Implementação e validação do método de determinação do urânio por ICP-MS em águas de consumo humano e águas naturais (superficiais e subterrâneas)

Universidade do Minho Escola de Ciências João Manuel Lopes Oliveira Implementação e validação do método de determinação do urânio por ICP-MS em águas de consumo humano e águas naturais (superficiais e subterrâneas) outubro de 2023 Implementação e validação do método de determinação do urânio por ICP-MS em águas de consumo humano e águas naturais (superficiais e subterrâneas) UMinho | 2023 João Manuel Lopes Oliveira Universidade do Minho Escola de Ciências João Manuel Lopes Oliveira Implementação e validação do método de determinação do urânio por ICP-MS em águas de consumo humano e águas naturais (superficiais e subterrâneas) Dissertação de Mestrado Mestrado em Técnicas de Caracterização e Análise Química Trabalho efetuado sob a orientação da Dra. Ana Cristina Pereira de Castro e da Doutora Maria Dulce Silva Geraldo outubro de 2023 ii Direitos de autor e condições de utilização do trabalho por terceiros Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Licença concedida aos utilizadores deste trabalho Atribuic!ão - Não Comercial - Compartilha Igual CC BY-NC-SA https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ iii Agradecimentos Ao longo destes dois anos, e sobretudo na realização desta dissertação de Mestrado, pude contar com importantes apoios e incentivos de pessoas que não poderia deixar de nomear e mostrar a minha imensa gratidão. À empresa Águas do Norte, S.A. e ao Engenheiro Marco Silva, por darem a oportunidade de estagiar e criar um estágio no qual foi possível colocar em prática todos os conhecimentos adquiridos durante a formação académica, assim como possibilitar as condições necessárias para a realização deste trabalho. À minha orientadora, Professora Doutora Dulce Geraldo, expresso desde já o meu enorme reconhecimento por me ter aceite como seu estagiário, por toda a ajuda infindável, grande amizade, e por se ter mostrado sempre disponível durante todo o trabalho, assim como pela transmissão de conhecimentos científicos. À responsável técnica Dr. Ana Castro, orientadora destacada pela empresa, por ter despendido o seu tempo para me acompanhar ao longo de todo o processo experimental para que este fosse concluído com sucesso, e por me oferecer bons conselhos. A todos membros do laboratório, Carlos, Clara, Marília, Paulo, Patrícia Cruz, Patrícia Fernandes, Pedro, Raquel, Tiago, Zé Nuno, por me terem acolhido durante estes meses de estágio, pelo espírito de entreajuda sempre mostrado, e pelos bons momentos que me proporcionaram. A todos eles, desejo as maiores felicidades, tanto a nível profissional como pessoal. À minha Mãe e ao meu Pai, pelo amor, carinho, afeto e dedicação. Obrigado por terem feito de mim a pessoa que sou hoje, por estarem sempre presentes na minha vida, e por acreditarem em mim e no meu trabalho. À minha Irmã, pelo compreensão, força, apoio e por nunca me falhar nos momentos mais difíceis. Aos meus amigos de infância, Gabi, Guida, Bia e Xica, por estarem comigo desde o primeiro dia desta jornada e por sempre me apoiarem e se mostrarem prontas para me ouvirem. Aos meus amigos, em especial aos que conheci no Mestrado, Nuno, Diogo, Paula, Andreia, não esquecendo a minha Diana e a família “Pullum”, que nasceu na “Bila”. A todos eles, agradeço toda a amizade, companhia e motivação durante estes anos. A todos, o meu sincero e profundo Muito Obrigado! iv Declaração de integridade Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. v Implementação e validação do método de determinação do urânio por ICP-MS em águas de consumo humano e águas naturais (superficiais e subterrâneas) Resumo A água constitui um bem essencial à vida, apresentando-se como um recurso indispensável à sobrevivência da biosfera, em geral. Posto isso, o controlo de qualidade da água é essencial para comprovar o nível de qualidade da água aliado ao cumprimento da legislação em vigor através da manutenção de um controlo operacional que permita detetar possíveis anomalias na qualidade da água, de modo a permitir que sejam postas em prática medidas preventivas/corretivas eficazes. Esta dissertação teve como objetivo a implementação, a validação e o controlo de qualidade do método de determinação do urânio por Espectrometria de Massa Acoplada a Plasma Indutivo (ICP-MS) em matrizes de águas de consumo humano e águas doce naturais (superficiais e subterrâneas). Antes de iniciar a validação do método propriamente dita foi necessário escolher o isótopo em estudo assim como o padrão interno a utilizar. O método foi então caracterizado considerando os parâmetros de desempenho: gama de trabalho, linearidade, sensibilidade, seletividade, limiares analíticos, precisão, justeza, assim como a estimativa da incerteza de medição. Posteriormente, foi monitorizado o controlo de qualidade interno com recurso a cartas de aceitação. Os resultados obtidos foram comparados com os critérios de aceitação definidos pelo Laboratório e com os valores estabelecidos na Diretiva (EU) 2020/2184, assim como pelo Decreto-Lei n.º 69/2023. O isótopo escolhido foi o 238 e o padrão interno utilizado foi o bismuto. O método analítico apresentou uma excelente linearidade e verificou-se ainda que a sensibilidade encontrava-se dentro do estipulado pelo fabricante, assim como os limitares analíticos encontravam-se adequados. O método apresentou taxas de recuperação dentro dos valores estipulados, concluindo que o método é seletivo. A precisão do método foi caracterizada recorrendo a ensaios realizados em condições de repetibilidade e de precisão intermédia em três níveis de concentração e duplicados de amostras. Os valores dos coeficientes de variação foram satisfatórios para todos os níveis de concentração e para os duplicados de amostras. Recorrendo a ensaios de recuperação e a um Material de Referência Certificado (MRC), constatou-se que não foi evidenciada ocorrência de erros sistemáticos, demostrando assim a justeza do método. A estimativa da incerteza baseada nos dados de validação foi calculada e demostrou ser adequada para o uso. O método foi devidamente implementado, validado e foi demostrada a sua adequação para a quantificação do urânio em diferentes matrizes de água. Palavras-chaves: Águas; Controlo de qualidade; ICP-MS; Urânio; Validação de métodos. vi Implementation and validation of the method for determining uranium by ICP-MS in drinking water and natural waters (surface and groundwater) Abstract Water is essential to life and an indispensable resource for the survival of the biosphere in general. That said, water quality control is essential to verify the level of water quality and compliance with the legislation in force through maintenance of an operational control that allows possible anomalies in water quality to be detected, so that effective preventive/corrective measures can be put in place. The aim of this dissertation was to implement, validate and control the quality of the method for determining uranium by Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICP-MS) in drinking water matrices and natural freshwater (surface and groundwater). Before starting the actual validation of the method, it was necessary to choose the isotope under study and the internal standard to be used. The method was then characterized considering the performance parameters: working range, linearity, sensitivity, selectivity, analytical thresholds, precision, accuracy, as well as the estimation of measurement uncertainty. Subsequently, internal quality control was monitored using acceptance charts. The results obtained were compared with the acceptance criteria defined by the Laboratory and with the values established in Directive (EU) 2020/2184, as well as DecreeLaw No. 69/2023. The isotope chosen was 238 and the internal standard used was bismuth. The analytical method showed excellent linearity and it was also found that the sensitivity was within the manufacturer's stipulations, and the analytical limits were adequate. The method presented recovery rates within the stipulated values, concluding that the method is selective. The precision of the method was characterized using tests carried out under repeatability conditions and intermediate precision was evaluated at three concentration levels and duplicate samples. The coefficient of variation values were satisfactory for all concentration levels and duplicate samples. Using recovery tests and a Certified Reference Material (CRM), it was found that there were no systematic errors, thus demonstrating the fairness of the method. The uncertainty estimate based on the validation data was calculated and proved to be suitable for use. The method was properly implemented and validated and its suitability for quantifying uranium in different water matrices was demonstrated. Keywords: Water; Quality control; ICP-MS; Uranium; Method validation. vii Índice Agradecimentos .............................................................................................................. iii Resumo ............................................................................................................................ v Abstract .......................................................................................................................... vi Índice de figuras ............................................................................................................. xi Índice de tabelas ........................................................................................................... xiii Lista de abreviaturas, siglas e símbolos ........................................................................ xvii Capítulo 1 I Enquadramento do trabalho ........................................................................... 1 1.1. Apresentação da empresa ................................................................................ 2 1.2. Laboratório da Águas do Norte, S.A. ................................................................. 4 1.3. Objetivos .......................................................................................................... 5 1.4. Organização da dissertação ............................................................................. 6 Capítulo 2 I Introdução ................................................................................................... 7 2.1. Água ................................................................................................................ 8 2.1.1. Águas superficiais ........................................................................................................ 10 2.1.2. Águas subterrâneas ..................................................................................................... 10 2.2. Urânio ............................................................................................................ 11 2.2.1. Propriedades físicas, químicas e radiológicas ............................................................... 12 2.2.2. Toxicidade ................................................................................................................... 13 2.2.3. Legislação ................................................................................................................... 14 2.3. Técnicas espectrométricas para determinação de urânio ............................... 14 2.3.1. Espectrometria de Massa Acoplada a Plasma Indutivo .................................................. 15 2.3.2. Princípio de funcionamento da técnica ......................................................................... 16 2.3.3. Interferências ............................................................................................................... 20 2.3.3.1. Interferências espectrais ...................................................................................... 21 2.3.3.2. Interferências não espectrais ............................................................................... 23 2.3.4. Outras técnicas ............................................................................................................ 25 2.4. Validação de métodos analíticos ..................................................................... 27 xiv Tabela 20 I Valores obtidos e utilizados na aplicação do Teste de Mandel, com o intuito de confirmar a linearidade. ....................................................................................................................................... 65 Tabela 21 I Taxa de recuperação média obtida em dez ensaios de recuperação, em três matrizes diferentes (águas de consumo humano (ACH) e águas doce naturais superficiais (ADNSup) e subterrâneas (ADNSub)). .................................................................................................................. 67 Tabela 22 I Valores obtidos para o limite de deteção do método e o limite de deteção instrumental. 68 Tabela 23 I Valores obtidos após análise de dez padrões independentes de concentração igual ao limite de quantificação (0,10012 µg U/L), ao longo do tempo, para avaliação do limite de quantificação. .... 69 Tabela 24 I Parâmetros de avaliação da precisão em condições de repetibilidade. ........................... 70 Tabela 25 I Valores obtidos na análise de cinco conjuntos de cinco soluções independentes, para cada nível de concentração (limite de quantificação, padrão intermédio e limite de aplicabilidade), ao longo do tempo, para a determinação da precisão intermédia do método para o urânio. .................................. 71 Tabela 26 I Valores obtidos na análise de soluções independentes, para cada nível de concentração (limite de quantificação, padrão intermédio e limite de aplicabilidade), ao longo do tempo, para a determinação da precisão intermédia do método para o urânio. ........................................................ 72 Tabela 27 I Resultados obtidos da precisão em condições de repetibilidade e de precisão intermédia, para os três níveis de concentração avaliados (limite de quantificação, padrão intermédio e limite de aplicabilidade), para o urânio com auxílio à ANOVA unifatorial. .......................................................... 73 Tabela 28 I Valores obtidos na análise de duplicados de amostras, ao longo do tempo, para a determinação da precisão intermédia do método para o urânio. ........................................................ 74 Tabela 29 I Resultados obtidos na análise de um MRC, com o intuito de avaliar a justeza do método de determinação do urânio. ................................................................................................................... 75 Tabela 30 I Resultados obtidos nos ensaios de recuperação efetuados de amostras reais fortificadas de água de consumo (ACH) e águas doce naturais superficiais e subterrâneas (ADNSup e ADNSub), para avaliação da justeza do método. ........................................................................................................ 76 Tabela 31 I Resultados obtidos experimentalmente para a quantificação da incerteza padrão associada à precisão. ........................................................................................................................................ 77 Tabela 32 I Resultados obtidos através dos ensaios de recuperação efetuados de forma a calcular a componente associada aos erros sistemáticos do método em três matrizes diferentes (água de consumo humano (ACH) e água doce natural superficial (ADNSup) e subterrânea (ADNSub)). .......................... 78 Tabela 33 I Valores obtidos da incerteza combinada, incerteza expandida e incerteza expandida percentual, do para três matrizes diferentes (água de consumo humano (ACH) e água doce natural xv superficial (ADNSup) e subterrânea (ADNSub)). ................................................................................. 79 Tabela 34 I Resultados obtidos através do MRC da Canada utilizado de forma a calcular a componente associada aos erros sistemáticos do método. .................................................................................... 79 Tabela 35 I Valores obtidos da incerteza combinada, incerteza expandida e incerteza expandida, em percentagem, do método, para o urânio. ........................................................................................... 80 Tabela 36 I Critérios de aceitação aplicados pelo Laboratório para o controlo de qualidade. ............ 81 Tabela 37 I Valores definidos em termos de amplitude (%) para os limites de controlo e aviso, tendo em vista a construção da carta de controlo de amplitudes, dos duplicados de amostra. ........................... 82 Tabela 38 I Resultados dos parâmetros obtidos a partir da análise dos padrões de controlo , utilizados para a construção da carta de controlo de indivíduos. ........................................................................ 84 Tabela 39 I Valores de concentração (µg U/L) para os limites de controlo e de aviso tendo em vista a construção da carta de controlo de indivíduos para os padrões de controlo. ....................................... 84 Tabela 40 I Resultados obtidos no ensaio interlaboratorial da AQUACHECK realizados para dezoito elementos previamente implementados no Laboratório. .................................................................... 87 Tabela 41 I Cálculos auxiliares para a determinação das incertezas associadas ao volume da micropipeta, do balão volumétrico e da incerteza combinada e expandida da concentração de uma solução padrão de urânio de 0,10012 µg U/L. ................................................................................. 99 Tabela 42 I Análise de dados obtidos pelo software Qtegra. ........................................................... 105 Tabela 43 I Equações das curvas de calibração obtidas, ao longo do tempo, e respetivos intervalos de confiança da ordenada na origem e do declive, para 95 % de probabilidade, assim como os respetivos coeficientes de determinação (R2). ................................................................................................... 106 Tabela 44 I Declives das curvas de calibração obtidos, ao longo do tempo, utilizados para construção da carta de controlo de declives. ..................................................................................................... 107 Tabela 45 I Declives das curvas de calibração obtidos, ao longo do tempo, utilizados para monitorização da carta de controlo de declives. ..................................................................................................... 107 Tabela 46 I Valores de concentração obtidos em amostras reais, através de ensaios de recuperação para o estudo da seletividade. ......................................................................................................... 108 Tabela 47 I Resultados obtidos na leitura de dez brancos, em condições de precisão intermédia. .. 109 Tabela 48 I Avaliação do padrão de menor concentração da curva de calibração, em condições de precisão intermédia, de forma a confirmar o LQ do método de determinação do urânio em estudo. . 109 Tabela 49 I Concentrações obtidas da avaliação da precisão do método, em condições de repetibilidade. ...................................................................................................................................................... 110 xvi Tabela 50 I Concentrações obtidas da análise de três níveis de concentração, ao longo do tempo, para a determinação da precisão intermédia. .......................................................................................... 111 Tabela 51 I Concentrações obtidas, para três níveis de concentração, ao longo do tempo, para a construção das cartas de controlo. .................................................................................................. 112 xvii Lista de abreviaturas, siglas e símbolos a Ordenada na origem ADN Água Doce Natural ACH Água de Consumo Humano ADNSub Água Doce Natural Subterrânea ANDSup Água Doce Natural Superficial b Declive da reta de calibração bi Desvio relativo à recuperação brms Valor quadrático médio dos desvios relativos dos ensaios de recuperação C Concentração CC Corrente contínua cps Contagens por segundo CQ Controlo de qualidade CQI Controlo de qualidade interno CRC Célula de reação/colisão CV Coeficiente de variação CVI Coeficiente de variação de precisão intermédia CVm Coeficiente de variação do método CVr Coeficiente de variação de repetibilidade DS2 Diferença de variâncias EIL Ensaios interlaboratoriais En Erro normalizado Er Erro relativo ER Ensaios de recuperação ERSAR Entidade Reguladora dos Serviços de Águas e Resíduos ETA Estação de Tratamento de Águas xviii ETAR Estação de Tratamento de Águas Residuais EU União Europeia (do inglês, European Union ) FAAS Espectrometria de Absorção Atómica com Chama (do inglês, Flame Atomic Absorption Spectrometry ) GFAAS Espectrometria de Absorção Atómica com Câmara de Grafite (do inglês, Graphite Furnance Atomic Absorption Spectrometry ) GL Graus de liberdade ICP-AES Espectrometria de Emissão Atómica Acoplada a Plasma Indutivo (do inglês, Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometry ) ICP-MS Espectrometria de Massa Acoplada a Plasma Indutivo (do inglês , Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry ) IEC Comissão Eletrotécnica Internacional (do inglês, International Electrotechnical Commission ) IPAC Instituto Português de Acreditação IPE Investimentos e Participações do Estado ISO Organização Internacional de Padronização (do inglês, International Organization for Standardization ) k Fator de expansão KED Discriminação da energia cinética (do inglês, Kinetic Energy Discrimination ) LA Limite de aceitação LAI Limite de aceitação inferior LAS Limite de aceitação superior LC Linha central LIA Limite inferior de aviso LIC Limite inferior de controlo LSA Limite superior de aviso LSC Limite superior de controlo LD Limite de deteção LQ Limite de quantificação xix MQb Quadrado das médias “entre os grupos” MQw Quadrado das médias “dentro do grupo” MRC Material de referência certificado MS Espectrómetro de Massa (do inglês, Mass Spectrometry ) m/z Razão massa-carga n Número de padrões nn número de ensaios de recuperação efetuados OMS Organização Mundial de Saúde p Número de grupos PCQA Programa de Controlo da Qualidade da Água PG Razão entre variâncias R Taxa de recuperação r Coeficiente de Correlação r Limite de repetibilidade Ref. Referência bibliográfica R2 Coeficiente de determinação RF Radiofrequência (do inglês, radio frequency ) S Desvio padrão Sa Desvio padrão da ordenada na origem Sb Desvio padrão do declive Sbetween Desvio padrão “entre grupos” SGQ Sistema de Gestão da Qualidade SI Desvio padrão de precisão intermédia Sm Desvio padrão do método SQb Quadrado da soma “entre grupos” SQtot Quadrado da soma total xx SQw Quadrado da soma “dentro do grupo” Sr Desvio padrão de repetibilidade Sy/x Desvio padrão residual Sy2 Desvio padrão residual da função quadrática t Parâmetro t de student TOC Carbono orgânico total (do inglês, Total Organic Carbon ) U Incerteza expandida uadd Incerteza da concentração de analito adicionada uc Incerteza padrão combinada uconc Incerteza da concentração da solução utilizada para a fortificação Ulab Incerteza obtida pelo laboratório Uref Incerteza expandida do material de referência certificado US-EPA Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (do inglês, United States Environmental Protection Agency ) uv Incerteza associada ao volume adicionado v Volume ! " Média xlab Valor obtido experimentalmente ou média aritmética dos valores obtidos xref Valor aceite como verdadeiro xs Valor supeito y Resultado instrumental obtido # $! Sinal interpolado na reta de calibração para uma concentração Z Fator de desempenho Z-score ∆! Variação da concentração ∆# Variação da resposta 1 Capítulo 1 Enquadramento do trabalho No presente capítulo é feita uma breve apresentação da empresa Águas do Norte, inserida no Grupo Águas de Portugal, empresa onde esta dissertação se desenvolveu. São também apresentados os objetivos pretendidos bem como a organização desta dissertação. Capítulo 1 | Enquadramento do trabalho 2 O estágio curricular no âmbito do Mestrado em Técnicas de Caracterização e Análise Química foi desenvolvido no laboratório da empresa Águas do Norte, do Grupo Águas de Portugal, localizado na ETA de Areias de Vilar, em Barcelos. 1.1. Apresentação da empresa Em 1993, em resultado da integração de Portugal na Comunidade Económica Europeia, foi possível implementar uma gestão empresarial no abastecimento de água e no saneamento de águas residuais em Portugal. Era assim constituída a Águas de Portugal, integrada no IPE – Investimentos e Partições do Estado, com a responsabilidade do desenvolvimento dos sistemas Multimunicipais de Abastecimento de Água e Saneamento de Águas Residuais [1]. O Grupo Águas de Portugal foi criado para liderar uma gestão empresarial, com o objetivo de melhorar a qualidade da água e o nível de atendimento das populações, colocando Portugal entre os melhores desempenhos ambientais da Europa [2]. Assim, as empresas do Grupo Águas de Portugal (Figura 1) prestam serviços, direta ou indiretamente, em todo o território continental nos domínios do abastecimento de água e do saneamento de águas residuais [3]. Figura 1 I Empresas nacionais e internacionais integradas no Grupo Águas de Portugal [3]. Capítulo 1 | Enquadramento do trabalho 3 A partir do Decreto-Lei n.º 93/2015, de 29 de maio, foi constituída a Águas do Norte, S.A., mediante a fusão das empresas Águas do Douro e Paiva, S.A., Águas do Noroeste, S.A., Águas de Trásos-Montes e Alto Douro, S.A. e SIMDOURO – Saneamento do Grande Porto, S.A., integradas no Grupo Águas de Portugal. Em sequência, foi-lhe atribuída, pelo Estado Português, a concessão da exploração e da gestão do Sistema Multimunicipal de abastecimento de água e de saneamento do Norte de Portugal [4,5]. Contudo, com o Decreto-Lei n.º 16/2017, de 1 de fevereiro de 2017, ocorre a criação do sistema multimunicipal de abastecimento de água do sul do Grande Porto e o sistema multimunicipal de saneamento do Grande Porto, ambos por cisão do sistema multimunicipal de abastecimento de água e de saneamento do Norte de Portugal, e as respetivas entidades gestoras, respetivamente, Águas do Douro e Paiva, S.A. e SIMDOURO – Saneamento do Grande Porto, S.A [4,6]. A Figura 2 mostra os municípios cujo abastecimento de água e o saneamento é efetuado pela Águas do Norte, S.A.. Figura 2 I Mapa do sistema multimunicipal de abastecimento de água e saneamento do norte de Portugal, efetuado pela Águas do Norte, S.A. [4]. Capítulo 2 | Introdução 10 acreditados e especializados [9,12]. A água pode ser classificada tendo em conta a sua origem de captação, sendo assim, classificamse em águas superficiais ou águas subterrâneas. 2.1.1. Águas superficiais As águas superficiais são, por exemplo, as águas que se encontram nos rios, albufeiras e lagos que apresentam características normais de águas à superfície como turvação, por ter materiais em suspensão, carga orgânica, baixo teor de sais dissolvidos [9]. Estas águas não penetram no solo e ao acumularem-se na superfície da Terra, são escoadas pelas chuvas ou pela ressurgência/reaparecimento das águas subterrâneas formando rios, lagos, lagoas, pântanos, entre outros. O oceano apesar de ser composto por água salgada, também é considerado água de superfície [20]. A monitorização da água superficial do planeta pode ser realizada utilizando medições de superfície, isto é, as taxas de fluxo dos riachos são medidas calculando a descarga (a quantidade de água que se move pelo riacho por unidade de tempo) em vários pontos ao longo do mesmo. Este tipo de monitorização é importante, uma vez que ajuda na determinação do impacto das atividades humanas e das mudanças climáticas na disponibilidade de águas superficiais. Outro tipo de monitorização é o recurso a imagens por satélite. Por outro lado, é essencial manter o controlo da vegetação ao redor dos corpos de água de superfície. A perda da vegetação, quer por fatores naturais, como incêndios, quer pela atividade humana, como desflorestação, pode ter um impacto negativo nas águas superficiais. Além disso, pode levar ao aumento de escoamento superficial e à erosão contribuindo assim para o risco de inundações [21]. As águas superficiais participam do ciclo hidrológico, sustentam os sistemas ecológicos, fornecem habitat para muitas espécies de plantas e animais e são consideradas umas das principais fontes de abastecimento de água potável do planeta [20]. Também são utilizadas para irrigação, tratamento de águas residuais, fins industriais, atividades pecuárias e produção de energia hidrelétrica [22]. 2.1.2. Águas subterrâneas No caso das águas subterrâneas como lençóis subterrâneos, fissuras em terrenos e furos, apresentam características distintas como a dureza (que as classificam como duras em solos calcários Capítulo 2 | Introdução 11 ou macias em solos graníticos). Além disso são límpidas, uma vez que são filtradas pelas camadas terrestres, podendo possuir elementos químicos dissolvidos com diferentes graus de nocividade. As águas subterrâneas podem ainda ser classificadas de acordo com o tipo de solos pelos quais passam. As águas originarias de solos calcários, típicos da região Sul de Portugal e também de Leiria apresentam dureza média/alta, alcalinidade e mineralização. Já as águas provenientes de solos graníticos, típicos do Norte do país apresentam baixa mineralização (sendo consideradas águas macias), baixa condutividade e elevada acidez, podendo também conter alguns materiais dissolvidos como o ferro, (frequentemente nos solos xistosos), manganês, nitrato, entre outros [23]. É do conhecimento público que as águas subterrâneas fornecem uma maior qualidade a nível microbiológico comparadas com as águas superficiais [24]. A água subterrânea é um recurso natural imprescindível para a vida e para a integridade dos ecossistemas que estão delas dependentes, representando as massas de águas doce mais sensíveis e importantes da União Europeia [23,25]. Assim, a mesma revela-se como uma fonte crucial de abastecimento público da água potável em diversas regiões, devendo ser protegida de modo a evitar a deterioração da qualidade, a fim de reduzir o nível do tratamento de purificação necessário à produção de água potável [25]. 2.2. Urânio Em 1789, Martin Klaproth descobriu um elemento químico perto de Freiberg, na Alemanha, que mudaria para sempre a história da humanidade. No momento da descoberta, o elemento estava na forma de óxido de urânio, contudo acreditou-se que o metal estava na sua forma isolada e foi dado o nome de urânio [26]. O urânio é um elemento químico muito importante do ponto de vista comercial e tecnológico. Este metal pertence à série dos actinídeos e esta situado no sétimo período da tabela periódica, sendo o último elemento natural da classificação periódica [26,27]. O urânio é largamente difundido na crosta terrestre, sendo mais abundante que o ouro, a prata, o mercúrio, o antimónio ou o cádmio. Encontra-se presente em diversos tipos de rochas, solos, sedimentos, águas superficiais e subterrâneas [28]. No entanto, geralmente ocorre em concentrações baixas. Capítulo 2 | Introdução 12 2.2.1. Propriedades físicas, químicas e radiológicas O urânio é representado pelo símbolo U, apresenta número atómico 92 e dentro dos elementos de ocorrência natural é o que apresenta maior massa atómica [29]. As principais propriedades do urânio estão apresentadas na Tabela 1. Tabela 1 I Principais propriedades físicas e químicas do urânio [29,30]. Propriedades Símbolo U Número atómico 92 Massa atómica (u) 238,029 Configuração eletrónica [Rn], 5f3, 6d1, 7s2 Ponto de fusão ( ° C) 1135 Ponto de ebulição ( ° C) 4131 Densidade (g.mL-1) 18,9 1ª energia de ionização (kJ.mol-1) 597,6 O urânio pode ser encontrado em seis estados de oxidação. Quando está no estado tetravalente, o urânio é relativamente estável e está geralmente associado a hidróxidos, fosfatos e fluoretos. No estado hexavalente, o urânio apresenta um comportamento mais estável e, em geral, encontra-se dissolvido em água [28,29]. No meio ambiente, o urânio ocorre naturalmente como três isótopos radioativos, o 234U, 235U e 238U [29,31]. No entanto, outros isótopos podem ser sintetizados pelo homem em laboratório, reatores de pesquisa e aceleradores de partículas [32]. Os isótopos naturais do urânio com as respetivas massas atómicas, abundâncias isotópicas e meias vidas estão apresentados na Tabela 2. Tabela 2 I Propriedades dos isótopos de urânio [29,33]. Isótopo Massa atómica (u) Abundância (%) Meia vida (anos) 234U 234,0410 0,005 2,45 ´ 105 235U 235,0439 0,711 7,04 ´ 108 238U 238,0289 99,283 4,47 ´ 109 Capítulo 2 | Introdução 13 Todos os isótopos de urânio sofrem as mesmas reações químicas e apresentam propriedades físicas quase idênticas. Contudo, as propriedades radioativas como tempo de meia vida, atividade específica e modo de decaimento, são diferentes. O processo de decaimento destes isótopos conduz isótopos estáveis (não radioativos) tais como o 206Pb, no caso do 234U e do 238U e 207Pb para o 235U [34]. 2.2.2. Toxicidade A exposição humana ao urânio tem sido há muito considerada um risco radiológico para a saúde, embora existam poucos estudos epidemiológicos capazes de demonstrar os danos resultantes, mesmo em contextos ocupacionais [28]. Contudo, acredita-se que o maior problema esta relacionado com a toxicidade química e, por isso, tem havido uma preocupação crescente de que os efeitos químicos do urânio representem um risco à saúde das populações expostas, assim como acontece com outros metais [35]. Quanto mais solúvel for o composto de urânio, mais tóxico ele se torna. Nos compostos insolúveis os efeitos radiológicos prevalecem [28,36]. A água potável é considerada a responsável por cerca de 70 % da absorção de urânio em uma dieta humana padrão. No corpo humano, o urânio tende a concentrar-se em locais específicos e, devido à sua radioatividade, pode aumentar os riscos de doenças no sangue e rins, e o desenvolvimento de cancro nos ossos [28,37]. Os rins são considerados os principais alvos da toxicidade química do urânio em seres humanos, o que pode levar ao aumento da probabilidade de danos na estrutura destes órgãos, podendo conduzir a insuficiência renal aguda. Estudos mais recentes mostraram uma forte relação entre o urânio presente na urina e o urânio presente na água potável proveniente de poços [28,38]. Não há evidências de que urânio seja essencial para os seres humanos [28]. Estudos em animais mostraram que a ingestão de água contaminada com urânio afeta o metabolismo dos ossos. Além disso, o urânio substitui o cálcio e o fosfato dos ossos aumentando a excreção urinária destes elementos, que são importantes componentes na estrutura dos ossos. A fácil incorporação do urânio nos ossos ocorre devido à distribuição deste elemento no esqueleto ser similar à do cálcio [28,39]. Os radionuclídeos, como o urânio, representam uma importante classe de poluentes inorgânicos, cuja quantificação é necessária tanto no presente como no futuro. As amostras ambientais (água, solos, sedimentos), bem como fertilizantes e resíduos industriais são exemplos onde a contaminação por urânio pode causar sérios problemas para o homem e para o meio ambiente [40]. Capítulo 2 | Introdução 14 2.2.3. Legislação Devido à elevada toxicidade química e radiológica do urânio, tornou-se importante estabelecer leis para controlar as emissões deste metal no ambiente, assim como o teor de urânio em diversas matrizes, como alimentos e sistemas aquáticos. Muitos órgãos reguladores e agências de saúde estão preocupados com a quantidade de urânio presente em águas destinadas ao consumo humano e em diversos tipos de alimentos. Por esse motivo, solicitam a determinação desse elemento em várias matrizes, resultando em uma ampla variação nos limites e diretrizes impostas para o urânio na água potável, desde 2 μg/L no Japão até 1700 μg/L na Rússia [41]. As diretrizes da Organização Mundial de Saúde (OMS, 1993) para a qualidade da água potável reconheceram o urânio como um potencial perigo químico, mas concluíram que estudos insuficientes estavam disponíveis na época para derivar um valor de referência realista. As edições seguintes das diretrizes produziram valores provisórios que foram revisados após o aumento das evidências toxicológicas. A quarta edição, incorporando o primeiro adendo (2017) recomendou um valor de referência provisório de 30 μg/L [42]. Tanto a Diretiva (UE) 2020/2184 para urânio nas águas de consumo humano [18] quanto o nível máximo de contaminante da US-EPA para urânio em águas potáveis [43] estão atualmente definidos em 30 μg/L, embora a Diretiva da UE só tenha entrado em vigor em 2021, com dois anos para os Estados-Membros transporem para a legislação nacional. No dia 21 de agosto de 2023 foi publicado no Diário da República o Decreto-Lei n.º 69/2023, onde estabelece-se o regime jurídico da qualidade da água destinada ao consumo humano, que já inclui o urânio na lista dos parâmetros químicos, no Anexo I – Parte B [44]. Relativamente à legislação relacionada com o controlo da qualidade para águas de consumo humano, o Laboratório onde este trabalho foi realizado, para o caso do urânio regeu-se pela Diretiva (EU) 2020/2184 do Parlamento Europeu e do Concelho, datada de 16 de dezembro de 2020, e pelo DecretoLei n.º 69/2023, de 21 de agosto de 2023, em que ambos estabelecem um valor paramétrico para o urânio de 30 µg U/L [9,18]. 2.3. Técnicas espectrométricas para determinação de urânio A determinação de metais em diferentes matrizes de águas pode ser efetuada com recurso a várias técnicas, como a Espectrometria de Absorção Atómica com Chama (FAAS) [45,46], com Câmara de Grafite (GFAAS) [46,47], Espectrometria de Emissão Atómica Acoplada a Plasma Indutivo (ICP-AES) [46,48] e Espectrometria de Massa Acoplada a Plasma Indutivo (ICP-MS) [46,49,50]. Capítulo 2 | Introdução 15 Quando se pretende escolher a técnica mais indicada a uma determinada análise, a escolha deve ter em atenção fatores como a capacidade de deteção, facilidade do uso, velocidade de análise e o custo da mesma [51,52]. 2.3.1. Espectrometria de Massa Acoplada a Plasma Indutivo Os primeiros equipamentos de Espectrometria de Massa Acoplada a Plasma Indutivo (ICP-MS) foram comercializados em 1983, sendo que, atualmente, o ICP-MS é uma das técnicas analíticas mais sensíveis e vantajosas na análise elementar numa ampla gama de matrizes [53,54]. Esta técnica, para além de conseguir determinar concentrações na gama dos ppt, permite também analisar simultaneamente, aproximadamente, 70 elementos, bem como os isótopos individuais destes elementos que estejam presentes na amostra em análise [53]. Além de apresentar baixos limites de deteção para uma grande parte dos elementos, destaca-se por possuir um elevado grau de seletividade que permite obter uma resposta única para o elemento em estudo bem como uma excelente precisão e justeza [55]. Esta técnica possui aplicações em diversas áreas, incluindo análise de águas e efluentes, materiais geológicos, indústrias alimentar e farmacêutica, além de ser utilizada na área da medicina, em análises clinicas e biológicas como sangue e urina, e também em medicina forense. Entre as aplicações mais relevantes desta técnica, destacam-se os campos da geologia e aplicações nucleares, onde é fundamental para o cálculo de razões isotópicas, permitindo a determinação simultânea dos diferentes isótopos de um elemento [49,53,54]. O ICP-MS pode, teoricamente, ser dividido em seis partes, sendo elas: o sistema de introdução das amostras, a região da formação do plasma (tocha), a zona da interface, o sistema de lentes, o analisador de massa e o detetor [46,49]. Na Figura 4 mostra um diagrama simples do equipamento. O método consiste na introdução da amostra a analisar, por ação de uma bomba peristáltica, formando-se um aerossol e, em seguida, este é transferido para um plasma de árgon. Os processos de transferência de energia causam a dissolução, a atomização e a ionização dos elementos presentes na amostra. A extração dos iões do plasma é feita através de uma interface em vácuo com um sistema lentes integrado e, em seguida, os iões são separados com base na razão massa-carga (m/z) por um espectrómetro de massa, e por fim os iões são medidos pelo detetor [56]. Capítulo 2 | Introdução 16 Figura 4 I Representação esquemática do sistema de um ICP-MS (adaptada de [49]). 2.3.2. Princípio de funcionamento da técnica Sistema de introdução da amostra O sistema de introdução da amostra de um ICP-MS é constituído pelo amostrador automático, uma bomba peristáltica, um nebulizador e uma câmara de nebulização. Assim, a bomba peristáltica bombeia a solução em direção ao sistema de introdução da amostra, permitindo também o controlo do fluxo da solução. Seguidamente, a solução da amostra passa no nebulizador, neste caso um nebulizador concêntrico, onde é convertida num aerossol com recurso a um fluxo de árgon, denominado gás nebulizador, ou também conhecido por gás de arraste [46,56]. O aerossol aqui formado passa através de uma câmara de nebulização, onde as gotículas são separadas de acordo com as suas dimensões, sendo as maiores removidas através da colisão com as paredes da câmara de nebulização. O excesso de solução que se forma na câmara de nebulização é removido pelo dreno, evitando que esta fique cheia [46,57]. Nesta fase do processo é também utilizado um refrigerador, que permite arrefecer a câmara de nebulização, levando a um controlo preciso da temperatura dentro da mesma, e consequentemente à obtenção de sinal mais estável. Ao resfriar a câmara de nebulização, o vapor de água formado vai condensar, reduzindo assim a quantidade de água no plasma. Isso resulta em uma redução na formação de iões poliatómicos (óxidos) [58]. Formação do plasma O sistema de formação do plasma possui dois componentes, a tocha e a bobina eletromagnética, geradora de radiofrequências [59]. A tocha é composta por três tubos concêntricos de quartzo, o tubo externo, o tubo intermédio e o tubo injetor, através dos quais fluem um gás, o árgon, mas com funções e fluxos distintos [46,59]. AmostraAmostra Gás nebulizador Nebulizador Câmara de nebulização Dreno Tocha Plasma Bomba mecânica (rotativa) Bomba turbomolecular Computador Detetor Interface Sistema de lentes Gás auxiliar Gás do plasma Bobina eletromagnética Espectrómetro de massa Capítulo 2 | Introdução 17 O gás utilizado para a formação do plasma circula dentro do tubo externo, a um fluxo de 12 – 17 L.min-1. O gás auxiliar passa no tubo intermédio a aproximadamente 1 L.min-1, tem como funções a redução da temperatura do tubo injetor e o aumento da separação entre a tocha e plasma. Por último, o gás nebulizador transporta a amostra em forma de aerossol num fluxo de aproximadamente 1 L.min-1 [59]. O árgon é o gás de eleição para este processo devido à sua resistência elétrica para dissipação de energia, condutividade térmica adequada para transmitir calor da região exterior do plasma para o interior, alta densidade eletrónica (1,3 x 1015 e-.cm-3), robustez do plasma e custo aceitável. A alta energia disponível de árgon (aproximadamente, 1520,6 kJ.mol-1) permite ionizar a maior parte dos elementos da tabela periódica, uma vez que a maioria possui energias de ionização de 385,0 a 1156,0 kJ.mol-1[60]. A bobina eletromagnética produz uma radiofrequência alternada, entre 27 e 56 MHz que promove a criação de um campo eletromagnético intenso no “topo” da tocha. Enquanto o gás que forma o plasma flui através da tocha, aplica-se uma faísca de alta voltagem, o que causa a dissociação de alguns eletrões dos átomos de árgon. Estes são acelerados pelo campo magnético colidindo com outros átomos de árgon, numa reação em cadeia que provoca a ionização do gás, formando um plasma de altas temperaturas (6000 a 10000 K). O plasma é mantido pela contínua transferência de energia por parte da bobina [46]. O aerossol previamente gerado na câmara de nebulização, sai do tubo injetor com grande velocidade, atravessando o centro da descarga do plasma, de seguida, atravessa várias zonas de aquecimento, ilustradas na Figura 5, onde sofre algumas alterações físicas. Figura 5 I Representação esquemática das diferentes zonas de temperatura no plasma (adaptada de [61]). Zona de pré-aquecimento 8000 K 7500 K6500 K 6000 K 10000 K Zona de radiação Zona analítica Capítulo 2 | Introdução 18 Na zona de pré-aquecimento sofre dessolvatação e vaporização, na zona de radiação ocorre a atomização e, finalmente, na zona analítica a ionização através da colisão com os eletrões do gás. Os iões da amostra são depois dirigidos em feixe para a região da interface [46,56]. Região da interface entre o ICP e espectrómetro de massa e sistema de lentes Os iões formados na tocha devem ser transportados de forma eficiente e mantendo a sua integridade elétrica, desde o plasma, que se encontra à pressão atmosférica (760 Torr), até à região analítica do espectrómetro de massa, no vácuo (10-8 Torr) [56]. A região da interface contém dois cones, geralmente de níquel, o sampler cone e o skimmer cone. O vácuo é mantido com o auxílio de uma bomba mecânica e uma bomba turbomolecular. Cada um dos cones possui um pequeno orifício que permite a passagem dos iões para um sistema de lentes eletrostáticas [56]. A região da interface é arrefecida por água e constituída por um material que dissipa o calor facilmente, como o cobre ou o alumínio [46]. Dado que os processos de atomização/ionização ocorrem à pressão atmosférica, a interface torna-se crucial no processo de criação de um ambiente de vácuo para o espectrómetro de massa. A Figura 6 mostra um esquema representativo da zona da interface de um ICP-MS. Figura 6 I Representação esquemática da seção transversal da região da interface entre o ICP e o espectrómetro de massa (adaptada de [60]). Amostra Tocha Bobina eletromagnética Sampler Cone Skimmer Cone Bomba mecânica (rotativa) 10-1 Torr Bomba turbomolecular 10-7 -10-8 Torr Feixe de iões Sistema de lentes Capítulo 2 | Introdução 19 Os iões formados são direcionados para a zona da interface, onde atravessam o sampler cone. Uma bomba mecânica é usada para manter uma pressão entre cones, de aproximadamente, 10-1 Torr. À medida que os iões entram nesta região da interface, a redução de pressão causa uma expansão do feixe de iões. Os iões são, posteriormente, extraídos através do skimmer cone e na câmara de vácuo principal que é mantida sob alto vácuo (10-8 Torr) por uma bomba turbomolecular. A essa pressão os iões podem ser guiados para o sistema de lentes, sendo que o principal objetivo dessas lentes é guiar o feixe de iões em direção ao analisador de massa e impedir que fotões e outras espécies neutras, como espécies de matriz não ionizada, cheguem ao detetor [46,56,57]. Análise de massa (Espectrómetro de massa (MS)) Existem vários tipos de dispositivos de separação de massa, sendo o mais comum e o utilizado pelo ICP-MS neste trabalho, o quadrupolo. Este tipo de dispositivo consiste em quatro hastes cilíndricas de metal, paralelas, de aço inoxidável ou molibdénio, um par com um determinado potencial de radiofrequência (RF) e o outro com uma corrente contínua (CC) [46,62]. O quadrupolo atua como um filtro de massa de iões, em que apenas aqueles que possuem um valor de m/z dentro de uma certa gama poderão atravessar o quadrupolo em direção ao detetor. Os restantes, com valores inferiores ou superiores, ficam com a trajetória alterada e atingem as hastes, sendo neutralizados. Durante uma análise multielementar este processo repete-se sucessivamente para cada analito com o respetivo ajuste RF/CC consoante a razão m/z que se deseja separar [46,56]. Detetor O sistema de deteção consiste num elétrodo (dínodo de conversão), num multiplicador de eletrões e num pré-amplificador. Os iões são submetidos à uma voltagem negativa, colidindo com o primeiro dínodo e libertando eletrões. Estes, por sua vez, colidem com os dínodos do multiplicador, duplicando sucessivamente a sua quantidade. Por fim, obtém-se uma corrente de eletrões, que corresponde aproximadamente 108 eletrões por cada ião (Figura 7). Desta forma, um multiplicador de eletrões pode gerar um sinal mensurável a partir do impacto de um único ião no detetor, conferindo um sensibilidade muito elevada [46,54]. A corrente de eletrões formada é depois processada e convertida em contagens de sinal elétrico ou concentração por um software próprio, usando padrões de calibração como referência para a sua quantificação. Deve ter-se em conta o sinal de ruído, normalmente causado por fotões que atingem o detetor apesar das medidas tomadas [57]. Capítulo 2 | Introdução 26 Nas Tabelas 3 e 4 apresentam-se os métodos analitos mais utilizados para a determinação do urânio em águas de consumo e águas doces naturais, assim como alguns parâmetros de validação para cada metodologia analítica. Tabela 3 I Estudos realizados utilizando ICP-MS para quantificação de urânio em águas de consumo humano. Método analítico Padrão interno GT ( µ g/L) LD (ng/L) R2 Precisão (%) Justeza (%) Ref. ICP-MS 103Rh 0,05 – 10 2,0 0,99995 3,0 TR: 91106 [67] 209Bi 0,001– 200 0,4 0,9999 1,6 - [68] 209Bi 0,5 – 5 20 0,9999 3,90 Er: 0,67 [69] GT: gama de trabalho; LD: limite de deteção; R2: coeficiente de determinação; TR: taxa de recuperação; Er: erro relativo Tabela 4 I Estudos realizados utilizando outros métodos analíticos, em águas doces subterrâneas, para quantificação de urânio. Método analítico GT ( µ g/L) LD ( µ g/L) Taxa de recuperação (%) Ref. ICP-AES 5 - 200 2,0 90 [70] Espectroscopia de fluorescência 1 -- 30 0,2 - [71] Espectroscopia Raman 100 – 10000 1,0 - [72] GT: gama de trabalho; LD: limite de deteção Posto isto, observando as Tabelas 3 e 4 a vantagem mais evidente da utilização da técnica ICPMS é a capacidade de atingir limites de deteção muito baixos, na gama dos ppt, enquanto as técnicas apresentadas na Tabela 4 os limites de deteção encontram-se na gama dos ppb. Porém, essa não é a única vantagem que o ICP-MS apresenta, destacam-se ainda, o facto de ser uma técnica multielementar, o volume de amostra ser muito baixo, o tempo de análise ser bastante reduzido e ser possível fazer análise de isótopos diferentes. Contudo, como todas as técnicas esta apresenta as suas desvantagens, sendo estas sobretudo devido ao elevado custo do equipamento e os técnicos responsáveis requerem um elevado nível de especialização [46,52]. Capítulo 2 | Introdução 27 2.4. Validação de métodos analíticos Sempre que um método analítico é implementado e antes de ser executado como método de rotina, é necessário proceder à sua validação. Este é um estudo experimental que tem como objetivo demonstrar que o procedimento analítico avaliado é adequado ao fim a que se destina, de modo a assegurar a confiabilidade dos resultados obtidos [73]. Assim, neste subcapítulo, aborda-se a validação de um método analítico quantitativo quando ponderada pelo estudo e conhecimento dos parâmetros de validação: seletividade/especificidade, gama de trabalho, linearidade, limiares analíticos, sensibilidade, precisão, em termos de repetibilidade e precisão intermédia, e justeza (Figura 11). Figura 11 I Parâmetros de desempenho avaliados na validação do método analítico. Os laboratórios procedem à validação de métodos sempre que utilizam métodos não normalizados, métodos desenvolvidos pelo próprio laboratório e métodos normalizados utilizados fora do âmbito de utilização previsto, ou de outra forma modificados. A validação não é exigida para métodos normalizados, ainda assim o laboratório necessita verificar o seu desempenho, de forma a aferir a sua capacidade de reproduzir o método no seu meio [8,74,75]. A implementação de um método analítico ou a validação do mesmo, é um processo lento e que não deve ser de alguma forma apressado, pois as consequências de erros a longo prazo, traduzem-se na perda de recursos, tempo e dinheiro. Assim, para além dos parâmetros de desempenho avaliados de forma direta e indireta, é também, segundo a norma ISO 11352:2012, estimada a incerteza do método [76,77]. Seletividade Especificidade Gama de trabalho Linearidade Sensibilidade Limiares analíticos Precisão Exatidão Incerteza da medição Capítulo 2 | Introdução 28 2.4.1. Curva de calibração A calibração, em análises quantitativas, permite estabelecer uma relação entre o sinal obtido pelo equipamento e a concentração, ou quantidade de uma substância conhecida [75,78]. Assim, antes de se proceder à determinação de qualquer parâmetro de desempenho deve-se fazer a seleção do melhor modelo para ajustar os resultados obtidos e, portanto, o critério de escolha do modelo de regressão que melhor se ajusta aos pontos é baseado no método dos mínimos quadrados. No caso do modelo de regressão linear, observa-se a existência de uma relação linear entre os valores de y (resposta instrumental) e de x (concentrações dos padrões), o que visualmente se traduz numa reta [73,75,76]. A partir da reta de calibração deste modelo, é possível obter uma equação da reta de calibração dada pela Equação 1. &=()++ Equação 1 Em que, ( corresponde ao declive e + à ordenada na origem. Os valores destas grandezas devem ser acompanhados da respetiva incerteza associada. Para tal, numa primeira fase é necessário calcular os desvios padrão associados à ordenada na origem ( ," ) e ao declive ( ,# ). Estes são calculados a partir das Equações 2 e 3. ,"=,$% & × .∑ %! " ! ( ∑ (%!*% + )" ! Equação 2 ,#=-#$ % .∑ (%!*% + )" ! Equação 3 Em que, / corresponde ao número de padrões utilizados para a construção da curva de calibração e ,$% & é o desvio padrão residual do modelo de regressão linear e, pode ser calculado recorrendo à Equação 4. ,$% & = .∑ ($!*$ / &)" !(*0 Equação 4 Em que, & 0 1 representa o sinal obtido, &2 , quando se interpola o valor de uma determinada concentração, )2 [73,79]. Seguidamente, os intervalos de confiança, tanto do declive como da ordenada na origem podem Capítulo 2 | Introdução 29 ser calculados a partir das Equações 5 e 6. (1±3,# Equação 5 +1±3," Equação 6 Assim, a equação da reta de calibração contendo as incertezas do declive e da ordenada na origem, com um intervalo de confiança de 95 %, n–2 graus de liberdade [73,76], encontra-se abaixo representada pela Equação 7. &= ( (±3,# ) )+(+1±3,") Equação 7 2.4.2. Gama de trabalho A gama de trabalho define-se como o intervalo de concentrações em que o sistema analítico avaliado produz resultados com uma incerteza aceitável, isto é, nesta gama o analito deve apresentar uma precisão e justeza aceitáveis [73]. A extremidade inferior da gama de trabalho é o limite de quantificação e a extremidade superior é o limite de aplicabilidade. Para a determinação da gama de trabalho seja possível, é necessário considerar o procedimento de calibração proposto e a linearidade do método [75,76]. No laboratório da empresa Águas do Norte, S.A., a gama de trabalho é selecionada tendo em conta a legislação em vigor e as gamas de concentração comuns nas amostras de rotina do laboratório [66]. 2.4.3. Linearidade A linearidade é a capacidade de um método fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração de analito. Existe diversas formas de avaliar a linearidade, entre elas o Laboratório recorre à visualização da representação gráfica da curva de calibração, juntamente com a avaliação do coeficiente de determinação (R2), sendo que este tem de ser superior a 0,9990, para o modelo de regressão se considerar bem ajustado [66]. Contudo, o Guia RELACRE 13 considera um modelo de regressão linear se encontra bem, ajustado se o valor do coeficiente de correlação (r) for superior a 0,995 [73]. Capítulo 2 | Introdução 30 Para além deste método, a linearidade é fundamentalmente avaliada com recurso a gráficos de análise de resíduos. Um gráfico de resíduos mostra a dispersão que exibem os resíduos (&2−& 0 2) no eixo das ordenadas e & 0 2 no eixo das abcissas [76]. Este tipo de gráfico ajuda a determinar se o modelo linear é apropriado para apresentar os dados fornecidos. Quando os resíduos apresentam-se espalhados aleatoriamente em torno do resíduo igual a zero, significa que o modelo linear encontra-se bem ajustado, e, assim, o modelo linear é apropriado [80]. Adicionalmente, este parâmetro também pode ser avaliado com recurso a um modelo estatístico, de acordo com a norma ISO 8466-1 [79], designado teste de Mandel , que faz a comparação entre o ajuste dos valores experimentais para a função linear, ,$% &, (Equação 4), e o ajuste dos mesmos para a função quadrática, ,$" (Equação 8). ,$"= .∑ ($!*$ / &)" !(*3 Equação 8 Em que, / designa o número de padrões utilizados para a construção da curva de calibração, e & 0 1 representa o sinal obtido, &2 , quando se interpola, na função quadrática, o valor de uma determinada concentração, )2 [73,79]. Seguidamente, procede-se ao cálculo da diferença de variâncias, 7,0 , de acordo com a Equação 9, abaixo representada. 7,0= ( /−2 ) ×,$% & 0−(/−3)×,$" 0 Equação 9 Em que, / designa o número de padrões utilizados para a construção da curva de calibração, ,$% & designa o desvio padrão residual da função de calibração linear e ,$" o desvio padrão residual da função de calibração quadrática [73,79]. Finalmente, calcula-se o valor de teste :; , de acordo com a Equação 10, com o intuito de verificar a existência de diferenças significativas, por comparação com o valor tabelado da distribuição de F de Snedecor / Fisher bicaudal (Fcrítico), para um grau de liberdade, no que diz respeito à diferença de variâncias e n-3 graus de liberdade, para o desvio padrão residual da função de calibração quadrática. :;=4-" -#" " Equação 10 Assim, se o valor do teste :; for inferior ou igual ao valor tabelado de F, a função de calibração Capítulo 2 | Introdução 31 é linear, ou seja, a função quadrática não permite um melhor ajuste. No entanto, se o valor do teste :; for superior ao valor tabelado de F, a gama de trabalho deverá ser reduzida de forma a garantir uma calibração linear ou por sua vez, proceder à verificação se, os dados de análise de amostras deverão ser avaliados através de uma função de calibração ponderada [73,76,79]. 2.4.4. Sensibilidade A sensibilidade é a capacidade de um método, ou equipamento, distinguir pequenas diferenças de concentração de analito. Assim, por norma, este parâmetro pode ser definido como a razão entre a variação da resposta ( ∆& ), que corresponde a uma variação na concentração de analito correspondente ( ∆) ) [73,75,76], representada pela Equação 11. ,</=>(>?>@+@<=1∆$ ∆% Equação 11 Na prática, se a função for linear, a sensibilidade será constante ao longo de toda a gama de trabalho e a sensibilidade corresponde ao declive da reta de calibração [73]. Porém, para o ICP-MS, o Laboratório onde o presente trabalho foi realizado, avalia a sensibilidade não pelos declives das curvas de calibração mas pelo número mínimo de contagens obtidas na realização do teste de sensibilidade ( Performance test ), sendo que, este teste é realizado sempre que o equipamento é utilizado antes de iniciar qualquer sessão de trabalho [66]. 2.4.5. Seletividade e especificidade A seletividade é a capacidade de um método identificar e distinguir um analito em particular numa mistura complexa sem interferência dos outros componentes, que são suscetíveis de causar um desvio na quantificação do analito e assim provocar desvios sistemáticos [73,75]. A especificidade de um método analítico corresponde à capacidade de o método avaliar inequivocamente o analito em relação a outras substâncias eventualmente presentes na amostra a analisar, ou seja, quando oferece garantias que a grandeza medida provém apenas do analito. Assim, será necessário averiguar a possibilidade de existir interferência de outras substâncias eventualmente presentes na amostra, utilizando para efeito uma amostra complexa [66]. Em geral, estes parâmetros são objeto de estudo na fase inicial do processo de validação, pois Capítulo 2 | Introdução 32 sem o conhecimento de que estes parâmetros são aceitáveis, a verificação dos outros parâmetros de desempenho apresentam escasso valor prático [66]. Usualmente, a seletividade é avaliada através de ensaios de recuperação, estudando-se, assim, as possíveis interferências existentes na matriz [73]. Assim, é feita a análise da amostra com e sem fortificação e é analisado o desvio dos resultados obtidos, em comparação com os esperados. Através da Equação 12, calcula-se então, a taxa de recuperação do analito (R (%)). A1(%)= C 6'(×8(*6'×8' 6)×8) D ×100 Equação 12 Em que, G"9 designa a concentração do analito da amostra fortificada, H9 é o volume final, G" refere-se à concentração de analito na amostra sem fortificação, H" é o volume de amostra, G: designa a concentração do analito da solução padrão adicionada, e H: o volume da solução padrão adicionada [66]. Posto isto, um método para ser considerado seletivo e específico deverá apresentar uma taxa de recuperação próxima de 100 %, dependendo das metodologias aplicadas, pois o critério para a aceitação de alguns métodos admite intervalos de recuperação mais ou menos alargados [73]. 2.4.6. Limiares analíticos Os limiares analíticos podem ser calculados de diferentes formas, de acordo com as metodologias utilizadas em rotina num laboratório. Sempre que os laboratórios utilizem métodos em que as medições são feitas em baixas concentrações, existem alguns aspetos a considerar, sendo a metodologia relacionada com todos estes conceitos é muito diversa e variável entre setores [75,76]. Assim, é importante conhecer a concentração mais baixa de analito que pode ser detetada e/ou quantificada pelo método a um nível de confiança especificado, em que o desempenho se torne aceitável para a aplicação típica. Estes conceitos são usualmente denominados, limite de deteção (LD) e limite de quantificação (LQ) [75,81]. 2.4.6.1. Limite de deteção O limite de deteção corresponde à concentração mínima de analito que um determinado método é capaz de detetar e distinguir, com uma certeza estatística razoável, normalmente 95 % [73,75,76]. Assim, quando aplicável, o Laboratório define o LD dos seus métodos de duas formas. Capítulo 2 | Introdução 33 Primeiramente, pode avaliar através dos resultados da análise de uma série de brancos [66]. Em termos quantitativos o LD pode ser obtido pela Equação 13. I7=3,31×, Equação 13 Em que, , refere-se ao desvio padrão dos resultados obtidos a partir das leituras dos brancos. Outra forma de se avaliar o LD é no caso da calibração for do tipo linear, pode-se recorrer à Equação 14. I7=13,3<×<-#$ % # Equação 14 Em que, ,$% & designa o desvio padrão residual da função de calibração linear, e ( corresponde ao declive da reta de calibração [73]. 2.4.6.2. Limite de quantificação O limite de quantificação corresponde à concentração mais baixa que um determinado método é capaz de quantificar, com um determinado nível de confiança, em que se verifica que o desempenho do método é aceitável para uma determinada aplicação, com uma determinada justeza e precisão [73,75,76]. A gama entre o LD e o LQ deve ser entendida como uma zona de deteção qualitativa, e portanto não quantitativa, pelo que não se deve reportar valores numéricos nesta gama. Na prática, o LQ corresponde ao padrão de concentração mais baixa usado para traçar a curva de calibração, excluindo o branco [75]. Assim, o LQ deve ser testado para averiguar se a justeza e precisão conseguidas são satisfatórias. Para isso, são feitas leituras de padrões de concentração referente ao LQ e é avaliado o coeficiente de variação (CV) e o erro relativo (Er), ambos expressos em percentagem (%), representados pelas Equações 15 e 16. GH1(%)=1 K - % +L ×100 Equação 15 MN1(%)=1 C= % + *%*+( = %*+( D ×100 Equação 16 Capítulo 2 | Introdução 34 Em que, , refere-se ao desvio padrão dos resultados obtidos, ) O é a média dos resultados obtidos, e )>?9 o valor aceite como verdadeiro [66,76]. O coeficiente de variação, segundo os critérios definidos pelo Laboratório, não deve exceder os 10 %, e o erro relativo deve também, preferencialmente, ser menor ou igual a 10 % [66]. Tal como o LD, outra forma de se avaliar o LQ é a partir dos dados da reta de calibração, em que se recorre à Equação 17. IP=1@A<×<-#$ % # Equação 17 2.4.7. Precisão A precisão define-se como o parâmetro que permite a avaliação da dispersão de resultados, obtidos por medições repetidas, no mesmo objeto ou em objetos similares, sob condições específicas, sendo elas, a repetibilidade, a precisão intermédia e a reprodutibilidade. A precisão pode variar com a gama de concentração, sendo recomendado o estudo em três níveis de concentração. Este parâmetro permite avaliar a qualidade dos resultados tendo em consideração possíveis erros aleatórios [73,82,83]. 2.4.7.1. Repetibilidade A repetibilidade representa a precisão de um método de ensaio efetuado em condições idênticas, isto é, refere-se aos ensaios efetuados sobre a mesma amostra, em condições tão estáveis quanto possível, como por exemplo, o mesmo laboratório, o mesmo analista, o mesmo equipamento, o mesmo tipo de reagentes e/ou os mesmos intervalos de tempo [73,75,76]. A forma de avaliar a precisão, em condições de repetibilidade, é através do desvio padrão de repetibilidade ( ,> ), associado aos resultados considerados ou na forma de coeficiente de variação de repetibilidade ( GH> ) para uma determinada gama de concentração. O GH> é dado pela Equação 18. GH>=1 K 1-* % + 1 L ×100 Equação 18 A partir do => pode-se determinar o limite de repetibilidade ( N> ). Este é o valor abaixo do qual se deve situar, para uma dada probabilidade (normalmente 95 %), a diferença entre dois ensaios obtidos, em condições de repetibilidade. O valor de N> é dado pela Equação 19. Capítulo 2 | Introdução 35 N>=2,81×,> Equação 19 Na prática, aceitam-se os resultados de duas determinações efetuadas em condições de repetibilidade se | )2−)2*@ | ≤N> . Caso tal não se verifique, deve repetir-se o ensaio em questão [73,75]. 2.4.7.2. Precisão intermédia A precisão intermédia exprime a precisão avaliada sobre os padrões de três níveis de concentrações, mas também em amostras reais, utilizando o mesmo método e o mesmo laboratório, mas fazendo variar uma ou mais condições, tais como, realizar as análises em dias diferentes ou analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes. Este parâmetro permite avaliar o impacto das alterações que poderão ocorrer no dia-a-dia do laboratório e é o parâmetro mais representativo da variabilidade dos resultados num laboratório [66,73,75,76]. A forma de avaliar a precisão, em condições de precisão intermédia baseia-se no desvio padrão de precisão intermédia ( ,B ) associado aos resultados considerados ou na forma de coeficiente de variação de precisão intermédia ( GHB ) para um determinado nível de concentração ou para duplicados de amostra. Assim, o ,B pode ser obtido pela Equação 20, para os três níveis de concentração selecionados, e a Equação 21, para amostras, caso o número de replicados seja igual a dois. ,B= . @ (*@ × ∑ (&C−& U )0 ( CD@ Equação 20 ,B= . @ 0×E × ∑ (&F@ −&F0)0 ( CD@ Equação 21 Em que, / designa o números de padrões analisados, &C é o resultado individual obtido, & U refere-se à média aritmética dos resultados individuais obtidos, 3 é o número de amostras analisadas em duplicado, e por último, (&F@ −&F0 ) representa a diferença entre os duplicados das amostras [66]. Para além do ,B , também é possível determinar o limite de precisão intermédia ( NB ) e o coeficiente de variação de precisão intermédia ( GHB ), recorrendo às Equações 22 e 23, respetivamente. Capítulo 2 | Introdução 42 considerando-se a componente dos erros aleatórios e sistemáticos, respetivamente [77,91]. Assim sendo, o primeiro passo desta abordagem passa pela determinação dos componentes da ]:>?S2TãO<>?1"E2V" e da ]FMTE?W"<>?1"E2V" , separadamente. Para o cálculo da ]:>?S2TãO<>?1"E2V" , o Laboratório definiu que esta deve ser calculada a partir da combinação da incerteza associada à precisão intermédia dos duplicados de amostras ( ]:,"JOTE>" ) com a incerteza associada à precisão intermédia do padrão de menor concentração ( ]:,6I ), referente ao limite de quantificação, segundo a Equação 36. Assim, em ambos os casos, a incerteza associada à precisão intermédia é o valor equivalente ao ,B . De seguida, deve-se considerar a incerteza associada à precisão intermédia na forma relativa, que é equivalente ao GHB [66,91]. ]:>?S2TãO<>?1"E2V" = . ]:,"JOTE>" 0+]:,6I 0 Equação 36 Para a componente da ]FMTE?W"<>?1"E2V" , o Laboratório usa os resultados obtidos nos ensaios de recuperação. Assim, a avaliação da incerteza associada aos erros sistemáticos a partir de ensaios de recuperação baseia-se na conjugação de duas componentes, a diferença entre a recuperação observada e a recuperação completa (100 %) (Equação 37) e a incerteza relativa da concentração de analito adicionada ( ]"NN ´ ) (Equação 38) [91]. (>JT = .∑ <(#! ´)" (8 Equação 37 Em que, 1 (>JT é o valor quadrático médio dos desvios relativos dos ensaios de recuperação, (2´ refere-se ao desvio relativo à recuperação completa e /( designa o número de ensaios de recuperação efetuados. ]"NN ´= . (]8 ´)0+(]SO(S ´)0 Equação 38 Em que, ]8 ´ define a incerteza relativa associada ao volume adicionado e ]SO(S ´ designa a incerteza relativa da concentração da solução utilizada para a fortificação [91]. Assim, a componente da incerteza associada à justeza do método, ]FMTE?W"<>?1"E2V" , através de ensaios de recuperação é dada pela Equação 39. Capítulo 2 | Introdução 43 ]FMTE?W"<>?1"E2V" = . (>JT0+(]"NN ´)0 Equação 39 Posto isto, a próxima etapa consiste em calcular a incerteza padrão combinada. O cálculo da incerteza padrão combinada ( ]S ) baseia-se na Lei de Propagação das Incertezas. Através das componentes da incerteza padrão estimadas a partir dos dados de validação e/ou do controlo de qualidade, nomeadamente, a combinação da componente da incerteza associada à precisão ( ]:>?T2çãO<>?1"E2V" ) e a componente associada à justeza ( ]FMTE?W"<>?1"E2V" ), permite o cálculo da incerteza padrão combinada, de acordo com a Equação 40 [91]. ]S= X ]:>?S2TãO<>?1"E2V"0+]FMTE?W"<>?1"E2V"0 Equação 40 Por fim, a etapa final, tal como na abordagem “passo a passo”, consiste em multiplicar a incerteza padrão combinada pelo fator de expansão, a fim de obter a incerteza expandida (Equação 35). 2.4.10. Garantia de Controlo de Qualidade Os erros são uma parte integrante do trabalho em rotina e, como tal, é essencial, por um lado, minimizá-los e, por outro lado, controlar a ocorrência destes, Controlo de Qualidade (CQ), de forma a otimizar a eficácia do Sistema de Gestão da Qualidade (SGQ) adotado. Assim, após a fase inicial de estudo do equipamento e da técnica analítica, e aprovação do método de análise, os laboratórios devem exercer um controlo da sua execução, garantindo que as condições de validade do método se mantenham [78]. Posto isto, o CQ deve ser planeado e implementado para permitir a monitorização contínua do desempenho analítico em rotina, de modo a que seja possível detetar tendências através da aplicação de técnicas estatísticas de análise de resultados. Tendo em conta estes aspetos, é importante realizar avaliações periódicas da veracidade e precisão dos resultados, através do Controlo da Qualidade tanto intralaboratorial (interno) como interlaboratorial (externo) [78,93]. 2.4.10.1. Controlo de qualidade interno O controlo de qualidade interno (CQI) consiste nas ações de CQ cuja implementação depende Capítulo 2 | Introdução 44 apenas da vontade e meios do laboratório, e não de um fator externo. Estas ações visam a monitorização e controlo da precisão e veracidade dos resultados produzidos pelo laboratório [78]. Assim, as cartas de aceitação constituem a ferramenta mais usada pelo Laboratório, no que diz respeito ao ICP-MS. Estas cartas apresentam limites definidos tendo em conta os objetivos do ensaio e são definidos, internamente, pelo laboratório. A principal vantagem das cartas de aceitação é que são mais fáceis de construir em relação a outras [66]. Outra ferramenta muito utilizada para monitorizar os resultados é a utilização de cartas de controlo, que substitui os limites definidos, usados nas cartas de aceitação, por limites estatísticos. A construção de cartas de controlo requer a realização de um estudo prévio de modo a definir o valor alvo e os limites de aviso e de controlo. Deste modo, é feito um estudo preliminar onde são efetuadas n análises de uma série de amostras ou padrões, em dias diferentes. De seguida, determinase a média, ) O, sendo este o valor da carta de controlo e, o respetivo , obtido em condições de precisão intermédia [84,94,95]. Os limites superiores de aviso (LSA) e inferiores de aviso (LIA) são dados com 95 % de confiança pelas Equações 41 e 42. I,_=) O +2, Equação 41 I`_=) O −2, Equação 42 Os limites superiores de controlo (LSC) e inferiores de controlo (LIC) são obtidos com 99,7 % de confiança, recorrendo às Equações 43 e 44. I,G=) O +3, Equação 43 I`G=) O −3, Equação 44 Posteriormente, todos os valores obtidos diariamente para esta grandeza devem ser introduzidos na carta de controlo. Deste modo, é possível verificar a deteção de desvios obtidos [93]. Em ambos os casos, as cartas correspondem a representações gráficas onde são registados os valores medidos pelo laboratório em função do tempo, o que permite aferir visualmente as flutuações ou tendências nos resultados obtidos. Podem também ser registados os resultados obtidos por repetições de amostras ou desvios entre replicados, entre outros parâmetros [93,94]. Capítulo 2 | Introdução 45 3 Capítulo 3 Metodologia experimental Neste capítulo, apresenta-se de forma detalhada, os equipamentos, reagentes e materiais utilizados, assim como os procedimentos experimentais utilizados na determinação do urânio por Espectrometria de Massa Acoplada a Plasma Indutivo e na preparação das soluções utilizadas. Capítulo 3 | Metodologia experimental 46 O método implementado neste trabalho foi utilizado na análise de amostras de águas de consumo e águas naturais. Foi utilizada água ultrapura para a preparação das soluções padrão obtida através de um sistema de purificação Milli-Q® IQ 7000, cujas características se encontram apresentadas na Tabela 6, especificamente, a temperatura, a condutividade e o carbono orgânico total (TOC). Tabela 6 I Características da água obtida a partir do sistema de purificação Milli-Q® IQ 7000. Temperatura (°C) Condutividade (µS/cm) TOC (ppb) 25 0,055 1,2 3.1. Materiais e Equipamentos Na Tabela 7 encontra-se apresentado o material volumétrico utilizado e a respetiva incerteza associada. Todo o material usado em ICP-MS é feito de um fluropolímero inerte, o perfluoroalcoxi alcano, PFA, específico para a análise de elementos traço, um polímero com boa estabilidade térmica e química. Tabela 7 I Material utilizado na realização do procedimento experimental e respetivas incertezas. Material Capacidade (mL) ± Incerteza (mL) Balões volumétricos 100 0,1 500 0,25 Micropipetas 0,1 0,0014 10 0,015 Tubos de Falcon 50 - Todo o material utilizado ao longo do trabalho deve estar livre de contaminantes. Por esse motivo, o material afeto à área analítica do ICP-MS é lavado num programa adequado às características do material, sendo que este encontra-se no Anexo 1. Após a lavagem deve-se descontaminar o material, enchendo os balões volumétricos e tubos de Falcon com ácido nítrico a 10 %, durante pelo menos 24 horas. Passado esse tempo, esvazia-se e passa-se por água ultrapura. Na Tabela 8 apresenta os equipamentos utilizados ao longo do procedimento experimental, bem como a sua marca e modelo. Capítulo 3 | Metodologia experimental 47 Tabela 8 I Equipamento utilizado na realização do trabalho experimental e respetiva marca e modelo. Equipamento Marca Modelo ICP-MS Thermo Fisher Scientific Thermo Scientific iCAP RQ Amostrador automático Teledyne Cetac ASX-560 No ICP-MS utilizado, existem diferentes componentes, nomeadamente, um espectrómetro de massa do tipo quadrupolo, detetor do tipo multiplicador de iões, bomba peristáltica com doze cilindros, câmara de nebulização de quartzo ( baffled cyclonic ), nebulizador concêntrico de borossilicato da marca Glass Expansion , tocha de quartzo da Glass Expansion e sampler e skimmer cones de níquel da Thermo Scientific . Além disso, este tem equipado a si um amostrador automático, com capacidade para cento e vinte amostras e dez posições padrão para tubos de Falcon de 50 mL, assim como uma campânula com ventilação, Teledyne Cetac ENC-560C. No Thermo Scientific iCAP RQ ICP-MS é possível fazer análises em dois modos, em modo standard (STD) e em modo célula de colisão (KED). O modo standard considera que não há sobreposição isobárica, nem formação de duplas cargas, sendo necessário o uso de equações de correção, assim como a correção do padrão interno no efeito matriz. Já em relação ao modo KED, utiliza-se o gás hélio como célula de colisão, tendo como função minimizar a formação de interferências poliatómicas, diminuindo a energia cinética destas. 3.2. Reagentes e gases Os reagentes e soluções padrão comerciais utilizados ao longo do procedimento experimental, bem como as suas respetivas características encontram-se enumerados na Tabela 9. O ácido nítrico 65 % p.a., foi destilado recorrendo a um destilador DST-1000, com o objetivo de se obter uma qualidade superior deste. Para a realização deste trabalho experimental utilizaram-se dois gases, o árgon como gás nebulizador, gás auxiliar e gás do plasma, com uma pureza superior a 99,999%, e o gás hélio para a célula de colisão, também de pureza superior a 99,999%. Capítulo 3 | Metodologia experimental 48 Tabela 9 I Reagentes utilizados durante a realização do procedimento experimental. Reagente Pureza (%) Matriz Marca Lote C ± U (mg/L) Ácido nítrico 65 - Merck K542656 - Padrão comercial de urânio 99,96 2 % HNO3 CPA chem 862620 902036 1001,2 ± 2,9 1001,2 ± 2,9 Solução de padrão interno de bismuto 99,95 5 % HNO3 CPA chem 733624 10,009 ± 0,040 Solução tune Bário (Ba) 99,99 2,5 % HNO3 0,5 % HCl CPA chem 864720 0,00099 ± 0,00001 Bismuto (Bi) 0,00101 ± 0,00001 Célsio (Ce) 0,00101 ± 0,00001 Cobalto (Co) 0,00098 ± 0,00001 Índio (In) 0,00100 ± 0,00001 Lítio (Li) 0,00098 ± 0,00001 Urânio (U) 0,00099 ± 0,00001 Material de referência de urânio - 0,2 % HNO3 Canada 0622 0,00182 ± 0,00014 3.3. Preparação de soluções 3.3.1. Preparação da solução de padrão interno de bismuto (5 µg Bi/L) Retirar para um balão volumétrico de 500 mL, 5 mL de ácido nítrico destilado e 250 µL da solução comercial padrão interno de bismuto e perfazer o volume com água ultrapura. 3.3.2. Preparação da solução de lavagem (2 % HNO3 v/v) Diluir 10 mL de ácido nítrico destilado, num balão volumétrico de 500 mL e perfazer com água ultrapura. 3.3.3. Preparação do branco de trabalho (1 % HNO3 v/v) Diluir 5 mL de ácido nítrico destilado, num balão volumétrico de 500 mL e perfazer com água ultrapura. O branco de trabalho é comummente chamado de branco de reagente. 3.3.4. Preparação de soluções e padrões utilizados para a curva de calibração a) Solução intermédia 1 (2000 µg U/L) Medir para um balão volumétrico de 500 mL, 1 mL de solução padrão comercial de urânio e 5 mL de ácido nítrico destilado (1 % v/v) e, por fim, perfazer o volume com água ultrapura. Solução com validade de um mês, quando conservada no frigorífico. Capítulo 3 | Metodologia experimental 49 b) Solução intermédia 2 (100 µg U/L) Diluir 25 mL da solução intermédia 1 (2000 µg U/L), num balão volumétrico de 500 mL, com 5 mL de ácido nítrico destilado (1 % v/v) e perfazer o volume com água ultrapura. Solução com validade de um mês, quando conservada no frigorífico. c) Soluções padrão para a curva de calibração Em balões volumétricos de 100 mL, medir os volumes indicados na Tabela 10 da solução intermédia 2 (100 µg U/L), juntamente com 1 mL de ácido nítrico destilado (1 % v/v) e perfazer o volume com água ultrapura, de forma a obter as concentrações estipuladas. Na Tabela 10 são também apresentadas as concentrações estipuladas para cada padrão com as respetivas incertezas expandidas. Todas as soluções padrão para a curva de calibração foram preparadas diariamente. As incertezas expandidas foram determinadas recorrendo à metodologia passo-a-passo, como exemplificado para o padrão de menor concentração de urânio no Anexo 2. Tabela 10 I Concentrações das soluções padrão utilizadas no traçado da curva de calibração e respetivas incertezas, sendo também apresentado os volumes da solução intermédia 2 utilizados para a preparação dos padrões. Padrão Volume sol. intermédia 2 (mL) C ± U (µg U/L) 1 0,1 0,10012 ± 9,3 ´ 10-4 2 0,2 0,2002 ± 1,5 ´ 10-3 3 0,4 0,4005 ± 2,8 ´ 10-3 4 0,8 0,8010 ± 5,4 ´ 10-3 5 2,0 2,002 ± 1,5 ´ 10-2 6 5,0 5,006 ± 3,5 ´ 10-2 3.3.5. Preparação de soluções e padrões utilizados para o controlo de qualidade a) Solução intermédia 1 (2000 µg U/L) Medir para um balão volumétrico de 500 mL, 1 mL de solução padrão comercial de urânio e 5 mL de ácido nítrico destilado (1 % v/v) e, por fim, perfazer o volume com água ultrapura. Validade de um mês, quando conservada no frigorífico. b) Solução intermédia 2 (100 µg U/L) Diluir 25 mL da solução intermédia 1 (2000 µg U/L), num balão volumétrico de 500 mL, com 5 mL de ácido nítrico destilado (1 % v/v) e perfazer o volume com água ultrapura. Validade de um mês, Capítulo 3 | Metodologia experimental 50 quando conservada no frigorífico. c) Soluções padrão de controlo da curva de calibração Em balões volumétricos de 100 mL, medir os volumes indicados na Tabela 11 da solução intermédia 2 (100 µg U/L), juntamente com 1 mL de ácido nítrico destilado (1 % v/v) e perfazer o volume com água ultrapura, de forma a obter as concentrações estipuladas. Na Tabela 11 são também apresentadas as concentrações estipuladas para cada padrão com as respetivas incertezas expandidas. Todas as soluções padrão de controlo da curva de calibração foram preparadas diariamente. Tabela 11 I Concentrações das soluções padrão controlo e respetivas incertezas, sendo também apresentado os volumes da solução intermédia 2 utilizados para a preparação dos padrões.. Vsol. intermédia 2 (mL) C ± U (µg U/L) Controlo 1 0,1 0,10012 ± 9,3 ´ 10-4 Controlo 2 0,6 0,6007 ± 4,1 ´ 10-3 Controlo 3 5,0 5,006 ± 3,5 ´ 10-2 3.4. Condições experimentais O analito em estudo, o urânio, foi analisado em diferentes matrizes, nomeadamente, em águas de consumo humano (ACH) e em águas doces naturais superficiais (ADNSup) e subterrâneas (ADNSub). Tabela 12 I Especificações das condições definidas do ICP-MS e do amostrador automático. Parâmetro Especificação Wash time 30 segundos Uptake time 180 segundos Leituras por amostra 3 Velocidade da bomba 40 rpm Fluxo do gás do plasma 14,0 L.min-1 Fluxo do gás auxiliar 0,80 L.min-1 Fluxo do gás nebulizador 1,10 L.min-1 Potência RF 1550,0 W Modo de trabalho KED Temperatura da sala 18 a 21 °C Capítulo 3 | Metodologia experimental 51 Como já referido, a análise foi realizada num ICP-MS, tendo em especial atenção as condições experimentais que se encontram definidas na Tabela 12. Ter em atenção que o fluxo do gás nebulizador apresentado é um valor médio (1,09 e 1,10 L.min-1) pois este varia consoante os testes realizados no início de cada série de trabalho para se obter o melhor desempenho. As instruções de funcionamento do equipamento encontram-se apresentadas no Anexo 3. 3.5. Procedimento experimental 3.5.1. Estudo do padrão interno O estudo do padrão interno foi realizado com duas amostras fortificadas, em matrizes diferentes (ACH e ADN). As amostras fortificadas foram preparadas em balões volumétricos de 500 mL. Adicionouse então, 0,5 mL de solução intermédia 2 (100 µg U/L), de forma que a solução preparada apresente uma concentração de urânio equivalente ao padrão referente ao limite de quantificação e 25 mL de cada possível analito interferente e maioritários (Ca, Na, Mg, Cl e K). Em seguida, preparou-se uma solução de padrão interno, como descrito na secção 3.3.1. Após a preparação das soluções, faz-se a análise, em separado, para cada uma das amostras. A amostra é colocada em vials próprios com capacidade de 10 mL no amostrador automático. Em seguida, adquire-se as contagens por segundo de cada amostra, durante um período de tempo, que represente uma série de trabalho no dia a dia. Com os resultados obtidos traçou-se um gráfico contagens normalizadas/tempo e pela visualização do gráfico foi possível proceder à escolha do padrão interno que melhor se adequa à determinação do urânio. 3.5.2. Estudo de interferências O software utilizado pelo ICP-MS, Qtegra ISDS 2.8, corrige as interferências isobáricas conhecidas, no entanto, não atua sobre possíveis interferências poliatómicas que possam existir. Assim, o Laboratório, por norma, identifica quais os possíveis interferentes poliatómicos de maior relevância e, em seguida, verifica experimentalmente a presença destes. Para isso, o Laboratório, normalmente, prepara várias amostras analíticas com concentrações crescentes de cada interferente que são analisadas em modo STD e em modo KED, com o objetivo de verificar se o analito em estudo possui interferentes poliatómicos e se é necessário usar o modo KED nas análises de rotina. Capítulo 4 | Apresentação e discussão dos resultados 58 comportamento mais semelhante ao do urânio. Ambos apresentam massas semelhantes, 209 e 238 u, respetivamente, assim como energias de ionização similares, 703,0 e 597,8 kJ.mol-1, respetivamente. Assim, o bismuto foi selecionado como o padrão interno para a análise do urânio. Figura 12 I Representação gráfica das contagens normalizadas em função do tempo/número de ensaios, para o urânio, ródio, índio e bismuto, em duas matrizes diferentes. 4.1.4. Estudo de interferências Como referido anteriormente, o Laboratório pretendia incluir o urânio na análise utilizando uma análise em modo de célula de colisão (KED). Assim, foram realizados dez ensaios de recuperação nas três matrizes em estudo, de forma a avaliar a seletividade do método, conforme mostrado no ponto 4.2.6. 4.2. Validação do método de determinação de urânio por ICP-MS Para implementar e validar o método analítico, foram utilizados como referência, os seguintes guias: RELACRE nº 3, “Validação de Resultados em Laboratórios Químicos”, RELACRE nº 13, “Validação de Métodos Internos de Ensaios em Análise Química”, RELACRE nº31, “Quantificação de incerteza de 0,850 0,970 1,090 1 7 13 19 25 31 37 Contagens normalizadas Número de ensaios 238U 103Rh 209Bi 115In 0,750 0,910 1,070 1 7 13 19 25 31 37 Contagens normalizadas Número de ensaios 238U 103Rh 115In 209Bi ACH ADN Capítulo 4 | Apresentação e discussão dos resultados 59 medição em ensaios químicos e físico-químicos” , e o guia Eurachem, “The Fitness for Purpose of Analytical Methods – A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics”, juntamente com o documento “ITL_0002” do Laboratório, que estabelece as regras para a implementação e validação de metais por ICP-MS. Deste modo, os parâmetros de desempenho foram caracterizados, incluindo a gama de trabalho, linearidade, sensibilidade, seletividade, limiares analíticos (limite de deteção e limite de quantificação), repetibilidade e precisão intermédia, justeza e incerteza de medição. Concluído o processo de validação do método interno, o procedimento do controlo de qualidade foi implementado, utilizando as cartas de aceitação utilizadas pelo Laboratório, e de forma complementar, as cartas de controlo. 4.2.1. Análise de dados ICP-MS e estratégias de calibração A calibração é o processo de determinação das respostas do equipamento para concentrações conhecidas de analito e, ao fazê-lo, permite que as concentrações da amostra sejam quantificadas. Existem vários métodos de calibração, sendo um deles, a calibração externa, que utiliza um conjunto de padrões separados de concentração conhecida para gerar uma curva de calibração da resposta do instrumento. No entanto, este método não leva em conta os efeitos induzidos pela matriz. Posto isto, uma boa maneira de compensar os efeitos de matriz é combinar a calibração externa com a padronização interna. Este é o método de calibração mais utilizado em ICP-MS e envolve a adição de um ou mais elementos a todas as soluções medidas (brancos, padrões de calibração, padrões de controlo de qualidade, amostras desconhecidas, etc.) com a mesma concentração. Espera-se que a resposta desse elemento seja a mesma durante todo o ensaio, de modo que qualquer variação seja considerada derivada do efeito de matriz. Um fator de correção é calculado a partir da resposta relativa do padrão interno, nomeadamente o bismuto, pelo software Qtegra ISDS. Este fator de correção é então aplicado aos analitos, neste caso, o urânio, para corrigir os efeitos de matriz. Na Figura 13 é visível as representações gráficas da resposta relativa do bismuto, ao longo de uma série de trabalho, do dia 23 de maio de 2023, bem como o fator de correção aplicado ao urânio. Atendendo a Figura 13, verifica-se claramente que a resposta relativa do bismuto, ao longo de toda a série, encontra-se dentro do critério de aceitação estipulado pelo Laboratório, para aceitação do padrão interno de 80 a 120 %. Capítulo 4 | Apresentação e discussão dos resultados 60 Figura 13 I Representações gráficas da resposta relativa do padrão interno, bismuto, ao longo de uma série de trabalho e do fator de correção aplicado ao analito, urânio. Além disso, uma vez que o equipamento faz três leituras para cada ensaio, e que o software calcula automaticamente a média desses valores, assim como, o coeficiente de variação (CV), o Laboratório estabeleceu um critério de aceitação de 10 %, para o coeficiente de variação. Na Tabela 16 apresenta para três soluções de controlo de qualidade, as leituras obtidas pelo software, assim como, os desvios padrão relativos. Tabela 16 I Valores de concentração obtidos, para as três leituras efetuadas pelo software, para três níveis de concentração, com os respetivos coeficientes de variação (CV). Padrão ( µ g U/L) Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3 CV (%) 0,10012 0,11002 0,10720 0,10680 1,6 0,6007 0,6352 0,5952 0,6056 3,4 5,006 5,044 4,959 4,871 1,7 Posto isto, verifica-se através da Tabela 16, que para os três casos apresentados, os CV encontram-se abaixo de 10 %, sendo este o de critério de aceitação definido pelo Laboratório. Caso algum, CV fosse superior a 10 %, o valor mais discrepante entre as três réplicas seria rejeitado. 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3 0 5 10 15 20 25 30 35 Fator correção Número de ensaios 70 80 90 100 110 120 130 Resposta relativa do padrão interno (%) Capítulo 4 | Apresentação e discussão dos resultados 61 4.2.2. Curva de calibração Iniciou-se o processo de validação do método, ao traçar da curva de calibração. Representou-se as contagens por segundo corrigidas (cps) para o urânio em função da concentração de seis soluções padrão dentro da gama de concentrações definidas, juntamente com o branco de trabalho. A gama de trabalho utilizada neste trabalho, foi selecionada tendo em conta a Diretiva (UE) 2020/2184, o Decreto-Lei n.º 69/2023 e as gamas de concentração comuns nas amostras de rotina do Laboratório, sendo que, assim a gama de trabalho definida para o urânio foi de 0,1 µg U/L a 5,0 µg U/L. Os resultados foram registados na Tabela 17 com as concentrações e respetivas incertezas expandidas e desvios padrão (S). Na Tabela 42 (Anexo 5) estão apresentadas as contagens por segundo obtidas pelo software, assim como os fatores de correção. Tabela 17 I Valores de concentração e contagens por segundo corrigidas utilizados para a construção da curva de calibração, assim como o respetivo desvio padrão. C ± U (µg U/L) Contagens por segundo corrigidas (cps) S (cps) 0 22,2 8,4 0,10012 ± 9,3 ´ 10-4 261,1´ 102 1,2´ 102 0,2002 ± 1,5 ´ 10-3 502,0 ´ 102 6,4´ 102 0,4005 ± 2,8 ´ 10-3 96,7 ´ 103 4,5´ 103 0,8010 ± 5,4 ´ 10-3 192,4 ´ 103 7,2´ 103 2,002 ± 1,5 ´ 10-2 481,0 ´ 103 7,9 ´ 103 5,006 ± 3,5 ´ 10-2 120,6 ´ 104 3,8´ 104 As incertezas expandidas, como já referido anteriormente, foram determinadas recorrendo à metodologia passo-a-passo, como demostrado no Anexo 2. A Figura 14 apresenta um exemplo da curva de calibração obtida no dia 23 de maio de 2023, utilizando um modelo linear, em que a ordenada na origem é forçada a intercetar o valor obtido na leitura do branco de trabalho. Na Figura 14 também são apresentadas as barras de erro dadas pelos respetivos desvios padrão (S). Capítulo 4 | Apresentação e discussão dos resultados 62 Figura 14 I Representação gráfica da curva de calibração das contagens por segundo (cps) em função da concentração de urânio (µg U/L), com os respetivos desvios padrão. A curva de calibração representada na Figura 14, apresenta como equação, I (cps) = 241039,8. C (µg U/L) + 22,2 e coeficiente de determinação (R2), 0,999997, ou seja, é possível aferir um elevado ajuste, isto porque o Laboratório considera satisfatório sempre que, R2 ³ 0,9990. A partir do traçado da curva de calibração foi também possível estimar o valor da incerteza associada ao declive e à ordenada na origem, bem como o valor do desvio padrão e coeficiente de variação do método, exposto na Tabela 18. Tabela 18 I Intervalos de confiança da ordenada na origem (tSa) e do declive (tSb) da curva de calibração, para 95 % de probabilidade, assim como os valores obtidos do desvio padrão do método (Sm) e o coeficiente de variação do método (CVm). a ± tSa (cps) b ± tSb (cps L µg-1) Sm (µg U/L) CVm (%) (0,2 ± 7,0) ´ 102 (241,0 ± 1,4) ´ 103 0,0050 0,41 Atendendo aos valores obtidos na Tabela 18, é possível verificar que a origem está contida no intervalo de confiança da ordenada na origem, verificando-se também que, o coeficiente de variação do método encontra-se bastante abaixo dos 10 % definidos pelo Laboratório, o permite verificar a qualidade dos resultados e demostrando a baixa dispersão destes. No Anexo 6 é apresentado as equações das curvas de calibração obtidas, ao longo do tempo, com os respetivos intervalos de confiança na origem e do declive, e os respetivos coeficientes de determinação. Para complementar e verificar a estabilidade das curvas de calibração ao longo do tempo, foi construída uma carta de controlo de indivíduos com o objetivo de monitorizar os declives das curvas obtidas ao longo do trabalho. -1% 0% 1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% 8% 9% 24 126,2 48 230,2 96 438,1 192 854,1 482 101,8 1 205 221,2 Resíduos (%) Y -1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 2000 2500 24 126,2 48 230,2 96 438,1 192 854,1 482 101,8 1 205 221,2 Resíduos (cps) Y (A) (B) 0,00E+00 2,00E+05 4,00E+05 6,00E+05 8,00E+05 1,00E+06 1,20E+06 1,40E+06 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 Contagens por segundo (Cps) C (µg U/L) #$! #$! Capítulo 4 | Apresentação e discussão dos resultados 63 Na Tabela 44 (Anexo 7) são apresentados os valores utilizados para a construção da carta de controlo exibida na Figura 15. Figura 15 I Carta de controlo de indivíduos para a monitorização do declive (cps L µg-1) das curvas de calibração. A partir da análise da Figura 15, verifica-se que todos os pontos experimentais encontram-se dentro dos limites de controlo. Assim, é possível concluir que os declives encontram-se sob controlo e que a estabilidade esta assegurada, uma vez que os pontos experimentais se encontram distribuídos aleatoriamente, dentro dos limites de controlo. 4.2.3. Linearidade A linearidade assume uma relevância sustentada após o traçado da curva de calibração, pois permite a verificação da capacidade de o método fornecer resultados proporcionais às concentrações do analito. Assim, o Laboratório avalia a linearidade pelo coeficiente de determinação, sendo que o Laboratório deverá avaliar pelo menos cinco curvas de calibração com um coeficiente de determinação (R2) ³ 0,9990. Posto isto, avaliou-se a linearidade de dez curvas de calibração, onde foi possível a obtenção de parâmetros, tais como, o coeficiente de determinação (R2), coeficiente de correlação (r) e o valor do teste t , apresentados na Tabela 19. Tabela 19 I Resultados obtidos através da análise de dez curvas de calibração, com o intuito de avaliar a linearidade. Coeficiente de determinação (R2) Coeficiente de correlação (r) t 0,99997 0,99998 382,539 200,0E+03 257,0E+03 314,0E+03 371,0E+03 428,0E+03 1 2 3 4 5 Declive (Cps L µg-1) Número de curvas de calibração LSA LIA LC LIC LSC Capítulo 4 | Apresentação e discussão dos resultados 64 Tendo em conta os parâmetros obtidos na Tabela 19 e a análise visual da Figura 14, é possível concluir que existe uma elevada linearidade. Esta conclusão é sustentada pela média dos coeficiente de determinação obtido, que é igual a 0,99997, sendo este superior ao definido pelo Laboratório (R2 ³ 0,9990). Através do coeficiente de correlação obtido (0,99998), também é comprovado que existe linearidade, pois atendendo os critérios de linearidade estabelecidos pelo Guia REACRE 13, as curvas de calibração, geralmente, devem apresentar valores de coeficientes de correlação superiores a 0,995. Para corroborar estas avaliações, realizou-se um teste de significância para a correlação, em que se conclui que existe correlação entre as abscissas e as ordenadas, uma vez que o valor de t obtido, apresenta-se superior ao valor tabelado (2,571). A análise dos gráficos de resíduos é uma outra forma de verificar a linearidade da curva de calibração, pois estes informam acerca do desvio da curva de calibração ao padrão e podem também revelar alguma tendência. A Figura 16 (A) representa os valores do sinal de resíduos em função do valor do sinal estimado ( & 0 2 ) e na Figura 16 (B) é apresentado o mesmo, mas os resíduos são apresentados em percentagem relativa. Figura 16 I Gráficos de resíduos da curva de calibração do urânio com (A) sinal absoluto do resíduo; (B) sinal do resíduo em percentagem relativa. Ao analisar as representações gráficas da Figura 16 (A) e (B), observa-se que nenhum dos padrões apresenta um desvio à curva de calibração superior a 10 %, valor geralmente tido como -1% 0% 1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% 8% 9% 24 126,2 48 230,2 96 438,1 192 854,1 482 101,8 1 205 221,2 Resíduos (%) Y -1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 2000 2500 24 126,2 48 230,2 96 438,1 192 854,1 482 101,8 1 205 221,2 Resíduos (Cps) Y (A) (B) 0,00E+00 2,00E+05 4,00E+05 6,00E+05 8,00E+05 1,00E+06 1,20E+06 1,40E+06 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 Contagens por segundo (Cps) C (µg U/L) #$! # $! Capítulo 4 | Apresentação e discussão dos resultados 65 referência. Não foram verificadas tendências de variação, ou seja, não foi detetada a existência de um erro sistematicamente superior ou inferior. Além das formas apresentadas, o Teste de Mandel também pode ser utilizado para avaliar a linearidade de um método, em que faz a comparação entre o ajuste dos valores experimentais tendo em consideração um regressão linear e uma função quadrática. Na Tabela 20 encontram-se os parâmetros utilizados para a aplicação do Teste de Mandel , calculados a partir das Equações 4, 8, 9 e 10. Tabela 20 I Valores obtidos e utilizados na aplicação do Teste de Mandel, com o intuito de confirmar a linearidade. a[ \ ⁄ a[: ba] cd 1205,652 978,264 3,440 3,595 Tendo em conta os parâmetros apresentados na Tabela 20, é possível concluir que a função de calibração de melhor ajuste é a linear, ou seja, a função polinomial não traduz um melhor ajuste dos pontos experimentais, uma vez que o valor do teste PG é inferior ao valor de F tabelado da distribuição de Fisher-Snedecor (7,709). 4.2.4. Sensibilidade A sensibilidade de um método relaciona-se com a menor variação mínima necessária na grandeza a medir, ou seja, a concentração, para se obter uma variação significativa do resultado da medição, isto é, no sinal. No caso do ICP-MS, o Laboratório avalia a sensibilidade pelo número mínimo de contagens obtidas na realização do teste de sensibilidade ( Performance Test ) e não pela primeira derivada da curva de calibração (declive). A Figura 17 demostra o desempenho do equipamento durante o processo de validação, tendo em conta as contagens mínimas definidas pelo fabricante para os elementos cobalto (59Co), índio (115In), bismuto (209Bi), urânio (238U), como apresentado na Tabela 13, do Capítulo 4. O Laboratório estabeleceu a realização de pelo menos dez determinações de sensibilidade. Capítulo 4 | Apresentação e discussão dos resultados 66 Figura 17 I Gráficos do desempenho da sensibilidade, ao longo do tempo, para os elementos cobalto (59Co), índio (115In), bismuto (209Bi) e urânio (238U). Pela observação da Figura 17 verifica-se que em toda a gama de massas analisadas o Performance test atende aos critérios estabelecidos, uma vez que as contagens obtidas para todos os elementos estão acima do estabelecido. No ICP-MS, uma das limitações mais significativas é a formação de óxidos, sendo por esse motivo também importante monitorizar a relação 140Ce16O/140Ce nos Performance tests , como já referido anteriormente. A Figura 18 demostra o desempenho do equipamento, quanto à formação de óxidos durante o processo de validação. Figura 18 I Gráficos da monitorização da formação de óxidos (140Ce16O/140Ce), ao longo do tempo. 0 10000 20000 30000 40000 50000 26/jan 27/jan 14/fev 15/fev 14/mar 22/mar 29/mar 12/abr 10/mai 23/mai Contagens por segundo 0 120000 240000 360000 480000 600000 26/jan 27/jan 14/fev 15/fev 14/mar 22/mar 29/mar 12/abr 10/mai 23/mai Contagens por segundo 0 100000 200000 300000 400000 500000 26/jan 27/jan 14/fev 15/fev 14/mar 22/mar 29/mar 12/abr 10/mai 23/mai Contagens por segundo 0 15000 30000 45000 60000 75000 26/jan 27/jan 14/fev 15/fev 14/mar 22/mar 29/mar 12/abr 10/mai 23/mai Contagens por segundo 59Co 115In 209Bi 238U 140Ce16O/140Ce 0,000 0,004 0,008 0,012 0,016 26/jan 27/jan 14/fev 15/fev 14/mar 22/mar 29/mar 12/abr 10/mai 23/mai Contagens por segundo Capítulo 4 | Apresentação e discussão dos resultados 67 Atendendo os resultados obtidos da monitorização da formação de óxidos (Figura 18) é visível que os valores obtidos encontram-se abaixo dos critérios estabelecidos. Isto indica que a formação de óxidos é residual e dentro dos limites aceitáveis. 4.2.5. Seletividade Depois de verificadas as possíveis interferências e selecionado o padrão interno, como é demostrado no subcapítulo 4.1.3, o Laboratório tem como procedimento avaliar a seletividade. Este parâmetro é avaliado recorrendo a ensaios de recuperação, nos quais quantidades conhecidas de analito (amostra fortificada) são adicionadas a amostras reais que abrangeram toda a gama de trabalho, com diferentes matrizes, ao longo do tempo, de forma a ser o mais representativo possível da rotina do Laboratório. Os resultados desses ensaios de recuperação realizados em amostras reais de três matrizes diferentes, como águas de consumo humano (ACH) e águas doce naturais superficiais (ADNSup) e subterrâneas (ADNSub) estão apresentados na Tabela 46 (Anexo 8). A partir dos resultados obtidos na Tabela 46 (Anexo 8) foram calculados os valores de recuperação média e os respetivos desvios padrão (S), apresentados na Tabela 21. Tabela 21 I Taxa de recuperação média obtida em dez ensaios de recuperação, em três matrizes diferentes (águas de consumo humano (ACH) e águas doce naturais superficiais (ADNSup) e subterrâneas (ADNSub)). Taxa de recuperação (%) S (%) Água de consumo humano 100,4 3,6 Água doce natural superficial 105,8 4,0 Água doce natural subterrânea 103,7 1,4 Com base na análise dos resultados expostos na Tabela 21, é possível observar que as taxas de recuperação média obtidas, para as três matrizes analisadas estão compreendidas dentro do intervalo de aceitação estabelecido pelo Laboratório (80 a 120 %). Assim, dado que as taxas de recuperação se encontram dentro do intervalo de aceitação e próximas de 100 % conclui-se que o método é seletivo nas matrizes estudadas, ou seja, tanto para águas de consumo humano quanto para águas doces naturais superficiais e subterrâneas, permitindo a determinação seletiva do urânio nessas amostras. Capítulo 4 | Apresentação e discussão dos resultados 74 desvio padrão de repetibilidade apresentados na Tabela 25 e os obtidos na análise estatística efetuada. Com o objetivo de aferir o valor máximo permitido de diferença entre duas réplicas dos padrões dos três níveis de concentrações estudados, entre si, independentemente do tempo que decorra entre leituras, foi necessário determinar o valor do limite de precisão intermédia. Deste modo, a diferença entre dois valores obtidos, para os três níveis de concentração avaliados, deverá ser inferior a 0,0081, 0,037 e 0,25 µg U/L, respetivamente. Os valores de coeficiente de variação de repetibilidade encontram-se também em conformidade com os resultados obtidos na avaliação individual da repetibilidade (Tabela 25). A caracterização da precisão em condições de repetibilidade a partir do coeficiente de variação deve ser efetuada, para cada um dos três níveis de concentração avaliados, segundo o maior valor obtido para esse parâmetro. Assim sendo, o CVr considerado para o padrão relativo ao limite de quantificação, padrão intermédio e ao padrão relativo ao limite de aplicabilidade é 2,1, 1,1 e 1,2 %, respetivamente. Desta forma, com base na análise dos valores obtidos para os coeficientes de variação de repetibilidade e precisão intermédia, é possível concluir que o método em estudo, é preciso em condições de precisão intermédia, para os três níveis de concentração avaliados, isto é, o padrão relativo ao limite de quantificação, padrão intermédio e o padrão relativo ao limite de aplicabilidade, visto que estes parâmetros se revelaram inferiores 10 %, tal como definindo pelo Laboratório. Posto isto, através das duas formas de avaliar a precisão intermédia acima apresentadas, para os três níveis de concentração, verifica-se que os resultados são concordantes. Além disso, o Laboratório também avalia a precisão intermédia através de duplicados de amostras. Na Tabela 28 é apresentado o valor do desvio padrão de precisão intermédia (SI), em duplicados de amostras, calculado através da Equação 21. Tabela 28 I Valores obtidos na análise de duplicados de amostras, ao longo do tempo, para a determinação da precisão intermédia do método para o urânio. SI ( µ g U/L) r ( µ g U/L) CV (%) 0,018 0,050 1,8 Mediante a análise dos resultados obtidos na Tabela 28, verifica-se que os valores de precisão intermédia obtido para os duplicados de amostra foi de 0,018 µg U/L. Retira-se ainda que o coeficiente de variação obtido é de 1,8 %. Sendo assim é possível concluir que o método é preciso em condições de precisão intermédia, para duplicados de amostras, uma vez que este parâmetro se encontra abaixo de 10 %. Capítulo 4 | Apresentação e discussão dos resultados 75 4.2.8. Justeza A justeza é um parâmetro de desempenho que pode ser avaliado de diversas formas, tal como referido anteriormente, no Capítulo 2, nomeadamente, a realização de ensaios de recuperação, a utilização de materiais de referência certificados, MRC, e ainda a participação em ensaios interlaboratoriais, EIL. Neste trabalho, para avaliar a justeza, recorreu-se a duas das três formas distintas de análise acima referidas, nomeadamente, a utilização de um material de referência certificados, MRC, e a realização de ensaios de recuperação. A participação de ensaios interlaboratoriais, EIL, é também uma ferramenta importante na validação de um método utilizado pelo Laboratório, mas por questões alheias ao Laboratório, não foi possível a realização destes. A avaliação da justeza pela utilização de um MRC foi efetuada através da análise do MRC TM– 9.3 Environmental Matrix Reference Material da marca Canada (Lote: 0622). Foi realizada uma diluição de 1:5 (1,00 mL do MRC num volume de 5,00 mL), diretamente nos tubos de ensaio do amostrador automático. Para a validação do método analítico, o Laboratório definiu um número mínimo de dez análises de um MRC, por esse motivo, foram efetuadas 10 análises independentes do MRC ao longo do tempo. A Tabela 29 exibe os valores dos parâmetros determinados através da avaliação da justeza pelo MRC, nomeadamente, a média (Cmédia), o desvio padrão (S), o erro relativo (Er), o Z - score , o erro normalizado (En) e o valor do teste t . Tabela 29 I Resultados obtidos na análise de um MRC, com o intuito de avaliar a justeza do método de determinação do urânio. C MRC ± UMRC ( µ g U/L) Cmédia ( µ g U/L) S ( µ g U/L) Er (%) Z - score En t 1,82 ± 0,14 1,75 0,043 3,8 - 0,49 - 0,30 0,82 O Laboratório avalia essencialmente os resultados obtidos da análise de um MRC através do erro relativo. Verifica-se pela análise dos resultados expostos na Tabela 29 que o valor obtido do erro relativo é reduzido, cumprindo o critério de aceitação do Laboratório que não deve exceder os 15 %. Em relação ao resultado do Z - score é possível aferir o desempenho satisfatório do método, uma vez que o valor obtido em módulo encontra-se abaixo do valor 2. O erro normalizado é inferior a 1 em módulo, o que corrobora mais uma vez o desempenho aceitável do método em termos de justeza, para o urânio. Por último, de forma a avaliar se os resultados produzidos são afetados por erros sistemáticos Capítulo 4 | Apresentação e discussão dos resultados 76 relevantes que necessitem de correção, recorre-se a um teste t-student . Como o valor do teste t obtido apresenta-se abaixo do valor tabelado (2,201), é possível inferir que os resultados produzidos não são afetados por erros sistemáticos relevantes que necessitem de correção. Assim, conclui-se que o método apresenta um ótimo desempenho, em termos de justeza. A determinação da justeza do método para o urânio foi também efetuada através da realização de ensaios de recuperação, a partir da fortificação de amostras reais de água de consumo humano e água doce natural (superficial e subterrânea), pela adição de 0,1 mL da solução intermédia 2 (100,12 µg U/L) a 5 mL da amostra real diluída numa proporção de 1:5, sendo que foram realizadas vinte réplicas. Na Tabela 30 encontram-se os resultados dos parâmetros obtidos através dos ensaios de recuperação realizados para cada uma das matrizes de água utilizada, destacando-se a taxa de recuperação, o desvio padrão (S) e ainda o erro relativo (Er). Tabela 30 I Resultados obtidos nos ensaios de recuperação efetuados de amostras reais fortificadas de água de consumo (ACH) e águas doce naturais superficiais e subterrâneas (ADNSup e ADNSub), para avaliação da justeza do método. ACH ADNSup ADNSub Taxa de recuperação (%) 104,3 107,0 105,7 S (%) 3,6 3,1 2,6 Er (%) 4,3 7,0 5,7 Atendendo aos resultados expostos na Tabela 30, é possível afirmar que os valores das taxas de recuperação encontram-se dentro do critério de aceitação (100 ± 20 %) estabelecido pelo Laboratório para este nível de concentração, isto é, entre 80 e 120 %. Além do critério de aceitação ser cumprido de forma satisfatória, o valor do erro relativo situa-se abaixo do valor estipulado de 15 % definido pelo Laboratório, permitindo concluir que o método é justo. Em suma, conclui-se que o método demostra uma boa justeza, uma vez que os resultados obtidos nos ensaios com o material de referência certificado, bem como nos ensaios de recuperação, revelaram um desempenho satisfatório do método na avaliação deste parâmetro. 4.2.9. Incerteza de medição A estimativa da incerteza de medição associada ao método de determinação foi efetuada recorrendo à metodologia utilizada pelo Laboratório como rotina, com base no definido na norma ISO 11352:2012 "Water Quality - Estimation of measurement uncertainty based on validation and quality Capítulo 4 | Apresentação e discussão dos resultados 77 control based" e o Guia RELACRE nº 31 “Quantificação de incerteza de medição em ensaios químicos e físico-químicos”. A abordagem adotada consistiu na recolha de dados de validação e controlo do método em ambiente intralaboratorial. Deste modo, a incerteza de medição foi estimada combinando a componente dos erros aleatórios e a componente dos erros sistemáticos, ou seja, as incertezas associadas à precisão, em condições de precisão intermédia, e as incertezas associadas à justeza, quantificada pelo erro relativo, respetivamente e de forma independente. Em relação à quantificação da incerteza associada à precisão ( e^_`a!bãc<_`def!ge ), esta foi avaliada a partir da combinação da incerteza padrão de duplicados de amostras reais de diferentes matrizes, realizadas ao longo do tempo ( e^,ehcbf_e ), e a incerteza padrão de controlo de qualidade correspondente ao limite de quantificação ( e^,ij ). A incerteza padrão de duplicados de amostras reais ( e^,ehcbf_e ), foi calculada diretamente a partir do desvio padrão da precisão dos duplicados de amostras, calculado pela Equação 21. Já a incerteza padrão de controlo de qualidade de menor concentração ( e^,ij ), foi obtida a partir do desvio padrão da precisão intermédia do controlo de qualidade, calculado pela Equação 20. Dessa forma, os resultados das incertezas padrão, a serem combinados para obter a incerteza associada à precisão encontram-se na Tabela 31, assim como o valor da incerteza padrão da precisão, associada à combinação dos duplicados de amostra e controlo de qualidade, calculado pela Equação 36. Tabela 31 I Resultados obtidos experimentalmente para a quantificação da incerteza padrão associada à precisão. e relativa e^,ehcbf_e 0,018 e^,ij 0,0029 e^_`a!bãc<_`def!ge 0,018 A partir da análise da Tabela 31 verifica-se que a incerteza padrão associada à precisão do método para o urânio é de 1,8 %. No Laboratório, a quantificação da incerteza associada à justeza é avaliada a partir dos ensaios de recuperação, para três matrizes diferentes. Neste caso, a incerteza associada à justeza do método ( eklbf`me<_`def!ge ) tem duas componentes de incerteza, nomeadamente a diferença entre os valores Capítulo 4 | Apresentação e discussão dos resultados 78 observados e a completa recuperação, ou seja, o desvio da recuperação completa (100 %) ( f_hb ), calculada pela Equação 37. A segunda componente é a incerteza da concentração do padrão adicionado ( eenn ´ ), calculada segundo a Equação 38. Na Tabela 32 encontram-se representados os resultados obtidos nos ensaios de recuperação efetuados, especificamente, o somatório do quadrado dos desvios relativos relativamente à recuperação completa (∑ (f! ´)] ), o valor quadrático médio dos desvios relativos dos ensaios de recuperação ( f_hb ), a incerteza relativa do volume adicionado ( eo ´ ), a incerteza relativa da concentração da solução utilizada para fazer a fortificação ( eacpa ´ ), a incerteza relativa da concentração de analito adicionada ( eenn ´ ) e a componente da incerteza associada à justeza do método ( eklbf`me<_`def!ge ), calculada a partir da Equação 39. De salientar que os ensaios de recuperação foram realizados em três matrizes diferentes. Tabela 32 I Resultados obtidos através dos ensaios de recuperação efetuados de forma a calcular a componente associada aos erros sistemáticos do método em três matrizes diferentes (água de consumo humano (ACH) e água doce natural superficial (ADNSup) e subterrânea (ADNSub)). g(f! ´)] f_hb eo ´ eacpa ´ eenn ´ eklbf`me<_`def!ge ACH 0,105 0,056 0,0034 0,0031 0,0046 0,056 ADNSup 0,156 0,076 0,076 ADNSub 0,142 0,062 0,082 A partir da análise da Tabela 32, verifica-se que os valores obtidos para a componente da incerteza associada aos erros sistemáticos foi de 5,6, 7,6 e 8,2 %, para a água de consumo, água doce natural superficial e água doce natural subterrânea, respetivamente. Uma vez que para o urânio não existem critérios estabelecidos em Decreto-Lei para máximos dos resultados das componentes da incerteza associadas aos erros aleatórios e aos erros sistemáticos, o Laboratório estabeleceu, por bem, um limite de 10 % para ambos. Verifica-se que tanto os resultados associados aos erros aleatórios quanto os resultados associados aos erros sistemáticos encontram-se abaixo de 10 %, mostrando que a metodologia utilizada é adequada para a estimativa da incerteza. A partir das incertezas relativas para as componentes associadas aos erros aleatórios e sistemáticos, foi calculada a incerteza combinada relativa ( ea ), a partir da Equação 40, para cada uma das matrizes. Capítulo 4 | Apresentação e discussão dos resultados 79 Tabela 33 I Valores obtidos da incerteza combinada, incerteza expandida e incerteza expandida percentual, do para três matrizes diferentes (água de consumo humano (ACH) e água doce natural superficial (ADNSup) e subterrânea (ADNSub)). ea U U (%) ACH 0,059 0,117 11,7 ADNSup 0,078 0,157 15,7 ADNSub 0,065 0,130 13,0 Posteriormente, as incertezas combinadas relativas foram convertidas em incertezas expandidas (U), multiplicando-as pelo fator de expansão, k = 2 (Equação 35), para um nível de confiança aproximadamente 95 %, de acordo com o descrito no Guia Relacre nº31. Esses valores estão apresentados na Tabela 33. Com base na análise da Tabela 33, é possível verificar que a incerteza final do método para o urânio, nas amostras de água de consumo humano, água doce natural superficial e água doce natural subterrânea, foi de 12, 16 e 13 %, respetivamente. Assim, atendendo aos resultados obtidos é demostrada a conformidade com o requisito estabelecido na Diretiva (EU) 2020/2184, no Decreto-Lei n.º 69/2023 e com os critérios de aceitação do Laboratório, uma vez que o valor do critério de aceitação é 30 %, independentemente da matriz estudada. Outra metodologia de quantificação da incerteza associada à justeza utilizada é avaliar a partir de um material de referência. Assim, e de forma complementar para efeitos de comparação, avaliou-se também a incerteza associada à justeza a partir de um material de referência certificado. A Tabela 34, apresenta os valores obtidos do tratamento de resultados efetuado, nomeadamente o bias relativo ( fhij´ ), o desvio padrão relativo associado aos resultados estimados do MRC ( aq!eb ´ ), e a incerteza padrão relativa associada ao valor do MRC ( ei_`r ´ ), a componente da incerteza associada à justeza do método ( eklbf`me<_`def!ge ). Tabela 34 I Resultados obtidos através do MRC da Canada utilizado de forma a calcular a componente associada aos erros sistemáticos do método. fhij´ aq!eb ´ ei_`r ´ eklbf`me<_`def!ge - 0,038 0,025 0,077 0,086 De acordo com a Tabela 34 é possível verificar que o valor obtido da componente associada aos erros sistemáticos foi de 8,6 %. Capítulo 4 | Apresentação e discussão dos resultados 80 Assim, a partir das incertezas relativas para as componentes associadas aos erros aleatórios e sistemáticos, foi calculada a incerteza combinada relativa ( ea ), a partir da Equação 40, para o MRC analisado. Posteriormente, essa incertezas foi convertida em incerteza expandida (U), multiplicando as incertezas combinadas relativas pelo fator de expansão, k = 2 (Equação 35), para um nível de confiança aproximadamente 95 %, de acordo com o descrito no Guia Relacre nº31. Esse valor final da incerteza do método está apresentado na Tabela 35. Tabela 35 I Valores obtidos da incerteza combinada, incerteza expandida e incerteza expandida, em percentagem, do método, para o urânio. ea U U (%) 0,088 0,176 17,6 Com base na análise da Tabela 35, verifica-se que a incerteza final do método para o urânio, quando a incerteza associada à justeza do método sido avaliada através de um MRC, foi de 18 %. Assim, atendendo aos resultados obtidos observa-se que a incerteza do método é ligeiramente superior quando se utiliza um MRC em comparação com os ensaios de recuperação. Contudo, é demostrada, ainda assim, a conformidade com o requisito estabelecido na Diretiva (EU) 2020/2184, no Decreto-Lei n.º 69/2023 e com os critérios de aceitação do Laboratório, uma vez que o valor do critério de aceitação é 30 %. Importa salientar que o Laboratório utiliza os ensaios de recuperação para o cálculo da incerteza do método, uma vez que desta forma consegue-se obter uma incerteza do método para cada tipo de matriz analisada pelo Laboratório. Posto isto, concluí-se que o método foi validado com sucesso e demostrou-se a adequabilidade deste, uma vez que os parâmetros de desempenho foram caracterizados e cumpriram com os critérios impostos pelo Laboratório e em consonância com os da Diretiva (EU) 2020/2184, assim como do Decreto-Lei n.º 69/2023. 4.2.10. Controlo de qualidade do método Após a conclusão do processo de validação do método, procedeu-se à implementação do controlo de qualidade intralaboratorial. Esse controlo é realizado em rotina através da análise de amostras de água natural doce (superficial e subterrânea) e amostras de água de consumo humano, que contêm o analito de interesse. Esse processo permite a monitorização contínua do desempenho analítico em rotina. Os critérios de aceitação estabelecidos para o controlo de qualidade estabelecido são Capítulo 4 | Apresentação e discussão dos resultados 81 apresentados na tabela (Tabela 36). Tabela 36 I Critérios de aceitação aplicados pelo Laboratório para o controlo de qualidade. Ensaio Critério de aceitação (± (%)) CQ LQ (0,10012 µg U/L) 25 CQ 0,6007 µg U/L 15 CQ 5,006 µg U/L 10 Duplicados de amostra 10 Recuperações de amostra 20 Er em MRC 15 4.2.10.1. Controlo de Qualidade Interno De forma a assegurar o controlo de qualidade interno e a precisão dos resultados obtidos, foram realizados duplicados de amostras, tendo em conta os critérios estabelecidos pelo Laboratório apresentados na Tabela 36. Os valores obtidos dos duplicados foram monitorizados por meio de uma carta de aceitação, na qual o limite estabelecido é de 10 %, como é apresentada na Figura 19. Figura 19 I Carta de aceitação de duplicados (LA – 10 %) para a monitorização do controlo de qualidade do método para determinação de urânio. Com base na análise da carta de aceitação da Figura 19, é possível verificar que todas as amplitudes relativas dos ensaios realizados encontram-se abaixo do limite de aceitação estabelecido de 10 %, confirmando e validando a precisão dos resultados obtidos. Além disso, verifica-se que os valores na série de duplicados não ultrapassam os 5 %, o que permite, no futuro, a redução do nível de aceitação para os 5 %. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 010 20 30 40 50 60 Amplitude (%) Número de ensaios 0 2 4 6 8 10 010 20 30 40 50 Amplitude (%) Número de ensaios LA Capítulo 4 | Apresentação e discussão dos resultados 82 Seguidamente, após a verificar que todas as amplitudes relativas dos ensaios realizados se encontravam abaixo do critério de aceitação do Laboratório, procedeu-se à construção da carta de controlo de amplitudes (Figura 20), tendo em conta os dados na Tabela 37. Tabela 37 I Valores definidos em termos de amplitude (%) para os limites de controlo e aviso, tendo em vista a construção da carta de controlo de amplitudes, dos duplicados de amostra. k " (%) LSA (%) LSC (%) D2 D´2 0,989 2,484 3,231 3,267 2,512 Figura 20 I Carta de controlo de amplitudes para os duplicados de amostra, tendo em vista a monitorização do controlo de qualidade do método. A partir da análise da carta de controlo de amplitudes (Figura 20) verifica-se que os pontos experimentais obtidos da amplitude relativa dos duplicados, encontram-se dentro dos limites estabelecidos, demostrando assim que o método se encontra sob controlo e que os resultados são consistentes. O Laboratório tem como procedimento elaborar cartas de aceitação, com o objetivo de implementar um monitoramento rigoroso da qualidade do método. Com esse propósito, recorreu-se à elaboração de uma carta de aceitação para o padrão de menor concentração da curva de calibração (0,10012 µg U/L), um padrão intermédio (0,6007 µg U/L) e o padrão de concentração mais elevada (5,006 µg U/L), recorrendo ao critério de aceitação de 25, 15 e 10 %, respetivamente. Na Figura 21 estão apresentadas as cartas de aceitação para as três concentrações referidas, sendo que em (A) apresenta para o padrão de concentração 0,10012 µg U/L, (B) concentração 0,6007 µg U/L e (C) concentração 5,006 µg U/L. A partir da Figura 21 constata-se que todos os resultados dos padrões selecionados, encontram-se dentro dos limites de aceitação estabelecidos pelo Laboratório. 0 1 2 3 4 010 20 30 40 50 Amplitude (%) Números de ensaios LSC LSA ! " R Capítulo 4 | Apresentação e discussão dos resultados 83 Figura 21 I Cartas de aceitação para o padrão: (A) de menor concentração da curva de calibração (0,10012 µg U/L); (B) intermédio (0,6007 µg U/L) e (C) de maior concentração (5,006 µg U/L) recorrendo ao critério de aceitação de 25, 15 e 10 %, respetivamente. Após a análise das cartas de aceitação, prosseguiu-se com a construção das cartas de controlo. Na Tabela 51 (Anexo 12) são apresentados os valores das medições dos padrões de controlo, utilizados para a elaboração da carta de controlo de indivíduos. A partir desses valores, foram determinados a média, o desvio padrão (S), o coeficiente de variação (CV), assim como o erro relativo (Er), expostos na Tabela 38, para os três níveis de concentração. 4,42 4,94 5,46 0 5 10 15 20 25 C (µg U/L) Número de ensaios 0,50 0,60 0,70 0 5 10 15 20 C (µg U/L) Número de ensaios 0,08 0,10 0,13 0 5 10 15 20 25 C (µg U/L) Número de ensaios LAS LAS LAS LAI LAI LAI LC LC LC (A) (B) (C) Capítulo 5 | Conclusão 90 através de dados de validação do método analítico recolhidos em ambiente intralaboratorial, permitiu demostrar o cumprimento do requisito especificado pela Diretiva (EU) 2020/2184 e pelo Decreto-Lei n.º 69/2023, assim como o critério de aceitação do Laboratório, uma vez que os valores de incerteza de medição obtidos, pelas ambas metodologias realizadas, encontram-se bastante abaixo do critério de aceitação definido de 30 %, sendo que quando se utiliza os ensaios de recuperação para o cálculo da incerteza associada à justeza obteve-se incertezas de 12, 16 e 13 %, para ACH, ADNSup e ADNSub, respetivamente. Já quando se utilizou o MRC para o cálculo da incerteza associada à justeza obteve-se uma incerteza de 18 %. Posto isto, afirma-se que o método foi validado com sucesso, uma vez que os parâmetros de desempenho foram caracterizados e cumpriram com os critérios impostos pelo Laboratório e em consonância com os da Diretiva (EU) 2020/2184 do Parlamento Europeu e do Concelho, datada de 16 de dezembro de 2020, assim como do Decreto-Lei n.º 69/2023, de 21 de agosto de 2023. Após a validação bem sucedida, procedeu-se à avaliação do sistema de controlo de qualidade tendo em vista a garantia da fiabilidade dos resultados durante a análise em rotina dos parâmetros em questão. Assim, através da monotorização do controlo de qualidade interno foi possível a confirmação de que o processo se encontra sob controlo, dado que nenhum dos resultados obtidos na análise dos padrões de controlo escolhidos, excedeu os critérios de aceitação estabelecidos pelo Laboratório. A dissertação realizada no âmbito do segundo ano do Mestrado em Técnicas de Caracterização e Análise Química permitiu colocar em prática os conhecimentos e competências adquiridas ao longo do primeiro ano e desenvolver o espírito crítico necessário para a análise dos resultados e deteção de problemas, possibilitando a ultrapassagem dos obstáculos que invariavelmente foram surgindo em ambiente empresarial. Além de terem sido aprofundadas competências científicas, foi desenvolvida a capacidade de trabalhar em equipa assim como a obtenção de uma maior autonomia no laboratório. Capítulo 5 | Conclusão 6 Capítulo 6 Referências bibliográficas Neste capítulo encontram-se apresentadas as referências bibliográficas utilizadas ao longo da dissertação. Capítulo 6 | Referências bibliográficas 92 [1] ADP S.A., «Águas de Portugal. História.», https://www.adp.pt/pt/proposito/a-nossahistoria/?id=7 , acedido a 23/11/2022. [2] ADP S.A., «Águas de Portugal. 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Imediatamente após o final dos programas deixar a porta da máquina aberta cerca de 10 cm, durante 10 a 15 minutos para se ter bons resultados de secagem e impedir a corrosão da máquina. De notar que a máquina de lavar encontra-se ligada a um depósito de água desionizada. Anexos 99 Anexo 2 I Incerteza expandida da concentração de soluções padrão Figura 23 I Diagrama de “causa-efeito” para a identificação de fontes de incerteza da solução padrão de menor concentração (0,10012 µg U/L). Tabela 41 I Cálculos auxiliares para a determinação das incertezas associadas ao volume da micropipeta, do balão volumétrico e da incerteza combinada e expandida da concentração de uma solução padrão de urânio de 0,10012 µg U/L. Micropipeta de 1000 µ L Descrição Incerteza de x Incerteza padrão (u(x)) Incerteza padrão relativa (u(x)/x) Calibração 0,58 0,33 - Temperatura 0,084 0,048 U (Vpip) - 0,34 0,0034 Balão Volumétrico de 100 mL Descrição Incerteza de x Incerteza padrão (u(x)) Incerteza padrão relativa (u(x)/x) Calibração 0,10 0,041 - Temperatura 0,084 0,048 U (V) - 0,063 0,00063 Cálculo da incerteza combinada uc(y) e da incerteza expandida U(y) Descrição Valor de x uc(y) uc(x)/x Csol.intermédia 2 ( µ g U/L) 100,12 0,31 0,0031 Vpipetado ( µ L) 100,00 0,34 0,0034 Vb.volumétrico (mL) 100,000 0,063 0,00063 Csol.padrão de 0,1 ( µ g U/L) 0,10012 0,00047 - Valor da mensurada Fator de expansão (K) Incerteza expandida (U) 0,10012 2 0,00093 0,10012 ± 9,3 ´ 10-4 µ g U/L Diagrama espinha de peixe para as soluções padrão para a curva de calibração ["#â%&'] ["#$%çã#()*+,-.é0)1(2(33] )!"#ã% Temperatura Calibração Calibração Temperatura )&' ()%* '* +, " Anexos 106 Anexo 6 I Curvas de calibração realizadas ao longo da validação do método de determinação do urânio e respetivos valores das incertezas associadas ao declive e à ordenada na origem, bem como os coeficientes de determinação obtidos para cada curva. Tabela 43 I Equações das curvas de calibração obtidas, ao longo do tempo, e respetivos intervalos de confiança da ordenada na origem e do declive, para 95 % de probabilidade, assim como os respetivos coeficientes de determinação (R2). Data Curvas de calibração R2 24/01/2023 I (cps) =((257,8 ± 8,7)´103).C (µg U/L) + (0,019 ± 4,2)´103 0,9999992 25/01/2023 I (cps) =((309,9 ± 4,4)´103).C (µg U/L) + (0,032 ± 2,1)´103 0,9999494 14/02/2023 I (cps) =((314,1 ± 5,5)´103).C (µg U/L) + (0,032 ± 2,7)´103 0,9999608 15/02/2023 I (cps) =((317,7 ± 8,4)´103).C (µg U/L) + (0,020 ± 4,1)´103 0,9999830 14/03/2023 I (cps) =((360,1 ± 4,7)´103).C (µg U/L) + (0,033 ± 2,3)´103 0,9999842 22/03/2023 I (cps) =((355,5 ± 4,4)´103).C (µg U/L) + (0,022 ± 2,1)´103 0,9999184 22/03/2023 I (cps) =((365,5 ± 3,3)´103).C (µg U/L) + (0,4 ± 1,6)´103 0,9999888 29/03/2023 I (cps) =((370,1 ± 2,0)´103).C (µg U/L) + (1,3 ± 9,9)´102 0,9999520 12/04/2023 I (cps) =((329,7 ± 3,0)´103).C (µg U/L) + (0,078 ± 1,5)´103 0,9999849 10/05/2023 I (cps) =((299,3 ± 6,3)´103).C (µg U/L) + (0,050 ± 3,0)´103 0,9999952 23/05/2023 I (cps) =((241,0 ± 1,4)´103).C (µg U/L) + (0,2 ± 7,0)´102 0,9999972 Anexos 107 Anexo 7 I Carta de controlo para estudo de estabilidade dos declives Tabela 44 I Declives das curvas de calibração obtidos, ao longo do tempo, utilizados para construção da carta de controlo de declives. Data Declive (cps L µ g-1) 24/01/2023 257720,9 25/01/2023 309943,0 14/02/2023 314120,4 15/02/2023 317724,6 14/03/2023 360293.2 22/03/2023 355484,5 Tabela 45 I Declives das curvas de calibração obtidos, ao longo do tempo, utilizados para monitorização da carta de controlo de declives. Data Declive (cps L µ g-1) 22/03/2023 365495,6 29/03/2023 370940,9 12/04/2023 329697,9 10/05/2023 299258,0 23/05/2023 241039,8 Anexos 108 Anexo 8 I Ensaios de recuperação em três matrizes para o estudo da seletividade Tabela 46 I Valores de concentração obtidos em amostras reais, através de ensaios de recuperação para o estudo da seletividade. Camostra µ g U/L Camostra + fortificação µ g U/L Água de Consumo Humano 0,001 1,966 0,001 1,975 0,000 2,014 0,003 2,005 0,001 2,003 0,001 1,995 0,002 1,986 0,002 1,968 0,001 2,025 0,001 1,766 Água Doce Natural Superficial 0,035 2,044 0,036 2,045 0,037 2,098 0,020 2,305 0,020 2,107 0,142 2,189 0,032 2,083 0,032 2,040 0,032 2,086 0,022 2,152 Água Doce Natural Subterrânea 0,003 2,040 2,410 4,429 0,413 2,447 0,407 2,485 0,039 2,088 0,072 2,117 0,008 2,005 0,133 2,123 0,091 2,124 0,034 2,083 Anexos 109 Anexo 9 I Limiares analíticos do método Tabela 47 I Resultados obtidos na leitura de dez brancos, em condições de precisão intermédia. Réplica C ( µ g U/L) 29/03/2023 0,00023 14/04/2023 0,00046 10/05/2023 0,00049 10/05/2023 0,00070 23/05/2023 0,00067 23/05/2023 0,00203 23/05/2023 0,00108 23/05/2023 0,00217 23/05/2023 0,00021 23/05/2023 0,00019 Média 0,00082 Desvio padrão 0,00069 Tabela 48 I Avaliação do padrão de menor concentração da curva de calibração, em condições de precisão intermédia, de forma a confirmar o LQ do método de determinação do urânio em estudo. Réplica C ( µ g U/L) 25/01/2023 0,1026 25/01/2023 0,1016 15/02/2023 0,1042 15/02/2023 0,1055 14/03/2023 0,1040 14/03/2023 0,1043 22/03/2023 0,1015 22/03/2023 0,1011 22/03/2023 0,1023 22/03/2023 0,1030 Média 0,1030 Desvio padrão 0,0014 Anexos 110 Anexo 10 I Precisão do método em condições de repetibilidade Tabela 49 I Concentrações obtidas da avaliação da precisão do método, em condições de repetibilidade. Réplica 0,10012 µ g U/L 0,6007 µ g U/L 5,006 µ g U/L y1 0,10154 0,6006 4,945 y2 0,09929 0,6087 4,954 y3 0,10106 0,6098 4,940 y4 0,10232 0,6196 4,995 y5 0,10304 0,6106 5,073 y6 0,10241 0,6043 5,002 Anexos 111 Anexo 11 I Precisão do método em condições de precisão intermédia Tabela 50 I Concentrações obtidas da análise de três níveis de concentração, ao longo do tempo, para a determinação da precisão intermédia. Data 0,10012 µ g U/L Data 0,6007 µ g U/L Data 5,006 µ g U/L 22/03/23 0,10154 29/03/23 0,5889 22/03/23 4,916 22/03/23 0,09929 29/03/23 0,5970 22/03/23 4,974 22/03/23 0,10106 29/03/23 0,6091 22/03/23 4,901 22/03/23 0,10232 12/04/23 0,6046 22/03/23 4,889 22/03/23 0,10304 12/04/23 0,6125 22/03/23 4,888 22/03/23 0,10241 12/04/23 0,6192 22/03/23 5,005 22/03/23 0,10025 12/04/23 0,6224 22/03/23 5,016 29/03/23 0,10596 12/04/23 0,6264 29/03/23 4,905 29/03/23 0,10053 10/05/23 0,5952 29/03/23 4,941 29/03/23 0,10306 10/05/23 0,5963 29/03/23 5,026 29/03/23 0,10096 10/05/23 0,5962 29/03/23 4,965 29/03/23 0,10365 10/05/23 0,6064 29/03/23 5,001 12/04/23 0,10374 10/05/23 0,6022 12/04/23 5,009 12/04/23 0,10715 23/05/23 0,6006 12/04/23 4,994 12/04/23 0,10835 23/05/23 0,6087 12/04/23 5,106 12/04/23 0,11020 23/05/23 0,6098 10/05/23 4,945 10/05/23 0,10610 23/05/23 0,6196 10/05/23 4,954 10/05/23 0,10475 23/05/23 0,6106 10/05/23 4,940 10/05/23 0,10678 23/05/23 0,6043 10/05/23 4,995 10/05/23 0,10364 23/05/23 0,5838 10/05/23 5,073 10/05/23 0,10649 - - 10/05/23 5,002 23/05/23 0,10661 - - 23/05/23 4,958 23/05/23 0,10593 - - 23/05/23 5,017 23/05/23 0,10603 - - 23/05/23 5,035 23/05/23 0,10824 - - 23/05/23 5,035 Anexos 112 Anexo 12 I Cartas de controlo Tabela 51 I Concentrações obtidas, para três níveis de concentração, ao longo do tempo, para a construção das cartas de controlo. Data 0,10012 µ g U/L Data 0,6007 µ g U/L Data 5,006 µ g U/L 25/01/23 0,10264 25/01/23 0,5940 25/01/23 4,917 25/01/23 0,10312 25/01/23 0,6068 25/01/23 4,985 25/01/23 0,10163 15/02/23 0,5984 25/01/23 4,859 14/02/23 0,10238 15/02/23 0,6074 14/02/23 5,011 14/02/23 0,10508 14/03/23 0,6048 14/02/23 4,885 14/02/23 0,10553 14/03/23 0,6014 14/02/23 4,911 15/02/23 0,10485 14/03/23 0,6165 15/02/23 4,861 15/02/23 0,10190 14/03/23 0,6100 15/02/23 5,008 15/02/23 0,10546 22/03/23 0,5812 15/02/23 5,005 14/03/23 0,10513 22/03/23 0,5819 14/03/23 5,008 14/03/23 0,10403 22/03/23 0,5891 14/03/23 5,018 14/03/23 0,10430 22/03/23 0,5909 14/03/23 5,067 14/03/23 0,10861 22/03/23 0,5878 14/03/23 5,014 14/03/23 0,10559 22/03/23 0,5838 14/03/23 5,003 22/03/23 0,09949 29/03/23 0,5984 22/03/23 4,884