Microestruturas híbridas eletroativas para a regeneração da medula espinhal

Universidade do Minho Escola de Ciências Fábio Manuel Ratana Rodrigues Microestruturas híbridas eletroativas para a regeneração da medula espinhal Outubro de 2022 Uminho | 2022 Microestruturas híbridas eletroativas para a regeneração da medula espinhal Fábio Manuel Ratana Rodrigues Universidade do Minho Escola de Ciências Fábio Manuel Ratana Rodrigues Microestruturas híbridas eletroativas para a regeneração da medula espinhal Dissertação de Mestrado Em Biofísica e Bionanossistemas Área de espacialização: Engenharia de tecidos Trabalho efetuado sob a orientação do Professor Doutor Senentxu Lanceros-Mendez Professora Doutora Clarisse Ribeiro Outubro de 2022 i D I R E I T O S D E A U T O R E C O N D I Ç Õ E S D E U T I L I Z A Ç Ã O D O T R A B A L H O P O R T E R C E I R O S Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne os direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. License granted to users of this work: Atribuição-NãoComercial-SemDerivações CC BY-NC-ND https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ Braga, 31 de outubro de 2022 _________________________________ (Fábio Manuel Ratana Rodrigues) Assinado por: Fábio Manuel Ratana Rodrigues Num. de Identificação: 15346538 Data: 2023.01.06 00:23:58+00'00' ii A G R A D E C I M E N T O S Este trabalho foi realizado de fevereiro de 2022 a abril de 2022, no âmbito do Programa ERASMUS no Centro Basco de Materiais (BCM), Aplicações e Estruturas e na Universidade do País Basco, e, no restante período, na Universidade do Minho. Antes de mais, gostaria de agradecer à minha orientadora, a Doutora Clarisse Ribeiro, por toda a disponibilidade e tempo que dedicou para me ajudar neste extenso trabalho que durou meses; assumidamente, não poderia pedir melhor tutora. Quero também agradecer ao meu orientador, Doutor Senentxu Lanceros-Mendez, por me ter aceitado no grupo e sugerido o programa ERASMUS em Bilbau, uma experiência enriquecedora que, decerto, voltarei a repetir. À Doutora Cármen Tubio, por me receber e acompanhar o meu trabalho durante os 3 meses de estância no BCM. Aos meus companheiros de Bilbau, Udane, Marina y Josu por terem tornado a experiência de mobilidade muito mais preenchida e enriquecedora. Quero também agradecer a todos os que me acompanharam do instituto da Biosustentabilidade (IB-S) e no BCM, especialmente ao Mestre Ander Garcia pelo apoio e dedicação na parte da impressão 3D e à Mestre Teresa Almeida pelo apoio prático nos ensaios de proliferação e tratamento de dados. Por fim, mas não menos importante, tenho o prazer de agradecer a todos os meus amigos, que me acompanharam nestes dois anos de mestrado, e, em especial, à minha família pelo apoio constante e incansável. iii D E C L A R A Ç Ã O D E I N T E G R I D A D E Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. Braga, 31 de outubro de 2022 __________________________________ (Fábio Manuel Ratana Rodrigues) Assinado por: Fábio Manuel Ratana Rodrigues Num. de Identificação: 15346538 Data: 2023.01.06 00:25:52+00'00' iv Resumo A medula espinhal é um elemento essencial do sistema nervoso central. Quando ocorre a lesão traumática da medula espinhal (LTME) os processos regenerativos ocorrem de forma a não restruturar as funções que lhe são atribuídas, originando perda de função motora e sensorial. A engenharia de tecidos aponta para desenvolver novos prognósticos para esta patologia restituindo as funções originais da medula espinhal. Uma das estratégias já conhecidas para regeneração de tecidos é a incidência de estímulos elétricos para adesão e orientação aquando do crescimento celular. Neste estudo foi desenvolvido um compósito de poli(vinilideno) (PVDF, do inglês, polyvinylidene fluoride), uma estrutura coberta de pilares piezoelétricos que irão através do movimento gerar um sinal elétrico para as células neuronais na sua superfície. Este compósito tem também na sua constituição nanopartículas superparamagnéticas, que vão permitir através de um campo magnético o movimento dos pilares que, por sua vez, origina o impulso elétrico. A este compósito 4D foi adicionado um hidrogel de alginato de sódio oxidado covalentemente ligado a proteínas RGD, um fator bioquímico que auxilia na fixação celular. O hidrogel tem a característica de se degradar à medida que as células proliferam e se diferenciam. Levando-as a receber os estímulos elétricos aquando já totalmente diferenciadas. Os compósitos magnetoelétricos (ME) têm a particularidade de gerarem corrente elétrica a partir de um estímulo magnético permitindo que este estímulo seja incidido nas células ao mesmo tempo que o tecido regenera. Várias técnicas foram utilizadas para estudar este sistema complexo, onde se denotou moção dos pilares por cisalhamento, a presença da fase β em mais de 80% do composto, uma percentagem de ferrites de 9,1%, e crescimento no ensaio de proliferação superior a 25%. Através de uso de compósitos eletroativos pretende-se melhorar e inovar este tratamento, com uso de hidrogéis in situ e interações elétricas não invasivas, aumentando a viabilidade celular, bem como controlando a diferenciação e orientação do crescimento neuronal após o implante. Engenharia de tecidos, Hidrogel, Impressão 3D, Medula Espinhal, Piezoeletricidade v Abstract The spinal cord is an essential element in the central nervous system. When traumatic spinal cord injury (LTME, from the Portuguese Lesão Traumática da Medula Espinhal) occurs, regenerative processes occur in a way that does not restructure the functions assigned to it, resulting in loss of motor and sensory function. Tissue engineering aims to develop new prognoses for this pathology, restoring the original functions of the spinal cord. One of the strategies already known for tissue regeneration is the incidence of electrical stimuli for adhesion and orientation during cell growth. In this study, a PVDF scaffold was developed, a structure covered with piezoelectric pillars that will, through movement, generate an electrical signal for the neuronal cells on its surface. This scaffold also has superparamagnetic nanoparticles in its constitution, which will allow the movement of the pillars through a magnetic field, which, in turn, gives rise to the electrical impulse. To this 4D scaffold, a hydrogel of oxidized sodium alginate covalently linked to RGD proteins, a biochemical factor that aids in cell attachment, was added to its surface. The hydrogel has the characteristic of degrading as cells proliferate and differentiate. Leading them to receive electrical stimuli when already fully differentiated. Magnetoelectric composites have the particularity of generating electric current from a magnetic stimulus, allowing this stimulus to be applied to the cells while the tissue regenerates. Several techniques were used to study this complex system, which denoted motion of the pillars by shear, the presence of the β phase in more than 80% of the compound, a percentage of ferrites of 9.1%, and growth in the proliferation assay greater than 25%. Through the use of electroactive scaffolds, it is intended to improve and innovate this treatment, with the use of in situ hydrogels and non-invasive electrical interactions, increasing cell viability, as well as controlling the differentiation and orientation of neuronal growth after implantation. Tissue engineering, Hydrogel, 3D Printing, Spinal Cord, Magnetoelectric composites vi Índice RESUMO ....................................................................................................................................................... IV ABSTRACT .................................................................................................................................................... V LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS .................................................................................................. VIII LISTA DE FIGURAS .................................................................................................................................... IX LISTA DE TABELAS ................................................................................................................................... XI 1.1 INTRODUÇÃO.................................................................................................................................. 2 1.2 OBJETIVOS ...................................................................................................................................... 3 1.3 ESTRUTURA DA TESE ................................................................................................................... 4 2.0 ENQUADRAMENTO TEÓRICO ..................................................................................................... 5 2.1 SISTEMA NERVOSO: MEDULA ESPINHAL ............................................................................................ 6 2.2 LESÃO TRAUMÁTICA DA MEDULA ESPINHAL ...................................................................................... 8 2.3 INTERVENÇÕES TERAPÊUTICAS NA LESÃO TRAUMÁTICA DA MEDULA ESPINHAL ..................................11 2.4 ENGENHARIA DE TECIDOS ................................................................................................................12 2.4.1 Propriedades dos scaffolds .........................................................................................................12 2.4.2 Hidrogéis ...................................................................................................................................16 2.5 BIOMATERIAIS ELETROATIVOS E BIORREATORES ...............................................................................17 2.5.1 Polímeros eletroativos ................................................................................................................17 2.5.2 Compósitos magnetoativos ..........................................................................................................19 2.6 ESTRATÉGIAS DE ENGENHARIA DE TECIDOS PARA REGENERAÇÃO DE MEDULA ESPINHAL: ESTADO DE ARTE. 21 3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................................25 3.1 PRODUÇÃO DOS PILARES ..................................................................................................................25 3.1.1 Impressão 3D dos moldes dos scaffolds .......................................................................................25 3.1.2 Síntese dos pilares eletroativos com e sem Fe3O4 ........................................................................25 3.2 PRODUÇÃO DO HIDROGEL ................................................................................................................26 3.2.1 Oxidação do Alginato de Sódio ...................................................................................................26 3.3 CARACTERIZAÇÕES DOS MATERIAIS .................................................................................................27 3.3.1 Microscopia eletrónica de varrimento .........................................................................................27 3.3.2 Goniómetro de ângulo de contato ...............................................................................................28 3.3.3 Teste de Absorção.......................................................................................................................28 3.3.4 Espectroscopía de infravermelhos transformada de Fourier – Reflexão total atenuada ................29 3.3.5 Calorimetria diferencial de varrimento .......................................................................................30 3.3.6 Magnetómetro de amostra vibratória ..........................................................................................31 3.3.7 Análise mecânica dinâmica .........................................................................................................32 3.3.8 Caracterização por Raios-X ........................................................................................................32 3.3.9 Inserção do fator bioquímico RGD no OSA .................................................................................32 3.3.10 Síntese do hidrogel de OSA/SA nos pilares ..............................................................................33 3.4 ENSAIOS CELULARES .......................................................................................................................33 3.4.1 Esterilização das amostras..........................................................................................................33 3.4.2 Cultura celular ...........................................................................................................................34 3.4.4 Proliferação celular....................................................................................................................35 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...........................................................................................................37 2 1.1 Introdução O termo engenharia de tecidos foi usado pela primeira vez em 1984, numa publicação que descreveu a organização de uma membrana semelhante ao endotélio na superfície de uma prótese oftálmica sintética de implante longo1. A origem do termo engenharia de tecidos e do conceito como o conhecemos hoje pode ser atribuído ao pioneiro da bioengenharia Y.C. Fung da Universidade da Califórnia em São Diego que liderou a apresentação de uma proposta mal sucedida em 1985 para um prémio do Programa de Centro de Pesquisa em Engenharia sob o título “Centro para a Engenharia de Tecidos Vivos”.2 A proposta foi apresentada novamente em 1987 numa conferência, o que despoletou um forte interesse no conceito dentro da NSF (National Science Foundation), e que levou a uma reunião especial sobre engenharia de tecidos no outono de 1987 e depois em 1988, a primeira reunião científica formal deste campo emergente. Nos dois anos seguintes, foram organizados um workshop e um simpósio que o ajudaram a estimular a literatura científica com este novo conceito2, que foi posteriormente publicado num artigo de revisão em 1993 por Robert Langer e Joseph Vacanti. Nessa altura, a engenharia de tecidos foi descrita como uma nova área que aplicava os princípios da biologia e da engenharia no desenvolvimento de substitutos biológicos que têm como objetivo restaurar, manter ou melhorar a função de um órgão/tecido.3 A partir de 1987, o número de investigadores a trabalhar na área de engenharia de tecidos cresceu substancialmente. Esse aumento deveu-se à entrada de investigadores recémformados no campo, mas também pelo facto de investigadores já estabelecidos começarem a reconhecer as suas linhas de trabalho existentes como engenharia de tecidos. Para além disso, com o alargamento do tema abrangido desta área, campos adjacentes relataram avanços que abordavam os principais desafios da engenharia de tecidos. Atualmente, a engenharia de tecidos é um mercado com um valor estimado de 9,2 mil milhões de euros, com uma perspetiva de crescimento de 12% até 2030 42. Está divido nas diferentes aplicações clínicas, nomeadamente: ortopédica e musculosquelética, neurológica, cardiovascular, pele e tecido tegumentar, dentes, entre outros. Apesar do rápido crescimento nos últimos 30 anos, a engenharia de tecidos ainda enfrenta algumas barreiras que impedem a sua funcionalidade total nos tecidos vivos, assim, novas estratégias emergentes são necessárias para fazer face aos obstáculos presentes, uma delas é o uso de materiais ativos. Os materiais ativos são materiais que alteram as suas propriedades físico-químicas em resposta a um estímulo externo específico, seja ele uma variação de temperatura, humidade ou pH, a presença de luz ou a aplicação de uma carga mecânica, campo elétrico ou magnético. 3 Assim, estes materiais caracterizam-se pela capacidade de, não só sentir o meio que os rodeia, como também de responder a estímulos provenientes do mesmo. Estes materiais têm sido cada vez mais usados na área da engenharia de tecidos, uma vez que estes podem fornecer diferentes tipos de estímulos, dependendo do tipo de material usado, como por exemplo estímulos elétricos e mecânicos. Esta abordagem tem demonstrado ser muito promissora, nomeadamente para aplicação em tecidos e/ou órgãos que no corpo humano estão sujeitos a este tipo de estímulos, nomeadamente o osso, musculo esquelético e cardíaco, e também os neurónios.4 As células do sistema nervoso são conhecidas pela sua capacidade de comunicação através de estímulos elétricos e químicos. Isto ocorre tanto entre neurónios como entre os nervos e as células musculares. Estímulos elétricos podem percorrer toda a extensão do corpo em menos de um segundo, induzindo contração muscular ou causando a libertação de substâncias para regular funções corporais. É, portanto, um fator importante e constante na comunicação entre o organismo e na função e desenvolvimento dos neurónios. Uma vez que eles reagem responsivamente a estímulos elétricos circundantes e direcionados, a abordagem de um compósito capaz de recriar um microambiente elétrico que forneça estes estímulos aparenta tornar-se em algo promissor. Assim, neste estudo, pretende-se desenvolver um compósito ME (transforma um estímulo magnético num elétrico e vice-versa) para a proliferação de neurónios e posteriormente para a regeneração da medula espinhal. 1.2 Objetivos O objetivo desta tese foi desenvolver um compósito ME biocompatível para reparação e regeneração da medula espinhal. Este compósito irá ser coberto com um hidrogel de degradação rápida para auxiliar a adesão durante a proliferação dos neurónios. Após a degradação do hidrogel, e durante a diferenciação, os neurónios estarão em contacto direto com o compósito ME, recebendo os estímulos elétricos diretamente. Todos os materiais utilizados terão de ser biodegradáveis ou biocompatíveis, bem como os subprodutos de degradação. Para alcançar este objetivo, será necessário: Desenvolver e caracterizar um novo tipo de compósito com pilares e nanopartículas de Fe3O4 por impressão 3D, para estimular as células neuronais. Caracterizar as amostras desenvolvidas quanto à sua magnetização, resistência mecânica, hidrofilicidade, composição química, absorção e finalmente os ensaios celulares. 4 Sintetizar e caracterizar um hidrogel de alginato de sódio oxidado com fatores bioquímicos para ajudar na proliferação e adesão celular. Testar a citotoxicidade do compósito desenvolvido e a sua influência em ensaios de proliferação celular. Segundamente, foi sintetizado um hidrogel de alginato de sódio oxidado, e ligado covalentemente a fatores bioquímicos de adesão celular. O objetivo do hidrogel é melhorar a adesão e viabilidade celular na fase de proliferação dos neurónios, para que após esta fase, o hidrogel degrade e os neurónios estejam em contacto com o compósito ME e recebam os estímulos elétricos para auxiliar e promover a diferenciação. 1.3 Estrutura da tese A tese está dividida em 5 capítulos. O primeiro capítulo contém uma contextualização do tema e do problema em questão, os objetivos e a estrutura da tese. No segundo capítulo aborda-se a constituição e as várias etapas da LTME, bem como uma introdução à engenharia de tecidos e as diversas estratégias nesta área para recuperar os tecidos totalmente ou parcialmente danificados. Contém também temas como a piezoeletricidade, o magnetismo de nanopartículas, funcionamento de biorreatores e o estado de arte de atuais soluções para a regeneração da medula espinhal. O terceiro capítulo contém a descrição dos materiais e métodos utilizados para a síntese e caracterização dos vários componentes do compósito criado. Contém também a explicação teórica de cada método e o processamento dos dados que serão depois apresentados no próximo capítulo. No quarto capítulo, são apresentados os resultados obtidos a partir da caracterização dos materiais e dos ensaios celulares. Para além disso, estes resultados são discutidos e comparados com o conhecimento pré-existente na literatura. O quinto capítulo finaliza com a conclusão de todo o trabalho realizado, bem como a sugestão de continuação do projeto em trabalho futuro. 5 Capítulo II: Enquadramento teórico 2.0 Enquadramento Teórico 6 2.1 Sistema Nervoso: Medula espinhal A medula espinhal está inserida no interior da coluna vertebral sendo um componente fundamental do sistema nervoso central. É uma estrutura cilíndrica alongada que se estende desde o nível do forame magno, através do canal vertebral, até a borda superior da primeira ou segunda vértebra lombar.5 A coluna vertebral está dividida em: 7 vertebras cervicais, 12 torácicas, 5 lombares e 5 sacrais, sendo finalizadas pelos ossos coccígeos, comumente denominado de cóccix.6 A medula espinhal tem uma superfície relativamente lisa com fissuras longitudinais nas faces anterior e posterior, percorridas por 31 emanações laterais regulares de pares de nervos dos dois lados da medula espinhal, designados de segmentações. A coluna vertebral apresenta apenas 30 vértebras interforaminadas. As segmentações estão presentes entre cada vértebra, no final do cóccix e na parte superior do atlas.3 O número de vértebras e segmentos da medula são iguais nos níveis torácico, lombar, sacral e coccígeo, mas, em vez dos sete esperados, são oito segmentos na coluna cervical (Figura 1). Existem duas regiões da medula espinhal que são aumentadas fusiformemente: a cervical e a lombar. Estas regiões são as que contêm mais matéria cinzenta na medula espinhal, devido ao maior número de nervos necessários para inervar os músculos. O alargamento FIGURA 1 - VISÃO LATERAL DA MEDULA ESPINHAL AO LONGO DAS VERTEBRAS DA COLUNA.2 7 cervical dá origem ao plexo braquial, que atende os membros superiores, enquanto o alargamento lombar dá origem ao plexo lombossacral, que tem a sua distribuição nos membros inferiores. O aspeto distal do cordão tem uma redução da sua espessura numa forma cônica chamada connus medullaris (Figura 2) abaixo do alargamento lombar, e o filium terminale desce da ponta do cone. Abaixo do nível da segunda vértebra lombar, onde termina a medula, as raízes nervosas continuam caudalmente e saem pelos forames intervertebrais. Este aglomerado descendente de raízes nervosas é denominado cauda equina.2 Uma vista transversal da medula espinhal demonstra uma matéria cinzenta em forma de 'H' cercada por uma substância branca (Figura 3). A matéria "H" cinzenta é constituída por células nervosas, axônios e dendritos, enquanto a matéria branca consiste em tratos axonais mielinizados e não mielinizados que percorrem longitudinalmente. Existem seis colunas, ou funículos, cada uma contendo os tratos motores ascendentes, sensoriais e descendentes. Essas colunas - os funículos anterior, lateral e posterior - são separadas lateralmente pelos sulcos póstero-laterais e ântero-laterais, ou sulcos, anteriormente pelo sulco mediano anterior e posteriormente pelo sulco mediano posterior.2 FIGURA 2 - VISÃO ANTERIOR DA MEDULA ESPINHAL AO LONGO DAS VERTEBRAS DA COLUNA.2 8 Existe proporcionalmente mais massa cinzenta nas seções lombossacrais porque a maior massa muscular nas extremidades inferiores requer maior inervação.2 Em contraste, há muito mais matéria branca vista em cortes cervicais devido à presença de fibras de conexão que abrangem todo o cordão, ligando todas as regiões do corpo com o cérebro. A substância branca da região lombossacra contém apenas fibras que atendem à extremidade caudal do cordão. Um exame atento da substância cinzenta mostra que ela é dividida em dez seções chamadas lâminas de Rexed. As lâminas posteriores desempenham um papel integral na receção e modulação sensorial, enquanto as lâminas anteriores ajudam a inervar os músculos.8 FIGURA 3 - CORTE TRANSVERSAL DA MEDULA ÓSSEA.2 A medula espinhal está protegida por 3 membranas, sendo estas: dura-máter, araquenóide, e pia mater, organizadas da mais exterior para a mais próxima da medula.2 2.2 Lesão traumática da medula espinhal A Lesão traumática da medula espinhal (LTME) é uma doença traumática desafiante que na maioria dos casos leva a perdas de funções motoras e sensoriais permanentes. Esta é uma doença difícil de tratar devido à presença de múltiplos mecanismos secundários.9 A LTME é caracterizada por um impulso traumático inicial resultando numa lesão mecânica nas membranas das células neuronais e da glia, rutura microvascular, desregulação iónica e sinalização pró-apoptótica.1 De seguida, é iniciada uma cascata de lesões secundárias que causam danos permanentes adicionais e disfunção neurológica. As lesões secundárias são divididas temporalmente em aguda, subaguda, intermédia e fase crónica. Durante a fase aguda (Figura 4a), a hemorragia e a disrupção da barreira hemato-espinhal expõem a medula a um 9 rápido influxo de células inflamatórias (como por exemplo, neutrófilos, macrófagos, etc.) e citocinas. A morte celular necrótica liberta trifosfato de adenosina (ATP, do inglês adenosine triphosphate), iões de potássio e DNA no microambiente circundante, ativando a microglia a libertar citocinas pró-inflamatórias adicionais e recrutar células inflamatórias periféricas.10,11 Os fagócitos eliminam os resíduos rapidamente, mas durante o processo, estes geram produtos citotóxicos, como espécies reativas de oxigénio (ROS do inglês reactive oxygen species) e nitrogénio, que produzem lesões celulares adicionais pela oxidação de proteínas, lípidos e DNA.12 10 FIGURA 4 – LESÃO TRAUMÁTICA DA MEDULA ESPINHAL: (A) FASE AGUDA (NAS PRIMEIRAS 48 HORAS); (B) FASE SUBAGUDA (ENTRE OS 2 E OS 14 DIAS); E (C) FASE INTERMÉDIA (ENTRE OS 14DIAS E OS 6 MESES) E CRÓNICA (APÓS OS 6 MESES).12 Durante a fase subaguda (Figura 4b), o edema progride, comprometendo o sistema vascular. As infiltrações de células inflamatórias aumentam a área de necrose, gerando microcavidades císticas à medida que as células e a arquitetura extracelular da medula são 11 danificadas. A morte dos neurónios e a falha na recaptação pelos astrócitos causam acumulação de glutamato no compartimento extracelular e excitotoxicidade dos neurônios próximos. A desregulação do cálcio, inflamação e isquemia contínua, adicionando-se ciclicamente ao microambiente citotóxico.12 As fases intermédia e crónica da LTME (Figura 4c) são caracterizadas pela dinâmica remodelação vascular, alterações na composição da matriz extracelular e reorganização dos circuitos neuronais locais e distais. A perda substancial do volume celular leva à criação de vácuo que por sua vez gera a formação de microcavitações císticas, que coalescem e se tornam uma barreira significativa à regeneração, migração celular e crescimento de axónios.13 Na região perilesional, os astrócitos proliferam e entrelaçam as suas ramificações na tentativa de conter a zona lesionada, tornando-se um potente inibidor da regeneração13. Astrócitos, pericitos e ependimócitos geram depósitos densos de proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPG do inglês chondroitin sulfate proteoglycans) como parte da cicatriz fibrosa, que se ligam a recetores leucocitários relacionados ao antígeno comum, como a proteína tirosina fosfatase (PTP do inglês protein tyrosine phosphatase).12 Isto ativa a GTPase RhoA e Rho associado à proteína quinase (ROCK), levando ao cone de crescimento axonal, colapso e falha regenerativa.12 De uma perspetiva sistémica, as lesões cervicais e torácicas altas podem produzir insuficiência respiratória e perda da inervação simpática cardiovascular, levando à hipotensão profunda.14,15 Isto pode agravar ainda mais a isquemia à medula. Além disso, a perda de inervação simpática aos órgãos linfáticos pode induzir uma imunodeficiência secundária, denominada paralisia imunológica, que aumenta a suscetibilidade dos pacientes a infeções.12 2.3 Intervenções terapêuticas na lesão traumática da medula espinhal Existem várias abordagens para o tratamento da LTME, sendo a principal a cirúrgica que consiste numa cirurgia para remoção de destroços e fluidos que poderiam agravar a pressão mecânica no local do trauma e assim aumentar a inflamação na medula, desta forma previne ou reduz as reações em cascata, diminuindo o volume da lesão.16 Outra abordagem é o uso da metilprednisolona, um fármaco com propriedades anti-inflamatórias que irá reduzir a ativação de macrófagos no local, e assim promover a redução da inflamação e aumentar a sobrevivência neuronal.30 Outros fármacos também já alcançaram os estudos clínicos, como é o caso da minociclina, um antibiótico que reduz a apoptose dos oligodendrócitos e da microglia, aumentando a regeneração neuronal.31 Todos estes métodos de tratamento visam a diminuição 18 Polímeros eletroativos são que exibem mudança no tamanho ou forma quando estimulados por um campo elétrico. Uma propriedade característica típica destes polímeros é que estes podem sofrer uma deformação substancial enquanto sustentam grandes forças.33,34 Estes podem ser divididos em polímeros eletroativos dielétricos e polímeros eletroativos iónicos. Os polímeros eletroativos iónicos funcionam através da movimentação dos iões no interior do polímero que, em alguns casos pode igualmente levar associada uma modificação mecânica do material (variação da rigidez ou deformação do material). Alguns exemplos são o fluido eletrorreológico16, polímero metal iónico17 e gel responsivo a estímulos.36 Os polímeros eletroativos dielétricos funcionam através das forças eletrostáticas entre dois elétrodos que comprimem o polímero, gerando assim alteração da sua forma, esta engenharia permite que o polímero se comprima em espessura e expanda em área aquando sob ação de um campo elétrico. Alguns exemplos deste tipo de engenharia são os polímeros ferroelétricos13, polímeros de enxerto eletrostrictivo38, polímeros cristalinos líquidos39 e polímeros piezoelétricos. Os polímeros piezoelétricos estão a ganhar uma grande importância devido ao seu enorme potencial de aplicação na área biomédica, geração e armazenamento de energia, monitorização e controlo, entre outras. De todos os polímeros piezoelétricos aquele que tem atraído mais atenção da comunidade científica, tecnológica e industrial é o PVDF devido às suas boas propriedades mecânicas, baixo preço, resistência a solventes, ácidos, calor e radiação. No entanto, as suas caraterísticas diferenciadoras mais relevantes, comparativamente com outros polímeros são a sua elevada resposta dielétrica, piezoelétrica, piroelétrica (criação de um potencial elétrico quando submetido a uma variação de temperatura) e ferroelétrica (polarização espontânea que pode ser invertida com a aplicação de um campo elétrico externo) o que lhe confere um elevado interesse científico e tecnológico. Este polímero plástico, existe em 5 diferentes conformações, sendo as 3 seguintes as mais abundantes: alfa, beta e gama. representadas na Figura 6. As diferentes conformações da cadeia deste polímero estão projetadas em zigue-zague num plano totalmente trans (TTTT) para a fase α, num plano TGTG (trans-gauche-transgauche), para a fase β e num plano T3GT3G para a fase λ.40 Assim cada cadeia, dependendo da fase cristalina em que está orientada, possui um momento dipolar com orientação e intensidade diferente. Aqui a fase β, apresenta um maior momento dipolar por unidade de polímero com o valor igual a 8×10−30Cm (Coulomb-metro).41 19 FIGURA 6 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA CONFORMAÇÃO EM CADEIA DAS FASES ΑLFA, BETA E GAMA DO PVDF.40 O PVDF gera um potencial elétrico quando deformado mecanicamente (e vice-versa) assim é importante que o estímulo mecânico seja fornecido de alguma forma. Para evitar o agravamento da lesão e como o paciente com a LTME estará imobilizado, um estímulo de forma indireta será o mais favorável. Desta forma, o estímulo magnético poderá ser a solução. 2.5.2 Compósitos magnetoativos Um compósito magnetoactivo é um material com inclusão de partículas magnéticas numa matriz (filme, gel ou outro tipo de scaffold), que permite, dependendo das características dessas partículas, a ativação através de campos magnéticos, de uma resposta mecânica denominados magnetomecânicos; de variações de dureza/viscosidade denominados magnetoreológicos; de movimentos iónicos denominados magnetoiónicos; de variações de condutividade denominados magnetoresistivos; de variações de temperatura; denominados magnetotérmicos ou da geração de potencial eléctrico denominados magnetoelétricos.64 Mas como funciona o magnetismo das nanopartículas? Quando o domínio das partículas diminui abaixo do diâmetro crítico, a coercividade dessas partículas torna-se zero e essas partículas tornam-se superparamagnéticas. O superparamagnetismo é influenciado por efeitos térmicos, e, por isso, quando nas partículas superparamagnéticas, as flutuações térmicas são fortes o suficiente para desmagnetizar espontaneamente um conjunto previamente saturado, essas partículas perdem a coercividade nula e não têm histerese magnética. As nanopartículas superparamagneticas magnetizam-se na presença de um íman/campo magnético externo, mas revertem para um estado não magnetizado quando o íman/campo magnético externo é removido. Isso evita um comportamento “ativo” das partículas quando não há campo aplicado. Como os óxidos de ferro (Fe3O4) é o mais 20 magnético de todos os minerais naturais da Terra, sendo por isso amplamente utilizado na forma de nanopartículas superparamagnéticas para todos os tipos de aplicações biológicas.44 FIGURA 7 – COMPORTAMENTO DAS NANOPARTÍCULAS DE FERRO E SUPERPARAMAGNÉTICAS NA PRESENÇA E AUSÊNCIA DE CAMPO EXTERNO A) REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DA COERCIVIDADE EM RELAÇÃO AO TAMANHO DA NANOPARTÍCULA44 Como se pode observar na figura 7a), na ausência de um campo magnético externo, os domínios de uma nanopartícula ferromagnética e superparamagnética encontram-se desalinhados. Quando o campo é aplicado o momento magnético das nanopartículas superparamagnéticas e ferromagnéticas de domínio único alinham-se com o campo aplicado. Quando voltamos a remover o campo magnético, as nanopartículas ferromagnéticas mantêm uma magnetização líquida, enquanto que as nanopartículas superparamagnéticas não exibem magnetização líquida devido à rápida reversão do momento magnético. Na figura 7b) também é possível observar a relação entre o tamanho das nanopartículas e as estruturas do domínio magnético. Ds e Dc representam os limites do superparamagnetismo e de tamanho crítico, respetivamente, ou seja, a partir do qual a partícula deixa de ter um único domínio e o tamanho em que passa a conter múltiplos domínios que se mantêm uns aos outros na ausência de campo externo. 21 2.6 Estratégias de engenharia de tecidos para regeneração de medula espinhal: Estado de arte. Os implantes de biomateriais têm como função reparar ou substituir a estrutura anatómica de tecidos ausentes ou danificados por meio das características morfológicas dos biomateriais contendo moléculas biológicas. Alguns exemplos de polímeros piezoelétricos biodegradáveis são polímeros de origem natural como o colagénio, celulose, quitina, quitosano, fibrina e amilose. No entanto, o coeficiente piezoelétrico destes polímeros atinge no seu limite 2 pC/N. Para aumentar este estímulo, polímeros sintéticos são também uma opção, como por exemplo o PVDF e o Poli(fluoreto de vinilideno-trifluoroetileno) (P[VDF-TrFE]. Estes polímeros eletroativos dielétricos demonstraram resultados promissores sob a forma de fibras in vitro45e in vivo4; assim como aplicação de filmes onde foram estimulados por oscilação46 ou por ultra-sons47 in vitro. Estes materiais são pouco citotóxicos e apresentam um coeficiente piezoelétrico de 24 pC/N e 38 pC/N para o PVDF e o P(VDF-TrFE), respetivamente. O PVDF e os seus co-polímeros estão amplamente estudados, filmes de PVDF revestidos com Poly-D-Lysine (PDL), e estimulados com 50 Hz de oscilação, demonstraram um aumento de 116% no número de ramificações de neurites, em células PC12, os números de terminais e processos também aumentaram 84 e 79%, respetivamente.46 Fibras de P(VDFTrFE) revestidas com matrigel demonstraram um maior número de células, neurites mais longas e maior mielinização, em células de Schwann (SCs) e explantes do gânglio da raiz dorsal (DRG).32 Estudo de micropilares de PVDF não foram encontrados em literatura, pelo que é uma morfologia inovadora nesta área. Nanopartículas também são conhecidas por aumentar o efeito magnetoelétrico de diferentes polímeros.48 Nanopartículas de óxido de ferro demonstraram resultados na destruição de biofilmes em bactérias, estas, conseguem penetrar nos biofilmes, enquanto os antibióticos não, sob um campo magnético para destruir e matar bactérias.49 Estas podem ser interiorizadas no interior de polímeros plásticos50 ou hidrogéis63 e gerar microambientes eletroatívos para células musculares, esqueléticas50 A combinação destas partículas com PVDF e P(VDF-TrFE) já foi realizada mas para outras morfologias51 onde se demonstrou que é possível fornecer estímulos mecanoelétricos às 22 células, como por exemplo células-tronco mesenquimais74 e pré-osteoblastos75 com crescimentos acima dos 25%. Apesar do progresso no uso de nanopartículas nos últimos dois anos, o verdadeiro potencial das aplicações das nanopartículas na resolução dos problemas atuais em engenharia de tecidos ainda não foi realizado.48 O objetivo de um scaffold é unir a medula espinhal danificada para que os pacientes possam recuperar a função motora e sensorial. Existem já vários estudos de matrizes poliméricas direcionadas para este sentido, nomeadamente: - QL6: QL6 é um material natural, peptídico e biodegradável com pH neutro, que é solúvel em água e se auto-monta numa conformação semelhante a uma rede em escala nanométrica in vivo, ou seja, é um material in situ. QL6 demonstra um efeito neuroprotetor na LTME e pode ser administrado antes ou com células-tronco neuronais para aumentar a sobrevivência do enxerto, reduzir a inflamação e a cicatriz glial e melhorar a função motora em modelos de pequenos animais.1 - Hialuronano/metilcelulose: Hialuronano/metilcelulose (HAMC) é um polímero injetável e biodegradável que é capaz de suportar o enxerto de células tronco neuronais e oligodendrócitos na LTME para aumentar a recuperação funcional. O polímero também pode ser modificado para fornecer fatores de crescimento (por exemplo, PDGF-AA (fator de crescimento derivado de plaquetas), pequenos péptidos ligantes (por exemplo, RGD, conhecido por aumentar a adesão celular21) e fármacos degradantes da cicatriz glial (por exemplo, condroitinase ABC, que irá catalisar as ligações de proteoglicanos de sulfato de condroitina CSPGs que são sobre expressas pelas células da glia.22 Existem também estratégias de engenharia de tecidos já em estudo clínico, nomeadamente: - INSPIRE—Neuro-Spinal Scaffold: O polímero é composto por poli(ácido lático-glicólico) covalentemente conjugado com poli-L-lisina e é projetado para favorecer interações célulamaterial. Foi demonstrado que o scaffold do polímero com células-tronco neuronais melhora a recuperação funcional em modelos de hemissecção de animais.24 Um estudo clínico de fase II avaliou a segurança e a viabilidade da implantação deste scaffold dentro das primeiras 96 horas após a lesão, ou seja, na fase aguda e subaguda. Foram denotadas melhorias significativas na função motora e sensorial, bem como desaparecimento da dor neuropática.23 23 - NeuroRegen scaffold de apo-colagénio de bovino: Um scaffold natural xenogénico, preparado através da aponeurose de bovino para formar filamentos, folhas ou tubos para crescimento neuronal, com boa biocompatibilidade e direcionamento de crescimento dos axónios.3 Este scaffold foi implantado com células-tronco mesenquimais (MSC do inglês mesenchymal stem cells) num estudo clínico de fase II com 8 pacientes na fase crónica da LTME, ou seja, com mais de 6 meses após a lesão. 1 ano após a implantação do scaffold, foi verificada uma expansão da área sensorial e motora, nomeadamente atividade dos dedos, aumento da estabilidade do tronco, sensação de defecação e recuperação da função neural autónoma.20 Através desta análise bibliográfica, verificou-se que existem estudos que confirmam a adequabilidade dos estímulos provenientes de materiais eletroatívos na modulação do comportamento de células. No entanto, não foram encontradas informações relativas à aplicação de estímulos MEs através de micropilares. Por isso, o principal foco desta dissertação é o desenvolvimento de uma plataforma ativa com estímulos gerados pelos micropilares e verificar se estes podem auxiliar a regeneração saudável de neurónios. 24 Capítulo III: Materiais e Métodos 25 3. Materiais e métodos 3.1 Produção dos pilares 3.1.1 Impressão 3D dos moldes dos scaffolds Foram desenvolvidos três modelos 3D para os moldes do scaffold com o uso do software Autodesk Fusion 360, Prusa Slicer 2.4.1. Os parâmetros do ficheiro G-code para as grelhas, incluíam uma altura de 1,5 mm, com uma densidade de preenchimento de 20%. Os micropilares foram contruídos com um filamento de Polivinil álcool (PVA, Verbatim) na Original Prusa i3 MK3S+ 3D printer com um bocal de 0.25 mm para as grelhas e de 0.4 mm para as restantes peças. Foi construída também uma caixa de reforço de poli-ácido lático (PLA do inglês PoliLactic Acid) para dar resistência à estrutura dos moldes. As peças construídas, dispostas na Figura 6, foram montadas manualmente no molde final. FIGURA 8 – ESQUEMA DE SÍNTESE DOS PILARES DE PVDF 3.1.2 Síntese dos pilares eletroativos com e sem Fe3O4 Micropilares de controlo: Para a escolha do melhor polímero foram feitas três tentativas: a primeira com PLLA (Merck) numa concentração de 10% em Diclorometano (DCM, Fisher Chemical), fabricado da seguinte forma: 26 Foi dissolvido PLLA (Merck) numa concentração de 10% em DCM. sob agitação magnética (200 rpm) durante 3 horas. Após a dissolução total do polímero, este foi injetado dentro dos moldes com o auxílio de uma seringa de plástico de 10 mL, com uma agulha de diâmetro interno de 0.16 mm (Nordson, EFD). Após verificar a polimerização do composto, estes foram colocados num gobelé de 1 L com água, durante 48 horas para a dissolução do PVA. Os moldes foram retirados da caixa de reforço com um bisturi e uma pinça, e deixados a secar à temperatura ambiente. (Figura 8). Na segunda tentativa foram usados os polímeros PLLA (Merck) e Estireno-EtilenoButileno-Estireno (SEBS do inglês Styrene-Ethylene-Butylene-Styrene, CHIYUAN) em frações 1:1, numa concentração de 10% de DCM, com o mesmo procedimento descrito acima; Para a última tentativa, foi utilizado o PVDF 6010 (Solvay) em dimetilformamida (DMF, Fisher Chemical) sob agitação magnética (200 rpm) durante 3 horas, após o polímero estar dissolvido, seguiu-se o mesmo procedimento descrito acima. Micropilares magnéticos: Foram dispersas primeiramente as ferrites ferromagnéticas (Fe3O4, Nanostructured & Amorphous Materials Inc.) em DMF numa concentração de 0.01 g/mL, e colocadas num sonicador durante 90 minutos. De seguida, foi adicionado o PVDF com uma concentração de 0.15 g/mL, e a amostra foi agitada mecanicamente durante 7 horas. Após este processo foi realizada a injeção nos moldes, dissolução do PVA e o processo de secagem, como descrito anteriormente para as amostras de PVDF. 3.2 Produção do hidrogel 3.2.1 Oxidação do Alginato de Sódio Preparou-se 100 mL de uma solução de alginato de sódio (Fisher Chemical) 1% (w/v). A essa solução foram adicionados gota a gota de uma solução de periodato de sódio (SigmaAldrich) [0,5M], perfazendo um volume total de 5 mL, sob agitação e ausência de luz. Após 24 horas, foram adicionados 2 mL de etilenoglicol (Sigma-Aldrich) para cessar a reação. Após 2 horas, a solução foi colocada em bolsas de diálise e a água foi substituída várias vezes ao longo de 3 dias. A solução foi por fim colocada a -80 ºC e após uns dias, liofilizada. 27 3.3 Caracterizações dos materiais 3.3.1 Microscopia eletrónica de varrimento O microscópio eletrónico de varrimento (SEM do inglês scanning electron microscopy) é constituído por uma fonte de eletrões, lentes eletromagnéticas e um detetor de eletrões secundários. Usa um feixe de eletrões em vez de luz, que é focado na amostra através das lentes eletromagnéticas que irá incidir na amostra. A amostra, por sua vez, emite eletrões secundários que são detetados quantitativamente. O número de eletrões emitidos depende da topografia da amostra, assim com as variações no número de eletrões detetados é possível construir o perfil topográfico58 (Figura 9). FIGURA 9 - IMAGEM ILUSTRATIVA DA CONSTITUIÇÃO DO MICROSCÓPIO ELETRÓNICO DE VARRIMENTO.20 As amostras foram preparadas com revestimento de ouro com cerca de 20 nm de espessura numa Quorum Emitech K550 Sputter Coater. De seguida, foram visualizadas no equipamento Hitachi S-4800 SEM com uma voltagem de 15 kV nas diferentes ampliações. Procedeu-se depois às medições dos pilares através do programa ImageJ. 34 através de radiação Ultravioleta (UVs) durante 3 horas, (1 hora e meia em cada lado). Por fim, as amostras foram sujeitas a 5 lavagens durante 5 minutos, cada com uma solução tampão de fosfato alcalino (PBS, do inglês, Phosphate-Buffered Saline, Biochrom) a 1%. 3.4.2 Cultura celular As células de neuroblastoma SH-SY5Y foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco/mistura de nutrientes F-12 Ham (DMEM/F-12 (1:1), Pan Biotech) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Biochrom) e 1% de penicilina/estreptomicina (P/S, Biochrom). As células foram semeadas em frascos de cultura de 75 cm2 a 37 ºC sob ar humidificado a 95% e atmosfera de 5% de CO2. O meio cultivado foi trocado a cada dois dias e quando as células atingiram cerca de 60-70% de confluência foram separadas com 0,05% de tripsina-EDTA (Biochrom). 3.4.3 Ensaio de citotoxicidade A avaliação da citotoxicidade das amostras produzidas foi realizada numa abordagem de contacto indireto, de acordo com os padrões descritos na norma ISO 10993-5. Para isso, os pilares previamente esterilizados foram colocados numa placa de cultura celular de 24 poços de poliestireno em contacto com DMEM Hans F-12 (1:1) e incubada sob condições de cultura (37 °C e 95% de ar humidificado contendo 5% CO2) por 24 horas. Ao mesmo tempo, as células SH-SY5Y foram semeadas numa placa de 96 poços de poliestireno com uma densidade de 3,0 x 104 células/mL e incubadas por 24 horas para permitir a adesão celular. Após 24 horas, o meio de cultura da placa de 96 poços foi removido e substituído por 100 μL por poço de meio extraído da placa que continha os scaffolds. De seguida, as células foram incubadas durante 72 horas nas mesmas condições. Após esse período, o número de células viáveis é quantificado pelo método de brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5difeniltetrazólio (MTT, Sigma Aldrich). Para isso, o meio em contacto com as células é retirado e substituído por uma solução de MTT (5 mg/mL de MTT dissolvido em DMEM na proporção de 1:10) e incubado no escuro a 37 °C por 3 horas. Depois disso, a solução de MTT é removida e o formazano precipitado dissolvido em 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) por cada poço. A quantificação é feita através da medição da absorvância a 570 nm, retirando a absorvância a 690 nm (absorvância correspondente da placa), usando um leitor de placas espetrofotométrico (Infinite M Plex, TECAN). 35 Todos os resultados foram obtidos a partir de 4 réplicas por cada amostra e analisados como a viabilidade média ± desvio padrão. A percentagem da viabilidade celular foi calculada através da equação 5 em que o controlo positivo representa as células nos poços que continham apenas o meio de cultura. O controlo positivo representa as células cultivadas apenas com meio e o controlo negativo as células cultivadas com meio e DMSO. 𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 (%) = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑣â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑎 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑣â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑜 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜 ×100 (5) 3.4.4 Proliferação celular Uma suspensão celular foi preparada para semear 10x104 celúlas/mL no topo de cada amostra. As placas de cultura foram incubadas nas mesmas condições de crescimento mencionadas anteriormente por 24 horas para permitir a adesão celular. O ensaio de resazurina foi realizado em ambos os momentos para avaliar a viabilidade celular. Para isso, foi adicionada solução de resazurina 3,14 𝑚𝑔/𝑚𝐿 ao meio celular e incubada por 6 horas numa concentração de 10%. A fluorescência foi medida (560 nm de excitação e emissão 590 nm) num leitor de microplacas (Biotech Synergy HT). A forma reduzida, resorufina, é rosa e altamente fluorescente, e a intensidade da fluorescência produzida é proporcional ao número de células vivas que respiram. Assim age como um indicador direto da saúde celular, deteta o nível de oxidação durante a respiração, medindo quantitativamente a viabilidade celular e a citotoxicidade.65 36 Capítulo IV: Resultados e Discussão 37 4. Resultados e discussão 4.1 Microscopia eletrónica de varrimento Na otimização dos pilares vários polímeros foram testados, nomeadamente os de PLLA, os de PLLA+SEBS, os de PVDF Grandes e Pequenos, e finalmente os de PVDF+Fe3O4 Grandes e Pequenos (Figura 15). Nos resultados com o PLLA denota-se apenas a formação de uma base opaca, os pilares formados eram frágeis e quebradiços, partindo-se ao longo do processo. Para melhorar a maleabilidade e resistência no processo de síntese, foi misturado PLLA e SEBS, um polímero com propriedades elásticas, usualmente com um comportamento semelhante ao de uma borracha, é frequentemente usado como modificador de impacto, flexibilizador ou endurecedor.64 Os pilares obtidos desta mistura de polímeros foram significativamente melhores. Foi possível verificar a presença de pilares, alguns partidos, outros com uma estrutura oca e inconsistente, no entanto ainda há lugar para otimizações. O PVDF é um polímero com propriedades piezoelétricas e uma boa maleabilidade e resistência, os resultados com este polímero foram substancialmente melhores, uma vez que os pilares obtidos são sólidos e têm uma estrutura consistente. FIGURA 15 - IMAGENS RETIRADAS POR SEM DOS PILARES DE: A) PLLA AMPLIADO 27X, B) PLLA+SEBS AMPLIADO 42X, C) PVDF PEQUENOS AMPLIADO 200X, D) PVDF GRANDES AMPLIADOS 100X, E) PVDF GRANDES COM FE3O4, E F) PVDF PEQUENOS COM FE3O4. 38 Quatro amostras diferentes foram sintetizadas e caracterizadas, nomeadamente, pilares de PVDF grandes e pequenos, pilares de PVDF com Fe3O4 grandes e pequenos. Os pilares pequenos após a síntese foram secados ao ar, onde perdem toda a água na sua constituição ficando pequenos, enquanto que os grandes, foram colocados numa caixa de petri fechados preservando a humidade e a água na sua constituição. Das imagens obtidas foram retiradas as medidas de altura dos pilares, largura da superfície e espaçamentos entre os pilares (Figura 16). Ao analisar os resultados, é possível verificar de uma forma geral que os pilares grandes não apresentam a distinção esperada dos pilares pequenos (maior altura, maior espaçamento e maior largura superficial). Isto deve-se ao facto do maior tamanho dos pilares pela presença de água no seu interior. Durante o processo de vácuo anterior ao SEM, a humidade do ar é extraída, o que por sua vez desidrata os pilares, este processo é contínuo até o vácuo desejado ser atingido, no qual os pilares já perderam toda a água na sua constituição e, portanto, acabam por não ser analisados no seu tamanho original. Verificando a altura dos pilares pequenos com e sem ferrites é possível verificar que o tamanho é muito semelhante e que não existem diferenças significativas na altura dos pilares. Nos pilares grandes, as diferenças são bastante significativas. O processo de secagem acelerado do vácuo, absorve toda a água em apenas alguns minutos, podendo ficar mais massa na base ou nos pilares. No caso das amostras medidas, a magnética teve uma maior perda de massa na zona da base, dando um maior tamanho aos pilares, enquanto na amostra de controlo, o oposto aconteceu, os pilares diminuíram aproximando-se da base. A largura da superfície dos pilares pequenos de PVDF com ferrites (260 ± 21 μm) e sem ferrites (276 ± 25 μm) apresenta, como esperado, uma diferença inferior ao desvio padrão, o que também não é um desvio significativo. Nas medidas de largura superficial dos pilares grandes, a amostra magnética apresenta uma largura maior do que a amostra de controlo, o que está em concordância com a altura dos pilares. Os que ficaram mais altos, ficaram também com FIGURA 16 - REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DA: A) ALTURA, B) LARGURA E C) ESPAÇAMENTO MÉDIO DOS PILARES DE PVDF. 39 uma maior área superficial, enquanto os que perderam massa, perderam altura e área de superfície, resultando num volume total menor. Verificando o espaçamento entre os pilares, é possível observar que os pequenos estão em concordância, os magnéticos com 188 ± 48 μm e os de PVDF com 194 ± 37 μm. As amostras grandes, por sua vez, têm um maior espaçamento do que as amostras pequenas estando as amostras magnéticas (295 ± 81 μm), semelhantes às de controlo (307 ± 40 μm). FIGURA 17 - IMAGENS RETIRADAS POR SEM, AMPLIADAS 1500X, DOS PILARES DE PVDF DESENVOLVIDOS: A) GRANDES MAGNÉTICOS E B) GRANDES DE CONTROLO. Na figura 17, obtida sem a deposição de ouro, é possível verificar a presença de uns pontos brilhantes o que provavelmente indica a presença dos óxidos de ferro na área superficial dos pilares magnéticos. Nas imagens dos pilares de controlo ampliadas 1500x denota-se a estrutura plástica do PVDF e a ausência de ferrites. 40 4.2 Goniómetro de ângulo de contacto A afinidade dos pilares à água foi analisada pelo ângulo de contacto e os resultados obtidos apresentados na Figura 18. É possível verificar que os pilares pequenos de controlo apresentaram um ângulo de contacto de 104 ± 11º, enquanto nas amostras pequenas magnéticas denotou-se uma melhor afinidade à água, com um ângulo de contacto de 93 ± 12º. Assim, os resultados indicam que ambas as amostras são hidrofóbicas. Nas amostras grandes de controlo e magnéticas, não se formou um ângulo de contacto, uma vez que a gota de água era absorvida imediatamente para o interior dos pilares. Isto poderá dever-se à quantidade de água que está presente no interior do pilar, isso faz com que a gota seja imediatamente absorvida. Controlo Magnético 80 85 90 95 100 105 110 115 120 Ângulo de contacto FIGURA 18 GRÁFICO REPRESENTATIVO DO ÂNGULO DE CONTACTO DOS PILARES PEQUENOS DE CONTROLO E MAGNÉTICOS. 41 4.3 Teste de Absorção Dada a hidrofobicidade dos pilares pequenos de PVDF de controlo e magnéticos, é necessário perceber se os pilares são molháveis pelo meio de cultura celular. Assim, um teste de absorção foi realizado para verificar se após a submersão os pilares irão alterar o seu grau de molhabilidade e absorver a água (figura 19). Na figura 19 é possível perceber que em 24 horas os pilares pequenos de controlo e magnéticos absorveram água e cresceram em volume. No caso dos pilares magnéticos denotou-se um crescimento de 10.4%, semelhante aos de controlo com um crescimento de 15.7%. FIGURA 19 - GRÁFICO DE BARRAS DO TESTE DE ABSORÇÃO DOS PILARES PEQUENOS DE CONTROLO E MAGNÉTICOS. MI É A MASSA INICIAL E MF A MASSA FINAL. 42 4.4 Magnetómetro de amostra vibrante Para determinar as propriedades magnéticas das amostras, o VSM foi executado (Figura 20). FIGURA 20 - GRÁFICO DE SCAN DE VSM DOS PILARES MAGNÉTICOS PEQUENOS. Na Figura 20 é possível verificar que os limites -10000 Oe e 10000 Oe são o campo no qual as nanopartículas atingem a magnetização de saturação, ou seja, a partir do qual não é possível aumentar mais a magnetização da amostra. A coercividade detetado na imagem por ampliação está compreendido entre os valores de 50 e -50 Oe, um intervalo insignificativo visto que a resolução usada é de 200 Oe, e, portanto, denota-se a ausência de uma curva de histerese, característica das partículas superparamagnéticas. Na Figura 21 está representada a curva de magnetização de 1 g de partículas de Fe3O4. O campo de saturação é atingido aos 47 emus. De acordo com esta informação é possível determinar a concentração de nanopartículas no compósito magnético através da equação 6. 43 FIGURA 21 - GRÁFICO D SCAN DE VSM DAS NANOPARTÍCULAS DE FE3O4. Fe3O4 𝑤𝑡. %𝑐𝑜𝑚𝑝ó𝑠𝑖𝑡𝑜 =100×4.296 47 = 9,1% (6) A concentração de nanopartículas no compósito magneto-elétrico corresponde a 9.1%, valor que corresponde ao esperado visto que o compósito foi produzido com 10% de nanopartículas. A ligeira diferença (entre a concentração esperada e a real) pode ser resultante da perda residual de vestígios de nanopartículas durante o processo de síntese. 50 amostra, que conferem rigidez ao compósito. É de notar também que a força de amplitude, mantêm-se em 1 N durante todo o ensaio, o que é também um indicativo da rigidez do compósito eletromagnético. A B C D FIGURA 26 - GRÁFICOS DE ANÁLISE POR DMA DE: (A) CONTROLO GRANDE, (B) CONTROLO PEQUENO, (C) MAGNÉTICO GRANDE, E (D) MAGNÉTICO PEQUENO. 4.9 Citotoxicidade Para os ensaios celulares os compósitos de pilares foram esterilizados por raios UV. De salientar que estes raios não penetram na água, ou em amostras contendo água na sua 51 constituição, pelo que apenas as amostras pequenas prosseguiram para a fase dos ensaios celulares. Assim, foi realizado primeiro o ensaio de citotoxicidade às amostras pequenas produzidas onde foram usadas 4 réplicas por cada tipo de amostra (figura 27). FIGURA 27 - VIABILIDADE CELULAR OBTIDA ATRAVÉS DO ENSAIO DE CITOTOXICIDADE COM AS CÉLULAS SH-SY5Y EM CONTACTO COM O MEIO EXPOSTO ÀS DIFERENTES AMOSTRAS. De acordo com a ISSO 10993-5 as amostras são classificadas como não citotóxicas, quando apresentam uma viabilidade celular acima dos 70%. Sabe-se que o PVDF é não tóxico e biocompatível76 e que baixas quantidade de ferrites também demonstraram não ser tóxicas77, com este ensaio confirma-se a sua não toxicidade. Todas as amostras passaram no teste em conjunto com o controlo positivo que representa as células apenas no meio celular. O controlo negativo representa as células com meio e DMSO, e apresenta uma viabilidade celular abaixo dos 5% como expectável. 4.10 Proliferação O estudo de proliferação foi realizado em condições estáticas nas amostras de micropilares pequenos de PVDF e de PVDF+Fe3O4 (Figura 28). Este estudo foi feito através do ensaio da resazurina. Olhando para os resultados é possível verificar que houve uma 52 proliferação celular em todas as amostras 24 horas após a adesão celular. No controlo denotouse um aumento de 38% de células vivas, nos pilares de PVDF (pilares de controlo) um aumento de 41%, e nos pilares de PVDF+Fe3O4 as células cresceram 27%. Denota-se um crescimento mais lento nas amostras com ferrites, provavelmente devido à presença das ferrites que são desfavoráveis a um crescimento mais rápido no ensaio estático. Também se poderá dever ao facto de as ferrites alterarem a rigidez do material o que poderá afetar a afinidade e proliferação das células. FIGURA 28 - AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO NA PROLIFERAÇÃO CELULAR DAS 24 ÀS 48 HORAS NAS AMOSTRAS DE PILARES MAGNÉTICOS E DE CONTROLO (CÉLULAS EM CONTACTO COM O POÇO DE POLIESTIRENO). Uma vez que ambos os pilares produzidos demonstraram promover a proliferação celular, o próximo passo será submetê-los a ensaios dinâmicos (através da utilização de um biorreator magnético) de forma a fornecer às células estímulos mecano-elétricos. Assim, a utilização de esta nova plataforma de pilares parece ser uma abordagem promissora para fornecer estímulos mecano-elétricos às células neuronais. 53 Capítulo V: Conclusões e Trabalho Futuro 5. Conclusões e trabalho futuro 54 5.1 Conclusões Neste trabalho foi sintetizado com sucesso um novo scaffold, composto por PVDF e alginato de sódio oxidado, covalentemente ligado a RGD para crescimento neuronal. Este scaffold está dividido num compósito magneto-elétrico e num hidrogel. O novo compósito magneto-elétrico construído com PVDF com 80% de fase β apresenta-se sob a forma de pilares orientados verticalmente recheados no seu interior com nanopartículas de Fe3O4 que irão promover o movimento dos pilares e assim dar o estímulo elétrico aos neurónios mimetizando o ambiente natural do corpo humano. Estes micropilares foram caracterizados quanto à sua morfologia, cristalinidade, composição química, hidrofilicidade, absortividade, resistência mecânica e citotoxicidade, para verificar a qualidade do compósito, bem como a sua funcionalidade mecanicamente e em células. Foi possível verificar que os compósitos produzidos não apresentam nenhuma citotoxicidade e promovem a proliferação celular de células SH-SY5Y. Assim, é possível concluir que durante este trabalho foi criado um novo compósito, com potencial para fornecer estímulos magneto-elétricos de forma a mimetizar o organismo e potenciar o crescimento de células neuronais. Este compósito apresenta potencial também para crescimento de outras linhas celulares que detetem os estímulos elétricos como vantajosos para o seu desenvolvimento, como por exemplo, de mioblastos e osteoblastos. O compósito de PVDF também poderá ser usado para funcionar como um pequeno biorreator. Apesar do seu tamanho reduzido, tem potencial para fornecer estímulos elétricos ao ambiente evolvente de forma a promover o desenvolvimento celular. Assim, ao adicionar um pequeno íman com moção, serviria como um microbiorreator. 5.2 Trabalho Futuro A engenharia de tecidos sugere que um antigo sonho, ‘a substituição de partes do corpo humano’, pode ser realizado. Embora qualquer cientista sóbrio e reflexivo entenda o longo caminho para o sucesso desta ideia, a nossa sociedade está no caminho para a concretização dessa possibilidade. Dito isto, para o trabalho futuro sugere-se mais caracterizações celulares como é o caso da expressão genética, mutagenicidade e teratogenicidade das células Sh-sy5y e de outras linhas celulares até, por fim chegar aos ensaios em animais. 55 É relevante iniciar ensaios de proliferação dinâmicos nas mesmas condições dos estáticos de forma a verificar experimentalmente o efeito dos estímulos ME nas células neuronais. Recomenda-se também a adição de ensaio de proliferação estáticos e dinâmicos no hidrogel de alginato de sódio oxidado juntamente com o compósito para verificar a eficácia do scaffold como um todo. Em termos de otimização do compósito pode-se otimizar o tamanho dos pilares, tornálos mais pequenos com o mesmo método através de uma impressora 3D de maior precisão/resolução, ou investigar outro método para uma morfologia mais favorável. Testes de proliferação com diferentes concentrações de nanopartículas de óxidos de ferro, para verificar qual a concentração mais favorável no desenvolvimento celular. Otimização dos ciclos de estímulos magnetelétricos no biorreator, os ciclos utilizados foram com base em estímulos de mio e osteoblastos. Sendo as células neste estudo, neuronais, poderá haver uma necessidade de aumentar a frequência ou a intensidade dos estímulos. Testes de degradação do hidrogel e sua otimização, consoante os estímulos magnetoelétricos e a proliferação celular para uma degradação completa durante a fase de proliferação celular no scaffold. Construir um pequeno suporte com um íman movível e verificar as potencialidades deste compósito como um biorreator. 56 Bibliografia 1Wolter JR, Meyer RF. Sessile macrophages forming clear endothelium-like membrane on inside of successful keratoprosthesis. Transactions of the American Ophthalmological Society. 1984;82:187 2Viola J, Lal B, Grad O (14 October 2003). 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