Bases moleculares de la evolución de la virulencia y resistencia a antibióticos en Escherichia Coli: mutación, recombinación y transferencia horizontal.
Abstract
En la batalla contra el auge de la aparición de resistencias bacterianas a antimicrobianos existen al menos tres factores o niveles de actuación imprescindibles: En primer lugar necesitamos comprender la evolución bacteriana e investigar cómo las bacterias son capaces de adquirir mecanismos de resistencia así como los elementos claves en dicha adquisición. Esta información nos aporta las herramientas necesarias para buscar soluciones innovadoras y efectivas. En relación con lo anterior, en esta tesis se describe la relación que existe entre la adquisición de mutaciones de resistencia a ácido nalidíxico y el aumento en recombinación en cepas comensales de Escherichia coli, y se discuten las causas de tal efecto, así como sus consecuencias evolutivas. En un segundo nivel se encuentra la propagación de dichas resistencias. Las bacterias son capaces de compartir información genética por diversos mecanismos, dicha información podría contener genes que codifican para resistencias a antibióticos, que pueden ser incorporados por la bacteria receptora confiriendo una ventaja evolutiva para la adaptación a una nuevo ambiente, como podría ser la presencia de antibióticos. La idea de que los antibióticos promueven la trasferencia horizontal de genes por medio de la conjugación estaba bastante establecida en la comunidad científica. Sin embrago recientemente se ha publicado un estudio que discute dichos resultados. En este trabajo se analiza el efecto que tienen los antibióticos sobre la conjugación, estableciendo unas condiciones experimentales consenso y comparando los resultados obtenidos con estudios anteriores. Los antibióticos promueven la aparición y propagación de resistencias por diversas vías, entre ellas la inducción de respuestas a estrés, por ejemplo la respuesta SOS al daño en el ADN. La activación de dicha respuesta se traduce en un incremento de la mutagénesis, y por tanto la probabilidad de adquirir resistencias. Teniendo en cuenta que en la actualidad, aunque se descubre nuevos antibióticos, aún no están disponibles para su uso en el ámbito clínico, un tercer nivel de actuación podría consistir en inhibir dichas respuestas de estrés. Esta estrategia podría ser una buena forma de alargar la vida de las moléculas que ya conocemos y evitar la aparición y propagación de resistencias. En esta tesis se describe la importancia del estrés oxidativo mediado por antibióticos como uno de los inductores clave de la respuesta SOS y se caracterizala novedosa acción de la molécula antioxidante N- Acetil Cisteína (NAC) sobre la inducción de dicha respuesta y la tasa de mutación en Escherichia coli. NAC inhibe la respuesta SOS promovida por ciprofloxacino (CIP) de forma indirecta, mediante la reducción de las especies reactivas del oxígeno (ROS). Dicha inhibición se traduce en una disminución de la tasa de mutación mediada por las polimerasas propensas a error. Además, abriendo un nuevo camino a explorar en el tratamiento antibiótico, nuestro laboratorio llevó a cabo un escrutinio en busca de moléculas capaces inhibidoras de la respuesta SOS mediada por CIP. En dicho escrutinio se obtuvieron varios candidatos, dos de ellos pertenecientes al grupo de las isoflavonas: genisteína y daidzeína, conocidas por su alto su poder antioxidante. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos con el antioxidante NAC, en esta tesis se caracteriza el efecto de genisteína (GNT) y daidzeína (DDZ) sobre la respuesta SOS promovia por CIP y sobre la consecuente mutagénesis asociada a dicha respuesta. Nuestros resultados muestran que, al igual que NAC, tanto GNT como DDZ son capaces de inhibir la respuesta SOS y reducir la mutagénesis promovida por el tratamiento antibiótico. Además, la caracterización llevada a cabo sugiere que las tres moléculas comparten mecanismo de acción. Por todo lo anterior, se propone el uso terapéutico de moléculas antioxidantes como adyuvantes en el tratamiento antibiótico. En resumen, en esta tesis se aporta aporta nueva información sobre elementos claves en la evolución bacteriana en relación con la aparición y propagación de resistencias a antibióticos desde una aproximación más básica y se plantean alternativas desde un punto de vista más aplicado.
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Bases moleculares de la virulencia y la resistencia a antibióticos en Escherichia coli: mutación, recombinación y transferencia horizontal Tesis Doctoral Ana Isabel Rodríguez Rosado Departamento de Medicina. Facultad de Medicina. Departamento Enfermedades Infecciosas. Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS)
Resumen En la batalla contra el auge de la aparición de resistencias bacterianas a antimicrobianos existen al menos tres factores o niveles de actuación imprescindibles: En primer lugar necesitamos comprender la evolución bacteriana e investigar cómo las bacterias son capaces de adquirir mecanismos de resistencia así como los elementos claves en dicha adquisición. Esta información nos aporta las herramientas necesarias para buscar soluciones innovadoras y efectivas. En relación con lo anterior, en esta tesis se describe la relación que existe entre la adquisición de mutaciones de resistencia a ácido nalidíxico y el aumento en recombinación en cepas comensales de Escherichia coli, y se discuten las causas de tal efecto, así como sus consecuencias evolutivas. En un segundo nivel se encuentra la propagación de dichas resistencias. Las bacterias son capaces de compartir información genética por diversos mecanismos, dicha información podría contener genes que codifican para resistencias a antibióticos, que pueden ser incorporados por la bacteria receptora confiriendo una ventaja evolutiva para la adaptación a una nuevo ambiente, como podría ser la presencia de antibióticos. La idea de que los antibióticos promueven la trasferencia horizontal de genes por medio de la conjugación estaba bastante establecida en la comunidad científica. Sin embrago recientemente se ha publicado un estudio que discute dichos resultados. En este trabajo se analiza el efecto que tienen los antibióticos sobre la conjugación, estableciendo unas condiciones experimentales consenso y comparando los resultados obtenidos con estudios anteriores. Los antibióticos promueven la aparición y propagación de resistencias por diversas vías, entre ellas la inducción de respuestas a estrés, por ejemplo la respuesta SOS al daño en el ADN. La activación de dicha respuesta se traduce en un incremento de la mutagénesis, y por tanto la probabilidad de adquirir resistencias. Teniendo en cuenta que en la actualidad, aunque se descubre nuevos antibióticos, aún no están disponibles para su uso en el ámbito clínico, un tercer nivel de actuación podría
consistir en inhibir dichas respuestas de estrés. Esta estrategia podría ser una buena forma de alargar la vida de las moléculas que ya conocemos y evitar la aparición y propagación de resistencias. En esta tesis se describe la importancia del estrés oxidativo mediado por antibióticos como uno de los inductores clave de la respuesta SOS y se caracterizala novedosa acción de la molécula antioxidante N- Acetil Cisteína (NAC) sobre la inducción de dicha respuesta y la tasa de mutación en Escherichia coli. NAC inhibe la respuesta SOS promovida por ciprofloxacino (CIP) de forma indirecta, mediante la reducción de las especies reactivas del oxígeno (ROS). Dicha inhibición se traduce en una disminución de la tasa de mutación mediada por las polimerasas propensas a error. Además, abriendo un nuevo camino a explorar en el tratamiento antibiótico, nuestro laboratorio llevó a cabo un escrutinio en busca de moléculas capaces inhibidoras de la respuesta SOS mediada por CIP. En dicho escrutinio se obtuvieron varios candidatos, dos de ellos pertenecientes al grupo de las isoflavonas: genisteína y daidzeína, conocidas por su alto su poder antioxidante. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos con el antioxidante NAC, en esta tesis se caracteriza el efecto de genisteína (GNT) y daidzeína (DDZ) sobre la respuesta SOS promovia por CIP y sobre la consecuente mutagénesis asociada a dicha respuesta. Nuestros resultados muestran que, al igual que NAC, tanto GNT como DDZ son capaces de inhibir la respuesta SOS y reducir la mutagénesis promovida por el tratamiento antibiótico. Además, la caracterización llevada a cabo sugiere que las tres moléculas comparten mecanismo de acción. Por todo lo anterior, se propone el uso terapéutico de moléculas antioxidantes como adyuvantes en el tratamiento antibiótico. En resumen, en esta tesis se aporta aporta nueva información sobre elementos claves en la evolución bacteriana en relación con la aparición y propagación de resistencias a antibióticos desde una aproximación más básica y se plantean alternativas desde un punto de vista más aplicado.
Índice Abreviaturas.......................................................................................................................1 Consideraciones iniciales.................................................................................................2 Bloque I Efecto de los antibióticos sobre la aparición y propagación de resistencias....................................................................................................................3 Capítulo I.I Efecto de las mutaciones que confieren resistencia a quinolonas sobre la recombinación homóloga.............................................................................................5 Introducción.........................................................................................................5 - Mutaciones que confieren resistencia a quinolonas y su importancia en la adquisición de resistencias a antimicrobianos.............................................................5 - Recombinación homóloga: mecanismo, regulación e importancia evolutiva en la aparición de resistencias.............................................................................................7 Objetivo.............................................................................................................10 Resultados.........................................................................................................11 - Mutaciones de resistencia a ácido nalidíxico confieren fenotipo hiper-recombinador. ...................................................................................................................................11 - Las mutaciones en las posiciones Ser83 y Asp87 de GyrA están relacionadas con el aumento de recombinación homóloga en cepas naturales de E. coli....................13 - El superenrollamiento se ve afectado en los mutantes GyrA1 y GyrA2..................15 - Las sustituciones en las posiciones Ser83 y Asp87 de GyrA no están relacionadas con un aumento de los niveles de SOS en la cepa M3.............................................18 Discusión..........................................................................................................20 Capítulo I.II Transferencia horizontal: efecto de los antibióticos sobre la conjugación bacteriana..................................................................................................................23 Introducción......................................................................................................23 - Transferencia horizontal de genes: Conjugación.....................................................23 - Importancia de la conjugación en la aparición de resistencias...............................24 - Papel de los antibióticos como promotores de la conjugación bacteriana..............25 Objetivo.............................................................................................................26 Resultados.........................................................................................................27 - Puesta a punto del método para el abordaje de nuestro objetivo...........................27
- Efecto del tratamiento antibiótico sobre la eficiencia de la conjugación bacteriana. ...................................................................................................................................30 Discusión...........................................................................................................39 Material y métodos.........................................................................................................43 - Cepas y plásmidos..........................................................................................43 - Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI).........................44 - Estimación de la recombinación homóloga.....................................................45 - Análisis de las alteraciones en el superenrollamiento.....................................45 - Análisis de los niveles de conjugación mediante fluorescencia......................46 Bloque IIInhibidores de la mutagénesis como herramienta contra la aparición de resistencias a antibióticos..........................................................................................47 Capítulo II.I NAC como inhibidor de la mutagénesis mediada por CIP......................49 Introducción.......................................................................................................49 - Antibióticos como promotores de la mutagénesis: inducción del sistema SOS y estrés oxidativo..........................................................................................................49 - Antioxidantes como inhibidores de la mutagénesis mediada por antibióticos.........51 Objetivo.............................................................................................................52 Resultados.........................................................................................................53 - El tratamiento con concentraciones subletales de CIP induce la mutagénesis en E. coli.............................................................................................................................53 - NAC reduce la inducción de la respuesta SOS mediada por CIP...........................54 - NAC reduce los niveles intracelulares de ROS producidos por CIP........................57 - NAC inhibe la respuesta SOS a través de la reducción de los niveles de ROS......58 - NAC reduce la mutagénesis inducida por CIP y mediada por la respuesta SOS....61 Discusión...........................................................................................................63 Capítulo II.II Búsqueda y caracterización de inhibidores del sistema SOS en la naturaleza..................................................................................................................65 Introducción.......................................................................................................65 - Inhibición del sistema SOS como estrategia contra la aparición de resistencias a antibióticos.................................................................................................................65 Objetivo.............................................................................................................68 Resultados.........................................................................................................69 - Genisteína y Daidzeína reducen la respuesta SOS mediada por CIP sin afectar la actividad antibacteriana del misno.............................................................................69
- La genisteína y la daidzeína reducen los niveles de ROS producidos por CIP.......72 - La genisteína y la daidzeína reducen la mutagénesis mediada por CIP ................72 Discusión...........................................................................................................74 Material y métodos.........................................................................................................76 - Cepas, plásmidos y medios de cultivo............................................................76 - CMI e isobolograma........................................................................................76 - Inducción de la respuesta SOS.......................................................................76 - Citometría de flujo...........................................................................................77 - Microscopía.....................................................................................................78 - Ensayos de tasa de mutación.........................................................................78 Discusión general.............................................................................................................79 Conclusiones....................................................................................................................82 Bibliografía........................................................................................................................83
Abreviaturas ADN: Ácido Desoxirribonucleico Ara: Arabinosa AMP: Ampicilina CAZ: Ceftazidima CIP: Ciprofloxacino DDZ: Daidzeína DSB: del inglés, Double Strand Break dsDNA: del inglés, double stranded DNA EDTA: ácido etilendiaminotetraacético FOS: Fosfomicina GEN: Gentamicina GFP: del inglés, Green Fluorescence Protein GNT: Genisteína NAL: ácido Nalidíxico NER: del inglés, Nucleotide Escision Repear QNR : del inglés, Quinolone Resistance QRDR: del inglés, Quinolone Resistence Determining Region RIF: Rifampicina ROS: del inglés, Reactive Oxigen Spicies ssDNA: del inglés, single stranded DNA TET: Tetraciclina TMP: Trimetoprima 1
homóloga. La proteína RecA desempeña un papel principal en los pasos centrales de la recombinación homóloga, alineando y emparejando dos moléculas de ADN para después promover el intercambio de hebra [25]. Su importancia en el proceso es tal que cuando se elimina la eficiencia de la recombinación asociada a la conjugación disminuye unas 100.000 veces [16]. De forma general, el mecanismo por el cual RecA promueve el emparejamiento homólogo y el intercambio de hebras de ADN consiste en los siguientes pasos ilustrados en la figura 2: 1) en presencia de ADN de hebra simple, RecA polimeriza sobre él formando un filamento nucleoproteico. 2)Este filamento, conocido como RecA*, es la forma activa de RecA que cataliza la invasión de una molécula de ADN de doble hebra que da resultado a un heterodúplex. 3) Tras la invasión, se produce la migración del nucleofilamento hasta alcanzar una región con homología de secuencia lo suficientemente grande como para catalizar el intercambio de hebras. El complejo resultante recibe el nombre de intermediario de Holliday. 4) Posteriormente, proteínas accesorias se encargan de resolver dicho intermediario y de ligar los diferentes fragmentos de la nueva molécula de ADN recombinante. En E. coli dos rutas son las responsables de la generación de ADN de hebra simple del ADN: RecBCD o RecFOR (figura 3, B y C respectivamente) [26]. La primera es necesaria 8 Figura 3. Esquema general del proceso de recombinación. Adaptada de la tesis doctoral de Jerónimo Rodríguez Beltrán (ref). El modelo representado en A es el de reparación de roturas de doble hebra, pero en su forma general, representa el proceso de recombinación homóloga catalizado por RecA (circulos rojos) en todos los casos. La generación de ADN de hebra simple puede ocurrir por la vía RecBCD (B) o por la vía RecFOR (C) dependiendo de si se trata de una rotura de doble hebra o de hebra simple, respectivamente.
para más del 99% de los eventos de recombinación asociados a la conjugación y la transducción [26]. El componente principal de dicha ruta es una proteína trimérica llamada RecBCD cuyo sustrato fisiológico es una molécula de ADN bicatenario y lineal, es decir, una rotura de doble hebra (en inglés, Double Strand Break, DSB) [27]. La segunda ruta, aunque peor caracterizada que la primera, es esencial para la reparación de roturas de hebra simple o discontinuidades (gaps, en inglés). Las proteínas encargadas del reclutamiento de RecA en dicha ruta forman el complejo RecFOR [28]. Discontinuidades en las cadenas de ADN, especialmente roturas de doble hebra o de hebra simple [26], así como bloqueos o regresiones de la horquilla de replicación [29], atraen a las enzimas responsables de la iniciación de la recombinación homóloga. En un trabajo previo publicado por nuestro laboratorio, Jerónimo Rodríguez- Beltrán y colaboradores analizaron la frecuencia de recombinantes de 160 cepas de E. coli (patógenas y comensales) procedentes de humanos. Sus resultados muestran que la frecuencia de recombinantes es muy diversa entre cepas, pudiendo haber diferencias de hasta 9 órdenes de magnitud. Esta amplia distribución nos permite diferenciar entre cepas hiperrecombinadoras, que se sitúan entre las frecuencias más altas de la distribución, frente a cepas hiporrecombinadoras, situadas en las más bajas. Además existe una correlación entre patogenicidad y altos niveles de frecuencia de recombinantes, ya que en general, las cepas patógenas mostraron niveles más altos que sus homólogos comensales. Estos resultados sugieren que existe una selección para la alta capacidad de recombinación, es decir que la evolución juega a favor de las cepas patógenas frente a y las comensales[30]. Dada la importancia evolutiva de este descubrimiento decidimos investigar qué mecanismos moleculares son los responsables de la hiperrecombinación homóloga. Durante el diseño de la aproximación experimental observamos un hallazgo tan fortuito como interesante, al igual que muchos otros en la historia de la ciencia: cepas naturales de E. coli, originalmente hiporrecombinadoras, presentaban un aumento en recombinación cuando adquirían resistencia a ácido nalidíxico (NAL). Yuki Ashizawa y colaboradores describieron que las mutaciones puntuales en las posiciones Leu488Pro y Leu492Pro de GyrA, así como el doble mutante 9
Ile203Val+Ile205Val conferían aun aumento de la recombinación ilegítima en E. coli [31]. Aunque dichas mutaciones no se han encontrado nunca en el ámbito clínico . Además, las mutaciones en la zona QRDR de gyrA, además de dsminuir la susceptibilidad a diversos antimicrobianos provocan alteraciones en el superenrollamiento, cambios en el transcriptoma [21], [22] así como un aumento de recombinación según nuestros resultados, pensamos que dichas mutaciones podrían ser las responsables de tal fenotipo hiperrecombinador. Objetivo Investigar si las mutaciones de resistencia a quinolonas en la zona QRDR de gyrA afectan a la frecuencia de recombinanates en cepas naturales de E. coli con fenotipo hiporecombinador. 10
Resultados - Mutaciones de resistencia a ácido nalidíxico confieren fenotipo hiperrecombinador. En un intento por investigar los mecanismos moleculares que regulan la hiperrecombinación en cepas naturales de E. coli, diseñamos un escrutinio que consistía en: seleccionar una cepa con una alta frecuencia de recombinantes y construir una librería de material genómico clonando trozos de su genoma en un plásmido movilizable. Esta librería sería transferida por conjugación a la cepa comensal de E. coli M3, descrita como hiporecombinadora [30]. Normalmente, en cualquier ensayo de conjugación, tanto la cepa donadora como la receptora son resistentes a algún antibiótico, de esta forma se pueden seleccionar donadores, receptores y transconjugantes sembrando en la combinación de antibióticos adecuada. Una manera sencilla y ampliamente usada para la obtención de una cepa resistente a un antibiótico es la selección de mutantes espontáneos a partir de un cultivo en fase estacionaria, siendo rifampicina, estreptomicina o ácido nalidíxico (NAL) las resistencias más usadas. En nuestro caso, seleccionamos mutantes espontáneos de la cepa receptora a NAL. Una vez obtenidos los mutantes M3 NalR, y antes de llevar a cabo el procedimiento descrito anteriormente para el escrutinio, debíamos comprobar que la frecuencia de recombinantes no se había visto afectada por la adquisición de dicha resistencia. Para ello se usó la metodología usada en Rodríguez- Beltrán y cols, en la cual usan un plásmido (pRhomo, ver material y métodos) diseñado específicamente para estimar la freciencia de aparición recombinantes. Aunque no esperábamos cambios, observamos que los tres mutantes espontáneos seleccionados presentaban una frecuencia de recombinantes mayor que la cepa silvestre M3 (figura 4 y tabla 1) 11
Cepas Frecuencia de recombinantes Desviación estándar M3 9,1E-08 2,2E-07 M3 NalR1 1,4E-04 1,3E-04 M3 NalR2 2,0E-5 9,8E-06 M3 NalR3 5,4E-06 6,7E-05 Dado el interés de estos resultados, decidimos estudiar si existía una relación directa entre la resistencia a Nal y el aumento de los niveles de recombinación homóloga. Para ello dirigimos nuestro análisis a caracterizar los niveles de recombinación en cepas con mutaciones conocidas como causantes de resistencia a Nal y otras quinolonas. - Las mutaciones en las posiciones Ser83 y Asp87 de GyrA están relacionadas con el aumento de recombinación homóloga en cepas naturales de E. coli. La resistencia a NAL y a otras quinolonas es adquirida principalmente por cambios en los aminoácidos Ser83 y Asp87 de GyrA (situados en la zona QRDR [17]), así como cambios en Ser80 y Glu84 de ParC. Además los cambios en GyrA se encuentran alrededor del residuo Tyr122, zona implicada en la unión de la proteína al ADN, y parecen ser los más prevalentes. Sólo una mutación de las dos mencionadas anteriormente es 12 Figura 4. Frecuencia de recombinantes medida con pRhomo. Cada una de las barras horizontales representan la mediana de tres réplicas independientes. Las barras de error se extienden a lo largo del rango intercuartílico. Se observa un aumento significativo en la frecuencia de recombinantes de los mutantes resistentes a ácido nalidíxico (M3 NalR1, 2 y 3) con respecto a la cepa silvestre (M3). Tabla 1. Frecuencia de recombinantes de pRhomo. Cada dato representa la mediana de tres réplicas biológicas de la cepa silvestre (M3) de de los tres mutantes resistetes a Nal, aislados de cultivos independientes (NalR1, 2 o 3).
suficiente para generar resistencia a altas concentraciones NAL y disminuir la susceptibilidad a fluoroquinolonas como ciprofloxacino (CIP) [18]. Para estudiar si dichas mutaciones en gyrA son las responsables del aumento en los niveles de recombinación homóloga en cepas naturales de E. coli con fenotipo hiporecombinador [30], seleccionamos tres cepas sensibles a NAL (tabla 2) que no contenían ninguno de los cambios mencionados anteriormente en los genes gyrA o parC. Se aislaron mutantes espontáneos resistentes a NAL sembrando un cultivo de la noche en placas de LB Agar suplementado con NAL 40 µg/ml . La zona QRDR de gyrA de dichos mutantes fue secuenciada y de cada una de las cepas se seleccionaron dos mutantes espontáneos llamados: GyrA1, con una mutación en Ser83 y GyrA2, con una mutación Asp87 (tabla 2). Cepa Mutación CMI NAL (µg/ml) CMI CIP (µg/ml) M3 silvestre 2 0,015 M3 GyrA1 Ser83Leu 512 0,25 M3 GyrA2 Asp87Gly 256 0,125 M28 silvestre 2 0,015 M28 GyrA1 Ser83Leu 256 0,25 M28 GyrA2 Asp87Tyr 128 0,125 C14 silvestre 2 0,015 C14 GyrA1 Ser83Leu 256 0,25 C14 GyrA2 Asp87Gly 128 0,125 La determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de NAL y CIP para cada una de las cepas muestran resistencia a NAL (CMI≥ 16 µg/ml) [19] y disminución de susceptibilidad a CIP en todos los mutantes seleccionados (tabla 2). Este resultado concuerda con lo anteriormente descrito en la literatura para dichas mutaciones en aislados clínicos de Enterobacter cloacae [18] y en aislados de E. coli procedentes de alimentos, animales y humanos [32]. 13 Tabla 2. Concentración mínima inhibitoria (CMI) para NAL y CIP de cepas naturales de E. coli y sus derivados con mutaciones en gyrA. La determinación se llevó a cabo según parámetros EUCAST
Tras confirmar el efecto esperado de las mutaciones en gyrA en sobre la CMI de CIP y NAL, analizamos si además estos mutantes mostraban un fenotipo hiperrecombinador. Para ello se calcularon las frecuencias de recombinantes para cada uno de ellos (tabla 3 y figura 5). Los resultados muestran que, tanto en la cepa en la que descubrimos dicho fenotipo (M3), como en otras dos cepas naturales (M28 y C14), la frecuencia de recombinantes aumenta entre 8 y 300 veces en aquellas variantes que portan mutaciones en gyrA con respecto a la cepa silvestre. Cepa Frecuencia de recombinantes IC 95% Incremento Réplicas M3 7,4x10 -7 1,4 x10 -6 1 5 M3 GyrA1 2,6x10 -4 1,65 x10 -3 661 5 M3 GyrA2 2,2x10 -4 1,45 x10 -3 233 5 M28 1,1x10 -6 2,2 x10 -5 1 11 M28 GyrA1 7,5x10 -5 4,94 x10 -4 26 7 M28 GyrA2 5,8x10 -5 8,47 x10 -5 41 8 C14 3,3x10 -6 9,10 x10 -6 1 8 C14 GyrA1 2,8x10 -5 1,81 x10 -4 6 7 C14 GyrA2 4,5x10 -5 2,45 x10 -4 10 6 Estos resultados sugieren fuertemente que las mutaciones en la zona QRDR de gyrA tienen un efecto sobre la recombinación homóloga en cepas naturales de E. coli. 14 Figura 5. Representación de la frecuencia de recombinantes de tres cepas naturales de E. coli y sus derivados resistentes a Nal. La resistencia viene dada por cambios en gyrA: GyrA1 contiene un cambio en el codón Ser83, mientras que en GyrA2 el cambio se encuentra en el codón Asp87. Las cajas representan el rango intercuartílico, la línea horizontal corresponde a la mediana de la población. Las barras de error se extienden a lo largo del IC95%. Se observan diferencias significativas (P<0,005) mediante el test estadístico U- Mann Whitney. Tabla 3. Frecuencia de recombinantes pRhomo en cepas naturales de E. coli y sus derivados resistentes a Nal (GyrA1 y GyrA2). Cada dato de frecuencia equivale a la mediana del número de réplicas biológicas que reflejado en la tabla. IC95% corresponde al intervalo de confianza.
- El superenrollamiento se ve afectado en los mutantes GyrA1 y GyrA2 Como comentamos en la introducción de este capítulo, las mutaciones en gyrA,que codifica la subunidad A de la toposiomerasa II, alteran en el superenrollamiento del ADN. En concreto, se ha descrito que los cambios en los residuos Ser83 o Asp87 disminuyen la afinidad por el ADN, ralentizando su función e impidiendo así la eliminación de enrollamiento positivo que se acumula en la parte anterior de la horquilla de replicación [21], [22] (figura 2). Según esta premisa y lo descrito en la literatura respecto a dichas mutaciones, en las cepas naturales de E. coli usadas en este trabajo, el superenrollamiento positivo del ADN debería ser mayor respecto a las silvestres en aquellas que contienen alguna de las dos mutaciones. Para comprobar esta posibilidad, se llevaron a cabo electroforesis en geles de agarosa del plásmido pBR322 en presencia de cloroquina, un agente intercalante débil que permite la separación de los diferentes topoisómeros de ADN (figura 6). La cloroquina, al igual que el bromuro de etidio, se inserta entre las hebras de la doble hélice aumentando el superenrollamiento positivo. Esto puede tener dos efectos en función del estado inicial de superenrollamiento del plásmido [33]. Normalmente, en un gel de agarosa, un plásmido superenrollado migra más rápido que su forma relajada, independientemente de la orientación de dicho superenrollamiento (positivo o negativo) (figura 6A). De esta manera los topoisómeros se distribuyen en un 15 Figura 6. Representación gráfica de la distribución de topoisómeros de ADN de un plásmido dado en un gel de agarosa en ausencia de cloroquina (A) o en presencia de 2-5 µg/ml de cloroquina (B) donde los topoisómeros se distribuyen a lo largo del gel quedando los que están negativamente superenrollados (-ve) en la parte superior, mientras los que los que están positivamente superenrollados (+ve) quedan en la parte inferior del gel.
gel entre dos posiciones: una banda en la parte inferior del gel que se corresponde con el ADN altamente enrollado (positiva o negativamente) y una banda en la parte superior que se corresponde con el ADN relajado. Al añadir cloroquina el ADN que inicialmente está enrollado negativamente se relaja y migrará más lento. Sin embargo, si el ADN de partida está enrollado positivamente, migrará aún más rápido que en ausencia de cloroquina (figura 6B). Asumiendo que las mutaciones en gyrA producen un aumento de superenrollamiento positivo [21], [22], en un gel de agarosa en presencia de cloroquina, los mutantes acumularían más topoisómeros en la parte inferior del gel (superenrollamiento positivo) y menos en la parte superior (superenrollamiento negativo) en comparación con el silvestre [33]. En la figura 7 observamos que, en presencia de 2,5 µg/ml de cloroquina, las cepas que contienen alguna de las dos mutaciones muestran un aumento de intensidad en las bandas del plásmido pBR322 que corresponden con las de mayor superenrollamiento positivo en comparación con la cepa silvestre. Así como la desaparición o disminución de intensidad de bandas con superenrollamiento negativo así como relajado o discontinuo. Estas diferencias son mucho más notables en las cepas M3 y M28 que en C14, coincidiendo también con la tendencia en frecuencia de recombinantes, siendo las cepas C14 GyrA1 y C14 GyrA2 las que muestran un menor incremento con respecto a su homólogo silvestre (tabla 3 y figura 5). Dichos resultados confirman el efecto ya reportado sobre las mutaciones en la zona QRDR de gyrA y las alteraciones en el superenrollamiento del ADN: cambios en los residuos Ser83 o Asp87 modifican la estructura de la proteína de tal manera que disminuye la afinidad por el ADN alterando su función [21], [22], lo que deriva en la acumulación de superenrollamiento positivo en la parte anterior de la horquilla de replicación [11]. 16
- Las sustituciones en las posiciones Ser83 y Asp87 de GyrA no están relacionadas con un aumento de los niveles de SOS en la cepa M3. Como se ha descrito previamente en la introducción de este capítulo, las sustituciones en las posiciones Ser83 y Asp87 de GyrA interfieren en la actividad enzimática de la ADN girasa, alteran el superenrollamiento del ADN y probablemente replicación del mismo. 17 Figura 7. Electroforesis del plásmido pBR322 en geles de agarosa en presencia de cloroquina. El plásmido ha sido obtenido de las cepas naturales de E. coli y sus deribados GyrA1 y GyrA2 en las cepa de E. coli M3, M28 y C14. A) 1: M3; 2:M3 GyrA1; 3: M3 GyrA2; 4: M28; 5: M28 GyrA1; 6: M28 GyrA2; 7: C14; 8: C14 GyrA1; 9: C14 GyrA2. B) Cuantificación de bandas para cada uno de los geles mediante el programa Image lab 3.0 de BioRad
industria ganadera fueron los más abundantes en todos los metagenomas. De hecho, los genes de resistencia para antibióticos usados en la industria ganadera son los más abundantes en la microbiota intestinal [52]. Las evidencias que presenta este estudio apoyan la hipótesis “de la granja a la mesa” (del inglés farm-to-fork) que postula que el uso no terapéutico de los antibióticos en la cría de animales promueve el incremento de resistencias a antibióticos en humanos a través del consumo comida o agua “contaminada” [52], [53]. - Papel de los antibióticos como promotores de la conjugación bacteriana. Como se comentó en la introducción de este capítulo, los antibióticos no son meros selectores de resistencias bacterianas existentes en una población, sino que ejercen un papel activo promoviendo la diversidad genética [3]–[8]. Dicho aumento de la diversidad genética puede estar promovido por el uso de antimicrobianos, a través de diferentes mecanismos como por ejemplo mutación, recombinación o el que en este apartado estamos analizando: la conjugación. Existen evidencias de que los antibióticos afectan de alguna manera la transferencia horizontal de genes. Si bien la mayoría indican que los antibióticos promueven la conjugación, también se ha reportado el efecto contrario [8]. Las concentraciones subletales de antibióticos no sólo incrementan la diversidad genética en una población, sino que además podrían contribuir en la propagación de dicha diversidad, aumentando la eficiencia de conjugación de manera directa, induciendo la expresión de la maquinaria de conjugación o activando la escisión de genes transferibles en el cromosoma de la célula donadora [54]–[57]. También se ha especulado, aunque no probado, que los antibióticos podrían elevar la tasa de conjugación de manera indirecta, activando respuestas celulares como la modificación de la composición de la pared celular o la regulación la expresión de genes claves para la supervivencia [58]–[62]. Sin embargo, recientemente se ha demostrado los antibióticos no afectan de forma significativa la eficiencia de conjugación [63]. Un antibiótico puede afectar la dinámica 24
general de la conjugación modulando la eficiencia de la misma, actuando como factor de selección que afecta a la dinámica de población después de la conjugación, o ambos. Según lo descrito en el trabajo de Lopatkin et al. [63], las aproximaciones experimentales llevadas a cabo en investigaciones anteriores no diferencian entre estos dos componentes. Esto se debe a que los protocolos experimentales consistían en experimentos típicos de conjugación in vitro en presencia de antibiótico, seguidos de un período de crecimiento antes de la cuantificación de transconjugantes. La conclusión de que los antibióticos promueven la conjugación se ha basado en el aumento observado de transconjugantes en presencia de un antibiótico en comparación con el control sin tratamiento. Lopatkin et al. conluyen que dichos diseños experimentales no pueden distinguir entre el efecto de los antibióticos sobre la eficiencia de la conjugación versus la dinámica de selección, ni tampoco muestran cómo éstos efectos son dependientes de la concentración de antibióticos. Las conclusiones obtenidas en los distintos trabajos publicados sobre el efecto de los antibióticos en la conjugación bacteriana son muy diversas, hay publicaciones que describen tanto aumento como inhibición de la eficiencia de la conjugación, resultados recientemente discutidos. Probablemente dichas diferencias están determinadas por la diversidad en las condiciones experimentales. Nuestra hipótesis es que, estableciendo un diseño experimental consenso, podríamos obtener resultados que satisfagan las diferencias establecidas. Objetivo Nuestro objetivo consiste en comprobar si realmente los antibióticos afectan a la eficiencia de la conjugación bacteriana. Para ello llevamos a cabo experimentos “tradicionales” de conjugación in vitro en presencia de una batería de antibióticos a varias concentraciones con distintos plásmidos conjugativos, usando un protocolo que nos permite tener en cuenta el crecimiento de las poblaciones bacterianas iniciales a la hora de cuantificar los niveles de conjugación [64], [65], y por tanto discriminar entre los dos componentes que afectan a la eficiencia de la misma. 25
Resultados - Puesta a punto del método para el abordaje de nuestro objetivo. La mayor parte de los resultados que se exponen en este apartado se obtuvieron durante una estancia en el grupo de intergenómica de la Universidad de Cantabria liderado por el profesor Fernando de la Cruz. En dicho laboratorio desarrollaron un escrutinio para identificar compuestos que pudieran interferir en el proceso de la conjugación [65] usando plásmidos conjugativos de diferentes grupos de incompatibilidad que emiten fluorescencia específicamente en las células transconjugantes [64]. El método consta de una cepa donadora que porta dos plásmidos, un plásmido conjugativo con la proteína fluorescente GFP bajo el control del promotor Lac, y un plásmido no movilizable que contiene el represor lacI q cuya función es inhibir la expresión de GFP en la célula donadora. La cepa receptora carece del represor LacI, de manera que cuando recibe el plásmido conjugativo emitirá fluorescencia. De esta forma, la emisión de fluorescencia será específica de las células transconjugantes (figura 11). La principal adaptación del protocolo es la elección de las cepas donadoras y receptoras en función de la CMI de los antibióticos que se usarán durante la conjugación. Dado que los ensayos se llevarán a cabo en presencia de distintas concentraciones de antibióticos, las sensibilidades de ambas cepas deben ser similares, para minimizar los efectos de los antimicrobianos en la dinámica de crecimiento de ambas poblaciones. Tras determinar la CMI de cada uno de los antibióticos testados para cada una de las cepas usadas en este trabajo, se escogió la cepa donadoracuyas sensibilidades fueron más parecidas a las de la cepa receptora JW336 lacI::Kan R (tabla 4). 26 Figura 11. Representación del método desarrollado por Getino M. y col. para llevar a cabo los ensayos de conjugación a gran escala y adaptado en este trabajo para comprobar el efecto que los antibióticos tienen sobre dicho proceso.
Antibióticos BW2773 Nal R (µg/ml) donadora JW336 lacI::Kan R (µg/ml) receptora Diana y mecanismo de acción Trimetoprima (TMP) 1- 0,5 0,5 Genotóxico. Interfiere en la síntesis de purinas inhibiendo la enzima dihidrofolato reductasa Ciprofloxacino (CIP) 0,25 0,06 Genotóxico. Interfiere en la replicación del ADN bloqueando la AND girasa. Fosfomicina (FOS) 1 1 Membrana. Interfiere en la síntesis de peptidoglicano. Ceftacidima (CAZ) 0,3 0,3 Membrana. Interfiere en la síntesis de peptidoglicano. Rifampicina (RIF) 4 4 ARNm. Inhibe la síntesis bloqueando la enzima RpoB. Tetraciclina (TET) 1- 0,5 0,5- 0,25 Síntesis de proteína. Se unen a la subunidad 30S del ribosoma inhibiendo la síntesis proteica. Gentamicina (GEN) 2 2 Síntesis de proteínas. Se unen a la subunidad 30S del ribosoma inhibiendo la síntesis proteica. Ambas cepas tenían una sensibilidad similar para todos los antibióticos excepto para ciprofloxacino (CIP). Esto se debe a que, como se abordó en el apartado anterior de este capítulo, las mutaciones que confieren resistencia a NAL disminuyen la sensibilidad a otras quinolonas. En este caso, la concentración de antibiótico usada durante los experimentos de conjugación se refiere a la CMI de la bacteria receptora (0,5 µg/ml). Una vez escogidas las cepas que se usarán en los ensayos de conjugación debemos determinar los umbrales a partir de los cuales se puede considerar que la fluorescencia emitida se debe a la conjugación en sí misma, y no al ruido inherente a todo experimento científico. Para ello, se determinó la fluorescencia emitida por los donadores y los receptores de forma independiente siguiendo el mismo protocolo establecido para los ensayos de conjugación. A su vez, de cada uno de esos cultivos se determinó la densidad óptica inicial (a tiempo 0) y final (pasadas las 6 horas de incubación). Se 27 Tabla 4. Valores de sensibilidad de las cepas donadora y receptora a los antibióticos testado en los ensayos de conjugación.
consideró crecimiento cuando la densidad óptica final está por encima de 0,3, valor que se corresponde con la absorbancia a tiempo 0. Para eliminar el componente de fluorescencia emitida por la propia densidad del cultivo, cada valor de fluorescencia GFP obtenido se normalizó por la D.O. 600nm. Según los resultados establecimos el umbral de autofluorescencia en 3x10 4 U.A GFP/OD (figura 12c). Dichos resultados muestran que la normalización no afecta a los niveles de fluorescencia, excepto en aquellos casos en los que el crecimiento está en valores cercanos al umbral, como es el caso de pAR102 (figura 12b), donde la fluorescencia aumenta de 1x10 4 U.A. GFP a 3x10 4 U.A. GFP/OD. Valores de absorbancia más bajos (por debajo del umbral establecido), harían que la fluorescencia normalizada se viera incrementada de forma errónea, lo que sería considerado un artefacto del método. Con independencia de estos casos puntuales, los valores de fluorescencia brutos y normalizados se mantienen similares en todos los casos (figura 12 a y c), por lo que la normalización equivaldría a dividir por una constante. 28 Figura 12. Deterimación del umbral de sensibilidad (línea discontinua gris) inherente al método para los valores de fluorescencia bruta (A), densidad óptica (B) y fluorescencia normalizada (C).En las gráficas de fluorescencia as cajas representan el rango intercuartílico, las líneas se corresponden con la mediana, la cruz con la media. Las barras de error se extienden a lo largo del Intervalo de Confianza 95% (IC95%). En la gráfica de crecimiento los símbolos se corresponden con la media de tres réplicas biológicas, las barras de error equivalen a la desviación estándar.
- Efecto del tratamiento antibiótico sobre la eficiencia de la conjugación bacteriana. Para analizar los resultados obtenidos en este apartado debemos tener en cuenta varios factores. En primer lugar, no todos los antibióticos afectan a todos los plásmidos por igual. Esto puede deberse a la propia naturaleza del plásmido conjugativo usado (tabla 5, material y métodos) así como al mecanismo de acción del antibiótico en cuestión. En segundo lugar, se testó un gradiente de concentraciones para cada antibiótico en torno a la CMI. Concentraciones por debajo o por encima de la CMI afectan de forma diferente tanto a la dinámica de poblaciones como a la eficiencia de la conjugación. A continuación vamos a analizar detenidamente los resultados obtenidos para cada antibiótico testado, teniendo en cuenta los factores enumerados anteriormente. Rifampicina (RIF) es un antibiótico perteneciente al grupo de las rifaminas, interfieren en la síntesis normal del ARN mensajero por medio de la unión a la subnunidad ẞ de la ARN polimerasa (RpoB). Con respecto al crecimiento se pueden diferenciar dos situaciones en función de la concentración de antibiótico. Cuando tratamos con concentraciones de RIF de entre 8 y 2 veces la CMI el crecimiento se ve afectado, de manera diferente en función del plásmido conjugativo en cuestión, siendo los plásmidos pAR105, pAR106 y pAR107 los más afectados. En estos casos los valores de densidad óptica obtenidos se sitúan por debajo del umbral establecido, por lo que no podemos asegurar que la fluorescencia obtenida en estas condiciones se deba a la conjugación, sino a la propia autofluorescencia de la biomasa (figura 13). Una situación alternativa es la que ocurre cuando tratamos con concentraciones equivalentes a la CMI e inferiores. El crecimiento en estos casos alcanza niveles similares a los obtenidos con la condición no tratada, sin embargo la fluorescencia emitida disminuye con respecto a dicha condición de manera dosis-respuesta. En dichas concentraciones hay una correlación significativa (spearman P<0,05) entre la 29
concentración de RIF y la fluorescencia emitida: a mayor concentración de antibiótico niveles de fluorescencia más bajos (figura 13). Dichos resultados indican que concentraciones subinhibitorias de RIF podrían afectar a la eficiencia de la conjugación. Aunque no podemos descartar que los resultados obtenidos se deban a que el tratamiento afecta a la síntesis de GFP, ya que RIF inhibe la síntesis normal de ARN mensajero. Aún así, tampoco podemos descartar un efecto sobre la síntesis de otras proteínas implicadas en la conjugación (figura 13). Gentamicina (GEN) es una antibiótico perteneciente al grupo de los aminoglucósidos, interfiere en la síntesis proteica dando lugar a proteínas no funcionales en microorganismos sensibles a su efecto. Los resultados obtenidos muestran que en general el crecimiento se ve más afectado en comparación con la condición no tratada que en el caso de RIF (figura 13). Siguen siendo los plásmidos pAR105 y pAR107 los más afectados, aunque en general hay más variabilidad en con respecto a la concentración por lo que no hay una diferencia tan clara entre concentraciones por encima y por debajo de la CMI. En los plásmidos donde el crecimiento se ve menos afectado (pAR102, pAR104 y pAR106) se da una situación muy similar a la descrita anteriormente para RIF. A concentraciones por encima de la CMI tanto el crecimiento como la fluorescencia se sitúan por debajo del umbral, por lo que no podemos asociar la fluorescencia emitida con los niveles de conjugación. Sin embargo, a concentraciones por debajo de la CMI, aunque el crecimiento se ve afectado por el tratamiento antibiótico, los valores se sitúan por encima del umbral en todos los casos. Igualmente se observa una inhibición de la fluorescencia que sigue una correlación dosis respuesta (spearman P<0,05). En este caso tampoco podemos descartar que dicha reducción en los niveles de fluorescencia se deba a la interferencia de GEN en la síntesis de GFP. Si se diera esta posibilidad, cabría esperar que el antibiótico afectara a la síntesis de proteínas involucradas en la conjugación, en cuyo caso nuestros resultados sugerirían que concentraciones subletales de GEN podrían afectar a la eficiencia de la conjugación (figura 13). 30
31 conjugación. Arriba densidad ótica 600nm, el círculo se sitúa en la media, las barras de error indican el error estándar. La línea de puntos gris indica el umbral de sensibilidad del método en todos los casos. Abajo fluorescencia normalizada por crecimiento, las cajas representan el rango intercuartílico, la línea horizontal corresponde a la mediana de la población y la cruz representa la media. Las barras de error se extienden a lo largo del IC95%. Los asteriscos indican diferencias significativas con respecto al no tratado (P<0,005 Tukey comparaciones múltiples).
Otro antibiótico probado que afecta a la síntesis de proteínas es tetraciclina (TET) que, al igual que GEN, se une a la subunidad 30S del ribosoma inhibiendo la síntesis normal de proteínas. Su efecto se probó en las mismas condiciones sobre dos plásmidos distintos, pAR104 y pAR107. En ambos, el efecto sobre el crecimiento difiere bastante de lo observado en el tratamiento con GEN para ambos plásmidos (figura 14). En primer lugar, a diferencia de lo que ocurría cuando tratamos con GEN, parece que el efecto del tratamiento con TET sigue la misma tendencia en ambos plásmidos, tanto en fluorescencia como en crecimiento, siendo éste último más bajo de forma generalizada en el plásmido pAR107 (figura 14). Estos resultados sugieren que antibióticos que comparten diana/ mecanismo no tienen porqué afectar de la misma forma. Además, se observa de nuevo una bajada en los niveles de fluorescencia que sigue una correlación dosis respuesta (spearman P<0,05) y que podría corresponderse con una inhibición de la conjugación. Ciprofloxacino (CIP) es un antibiótico perteneciente al grupo de las fluoroquinolonas que produce daño genotóxico al interferir en la replicación del ADN bloqueando la ADN girasa. 32 Figura 14. Efecto de tetraciclina sobre el crecmimiento y la eficiencia de la conjugación. Arriba densidad ótica 600nm, el círculo se sitúa en la media, las barras de error indican el error estándar. La línea de puntos gris indica el umbral de sensibilidad del método en todos los casos. Abajo fluorescencia normalizada por crecimiento, las cajas representan el rango intercuartílico, la línea horizontal corresponde a la mediana de la población y la cruz representa la media. Las barras de error se extienden a lo largo del IC95%. Los asteriscos indican diferencias significativas con respecto al no tratado (P<0,005 Tukey comparaciones múltiples).
Para este antibiótico es posible hacer un análisis general de los resultados, ya que son bastante similares en todos los plásmidos testados. El crecimiento se ve menos afectado que en situaciones analizadas anteriormente, de hecho, se encuentra por encima del umbral establecido en todas las concentraciones testadas (incluidas aquellas muy por encima de la CMI). Aunque las diferencias en fluorescencia no son tan evidentes como en las situaciones expuestas anteriormente, son significativas en todos los casos excepto para el plásmido pAR106, debido probablemente a que la dispersión de los datos en el no tratado es mayor. Estos resultados sugieren que CIP podría interferir en la eficiencia de la conjugación (figura 15). 33 Figura 15. Efecto de ciprofloxacino sobre el crecmimiento y la eficiencia de la conjugación. Arriba densidad ótica 600nm, el círculo se sitúa en la media, las barras de error indican el error estándar. La línea de puntos gris indica el umbral de sensibilidad del método en todos los casos. Abajo fluorescencia normalizada por crecimiento, las cajas representan el rango intercuartílico, la línea horizontal corresponde a la mediana de la población y la cruz representa la media. Las barras de error se extienden a lo largo del IC95%. Los asteriscos indican diferencias significativas con respecto al no tratado (P<0,005 Tukey comparaciones múltiples).
acción a la hora de obtener conclusiones. CIP y TMP inducen daño en el ADN de diferente forma, el primero de forma directa, inhibiendo la replicación mediante el bloqueo de la ADN girasa, el segundo de forma indirecta, modificando el balance en el pool de nucleótidos necesarios para la replicación. Ambos parecen afectar de forma similar al crecimiento, sin embargo no ocurre lo mismo con con los niveles de fluorescencia: CIP parece inhibir la conjugación, mientras que TMP parece no tener efecto la misma. Si bien es cierto que, en ningún caso observamos que los antibióticos promuevan la conjugación bacteriana, sí que hemos obtenido resultados que indican una posible inhibición. En contraposición con lo descrito por Lopatkin et al. [63], donde concluyen que el tratamiencto con GEN y norfloxacino (quinolona que comparte mecanismo de acción con CIP) no interfiere en la eficiencia de la conjugación, nuestros resultados sugieren que tanto CIP como GEN podrían tener un efecto inhibidor. Aunque en ambos trabajos se utiliza una metodología similar, esta contradicción podría deberse a diferencias en la aproximación experimental. Mientras que en nuestros ensayos es el propio plásmido conjugativo el que codifica la maquinaria necesaria para la conjugación, en su trabajo la expresión de dicha maquinaria es constitutiva. Teniendo en cuenta que GEN afecta a la síntesis de proteínas, el efecto que este antibiótico pueda tener sobre la expresión de dicha maquinaria y por tanto sobre la eficiencia de la conjugación podría estar subestimado, dando lugar a un falso negativo. Aunque teniendo en cuenta los resultados de este capítulo, así como la literatura, la conclusión más robusta a la que podemos llegar es que no podemos generalizar sobre el efecto que los antibióticos tienen sobre la eficiencia de la conjugación bacteriana. Sino que debemos tener en cuenta los múltiples factores que afectan a la misma y las condiciones en las que se lleva a cabo, para obtener un resultado fiable en cada situación. 40
Material y métodos - Cepas y plásmidos. Para la caracterización del efecto de las mutaciones de resistencia a NAL sobre la recombinación se usaron tres cepas comensales de E. coli aisladas de muestras fecales de individuos no relacionados entre ellos procedentes de Mali (M3 y M28) y Croacia (C14) [38]. Sus derivados con mutaciones en la zona QRDR de gyrA se obtuvieron sembrando un cultivo en fase estacionaria en LB agar NAL 40 µg/ml. Tras un período de incubación de 16 horas a 37ºC, se seleccionaron cuatro colonias procedentes de cultivos independientes y fueron secuenciadas en busca de las mutaciones más prevalentes que confieren resistencia a Nal: cambios en los codones correspondientes a los residuos Ser83 y Asp87. El plásmido pRhomo [30] (figura 19) se usó como herramienta para medir recombinación homóloga. Figura 19. Representación esquemática del plásmido pRhomo, herramienta para medir recombinación homóloga. Mapa del plásmido pRhomo antes (izquierda) y después (derecha) de la recombinación. tetA5’ y tetA3’ son alelos no funcionales de tetA con deleciones en el extremo C- terminal o N- terminal respectivamente, en pRhomo (AMPR GENR). Ambos alelos comparten una zona de solapamiento de 627 pb con el 100% de homología, y están separados el no del otro por un fragmento de 1042 pb que contiene el gen aacC1 (resistencia a gentamicina).con sólo un evento de recombinación entre los dos alelos tetA se restaura una copia funcional del gen tetA, originando el plásmido pRhomo-tet (AmpR TetR). Adaptada de Rodríguez- Beltrán et al., 2015. 41
Para la caracterización del efecto de los antibióticos sobre la eficiencia de la conjugación bacteriana, se usaron dos cepas: la cepa donadora es E. coli BW2773 resistente a NAL (NALR), contiene dos plásmidos: uno conjugativo que expresa GFP bajo el control del promotor Lac. El segundo plásmido es el PUC18, no movilizable, que contiene el represor lacI q . Dicho represor inhibe la expresión de GFP en la célula donadora. La cepa receptora es E. coli JW336 resistente a Kanamicina (KANR), mutante LacI - de la colección Keio, que permite la expresión de GFP cuando recibe el plásmido por medio de la conjugación (figura 9). De esta manera sólo se detectará fluorescencia de GFP cuando el plásmido conjugativo haya pasado de la célula donadora la receptora. Para determinar si dicho efecto dependía también del tipo de plásmido conjugativo, se llevaron a cabo los experimentos con 5 plásmidos de diferentes grupos de incompatibilidad, detallados en la tabla 5. Nombre Plásmido Parental Características Ref. pAR102 R1drd19 IncFII Amp R , Cm R , Km R , Sm R cat::tet - PA1/04/03 - gfpmut3b* - T0 [64], [66] pAR104 pOX38Km IncFI Km R , Cm R aph (Tn5)::cat - PA1/04/03 - gfpmut3b* - T0 [66] pAR105 pLG221 IncI1 Km R , Cm R aph (Tn5)::cat - PA1/04/03 - gfpmut3b* - T0 [66] pAR106 RP4 IncP Cm R istAB-aph::cat - PA1/04/03 - gfpmut3b* - T0 [66] pAR107 pSU2007 IncW Km R , Tp R , Cm R aph (Tn5)::cat - PA1/04/03 - gfpmut3b* - T0 [66] - Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI). La susceptibilidad a CIP y NAL se testó en las cepas M3, M28, C14 y sus derivadas GyrA1 y GyrA2 mediante la determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI). Así mismo, para los ensayos de conjugación se testó la susceptibilidad de las cepas donadora y receptora para los antimicrobianos testados mediante el mismo método (tabla 4). 42 Tabla 5. Descripción de los plásmidos testados en los ensayos de conjugación en presencia de antibiótico.
En ambos casos la CMI se llevó a cabo mediante el mismo protocolo: en placas de 96 pocillos, cada pocillo contiene 10 5 células de E. coli en fase exponencial en 100µl de LB suplementado con el antibiótico apropiado. Las placas se incubaron a 37ºC durante 20 horas. - Estimación de la recombinación homóloga. Las cepas M3, M28, C14 y sus respectivos derivados mutantes GyrA1 (Ser83) y GyrA2 (Asp87) fueron transformadas con pRhomo. Cuatro transformantes independientes se crecieron a 37ºC y 180 rpm durante 16 horas en LB Broth ampiclina (AMP) 100 µg/ml y gentamicina (GEN) 15 µg/ml. Para disminuir la probabilidad de llevar a cabo el ensayo con células que contengan plásmidos en su forma recombinada, entre 10 1 -10 2 células de cada uno de los transformantes se inocularon en LB AMP 100 µg/ml. Dichos cultivos se incubaron durante la noche a 37ºC 180 rpm. Posteriormente, se sembraron diluciones apropiadas de los cultivos crecidos hasta saturación en LB Agar AMP 100 µg/ml y tetraciclina (TET) 15 µg/ml y se incubaron a 37ºC durante 24 horas. La frecuencia de recombinantes se calcula como la mediana del número de recombinantes (AMPR y TETR) dividida por la mediana del número de células viables crecidas en LB Agar AMP 100 µg/ml. - Análisis de las alteraciones en el superenrollamiento. La purificación del plásmido pBR322 se llevó a cabo con el kit NucleoBond ® Xtra Midi Plus Macheray- Nagel, a partir de 400 ml de cultivo en fase exponencial (D.O. 0,5) crecidos a 37ºC con baja agitación (150 rpm) para permitir la replicación del plásmido y maximizar la eficiencia de la extracción. Posteriormente las muestras de ADN se cuantificaron mediante nanodrop. Las electroforesis se llevaron a cabo en geles de agarosa 1% de 27cm de largo con Tris Borato EDTA (TBE) 2X y cloroquina 2,5 µg/ml tanto en el gel como en el tampón de corrida. Para cada una de las muestras se cargó 1µg de plásmido, y se corrió a 3V cm -1 durante 16 horas. 43
Para eliminar la cloroquina después de la electroforesis, los geles se lavaron en abundante agua destilada con agitación al menos durante 3 horas. Durante este tiempo el agua se cambió cada 20-30 minutos. Una vez finalizado el lavado, los geles se tiñeron con bruomuro de etidio 1 µg/ml en agua destilada durante al menos hora. Tras la tinción, los geles se lavaron con agua y observamos los topoisómeros del plásmido bajo la luz ultravioleta. El análisis y cuantificación de las bandas se llevó a cabo mediante el programa Image Lab 3.0 de BioRad. - Análisis de los niveles de conjugación mediante fluorescencia. Brevemente, en primer lugar se preparan placas de 96 pocillos con LB agar más antibiótico en las diferentes concentraciones a probar, además de los controles sin tratar. En el caso de CIP se tomará como referencia la CMI más baja, es decir la de la receptora (0,06 µg/ml). Cada una de las condiciones se testará al menos por triplicado. Para la conjugación, 10 ml de cultivo o/n (aprox. 109 céls./ml) de ambas cepas, donadora y receptora, se centrifugan a 8000 rpm y se resuspenden en 5ml de LB. Ambos cultivos se mezclan y se añade 10 µl de dicha mezcla a cada uno de los pocillos, lo que se traduce en una población inicial de aproximadamente 2x107 células por pocillo, mitad donadoras y mitad receptoras. Los cultivos se incubaron durante 6 horas a 37ºC para permitir que se dieran eventos de conjugación. Pasado este tiempo, la mezcla de cada uno de los pocillos es resuspendida en 100 µl de solución salina y se medirá fluorescencia a 450nm y DO600nm. Los resultados se trataron de la siguiente forma, siendo: Niveles de fluorescencia brutos = GFP Absorbancia 600nm= DO 600 Niveles fe fluorescencia normalizados = GFP/DO 600 44
Bloque II Inhibidores de la mutagénesis como herramienta contra la aparición de resistencias a antibióticos. 45
Cada vez existen mayores evidencias de que los antibióticos, además de su acción antimicrobiana, pueden tener efectos secundarios indeseados que promuevan, al menos en algunos casos, la variabilidad genética bacteriana [8]. El comienzo de la producción en masa de los antibióticos representó un gran avance en el tratamiento médico de las enfermedades infecciosas, el entusiasmo era tal que los médicos, así como la comunidad científica en general, pensaron que el fin de la enfermedades infecciosas había llegado [67]. De hecho, los microbiólogos estaban tan convencidos que asumieron que la evolución de la resistencia a antibióticos era poco probable ya que frecuencia de mutación de las bacterias era despreciable [68]. Lamentablemente, el tiempo ha demostrado que fueron excesivamente optimistas respecto al panorama que se presentaba. Nadie pudo anticipar la gran variedad de mecanismos que las bacterias tienen para evolucionar. Es por ello que entender las respuestas fisiológicas bacterianas que promueven la variabilidad genética es crucial para frenar la expansión de las resistencias [69], [70]. 46
Capítulo II.I NAC como inhibidor de la mutagénesis mediada por CIP. Introducción - Antibióticos como promotores de la mutagénesis: inducción del sistema SOS y estrés oxidativo. Las evidencias indican que los antibióticos, especialmente cuando están presentes en concentraciones subletales, son responsables del aumento en variabilidad genética, y por tanto, participan en la aparición de resistencias antimicrobianas. Los efectos secundarios de los antibióticos sobre la variabilidad genética pueden ser causados por diferentes vías: aumentando los niveles de radicales libres o estrés oxidativo en el interior celular, induciendo las polimerasas propensas a error reguladas por la respuesta SOS, provocando el desbalance del metabolismo de los nucleótidos o mediante la acción directa sobre el ADN [6]. En algunos casos, la respuesta fisiológica de la célula está directamente relacionada con el mecanismo del antibiótico. Éste sería el caso de la respuesta SOS, una respuesta genética coordinada al daño en el ADN. Muchos antibióticos, como por ejemplo las quinolonas, producen daño directo en el ADN. En concreto, CIP provoca el estancamiento de la horquilla de replicación mediante el bloqueo de la ADN girasa, causando muerte celular [71]. El resultado es la producción de roturas de doble hebra (Double Strand Breaks, DSB del inglés) que son procesadas a hebra simple de ADN (en inglés Single Strand DNA, ssDNA), señal que activa la respuesta SOS. La abundncia de ssDNA no es más que el primer nivel de regulación de este sistema. El segundo nivel está basado en la regulación transcripcional, llevada a cabo por la interacción de las proteínas RecA y LexA. RecA se une al ssDNA formando el filamento nucleoproteico RecA-ssDNA (figura 20). Este filamento, además de mediar la recombinación, es capaz de activar la capacidad autoproteolítica de LexA, el represor del sistema SOS [34] dando lugar a dos cadenas polipeptídicas sin actividad, liberando la expresión del sistema . En ausencia de daño en el ADN, el represor LexA se mantiene unido en forma homodimérica a una secuencia denominada caja SOS situada en la región operadora de los genes del sistema [72]. 47
Una vez activada dicha respuesta, el sistema regula la expresión de más de 40 genes. Entre ellos se incluyen genes que codifican para proteínas que llevan a cabo el tercer nivel de regulación del sistema, o regulación postranscripcional (figura 16). Por ejemplo, RecX actúa bloqueando la extensión del filamento nucleoproteico durante su ensamblaje [73] o RdgC que inhibe, al menos in vitro, la autoproteolisis de LexA [74]. En los primeros momentos de la inducción SOS se activa la transcripción de genes cuya función es reparar lesiones en el DNA de manera no mutagénica, como el sistema de reparación por escisión de nucleótidos (NER, del inglés, nucleotide excision repair), compuesto por los genes uvrA, uvrB y uvrD [75]. Pero si el daño persiste, se activan ADN polimerasas especializadas capaces de replicar el DNA incluso cuándo la hebra molde está muy dañada. Se denominan polimerasas propensas a error y llevan a cabo la síntesis de translesión (en inglés, DNA translesion synthesis, TLS). TLS es el mecanismo por el cual el ADN seriamente dañado puede ser replicado con el coste de una reducida fidelidad. En E. coli, las ADN polimerasas encargadas de lidiar con dicha situación con Pol II, Pol IV y Pol V, codificadas respectivamente por los genes polB, dinB y umuDC [76]. 48 Figura 20. Inducción y control de la expresión del regulón SOS. La presencia de ssDNA es la señal que dispara la inducción del sistema. RecA (representado por círculos rojos) polimeriza sobre él, lo que desencadena la autoproteólisis del represor del sistema, LexA (hexágonos azules). Esto libera la represión de los genes SOS (en el diagrama genéricamente identificados por la etiqueta “SOS”), entre los que se encuentran lexA y recA. Otras proteínas con efecto regulador, se han señalado en el diagrama con flechas rojas. Adaptada de la tesis doctoral de Jerónimo Rodróguez Beltrán.
Sin embargo, la respuesta fisiológica de las bacterias a los antibióticos no siempre está directamente relacionada con el mecanismo de acción. Por ejemplo, se ha demostrado que algunos antibióticos bactericidas producen una perturbación en la homeostasis redox del interior celular. La causa de dicha perturbación es el aumento de la tasa de respiración intracelular acompañada por la desestabilización de los complejos Hierro- Azufre, los cuales conducen a la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS, del Inglés Reactive Oxigen Species) por la reacción química de Fenton [77]–[79], capaces de oxidar componentes celulares fundamentales, incluyendo proteínas, lípidos y el ADN. Las especies reactivas del oxígeno se han propuesto como una causa común de la muerte bacteriana producida por antibióticos de diversas familias [78]–[80], aunque otra parte de la comunidad científica discute dicho argumento [81], [82]. Lo cierto es que la oxidación del ADN por ROS produce una gran variedad de lesiones que, si no son reparadas, son mutagénicas y pueden causar a muerte celular [83], [84]. Teniendo en cuenta todo esto, en este capítulo estudiamos la interrelación entre dos rutas implicadas en el aumento de mutagénesis mediada por antibióticos: TLS mediada por la respuesta SOS y la mutagénesis inducida por ROS. Demostramos que estas dos rutas no son independientes sino que están íntimamente relacionadas. Además, ROS actúa como buen inductor de la respuesta SOS ya que producen daño en el ADN de manera directa [85]–[87]. De manera que la replicación del ADN dañado mediada por la respuesta SOS puede estar inducida por la presencia de daño oxidativo, tanto en el “pool” de nucleótidos como en el ADN propiamente [88], [89]. - Antioxidantes como inhibidores de la mutagénesis mediada por antibióticos. Una de las evidencias más claras de la relación entre el estrés oxidativo y la inducción de la respuesta SOS está recopilada en diversos estudios en los que se propone que el tratamiento con moléculas antioxidantes puede atenuar la inducción de la misma [90]–[93]. 49
En la figura 26 se muestra la fluorescencia emitida por 30.000 células tratadas con ½CMI de CIP, 0,5% NAC o ambos compuestos en combinación. Como cabría esperar, el tratamiento con CIP incrementa los niveles de ROS con respecto al control no tratado. Dicha inducción de ROS es revertida en presencia de NAC, alcanzando niveles cercanos al basal. Este resultado sugiere que NAC, reduciendo los niveles de ROS producidos por la exposición a CIP, podría disminuir en consecuencia el daño en el ADN y por tanto la inducción de la respuesta SOS. - NAC inhibe la respuesta SOS a través de la reducción de los niveles de ROS. A pesar de que los resultados mostrados anteriormente indican que la capacidad antioxidante de NAC podría estar detrás de su efecto sobre la inducción de la respuesta SOS, no podemos descartar otras posibilidades. NAC podría interferir en la actividad de la maquinaria reguladora del SOS, por ejemplo, inhibiendo la formación del filamento de 56 Figura 26. NAC reduce la producción de ROS intracelular mediada por CIP. Los niveles de ROS tras 8 horas de tratamiento con CIP, NAC o ambos en combinación se analizaron en 30.000 células midiendo la fluorescencia emitida por la oxidación de la sonda H 2 DCFDAmediante citometría de flujo. Los controles sin tratar se muestran como referencia. a) Gráfico de puntos para mostrar la distribución de la fluorescencia en las diferentes poblaciones tras el tratamiento. Al menos el 99% de los eventos capturados aparecen en el gráfico. La escala de colores nos da información sobre la densidad celular en cada nivel de fluorescencia. b) Para una comparación más detallada, los datos de 0 a 100 Unidades de fluorescencia se muestran en diagrama de cajas en los cuales la barra horizontal representa la mediana, la profundidad de las cajas el rango intercuartílico (RI, 50% de la población), y las barras de error se extienden hasta 0,5 veces RI.
RecA sobre la hebra simple de ADN (figura 3), o impidiendo la autoproteolisis de LexA. represor del sistema. Si fuera así, la NAC debería reducir la inducción de la respuesta SOS incluso cuando el daño es independiente los niveles de ROS. Para probar esta posibilidad, medimos la inducción de la respuesta SOS en la cepa de E. coli SMR14354 [107], [108], que porta en su cromosoma un sitio de corte único para la enzima I-SceI, cuya expresión está regulada por L-Arabinosa (Ara). La producción de dicha enzima en presencia de Ara genera cortes de doble hebra en el ADN y, por consiguiente, induce la respuesta SOS (figura 27). En primer lugar quisimos confirmar que la producción de cortes en el ADN por I-SceI no incrementa de forma colateral los niveles de ROS. Mediante citometría de flujo cuantificamos la oxidación de la sonda fluorescente H 2 DCFDA en presencia de CIP, ARA o en combinación (figura 28B). 57 Figura 27. Representación esquemática del diseño experimental. Para generar DSB in vivo, la cepa SMR14354 lleva un sitio único de corte (triángulo rojo) para la enzima I-SceI (tijeras) situado cerca del OriC, cuya expresión es inducida por L- arabinosa (ARA). Figura 28. Los DSBs generados por cortes I-SceI inducen la respuesta SOS sin aumentar los niveles de ROS. a) El tratamiento con Ara 0,1% genera DSBs que a su vez inducen la respuesta SOS(curva amarilla). El tratamiento con NAC solo (curva azul) o en combinación con Ara (curva verde), no altera la inducción de la respuesta SOS. Las barras de error representarían la desviación estándar, no mostradas por ser más pequeñas que los puntos del gráfico. El panel superior muestra la densidad óptica (D.O.) a 595nm bajo las mismas condiciones b) Niveles de ROS detectados en una población de 30.000 células mediante citometría de flujo midiendo la oxidación de la sonda fluorescente H 2 DCFCA. No se observa aumento significativo de ROS tras la inducción de DSBs durante 8 horas.
Una vez comprobado los cortes con I-SceI no tiene un efecto significativo sobre la producción de ROS, medimos la inducción del SOS a diferentes tiempos después de la inducción de los cortes de doble hebra en el ADN. Los resultados demuestran que el tratamiento con NAC no causa una inhibición detectable de la respuesta SOS, lo que indica que la inhibición del SOS mediante NAC es dependiente de ROS (figura 28B) (Ttest Ara Vs Ara+NAC no significativo, P= 0,5562; t= 0,6414; df= 4). Aunque está descrito que las condiciones experimentales usadas para este ensayo cusan al menos un corte de doble hebra en el 90% de las células, y más de uno en el 50% de ellas [108], la inducción de la respuesta SOS es menor que la causada por 8 ng/ml de CIP (6 veces respecto a 14 veces). Una explicación alternativa para nuestros resultados podría ser que NAC no fuera capaz de disminuir bajos niveles de inducción de la respuesta SOS. Para descartar esta posibilidad y ver si NAC es capaz de inhibir la inducción a niveles de SOS similares a los obtenidos con los cortes I-SceI, decidimos probar el efecto de NAC en cultivos tratados con bajas concentraciones de CIP. Los resultados muestran que NAC es capaz de reducir la respuesta SOS mediada por CIP en todas las concentraciones testadas (figura 29, ANOVA positivo, comparaciones múltiples Tukey Pvalor<0,005 en todos los casos). 58
- NAC reduce la mutagénesis inducida por CIP y mediada por la respuesta SOS. El incremento de la mutagénesis mediado por quinolonas se atribuye a la actividad de las polimerasas propensas a error (TLS), cuya transcripción se induce como parte del sistema SOS [35], [76]. Sin embargo, el aumento de los niveles de ROS es también una causa importante del aumento en la mutagénesis [83], [84], por tanto sería interesante caracterizar la contribución de cada uno de estos mecanismos. Con este fin, analizamos la tasa de mutación en presencia de CIP en dos cepas: IBDS1 y su derivaba TLS - , que carece de los genes que codifican para las tres polimerasas propensas a error: polB, dinB y umuDC [98]. En primer lugar, verificamos que la cepa TLS - presenta niveles de ROS y de inducción de SOS similares a los de la cepa silvestre IBDS1 tras el tratamiento con CIP, NAC o ambos en combinación (figura 30). Las tasas de mutación de las poblaciones tratadas con CIP muestran que hay un incremento de la mutagénesis en ambas cepas, IBDS1 y TLS - , en los dos marcadores usados: Rifampicina (RIFR) y Tetraciclina (TETR). Sin embargo dicho incremento es mucho menor en esta última (figura 31). Este resultado indica que una fracción de la mutagénesis mediada por CIP es independiente de la acción de las polimerasas propensas a error. 59 Figura 30. Los niveles de ROS e inducción SOS son similares en la cepa silvestre y su derivbada TLS - . a) representación de la fluorescencia obtenida mediante la monitorización de la oxidación de la sonda H2DCFDA por citometría de flujo. Las cajas representan el rango intercuartílico (RI, 50% de la población), las barras de error se extienden a lo largo de 0,5 RI, y la línea horizontal representa la mediana. b) crecimiento (D.O. 595nm) e inducción de la respuesta SOS de la cepa TLS - tratada con CIP, NAC o ambos en combinación. Cada uno de los puntos representan la media de tres réplicas biológicas, las barras de error se extienden a lo largo de la desviación estándar. En todos los casos (a y b) los tratamientos se corresponden con CIP 8ng/ml (amarillo), NAC 0,5% (azul), ambos en combinación (verde) y control sin tratar (gris).Los resultados son similares a los obtenidos en la cepa silvestre.
Cuando se trató la cepa silvestre IBDS1 con CIP en combinación con NAC, la mutagénesis para ambos marcadores disminuye hasta un 40% (figura 31A), lo que resalta la importancia de ROS como un importante inductor de la mutagénesis mediada por CIP. En la cepa TLS - , dicho aumento de la mutagénesis mediado por CIP no varía en el tratamiento combinado CIP+ NAC, indicando que la mutagénesis independiente de las polimerarsas propensas a error es también independiente de ROS (figura 31B). En conjunto estos resultados muestran que, bajo el tratamiento con CIP, las polimerasas propensas a error en una cepa silvestre de E. coli actúan de forma sinérgica con ROS dando lugar a una ruta compleja que da lugar a la mutagénesis. En consecuencia, y como muestran nuestros resultados, la disminución de ROS mediante el tratamiento con NAC causa una reducción de la mutagénesis alcanzando niveles similares a los obtenidos en la cepa TLS - . 60 Figura 31. NAC reduce la mutagénesis mediada por CIP en la cepa silvestre pero no en su derivada TLS - . Las cepas silvestre (a) y TLS- (b) se trataron durante 8 horas con 8ng/ml de CIP y NAC al 0,5% o ambos en combinación. Tras 20 horas de recuperación en medio sin tratamientos se calcularon las tasas de mutación usando rifampicina (amarillo) o tetraciclina (azul) como marcadores selectivos. Las diferencias se consideran estadísticamente significativas cuando las barras de error (IC 95%) no solapan.
Discusión. Los antibióticos pertenecientes al grupo de las fluoroquinolonas provocan daño en el ADN mediante el bloqueo de la horquilla de replicación [71], induciendo de manera directa la respuesta SOS y por tanto la acción de las polimerasas propensas a error, con el consiguiente aumento de la mutagénesis [76], [109]. Además los antibióticos bactericidas aumentan los niveles de ROS [77], [79], [89], dañando el ADN y pudiendo actuar a su vez como inductores de la respuesta SOS [80], [84]. Sin embargo la contribución relativa de ambos procesos en el aumento de la tasa de mutación promovida por antibióticos no está clara. Nuestros resultados muestran que la reducción de los niveles de ROS debida al tratamiento con el antioxidante NAC inhiben parcialmente la inducción de la respuesta SOS. Dicho efecto era en cierta manera previsible ya que, como es sabido, ROS es un buen inductor de la respuesta SOS [85]–[87]. Sin embargo, la magnitud del efecto observado en este trabajo, como por ejemplo la reducción de hasta el 75% de la inducción de la respuesta SOS cuando tratamos con NAC, sugiere que ROS es el contribuyente principal en la activación de la respuesta SOS mediada por fluoroquinolonas. Esta idea correlaciona con los resultados obtenidos en el análisis de la mutagénesis, en los cuales de observa una reducción significativa (pero no eliminación) de la tasa de mutación mediada por CIP en la cepa silvestre en presencia de NAC. Dicha reducción equipara los valores de tasa de mutación en la cepa silvestre a los obtenidos en su derivada TLS - , sugiriendo que la mutagénesis residual inducida por CIP es independiente de la reparación llevada a cabo por las polimerasas propensas a error. De acuerdo con esta hipótesis, los resultados obtenidos muestran un incremento en mutagénesis mediada por CIP en la cepa TLS - , corroborando lo descrito en un trabajo publicado en 2016 en el cual describen un aumento en la frecuencia de inserciones/deleciones al tratar con CIP una cepa carente de polimerasas propensas a error [110]. Todos estos resultados refuerzan la existencia de una vía alternativa de inducción de la mutagénesis independiente de TLS. Pomerantz et al. sugirieron que la polimerasa Pol I podría actuar como polimerasa propensa a error en los heterodúplex mediados por RecA (llamados D- loops en inglés) producidos en la reparación mediante recombinación de los cortes de doble hebra [111]. Por tanto, podría ocurrir que los cortes en el ADN generados por la 61
acción de CIP aumenten la creación de estos heterodúplex con la consecuente intervención de Pol I y su contribución en el aumento en la mutagénesis. Si este mecanismo es independiente de ROS tal y como se piensa, podría explicar la mutagénesis independiente de TLS que muestran los datos obtenidos en este trabajo. Además este trabajo podría tener una aplicación clínica más allá de entender los mecanismos que subyacen en el aumento de la mutación mediada por el tratamiento antibiótico. NAC podría usarse como adyuvante en el tratamiento con CIP, reduciendo la aparición de resistencias y por tanto mejorando la efectividad del antibiótico a corto y largo plazo. A su favor está el hecho de ser una molécula conocida, segura clínicamente, aprobada por la FDA y usada para el tratamiento de diversos trastornos [97]. En este capítulo se ha demostrado que concentraciones de NAC alcanzables a nivel fisiológico inhibe la respuesta SOS sin comprometer la actividad bactericida de CIP. Por el contrario, se ha descrito que NAC en sí mismo presenta actividad antibacteriana contra Helicobacter pylori [103] Haemophilus influenze [104] y contra las biopelículas formadas por Pseudomonas aeruginosa [105]. Desde un punto de vista clínico, la inhibición de la respuetsa SOS podría conllevar algunos beneficios más allá de la reducción de la mutagénesis. Por ejemplo, la filamentación, proceso controlado por la respuesta SOS, es crucial para el desarrollo de algunas infecciones bacterianas como las del tracto urinario [112]. De ahí que la inhibición de la filamentación haya sido propuesta como diana terapéutica para mejorar el pronóstico de infecciones bacterianas. En este sentido, los resultados de este capítulo muestran que NAC disminuye significativamente la fracción de células filamentadas durante el tratamiento antibiótico. Por tanto, NAC se podría usar como inhibidor del SOS cuyos efectos beneficiosos van más allá de reducir la mutagénesis mediada por el tratamiento antibiótico. En un contexto más amplio, nuestro trabajo abre nuevas vías para la investigación de moléculas antioxidantes como inhibidores potenciales de la respuesta SOS, reduciendo el desarrollo de resistencias bacterianas, así como disminuyendo la patogenicidad sin afectar a la actividad del antibiótico. 62
Capítulo II.II Búsqueda y caracterización de inhibidores del sistema SOS en la naturaleza. Introducción - Inhibición del sistema SOS como estrategia contra la aparición de resistencias a antibióticos. Como hemos comentado a lo largo de esta tesis, los antibióticos tienen un papel relevante en el aumento de la variabilidad genética bacteriana [6]. La mutagénesis mediada por concentraciones subletales de antibiótico puede ser inducida de varias formas, entre ellas el aumento de estrés oxidativo por la producción de ROS [84] y o la inducción de la respuesta SOS, que conlleva la expresión de las polimerasas propensas a error [113]. Ambas vías no son independientes, por el contrario, nuestros resultados obtenidos con concentraciones subletales de CIP muestran que existe una estrecha relación entre ellas. La mutagénesis no siempre es producto del mecanismo de acción de los antibióticos, CIP produce DSBs mediante el bloqueo de la ADN girasa y a su vez aumenta los niveles de ROS producto de la reacción de fenton [77], [79], [89]. ROS actúa como inductor de la respuesta SOS [85], contribuyendo en gran medida a la mutagénesis mediada por las polimerasas propensas a error, según los resultados obtenidos en el capítulo anterior. Además, el antioxidante NAC reduce de la mutagénesis mediada por CIP sin afectar a la capacidad bactericida del mismo, inhibiendo la respuesta SOS y por tanto el efecto mutagénico de las polimerarsas propensas a error. Teniendo en cuenta todo lo anterior, la inhibición indirecta de la respuesta SOS mediante el uso de moléculas antioxidantes como adyuvantes en el tratamiento antibiótico podría ser una buena estrategia para reducir la aparición de resistencias bacterianas. Con este fin, nuestro laboratorio realizó un escrutinio en colaboración con la Fundación Medina en Granada para buscar posibles sustancias inhibidoras de la respuesta SOS entre una colección de más de 50.000 extractos naturales procedentes de hongos. La metodología usada para inducir y monitorizar la respuesta SOS está basada en la aproximación experimental llevada a cabo en el laboratorio para este tipo de ensayos: detectar los niveles de fluorescencia emitidos por el plásmido pSC101 PrecA::GFP en 63
presencia de concentraciones subletales de CIP. Dicho plásmido contienen una fusión transcripcional del promotor nativo del gen recA y la proteína fluorescente verde GFP, de forma que cuando se activa la transcripción de recA se produce la emisión detectable de fluorescencia. En primer lugar se procedió a validar las condiciones en las que llevaría a cabo el experimento a gran escala, ajustando parámetros relevantes como la concentración de CIP óptima para la inducción de la respuesta SOS o el tamaño del inóculo, y llevando a cabo un proceso de minimización del ensayo hacia volúmenes de cultivo menores (lo cual supone un considerable ahorro de recursos). Una vez elegidas las condiciones más favorables para llevar a cabo el cribado de alta densidad se procedió a realizar el ensayo utilizando más de 3.000 extractos naturales diferentes. Los extractos se obtienen a partir de fermentaciones de hongos y actinomicetos aislados de substratos variados y múltiples orígenes geográficos, dotando a la colección de una gran diversidad, tanto filogenética como química. De los más de 3.000 extractos analizados usando una dilución estándar 1:50, se encontraron 142 que presentaron al menos un 60 por ciento de inhibición de la respuesta SOS. En la segunda fase del escrutinio se procedió a probar los extractos positivos (142) en a 5 concentraciones distintas de extracto (1:5, 1:50, 1:100, 1:200 y 1:400). El objetivo de dicho cribado es seleccionar como candidatos aquellos compuestos que mostraran una buena relación dosis/respuesta, es decir, a mayor concentración del extracto mayor inhibición de la respuesta SOS. Sólo 6 extractos se obtuvieron como candidatos en esta segunda fase. Una vez confirmada la actividad de los 6 extractos obtenidos como candidatos se prepararon para la siguiente fase: fraccionamiento, análisis de la actividad de las fracciones e identificación del/los compuestos presentes en las fracciones, como responsables potenciales de la actividad inhibitoria. Como resultado se obtuvieron 5 compuestos, dos de ellos antioxidantes conocidos perteneciente al grupo de los flavonoides. 64
Los flavonoides son metabolitos secundarios de plantas y hongos cuya estructura química común consiste en un esqueleto de 15 carbonos distribuidos en dos anillos fenolicos (figura 32. Anillos A y B) y un anillo heterocíclico (figura 32. anillo C). Están distribuidos en diferentes subclases en función de la posición en la que el anillo B se une al C, y en función del grado de insaturación y oxidación de éste último [114]. Gracias a sus propiedades antioxidantes, antimutagénicas, antinfamatorias y anticarcinogénicas, además de su capacidad para modular la actividad de enzimas claves en la célula, se les asocia con una amplio espectro de efectos promotores de la salud y son un componente indispensable en complementos nutricionales, productos farmaceuticos y cosmética [114]. La inhibición de la respuesta SOS mediada por CIP usando Baicaleína, un flavonoide perteneciente al subgrupo de las flavonas (figura 32) fue descrita en Staphilococcus aureus por Peng, Q. et al. Y es atribuida a su capacidad antioxidante [94]. Los dos compuestos potenciales inhibidores de la respuesta SOS obtenidos en el escrutinio son genisteína (GNT) y daidzeína (DDZ), pertenecientes al subgrupo de las isoflavonas. A ambos se les atribuye capacidad estrogénica, debido a su similitud en estructura con dicha molécula, es capaz de unirse a receptores de estrógeno imitando los efectos del mismo [115], [116]. Poseen una gran capacidad antioxidante, una de las reivindicaciones más importantes en ingredientes alimenticios, complementos nutricionales y productos anticancerígenos. Además, el alto poder antioxidante del 65 Figura 32. Representación esquemática de la estructura química general de las flavonas e Isoflavonas en la parte superior. En la parte inferior estructura química de la Baicaleína y de los dos compuestos a caracterizar en este capítulo: Genisteína y Daidzeína.
Discusión. Con el objetivo de encontrar inhibidores de la respuesta SOS como estrategia contra la aparición de resistencias bacterianas, se llevó acabo un escrutinio en colaboración con la Fundación Medina en Granada. De dicho escrutinio se se obtuvieron varios candidatos, dos de ellos bastante interesantes por su naturaleza antioxidante: genisteína (GNT) y daidzeína (DDZ), pertenecientes al grupo de las isoflavonas. A ambos compuestos se les atribuyen diversas propiedades, son componentes esenciales en complementos alimenticios, y además se han propuesto como posible tratamiento de enfermedades crónicas de distinta índole[114], [117]. Otros flavonoides como la hesperidina, perteneciente al subgrupo de las flavonas al igual que la baicaleína, ya se usan como medicamento en el tratamiento de trastornos en el retorno venoso. Por todas estas razones pensamos que GNT y DDZ podrían ser buenos candidatos como adyuvantes en el tratamiento antibiótico. La caracterización de ambos compuestos llevada a cabo en este capítulo indica que, tanto GNT como DDZ inhiben el 40% la respuesta SOS mediada por CIP, 10% menos que los resultados obtenidos con NAC. Sin embargo, por limitaciones de solubilidad, la concentración de GNT y DDZ presente en el medio es mucho menor que la concentración de NAC con la que se llevó a cabo la caracterización (50 µg/ml vs 5mg/ml, 100 veces menor). Esta diferencia de efecto con respecto a dosis podría deberse a la propia naturaleza del compuesto y a su capacidad antioxidante. Además en el tratamiento GNT+ CIP ó DDZ+ CIP se observa una reducción de la tasa de mutación para los dos marcadores testados en la cepa silvestre IBDS1, de un 45% en el tratamiento combinado con GNT y un 35% con DDZ. Sin embargo, no se observan diferencias significativas en tasa de mutación en la derivada TLS -, lo que indica que la mutagénesis elimiada por los flavonoides es consecuencia de la acción de las polimerasas propensas a error, y por tanto tiene su origen en la inducción de la respuesta SOS. Así mismo, los dos compuestos disminuyen los niveles de ROS producidos por CIP en la cepa IBDS1. Teniendo en cuenta todo lo anterior pensamos que, como en el 72
tratamiento con CIP+ NAC, es el efecto antioxidante de los flavonoides el que inhibe la inducción de la respuesta SOS mediante la reducción de la producción de ROS intracelular provocada por el tratamiento antibiótico, disminuyendo de esta forma la mutagénesis asociada a la acción de las polimerasas propensas a error. 73
Material y métodos - Cepas, plásmidos y medios de cultivo. Los experimentos de tasa de mutación, así como las curvas de crecimiento y los ensayos de citometría se llevaron a cabo con la cepa de E. coli MG1655 attλ::cI (Ind -) λpR tet Δara::FRT ΔmetRE::FRT, llamada IBDS1, y su derivada carente de polimerasas propensas a error (TLS - ). Las mutaciones que inactivan el gen represor λ cI (Ind -) permiten la expresión del gen λpRtetA, que confiere resistencia a TET [98]. La cepa SMR14354 (E. coli MG1655 ΔaraBAD567 Δattλ::PBADI-SceI zfd2509.2::PN25tetR FRT ΔattTn7::FRT catFRT PN25tetOgam-gfp) se usó para medir la inducción de la respuesta SOS mediada por DSB. Dicha cepa porta un único sitio de corte para I- SceI cerca del OriC del cromosoma bacteriano, y su expresión está regulada por el promotor inducible por arabinosa Para [108]. El plásmido PSC101-PrecA::gfp [100] se usó para monitorizar la inducción de la respuesta SOS mediante fluorescenccia. Las cepas se incubaron en medio LB Broth, suplementado en algunos casos con CIP (a diferentes concentraciones), Kanamicina (KAN; 30µg/ml), Ara 0,1% v/v o NAC 0,5% v/v. - CMI e isobolograma. La concentración mínima inhibitoria (CMI), así como el isobolograma para analizar una posible interacción entre CIP y los compuestos testados (NAC, GNT, DDZ y DMSO) se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos. Cada pocillo contiene 10 5 células de E. coli en fase exponencial en 100µl de LB suplementado con CIP, NAC, o ambos en combinación para la caracterización del efecto de dicho compuesto. En el caso de los flavonoides las CMIs se llevaron a cabo en presencia de CIP en combinación con GNT 50µg/ml, DDZ 50µg/m y DMSO 0,5% v/v. Las placas se incubaron a 37ºC durante 20 horas. Para el isobolograma se determinó la absorbancia a 595 nm mediante un espectrofotómetro TECAN infinite® F200 tras 20 horas de incubación a 37ºC. - Inducción de la respuesta SOS Los ensayos de inducción de la respuesta SOS se llevaron a cabo a partir tres cultivos independientes incubados durante la noche de la cepa portadora del plásmido PSC101- 74
PrecA::gfp. Diluciones 1:100 de dichos cultivos en 5 ml de LB suplementado con KAN se incubaron hasta fase exponencial avanzada (D.O. 600 0,5-0,6) a 37ºC y 200 r.p.m. a este paso le sigue una nueva dilución 1:50 en LB+KAN. Alícuotas de 2ml se trataron con CIP, NAC, GNT, DDZ, DMSO o en las combinaciones apropiadas a diferentes concentraciones, durante 8 horas a 37ªC y 250 r.p.m. Dicho procedimiento se llevó a cabo de la misma manera con la cepa SMR14354, añadiendo 0,1% v/v de Ara en vez de CIP como inductor del SOS. En cada experimento se incluyeron tres réplicas de controles sin tratamiento. La monitorización de la absorbancia a 595 nm y la fluorescencia GFP (485/520 nm) se llevó a cabo mediante el lector de placas TECAN infinite® F200. La inducción del SOS se obtuvo normalizando la fluorescencia bruta por la absorbancia en cada una de las muestras. Para determinar el incremento con respecto al control no tratado, la media de la inducción SOS de tres réplicas por cada condición se dividió por el valor medio de las muestras no tratadas. - Citometría de flujo. Para medir los niveles intracelulares de ROS usamos la sonda fluorescente 2’, 7’- Diclorofluoresceína diacetato (H 2 DCFDA, Sigma-Aldirch). Diluciones 1:100 de cultivos de la noche en 5 ml de LB suplementado con 100µg/ml de H 2 DCFDA se llevaron hasta fase exponencial (D.O. 600 0,5-0,6) incubando a 37ºC y 200r.p.m.controles de cada condición sin sonda se añadieron para monitorizar la autofluorescencia. Alícuotas de 2ml a partir una dilución 1:50 de ambos cultivos (con y sin H 2 DCFDA) se tratan con 8ng/ml de CIP , NAC 0,5%, GNT 50 µg/ml, DDZ 50 µg/ml, o en las combinaciones apropiadas de CIP+ compuesto. Para determinar si los cortes de doble hebra aumentan los niveles de ROS intracelular, los cultivos se trataron con 0,1% de ARA en vez de CIP. El tratamiento se llevó a cabodurante 8 horas a 37ºC y 250 r.p.m. La fluorescencia verde emitida por la oxidación intracelular de la sonda se midió usando un citómetro guava easyCyte (Millipore). Para cada condición se analizaron tres réplicas de 10.000 eventos cada una, con una concentración de 200-400 células/µl. Para el análisis de la filamentación, el parámetro forward scatter (que mide tamaño celular) se determinó en cada condición en las muestras sin H 2 DCFDA. El tratamiento de datos y la representación de los mismo se llevaron a cabo mediante algoritmos diseñados en R (www.R-project.org/). 75
- Microscopía. Los cultivos se trataron con CIP, NAC o ambos de la misma manera que en los ensayos de tasa de mutación (ver más abajo). Tras 8 horas de tratamiento, un frotis de cada muestra se preparó de la siguiente forma: 10 µl de cultivo se extendieron en un portaobjetos con un asa, posteriormente se fijó la muestra con calor y se tiñó con safranina durante 1 minuto. Posteriormente las muestras se lavaron con abundante agua destilada. La observación de los filamentos se llevó a cabo bajo el objetivo 100X de un microscopio Olympus BX61. - Ensayos de tasa de mutación. Los ensayos de tasa de mutación se llevaron a cabo a partir tres cultivos independientes incubados durante la noche de la cepa IBDS1 o su derivada TLS -. Diluciones 1:100 de dichos culivos en 5 ml de LB suplementado se llevaron hasta fase exponencial (D.O. 600 0,5-0,6) a 37ºC y 200 r.p.m. A este paso le sigue una nueva dilución 1:50 en LB. Alícuotas de 2ml se trataron con CIP, NAC, GNT, DDZ o en las combinaciones apropiadas a diferentes concentraciones, durante 8 horas a 37ªC y 250 r.p.m. durante 8 horas. Una vez trascurrido este tiempo, 1ml de cada muestra se centrifugó durante 6 min a 8000 r.p.m. Las células se resuspendieron en nuevo LB y se incubaron durante 20 horas a 37ºC y 200 r.p.m. para la resolución de los filamentos provocados por el tratamiento antibiótico. Se sembraron diluciones apropiadas de cada cultivo se en placas de LB suplementado con TET 15 µg/ml o RIF 100 µg/ml como marcadores selectivos, y en LB agar para el cálculo de viables. Las placas se incubaron durante 24 horas. El número esperado de mutaciones por cultivo (m) y el intervalo de confianza del 95% se calcularon usando la estimación por máxima verosimilitud (maximum likelihood estimator, en inglés) mediante el programa rSalvador [119] para R (www.R-project.org/). Las tasas de mutación (mutaciones por célula y por generación) se calcularon dividiendo m por el número total de generaciones. Las diferencias se consideran estadísticamente significativas cuando los intervalos de confianza no solapan. 76
Discusión general Para frenar el auge de las bacterias resistentes a antibióticos, resulta imprescindible entender las bases moleculares por las cuales las bacterias adquieren dicha capacidad. En un esfuerzo por aportar nueva información al respecto, esta memoria recopila gran parte de los resultados obtenidos en tres líneas de investigación: los mecanismos de la hiperrecombinación, el efecto de los antibióticos sobre la conjugación bacteriana (y por tanto la propagación de resistencias) y la inhibición de la respuesta SOS como estrategia en la lucha contra la aparición de resistencias. La adquisición de mutaciones espontáneas en la zona QRDR de gyrA, no sólo disminuye la susceptibilidad de las bacterias a las quinolonas, como ácido nalidíxico y ciprofloxacino, sino que también promueve cambios en el estado de enrollamiento del ADN. La incapacidad de la ADN girasa para llevar a cabo su función de forma eficiente, eliminando el superenrrollamiento positivo acumulado en la parte delantera a la horquilla de replicación, produce cambios en el superenrrollamieto que pueden acabar con el estancamiento de dicho proceso. [21], [22]. Por otra parte, las cepas con sustituciones en GyrA en las posiciones Ser83 y Asp87 presentan un fenotipo hiperrecombinador. Es probable que el aumento en recombinación sea una herramienta para resolver el daño en la replicación provocado por los cambios en el enrollamiento [38], [39]. La hiperrecombinación se ha asociado a mayor patogenicidad y virulencia en Escherichia coli [30]. Rodríguez- Beltrán et al describieron que, las cepas patógenas extraintestinales (orina, sangre y otros aislados) se situaban en frecuencias de recombinación superiores a las cepas comensales aisladas de heces. Además, existe una correlación positiva entre la recombinación y el número de genes de virulencia. Por todo lo anterior, la adquisición de una mutación puntual en gyrA, y el aumento en recombinación asociado a la misma podría ser una ventaja evolutiva. Así mismo, la propagación de las resistencias es otro factor clave y constituye un nivel de actuación en la lucha contra la expansión de las resistencias a antibióticos. Las bacterias comparten información genética por medio de la conjugación. Uno de los 77
ambientes donde se dan las condiciones idóneas para fomentar el intercambio de material genético entre bacterias por medio de la conjugación es el intestino. El uso de los antibióticos en diversos ambientes se ha asociado con el auge y propagación de resistencias. Forslund y cols. [52], en un análisis del metagenoma de la microbiota del intestino para buscar las resistencias potenciales, describieron que las más abundantes son las resistencias a antibióticos que han estado más tiempo disponibles y los usados en ganadería, lo que refuerza la hipótesis “de la granja a la mesa” (en inglés fram-to-fork). Una de las formas por las que los antibióticos pueden promover la variabilidad genética es la transferencia horizontal de genes, la conjugación. Hasta ahora se se ha descrito que los antibióticos inducen la conjugación, aunque recientemente se ha publicado un estudio que difiere en esa postura y que asocian esos resultados a limitaciones técnicas de la aproximación experimental [63]. Sin embargo, las condiciones experimentales llevadas a cabo en ese estudio son difieren bastante de aquellas en las que la conjugación tiene lugar en la naturaleza. En un intento por aportar más información sobre el efecto que los antibióticos pueden tener en la propagación de resistencias se testó una amplia batería de antibióticos de diferentes grupos en un rango de concentraciones por encima y por debajo de la CMI, con una aproximación técnica similar a la que usaron Lopatkin et al. y unas condiciones de incubación y de densidad de población idóneas para que la conjugación se lleve a cabo. Aunque nuestros resultados corroboran que mayoritariamente los antibióticos no tienen un efecto significativo sobre la conjugación bacteriana, hay concentraciones y tipos de antibióticos en los que sí observamos diferencias con respecto al control no tratado. Sin embrago, dicho efecto no es de aumento sino de disminución en la eficiencia de conjugación. Nos obstante, según los resultados obtenidos, no podemos generalizar sobre un efecto concreto sino que debemos tener en cuenta el tipo de antibiótico y la concentración del mismo, así como la naturaleza del propio plásmido conjugativo. En un tercer nivel de actuación, y desde un punto de vista más aplicado, en esta tesis se ha llevado a cabo la caracterización de compuestos inhibidores del SOS como estrategia contra la aparición de resistencias, propuestos como adyuvantes en el 78
tratamiento antibiótico. Nuestros resultados demuestran que el estrés oxidativo provocado por la acción de los antibióticos es uno de los mayores contribuyentes en la inducción de la respuesta SOS, y que el tratamiento combinado antioxidante+antibiótico disminuye la producción de ROS y por tanto la mutagénesis mediada por antibióticos. 79
Conclusiones 1. La adquisición de mutaciones de resistencia a ácido nalidíxico en la zona QRDR de gyrA confieren fenotipo hiperrecombinador en aislados comensales de E. coli, de manera independiente al sistema SOS y asociado a cambios en el superenrrollamiento del ADN 2. En el efecto que los antibióticos tienen sobre la conjugación bacteriana y por tanto, sobre la propagación de resistencias, la diana y el mecanismo de acción del antibiótico en cuestión, así como la concentración, son factores determinantes. No tanto así el tipo de plásmido conjugativo. 3. Antibióticos que afectan a la integridad de la membrana, como CAZ y FOS, no parecen tener efecto sobre los niveles de conjugación. En contraposición, el tratamiento con antibióticos que afectan de forma directa o indirecta la síntesis de proteínas, como GEN, TET o RIF, podría inhibir la conjugación interfiriendo en la síntesis de proteínas involucradas en el proceso. 4. La producción de especies reactivas del oxígeno mediada por ciprofloxacino es uno de los principales inductores de la respuesta SOS. 5. Los antioxidantes N- acetil cisteína, genisteína y daidzeína inhiben la respuesta SOS a través de la reducción de los niveles de ROS y reducen la mutagénesis en la cepa silvestre IBDS1 pero no en su deribada TLS - . 6. Moléculas antioxidantes como N- acetil cisteína, genisteína y daidzeína, representan una posible una nueva familia de compuestos adyuvantes en el tratamiento antibiótico, abriendo un nuevo camino en la lucha contra las resistencias bacterianas. 80
Bibliografía [1] L. L. Ling et al., “A new antibiotic kills pathogens without detectable resistance,” Nature, vol. 517, pp. 455–459, 2015. [2] F. C. Cabello, “Heavy use of prophylactic antibiotics in aquaculture: A growing problem for human and animal health and for the environment,” Environ. Microbiol., vol. 8, no. 7, pp. 1137–1144, 2006. [3] S. Luria and M. Delbrück, “Mutations of Bacteria from Virus Sensitivity to Virus Resistance.,” Genetics, vol. 28, no. 6, pp. 491–511, 1943. [4] Joshua Lederberg and Esther M. Lederberg, “Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.,” J. Bacteriol., vol. 63, no. 3, pp. 399–406, 1952. [5] E. F. Mao, L. Lane, J. Lee, and J. H. Miller, “Proliferation of mutators in a cell population,” J. Bacteriol., vol. 179, no. 2, pp. 417–422, 1997. [6] J. Blázquez, A. Couce, J. Rodríguez-Beltrán, and A. Rodríguez-Rojas, “Antimicrobials as promoters of genetic variation,” Curr. Opin. Microbiol., vol. 15, no. 5, pp. 561–569, 2012. [7] A. Rodríguez-Rojas, J. Rodríguez-Beltrán, A. Couce, and J. Blázquez, “Antibiotics and antibiotic resistance: A bitter fight against evolution,” Int. J. Med. Microbiol., vol. 303, no. 6–7, pp. 293–297, 2013. [8] A. Couce and J. Blázquez, “Side effects of antibiotics on genetic variability,” FEMS Microbiol. Rev., vol. 33, no. 3, pp. 531–538, 2009. [9] J. H. B. and R. P. B. George Y. Lesher, Ernest J. Froelich, Monte D. Gruett, “1,8- Naphthyridine Derivatives. A New Class of Chemotherapeutic Agents,” J. Med. Chem., vol. 0, no. 1, pp. 1063–1065, 1962. [10] S. Heeb, M. P. Fletcher, S. R. Chhabra, S. P. Diggle, P. Williams, and M. Cámara, “Quinolones: From antibiotics to autoinducers,” FEMS Microbiol. Rev., vol. 35, no. 2, pp. 247–274, 2011. [11] D. T. Bearden and L. H. Danziger, “Mechanism of action of and resistance to quinolones.,” Pharmacotherapy, vol. 21, p. 224S–232S, 2001. [12] D. C. Hooper, “Mechanisms of action and resistance of older and newer fluoroquinolones,” Clin Infect Dis, vol. 31 Suppl 2, no. Suppl 2, pp. S24-8, 2000. [13] K. Drlica, M. Malik, R. J. Kerns, and X. Zhao, “Quinolone-mediated bacterial death,” Antimicrob. Agents Chemother., vol. 52, no. 2, pp. 385–392, 2008. 81
[92] Y. Oda, “Inhibitory effect of curcumin on SOS functions induced by UV irradiation,” Mutat. Res. Lett., vol. 348, no. 2, pp. 67–73, 1995. [93] Jürgen Müller and Siegfried Janz, “Modulation of the H202-lnduced S S Response in Escherichia coli PQ300 by Amino Acids , Metal,” Enviromental ans Mol. Mutagen., vol. 163, no. 1 993, pp. 157–163, 1993. [94] Q. Peng et al., “Baicalein Suppresses the SOS Response System of Staphylococcus Aureus Induced by Ciprofloxacin,” Cell. Physiol. Biochem. y Biochem., vol. 515041, pp. 1045–1050, 2011. [95] Y. H. Hwang, H. J. Yang, D. G. Kim, and J. Y. Ma, “Inhibitory Effects of Multiple-Dose Treatment with Baicalein on the Pharmacokinetics of Ciprofloxacin in Rats,” Phyther. Res., vol. 31, no. 1, pp. 69–74, 2017. [96] Y. Samuni, S. Goldstein, O. M. Dean, and M. Berk, “The chemistry and biological activities of N-acetylcysteine,” Biochim. Biophys. Acta - Gen. Subj., vol. 1830, no. 8, pp. 4117–4129, 2013. [97] I. Elbini Dhouib, M. Jallouli, A. Annabi, N. Gharbi, S. Elfazaa, and M. M. Lasram, “A minireview on N-acetylcysteine: An old drug with new approaches,” Life Sci., vol. 151, pp. 359–363, 2016. [98] I. Bjedov, C. N. Dasgupta, D. Slade, S. Le Blastier, M. Selva, and I. Matic, “Involvement of Escherichia coli DNA polymerase IV in tolerance of cytotoxic alkylating DNA lesions in vivo,” Genetics, vol. 176, no. 3, pp. 1431–1440, 2007. [99] A. Frenoy and S. Bonhoeffer, “Death and population dynamics affect mutation rate estimates and evolvability under stress in bacteria,” PLoS Biol., vol. 16, no. 5, pp. 1– 23, 2018. [100] M. Ronen, R. Rosenberg, B. I. Shraiman, and U. Alon, “Assigning numbers to the arrows: parameterizing a gene regulation network by using accurate expression kinetics.,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 99, no. 16, pp. 10555–60, 2002. [101] T. Do Thi et al., “Effect of recA inactivation on mutagenesis of Escherichia coli exposed to sublethal concentrations of antimicrobials,” J. Antimicrob. Chemother., vol. 66, no. 3, pp. 531–538, 2011. [102] U. Szkudlarek et al., “Effect of inhaled N-acetylcysteine on hydrogen peroxide exhalation in healthy subjects,” Pulm. Pharmacol. Ther., vol. 17, no. 3, pp. 155–162, 2004. [103] S. Jang, E. J. Bak, and J. H. Cha, “N-acetylcysteine prevents the development of gastritis induced by Helicobacter pylori infection,” J. Microbiol., vol. 55, no. 5, pp. 396–402, 2017. [104] G. Landini, D. Maggio, F. Sergio, J. Docquier, and M. Rossolini, “Effect of High N -Acetylcysteine Concentrations on Antibiotic Activity against a LArge Collection of 88
Respiratory Pathogens,” Antimacrobial Agents Chemother., vol. 60, no. 12, pp. 7513–7517, 2016. [105] T. Zhao and Y. Liu, “N-acetylcysteine inhibit biofilms produced by Pseudomonas aeruginosa,” BMC Microbiol., vol. 10, no. 1, 2010. [106] O. Huisman, R. D’Ari, and S. Gottesman, “Cell-division control in Escherichia coli: specific induction of the SOS function SfiA protein is sufficient to block septation.,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 81, no. 14, pp. 4490–4494, 1984. [107] H. Wimberly, C. Shee, P. C. Thornton, P. Sivaramakrishnan, S. M. Rosenberg, and P. J. Hastings, “R-loops and nicks initiate DNA breakage and genome instability in nongrowing Escherichia coli.,” Nat. Commun., vol. 4, p. 2115, 2013. [108] C. Shee et al., “Engineered proteins detect spontaneous DNA breakage in human and bacterial cells,” Elife, vol. 2013, no. 2, pp. 1–25, 2013. [109] A. R. Fernández De Henestrosa et al., “Identification of additional genes belonging to the LexA regulon in Escherichia coli,” Mol. Microbiol., vol. 35, no. 6, pp. 1560– 1572, 2000. [110] L. Y. Song et al., “The Mutational Consequences of Ciprofloxacin In Escherichia coli,” Antimicrob. Agents Chemother., no. August, p. AAC.01415-16, 2016. [111] R. T. Pomerantz, M. F. Goodman, and M. E. O’Donnell, “DNA polymerases are errorprone at RecA-mediated recombination intermediates,” Cell Cycle, vol. 12, no. 16, pp. 2558–2563, 2013. [112] B. Li, P. Smith, D. J. Horvath, F. E. Romesberg, and S. S. Justice, “SOS regulatory elements are essential for UPEC pathogenesis,” Microbes Infect., vol. 12, no. 8–9, pp. 662–668, 2010. [113] G. C. Walker, “Mutagenesis and more: umuDC and the Eschericia coli SOS response,” Genetics, vol. 148, pp. 1599–1610, 1998. [114] A. N. Panche, A. D. Diwan, and S. R. Chandra, “Flavonoids: An overview,” J. Nutr. Sci., vol. 5, 2016. [115] C. Duffy, K. Perez, and A. Partridge, “Implications of Phytoestrogen Intake for Breast Cancer,” CA. Cancer J. Clin., vol. 57, no. 5, pp. 260–277, 2007. [116] M. Messina, W. McCaskill-Stevens, and J. W. Lampe, “Addressing the soy and breast cancer relationship: Review, commentary, and workshop proceedings,” J. Natl. Cancer Inst., vol. 98, no. 18, pp. 1275–1284, 2006. [117] E. Miadoková, “Isoflavonoids - an overview of their biological activities and potential health benefits,” Interdiscip. Toxicol., vol. 2, no. 4, pp. 211–218, 2009. [118] S. D. S. Banjarnahor and N. Artanti, “Antioxidant properties of flavonoids,” Med. J. Indones., vol. 23, no. 4, pp. 239–244, 2014. 89
[119] Q. Zheng, “rSalvador: An R Package for the Fluctuation Experiment,” Genes| Genomes|Genetics, vol. 7, no. 12, pp. 3849–3856, 2017. 90