La sangre como marcador de utilidad clínica y toxocológica: estudio de los efecto de los contaminantes persistentes en tortugas marinas

TESIS DOCTORAL EUROPEA La sangre como marcador de utilidad clínica y toxicológica: estudio de los efectos de los contaminantes persistentes en tortugas marinas MARÍA CAMACHO RODRÍGUEZ Las Palmas de Gran Canaria, 2013 3 PROGRAMA DE DOCTORADO CLÍNICA E INVESTIGACIÓN TERAPÉUTICA TESIS DOCTORAL Doctorado Europeo LA SANGRE COMO MARCADOR DE UTILIDAD CLÍNICA Y TOXICOLÓGICA: ESTUDIO DE LOS EFECTOS DE LOS CONTAMINANTES PERSISTENTES EN TORTUGAS MARINAS Memoria que para optar al grado de Doctora por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, presenta la Licenciada MARIA CAMACHO RODRÍGUEZ Directores: Dr. JORGE ORÓS MONTÓN Dr. OCTAVIO PÉREZ LUZARDO Dr. LUIS DOMÍNGUEZ BOADA Jorge Orós Octavio Pérez Luis Domínguez María Camacho Las Palmas de Gran Canaria, 1 de Julio de 2013 PROGRAMA DE DOCTORADO EN CLÍNICA E INVESTIGACIÓN TERAPÉUTICA DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA ANIMAL, PRODUCCIÓN ANIMAL, BROMATOLOGÍA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS TESIS DOCTORAL Doctorado Europeo LA SANGRE COMO MARCADOR DE UTILIDAD CLÍNICA Y TOXICOLÓGICA: ESTUDIO DE LOS EFECTOS DE LOS CONTAMINANTES PERSISTENTES EN TORTUGAS MARINAS Doctoranda MARIA CAMACHO RODRÍGUEZ Las Palmas de Gran Canaria, 1 de Julio de 2013 A mi madre 21 Agradecimientos Con el dinero que mi madre me dio para comprarme unas gafas de vista (50.000 pesetas de la época) me apunté al voluntariado del Programa de Conservación de tortuga boba de Boavista (Cabo Verde), en el verano del año 2000. Si en aquel momento alguien me hubiese dicho que varios años después volvería a colaborar y muestrear tortugas nidificantes para investigar, me hubiera costado mucho creerlo. En aquel entonces estaba empezando la carrera de veterinaria y, una cosa es verdad, ni durante los años de estudio universitario, ni cuando acabé, me imaginé realizar una Tesis Doctoral. Sin embargo, años después volví a Boavista para trabajar con estos seres tan increíblemente espectaculares, de lo cual estoy inmensamente agradecida… Y es a estos seres a los que debo agradecer en primera instancia el que esté escribiendo estas líneas. Gracias por haber soportado más de un pinchazo… y deseo que este trabajo contribuya a mejorar la situación tan comprometida por la que están pasando todas las tortugas marinas. Hoy, después de algunos años y miles de vivencias compartidas, muchas son las personas a las que debo y quiero agradecer su ayuda. Nadie dijo que este sería un camino fácil. Con todos sus momentos, buenos y malos, altos y bajos, sin duda, volvería a empezar. Haber realizado esta Tesis Doctoral me ha permitido trabajar, compartir y conocer a personas que me han enriquecido tanto profesional como personalmente. En primer lugar y como no puede ser de otro modo, agradezco a mis tres Directores Jorge, Octavio y Luis. He de reconocer que he tenido una suerte enorme teniéndoles a ellos como guías. Por ser unos Profesionales “como la copa de un pino”, pero sobre todo por ser tan buenas personas. 22 Gracias Jorge por haberme ofrecido esta oportunidad cuando ni si quiera yo me lo planteaba. Por confiar en mí… Por animarme en algunos momentos en que lo he necesitado y por ayudarme SIEMPRE. Desde los “inicios más iniciales” hasta el final, sin ti no hubiese sido posible nada de todo esto. Tu saber estar y tu buena reacción en algunos momentos han sido fundamentales para darme ánimos y fuerzas cuando lo he necesitado. Gracias por tu paciencia, sobre todo al comienzo de esta aventura. Siento un respeto inmenso hacia tu persona. Siempre tendré presente tu gran profesionalidad, tu enorme capacidad, tu sentido de la responsabilidad y tu trato siempre cercano. A Octavio, más que un Director. Tu infinita paciencia, tu comprensión, tu amabilidad… Gracias por “tu frikismo” en el laboratorio. Por contagiarme tus ganas de averiguar e ir más allá y sobre todo por hacerme creer en todo lo que hacía. Contigo he descubierto la magia de la investigación. Además ambos compartimos ese lado ecologista y más crítico, y nuestra preocupación y sensibilidad por conservar este planeta. Muchas gracias también a ti Luis. Tus sabios consejos (no por viejo… que conste) han sido imprescindibles. Contigo he aprendido muchísimo a mejorar los diferentes trabajos en manuscritos para publicación (que tiene tela!). Gracias también por tu paciencia y tu ayuda. Gracias por tu guía en la estadística y dar respuesta a preguntas que yo sola nunca hubiese podido contestar. Tu humor ha puesto color y alegría en momentos que para mi eran grises. Pero sobre todo, muchas gracias por mostrarme el camino ante un futuro incierto. A Pascual Calabuig, Veterinario del Centro de Recuperación de Fauna Silvestre de Tafira. Sin él nunca hubiese empezado este trabajo. Gracias Pascual por haber pensado en mí y gracias por convencerme de que lo iniciase. Gracias por tu ayuda inicial en la búsqueda de becas. Este trabajo ha sido el nexo perfecto que me ha permitido formarme también en la clínica veterinaria de fauna salvaje durante este tiempo y acercarme al mundo de la conservación. Gracias por enseñarme muchísimas cosas y por confiar siempre en mi. Gracias a Pino Quintana. Nunca sabré como mostrarte mi agradecimiento a tu desinteresada ayuda con el análisis estadístico de datos. Gracias a ti me inicié en “el oculto mundo” de la estadística. GRACIAS por tu paciencia cuando para mi todo lo que me decías sonaba a chino y por poner luz al final del túnel. Gracias a ti he aprendido muchísimo en algo que nunca me hubiese imaginado y sin duda tu despertaste mi interés en saber más. Gracias a la Fundación Loro Parque por confiar e impulsar este trabajo de esta Tesis Doctoral. 23 A todo el personal de Tafira. A Loli por convertirse en una muy buena compañera de trabajo y ayudarme en todo lo que estaba de su mano. A Iballa por facilitarme el trabajo y preocuparse siempre. JUANITO, ¡Paquito!, Toni, Carlos, Santi, Daida, Saulo, Manolo y Vicente me han ayudado con la logística y con las tortuguitas en recuperación. Siempre dispuestos a tenderme una mano cuando lo he necesitado, que han sido muchísimas muchísimas veces. Muchas gracias también a Ale, colega veterinario, compañero becario de Tafira, pero sobre todo amigo. Gracias por ayudarme siempre que te lo he pedido. Tengo que agradecer también a los numerosos voluntarios en prácticas que han pasado por el hospital y me han ayudado, especialmente a Judit Pinós, amiga y la mejor tortuguera del mundo mundial. Gracias Ju!!! Sin ti no sé qué hubiera hecho. A la ONG Natura 2000 de Cabo Verde. Gracias a Luis Felipe López Jurado por aceptarme en el Campamento de Ervatao durante todos los veranos de muestreo. A María, Saray y Ana por facilitarme todo lo que he necesitado y así poder realizar parte de este trabajo en Boavista. Y por supuesto a las personas de Boavista que hacen que te sientas que estás en un sitio que no quieres abandonar. Tengo que nombrar con especial cariño a Fortu por darme cariño y preocuparse por mí, por su rico pan y cuidarnos con sus súper desayunos. Julião por darnos alegría con sus bailes y su risa, sus viajes en el coche con la música caboverdiana a todo volumen recorriendo un paisaje único estarán siempre en mi recuerdo. También tengo que agradecer a todos los monitores y voluntarios con los que he coincidido en Ervatao y han participado en mi trabajo ayudándome cada noche. Si me tuviera que quedar con una única persona de mis estancias en Boavista, sin duda ese sería PEDRÍN. El mejor amigo, compañero de trabajo (friki máximo) y con el que comparto muchísimas cosas. Gracias Pedro por haberme ayudado en tantísimas cosas. Por facilitarme temas logísticos imprescindibles en un lugar como Boavista, por tu gran ayuda en la playa y en el campamento, por escucharme, por tus ánimos y por preocuparte siempre por mí. ¡GRACIAS! Junto a Pedro debo agradecer a Estra de Naturalia, agencia local de ecoturismo de la isla de Boavista, y a sus trabajadores, quienes me avisaban y colaboraban para que pudiera muestrear también las tortugas que ellos marcaban. A Genaro con el me divertía mucho con sus ocurrencias y simpatía. A Chifo! Al que creo que nunca entendería correctamente ni aun estando toda la vida en Boavista, y menos aún por un walkie talkie!! (yo no sé si había encontrado una tortuga o no, si ésta estaba saliendo del mar, volviendo, poniendo los huevos o que ¡madre mía!). Nunca olvidaré la noche que me gritaba tirando de mi mano y corriendo: Força María! Força María! cuando me iba quedando sin fuerzas en la carrera de una punta a otra de Punta Cosme (con flato incluido). Gracias también a Carol y Tom por la ayuda prestada. CAPÍTULO III Organochlorine pesticide and polychlorinated biphenyls in plasma of juvenile and adult nesting Caretta caretta from the Eastern Atlantic .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..163 ABSTRACT . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..165 INTRODUCTION .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..166 MATERIAL AND METHODS (Animal data) .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..167 RESULTS . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..168 DISCUSSION . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..173 CONCLUSIONS .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..178 CAPÍTULO IV Comparative study of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in plasma of Eastern Atlantic juvenile and adult nesting loggerhead sea turtles (Caretta caretta) . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..179 ABSTRACT . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..181 INTRODUCTION .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..182 MATERIAL AND METHODS (Animal data) .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..183 RESULTS . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..185 DISCUSSION . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..187 CONCLUSIONS .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..189 CAPÍTULO V Heavy metals and essential elements values in blood of loggerhead sea turtles (Caretta caretta) from a nesting colony of Boavista Island (Cape Verde, West Africa). . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..193 ABSTRACT . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..195 INTRODUCTION .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..196 MATERIAL AND METHODS (Animal data) .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..197 RESULTS . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..197 DISCUSSION . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..202 CONCLUSIONS .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..207 CAPÍTULO VI Potential adverse health effects of persistent organic pollutants on sea turtles: evidences from a cross-sectional study on Cape Verde loggerhead sea turtles (Caretta caretta) . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..209 ABSTRACT . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..211 INTRODUCTION .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..212 MATERIAL AND METHODS (Animal data) .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..213 RESULTS . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..214 DISCUSSION . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..219 CONCLUSIONS .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..223 CAPÍTULO VII Monitoring organic pollutants and metals in juvenile loggerhead sea turtles (Caretta caretta) undergoing rehabilitation .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 225 ABSTRACT . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 227 INTRODUCTION .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 228 MATERIAL AND METHODS (Animal data) .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 229 RESULTS . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 229 DISCUSSION . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 232 CONCLUSIONS .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 239 CONCLUSIONES . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 241 BIBLIOGRAFÍA . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 245 1. Referencias bibliográficas . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 247 2. Referencias electrónicas . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 275 GLOSARIO . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 277 ANEXO I Crude oil as stranding cause among loggerhead sea turtles (Caretta caretta) in the Canary Islands, Spain (1998-2011) . .. .. .. .. .. .. .. .. ..283 ANEXO II Pansteatitis associated with high levels of polychlorinated biphenyls in a wild loggerhead sea turtle Caretta caretta . .. .. .. .. .. .. .. .. ..289 33 Resumen Durante el transcurso del siglo XX se produjeron innumerables cambios en el ritmo de crecimiento y producción de la civilización humana. El desarrollo de la agricultura intensiva, la concentración a gran escala de las zonas urbanas y la creciente industrialización, han contribuido a la contaminación global de los ecosistemas marinos. Las principales sustancias introducidas por la actividad del hombre incluyen compuestos organoclorados, productos derivados del petróleo y metales pesados. Muchos de estos compuestos son liberados y depositados de forma permanente y es por esto que comúnmente son reconocidos dentro del grupo de Contaminantes Tóxicos Persistentes (CTPs). Los CTPs se caracterizan por su escasa degradación, capacidad para bioacumularse y por sus conocidos efectos carcinogénicos y como disruptores endocrinos y metabólicos. De hecho, a pesar de que el uso y fabricación de algunas de estas sustancias fue prohibido en los años 1970-80, todavía hoy se siguen detectando en muestras humanas, animales o medioambientales. Debido a su toxicidad y persistencia medioambiental, resultan importantes los estudios de detección de niveles de CTPs en las poblaciones de animales de vida libre. Y ello es especialmente relevante para aquellas especies, que como las tortugas marinas, se encuentran amenazadas o en peligro de extinción, pues los efectos que estas sustancias ocasionan en el organismo podrían contribuir al decline de tales poblaciones. En este contexto hemos de reseñar que los CTPs han sido detectados en tejidos de tortugas marinas de todo el mundo y que la contaminación química se postula como un gran factor de riesgo para la conservación de las diferentes especies de tortugas marinas. 34 El presente trabajo estudia los perfiles de contaminación por CTPs en sangre de las poblaciones de tortuga boba de Canarias y Cabo Verde. Además analiza los potenciales efectos tóxicos de los contaminantes sobre el estado general de las tortugas y sus parámetros clínicos, observándose numerosas asociaciones entre las concentraciones de CTPs y el estado de salud las tortugas. 35 Estructura del presente manuscrito de tesis doctoral Hemos creído conveniente para una mejor comprensión del presente manuscrito incluir este apartado en el que explicamos cuál ha sido la estructura que hemos elegido para presentar los resultados y conclusiones obtenidas. Dado que el trabajo realizado durante estos años ha dado lugar a la preparación de varios manuscritos para publicación en revistas científicas internacionales hemos decidido presentar los resultados de esta Tesis Doctoral manteniendo la estructura de dichas publicaciones, en el idioma original en el que fueron escritas (inglés), ya que esta Tesis Doctoral opta a la titulación homologada de la UE. No obstante, para facilitar su lectura y contextualización hemos preparado un capítulo de introducción general. Aunque cada capítulo-manuscrito tiene su pequeña introducción individual. Seguidamente a la introducción general se exponen la Justificación y Objetivos principales del presente trabajo de Tesis Doctoral. Con respecto a la descripción del Material y Métodos y la relación de referencias bibliográficas se ha optado por unificar la información y presentarlas de forma conjunta, salvo para los Capítulos I y II, donde se ha insertado la separata original del artículo publicado para el correspondiente estudio debido a que estos dos últimos capítulos-manuscritos presentan una metodología diferente. En el resto de Capítulos (III-VII), se exponen los resultados, discusión y conclusiones correspondientes a cada estudio, además de su breve introducción, como ya comentamos anteriormente. 36 Las conclusiones generales se presentan igualmente de forma conjunta para todos los capítulos al final del presente manuscrito. De esta manera este manuscrito de Tesis Doctoral consta de siete capítulos diferentes, correspondiendo cada uno de ellos con un trabajo preparado para publicación internacional. Los capítulos que conforman esta Tesis Doctoral son los siguientes: CAPÍTULO 1: Estado metabólico y respiratorio de tortugas boba (Caretta caretta) juveniles varadas: 66 casos (2008–2009). En este apartado se evalúan los desórdenes ácido-base y bioquímicos que las tortugas presentan en el momento del ingreso al hospital, determinando de esta manera el tipo de deshidratación desarrollado. Además se estudiaron diferencias entre las causas de ingreso y la evolución de las tortugas y se establecen rangos de referencia de valores de rehabilitación de pH, gases sanguíneos, electrolitos, glucosa, BUN y osmolalidad. Publicado en Journal of the American Veterinary Medical Association, 2013 Vol 242 (3): 396-401. CAPÍTULO 2: Adenitis de la glándula de sal como única causa de varamiento en tortugas boba (Caretta caretta) varadas. En este trabajo se describe la morfología y patología de la adenitis de la glándula de sal como una causa de varamiento en tortugas boba. Además se evalúan la concentración en plasma de sodio, cloro y osmolalidad en dos de las tortugas que ingresaron vivas y presentaron la misma lesión en la glándula sal, evolucionando negativamente. Publicado en Diseases of Aquatic Organisms, 2012 Vol 95: 163–166. CAPÍTULO 3: Determinación de pesticidas organoclorados y bifenilos policlorados en plasma de juveniles y hembras nidificantes de Caretta caretta del Este del Atlántico. En este capítulo se determinan concentraciones en plasma de contaminantes orgánicos persistentes (COPs) y se evalúan las diferencias entre grupos de tortugas, zonas geográficas, años de muestreo y tamaño de las tortugas. Además en el caso de las tortugas juveniles, se evalúan las posibles asociaciones entre las causas de varamiento de los animales y la concentración de COPs. Aceptado para publicación en la revista Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. CAPÍTULO 4: Determinación de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) en plasma de juveniles y hembras nidificantes de Caretta caretta del Este del Atlántico. En este apartado se determinan las concentraciones en plasma de PAHs y se estudian las diferencias entre grupos de tortugas, zonas geográficas, años de muestreo y tamaño de las tortugas. También, en el caso del grupo de tortugas juveniles, se evalúan las posibles asociaciones entre las causas de varamiento de los animales y la concentración de PAHs. Publicado en Marine Pollution Bulletin, 2012 Vol 64:1974–1980. 37 CAPÍTULO 5: Determinación de metales y metaloides en sangre de Caretta caretta de la población nidificante en Boavista (Cabo Verde). En este capítulo se monitorizan los niveles de contaminantes inorgánicos persistentes (CIPs) en sangre de tortuga boba de hembras nidificantes sanas. Además se estudian los potenciales efectos de los CIPs sobre parámetros generales de salud y el tamaño de hembras adultas. Igualmente se analizan diferencias con el tamaño de las tortugas y los niveles de contaminación. Aceptado para publicación en la revista Marine Environmental Research. CAPÍTULO 6: Posibles efectos adversos sobre la salud de los contaminantes orgánicos persistentes en tortugas marinas: evidencias de un estudio transversal en tortugas bobas (Caretta caretta) de Cabo Verde. En este capítulo se estudian los potenciales efectos de los COPs sobre parámetros hematológicos y bioquímicos de tortugas sanas nidificantes. Además se evalúan diferencias observadas entre el tamaño de las tortugas y las concentraciones de contaminantes encontradas. Publicado en Science of the Total Environment, 2013 Vol 458460: 283–289. CAPÍTULO 7: Determinación de COPs y metales en juveniles de tortugas boba (Caretta caretta) durante el periodo de rehabilitación. En el presente capítulo, además de monitorizar los niveles de CTPs durante diferentes momentos del proceso de recuperación de las tortugas, se evalúan los potenciales efectos de los CTPs sobre parámetros sanguíneos. Además, se estudian diferencias de contaminación entre tortugas que mueren durante el periodo de rehabilitación con aquellas que sobreviven. Igualmente se analizan las posibles diferencias con las variadas causas de varamiento y la condición corporal de las tortugas en el momento del ingreso con la concentración de contaminantes. En el momento del depósito de esta Tesis Doctoral el presente capítulo-manuscrito se encuentra en fase de revisión para su publicación internacional. Además, se anexan dos trabajos llevados a cabo durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral por parte de nuestro grupo de investigación y que guardan relación con el contenido de este manuscrito: ANEXO I: Crude oil as stranding cause among loggerhead sea turtles (Caretta caretta) in the Canary Islands, Spain (1998-2011). ANEXO II: Pansteatitis associated with high levels of polychlorinated biphenyls in a wild loggerhead sea turtle Caretta caretta. INTRODUCCIÓN 1. Generalidades de las tortugas marinas 2. Valores hematológicos y bioquímicos de las tortugas marinas 3. La contaminación química global 4. Características generales de los contaminantes tóxicos persistentes (CTPs) 5. Contaminantes tóxicos persistentes en fauna salvaje 46 Además de la explotación directa y las capturas indirectas, existen otras amenazas antropogénicas que actúan sobre estos reptiles. El desarrollo urbanístico en las zonas costeras, donde las tortugas ponen sus huevos, puede impedir o reducir la nidificación, o bien reducir el éxito de eclosión (Lutcavage et al., 1997a). Los programas de conservación que se desarrollan in situ en poblaciones de todo el mundo son numerosos. Estos programas incluyen protección y monitorización de las playas de nidificación, de las hembras y de los nidos. Además desarrollan una importante labor de sensibilización a las poblaciones locales. En las últimas décadas, el aumento del tráfico marítimo también ha conllevado efectos negativos directos e indirectos sobre todas las especies animales que habitan en este ecosistema, incluidas las tortugas marinas. Por un lado, algunos autores han descrito traumatismos, cortes y amputaciones en las tortugas (Calabuig and Liria, 2007; Margaritoulis, 2007; Orós et al., 2005) por colisiones directas con barcos u otras embarcaciones. Además, los vertidos accidentales o ilegales de petróleo suponen un gran riesgo para estas especies (Milton et al., 2003). El petróleo y sus derivados, así como otras sustancias tóxicas y residuos sólidos no degradables vertidos al mar, pueden circular por los océanos y acumularse en las zonas de convergencia y líneas de deriva. En estos mismos lugares, las corrientes oceánicas concentran los nutrientes que estimulan la proliferación del plancton y de otros organismos. Estas zonas constituyen los hábitats de alimentación de los juveniles de tortugas marinas durante la fase pelágica de su ciclo biológico. La ingesta de petróleo y de otros contaminantes ambientales puede producirles una grave intoxicación y posteriormente la muerte. Así, algunos autores han descrito la muerte por petróleo de tortugas marinas varadas en las costas de las Islas Canarias (Orós et al., 2005). Recientemente, nuestro grupo de investigación ha estudiado la incidencia de tortugas varadas por petróleo en las costas de las Islas Canarias, mostrando una disminución en el número de tortugas varadas por esta causa a partir de la declaración de las aguas del Archipiélago como zona marítima especialmente sensible por la Organización Marítima Internacional (OMI) (Camacho et al., 2013a) (ver Anexo I). Sin embargo, hoy en día las tortugas petroleadas siguen siendo una causa de varamiento en las costas del Archipiélago (Orós et al., 2013). Además los efectos crónicos a la exposición de estos contaminantes han sido escasamente estudiados (Lutcavage et al., 1997a). Por otro lado, la ingestión de plásticos y de otros cuerpos extraños, que son confundidos con alimentos, puede originar lesiones y obstrucciones graves en el tracto digestivo (Lazar and Gracan, 2011; Orós et al., 2005; Torrent et al., 2002). Además, las tortugas pueden enredarse en la basura y desechos de los barcos como sacos de rafia, cabos y trozos de redes que causan amputaciones de miembros e incluso muerte por ahogamiento (Calabuig and Liria, 2007; Gibson and Smith, 1999; Orós et al., 2005). Además, el análisis retrospectivo de las causas de varamiento de tortugas marinas vivas en las costas de las Islas Canarias en la última década, muestra cómo la mayor parte de los animales vararon por razones derivadas de la actividad humana, siendo la causa más frecuente el 47 enmallamiento en las artes de pesca (50.98%) (Orós et al., 2013). Por otro lado, nos parece importante resaltar el importante número de tortugas que varan y se desconoce su causa (14.08%). La etiología de estos varamientos quizás esté vinculada con la creciente contaminación marina, aunque esta teoría debe ser todavía estudiada. De forma indirecta, la contaminación química ambiental, no solo la causada directamente por el creciente tráfico marítimo sobre los océanos, sino también la contaminación derivada de numerosas sustancias químicas utilizadas por el hombre o la derivada de su propia actividad, es otro de los importantes factores que están influyendo negativamente sobre las poblaciones de tortugas marinas de diferentes maneras. Además, la contaminación ambiental va ligada al cambio climático que se predice en el próximo siglo (IPCC 2007). Los efectos negativos de este calentamiento global han planteado numerosas cuestiones, y las tortugas marinas no han quedado al margen (Poloczanska et al., 2009). Además, el efecto inmunosupresor de numerosas sustancias químicas ha sido documentado en numerosos experimentos tanto de laboratorio como en animales de vida libre (Keller et al., 2000, 2005 y 2006). La aparición de algunas enfermedades en especies marinas ha sido relacionada con la contaminación ambiental (Lafferty et al., 2004). Algunos autores han hipotetizado que la alta prevalencia de tumores (fibropapilomas) en ciertas poblaciones de tortugas marinas está asociada a este efecto inmunosupresor de los contaminantes (Aguirre et al., 1994; Schumacher et al., 1998). Aunque en menor medida que, por ejemplo la pesca incidental, las enfermedades naturales también ocasionan la muerte o debilitamiento de las tortugas marinas. Enfermedades con un origen nutricional, metabólico, bacteriano, parasitario, vírico o micótico han sido documentadas en estos reptiles (McArthur, 2004; Wyneken et al., 2006). Se han realizado en los últimos años importantes avances sobre ciertas patologías o causas de muertes naturales que acechan a estos organismos. Sin embargo, todavía no se tiene un buen conocimiento de muchas de sus enfermedades, ya que la mayoría de las tortugas estudiadas se encuentran muertas o la muerte no se puede atribuir a una causa particular. Por otro lado, el estudio de parámetros clínicos, como valores hematológicos y bioquímicos, son fundamentales a la hora de poder diagnosticar e interpretar los procesos patológicos que afectan a estas especies. Aunque disponemos de una amplia revisión de valores fisiológicos de ciertos indicadores de salud en tortugas marinas, determinados parámetros bioquímicos han sido escasamente estudiados. Recientemente nuestro grupo de investigación ha llevado a cabo un estudio encaminado a ofrecer un mayor conocimiento de parámetros bioquímicos indicadores del estado nutricional y del grado de deshidratación que padecen tortugas varadas en las Islas Canarias (Camacho et al., 2013c) (datos correspondientes al Capítulo I). Aunque las causas de varamiento fueron 48 en su mayoría motivadas por razones antropogénicas, el origen que llevó al varamiento de algunos animales debilitados de este estudio no fue identificado. Se ha observado un creciente ingreso de ejemplares severamente debilitados en algunos hospitales de tortugas marinas en la costa este de EE.UU. (Norton et al., 2005). Sin embargo, se desconocen las causas que originan que estos animales presenten estos cuadros típicos de anemia, leucocitosis (indicativa de infecciones bacterianas), deshidratación, hipoglucemia, severa caquexia y una gran carga de parásitos externos. A pesar del enorme progreso realizado en las últimas cinco décadas en relación a la historia natural, biología y ecología de las tortugas marinas, son numerosas las incógnitas que aún deben ser investigadas. La contaminación ambiental y la aparición de enfermedades promovidas por cambios en el ambiente inducidos por el hombre han sido previamente sugeridas (Lafferty et al., 2004; Witham, 1995). Muchos son los efectos tóxicos ampliamente conocidos de sustancias xenobióticas en los seres vivos. Sin embargo, a pesar de que numerosos estudios han monitorizado sustancias químicas en las tortugas marinas, la evaluación de los potenciales efectos de los contaminantes ambientales sobre la salud de las poblaciones de tortugas marinas ha sido escasamente estudiada. Las tortugas marinas no han quedado aisladas de esta contaminación y por ello los estudios de monitorización de los niveles contaminación de sustancias químicas se encuentran entre las 20 cuestiones prioritarias para la conservación de las tortugas marinas a nivel mundial (Hamann et al., 2010), lo que ha motivado el planteamiento de esta Tesis Doctoral. 49 2. Parámetros hematológicos y bioquímicos de las tortugas marinas Los parámetros clínicos proporcionan una herramienta diagnóstica y pronóstica fácil tanto en vertebrados superiores como inferiores (Campbell, 2004; Canfield, 1998; Tavares-Dias et al., 2009). Por lo tanto, el establecimiento de rangos normales de referencia de parámetros hematológicos y bioquímicos es considerado muy importante para la evaluación y seguimiento del estado de salud de los quelonios. Tales evaluaciones son dependientes de la existencia de los valores de referencia fiables para animales sanos. Recientemente, algunos estudios han aportado rangos normales de referencia tanto para quelonios de vida libre como para animales cautivos (Hidalgo-Vila et al., 2007; Knotková et al., 2002; Metin et al., 2006; Pires et al., 2006; Samour et al., 1998). Se ha descrito que tortugas criadas en cautividad pueden tener valores sanguíneos diferentes que tortugas salvajes (Bolten and Bjorndal, 1992; Chandavar and Naik, 2004; Santos et al., 2005), debido a la artificialidad de la dieta o a condiciones estresantes (Bolten and Bjorndal, 1992; Santos et al., 2005). Sin embargo, los estudios de valores fisiológicos sanguíneos de tortugas mantenidas en cautividad nos pueden proporcionar información sobre la salud de los animales y, por lo tanto puede ser utilizado como una herramienta de trabajo rápido para el diagnóstico (Pires et al., 2006). El número de estudios llevados a cabo en tortugas marinas en las últimas décadas deja de manifiesto el gran esfuerzo en investigación y conservación que se viene desarrollando en este grupo de reptiles. Valores de referencia de parámetros sanguíneos en diferentes especies de tortugas marinas han sido publicados en distintas poblaciones de todo el mundo (Bolten and Bjorndal, 1992; Casal et al., 2009; Deem et al., 2009; Delgado et al., 2011; Flint et al., 2010; Gelli et al., 2009; Jacobson et al., 2007; Stamper et al., 2005; Swimmer, 2000). Sin embargo, ciertos parámetros bioquímicos como los electrolitos, gases sanguíneos y el estado ácido-base han sido escasamente estudiados en estas especies (Camacho et al., 2013c; Innis et al., 2007). Los parámetros sanguíneos en quelonios y reptiles en general, son influenciados por muchos factores, condiciones ambientales, edad, sexo, estado de salud, sitios geográficos, estado fisiológico como la hibernación y reproducción (Christopher, 1999; Dickinson et al., 2002; Heard et al., 2004; Jacobson, 2007). De igual manera al resto de reptiles, las tortugas marinas son animales ectotérmicos, por ello los cambios estacionales en la temperatura se acompañan de cambios en su temperatura corporal (Lutz and Dunbar-Cooper, 1987). Algunos cambios observados en la bioquímica sanguínea de las tortugas marinas demuestran que las concentraciones de los iones internos se emplean para regular la actividad de las vías metabólicas sensibles a estos iones (Lutz, 1975). Por lo tanto, cuando se realice una interpretación de datos hematológicos o bioquímicos, se debe considerar la gran influencia que determinados factores externos tienen sobre la 50 fisiología normal y la salud de los vertebrados ectotérmicos en comparación con los vertebrados endotérmicos. Por ejemplo, las hembras de iguana verde (Iguana iguana) grávidas presentan significativamente mayores concentraciones de calcio, fósforo, proteínas totales, colesterol y globulina que los machos, las hembras no grávidas y los juveniles. Además, las hembras grávidas presentan un ratio albúmina: globulina significativamente menor que los otros 3 grupos mencionados. Las hembras no grávidas presentan significativamente mayor calcio y colesterol que los machos. Los juveniles exhiben significativamente mayor concentración de glucosa, comparado con los adultos, y significativamente mayor calcio que los machos adultos (Harr et al., 2001). De igual manera, en tortugas marinas también se han demostrado diferencias significativas entre parámetros sanguíneos en función de la alimentación, zona geográfica y estado fisiológico (Casal et al., 2009; Deem et al., 2009). Además, diferencias en la condición y estado de salud de tortugas marinas varadas también deben ser tenidos en cuenta a la hora de interpretar los valores de parámetros sanguíneos (Anderson et al., 2011; Casal and Orós, 2009; Innis et al., 2007). La evaluación de los parámetros hematológicos proporciona información rápida y útil para el clínico en reptiles (Jacobson, 2007; Tavares-Dias et al., 2009). Los parámetros hematológicos más frecuentemente determinados incluyen: recuento de glóbulos rojos (RBC), glóbulos blancos (WBC) y diferencial de leucocitos, así como el examen de la morfología de las células sanguíneas en frotis teñidos. De esta manera, los parámetros hematológicos son ampliamente utilizados para diagnosticar enfermedades en quelonios, evaluar el estado de salud de los individuos (Christopher et al., 2003; Joyner et al., 2006; Work and Balazs, 1999), y como un indicador pronóstico después del tratamiento (Knotkova et al., 2005). Muchas de las enfermedades (por ejemplo, hemoparasitosis, enfermedades inflamatorias) están asociadas con cambios en los parámetros hematológicos en quelonios. Es importante tener en cuenta que para la recogida de la sangre destinada a la realización de tests bioquímicos se recomienda el uso de heparina de litio como anticoagulante. Además, se deben obtener el plasma en lugar del suero debido a que en reptiles la formación del coágulo puede demorarse mucho y resultar en cambios significativos en algunos valores bioquímicos del suero (especialmente los electrolitos) (Bolten et al., 1992). Por otra parte, también son importantes las diferentes técnicas desarrolladas por los laboratorios para las pruebas bioquímicas, debiendo ser tenidas en cuenta a la hora de interpretar los resultados obtenidos (Wolf et al., 2008). Los valores bioquímicos sanguíneos frecuentemente usados en las tortugas marinas y en otros reptiles son: proteínas totales, albúmina, globulina, bilirrubina total, creatinina, ácido úrico, aspartato aminotransferasa (AST), alanina 51 aminotransferasa (ALT), fosfatasa alcalina (ALP), creatinkinasa (CPK), lactato deshidrogenasa (LDH), gamma glutamil transpeptidasa (GGT), nitrógeno ureico sanguíneo (BUN), calcio, fósforo, colesterol, triglicéridos, glucosa, hierro, sodio, potasio y cloro (Aguirre, 1996; Campbell, 1996). Los cambios en los parámetros bioquímicos inducidos por diferentes condiciones patológicas son similares a los observados en los mamíferos, aunque existen diferencias (Heard et al., 2004). Los valores bioquímicos plasmáticos representan un buen instrumento diagnóstico para monitorizar el estado de salud de las tortugas marinas en estado silvestre (Aguirre et al., 1995; Bolten and Bjorndal, 1992). El plasma de muchos quelonios sanos muestra una coloración amarilloanaranjada. Esto puede ser el resultado de la ingestión de pigmentos carotenoides de plantas y no debería ser necesariamente interpretado como un indicativo de una anormal o excesiva degradación de la hemoglobina (Nakamura, 1980). Bolten y Bjorndal (1992) afirman que las tortugas verdes (Chelonia mydas) que presentan un plasma poco coloreado han estado alimentándose de forma carnívora en mar abierto, mientras que las que presentan un plasma amarillento son de tendencia herbívora. La contaminación con linfa de las muestras sanguíneas obtenidas de los quelonios causa dilución en los parámetros LDH, ALP, ácido úrico y albúmina. La linfodilución no presenta efectos sobre los resultados de la urea, fósforo o calcio. Como en otros reptiles, durante la foliculogénesis de las tortugas hembras, los niveles de calcio, fósforo, globulina y colesterol pueden observarse elevados (Raphael, 2003). La evaluación de las respuestas hematológicas y bioquímicas a factores fisiológicos y ambientales, y estudios comparativos de las tortugas clínicamente sanas y enfermas proporcionanan información detallada para su gestión y conservación. Esto es especialmente importante en especies en peligro de extinción, ya que dicha información se puede utilizar para planificar estrategias dirigidas a su conservación (Aguirre et al., 1995; Bolten and Bjorndal, 1992; Brenner et al., 2002; Casal et al., 2009; Casal and Orós, 2009). 52 3. La contaminación química global En 1962, Rachel Carson escandalizó a la sociedad con las descripciones de cómo los contaminantes ambientales afectan a las poblaciones de vida silvestre. Desde entonces, numerosos autores han descrito las consecuencias fatales del uso de ciertos contaminantes químicos sobre la vida silvestre y por supuesto sobre los seres humanos. Cáncer, anormalidades en el desarrollo, alteraciones reproductivas, inmunosupresión son algunos de los efectos conocidos de muchas sustancias tóxicas que se encuentran en los seres vivos provenientes del medio ambiente. Si bien nadie puede negar que los productos químicos aportan importantes beneficios para la sociedad, a través de su uso en la asistencia sanitaria por ejemplo, existen numerosas evidencias de que algunos de ellos están dañando la vida silvestre y por desgracia a los seres humanos. En el momento actual se vive una crisis financiera mundial debido, probablemente, al modelo de vida por el que han apostado los países desarrollados en las últimas décadas de nuestra existencia. Este modo de vida del ser humano ha acarreado consecuencias fatales sobre nuestros ecosistemas y sobre todos los seres vivos de nuestro planeta. ¿Podemos seguir creciendo hasta el infinito en un planeta finito? El planeta padece un grado terrible de contaminación cuyas consecuencias afectan a nuestra propia salud. El concepto ético de “desarrollo sostenible” ha respondido inicialmente a la esperanza de un cambio de este modelo. Numerosos acuerdos y compromisos internacionales intentan mejorar nuestra futura calidad de vida. Sin embargo, la sociedad del siglo XXI, es hoy por hoy dependiente de productos químicos artificiales en prácticamente todo lo que nos rodea: de los plaguicidas a los cosméticos, desde biberones a los ordenadores, etc Por un lado, el mundo de la alta tecnología ha experimentado una aceleración constante y progresiva en los últimos treinta años. Cada año, los fabricantes presentan nuevas maravillas técnicas para ganar posiciones en una carrera impuesta por las feroces leyes del mercado. Las novedades generan expectación y más de un consumidor no puede resistirse a cambiar de móvil, de ordenador o de reproductor de MP3 si el bolsillo se lo permite. Una de las consecuencias más inmediatas de este consumo exacerbado es que, cada año, más dispositivos electrónicos acaban en los contenedores de basura. Sólo en España, las familias producen más de 100.000 toneladas al año de basura electrónica (frecuentemente denominada con el térmico anglosajón E-Waste). Si a esa cantidad se le añaden los desechos que produce el sector de la electrónica, el resto de la industria y los establecimientos comerciales, se alcanza la cifra en toda España de 200.000 toneladas de desperdicios electrónicos al año. Se estima que la producción global de basura electrónica es de 20-25 millones de toneladas por año, siendo la mayor parte producida en Europa, Estados Unidos y Australasia. No obstante, China, los países de Europa del Este y Latinoamericanos se convertirán también en grandes 53 productores de basura electrónica durante los próximos diez años (Robinson, 2009). La basura electrónica contiene metales valiosos como el cobre o el platino, pero también numerosos contaminantes ambientales potenciales, especialmente plomo, estaño, mercurio, cadmio, níquel, difeniléteres polibrominados (PBDEs) y bifenilos policlorados (PCBs). Además, la incineración de la basura electrónica puede generar dioxinas, furanos e hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs), entre otros. Una gran mayoría de esta basura electrónica es desechada, aun actualmente, en los vertederos, ya que la tecnología de reprocesamiento efectiva, que recupera la mayor parte de los materiales minimizando el impacto ambiental, es muy cara. En consecuencia, pese a ser ilegal en el marco del Convenio de Basilea (UNEP 2009), los países ricos exportan cada año una cantidad desconocida de desechos electrónicos a los países pobres, donde las técnicas de reciclaje incluyen la quema y la disolución en ácidos fuertes con muy pocas medidas para proteger la salud humana y el medio ambiente (Cobbing 2008). Este tipo de “reprocesamiento” da como resultado inicial una fuerte contaminación local, pero que en breve plazo es seguida por la migración de los contaminantes a los acuíferos y finalmente a su incorporación a la cadena alimenticia. Los trabajadores del sector de los desechos electrónicos sufren efectos negativos en la salud por el contacto con la piel y la inhalación de estas sustancias (Qu et al., 2007), mientras que la comunidad en general está expuesta a los contaminantes a través del humo, polvo, agua potable y sobre todo de los alimentos (Chatterjee, 2007). Por otro lado, otro gran sector de la industria química -el de los productos plaguicidasha contribuido enormemente en los últimos 70 años a incrementar los rendimientos del sector agrícola mediante el control de las plagas y enfermedades, y también el control de la enfermedades transmitidas por insectos (paludismo, dengue, encefalitis, filariasis, etc) (Abhilash and Singh, 2009). La necesidad de aumentar la producción de alimentos para la población mundial en rápido crecimiento es bien conocida y una de las estrategias para aumentar la productividad de los cultivos es el manejo efectivo de plagas ya que más del 45% de la producción anual de alimentos se pierde por la infestación de plagas. En los países tropicales las pérdidas en los cultivos son aún mayores debido a que las elevadas temperaturas y el alto grado de humedad dan lugar a la proliferación de las plagas, por lo que la aplicación de productos plaguicidas es muy intensa en estos países (Abhilash and Singh, 2009). Debido al uso y abuso de este tipo de productos se produce una considerable generación de residuos, lo cual repercute en el coste de los productos, pero sobre todo produce consecuencias adversas sobre la salud de los ecosistemas y del hombre. La aplicación inadecuada de plaguicidas afecta al medioambiente en su conjunto, haciendo que los residuos contaminen el suelo, el aire y las aguas y que finalmente alcancen la cadena alimentaria (UN/DESA 2002). De entre todos los grupos de insecticidas preocupan especialmente los insecticidas organoclorados como el diclorodifeniltricloroetano (DDT), hexaclorociclohexano (HCH), aldrina y dieldrina, ya que, aún hoy en día, se encuentran entre los plaguicidas más utilizados en los países en desarrollo de 54 África y Asia debido a su bajo coste, eficacia y versatilidad en la lucha contra plagas y los insectos vectores de enfermedades (Lallas, 2001). Sin embargo, debido a su potencial de bioacumulación y efectos biológicos, estos compuestos fueron prohibidos en los países desarrollados desde hace más de tres décadas (Luzardo et al., 2006; Zumbado et al., 2005). Su resistencia a la degradación ha dado lugar a la contaminación universal por estos compuestos que se encuentran en muchos compartimentos del medio ambiente. Según el inventario de la Organización para la Agricultura y la Alimentación (FAO), más de 500.000 toneladas de plaguicidas obsoletos y no utilizados representan una amenaza real para el medio ambiente y la salud pública mundial. Si bien hemos mencionado dos de los grandes sectores de la industria química, otro grupo de contaminantes que no podemos desligar es el de la industria petroquímica. En nuestras sociedades los modelos de producción están directa o indirectamente basados en el consumo de hidrocarburos. La energía que hoy se emplea mundialmente proviene, en su mayor parte, de la combustión de hidrocarburos; los medios de transporte (terrestres, aéreos y marítimos) los emplean como combustibles, y gran parte de la variada gama de productos plásticos se sintetizan a partir de ellos. La extrema dependencia alcanzada hacia los hidrocarburos por el mundo actual, y su elevado consumo, han traído aparejados problemas ambientales expresados en términos de contaminación atmosférica por sus productos de combustión, contaminación de aguas, derrames de petróleo y producción y acumulación de residuos no biodegradables (plásticos). Por otra parte, siendo el petróleo, el gas natural y el carbón recursos naturales no renovables, su consumo debería racionalizarse y muchas de sus aplicaciones, sobre todo la energética, sustituirse paulatinamente por fuentes ambientalmente más limpias y duraderas. Por lo tanto, los PAHs han estado presentes como contaminantes desde los inicios de la vida del hombre, ya que son compuestos naturales presentes en el medio ambiente. Sin embargo, el crecimiento industrial ha supuesto un aumento de gran número de contaminantes en el entorno natural, entre ellos estos hidrocarburos. Existe un vínculo entre el cambio climático y los hidrocarburos, ya que la quema de combustibles fósiles es la principal fuente de emisiones de dióxido de carbono a la atmósfera. Debido a la creciente preocupación sobre el calentamiento global del planeta, se han firmado acuerdos internacionales con el compromiso de disminuir las emisiones de CO2 en la atmósfera, cuyos niveles han aumentado de un modo alarmante durante las últimas décadas. Toda esta situación de contaminación medioambiental con sustancias que producen efectos adversos sobre la salud es altamente preocupante y lógicamente no ha pasado desapercibida a las autoridades gubernamentales. Por este motivo, en el año 2006 la Unión Europea (UE) promulgó una ambiciosa y monumental iniciativa legislativa para el Registro, Evaluación, Autorización y Restricción de las sustancias químicas (REACH). Había muchas razones para la 55 promulgación del REACH, pero en general es una extensión del deseo global de que se produzcan menos productos químicos industriales, de comprender los posibles riesgos humanos y ecológicos de los que ya existen, y de asegurarse de que no se produce ninguna nueva catástrofe o amenaza relacionada con el uso de las sustancias químicas (Williams et al., 2009). De acuerdo con esta directiva comunitaria, salvo unas pocas excepciones, es necesario el registro de todas las sustancias químicas fabricadas o importadas en la UE. Esta inscripción en el registro generará un expediente que contendrá datos sobre las características físicoquímicas, así como las propiedades toxicológicas y ecotoxicológicas de cada una de las sustancias. Para muchos productos químicos, el examen de los peligros y riesgos derivados del uso de estas sustancias también se requerirá en forma de un informe de seguridad química. Comenzando con el doble proceso de expediente y la evaluación de sustancias, la Agencia Europea de Sustancias Químicas (ECHA), los Estados miembros de la UE, y la Comisión Europea identificarán los productos químicos que representan riesgos inaceptables para la salud humana y/o el medio ambiente, y en consecuencia reducirán o restringirán su uso. No obstante, a pesar de que REACH y otros acuerdos internacionales son una ambiciosa estrategia de cara al futuro, no resuelve el problema de los contaminantes que ya han sido vertidos y están en circulación en el medioambiente. Por esto, varias organizaciones internacionales han desarrollado estrategias encaminadas a eliminar o reducir la producción, uso y liberación de las sustancias persistentes y bioacumulativas con efectos adversos para la salud, los denominados contaminantes tóxicos persistentes (CTPs). 62 De cara a facilitar la descripción de las características de los compuestos organoclorados seleccionados para este trabajo de Tesis Doctoral, abordaremos su estudio por separado, dividiéndolos en: 1) Plaguicidas organoclorados y 2) Dioxinas y compuestos análogos. El otro grupo de compuestos orgánicos analizado es el de los PAHs, el cual describiremos separadamente en tercer lugar, por la ausencia de cloro en su estructura química. 4.1.1. Plaguicidas organoclorados Bajo el nombre de plaguicidas organoclorados (POCs) se agrupa un número considerable de compuestos sintéticos cuya estructura química, en general, corresponde a la de los hidrocarburos clorados, aunque, además de cloro, algunos de ellos poseen oxígeno o azufre o ambos elementos en su estructura. Los compuestos organoclorados fueron los primeros insecticidas orgánicos utilizados a gran escala. Anteriormente sólo se usaban insecticidas naturales, tales como la nicotina, el azufre, la rotenona (extraída de una planta llamada derris), o el piretro (extraído de las cabezas florales de los crisantemos). Entre sus propiedades destacan su reducida volatilidad, alta estabilidad química y solubilidad en lípidos, lenta biotransformación y degradación en el medio ambiente, así como una notable resistencia al ataque de los microorganismos (Matsumoto et al., 2009). Estas propiedades, que les hacían enormemente atractivos, son también las que en última instancia han provocado su prohibición en numerosos países, pues constituyen el fundamento de los problemas que plantean al medio ambiente: persistencia, bioacumulación y biomagnificación en seres vivos (animales y humanos), transporte de largo alcance y toxicidad, características propias y comunes de todos los COPs y que llevaron a la inclusión de la mayoría de estos plaguicidas en el Convenio de Estocolmo. Hay que destacar que las restricciones impuestas en el uso de estos compuestos organoclorados se han traducido en un marcado descenso en la concentración media de estos plaguicidas en tejidos hu manos, como pone de manifiesto el caso del DDT. En la década de 1960, la concen tración media en tejido adiposo en los habitantes de Estados Unidos era de 5 ppm, mientras que en 1990 se encontraba ya a niveles unas 100 veces inferiores. Sin embargo, estudios recientes realizados en nuestro país demuestran que, 35 años después de su prohibición, aún es posible medir su principal metabolito, el DDE, en la sangre de la práctica totalidad de los individuos adultos sanos y el DDT en cerca del 30% de la población (Jakszyn et al., 2009; Luzardo et al., 2006; Zumbado et al., 2005), e incluso en el líquido amniótico (Luzardo et al., 2009). Este hecho no es sorprendente ya que su uso persiste, o incluso ha sido reintroducido tras un periodo de prohibición, en países en vías de desarrollo, donde desempeñan un importante papel como agentes de control de organismos vectores (malaria en algunos países de África y Sudamérica) y aún como insecticida de uso agrícola. 63 Al igual que el resto de organoclorados considerados en este apartado, la tendencia a la biomagnificación y persistencia ambiental de los insecticidas organoclorados hace que estén sujetos a amplios ciclos de transporte en toda la biosfera. De esta forma, se han encontrado niveles relativamente altos de un cóctel de insecticidas organoclorados en el tejido adiposo de humanos y también animales como focas, morsas, ballenas y peces capturados en el círculo polar ártico (Hoekstra et al., 2005; Leonards et al., 2008). Entre 1954 y 1961, en Sheldon (EE.UU.), se pulverizaron las tierras con DDT para acabar con una invasión de escarabajo japonés, y con ello se inició un proceso de fatales consecuencias. Los escarabajos agonizantes atrajeron a los pájaros insectívoros, la lluvia arrastró los componentes químicos afectando a las lombrices y se contaminaron los charcos donde bebían diferentes aves. Ardillas, ratas almizcleras, conejos o zorras tigrillo fueron los siguientes en morir. Los pájaros que sobrevivieron quedaron estériles, ya que el DDT impide que la cáscara de los huevos se endurezca, con lo que se rompían antes de su ciclo natural (Krantz et al., 1970; Mulhern et al., 1970). Los gatos desaparecieron. A medida que el DDT iba escalando niveles tróficos, aumentaba su concentración en tejidos animales. Esta realidad fue destapada en 1962 por la bióloga norteamericana Rachel Carson en su libro “La Primavera Silenciosa”, best-seller que fundó las bases del ecologismo moderno (Carson et al., 1962; Jaga and Brosius, 1999). Por primera vez se habló del peligro de usar DDT y otros productos químicos usados como plaguicidas. Lo más alarmante no era únicamente su toxicidad, sino también su capacidad para persistir en los organismos por medio de la acumulación en los tejidos grasos. Rachel Carson escogió el título para su libro porque quiso remarcar que, de seguir así, podríamos vivir una primavera sin pájaros, silenciosa. Con la publicación de sus trabajos se inició un amplio debate que condujo finalmente a la prohibición del uso del DDT y muchos otros insecticidas organoclorados en muchos países, así como su inclusión en todas las listas de regulación de CTPs que se han ido promulgando y, por supuesto, si bien con un retraso de 40 años, finalmente en el Convenio de Estocolmo. 4.1.1.1. Clasificación y propiedades físico-químicas Atendiendo a su estructura, modo de síntesis u otras propiedades comunes a un grupo de ellos, se han propuesto varias clasificaciones para los insecticidas organoclorados. Presentamos la clasificación y las propiedades físico-químicas (O’Neil, 2006) según su estructura química de los compuestos analizados en esta tesis doctoral: Compuestos poliaromáticos clorados (DDT, Metoxicloro): El DDT es prácticamente insoluble en agua a 25°C. Sin embargo es moderadamente soluble a soluble en numerosos disolventes orgánicos, tales como hidrocarburos aromáticos, alifáticos, cetonas y alcoholes. Su presión de vapor es baja (1,9 x 10-7 mm Hg a 20°C) por lo que se considera no 64 volátil, pero puede pasar al aire a partir del suelo de manera continua, sobre todo en presencia de agua. En presencia de luz ultravioleta, el DDT pierde ácido clorhídrico y se transforma en DDE, compuesto que carece de acción insecticida, pero conserva todo el resto de propiedades. El resto de los plaguicidas poliaromáticos clorados tienen características similares a las del DDT. Cicloalcanos clorados (Hexaclorociclohexano): El hexaclorociclohexano técnico (HCH) es una mezcla de 8 isómeros, entre los cuales el isómero conocido como gamma HCH o lindano está presente en una proporción del 10-18%. Es precisamente este isómero el que le confiere las propiedades insecticidas a la mezcla, pues los demás isómeros del HCH apenas poseen efecto tóxico agudo sobre los insectos y otros organismos. Debe mencionarse, sin embargo, que hay numerosos estudios que identifican al isómero beta HCH como promotor del cáncer de mama (Wong and Matsumura, 2007; Zou and Matsumura, 2003). El lindano (gamma HCH) es moderadamente soluble en agua (10 mg/l) y más soluble en acetona, cloroformo y etanol. Su presión de vapor es baja (9,4 x 10-6 mm Hg a 20°C). Es estable a la acción de la luz solar, del oxígeno del aire, del calor y de los ácidos concentrados. Sin embargo, en medio alcalino se descompone y libera con facilidad ácido clorhídrico. Compuestos ciclodiénicos clorados (Aldrina, Dieldrina, Endrina, Heptacloro, Endosulfán, Clordano, Mirex): El clordano técnico es una mezcla de diferentes hidrocarburos clorados, estrechamente relacionados por sus estructuras: en teoría contiene 70% de cis-clordano, 25% de trans-clordano, 1% de heptacloro y el 4% restante de una mezcla de otros compuestos. Su volatilidad es intermedia entre la del lindano y la del DDT. Es prácticamente insoluble en agua y soluble en éteres, cetonas, hidrocarburos aromáticos y alifáticos. Es relativamente estable ante los ácidos, mientras que en medio alcalino libera ácido clorhídrico con facilidad. De manera similar, el heptacloro y el endosulfán tienen limitada solubilidad en agua: se disuelven preferentemente en cloroformo, tetracloruro de carbono, xileno y otros disolventes orgánicos y son moderadamente solubles en etanol. Son estables ante la humedad, el aire y el calor y no se degradan por la acción de la luz ultravioleta. El heptacloro es moderadamente estable en presencia de agua, ácidos, bases y agentes oxidantes. En el ambiente se transforma para dar su epóxido, el cual es todavía más estable. El endosulfán es sensible a los ácidos y a las bases y, en presencia de agua, se hidroliza, dando lugar a endosulfandiol, el cual carece de acción insecticida. La aldrina tiene un punto de fusión entre 104 y 104,5°C y una presión de vapor baja (7.5 x 10-5 mm Hg a 20°C). Es muy poco soluble en agua. 65 Este compuesto es estable ante los ácidos débiles, las bases y el calor y es sensible a la acción de la luz ultravioleta. En presencia de ácidos fuertes y tras su biotransformación en los seres vivos se transforma en dieldrina, la cual es mucho más estable. La dieldrina y endrina poseen características físicoquímicas similares a las de la aldrina. El mírex forma cristales incoloros con un punto de fusión de 485°C y una presión de vapor muy baja. Es prácticamente insoluble en agua, pero moderadamente soluble en benceno, tetracloruro de carbono, xileno y otros disolventes orgánicos. En condiciones ambientales es extremadamente estable y persistente. Bencenos policlorados (pentaclorobenceno, hexaclorobenceno): El hexaclorobenceno es un sólido blanco cristalino que no ocurre en forma natural en el medio ambiente. Tiene un punto de fusión de 231°C y una presión de vapor de 0.1 mm Hg a 20°C. Es prácticamente insoluble en agua y muy soluble en disolventes orgánicos, como hexano, benceno, cloruro de metileno, etc. En condiciones ambientales es extremadamente estable y persistente. Además de haber sido utilizado hasta el año 1965 como plaguicida, se forma espontáneamente a partir de otros compuestos orgánicos policlorados, como subproducto industrial y en la combustión de residuos sólidos urbanos. El pentaclorobenceno tiene unas características muy similares a las del hexaclorobenceno. 4.1.1.2. Parámetros toxicocinéticos Como ocurre con todas las sustancias químicas, la toxicidad de los organoclorados depende de la absorción, distribución, metabolización y eliminación: Absorción: Los POCs (con algunas excepciones) pueden ser absorbidos de forma tópica u oral de forma muy rápida debido a la alta liposolubilidad de estos compuestos (Marth et al., 1989). Actualmente, la vía principal de exposición a estos compuestos es la oral, a través de los alimentos, principalmente los más ricos en grasas animales. Como hemos visto los POCs no son altamente volátiles así que la inhalación no es una ruta normal de exposición (Jaeger et al., 1975). Distribución: En el organismo, la distribución de los POCs se hace al hígado, riñón, cerebro y principalmente al tejido adiposo (Tao et al., 2009). En el medioambiente, al igual que todos los hidrocarburos tratados con cloro, lo que les confiere una alta liposolubilidad, se distribuyen igualmente a los tejidos grasos de los seres vivos; consecuentemente ocurre la bioacumulación en la cadena alimentaria, y por consiguiente en animales (Backer et al., 2001) y seres humanos (Pandit et al., 2002; Smith and Gangolli, 2002). 66 Metabolización: Los compuestos poliaromáticos clorados, tales como el DDT, son declorinados mediante oxidasas de función mixta (MFOs), si bien no todos con la misma eficacia. Así, el metoxicloro es rápidamente eliminado comparado con el DDT por decloración y oxidación. Los ciclodienos tales como la endrina son rápidamente convertidos en epóxidos mediante las MFOs. Los bencenos policlorados, como el pentaclorobenceno experimentan glucuronidación y sulfoconjugación. Como vemos, existen varias rutas de biotransformación de los POCs, pero en general, salvo algunas excepciones como es el caso del lindano, la degradación metabólica de estos plaguicidas tiene lugar muy lentamente, debido a la presencia de múltiples átomos de cloro como sustituyentes, muy difíciles de eliminar por mecanismos enzimáticos, y a las estructuras aromáticas complejas que presentan algunos de estos compuestos. El lento ritmo de metabolismo junto con la elevada liposolubilidad dan lugar al almacenamiento prolongado en el tejido adiposo, del que se movilizan muy lentamente para restaurar el equilibrio entre tejidos y sangre a medida que progresa la transformación metabólica y la excreción. Excreción: La mayor ruta de excreción de los organoclorados es mediante la bilis al tracto digestivo y consecuentemente puede ocurrir la recirculación enterohepática. Los metabolitos son también lipofílicos, con lo que se almacenan en el tejido adiposo y pueden distribuirse nuevamente (Tanabe and Kunisue, 2007). La vida media de algunos difenilalifáticos tales como el DDT y los ciclodienos puede ser desde varios días hasta varios meses/años. La eliminación puede a veces ser explicada por un modelo de dos compartimentos, donde la primera fase es una eliminación rápida y la segunda, una eliminación más prolongada (Daly et al., 2007; Tanabe and Kunisue, 2007). 4.1.1.3. Mecanismo de acción y toxicidad Cuando hablamos del mecanismo de acción tóxica de los POCs hay que distinguir claramente entre el mecanismo que produce la toxicidad aguda (responsable de la amplia utilización que durante décadas han tenido estos compuestos en el control de plagas) y los mecanismos de toxicidad a largo plazo, comunes además a gran parte del resto de CTPs, que se producen tras la exposición inadvertida a bajas concentraciones de estos compuestos durante toda la vida. Gran parte de los efectos adversos que tiene sobre los seres vivos la exposición crónica a dosis bajas de estas sustancias, han sido encuadrados en el fenómeno denominado disrupción endocrina. Los mecanismos de toxicidad crónica se exponen más adelante conjuntamente con el resto de CTPs. Así hay varios mecanismos de toxicidad aguda de los POCs. Un mecanismo común a todos ellos es la interferencia con el arco reflejo que se establece entre 67 los nervios sensoriales, el sistema nervioso central y los nervios motores, que activan la respuesta muscular a los estímulos externos (Mariussen and Fonnum, 2006). En insectos o mamíferos intoxicados por acción del DDT o compuestos similares, se observan temblores y convulsiones persistentes, lo que sugiere una descarga repetida de las neuronas. El estudio de la conducta eléctrica de las fibras nerviosas muestra que los POCs inducen un alargamiento considerable de la fase descendente del potencial de acción, manteniendo así a la membrana de la neurona en un estado parcialmente despolarizado, muy susceptible a una nueva despolarización total ante los menores estímulos. Esta modificación del comportamiento eléctrico de las células nerviosas se produce por varios mecanismos, interfiriendo con el transporte activo de sodio hacia el exterior del axón durante la repolarización (Mariussen and Fonnum, 2006; Narahashi, 2002). El DDT, además, inhibe la calmodulina, necesaria para el transporte de iones calcio, a su vez imprescindible en la secreción de neurotransmisores en la sinapsis. También inhibe la adenosina trifosfatasa (ATPasa) de las neuronas, en particular las bombas de sodio, potasio y calcio, esenciales en la repolarización (Janik and Wolf, 1992). Los clorobencenos, clorociclohexanos y clorociclodienos también son inhibidores potentes de las bombas de Na+, K+ y Ca2+ en las membranas de las neuronas, provocando potenciales de acción disminuidos (Mariussen and Fonnum, 2006; Narahashi, 2002). Pero estos plaguicidas actúan también por estimulación del sistema nervioso central, ya que son antagonistas del ácido y-aminobutírico (GABA), con lo que bloquean el paso de iones cloruro inducido por este neurotransmisor (Coats, 1990; Sunol et al., 1998). El mecanismo inhibitorio de GABA explica los efectos colinérgicos (sobreestimulación mediada por la acetilcolina) de la dieldrina y del lindano en varias especies. A diferencia del DDT, para el que existen pocos casos de intoxicación con resultado de muerte, los clorociclodienos han sido causantes de numerosas muertes, además de ser muy persistentes y tóxicos para el medio ambiente. Se absorben rápida y eficazmente por vía cutánea, lo que contribuye a la mayor toxicidad que se ha observado en exposiciones ocupacionales. Además de los efectos sobre el sistema nervioso ya comentados, la exposición a lindano y al llamado lindano técnico (una mezcla de todos los isómeros del HCH) produce efectos tóxicos sobre el hígado y los túbulos renales, aunque se desconoce el mecanismo de toxicidad sobre estos órganos (Reddy et al., 1994; Srinivasan et al., 1984). Los efectos tóxicos agudos de los POCs han sido clasificados como primarios y secundarios. El efecto primario es aquel por el cual el plaguicida actúa directamente sobre una especie dada, matándola o reduciendo sensiblemente su población. El efecto es secundario si el plaguicida no actúa directamente sobre la especie, pero destruye su sustrato o su hábitat y la pone seriamente en peligro de desaparición (Milne, 1995). 68 4.1.2. Dioxinas y compuestos análogos a las dioxinas Bajo el nombre genérico de dioxinas y compuestos análogos se engloba a un grupo de sustancias químicas complejas que se caracterizan por tener varios aspectos en común, entre ellos, contener cloro en sus moléculas y una alta liposolubilidad, lo que las convierte en sustancias estructural, ambiental y biológicamente persistentes, además de acumularse y biomagnificarse a lo largo de la cadena trófica (Van den Berg et al., 1998; Van den Berg et al., 2006). Tanto por sus características similares como por sus bien conocidos efectos tóxicos, nos parece importante mencionarlos en su conjunto. De hecho, las dioxinas son ampliamente conocidas por su potente capacidad carcinogénica, estando incluidas en el Grupo I de sustancias de la Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer (IARC). Aunque, como ya dijimos, en el presente trabajo se analizaron únicamente los PCBs, análogos de las dioxinas, y es de ellos de los que hablaremos más en profundidad. Las dioxinas son un grupo de microcontaminantes de origen antropogénico ampliamente distribuidos en el medio ambiente. No tienen uso alguno, pero se forman espontáneamente en multitud de procesos industriales, como la manufactura de ciertos productos químicos, procesos industriales como la fabricación de PVC, la incineración de residuos sólidos urbanos o el blanqueo de la pulpa de madera en la fabricación de papel. A diferencia de éstas, que aparecen como subproductos indeseables, los PCBs fueron intencionadamente fabricados. Los primeros compuestos de PCB fueron sintetizados en 1864 por Schmidt y Schultz. Sin embargo, su producción comercial para una gran variedad de aplicaciones, comenzó mayoritariamente por la compañía Monsanto en los Estados Unidos en 1929 y se extendió hasta 1977 (Headrick et al., 1999). Debido a sus características físico-químicas como son su alta estabilidad, inercia y características dieléctricas, que eran ventajosas para muchos propósitos industriales, los PCBs fueron utilizados para una gran variedad de usos; en sistemas cerrados tales como transformadores eléctricos, condensadores y sistemas de traspaso térmico (en todos ellos como retardantes de llama para evitar el incendio de dichos aparatos), así como también, en sistemas hidráulicos. Durante un tiempo, los PCBs también tuvieron otra variedad de usos, puesto que fueron utilizados en formulaciones de pinturas, polímeros, pegamentos, lubricantes, plastificantes, formulaciones de plaguicidas y como agentes para la suspensión de pigmentos en el papel de copia sin carbón (Headrick et al., 1999; Safe, 1990). Los PCBs dejaron de fabricarse en todo el mundo en 1983. Tales restricciones han derivado en una disminución en la concentración de PCBs en animales silvestres desde entonces, cuando de hallaron concentraciones por encima de los 100 mg/kg en peces de ecosistemas altamente contaminados (Brown et al., 1985). Se estima que de los dos millones de toneladas que se fabricaron en el pasado, un 31%, 370.000 toneladas, todavía están presentes en el medioambiente global, donde todavía no han sufrido degradación, tal es su persistencia. Además, todavía más 69 preocupante, si cabe, es el hecho de que unas 780.000 toneladas más siguen aún funcionando en equipos eléctricos antiguos, lo que significará, si no se le pone remedio, una fuente futura de descarga medioambiental cuando estos equipos sean desechados. Los PCBs son eliminados de la atmósfera mediante procesos físicos tales como deposiciones secas o húmedas, absorción de vapores y depósitos en suelos, aguas superficiales y superficies de plantas. La mayor parte de los PCBs que se depositan en las aguas superficiales se absorben sobre los sedimentos suspendidos en el agua. Una vez unidos al suelo y al sedimento, estos químicos quedan generalmente ahí fijados, a excepción del transporte a granel debido a la erosión del suelo (Dickson and Buzik, 1993). 4.1.2.1. Clasificación y propiedades físico-químicas Son una serie de compuestos organoclorados, que constituyen una serie de 209 congéneres, los cuales se forman mediante la cloración de diferentes posiciones del bifenilo, 10 en total. Cada posición puede ser sustituida por un átomo de cloro. Si las posiciones 2, 2’, 6 y 6’ no tienen ningún cloro los bifenilos se mantienen coplanares, hablando por tanto de PCBs coplanares o no-orto. Si tenemos una posición sustituida en cada lado, son PCBs mono-orto sustituidos, y el resto son los PCBs no coplanares. Su fórmula empírica es C12H10Cln, donde n puede variar entre 1 y 10, siendo mayoritarios los congéneres con 2 a 7 cloros. Los PCBs coplanares y los mono-orto sustituidos son los que tienen mayor importancia medioambiental y analítica debido a su mayor toxicidad posiblemente debido a la coplanaridad de la molécula (Headrick et al., 1999; Huwe, 2002; Schecter et al., 2006), y son los que denominamos “compuestos análogos a las dioxinas” (DL-PCBs, de la denominación anglosajona dioxin-like PCBs). Las propiedades fisicoquímicas de estos compuestos también dependen del grado de cloración y de si son no-orto, mono-orto o no coplanares. Así, la presión de vapor disminuye con el grado de cloración, y lo mismo con su estabilidad en el medio ambiente. El periodo de semivida puede variar desde 10 días a un año y medio; por lo general estos compuestos son termoestables (punto de ebullición de 320-420°C), no los ataca la luz y son difícilmente biodegradables. Son ligeramente solubles en agua y muy liposolubles, por lo que se disuelven en su mayor parte de disolventes orgánicos (Headrick et al., 1999; Huwe, 2002; Schecter et al., 2006). 4.1.2.2. Parámetros toxicocinéticos Dada la importancia de los efectos tóxicos de estas sustancias, la absorción, la distribución, el metabolismo y la excreción de los PCBs han sido estudiadas en profundidad (Van den Berg et al., 1994). 70 Absorción: Debido a la alta liposolubilidad de estos compuestos la absorción es eficaz por todas las vías. No obstante, la principal vía de exposición es la oral, a través de los alimentos, siendo la absorción por el resto de vías prácticamente despreciable. La absorción gastrointestinal puede exceder el 75% de la dosis ingerida para los congéneres tratados con cloro en porcentajes más bajos. El incremento del tamaño molecular (proporcional al número de sustituciones con cloro) reduce significativamente la absorción intestinal, estimándose la absorción de los compuestos con 8 átomos de cloro de tan solo un 2-10%. Distribución: los PCBs se distribuyen extensa y eficazmente por el organismo. Una vez absorbidos alcanzan fácilmente el compartimento central y se distribuyen principalmente unidos a los quilomicrones, lipoproteínas y otras proteínas plasmáticas. El hígado y de forma muy relevante el tejido adiposo son los principales sitios de depósito de estos compuestos en la mayor parte de las especies. En algunas especies son también relevantes como sitios de almacenamiento la piel y las glándulas suprarrenales. Metabolismo: El metabolismo PCBs es necesario para la eliminación urinaria y biliar, desempeñando así un papel importante en la regulación del índice de la excreción de estos compuestos. En ratas, las reacciones metabólicas incluyen la oxidación, preferiblemente en las posiciones laterales y la decloración reductora así como la rotura de las uniones de oxígeno del difenil-eter. Excreción: La eliminación de los metabolitos polares de PCBs ocurre predominantemente por vía biliar y fecal, donde la excreción urinaria desempeña un papel muy minoritario. Sin embargo, se ha comprobado que esto no es así para todas las especies, ya que por ejemplo la eliminación urinaria desempeña un papel importante en el hámster. La semivida de estas sustancias químicas en humanos es de alrededor de 6 meses, dependiendo del índice de cloración de la sustancia (Leung et al., 2006). 4.1.2.3. Mecanismo de acción y toxicidad El mecanismo de acción mejor conocido y estudiado de los PCBs es el que está mediado principalmente por su capacidad de unirse al receptor de aril hidrocarburos (AhR), del que son agonistas, induciendo la síntesis de proteínas. El AhR es un factor de transcripción activado por unión de ligando que está implicado en la regulación de varios genes, incluyendo muchos que codifican para enzimas que desempeñan un papel importante en el metabolismo de las sustancias tóxicas, así como en genes implicados en la regulación del crecimiento 71 y la diferenciación celular (Denison and Nagy, 2003; Denison et al., 2002; Hahn, 2002; Mandal, 2005). Parece ser que muchos de los efectos tóxicos atribuidos a estos organoclorados requieren la activación del AhR. La toxicidad de congéneres individuales se relaciona altamente con la afinidad con la que estos compuestos se unen al AhR, siendo más tóxicos los congéneres que se unen con mayor afinidad al AhR (Okey et al., 1994). En ausencia de ligando, el AhR está como complejo soluble multiproteínico en el citoplasma celular. Cuando una dioxina o compuesto análogo (PCBs) atraviesa la membrana plasmática se une al AhR y el complejo ligando-AhR experimenta un cambio conformacional que expone una secuencia de localización nuclear. El complejo se trasloca entonces al núcleo de la célula y las chaperonas se disocian del complejo. El complejo AhR-ligando es capaz ahora de unir varias proteínas nucleares y formar heterodímeros que son capaces de unirse a determinadas regiones del ADN, conocidas como elementos de respuesta a las dioxinas (DRE). La unión de los heterodímeros activados por ligando al DRE estimula la transcripción de una serie de genes. Entre los mejor conocidos están los que codifican para las enzimas de la subfamilia CYP1A1 del citocromo P450 (Denison and Nagy, 2003; Denison et al., 2002). Se piensa, que la modulación continua e inadecuada de la expresión de estos genes es la responsable de una serie de cambios bioquímicos, celulares y de los tejidos que dan lugar a parte de los efectos tóxicos de estos compuestos (Mandal, 2005). Los PCBs coplanares y los mono-orto sustituidos presentan la capacidad de adoptar una conformación coplanar siendo así similares a la del 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina, el compuesto más tóxico para los organismos confirmado por numerosos datos (Kannan et al., 1993; Safe, 1990; Seegal et al., 1991; Tanabe et al., 1987). Esta configuración plana facilita que las dioxinas presenten una fuerte afinidad al AhR, lo que ha originado que dichos congéneres de PCBs sean caracterizados como dioxinas por tener un potencial tóxico similar a éstas. Si bien, de los 209 congéneres posibles de PCBs, sólo 12 (DL-PCBs) se considera que tienen efectos análogos a las dioxinas. Así, los congéneres planos similares a las dioxinas se definen por ser compuestos con un valor de factor de equivalencia tóxica (TEF) distinto al cero, según el proceso de cálculo de equivalencia tóxica establecido por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (USEPA) en 1989. Los síntomas tóxicos característicos de estos compuestos coinciden con los anteriormente descritos para las dioxinas como agentes inductores de la actividad enzimática del Ah e incluyen pérdida de peso, atrofia del timo, edema subcutáneo, supresión inmunológica, alteración hormonal, carcinogenicidad, y efectos reproductivos de fetotoxicidad y teratogénesis (Tillet et al., 1991). El cóngenere 118, catalogado como similar a las dioxinas, destaca por su elevado potencial inductor de enzimas y un elevado potencial de toxicidad (McFarland and Clarke, 1989). 78 Esta clasificación es importante en relación al conocimiento de la tasa de transporte de estos iones a través de las membranas celulares, y sitios de almacenamiento (en proteínas o en gránulos citoplasmáticos). La clase B y la intermedia son de especial importancia, ya que su afinidad por compuestos con nitrógeno o azufre contribuyen a su capacidad de formar complejos proteicos (Roesijadi and Robinson, 1994). 4.2.1. Toxicocinética, mecanismo de acción y toxicidad de los CIPs Los metales no son biodegradables. La absorción de los metales varía en función de la vía de entrada en el organismo, de su especiación química y de mecanismos homeostásicos. La distribución de los elementos metálicos en el organismo depende de la facilidad con que atraviesan las membranas y de la afinidad por los componentes de órganos y tejidos (Soria et al., 1995). La mayoría de los elementos se transportan unidos a la fracción macromolecular de las proteínas plasmáticas, mediante enlace con grupos funcionales, en especial sulfhidrilos, amino, fosfatos, carboxilato, imidazol e hidróxido; de ellos los más estables son las uniones con el azufre y el nitrógeno de los grupos sulfhidrilo y amino (Goyer, 1996). La detoxificación por parte de los organismos consiste en secuestrar iones metálicos activos con proteínas como la metalotioneína o el glutatión, o depositándolos en una forma insoluble en gránulos intracelulares, o su excreción por heces. Se han descrito complejos de metaloproteínas involucrados en la detoxificación o protección de la toxicidad de algunos metales (Goyer, 1984). Las metalotioneínas forman complejos con el Cd, Zn, Hg, cobre (Cu), y otros metales (Roesijadi and Robinson, 1994), y la ferritina y la hemosiderina son ferroproteínas intracelulares que acumulan hierro. En ocasiones, la biotransformación puede modificar el estado de oxidación del ion metálico, con aumento de su toxicidad, como ocurre por ejemplo con el arsénico (As3+ resulta más tóxico que As5+) (Soria et al., 1995). La especiación química del metal es un factor importante en su posible papel toxicológico, no sólo en su absorción, sino también en la acción que llevará a cabo dentro del organismo. Por ejemplo, el fosfato forma sales menos solubles con metales y con otros iones, mientras que los compuestos alquilo, como el tetraetilplomo o el metilmercurio son liposolubles, siendo más solubles en la mielina que las sales inorgánicas de dichos metales (Goyer, 1996) lo que redundará en una mayor neurotoxicidad. 79 Los metales se pueden encontrar como iones libres o en compuestos inorgánicos, lo cual afecta a su biodisponibilidad. Los compuestos metálicos orgánicos e inorgánicos insolubles precipitan, e imposibilitan su bioconcentración (Hodson, 1988). Sin embargo, la formación de ciertos compuestos organometálicos aumenta su hidrofobicidad, lo cual favorece su bioconcentración (Tsuda et al., 1988). Los efectos tóxicos de los CIPs varían enormemente entre elementos, considerándose aquellos más tóxicos los metales no esenciales para los animales o seres humanos. Entre los efectos crónicos producidos por estos contaminantes se incluye el cáncer, efectos sobre el sistema inmunológico y el aparato reproductor. Nos interesa sobre todo destacar, que la capacidad de ejercer efectos sobre la acción hormonal de algunos de los CIPs (como el Cd, Hg, As, Pb ) se produce incluso a dosis muy bajas, compatibles con las dosis de exposición medioambiental a este metal (Lavivoli et al., 2009). Los efectos sobre el sistema endocrino (alteración o disrupción endocrina) de los CIPs se analizaran a continuación en conjunción con los COPs. 4.3. Los contaminantes químicos como disruptores endocrinos Es necesario distinguir claramente entre los efectos tóxicos agudos de los CTPs, producidos tras la exposición habitualmente única a dosis elevadas, de los efectos crónicos de una exposición a dosis muy bajas pero durante periodos de tiempo muy largos, que pueden abarcar toda la vida. Gran parte de los efectos adversos que tiene la exposición crónica a dosis bajas de estas sustancias químicas en los seres vivos, en el contexto de la exposición ambiental, han sido encuadrados en el fenómeno denominado disrupción endocrina. Por lo tanto los contaminantes químicos capaces de producir disrupción endocrina son denominados DISRUPTORES ENDOCRINOS. Según la USEPA, un disruptor endocrino (DE) es “un agente exógeno que interfiere con la síntesis, secreción, transporte, metabolismo, unión o eliminación de las hormonas que de forma natural están presentes en el cuerpo y que son las responsables de la homeostasis, la reproducción y el desarrollo” (Diamanti-Kandarakis et al., 2009). El rango de compuestos químicos que se consideran disruptores endocrinos es muy amplio y crece día a día, comprendiendo desde productos químicos sintetizados por el hombre hasta sustancias que se encuentran de manera natural en los alimentos o en el medioambiente. 80 La capacidad de los contaminantes químicos medioambientales para interferir en la función endocrina fue establecida hace más de 30 años. El hecho inicial fue la constatación de que la población de pájaros piscívoros había declinado en los Estados Unidos debido a problemas reproductivos graves. Tales observaciones permitieron la identificación del 4,4’-DDE, un metabolito del pesticida organoclorado DDT, como agente causante de las alteraciones reproductivas observadas (Hickey and Anderson, 1968). El problema fue parcialmente resuelto con la retirada del pesticida en 1972, aunque como hemos visto sus residuos continúan estando presentes en el medioambiente, afectando por tanto a las poblaciones expuestas. Actualmente el conocimiento acerca de estas sustancias y sus mecanismos de acción es bastante grande, pero quedan aún grandes lagunas en la comprensión global de sus efectos sobre la salud del hombre y el resto de los seres vivos. En un principio se pensaba que los DE ejercían sus efectos principalmente a través de su unión con los receptores nucleares para hormonas, incluyendo los receptores de estrógenos (REs), los receptores de andrógenos (RAs), los receptores de progesterona (RPs), los receptores de hormonas tiroideas (RTs) y los receptores de retinoides, entre otros. Hoy en día la base científica de conocimiento sobre el tema ha aumentado y muestra que el espectro de mecanismos de acción es mucho mayor. Así se sabe que los DE actúan mediante su unión a los receptores nucleares, pero también a los receptores no nucleares (o de membrana) para hormonas esteroideas, receptores no esteroideos (p.e. receptores para neurotransmisores, como el receptor de serotonina, el receptor de dopamina o el receptor de norepinefrina), receptores huérfanos (p.e. el AhR), rutas enzimáticas implicadas en la biosíntesis de esteroides y/o metabolismo, y numerosos otros mecanismos que convergen en la afectación de los sistemas endocrino o reproductivo. De esta manera, desde una perspectiva fisiológica, un DE es un compuesto, ya sea natural o sintético, que, a través de la exposición ambiental, altera los sistemas hormonales y homeostáticos que le permiten al organismo comunicarse y responder a su medioambiente (Diamanti-Kandarakis et al., 2009). Si bien la mayor parte de los efectos netos de los DE podrían catalogarse como “efectos estrogénicos”, lo cual ha motivado que durante tiempo se haya hablado de los DE como sinónimo de xenoestrógenos, existen numerosas sustancias que tienen efectos androgénicos o, más frecuentemente antiandrogénicos, y también como agonistas o antagonistas de las hormonas tiroideas. El grupo de moléculas de origen antropogénico que han sido identificadas hasta el momento como DE es enormemente amplio y heterogéneo, e incluye desde sustancias plásticas o plastificantes (como el Bisfenol A), fungicidas (como la vinclozolina), fármacos (como el dietilestilbestrol, DES) y, por supuesto, gran parte de los CTPs incluidos en el Convenio de Estocolmo: PAHs, PCBs, dioxinas y furanos así como muchos de los POCs (DDT, metoxicloro, clordano, entre otros). Incluso algunos metales pesados y metaloides pueden tener actividad estrogénica, por lo que también pueden ser incluidos como DE. 81 Hay que destacar que no todos los DE son de origen antropogénico, sino que también existen en la naturaleza sustancias que han sido identificadas como DE, como los fitoestrógenos o el cumarol (Kuiper et al., 1998). Es presumible que una vez que se disponga de una batería adecuada de tests toxicológicos, útiles para explorar diferentes actividades hormonales, la lista de nuevos disruptores endocrinos se ampliará sustancialmente. De hecho los organismos nacionales e internacionales con intereses en la regulación y comercialización de compuestos químicos han lanzado la propuesta para la estandarización de estos tests y su aplicación sistemática a los compuestos de nueva creación y a aquellos preexistentes. Es esta una tarea difícil y costosa si se tiene un cuenta que está previsto testar en los próximos años más de 100.000 moléculas químicas y que los tests deben investigar actividades hormonales/antihormonales muy diversas. La lista de mimetizadores hormonales aumenta con la misma velocidad que se expande nuestro conocimiento sobre las formas de exposición a estas sustancias. Esto se debe de una parte al descubrimiento (muchas veces accidental) de la contaminación de muestras biológicas de origen animal y humano, y de otra, a la información disponible sobre utilización, uso y consumo de estos compuestos químicos. Todas estas sustancias son, lógicamente, muy diversas desde un punto de vista químico, lo que representa un desafío en el campo de estudio de la disrupción endocrina, ya que, aparte de su pequeño tamaño (< 1000 Daltons), no parecen compartir otras características que hagan predecir si una molécula química va a comportarse como un DE o no. Sin embargo, en términos muy amplios, DE como los PCBs y POCs por ejemplo contienen grupos halogenados en su estructura (con sustituciones por átomos de cloro). Además, muchas de estas moléculas contienen un grupo fenólico que se piensa que es el responsable de conferirles similitud con las hormonas esteroideas, siendo así reconocidos como ligandos por los receptores de dichas hormonas, ya sea como agonistas o como antagonistas. Ya hemos visto que las fuentes de contaminación y de exposición a estos compuestos que se comportan como DE son muy variables, pero pueden considerarse un fenómeno global que afecta a todos los seres vivos del planeta, que están expuestos de forma constante a mezclas, enormemente variables de individuo a individuo y de región en región, de estas sustancias que fueron mayoritariamente diseñadas para ser persistentes. La situación es además cambiante, puesto que como ya sabemos, muchos de estos compuestos han sido prohibidos hace ya décadas, mientras que otros aún están permitidos para algunos usos o han sido prohibidos mucho más recientemente. 82 5. Contaminantes tóxicos persistentes en fauna salvaje 5.1. Breve descripción general El descubrimiento de que los POCs podrían reducir el espesor de la cáscara de huevo en las especies de rapaces, es quizás el caso más conocido y ampliamente documentado en toxicología de fauna salvaje. Durante los años 1940 y 1950, Derrick Ratcliff de la British Nature Conservancy señaló un descenso en las poblaciones de halcón peregrino (Falco peregrinus) en toda Europa. Poco después, el fracaso reproductivo en estos halcones y en otras especies de aves se asociaron a una disminución del grosor de la cáscara del huevo (Ratcliffe, 1967). La novela de Rachel Carson (1962), que ya hemos nombrado anteriormente, alimentó el debate entre los graves efectos de la contaminación ambiental y la vida silvestre. Ratter y col. (2009) hacen una amplia revisión de la historia de la toxicología en la fauna salvaje, describiendo intoxicaciones por plomo en faisanes (Phasianus colchicus) ya en el año 1876 (Calvert, 1987). En 1979, debido a la creciente necesidad de investigar en aspectos relacionados con la contaminación ambiental, se creó “The Society of Environmental Toxicology and Chemistry” (SETAC). Toxicólogos en fauna silvestre fueron los primeros miembros de esta sociedad, y hoy en día, sigue siendo una importante organización para la difusión de trabajos de investigación en este campo (Kendall, 2008). El descubrimiento de masivas mortalidades de animales en el campo asociadas a las sustancias químicas, llevó a los toxicólogos de la época a iniciar experimentos en el laboratorio con el objetivo de establecer datos de referencia sobre la toxicidad aguda y crónica de los contaminantes ambientales en fauna salvaje. Actualmente, la toxicidad de muchos de los contaminantes ambientales bien conocidos, como el DDT, los PCB, y varios metales, han sido ampliamente estudiados en la fauna salvaje. Aunque todavía queda mucho por aprender acerca de los efectos de estas sustancias por sí solas, y especialmente en las mezclas, durante aproximadamente los últimos 30 años se ha hecho un enorme progreso. Además, los límites de protección para los seres humanos en las actuales evaluaciones de riesgo de las sustancias químicas a menudo se basan en los datos de exposición de fauna silvestre. Por lo tanto, los estudios toxicológicos en fauna silvestre ofrecen la oportunidad de participar en procesos de regulación dirigidas a la protección de la salud ambiental y humana. La contaminación de los ambientes acuáticos, y en particular de nuestros océanos, ha planteado muchas preguntas acerca de la condición de nuestro medio ambiente. Así, en la actualidad disponemos de una amplia revisión bibliográfica 83 de monitorización de concentraciones de contaminantes tóxicos persistentes en muchas especies animales terrestres y marinos (Di Giulio and Hinton, 2008; Gardner, 2006b; Kendall, 2010; O’Shea and Tanabe, 2003; Rattner et al., 2011; Sparling et al., 2010). Nosotros centraremos nuestra revisión principalmente en animales de vida acuática, y más concretamente en tortugas marinas. 5.2. CTPs en animales de vida acuática Las concentraciones de CTPs se han analizado en muchas especies marinas como peces y crustáceos por su posible efecto en el ser humano al ingerirlos como alimento. Sin embargo, los mamíferos marinos son por excelencia, las especies animales de vida silvestre que han sido estudiadas en mayor profundidad (O’Shea and Tanabe, 2003). Su posición en lo más alto de la cadena trófica, y el carácter de biomagnificación que acompaña a este grupo de contaminantes, hacen que se conviertan en las especies de vida acuática que mayores concentraciones de contaminantes acumulan. Además, el tejido adiposo de estos mamíferos marinos representa un porcentaje destacable dentro de su composición corporal, siendo un depósito ideal para estos contaminantes lipofílicos (Cockcroft et al., 1989). Esto unido al hecho de que son animales con un largo periodo de vida justifica que lleguen a almacenar elevadas concentraciones de compuestos tóxicos. Por el contrario, las tortugas marinas se encuentran en eslabones más bajos de la cadena trófica, detectándose así concentraciones de contaminantes persistentes más bajas en los tejidos de estos reptiles que en tejidos de otras especies (de reptiles en general, ver: Sparling et al., 2010; tortugas en general, ver: Meyers-Schone and Walton, 1994; lagartos y serpientes, ver: Campbell and Campbell, 2002; mamíferos, ver: Aguilar et al., 2002). En un reciente estudio llevado a cabo por Lazar y col. (2011) en tortuga boba (Caretta caretta), observaron que el factor de biomagnificación de compuestos organoclorados fue de un orden de magnitud varias veces más bajo que el observado en mamíferos marinos en estudios previos (Fraser et al., 2002; Strandberg et al., 1998; Weijs et al., 2009). Además de las diferencias del estado trófico, la disminución de factores de biomagnificación quizás también puede ser debido al resultado de una más baja actividad metabólica y diferencias en la capacidad de eliminación de contaminantes persistentes entre mamíferos y tortugas marinas (Gray, 2002; McKay and Fraser, 2000). La bioconcentración (y por lo tanto la biomagnificación) de otros contaminantes como los metales varía en gran medida no solo en función de la especie del organismo expuesto, sino además del metal en cuestión (Bradley and Sprague, 1985). Algunas especies acumulan altas concentraciones de metales (p. e., zooplancton), mientras que otros organismos superiores (p. e., peces) tienen sistemas que regulan la concentración o presentan proteínas (metalotioneínas) que secuestran los metales (Hodson, 1988; Rainbow and White, 1990). 84 Como ya mencionamos, los PAHs a diferencia de otros CTPs, sí pueden ser metabolizados por algunos organismos. Así por ejemplo, los organismos acuáticos que metabolizan poco los PAHs como las algas y los moluscos y otros invertebrados, pueden acumular altas concentraciones de PAHs, mientras que organismos que los metabolizan como los peces y otros vertebrados los acumulan poco. Las concentraciones de PAHs observadas en organismos marinos indican un alto grado de contaminación en algunas áreas. Un estudio llevado a cabo recientemente sobre bivalvos (Perna perna) en 18 estaciones a lo largo de la costa atlántica de Marruecos dio valores para (Σ14 PAHs) de 3.4 a 34.6 ng/g peso fresco con valores de 87-109 ng/g peso fresco cerca de ciudades como Agadir o El Jadida (Moukrim, 2002). Aunque no existe una amplia bibliografía como en el caso de los mamíferos marinos, en las últimas décadas se ha hecho un gran avance en el número de estudios de la mayoría de los CTPs en diferentes tejidos de tortugas marinas (ver revisiones de Meyers-Shone and Walton, 1994; Pugh and Becker, 2001; D’lio et al., 2011). Los COPs más ampliamente documentados son los contaminantes organoclorados en tortugas marinas (Corsolini et al., 2000; Gardner et al., 2003; Labrada-Martagón et al., 2011; Lake et al., 1994; Lazar et al., 2011; Miao et al., 2001; Monagas et al., 2008). Los metales pesados y metaloides también han sido ampliamente documentados (Aguirre et al., 1994; Franzellitti et al., 2004; García-Fernández et al., 2009; Gardner et al., 2006; Godley et al., 1999; Godley et al., 1998b; Gordon et al., 1998; Maffucci et al., 2005; Sakai et al., 2000; Storelli et al., 1998b; Storelli and Marcotrigiano, 2003; Storelli et al., 2005; Torrent et al., 2004). Sin embargo, otros CTPs como los PAHs han sido poco estudiados en estos reptiles (Alam and Brim, 2000; Camacho et al., 2012; Godley et al., 1998a). De esta manera, si bien disponemos de estudios en diferentes tejidos o huevos de todas las especies de tortugas marinas, es cierto que mientras algunas poblaciones han sido ampliamente estudiadas, de otras carecemos de información de exposición a contaminantes. Las regiones más estudiadas son la costa este de EE.UU. y el mar Mediterráneo. Las diferencias de concentración de contaminantes observadas entre diferentes zonas reflejan las diferentes grados de exposición de las tortugas marinas según sus movimientos migratorios o áreas de alimentación (Alava et al., 2011; Ragland et al., 2011), estando mayormente expuestas tortugas marinas que se alimentan en zonas costeras de mayor contaminación (Komoroske et al., 2012). El perfil de distribución de los contaminantes en los diferentes tejidos varía enormemente en vertebrados marinos, encontrándose las mayores concentraciones de organoclorados por ejemplo, en el tejido adiposo, seguida por el hígado, riñones y músculo (Colborn and Clement, 1992; Martineau et al., 1987; Mckenzie et al., 1999; Rybitski et al., 1995; Tanabe et al., 1983). Esto es atribuible a la cantidad del contenido lipídico y triglicéridos de los tejidos y la afinidad de estos contaminantes para acumularse en la grasa, existiendo una fuerte correlación entre la cantidad de lípidos y la concentración de estos contaminantes (Cockcroft et al., 1989). 85 La mayor parte de los datos de contaminantes en tortugas marinas provienen de tortugas muertas, tortugas con hipotermia, animales varados o tortugas capturadas accidentalmente durante actividades de pesca (Innis et al., 2008; Pugh and Becker, 2001). Los niveles de concentración de contaminantes en animales muertos quizás estén sesgados debido al hecho de que los animales muertos puedan presentar mayores concentraciones que animales vivos. Aguilar y col. (1994a) observaron cómo delfines muertos por la epidemia de morbillivirus presentaron concentraciones mucho mayores que animales aparentemente sanos de la misma zona. En tortugas marinas algunos autores han observado igualmente mayores concentraciones en animales muertos por enfermedad que en aquellos vivos aparentemente sanos (Keller et al., 2004a). Además, la descomposición de cadáveres varados puede complicar el análisis de contaminantes. Un estudio reciente ha demostrado la utilidad de la sangre como un tejido alternativo para el análisis de organoclorados en tortugas marinas (Keller et al., 2004a; Keller et al., 2004b). La fuerte correlación observada entre la concentración de CTPs en sangre y los diferentes tejidos indican que los contaminantes en la sangre están en equilibrio con su almacenamiento en los tejidos, siendo así un buen estimador de la concentración de éstos en el tejido adiposo, hígado, músculo y riñones (Keller et al., 2004a; van de Merwe et al., 2010). Prueba de la utilidad de la sangre para analizar las concentraciones de estos contaminantes en tortugas marinas como un método no letal, otros autores han estudiado los CTPs en sangre de tortuga marina (Day et al., 2005; Day et al., 2007; Kenyon et al., 2001; Labrada-Martagón et al., 2011; Ragland et al., 2011; Swarthout et al., 2010; van de Merwe et al., 2010). Sin embargo, existen algunos factores biológicos que deben ser tenidos en cuenta a la hora de interpretar los resultados de los CTPs en los seres vivos. La persistencia de los niveles de contaminantes puede variar en función de la dieta, edad, sexo, estado reproductivo, condición corporal o la incidencia de enfermedades. Además, se debe tener en cuenta que, en momentos de cambios fisiológicos como enfermedades, temperaturas extremas, compromiso nutricional, producción de huevos o gestación y lactancia, las reservas lipídicas pueden ser movilizadas para obtener energía, redistribuyendo los CTPs acumulados en las reservas grasas hacia el torrente sanguíneo (Aguilar and Borrell, 1994b; Debier et al., 2006; Humphrey, 1988; Keller et al., 2004a; Lydersen et al., 2002; Matthews et al., 1984). El hecho de que los animales muertos presenten mayores concentraciones que los animales vivos, puede estar influido por algunos de estos factores biológicos, modificando así sustancialmente la interpretación de los resultados obtenidos. Por lo tanto, el buen conocimiento de estos parámetros y del método analítico usado, es fundamental en los trabajos de campo que se realicen. 86 5.3. Factores biológicos que afectan la persistencia de los niveles de contaminantes en el organismo La exposición de algunos organismos a determinados contaminantes es comúnmente estudiada a través de la concentración de la sustancia objetivo en los tejidos adecuados del organismo. Esto es evidentemente más fácil y más exacto efectuarlo así que realizar la medida directa o, a través de la dieta, o de otras fuentes de exposición, por lo que este método se usa generalmente para controlar la exposición de la población y para identificar aquellos componentes del ecosistema susceptibles a tales contaminantes (Aguilar et al., 1999). Sin embargo, cuando se estudia un número lo suficientemente amplio de individuos pertenecientes a la misma población, se observa una variación sustancial en los niveles de residuos encontrados en los tejidos. Lo que esto sugiere es que individuos de la misma población, aun expuestos a las mismas condiciones ecológicas, no se exponen de manera idéntica a los contaminantes y que su capacidad de excreción de los mismos es también diferente. Esto indica que comparar resultados sea frecuentemente complicado así como asegurar la extensión de la exposición, debido a las diferencias significativas que aparecen a nivel tisular entre individuos de diferentes sexos, edad, estado reproductivo o condición nutricional (Aguilar et al., 1999). 5.3.1. Composición corporal y condición nutritiva La distribución de contaminantes en un organismo es compleja, pero principalmente depende de las propiedades físicas y químicas de los componentes que lo forman y del organismo en sí. Como hemos visto, una de las características de la mayoría de los CTPs es el carácter lipofílico de estas sutancias. Esta propiedad implica que un organismo con grandes compartimentos de grasa tendrá gran capacidad para retener tales contaminantes químicos (Aguilar, 1985). Además, la composición corporal afecta a la contribución relativa de cada parte del cuerpo a la carga corporal total de contaminantes. Así, un órgano contribuirá de manera más importante a la carga total de contaminantes cuanto mayor sea su contenido en grasa o, como en el caso del músculo, cuanto mayor sea su representación en la masa corporal (Aguilar, 1985). Por lo tanto, el reparto de los contaminantes lipofílicos será proporcional al contenido de lípidos en los tejidos, por lo que las concentraciones tienden a ser más altas en tejido adiposo, seguido por los huevos, los testículos, el hígado, los riñones y músculo en diferentes especies (Bishop et al., 1995; Bryan et al., 1987; Dabrowska et al., 2006; Perugini et al., 2006; Storelli et al., 2007). La grasa subcutánea contiene la mayor cantidad de contenido lipídico y porcentaje de triglicéridos (expresado sobre el total de lípidos). En contraste, el músculo pectoral presenta el menor contenido de lípidos y triglicéridos y el mayor nivel 87 de lípidos polares, presentando las concentraciones más bajas de organoclorados entre los tejidos analizados (Rybitski et al., 1995). Aunque las gónadas presentan un mayor porcentaje de lípidos frente al músculo (Lutcavage and Musick, 1985), muchas de los animales que se analizan son aún juveniles y la pequeña cantidad de tejido gonadal con el que se cuenta es insuficiente para realizar los análisis necesarios. Por ello se considera que la grasa subcutánea debe ser el tejido a elegir para la detección de los organoclorados en tortugas marinas muertas (Rybitski et al., 1995). Por otro lado, la distribución de los metales en los tejidos varía en función del metal en cuestión. En general, las mayores concentraciones han sido observadas en el hígado y riñón (García-Fernández et al., 2009; Storelli and Marcotrigiano, 2000; Torrent et al., 2004). Sin embargo, no está claro que el estado nutritivo pueda influenciar la concentración de tejidos de contaminantes no lipofílicos (algunos metales pesados) (Aguilar and Borrell, 1990). Por otro lado, los niveles de CTPs detectados en sangre son muchísimo más bajos que los esperados en cualquier tejido animal. Sin embargo, los contaminantes en la sangre están en equilibrio con su almacenamiento en los tejidos, considerándose un buen estimador de la concentración de éstos. El hecho de poder analizar los contaminantes a través de un método no letal, es fundamental en estas especies protegidas. La concentración en sangre de muchos contaminantes son más un indicador de exposición reciente, mientras que los escudos de caparazón de tortugas marinas reflejan más la contaminación a largo plazo (Wang, 2005). Con las ventajas de los modernos instrumentos capaces de detectar contaminantes a niveles muy bajos, es posible determinar sustancias xenobióticas en la sangre, cáscara o escudos con una alta precisión, pudiendo así monitorizar los niveles de contaminantes ambientales en las poblaciones naturales. 5.3.2. Dieta La mayoría de las sustancias que actúan como CTPs se incorporan a los seres vivos mediante la ingesta de alimentos. El efecto de la dieta es particularmente importante porque muchas de estas sustancias químicas aumentan su concentración a través de la cadena trófica, siendo la concentración en los grandes predadores mucho mayor que en aquellos organismos que ocupan niveles tróficos más bajos. Por lo que diferencias en el tipo de alimentación conllevarán también a diferencias de las concentraciones en sus tejidos. Para aquellos contaminantes en los que la biomagnificación es importante, la dieta resulta un factor determinante en la concentración de los tejidos. Así se explican la mayoría de las variaciones interespecíficas que se dan en especies que habitan en las mismas aguas. Sin embargo, independientemente del factor de bioacumulación, algunos organismos pueden mostrar especificidad para la acumulación de un determinado compuesto lo que puede llevar a un aumento de los niveles del mismo en los subsiguientes estados de la cadena trófica. Por ejemplo, los niveles de níquel en ballenas son comparativamente mayores que en odontocetos (Aguilar et al., 1999). 94 5.3.5. Migración o incidencia a enfermedades Como hemos comentado, los CTPs acceden a los tejidos de las tortugas marinas y otros animales marinos principalmente a través de la dieta y la reproducción, por transferencia de las hembras a su descendencia. El grado de bioacumulación de tales contaminantes depende de la posición en la cadena trófica ocupada por una especie, su hábitat y la localización geográfica de los individuos, así como del estado de salud del individuo (Bernhoft and Skaare, 1994). Por otro lado, la condición del animal y la exposición pueden afectar el contenido de sustancias xenobióticas en los tejidos. De esta manera animales sometidos a periodos de inanición bien por largas migraciones o por enfermedad, sufrirían una movilización de las grasas (y por lo tanto de los contaminantes lipofílicos acumulados en ella) para obtener energía. Geyer y col. (1994) demostraron que el gran factor biótico que influye en la toxicidad de los contaminantes químicos lipofílicos es el contenido lipídico del organismo. Animales con altos contenidos de grasas pueden acumular y tolerar mayores concentraciones de estos contaminantes químicos, debido a que son almacenados en el tejido adiposo resultando menos accesibles a órganos y receptores. Por el contrario, aquellos organismos emaciados que necesitan movilizar sus reservas de grasas se someten casi inevitablemente a los efectos tóxicos como resultado de la movilización de los contaminantes. Ello puede resultar en un aumento de la concentración de los contaminantes menos biodegradables en el tejido adiposo remanente (Bernhoft and Skaare, 1994). Así por ejemplo, en especies sujetas a una estricta migración estacional y a régimenes nutricionales, la grasa corporal puede variar de manera dramática a lo largo del año. Se ha observado en algunas ballenas cómo su peso corporal aumentaba en un 50-100% al final del período de alimentación principalmente a causa de la acumulación de grasa (Lockyer and Brown, 1981). La gran talla que presentan las ballenas se ha asociado con la necesidad de acumular cantidades sustanciales de reservas lipídicas para cubrir la migración y los requerimientos reproductivos durante los períodos de escasa o falta de alimentación (Brodie, 1975). Las variaciones nutritivas pueden dar lugar a diferencias en el contenido lipídico de los tejidos, tanto en volumen como en composición. Se han descrito cambios en huesos, riñones y otros órganos de manera significativa para un número importante de especies de mamíferos marinos (Aguilar et al., 1999). También hay que tener en cuenta que la exposición de los individuos varía según las distancias recorridas durante la migración. La mayor parte de las tortugas juveniles observadas en las Islas Canarias proceden de la costa este de EE.UU. y en menor proporción de México y Cabo Verde (Monzón Argüello et al., 2010). Esta amplia diversidad de hábitats conduce inevitablemente a diferencias en la exposición, pues algunas tortugas se alimentan en áreas contaminadas mientras otras lo hacen en áreas prácticamente vírgenes, siendo la ingestión la ruta más probable de exposición a los contaminantes para estas tortugas (Corsolini et al., 2000). 95 La tortuga laúd, Dermochelys coriacea, migra miles de kilómetros entre las áreas de alimentación y aquellas en donde nidifica (Davenport, 1997). Así que la exposición a los contaminantes ambientales variará acorde los niveles de contaminación entre las distintas áreas visitadas por las tortugas (Keller et al., 2004a). En el estudio llevado a cabo por Guirlet y col. (2010), observaron que las hembras que tardaban tres años entre periodos reproductivos presentaban mayores concentraciones de organoclorados en sus huevos (debido a un mayor tiempo de bioacumulación) que aquellas hembras que regresaban a los dos años a la playa donde nidifica, sugiriendo de esta manera que las hembras con periodos de recuperación más amplios transmitirían mayor carga de contaminantes a sus huevos. Las épocas naturales de mayor demanda energética son aquellas durante la migración o la producción de los huevos. El hecho de que las tortugas muestren una importante pérdida de peso entre las zonas de alimentación y las de nidificación (disminuyendo en un 33% de su masa corporal) (James et al., 2005) apoya esta hipótesis (Wallace et al., 2005). Por otro lado, la incidencia de enfermedades puede afectar los niveles de contaminantes en los tejidos de los organismos. Hay que tener en cuenta que la mayoría de los estudios realizados sobre la concentración de contaminantes en los distintos organismos estudiados se llevan a cabo a partir de individuos muertos. Además, en la mayoría de los casos, la causa de la muerte de estos animales no está clara, excepto en áreas en las que las interacciones pesqueras son frecuentes o se observan evidentes lesiones debido a causas antropogénicas. Existen diversas razones por las cuales un organismo enfermo puede llevar una carga anormal de contaminantes en su organismo. Por ejemplo, un animal que ha estado enfermo durante un período largo de tiempo es probable que se encuentre desnutrido o se haya alimentado de fuentes diferentes de las que constituyen su dieta habitual. Además, el daño producido por muchas enfermedades sobre órganos puede alterar la capacidad para metabolizar o excretar determinados tóxicos. Por ello resulta cuestionable si la concentración en los tejidos de dichos organismos son representativos o no de unas condiciones normales. Los efectos de un cambio en la dieta o la movilización de grasas de tejidos contaminados, particularmente si los tóxicos resultan lipofílicos, se han discutido anteriormente. En términos generales, se espera un aumento de la concentración cuando el individuo aumenta de peso. Sin embargo, los efectos de las alteraciones fisiológicas y metabólicas resultan ser desconocidos en la mayoría de los casos estudiados (Aguilar et al., 1999). Se ha detectado una condición corporal disminuida asociada a altos niveles de contaminantes persistentes en estudios realizados en tortugas marinas (Monagas et al., 2008; Orós et al., 2009). Aunque en el estudio llevado a cabo por Monagas y col. (2008) no se pudieron asociar únicamente los altos niveles de pesticidas con las lesiones observadas en el hígado, no se descartaron los efectos crónicos del DDT como causa de muerte. 96 Es importante resaltar que en los estudios que realizan la medición de los contaminantes en sangre se debe tener en cuenta el estado de los animales a la hora de interpretar los resultados de dicha contaminación. Una movilización de grasa en animales enfermos o emaciados puede conllevar un aumento de los contaminantes en sangre. Previos estudios han mostrado una fuerte correlación entre los lípidos de reservas de grasa y los niveles sanguíneos de organoclorados en tortugas boba (Keller et al., 2004a), lo que indica que cuando los lípidos se movilizan (para satisfacer la demanda de energía, bien sea para la producción de huevos, ayuno o el mantenimiento de los tejidos), estas sutancias lipofílicas son liberadas en el torrente sanguíneo (Hamann et al., 2002; Kwan, 1994), y así ha sido previamente apuntado por algunos autores en tortugas marinas (Keller et al., 2004a; Orós et al., 2009; van de Merwe et al., 2010). 5.4. Efectos de los contaminantes sobre poblaciones de fauna salvaje Las preocupaciones actuales acerca de la pérdida de componentes críticos de la biodiversidad indican que los contaminantes ambientales pueden jugar un papel clave en la disminución de muchas de las especies (Carpenter et al., 2008; Schipper et al., 2008; Stuart et al., 2004). Hay varias formas principales en que los contaminantes pueden afectar a los parámetros del ciclo de vida de las distintas poblaciones animales. Los efectos pueden ser a través de una intervención directa en la función fisiológica de un individuo, lo que resulta en cambios en el crecimiento, reproducción o incluso provocar la muerte. Además, los efectos indirectos como el cambio climático o destrucción del hábitat son igualmente importantes desde el punto de vista del crecimiento de la población. Los efectos indirectos pueden pasar desapercibidos y los efectos globales de los contaminantes sobre la población pueden ser subestimados. A lo largo de esta introducción hemos mencionado los principales mecanismos fisiológicos por los que los CTPs tienen consecuencias adversas sobre los seres vivos. En términos generales podemos decir que los contaminantes son ampliamente conocidos por afectar negativamente sobre tres aspectos, fundamentales para mantener un buen equilibrio de las poblaciones naturales: supervivencia, reproducción y crecimiento. 5.4.1. Efectos de los CTPs sobre la supervivencia Los contaminantes pueden reducir la supervivencia por muchos mecanismos, incluyendo mortalidad aguda, cáncer, supresión del sistema inmune o alterando el estado general de salud. Hoy en día, las intoxicaciones agudas, salvo por accidente, suelen ser poco frecuentes en la naturaleza. De hecho, las concentraciones de algunos organoclorados como por ejemplo los PCBs detectadas en aguas y organismos acuáticos no parecen ser tóxicas de forma aguda para la mayoría de la comunidad acuática, pues las concentraciones 97 ambientales suelen estar aproximadamente en niveles de uno a dos órdenes de magnitud por debajo de las concentraciones señaladas como letales por los estudios de laboratorio. Sin embargo, se ha descrito que altas dosis de niveles de contaminantes transferidos de las madres a las crías puede provocar aumento de la mortalidad en las primeras etapas de vida. Algunos de los CTPs son transferidos de una generación a la siguiente a través de la lactancia principalmente (Fukushima and Kawai, 1981; Subramanian et al., 1988a, b; Tanabe et al., 1982), siendo el desarrollo y crecimiento de los lactantes, los estados de vida más sensibles a los efectos de las toxinas (Beckman et al., 1999; Krahn et al., 2009; Schwacke et al., 2002; Viberg et al., 2003). Además, los niveles de los contaminantes organoclorados transmitidos a los lactantes son mayores en el primer primogénito que en las siguientes descendencias (Beckman et al., 1999; Lee et al., 1996; Ylitalo et al., 2001). Fukushima y Kawai (1981) consideran que el primer descendiente del delfín listado (Stenella coeruleoalba) recibe cuatro veces más organoclorados que los siguientes. Se cree que estos altos niveles de contaminantes pueden contribuir a la muerte en animales jóvenes (Schwacke et al., 2002). Dejando de lado los mamíferos, en los Grandes Lagos, que están altamente contaminados por PCBs, los estados embrionarios de aves y peces a menudo sufren de edema y deformidades y consecuente muerte (Gilbertson et al., 1991; Wright and Tillitt, 1999). Fernie y col. (2001) observaron que la exposición de los huevos del cernícalo americano (Falco sparverius) a PCBs, provocó una mortalidad mayor en las crías de los huevos expuestos que en aquellos control. El periodo embrionario en aves también ha sido definido como el momento más sensible a los efectos de los organoclorados (Carlson and Duby, 1973). También existen numerosas evidencias de contaminación por PAHs y sus efectos letales en estadios larvarios de peces (Eisler, 2000). La mortalidad en estadios tempranos ha sido igualmente documentada en reptiles. Se ha descrito una reducción en el éxito de eclosión y una mayor mortalidad en los cocodrilos americanos (Alligator mississippiens) que habitan en el lago Apopka, un lago altamente contaminado de Florida (Guillette et al., 1994). En particular en tortugas de ambientes acuáticos, algunos estudios experimentales han destacado la misma susceptibilidad en los primeros estadios de vida a los efectos tóxicos de las sustancias químicas (Bishop et al., 1994; Bishop et al., 1996; Hebert et al., 1993). Concretamente en Chelydra serpentina, se observó que niveles de PCBs dentro de un rango de 5272 µg/kg de peso húmedo ocasionaron disminución en el éxito en el nacimiento (Bishop et al., 1991). Los embriones de tortugas galápagos muestreados en zonas contaminadas por PAHs mostraron mayores incidencias a la deformación, incluyendo anormalidades letales, que en otras zonas no contaminadas (Van Meter et al., 2006). Las mayores concentraciones destacadas de CTPs en animales de vida libre se citan en mamíferos marinos, concretamente en odontocetos (Colborn and Smolen, 1996). Por el contrario, las tortugas marinas adultas no pueden acumular concentraciones letales de estos contaminantes ya que, además de vivir en 98 hábitats de mar abierto, se alimentan en eslabones más bajos de la cadena alimenticia que por ejemplo, los peces de los que se alimentan los mamíferos marinos. Sin embargo, algunas tortugas se alimentan en las desembocaduras de los ríos y habitan en aguas costeras y estuarios cerca de la costa donde pueden llegar mayores concentraciones de contaminantes desde sus fuentes de alimento. A pesar de ello, las tortugas marinas no pueden acumular niveles tan altos. Además, su sensibilidad a estos contaminantes es poco conocida. No obstante, se ha confirmado también la transferencia de los contaminantes acumulados a lo largo de la vida de hembras adultas de reptiles a través de sus huevos, sugiriendo que quizás éstos puedan llegar a niveles letales para un embrión en desarrollo (Alam and Brim, 2000), y por lo tanto especialmente en los huevos de sus primeras puestas (Guirlet et al., 2010). Aunque Guirlet et al. (2010) intentaron establecer una relación entre la alta mortalidad embrionaria observada en la población de tortuga laúd (Dermochelys coriacea) (Caut et al., 2006) nidificante en Guinea Francesa (la población nidificante más grande observada para esta especie) y algunos contaminantes organoclorados, los resultados de este estudio no probaron esta asociación. Sin embargo, en un estudio más reciente llevado a cabo por Perrault y col. (2011), con el objetivo de responder a la misma pregunta del porqué del bajo éxito reproductivo en esta especie, midieron concentraciones de Hg y Se. El Se juega un papel protector de la toxicidad del Hg (Perrault et al., 2011; Storelli et al., 1998a), y por lo tanto bajos niveles de Se quizás conllevan a mayor toxicidad del Hg. Estos autores probaron por primera vez evidencias del importante papel que juegan el Hg y Se con el éxito reproductivo, observando una correlación positiva entre el Se y el ratio Se/Hg con el número de crías emergidas. Por otro lado, otros autores han observado altas concentraciones de metaloides como el Zn en huevos infértiles de tortuga verde (Chelonia mydas) comparándolos con el vitelo de crías sanas en playas contaminadas de Turquía (Ozdilek and Ozdilek, 2007). La transferencia de la madre y el efecto de los contaminantes en las etapas iniciales de la vida en tortugas marinas deben ser estudiados más en profundidad en futuros estudios. El cáncer es uno de los efectos conocidos de los CTPs en roedores de laboratorio y, posiblemente, en los seres humanos (Colborn et al., 1993; Eisler, 2000; Fitzgerald et al., 2004; Safe, 1993), siendo además en el caso de los PAHs uno de los efectos más conocidos y estudiados en numerosas especies bajo condiciones de laboratorio (Albers, 1984) y variando la sensibilidad sustancialmente entre especies animales y la inducción de tumores por los PAHs (Eisler, 2000; Neff, 1985). Sin embargo, aunque la inducción de cáncer por contaminantes se ha observado en algunas poblaciones de vida silvestre, el cáncer rara vez se ha observado en fauna silvestre. El caso de las belugas (Delphinapterus leucas) que viven en el lago San Lorenzo, presentan niveles tan altos de PCB y plaguicidas que sus cuerpos se consideran residuos tóxicos de acuerdo a las regulaciones canadienses. Esta población estuvo cerca de la extinción quedando sólo 500 individuos aproximadamente en 1995 (De Guise et al., 1995). Sin embargo, las poblaciones del Ártico de esta especie con menores niveles de exposición no presentan estos problemas tan graves de salud. 99 El cáncer es una de las principales causas de muerte en estos animales del lago San Lorenzo y fue observado en el 27% de 129 animales varados muertos (Martineau et al., 2002). En otros animales marinos como el pez gato (Ameiurus nebulosus) y otros especies de peces, también se ha observado una prevalencia mayor a padecer tumores hepáticos y de piel en ambientes de mayor contaminación (Baumann, 1989; Chang et al., 1998). Sin embargo el cáncer en general es difícil de vincular a consecuencias negativas sobre la población. El cáncer quizás no produzca necesariamente la muerte y generalmente se presenta en animales de mayor edad, por lo que la tasa de crecimiento de una población no se verá afectada. Por ejemplo, las tasas de cáncer en seres humanos son más altas en adultos, pero esto no afecta a la tasa de crecimiento de la población. Excepto en el caso de la fibropapilomatosis, las neoplasias en tortugas marinas son muy poco comunes. Sólo se ha documentado un caso de cáncer del tipo linfoma en una hembra de tortuga boba (Caretta caretta). Orós y col. (2001) diagnosticaron la muerte de este animal debido a un linfoma linfoblástico multicéntrico. Sin embargo, la fibropapilomatosis es muy frecuente en algunas poblaciones de tortugas marinas. Esta patología se caracteriza por múltiples tumores cutáneos de naturaleza fibroepitelial. Aunque no es un tumor maligno, a menudo es letal debido a que pueden cubrir los ojos, la boca o la cloaca, impidiendo así una correcta alimentación. También se ha observado una forma visceral de la enfermedad. Estudios experimentales han demostrado que un agente infeccioso subcelular y sensible al cloroformo está implicado en la etiopatogenia de estos tumores, sospechándose de un herpesvirus (Herbst et al., 1995; Herbst et al., 1996). Aguirre y col. (1994) realizaron un estudio con 10 tortugas verdes con fibropapilomatosis, con el fin de hallar una relación entre la enfermedad y la posible presencia de contaminantes orgánicos y trazas de metales pesados. Ninguno de los metales encontrados superó los valores habituales para tortugas marinas sanas, descartándose cualquier relación entre la presencia de metales pesados y la fibropapilomatosis. Se ha sugerido que la acción de agentes inmunosupresores de contaminantes ambientales podían activar a virus latentes o aumentar su virulencia (Balazs and Poley, 1991; Gamache and Horrocks, 1992; Hutchinson and Simmonds, 1991). Además, algunos autores han sospechado que los contaminantes organoclorados pueden promover los tumores mediante la supresión del sistema inmune (Aguirre et al., 1994; Schumacher et al., 1998). Entre los posibles sistemas orgánicos afectados por la presencia de CTPs se encuentra de manera destacada el sistema inmune. En la revisión realizada por Keller y col. (2000) sobre inmunotoxicología en fauna salvaje, se describen numerosos trabajos que demuestran cómo los CTPs pueden suprimir el sistema inmunológico de peces silvestres, aves y mamíferos. Los pollos de charrán común (Sterna caspia) localizados en sitios contaminados por organoclorados en los Grandes Lagos mostraron supresión del sistema inmune (Grasman et al., 1996). Además, las concentraciones de PCB en sangre de estas aves marinas se correlacionaron significativamente con la reducción de los linfocitos T 100 (Grasman and Fox, 2001). Finkelstein y col. (2007) observaron alterada la función inmunológica de albatros (Phoebastria nigripes) por organoclorados y metales pesados como el Hg en el Pacífico Norte. Varios parámetros inmunológicos se observaron suprimidos en focas (Phoca vitulina) que fueron alimentadas con pescado contaminado por organoclorados del Mar Báltico (Ross et al., 1996). Lahvis y col. (1995) también observaron que el aumento de organoclorados en la sangre de delfines mulares (Tursiops truncatus) conllevaron inmunosupresión. El Hg ha sido asociado con efectos negativos sobre la función inmunológica en focas (Das et al., 2008). Además, mortalidades masivas de mamíferos marinos han sido vinculadas al debilitamiento del sistema inmunológico asociado a la contaminación ambiental (Aguilar and Borrell, 1994a; Dietz et al., 1989) y por lo tanto son más susceptibles a padecer infecciones (Beineke et al., 2010). Se han llevado a cabo numerosos estudios en especies de salmón sobre contaminación por PAHs, mostrando una mayor susceptibilidad a padecer enfermedades aquellos peces más expuestos (Johnson et al., 2008). En el caso de las tortugas marinas, poco se sabe sobre su sistema inmune y su relación con enfermedades. Al igual que en otros reptiles, su sistema inmunológico puede variar con los cambios estacionales, como la temperatura y el fotoperiodo o estrés. Los escasos trabajos que existen en reptiles y los efectos inmunotoxicológicos de los CTPs se han iniciado en la última década (ver revisión de Keller y col. 2006). Tangredi y Evans (1997) observaron concentraciones superiores de pesticidas en el hígado de tortuga de caja común (Terrapene carolina carolina) que padecían infecciones bacterianas crónicas, comparadas con otras tortugas con buena condición corporal muertas por heridas accidentales. Los efectos de los contaminantes orgánicos sobre el sistema inmune en caimanes de zonas contaminadas han sido objeto de numerosos estudios (Peden-Adams, 1999; Rooney et al., 2003). Así en juveniles de esta especie del lago Apopka se han observado alteraciones tímicas que sugieren que la maduración de los linfocitos T puede estar alterada (Rooney et al., 2003). Yu y col. (2012) estudiaron los posibles efectos en tortugas acuáticas (Trachemys scripta elegans) expuestas a PCBs sugiriendo posible modulación del sistema inmune por estos organoclorados. El efecto de los CTPs sobre el sistema inmune de las tortugas marinas ha sido poco estudiado. Keller y col. (2006) demostraron por primera vez en un estudio in vitro que los contaminantes organoclorados quizás modulen el sistema inmune de estos reptiles marinos. La afectación del sistema inmune por la presencia de organoclorados en tortugas boba (Caretta caretta) había sido previamente sugerida por la alteración del número de leucocitos en la sangre, la ratio heterófilos/linfocitos y por la proliferación de linfocitos que inducen la división celular (mitogénesis) (Keller et al., 2004c). Además se observaron correlaciones entre los CTPs medidos en sangre de Caretta caretta y la actividad de la lisozima y la proliferación de linfocitos T y B, incluso a concentraciones en sangre mucho más bajas que en otras especies marinas. Esto hace pensar que las tortugas boba quizás son sensibles a la modulación del sistema inmune por los organoclorados 101 y ciertos metales pesados como el Hg incluso a bajas concentraciones (Day et al., 2007; Keller et al., 2006). Sin embargo, en el estudio llevado a cabo por Komoroske y col. (2011) no se encontraron correlaciones estadísticamente significativas entre los niveles de p,p’-DDE y la proliferación de linfocitos. Aunque no existen estudios relacionados con el efecto de los PAHs sobre el sistema inmune en tortugas marinas, Lutcavage y col. (1997b) documentó efectos subletales del petróleo y la salud del sistema inmunológico en tortugas bobas. Por otro lado, los animales enfermos por lo general tienen sistemas inmunitarios debilitados. Por ejemplo, la inmunosupresión se ha visto en tortugas verdes (Chelonia mydas) afectadas por fibropapilomatosis, pero se desconoce si la enfermedad fue causada por la inmunosupresión o la inmunosupresión es anterior a la enfermedad (Cray et al., 2001; Work et al., 2001). También se ha citado un aumento en la proporción heterófilos/linfocitos como indicador de enfermedad en tortugas marinas (Aguirre et al., 1995; Cray et al., 2001; Work et al., 2001). En los últimos años se ha observado un aumento de la incidencia de varamientos de tortugas boba (Caretta caretta) debilitadas en la costa de EE.UU. (Norton et al., 2005). Estas tortugas se caracterizan por presentar severa caquexia, gran carga de parásitos externos e internos e infecciones bacterianas. Sin embargo, el origen que desencadena este estado es aún desconocido. Day y col. (2010) estudiaron la posible relación entre el Hg y diferentes parámetros clínicos en tortugas de estas características, no observando diferencias entre las tortugas sanas y aquellas debilitadas. Debido al escaso número de casos de tortugas debilitadas, no se han podido relacionar los niveles de Hg y la supresión del sistema inmune observada como origen de este estado (Day et al., 2007). Otros autores han observado aumento de niveles de ciertos CTPs en grupos de tortugas con estas características (Day, 2003; Keller et al., 2006). En un reciente estudio llevado a cabo por nuestro grupo de investigación, se asociaron las altas concentraciones de PCBs encontradas con la causa de muerte de una hembra inmadura de Caretta caretta que padeció pansteatitis. Además es la primera vez que se observa esta patología en estos reptiles (ver Anexo II). La determinación del estado general de salud es otro factor importante a la hora de determinar los negativos efectos de los contaminantes ambientales sobre los seres vivos. Los parámetros hematológicos y bioquímicos son ampliamente usados para determinar el estado general de salud de cualquier especie animal. Los efectos de los contaminantes también han sido evaluados a estos niveles subcelulares en distintas especies animales. De esta manera, se han documentado los efectos tóxicos de los PCBs sobre el riñón, y sobre los diferentes parámetros bioquímicos sanguíneos, como el nitrógeno ureico en sangre y el nivel de los electrolitos, que son utilizados para confirmar la disfunción renal (McConnell, 1985). En peces, la exposición al clordano se tradujo en un aumento de la concentración del sodio y 102 del magnesio (Bansel et al., 1979). Otros parámetros bioquímicos como la glucosa mostraron una correlación negativa con contaminantes, como en el caso de ratas expuestas a PCBs (Boll et al., 1998; Chu et al., 1994). El aumento de la AST se usa comúnmente como indicador de daño hepatocelular en aves y mamíferos expuestos a organoclorados (Arnold et al., 1990; Feeley, 1995). Albers y col. (1986) no encontraron alteraciones en el hematocrito y en el análisis bioquímico de tortugas mordedoras con niveles importantes de organoclorados en sus tejidos. Los estudios que muestran los potenciales efectos de los CTPs a estos niveles fisiológicos son muy escasos también en tortugas marinas (Day et al., 2007; Innis et al., 2008; Keller et al., 2004c; Swarthout et al., 2010), y los resultados son contradictorios. Previamente se han revisado en algunas poblaciones de tortugas marinas expuestas a contaminantes persistentes los parámetros generales de salud (George, 1997). Se ha observado que algunos parámetros, como la presión osmótica y la urea, sufren cambios estacionales, pero otros se mantienen relativamente constantes durante todo el año, como la glucosa y el hematocrito (Bolten and Bjorndal, 1992). En el estudio realizado por Keller y col. (2004c) se obtuvo la primera evidencia de que los compuestos organoclorados pueden afectar al estado de salud de las tortugas marinas. Aunque las concentraciones que se detectaron de estos tóxicos fueron relativamente bajas comparadas con otras especies, observaron un importante número de correlaciones entre la carga de contaminantes y parámetros generales de salud de diferentes funciones biológicas, como inmunidad y homeostasis de proteínas, carbohidratos e iones. La alteración de parámetros hematológicos como el hematocrito y glóbulos rojos, se han observado correlacionados positivamente con PCBs, sugiriendo que estos organoclorados pueden causar anemia en tortugas marinas (Keller et al., 2004c). Además en el estudio realizado por Lutcavage y col. (1997b) las tortugas expuestas a petróleo presentaron reducido su número total de glóbulos rojos. Además, en un estudio donde evaluaron diferencias entre parámetros clínicos y las causas de ingreso de tortugas boba, se observó que las tortugas que vararon petroleadas presentaron disminuciones significativas de RBC y aumento de WBC y trombocitos con respecto a tortugas clínicamente sanas (Casal and Orós, 2009). También se han observado correlaciones significativas entre CTPs y electrolitos en tortugas marinas (Innis et al., 2008; Keller et al., 2004c). El equilibrio iónico en las tortugas marinas es regulado no sólo por el riñón, sino también por las glándulas excretoras de sal. Las glándulas excretoras de sal de las tortugas bobas concentran el sodio 8 veces más respecto al plasma y el magnesio 45 veces más y excretan el fluido resultante a través de los conductos próximos a los ojos (Vargo et al., 1986). Si el riñón o las glándulas de la sal de las tortugas marinas son sensibles a los organoclorados, como se ha visto en otras especies (McConnell, 1985), la correlación observada por Keller y col. (2004c), podría significar que los organoclorados afectan a estos órganos y al equilibrio iónico de las tortugas marinas. En un reciente estudio llevado a cabo por nuestro grupo 103 de investigación, se muestra por primera vez en tortugas marinas, la patología de la glándula de sal como causa de muerte en los animales estudiados. Dos de los animales analizados en este estudio mostraron unos niveles de sodio, cloro y osmolalidad aumentados debido a la disfuncionalidad de la glándula (Orós et al., 2011) (datos correspondientes al Capítulo II). La concentración de glucosa en sangre está claramente relacionada con el estado nutricional en las tortugas boba (Lutcavage et al., 1997b). La glucosa en el plasma es estrictamente regulada por el hígado y su compleja interacción con el hipotálamo y con la hipófisis y las glándulas adrenales. Por ello, cualquier posible interferencia de los CTPs en los órganos mencionados podría ser la causa de una alteración de los niveles de glucosa en sangre. En el estudio de Keller y col. (2004c) se observó una correlación negativa entre los niveles de glucosa y la concentración de dieldrín y DDTs en el tejido adiposo de tortugas boba. También se conoce la alteración de la actividad de las enzimas hepáticas por la presencia de organoclorados, como la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa y la enzima málica, responsables de la regulación de proteínas, lípidos y azúcares (Boll et al., 1998). En tortugas boba, se han correlacionado valores altos en la concentración de organoclorados con una disminución del cociente albúmina/ globulina (Keller et al., 2004c). En el mismo estudio se observó un aumento de la actividad de la AST y una disminución de la ALP en individuos con altos niveles de organoclorados. Debido a la falta de estudios que determinen la distribución de estas enzimas en los órganos de las tortugas marinas, resulta difícil interpretar las correlaciones observadas en este estudio. Si nos basamos en la evidencia experimental de que los organoclorados causan daños en el hígado y consecuentemente producen un aumento de la AST en plasma en mamíferos y aves, es plausible que la fuerte correlación encontrada por Keller y col. (2004c) sea un indicativo de daño hepatocelular en tortugas marinas contaminadas por organoclorados. Esta interpretación es reforzada por la ausencia de correlación entre organoclorados y actividad CPK, enzima de origen muscular. Según Campbell (1996), de un daño hepatocelular se espera que resulte un aumento de la AST, pero no de la CPK. En el estudio de Day y col. (2007) se observaron correlaciones de los niveles de Hg con aumentos de las AST y disminuciones de CPK. Sin embargo, se observó una correlación positiva entre los niveles de CPK y Hg en el estudio de Innis y col. (2008). Todas las correlaciones observadas por diversos autores entre los niveles de CTPs y los diferentes parámetros medidos sugieren que el estado de salud de las tortugas boba se ve afectado por estos contaminantes. Sin embargo, es importante destacar que la mayoría de los indicadores medidos no rebasaron los rangos establecidos para esta especie. Si bien es cierto que los rangos descritos se han concluido tras el examen de tortugas marinas de vida libre que, indudablemente, han estado expuestas a contaminantes persistentes. Además, es posible que pudieran darse efectos adversos en un animal aun cuando sus parámetros se JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..113 113 Justificación y objetivos En los últimos 50 años, los efectos directos e indirectos del creciente desarrollo humano sobre el medio ambiente, han desencadenado una situación severamente comprometida para todas las especies de tortugas marinas. La pesca no selectiva indiscriminada, el saqueo de huevos o la caza de tortugas para consumo, el desarrollo costero y la contaminación marina son las principales amenazas a nivel mundial a las que se encuentran expuestos estos reptiles. Esta situación de alarma ha despertado un creciente interés por la conservación de estas especies, realizándose numerosos esfuerzos encaminados a un mayor conocimiento y protección de estos singulares vertebrados marinos. Sin embargo, a pesar del enorme progreso que se ha realizado en las últimas décadas, numerosas son las incognitas que debemos resolver. El desconocimiento de aspectos clínicos fundamentales para una correcta rehabilitación de tortugas varadas, o el comportamiento de determinados parámetros de salud a los negativos efectos de sustancias químicas presentes en el medio ambiente, son algunas de las tareas pendientes que deben ser investigadas. Parámetros clínicos como el pH, gases sanguíneos y electrolitos han sido escasamente estudiados en tortugas marinas. El buen conocimiento de estos prarámetros es necesario para interpretar el grado y tipo de deshidratación que presenta un animal accidentado o enfermo. Referencias de valores fisiológicos de estos parámetros son fundamentales para el establecimiento de correctas terapias médicas que ayuden al proceso de rehabilitación. Además, ciertas patologías pueden afectar directamente los niveles plasmáticos de estos parámetros clínicos, siendo fundamental su estudio y evaluación en el marco de medidas dirigidas a la conservación de estas especies. 114 Por otro lado, a lo largo de la Introducción de esta Tesis Doctoral, hemos visto cómo en la sociedad del siglo XXI vivimos rodeados de un cóctel de sustancias químicas con capacidad de interaccionar con los animales y el hombre y que son capaces en muchos casos de producir efectos adversos sobre la salud. La Organización de las Naciones Unidas ha trabajado durante los últimos 25 años para alcanzar acuerdos que minimicen y eliminen los riesgos de la contaminación química. En el marco legislativo, los convenios internacionales han dado prioridad en sus políticas al tratamiento de las sustancias tóxicas y peligrosas. Muchos de estos acuerdos identifican como objetivo prioritario las sustancias persistentes, tóxicas y bioacumulativas y en especial a los organohalogenados. El Convenio de Estocolmo es el instrumento internacional que regula el tratamiento de las sustancias tóxicas, auspiciado por el Programa de Naciones Unidas para el Medio Ambiente (PNUMA). Este convenio ha sido el resultado de largos años de negociación para obtener compromisos legales de los países que obligue de manera urgente la eliminación de los Compuestos Orgánicos Persistentes (COPs) más tóxicos. Los COPs son un conjunto de sustancias químicas que comparten cuatro características básicas: (1) son tóxicos para la salud animal y humana y contaminan el medio ambiente; (2) son “orgánicos” por tener carbono en su estructura química, lo que los hace ser solubles en grasas y permite que se bioacumulen y biomagnifiquen a lo largo de las cadenas alimentarias; (3) son persistentes ya que duran años o décadas antes de degradarse; y (4) pueden desplazarse a grandes distancias. Estas propiedades intrínsecas de los COPs forman una combinación peligrosa que hace que sea prácticamente imposible controlarlos efectivamente una vez liberados en el ambiente. Los COPs actúan de numerosas formas e interfieren en procesos biológicos fundamentales para los seres vivos. Por lo tanto, son capaces de afectar la salud de los seres vivos incluso en cantidades muy pequeñas, medidas en partes por millón o incluso partes por trillón. Los efectos en la salud pueden ser inmediatos o bien manifestarse mucho tiempo después o incluso a las generaciones sucesivas. Los efectos crónicos producidos por los COPs incluyen el cáncer, problemas reproductivos, alteración del sistema inmunológico, lo que baja las defensas del cuerpo y lo hace más propicio a contraer otras enfermedades, efectos de la disrupción hormonal y alteraciones en el comportamiento, entre otros. Es importante destacar que los COPs incluidos en el Convenio de Estocolmo, al igual que otras sustancias químicas, son disruptores endocrinos, es decir, causan desequilibrios hormonales debido a que pueden imitar, sustituir o inhibir la acción de las hormonas, lo que provoca un gran número de reacciones bioquímicas incontroladas. Los COPs liberados en el ambiente se disuelven en los tejidos grasos de vegetales y animales y se van concentrando en ellos, a través de un proceso denominado bioacumulación. Esta concentración se biomagnifica, es decir, aumenta en cientos e incluso millones de veces, en la medida en que los organismos expuestos a los 115 COPs son devorados por sus depredadores, lo que hace que estos contaminantes se desplacen por los diferentes eslabones de las cadenas alimentarias. De este modo, los COPs alcanzan las concentraciones más altas en las especies que están en los niveles más elevados de las cadenas alimentarias. Además de los COPs también preocupan por comportarse de forma muy similar, algunos compuestos inorgánicos, presentes de forma natural en el ambiente, pero que debido a las actividades humanas han sido concentrados cientos de miles de veces en determinadas regiones del planeta. Compuestos de metales no esenciales (como por ejemplo el arsénico, cadmio, mercurio o plomo) se comportan en este sentido como los COPs ya que también resultan tóxicos para los seres vivos a dosis muy bajas, pueden comportarse como disruptores endocrinos, son capaces de distribuirse por el medioambiente y son igualmente capaces de incorporarse a los seres vivos a través de la cadena alimentaria. Es por esto que se habla de Contaminantes Toxicos Persistentes (CTPs), cuando se quiere incluir tanto a los compuestos orgánicos como a los inorgánicos. Por los riesgos que entrañan los CTPs en los seres vivos, conocer la exposición de las tortugas marinas a estos contaminantes se plantean como uno de los temas prioritarios en la conservación de estos reptiles. El acceso a animales silvestres marinos es frecuentemente complicado y es por ello que la mayor parte de los estudios se han realizado en tejidos de animales muertos. De esta manera, disponemos de una amplia bibliografía de los niveles de contaminación en diferentes tejidos de tortugas marinas. Sin embargo, mientras algunas poblaciones han sido ampliamente estudiadas, otras como la población de tortuga boba de Cabo Verde carecen por completo de información. Algunos autores han publicado niveles de contaminación en tejidos de Caretta caretta varadas muertas en el Atlántico Este, pero no existen datos de niveles de contaminación en tortugas vivas en estas aguas. Recientemente se ha demostrado la utilidad de la muestra sanguínea como un método no letal para monitorizar los niveles de CTPs en tortugas marinas. La utilización de métodos que no impliquen la muerte de los animales es fundamental en especies que se encuentran protegidas. Además, las ventajas de los modernos analizadores químicos de alta sensibilidad, permiten incluso con cantidades de muestra relativamente pequeñas, la determinación de sustancias químicas en animales vivos. Por otro lado y como hemos visto, no existen muchos estudios que evalúen los efectos sobre la salud de las tortugas marinas o su descendencia de los CTPs. Además, escasos estudios han investigado los efectos de estos contaminantes sobre parámetros generales de salud. Una alta sensibilidad de las tortugas marinas a los efectos de los contaminantes ambientales ha sido previamente postulada debido a las numerosas correlaciones encontradas entre algunos contaminantes y parámetros sanguíneos, incluso a bajas concentraciones. 116 Por todo lo expuesto, en esta Tesis Doctoral se plantean como OBJETIVOS PRINCIPALES los siguientes puntos: 1. Documentar valores de referencia de pH, gases sanguíneos, equilibrio ácido-base y parámetros bioquímicos en tortugas boba juveniles varadas. Esto permitirá evaluar los desequilibrios ácidobase y bioquímicos que presentan las tortugas en el momento del ingreso al hospital. Además se estudiarán diferencias entre las causas de ingreso y la evolución de las tortugas y los valores bioquímicos obtenidos. 2. Evaluar la afectación de niveles de electrolitos en tortugas que presentan una afectación de la funcionalidad de la glándula de sal. 3. Monitorizar niveles de CTPs en tortugas boba vivas del Este del Atlántico, estudiando las posibles diferencias temporales y geográficas de niveles de contaminación en diferentes grupos de tortuga boba: juveniles vs. adultas. Además, en las tortugas juveniles se monitorizarán los niveles de CTPs durante diferentes momentos del periodo de rehabilitación de las tortugas y se evaluarán diferencias entre las distintas causas de ingreso y el tamaño de los animales varados. 4. Evaluar los potenciales efectos de los CTPs sobre parámetros generales de salud en ambos grupos de tortugas. MATERIAL Y MÉTODOS 1. Área de estudio y muestreo 2. Análisis clínicos 3. Análisis toxicológicos 4. Análisis estadístico de los datos MATERIAL Y MÉTODOS 1. Área de estudio y muestreo. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..119 1.1. Archipiélago de Canarias . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..120 1.1.1. Toma de datos y muestreo .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..120 1.2. Archipiélago de Cabo Verde . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 122 1.2.1. Toma de datos y muestreo .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..123 1.3. Almacenamiento y tratamiento de muestras previo a los análisis clínicos y toxicológicos . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..124 2. Análisis clínicos .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..125 2.1. Análisis hematológicos . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..125 2.1.1. Recuento total de eritrocitos.. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..125 2.1.2. Recuento total de leucocitos.. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..126 2.1.3. Recuento diferencial leucocitario .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..126 2.1.4. Estimación del número de trombocitos .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..127 2.1. Análisis bioquímicos .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..127 3. Análisis toxicológicos . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 128 3.1. Generalidades . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..128 3.2. Material, reactivos e instrumental.. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..129 3.2.1. Reactivos . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..129 3.2.2. Material. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..132 3.2.3. Aparatos auxiliares .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..133 3.2.4. Instrumentación analítica y accesorios . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 134 3.3. Procedimientos . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 135 3.3.1. Preparación de patrones y materiales de referencia .. .. .. .. .. .. ..135 3.3.1.1. Preparación de soluciones de fortificación de los COPs.. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..135 3.3.1.2. Fortificación con COPs de muestras de plasma .. .. .. .. ..135 3.3.1.3. Preparación de rectas de calibrado de COPs.. .. .. .. .. .. ..136 3.3.1.4. Preparación de rectas de calibrado de CIPs . .. .. .. .. .. .. ..137 3.3.2. Preparación de las muestras .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..137 3.3.2.1. Preparación de las muestras de plasma para el análisis de COPs .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..137 3.3.2.2. Extracción.. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..138 3.3.2.2. Preparación de muestras de sangre para el análisis de CIPs .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..138 3.3.3. Análisis químico .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..138 3.3.3.1. Análisis de COPs.. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..138 3.3.3.2. Análisis de CIPs . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 145 4. Análisis estadístico de los datos . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..147 119 1. Área de estudio y muestreo Los ejemplares de tortuga boba incluidos en este estudio fueron muestreados en dos zonas diferentes: Gran Canaria (Islas Canarias, España) y la isla de Boavista (República Independiente de Cabo Verde). Ambos archipiélagos están situados en el este del Océano Atlántico (Figura 1), formando junto con los Archipiélagos de las Islas Azores y Madeira la Región de la Macaronesia. Figura 1. Mapa del noreste del Océano Atlántico señalando los Archipiélagos de muestreo. 126 2.1.2. Recuento total de leucocitos En reptiles, los recuentos totales de leucocitos deben hacerse por métodos manuales; esto se debe a la existencia de trombocitos y eritrocitos nucleados, que impiden el uso de los contadores celulares electrónicos (Campbell, 1996; Campbell, 2004; Wilkinson, 2004). Para realizar el recuento de leucocitos, se empleó el mismo método usado en el recuento total de eritrocitos, que es el denominado “método de Natt & Herrick”, por considerarse que valora de forma más precisa el recuento de leucocitos que la otra técnica de medición más empleada (el sistema eosinophil unopette) (Fontenot et al., 2004). Así, se empleó el diluyente Natt & Herrick y la pipeta hemocitométrica de Thoma (en este caso con la perla blanca), usando una dilución de 1/20. Para realizar el recuento se utilizó también la cámara de Neubauer. Se cuenta el número de células presentes en los 4 cuadrados grandes de las esquinas de la cámara. El número de leucocitos contados se multiplica por 50 obteniéndose el número de leucocitos por µl de sangre (Campbell, 1996). 2.1.3. Recuento diferencial leucocitario Los frotis sanguíneos se tiñeron 1 hora después de su obtención, una vez secados al aire, siendo recomendable efectuar la tinción de las extensiones lo antes posible para preservar mejor la morfología celular (Raphael, 2003). Una vez realizadas las extensiones sanguíneas y posterior secado al aire, se efectuaron las tinciones hematológicas. Las tinciones hematológicas rápidas son útiles para evaluar los frotis sanguíneos de los quelonios (Wilkinson, 2004), como son las tinciones tipo Romanowsky (Wallach and Boever, 1993). En este trabajo se utilizó un método rápido de tinción, el Diff quick® (DQ) (Panóptico rápido. In Vitro Diagnosticum, QCA), basado en tinciones tipo Romanowsky (Work et al., 1998) ya que otorga suficiente calidad en las extensiones sanguíneas como para realizar una correcta identificación y caracterización de las células sanguíneas (Barrows et al., 2004). Este método ha sido utilizado por distintos autores para evaluar las células sanguíneas de los quelonios (López-Olvera et al., 2003) y tortugas marinas (Casal and Orós, 2009; Montilla et al., 2006). Se trata de una modificación de la técnica de Wright, que convierte los cuatro minutos clásicos del proceso en tres etapas de una duración aproximada de 15 segundos. La técnica se desarrolla en 4 pasos: 1º, la preparación sanguínea se introduce en el fijador, (disolución metílica de triarilmetano) durante 5 segundos (u 8 inmersiones). 2º, se quita el exceso de fijador, sin aclarar, y se sumerge el portaobjetos en el colorante rojo (solución tamponada ácida de xanteno, eosina) durante 5 segundos (u 8 inmersiones). 127 3º, se quita el exceso de colorante, sin aclarar, y se introduce en el colorante azul (solución tamponada alcalina, hematoxilina) durante 5 segundos (u 8 inmersiones). 4º, Finalmente la preparación se aclara suavemente con agua corriente destilada hasta observar que el agua se vuelve cristalina y posteriormente se seca al aire. Una vez secas, las preparaciones sanguíneas se observaron mediante el microscopio óptico utilizando el objetivo de 100 aumentos y usando aceite de inmersión. Se contaron 200 leucocitos en cada extensión sanguínea, en diferentes áreas, en dirección de la cola a la cabeza del frotis y en forma de vaivén (muralla almenada), obteniéndose seguidamente los porcentajes de cada tipo celular. Es importante examinar todas las áreas de la extensión sanguínea para obtener una muestra representativa de los leucocitos. Las células grandes, como los monocitos y los heterófilos, con frecuencia se encuentran en los márgenes de los frotis, pudiendo ser fácilmente subestimados si no se observan todas las áreas de las preparaciones (Wilkinson, 2004). 2.1.4. Estimación del número de trombocitos Realmente no existe un método fiable para realizar recuentos directos de trombocitos. No obstante, se puede hacer una estimación del número de trombocitos presentes en la sangre de cada tortuga. Para ello, elegimos un campo al azar en el frotis sanguíneo, donde no haya trombocitos agregados, y contamos el número de trombocitos presentes en dicho campo multiplicando este valor por el cuadrado del objetivo empleado; obteniendo así la estimación del número de trombocitos por µl de sangre (Barrows et al., 2004; Casal and Orós, 2009; Raskin, 2000; Wilkinson, 2004). 2.2. Análisis bioquímicos Para la determinación de los valores bioquímicos empleamos un analizador automático de química seca (Olympus AU640, Japan). Los valores bioquímicos sanguíneos estudiados fueron los siguientes: proteínas totales, albúmina, globulina, triglicéridos, ácido úrico, glucosa, colesterol total, urea, bilirrubina total, creatinina, lactato deshidrogenasa (LDH), aspartato aminotransferasa (AST), alanino aminotransferasa (ALT), fosfatasa alcalina (ALP), γ-glutamil transferasa (GGT), creatina fosfoquinasa (CPK), amilasa, lipasa, calcio, cloro, sodio, potasio, fósforo y magnesio. Constituyen parámetros sanguíneos frecuentemente usados en las tortugas marinas (Aguirre, 1996). El valor aproximado de la globulina se calculó a través de la resta entre la albúmina a las proteínas totales. 128 3. Análisis toxicológicos 3.1. Generalidades Cuando se quiere hacer un análisis de contaminantes en matrices complejas como son las muestras de plasma objetivo de esta tesis, es imprescindible realizar un trabajo previo de extracción de dichos analitos de la matriz en la que están contenidos, o bien, de digestión de la muestra en el caso de análisis de contaminantes inorgánicos. Son diversas las técnicas que pueden emplearse para ello. Los principales aspectos que se deben considerar en la extracción de COPs desde el plasma son, permitir un tiempo apropiado de exposición del sistema disolvente en la matriz de muestras y limitar la manipulación de las muestras. La contaminación cruzada por residuos dejados por altos niveles de contaminantes procedentes de otras muestras previamente analizadas pueden constituir un problema en esta fase de extracción y todos los equipos y el material deben limpiarse exhaustivamente y verificarse después de cada lote de muestras, usando los blancos y controles adecuados. Por este mismo motivo la pureza de los disolventes y reactivos utilizados en todo el proceso analítico también es un aspecto importante. Sólo se deben utilizar disolventes de alta pureza destilados, utilizar material de vidrio sometido a un procedimiento previo de limpieza con disolvente y además aplicarse estándares internos a la muestra tan pronto como sea posible en el proceso. Una vez obtenidos los extractos procedentes de matrices complejas, para el análisis de COPs habitualmente es necesario proceder a una purificación de los mismos, y eliminar así los restos de grasas principalmente, ya que las impurezas disminuyen de forma muy relevante la sensibilidad de los métodos de detección empleados. Por último, antes del análisis, los extractos purificados obtenidos deben ser concentrados ya que en el proceso se han utilizado distintos volúmenes de disolventes que han ido diluyendo la muestra. Por lo tanto el uso de concentradores a base de gas inerte se hace imprescindible en la preparación final de las muestras que van a someterse al análisis instrumental. Como veremos en las siguientes secciones de este apartado de Material y Métodos, en esta Tesis Doctoral hemos utilizado una combinación de todas estas técnicas en las diferentes etapas del proceso analítico, siguiendo los métodos oficiales de análisis de la UE elaboradas por el Comité Europeo de Normalización. 129 3.2. Material, reactivos e instrumental 3.2.1. Reactivos Para el análisis de contaminantes en matrices biológicas sólo se pueden utilizar reactivos de máxima pureza (calidad “Para análisis de residuos” (PAR) o similar) y únicamente agua destilada y desmineralizada. Los reactivos que hemos utilizado en la elaboración de esta Tesis Doctoral son los siguientes: Solventes orgánicos: Todos los solventes Panreac empleados disponen de un certificado de registro de calidad de acuerdo con la norma ISO 9002. • Acetonitrilo Panreac, grado PAR. Pureza 99.8%. • Ciclohexano Panreac, grado PAR. Pureza 99.8%. • n-Hexano Panreac, grado PAR. Pureza 95%. • Metanol Panreac, grado PAR. Pureza 99.9%. Agua destilada ultrapura MilliQ, recogida directamente en botella de vidrio. Suero fetal bovino (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, EE.UU.) Columnas de extracción en fase sólida (SPE) Chromabond C18ec/3 ml/200 mg Macherey-Nagel. Patrones de los POCs, PCBs y PAHs investigados: • Patrones en estado sólido -HCB (hexaclorobenceno) de Laboratorio Dr. Ehrenstorfer, del 99.6% de pureza. -α-HCH (isómero α del 1,2,3,4,5,6-hexaclorociclohexano) de Laboratorio Dr. Ehrenstorfer, del 99.5% de pureza. -β-HCH (isómero β del 1,2,3,4,5,6-hexaclorociclohexano) de Laboratorio Dr. Ehrenstorfer, del 99.6% de pureza. -γ-HCH (isómero γ del 1,2,3,4,5,6-hexaclorociclohexano o lindano) de Laboratorio Dr. Ehrenstorfer, del 99.7% de pureza. -δ-HCH (isómero δ del 1,2,3,4,5,6-hexaclorociclohexano) de Laboratorio Dr. Ehrenstorfer, del 99.6% de pureza. -Aldrina (1,2,3,4,10,10-hexacloro-1,4,4a,5,8,8a-hexahidro-1,4:5,8 dimetanonaftaleno) de Laboratorio Dr. Ehrenstorfer, del 99.6% de pureza. -Dieldrina (1,2,3,4,10,10-hexacloro-6,7-epoxi-1,4,4a,5,6,7,8,8aoctahidro-endo,endo-1,4:5,8-dimetanonaftaleno) de Laboratorio Dr. Ehrenstorfer, del 98.1% de pureza. -Endrina (1,2,3,4,10,10-hexacloro-6,7-epoxi-1,4,4a,5,6,7,8,8aoctahidro-endo,endo-1,4:5,8-dimetanonaftaleno) de Laboratorio Dr. Ehrenstorfer, del 99.4% de pureza. -Heptacloro (1,4,5,6,7,8,8-heptacloro-3a,4,7,7a-tetrahidro-4,7metanoindeno) de Laboratorio Dr. Ehrenstorfer, del 98.1% de pureza. 130 -cis-Heptacloro epóxido (isómero cis del 2,3,4,5,6,7,7-heptacloro1A,1B,5,5A,6,6A-hexahodro-2,5-metano-2H-indeno (1,2-b) oxireno) de Laboratorio Dr. Ehrenstorfer del 99.8% de pureza. -α-Endosulfán (isómero α del 1,2,3,4,7,7-hexaclorobiciclo [2.2.1]-2-hepteno-5,6-bioximetileno sulfito) de Laboratorio Dr. Ehrenstorfer, del 98.1% de pureza. -β-Endosulfán (isómero β del 1,2,3,4,7,7-hexaclorobiciclo [2.2.1]-2-hepteno-5,6-bioximetileno sulfito) de Laboratorio Dr. Ehrenstorfer, del 98.8% de pureza. -cis-clordano (isómero cis del 1,2,4,5,6,7,8,8-octacloro2,3,3a,4,7,7a-hexahidro-4,7-metano-1H-indeno) de Laboratorio Dr. Ehrenstorfer, del 99.9% de pureza. -trans-clordano (isómero trans del 1,2,4,5,6,7,8,8-octacloro2,3,3a,4,7,7a-hexahidro-4,7-metano-1H-indeno) de Laboratorio Dr. Ehrenstorfer, del 99.9% de pureza. -4,4’-DDT (1,1,1-tricloro-2,2-bis (p-metoxifenil)etano) de Laboratorio Dr. Ehrenstorfer, del 99.5% de pureza. -4,4’-DDE (1,1-dicloro-2,2-bis (p-metoxifenil)etano) de Laboratorio Dr. Ehrenstorfer, del 99.5% de pureza. -4,4’-DDD (1,1-dicloro-2,2-bis (p-clorofenil)etano) de Laboratorio Dr. Ehrenstorfer, del 99.5% de pureza. -PCB 202 (2,2’,3,3’,5,5’,6,6’-octaclorobifenilo) de Laboratorio Dr. Ehrenstorfer, del 99.5% de pureza. -Tetracloroxileno (2,4,5,6-tetracloro-m-xileno) de Laboratorio Dr. Ehrenstorfer, del 99.5% de pureza. Patrones en disolución -PCB 28 (2,4,4’-triclorobifenilo) de Absolute Standards (100 µg/mL en isooctano). -PCB 52 (2,2’,5,5’-tetraclorobifenilo) de Absolute Standards (100 µg/mL en isooctano). -PCB 77 (3,3’4,4’-tetraclorobifenilo) de Absolute Standards (100 µg/mL en isooctano). -PCB 81 (3,4,4’,5-tetraclorobifenilo) de Absolute Standards (100 µg/ mL en isooctano). -PCB 101 (2,2’,4,5,5’-pentaclorobifenilo) de Absolute Standards (100 µg/mL en isooctano). -PCB 105 (2,3,3’,4,4’-pentaclorobifenilo) de Absolute Standards (100 µg/mL en isooctano). -PCB 114 (2,3,4,4’,5-pentaclorobifenilo) de Absolute Standards (100 µg/mL en isooctano). -PCB 118 (2,3’4,4’,5-pentaclorobifenilo) de Absolute Standards (100 µg/mL en isooctano). -PCB 123 (2’,3,4,4’,5-pentaclorobifenilo) de Absolute Standards (100 µg/mL en isooctano). 131 -PCB 126 (3,3’,4,4’,5-pentaclorobifenilo) de Absolute Standards (100 µg/mL en isooctano). -PCB 138 (2,2’,3,4,4’,5’-hexaclorobifenilo) de Absolute Standards (100 µg/mL en isooctano). -PCB 153 (2,2’,4,4’,5,5’-hexaclorobifenilo) de Absolute Standards (100 µg/mL en isooctano). -PCB 156 (2,3,3’,4,4’,5-hexaclorobifenilo) de Absolute Standards (100 µg/mL en isooctano). -PCB 157 (2,3,3’,4,4’,5’-hexaclorobifenilo) de Absolute Standards (100 µg/mL en isooctano). -PCB 167 (2,3’,4,4’,5,5’-hexaclorobifenilo) de Absolute Standards (100 µg/mL en isooctano). -PCB 169 (3,3’,4,4’,5,5’-hexaclorobifenilo) de Absolute Standards (100 µg/mL en isooctano). -PCB 180 (2,3,4,5,2’,4’,5’-heptaclorobifenilo) de Absolute Standards (100 µg/mL en isooctano). -PCB 189 (2,3,3’,4,4’,5,5’-heptaclorobifenilo) de Absolute Standards (100 µg/mL en isooctano). -Naftaleno (biciclo[4.4.0]deca-1,3,5,7,9-penteno)de Absolute Standards (100 µg/mL en ciclohexano). -Acenafteno (1,2-Dihidroacenaftileno) de Absolute Standards (100 µg/mL en ciclohexano). -Acenaftileno de Absolute Standards (100 µg/mL en ciclohexano). -Antraceno de Absolute Standards (100 µg/mL en ciclohexano). -Fenantreno de Absolute Standards (100 µg/mL en ciclohexano). -Fluoreno (9H-Fluoreno) de Absolute Standards (100 µg/mL en ciclohexano). -Fluoranteno de Absolute Standards (100 µg/mL en ciclohexano). -Criseno de Absolute Standards (100 µg/mL en ciclohexano). -Pireno de Absolute Standards (100 µg/mL en ciclohexano). -Benzo [a] antraceno de Absolute Standards (100 µg/mL en ciclohexano). -Benzo [b] fluoranteno de Absolute Standards (100 µg/mL en ciclohexano). -Benzo [k] fluoranteno de Absolute Standards (100 µg/mL en ciclohexano). -Benzo [a] pireno de Absolute Standards (100 µg/mL en ciclohexano). -Dibenzo [a,h] antraceno de Absolute Standards (100 µg/mL en ciclohexano). -Indeno [1,2,3-c,d] pireno de Absolute Standards (100 µg/mL en ciclohexano). -Benzo [g,h,i] perileno de Absolute Standards (100 µg/mL en ciclohexano). 132 Patrones de los elementos inorgánicos investigados: Solución estándar multi-elemento a 1000 mg/l, Std. 3 Perkin Elmer pure plus conteniendo todos los elementos incluidos en el estudio. Material certificado de referencia para la investigación de metales pesados (NIST SRM 1846) del National Institute of Standards, Gaithersburg, EE.UU. Los solventes orgánicos y reactivos utilizados a lo largo de este estudio han sido sometidos a PRUEBAS DE PUREZA con el objetivo de comprobar si estaban exentos de impurezas que pudieran interferir en el posterior análisis por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS), tal y como se detalla a continuación: Solventes orgánicos: se ha seguido el criterio de la norma UNE-EN 1528-1 para la determinación de contaminantes orgánicos (AENOR, 1997) para evaluar la pureza de los solventes orgánicos utilizados en el presente estudio. Para ello se han concentrado 110 veces que supera en 20 veces es el valor máximo alcanzado en cualquiera de los métodos analíticos empleados. Posteriormente los concentrados se analizaron mediante GC-MS y se comprobó la ausencia de los espectros de masas de los analitos incluidos en el estudio a los tiempos de retención correspondientes a los mismos. Agua destilada MilliQ: el agua destilada utilizada en el presente estudio fue lavada con n-hexano (150 ml de n-hexano/l de agua) para eliminar impurezas que pudieran interferir en los resultados. Su pureza se ha comprobado analizando por GC-MS el extracto orgánico concentrado 40 veces, procedente de agitar 15 ml de agua y 20 ml de n-hexano en embudo de decantación durante 2 minutos. 3.2.2. Material • Filtros de disco de 0.22 μm Chromafil (Macherey-Nagel, Alemania) • Vasos de precipitado de vidrio de diferentes volúmenes (50, 100 y 200 ml). • Matraces aforados de vidrio de diferentes volúmenes (10, 50, 100, 250, 500 y 1,000 ml). • Probetas graduadas de vidrio, sin tapón y con tapón de cierre esmerilado, de diferentes volúmenes (10, 50, 100, 200, 500 ml). • Embudos de vidrio de 75 mm de diámetro. • Tubos de ensayo de vidrio de 15 ml de capacidad. • Viales de vidrio de 20 ml de capacidad provistos de septum recubierto de teflón y cápsula de cierre hermético de aluminio. • Viales de vidrio de 1.8 ml de capacidad, provistos de tapón roscado con septum recubierto de teflón Supelco, para utilizar con inyector automático de cromatógrafos de gases. 133 • Viales de vidrio con inserto de 200 µl de capacidad, para utilizar con inyector automático de cromatógrafos de gases de Supelco. • Pipetas Pasteur de vidrio. • Imanes para agitador magnético recubiertos de teflón de diferentes tamaños de Sigma-Aldrich. • Microjeringas de vidrio de 10 µl y 50 µl, SGE Analytical Science Sin duda es obvia la importancia de la LIMPIEZA DEL MATERIAL para evitar cualquier interferencia en la determinación cromatográfica de los analitos. Por este motivo, todo el material de preparación de muestras fue lavado con agua y detergente, enjuagado con agua destilada y secado en estufa a 102 ± 2°C, y finalmente se lavó 3 veces con n-hexano. La ausencia de picos interferentes con los analitos se comprobó inyectando el n-hexano puesto en contacto con el material previamente lavado como se describe arriba. 3.2.3. Aparatos auxiliares • Balanza de precisión, de 1 mg a 210 g, con una desviación máxima de 0.1 mg. A & D Instruments Ltd. • Vitrina de aspiración y filtración de gases Cruma 1010 G/GS. • Centrífuga portátil de sobremesa modelo 5702R (Eppendorf, EE.UU.) • Sistema de vacío (vacuum manifold, Waters Corporation, USA). • Unidad de mineralización de muestras bajo presión (hasta 30 bar) asistida por microondas Milestone modelo MLS 1200 mega de 10 posiciones (vasos de teflón), equipada con módulo de gases Milestone EM-45/A y controlador digiltal Milestone mega 240. • Estación de concentración por corriente de nitrógeno Techne Simple Concentrator equipada con calefactor de tubos Techne Dry-block DB-3. • Sistema de generación de nitrógeno Clan Tecnológica Zefiro 35 LCMS con capacidad para generar 35 l de nitrógeno por minuto. • Estufa de convección natural Selecta DigitHeat 80L. • Ultrasonidos Ultrasons Selecta de 2.8 l de capacidad y ondas sonoras de alta frecuencia (40 KHz). • Baño de agua con control digital de 5 l de capacidad. Selecta. • Agitador magnetic Ovan Multimix D9P. • Agitador orbital Cole-Parmer Torque de 20 posiciones. • Agitador de balanceo Selecta Movil-Tub de 15 posiciones. • Agitadores vortex Selecta. • Micropipetas Eppendorf (2-20 µl, 20-100 µl, 20-200 µl, 100-1,000 µl y 200-5,000 µl). 134 3.2.4. Instrumentación analítica y accesorios SISTEMA DE CROMATOGRAFÍA DE GASES-ESPECTROMETRÍA DE MASAS DE TRIPLE CUADRUPOLO (GC-QqQ-MS) formado por los siguientes equipos y accesorios: • Cromatógrafo de gases Thermo Finnigan, modelo TRACE GC ULTRA, equipado con inyector split/splitless. • Espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Thermo Finnigan, modelo Quantum XLS. • Inyector automático Thermo Finnigan, modelo TriPlus SL/SSL con bandeja de 105 posiciones. • Microjeringa para inyector automático de 10 µl. • Columna cromatográfica capilar de sílice fundida con fase estacionaria de 5% fenil metil silicona, de 30 m de longitud, 0.25 mm de diámero interno y 0.25 µm de espesor de película (BPX5, SGE Analytical Science). • Estación de trabajo DELL, dotada de software Xcalibur (Ver. 2.0.1) para el control, la adquisición y análisis de los datos. Este software cuenta con una librería de transiciones generadas por impacto electrónico a 70 eV en modo de monitorización de reacciones seleccionadas (SRM) especialmente creada en nuestro laboratorio para los analitos objeto de esta Tesis. • Gas portador Helio BIP del 99.9995% de pureza mínima, suministrado por Carburos Metálicos, con la certificación ISO 9002 concedida por AENOR (Asociación Española de Normalización). • Gas de colisión Argón X50S del 99.9995% de pureza mínima, suministrado por Carburos Metálicos, con la certificación ISO 9002 concedida por AENOR. • Filtro de purificación de gases de cromatografía con alta capacidad para el atrapamiento de humedad, oxígeno e hidrocarburos, con indicador de capacidad, SGE analytical Science. • Liners, septums, férrulas, tuercas, uniones y resto de material de cromatografía de gases de SGE Analytical Science. SISTEMA DE ESPECTROSCOPÍA DE EMISIÓN ÓPTICA DE PLASMA ACOPLADO INDUCTIVAMENTE (ICP-OES) formado por los siguientes equipos y accesorios: • Espectrómetro de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente Perkin Elmer modelo Optima 2100 DV con configuraciones axial (AXICP-OES) y radial (RD-ICP-OX) equipado con una red de difracción de 79 líneas/nm, un detector de estado sólido y una antorcha de plasma con una inyección de 2 mm de diámetro interno. • Fuente de radiofrecuencia de 40 MHz que proporciona una energía de 0.75-1.5 kW. 135 • Sistema de vaporización de la muestra mediante ultrasonidos CETAC Ultrasonic Nebulizer y cámara de vaporización U5000AT+. • Inyector automático Perkin Elmer modelo 90. • Gas de vaporización Argón X50S del 99.9995% de pureza mínima, suministrado por Carburos Metálicos, con la certificación ISO 9002 concedida por AENOR. 3.3. Procedimientos 3.3.1. Preparación de patrones y materiales de referencia 3.3.1.1. Preparación de soluciones de fortificación de los COPs Para la elaboración de las soluciones patrón que iban a ser adicionadas a las muestras de plasma para la determinación de los porcentajes de recuperación, se eligió acetona en base a dos factores: su solubilidad y miscibilidad tanto en matrices con un alto contenido en agua como con los solventes apolares (n-hexano, tolueno y diclorometano) en los que están preparados las soluciones madre. Un factor negativo que podría haber hecho que se desechara su elección es la capacidad de la acetona, al igual que el acetonitrilo, para provocar un precipitado de proteínas cuando se añaden al plasma. Sin embargo, se comprobó previamente que el volumen de solvente adicionado no producía un cambio físico apreciable en la matriz investigada. Las soluciones madre de 1 ó 0.1 mg/ml de solución de los patrones estándar sólidos se han realizado en n-hexano, solvente recomendado por la USEPA para la elaboración de soluciones patrón, excepto en el caso del β-HCH donde, por razones de solubilidad, se ha elegido diclorometano para conseguir la completa disolución del patrón puro. A partir de ellas se prepararon las soluciones de trabajo para añadir al plasma, tal y como se comentó anteriormente. Se prepararon dos soluciones de trabajo de 1 y 10 µg/mL, en acetona para la fortificación del plasma, a partir de las soluciones madre de cada contaminante individual a 1 ó 0.1 mg/ml en n-hexano, ciclohexano, diclorometano o isooctano. Se preparó una solución de trabajo a 10 µg/mL en acetona para su utilización como estándar interno, conteniendo cis heptacloro epóxido, 3,4,5,6 tetracloro-m-xileno y PCB 202, a partir de las soluciones madre de cada estándar interno a 1 mg/ml en ciclohexano o isooctano. 3.3.1.2. Fortificación con COPs de muestras de plasma Según las recomendaciones de la Guía para el plan de vigilancia mundial de COPs (PNUMA 2007) la determinación de los porcentajes de recuperación de las técnicas de extracción empleadas debería ser determinada, preferentemente, mediante la adición de los analitos objeto de estudio a una muestra similar a la estudiada y exenta de concentraciones por encima del nivel de detección de los analitos investigados. 142 Tabla 5. Nombre del compuesto, límite de cuantificación (LOQ), rango de linearidad y coeficiente de regresión (r2) de todos los COPs y estándares internos incluidos en el estudio. Compuesto LOQ (ng/ml) Rango lineal (ng/ml) r2 Tetracloro xileno (IS) NA NA NA α-Hexaclorociclohexano 0.001 0.001 – 20 0.999 Hexaclorobenceno 0.001 0.001 – 20 1.000 β-Hexaclorociclohexano 0.001 0.001 – 20 0.999 γ-Hexaclorociclohexano 0.001 0.001 – 20 0.998 δ-Hexaclorociclohexano 0.001 0.001 – 20 0.999 PCB 28 0.01 0.01 – 20 0.994 Heptacloro 0.001 0.001 – 20 0.997 PCB 52 0.01 0.01 – 20 0.974 Aldrina 0.001 0.001 – 20 0.998 trans-clordano 0.01 0.01 – 20 0.998 PCB 101 0.001 0.001 – 20 0.991 cis-clordano 0.001 0.001 – 20 0.995 α-endosulfán 0.01 0.01 – 20 0.999 4,4’-DDE 0.001 0.001 – 20 0.994 PCB 81 0.001 0.001 – 20 0.995 PCB 77 0.001 0.001 – 20 1.000 4,4’-DDD 0.01 0.01 – 20 0.987 cis-Heptacloro epóxido (IS) NA NA NA Endrina 0.01 0.01 – 20 0.999 PCB 118 0.01 0.01 – 20 0.999 PCB 123 0.001 0.001 – 20 0.974 β-endosulfán 0.001 0.001 – 20 0.994 PCB 114 0.001 0.001 – 20 0.989 PCB 153 0.005 0.005 – 20 0.999 PCB 105 0.001 0.001 – 20 0.991 4,4’-DDT 0.01 0.01 – 20 0.999 PCB 138 0.01 0.01 – 20 0.997 PCB 126 0.001 0.001 – 20 0.983 PCB 167 0.001 0.001 – 20 1.000 PCB 202 (IS) NA NA NA Metoxicloro 0.01 0.01 – 20 0.995 PCB 156 0.001 0.001 – 20 0.956 PCB 157 0.001 0.001 – 20 0.992 PCB 180 0.005 0.005 – 20 1.000 PCB 169 0.001 0.001 – 20 0.965 PCB 189 0.001 0.001 – 20 1.000 143 Consideramos como límite de cuantificación (LOQ) un valor 3.3 veces superior al límite de detección (LOD) de cada analito. Como se muestra en la Tabla 4 el LOQ fue de 0.01 ng/ml para el 4,4’-DDT, 4,4’-DDE, 4,4’-DDD, metoxicloro y PCBs 28, 52, 101, 118 y 138; de 0.005 ng/ml para los PCBs 153 y 180 y todos los PAHs; y de 0.001 ng/ml para el resto de los analitos. La cuantificación se basó en el factor resultante de dividir el área del analito entre el área del estándar interno y se realizó frente a una recta de calibrado de 7 puntos en ciclohexano. Para la cuantificación se usó el programa LCQuan versión 2.0 de ThermoFisher Scientific Corporation (San José, EE.UU.) (Figura 4). En este trabajo expresamos los resultados de los contaminantes de forma individual, y también como sumatorios. Así, denominamos: • Sumatorio de DDTs (ΣDDTs) a la suma de las concentraciones de 4,4’- DDT, 4,4’-DDE y 4,4’-DDD. • Sumatorio de ciclodienos (Σciclodienos) a la suma de las concentraciones de aldrina, dieldrina, endrina, heptacloro. • Sumatorio de hexaclorociclohexano (ΣHCH) a la suma de las concentraciones de los isómeros α-, β-, γ-, y δdel hexaclorociclohexano. • Sumatorio de endosulfán (Σendosulfán) a la suma de las concentraciones de los isómeros αy βdel endosulfán. • Sumatorio de clordano (Σclordano) a la suma de las concentraciones de los isómeros cisy transdel clordano. • Sumatorio de POCs (ΣPOCs) a la suma de las concentraciones de los 17 POCs incluidos en este estudio. • Sumatorio de marcadores de PCBs (ΣM-PCBs) a la suma de las concentraciones de los congéneres de PCBs nº 28, 52, 101, 118, 138, 153, y 180 • Sumatorio de PCBs análogos a las dioxinas (ΣDL-PCBs) a la suma de las concentraciones de los congéneres de PCBs nº 77, 81, 105, 114, 118, 123, 126, 156, 157, 167, 169 y 189 • Sumatorio de PCBs (ΣPCBs) a la suma de las concentraciones de todos los congéneres de PCBs incluidos en este estudio. • Sumatorio de PAHs (ΣPAHs) a la suma de las concentraciones de todos los PAHs incluidos en este estudio. 144 Figura 4. Pantalla del programa LCQuan 2.0 usado para la cuantificación de los analitos incluidos en este estudio. 145 3.3.3.2. Análisis de CIPs Los análisis para la determinación de CIPs (arsénico, cadmio, cromo, cobre, manganeso, níquel, plomo, mercurio, selenio, zinc y aluminio) fueron realizados con un sistema de espectroscopía de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES) Perkin Elmer modelo Optima 2100 DV, tal y como ha sido previamente descrito (Nascimento et al., 2010). La evaluación de la estabilidad del plasma a corto y a largo plazo se realizó con una solución de sangre digerida (1:50, v/v), que contenía 2.0 mg/l de magnesio (Mg) en HNO3 al 2% (v/v). Para evaluar la estabilidad a corto plazo se realizaron 15 medidas consecutivas de la intensidad de la línea de Mg a 280.265 nm, con posterior análisis de la desviación típica relativa. Con el fin de establecer la estabilidad a largo plazo, la línea de emisión del Mg fue monitorizada durante 2 h, en el transcurso de las cuales se realizaron 8 medidas a intervalos de 15 min. Ambas pruebas se realizaron en la configuración axial del ICP-OES (AX-ICP-OES) con un caudal de gas de nebulización de 0,6 l/min y 1,3 kW de potencia aplicada, según lo sugerido por la literatura (Nascimento et al., 2010). El equipo se ajustó utilizando un caudal de gas de nebulización de entre 0.3 y 1.1 l/min y una potencia desde 1,1 hasta 1,5 kW. Según se iban cambiando estos parámetros se evaluó la robustez del plasma utilizando el ratio de la señal Mg II/ Mg I como diagnóstico. El plasma se consideró estable cuando la relación Mg II/ Mg I fue superior o igual a 8. El rango de linearidad estudiado fue de entre 2.0 y 70.0 µg/l. La curva de linearidad se obtuvo a partir de soluciones acuosas de estándares (n=3) o en sangre digerida (n=3). Se comparó la pendiente de la curva para cada elemento (coeficiente angular) obtenida en agua y en sangre digerida para evaluar la presencia de efecto matriz utilizando el test de t de Student. Las cuentas por segundo (CPS) para cada concentración fueron medidas 3 veces y se utilizó la media para representar las curvas de linearidad. En todos los análisis se utilizó una concentración de 1 mg/ml de litio (Li) y níquel (Ni) como estándares internos. Las condiciones de operación del ICP-OES se muestran en la Tabla 6. 146 Tabla 6. Condiciones de operación del ICP-OES Valor General Potencia de la radiofrecuencia (W) 1300 Velocidad de absorción de muestra (ml/min) 1.5 Flujo de gas (l/min) Plasma 15.0 Auxiliar 0.5 Nebulizador 0.8 Longitud de onda de detección (nm) Arsénico (As) 193.695 Cadmio (Cd) 214.440 Cromo (Cr) 267.716 Mercurio (Hg) 253.652 Plomo (Pb) 220.353 Cobre (Cu) 324.752 Manganeso (Mn) 257.610 Níquel (Ni) 341.476 Selenio (Se) 196.026 Zinc (Zn) 206.200 Aluminio (Al) 396.153 147 4. Análisis estadístico de los datos Para el análisis estadístico de los datos obtenidos durante esta Tesis se empleó el Programa PASW Statistics v 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Debido a que los niveles de los CTPs medidos en muestras de plasma (o sangre entera en el caso de los CIPs) no seguían una distribución normal, se expresan los datos en media y desviación estándar y en mediana, así como valores máximos y mínimos cuantificados (rango). Asimismo se muestra el porcentaje de muestra en que se detectó cada contaminante o grupo de contaminantes. Al ser los niveles de contaminantes variables continuas que no siguen una distribución normal, en los estudios de comparación entre grupos se han empleado tests no paramétricos (U de Mann-Whitney y Kruskal Wallis). Los análisis de comparación entre grupos de variables categóricas (por ejemplo, porcentaje de detección o no detección de un contaminante) se realizaron mediante X2. La correlación de contaminantes con variables continuas se analizó mediante el test de correlación de Spearman. Valores de p menores de 0.05 (dos colas) se consideraron como estadísticamente significativos. CAPÍTULO I Metabolic and respiratory status of stranded juvenile loggerhead sea turtles (Caretta caretta): 66 cases (2008–2009) 150 CAPÍTULO I Metabolic and respiratory status of stranded juvenile loggerhead sea turtles (Caretta caretta): 66 cases (2008–2009) .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..149 ABSTRACT .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..151 INTRODUCTION .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..151 MATERIAL AND METHODS .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..151 RESULTS .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..152 DISCUSSION .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..154 CONCLUSIONS .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..155 254 de Solla, S.R., Bishop, C.A., Van der Kraak, G., Brooks, R.J., 1998. Impact of organochlorine contamination on levels of sex hormones and external morphology of common snapping turtles (Chelydra serpentina serpentina) in Ontario, Canada. Environ Health Perspect 106, 253-260. de Solla, S.R., Fernie, K.J., 2004. Characterization of contaminants in snapping turtles (Chelydra serpentina) from Canadian Lake Erie Areas of Concern: St. Clair River, Detroit River, and Wheatley Harbour. Environ Pollut 132, 101-112. De Voogt, P., Brinkman, U.A.T., 1989. Production, properties and usage of polychlorinated biphenyls. In: Kimlbrough, R., Jensen, S. (Eds.), Halogenated Biphenyls, Terphenyls, Napthalenes, Dibenzodioxins and Related Products. Elservier, Amsterdam, pp. 3-45. Debier, C., Chalon, C., Le Boeuf, B.J., de Tillesse, T., Larondelle, Y., Thome, J.P., 2006. Mobilization of PCBs from blubber to blood in northern elephant seals (Mirounga angustirostris) during the post-weaning fast. Aquat Toxicol 80, 149-157. Debier, C., Pomeroy, P.P., Dupont, C., Joiris, C., Comblin, V., Le Boulenge, E., Larondelle, Y., Thome, J.P., 2003a. Dynamics of PCB transfer from mother to pup during lactation in UK grey seals Halichoerus grypus: differences in PCB profile between compartments of transfer and changes during the lactation period. Mar Ecol Prog Ser 247, 249–256. Debier, C., Pomeroy, P.P., Dupont, C., Joiris, C., Comblin, V., Le Boulenge, E., Larondelle, Y., Thome, J.P., 2003b. Quantitative dynamics of PCB transfer frommother to pup during lactation in UK grey seals Halichoerus grypus. Mar Ecol Prog Ser 247, 237–248. Deem, S.L., Norton, T.M., Mitchell, M., Segars, A., Alleman, A.R., Cray, C., Poppenga, R.H., Dodd, M., Karesh, W.B., 2009. Comparison of blood values in foraging, nesting, and stranded loggerhead turtles (Caretta caretta) along the coast of Georgia, USA. J Wildl Dis 45, 41-56. Delgado, C., Valente, A., Quaresma, I., Costa, M., Dellinger, T., 2011. Blood biochemistry reference values for wild juvenile loggerhead sea turtles (Caretta caretta) from Madeira archipelago. J Wildl Dis 47, 523-529. Denison, M.S., Nagy, S.R., 2003. Activation of the aryl hydrocarbon receptor by structurally diverse exogenous and endogenous chemicals. Annu Rev Pharmacol Toxicol 43, 309-334. Denison, M.S., Pandini, A., Nagy, S.R., Baldwin, E.P., Bonati, L., 2002. Ligand binding and activation of the Ah receptor. Chem Biol Interact 141, 3-24. Desvages, G., Girondot, M., Pieau, C., 1993. Sensitive Stages for the Effects of Temperature on Gonadal AromataseActivity in Embryos of the Marine Turtle Dermochelys coriacea. Gen Comp Endocrinol 92, 54-61. Di Giulio, R.T., Hinton, D.E., 2008. Introducción. In: Di Giulio, R.T., Hinton, D.E. (Eds.), The toxicology of fishes. CRC Press Taylor and Francis Group. Boca Raton, USA, pp. 3-9. Diamanti-Kandarakis, E., Bourguignon, J.P., Giudice, L.C., Hauser, R., Prins, G.S., Soto, A.M., Zoeller, R.T., Gore, A.C., 2009. Endocrine-disrupting chemicals: an Endocrine Society scientific statement. Endocr Rev 30, 293-342. Dickinson, V.M., Jarchow, J.L., Trueblood, M.H., 2002. Hematology and plasma biochemistry reference range values for free-ranging desert tortoises in Arizona. J Wildl Dis 38, 143-153. Dickson, L.C., Buzik, S.C., 1993. Health risks of “dioxins”: a review of environmental and toxicological considerations. Vet Hum Toxicol 35, 68-77. Dietz, R., Heide-Jorgenson, M.-P., Härkönen, T., 1989. Mass death of harbour seals Phloca vitulina in Europe. Ambio 18, 258-264. Divers, S.J., 2000. Reptilian liver and gastrointestinal testing. In: Fudge, A.M. (Ed.), Laboratory Medicine (Avian and Exotic Pets). W.B. Saunders Company, Philadelphia, USA. Dood, J.C.K., 1988. Synopsis of the biological data on the loggerhead sea turtle Caretta caretta (Linnaeus 1758). United States Fish and Wildlife Service. U. S. Department of the Interior. FAO Synopsis NMFS-149. Biological Report 88 (14) Washington, D.C. Dunier, M., Siwicki, A.K., 1993. Effects of pesticides and other organic pollutants in the aquatic environment on immunity of fish: a review. Fish Shellfish Immunol 3, 23-438. Eder, E., Ceballos, A., Martins, S., Pérez-García, H., Marín, I., Marco, A., Cardona, L., 2012. Foraging dichotomy in loggerhead sea turtles Caretta caretta off northwestern Africa. Mar Ecol Prog Ser 470, 113-122. 255 Ehrhart, L.M., Bagley, D.A., Redfoot, W.E., 2003. Loggerhead turtles in the Atlantic Ocean: Geographic distribution, abundance, and population status. In: Bolten, A.B., Witherington, B.E. (Eds.), Loggerhead sea turtles. Smithsonian Institution Press, Washington, USA, pp. 157-174. Eisenreich, K.M., Kelly, S.M., Rowe, C.L., 2009. Latent mortality of juvenile snapping turtles from the Upper Hudson River, New York, exposed maternally and via the diet to polychlorinated biphenyls (PCBs). Environ Sci Technol 43, 6052-6057. Eisler, R., 2000. Polycyclic Aromatic Hydrocarbons. Handbook of Chemical Risk Assessment: Health Hazards to Humans, Plants, and Animals. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA. Encalada, S.E., Bjorndal, K.A., Bolten, A.B., Zurita, J.C., Schroeder, B., Possardt, Sears, C.J., Bowen, B.W., 1998. Population structure of loggerhead turtle (Caretta caretta) nesting colonies in the Atlantic and Mediterranean as inferred from mitochondrial DNA control region sequences. Mar Biol 130, 567-575. Epperly, S., 2003. Fisheries-related mortality and turtle excluder devices (TEDs). In: Lutz, P.L., Musick, J.A., Wyneken, J. (Eds.), The Biology of Sea Turtles II. CRC Marine Science Series, Florida, USA, pp. 339-353. Ertl, R.P., Winston, G.W., 1998. The microsomal mixed function oxidase system of amphibians and reptiles: components, activities and induction. Comp Biochem Physiol 121, 85-105. Feeley, M.M., 1995. Biomarkers for Great Lakes priority contaminants: halogenated aromatic hydrocarbons. Environ Health Perspect 103 Suppl 9, 7-16. Felsot, A.S., Racke, K.D., Hamilton, D.J., 2003. Disposal and degradation of pesticide waste. Rev Environ Contam Toxicol 177, 123-200. Fernández, P., Vilanova, R.M., Martínez, C., Appleby., Grimalt, J.O., 2000. The historical record of atmospheric pyrolitic pollution over Europe registered in the sedimentary PAH from remote mountain lakes. Environ Sci Technol 34, 1906-1913. Fernie, K.J., Smits, J.E., Bortolotti, G.R., Bird, D.M., 2001. In ovo exposure to polychlorinated biphenyls: reproductive effects on second-generation American kestrels. Arch Environ Contam Toxicol 40, 544-550. Ferri, V., 1999. Introducción. In: Grijalbo (Ed.), Tortugas y galápagos. Editorial Grijalbo, España, pp. 8-28. Finkelstein, M.E., Grasman, K.A., Croll, D.A., Tershy, B.R., Keitt, B.S., Jarman, W.M., Smith, D.R., 2007. Contaminantassociated alteration of immune function in black-footed albatross (Phoebastria nigripes), a North Pacific predator. Environ Toxicol Chem 26, 1896-1903. Fitzgerald, D.J., Robinson, N.I., Pester, B.A., 2004. Application of benzo [a] pyrene and coal tar tumor doseresponse data to a modified benchmark dose method of guideline development. Environ Health Perspect 112, 1341-1346. Flint, M., Morton, J.M., Limpus, C.J., Patterson-Kane, J.C., Mills, P.C., 2010. Reference intervals for plasma biochemical and hematologic measures in loggerhead sea turtles (Caretta caretta) from Moreton Bay, Australia. J Wildl Dis 46, 731-741. Focardi, S., Leonzio, C., Fossi, C., 1988. Variations in polychlorinated biphenyl congener composition in eggs of Mediterranean water birds in relation to their position in the food chain. Environ Pollut 52, 243-255. Fontenot, D.K., Lamberski, N., Pfaff, S., 2004. Physical, Hematologic, and Plasma Biochemistry Values of Five Crocodile Monitors, Varanus salvadorii. J Herpet Med Surgery 14, 5-9. Fossi, C., Leonzio, C., Focardi, S., Renzoni, A., 1988. The black-headed gull´s adaptation to polluted environments: the role of the mixed-function oxidase detoxification system. Environ Conserv Biol 15, 221-224. Fox, G.A., 2001a. Effects of endocrine disrupting chemicals on wildlife in Canada: past, present, and future. Water Qual Res J Can 36, 233-251. Fox, G.A., 2001b. Wildlife as sentinels of human health effects in the Great Lakes-St. Lawrence basin. Environ Health Perspect 109 Suppl 6, 853-861. Franzellitti, S., Locatelli, C., Gerosa, G., Vallini, C., Fabbri, E., 2004. Heavy metals in tissues of loggerhead turtles (Caretta caretta) from the northwestern Adriatic Sea. Comp Biochem Physiol 138, 187-194. Fraser, A.J., Burkow, I.C., Wolkers, H., Mackay, D., 2002. Modeling biomagnification and metabolism of contaminants in harp seals of the Barents Sea. Environ Toxicol Chem 21, 55-61. 256 Frías-Espericueta, M.G., Osuna-López, J.I., Ruíz-Telles, A., Quintero-Álvarez, J.M., López-López, G., Izaguirre-Fierro, G., Voltolina, D., 2006. Heavy metals in the tissues of the sea turtle Lepidochelys olivacea from a nesting site of the northwest coast of Mexico. Bull Environ Contam Toxicol 77, 179-185. Fukushima, M., Kawai, S., 1981. Variation of organochlorine residue concentration and burden in striped dolphin, Stenella coeruleoalba, with growth. In: Fujiyama, T. (Ed.), Studies on the levels of organochlorine compounds and heavy metals in the marine organisms, University of the Ryukyus, Okinawa, pp. 97-114. Gallien, I., Caurant, F., Bordes, M., Bustamante, P., Miramand, P., Fernandez, B., Quellard, N., Babin, P., 2001. Cadmium-containing granules in kidney tissue of the Atlantic white-sided dolphin (Lagenorhyncus acutus) off the Faroe Islands. Comp Biochem Physiol 130, 389-395. Gamache, N., Horrocks, J., 1992. Fibropapilloma disease in green turtles, Chelonia mydas around Barbados, West Indies. In: Salmon, M., Wyneken, J. (Eds.), Proc. 11th Ann. Workshop on Sea Turtle Biology & Conservation 26 February-2 March 1991, Jekyll Island, Georgia. National Oceanic & Atmospheric Administration/National Marine Fisheries Service, January 1992. NOAA Tech. Memo. NMFS-SEFSC-302. García-Fernández, A.J., Gómez-Ramírez, P., Martinez-López, E., Hernández-García, A., Maria-Mojica, P., Romero, D., Jiménez, P., Castillo, J.J., Bellido, J.J., 2009. Heavy metals in tissues from loggerhead turtles (Caretta caretta) from the southwestern Mediterranean (Spain). Ecotoxicology Environ Saf 72, 557-563. Gardner, S.C., 2006b. Introduction to reptilian toxicology. In: Gardner, S.C., Oberdörster, E. (Eds.), Toxicology of reptiles. Taylor and Francis Group, Boca Raton, Florida, USA. Gardner, S.C., Fitzgerald, S.L., Vargas, B.A., Rodríguez, L.M., 2006. Heavy metal accumulation in four species of sea turtles from the Baja California peninsula, Mexico. Biometals 19, 91-99. Gardner, S.C., Pier, M.D., Wesselman, R., Juarez, J.A., 2003. Organochlorine contaminants in sea turtles from the Eastern Pacific. Mar Pollut Bull 46, 1082-1089. Gelli, D., Ferrari, V., Zanella, A., Arena, P., Pozzi, L., Nannarelli, S., Vaccaro, C., Bernardini, D., Romagnoli, S., 2009. Establishing physiological blood parameters in the loggerhead sea turtle (Caretta caretta). Eur J Wildl Res 55, 59-63. Gendron, A.D., Bishop, C.A., Van Der Kraak, G., Fortin, R., Hontela, A., 1994. Proceedings of Society of Environmental Toxicology and Chemistry 15th Annual Meeting. Denver, Colorado, USA, p. 162. George, R.H., 1997. Health problems and diseases of sea turtles. In: Lutz, P., Musick, J.A. (Eds.), The Biology of Sea Turtles. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, pp. 363-385. Geraci, J.R., 1990. Physiologic and toxic effects on cetaceans. In: Geraci, J.R., Aubin, D.J. (Eds.), Sea Mammals and Oil: Confronting the Risks. Academic Press, San Diego, California, USA, pp. 167-192. Gertsenberger, S.L., Heimler, I., Smies, R., Hutz, R.J., Dasmahapatra, A.K., Tripoli, V., Dellinger, J.A., 2000. Minimal endocrine alterations in rodents after consumption of lake trout (Salvelinus namaycush). Arch Environ Contamin Toxicol 38, 371-376. Geyer, H.J., Scheunert, I., Bruggemann, R., Matthies, M., Steinberg, C.E., Zitko, V., Kettrup, A., Garrison, W., 1994. The relevance of aquatic organisms’ lipid content to the toxicity of lipophilic chemicals: toxicity of lindane to different fish species. Ecotoxicology Environ Saf 28, 53-70. Gibson, J., Smith, G., 1999. Reducing threats to foraging habitats. In: Eckert, K.L., Bjorndal, K.A., Abreu-Grobois, F.A., Donnelly, M. (Eds.), Research and Management Techniques for the Conservation of Sea Turtles. IUCN/SSC Marine Turtle Specialist Group Publication, pp. 184-188. Gilbertson, M., Kubiak, T., Ludwig, J., Fox, G., 1991. Great Lakes embryo mortality, edema, and deformities syndrome (GLEMEDS) in colonial fish-eating birds: similarity to chick-edema disease. J Toxicol Environ Health 33, 455-520. Godley, B.J., Broderick, A.C., Mrosovsky, N., 2001. Estimating hatchling sex ratios of loggerhead turtles in Cyprus from incubation durations. Mar Ecol Prog Ser 210, 195-201. Godley, B.J., Gaywood, M.J., Law, R.J., McCarthy, C.J., McKenzie, C., Patterson, I.A.P., Penrose, R.S., Reid, R.J., Ross, H.M., 1998a. Patterns of marine turtle mortality in British waters (1992-1996) with reference to tissue contaminants levels. J Mar Biol Ass UK 78, 973-984. Godley, B.J., Thompson, D.R., Furness, R.W., 1999. Do heavy metal concentrations pose a threat to marine turtles from the Mediterranean Sea? Mar Poll Bull 38, 497-502. 257 Godley, B.J., Thompson, D.R., Waldron, S., Furness, R.W., 1998b. The trophic status of marine turtles as determined by stable isotope analysis. Mar Ecol Prog Ser 166, 277–284. Gordon, A.N., Pople, A.R., Ng, J., 1998. Trace metal concentrations in livers and kidneys of sea turtles from southeastern Queensland, Australia. Mar Freshwater Res 1998, 409–414. Gottdenker, N.L., Jacobson, E.R., 1995. Effect of venipuncture sites on hematologic and clinical biochemical values in desert tortoises (Gopherus agassizii). Am J Vet Res 56, 19-21. Goyer, R.A., 1984. Metal-protein complexes in detoxification process. In: Brown, S.S. (Ed.), Clinical Chemistry and Clinical Toxicology, 2. Academic Press, London, pp. 199-209. Goyer, R.A., 1996. Toxic effects of metals. In: Klaassen, C.D. (Ed.), Casarett and Doull´s Toxicology. The Basic Science of Poisons. 5th Edition. McGraw-Hill, New York, pp. 691-736. Grant, A., Middleton, R., 1990. An assessment of metal contamination in the Humbert Estuary, U. K. Estuarine Coastal Shelf Sci 31, 71-85. Grasman, K.A., Fox, G.A., 2001. Associations between altered immune function and organochlorine contamination in young Caspian terns (Sterna caspia) from Lake Huron, 1997-1999. Ecotoxicology 10, 101-114. Grasman, K.A., Fox, G.A., Scanlon, P.F., Ludwig, J.P., 1996. Organochlorine-associated immunosuppression in prefledgling Caspian terns and herring gulls from the Great Lakes: an ecoepidemiological study. Environ Health Perspect 104 Suppl 4, 829-842. Grasman, K.A., Scanlon, P.F., Fox, G.A., 1998. Reproductive and physiological effects of environmental contaminants in fish-eating birds of the Great Lakes: a review of historical trends. Environ Monitor Assess 53, 117-145. Gray, J.S., 2002. Biomagnification in marine systems: the perspective of an ecologist. Mar Pollut Bull 45, 46-52. Greig, D.J., Ylitalo, G.M., Hall, A.J., Fauquier, D.A., Gulland, F., 2007. Transplacental transfer of organochlorines in California sea lions (Zalophus californianus). Environ Toxicol Chem 26, 37-44. Guillette, L.J., 2000. Contaminant-induced endocrine disruption in wildlife. Growth hormone and IGF Res Supplement B, 45-50. Guillette, L.J., Jr., Gross, T.S., Masson, G.R., Matter, J.M., Percival, H.F., Woodward, A.R., 1994. Developmental abnormalities of the gonad and abnormal sex hormone concentrations in juvenile alligators from contaminated and control lakes in Florida. Environ Health Perspect 102, 680-688. Guillette, L.J., Jr., Pickford, D.B., Crain, D.A., Rooney, A.A., Percival, H.F., 1996. Reduction in penis size and plasma testosterone concentrations in juvenile alligators living in a contaminated environment. Gen Comp Endocrinol 101, 32-42. Guimaraes, R.M., Asmus, C.I., Meyer, A., 2007. DDT reintroduction for malaria control: the cost-benefit debate for public health. Cad Saude Publica 23, 2835-2844. Guirlet, E., Das, K., Girondot, M., 2008. Maternal transfer of trace elements in leatherback turtles (Dermochelys coriacea) of French Guiana. Aquat Toxicol 88, 267-276. Guirlet, E., Das, K., Thome, J.P., Girondot, M., 2010. Maternal transfer of chlorinated contaminants in the leatherback turtles, Dermochelys coriacea, nesting in French Guiana. Chemosphere 79, 720-726. Hahn, M.E., 2002. Aryl hydrocarbon receptors: diversity and evolution. Chem Biol Interact 141, 131-160. Hall, R.J., Belisle, A.A., Sileo, L., 1983. Residues of petroleum hydrocarbons in tissues of sea turtles exposed to the Ixtoc I oil spill. J Wildl Dis 19, 106-109. Hamann, M., Godfrey, M.H., Seminoff, J.A., Arthur, K., Barata, P.C.R., Bjorndal, K.A., Bolten, A.B., Broderick, A.C., Campbell, L.M., Carreras, C., et al., 2010. Global research priorities for sea turtles: informing management and conservation in the 21st century. Endang Species Res 11, 245-269. Hamann, M., Limpus, C.J., Owens, D.W., 2003. Reproductive cycles of males and females. In: Lutz, P.L., Musick, J.A., Wyneken, J. (Eds.), The Biology of Sea Turtles II. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, pp. 135-162. Hamann, M., Limpus, C.J., Whittier, J.M., 2002. Patterns of lipid storage and mobilisation in the female green sea turtle (Chelonia mydas). Comp Biochem Physiol 172, 485-493. 258 Hanley, C.S., Hernandez-Divers, S.J., Bush, S., Latimer, K.S., 2004. Comparison of the effect of dipotassium ethylenediaminetetraacetic acid and lithium heparin on hematologic values in the green iguana (Iguana iguana). J Zoo Wildl Med 35, 328-332. Hanson, J., Wibbels, T., Martin, R.E., 1998. Predicted female bias in hatchling sex ratios of loggerhead sea turtles from a Florida nesting beach. Can J Zool – Rev Can Zool 76, 1850-1861. Harr, K.E., Alleman, A.R., Dennis, P.M., Maxwell, L.K., Lock, B.A., Bennett, R.A., Jacobson, E.R., 2001. Morphologic and cytochemical characteristics of blood cells and hematologic and plasma biochemical reference ranges in green iguanas. J Am Vet Med Assoc 218, 915-921. Hatase, H., Takai, N., Matsuzawa, Y., Sakamoto, W., Omuta, K., Goto, K., Arai, N., Fujiwara, T., 2002. Size-related differences in feeding hábitat use of adult female loggerhead turtles Caretta caretta around Japan determined by stable isotope analyses and satellite telemetry. Mar Ecol Prog Ser 233, 273-281. Hawkes, L.A., Broderick, A.C., Coyne, M.S., Godfrey, M.H., López-Jurado, L.F., López-Suárez, P., Merino, S.E., VaroCruz, N., Godley, B.J., 2006. Phenotypically linked dichotomy in sea turtle foraging requires multiple conservation approaches. Curr Biol 16, 990-995. Hawkey, C.M., Dennet, T.B., 1989. Atlas de hematología veterinaria comparada. Grass Ediciones, SA, Barcelona. Hayes, T., Haston, K., Tsui, M., Hoang, A., Haeffele, C., Vonk, A., 2002a. Herbicides: feminization of male frogs in the wild. Nature 419, 895-896. Hayes, T.B., Collins, A., Lee, M., Mendoza, M., Noriega, N., Stuart, A.A., Vonk, A., 2002b. Hermaphroditic, demasculinized frogs after exposure to the herbicide atrazine at low ecologically relevant doses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 5476-5480. Haylamicheal, I.D., Dalvie, M.A., 2009. Disposal of obsolete pesticides, the case of Ethiopia. Environ Int 35, 667673. Haynes, D., Johnson, J.E., 2000. Organochlorine heavy metal and polyaromatic hydrocarbon pollutant concentrations in the Great Barrier Reef (Australia): a review. Mar Pollut Bull 41, 267–278. Hays, G.C., Fossette, S., Katselidis, K.A., Schofield, G., Gravenor, M.B., 2010. Breeding periodicity for male sea turtles, operational sex ratios, and implications in the face of climate change. Conserv Biol 24, 1636-1643. Headrick, M.L., Hollinger, K., Lovell, R.A., Matheson, J.C., 1999. PBBs, PCBs, and dioxins in food animals, their public health implications. Vet Clin North Am Food Anim Pract 15, 109-131, ix-x. Heard, D., Harr, K., Wellehan, J., 2004. Diagnostic sampling and laboratory tests. In: Girling, S.J., Raiti, P. (Eds.), Manual of Reptiles. 2nd ed. British Small Animal Veterinary Association, Quedgeley, England, pp. 71-86. Hebert, C.E., Glooschenko, G.E., Haffner, G.D., Lazar, R., 1993. Organic contaminants in snapping turtle (Chelydra serpentina) populations from southern Ontario, Canada. Arch Environ Contamin Toxicol 24, 35–43. Hebert, C.E., Weseloh, D.V., 2006. Adjusting for temporal change in trophic position results in reduced rates of contaminant decline. Environ Sci Technol 40, 5624-5628. Hecker, M., Murphy, M.B., Giesy, J.P., Hopkins, W.A., 2006. Induction of cytochrome P4501A in African brown house snake (Lamprophis fuliginosus) primary hepatocytes. Environ Toxicol Chem 25, 496-502. Henríquez-Hernández, L.A., Luzardo, P.L., Almeida-González, M., Álvarez-León, E.E., Serra-Majem, L., Zumbado, M., Boada, L.D., 2011. Background levels of polychlorinated biphenyls in the population of the Canary Islands (Spain). Environ Res 111, 10-16. Herbst, L.H., Jacobson, E., Moretti, R., Brown, T., Sundberg, J.P., Klein, P.A., 1995. Experimental transmission of green turtle fibropapillomatosis using cell-free tumor extracts. Dis Aquat Organ 22, 1-12. Herbst, L.H., Moretti, R., Brown, T., Klein, P.A., 1996. Sensitivity of the transmissible green turtle fibropapillomatosis agent to chloroform and ultracentrifugation conditions. Dis Aquat Organ 25, 225-228. Hickey, J.J., Anderson, D.W., 1968. Chlorinated hydrocarbons and eggshell changes in raptorial and fish-eating birds. Science 162, 271-273. Hidalgo-Vila, J., Díaz-Paniagua, C., Pérez-Santigosa, N., Laza, A., Camacho, I., Recio, F., 2007. Hematologic and biochemical reference intervals of free-living Mediterranean pond turtles (Mauremys leprosa). J Wildl Dis 43, 798801. 259 Hodson, P.V., 1988. The effect of metal metabolism on uptake, disposition and toxicity in fish. Aquat Toxicol 11, 3-18. Hoekstra, P.F., O’Hara, T.M., Backus, S.M., Hanns, C., Muir, D.C., 2005. Concentrations of persistent organochlorine contaminants in bowhead whale tissues and other biota from northern Alaska: implications for human exposure from a subsistence diet. Environ Res 98, 329-340. Holliday, D.K., Elskus, A.A., Roosenburg, W.M., 2009. Impacts of multiple stressors on growth and metabolic rate of Malaclemys terrapin. Environ Toxicol Chem 28, 338-345. Hotchkiss, A.K., Rider, C.V., Blystone, C.R., Wilson, V.S., Hartig, P.C., Ankley, G.T., Foster, P.M., Gray, C.L., Gray, L.E., 2008. Fifteen years after “Wingspread”-environmental endocrine disrupters and human and wildlife health: where we are today and where we need to go. Toxicol Sci 105, 235-259. Humphrey, H.E.B., 1988. Chemical contaminants in the Great Lakes: the human health aspect. In: Evans, M.S. (Ed.), Toxics contaminants and ecosystem health: a Great Lakes focus, Wiley, New York, pp. 153-156. Hutchinson, J., Simmonds, M., 1992. Escalation of threats to marine turtles. Oryx 26, 95-102. Hutchinson, L., Simmonds, M., 1991. A review of the effects of pollution on marine turtles. A Greenpeace Ecotoxicology Proyect London. Greenpeace International. Huwe, J.K., 2002. Dioxins in food: a modern agricultural perspective. J Agric Food Chem 50, 1739-1750. Ikonomopoulou, M.P., Olszowy, H., Hodge, M., Bradley, A.J., 2009. The effect of organochlorines and heavy metals on sex steroid-binding proteins in vitro in the plasma of nesting green turtles, Chelonia mydas. Comp Biochem Physiol 179, 653-662. Ikonomopoulou, M.P., Olszowy, H., Limpus, C., Francis, R., Whittier, J., 2011. Trace element concentrations in nesting flatback turtles (Natator depressus) from Curtis Island, Queensland, Australia. Mar Environ Res 71, 10-16. Innis, C., Tlusty, M., Perkins, C., Holladay, S., Merigo, C., Weber, E.S., 2008. Trace metal and organochlorine pesticide concentrations in cold-stunned juvenile kemp’s ridley turtles (Lepidochelys kempii) from Cape Cod, Massachusetts. Chelonian Conserv Biol 7, 230-239. Innis, C.J., Tlusty, M., Merigo, C., Weber, E.S., 2007. Metabolic and respiratory status of cold-stunned Kemp’s ridley sea turtles (Lepidochelys kempii). Comp Biochem Physiol 177, 623-630. Inoue, N., Makita, Y., 1996. Neurological aspects in human exposure to manganese. In: Chang, L.W. (Ed.), Toxicology of Metals. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, pp. 415– 422. IUCN, 2007. International Union for Conservation of Nature and Natural Resources (IUCN). IUCN Red List of Threatened Species. IUCN SSC. UK Office, Cambridge, UK. Jacobson, E., 1992. Laboratory investigations. In: Beynon, P.H. (Ed.), Manual of reptiles. British Small Animal Veterinary Association, Cheltenham, pp. 50-53. Jacobson, E.R., 2007. Infectious diseases and pathology of reptiles. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA. Jaeger, R.J., Conolly, R.B., Reynolds, E.S., Murphy, S.D., 1975. Biochemical toxicology of unsaturated halogenated monomers. Environ Health Perspect 11, 121-128. Jaga, K., Brosius, D., 1999. Pesticide exposure: human cancers on the horizon. Rev Environ Health 14, 39-50. Jakszyn, P., Goni, F., Etxeandia, A., Vives, A., Millan, E., López, R., Amiano, P., Ardanaz, E., Barricarte, A., Chirlaque, M.D., et al., 2009. Serum levels of organochlorine pesticides in healthy adults from five regions of Spain. Chemosphere 76, 1518-1524. James, M.C., Ottensmeyer, C.A., Myers, R.A., 2005. Identification of high-use habitat and threats to leatherback sea turtles in northern waters: new directions for conservation. Ecol Lett 8, 195–201. Janik, F., Wolf, H.U., 1992. The Ca(2+)-transport-ATPase of human erythrocytes as an in vitro toxicity test system-- acute effects of some chlorinated compounds. J Appl Toxicol 12, 351-358. Jerez, S., Motas, M., Cánovas, R.A., Talavera, J., Almela, R.M., Del Río, A.B., 2010. Accumulation and tissue distribution of heavy metals and essential elements in loggerhead turtles (Caretta caretta) from Spanish Mediterranean coastline of Murcia. Chemosphere 78, 256-264. 260 Johnson, L.L., Arkoosh, M.R., Bravo, C.F., Collier, T.K., Krahn, M.M., Meador, J.P., Myers, M.S., Reichert, W.L., Stein, J.E., 2008. The Effects of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Fish from Puget Sound, Washington. In: di Giulio, R.T., Hinton, D.E. (Eds.), The Toxicology of Fishes. CPR Press, Boca Ratón, New York, USA. Joyner, P.H., Shreve, A.A., Spahr, J., Fountain, A.L., Sleeman, J.M., 2006. Phaeohyphomycosis in a free-living eastern box turtle (Terrapene carolina carolina). J Wildl Dis 42, 883-888. Julshamn, K., Andersen, A., Ringdal, O., Morkore, J., 1987. Trace elements intake in the Faroe Islands. I. Element levels in edible parts of pilot whales (Globicephalus meleanus). Sci Total Environ 65, 53-62. Kakizoe, Y., Sakaoka, K., Kakizoe, F., Yoshii, M., Nakamura, H., Kanou, Y., Uchida, I., 2007. Successive changes of hematologic characteristics and plasma chemistry values of juvenile loggerhead turtles (Caretta caretta). J Zoo Wildl Med 38, 77-84. Kamezaki, N., Matsuzawa, Y., Abe, O., Asakawa, H., Fuji, T., Goto, K., Hagino, S., Hayami, H., Ishii, M., Iwamoto, T., et al., 2003. Loggerhead turtle nesting in Japan. In: Bolten, A.B., Witherington, B.E. (Eds.), Loggerhead sea turtles. Smithsonian Institution Press, Washington, USA, pp. 210-217. Kampalath, R., Gardner, S.C., Méndez-Rodríguez, L., Jay, J.A., 2006. Total and methylmercury in three species of sea turtles of Baja California Sur. Mar Poll Bull 52, 1784-1832. Kannan, K., Perrotta, E., 2008. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in livers of California sea otters. Chemosphere 71, 649-655. Kannan, K., Tanabe, S., Borrell, A., Aguilar, A., Focardi, S., Tatsukawa, R., 1993. Isomer-specific analysis and toxic evaluation of polychlorinated biphenyls in striped dolphins affected by an epizootic in the western Mediterranean sea. Arch Environ Contamin Toxicol 25, 227-233. Kashiwagi, K., Utsumi, K., Kashiwagi, K., Ohta, S., Sugihara, K., Hanada, H., Kitamura, S., 2008. Effects of endocrine disrupting chemicals on amphibian metamorphosis and mitochondrial membrane permeability transition. J Health Sci 54, 273-280. Kaska, Y., Downie, J.R., Tippet, R., Furness, R.W., 1998. Natural temperature regimes for loggerhead and green turtle nests in the eastern Mediterranean. Can J Zool 76, 723-729. Keller, J.M., Kucklick, J.R., Harms, C.A., McClellan-Green, P.D., 2004a. Organochlorine contaminants in sea turtles: correlations between whole blood and fat. Environ Toxicol Chem 23, 726-738. Keller, J.M., Kucklick, J.R., McClellan-Green, P.D., 2004b. Organochlorine contaminants in loggerhead sea turtle blood: extraction techniques and distribution among plasma and red blood cells. Arch Environ Contamin Toxicol 46, 254-264. Keller, J.M., Kucklick, J.R., Stamper, M.A., Harms, C.A., McClellan-Green, P.D., 2004c. Associations between organochlorine contaminant concentrations and clinical health parameters in loggerhead sea turtles from North Carolina, USA. Environ Health Perspect 112, 1074-1079. Keller, J.M., McClellan-Green, P., 2004. Effects of organochlorine compounds on cytochrome P450 aromatase activity in an immortal sea turtle cell line. Mar Environ Res 58, 347-351. Keller, J.M., McClellan-Green, P.D., Kucklick, J.R., Keil, D.E., Peden-Adams, M.M., 2006. Effects of organochlorine contaminants on loggerhead sea turtle immunity: comparison of a correlative field study and in vitro exposure experiments. Environ Health Perspect 114, 70-76. Keller, J.M., McClellan-Green, P.D., Lee, A.M., Arendt, M.D., Maier, P.P., Segars, A.L., Whitaker, J.D., Keil, D.E., Peden-Adams, M.M., 2005. Mitogen-induced lymphocyte proliferation in loggerhead sea turtles: comparison of methods and effects of gender, plasma testosterone concentration, and body condition on immunity. Vet Immun Immunop 103, 269-281. Keller, J.M., Meyer, J.N., Mattie, M., Augsperger, T., Rau, M., Dong J, Levin, E.D., 2000. Assessment of immunotoxicology in wild populations: review and recommendations. Rev Toxicol 3, 167–212. Keller, J.M., Thorvalson, K., Sheridan, T., Harms, C.A., Segars, A.L., Beasley, J., Day, R., Peden-Adams, M., Kucklick, J.R., Norton, T., 2007. Organic contaminant concentrations change in debilitated loggerhead turtle plasma during recovery in rehabilitation. In: Rees, A.F., Frick, M., Panagopoulou, A., Williams, K. (Eds.), Proceedings of the Twenty-Seventh Annual Symposium on sea turtles biology and conservation, South Carolina, USA, p. 20. Kendall, R.J., 2008. Wildlife Toxicology: Integration of Ecological and Toxicological Research Strategies. Society of Environmental Toxicology and Chemistry 29th Annual Meeting, Tampa, Florida, USA, pp. 16–20. 261 Kendall, R.J., 2010. Introduction and Overview. In: Kendall, R.J., Lacher, T.E., Cobb, G.P., Cox, S.B. (Eds.), Wildlife toxicology: emerging contaminant and biodiversity issues. Taylor and Francis Group, Boca Raton, USA, pp. 1-14. Kennedy, C.J., Farrel, A.P., 2005. Ion homeostasis and internal stress response in juvenile Pacific herring, Clupea pallasi, exposed to the water-soluble fraction of crude oil. J Exp Mar Biol Ecol 323, 43-56. Kenyon, L.O., Landry, A.M., Gill, G.A., 2001. Trace metal concentrations in blood of the kemp’s ridley sea turtle (Lepidochelys kempii). Chelonian Conserv Biol 4, 128–135. Kitana, N., Callard, I.P., 2008. Effect of cadmium on gonadal development in freshwater turtle (Trachemys scripta, Chrysemys picta) embryos. J Environ Sci Health 43, 262-271. Kleinow, K., Baker, J., Nichols, J., Gobas, F., Parkerton, T., Muir, D., Monteverdi, G., Mastrodome, P., 1999. Exposure, uptake, and disposition of chemicals in reproductive and developmental stages of selected oviparous vertebrates. In: Di Giulio, R.T., Tillit, D.E. (Eds.), Reproductive and developmental effects of contaminants in oviparous vertebrates. SETAC Press, Pensacola, Florida, USA, pp. 9–111. Knotková, Z., Doubek, J., Knotek, Z., Hájková, P., 2002. Blood cell morphology and plasma biochemistry in Russian tortoises. Acta Vet Brno 71, 191-198. Knotkova, Z., Mazanek, S., Hovorka, M., Sloboda, M., Knotek, Z., 2005. Haematology and plasma chemistry of Bornean River turtles suffering from shell necrosis and haemogregarine parasites. Case Report 50, 421–426. Komoroske, L.M., Lewison, R.L., Seminoff, J.A., Deheyn, D.D., Dutton, P.H., 2011. Pollutants and the health of green sea turtles resident to an urbanized estuary in San Diego, CA. Chemosphere 84, 544-552. Komoroske, L.M., Lewison, R.L., Seminoff, J.A., Deustchman, D.D., Deheyn, D.D., 2012. Trace metals in an urbanized estuarine sea turtle food web in San Diego Bay, CA. Sci Total Environ 417-418, 108-116. Krahn, M.M., Hanson, M.B., Schorr, G.S., Emmons, C.K., Burrows, D.G., Bolton, J.L., Baird, R.W., Ylitalo, G.M., 2009. Effects of age, sex and reproductive status on persistent organic pollutant concentrations in “Southern Resident” killer whales. Mar Pollut Bull 58, 1522-1529. Krantz, W.C., Mulhern, B.M., Bagley, G.E., Sprunt, A., Ligas, F.J., Robertson, W.B., Jr., 1970. Organochlorine and heavy metal residues in bald eagle eggs. Pestic Monit J 4, 136-140. Kuiper, G.G., Lemmen, J.G., Carlsson, B., Corton, J.C., Safe, S.H., van der Saag, P.T., van der Burg, B., Gustafsson, J.A., 1998. Interaction of estrogenic chemicals and phytoestrogens with estrogen receptor beta. Endocrinology 139, 4252-4263. Kwan, D., 1994. Fat reserves and reproduction in the green turtle, Chelonia mydas. Wildlife Res 21, 257-266. Labrada-Martagón, V., Rodríguez, P.A., Méndez-Rodríguez, L.C., Zenteno-Savín, T., 2011. Oxidative stress indicators and chemical contaminants in East Pacific green turtles (Chelonia mydas) inhabiting two foraging coastal lagoons in the Baja California peninsula. Comp Biochem Physiol 154, 65-75. Lafferty, K.D., Porter, J.W., Ford, S.E., 2004. Are diseases increasing in the ocean? Annu Rev Ecol Syst 335, 31-54. Lahaye, V., Bustamante, P., Dabin, W., Van Canneyt, O., Dhermain, F., Cesarini, C., Pierce, G.J., Caurant, F., 2006. New insights from age determination on toxic element accumulation in striped and bottlenose dolphins from Atlantic and Mediterranean waters. Mar Pollut Bull 52, 1219-1230. Lahvis, G.P., Wells, R.S., Kuehl, D.W., Stewart, J.L., Rhinehart, H.L., Via, C.S., 1995. Decreased lymphocyte responses in free-ranging bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) are associated with increased concentrations of PCBs and DDT in peripheral blood. Environ Health Perspect 103 Suppl 4, 67-72. Lake, J.L., Haebler, R., Mckinney, R., Lake, C.A., Sadove, S.S., 1994. PCBs and other chlorinated organic contaminants in tissue of juvenile kemp’s ridley turtles (Lepidochelys kempii). Mar Environ Res 38, 313-327. Lam, J.C., Tanabe, S., Chan, S.K., Lam, M.H., Martin, M., Lam, P.K., 2006. Levels of trace elements in green turtle eggs collected from Hong Kong: evidence of risks due to selenium and nickel. Environ Pollut 144, 790-801. Laurent, L., Casale, P., Bradai, M.N., Godley, B.J., Gerosa, G., Broderick, A.C., Schroth, W., Schierwater, B., Levy, A.M., Freggi, D., et al., 1998. Molecular resolution of marine turtle stock composition in fishery bycatch: a case study in the Mediterranean. Molec Ecol 7, 1529-1542. Law, R.J., Klungsoyr, J., 2000. The analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in marine samples. Internat J Environ Poll 13, 262-283. 262 Lazar, B., Gracan, R., 2011. Ingestion of marine debris by loggerhead sea turtles, Caretta caretta, in the Adriatic Sea. Mar Pollut Bull 62, 43-47. Lazar, B., Maslov, L., Romanic, S.H., Gracan, R., Krauthacker, B., Holcer, D., Tvrtkovic, N., 2011. Accumulation of organochlorine contaminants in loggerhead sea turtles, Caretta caretta, from the eastern Adriatic Sea. Chemosphere 82, 121-129. Lee, J.S., Tanabe, S., Umino, H., Tatsukawa, R., Loughlin, T.R., Calkins, D.C., 1996. Persistent organochlorines in Steller sea lion (Eumetopias jubatus) from the bulk of Alaska and the Bering Sea 1976-1981. Mar Pollut Bull 32, 535-544. Leighton, F.A., 1993. The toxicity of petroleum oils to birds. Environ Rev 1, 92-103. Leonards, P.E., van Hattum, B., Leslie, H., 2008. Assessing the risks of persistent organic pollutants to top predators: a review of approaches. Integr Environ Assess Manag 4, 386-398. Leung, H.W., Kerger, B.D., Paustenbach, D.J., 2006. Elimination half-lives of selected polychlorinated dibenzodioxins and dibenzofurans in breast-fed human infants. J Toxicol Environ Health. Part A 69, 437-443. Ley-Quiñonez, C., Zavala-Norzagaray, A.A., Espinosa-Carreon, T.L., Peckham, H., Marquez-Herrera, C., CamposVillegas, L., Aguirre, A.A., 2011. Baseline heavy metals and metalloid values in blood of loggerhead turtles (Caretta caretta) from Baja California Sur, Mexico. Mar Pollut Bull 62, 1979-1983. Limpus, C.J., Chaloupka, M., 1997. Nonparametric regression modelling of green sea turtle growth rates. Mar Ecol Prog Ser 149, 23-24. Limpus, C.J., Limpus, D.J., 2003. Loggerhead turtles in the Equatorial and Southern Pacific Ocean: a species in decline. In: Bolten, A.B., Witherington, B.E. (Eds.), Loggerhead sea turtles. Smithsonian Institution Press, Washington, USA, pp. 199-209. Lind, P.M., Milnes, M.R., Lundberg, R., Bermudez, D., Orberg, J.A., Guillette, L.J., 2004. Abnormal bone composition in female juvenile American alligators from a pesticide-polluted lake (Lake Apopka, Florida). Environ Health Perspect 112, 359-362. Lockyer, C., Brown, S.G., 1981. The migration of whales. In: Aidley, D.J. (Ed.), Society for experimental biology seminar series (13). Animal migration. Cambridge University Press, Cambridge, UK, pp. 105-137. López-Jurado, L.F., Cabrera, I., Cejudo, D., Évora, C., Alfama, P., 2000a. Distribution of marine turtles in the Archipelago of Cabo Verde, Western Africa. Proceedings of the 19th Annual Symposium on Sea Turtle Biology and Conservation, 245-247. López-Olvera, J.R., Montane, J., Marco, I., Martínez-Silvestre, A., Soler, J., Lavin, S., 2003. Effect of venipuncture site on hematologic and serum biochemical parameters in marginated tortoise (Testudo marginata). J Wildl Dis 39, 830-836. López Jurado, L.F., Evora, C., Cabrera, I., Cejudo, D., Alfama, P., 2000b. Proposal for the conservationof marine turtles on the island of Boavista (Republic of Cabo Verde, western Africa). Proceedings of the 19th Annual Symposium on Sea Turtle Biology and Conservation, 204-206. López Jurado, L.F., Sanz, P., Abella, E., 2007. Loggerhead nesting on Boa Vista, República de Cabo Verde. In: SWOT Reports-State of the World’s Sea Turtles 2. Lutcavage, E.M., Musick, J.A., 1985. Aspects of the biology of sea turtles in Virginia. Copeia, 449-456. Lutcavage, E.M., Pamle, P., Witherington, Lutz, P.L., 1997a. Human Impacts on Sea Turtles Survival, The Biology of Sea Turtles, CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, pp. 387-408. Lutcavage, M.E., Lutz, P.L., Bossart, G.D., Hudson, D.M., 1997b. Physiologic and clinicopathologic effects of crude oil on loggerhead sea turtles. Arch Environ Contamin Toxicol 28, 417-422. Lutz, P., Dunbar-Cooper, A., 1987. Variations in the blood chemistry of the loggerhead sea turtle, Caretta caretta. Fishery Bull 85, 37-43. Lutz, P., Lutcavage, M., Hudson, D., 1986. Study of the Effect of Oil on Marine Turtles. In: Vargo, S., Lutz, P.L., Odell, D.K., Van Vleet, T., Bossart, G. (Eds.). Final Report. Physiological effects, Minerals Management Service Contract Number 114-12-0001-30063 Florida Inst. of Oceanography, St. Petersburg, Florida, USA. Lutz, P.L., 1975. Adaptative and avolutionary aspects of the ionic content of fishes. Copeia, 369-373. 263 Luzardo, O.P., Goethals, M., Zumbado, M., Álvarez-León, E.E., Cabrera, F., Serra-Majem, L., Boada, L.D., 2006. Increasing serum levels of non-DDT-derivative organochlorine pesticides in the younger population of the Canary Islands (Spain). Sci Total Environ 367, 129-138. Luzardo, O.P., Mahtani, V., Troyano, J.M., Álvarez de la Rosa, M., Padilla-Pérez, A.I., Zumbado, M., Almeida, M., Burillo-Putze, G., Boada, C., Boada, L.D., 2009. Determinants of organochlorine levels detectable in the amniotic fluid of women from Tenerife Island (Canary Islands, Spain). Environ Res 109, 607-613. Lydersen, C., Wolkers, H., Severinsen, T., Kleivane, L., Nordoy, E.S., Skaare, J.U., 2002. Blood is a poor substrate for monitoring pollution burdens in phocid seals. Sci Total Environ 292, 193-203. Maffucci, F., Caurant, F., Bustamante, P., Bentivegna, F., 2005. Trace element (Cd, Cu, Hg, Se, Zn) accumulation and tissue distribution in loggerhead turtles (Caretta caretta) from the Western Mediterranean Sea (southern Italy). Chemosphere 58, 535-542. Mandal, P.K., 2005. Dioxin: a review of its environmental effects and its aryl hydrocarbon receptor biology. Comp Biochem Physiol 175, 221-230. Mansour, S.A., 2004. Pesticide exposure-Egyptian scene. Toxicology 198, 91-115. Marco, A., Abella, E., Liria Loza, A., Martins, S., López, O., Jiménez Bordón, S., Medina, M., Oujo, C., Gaona, P., Godley, B.J., López Jurado, L.F., 2012. Abundance and exploitation of loggerhead turtles nesting in Boa Vista island, Cape Verde: the only substantial rookery in the eastern Atlantic. Ani Conserv 15, 351-360. Marco, A., Pérez, E.A., Monzón Argüello, C., Martins, S., Araujo, S., López Jurado, L.F., 2011. The international importance of the archipelago of Cape Verde for marine turtles, in particular the loggerhead turtle Caretta caretta. Zool Cabover 2 1, 1-11. Marcovaldi, M.A., Godfrey, M.H., Mrosovsky, N., 1997. Estimating sex ratios of loggerhead turtles in Brazil from pivotal incubation durations. Can J Zool 75, 755–770. Margaritoulis, D., 2007. Status update of marine turtles in the Mediterranean. In: López-Jurado, L.F., Liria Loza, A. (Eds.), Marine turtles. Recovery of extinct populations, Monografía del Instituto Canario de Ciencias Marinas. Pérez-Galdós, S.L.U, Gran Canaria, pp. 77-94. Margaritoulis, D., Argano, R., Baran, I., Bentivegna, F., Bradai, N.M., Camiñas, J.A., Casale, P., De Metrio, G., Demetropoulos, A., Gerosa, G., Godley, B.J., Haddoud, D.A., Joughton, J., Laurent, L., Lazar, B., 2003. Loggerhead turtles in the Mediterranean Sea: present knowledge and conservation perspective. In: Bolten, A.B., Witherington, B.E. (Eds.), Loggerhead sea turtles. Smithsonian Institution Press, Washington, USA, pp. 175-198. Mariussen, E., Fonnum, F., 2006. Neurochemical targets and behavioral effects of organohalogen compounds: an update. Crit Rev Toxicol 36, 253-289. Marsili, L., Caruso, A., Fossi, M.C., Zanardelli, M., Politi, E., Focardi, S., 2001. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in subcutaneous biopsies of Mediterranean cetaceans. Chemosphere 44, 147-154. Marth, E., Stunzner, D., Kock, M., Mose, J.R., 1989. Toxicokinetics of chlorinated hydrocarbons. J Hyg Epidemiol Microbiol Immunol 33, 514-520. Martineau, D., Beland, P., Desjardins, C., Legace, A., 1987. Levels of organochlorine chemicals in tissues of beluga whales (Delphinapterus leucas) from the St. Lawrence Estuary, Quebec, Canada. Arch Environ Contamin Toxicol 16, 137-147. Martineau, D., Lemberger, K., Dallaire, A., Labelle, P., Lipscomb, T.P., Michel, P., Mikaelian, I., 2002. Cancer in wildlife, a case study: beluga from the St. Lawrence estuary, Quebec, Canada. Environ Health Perspect 110, 285-292. Matsumoto, E., Kawanaka, Y., Yun, S.J., Oyaizu, H., 2009. Bioremediation of the organochlorine pesticides, dieldrin and endrin, and their occurrence in the environment. Appl Microbiol Biotechnol 84, 205-216. Matthews, H.B., Surles, J.R., Carver, J.G., Anderson, M.W., 1984. Halogenated biphenyl transport by blood components. Soc Toxicology 4, 420-428. McArthur, S., 2004. Problem-solving approach to conditions of marine turtles. In: McArthur, S., Wilkinson, R., Meyer, J. (Eds.), Medicine and Surgery of Tortoises and Turtles. Blackwell Publishing Ltd, Oxford, UK, pp. 301-307. McConnell, E.E., 1985. Comparative toxicity of PCBs and related compounds in various species of animals. Environ Health Perspect 60, 29-33. 270 Schwartz, F.J., 1988. Aggregations of Young Hatchling Loggerhead Sea Turtles in the Sargassum off North Carolina. Mar Turtle Newsl 42, 9-10. Seaman, G.A., Lowry, L.F., Frost, K.J., 1982. Foods of belukha whales Delphinapterus leucas in Western Alaska. Cetology 44, 1-19. Seegal, R.F., Bush, B., Shain, W., 1991. Neurotoxicology of ortho-substituted polychlorinated biphenyls. Chemosphere 23, 1941-1949. Seidel, W.R., McVea, C.J., 1995. Development of a sea turtle excluder shrimp trawl for the southeast U.S. penaeid shrimp fishery. In: Bjorndal, K.A. (Ed.), Biology and Conservation of Sea Turtles. Smithsonian Institution Press, Washington D.C., pp. 497-502. Seminoff, J.A., Resendiz, A., Resendiz, B., Nichols, W.J., 2004. Ocurrence of loggerhead sea turtles (Caretta caretta) in the Gulf of California, Mexico: evidence of life-history variation in the Pacific Ocean. Herpetol Rev 35, 24-27. Sheehan, D.M., Willingham, E., Gaylor, D., Bergernon, J.M., Crews, D., 1999. No threshold dose for estradiolinduced sex reversal of turtle embryos: how little is too much? Environ Health Perspect 107, 155-159. Sipes, I.G., Gandolfi, A.J., 1991. Biotransformation of toxicants. In: Ambur, M.O., Doull, J., Klaassen, C.O. (Eds.), The basic sciense of poisons. 4th Edn. McGraw-Hill, Inc., New York, USA, pp. 88-126. Smith, A.G., Gangolli, S.D., 2002. Organochlorine chemicals in seafood: occurrence and health concerns. Food Chem Toxicol 40, 767-779. Smith, G.J., Hall, R.J., 1994. Wildlife toxicology. In: Cockerham, L.G., Shane, B.S. (Eds.), Basic Environmental Toxicology. CRC Press, Boca Ratón, Florida, USA, pp. 409-424. Soria, M.L., Repetto, G., Repetto, M., 1995. Revisión general de la toxicología de los metales. In: Repetto, M. (Ed.), Toxicología Avanzada. Díaz de Santos, S.A., Madrid, España, pp. 293-358. Sparling, D.W., Linder, G., Bishop, C.A., Krest, S.K., 2010. Recent advancements in amphibian and reptile ecotoxicology. In: Sparling, D.W., Linder, G., Bishop, C.A., Krest, S.K. (Eds.), Ecotoxicology of amphibians and reptiles. Taylor and Francis Group. Boca Ratón. Published in collaboration with the Society of Environmental Toxicology and Chemistry (SETAC). New York, USA, pp. 1-12. Speake, B.K., Thompson, M.B., Thacker, F.E., Bedford, G.S., 2003. Distribution of lipids from the yolk to the tissues during development of the water python (Liasis fuscus). Comp Biochem Physiol 173, 541-547. Spotila, J.R., 2004. Sea turtles. A complete guide to their biology, behavior, and conservation. The Johns Hopkins University Press, Baltimore, USA, p. 228. Srinivasan, K., Ramesh, H.P., Radhakrishnamurty, R., 1984. Renal tubular dysfunction caused by dietary hexachlorocyclohexane (HCH) isomers. J Environ Sci Health B 19, 453-466. Ssebugere, P., Wasswa, J., Mbabazi, J., Nyanzi, S.A., Kiremire, B.T., Marco, J.A., 2010. Organochlorine pesticides in soils from south-western Uganda. Chemosphere 78, 1250-1255. Stamper, M.A., Harms, C., Epperly, S.P., Braun-McNeill, J., Stoskopf, M.K., 2005. Relationship between barnacle epibiotic load and hematologic parameters in loggerhead sea turtles (Caretta caretta), a comparison between migratory and residential animals in Pamlico Sound, North Carolina. J Zoo Wildl Med 36, 635-641. Stewart, K.R., Keller, J.M., Templeton, R., Kucklick, J.R., Johnson, C., 2011. Monitoring persistent organic pollutants in leatherback turtles (Dermochelys coriacea) confirms maternal transfer. Mar Pollut Bull 62, 1396-1409. Stoica, A., Pentecost, E., Martin, M.B., 2000. Effects of arsenite on estrogen receptor-alpha expression and activity in MCF-7 breast cancer cells. Endocrinology 141, 3595-3602. Storelli, M.M., Barone, G., Marcotrigiano, G.O., 2007. Polychlorinated biphenyls and other chlorinated organic contaminants in the tissues of Mediterranean loggerhead turtle Caretta caretta. Sci Total Environ 373, 456-463. Storelli, M.M., Ceci, E., Marcotrigiano, G.O., 1998a. Comparison of total mercury, methylmercury, and selenium in muscle tissues and in the liver of Stenella coeruleoalba (Meyen) and Caretta caretta (Linnaeus). Environ Contam Toxicol 61, 541-547. Storelli, M.M., Ceci, E., Marcotrigiano, G.O., 1998b. Distribution of heavy metal residues in some tissues of Caretta caretta (Linnaeus) specimen beached along the Adriatic Sea (Italy). Bull Environ Contam Toxicol 60, 546-552. 271 Storelli, M.M., Marcotrigiano, G.O., 2000. Chlorobiphenyls, HCB, and organochlorine pesticides in some tissues of Caretta caretta (Linnaeus) specimens beached along the adriatic sea, Italy. Bull Environ Contam Toxicol 64, 481-488. Storelli, M.M., Marcotrigiano, G.O., 2003. Heavy metal residues in tissues of marine turtles. Mar Pollut Bull 46, 397-400. Storelli, M.M., Storelli, A., D’Addabbo, R., Marano, C., Bruno, R., Marcotrigiano, G.O., 2005. Trace elements in loggerhead turtles (Caretta caretta) from the eastern Mediterranean Sea: overview and evaluation. Environ Pollut 135, 163-170. Strandberg, B., Bandh, C., van Bavel, B., Bergqvist, P.A., Broman, D., Naf, C., Pettersen, H., Rappe, C., 1998. Concentrations, biomagnification and spatial variation of organochlorine compounds in a pelagic food web in the northern part of the Baltic Sea. Sci Total Environ 217, 143-154. Stuart, S.N., Chanson, J.S., Cox, N.A., Young, B.E., Rodrigues, A.S., Fischman, D.L., Waller, R.W., 2004. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science 306, 1783-1786. Subramanian, A., Tanabe, S., Tatsukawa, R., 1988a. Estimating some biological parameters of Baird´s beaked whales using PCBs and DDEs as tracers. Mar Poll Bull 19, 284-287. Subramanian, A., Tanabe, S., Tatsukawa, R., 1988b. Use of organochlorines as chemical tracers in determining some reproductive parameters in Dalli-type Dall´s porpoise Phocoenoides dalli. Mar Environ Res 25, 161-174. Sullivan, L.C., Orgeig, S., Wood, P.G., Daniels, C.B., 2001. The ontogeny of pulmonary surfactant secretion in the embryonic green sea turtle (Chelonia mydas). Physiol Biochem Zool 74, 493-501. Sunol, C., Vale, C., Rodriguez-Farre, E., 1998. Polychlorocycloalkane insecticide action on GABA-and glycinedependent chloride flux. Neurotoxicology 19, 573-580. Suzuki, K., Noda, J., Yanagisawa, M., Kawazu, I., Sera, K., Fukui, D., Asakawa, M., Yokota, H., 2012. Particle-induced X-ray emission analysis of elements in plasma from wild and captive sea turtles (Eretmochelys imbricata, Chelonia mydas, and Caretta caretta) in Okinawa, Japan. Biol Trace Element Res 148, 302-308. Swarthout, R.F., Keller, J.M., Peden-Adams, M., Landry, A.M., Fair, P.A., Kucklick, J.R., 2010. Organohalogen contaminants in blood of Kemp’s ridley (Lepidochelys kempii) and green sea turtles (Chelonia mydas) from the Gulf of Mexico. Chemosphere 78, 731-741. Swimmer, J.Y., 2000. Biochemical responses to fibropapilloma and captivity in the green turtle. J Wildl Dis 36, 102-110. Szefer, P., Szefer, K., Pempkowiak, J., Skwarzec, B., Bojanowski, R., Holm, E., 1994. Distribution and coassociations of selected metals in seals of the Antarctic. Environ Pollut 83, 341-349. Tanabe, S., Hidaka, H., Tatsukawa, R., 1983. PCBs and chlorinated pesticides in Antarctic atmosphere and hydrosphere. Chemosphere 12, 277-288. Tanabe, S., Kannan, N., Subramanian, A., Watanabe, S., Tatsukawa, R., 1987. Highly toxic coplanar PCBs: occurrence, source, persistency and toxic implications to wildlife and humans. Environ Pollut 47, 147-163. Tanabe, S., Kunisue, T., 2007. Persistent organic pollutants in human breast milk from Asian countries. Environ Pollut 146, 400-413. Tanabe, S., Madhusree, B., Öztürk, A.A., Tatsukawa, R., Miyazaki, N., Özdamar, E., Aral, O., Samsun, O., Öztürk, B., 1997. Persistent organochlorine residues in harbour porpoise (Phocoena phocoena) from the Black Sea. Mar Poll Bull 34, 338-347. Tanabe, S., Mori, T., Tatsukawa, R., 1984. Bioaccumulation of DDTs and PCBs in southern minke whale (Balaenoptera acutorostrata). Proceedings of the Sixth Symposium on Polar Biology. Mem Nat Inst Polar Res (Japan), Japan, pp. 140-150. Tanabe, S., Tatsukawa, R., Maruyama, K., Miyazaki, N., 1982. Transplacental transfer of PCBs and chlorinated hydrocarbon pesticides from the pregnant striped dolphin (Stenella coeruleoalba) to the fetus. Agr Biol Chem 46, 1249-1254. Tangredi, B.P., Evans, R.H., 1997. Organochlorine pesticides associated with ocular, nasal, or otic infection in the eastern box turtle (Terrapene carolina carolina). J Zoo Wildl Med 28, 97-100. 272 Tao, S., Liu, W.X., Li, X.Q., Zhou, D.X., Li, X., Yang, Y.F., Yue, D.P., Coveney, R.M., 2009. Organochlorine pesticide residuals in chickens and eggs at a poultry farm in Beijing, China. Environ Pollut 157, 497-502. Tavares-Días, M., Oliveira-Junior, A.A., Silva, M.G., Marcon, J.L., Barcellos, J.F.M., 2009. Comparative hematologic and biochemical analysis for giant turtles from the Amazon farmed in poor and normal nutritional conditions. Vet Archiv 79, 601–610. Thorbjarnarson, J., Lagueux, C., Bolze, D., Klemens, M., Meylan, A., 2000. Human use of turtle: a worldwide perspective. In: Klemens, M. (Ed.), Turtle Conservation. Smithsonian Institution Press, Washington and London, pp. 3384. Tillet, D.E., Ankley, G.T., Verbrugge, D.A., Giesey, J.P., Lugwig, J.P., Kubiak, T.J., 1991. H4IIE rat hepatoma cell bioassay-derived 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin equivalents in colonial fish-eating waterbird eggs from the Great Lakes. Arch Environ Contamin Toxicol 21, 91-101. Torrent, A., Déniz, S., Ruiz, A., Calabuig, P., Sicilia, J., Orós, J., 2002. Esophageal diverticulum associated with Aerococcus viridans infection in a loggerhead sea turtle (Caretta caretta). J Wildl Dis 38, 221-223. Torrent, A., González-Díaz, O.M., Monagas, P., Orós, J., 2004. Tissue distribution of metals in loggerhead turtles (Caretta caretta) stranded in the Canary Islands, Spain. Mar Pollut Bull 49, 854-860. Tsuda, T., Nakanishi, H., Sideru, A., Takebayashi, J., 1988. Bioconcentration and metabolism of butyltin compounds in carp. Water Res 22, 647-651. Turnbull, B.S., Smith, C.R., Stamper, M.A., 2000. Medical implications of hypotermia in threatened loggerhead (Caretta caretta) and endangered kemp’s ridley (Lepidochelys kempii) and green (Chelonia mydas) sea turtles. Proceedings AAZV and IAAAM joint Conference, 31-35. US Environmental Protection Agency (USEPA), 1980. Ambient water quality critera for polycyclic aromatic hydrocarbons. Criteria and Standards Division, Environmental Protection Agency, Washington, D.C. p. A-1 to B-6. EPA-440/5-80-069. van de Merwe, J.P., Hodge, M., Olszowy, H.A., Whittier, J.M., Lee, S.Y., 2010. Using blood samples to estimate persistent organic pollutants and metals in green sea turtles (Chelonia mydas). Mar Pollut Bull 60, 579-588. Van de Vijver, K.I., Hoff, P.T., Das, K., Van Dongen, W., Esmans, E.L., Siebert, U., Bouquegneau, J.M., Blust, R., De Coen, W.M., 2004. Baseline study of perfluorochemicals in harbour porpoises (Phocoena phocoena) from Northern Europe. Mar Pollut Bull 48, 992-997. van den Berg, H., 2009. Global status of DDT and its alternatives for use in vector control to prevent disease. Environ Health Perspect 117, 1656-1663. Van den Berg, M., Birnbaum, L., Bosveld, A.T., Brunstrom, B., Cook, P., Feeley, M., Giesy, J.P., Hanberg, A., Hasegawa, R., Kennedy, S.W., et al., 1998. Toxic equivalency factors (TEFs) for PCBs, PCDDs, PCDFs for humans and wildlife. Environ Health Perspect 106, 775-792. Van den Berg, M., Birnbaum, L.S., Denison, M., De Vito, M., Farland, W., Feeley, M., Fiedler, H., Hakansson, H., Hanberg, A., Haws, L., et al., 2006. The 2005 World Health Organization reevaluation of human and Mammalian toxic equivalency factors for dioxins and dioxin-like compounds. Soc Toxicol 93, 223-241. Van den Berg, M., De Jongh, J., Poiger, H., Olson, J.R., 1994. The toxicokinetics and metabolism of polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDDs) and dibenzofurans (PCDFs) and their relevance for toxicity. Crit Rev Toxicol 24, 1-74. Van Meter, R.J., Spotila, J.R., Avery, H.W., 2006. Polycyclic aromatic hydrocarbons affect survival and development of common snapping turtle (Chelydra serpentina) embryos and hatchlings. Environ Pollut 142, 466-475. Van Metre, P.C., Mahler, B.J., Furlong, E.T., 2000. Urban sprawl leaves its PAH signature. Environ Sci Technol 34, 4064-4070. Vargo, S., Lutz, P., Odell, D., Van Vleet, E., Bossart, G., 1986. Study of the effects of oil on marine turtles. Final Report. MMS 86-0070. Department of the Interior, Minerals Management Service, Vienna, Virginia, USA. Verreault, J., Villa, R.A., Gabrielsen, G.W., Skaare, J.U., Letcher, R.J., 2006. Maternal transfer of organohalogen contaminants and metabolites to eggs of Arctic-breeding glaucous gulls. Environ Pollut 144, 1053-1060. Viberg, H., Fredriksson, A., Jakobsson, E., Orn, U., Eriksson, P., 2003. Neurobehavioral derangements in adult mice receiving decabrominated diphenyl ether (PBDE 209) during a defined period of neonatal brain development. Soc Toxicol 76, 112-120. 273 Villa, S., Finizio, A., Díaz, R., Vighi, M., 2003. Distribution of organochlorine pesticides in pine needles of an oceanic islands: the case of Tenerife (Canary Islands, Spain). Water Air Soil Poll 143, 335-349. Vos, J.G., Dybing, E., Greim, H.A., Ladefoged, O., Lambre, C., Tarazona, J.V., Brandt, I., Vethaak, A.D., 2000. Health effects of endocrine-disrupting chemicals on wildlife, with special reference to the European situation. Crit Rev Tox 30, 71-133. Wagemann, R., Trebacz, E., Boila, G., Lockhart, W.L., 1998. Methylmercury and total mercury in tissues of arctic marine mammals. Sci Total Environ 218, 19-31. Walker, C.H., 1980. Species variations in some hepatic drug metabolizing enzymes. Progress Drug Metabol 5, 113-164. Walker, C.H., Hopkin, S.P., Sibly, R.M., Peakall, D.B., 1996. Principles of Ecotoxicology. Taylor and Francis Ltd, USA. Walther, G.R., Post, E., Convey, P., Menzel, A., Parmesan, C., Beebee, T.J., Fromentin, J.M., Hoegh-Guldberg, O., Bairlein, F., 2002. Ecological responses to recent climate change. Nature 416, 389-395. Wallace, B.P., Williams, C.L., Paladino, F.V., Morreale, S.J., Lindstrom, R.T., Spotila, J.R., 2005. Bioenergetics and diving activity of internesting leatherback turtles Dermochelys coriacea at Parque Nacional Marino Las Baulas, Costa Rica. J Experim Biol 208, 3873-3884. Wallach, J.D., Boever, W.J., 1993. Diseases of exotic animals: medical and surgical management. W. B. Saunders Company, Philadelphia, USA. Wang, H., 2005. Trace metal uptake and accumulation pathways in kemp’s ridley sea turtles (Lepidochelys kempii). Phd Tesis, Doctor of philosophy, University of Texas, USA. Weber, R., Gaus, C., Tysklind, M., Johnston, P., Forter, M., Hollert, H., Heinisch, E., Holoubek, I., Lloyd-Smith, M., Masunaga, S., et al., 2008. Dioxinand POP-contaminated sites--contemporary and future relevance and challenges: overview on background, aims and scope of the series. Environ Sci Pollut Res Int 15, 363-393. Weijs, L., Dirtu, A.C., Das, K., Gheorghe, A., Reijnders, P.J., Neels, H., Blust, R., Covaci, A., 2009. Inter-species differences for polychlorinated biphenyls and polybrominated diphenyl ethers in marine top predators from the Southern North Sea: Part 2. Biomagnification in harbour seals and harbour porpoises. Environ Pollut 157, 445-451. Whitaker, B.R., Krum, H., 1999. Medical management of sea turtles in aquaria. In: Fowler, M.E., Millan, E. (Eds.), Zoo and Wild Animal Medicine. Current Therapy. W. B. Saunders Company, Philadelphia, USA, pp. 217-231. Who, 1976. Polychlorinated biphenyl and terphenyls. World Health Organization, Geneva, Suiza, p. 85. Wibbels, T., Bull, J.J., Crews, D., 1991. Chronology and morphology of temperature-dependent sex determination. J Experim Zool 260, 371-381. Wibbles, T., Owens, D.W., Limpus, C.J., Reed, P.C., Amoss, M.S.J., 1990. Seasonal changes in serum gonadal steroids associated with migration, mating and nesting in the loggerhead sea turtle (Caretta caretta). General and Comparative Endocrinology 79, 154-164. Wiig, Ø., 1998. Survival and reproductive rates for polar bears at Svalbard. Int Conf Bear Res 10. Wiktelius, S., Edwards, C.A., 1997. Organochlorine insecticide residues in African Fauna: 1971-1995. Rev Environ Contamin Toxicol 151, 1-37. Wilcox, B.A., Aguirre, A.A., 2004. One ocean, one health. EcoHealth 1, 211-212. Wilkinson, R., 2004. Clinical pathology. In: McArthur, S., Wilkinson, R., Meyer, J. (Eds.), Medicine and Surgery of Tortoise and Turtles. Blackwell Publishing, Oxford, UK, pp. 141-186. Williams, E.S., Panko, J., Paustenbach, D.J., 2009. The European Union’s REACH regulation: a review of its history and requirements. Crit Rev Toxicol 39, 553-575. Willingham, E., Baldwin, R., Skipper, J.K., Crews, D., 2000. Aromatase activity during embryogenesis in the brain and adrenal-kidney-gonad of the red-eared slider turtle, a species with temperature-dependent sex determination. Gen Comp Endocrinol 119, 202-207. Willingham, E., Crews, D., 1999. Sex reversal effects of environmentally relevant xenobiotic concentrations on the red-eared slider turtle, a species with temperature-dependent sex determination. Gen Comp Endocrinol 113, 429-435. 274 Willingham, E.J., 2001. Embryonic exposure to low-dose pesticides: effects on fitness parameters in the hatchling red-eared slider turtle. Toxicol Environ Health 64, 257–272. Witham, R., 1995. Disruption of sea turtle habitat with emphasis on human influence. In: Bjorndal, K.A. (Ed.), Biology and Conservation of Sea Turtles. Edición revisada. Smithsonian Institution Press, Washington, USA, pp. 519-522. Wolf, K.N., Harms, C.A., Beasley, J.F., 2008. Evaluation of five clinical chemistry analyzers for use in health assessment in sea turtles. J Am Vet Med Assoc 233, 470-475. Wong, P.S., Matsumura, F., 2007. Promotion of breast cancer by beta-hexachlorocyclohexane in MCF10AT1 cells and MMTV-neu mice. BMC Cancer 7, 130. Work, T.M., Balazs, G.H., 1999. Relating tumor score to hematology in green turtles with fibropapillomatosis in Hawaii. J Wildl Dis 35, 804-807. Work, T.M., Rameyer, R.A., Balazs, G.H., Cray, C., Chang, S.P., 2001. Immune status of free-ranging green turtles with fibropapillomatosis from Hawaii. J Wildl Dis 37, 574-581. Work, T.M., Raskin, R.E., Balazs, G.H., Whittaker, S.D., 1998. Morphologic and cytochemical characteristics of blood cells from Hawaiian green turtles. Am J Vet Res 59, 1252-1257. Wright, P.J., Tillitt, D.E., 1999. Embryotoxicity of Great Lakes lake trout extracts to developing rainbow trout. Aquatic Toxicol 47, 77-92. Wyneken, J., Mader, D.R., Weber III, E.S., Merigo, C., 2006. Medical care of sea turtles. In: Mader, D.R. (Ed.), Reptile Medicine and Surgery. Saunders, Elsevier Inc., St. Louis, Missouri, USA, pp. 972–1007. Ylitalo, G.M., Matkin, C.O., Buzitis, J., Krahn, M.M., Jones, L.L., Rowles, T., Stein, J.E., 2001. Influence of life-history parameters on organochlorine concentrations in free-ranging killer whales (Orcinus orca) from Prince William Sound, AK. Sci Total Environ 281, 183-203. Yntema, C.L., Mrosovsky, N., 1979. Incubation temperature and sex ratio in hatchling loggerhead turtles: a preliminary report. Mar Turtle Newsl 11, 9-10. Yu, S., Halbrook, R.S., Sparling, D.W., 2012. Accumulation of polychlorinated biphenyls (PCBs) and evaluation of hematological and inmunological effects of PCB exposure on turtles. Bull Environ Contam Toxicol 88(6), 823-827. Ziswiler, V., 1986. Clase Reptiles Reptilia. In: Omega (Ed.), Zoología especial Vertebrados Tomo II: Amniotas, Barcelona, Spain, pp. 23-72. Zou, E., Matsumura, F., 2003. Long-term exposure to beta-hexachlorocyclohexane (beta-HCH) promotes transformation and invasiveness of MCF-7 human breast cancer cells. Biochem Pharmacol 66, 831-840. Zumbado, M., Goethals, M., Álvarez-León, E.E., Luzardo, O.P., Cabrera, F., Serra-Majem, L., Domínguez-Boada, L., 2005. Inadvertent exposure to organochlorine pesticides DDT and derivatives in people from the Canary Islands (Spain). Sci Total Environ 339, 49-62. 275 2. Referencias electrónicas Aresco, M.J., James, F.C., 2005. Ecological relationships of turtles in north Florida lakes: a study of omnivory and the structure of a lake food web. Final report, Contract NG01-011, Tallahassee (Florida): Florida Fish and Wildlife Conservation Commission. Available from: Disponible en: http://www.lakejacksonturtles.org/aresco/ arescojames2005. Cobbing M. Toxic Tech: Not in Our Backyard. Uncovering the Hidden Flows of e-waste. Greenpeace International, (2008). Disponible en: http://www.greenpeace.org/raw/content/belgium/fr/press/reports/toxic-tech.pdf Commission Decision Implementing Council Directive Nº 96/23/CE of August 12. (2002) Off J Eur Union,L 221/18. Disponible en: http://eurlex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2002:221:0008:0036:EN:PDF IARC (1987) Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, Supplement 7 (1987). Disponible en: http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/suppl7/index.php IMO (2007) Canary Islands as a Particularly Sensitive Sea Area (PSSA) by the International Maritime Organization (IMO). http://www.imo.org/OurWork/Environment/pollutionprevention/pssas/Pages/Default.aspx IPCC (2007) Climate Change 2007: the physical basis. Contribution of Working Group I to the fourth assessment. Report of the intergovernmental panel on climate change. Cambridge University Press, Cambridge. Disponible en: http://www.ipcc.ch/publications_and_data/publications_ipcc_fourth_assessment_report_wg1_report_the_ physical_science_basis.htm IUCN (2012) The International Union for Conservation of Nature (IUCN). IUCN Red List of Threatened Species. Disponible en: http://www.iucnredlist.org/details/3897/0 Jacobson, E., Bjorndal, K., Bolten, A., Herren, R., Harman, G., Wood, L., 2007. Establishing plasma biochemical and hematocrit reference intervals for sea turtles in Florida. http://accstr.ufl.edu/blood_chem.htm/ PNUMA (2007) Guía para el plan de vigilancia mundial de contaminantes orgánicos persistentes. Disponible en: http://www.pops.int/documents/meetings/effeval/guidance_sp/guidance_esp.pdf UN/DESA (2002) Changing Unsustainable Patterns of Consumption and Production, Johannesburg Plan on Implementation of the World summit on Sustainable Development, Johannesburg, 2002 (Chapter III). Disponible en: http://www.un.org/esa/sustdev/documents/WSSD_POI_PD/English/POIChapter3.htm UNEP. Basel Convention on the Control of Transboundary Movements of HazardousWastes and their Disposal. United Nations Environment Programme. (2009) http://www.basel.int/ United Nations Environment Programme. (2001a). Stockholm convention on persistent organic pollutants. Disponible en: http://www.pops.int/documents/convtext/convtext_en.pdf United Nations Environment Programme. (2001b). Stockholm convention on persistent organic pollutants: status of ratification Disponible en: http://chm.pops.int/Countries/StatusofRatification/tabid/252/language/es-CO/ Default.aspx United Nations Environment Programme. (2001c). Stockholm convention on persistent organic pollutants: the new 9 substances under the Stockholm Convention Disponible en: http://chm.pops.int/Programmes/NewPOPs/ The9newPOPs/tabid/672/language/en-US/Default.aspx GLOSARIO GLOSARIO .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..277 279 Glosario 4,4’-DDD*: Dichlorodiphenyldichloroethane - Diclorodifenildicloroetano (IUPAC 1,1-dicloro-2,2-bis(p-clorofenil) etano). 4,4’-DDE*: Dichlorodiphenyldichloroethylene - Diclorodifenildicloroetileno (IUPAC 1,1-dicloro-2,2-bis(pmetoxifenil)etano). 4,4’-DDT*: Dichlorodiphenyltrichloroethane - DiclorodifenilTricloroetano (IUPAC 1,1,1-tricloro-2,2-bis(pmetoxifenil)etano). AEF: Factor de enriquecimiento antropogénico. AENOR: Asociación Española de Normalización. AhR*: Aryl hidrocarbon Receptor - Receptor aril hidrocarburo. Al: AluminioAluminum. ALP: Fosfatasa alcalina - Alkaline phosphatase. ALT: Alanino aminotransferasa - Alanine aminotransferase. As: Arsénico - Arsenic. AST: Aspartato aminotransferasa – Aspartate aminotransferase. ATPasa: Adenosina trifosfatasa. AX-ICP-OES*: Axial Configuration of the Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy - Configuración axial de la Espectroscopía de Emisión Óptica de Plasma Acoplado Inductivamente. BUN: Nitrógeno ureico sanguíneo - Blood urea nitrogen. CCL: Curve carapace length – Largo curva del caparazón (LCC). Cd: Cadmio – Cadmium. CIPs: Contaminantes Inorgánicos Persistentes. CITES: Convention of International Trade in Endangered Species - Convención sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres. ANEXO 2 Pansteatitis associated with high levels of polychlorinated biphenyls in a wild loggerhead sea turtle Caretta caretta ANEXO II Pansteatitis associated with high levels of polychlorinated biphenyls in a wild loggerhead sea turtle Caretta caretta . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..289