiales lejos del lugar de aplicación es un hecho indicativo de este proceso. Cuando las precipitaciones o los riegos se producen en el momento en el que el plaguicida se encuentra en la superficie del suelo, el riesgo de contaminación de aguas superficiales se incrementa. En nuestro país, donde la mayor parte del agua de consumo humano procede de pantanos, este problema tiene una gran importancia. La dificultad para predecir este proceso hace que los modelos actuales no predigan de forma absoluta las concentraciones de plaguicida en las aguas de escorrentía sino más bien Dinámica de plaguicidas 58 establecen las condiciones que disminuyen las pérdidas y sugieren las medidas más apropiadas para minimizar el proceso, como la incorporación del plaguicida a una cierta profundidad o el empleo de formulaciones de liberación controlada. 1.1.1.3 c) Absorción por plantas y organismos El proceso de absorción por plantas y organismos de los plaguicidas que se encuentran en el suelo está determinado en gran medida a la fijación del plaguicida por los coloides del suelo y constituye la finalidad de la aplicación de los productos fitosanitarios a los suelos. Las plantas y microorganismos asimilan plaguicidas, acumulándolos y metabolizándolos. La gran variedad de plantas y organismos resistentes a determinados plaguicidas lo son porque lo metabolizan a compuestos no tóxicos, lo que constituye un vía natural de descontaminación (Schmidt y Fedtke, 1977). 1.1.2 Procesos de degradación Los plaguicidas se ven afectados en el suelo por diferentes transformaciones que son las responsables de su desaparición, generalmente con formación de compuestos de menor toxicidad (Cheng y Lehman, 1985) y que, por tanto, reducen la contaminación de plantas y aguas superficiales y subterráneas. Los procesos de degradación o transformación se suelen dividir, según su origen, en tres grupos: 1.- degradación química, mediadas por gran cantidad de compuestos orgánicos e inorgánicos, 2.- degradación microbiana o biodegradación, catalizada exclusivamente por enzimas y 3.- procesos de fotodegradación. Los factores que, de forma general, afectan a estos procesos Introducción 59 son: la estabilidad química de la molécula, la adsorción a componentes del suelo, el efecto del plaguicida en cuestión sobre la microflora del suelo, factores ambientales como la humedad del suelo, la radiación solar y temperatura y las propiedades físico-químicas de los suelos. 1.1.2.1 Procesos de degradación química Los procesos de degradación química más frecuentes son las reacciones de hidrólisis y oxidación y los que presentan mayor variedad de transformaciones (Armstrong y Konrad, 1974). Todas estas reacciones suelen ser catalizadas en mayor o menor grado por la superficie de las arcillas, óxidos metálicos, iones metálicos, superficies de sustancias húmicas y materiales orgánicos diversos (Cornejo et al., 1983). Las reacciones hidrolíticas son catalizadas por ácidos, bases y/o metales de transición, por lo que afectan en gran medida a las tasas de hidrólisis. Factores determinantes de las tasas de degradación química son el mecanismo de reacción y la estructura química del plaguicida. Entre los factores más importantes que afectan a los procesos de degradación química se encuentran el pH, el potencial red-ox, la temperatura y la composición de la disolución y de la fracción coloidal del suelo. La adsorción del plaguicida a los coloides del suelo puede tener un efecto doble ya que puede proteger al plaguicida de la degradación química, pero también puede potenciarla, como en el caso de reacciones catalizadas por la superficie de los componentes coloidales. Los cationes de cambio de los minerales de la arcilla y el agua de hidratación participan en muchas reacciones de degradación catalizadas por la superficie (Russell et al., 1968; Laird, 1996). Walker y Blacklow (1994) confirmaron la hidrólisis química de simazina y Dinámica de plaguicidas 60 atrazina mediante la esterilización del suelo, observando una relación positiva entre el tiempo de vida media de la triazina y la proporción de herbicida aplicado que fue adsorbido por los suelos. Por otra parte, Briggs y Dawson (1970) observaron para el pesticida diclobenil, una relación inversa entre el grado de hidrólisis no biológica y el de adsorción, en un estudio con 34 suelos. En general, las reacciones químicas de degradación de plaguicidas, salvo en casos puntuales, tienen menos importancia medioambiental que las biológicas, pues la tasa de reacción es más lenta debido a la competición de los oxidantes por la materia orgánica. 1.1.2.2 Biodegradación Los procesos de biodegradación se deben fundamentalmente a la microflora del suelo (bacterias y hongos). Los microorganismos capaces de degradar a los plaguicidas se encuentran tanto en los suelos y medios acuáticos como en aguas residuales de tratamiento de plantas, además de que un gran número y diversidad de microorganismos pueden ser encontrados en suelos de cultivo (Bordjiba et al., 2001). La extensión del metabolismo microbiano puede ir desde transformaciones menores que no afectan significativamente a las propiedades químicas o toxicológicas del herbicida, hasta procesos de mineralización, como es la degradación del plaguicida hasta la obtención de CO2, H2O y NH4+. La tasa de metabolismo puede oscilar entre extremadamente lenta, con una vida media de años, hasta rápida, con vida media de días. Introducción 61 En general, la tasa de biodegradación aumenta con la temperatura y con el aumento de la humedad del suelo hasta capacidad de campo (Parker y Doxtader 1983; Allen y Walker, 1987; Yen et al., 2003), debido a un aumento de la población microbiana. La adsorción reduce la biodegradación, ya que las moléculas adsorbidas no suelen estar disponibles para los microorganismos. El efecto de la materia orgánica en los procesos de biodegradación es doble. Por una parte, al adsorber el plaguicida reduce la biodegradación (Shea y Weber, 1983; Mersie y Foy, 1985; Walker et al., 1989; Ainsworth et al., 1989; Barriuoso et al., 1997; Guo et al., 2000). Por otra parte, la materia orgánica puede ser un sustrato nutritivo para la microflora, dando lugar un aumento de ésta a un aumento de la población microbiana y por tanto a una mayor tasa de degradación de plaguicidas biodegradables (Walker y Welch, 1989; Nair y Schnoor, 1994; Cox et al., 1999b; Hole et al., 2001). De acuerdo con Scow y Hutson (1992), la adsorción influye en la cinética de la biodegradación, no sólo modificando la concentración del compuesto químico en la disolución del suelo, sino también mediante una inducción directa de las respuestas regulatorias de los microorganismos dependientes de la concentración del plaguicida en el medio. Sin embargo, en algunos casos, se ha visto que la toxicidad ha sido el principal factor controlador de la biodegradación (Martins y Mermoud, 1998). En estos casos, la adsorción reduciría la concentración del producto químico en la disolucón del suelo hasta niveles no tóxicos e, indirectamente, favorecería la biodegradción (Van Loosdrecht et al., 1990). Prado y Airoldi (2001a), al estudiar la biodegradación de 2,4-D en suelos observaron que el herbicida aplicado hasta una concentración de 2.67 mg g-1 fue utilizado como fuente de carbono para el crecimiento de la población microbiana, sin embargo, para concentraciones Enmiendas orgánicas 68 derivado del residuo líquido de almazara. Últimamente se está estudiando la influencia del residuo sólido de almazaras, conocido como alperujo en el comportamiento de plaguicidas (Albarrán et al., 2003 y 2004; Fernandes et al., 2006; Cox et al., 2007; Delgado Moreno y Peña, 2007; Delgado-Moreno et al. 2007). La adición de alperujo y alperujo extractado a un suelo arenoso produjo un aumento en la adsorción y persistencia del herbicida simazina y disminución de la lixiviación y mineralización respecto al suelo no enmendado o control (Albarrán 2003 y 2004). Sin embargo, la adición de alperujo, a pesar del aumento en C orgánico, no siempre implica un aumento en la adsorción de plaguicidas, como informaron Fernandes et al. (2006), quienes no observaron ningún aumento en la adsorción del fungicida metalaxil en suelos enmendados con alperujo respecto al suelo sin enmendar, y lo atribuyeron a las moléculas de bajo peso molecular y no humificadas de la fracción soluble del alperujo que se absorbían a los componentes minerales de la fracción arcilla del suelo y competían con el fungicida por los sitios de adsorción. Sí observaron una disminución de la lixiviación y aumento del fungicida al compararlo con el control. Cox et al. (2007) tampoco observaron cambio en la adsorción del herbicida diurón en un suelo arcilloso enmendado con alperujo. Introducción 69 1.3 El olivar, el aceite de oliva y los residuos de la producción de aceite de oliva 1.3.1 Origen y extensión del cultivo del olivo El origen del olivo se remonta a la antigüedad a 12.000 años a.C. Se han encontrado fósiles de hojas de olivo en depósitos del Plioceno en Mondargino (Italia), también en el norte de África se han encontrado restos fosilizados correspondientes al Paleolítico Superior y en España restos de olivos silvestres en excavaciones datadas en la edad de Bronce. (Consejo Oleícola Internacional). El cultivo del olivo se cree que se originó en Asia Menor hace 6000 años y desde ahí se extendió hacia Anatolia y Egipto. En el siglo XVI a.C. los fenicios llevaron el olivo por el Mediterráneo, llegando a Trípoli, Túnez y Sicilia, de donde pasó al sur de Italia. Los romanos continuaron con la expansión del olivo en los países del Mediterráneo. En España el cultivo del olivo fue introducido por los fenicios (1.050 a.C.), pero no fue hasta la llegada de los romanos cuando consiguió mayor desarrollo. Los árabes introdujeron especies cultivadas en el norte de África e influenciaron la difusión de su cultivo. A partir del descubrimiento de América se introduce el olivo en el continente americano y hoy en día también se cultiva en países como Australia, Japón, China y Sudáfrica. Residuos de almazara 70 1.3.2 Importancia medioambiental del olivar El cultivo de olivos contribuye a la sostenibilidad de los recursos naturales porque favorece la conservación de los suelos y necesita aportes limitados (Loumou y Giourga, 2003). Según recoge la Consejería de Agricultura y Pesca de la Junta de Andalucía en el Manual de buenas prácticas agraria en los diferentes sistemas productivos del olivar andaluz, la importancia medioambiental del olivar radica en que si la cubierta vegetal está bien manejada puede aportar una serie de ventajas: protección del suelo del impacto directo de la lluvia, mejora las propiedades físicas, químicas y biológicas de los suelos, aumenta la velocidad de infiltración del agua, reduce las pérdidas de suelo por erosión, reduce las pérdidas de agua por evaporación , aumenta el contenido de materia orgánica de las capas superficiales, favorece la biodiversidad, reduce los problemas de lavado y lixiviación de nutrientes y mejora el balance hídrico en los olivares al evitar la escorrentía. Si además los olivares se manejan correctamente se obtienen buenas producciones e incluso se mejora la productividad a largo plazo. De Prado y de Prado (2003) también señalan la importancia que tiene la cubierta vegetal en el olivar como medio de lucha para el control de las malas hierbas y de la erosión en superficies con elevada pendiente. 1.3.3 Empleo de herbicidas en el olivar Las razones que han llevado a utilizar herbicidas sobre el suelo del olivar han sido la necesidad de eliminar las malas hierbas, mejorar la estructura del suelo y obtener una mayor producción. La presencia de malas hierbas conlleva una serie de inconvenientes como la competencia por el agua y Introducción 71 nutrientes en primavera y verano y la dificultad en las tareas de recolección en otoño-invierno. De Prado et al. (2003) recomiendan tener un buen conocimiento de la flora de la parcela del olivar para un buen manejo del suelo y obtener un rendimiento eficaz de los herbicidas. El olivar mediterráneo ocupa grandes superficies de forma continua en terrenos con pendientes a veces elevadas, y por tanto, con dificultad para la aplicación de los herbicidas. El agua de escorrentía de los olivares que están en pendiente puede transportar a los herbicidas que pueden acabar en desagües naturales si no se utilizan barreras apropiadas. La presencia de plaguicidas en suelos y aguas, si no se toman medidas, pueden llegar a constituir un problema de degradación y contaminación de los suelos y acuíferos. Los riesgos derivados de la erosión y del arrastre de partículas de nutrientes y productos fitosanitarios provocó que la Dirección General de Agricultura del Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación revisara en Agosto de 2003 las autorizaciones de los herbicidas utilizados en el olivar y se restringió el uso de diurón y terbutilazina a las franjas de los ruedos de los olivos y una única aplicación por año, siendo la dosis máxima permitida de 1.5 kg ha-1 de sustancia activa. El tratamiento debe realizarse con pulverizadores de baja presión, con pulverización dirigida verticalmente al suelo y como plazo límite se puede aplicar hasta tres semanas antes de la recolección de la aceituna y siempre que no se hayan caído frutos al suelo. En Julio de 2005 la Dirección General de Agricultura del MAPA acordó la suspensión temporal de las autorizaciones de los productos fitosanitarios que contengan terbutilazina, diurón o mezclas de ambas sustancias activas, así como los que contengan simazina o mezclas en zonas de protección de aguas superficiales embalsadas Residuos de almazara 72 que se destinen a aguas de consumo humano, así como en plantaciones de ribera y parcelas de frutales u otras especies leñosas irrigadas mediante sistemas de inundación y que disten menos de 50 m de cursos de aguas naturales. Para maximizar la efectividad de los herbicidas empleados en el olivar y reducir su impacto ambiental de Prado et al. (2003) recomiendan una serie de prácticas: - Elección adecuada del producto, su dosis y fecha de aplicación - Equipo pulverizador adecuado y en buen estado - Respeto al medio ambiente - Reducción del área tratada - Utilización de la dosis mínima recomendada - Elección del herbicida de actividad similar que presente menor toxicidad, menor dosis y menor lixiviación - Conocimiento de las características físico-químicas de los herbicidas Los herbicidas autorizados por la Consejería de Agricultura y Pesca de la Junta de Andalucía en el cultivo del olivar a 11 de Septiembre de 2008 son: alquitrán de hulla, amitrol, diclobenil, diflufenican, diquat, flazasulfuron, fluometuron, fluroxipir, glifosato, glufosinato amónico, MCPA ácido, oxifluorfen, paraquat, quizalop-p-etilo, terbutilazina, tiocianato amónico y tribenuron-metilo. 1.3.4 Producción del aceite de oliva y residuos generados La mayor parte de la producción mundial de aceite de oliva se registra en los países del Mediterráneo, siendo España el principal productor de aceite Introducción 73 de oliva, seguido de Italia y Grecia (Luchetti, 2002). En el año 2006, según los datos publicados en el Anuario de Estadística Agroalimentaria 2007, en España se produjo un total de 1.092.602 Tm de aceite de oliva virgen, y se exportaron 509.677 Tm. En ese mismo año en Andalucía la cantidad total de aceite de oliva obtenido fue de 924.620 Tm, lo que corresponde a un 85% de la producción nacional de aceite de oliva. La obtención del aceite de oliva implica una serie de procesos. Comienza con el lavado de la aceituna, molienda, batido y la propia extracción que constituye el paso básico de todo el proceso. La cantidad y propiedades físico-químicas de los residuos que se producen dependen del método de extracción utilizado. Hay dos maneras de extraer el aceite. Una, la forma tradicional por presión que se ha usado durante siglos y que sólo ha sufrido modificaciones menores y la otra forma por centrifugación que es el método de extracción que las industrias oleícolas vienen utilizando en las últimas décadas (Roig et al., 2006). En España la tecnología para la extracción del aceite de oliva ha progresado notablemente desde los años setenta, cuando apareció el sistema de centrifugación de 3 fases. Este sistema utiliza agua caliente que se añade a la masa de aceitunas antes de entrar en el decantador para conseguir fluidificar la masa, tras la centrifugación se obtienen 3 productos que salen independientemente del decantador: el aceite de oliva, un residuo líquido (alpechín), constituido por el agua de vegetación más agua añadida, y un residuo sólido (orujo) formado por los huesos y restos de las aceitunas. Las ventajas de este proceso respecto al sistema de presión tradicional son: una completa automatización del proceso, mejor calidad del aceite y necesidad de menor espacio. Entre los inconvenientes está: mayor gasto de agua y energía, instalaciones más caras y la generación de una gran cantidad de alpechín en un Residuos de almazara 74 corto periodo de tiempo, de Noviembre a Febrero. Este residuo líquido con un elevado contenido en materia orgánica y fitotoxicidad era vertido ilegalmente a ríos y arroyos, constituyendo un problema medioambiental. Para evitar estos problemas de contaminación se obligó a las almazaras a gestionar estos residuos, almacenándolos en balsas para su evaporación natural, se desarrollaron plantas para su tratamiento y se usaron como fertilizantes del suelo. Sin embargo, estos sistemas no se han consolidado en el sector oleícola por razones técnicas y económicas. A principio de los años 90 se desarrolló un nuevo sistema de extracción de aceite de oliva, conocido como sistema de centrifugación de dos fases, que a diferencia del de tres fases no utiliza agua caliente a la entrada de la masa de aceitunas en el decantador que tiene dos salidas. Los productos que se generan son el aceite de oliva y un residuo sólido con un elevado contenido en humedad (56-75%) (Alburquerque et al., 2004) llamado alperujo y que está constituido por mezcla de aguas de vegetación, partes sólidas de la aceituna y restos grasos. Este sistema reduce en un 75% los residuos generados por el sistema de tres fases y consume menos agua, por lo que se le denominó sistema ecológico. En España el sistema de dos fases rápidamente sustituyó al de tres fases y según los datos de IMPEL 2003 el 98% de las almazaras en España utilizan el nuevo sistema de centrifugación para la extracción del aceite de oliva, sin embargo en Italia y Grecia se sigue utilizando mayoritariamente el sistema de tres fases. El nuevo residuo generado en el sistema de centrifugación en dos fases, alperujo, fue caracterizado por Alburquerque et al. (2004) con muestras procedentes de distintas almazaras de Andalucía y el este de España durante tres campañas sucesivas comprendidas entre los años 1997 y 2000. El residuo alperujo está constituido fundamentalmente por lignina, celulosa, hemicelulosa, grasas, Introducción 75 proteínas, hidratos de carbono hidrosolubles y fenoles hidrosolubles y las características físico-químicas de este residuo se muestran en la Tabla 1.2. Según estos autores el contenido en materia orgánica y en Carbono orgánico total (COT) es mucho mayor en el alperujo que en el alpechín, lodos de alpechín o cualquier otro residuo orgánico utilizado como enmienda. Respecto al contenido de nutrientes, alperujo es rico en K (2%), sin embargo las cantidades de P, Ca y Mg son inferiores a las de otros residuos, como los lodos de depuradora o los residuos sólidos urbanos. La concentración de metales pesados en el alperujo es casi inexistente en comparación con otros residuos orgánicos propuestos como fertilizantes o enmendantes agrícolas. Tabla 1.2. Características físico-químicas del alperujo (Alburquerque et al., 2004). pH CE (dS m-1) Cenizas (%) COT (%) M.O. (%) C/N N total (%) Media 5.3 3.4 6.7 52 93 48 1.1 Intervalo (4.9-6.5) (0.9-4.8) (2.4-15.1) (50-54) (85-98) (28-73) (0.7-1.8) 1.3.4.1 Procesos para la reutilización del alperujo Debido al elevado contenido en humedad del alperujo y su consistencia pastosa su manejo y transporte resulta complicado. Para la gestión de este residuo se han propuesto distintos procesos, como han recogido Roig et al. (2006), y los divide en tratamientos físico-químicos, aplicación directa, transformaciones biotecnológicas, extracción de productos y otras opciones. Residuos de almazara 76 1.3.4.1 a) Tratamientos físico-químicos Secado y segunda extracción Entre estos tratamientos se encuentran el secado y segunda extracción de aceite como se hacía con el orujo obtenido en el sistema de centrifugación en tres fases, pero el alto contenido en agua del alperujo producía problemas técnicos durante el proceso de secado en las almazaras. Estos problemas dieron lugar al desarrollo de nuevos métodos de secado, pero por el aumento del coste del proceso, por consumir más energía y la baja demanda de aceite de orujo no es una alternativa que se utilice mucho. Después de la segunda extracción el residuo sólido que queda: orujillo se puede utilizar como combustible para obtener energía térmica o eléctrica, porque tiene un elevado poder calorífico (400 Kcal kg-1). Parte de la energía obtenida puede utilizarse para el secado del alperujo fresco (Azbar et al., 2004) y Jurado et al. (2003) proponen usar alperujo para obtener un gas sintético para la producción de energía. 1.3.4.1 b) Aplicación directa La aplicación de alperujo como enmienda de suelos es otra alternativa para la eliminación de este residuo. Proporciona materia orgánica y K y aunque es menos fitotóxico que el alpechín produce desequilibrios nutricionales debido a la elevada relación C/N que modifica el ciclo del N, por lo que se recomienda añadir N mineral al alperujo antes de aplicarlo como enmienda (Thompson y Nogales, 1999). Lopez Piñeiro et al. (2008) aplicaron alperujo y orujillo como enmiendas en olivares para estudiar su efecto en las propiedades del suelo y en Introducción 77 el rendimiento de los olivos, observando un aumento en la estabilidad de los agregados y en el contenido en M.O., N total y P y K disponibles. Observaron que la aplicación repetitiva de estos residuos no causó deficiencias de N ni de P y ejerció un efecto positivo en el rendimiento de los olivos, aunque la menor dosis de enmienda (30 Mg ha-1) tuvo mayor efecto sobre la producción de los olivos que la dosis mayor (60 Mg ha-1), concluyendo que alperujo y orujillo pueden aplicarse directamente y servir de fuente de C en suelos mediterráneos, contrarrestando el proceso continuo de degradación al que están estos suelos sometidos. 1.3.4.1 c) Transformaciones biotecnológicas Dentro de las transformaciones biotecnológicas a las que se puede someter el alperujo se encuentra la digestión anaeróbica, fermentación y compostaje. Digestión anaeróbica La digestión anaeróbica presenta una serie de ventajas sobre la aeróbica: se consigue un alto grado de purificación, bajo requerimiento de nutrientes, se generan pequeñas cantidades de lodo residual y se genera biogas como combustible. Borja et al. (2006) estudiaron la digestión anaerobia de alperujo a temperatura mesofílica (35 ºC) obteniendo una eficiencia de la eliminación de la demanda química de oxígeno (DQO) del residuo del 83-97%. Fermentación La fermentación del alperujo por microorganismos en un medio sólido proporciona alimento para el ganado ya que este proceso aumenta las Residuos de almazara 84 materia orgánica, CCC, COT y CO hidrosoluble, concluyendo que la detoxificación del compost contribuye a su madurez y que los distintos composts preparados alcanzaban un grado de madurez y estabilidad aceptables, aunque los valores de la relación C/N, CCC y CO hidrosoluble eran distintos respecto a los valores de otros tipos de compost. Tabla 1.3. Características físico-químicas del alperujo compostado (Cegarra et al., 2006; Alburquerque et al., 2006a; Alburquerque et al., 2006b; Cayuela et al., 2006; Alfano et al., 2008) pH CE (dS m-1) COT (%) M.O. (%) C/N Media 8.4 4.4 37 67 28 Intervalo (5.4-9.5) (2.4-7.3) (21-49) (35-91) (17-54) Últimamente también se ha estudiado el efecto que tiene la aplicación de compost de alperujo en cultivos, en concreto en acelgas (Paredes et al., 2005), en pimientos (Alburquerque et al., 2006a). En el estudio de Paredes et al. (2005) se comparó la aplicación del compost elaborado con residuos de alperujo con otro elaborado de igual manera, pero sin alperujo y también se comparó con abono mineral, en el cultivo de acelgas. El alperujo compostado no ejercía ningún efecto tóxico sobre las plantas y se conseguía un rendimiento similar que con el compost sin alperujo y con el abono inorgánico. También observaron que la aplicación del alperujo compostado aumentaba las propiedades físicoquímicas y de fertilidad del suelo. Alburquerque et al. (2006a) compararon la aplicación del compost de alperujo con la aplicación de abono animal y con compost de lodos de depuradora y aunque el rendimiento del cultivo de pimientos fue similar con las tres enmiendas, obtuvieron una disminución en el contenido de materia orgánica del suelo con el compost de los lodos de Introducción 85 depuradora y con el abono animal, mientras que con el alperujo compostado permaneció prácticamente invariable. La aplicación de alperujo compostado se ha propuesto también para la recuperación de minas de Pb y Zn porque consiguen mantener y estimular la actividad microbiana, además de los ciclos biogeoquímicos en las minas, siempre que no se pretenda inmovilizar estos metales, porque aumentan su solubilidad y su extracción (Romero et al., 2005). Puede por tanto concluirse que, someter el alperujo al proceso de compostaje previo a la aplicación al suelo como enmienda, mejora las propiedades agronómicas del suelo y reduce y evita algunos de los inconvenientes que tiene la aplicación directa del alperujo, como son los efectos fitotóxicos y propiedades antimicrobianas por el contenido en compuestos fenólicos y lipídicos (Linares et al., 2003). 1.3.5.2 Vermicompostaje El vermicompostaje es un proceso biotecnológico por el que por medio de lombrices o gusanos las sustancias orgánicas se convierten en productos húmicos estabilizados. Normalmente el proceso de vermicompostaje es más eficiente que el de compostaje porque las lombrices se alimentan de la materia orgánica y crean condiciones que favorecen la colonización y degradación por los microorganismo del material orgánico parcialmente descompuesto y fragmentado y como consecuencia de la acción combinada de los microorganismos y las lombrices, una gran cantidad de materia orgánica se mineraliza en el proceso de vermicompostaje. Residuos de almazara 86 Este proceso ha sido propuesto por diversos autores como un sistema eficiente para la biorremediación de residuos de la industria agroalimentaria, con bajo contenido en lignina (Romero et al., 2006), como por ejemplo es el caso de los residuos de la producción de aceite de oliva (Nogales et al., 1999; Benítez et al., 2002). Y se ha estudiado el efecto de su aplicación en el comportamiento de herbicidas. Romero et al. (2006) observaron que la adsorción de herbicidas hidrofóbicos en residuos sin tratar o vermicompostados era mayor que para los herbicidas aniónicos y Delgado Moreno et al. (2007), observaron un aumento en la adsorción de triazinas en el suelo enmendado con alperujo vermicompostado en comparación con el suelo no enmendado, de forma similar a la aplicación de alperujo compostado, pero en menor medida que la aplicación de alperujo fresco que era la enmienda con la que se obtenía mayor adsorción de los herbicidas. 2. OBJETIVOS 89 2. OBJETIVOS El objetivo global de esta Memoria es estudiar el comportamiento de cuatro herbicidas utilizados en el cultivo del olivar, diurón, terbutilazina, MCPA y amitrol, en suelos de olivar y en estos mismos suelos enmendados con residuos de almazara. Se han seleccionado dos suelos de olivar, uno perteneciente a la finca experimental del IRNAS en Coria del Río (Sevilla) y otro perteneciente al IFAPA en Mengíbar (Jaén), y dos residuos de almazara, uno sin compostar y otro compostado. Un conocimiento global y simultáneo de los diversos procesos que afectan al comportamiento de estos herbicidas en suelos de olivar es fundamental tanto desde el punto de vista agronómico como medioambiental. Este objetivo global se concreta en la consecución de los siguientes objetivos generales: I. Examinar, a escala de laboratorio, la relevancia de las propiedades físico-químicas de los suelos de olivar en los procesos de adsorción, disipación, movilidad y biodisponibilidad de los herbicidas estudiados, procesos que determinan el destino final de plaguicidas poco volátiles en el suelo. II. Examinar la influencia que tiene la adición de residuos de almazara al suelo en los procesos anteriores. III. Estudiar, en condiciones reales de cultivo, el efecto que la enmienda con residuos de almazara tiene en la persistencia de dos herbicidas ampliamente utilizados en el olivar, diurón y terbutilazina. 90 El alcance de estos tres objetivos ha supuesto su división en los siguientes subobjetivos concretos: 1. Estudio de la adsorción-desorción de diurón, terbutilazina, MCPA y amitrol en suelos de olivar enmendados y sin enmendar con alperujo fresco y alperujo compostado. 2. Estudios de disipación de diurón, terbutilazina, MCPA y amitrol en suelos enmendados y sin enmendar en condiciones de laboratorio y su relación con los estudios de adsorción-desorción en dichos suelos. 3. Evaluación de la influencia de la adición de residuos de almazara en la mineralización de los herbicidas diurón y terbutilazina. 4. Estudios de lixiviación en columnas de suelo enmendado y sin enmendar de los herbicidas diurón, terbutilazina, MCPA y amitrol, y su relación con los estudios de adsorción-desorción y lixiviación en esos mismos suelos. 5. Evaluación de la influencia de la adición de residuos de almazara y del tiempo de residencia de los herbicidas en el suelo en la disponibilidad de diurón y terbutilazina mediante extracciones con disolventes acuosos y orgánicos. 6. Estudio de la influencia del envejecimiento y de la adición de residuos de almazara en la biodisponibilidad de herbicidas del grupo de las Objetivos 91 triazinas (terbutilazina y atrazina) mediante la utilización de la bacteria Pseudomonas sp cepa ADP. 7. Teniendo en cuenta los resultados de los objetivos previos, el último objetivo será evaluar en la finca experimental del IFAPA Venta del Llano (Mengíbar, Jaén) cómo afecta la aplicación continuada de residuos de almazara, uno fresco y otro compostado, a las cantidades de los herbicidas diurón y terbutilazina presentes en el suelo mediante dos ensayos en condiciones de campo durante las campañas 2005/2006 y 2006/2007. 92 3. MATERIALES Y MÉTODOS 95 Cl Cl NH C O N CH 3 3 CH N N N Cl NH CH CH 23 NH C CH CH CH 3 3 3 Cl CH3 OCH2CO OH 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Herbicidas Los herbicidas utilizados en los estudios recogidos en esta memoria son herbicidas ampliamente utilizados en el olivar tanto en Andalucía como en Extremadura, cuyas estructuras químicas se indican en la Figura 3.1. Atrazina se ha utilizado únicamente en los estudios de disponibilidad y biodisponibilidad por tratarse de una molécula modelo en estudios de dinámica de plaguicidas y porque las bacterias empleadas en el estudio son específicas de la degradación de atrazina. Las características de este herbicida se describen en el apartado 3.4.6 de este capítulo. a) b) c) d) Fig. 3.1 Estructura molecular de los herbicidas a) diurón, b) terbutilazina, c) MCPA y d) amitrol. NH N N NH2 102 de Análisis de Suelos del IRNAS siguiendo la metodología habitual. La Tabla 3.1 muestra las propiedades físico-químicas de los suelos. El contenido en materia orgánica se determinó por oxidación con dicromato según Nelson y Sommers (1982). El pH del suelo se midió en una mezcla de suelo/agua destilada con relación 1:2 (p/p) y la textura del suelo se determinó por sedimentación. El suelo BJ es un suelo arcillo limoso con bajo contenido en M.O. (Tabla 3.1). y el suelo P2 se trata de un suelo franco arenoso con muy bajo contenido en materia orgánica (M.O.) (Tabla 3.1), se ha clasificado como Typic Rhodoxeralf según la clasificación de la USDA. 3.3 Enmiendas Se ha trabajado con 2 enmiendas orgánicas: alperujo y alperujo compostado. El contenido en M.O. se determinó por oxidación con dicromato, según Nelson y Sommers (1982) (Tabla 3.2). 3.3.1 Alperujo Alperujo es el residuo sólido que se produce en el proceso de extracción de aceite de oliva en 2 fases. Este proceso se desarrolló durante los años 90 para sustituir al proceso de extracción de 3 fases, que además de aceite de oliva, generaba un residuo sólido: orujo y un residuo líquido muy contaminante: alpechín. En cambio, en el sistema de centrifugación en 2 fases, que se diferencia del de 3 fases en que el decantador del proceso de centrifugación es de 2 fases en vez de 3, sólo se genera aceite de oliva y alperujo como residuo Materiales y Métodos 103 sólido. El contenido en humedad del alperujo es elevado, es un residuo rico en lignina, celulosa y hemicelulosa. También contiene fenoles. El alperujo fresco utilizado tanto en los estudios de campo como de laboratorio, procede de la almazara del centro IFAPA Venta del Llano en Mengíbar (Jaén). Para disminuir su humedad se secó al aire libre mediante volteo con máquina pala. Tabla 3.2. Propiedades físico-químicas de las enmiendas orgánicas aplicadas, alperujo fresco y alperujo compostado. Temporada Enmienda M.O. (%) N (%) C/N 05/06 AF 93.22 ± 1.00 1.10 ± 0.25 48.99 ± 12.13 AC 67.16 ± 5.30 1.38 ± 0.08 26.46 ± 3.26 06/07 AF 92.21 ± 1.00 1.31 ± 0.08 39.26 ± 2.00 AC 71.17 ± 2.65 1.05 ± 0.07 36.70 ± 2.48 3.3.2 Alperujo compostado El alperujo compostado se obtuvo dejando el alperujo fresco en un tanque para que se secara al aire, favoreciendo el proceso de fermentación y consiguiendo reducir el contenido en polifenoles que son fitotóxicos. Posteriormente se añadieron restos de poda y hojas de los olivos con el objetivo de favorecer la aireación. Antes de aplicar el alperujo compostado al suelo se controló la relación C/N, añadiendo urea como fuente de N para que la relación C/N fuera inferior a 20, como marca la legislación vigente, R.D. 824/2005. El tiempo que dura el proceso de compostaje del alperujo puede oscilar entre 4 y 6 meses. 104 3.4 Estudios de laboratorio 3.4.1 Estudios de adsorción Las adsorción de los herbicidas en los suelos originales y enmendados se realizó haciendo interaccionar 5 g de suelo con 10 mL de una disolución de concentración inicial (Ci) de 5, 10, 20, 40 y 50 µM de herbicida (duplicado). Las disoluciones de los herbicidas se prepararon utilizando CaCl2 0.01M como disolvente, para mantener constante la fuerza iónica. Se utilizaron tubos de centrífuga de 50 mL de capacidad y de polipropileno (Figura 3.2). Se dejó en agitación en volteo durante 24 horas, tiempo suficiente para que se alcanzara el equilibrio y se centrifugaron a 10.000 rpm durante 10 minutos. Se filtró el sobrenadante con filtros de fibra de vidrio de 0.45 µm y se analizaron por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), obteniéndose los valores de concentración de los herbicidas en el equilibrio (Ce). En el caso de diurón, terbutilazina y MCPA se utilizó el detector de fotodiodos y para amitrol el detector de espectroscopía de masas. Las condiciones utilizadas se describirán en la sección 3.6 de técnicas analíticas. Figura 3.2. Esquema del proceso de adsorción de los herbicidas en las muestras de suelo. Agitación 24h 5g Suelo 10 mL de disolución de herbicida de concentración conocida Centrifugación 10.000 rpm 10 minutos Análisis del sobrenadante por HPLC Materiales y Métodos 105 Se asumió que las diferencias entre Ci y Ce se debían a procesos de adsorción de los herbicidas en los suelos. Las isotermas de adsorción se obtuvieron representando las cantidades de herbicida adsorbido (Cs) frente a las concentraciones de equilibrio (Ce) correspondientes a cada concentración inicial. (Ci - Ce) V Cs = —————— m Siendo V (mL) el volumen de la disolución de herbicida y m (g) el peso del suelo. Las isotermas obtenidas experimentalmente se ajustaron a la ecuación de Freundlich Cs = Kf Ce1/nf Siendo Kf el coeficiente de distribución que corresponde a la cantidad de plaguicida adsorbido cuando Ce es igual a la unidad y 1/nf es otra constante que indica la intensidad de la adsorción. Del ajuste lineal de la expresión logarítmica de la ecuación de Freundlich se obtienen los valores de Kf como la ordenada en el origen y de 1/nf como la pendiente de la recta de la representación de log Cs frente a log Ce. log Cs = log Kf + 1/nf log Ce 106 3.4.2 Estudios de desorción Tras la adsorción se realizaron tres desorciones sucesivas de la disolución de mayor concentración (50 µM) para cada herbicida. Una vez centrifugadas las muestras de suelo correspondientes a la adsorción, se retiraron 5 mL de sobrenadante y se añadieron 5 mL de CaCl2 0.01 M, se resuspendió el suelo con la disolución y se dejó de nuevo en agitación durante 24 horas. Después de centrifugar a 10.000 rpm durante 10 minutos se retiraron 5 mL de sobrenadante (1ª desorción) y se añadieron 5 mL de CaCl2 0.01M. Se repitió el mismo procedimiento hasta un total de 3 ciclos de desorción. La cantidad de herbicida en el sobrenadante (Ce) también se determinó por HPLC. Para obtener las isotermas de desorción se representó Ce frente a la cantidad de herbicida adsorbida por el suelo en la desorción (Csd). Los coeficientes de histéresis, expresados en porcentaje, se calcularon según la ecuación: 1/nf des %H = ———— x 100 1/nf ads El porcentaje de desorción se calculó de acuerdo a la siguiente ecuación: CSA 50 - CSD3 50 %D = ———————— x 100 CSA 50 Materiales y Métodos 107 3.4.3 Estudios de disipación Antes de comenzar con este estudio se determinó la capacidad máxima de retención de agua de los suelos originales y los suelos enmendados. Se realizó un duplicado de cada tipo de suelo. Se pesó un embudo con papel de filtro saturado con agua sobre un matraz erlenmeyer. Se colocaron 30 g de suelo en el embudo y se añadió agua destilada al suelo hasta que se saturó y comenzó a drenar el agua. Se dejó transcurrir 24 horas y pasado ese tiempo se volvió a pesar el conjunto de matraz y embudo con el suelo. La diferencia entre este peso y el peso inicial es la cantidad máxima de retención de agua de 30 g de suelo. Se calculó el porcentaje de capacidad máxima de retención de agua de cada suelo. Para los estudios de disipación se pesaron 500 g de suelo original o enmendado por duplicado y se colocaron en bandejas. Se le añadió 10 mL de una disolución de herbicida en etanol, aplicándose diurón y terbutilazina a una dosis de 3 kg ha-1, amitrol se aplicó a una dosis de 2 kg ha-1 y de 1.5 kg ha-1 para MCPA. A continuación se añadió agua destilada, la cantidad correspondiente al 40% de la capacidad máxima de retención de agua del suelo. Se tamizó 2 veces con un tamiz de 5 mm de luz de malla, para distribuir homogéneamente el herbicida en las muestras. Los suelos se pasaron a envases de vidrio y se pesaron, para controlar la humedad semanalmente y se guardaron en oscuridad. En caso de pérdida de humedad se reponía con agua destilada. Se tomaron muestras a tiempo 0 y a los 3, 10, 17, 24 y 31 días para diurón y terbutilazina. Para MCPA en los suelos P2 original y enmendado la toma de muestra se realizó a tiempo 0 y después de 4, 12, 19, 26, 33, 61 y 82 días de haber aplicado el herbicida. Para el mismo herbicida en los suelos de Jaén original y enmendado además del tiempo 0 se recogieron muestras tras 31, 59, 80, 101, 108 129 y 171 días de haber iniciado el estudio. Las muestras se congelaron hasta el momento de extracción de los herbicidas. Las extracciones se realizaron con una relación 1:2 (p/v) de 5 g de suelo y 10 mL de extractante. Para diurón, terbutilazina y amitrol el agente extractante fue metanol y para MCPA una mezcla de ácido fosfórico (pH=2) y metanol en proporción (40:60) (v/v). La extracción se llevó a cabo mediante agitación durante 24 horas en un agitador de volteo, en el caso de amitrol se hizo por ultrasonidos durante 15 minutos, posteriormente se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos y el extracto o sobrenadante se filtró utilizando filtros de fibra de vidrio de 0.45 µm. Las cantidades de herbicida extraído se determinaron por HPLC. Ensayos previos de extracción mostraron que la recuperación de los herbicidas fue superior al 90%, excepto en el caso de amitrol que fue de un 55%. Las curvas de disipación se ajustaron a una cinética de primer orden. C = C0 e-kt Siendo Co la concentración inicial de herbicida, C la concentración de herbicida en el tiempo t y k la constante de disipación. La vida media se calculó utilizando la ecuación: ln 2 t1/2 = ——— k Materiales y Métodos 109 3.4.4 Estudios de mineralización Se estudió la mineralización de diurón y de terbutilazina en el suelo original de Jaén y el mismo suelo enmendado con alperujo en el laboratorio. Se colocaron 20 g de suelo sin enmendar o enmendado, por duplicado, en un matraz biométrico de 250 mL. Se añadió la disolución de herbicida marcado con 14C para conseguir una radiactividad de 84 Bq g-1 y también se aplicó herbicida sin marcar para alcanzar una concentración de 3 kg ha-1. Se esperó para que se evaporara el disolvente de la disolución, etanol, y después se añadió agua destilada al suelo para ajustar el contenido al 40% de la capacidad máxima de retención de agua del suelo. En el brazo del matraz biométrico se añadió 1 mL de NaOH 1N para atrapar el CO2 que se fuera liberando de la mineralización del herbicida por los microorganismos del suelo y se colocó un tapón de goma. Se pesó el matraz y el peso se controlaba semanalmente para ajustar el contenido de humedad, en caso de que fuera necesario. El mL de NaOH se reemplazaba semalmente. El mL de NaOH retirado se mezclaba con 5 mL de líquido de centelleo, se dejaba durante 24 horas en la oscuridad y después se medía en el contador de centelleo (Beckman LD 5000 TD). 3.4.5 Estudios de lixiviación Se empaquetaron manualmente columnas de vidrio de 24 cm de longitud con los suelos originales y con los suelos enmendados. La columnas tenían un diámetro interno de 3.1 cm y se llenaron hasta una altura de 20 cm. En la parte inferior se colocó lana de vidrio y sobre ella 10 g de arena de mar lavada para evitar la pérdida de partículas de suelo y otros 10 g de arena se colocaron en la parte superior de la columna sobre el suelo, con la finalidad de 110 distribuir uniformemente la disolución inicial del herbicida y las disoluciones de lavado aplicadas posteriormente, así como de evitar las pérdidas por evaporación (Figura 3.3). Figura 3.3. Dibujo de las columnas de suelo empaquetadas a mano y utilizadas para el estudio de lixiviación de los plaguicidas. Antes de aplicar el herbicida se procedió a determinar el volumen de poro de los suelos originales y los suelos enmendados en las columnas de vidrio. Se añadieron 80 mL de CaCl2 0.01 M y una vez transcurridas 24 h se midió el volumen lixiviado. La diferencia entre el volumen aplicado y el recogido corresponde al volumen de poro de la columna de suelo. Los herbicidas se aplicaron disueltos en metanol, la dosis para diurón y terbutilazina aplicados individualmente fue de 3 kg ha-1 y cuando se aplicaron conjuntamente la dosis de cada herbicida fue de 2 kg ha-1, la dosis de amitrol fue de 2 kg ha-1 y la de MCPA de 1.5 kg ha-1. Después de 24 horas se procedió a aplicar diariamente 10 mL de CaCl2 0.01M durante 30 días y diariamente se 24 cm 20 cm 3.1 cm Materiales y Métodos 111 recogían los lixiviados, se medía el volumen lixiviado y se mantenían refrigerados (4 ºC) hasta el momento de ser analizados por HPLC, entonces se dejaban a temperatura ambiente y se filtraban con filtros de fibra de vidrio de 0.45 µm. Las concentraciones de herbicida medidas en los lixiviados se representaron frente al volumen de poro aplicado, obteniéndose las curvas de elución relativa. Las curvas de elución acumulativas resultaron de representar el porcentaje de plaguicida acumulado en los lixiviados frente al volumen de poro aplicado. Una vez finalizado el experimento de lixiviación, se extrajo el suelo de las columnas. Una vez que el suelo se encontraba fuera de la columna de vidrio, se procedió a dividir el suelo en 4 fragmentos de 5 cm de longitud cada uno, que correspondían a las profundidades: 0-5, 5-10, 10-15 y 15-20 cm. Cada fragmento se guardó en una bolsa identificada y se congeló hasta el momento de la extracción del herbicida y posterior análisis por HPLC. La extracción se realizó de igual manera que se ha descrito en la sección correspondiente al estudio de disipación. Una vez filtrados los extractos se analizaron por HPLC. 3.4.6 Estudios de disponibilidad y biodisponibilidad Se estudió la influencia que tiene la aplicación de alperujo fresco y el envejecimiento, es decir, el tiempo que permanece el herbicida en el suelo, en la disponibilidad de dos herbicidas pertenecientes a la familia de las triazinas, atrazina y terbutilazina, en dos suelos arenosos. El herbicida atrazina se ha 118 Durante el primer año (campaña 2005/06) se tomaron muestras tras 7, 14, 21, 49, 70 y 117 días después de la aplicación de los herbicidas el día 5 de Octubre de 2005. El segundo año de estudio se aplicó el herbicida comercial el día 20/10/06 y se tomaron muestras a tiempo 0 y los días 10, 52, 82, 111, 144 y 181 después del tratamiento. Dentro de cada subparcela se tomaron seis replicados con barrena, a 3 profundidades: 0-10, 10-20 y 20-30 cm. Las muestras se congelaron para su posterior análisis. En la Tabla 3.3 se muestra el contenido en C.O. y M.O. de los suelos de las parcelas de donde se tomaron las muestras para el estudio de persistencia. Tabla 3.3. Contenido en M.O y C.O. de los suelos de las parcelas donde se realizó el estudio de persistencia. T: suelo testigo, no enmendado; AF: enmendado con alperujo fresco; AC: enmendado con alperujo compostado. Suelo 05/06 06/07 % M.O. % C.O. % M.O. % C.O. T 1.84 1.07 1.82 1.06 AF 2.82 1.64 2.69 1.56 AC 2.38 1.38 2.56 1.48 Llegado el momento de la extracción de los herbicidas se descongelaron las muestras, en caso necesario se secaron al aire, se limpiaron de restos de hojas, ramas, piedras, etc. y se tamizaron con un tamiz de 5 mm de luz de malla. Por triplicado se pesaron 10 g de suelo en tubos de centrífuga de 50 mL de copolímero de polipropileno y se añadieron 10 mL de MeOH, se dejaron en Materiales y Métodos 119 agitación en volteo durante 24 horas, se centrifugaron a 10.000 rpm durante 10 minutos y se recogió el sobrenadante. El suelo se volvió a extraer con otros 10 mL de MeOH, se resuspendió el suelo con ayuda de una espátula y se agitó el tubo de centrífuga en un vortex durante 1 minuto, se centrifugó en condiciones iguales a las descritas con anterioridad y el sobrenadante se mezcló con el recogido anteriormente. Los 20 mL de extracto se llevaron a sequedad en un rotavapor, se añadieron 2 mL de MeOH al matraz para recoger los herbicidas, se filtró con filtro de fibra de vidrio de 0.45 µm y se analizó por HPLC. Los datos obtenidos se trataron con el programa estadístico SPSS para Windows v. 14. 3.6 Técnicas analíticas Tabla 3.4. Condiciones utilizadas para el análisis de los herbicidas por HPLC con detector de fotodiodos. Herbicida Fase móvil (%) λ Detección (nm) Tiempo retención (min) Diurón Acetonitrilo-Agua (40:60) 250 4.5 Diurón +DCPMU+DCPU Acetonitrilo-Agua (35:65) 250 6.8, 5.0, 3.5 Terbutilazina Acetonitrilo-Agua (50:50) 220 3.8 Diurón + Terbutilazina Acetonitrilo-Agua (40:60) 250 y 220 5.0 y 7.7 MCPA Ácido fosfórico 1N - Metanol (40:60) 230 4.6 Los herbicidas se analizaron por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Todos los herbicidas, excepto amitrol, se analizaron con un 120 cromatógrafo que consta de una bomba Waters 1525, autoinyector Waters 717 y detector de fotodiodos Waters 2996. La columna empleada fue Nova Pack C18 de 150 mm de longitud y 3.9 mm de diámetro interno de Waters. El volumen de inyección fue de 25 µL y el flujo de la fase móvil de 1 mL min-1. En la tabla 3.4 se muestran las condiciones de trabajo utilizadas. Amitrol se analizó con un sistema cromatográfico Waters 2690, equipado con bomba y autoinyector. La detección se realizó con un espectrómetro de masas cuatro triple cuadrupolo de Micromass (Manchester, U.K.). La separación cromatográfica se realizó con una columna de fase reversa Purospher STAR RP-18 de 125 mm de longitud, 2 mm de diámetro interno y 5 µm de diámetro de partícula, precedida de una precolumna de 4x4 mm y del mismo material de relleno que la columna de Merck (Darmstadt, Alemania). La fase móvil empleada fue metanol-agua (20:80) (v/v) a un flujo de 0.2 mL min-1 y el volumen de inyección fue de 10 µL. La energía del cono se fijó en 30V y la de colisión en 20 eV para la transición 85→57 y 30 eV para la transición 85→43. El tiempo de retención de amitrol era de 2 minutos. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 123 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1 Estudios de adsorción-desorción 4.1.1 Diurón 4.1.1 a) Isotermas de adsorción Tras hacer interaccionar el suelo con disoluciones de herbicida con distintas concentraciones, se determinaron las concentraciones en el equilibrio y se obtuvieron las isotermas de adsorción representando las concentraciones adsorbidas de diurón (Cs, µmol kg-1) frente a las concentraciones de equilibrio (Ce, µM) (Figura 4.1). Posteriormente, los valores de Ce y Cs se ajustaron linealmente a la ecuación de Freundlich para así obtener los coeficientes Kf y 1/nf de adsorción. log Cs = log Kf + 1/nf log Ce Tabla 4.1. Parámetros de Freundlich de adsorción de diurón y valores de Koc. Suelo Kf ads 1/nf ads R2 Koc BJ 4.31 (4.01-4.62)* 0.839 ± 0.033** 0.9954 404 (376-433)* (BJ+AF)L 10.28 (9.56-11.06) 0.964 ± 0.051 0.9916 415 (386-447) (BJ+AC)L 7.74 (7.21-8.31) 0.969 ± 0.0440 0.9938 296 (276-318) (BJ+AF)C 3.69 (3.52-3.87) 0.877 ± 0.021 0.9982 226 (215-237) P2 1.51 (1.20-1.91) 0.844 ± 0.089 0.9677 413 (328-523) (P2+AF)L 7.96 (7.27-8.71) 1.148 ± 0.065 0.9904 775 (708-848) * Números entre paréntesis son desviaciones estándar respecto a la media ** Los números son medias de 1/nf ± desviación estándar Estudios de adsorción-desorción 124 Figura 4.1. a) Isotermas de adsorción de diurón aplicado en los suelos originales y enmendados con alperujo. b) Ajuste lineal de las isotermas de adsorción. Los valores de 1/nf obtenidos para diurón, tanto en los suelos originales, como en los enmendados, son en general menores que la unidad (Tabla 4.1), lo cual indica que la adsorción es altamente dependiente de la concentración inicial de la disolución, con mayores porcentajes de adsorción a m enores concentraciones (Cox et al., 1997b). La mayoría de las isotermas son de tipo L, Cs (µmol kg-1) 0 20 40 60 80 100 BJ (BJ+AF) L (BJ+AC) L (BJ+AF) C P2 (P2+AF) L a) Ce (µM) 0 10 20 30 40 Cs (µmol kg-1) 0 20 40 60 80 100 BJ (BJ+AF) L (BJ+AC) L (BJ+AF) C P2 (P2+AF) L b) Resultados y Discusión 125 según la clasificación de Giles et al. (1960): a medida van ocupando las moléculas de diurón los lugares de adsorción, se hace más difícil encontrar un sitio vacante disponible. En los casos del suelo arcilloso BJ enmendado con alperujo fresco (BJ+AF)L y alperujo compostado en el laboratorio (BJ+AC)L, el valor de la pendiente 1/nf está próximo a la unidad. Se trata por tanto de una isoterma tipo C (Giles et al., 1960). Las curvas tipo C se caracterizan por un reparto constante del plaguicida entre la disolución y el suelo, especialmente la fracción orgánica (Patakioutas y Albanis, 2002). Sólo en el suelo P2 enmendado con alperujo fresco en el laboratorio se obtiene un valor de 1/nf para diurón superior a 1 ( Tabla 4.1). Se trata de una isoterma tipo S, indicándonos la existencia de competencia entre las moléculas de plaguicida y las de agua por los sitios de adsorción (Giles et al., 1960). Los valores de Kf de diurón han oscilado entre 1.51 en el suelo P2 original y 10.28 en el suelo BJ enmendado con alperujo fresco en el laboratorio (BJ+AF)L. Los coeficientes de adsorción Kf de diurón en los dos suelos estudiados sin enmendar, P2 y BJ, pueden compararse porque los valores de 1/nfads son similares (Hance, 1967; Bowman, 1981). Los valores obtenidos de Kf ads indican mayor adsorción de diurón en el suelo BJ que en el suelo P2. El suelo BJ tiene mayor contenido en materia orgánica (1.84%) y en arcilla (51.6%) que el suelo P2 (0.63% de M.O. y 20.4% de arcilla) (Tabla 3.1). Ambos componentes de los suelos se ha visto que se correlacionan positivamente con la adsorción del herbicida diurón (Alva y Singh, 1990; Inoue et al., 2006). Tanto en el suelo arenoso P2, como el arcilloso BJ, los valores de Kf (Tabla 4.1) indican que la adsorción de diurón aumenta cuando los suelos se enmiendan con alperujo fresco y alperujo compostado en el laboratorio a razón de 10% en peso. Este aumento en Kf puede atribuirse al aumento en materia orgánica y carbono orgánico al aplicar la enmienda al suelo (Tabla 3.1). Estos Estudios de adsorción-desorción 126 resultados concuerdan con otros publicados por autores como Cox et al. (1998); Sánchez-Camazano et al. (2000); Said Pullicino et al. (2004) y Dorado et al. (2005). En el suelo BJ, la materia orgánica aumenta de 1.84% a 4.27% y 4.51% cuando se enmienda con alperujo fresco y alperujo compostado, respectivamente. En el suelo P2, el porcentaje de M.O. de 0.63 en el suelo sin enmendar asciende a 1.77% cuando se enmienda con alperujo y a 3.04% cuando la enmienda está compostada. Sin embargo cuando el suelo se enmienda en el campo, aún aumentando el contenido en materia orgánica de 1.84 a 2.82% en el suelo BJ, no se observan diferencias significativas en la adsorción entre el suelo enmendado y el suelo original. Fernández-Bayo et al. (2008) tampoco encontraron correlación entre la cantidad adsorbida de diurón e imidacloprid con el contenido en C.O., en un estudio con 8 suelos agrícolas, atribuyendo este resultado al bajo contenido en C.O. de los suelos (entre 0.24% y 2.5%). Según estos autores, otras propiedades de los suelos, normalmente enmascaradas por el contenido en C.O., jugarían un papel importante en la dinámica de adsorción de diurón e imidacloprid. Cox et al. (2007) también observaron una menor adsorción de diurón en un suelo enmendado con una enmienda comercial líquida, que en el suelo original, pese al aumento del contenido total de C.O. tras la enmienda. La disminución en la adsorción de diurón se atribuyó a la interacción de la materia orgánica soluble de la enmienda líquida y el herbicida en disolución, así como a competencia por los sitios de adsorción. Por lo tanto, no sólo la cantidad de M.O., sino también la naturaleza de la misma pueden afectar a la adsorción de diurón. La aplicación de la enmienda en el laboratorio o en el campo también puede influir en los resultados obtenidos. En el primer caso, tras añadir la enmienda, el suelo se tamiza para conseguir una distribución lo más homogénea posible de la enmienda. Por el contrario, en el campo, pese a Resultados y Discusión 127 pasar una pala tras la adición del alperujo, probablemente no se consiga un reparto tan homogéneo de la enmienda en el suelo. Con objeto de disminuir la variabilidad en la adsorción entre distintos suelos, debido a la variedad en la cantidad y la calidad de los componentes del suelo, especialmente de la materia orgánica, también se han calculado los coeficientes de adsorción normalizados al contenido de carbono orgánico (C.O.) (Koc) (Tabla 4.1): Kf Koc = ————— x 100 %C.O. Esta normalización asume que la M.O. es el componente principal de los suelos en el control de la adsorción y que las propiedades de adsorción de la M.O. son las mismas en todos los suelos (Seybold y Mersie, 1996). Según Green y Karickhoff (1990), Koc es un coeficiente que describe la distribución de un plaguicida entre las fases acuosa y orgánica del suelo. Esta aproximación es más adecuada para plaguicidas hidrofóbicos, plaguicidas no i ónicos con una solubilidad en agua inferior a 10-3 M, pero se puede aplicar prácticamente a muchos plaguicidas que son ligeramente polares y demasiado solubles en agua para ser considerados hidrofóbicos. A pesar de la diferencia entre los valores de Kfads en los suelos originales BJ y P2 no se han encontrado diferencias significativas en los valores de Koc. (Tabla 4.1). Tampoco se han obtenido diferencias significativas en los valores de Koc del suelo BJ original y el mismo suelo enmendado con alperujo fresco en el laboratorio (BJ+AF)L (404 y 415 respectivamente) (Tabla 4.1). Sin embargo, cuando este suelo se enmienda con alperujo compostado en el laboratorio o con alperujo fresco en el campo, los valores de Koc disminuyen Estudios de adsorción-desorción 128 significativamente a 296 y 226 respectivamente. Estos valores más bajos de Koc indican una menor capacidad de adsorción de la enmienda orgánica. Resultados similares fueron observados por González Pradas et al., (1998) en el caso de diurón y un suelo enmendado con turba. Por el contrario, en el suelo arenoso P2 es mayor el valor de Koc en el suelo enmendado que en el suelo original, 775 frente a 413. Figura 4.2 a) Isotermas de adsorción de diurón aplicado junto con terbutilazina en el suelo original BJ y el mismo suelo enmendado con alperujo. b) Ajuste lineal de las isotermas de diurón coaplicado con terbutilazina. Cs (µmol kg-1) 0 20 40 60 80 100 BJ (BJ+AF) L (BJ+AC) L (BJ+AF) C a) Ce (µM) 0 5 10 15 20 25 Cs (µmol kg-1) 0 20 40 60 80 100 BJ (BJ+AF) L (BJ+AC) L (BJ+AF) C b) Resultados y Discusión 135 en el suelo con mayor contenido en C.O., confirmando que la adsorción de estos tres herbicidas está controlada predominantemente por el contenido en M.O. de los suelos. Como en el caso de diurón, no s e observa ningún cambio de adsorción de terbutilazina en el suelo arcilloso cuando éste se enmienda con alperujo fresco en el campo (BJ+AF)C , al compararlo con el suelo original. Al igual que en el caso de diurón, esto puede atribuirse a que el aumento en M.O. (Tabla 3.1) tras la enmienda en el campo no es tan alto como en el laboratorio. La cantidad de enmienda aplicada corresponde a un 1.8% (p:p), respecto al 10% (p:p) de enmienda que se aplica cuando el suelo se enmienda en el laboratorio. El tiempo transcurrido desde que se aplicó la enmienda hasta que se realizó el estudio de adsorción (mayor en el campo que en el laboratorio), puede influir también en los resultados obtenidos, ya que según resultados de varios estudios al aumentar el tiempo de incubación de la enmienda en el suelo disminuye la adsorción de los herbicidas (Undabeytia et al., 2004; Delgado-Moreno et al., 2007). Tabla 4.5. Parámetros de Freundlich de adsorción de terbutilazina y valores de Koc. Suelo Kf ads 1/nf ads R2 Koc BJ 2.58 (2.29-2.90)* 0.963 ± 0.051** 0.9916 241 (215-271)* (BJ+AF)L 12.02 (11.27-12.83) 1.150 ± 0.057 0.9927 485 (455-518) (BJ+AC)L 8.70 (7.65-9.89) 1.050 ± 0.090 0.9786 332 (292-378) (BJ+AF)C 2.56 (2.35-2.78) 0.982 ± 0.037 0.9958 156 (144-170) P2 1.29 (1.07-1.57) 0.951 ± 0.075 0.9819 354 (292-430) (P2+AF)L 17.02 (16.29-17.79) 0.958 ± 0.040 0.9949 1658 (1587-1733) * Números entre paréntesis son desviaciones estándar respecto a la media ** Los números son medias de 1/nf ± desviación estándar Estudios de adsorción-desorción 136 Figura 4.5 a) Isotermas de adsorción de terbutilazina en los suelos sin enmendar y enmendados con alperujo. b) Ajuste lineal de las isotermas de adsorción de terbutilazina. En el suelo arenoso P2 es en el que se produce el mayor aumento en la adsorción de terbutilazina tras la enmienda en el laboratorio respecto al suelo no enmendado: el valor de Kf ads es 13 veces superior en el suelo enmendado al compararlo con el suelo original (Tabla 4.5). Esto es indicativo de la importancia de la M.O. en la adsorción de terbutilazina. Dolaptsoglou et al. (2007) observaron un comportamiento similar en la adsorción de terbutilazina Cs (µmol kg-1) 0 20 40 60 80 100 BJ (BJ+AF) L (BJ+AC) L (BJ+AF) C P2 (P2+AF) L a) Ce (µM) 0 5 10 15 20 25 30 35 Cs (µmol kg-1) 0 20 40 60 80 100 BJ (BJ+AF)L (BJ+AC)L (BJ+AF)C P2 (P2+AF)L b) Resultados y Discusión 137 cuando al suelo se le aplicaban distintas enmiendas orgánicas como: compost de residuos avícolas, paja y especialmente con residuos sólidos urbanos. Delgado- Moreno et al. (2007) también observaron un aumento en la adsorción de cuatro triazinas, entre ellas terbutilazina, cuando el suelo se enmendaba con alperujo fresco, compostado y vermicompostado. Cuando los coeficientes de adsorción se expresan en función de C.O. (Koc), no observamos una reducción en la variabilidad de la adsorción. Se observa un aumento en Koc en los suelos en los que la adsorción aumenta tras la enmienda, especialmente en el suelo (BJ+AF)L, en el que Kf ads aumenta de 2.6 a 12. En el caso del suelo arenoso P2 también observamos este aumento tan significativo en Koc. Esta alta variación de los valores de Koc de las triazinas con el tratamiento de los suelos, es indicativo de que la adsorción de estos herbicidas no depende sólo de la cantidad de M.O., sino también de la calidad de la M.O. Delgado-Moreno et al. (2007) observaron que los herbicidas más hidrofóbicos, como atrazina y prometrina, presentan mayores valores de Koc y mayor afinidad por los suelos enmendados con residuos de almazara que contienen ácidos húmicos con grupos alifáticos y elevado contenido en lípidos constituídos por mezclas de n-alcanos, n-alcanoles y ácidos grasos. Estos constituyentes de la matriz del suelo favorecen la adsorción de las triazinas por la formación de enlaces hidrofóbicos. También según estos autores cabe destacar que las superficies macromoleculares de estructuras alifáticas son más flexibles que las estructuras aromáticas asociadas con impedimentos estéricos y la adsorción de atrazina puede explicarse por la retención por el C alifático de las sustancias húmicas que le confiere mayor grado de flexibilidad estereoquímica y le permite la adsorción del herbicida dentro de una matriz macromolecular tridimensional. Estudios de adsorción-desorción 138 Figura 4.6 a) Isotermas de adsorción de terbutilazina aplicado con diurón en el suelo BJ original y enmendado con alperujo. b) Ajuste lineal de las isotermas de adsorción de terbutilazina coaplicado con diurón. La Figura 4.6 muestra las isotermas de adsorción de terbutilazina aplicado junto con el herbicida diurón en el suelo BJ sin enmendar y enmendado con residuo sólido de almazara y los parámetros de adsorción se presentan en la Tabla 4.6. Al igual que sucedía con diurón, no existen diferencias significativas en la adsorción de terbutilazina con la coaplicación con diurón, ni en los valores de Kf ni en los valores de Koc. Estos resultados difieren de los observados por Businelli (1997), quien observó una disminución Cs (µmol kg-1) 0 20 40 60 80 100 BJ (BJ+AF) L (BJ+AC) L (BJ+AF) C a) Ce (µM) 0 5 10 15 20 25 30 Cs (µmol kg-1) 0 20 40 60 80 100 BJ (BJ+AF) L (BJ+AC) L (BJ+AF) C b) Resultados y Discusión 139 en los valores de Kf para atrazina cuando se coaplicaba con terbutilazina y prometrina en comparación a l a aplicación de atrazina como único herbicida, atribuyendo este resultado a la competencia entre los herbicidas por los mismos sitios de adsorción. Tabla 4.6. Parámetros de Freundlich de adsorción de terbutilazina coaplicada con diurón y valores de Koc. * Números entre paréntesis son desviaciones estándar respecto a la media ** Los números son medias de 1/nf ± desviación estándar 4.1.2 b) Estudios de desorción Las isotermas de adsorción-desorción de terbutilazina en los suelos estudiados se h an representado en la Figura 4.7. N o se han obtenido buenos ajustes lineales de las isotermas de desorción de terbutilazina en los suelos enmendados con alperujo fresco en el laboratorio (R2 ≤ 0.685). En cambio, en el resto de los suelos, las correlaciones para el ajuste lineal de las isotermas de desorción sí han sido buenos (R2 ≥ 0.962) (Tabla 4.7). Suelo Kf ads 1/nf ads R2 Koc BJ 2.48 (2.16-2.84)* 0.965 ± 0.059** 0.9889 232 (202-266)* (BJ+AF)L 13.03 (11.18-15.18) 0.861 ± 0.110 0.9530 526 (452-613) (BJ+AC)L 7.33 (6.53-8.22) 0.920 ± 0.067 0.9841 280 (249-314) (BJ+AF)C 3.27 (2.93-3.65) 0.840 ± 0.047 0.9907 200 (179-223) Estudios de adsorción-desorción 140 0 5 10 15 20 25 30 0 20 40 60 80 100 Adsorción BJ Desorción BJ 0246810 Adsorción (BJ+AF) L Desorción (BJ+AF) L 0 2 4 6 8 10 12 Cs (µmol kg-1) 0 20 40 60 80 100 Adsorción (BJ+AC) L Desorción (BJ+AC) L 0 5 10 15 20 25 Adsorción (BJ+AF) C Desorción (BJ+AF) C Ce (µM) 0 5 10 15 20 25 30 35 0 20 40 60 80 100 Adsorción P2 Desorción P2 0246810 Adsorción (P2+AF) L Desorción (P2+AF) L Figura 4.7. Isotermas de adsorción-desorción de terbutilazina en los suelos originales y enmendados con alperujo. Los valores obtenidos de 1/nf des son menores que los obtenidos para 1/nf ads, al igual que ocurría con el herbicida diurón. Este hecho nos indica que se Resultados y Discusión 141 produce el fenómeno de histéresis en el proceso de adsorción-desorción de terbutilazina en los suelos estudiados. Otros autores también han observado el fenómeno de histeresis en el caso de los herbicidas del grupo de las triazinas (Dousset et al. 1994; Chefetz et al. 2004; Delgado-Moreno et al. 2007). Llama la atención que en el suelo arenoso P2 sin enmendar la reversibilidad es menor que en el suelo arcilloso BJ, en el que se producía mayor adsorción de terbutilazina. Esto difiere de lo observado con diurón, en el que el porcentaje de histéresis de los suelos sin enmendar es similar (Tabla 4.3), y vuelve a poner de manifiesto los diferentes mecanismos de adsorción-desorción implicados en el caso de cada herbicida. Tabla 4.7. Parámetros de Freundlich de desorción de terbutilazina y porcentajes de histéresis y de desorción. Suelo Kf des 1/nf des R2 %H %D BJ 8.07 (7.58-8.58)* 0.583 ± 0.023** 0.9969 60.53 43.77 (BJ+AF)L 63.53 (55.27-73.04) 0.206 ± 0.099 0.6854 17.93 10.36 (BJ+AC)L 20.85 (17.60-24.69) 0.598 ± 0.082 0.9633 56.90 22.54 (BJ+AF)C 7.49 (6.88-8.15) 0.633 ± 0.032 0.9950 64.49 44.30 P2 13.46 (12.07-15.00) 0.267 ± 0.039 0.9615 28.12 29.15 (P2+AF)L 87.30 (86.42-88.18) 0.016 ± 0.009 0.6001 1.67 1.92 * Números entre paréntesis son desviaciones estándar respecto a la media ** Los números son medias de 1/nf ± desviación estándar Cuando se estudia la desorción de terbutilazina coaplicada con diurón, se produce en el suelo original BJ el fenómeno de histéresis negativo, que se caracteriza porque la isoterma de desorción está por debajo de la isoterma de adsorción (Figura 4.8), H > 100% y Kads > Kdes. Barriuso et al. (1994) y Celis et al. (1997b) también observaron el fenómeno de histéresis negativo para la Estudios de adsorción-desorción 142 desorción de atrazina y simazina. Barriuso et al. (1994) consideraron este resultado como "aberrante" porque implica que la cantidad de herbicida desorbido es superior a la cantidad adsorbida. Esto lo atribuyeron al efecto de la concentración de sólidos, por el cual la adsorción disminuye cuando aumenta la concentración de sólidos en la suspensión y el proceso de centrifugación produciría un aumento temporal en la relación sólido/disolución que favorecería el proceso de desorción. Otra explicación al fenómeno de histéresis negativa según apuntan estos autores es q ue en los experimentos de desorción sólo se elimina el agua externa y permanece retenida el agua interlaminar de las arcillas. Este fenómeno sólo se observa cuando el proceso de adsorcióndesorción es altamente reversible y en suelos con alto contenido en arcillas con elevados coeficientes de adsorción. La reversibilidad del proceso de adsorcióndesorción en este caso es muy elevada, como puede comprobarse por el alto valor de %H (Tabla 4.8). Cuando la enmienda se aplica al suelo en el campo también se obtiene una alta reversibilidad, pero en cambio si el suelo es enmendado en el laboratorio con alperujo aumenta la irreversibilidad en la adsorción-desorción de terbutilazina. Es decir, al igual que ocurría con diurón la irreversibilidad en el suelo arcilloso aumenta con el aumento en la adsorción. Tabla 4.8. Parámetros de Freundlich de desorción de terbutilazina aplicada junto a diurón y porcentajes de histéresis y de desorción. Suelo Kf des 1/nf des R2 %H %D BJ 0.93 (0.45-1.90)* 1.215 ± 0.251** 0.9213 125.91 66.33 (BJ+AF)L 40.27 (35.18-46.10) 0.327 ± 0.071 0.9131 37.93 17.09 (BJ+AC)L 24.43 (22.44-26.61) 0.448 ± 0.039 0.9853 48.73 24.85 (BJ+AF)C 2.43 (1.64-3.59) 0.979 ± 0.141 0.9600 116.58 53.88 * Números entre paréntesis son desviaciones estándar respecto a la media ** Los números son medias de 1/nf ± desviación estándar Resultados y Discusión 143 0 20 40 60 80 Adsorción BJ Desorción BJ Adsorción (BJ+AF) L Desorción (BJ+AF) L Ce (µM) 0 5 10 15 20 25 30 Cs (µmol kg-1) 0 20 40 60 80 Adsorción (BJ+AC) L Desorción (BJ+AC) L 0 5 10 15 20 25 30 Adsorción (BJ+AF) C Desorción (BJ+AF) C Figura 4.8. Isotermas de adsorción-desorción de terbutilazina aplicado con diurón en el suelo original BJ y el mismo suelo enmendado con alperujo. 4.1.3 MCPA 4.1.3 a) Isotermas de adsorción La Figura 4.9 muestra la representación de las isotermas de adsorción de MCPA en los suelos seleccionados para el estudio. Las isotermas de adsorción de MCPA en los suelos estudiados son de tipo L según la clasificación de Giles et al. (1960) que se caracteriza por una disminución en los sitios de adsorción a medida que aumenta la concentración. Sólo para el suelo Estudios de adsorción-desorción 144 Cs (µmol kg-1) 0 4 8 12 16 20 BJ (BJ+AF)L (BJ+AC)L (BJ+AF)C P2 (P2+AF)L (P2+AC)L a) BJ enmendado en el laboratorio con alperujo compostado (BJ+AC)L, la isoterma es de tipo C. En este caso la curva es lineal y el soluto penetra en el sólido con más facilidad que el disolvente. En general el ajuste lineal a la ecuación de Freundlich es muy bueno (R2 = 0.962 - 0.999). Los valores de los parámetros de adsorción se muestran en la Tabla 4.9. Figura 4.9 a) Isotermas de adsorción de MCPA en los suelos sin enmendar y enmedados con alperujo. b) Ajuste lineal de las isotermas de adsorción de MCPA en los mismos suelos. Ce (µM) 010 20 30 40 50 60 Cs (µmol kg-1) 0 4 8 12 16 20 BJ (BJ+AF)L (BJ+AC)L (BJ+AF)C P2 (P2+AF)L (P2+AC)L b) Bibliografía 249 Gallardo Lancho, J. 1982. La materia orgánica del suelo - su importancia en suelos naturales y cultivados. Temas de divulgación (Instituto de Orientación y Asistencia Técnica del Oeste) nº 6, Instituto de Orientación y Asistencia Técnica del Oeste, Salamanca. Gan, J.; Yates, S.R.; Papiernik, S.; Crowley, D. 1998. Application of organic amendments to reduce volatile pesticide emissions from soil. Environ. Sci. Technol. 32, 3094-3098. García-González, V.; Govantes, F.; Shaw, L.J.; Burns, R.G.; Santero, E. 2003. Nitrogen control of atrazine utilization in Pseudomonas sp. strain ADP. Appl. Environ. Microbiol. 6987–6993. Ghadiri, H.; Rose, C.W.; Connell, D.W. 1995. Degradation of organochlorine pesticides in soils under controlled environment and outdoor conditions. J. Environ. Manage. 43, 141-151. Giacomazzi, S. y Cochet, N. 2004. 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The objective of this work was to investigate the effect of olive oil production industry organic waste (alperujo) on soil sorption-desorption, degradation, and leaching of diuron [3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea] and terbuthylazine [ N 2- tert -butyl-6-chloro- N 4-ethyl-1,3,5-triazine-2,4-diamine], two herbicides widely used in olive crops. The soils used in this study were a sandy soil and a silty clay soil from two different olive groves. The sandy soil was amended in the laboratory with fresh (uncomposted) alperujo at the rate of 10% w/w, and the silty clay soil was amended in the field with fresh alperujo at the rate of 256 kg per tree during 4 years and in the laboratory with fresh or composted alperujo. Sorption of both herbicides increased in laboratory-amended soils as compared to unamended or field-amended soils, and this process was less reversible in laboratory-amended soils, except for diuron in amended sandy soil. Addition of alperujo to soils increased half-lives of the herbicides in most of the soils. Diuron and terbuthylazine leached through unamended sandy soil, but no herbicide was detected in laboratory-amended soil. Diuron did not leach through amended or unamended silty clay soil, whereas small amounts of terbuthylazine were detected in leachates from unamended soil. Despite their higher sorption capacity, greater amounts of terbuthylazine were found in the leachates from amended silty clay soils. The amounts of dissolved organic matter from alperujo and the degree of humification can affect sorption, degradation, and leaching of these two classes of herbicides in soils. It appears that adding alperujo to soil would not have adverse impacts on the behavior of herbicides in olive production. KEYWORDS: Diuron; terbuthylazine; soil; organic amendment; alperujo INTRODUCTION Olive is one of the most important crops in the Mediterranean region, where 97% of the world’s olive oil is produced (1). Spain is the main olive oil producing country in the world, followed by Italy. In the early 1990s, a two-phase centrifugation process was introduced for olive oil extraction. This process extracts more oil from the olives and consumes less water and energy as compared to other processes and does not produce olive mill wastewater (2). The two-phase process for olive oil extraction produces a solid waste (alperujo),which is rich in organic matter, including lignin (3,4). Large amounts of this residue are generated in short periods of time: in Spain alone, this new system generates approximately 4 000 000 Mg per year of alperujo,usually from November to January, and represents a major potential environmental problem. The soils of the countries of the Mediterranean region are characterized by a low organic matter (OM) content (5). To improve the amount of organic matter in these soils, the use of organic amendments, such as sewage sludge, manure, and urban waste, has been suggested. Alperujo has a very high organic matter content (90%); therefore, its use as soil amendment has been proposed to enrich soils poor in organic matter and as a solution for its disposal without any expensive chemical or thermal treatment (6,7). Also, this residue has the advantage of being free of pathogens and heavy metals. The application of olive mill wastes to the land, either raw or after composting, properly mixed, and incorporated at acceptable loading rates, might constitute an extremely effective contribution to increasing crop yields and to maintaining or improving soil fertility (8, 9). Diuron and terbuthylazine are commonly used herbicides in olive tree cultures in Spain. Diuron is a substituted-urea herbicide used to control a wide variety of annual and perennial weeds. It is absorbed by plant roots and interferes in the * Corresponding author: e-mail, [email protected]. †Instituto de Recursos Naturales y Agrobiologı´a de Sevilla IRNAS CSIC. §University of Minnesota. 4828 J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 4828 − 4834 10.1021/jf070525b CCC: $37.00 © 2007 American Chemical Society Published on Web 05/19/2007 photosynthetic process in the Hill reaction. It is used on many agricultural crops and also for long-term pre-emergence weed control in noncrop areas (10). It is relatively persistent in soil with half-lives from 1 month to 1 year (11). Microbial degradation is considered to be the primary mechanism for its dissipation from soil (12,13). Diuron has been detected in surface waters at concentrations of >5μg/L (14). Terbuthylazine is a chloro-S-triazine herbicide used for preemergence and postemergence weed control (15). It is absorbed by roots and inhibits the Hill reaction and CO2sorption in the chlorophyllic function. Triazines are weak bases with low water solubility. The main degradation process is microbial (16-18). The main terbuthylazine metabolites, formed by dealkylation (desethylterbuthylazine) and hydroxylation (2-hydroxydeseth- ylterbuthylazine), and the parent compound have been detected in groundwater and are considered to be potential pollutants for aquifer contamination (19). It is known that sorption-desorption, leaching, and dissipation of chemicals in soils are influenced by the soil OM content. Increased OM in soil generally results in greater pesticide sorption, decreased leaching, and greater persistence in soil. Increased sorption may decrease the bioavailability of the pesticides, resulting in inadequate pest control. These effects have been observed in soils amended with sewage sludge and carbon-rich waste materials (20,21). The aim of this work was to determine the influence of the two-phase olive oil mill waste (alperujo), when added to soils as amendment, on the soil processes affecting the bioavailability, that is, sorptiondesorption, degradation, and leaching, of the herbicides diuron and terbuthylazine. MATERIALS AND METHODS Herbicides. Diuron [3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea) (purity )99%), purchased from Dr. Ehrenstorfer GmbH (Augsburg, Germany) is a crystalline colorless solid, which has solubility in water of 36.4 mg L-1at 25 °C and log Kow (25 °C) of 2.85 (0.03 (22). [14C]Diuron (5.43 MBq/mg, >95% radiochemical purity) was purchased from IZOTOP Institute of Isotopes Co. (Budapest, Hungary). Terbuthylazine (N2-tert-butyl-6-chloro-N4-ethyl-1,3,5-triazine-2,4-diamine) (99% purity) was also purchased from Dr. Ehrenstorfer GmbH. It is a colorless powder with a water solubility of 8.5 mg L-1at 20 °C and log Kow of 3.21 (22). [14C]Terbuthylazine (1.99 MBq/mg and 94.3% radiochemical activity) was kindly supplied by Syngenta (Basel, Switzerland). Soils and Organic Amendments. Two soils were used in this study: a sandy soil (SS) (pH 8.4, 0.63% OM, 20% clay, 71% sand) from an olive grove located in Coria del Rio (Sevilla, Spain) and a silty clay soil (SC) (pH 8.3, 1.84% OM, 52% clay, 6% sand) from an olive grove located in Mengı´bar (Jaen, Spain). Soil SC was amended with alperujo from Mengı´bar in the field (FA) from 2002 to 2005 at a rate of 18000 kg ha-1(SC+FA). Soil SC amended in the field (SC+FA) and unamended soils SC and SS were sampled with a spade, air-dried, and sieved to passa2mmmesh. Unamended SS and SC soils were amended in the laboratory (10% w/w) with the same alperujo added in the field (SS+A and SC+A, respectively). Alperujo had the following properties: pH 5.8, 93.2% OM, 25 g kg-1dissolved organic carbon (DOC), and C/N )18.3. Unamended SC soil was also amended in the laboratory with a 10% w/w composted alperujo (SS+CA) from the same source. This alperujo was composted by air-drying fresh alperujo in a tank to favor the fermentation process and to reduce polyphenols. Composted alperujo had the following properties: pH 7.9, 49.2% OM, 3000 μgg -1DOC, and C/N )16.5. After composting, olive tree prunings and leaves were added to facilitate aeration. The amendment was weighed and added to the soil, and the mixture was sieved twice witha2mmsieve to homogenize the amendment and soil. OM of the soil samples (unamended and amended) and amendments (uncomposted alperujo and composted alperujo) was determined by dichromate oxidation (23), soil pH was determined in a 1:2 (w/w) soil/deionized water mixture, and texture was determined by sedimentation. The organic amendments were further characterized by fluorescence spectroscopy. The DOC from alperujo and composted alperujo was obtained by shaking with a 0.1 M CaCl2solution, which minimized the extraction of clay and mimicked the ionic strength of the pore water (24). Suspensions were shaken for 15 min at room temperature, centrifuged at 1000gfor 15 min, and then filtered through a 0.4 μm pore polycarbonate filter. DOC was measured with a Shimadzu TOC- 5050A Total Carbon Analyser (Duisburg, Germany). The fluorescence spectra, from 300 to 480 nm, were obtained in a Varian Cary Eclipse fluorescence spectrophotometer (Palo Alto, CA) using 1 cm cuvettes excited at 254 nm. A humification index (HIX) was calculated from the fluorescence data as (25): where Wl is the wavelength in nanometers and IWl is the fluorescence intensity at this wavelength. Sorption-Desorption Studies. Duplicate samples (5 g) of unamended and amended soils were treated with 10 mL of diuron and terbuthylazine solutions (initial concentrations, Ci, ranged from 5 to 50 μM in 0.01 M CaCl2). Previously, it was determined that equilibrium was reached in <24 h and that no measurable degradation occurred during this period. Equilibrium concentrations (Ce) in the supernatants after 24 h of equilibration time were determined by HPLC under the following conditions: Nova-Pack column, 150 mm length ×3.9 mm i.d.; column packing, C18; flow rate, 1 mL min-1; eluent system for diuron 60:40 water/acetonitrile mixture and UV detection at 250 nm and for terbuthylazine 50:50 water/acetonitrile mixture and detection at 222 nm. Differences between Ciand Cewere assumed to be the amounts sorbed (Cs). Sorption isotherms were fitted to the Freundlich equation, Cs)KfCe1/nf, and sorption coefficients Kfand 1/nfcalculated. Sorption coefficients Kfnormalized to organic carbon (OC) content of the soils (Koc) were also calculated, Koc )Kf/%OC ×100. Herbicide desorption was made with successive washings (three times) with 0.01 M CaCl2of the soil that was initially equilibrated with 50 μM herbicide concentration for 24 h. Desorption isotherms were fitted to the Freundlich equation, and the hysteresis coefficient was calculated, H)[(1/nf,des)/(1/nf,sor)] ×100. Degradation Studies. Duplicate samples (500 g) of each soil were treated with an ethanol solution of diuron or terbuthylazine to give a final concentration of 3 mg kg-1of dry soil. After moisture contents had been adjusted to 40% of soil water-holding capacity, soil samples were thoroughly mixed, transferred to glass jars, capped, and incubated in the dark at 20 (2°C for 33 days. Moisture contents were maintained at a constant level throughout the experiment by adding distilled water as necessary. Soils were sampled periodically and diuron and terbuthylazine extracted by shaking5gofsoil with 10 mL of methanol for 24 h. Recoveries were >90%. Methanol extracts were analyzed by HPLC as described above. Diuron and terbuthylazine dissipation curves in original and amended soils were fitted to first-order kinetics (C)Ci e-Kt) and half-lives (t1/2) calculated. Portions (20 g) of SC soil (unamended and amended in the laboratory SC+A) were placed in 250 mL biometer flasks and treated with 0.1 mL of an ethanol solution of [ring-UL-14C]diuron or terbuthylazine (1682 Bq) and nonlabeled herbicide to give a concentration of 3 mg kg-1of dry soil. After evaporation of the solvent, the moisture content was adjusted to -0.33 kPa and maintained at constant level throughout the experiment. The flasks were closed with rubber stoppers and incubated at 20 °C for a period of 6 weeks. The side arm of the biometer flask contained 1 mL of 1 M NaOH to trap the 14CO2released during the experiment. The NaOH solution was sampled periodically and replaced with fresh solution. The amount of 14CO2in the vials was determined by mixing 1 mL of NaOH solution with 5 mL of Beckman Ready Safe Scintillation cocktail and counting radioactivity using a LD 5000 TD Beckman liquid scintillation analyzer. For photolysis studies, 100 mL of diuron and terbuthylazine aqueous solutions (10 mg L-1) was irradiated in 250 mL quartz flasks for 48 h in a Suntest photoreactor equipped with a xenon lamp and a permanent filter selecting wavelength >290 nm. This apparatus exhibits a radiation HIX )∑ Wl )435 480 IWl/∑ Wl )300 345 IWl Fate of Diuron and Terbuthylazine in Amended Soils J. Agric. Food Chem., Vol. 55, No. 12, 2007 4829 very close to that of natural sunlight (26). Flasks were sampled periodically, and herbicide concentration was determined by HPLC. Photodegradation curves of diuron and terbuthylazine as a function of irradiation time were fitted to first-order kinetics and half-lives calculated. In the case of diuron, photolysis studies with unamended and amended SS soil were also performed. Duplicate amounts of SS and SS+A soils (5 g) were treated with diuron (10 mg kg-1) and moisture content adjusted to 100% of their soil water-holding capacity in 4 cm diameter dishes, which were irradiated for 48 h in the Suntest photoreactor. Moisture content was maintained constant by the addition of water after 30 min of irradiation. After 2, 6, 12, 24, and 48 h of irradiation, soil samples were extracted with methanol (1:2 w/v) and extracts analyzed by HPLC for their herbicide content. Photodegradation curves of diuron in SC and SC+A soils as a function of irradiation time were fitted to first-order kinetics and half-lives calculated. Leaching Studies. Duplicate columns (3.1 cm i.d.) were hand-packed with amended and unamended soils to a height of 20 cm soil in each column. Glass wool was placed at the bottom of the column to avoid soil losses, and sea sand was added at the top of the soil. After saturation of the soils with 0.01 M CaCl2, solutions of diuron or terbuthylazine in methanol were added to the soil in the column at a rate of 3 kg ha-1. After 24 h, enough time for the methanol to evaporate, 10 mL of 0.01 M CaCl2was added daily and the leachates were collected during 30 days. The leachates were analyzed by HPLC, as previously described. At the end of the leaching study, soils were taken out of the columns with N2and sectioned into 5 cm increments corresponding to different depths, and the herbicides were extracted with methanol. The extracts were analyzed by HPLC. RESULTS AND DISCUSSION Sorption-Desorption Studies. Diuron sorption-desorption isotherm coefficients in the original and amended SS and SC soils are given in Table 1. In laboratory-amended sandy soil (SS+A), the addition of alperujo amendment increased OM by a factor of 8 and diuron sorption Kfvalue by a factor of 4. In laboratory-amended silty clay soil (SC+A), there was a similar increase (2×) in both OM and Kf. Composted alperujo has much lower organic matter and DOC contents (49.2%, 3 g kg-1, respectively) than alperujo (93.2%, 25 g kg-1, respectively), although this OM has a higher HIX (13) than alperujo (HIX ) 3). This results in lower sorption coefficient for SC+CA than for SC+A. In field-amended silty clay (SC+FA), sorption of diuron was similar to that in unamended soil SC, despite a 50% increase in OM. These data show that both source and amount of OM can affect diuron sorption (27,28), as also indicated by the variability in Koc values (Table 1). Alperujo amendments had a similar, but more pronounced, effect on terbuthylazine. Kfincreased by a factor of 13 in laboratory-amended SS soil as compared with the 8-fold increase in OM. In laboratory-amended silty clay soil (SC+A), there was a 5-fold increase in Kfas opposed to the 2×increase in OM. Similarly to diuron, composted alperujo (SC+CA) rendered lower sorption coefficients, and in field-amended siltt clay (SC+FA) sorption of terbuthylazine was similar to that in unamended soil SC, despite a 50% increase in OM. In contrast to diuron, Koc values for terbuthylazine increased in every laboratory soil upon amendment (Table 1). For both herbicides, higher hysteresis coefficients (higher reversibility) were observed in SC than in SS soil, which is not in accordance with SC higher sorption capacity (Table 1). For SS soil, amendment with alperujo slightly increased diuron hysteresis coefficientes, whereas these coefficients greatly decreased in the case of terbuthylazine, which indicates a very high increase in irreversibility upon amendment. This can be attributed in part to the higher affinity of terbuthylazine for organic matter in SS+A soil than in unamended SS soil: Koc for terbuthylazine increased upon amendment by a factor of 1.7, whereas Koc for diuron decreased upon amendment by a factor of 2. In the case of laboratory-amended SC soil, hysteresis coefficients decreased upon amendment for both herbicides, suggesting lower reversibility, whereas in the field-amended soil hysteresis coefficients slightly increased. One interesting difference between the sorption behavior of diuron and that of terbuthylazine in organically amended soils is the lower hysteresis coefficient for diuron in the soil amended with composted alperujo SC+CA of lower sorption capacity than in SC+A. In the case of terbuthylazine we find the contrary, higher irreversibility in SC+A of higher sorption capacity (Table 1). The higher DOC content of alperujo together with the more polar character of the herbicide diuron when compared to terbuthylazine (higher water solubility and lower Kow than terbuthylazine) could account for this. The greater affinity of diuron for the high amount of DOC present in alperujo would give rise to a higher reversibility of diuron sorption on SC+A soil than on SC+CA soil, in which the amount of DOC is lower and also less polar, as indicated by its higher HIX. Previous results seem to corroborate this hypothesis, because we have found that diuron is able to form stable complexes with DOC from organic amendments (28). Degradation Studies. Incubation Studies in the Dark. The increase in organic matter content upon amendment has been shown to promote biodegradation by enhancing microbial populations and activities (29-32). However, we do not observe this effect with alperujo and the herbicides studied. In the case Table 1. Diuron and Terbuthylazine Sorption − Desorption Coefficients and Half-Lives ( t 1 / 2 ) in Dissipation Studies soil pH/%OM K f (mg 1 - 1 / n f kg - 1 mL 1 / n f ) K oc 1/ n f R 2 SORP R 2 DESORP H (%) t 1 / 2 (days) R 2 ( t 1 / 2 ) diuron SS 8.4/0.63 2.50 (2.37 − 2.65) a 685 (649 − 726) 0.79 ± 0.02 b 1.00 0.97 62.2 24.0 (22.4 − 25.7) a 0.98 SS + A 6.8/4.80 10.0 (9.7 − 10.3) 360 (348 − 371) 0.87 ± 0.02 1.00 1.00 68.4 342 (125 − 463) 0.08 SC 8.2/1.84 4.31 (4.01 − 4.62) 404 (376 − 433) 0.84 ± 0.03 1.00 1.00 60.7 103 (81.6 − 141) 0.79 SC + A 7.9/4.27 10.3 (9.6 − 11.1) 415 (386 − 447) 0.96 ± 0.05 0.99 0.98 54.4 150 (96.4 − 333) 0.52 SC + CA 7.9/4.51 7.74 (7.21 − 8.31) 296 (276 − 318) 0.97 ± 0.04 0.99 0.98 32.7 155 (112 − 252) 0.63 SC + FA 8.5/2.82 3.69 (3.52 − 3.87) 226 (215 − 237) 0.88 ± 0.02 0.99 1.00 67.5 61.9 (56.84 − 67.90) 0.97 terbuthylazine SS 8.4/0.63 1.29 (1.07 − 1.57) 353 (293 − 430) 0.95 ± 0.07 0.98 0.96 28.1 110 (103 − 108) 0.98 SS + A 6.8/4.80 17.0 (16.3 − 17.8) 611 (585 − 639) 0.96 ± 0.04 1.00 0.60 1.67 87.1 (79.0 − 97.4) 0.96 SC 8.2/1.84 2.60 (2.29 − 2.89) 244 (215 − 271) 0.96 ± 0.05 0.99 1.00 60.5 34.3 (30.7 − 38.8) 0.95 SC + A 7.9/4.27 12.0 (11.3 − 12.8) 485 (456 − 518) 1.15 ± 0.06 1.00 0.69 17.9 109 (93.5 − 132) 0.92 SC + CA 7.9/4.51 8.70 (7.65 − 9.89) 333 (292 − 378) 1.05 ± 0.09 0.98 0.96 56.9 88.4 (76.1 − 108) 0.89 SC + FA 8.5/2.82 2.50 (2.35 − 2.78) 153 (144 − 170) 0.98 ± 0.04 1.00 1.00 64.5 50.8 (48.2 − 53.7) 1.00 a Numbers in parentheses are standard errors about the mean K f or t 1 / 2 . b Numbers are mean 1/ n f ± standard deviation. 4830 J. Agric. Food Chem., Vol. 55, No. 12, 2007 Cabrera et al. of diuron (Figure 1), the shortest half-life was observed in unamended sandy soil SS (Table 1), which had low sorption capacity. When SS was amended with alperujo, diuron concentration remained unaffected after a 30 day incubation period (Figure 1;Table 1). This can be attributed to the very high increase in diuron sorption upon amendment in this soil (Table 1), because sorption protects herbicides from biodegradation (33-35). Little difference was observed between original soil SC and soils amended in the laboratory (SC+A and SC+CA), despite the increase in sorption. However, it should be noted that this increase in sorption upon amendment was much lower than that in sandy soil (Table 1). In the soil amended in the field (SC+FA), the diuron half-life was much lower than in the original soil SC, despite the similar sorption behavior observed, indicating that sorption was not the only process affecting degradation. Previous cropping history seems to be playing an important role in the rapid dissipation of diuron in SC+FA soil, because this soil had been treated in the field with diuron in the past 5 years, whereas soils amended in the laboratory (SC+A and SC+CA) were not treated with diuron during this period. This agrees with data reported by Piutti et al. (36), who found that degradation rates of diuron, isoproturon, and pendimethalin were not affected after the first cropping cycle, but were significantly increased in planted soils after five cropping cycles. A completely different behavior was observed with terbuthylazine (Figure 1;Table 1). Dissipation was very slow in the sandy soil, with a much longer half-life than that observed for diuron, despite the lower persistence reported for terbuthylazine than for diuron (22,37). Small but significant differences were observed between SS and SS+A, despite the great increase in Figure 1. Dissipation of diuron and terbuthylazine in unamended and amended SS and SC soils in the dark. Figure 2. Diuron photodegradation in solution and in unamended and amended SS soils (error bars are smaller than symbols). Figure 3. Cumulative leaching of diuron and terbuthylazine in SS soil. Fate of Diuron and Terbuthylazine in Amended Soils J. Agric. Food Chem., Vol. 55, No. 12, 2007 4831 terbuthylazine sorption in sandy soil upon amendment with alperujo (Table 1). In the case of the silty clay soil SC, the total amount of terbuthylazine dissipated was in every case lower in amended soils than in the original ones (Figure 1), especially in the case of soils amended in the laboratory, SC+A and SC+CA, of higher organic matter content and sorption coefficients (Table 1). We did not find the rapid dissipation in the soil amended in the field (SC+FA) as was observed in the case of diuron, which can be attributed again to the cropping history of the soil, because terbuthylazine was not applied in the past 5 years. Diuron mineralization in SC soil after 6 weeks of incubation was low (0.54 (0.04% of applied) and slightly lower in SC+A (0.43 (0.03% of applied). The effect of alperujo in terbuthylazine mineralization was greater than that in diuron. Terbuthylazine mineralization in unamended SC soil was 0.9 (0.16% of applied, and when soil was amended with alperujo, the amount of terbuthylazine mineralized decreased to 0.27 (0.2% of applied. These results do not agree with those reported by Gan et al. (32) and Wanner (38), who found increases in pesticide mineralization in amended soils due to an increase in soil microbial activity. However, similar results were obtained in ref 5with terbuthylazine in a soil amended with urban sewage sludge and in ref 7with simazine and a soil amended with alperujo. The latter attributed this lower mineralization in amended soils to a possible toxic effect of alperujo on soil microbial population. Alternatively, soil microorganisms in soils amended with alperujo may have preferentially used the organic matter of alperujo as a carbon and energy source instead of diuron or terbuthylazine and at the same time degraded the herbicides through co-metabolic reactions that do not cause CO2 release (7). Photolysis Studies. Photolysis can be a significant abiotic degradation process affecting pesticides and other organic contaminants in water, soils, and plants. No changes in terbuthylazine solution concentration (20 μM) were observed after 48 h of irradiation. Diuron photodegradation in aqueous solution (20 μm) and photodegradation of diuron in SS and SS+A soils are shown in Figure 2. Diuron concentration in the dark control (under the same conditions except for the light) did not significantly decrease (data not shown). Under the conditions studied, diuron half-life in aqueous solution was 18.8 h. The half-life increased to 33.1 h in the sandy soil SS, and the increase is attributed to absorption of light by soil components and screening or light attenuation effect of the soil particles (39). When the soil was amended with alperujo, there was no photolysis. We did not observe a photosensitizing effect of the increase in organic matter, as reported for other pesticides in the presence of organic matter (26,40). This can be attributed not only to the higher adsorption of diuron in SS+A soil when compared with that in unamended SC (Table 1) but also to the dark color of SS+A, which would have a light-filtering effect, protecting diuron molecules from photodegradation. Leaching Studies. Diuron was detected in leachates from SS soil (Figure 3) and was not detected in leachates from SS+A or any of the leachates of unamended or amended SC soil during the 30 day study, which can be attributed to the higher sorption in these soils (Table 1). The amounts of diuron extracted and leached from the soil columns are given in Table 2. The total amount recovered in SS soil columns (leached +extracted) is much lower than that recovered in soil extraction of the SS+A column, which can be attributed to the higher persistence and higher sorption of diuron in SS+A than in SS (Table 1). In the case of SC soils, the higher recoveries correspond to SC+A and SC+CA soil columns, also of higher persistence and higher sorption but lower reversibility than unamended SC soil, especially in the case of SC+CA (Table 1). In the case of SC+FA, the amounts recovered are similar to that recovered from unamended soil SC, which do not agree with the lower t1/2 observed in dissipation studies (Table 1), suggesting that sorption prevails over dissipation, because both soils (SC and SC+FA) have similar sorption-desorption behaviors. High amounts of terbuthylazine (nearly 60% of the applied herbicide) were recovered in leachates from SS soil (Figure 3), of very low sorption capacity, whereas no terbuthylazine Table 2. Percentage of Diuron and Terbuthylazine Leached and Extracted from the Soil Columns after the Leaching Study soil SS SS + ASCSC + ASC + CA SC + FA diuron leached 13.92 ± 2.93 a 00000 extracted 0 − 5 cm 20.05 ± 1.33 0.59 ± 0.14 5.43 ± 0.71 38.11 ± 0.09 19.35 ± 2.99 19.07 ± 1.25 extracted 5 − 10 cm 15.17 ± 2.01 10.47 ± 1.63 6.10 ± 0.65 10.21 ± 4.98 17.64 ± 0.81 39.78 ± 2.47 extracted 10 − 15 cm 9.95 ± 1.32 42.41 ± 9.15 6.49 ± 2.02 0.85 ± 0.44 1.95 ± 0.29 15.93 ± 0.60 extracted 15 − 20 cm 4.30 ± 0.10 32.21 ± 10.2 2.85 ± 1.94 0.81 ± 0.38 0.46 ± 0.07 0.60 ± 0.12 total recovery b 63.39 ± 4.85 85.68 ± 21.1 20.86 ± 3.90 49.98 ± 4.95 39.39 ± 4.16 75.38 ± 4.20 terbuthylazine leached 58.38 ± 0.76 0 1.68 ± 0.45 2.43 ± 0.65 1.50 ± 0.53 3.59 ± 0.27 extracted 0 − 5 cm 2.13 ± 0.27 47.07 ± 9.62 5.62 ± 0.77 75.66 ± 1.19 46.44 ± 0.01 9.65 ± 3.81 extracted 5 − 10 cm 3.01 ± 0.27 19.40 ± 0.10 18.18 ± 2.47 9.70 ± 1.57 36.20 ± 3.01 19.29 ± 1.68 extracted 10 − 15 cm 3.97 ± 0.02 3.71 ± 0.56 21.39 ± 2.47 5.21 ± 1.56 5.49 ± 0.07 22.23 ± 1.99 extracted 15 − 20 cm 6.70 ± 0.18 1.55 ± 1.55 8.72 ± 0.16 5.26 ± 0.39 3.59 ± 0.37 6.26 ± 2.70 total recovery b 74.19 ± 1.5 71.73 ± 8.53 55.60 ± 6.33 98.27 ± 5.36 93.21 ± 3.99 61.02 ± 2.84 a Numbers are mean value ± standard deviation ( n ) 2). b Total recovery ) leached + extracted. Figure 4. Cumulative leaching of terbuthylazine in unamended and amended SC soils. 4832 J. Agric. Food Chem., Vol. 55, No. 12, 2007 Cabrera et al. OC in MN-U), as has been widely reported by many authors (29–32). Delgado-Moreno et al. (22) also observed an increase in Kfvalues for four triazine herbicides, including terbuthylazine, in soil freshly amended with olive-mill waste as compared to unamended soil. However, if the soil was preincubated with the organic amendment for 1–3 months, there was no difference in sorption for amended and unamended soils (22). Aging, or residence time, of the herbicides in soil, caused an increase, with time, in the apparent Kdand Koc values for terbuthylazine in both unamended and amended SP soils. In SP-U, the Kdincreased by a factor of 2.8 after 4 wk of incubation and by a factor of 2.1 in the SP-A soil during the same period of time (Table 1). Atrazine Kdand Koc values also increased with aging time in the unamended SP-U soil by a factor of 3.0, and by a factor of 6.5 for the MN-U soil. However, in the amended soils (SP-A and MN-A), the atrazine Kdand Koc values did not change significantly during the incubation period. Similar results were reported by Johannesen and Aamand (33) who calculated Kdin aged soils from the pore-water content of 14 C and found an increase in sorption of atrazine and terbuthylazine in unamended soil with aging time. Similar increases in sorption with incubation time have also been observed for a variety of classes of herbicides, including the sulfonylaminocarbonyltriazolinone herbicides (34). In contrast, Menasseri et al. (35) did not observe an increase in sorption of dicamba in either amended or unamended soil with increased aging time. Sorption is one of the main processes that affects the fate of pesticides in soil and water (36), and sorption-desorption interactions of pesticides with soil determine the availability of these organic compounds for plant uptake, transport, and microbial degradation in soil (37). Equilibrium sorption estimates (Kdand Koc values) can be used to predict the mobility of pesticides in soil (38, 39). Transport models typically use Kdor Koc values to describe pesticide retention by soil (40). The accuracy of the sorption estimates can be more important than the choice of transport model in correctly simulating pesticide leaching (40), emphasizing the need for evaluating pesticide sorption in aged soils. Aging effects on sorption can also impact mobility classifications of pesticides. For instance, mobility classification based on a unitless retardation factor (RF) (41), which in turn is a function of Kd, would change from moderately mobile to moderately immobile for terbuthylazine and atrazine in the unamended soils. In contrast, aging would not have an effect on amended MN soil. Pseudomonas sp. strain ADP, a triazine mineralizing bacterium (24), has previously been used to determine the bioavailability of selected triazines in soil (42, 43). In freshly treated soil, atrazine and terbuthylazine mineralization by Pseudomonas sp. strain ADP has been shown to be inversely related to soil sorption (i.e., less mineralization was seen with increased sorption) (42). Atrazine bioavailability has been reported to decrease in aged soil, as evidenced by decreased mineralization of atrazine by Pseudomonas ADP in soils aged for different lengths of time soil prior to inoculation with Pseudomonas ADP (43). In the same study with a subsurface soil, atrazine mineralization was significantly reduced when the aging time exceeded 1 d, whereas no differences were observed between mineralization rates of samples aged 7–30 d. In a similar study done using a surface soil, atrazine mineralization decreased as a function of increased aging time; however, no effect of aging on atrazine mineralization was observed for an aquifer sediment (33). In the above-mentioned studies on aging effects on atrazine mineralization, however, there were no independent measurements of the amounts of atrazine present in the aged soils. Since Pseudomonas sp. strain ADP has been shown to be able to mineralize, within hours, the same amount of atrazine and simazine in aged soils that was extractable from the same aged soils using aqueous methanol (25, 44), it may be possible that the reported decrease in mineralization of 14 C- atrazine by Pseudomonas ADP (33, 42, 43) was due to decreased amounts of atrazine present with aging, as opposed to decreased availability of the aged residues to the degrading microorganism. Although there are studies on bioavailability of pesticides in soils of different organic matter content, we are aware of no research that has used a specific degrading bacterium to study the effects of organic amendments, such as alperujo, on bioavailability of aged atrazine and terbuthyalzine residues. To examine the influence of organic amendments on bioavailability of aged pesticide residues in more detail, Pseudomonas sp. strain ADP was added to aged, alperujo-amended, and unamended soils, and 14 C mineralization was followed over time. In unamended SP soil (SP-U), the amount of 14 C- terbuthylazine mineralized by Pseudomonas ADP increased from 6% to 11% of applied chemical at the end of a 28 d incubation period (Table 2). Even though Pseudomonas sp. strain ADP has been shown to be less efficient at mineralizing terbuthylazine as compared to atrazine (33, 42), the amount of 14 C-terbuthylazine mineralized by Pseudomonas sp. strain ADP was less than expected considering the amount of water extractable terbuthylazine (>70% of applied terbuthylazine) (Figure 2a). In the case of 14 C-atrazine, the total amount of herbicide mineralized by the bacterium was also lower than expected at time 0, particularly because >90% of the atrazine was aqueous extractable. Increasing the inoculation density of Pseudomonas sp. strain ADP in the SP-U soil from 1 ×10 8 to 2×10 8 organisms g -1 nearly doubled the amount of atrazine mineralized at time 0, from 5% to 8% of applied. The average amount of atrazine mineralized in unamended MN soil (MN- U) by the lower density inoculum during the 17 d incubation period (23% of applied) was slightly higher than when MN-U Table 1. Kdand Koc Values Calculated for Unamended (U) and Amended (A) Spanish (SP) and Minnesota (MN) Soils after Different Aging Times incubation time (d) Kd(mL g -1 )Koc (mL g -1 ) triazine soil 0 7 14 28 a 071428 a terbuthylazine SP-U 1.0 (0.0 1.4 (0.3 2.0 (0.6 2.8 (0.8 278 (7 389 (72 556 (157 778 (216 SP-A 10.7 (0.9 12.1 (2.0 10.0 (1.2 22.2 (0.5 385 (32 435 (71 360 (43 799 (17 atrazine SP-U 0.3 (0.0 0.6 (0.0 0.9 (0.1 83 (8 167 (0 250 (16 SP-A 3.9 (0.7 2.6 (0.3 3.6 (0.2 140 (25 94 (11 129 (6 MN-U 1.7 (0.3 7.9 (0.2 10.7 (1.4 113 (18 527 (11 713 (93 MN-A 11.6 (1.1 11.7 (0.6 8.8 (1.5 265 (26 266 (14 201 (35 a Atrazine incubation was 25 d. 4116 J. Agric. Food Chem., Vol. 56, No. 11, 2008 Cabrera et al. soil was inoculated with twice as many microorganisms and incubated for 26 d (15% of applied). The amount of atrazine mineralized in SP-U at time 0 was also low in comparison with other studies of atrazine and simazine mineralization by Pseudomonas sp. strain ADP, but increased to comparable levels as has been previously reported by the end of the incubation period (25, 33, 43, 44). An increase in atrazine mineralization was observed in MN-U soil with incubation. Jacobsen et al. (42) also observed less mineralization of terbuthylazine as compared to atrazine; in both cases, the amount of herbicide mineralized by the bacteria increased at the end of the aging period. The amount of labeled herbicide mineralized by Pseudomonas sp. strain ADP in alperujo-amended soils was much less than that seen in the unamended soils, <1% of applied at every aging time, except for atrazine in SP-A soil after 10 or 26 d incubation. These results indicate that olive mill waste used as organic amendment reduces either bioavailability or degradation of terbuthylazine and atrazine in soil. Masaphy and Mandelbaum (26) reported a significant decrease in atrazine mineralization rates in soils irrigated with treated wastewater as compared to the soils not irrigated. They attributed this decrease in mineralization to a combination of factors, the increase in sorption and complexation of atrazine with the OM in the soil with aging, and the increase in N of soil by the wastewater irrigation. The low rate of triazine mineralization by Pseudomonas sp. strain ADP in these studies may be due to the microorganism’s use of inorganic sources of N preferentially over herbicide-derived N, thereby reducing triazine degradation. Laboratory studies have previously shown that inorganic nitrogen inhibits the ability of Pseudomonas ADP to degrade atrazine (45). It is possible that once the inorganic sources of N were depleted by microbial activity during the incubation in the unamended soils, particularly in SP soil, the Pseudomonas sp. strain ADP then used the triazines as a N source. It is suggested that in amended soil, alternate sources of N (alperujo C:N ratio was relatively high, 18.3) were not depleted during the incubation, resulting in very little triazine mineralization (<1% of applied triazine). However, the reported relationship between available N and atrazine mineralization is contradictory. Shapir et al. (46) found that atrazine mineralization activity of Pseudomonas sp. strain ADP was not negatively influenced by the addition of wastewater and sludge as amendments. It appears that bioavailability of triazines in aged soil is a complex process that may be difficult to characterize. While Barriuso et al. (25) reported a correlation between the amounts of 14 C-residues in water and organic extracts and bioavailable residues, and proposed that this may help to determine the bioavailability of other triazines, we could not use this correlation in our studies due to the low mineralization of herbicide by Pseudomonas sp. strain ADP in comparison with the amounts of extractable 14 C. Jacobsen et al. (42), using a two compartment model on terbuthylazine mineralization and sorption data, suggested that terbuthylazine mineralization in soil inoculated with Pseudomonas sp. strain ADP was initially controlled by the rate of mineralization by Pseudomonas sp. strain ADP, followed by the sorption of terbuthylazine. They further suggested that in soils with high biodegrading potential, sorption was the limiting parameter for terbuthylazine mineralization, whereas in soils with low biodegrading potential, the limiting parameter was the number of degrading microorganisms. However, the present research indicates that the N status of the soil may be equally of importance. More work is needed on the relationship between the availability of inorganic N in soil and triazine mineralization by Pseudomonas sp. strain ADP. In conclusion, addition of alperujo, a solid olive-mill waste, as an organic amendment to sandy soils from Spain and Minnesota resulted in reduced availability of two triazine herbicides, terbuthylazine and atrazine, as compared to unamended soils. In the Spanish soil, terbuthylazine sorption increased with aging in both amended and unamended soils. Aging/amendment interactions appear to be triazine dependent, and atrazine sorption increased with aging in both unamended Spanish and Minnesota soils. Although atrazine sorption was greater in alperujo-amended soils, as compared to unamended soils, aging had no effect on atrazine sorption in amended soils. Addition of alperujo decreased mineralization of both herbicides by Pseudomonas sp. strain ADP as compared to unamended soils. The mineralization of the herbicides in unamended soil increased with aging, possibly because of decreased readily available inorganic N in the soils during incubation. ACKNOWLEDGMENT We thank Andrea Bolks for her help with the sample oxidation and Brian Barber for his technical assistance. LITERATURE CITED (1) Leistra, M.; Boesten, J. J. T. I. Pesticide contamination of groundwater in Western-Europe. Agric. Ecosyst. EnViron. 1989, 26, 369–389. (2) Kolpin, D. W.; Barbash, J. E.; Gilliom, R. J. Occurrence of pesticides in shallow groundwater of the United States: Initial results from the National Water-Quality Assessment Program. EnViron. Sci. Technol. 1998,32, 558–566. Table 2. 14 C Herbicide Mineralized by Pseudomonas sp. Strain ADP in Unamended (U) and Amended (A) Spanish (SP) and Minnesota (MN) Soils during a 28 day Incubation herbicide mineralized during incubation (% of applied) triazine soil inoculum density (organisms g -1 )T)0d T)7-10 d a T)14-17 d b T)26-28 d c terbuthylazine SP-U 1 ×10 8 5.7 (1.6 <1 5.9 (0.5 11.1 (3.1 SP-A 1 ×10 8 <1 <1 1.0 (0.5 <1 atrazine SP-U 1 ×10 8 5.3 (1.4 34.4 (11.2 SP-U 2 ×10 8 8.2 (1.6 12.0 (2.5 30.8 (11.3 SP-A 1 ×10 8 <1 1.7 (0.9 SP-A 2 ×10 8 <1 3.5(1.4 25.2 (9.8 MN-U 1 ×10 8 13.3 (0.3 29.0 (12.6 23.1 (2.6 MN-U 2 ×10 8 18.3 (5.1 19.0 (11.8 15.4 (5.0 MN-A 1 ×10 8 <1 <1 <1 MN-A 2 ×10 8 <1 <1 <1 a T)7 d terbuthylazine SP, T)10 d atrazine SP, T)9 d atrazine MN. b T)14 d terbuthylazine, T)17 d atrazine. c T)28 d terbuthyalzine, T)26 d atrazine. Availability of Triazine Herbicides in Aged Soils J. Agric. Food Chem., Vol. 56, No. 11, 2008 4117 (3) Barbash, J. E.; Thelin, G. P.; Kolpin, D. W.; Gilliom, R. J. Major herbicides in ground water. 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Accepted March 19, 2008. We thank the MEC of Spain for a predoctoral FPI fellowship (for A.C.). JF800095T Availability of Triazine Herbicides in Aged Soils J. Agric. Food Chem., Vol. 56, No. 11, 2008 4119 Joumal 01 Environmenta/ Sciellce and /fea/eh Pare B (2008) 43, 713-716 Copyright 1" Taylor & Francis Group, LLC ISSN: 0360-1234 (Priot); 1532-4109 (Onlinc) DO!: 10_1080103601230802388835 o Taylor & Francis ~TaYIOr&FranCi1GrOup Terbuthylazine persistence in an organic amended soil ALEGRÍA CABRERA, LUCÍA COX, PILAR VELARDE and JUAN CORNEJO Instituto de Recursos Naturales y Agrqbiología de Sevilla, Sevilla, Spain The aim of this work was to study the efTect of the application of a so lid waste from olive oil production (alperujo) on the movement and persistence of the herbicide terbuthylazine (N2-tert-butyl-6-chloro-N4-ethyl-I,3,5-triazine-2,4-diamine). An experimental olive grove was divided in two plots: (i) Plot without organic amendment (blank) and (ii) Plot treated with alperujo during 3 years at a rate o[ 17920 kg o[ alperujo ha -l. Terbuthylazine was applied to both plots at arate of 2 kg ha -1 a.i. Triplicates from each plot were sampled at 3 depths (0-10, 10-20 and 20-30 cm), air-dried, remains of olive leaves, grass roots, and stones removed and sieved through a 5 mm mesh sicve. Terbuthylazine was extracted with methanol 1:2 weight:volume ratio, the extracts were evaporated to dryness, resuspended in 2 mL of methanol, filtered and anylized by high performance liquid chromatography (HPLC). Higher amounts o[ terbuthylazine were detected at each sampling depth in plots treated with alperujo. The increase in soil organic matter content upon amendment with alpcrujo slightly increased sorption, suggesting that other factors beside sorption alTect terbuthylazine degradation rate in organic amended soils. Keywords: Olive oil production waste: terbuthylazine; soil; dissipationl; field study. Introduction Olive is one of the most important crops in the Mediterranean region, where 97% of the world olive oil is produced.[ll The two-phase centrifugation process, introduced in the early 1990s for olive oil extraction, extracts more oil from the olives, consumes les s water and energy as compared to other processes, and does not produce olive mili wastewater,l21 The two-phase process for olive oil extraction produces a solid waste called alperujo, which is rich in organic matter and lignin.[3-4] Soil amendment with alperujo increases soil organic matter affecting soil physico-chemical and biological environments and, consequently, affecting immobilization and degradation of herbicidesY] Tbe increase in soil organic matter can increase sorption potential and reduce pesticide contamination of ground water.[6-7] Under controlled laboratory conditions, an increase in sorption and a decrease in leaching of simazine was observed in soils amended with alperujoJ4,8-9] Albarrán et al.l9] also found that in soils enriched with alperujo, biodegradation of simazine is reduced, which has been attributed in part to microbial preference to use the exogenous organic matter rather than Address correspondence to Dr. Lucía Cox, Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla, CSIC, PO. Box 1052,41080 Sevilla, Spain; E-mail: [email protected]. Received: February 15,2008. herbicide. These results suggest that in sorne cases herbicide persistence can be increased upon organic amendment, and consequently the risk of soil and associated water resources contamination can be increased. The aim of the present study was to investigate the effect that soil amendment with alperujo has on immobilization and mobility of the herbicide terbuthylazine, and for this purpose a field experiment was performed. Terbuthylazine is a chloro-S-triazine herbicide used for pre-emergence and post-emergence weed control.[I0] Triazines are weak bases with low water solubility. The main degradation process is microbial[111, although it is slowly degraded when environmental conditions are unfavorable, being persistent in soil and aquifer sedimentJ I213 1 The main terbuthylazine metabolites, formed by dealkylation and hydroxylation, and the parent compound have been detected in groundwater, and are considered as poten ti al pollutants for aquifer contamination.l 14 ] Materials and rnetbods Herhicide, soil alld orgallic waste Terbuthylazine (N2-tert-butyl-6-chloro-N4 -ethyl-l ,3,5- triazine-2,4-diamine) (99% purity), was purchased from Dr. Ehrenstorfer GmbH (Augsburg, Germany). It is a colorless powder with a water solubility of 8.5 mg L -1 at 20°C and log Kow of 3.21 .lIS] It is absorbed by roots and inhibits Hill reaction and CO 2 sorption in the chlorophyllic 714 Table 1. Physicochemical properties of organic residue alperujo (A) and soil, unamendcd (S) and amcnded with A (S + A). Residue/ soil Alpcrujo S S+A pH 5.81 8.2 8.5 Organic matter % e/N 93.2 18.3 1.84 16.5 2.82 10.6 function. The commercial formulation ANIBAL (28.5% terbuthylazine) was purchased from Aragonesas Agro (Madrid, Spain). Physicochemical properties of the solid residue from olive oil production industry, alperujo, are given in Table 1, together with properties of unamended soil (S) and amended soil (S+A). SOl'ptioll studies Duplicate samples (5 g) of unamended (S) and amended soil (S + A) (air dried) were treated with 10 mL of terbuthylazine solutions (initial concentrations, Ci, ranging from 5 to 50 fLM in 0.01 M CaCh). Previously, it was de termined that equilibrium was reached in les s than 24 h, and that no measurable degradation occurred during this period. Equilibrium concentrations (Ce) in the supernatants were determined by HPLC under the following conditions: Nova-Pack column, 150 mm length x 3.9 mm i.d.; column packing, C18; flow rate, 1 mL min- 1; eluent system 50:50 water-acetonitrile mixture and UV detection at 222 nm. Terbuthyalzine retention time was 4.3 mino Sorption isotherms were fitted to Freundlich equation (Cs = Kf x Cenf) and sorption coefficients Kf and nf were calculated. Field study Field experiment was carried out in a 50 ha olive grove 10- cated in an experimental farm at Mengibar (Jaen, Southern Spain). The climate of the area is typically Mediterranean. The olive trees (64 years old on 2008) were irrigated under drip irrigation from April 15 until October 15 (2006). The total amount of water received was 8,544 L per olive tree. Total rainfall was 492 mm in 2006. Two subplots composed of four olive trees (12 x 12 m plantation distance) were randomly selected from the 50 ha olive grove for the two different treatments: soil amended with alperujo and herbicide treatment (S + A) and unamended soil and terbuthylazine treatment (S). Alperujo was applied to S + A plots during three consecutive years at the rate of 17,920 kg ha-Ion the first days of April. After amendment, soil was tilled to a depth of 4 cm. Commercial herbicide formulation ANIBAL was applied with a standard spraying machine to S + A and S plots on October 5 (2005) at the rate of 7 L ha -1. At each subplot, three soil samples were taken with a spade at 0-10,10-20 and 20- 30 cm depth. Samples were extracted twice with methanol at Cabrera et al. Table 2. Terbuthylazine sorption cocfficients in unamended (S) and amended soils (S + A). Soil Kf Nf R2 s 2.60 (2.29-2.89) 0.96 ± 0.05 1.00 S+A 2.50 (2.35-2.78) 0.98 ± 0.04 1.00 1:2 soil/solution ratio (recoveries >90%for each herbicide). Extracts were mixed and rotary-vacuum evaporated almost to dryness at 40°C. The residue was dissolved in 2 mL of methanol and analyzed by HPLC as described aboye. Statistical allalysis Statistical analysis was carried out using Statistical Package for Social Sciences (SPSS) for Windows V. 14.0. Repeated measures analyses of variance (ANOVA) were used. All pairwise multiple comparisons were performed using the Duncan test. DifTerences between results were considered statistically significant at p < 0.05. Results and discussion SOIptioll studies Terbuthylazine sorption isotherms were performed and sorption coefficients after fitting sorption isotherms to Freundlich equation are given in Table 2. Terbuthylazine sorption has been reported to depend on organic matter.[16] However, in our study, we do not find significant difTerences in sorption of terbuthylazine between the unamended soil and the amended soil (Table 2), despite the increase in organic matter from 1.84 to 2.82 (Table 1). In a previous study we have shown alperujo has very high content in dissolved organic matter of very low humification index.[5] This dissol ved organic matter has been shown to be able to interact with soil components[17] which can decrease terbuthylazine sorption. Field studies The total amounts of terbuthylazine recovered from unamended soil (S) and soil treated with alperujo (S + A) plots are given in Table 3 and in Figure 1. Very low mobility of terbuthylazine in depth is observed in both soils, since greater amounts ofterbuthylazine are found within the first 10 cm ofthe soil profile even after lOO days ofherbicide application. Except for the first sampling date (7 days), there are significant difTerences between treatments in the total amounts of terbuthylazine recovered. Higher amounts of herbicide were detected in S + A plots when compared to S plots. The small increase in sorption upon amendment (Tab1e 2) suggests that sorption is not the main factor affecting terbuthylazine distribution in the soil. Differences Terbuthylazine in soil Table 3. Amounts of terbuthylazine (/Lg g-l soil) recovered from unamended soil (S) and amended soil (S + A) at differenl sampling dates. Va1ues wilh diffcrenllctters at each sampling dale and each soil deplh are significant1y differenl. (Duncan lest, p < 0.05). Days after Soil depth (cm) Herbicide treatment Soil 0-10 10-20 20-30 S 0.225<1 0.104a 0.13¡';" S+A 0.280" 0.129" 0.104" 14 S O.I27 b 0.077b 0.OS9 ajb S+A 0.361" 0.144a 0.080" 21 S 0.188 ajh 0.069b o.osi' S+A 0.226" 0.136" 0.113" 49 S 0.121 b 0.088b 0.OS3 b S+A 0.202" 0.087b 0.101" 70 S 0.076b 0.036b 0.033b S+A 0.IS9a 0.063" 0.077<1 117 S 0.070" O.OlSb 0.020b S+A 0.079a 0.040<1 0.O6l" in degradation rates should explain this. In fact, in previous laboratory dissípation studies, hígher half !ife for terbuthylazine was found in a sandy soil treated with alperujo when compared to unamended soilJ51 Also, in the case of the Q! c: 04000- .~ 03000- :;, .<: '5 .o :;; 02000- 1- g' 01000- 00000- s S+A Sampling days 14 21 49 Sampling days 70 I ~ep.~(g.~) 1 I üj' 1().20 I ~~J ~mrfll I~[§ 117 Fig. 1. AmoUnls Oflerbulhylazine (fLg g-I) recovered al each sampling day al 0--10, 10-20 and 20-·30 cm deplh in unamended soil (S) and alpcrnjo-amendcd soil (S + A) plols. 715 herbicide simazine and a soil amended with alperujo, Albarrán et al.[9) found lower mineralization of this herbicide in amended soils, which was attributed to a possib1e toxic effect of alperujo on soil microbial population. Conclusions Addition of organic amendments to soil is becoming a co)nmon practice in agriculture. Numerous previous studies with different types of organic amendments, urban sewage sludge, urban waste compost, manure etc., have shown an increase in pesticide sorption, reducing the amount of pesticide available fol' leaching to groundwater and for run off to surface waters. However, in our study, soil addition of organic wastes fr0111 olive oil production industry (alperujo) does not modify the sorption capacity of soil for terbuthylazine. Field dissipation study has shown an increase in terbuthylazine persístence in the amended soil with alperujo, suggesting that other factors, such as different degradation rates upon amendment, are involved. Further experiments to confirm this should be carried out. Acknowledgments This work has been partially financed by Project AGL 2007- 65771 from the Spanish MEe and Research Group RNM 124 of Juntade Andalucia. Alegría Cabrera thanks [he Ministerio de Educacion y Ciencia for her FPI fellowship. References [1] Borja, R.: Rincón, B.; Raposo, F. 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Due to its anionic form at natural soil pH, there is high risk of leaching and groundwater contamination by the use of this herbicide. The aim of this work was to study the effects of organoclay-based formulations of MCPA and olive oil waste amendment on MCPA leaching in a sandy loam soil. For this purpose, batch adsorption and column leaching studies were performed. The organoclays used to prepare the clay-based formulations of MCPA were obtained by treating Wyoming montmorillonite (SWy-2) and Arizona montmorillonite (SAz-1) with an amount of hexadecyltrimethylammonium (HDTMA) cation equal to 100% of the CEC of the montmorillonites. The organic residue used in this study was a solid waste from olive oil production (olive oil waste, OOW). The soil was amended with the organic residue at the rate of 10% (w/w). Batch release and column leaching studies indicated that organoclay-based formulations of MCPA reduced the release rate and the leaching of the herbicide as compared to the use of a conventional formulation containing the herbicide in an immediately available form. The increase in soil organic matter of the soil upon amendment with the organic residue also resulted in greater adsorption and reduced leaching of MCPA in the soil. Accordingly, both the use of organoclaybased formulations and the amendment of soil with OOW are proposed as efficient strategies to reduce extensive leaching losses associated with the application of MCPA in high-risk scenarios, such as Mediterranean olive groves. Keywords: Herbicide leaching; MCPA; Olive oil waste; Organoclays; Soil; Received: July 17, 2008; revised: September 10, 2008; accepted: October 1, 2008 DOI: 10.1002/clen.200800159 1 Introduction Surface and groundwater contamination by herbicides used in olive groves in Spain and other Mediterranean countries has become a serious issue, and has led authorities to prohibit or restrict the application of widely used active ingredients, e.g., simazine, diuron, terbuthylazine, or MCPA [1]. In olive groves, conditions that favor offsite movement of the applied herbicides predominate. Soil texture, pronounced slopes, and climatic conditions favor losses of herbicide by leaching and runoff processes. To compensate for such losses, herbicides need to be applied in concentrations greatly exceeding those strictly required for weed control, and the excessive quantities added increase the risk of surface and groundwater pollution. In this context, there is a need to develop strategies directed to preventing water pollution by herbicides applied to olive groves, particularly in high-risk scenarios such as Mediterranean areas [2]. The use of slow release formulations has been demonstrated to be an efficient strategy to reduce the environmental impact of soilapplied pesticides. Beneficial effects related to the use of slow release formulations include reduced mobility of the active ingredient, reduction in the amount of chemical required for pest control, savings in manpower and energy from the reduction of the number of applications required in comparison to conventional formulations, increased safety for the pesticide applicator, and a general decrease in non-target effects [3]. Organoclays, i.e., natural clay minerals with their original inorganic exchange cations replaced with organic cations, have been shown to be very good adsorbents for different classes of pesticides, and therefore, have been proposed as carriers for the design of slow release formulations of pesticides [4–7]. Soils of low organic carbon content have a low capacity for retarding pesticide mobility [8], since soil organic matter is the primary adsorbent for pesticides and adsorption is one of the main processes reducing the level of pesticide leaching in soil [9]. Organic amendments can be used to modify the surfaces of soils and subsurface Correspondence: Prof. J. Cornejo, Instituto de Recursos Naturales y Agrobiologa de Sevilla (IRNAS), CSIC, Avenida Reina Mercedes 10, Apartado 1052, 41080 Sevilla, Spain. E-mail: [email protected] Abbreviations: HDTMA, Hexadecyltrimethylammonium; MCPA,4- chloro-2-methylphenoxyacetic acid; OOW, Olive oil waste; SA-HDTMA, HDTMA-treated Arizona montmorillonite; SW-HDTMA, HDTMA-treated Wyoming montmorillonite i2008 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.clean-journal.com 990 Clean 2008, 36 (12), 990 – 995 Clean 2008, 36 (12), 990 – 995 Organoclays and Organic Amendment to Reduce MCPA Leaching in Soil 991 materials, promoting adsorption and reducing groundwater contamination by pesticides [10, 11]. Furthermore, the addition of organic amendments modifies soil chemical and biological conditions, which can affect degradation and, in some cases, accelerate this process [11–13], reducing the total amount of chemical potentially available for leaching. The new technologies for olive-oil extraction generate a solid residue rich in organic matter. This olive oil waste (OOW) is generated in great amounts in Spain (4,000,000 Mg/year), and represents a major environmental problem. Soil incorporation of OOW has been shown to increase fertility and control erosion [14, 15], but also to reduce pesticide leaching [16]. In this work, batch and column leaching experiments were designed to assess and compare the ability of organoclay-based formulations and the application of OOW to soil to reduce the leaching of the herbicide MCPA in a Mediterranean sandy loam soil. MCPA was selected since it is a highly mobile herbicide commonly used in high risk scenarios of surface and groundwater contamination, such as Mediterranean olive groves. 2 Materials and Methods 2.1 Herbicide Analytical grade MCPA (purity = 98.9%) from Riedel-de Han (Germany) was used to prepare the clay-based formulations of the herbicide, the initial herbicide solutions used in the adsorption experiments, and the external standards for herbicide analysis. Commercial MCPA, amine salt 60% soluble concentrate (SL) from Tratamientos Guadalquivir S.L. (Spain), was used as a reference standard formulation in the release and leaching experiments. 2.2 Soil and Organic Amendment The soil used in the experiments was a sandy loam soil (0–20 cm) with 73% sand, 7% silt and 20% clay sampled from an experimental olive field located in Seville (Spain). It contained 1.0% CaCO3and 1.62% organic matter. The pH measured in a 1:2 (w/w) soil:deionized water suspension was 8.2. The organic amendment used was a fresh, uncomposted olive oil waste (OOW). The properties of this organic waste are: pH 5.8, 93.2% organic matter, 25 g/kg dissolved organic carbon, and a C/N ratio of 18.3. The soil was amended in the laboratory with OOW at the rate of 10% (w/w). 2.3 Organoclays and Organoclay-Based Formulations of MCPA The organoclays used in this work, i.e., SW-HDTMA and SA-HDTMA, were prepared by treating Na-rich SWy-2 Wyoming montmorillonite and Ca-rich SAz-1 Arizona montmorillonite with an ethanol/ water (50:50) solution containing an amount of hexadecyltrimethylammonium (HDTMA) cation, Fig. 1, as the chloride salt, equal to the cation exchange capacity (CEC) of the montmorillonites [6]. The CEC of SWy-2 and SAz-1 are 74.6 and 120 cmolc/kg, respectively. Additional physicochemical properties of SWy-2 and SAz-1 can be found in van Olphen and Fripiat [17]. The suspensions were shaken for 24 h, centrifuged, washed with distilled water until Cl-free, and then lyophilized. Some characteristics of the resultant organoclays are given in Tab. 1. The percentage of the CEC occupied by HDTMA cations (OCtS) was calculated from the N-content of the samples, determined by elemental analysis. The basal spacing values, d001, were measured on air-dried oriented specimens in a Siemens D5000 diffractometer using CuKaradiation. The organoclay-based formulations of MCPA were prepared by treating 400 mg of organoclay (SW-HDTMA or SA-HDTMA) with 160 mL of an aqueous solution of MCPA. The concentration of MCPA in solution was 600 mg/L for SW-HDTMA and 200 mg/L for SA-HDTMA, in order to achieve similar herbicide content in both formulations. Extractions with a 60:40 methanol:diluted H3PO4(pH = 2) mixture revealed that the final amounts of MCPA adsorbed on SW-HDTMA and SA-HDTMA were 6.5 and 5.6%, respectively. 2.4 Batch Adsorption Isotherms Adsorption isotherms of MCPA on the organoclays and on unamended and amended soil were obtained by the batch equilibration procedure. MCPA adsorption isotherms on the organoclays were obtained by shaking suspensions containing 20 mg of organoclay and 8 mL of MCPA aqueous solutions with initial herbicide concentrations ranging between 0.1 and 2 mg/L at 20 l28C for 24 h. MCPA adsorption isotherms on unamended and amended soil were obtained in a similar manner by equilibrating 5 g of soil with 10 mL of MCPA solutions with initial herbicide concentrations ranging between 1 and 10 mg/L. After equilibration, the suspensions were centrifuged and 4 mL of the supernatant solutions was removed for analysis. The herbicide concentration in the supernatant solutions, Ce, was determined by high-performance liquid chromatography (HPLC) as described below. The amount of herbicide adsorbed in the soil and the organoclays, Cs, was calculated from the difference between the initial and the equilibrium solution concentrations. i2008 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.clean-journal.com Figure 1. Chemical structures of MCPA and HDTMA. Table 1. Some characteristics of the organoclays used as adsorbents of MCPA. Organoclay Montmorillonite Organic cation OCtSa) d001b) () SW-HDTMA SWy-2 Hexadecyltrimethylammonium 93 18.0 SA-HDTMA SAz-1 Hexadecyltrimethylammonium 100 24.0 a) Organic cation saturation: percentage of the CEC of the montmorillonites compensated by HDTMA cations (calculated from the N content of the organoclays) b) d001: basal spacing value for air-dried oriented specimens.