Valoración del tratamiento con sellantes biológicos y terapia celular en la prevención de la fístula broncopleural en un modelo experimental in vivo

TÍTULO DE LA TESIS “VALORACIÓN DEL TRATAMIENTO CON SELLANTES BIOLÓGICOS Y TERAPIA CELULAR EN LA PREVENCIÓN DE LA FÍSTULA BRONCOPLEURAL EN UN MODELO EXPERIMENTAL IN VIVO” Tesis Doctoral presentada por: D. PEDRO ROLANDO LLONTOP SANTISTEBAN Dirigida por los doctores: Dr. Norberto Santana Rodríguez. Dr. Leandro Fernández Pérez. Dr. Bernardino Clavo Varas. El Director, El Director, El Director, El Doctorando, (firma) (firma) (firma) (firma) Las Palmas de Gran Canaria a, 14 de Mayo de 2010 UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA INSTITUTO UNIVERSITARIO DE SANIDAD Y SEGURIDAD ALIMENTARIA PROGRAMA DE DOCTORADO: SANIDAD ANIMAL Con todo el sentimiento de amor más puro que puede brotar de mi ser… para mi querida familia: Pedro, Elsa, Maricelly, Fernando, César, Annie, Primi, Lela y Esther. “La llave del éxito en la vida es el conocimiento del valor de las cosas”. O'Reilly. Barranco de la Ballena, Sn 35010 – Las Palmas de Gran Canaria Telf.: 928 45 00 00 NORBERTO SANTANA RODRÍGUEZ, DOCTOR EN MEDICINA CON INTENSIFICACIÓN PARA LA ACTIVIDAD INVESTIGADORA EN EL SISTEMA NACIONAL DE SALUD DEL MINISTERIO DE SANIDAD Y CONSUMO, INSTITUTO DE SALUD CARLOS III. CERTIFICA: Que el trabajo de investigación titulado “Valoración del tratamiento con sellantes biológicos y terapia celular en la prevención de la fístula broncopleural en un modelo experimental in vivo” ha sido realizado por D. PEDRO ROLANDO LLONTOP SANTISTEBAN, en la Unidad de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín y en el Laboratorio de Farmacología de la Universidad de las Palmas de Gran Canaria, bajo mi dirección y asesoramiento, una vez revisada la presente memoria la encuentro apta para su defensa como Tesis Doctoral, para optar al grado de doctor. Y para que así conste y surta los efectos oportunos extiendo el presente certificado, en Las Palmas de Gran Canaria a siete de abril de dos mil diez. Fdo.: Norberto Santana Rodríguez Barranco de la Ballena, Sn 35010 – Las Palmas de Gran Canaria Telf.: 928 45 00 00 BERNARDINO CLAVO VARAS, DOCTOR EN MEDICINA CON INTENSIFICACIÓN PARA LA ACTIVIDAD INVESTIGADORA EN EL SISTEMA NACIONAL DE SALUD DEL MINISTERIO DE SANIDAD Y CONSUMO, INSTITUTO DE SALUD CARLOS III. CERTIFICA: Que el trabajo de investigación titulado “Valoración del tratamiento con sellantes biológicos y terapia celular en la prevención de la fístula broncopleural en un modelo experimental in vivo” ha sido realizado por D. PEDRO ROLANDO LLONTOP SANTISTEBAN, en la Unidad de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín y en el Laboratorio de Farmacología de la Universidad de las Palmas de Gran Canaria, bajo mi dirección y asesoramiento, una vez revisada la presente memoria la encuentro apta para su defensa como Tesis Doctoral, para optar al grado de doctor. Y para que así conste y surta los efectos oportunos extiendo el presente certificado, en Las Palmas de Gran Canaria a siete de abril de dos mil diez. Fdo.: Bernardino Clavo Varas LEANDRO FRANCISCO FERNÁNDEZ PÉREZ, PROFESOR TITULAR DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA. CERTIFICA: Que el trabajo de investigación titulado “Valoración del tratamiento con sellantes biológicos y terapia celular en la prevención de la fístula broncopleural en un modelo experimental in vivo” ha sido realizado por D. PEDRO ROLANDO LLONTOP SANTISTEBAN, en la Unidad de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín y en el Laboratorio de Farmacología de la Universidad de las Palmas de Gran Canaria, bajo mi dirección y asesoramiento, una vez revisada la presente memoria la encuentro apta para su defensa como Tesis Doctoral, para optar al grado de doctor. Y para que así conste y surta los efectos oportunos extiendo el presente certificado, en Las Palmas de Gran Canaria a siete de abril de dos mil diez. Fdo.: Leandro Francisco Fernández Pérez Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban AGRADECIMIENTOS Hacer una Tesis Doctoral es sumergirse en un aventura llena de vicisitudes, donde se mezclan un sinfín de experiencias que nos llevan a conocer y a pasar, al mismo tiempo, de la desesperación a la alegría, del error a la verdad y del desánimo a la esperanza. Esto requiere dedicación, constancia, tenacidad y sobre todo un gran esfuerzo para confiar en uno mismo. Creo sinceramente que, sin todo el apoyo que he recibido no hubiera podido superar los muchos obstáculos que se me han presentado, y ahora no estaría escribiendo estas líneas de agradecimientos. A mi director de Tesis, el Dr. Norberto Santana, no sólo le agradezco su apoyo tanto científico como moral, sino también, servirme de guía a la hora de orientar mi carrera científica, que espero sólo acabe de empezar. Siguen en mí esas palabras que se “grabaron a fuego” en las profundas fibras de mi corazón: “¡los amigos de mis amigos, son mis amigos!” fueron las primeras palabras en escuchar antes de conocerte en persona. Gracias Norbe, por ayudarme a conseguir una beca, por acompañarme a Extranjería, pero sobre todo, por ser amigo y uno de los responsables de que haya terminado ésta Tesis. A mis directores de Tesis, Dr. Leandro Fernández y Dr. Bernardino Clavo por su gran calidad científica y profesional, por su apoyo, confianza, enseñanza y por haber contribuido con su esfuerzo y trabajo para que ésta Tesis se haya hecho realidad. A la Dra. Ma Dolores Fiuza, no sólo por sus sabios consejos sino también por su dedicación y apoyo incondicional en la parte estadística. Siempre, ese primer saludo al entrar a la Unidad de Investigación, lo llevaré impreso en mi mente y en mi corazón. Desde estas líneas le digo ¡muchas gracias por todo!. Un agradecimiento muy especial también para el Dr. Rafael Camacho por su dedicación incondicional y aporte importantísimo en la valoración de la parte histológica; y a Lourdes Ramírez por su siempre disposición a colaborar con el grupo de Cirugía Experimental y en especial en esta Tesis. A Ardiel Quintana, Patricia Martín y Yanira Brito por todo su esfuerzo y apoyo en el laboratorio con la parte genómica, motivándome de esta forma a seguir adelante. Al Dr. Alfredo Santana por sus opiniones y consejos, así también por su colaboración en la parte de células madre; y al Dr. José Luis Martín, por su enseñanza en el bienestar animal y ayuda en el quirófano. Al Dr. José Carlos Rodríguez, por permitirme realizar esta Tesis Doctoral en las instalaciones de la Unidad de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín. Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban ÍNDICE II 2.6.4.- Colgajos musculares y epiplon …………………………………… 22 3.- PLASMA RICO EN FACTORES DE CRECIMIENTO ……………………… 25 3.1.- Las plaquetas ……………………………………………………………… 26 3.2.- Desventajas del uso de PRFC ……………………………………………... 29 4.- FACTORES DE CRECIMIENTO CELULAR ……...………………………… 29 4.1.- Definición ……………………………………………………………..…… 29 4.2.- Síntesis …………………………………………………………………...... 30 4.3.- Mecanismo de acción …………………………………………………….... 30 4.4.- Funciones ………………………………………………………………….. 32 4.5.- Clasificación y tipos …………………………………………………..…… 33 4.6.- Otras proteínas relacionadas con la reparación tisular ……….………...….. 33 4.6.1.- Colágeno ……………………………………………………...…… 33 5.- LAS CÉLULAS MADRE ……………………………………………………....... 34 5.1.- Tipos de células madre …………………………………………………….. 35 5.1.1.- Células madre embrionarias ……………………………………….. 36 5.1.2.- Células madre adultas …………………………………………...… 36 5.1.2.1.- Fuentes de obtención de CM adultas ……………………. 37 5.1.2.2.- Mecanismo de diferenciación de las células madre adultas 37 6.- LA BIOLOGÍA MOLECULAR EN EL ESTUDIO BRONQUIAL ………….. 39 6.1.- Regulación de la expresión génica ……………………………………….. 39 6.2.- PCR y PCR cuantitativa en tiempo real ………………………………...… 41 II.-JUSTIFICACIÓN ………………………………………………………...……… 45 III.-OBJETIVOS ……………………………………………...……………………... 49 IV.-MATERIAL Y MÉTODO ……………….……………………………………... 53 1.-MATERIAL ……………………………………………………………………….. 53 1.1.-Animales de experimentación ……………………………………………... 53 1.2.-Salas, equipos y material inventariable …………………………………..... 54 1.3.-Material quirúrgico ………………………………………………………… 55 1.4.-Medicación anestésica y analgésica ……………………………………….. 55 1.5.- Material utilizado para las mediciones ……………………………………. 55 2.-MÉTODO …………………………………………………………………………. 56 2.1.-Diseño ……………………………………………………………………… 56 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban ÍNDICE III 2.2.-Técnica quirúrgica …………………………………………………………. 57 2.3.- Cuidados postoperatorios …………………………………………………. 62 2.4.- Tratamientos sellantes del muñón bronquial …..………………………….. 63 2.4.1.- Obtención del PPP autólogo ……………………...………............. 63 2.4.2.- Obtención de CM derivadas del tejido adiposo ……...................… 65 2.4.3.- Trasplante de ADSC ……………..………………………......…… 65 2.5.- Obtención y recogida de las muestras ……………………………………. 66 2.6.- Mediciones ………………………………………………………...……… 67 2.6.1.- Evolución clínica del período postoperatorio …………………….. 67 2.6.2.- Determinaciones histológicas …………………………………….. 67 2.6.2.1.- Procesamiento de las muestras …………………………... 67 2.6.2.2.- Lectura de las muestras ………………………………….. 68 2.6.3.- Determinación de la expresión genómica ………………………… 69 2.6.3.1.- Extracción de ARN y síntesis de cADN ………………... 69 2.6.3.2.- Determinación de la expresión genómica mediante qRTPCR ………………………………………………………………. 70 2.7.- Análisis Estadísticos ………………………………………………………. 72 V.-RESULTADOS …………………………………………………………………… 75 1.- Evolución clínica del período postoperatorio ………………………..……………. 75 2.- Determinaciones histológicas ……………………………………...………..…….. 75 2.1.- Influencia del tratamiento local sobre el muñón bronquial ………………... 75 2.2.- Influencia del tratamiento con Tissucol® ……………………………..…… 80 2.3.- Influencia del tratamiento con PPP autólogo ……………………….…..…. 84 2.4.- Influencia del tratamiento con ADSC …………………………………..…. 89 2.5.- Influencia del tratamiento combinado con ADSC+Tissucol® …………...... 93 3.- Análisis de los cambios en la expresión de genes ………………………………..... 100 3.1.- Colágeno 2a1 …………………………………………………………….… 100 3.2.- Ctgf …………………………………………………………………...……. 101 3.3.- Sox 6 …………………………………………………...…………………... 102 3.4.- Tgfβ-1 ……………………………………………………………………… 103 3.5.- Vegfa ……….………………………………..…………………………….. 104 3.6.- Igf-1 ………………………………………………………………………... 105 3.7.- Agc-1 ………………………………………………………………………. 106 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban ÍNDICE IV VI.-DISCUSIÓN ……………………………………………………………………... 109 VII.-CONCLUSIONES ……………………………………………………………… 119 VIII.-BIBLIOGRAFÍA ……………………………………………………………… 125 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban ÍNDICE DE TABLAS V ÍNDICE DE TABLAS INTRODUCCIÓN Tabla I. Etiología asociada con la aparición de FBP …………...………....... 11 Tabla II. Clasificación de la FBP ………………………...…………….......... 12 Tabla III. Factores de riesgo en la dehiscencia del muñón bronquial. Factores preoperatorios ……………………………………..………………. 13 Tabla IV. Factores de riesgo en la dehiscencia del muñón bronquial. Factores intraoperatorios ……………………………………....................…. 14 Tabla V. Factores de riesgo en la dehiscencia del muñón bronquial. Factores postoperatorios ……………………………………......................... 14 Tabla VI. Principales constituyentes de los orgánulos plaquetarios y actividades ……………………………………………………......... 28 Tabla VII. Familia de factores de crecimiento ……………………………....... 33 MATERIAL Y MÉTODO Tabla VIII. Diseño de los grupos para el estudio histológico ……………….…. 56 Tabla IX. Diseño de los grupos para el estudio genómico ………………........ 57 Tabla X. Genes y condiciones de la PCR en tiempo real ………………........ 71 RESULTADOS Tabla XI Número de muertes en los grupos ……………………………......... 75 Tabla XII. Hallazgos microscópicos de la mucosa y submucosa bronquial ...... 76 Tabla XIII. Hallazgos microscópicos de la pared bronquial ………………........ 78 Tabla XIV. Hallazgos microscópicos de la pleura peribronquial …………........ 79 Tabla XV. Hallazgos microscópicos de la mucosa y submucosa con Tissucol®. 80 Tabla XVI. Hallazgos microscópicos de la pared bronquial con Tissucol® ……. 82 Tabla XVII. Hallazgos microscópicos de la pleural peribronquial con Tissucol®. 83 Tabla XVIII. Hallazgos microscópicos de la mucosa y submucosa con PPP ….... 85 Tabla XIX. Hallazgos microscópicos de la pared bronquial con PPP …............. 86 Tabla XX. Hallazgos microscópicos de la pleura peribronquial con PPP……... 88 Tabla XXI. Hallazgos microscópicos de la mucosa y submucosa con ADSC…. 89 Tabla XXII. Hallazgos microscópicos de la pared bronquial con ADSC ………. 91 Tabla XXIII. Hallazgos microscópicos de la pleura peribronquial con ADSC ….. 93 Tabla XXIV. Hallazgos microscópicos de la mucosa y submucosa con Tissucol® + ADSC ……………………………………………......................... 94 Tabla XXV. Hallazgos microscópicos de la pared bronquial con Tissucol® + ADSC …………………………………………………………….... 96 Tabla XXVI. Hallazgos microscópicos de la pleura peribronquial con Tissucol® + ADSC ………………………………………………………….... 97 Tabla XXVII. Expresión de Col2a1 en el muñón bronquial postneumonectomía… 100 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban ÍNDICE DE TABLAS VI Tabla XXVIII. Expresión de Ctgf en el muñón bronquial postneumonectomía …... 101 Tabla XXIX. Expresión de Sox6 en el muñón bronquial postneumonectomía ….. 102 Tabla XXX. Expresión de Tgfβ-1 en el muñón bronquial postneumonectomía ... 103 Tabla XXXI. Expresión de Vegf en el muñón bronquial postneumonectomía ….. 104 Tabla XXXII. Expresión de Igf-1 en el muñón bronquial postneumonectomía ….. 105 Tabla XXXIII. Expresión de Agc-1 en el muñón bronquial postneumonectomía .... 106 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban ÍNDICE DE FIGURAS VII ÍNDICE DE FIGURAS INTRODUCCIÓN Figura 1. Corte transversal del bronquio ………………………...……….. 2 Figura 2. Musculatura lisa en el bronquio ……………….……………..… 3 Figura 3. Radiografía posteroanterior de tórax …………...……………… 10 Figura 4. Fibrobroncoscopía mostrando la FBP ………………………..... 10 Figura 5. Gammagrafía mostrando la imagen de la FBP ……………….... 18 Figura 6. Tratamiento de la FBP …………………………………………. 19 Figura 7. Resección costal ……………………………………………….. 21 Figura 8. Salida de líquido fibrinopurulento ……………………………... 21 Figura 9. Uso de colgajos de músculo intercostal …………………...…… 22 Figura 10. Uso de colgajos de músculo serrato anterior ………………....... 22 Figura 11. Uso del epiplon ………………………………………………… 23 Figura 12. Componentes de la sangre …………………………..…………. 25 Figura 13. Acción de los GFs. sobre las células productoras ………...…… 30 Figura 14a. Modelo clásico de diferenciación celular ……………………… 38 Figura 14b. Modelo clásico de diferenciación celular para precursores comprometidos ………………………………………………… 38 Figura 14c. Modelo de trans-diferenciación ………………………………... 38 Figura 14d. Modelo de de-diferenciación y re-diferenciación ……………… 38 Figura 15. Regulación de la expresión génica …………………………….. 40 MATERIAL Y MÉTODO Figura 16. Rata de la cepa Sprague-Dawley ………………………………. 53 Figura 17. Quirófano de la unidad de investigación-HUGC Dr. Negrín ….. 54 Figura 18. Fármacos anestésicos …………………………………..………. 57 Figura 19. Intubación orotraqueal …………………………………………. 58 Figura 20. Posición decúbito lateral derecho del animal ………………..… 58 Figura 21. Ventilador Servo 900® ………………………………………..... 59 Figura 22. Toracotomía posterolateral izquierda ……………………..…… 59 Figura 23. Incisión en el 4º espacio intercostal ……………………...…….. 60 Figura 24. Tracción del pulmón izquierdo y disección del hilio pulmonar .. 60 Figura 25. Clip de titanio ………………………………………………….. 61 Figura 26. Sutura del muñón bronquial …………………………………... 61 Figura 27. Colocación del drenaje pleural ……………….………………... 62 Figura 28. Cierre de toracotomía ……………………………………...…... 62 Figura 29. Salas de pre y post operatorio ……………………………..…... 62 Figura 30. Obtención del PPP autólogo ……………………...……………. 64 Figura 31. Adición de cloruro cálcico al 10% …………………………….. 64 Figura 32. Formación del coágulo después de inducirle calor …………….. 64 Figura 33. ADSC de rata vista al microscopio invertido 4x ………………. 65 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban ÍNDICE DE FIGURAS VIII Figura 34. Trasplante de ADSC en el muñón bronquial ……………….….. 66 Figura 35. Extracción del bloque cardiopulmonar en el sacrificio ……..…. 67 Figura 36. Dispensador de parafina y placa fría (A). Microtomo (B) …..… 68 Figura 37. Microscopio óptico Olympus BX50® …………………..……… 69 Figura 38. Termociclador de capilares Ligth Cycler® 1.5 ……………...….. 70 RESULTADOS Figura 39. Vista macroscópica del muñón bronquial, grupo Tissucol® …… 80 Figura 40. Vista macroscópica del muñón bronquial, grupo ADSC ............ 89 Figura 41. Vista macroscópica del muñón bronquial, grupo ADSC+Tissucol® …………………………………...………….. 94 Figura 42. Imágenes de las categorías histológicas evaluadas …………….. 99 Figura 43. Expresión de Col2a1, control vs ADSC ……………...….…….. 101 Figura 44. Expresión de Sox6, control vs ADSC y Tissucol® …………...... 102 Figura 45. Expresión de Tgfβ-1, control vs ADSC …………….………….. 103 Figura 46. Expresión de Vegfa, control vs ADSC ………….…………...… 104 Figura 47. Expresión de Igf-1, control vs ADSC, Tissucol® y Tissucol+ADSC ………………………………………………... 105 Figura 48. Expresión de Agc-1, control vs. ADSC ………...…….………... 106 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban ABREVIATURAS IX ABREVIATURAS ADN ácido desoxirribonucleico ADP adenosín difosfato ADSC Agc-1 APUD ARN células madre derivadas del tejido adiposo aggrecan-1 captación y descarboxilación de precursores de aminas ácido ribonucleico ATP adenosín trifosfato ARDS Bdnf síndrome de distrés respiratorio agudo factor neurotrófico derivado del cerebro BMP proteína morfogénica ósea BO bronquiolitis obliterante Ca++ calcio cc centímetro cúbico cm CM Col2a1 centímetro célula madre colágeno tipo II a 1 Col4a1 colágeno tipo IV a 1 COX-2 ciclooxigenasa-2 Ctgf CuSO4 DLCO DPX factor de crecimiento de tejido conectivo sulfato cúprico difusión de monóxido de carbono fosfato dibutil xileno DTPA Egf EMTU ácido dietilentriaminopentaacético factor de crecimiento epidérmico unidad trófica epitelial-mesenquimal EPOC EtOH enfermedad pulmonar obstructiva crónica etanol FB fístula bronquial FBP FELASA FEVI Fgf FiO2 fístula broncopleural Federación Europea de Asociaciones de Animales de Laboratorio Flujo espiratorio máximo en el primer segundo Factor de crecimiento fibroblástico fracción inspirada de oxígeno FR frecuencia respiratoria GFs GITC factores de crecimiento isotiocianato de guanidina H2S ácido sulfhídrico h Hbgf hora factor de crecimiento ligado a la heparina I/E relación inspiratoria/espiratoria Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban ABREVIATURAS X Igf-1 IGFBP im factor de crecimiento insulínico-1 insulin-like growth factor binding proteins intramuscular IOT intubación orotraqueal ip intraperitoneal iv JNK intravenoso quinasa c-jun N-terminal Kg MAPK MEC kilogramos proteína quinasa activada por mitogénesis matriz extracelular mg miligramos min minutos ml mililitros mm Ngf milímetros factor de crecimiento nervioso NH3 amoníaco NO2 óxido de nitrógeno N2O óxido nitroso O2 PBS PCR oxígeno solución salina amortiguada por fosfatos reacción en cadena de la polimerasa Pdgf factor de crecimiento derivado de las plaquetas PEEP PPIA PPP presión positiva al final de la espiración ciclofilina A plasma pobre en plaquetas PRFC plasma rico en factores de crecimiento PRP plasma rico en plaquetas rpm RT-PCR respiraciones por minuto PCR cuantitativo a tiempo real Rx radiografía sc subcutáneo SCF SD factor activador de células madre desviación estándar TAC tomografía axial computarizada Tgfβ-1 factor de crecimiento transformante β1 Vegf factor de crecimiento endotelial vascular Xe-133 xenón-133 99mTc technetium-99m Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 6 El epitelio bronquial posee excelente capacidad de reparación siempre y cuando su membrana basal permanezca intacta después del daño bronquial. Las células ciliares degeneradas se desprenden hacia la luz bronquial y de ahí se elimina rápidamente mediante fagocitosis, acción mucociliar de los remanentes de la carpeta mucociliar, o mediante la fuerza física ejercida por la tos. La reparación bronquial requiere conjuntamente de los procesos de inflamación y de proliferación celular. Numerosos mensajeros químicos como las citoquinas, quimioquinas, neurotransmisores, óxido nítrico y factores de crecimiento participan en la inflamación y reparación del epitelio bronquial18-20. Algunos factores se producen localmente mientras que otros son importados al sitio de la lesión bronquial por el torrente circulatorio. Es importante reiterar que tanto la inflamación como la reparación celular utilizan a la membrana basal como andamio para el movimiento y proliferación nuevas células bronquiales. La reparación de la mucosa bronquial en respuesta a un daño agudo se lleva a cabo en cinco fases principales21. 1Células viables presentes en el margen de la superficie ulcerada comienzan a migrar en cuestión de minutos a lo largo de la membrana basal para rápidamente cubrir el área ulcerada. En esta fase se observa histológicamente un epitelio aplanado que cubre partes de la membrana basal. 2Las células basales y las “células secretoras no ciliadas” son las “células madre” (stem cells) encargadas de restituir las células epiteliales perdidas. Estas “células madre” entran en mitosis y sus células hijas (todavía no diferenciadas) migran rápidamente al epitelio dañado a lo largo de la membrana basal. En esta fase de “restitución” se pueden observar microscópicamente figuras mitóticas en la mucosa bronquial generalmente en los bordes de la úlcera. 3Las células hijas también conocidas como “células preciliares” maduran, toman forma cuboidal y se acomodan en la pared bronquial para más tarde diferenciarse finalmente en células ciliares o en células caliciformes. En esta fase de proliferación celular se observa hacinamiento de células en la mucosa que se percibe microscópicamente como una leve hiperplasia bronquial. Se estima que durante esta fase hay 20-30% más células que en epitelio normal. 4Reorganización de la población celular eliminando cualquier exceso de células mediante procesos de apoptosis. En esta fase de reorganización se observa una pared bronquial más o menos normal pero su luz contiene algunas células descamadas y algunos leucocitos. 5Finalmente, el epitelio dañado es reparado y se restablece tanto la estructura como la función normal de la mucosa bronquial. En esta última fase el epitelio bronquial tiene una apariencia microscópica normal y sólo se Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 7 observan algunas células descamadas o inflamatorias en los espacios broncoalveolares. Cuando la mucosa bronquial se expone a un daño continuo o persistente como es el caso de las infecciones crónicas, el epitelio pseudoestratificado ciliar puede sufrir hiperplasia o metaplasia22. Las células caliciformes frecuentemente proliferan aumentado no solo el número de estas células en la mucosa bronquial sino también la cantidad de moco secretado. La hiperplasia caliciforme es un cambio comúnmente observado en bronquitis crónica y se manifiesta clínicamente como hipersecreción bronquial. Ejemplos de enfermedades que se caracterizan por hiperplasia caliciforme e hipersecreción son el asma en gatos y perros23,24, inflamación crónica respiratoria (bronconeumonías crónicas) en todas las especies, huélfago en caballos25, y desde luego neumonías verminosas en donde los parásitos residen en la luz bronquial (Dictiocaulosis pulmonar). Estudios experimentales sugieren que la hiperplasia caliciforme es el resultado de la proliferación de dos estirpes celulares: proliferación de las mismas células caliciformes y proliferación de células basales (madres) que posteriormente se diferencian en células caliciformes. El proceso de hiperplasia puede verse desde dos puntos de vista diferentes. En el primer caso, la hiperplasia caliciforme puede considerarse como un mecanismo de defensa, mientras que en el segundo caso puede considerarse como un proceso adverso pues el exceso de moco impacta desfavorablemente en el funcionamiento del sistema de conducción. Este último caso ocurre con el asma y la enfermedad pulmonar crónica obstructiva en donde la sobreproducción de moco interfiere notablemente con el movimiento del aire a través del sistema de conducción. Poco se conoce sobre los mecanismos específicos que regulan la hiperplasia caliciforme bronquial. Además de factores que inducen mitosis, la homeostasis caliciforme también parece estar regulada por mecanismos de apoptosis en el epitelio bronquial. En resumen, la hiperplasia caliciforme puede considerarse en algunos casos como un proceso protector pero con funciones adversas transitorias, mientras que en otros como en el asma bronquial, puede considerarse un mecanismo fuera de control y con funciones adversas recurrentes26. Durante el daño o irritación crónica bronquial puede desarrollarse una metaplasia de tipo escamosa27 en el cual el epitelio ciliar que es especializado se remplaza por un epitelio escamoso que es menos especializado pero más resistente al daño. Los mecanismos implicados en la metaplasia escamosa bronquial están siendo investigados extensamente, pues se sabe que ésta es una alteración preneoplásica en tumores nasales y broncopulmonares. La asociación entre metaplasia y neoplasia se observa comúnmente en los bronquios de los fumadores. Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 8 Así como el epitelio bronquial reacciona a la irritación o daño produciendo hiperplasia caliciforme o metaplasia escamosa, de la misma forma las glándulas bronquiales reaccionan aumentando su tamaño y el volumen de sus secreciones. El aumento de tamaño glandular es referido tanto como hiperplasia como hipertrofia ya que se presenta un aumento en el número y tamaño de células28. En algunos casos los ductos que descargan las secreciones glandulares se dilatan formando la llamada ectasia ductal bronquial (bronchial gland duct ectasia). En estudios histopatológicos de rutina es difícil evaluar el tamaño de las glándulas bronquiales pues se requiere tomar en cuenta las variaciones entre especies animales, así como también, reconocer que el tamaño glandular varía de acuerdo al tamaño del bronquio. Un ejemplo de variación de especie se observa típicamente en los bronquios felinos en donde el tamaño de las glándulas es proporcionalmente mucho mayor al de otras especies domésticas. Este problema de la subjetividad para la evaluación glandular fue parcialmente solucionado estableciendo la relación normal o índice entre el tamaño glandular y grosor de la pared bronquial en los pulmones de humanos. Este índice se conoce “índice de Reid” (Reid Index) y su valor normal en el humano es de 0.33 o sea que la glándula bronquial es aproximadamente 33% del grosor de la pared bronquial29. Altos índices de Reid se describen en pacientes con bronquitis crónica. Los mecanismos que gobiernan la hiperplasia bronquial son complejos e involucran tanto células epiteliales como mesenquimales, así como a numerosos mensajeros químicos. El término remodelación tisular se utiliza con frecuencia en patología contemporánea para describir los procesos que ocurren en la reparación y que incluyen inflamación, modificación de matrices extracelulares, hipertrofia, hiperplasia y apoptosis30. Los cambios más relevantes en la remodelación bronquial son la hiperplasia caliciforme, deposición de colágeno y engrosamiento de la lámina reticular, hiperplasia del músculo liso, neo-vascularización y proliferación de terminaciones nerviosas. Es importante notar que en la remodelación bronquial los cambios morfológicos pueden manifestarse antes de la presentación de los signos clínicos. Algunos investigadores han comparado la remodelación bronquial con una curación de herida por segunda intención31. O sea que la falta de resolución en una lesión aguda bronquial inicial crea un medioambiente en donde se mantienen continuamente procesos de inflamación y cicatrización. Otro concepto novedoso relacionado a la remodelación bronquial es la aparición postnatal de la EMTU que no es otra cosa que la relación epitelio-submucosa32,33. Durante el desarrollo embrionario el crecimiento y diferenciación de los tejidos depende en gran medida de una comunicación directa entre células epiteliales y mesenquimales. Esta comunicación entre epitelio y tejido conectivo desaparece una vez que se han formado los bronquios tras el nacimiento. Se ha postulado que en el asma y en otras Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 9 afecciones crónicas respiratorias esta comunicación fetal se restablece causando una proliferación celular desordenada y una deposición excesiva de matrices colágenas en la lámina propia de los bronquios32. Por otro lado, la bronquiectasia es una alteración importante que se desarrolla en los bronquios a raíz de una obstrucción o de una inflamación crónica y severa. La bronquiectasia es un proceso irreversible en los cuales los bronquios se dilatan permanentemente como resultado de un daño y debilitamiento de la pared bronquial34. Este padecimiento ha sido dividido etiológicamente en dos grandes grupos: bronquiectasia obstructiva y bronquiectasia no obstructiva. En el primer caso la dilatación de la pared bronquial ocurre en la porción distal de un bronquio obstruido por un tumor o cuerpo extraño. En la bronquiectasia no obstructiva (destructiva) se debe fundamentalmente a infecciones pulmonares crónicas en los cuales las paredes bronquiales son destruidas por el proceso inflamatorio mientras que la tracción ejercida por el tejido pulmonar adyacente produce la dilatación del tubo bronquial35,36. Desde el punto de vista morfológico la bronquiectasia se divide en sacular y cilíndrica. La bronquiectasia sacular aparece macroscópicamente como sacos redondos llenos de exudado purulento que se parecen a los abscesos pulmonares. Sin embargo, mientras que los abscesos están delimitados por una cápsula o membrana piogénica, en bronquiectasia sacular el exudado está rodeado por restos de la pared bronquial.37 La bronquiectasia cilíndrica aparece como cilindros uniformes de exudado rodeado por segmentos largos de paredes bronquiales. Los pulmones con bronquiectasia tienen una apariencia externa nodular que frecuentemente se describe en necropsias como apariencia bocelada. Microscópicamente, en la bronquiectasia se observa exudado purulento o necropurulento rodeado de tejido conectivo entremezclado con restos de cartílago, músculo liso y remanentes de tejido glandular infiltrados por neutrófilos, linfocitos y células plasmáticas34,38,39. F FÍ ÍS ST TU UL LA A B BR RO ON NC CO OP PL LE EU UR RA AL L 2.1.- Definición, etiología, factores de riesgo e incidencia 2.1.1.- Definición La fístula broncopleural (FBP) es una comunicación anormal que se establece entre el árbol bronquial y el espacio pleural, siendo producida por la dehiscencia del muñón bronquial, que ocasiona un empiema por contaminación e infección retrógrada del bronquio remanente40. La dehiscencia del muñón bronquial es definida como una alteración en el cierre bronquial que ocurre después de una resección quirúrgica del pulmón. Aunque afortunadamente es poco frecuente, cuando ésta ocurre representa un 2 2 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 10 desafiante y frustrante problema de manejo asociada con una importante morbilidad y mortalidad que conlleva a una prolongada estancia hospitalaria y una elevada utilización de recursos sanitarios. La FBP causa una disrupción de la vía aérea, contamina el espacio pleural y anega de líquido el pulmón o pulmones remanentes, pudiendo originar una neumonía por aspiración. Hay que distinguir, sin embargo, las fugas persistentes aéreas de las resecciones pulmonares de lo que realmente es una fístula bronquial (FB). No es una mera distinción académica, ya que la etiología y el tratamiento son muy distintos. Las primeras son fístulas alveolo-pleurales que se originan a partir de laceraciones del parénquima pulmonar, y su tratamiento es el mantenimiento, el tiempo que sea necesario de los drenajes torácicos, y en última instancia la utilización de dispositivos de seguimiento ambulatorio como la válvula de Heimlich y más rara vez la reintervención quirúrgica. En cambio, una FBP es una urgencia quirúrgica que necesitará de algún tipo de intervención. 2.1.2.- Etiología La etiología de la FBP es variada y puede amenazar la vida de un paciente. Pueden aparecer después de una resección pulmonar (causa más común) ya sea una neumonectomía o una lobectomía, por complicaciones infecciosas en casos con necrosis pulmonar, tras quimioterapia o radioterapia (por cáncer pulmonar), y muy rara vez en casos de neumotórax persistente espontáneo y tuberculosis (menos común)41-44 Figura 3. Radiografía posteroanterior de tórax. Colección de líquido y nivel hidro-aéreo en hemitórax izquierdo Figura 4. Fibrobroncoscopía mostrando la FBP Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 11 En la fisiopatología, la aparición de una fístula temprana (dentro de la primera semana) ocurre generalmente por un fallo técnico de la sutura del muñón ya sea por encontrarse muy suelta, o todo lo contrario, es decir, cuando se aplica una excesiva tensión a los bordes del tejido bronquial que producen isquemia del mismo. La intermedia (entre 8 y 30 días) es debida a un fallo en la cicatrización en pacientes que recibieron radioterapia previa. Por último, la fístula tardía (más de 30 días) suele asociarse a bronquitis o empiema que conduce a la pérdida de la integridad del tejido, evita la cicatrización e incluso puede llevar a la ruptura del bronquio45. Se ha descrito que la mortalidad del empiema post-neumonectomía con FBP puede llegar a ser del 1113%46,47. Así mismo, ésta patología se presenta en pacientes con enfermedades respiratorias graves, como por ejemplo el síndrome de distrés respiratorio agudo, crisis bronquial obstructiva severa, absceso pulmonar o pleuroneumonía complicada44,48. Sato y cols49 analizaron sus experiencias postoperatorias, llegando a la conclusión que 5 de 64 casos (7.8%) tuvieron FBP en el caso de enfermedades inflamatorias y 19 de 481 casos (4%) en los casos de cáncer de pulmón. En estos últimos pacientes, las FBPs están TABLA I. ETIOLOGÍA ASOCIADA CON LA APARICIÓN DE FBP Infecciones Haemophilus influenzae Streptococcus viridans Staphylococcus viridans Pseudomona aeruginosa Nonhemolytic streptococcus Aspergillus Histoplasma capsulatum Médicos Pleuroneumonía complicada Obstrucción bronquial severa Distrés respiratorio agudo (ARDS) Quirúrgicos (lobectomía) Enfisema lobar congénito LSI Secuestro pulmonar LII Bronquiectasias LSD Enfermedad concomitante Cardiopatía congénita Enfermedad neurológica Genetopatía Bronquiolitis obliterante Enfermedad maligna Cáncer de pulmón Cáncer de tiroides Cáncer de esófago Linfomas Otros Neumotórax espontáneo persistente Enfermedad pulmonar necrosante asociada a radiación o quimioterapia Idiopática Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 12 asociados con casos avanzados, tumores residuales en el muñón bronquial o el uso intratorácico de quimioterapia. La FBP puede ocurrir también como una complicación tardía y grave de los procedimientos broncoplásticos, en los que suele aparecer en la 3ª a la 4ª semana tras la operación y se reconoce como causa fundamental de la misma el fallo técnico45. La colocación de tubos de drenaje pleural o de catéteres venosos centrales48,50, y los procedimientos con riesgo de trauma pulmonar como la pleurodesis51,52 pueden ocasionarla, así como también, la disección ganglionar mediastínica al producir devascularización bronquial, pudiendo favorecer la dehiscencia bronquial y la subsecuente formación de una FBP. TABLA II. CLASIFICACIÓN DE LA FBP Postoperatoria No postoperatoria Asociada con resección Después de procedimientos Malignidad Biopsia pleural Trauma Broncoscopia Infecciosas Biopsia de pulmón Asociada a enfermedad pleuroparenquimal Idiopática Empiema Infecciones Trauma torácico Neumotórax espontáneo persistente Otras infecciones Trauma torácico Otros Enfermedad pulmonar necrotizante asociada a radiación o quimioterapia Reparación de perforaciones traqueal o esofágica ARDS Enfermedad de reflujo gastroesofágico Síndrome de Boerhaave Debido a que la etiología quirúrgica y no quirúrgica de la FBP tiene diferentes abordajes y pronósticos se ha clasificado a la FBP en la Tabla II53. Ésta clasificación puede ser útil al clínico y puede servirle de guía para la elección y aproximación al diagnóstico. En general, los procedimientos quirúrgicos (particularmente, los que están relacionados con pulmones necróticos o cáncer pulmonar) tienen la incidencia más alta y pueden tener el peor pronóstico. 2.1.3.- Factores de riesgo La predisposición a la dehiscencia del muñón bronquial puede ocurrir debido a factores de riesgo preoperatorios, intraoperatorios y postoperatorios. Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 13 2.1.3.1.- Los factores de riesgo preoperatorios Está relacionada con las características propias de cada paciente tales como enfermedades concomitantes (inmunodepresión, diabetes insulino-dependiente41, malnutrición), medicamentos (esteroides, inmunosupresores) y tratamientos previos a la cirugía como la radiación preoperatoria del tórax41. Estudios realizados por Algar y cols 54, demostraron que la aparición de la FBP precoz después de una neumonectomía estuvo significativamente asociada con la EPOC (p=0.017), la hiperglicemia (p=0.003), la hipoalbuminemia (p=0.017) y la terapia con esteroides previa a la cirugía (p<0.001). En la medida de lo posible se deben corregir o disminuir estos factores de riesgo. Así, las infecciones o la malnutrición deben ser tratadas de una forma agresiva. Los tratamientos con esteroides deben ser ajustados a las dosis más bajas posibles antes de la cirugía. Los pacientes diabéticos deben seguir un estricto control y restringir el hábito tabáquico a los pacientes. También se han descrito otros factores de riesgo, que estarían relacionados con los anteriores como son: fiebre, H. influenzae en esputo, índice de sedimentación eritrocítica elevada y anemia55. TABLA III. FACTORES DE RIESGO EN LA DEHISCENCIA DEL MUÑÓN BRONQUIAL Factores preoperatorios Esteroides Medicamentos inmunosupresores (e.j. azatioprina) Medicamentos antiproliferativos (e.j. sirolimus) Enfermedad colágeno vascular Cirrosis Fumadores Neumonía Enfermedad inflamatoria pulmonar Infección pleural/empiema Tuberculosis activa Radioterapia torácica previa Diabetes mellitus/hiperglicemia Pacientes con edad avanzada (>60 años) Malnutrición/hipoalbuminemia Quimioterapia preoperatoria Función pulmonar comprometida (EPOC, FEV1 baja, DLCO baja) Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 14 2.1.3.2.- Los factores de riesgo intraoperatorios TABLA IV. FACTORES DE RIESGO EN LA DEHISCENCIA DEL MUÑÓN BRONQUIAL Factores intraoperatorios Neumonectomía derecha Desvascularización del bronquio Fallo técnico de la grapadora Sutura desintegrada Margen bronquial afecto por tumor Muñón bronquial largo Linfadenectomía mediastínica56 Diámetro grande del muñón bronquial (>25 mm)57 Trasfusión sanguínea52 Las resecciones pulmonares amplias como la neumonectomías constituyen un factor importante de riesgo de FBP58,59, siendo significativamente más frecuente su aparición tras la neumonectomía derecha (13.2%) que tras la neumonectomía izquierda (5.0%)60-63. Hay dos razones principales para que se incremente esta incidencia en la neumonectomía derecha. Una de ellas es que el bronquio principal está irrigado por una sóla arteria bronquial, mientras que el bronquio principal izquierdo está irrigado por dos arterias bronquiales. La segunda es que60-63 el bronquio principal izquierdo se encuentra protegido debajo del arco aórtico con un tejido mediastínico circundante vascularizado. El muñón del bronquio izquierdo se retrae debajo del arco aórtico, mientras que el bronquio principal derecho no tiene tal protección natural. Éste es, probablemente, un componente del riesgo inherente de la neumonectomía derecha. Cuando además, la neumonectomía derecha se asocia a terapia neo-adyuvante, se ha observado una mortalidad de 24%64 debido a FBP. Otro factor de riesgo a tener en cuenta es la metástasis de los ganglios subcarinales61 en contacto con el muñón bronquial. 2.1.3.3.- Los factores de riesgo postoperatorios Entre los factores de riesgo más importantes para la formación de una FBP se encuentran la necesidad de ventilación mecánica postoperatoria63, de hecho la extubación precoz debe ser una prioridad después de la cirugía para evitar el inherente barotrauma que puede poner en riesgo el cierre del muñón bronquial. TABLA V. FACTORES DE RIESGO EN LA DEHISCENCIA DEL MUÑÓN BRONQUIAL Factores postoperatorios Ventilación mecánica presión positiva Empiema postoperatoria Uso prolongado de tubo de drenaje torácico Requerimiento de trasfusiones de sangre Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 15 Otros factores de riesgo que están implicados son: la fiebre, uso de esteroides, leucocitosis, traqueostomía y broncoscopia para succionar el esputo/moco55, contaminación de la cavidad pleural41. 2.1.4.- Incidencia Aunque ha disminuido en los últimos años, debido al avance de las técnicas quirúrgicas, la incidencia y desarrollo de la FBP varía desde 1.5% – 28% después de una resección pulmonar43,59,65,66. Ésta variabilidad aparentemente depende de la etiología, la técnica quirúrgica y la experiencia del cirujano67-69. La incidencia es menor cuanto mejores sean las condiciones del paciente. Cerfolio65 describió una incidencia que variaba desde 4.5% a 20% tras una neumonectomía y de 0.5% después de una lobectomía65. Sirbu y cols59, encontró en 490 pacientes que sufrieron una resección pulmonar debido a cáncer de pulmón una incidencia de FBP de 4.4% (22 de 490 pacientes), 21 de los pacientes (95.5%) fueron hombres y 1 paciente (4.5%) fue mujer con un promedio de edad de 57.8 años. La FBP ocurrió en 12 pacientes tras una neumonectomía (54.6%), en 9 después de una lobectomía (40.9%), y en 1 paciente (4.5%) después de una resección broncoplástica en manguito59. Como se ha comentado previamente, los aspectos de la técnica quirúrgica también influye en la incidencia de FBP como la neumonectomía y sobre todo la del hemitórax derecho que puede llegar a ser incluso de un 75%70, un muñón bronquial largo, cáncer residual en el margen bronquial, devascularización del muñón bronquial, ventilación prolongada o reintubación después de la resección y la inexperiencia quirúrgica. La resección excesiva o escasa en tumores malignos, con tejido tumoral residual cercano o residual en el muñón bronquial41,58, la tensión de la sutura y la excesiva disección peribronquial y paratraqueal se han asociado con el incremento en la incidencia de FBP. Todos ellos incrementan el riesgo de necrosis isquémica con subsecuente colonización bacteriana. La mayor incidencia de FBP se presenta en adultos, asociándose a una mortalidad que puede oscilar entre 18%–50%71. En niños, la mayoría de los estudios corresponden a casos de prematuros en los cuales la FBP aparece como complicación de la ventilación mecánica debido a un ARDS por membrana hialina. La mortalidad en éstos pacientes puede sobrepasar el 50% en aquellos prematuros de muy bajo peso al nacimiento72. Cuando consideramos la incidencia de la FBP en relación al tipo de sutura, Sonobe y cols73 encontró una incidencia de 1.8% cuando se utiliza una sutura manual, 5,0% cuando el muñón bronquial es cerrado con una grapadora, y 1,9% si se combina el cierre con grapadora y una sutura de refuerzo en el lado distal a las grapas y un 1,0% cuando la sutura de reforzamiento fue colocada en el lado proximal a las grapas. Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 22 2.6.4.- Colgajos musculares y epiplón En los pacientes con FBP precoz tras una cirugía de resección pulmonar, la mayoría de los casos se deben a la dehiscencia de la sutura del muñón bronquial por fallo de cierre del mismo. Salvo que la fístula sea pequeña o no lo permitan las condiciones clínicas del paciente, se intenta el cierre endoscópico o el sellado quirúrgico del muñón100-102. La técnica utilizada se conoce como técnica de Abruzzini y comprendería la resección del muñón por esternotomía media, a través del mediastino para evitar la zona séptica de la cavidad pleural, la sutura del bronquio en margen sano y el relleno de la cavidad ya sea con músculos, epiplón o su obliteración mediante una toracoplastia, menos usada103,104 (Figura 9 y 10). Como ya hemos dicho, el mejor tratamiento para la FBP es la prevención. Ésta gira alrededor de técnicas quirúrgicas meticulosas y el libre uso de profilácticos. La cobertura del muñón bronquial con colgajos musculares pediculados se ha descrito en pacientes sometidos a terapia neoadyuvante en cáncer de pulmón, protegiendo el muñón bronquial de isquemia adicional y necrosis47. El uso de estos colgajos musculares se recomienda en pacientes con empiema pleural en los que se requiere resección pulmonar mayor o cuando el compromiso infeccioso del parénquima pulmonar pone en riesgo el muñón bronquial. Aunque el uso de colgajos musculares pediculados o miocutáneos no está exento de complicaciones, es un método efectivo y confiable para el manejo de pacientes con lesiones cardiotorácicas complicadas, entre las que incluyen FBP y empiema105. En ocasiones la fístula puede recidivar por atrofia del músculo traslocado con el consecuente fallo para sellar el muñón y llenar la cavidad pleural residual106. Las mioplastías aportan relleno a las cavidades, vascularización y refuerzo de suturas. Los músculos más comúnmente usados en éste tipo de procedimientos han Figura 9. Uso de colgajos de músculo intercostal Figura 10. Uso de colgajos de músculo serrato anterior Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 23 sido el dorsal ancho, el pectoral mayor, el serrato anterior y el recto anterior del abdomen. El uso de un músculo como colgajo requiere la disección quirúrgica de todo o parte del mismo sin interrumpir su vascularización, por lo que es básico tener conocimientos de la anatomía vascular de éste. El factor más importante para la elección del colgajo va a ser la localización de la toracotomía. Otro aspecto a tener en cuenta en la selección del músculo es la forma y la función tanto en el sitio donante como el receptor. El uso de algunos músculos puede dejar considerables secuelas funcionales y estéticas. Por ello se debe usar uno de un grupo muscular con funciones sinérgicas o realizar técnicas preservadoras de la función y/o de la forma del músculo basadas en la particular circulación e inervación del mismo. El último factor que se debe tener en cuenta en la selección de mioplastías es el arco de rotación, éste depende del avance del músculo desde la zona donante sin desvascularizarse y el alcance del mismo para llegar al sitio receptor. El punto de rotación es determinado por el lugar de entrada del pedículo dominante en el músculo107. Por otro lado, se ha descrito el uso del omento para el manejo profiláctico de los muñones bronquiales en riesgo, la desventaja de ésta técnica radica en agregar una laparotomía y manipulación intraabdominal98 (Figura 11). Finalmente, el índice más alto de supervivencia en un FBP se debe a una sospecha temprana, así como, su rápido diagnóstico, manejo inicial y una intervención quirúrgica agresiva. Figura 11. Uso del epiplon Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 24 A modo de indicaciones generales: Si se hace el diagnóstico de FBP en las primeras 24 a 48 horas del período postoperatorio: -Se recomienda realizar una toracotomía de urgencia con la inclusión de nuevos puntos de sutura o reamputación y nueva sutura del bronquio, según los hallazgos. Recubrir la sutura con un colgajo de pleura, pericardio o de músculo intercostal con su paquete vasculonervioso. -Si se trata de una gran fístula que de inicio requiera ventilación mecánica, se deben disminuir los parámetros de presión positiva (PIM y PEEP) hasta los niveles que permitan mantener la adecuada ventilación con la mínima fuga posible a través de la fístula. -La ventilación de alta frecuencia mejora el intercambio gaseoso y disminuye el escape aéreo. Cuando el diagnóstico se hace después del tiempo señalado: -La conducta terapéutica y su secuencia dependerá en general del estado físico del paciente, su enfermedad de base, reserva cardiorrespiratoria preoperatoria, hallazgos operatorios previos y tipo de resección realizada, cronología, magnitud y topografía de la fístula, experiencia quirúrgica y respuesta a los procederes aplicados. Es recomendable: -Evacuar el empiema asociado y esterilizar lo más posible la cámara pleural. -Punciones torácicas, drenaje pleural (excepcionalmente con aspiración negativa controlada a baja presión) y lavados pleurales. -Antibioterapia sistémica y local. -Revisión quirúrgica de la cámara pleural, (extracción de cuerpos extraños y masas de fibrina que impiden el cierre de la fístula) la que se podrá complementar con una operación sobre la pared para reducir su volumen (toracoplastia) o ventana torácica. - Una vez drenada la cámara pleural se podrán realizar: -Cauterizaciones endoscópicas repetidas o colocación de sellantes a través del broncoscopio de fibra óptica (habitualmente en fístulas menores de 5 mm de diámetro). Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 25 -Transposiciones intratorácicas de colgajos musculares pediculados o libres (pectoral mayor, menor, serrato anterior, músculo intercostal, dorsal ancho, recto anterior del abdomen) o transdiafragmática de epiplón mayor, de acuerdo con el cuadro clínico y tamaño y localización del espacio pleural residual. -De no existir empiema, lo que habitualmente es excepcional, puede valorarse la posibilidad de practicar reamputación con sutura en parte sana del bronquio o ampliación de la resección pulmonar. -Neumonectomía en fístulas grandes incontrolables de lóbulo superior. En fístulas de lóbulo medio o inferior derecho, sección del bronquio intermediario conservando el lóbulo superior. Lobectomías en caso de fístulas tras resecciones pulmonares segmentarias o atípicas. -En el caso de fístulas crónicas es difícil y peligroso intentar el abordaje del bronquio a través de la fibrosis mediastínica, debiendo seguirse el principio de buscar el bronquio en zona sana. En las fístulas derechas, directamente en el mediastino a través de una esternotomía media (técnica de Abruzzini). En el lado izquierdo por toracotomía estándar movilizando ampliamente el cayado aórtico. Estas técnicas son de manejo excepcional y sólo a tomar en cuenta después del fracaso de los tratamientos anteriores y de la enfermedad causal. P PL LA AS SM MA A R RI IC CO O E EN N F FA AC CT TO OR RE ES S D DE E C CR RE EC CI IM MI IE EN NT TO O La estimulación de la regeneración de tejidos del organismo sigue siendo uno de los retos más perseguidos y anhelados por los especialistas en varias áreas terapéuticas. Los últimos adelantos se dirigen a aumentar o mejorar los mecanismos intrínsecos de respuesta celular, centrándose en un elemento nuevo: la sangre y sus componentes. De ésta manera se llega al plasma rico en factores de crecimiento (PRFC) (Figura 12). 3 3 Figura 12. Componentes de la sangre Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 26 El plasma sanguíneo es la porción líquida de la sangre en la que están inmersos los elementos formes. Es esencialmente una solución acuosa de composición compleja que contiene un 91% de agua, proteínas (6-8 g/dL), aminoácidos, glúcidos, lípidos, sales, hormonas, enzimas, anticuerpos, urea, gases en disolución y sustancias inorgánicas como sodio, potasio, cloruro de calcio, carbonato y bicarbonato. Además de vehiculizar las células de la sangre, también transporta los alimentos y las sustancias de desecho recogidas de las células. El volumen plasmático total oscila entre 40-50mL/Kg peso. Young y Medawar108 en 1940, publicaron un artículo donde explicaban que habían conseguido unir varios nervios periféricos de conejos con plasma sanguíneo. En 1943 Tarlov109 hizo experimentos similares. Trabajó con plasma de conejo autólogo y homólogo y desarrolló una técnica especial para mejorar la aposición nerviosa del muñón, pero la fuerza y estabilidad de los sellantes era pobre y las técnicas de microcirugía aún no se habían desarrollado, por lo que el número de fracasos fue alto. Los investigadores han identificado sustancias biológicamente activas en el plasma sanguíneo, que promueven la reparación del tejido afectado. Éstos agentes han sido denominados factores de crecimiento (GFs). Marshal Urist110 describió en 1965 la proteína morfogénica ósea (BMP) y desde entonces se han sintetizado estas y otras proteínas, que nuestro organismo posee de forma natural en la sangre y particularmente en las plaquetas. En 1982 Knighton y col., descubren el potencial de los factores de crecimiento como estimuladores de la curación de lesiones y heridas111. Inicialmente los procedimientos de obtención del plasma rico en plaquetas (PRP) partían de cantidades de sangre muy grandes (500 cc) que requerían de unos aparatos especiales y costosos que impedían la utilización en procedimientos ambulatorios112. En la década de los 90 varios autores utilizaron los concentrados a base de PRP en injertos orales y maxilofaciales, con el fin de obtener la fibrina de manera autóloga, activando el PRP con trombina bovina. De esta forma observaron que, además del beneficioso efecto osteoconductivo que aportaba la fibrina, existía un aporte de factores de crecimiento beneficiosos para la curación ósea112,113. 3.1.- Las plaquetas Las plaquetas son porciones citoplasmáticas de los megacariocitos de la médula ósea. En sangre encontramos de 150.00 a 400.000/µl y como no tienen núcleo para replicarse, morirán en 7-9 días. Además de intervenir en los procesos de hemostasis mediante la formación del coágulo, inician el proceso de reparación de las heridas114 ya que son un reservorio fisiológico de algunos factores de crecimiento que poseen un papel activo en la Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 27 regeneración de los tejidos115. Las plaquetas son una fuente rica de al menos tres factores de crecimiento, el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (Pdgf), factor de crecimiento tumoral beta 1(Tgfβ-1) y factor de crecimiento tumoral beta 2 (Tgfβ2)116. Cuando se produce una herida, las plaquetas se unirán al colágeno expuesto de la pared vascular (adhesión) y a la vez entre sí (agregación) a través de puentes de fibrinógeno. La degranulación (activación) de las plaquetas se puede realizar por varios mecanismos, mecánicos o químicos. Uno de los más fuertes es la adhesión de las plaquetas al colágeno y otros componentes del endotelio, otro sería la presencia de trombina. Al activarse, las plaquetas obtienen una forma esferoidal y espinosa con movimientos de pseudópodos y expulsión de gránulos que liberarán a su vez factores de crecimiento. Una plaqueta en circulación posee alrededor de 35 gránulos alfa y 5 cuerpos densos117. También se liberan nuevos factores agregantes que, junto con la fase plasmática de la coagulación, originarán trombina y posteriormente sustituirán el fibrinógeno soluble por fibrina. Este proceso no se realizará si existe ruptura o fragmentación plaquetaria por lo que las variaciones en la obtención de los preparados plasmáticos ricos en plaquetas modificarán el contenido de factores de crecimiento final118. In vitro se ha visto que la membrana de las plaquetas también estimula la actividad mitogénica de las células óseas humanas contribuyendo a la regeneración de tejidos mineralizados119. Tras la liberación inicial de factores de crecimiento del PRP, las plaquetas sintetizarán y liberarán más GFs durante los 7 días siguientes de su vida. Una vez mueren, los macrófagos que habrán alcanzado la zona estimulados por las propias plaquetas, liberarán a continuación más factores de crecimiento120. Las plaquetas desempeñan un papel muy importante dentro del PRP, ya que constituyen la principal fuente de actividad mitógena en el plasma sanguíneo121 y van a funcionar como un vehículo portador de factores de crecimiento y de otras proteínas que desempeñan un papel importante en la biología ósea, como son la fibronectina y otras proteínas adhesivas122. En 1993, Hood123 describió el uso de concentrados plaquetarios para formar gel plaquetario, extraído mediante un método de centrifugación diferencial124. Se obtienen entre 50 y 60 ml. de concentrados plaquetarios que son mezclados con trombina bovina y que han sido de gran utilidad en cirugía cardiaca para sellar erosiones ocasionadas por la disección en las reintervenciones, así como para el sellado de las líneas de suturas y de las prótesis123,125. Se ha utilizado para el sellado de áreas cruentas y como hemostático en cirugía de hígado y riñón123, y además en la reparación de fístulas de líquido cefalorraquídeo en la duramadre con porcentajes de éxito del 95%126. Otro grupo de investigadores, dirigidos por Marx en 1998112, estudiaron el comportamiento de las plaquetas de la sangre como responsables de la reparación celular, encontrando los tres factores de crecimiento ya comentados: Pdgf, Tgfβ-1 y Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 28 Tgfβ-2. En el 2004 éste mismo autor, describió otros siete factores de crecimiento implicados120. De forma que, Anitua en 1999 propone utilizar en clínica el PRFC que contienen importantes GFs como: Tgfβ-1, factor de crecimiento vascular derivado del endotelio (Vegfa), factor de crecimiento insulinico 1 (Igf-1), ya que dichas proteínas tienen propiedades como la migración celular dirigida (quimiotáxis), proliferación y la diferenciación celular, procedimientos claves en los procesos de reparación y regeneración 127-129. Tabla VI. Principales Constituyentes de los Orgánulos Plaquetarios y Actividades Constituyentes Actividad Cuerpos Densos ADP Agregación ATP Ca2+ Pro-agregación Serotonina Agregación Gránulos Factor plaquetario 4 (PF4) Proteína neutralizador de heparina Trombomodulina Inhibición de la actividad de trombina tromboglobulina ( -TBG) Antiheparina Trombospondin (TSP-1) Glicoproteína adhesiva Fibronectina Factor Van Willebrand Pdgf Factores de crecimiento para fibroblastos, queratinocitos, células endoteliales y musculares Tgf -1 Factor de crecimiento de hepatocito (HGF) Factor de crecimiento fibroblástico básico (bFgf) Factor de crecimiento vascular endotelial (Vegfa, Vegfc) Factor de crecimiento epidérmico (Egf) Inhibidor C1 Inhibidor Fibrinógeno procoagulante Antígeno Factor VIII Mejorador de la adhesión plaquetaria Macroglobulina 2 Antiproteasas Antiplasmina 2 Fuente: Bocci, V, 2002 130 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 29 3.2.- Desventajas del uso de PRFC Sin duda, son innegables los buenos resultados de los tratamientos con concentrados de PRFC, en relación a la mejor y más rápida regeneración de los tejidos donde se han aplicado112,127,131. Por otro lado, las dosis de GFs en el PRFC son dosis terapéuticas y no filológicas, y que por lo tanto actúan sobre el incremento de la proliferación celular y la replicación del ADN de manera indirecta, a través de complejas vías de transducción de señal. Hay evidencias que muestran que los GFs encontrados en las plaquetas, aparecen sobre expresados en los tejidos tumorales. Estos hechos nos plantean las siguientes preguntas: 1) ¿El aumento de las concentraciones de éstos GFs utilizados en las dosis terapéuticas habituales, y en determinados tejidos y localizaciones anatómicas, podría iniciar un proceso oncogénico en tejidos normales?. 2) ¿Podrían inducirlo en tejidos displásicos o que han sido expuestos a carcinógenos?. 3) ¿Qué mecanismos bioquímicos nos harían sospechar que la oncogénesis se podría producir de una manera dosis-dependiente o tiempo dependiente?118. No se ha descrito mayor riesgo de infecciones, transmisión de enfermedades o cualquier otro efecto indeseable con la utilización de PRFC. Tampoco se conocen las concentraciones ideales de cada factor de crecimiento o la dosificación adecuada para cada situación terapéutica en concreto y también hay que destacar la potencial existencia de GFs que todavía no han sido descritos127,132. F FA AC CT TO OR RE ES S D DE E C CR RE EC CI IM MI IE EN NT TO O C CE EL LU UL LA AR R 4.1.- Definición Los factores de crecimiento (GFs) son péptidos grandes o glicoproteínas que ejercen diversos efectos sobre el crecimiento, el metabolismo y la diferenciación celular; regulando diversos procesos biológicos a través de interacciones con receptores celulares que funcionan como un ligando-activador de enzimas intracelulares133. Los GFs fueron descubiertos inicialmente debido a su capacidad para estimular la mitosis contínua de células quiescentes, en un medio nutricionalmente completo que carecía de suero. Esto distingue a los GFs de los elementos esenciales, cofactores y nutrientes requeridos para los procesos metabólicos, pero que no son suficientes para iniciar la división celular134. 4 4 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 30 4.2.- Síntesis Los GFs son producidos localmente a nivel del tejido lesionado, y sistémicamente desde diferentes fuentes, siendo sintetizados por muchos tipos celulares que intervienen en la reparación de los tejidos134. Las plaquetas almacenan los GFs en los gránulos alfa, que tras una lesión se liberan al medio extracelular durante el proceso de la coagulación. La concentración de los GFs alcanzada tras la degranulación de los gránulos alfa se incrementa de forma lineal132. 4.3.- Mecanismo de acción Los GFs actúan sobre la célula diana de diversas formas: estimulación endocrina, paracrina, yuxtacrina, autocrina e intracrina 134. Un modo de acción endocrino tiene lugar cuando un GFs secretado por una célula ejerce su acción sobre otras células a distancia. El paracrino ocurre cuando el GFs tiene efecto sobre las células adyacentes y el modo yuxtacrino es similar, aunque el GFs ejerce su efecto cuando está unido a la membrana celular ó a la matriz extracelular. Las acciones autocrinas están mediadas por un GFs sobre su propia célula de origen, después de su secreción dentro del medio extracelular135. Una variación de la acción autocrina ha sido denominada intracrina y fue descrita por primera vez en una variante oncogénica del PDGF denominada v-sis136. La acción intracrina ocurre dentro de la célula de origen, y es así independiente de la secreción del GF135. Los GFs liberados desde los macrófagos, neutrófilos, linfocitos, plaquetas y fibroblastos, se unen a las células diana por una vía específica a través de los receptores de superficie celulares, induciendo a las células a migrar, dividirse o producir otras proteínas (síntesis de la matriz) y factores requeridos para la reparación137. Una interrelación compleja de lazos de “feed-back” surge en el medioambiente tisular, donde los GFs se regulan así mismos los unos a los otros durante el crecimiento tisular137. Figura 13. Acción de los GFs sobre las células productoras Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 31 Los efectos de los GFs están mediados por la activación de receptores celulares específicos138. Los receptores son complejos de proteínas transmembrana que pueden unir GFs a sus dominios extracelulares con una alta afinidad y especificidad y pueden transmitir la información generada por la unión produciendo cambios intracelulares. Las similitudes estructurales entre los receptores celulares pueden explicar la reactividad cruzada entre sustancias137. Los receptores de los GFs constan de por lo menos tres dominios: una región extracelular que se une al factor de crecimiento con alta afinidad y especificidad, un segmento intramembrana, y uno o más dominios intracelulares que interactúan con señales moleculares dentro de la célula. A pesar de la diversidad de GFs y receptores caracterizados, todos los receptores comparten estos rasgos estructurales. Cuando el mismo ligando se une a dos receptores vecinos ocurren cambios conformacionales que son transmitidos al dominio intracelular, y origina una serie de cambios citoplasmáticos que dan lugar al inicio de la transcripción de los ácidos nucleicos. Los receptores de los GFs ejercen su función uniéndose a enzimas intracelulares a las que activan. Con la excepción de los receptores para la familia de Tgfβ, todos los receptores de los GFs estudiados tienen actividad tirosinquinasa. Así en muchos casos, los fenómenos intracitoplasmáticos se llevan a cabo a través de esta enzima, la cual fosforila proteínas citoplasmáticas, alguna de las cuales permanecen en el citoplasma y otras pasan al núcleo donde producen una activación genética137. Los receptores para Tgfβ y moléculas relacionadas fosforilan substratos de serina y treonina en lugar de tirosina139. Varios principios generales gobiernan los pasos a través de los cuales los GFs activan sus receptores, aunque hay detalles específicos que difieren para cada combinación GFs-receptor. La unión de un GFs al dominio extracelular de su receptor, conduce a una dimerización u oligomerización del receptor135. Los cambios conformacionales inducidos por la unión al ligando activan el dominio intracelular quinasa del receptor, lo cual conduce secuencialmente a una fosforilación del receptor, por un mecanismo de transfosforilación, y entonces a la fosforilación de otros substratos. La autofosforilación, particularmente sobre los residuos de tirosina, crea una serie de sitios cercenados para otras proteínas intracelulares que contienen módulos denominados dominios SH2, por su similitud con una región de aproximadamente 100 aminoácidos que fue identificada por primera vez en el oncogén celular c-src140. Se ha identificado otra clase de lugar de unión a fosfotirosina, denominado dominio PTB. Aunque estructuralmente distinto del dominio SH2, es funcionalmente equivalente en mediar interacciones entre una tirosina fosforilada y una proteína de señalización. Así, los receptores de GFs activados con múltiples tirosinas fosforiladas en diferentes contextos de aminoácidos, vuelven al punto focal para la agregación intracelular transitoria de muchas proteínas que contienen SH2 - o PTB-. Estas proteínas incluyen una variedad de intermediarios en sendas de transducción de señal, con los últimos efectos amplificados y diversificados respecto a la señal inicial inducida por la unión de los GFs a su receptor141. Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 38 que una célula progenitora restringida hacia un solo linaje da origen a células de su misma estirpe (Figura 14a). El segundo modelo se refiere a la capacidad que tiene las CM adultas de diferenciarse en progenitores más activos en el ciclo celular que pueden dar origen a su vez a células de linajes celulares diferentes, tal es el caso de la CM hematopoyética la cual puede generar dos progenitores celulares diferentes (progenitor mieloide y progenitor linfoide) que dan origen a su vez a linajes celulares diferentes (Figura 14b). En el tercer modelo, conocido como trans-diferenciación, las CM de un tejido particular bajo condiciones de un microambiente diferente al original, adquieren la capacidad de generar células de muy diversos linajes (Figura 14c). El último modelo hace referencia a la capacidad que poseen las células maduras de de-diferenciarse y re-diferenciarse a células del mismo tejido que le dio origen o a un tejido diferente179 (Figura 14d). Figura 14a. Modelo clásico de diferenciación celular Figura 14b. Modelo de diferenciación celular para precursores comprometidos Figura 14c. Modelo de trans-diferenciación Figura 14d. Modelo de de-diferenciación y re-diferenciación Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 39 L LA A B BI IO OL LO OG GÍ ÍA A M MO OL LE EC CU UL LA AR R E EN N E EL L E ES ST TU UD DI IO O B BR RO ON NQ QU UI IA AL L El término biología molecular fue utilizado por primera vez en 1945 por William Astbury para referirse al estudio de la estructura química y física de las macromoléculas biológicas. Por aquel tiempo, los bioquímicos habían descubierto muchas reacciones químicas intracelulares fundamentales y habrían comprendido la importancia de las reacciones específicas y de la estructura de las proteínas para definir numerosas propiedades de las células. Sin embargo, el desarrollo de la biología molecular tuvo que esperar a que los adelantos más prolíficos se llevaran a cabo estudiando sistemas “sencillos” tales como bacterias y bacteriófagos (virus bacterianos), los cuales proporcionan información acerca de los procesos biológicos básicos de una forma más rápida que las células animales. A pesar de que las bacterias y los bacteriófagos son en sí mismos biológicamente muy complicados, permitieron a los científicos identificar el ADN como la molécula que contiene la mayoría, si no toda, de la información genética de una célula. Después de éste descubrimiento, el nuevo campo de la genética molecular avanzó rápidamente a finales de la década de los años 50 y principios de los años 60 proporcionando nuevos conceptos a una velocidad que sólo puede compararse con la del desarrollo de la mecánica cuántica en los años 20. El éxito inicial y la acumulación de una gran cantidad de información permitieron a los investigadores aplicar las técnicas y los poderosos métodos lógicos de la genética molecular a temas como la función nerviosa y muscular, la estructura de membrana, el modo de acción de los antibióticos, la diferenciación celular, el desarrollo, inmunología, etc. En el año 2001 se publicó la secuencia completa del genoma humano, y poco después se completó la del ratón y otras especies183. Esta información, constituye una excelente base para la investigación de los procesos moleculares relacionados con múltiples procesos patológicos o el mecanismo de acción de hormonas y fármacos. Sin embargo, la secuencia del genoma sólo nos aporta una información estructural del mismo y aún estamos muy lejos de conocer la anotación funcional de la mayor parte de los genes. Para intentar llenar este vacío, se ha desarrollado rápidamente la genómica funcional y en la actualidad disponemos de técnicas que permiten explorar a gran escala y con rapidez las funciones del genoma de múltiples especies. 6.1.- Regulación de la expresión génica Todas las células del organismo poseen la misma información genética, pero es la expresión de determinado número de genes lo que define a los distintos tipos 6 6 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 40 celulares. Esta expresión diferencial determina la producción y la activación de determinadas proteínas en respuesta por ejemplo, a los procesos de desarrollo celular e influencia ambiental. Algunos genes se expresan en niveles constantes en muchos tipos celulares, mientras que otros sólo se expresan en determinadas células o en respuesta a determinados estímulos. Los genes codifican proteínas, y son estas las que llevan a cabo las distintas funciones en la célula determinando sus propiedades. La producción de proteínas a partir de la información genética está regulada a distintos niveles. (Figura 15) El primer nivel hace referencia la integridad física del ADN, que como es sabido se encuentra fuertemente empaquetado en la cromatina, la cual controla el grado al que pueden actuar los reguladores de la transcripción y la maquinaria de ARN polimerasa sobre determinados genes. El inicio de la transcripción está estrictamente controlado por la presencia de co-reguladores y cofactores. El ARN producido es sometido a distintos procesos de maduración que afectará a sus propiedades. La funcionalidad del ARN mensajero (ARNm) depende del transporte desde el núcleo al citosol, de la estabilidad y ratio de degradación, y de la eficiencia translacional del transcrito. Y por último, la función y estabilidad de las proteínas producidas está regulada por modificaciones postraslacionales, por su localización y por su interacción con otras proteínas o ligandos. Lo ideal sería estudiar todos estos procesos dinámicos del genoma y las proteínas de manera conjunta, pero hasta ahora las técnicas de alta resolución sólo permiten mediciones estacionarias184. Figura 15. Regulación de la expresión génica Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 41 El inicio de la transcripción está regulado por una gran variedad de factores de transcripción. Algunos elementos en el inicio de la transcripción génica son comunes a muchas células, como lo son los factores de transcripción generales o la maquinaria de la ARN polimerasa. En última instancia, la cantidad de un ARN específico en una célula depende por tanto de la disponibilidad de todos estos factores. La ARN polimerasa interacciona con la región promotora de un gen para el inicio de la transcripción. Cada factor es capaz de reconocer una región específica en el ADN185. Puede ocurrir que determinados nucleótidos presentes en la región promotora condicionen una interacción más o menos intensa. El mecanismo general se resume de esta manera. El factor de transcripción IID se una a la caja-TATA, localizada en la región promotora. Se recluta al resto de la maquinaria ARN polimerasa y se inicia la transcripción. Estos factores controlan las proteínas y los ARNm que van a ser producidas en una célula, dándole así especificidad al sistema186. Distintos tipos de células pueden tener el mismo tipo de factores, pero es la diferencia en la concentración de éstos y las distintas combinaciones entre ellos lo que permite la activación o la inhibición de determinados genes en un momento dado. Así, dependiendo del lugar del ADN al que se unan los factores de transcripción en relación con el punto de inicio de la misma, y en qué combinación, se puede mediar la activación o la inhibición de determinados genes específicos. Incluso factores que no se han unido al ADN pueden influir sobre este proceso pudiéndose unir a otros que si se encuentran interaccionando con el material genético187. 6.2.- PCR y PCR cuantitativa en tiempo real Ideada por el científico Kary Mullis a mediados de los 80 y más conocida como PCR (Polymerase Chain Reaction)188, la reacción en cadena de la polimerasa ha cambiado el curso de las ciencias biológicas y biomédicas más que cualquier otra técnica inventada durante el siglo XX. El gran éxito científico de la PCR reside en que permite obtener in vitro un gran número de copias de fragmentos específicos de ADN, basándose en un principio muy sencillo: la utilización de mecanismos similares a los empleados por la propia célula en la replicación del ADN durante la división celular. Gracias a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se puede obtener un número muy alto de copias de ADN partiendo de un fragmento determinado del mismo189. Básicamente, consiste en someter al ADN a un ciclo de temperaturas siguiéndose estos pasos: (i) desnaturalización, (ii) alineamiento de los cebadores y (iii) extensión. Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban INTRODUCCIÓN 42 Una evolución importante de esta tecnología ha sido el desarrollo de la PCR cuantitativa a tiempo real (RT-PCR). La RT-PCR sigue el principio de la PCR convencional, pero con una serie de ventajas. Igualmente se necesita un ADN (cADN), una polimerasa, unos cebadores y unos fluorocromos190. Debido a que cada nuevo fragmento sintetizado lleva incorporado fluorocromos, es posible saber exactamente y en cada ciclo la cantidad de moléculas sintetizadas, que será proporcional a la señal de fluorescencia emitida. La cinética de la reacción de amplificación es por tanto conocida y registrada. Un algoritmo específico convierte la señal luminosa en un número que es usado por nosotros para saber cuánto se está generado en un determinado pocillo y en un determinado momento. Los sistemas de detección por fluorescencia empleados en esta técnica son de dos tipos; agentes intercalantes (SYBR Green) y sondas específicamente diseñadas que tienen incorporados los fluorocromos (Taqman). En esta Tesis Doctoral se ha hecho uso del primero de los sistemas. Esta técnica es muy rápida y fiable, y permite hacer estudios de expresión génica con facilidad, especificidad y elevada sensibilidad191,192. Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban JUSTIFICACIÓN 43 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban JUSTIFICACIÓN 44 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban JUSTIFICACIÓN 45 En la actualidad, la FBP continúa siendo una temible complicación postquirúrgica, a pesar de los avances experimentados en los cuidados perioperatorios y postoperatorios, así como de las técnicas quirúrgicas empleadas en Cirugía Torácica. La FBP compromete de una forma muy seria la vida del paciente y sus posibilidades de recuperación total tras la intervención, relegando a un segundo plano todos lo esfuerzos quirúrgicos y médicos realizados por tratar y en última medida curar al paciente de la neoplasia que amenza su vida. Las FBP postquirúrgicas son una de las causas que originan más reingresos hospitalarios tras las resecciones pulmonares. La mortalidad de una FBP perioperatoria es alta, y si el paciente requiere una intervención quirúrgica urgente para resolverla, el riesgo de fallecimiento se incrementa aún más. A pesar de que en la práctica clínica y de forma preventiva y en algunas ocasiones empírica, los cirujanos realizan coberturas del muñón bronquial para protegerlo de la isquemia adicional y la necrosis con pleura, grasa pericárdica, colgajos musculares y algunos sellantes biológicos de uso comercial, ninguno de los tratamientos ha demostrado ser óptimo para prevenir la FBP. Es por ello que el mejor tratamiento de la FBP es su prevención. Una lesión que altera la continuidad de la superficie de un tejido desencadena diversas reacciones celulares, mecanismos de reparación tisular y señales químicas para restablecer y modular la integridad del área lesionada. El bronquio es una estructura dinámica con multitud de tipos celulares y por tanto distintas respuestas a la agresión. Qué ocurre con el muñón bronquial remanente tras una resección pulmonar, qué mecanismos moleculares están implicados en sus fases de reparación y si estas respuestas pueden ser moduladas por agentes biológicos externos es algo que aún no se conoce. En este sentido, existen escasos estudios que valoren el uso preventivo de sellantes biológicos y su influencia sobre la reparación del muñón bronquial. Todas estas evidencias demandan un esfuerzo de investigación experimental básica. En concreto, un esfuerzo dirigido a la búsqueda de tratamientos preventivos de la FBP y al conocimiento de los rutas moleculares implicadas en sus mecanismos de acción. Con este deseo se ha desarrollado la presente Tesis Doctoral en la que nos propusimos estudiar y valorar en el animal de experimentación, la capacidad de cicatrización del muñón bronquial tras una neumonectomía, mediante la aplicación local de un sellante de fibrina como es el Tissucol®, el plasma autólogo y el trasplante de células madre, directo o vehiculizado con Tissucol®, con la finalidad de prevenir la aparición de la FBP y sus complicaciones. Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban JUSTIFICACIÓN 46 Este conocimiento podría ayudar a entender mejor la fisiopatología de la cicatrización y remodelado del muñón bronquial tras una resección pulmonar y sentar unas bases más sólidas que permitan desarrollar estrategias terapéuticas específicas y preventivas de la FBP que, en última instancia y con carácter traslacional, ayuden a mejorar la esperanza de vida de los pacientes sometidos a una resección pulmonar. Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban OBJETIVOS 47 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban MATERIAL Y MÉDOTO 54 minerales, semillas de oleaginosas y productos de pescado (R.02-E Standard Diet, Prolabor, España). Se suministró agua ad libitum con pH 6,5 8,5; y el encamado consistía en viruta de bagazo de caña desmeollado. La monitorización microbiológica de rutina, de acuerdo a las recomendaciones de la FELASA, no ha revelado presencia de patógenos en ratas durante el periodo del estudio experimental194. Siguiendo las recomendaciones de FELASA, se ha supervisado en todo momento la conducta, el estrés y el bienestar de los animales195. De este modo se han valorado signos fisiológicos oculares (hematoporfirina y hundimiento del globo ocular), respiratorios (estornudo, flujo nasal y frecuencia respiratoria), aspecto externo (piloerección, lordosis, deshidratación y pérdida de peso) y signos de actividad anormal (somnolencia, anorexia, automutilación y vocalización). Se han seguido las normas internacionales y nacionales vigentes sobre cuidado y protección de los animales de experimentación, bajo condiciones sanitarias en la categoría de convencional limpio de acuerdo a las recomendaciones y exigencias recogidas en el Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos (National Research Council, 1996), Directiva del Consejo Europeo 86/609 (DirectivaComisión de las Comunidades Europeas, 1986), Real Decreto Español 1201/2005 (Ministerio Presidencia, 2005) y la Ley 32/2007 (Cortes Generales, 2007). 1.2.- Salas, equipos y material inventariable Para el desarrollo del modelo experimental, se ha utilizado el quirófano I para animales inmunocompetentes con nivel de contención biológica II y las salas de preoperatorio y postoperatorio de la Unidad de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín. Así como, ventiladores Servo 900® (Siemens-Elema, Suecia), microscopio de pie Zeiss OPMI® 9-12,5x (West, Alemania), nevera Misa® de 4 ºC y congelador Revco® de -70 ºC. Figura 17. Quirófano de la Unidad – HUGC Dr. Negrín Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban MATERIAL Y MÉDOTO 55 1.3.- Material quirúrgico Para garantizar un mínimo de esterilidad se han utilizado paños quirúrgicos estériles, así también bisturís nº 22, jeringas de insulina, agujas 25 G, tijeras de Metzembaum y Mayo, pinzas de disección, pinzas de Adson, pinzas de microcirugía (relojero), tijeras de microcirugía, tijeras de microcirugía Westcott, porta aguja Baumgartner, blefarostato Murdock, microportaguja Castroviejo estriado, micro porta aguja Barraquer, suturas de Vycril® (Jonhnson and Jonhnson, Madrid , España) y seda negra 3/0 (Silkan®. B. Braun Surgical S.A. España), ligaduras de Surgipro II® de 6/0 y 7/0 (Tyco-Healthcare, USA), torundas y gasas estériles. 1.4.- Medicación anestésica y analgésica Los fármacos que se han empleado en la anestesia de los animales han sido: lidocaína 1% (Xilonibsa®, Inibsa, Barcelona, España), medetomidina (Domtor®, Pfizer, Madrid, España), ketamina (Ketolar 500®, Pfizer, Madrid, España) y atropina 1% (Atropina®, Braun, Madrid, España). El efecto de la medetomidina se ha revertido con su antagonista, el atipamezol (Antisedan®, Pfizer, Madrid, España.) Como analgésico postoperatorio se ha empleado la buprenorfina (Buprex®, Shering-Plug. Barcelona. España). 1.5.- Material utilizado para las mediciones Las muestras se fijaron en formol 3,7 - 4% en recipientes de vidrio oscuro y a temperatura ambiente. La deshidratación se llevó a cabo con alcoholes y xilol (Leica, TP-1050, Leica Instruments, Gmbh, Nussloch, Alemania). Las muestras se incluyeron en parafina (Leica, Reichert-Jung Histoembedder, Leica Instruments, Gmbh, Nussloch, Alemania). Para la preparación de las secciones se utilizaron un microtomo (Leica, LR-2055, Leica Instruments, Gmbh, Nussloch, Alemania), un calentador de agua P Selecta y portaobjetos 76 x 26 Knittel Glaber. Para la coloración de las muestras en Hematoxilina-Eosina se necesitó los siguientes materiales: hematoxilina, alcohol etílico, potasio alume, agua destilada, óxido mercúrico, ácido acético glacial, eosina soluble en agua. Para purificar el RNA se usó GITC-fenol/cloroformo. El bromuro de etidio de Pierce (Rockford, IL). Para la síntesis del cADN se uso el kit Script cADN síntesis (BioRad, Barcelona-España). Los cebadores fueron fabricados por Thermo Electrón (www.thermo.co). Para realizar las PCRs a tiempo real se usó SYBR Green (Foster City, CA). El resto de reactivos procedían de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban MATERIAL Y MÉDOTO 56 M MÉ ÉT TO OD DO O 2.1.- Diseño Se diseñó un estudio experimental con un total de 121 ratas de la cepa Sprague-Dawley, realizándose a todas ellas una neumonectomía izquierda. Tras la misma y sobre el muñon bronquial se aplicó localmente 4 tipos de sellantes biológicos salvo en los animales del grupo control que no recibieron tratamiento. Tras el sacrificio del animal se extrajo el muñón bronquial para estudio histológico o de expresión génica. Para el anásis histológico se han seleccionado 61 animales, que han sido distribuídos aleatoriamente en cinco grupos: a) grupo control, b) grupo que recibió Tissucol®, c) grupo que recibió plasma fresco pobre en plaquetas (PPP), d) grupo que recibió ADSC y e) grupo que recibió Tissucol®+ADSC. Cada grupo ha sido subdividido, a su vez, en 2 subgrupos en función del tiempo de sacrificio establecido: 10 y 20 días postneumonectomía (Tabla VIII). Tabla VIII. Diseño de los grupos para el estudio histológico Grupo Tratamiento Nº de animales TOTAL 10 días 20 días A Grupo Control 6 7 13 B Grupo Tissucol® 6 6 12 C Grupo PPP 6 6 12 D Grupo ADSC 6 6 12 E Grupo Tissucol® + ADSC 6 6 12 TOTAL 30 31 61 Para el estudio de expresión génica se han seleccionado 60 animales, que han sido distribuídos teniendo en cuenta los mismos criterios utilizados para el estudio histológico. (Tabla IX). 2 2 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban MATERIAL Y MÉDOTO 57 Tabla IX. Diseño de los grupos para el estudio genómico Grupo Tratamiento Nº de animales TOTAL 10 días 20 días A Grupo Control 6 6 12 B Grupo Tissucol® 6 6 12 C Grupo PPP 6 6 12 D Grupo ADSC 6 6 12 E Grupo Tissucol® + ADSC 6 6 12 TOTAL 30 30 60 2.2.- Técnica quirúrgica -Modelo quirúrgico de neumonectomía con posterior sutura y sellado del muñón bronquial Para la anestesia de los animales se ha utilizado un protocolo de combinación de un α-2 agonista (medetomidina) y un agente disociativo (ketamina) por vía parenteral196. De este modo se ha procedido a la premedicación con 0,5 mg/kg sc de medetomidina (Domtor® Pfizer, Madrid, España), tras 5 minutos y una vez comprobada la sedación del animal se ha inyectado 75 mg/kg ip de ketamina (Ketolar 500®, Pfizer, Madrid, España). Finalmente se ha inyectado 0,04 mg/kg im de atropina (Atropina® Braun, España) a los 3 minutos de administrar la ketamina (Figura 18). Figura 18. Fármacos anestésicos. A: Domtor®, Ketamina® y atropina®. B: Xilonibsa®. C: Antisedan®. D: Betadine®. E: Buprex® Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban MATERIAL Y MÉDOTO 58 Una vez anestesiado se ha rasurado la piel del hemitórax izquierdo. Tras esto, se ha procedido a realizar una intubación orotraqueal (IOT) del animal (Figura 19) según la técnica descrita por Weksler y cols197. Para ello se ha aplicado, al final de la laringe, lidocaína al 2% (Xylonibsa®, Inibsa, Barcelona, España) con una torunda de algodón para prevenir el espasmo de la musculatura laríngea. Para localizar los cartílagos aritenoides, se ha desplazado la epiglotis con la ayuda de una guía de teflón de punta roma que se ha introducido entre dichos cartílagos en el interior de la laringe hasta una profundidad aproximada de 0,5 cm. A través de la guía mencionada, se ha introducido un catéter intravenoso de 14 G x 51 mm (Abbocath®-T, Abbot Ireland Ltd., Sligo, Irlanda) en la tráquea. Tras retirar la guía de la boca del animal, el catéter se ha asegurado al maxilar superior para evitar su desplazamiento durante la intervención. Se ha posicionado al animal en decúbito lateral derecho y se ha fijado el miembro torácico izquierdo en extensión completa (Figura 20). Figura 19. Intubación orotraqueal Figura 20. Posición decúbito-lateral derecho del animal Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban MATERIAL Y MÉDOTO 59 Se ha ventilado al animal con un ventilador SERVO 900 (Siemens S.A., Madrid, España) (Figura 21) con una presión de 12 cm de H2O, una relación inspiración/espiración de 1:2, frecuencia respiratoria de 60 rpm, y una FiO2 de 0,21. Una vez comprobada la estabilidad respiratoria del animal y la consecución de un adecuado plano anestésico (ausencia de movimientos voluntarios respiratorios, no presencia de distrés respiratorio, coloración de mucosas normales y la ausencia de reflejo palpebral y patelar), se ha realizado una toracotomía posterolateral izquierda. Con tijeras de Mayo se ha realizado una disección roma del plano subcutáneo hasta visualizar el latíssimus dorsi y los músculos serratus dorsalis y ventralis, los cuales se han seccionado exponiéndose de este modo las costillas y la musculatura intercostal (Figura 22). Se ha abierto el 4º espacio intercostal con tijeras de microcirugía Westcott (Figura 23), y se ha utilizado como separador torácico un blefarostato. Se ha extraido el pulmón de la cavidad torácica y se ha colocado un clip de folios que ha servido de medio de tracción. Figura 22. Toracotomía posterolateral izquierda. Exposición de músculos intercostales y costillas. Figura21. Ventilador SERVO 900® Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban MATERIAL Y MÉDOTO 60 A continuación, se ha procedió a la disección del hilio pulmonar con la identificación de la arteria, bronquio y vena pulmonar (Figura 24). Se ha ligado la arteria y la vena pulmonar con sutura monofilamentosa 6/0 no absorbible de polipropileno del 6-0 (Surgipro II , Tyco-Healthcare, USA) y seccionadas próximas al corazón. Se ha colocado un clip de titanio próximo a la carina traqueal (Surgiclip II M-11.5, Autosuture Premium, Tyco-Healthcare, USA) (Figura 25) y se ha cortado el bronquio dejando 2 cartílagos bronquiales distales al clip, y se han aproximado los bordes bronquiales con la colocación de dos puntos de 6/0 de Surgipro II (Figura 26). Figura 23. Incisión en el 4º espacio intercostal. Se observa músculo intercostal y pleura parietal. Figura 24. Tracción de pulmón izquierdo y disección del hilio pulmonar Hilio Pulmonar Pulmón Izquierdo Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban MATERIAL Y MÉDOTO 61 Finalmente, se ha procedido al cierre de la toracotomía aproximando las costillas con puntos en “x” mediante una sutura absorbible 3/0 polyglactin 910 (Vicryl®, Ethicon, Inc, Johnson and Johnson Intl, Brussels, Belgium). Posteriormente, se ha realizado una sutura continua de los planos musculares y subcutáneo con sutura absorbible 3/0 de Vicryl® y una sutura de puntos simples en la piel con sutura no absorbible de 3/0 (Silkan®, B. Braun Surgical S.A, España). Para revertir el plano anestésico se ha administrado 0,5 mg/kg im de atipamezol (Antisedan®, Pfizer, Madrid, Spain) (Figura 18-C). Se ha colocado un drenaje pleural de pequeño calibre (Pleurocath® de 8 french) conectado a un sello de agua (Figura 27) con la finalidad de devolver a la cavidad torácica su presión negativa. Cuando el animal ha presentado respiración espontánea, se ha procedido a retirar el drenaje y se ha suturado la piel de la zona de salida del mismo con un punto en U (Figura 28) de Silkan® 3/0. Se ha efectuado la antisepsia de las incisiones realizadas en la piel con aplicación tópica de povidona yodada (Betadine®. Laboratorios Asta Médica, Madrid, España) (Figura 18-D). Figura 26. Sutura del muñón bronquial. Se observa clip e hilos de sutura Muñón bronquial Figura 25. Clips de titanio Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban MATERIAL Y MÉDOTO 62 2.3.- Cuidados postoperatorios Tras la cirugía, los animales fueron llevados al área postoperatoria de la Unidad de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín para proveerles de los cuidados necesarios hasta el momento del sacrificio. Estos cuidados incluían: 1) calor y confort, 2) cuidados respiratorios, 3) hidratación, 4) control del dolor y cuidados generales. Figura 27. Colocación del drenaje pleural. De esta manera se devolverá presión negativa a la cavidad torácica. Figura 28. Cierre de Toracotomía Figura 29. Salas de pre y postoperatorio Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban MATERIAL Y MÉDOTO 63 1. Calor y confort Para prevenir la hipotermia, los animales del estudio se colocaron dentro de sus jaulas sobre un lecho a base de viruta de bagazo de caña desmeollado, y expuestos al calor de lámparas. La temperatura media del ambiente ha sido de 21+1 ºC. Un termómetro indicaba la conveniencia o no de la temperatura. 2. Cuidados respiratorios Se controlaron periódicamente los movimientos respiratorios de los animales prestando especial atención a la presencia de signos de depresión respiratoria. 3. Hidratación En el estudio, los animales fueron hidratados durante las primeras 24 horas con 2,5 mL/Kg de peso de Ringer lactato inmediatamente tras la operación y con 2 mL/Kg de peso de dextrosa 4% a las 12 h de la intervención. 4. Control del dolor Finalmente y como analgésico, se ha administrado a todos los animales 0,03 mg/Kg/12h sc de buprenorfina (Buprex®, Schering-Plough, Madrid, España) (Figura 18-E) durante las primeras 48 horas postcirugía, administrando la primera dosis una hora después de la inyección de atipamezol. 2.4.- Tratamientos sellantes del muñón bronquial Dependiendo del grupo de animales neumonectomizados, se ha procedido a la aplicación local y directa sobre el muñón bronquial de los tratamientos sujetos a estudio: Tissucol®, PPP autólogo, ADSC, ADSC + Tissucol®. 2.4.1.- Obtención del PPP autólogo Durante la toracotomía lateral izquierda y previa a la neumonectomía, se ha extraído asépticamente con una aguja de 22 G x 1 ¼” por punción cardíaca, 1.5 ml de sangre que contenía una media de 717.285±190.973 plaquetas/µl. La sangre se ha depositado en un tubo de ensayo de 5 ml que contenía 0.15 ml de citrato de sodio (9NC 0.129M; BD Vacutainer Systems®, Stewartby, UK), y se han mezclado suavemente con la finalidad de homogenizar el contenido. Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban MATERIAL Y MÉDOTO 70 Cat.No. 04896866001, Mannchim-Alemania), siguiendo las recomendaciones del fabricante y se ha seguido el siguiente protocolo: Una vez que se han descongelado y centrifugado los reactivos, se han mantenido en hielo, en tubos de 0,2 ml adecuadamente rotulados a los que se ha añadido: el ARN muestra (para obtener 1ug de ARN total), 1ul de Anchored-oligo (dt) 18 primer (vial 5), 2ul de Random Hexamer Primer (vial 6), agua, para un volumen total final de 13 ul. A continuación, se han desnaturalizado las muestras a 65°C durante 10 minutos y se han colocado los tubos en hielo. A cada tubo se le ha añadido, y en este orden, lo siguiente: 4ul de Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer 5x (vial 2), 0,5ul de Protector RNase inhibitor, 40U/ul (vial 3), 2ul de Deoxynucleotide Mix, 10mM (vial 4) y 0,5ul de Transcriptor Reverse Transcriptase, 20U/ul (vial 1), para un volumen total final de 20ul. Una vez que se les ha añadido los reactivos anteriores, se ha mezclado bien (sin utilizar vortex) y se ha centrifugado los tubos para luego ser colocados en el bloque del termociclador, pasando todo ellos por los siguientes programas: 10 minutos a 25°C para que se unan los Random Hexamer Primer, 60 minutos a 50°C para que el Transcriptor Reverse Transcriptase sintetice cADN, 5 minutos 85°C para que el ARNasa digiera el ARN mensajero y mantenerse a 4°C para que no se degrade el cADN. Acabada la etapa del termociclador, los tubos con el cADN ya sintetizado se han conservado en una nevera a -20°C 2.6.3.2.- Determinación de la expresión genómica mediante qRT-PCR Se ha utilizado un termociclador de capilares LightCycler® 1.5 (Roche, Mannheim, Alemania), con el kit “LightCycler FastStart ADN Master SYBR Green I” (Roche, Cat. No. 12 239 264 001) y el software de Lightcycler 3. 5. 3. y se han seguido las instrucciones del fabricante. Figura 38. Termociclador de capilares LightCycler® 1.5 . Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban MATERIAL Y MÉDOTO 71 Los cebadores que se han usado para cada uno de los genes del estudio han sido diseñados utilizando el software online “Primer3” (http://frodo.wi.mit.edu/) y posteriormente se han optimizado con la temperatura de anillado y la concentración de MgCl2. La especificidad de los cebadores ha sido comprobada mediante electroforesis en gel de agarosa, para ello se ha realizado un pool de cada grupo experimental y con cada pareja de primers de los genes estudiados, se ha hecho una PCR con la que posteriormente se ha realizado una electroforesis en gel de agarosa y se ha comprobado que generaba una banda del tamaño esperado. El fragmento amplificado se ha analizado mediante una curva de melting que permite la identificación y diferenciación de las variantes genéticas. Los cebadores específicos que se han empleado y las condiciones de la RTPCR en tiempo real han sido recogidos en la tabla X. Los resultados han sido corregidos mediante el gen PPIA (peptidylprolyl isomerase A, ciclofilina A) como housekeeping gene199, ya que es el que presenta una expresión más estable. Tabla X. Genes y condiciones de la PCR en tiempo real Gen Numero Descripción Prime Foward Prime Reverse Tamaño (BP) PPIA NM_017101 peptidylprolyl isomerase A, ciclofilina A GGTGACTTCAC ACGCCATAA AGCCACTC AGTCTTGG CAGT 173 Igf-1 NM_178866 factor de crecimiento ligado a insulina 1 TCTGAGGAGG CT GGAGATGT GTTCCGAT GTTTTGCA GGTT 240 Tgfβ-1 NM_021578 factor de transformación de crecimiento, beta 1 TGAGTGGCTGT CTTTTGACG TGGGAGTG ATCCCATT GATT 146 Ctgf NM_022266 factor de crecimiento de tejido conectivo AGACCTGT GCCTGCCA TTAC ACTTCGGT GGGGTGTT TTC 242 Vegfa NM_001110334 factor de crecimiento endotelial vascular GCCCATGAAG TGGTGAAGTT TATGTGCT GGCTTTGG TGAG 243 Sox6 NM_001024751 SRY (sex determining region Y)-box 6 CTGCCTCTGCA CCCCATAATG TTGCTGAG ATGACAGA ACGCT 111 Agc-1 NM_022190 Aggrecan 1 CCTGCTACTTC ATCGACCCC AGATGCTG TTGACTCG AACCT 150 Col2a1 NM_012929 colágeno type II alfa 1 CTCACGCCTTC CCATTGTT ATCAGGTC AGGTCAGC CATTC 201 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban MATERIAL Y MÉDOTO 72 2.7.- Análisis estadístico El análisis estadístico se ha realizado mediante el paquete estadístico SPSS v15.0 para Windows (2005, SPSS Inc. Illinois, USA). La expresión de los genes la mostramos como media con su desviación estándar (SD), salvo Vegfa que se ha valorado en base a la mediana con valores mínimo y máximo. Las determinaciones histológicas se expresan en porcentajes. Para los contrastes de hipótesis hemos considerado un error α= 0.05. Hemos aplicado el test de la U de Mann Whitney para dos muestras independientes para verificar las diferencias en la expresión de los genes, ya que estas no siguen una distribución normal (Test de KolmogorovSmirnov). Se ha realizado el Test de Chi-Cuadrado con la razón de verosimilitud (RV) para valorar la asociación de las determinaciones histológicas de los tratamientos versus los controles. Se ha considerado que existía significación estadística si p<0,05. Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban RESULTADOS 73 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban RESULTADOS 74 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban RESULTADOS 75 1.- Evolución clínica del período postoperatorio En general, los animales operados (n=121) en todos los grupos se han recuperado satisfactoriamente de la anestesia después de la cirugía, aunque con evidentes signos de hipotermia, que se han controlado con fuentes de calor. Los animales han presentado movimientos respiratorios espontáneos y el reflejo ocular en los 2 primeros minutos posteriores a la administración de atipamezol. La posición fisiológica y la deambulación la han recuperado entre los 3 y los 5 minutos. También se ha apreciado que el 80% de los animales han presentado hemoporfirina alrdedor de los ojos, debido al malestar propio de la cirugía pero que desaparecía a los 2 días. No se ha observado exudados serohemorrágicos por naríz, ni disnea producto de la cirugía. Se han producido 4 muertes; 2 en los animales del grupo control debido a FBP precoz debida a fallo mecánico en la estanquiedad del cierre bronquial con el microclip bronquial durante el acto quirúrgico, 1 en el grupo de ADSC y 1 en el grupo Tissucol®+ADSC debido a edema del pulmón contralateral (Tabla XII). El tiempo quirúrgico empleado ha tenido una duración de 45 – 50 min hasta el cierre de la piel. Tabla XI. Número de muertes en los grupos GRUPO TRATADO CAUSA DE MUERTE TOTAL Control FBP precoz 2 ADSC Edema pulmonar 1 Tissucol ®+ ADSC Edema pulmonar 1 2.- Determinaciones histológicas 2.1.-Influencia del tratamiento local sobre el muñon bronquial A continuación mostramos los resultados del estudio histológico después de agrupar todos lo animales que han recibido tratamiento y compararlos con la evolución natural del munón bronquial. Podemos observar que en la mucosa y submucosa: Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban RESULTADOS 76 1.-Existe una tendencia a producir más inflamación en los animales tratados a 20 días, ya que un 26% de los animales tratados presenta inflamación moderada frente a ninguno del grupo control (p=0,057). 2.-El tratamiento induce una tendencia a la fibrosis localizada ya que el 31,8% de estos animales presentan fibrosis focal a los 10 días (p=0,096). 3.-Los animales tratados presentan significativamente menos necrosis de la mucosa y de la submucosa a los 20 días de la cirugía (p=0,034). Mucosa y Submucosa Control Caso p Inflamación 10 días Leve Recuento 3 16 0,842 % 75 72,7 Moderada Recuento 0 1 % 0 4,5 Grave Recuento 1 5 % 25 22,7 Total Recuento 4 22 % 100 100 20 días Leve Recuento 7 17 0,057 % 100 73,9 Moderada Recuento 0 6 % 0 26,1 Grave Recuento 0 0 % 0 0 Total Recuento 7 23 % 100 100 Fibrosis 10 días Inexistente Recuento 0 0 0,096 % 0 0 Focal Recuento 0 7 % 0 31,8 Difusa Recuento 4 15 % 100 68,2 Total Recuento 4 22 % 100 100 20 días Inexistente Recuento 0 1 0,760 % 0 4 Focal Recuento 4 13 % 57,1 56,5 Difusa Recuento 3 9 % 43 39 Total Recuento 7 23 Tabla XII. Hallazgos microscópicos de mucosa y submucosa bronquial Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban RESULTADOS 77 % 100 100 Úlceras 10 días Inexistente Recuento 2 12 0,867 % 50 54,5 Focal Recuento 2 10 % 50 45,5 Total Recuento 4 22 % 100 100 20 días Inexistente Recuento 4 14 0,860 % 57,1 60,9 Focal Recuento 3 9 % 42,9 39,1 Total Recuento 7 23 % 100 100 Necrosis 10 días No Recuento 4 16 0,129 % 100 72,7 Si Recuento 0 6 % 0 27,3 Total Recuento 4 22 % 100 100 20 días No Recuento 4 21 0,034 % 57,1 91,3 Si Recuento 3 2 % 42,9 8,7 Total Recuento 7 23 % 100 100 A nivel de la pared bronquial observamos que: 1.-Hay un mayor grado de inflamación (grave) en los animales que han recibido tratamiento a los 10 días (p=0,012) que no se aprecia en los animales controles. 2.-El tratamiento del muñón induce un grado menor de fibrosis de la pared (fibrosis focal) a los 10 días con respecto a los controles, que no es estadísticamente significativa (p=0,171). 3.-El tratamiento del muñón protege de la necrosis frente a la evolución natural del muñon a los 20 días (p=0,001). Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban RESULTADOS 78 Pared bronquial Control Caso p Inflamación 10 días Leve Recuento 4 6 0,012 % 100 27,3 Moderada Recuento 0 7 % 0 31,8 Grave Recuento 0 9 % 0 40,9 Total Recuento 4 22 % 100 100 20 días Leve Recuento 6 17 0,518 % 85,7 73,9 Moderada Recuento 1 6 % 14,3 26,1 Grave Recuento 0 0 % 0 0 Total Recuento 7 23 % 100 100 Fibrosis 10 días Inexistente Recuento 0 0 0,171 % 0 0 Difuso Recuento 4 17 % 100 77,3 Focal Recuento 0 5 % 0 22,7 Total Recuento 4 22 % 100 100 20 días Inexistente Recuento 0 0 0,300 % 0 0 Difuso Recuento 6 15 % 85,7 65,2 Focal Recuento 1 8 % 14,3 34,8 Total Recuento 7 23 % 100 100 Necrosis 10 días Sí Recuento 0 2 0,404 % 0 9,1 No Recuento 4 20 % 100 90,9 Total Recuento 4 22 % 100 100 20 días Sí Recuento 5 2 0,001 % 71,4 8,7 No Recuento 2 21 % 28,6 91,3 Total Recuento 7 23 Tabla XIII. Hallazgos microscópicos de la pared bronquial Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban RESULTADOS 79 % 100 100 A nivel de la pleura peribronquial observamos que: 1.-El tratamiento muestra una tendencia a inducir mayor grado de inflamación a los 10 días (p=0,093) que es significativa a los 20 días (p=0,023). Pleura peribronquial Control Caso p Inflamación 10 días Leve Recuento 2 3 0,093 % 50 13 Moderada Recuento 2 11 % 50 47,8 Grave Recuento 0 9 % 0 39,1 Total Recuento 4 23 % 100 100 20 días Leve Recuento 7 12 0,023 % 100 52,2 Moderada Recuento 0 5 % 0 21,7 Grave Recuento 0 6 % 0,0 26,1 Total Recuento 7 23 % 100 100 Fibrosis 10 días Inexistente Recuento 1 1 0,325 % 25 4,3 Focal Recuento 1 10 % 25 43,5 Difuso Recuento 2 12 % 50 52,2 Total Recuento 4 23 % 100 100 20 días Inexistente Recuento 2 4 0,554 % 28,6 17,4 Focal Recuento 4 11 % 57,1 47,8 Difuso Recuento 1 8 % 14,3 34,8 Total Recuento 7 23 % 100 100 Tabla XIV. Hallazgos microscópicos de la pleura peribronquial Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban RESULTADOS 86 Úlceras 10 días Inexistente Recuento 2 1 0,260 % 50 16,7 Focal Recuento 2 5 % 50 83,3 Total Recuento 4 6 % 100 100 20 días Inexistente Recuento 4 1 0,125 % 57,1 16,7 Focal Recuento 3 5 % 42,9 83,3 Total Recuento 7 6 % 100 100 Necrosis 10 días No Recuento 4 4 0,124 % 100 67 Si Recuento 0 2 % 0 33 Total Recuento 4 6 % 100 100 20 días No Recuento 4 6 0,034 % 57 100 Si Recuento 3 0 % 43 0 Total Recuento 7 6 % 100 100 A nivel de la pared bronquial observamos en la Tabla XIX que: 1.-Mayor grado de inflamación (moderada y grave) en los animales que han recibido PPP a los 10 días (p=0,006). 2.-El tratamiento del muñón con PPP induce a los 10 y 20 días una distribución difusa de la fibrosis semejante a los controles, y a diferencia de lo que ocurre con el Tissucol®. 3.-Protege al muñón de la necrosis a los 20 días ya que ninguno de los animales tratados presentó necrosis frente a un 71,4% de los animales controles que si lo presentaron (p=0,003). Pared bronquial Control PPP p Inflamación 10 días Leve Recuento 4 0 0,006 % 100 0 Moderada Recuento 0 2 Tabla XIX. Hallazgos microscópicos de la Pared bronquial con PPP Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban RESULTADOS 87 % 0 33,3 Grave Recuento 0 4 % 0 66,7 Total Recuento 4 6 % 100 100 20 días Leve Recuento 6 4 0,416 % 85,7 66,7 Moderada Recuento 1 2 % 14,3 33,3 Grave Recuento 0 0 % 0 0 Total Recuento 7 6 % 100 100 Fibrosis 10 días Inexistente Recuento 0 0 % 0 0 Focal Recuento 0 0 % 0 0,0 Difuso Recuento 4 6 % 100 100 Total Recuento 4 6 % 100 100 20 días Inexistente Recuento 0 0 0,416 % 0 0 Focal Recuento 1 2 % 14,3 33,3 Difuso Recuento 6 4 % 85,7 66,7 Total Recuento 7 6 % 100 100 Necrosis 10 días Sí Recuento 0 0 % 0 0 No Recuento 4 6 % 100 100 Total Recuento 4 6 % 100 100 20 días Sí Recuento 5 0 0,003 % 71,4 0 No Recuento 2 6 % 28,6 100 Total Recuento 7 6 % 100 100 A nivel de la pleura peribronquial, en la Tabla XX se observa: Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban RESULTADOS 88 1.-Una tendencia a producir mayor grado de inflamación (grave) a los 20 días (p=0,057). 2.-Un predominio a producir fibrosis con distribución focal de la misma a los 10 días (p=0,435) y 20 días (0,210) ya que todos los animales tratados prsentaron signos de fibrosis. Pleura peribronquial Control PPP p Inflamación 10 días Leve Recuento 2 1 0,233 % 50 16,7 Moderada Recuento 2 3 % 50 50 Grave Recuento 0 2 % 0 33,3 Total Recuento 4 6 % 100 100 20 días Leve Recuento 7 3 0,057 % 100 50 Moderada Recuento 0 2 % 0,0 33,3 Grave Recuento 0 1 % 0 16,7 Total Recuento 7 6 % 100 100 Fibrosis 10 días Inexistente Recuento 1 0 0,435 % 25 0,0 Focal Recuento 1 2 % 25,0 33,3 Difuso Recuento 2 4 % 50 66,7 Total Recuento 4 6 % 100 100 20 días Inexistente Recuento 2 0 0,210 % 29 0,0 Focal Recuento 4 4 % 57,1 66,7 Difuso Recuento 1 2 % 14,3 33,3 Total Recuento 7 6 % 100 100 Tabla XX. Hallazgos microscópicos de la pleura peribronquial con PPP Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban RESULTADOS 89 2.4.-Influencia del tratamiento con ADSC Desde el punto de vista macroscópico pudimos observar una masa de tejido de consistencia fibrosa de aproximadamente 0.8 cm a los 20 días, que rodeaba los bordes del muñón e incluso se encontraba adherida a la pared costal coincidiendo con la toracotomia. (Figura 40). En la Tabla XXI se muestran los hallazgos histológicos observados en el muñón bronquial de los animales tratados con ADSC tras la neumonectomía. Podemos observar que en la mucosa y sumbucosa: 1.-Se produce más inflamación en los animales tratados con células madre a los 20 días, ya que un 40% de los animales tratados presenta inflamación moderada frente a ninguno del grupo control (p=0,043). 2.-Evita la aparición de úlceras a los 10 días (p=0,046) y a los 20 días (p=0,047). 3.-Protege de la producción de necrosis a los 20 días ya que ninguno de los animales tratados presentó necrosis frente a un 43% de los animales controles que si lo presentaron (p=0,047). Mucosa y submucosa Control ADSC p Inflamación 10 días Leve Recuento 3 4 0,246 % 75 80 Tabla XXI. Hallazgos microscópicos de la mucosa y submucosa con ADSC Figura 40. Vista macroscópica del muñón bronquial, grupo ADSC. A: muñón bronquial. B: Parrilla costal. Obsérvese la masa blanquecina que engloba el muñón bronquial y que se encuentra pegada a la parrilla costal (flecha). A B Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban RESULTADOS 90 Moderada Recuento 0 1 % 0 20 Grave Recuento 1 0 % 25 0 Total Recuento 4 5 % 100 100 20 días Leve Recuento 7 3 0,043 % 100 60 Moderada Recuento 0 2 % 0 40 Grave Recuento 0 0 % 0 0 Total Recuento 7 5 % 100 100 Fibrosis 10 días Inexistente Recuento 0 0 0,259 % 0 0 Focal Recuento 0 1 % 0 20 Difusa Recuento 4 4 % 100 80 Total Recuento 4 5 % 100 100 20 días Inexistente Recuento 0 0 0,921 % 0 0,0 Focal Recuento 4 3 % 57,1 60 Difusa Recuento 3 2 % 43 40 Total Recuento 7 5 % 100 100 Úlceras 10 días Inexistente Recuento 2 5 0,046 % 50 100 Focal Recuento 2 0 % 50 0 Difusa Recuento 0 0 % 0 0 Total Recuento 4 5 % 100 100 20 días Inexistente Recuento 4 5 0,047 % 57 100 Focal Recuento 3 0 % 43 0 Difusa Recuento 0 0 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban RESULTADOS 91 % 0 0 Total Recuento 7 5 % 100 100 Necrosis 10 días No Recuento 4 5 % 100 100 Si Recuento 0 0 % 0 0 Total Recuento 4 5 % 100 100 20 días No Recuento 4 5 0,047 % 57,1 100 Si Recuento 3 0 % 100 0 Total Recuento 7 5 % 100 100 A nivel de la pared bronquial (Tabla XXII) observamos que: 1.-Produce un mayor grado de inflamación (moderada y grave) en los animales que han recibido tratramiento con ADSC a los 10 días (p=0,025) que no se aprecia en los animales controles. 2.-Protege de la aparición de necrosis a los 20 días ya que ninguno de los animales tratados presentó necrosis frente a un 71,4% de los animales controles que si lo presentaron (p=0,005). 3.- Presencia de células de gran tamaño en el tejido conectivo de la pared bronquial. Pared bronquial Control ADSC p Inflamación 10 días Leve Recuento 4 1 0,025 % 100 20 Moderada Recuento 0 3 % 0 60 Grave Recuento 0 1 % 0 20 Total Recuento 4 5 % 100 100 20 días Leve Recuento 6 4 0,793 % 85,7 80 Tabla XXII. Hallazgos microscópicos de la pared bronquial con ADSC Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban RESULTADOS 92 Moderada Recuento 1 1 % 14,3 20 Grave Recuento 0 0 % 0 0 Total Recuento 7 5 % 100 100 Fibrosis 10 días Inexistente Recuento 0 0 0,259 % 0 0 Focal Recuento 0 1 % 0 20 Difuso Recuento 4 4 % 100 80 Total Recuento 4 5 % 100 100 20 días Inexistente Recuento 0 0 0,310 % 0 0 Focal Recuento 1 2 % 14,3 40 Difuso Recuento 6 3 % 85,7 60 Total Recuento 7 5 % 100 100 Necrosis 10 días Sí Recuento 0 0 % 0 0 No Recuento 4 5 % 100 100 Total Recuento 4 5 % 100 100 20 días Sí Recuento 5 0 0,005 % 71,4 0 No Recuento 2 5 % 28,6 100 Total Recuento 7 5 % 100 100 A nivel de la pleura peribronquial (Tabla XXIII) se observa: 1.-Un mayor grado de inflamación (grave) aunque no significativo a los 10 días (p=0,233) y un mayor grado de inflamación (moderada) significativo a los 20 días (p= 0,043). 2.-Un mayor grado de fibrosis no significativo con distribución focal de la misma a los 10 días (p=0,382) y 20 días (p=0,296), ya que todos los animales tratados Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban RESULTADOS 93 presentaron signos de fibrosis frente un 29% de los controles que no la presentaron a los 20 días. Pleura peribronquial Control ADSC p Inflamación 10 días Leve Recuento 2 1 0,233 % 50 16,7 Moderada Recuento 2 3 % 50 50 Grave Recuento 0 2 % 0 33,3 Total Recuento 4 6 % 100 100 20 días Leve Recuento 7 3 0,043 % 100 60 Moderada Recuento 0 2 % 0 40 Grave Recuento 0 0 % 0 0 Total Recuento 7 5 % 100 100 Fibrosis 10 días Inexistente Recuento 1 0 0,382 % 25 0,0 Focal Recuento 1 3 % 25 50 Difuso Recuento 2 3 % 50 50 Total Recuento 4 6 % 100 100 20 días Inexistente Recuento 2 0 0,296 % 29 0 Focal Recuento 4 4 % 57 80 Difuso Recuento 1 1 % 14 20 Total Recuento 7 5 % 100 100 2.5.-Influencia del tratamiento combinado con ADSC+Tissucol® Tabla XXIII. Hallazgos microscópicos de la pleura peribronquial con ADSC Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban RESULTADOS 94 Desde el punto de vista macroscópico pudimos observar una masa de tejido de consistencia fibrosa de aproximadamente 1 cm a los 20 días, que rodeaba los bordes del muñón e incluso se encontraba adherida a la pared costal coincidiendo con la toracotomia (Figura 41). A continuación se muestran los hallazgos histológicos observados en el muñón bronquial de los animales tratados con ADSC+Tissucol® local tras la neumonectomía. Podemos observar que en la mucosa y sumbucosa (Tabla XXIV): 1.-Mayor inflamación leve en todos los animales tratados con ADSC y Tissucol® a los 10 y 20 días aunque no significativa (p=0,182 y p=0,236 respectivamente), a diferencia de los grupos de tratamiento anteriores que tienen tendencia a producir un mayor grado de inflamación. 2.-Evita la aparición de úlceras a los 20 días (p=0,034). 3.-Protege de la producción de necrosis a los 20 días ya que ninguno de los animales tratados presentó necrosis frente a un 43 % de los animales controles que si la presentaron (p=0,034). Mucosa y submucosa Control Tissucol® + ADSC p Inflamación 10 días Leve Recuento 3 5 0,182 % 75 100 Moderada Recuento 0 0 Tabla XXIV. Hallazgos microscópicos de la mucosa y submucosa con Tissucol®+ADSC Figura 41. Vista macroscópica del muñón bronquial, grupo ADSC+Tissucol®. A: del muñón bronquial. B: Parrilla costal. Obsérvese la masa blanquecina asociada a la toracotomía (flecha) A B Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban RESULTADOS 95 % 0 0 Grave Recuento 1 0 % 25 0 Total Recuento 4 5 % 100 100 20 días Leve Recuento 7 6 % 100 100 Moderada Recuento 0 0 % 0 0 Grave Recuento 0 0 % 0 0 Total Recuento 7 6 % 100 100 Fibrosis 10 días Inexistente Recuento 0 0 % 0 0 Focal Recuento 0 0 % 0 0 Difusa Recuento 4 5 % 100 100 Total Recuento 4 5 % 100 100 20 días Inexistente Recuento 0 0 0,391 % 0 0 Focal Recuento 4 2 % 57,1 33,3 Difusa Recuento 3 4 % 42,9 66,7 Total Recuento 7 6 % 100 100 Úlceras 10 días Inexistente Recuento 2 4 0,343 % 50 80 Focal Recuento 2 1 % 50 20 Total Recuento 4 5 % 100 100 20 días Inexistente Recuento 4 6 0,034 % 57 100 Focal Recuento 3 0 % 43 0 Total Recuento 7 6 % 100 100 Necrosis 10 días No Recuento 4 4 0,259 % 100 80 Si Recuento 0 1 % 0 20 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban RESULTADOS 102 3.3.- Sox 6 Los datos de la expresión de Sox 6 se muestran en la siguiente tabla: Sox 6 Grupo Media±SD p 10días Control 1,01±0,16 Tissucol® 1,66±0,88 0,439 Plasma 1,02±0,34 0,439 ADSC 2,35±1,54 0,121 Tissucol®+ADSC 1,33±0,49 0,197 20días Control 1,01±0,20 Tissucol® 1,37±0,23 0,039 Plasma 1,42±0,34 0,121 ADSC 1,79±0,20 0,020 Tissucol®+ADSC 1,23±0,32 0,289 No se han observado cambios significativos en la expresión de Sox 6 a los 10 días en los grupos que recibieron tratamiento, salvo un incremento de su expresión no significativo en el grupo de Tissucol® y ADSC. Si se ha observado un incremento significativo de su expresión en el tratamiento con Tissucol® (p=0,039) y con ADSC (p=0,020) a los 20 días. A continuación se muestra gráficamente la expresión del gen Sox6 con significación estadística (*). Tabla XXIX. Expresión de Sox 6 en el muñón bronquial postneumonectomía Figura 44. Expresión de Sox6, control vs ADSC y Tissucol® * * * * Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban RESULTADOS 103 3.4.- Tgfβ-1 Los datos de la expresión de Tgfβ-1 se muestran en la siguiente tabla: Tgfβ-1 Grupo Media±SD p 10días Control 1,00±0,26 Tissucol® 1,42±0,69 0,302 Plasma 1,40±0,69 0,439 ADSC 0,49±0,30 0,071 Tissucol®+ADSC 1,79±0,94 0,302 20días Control 1,00±0,71 Tissucol® 0,57±0,34 0,302 Plasma 1,29±1,57 0,606 ADSC 0,23±0,11 0,020 Tissucol®+ADSC 0,78±0,79 0,724 No se han observado cambios significativos en la expresión de Tgfβ-1 a los 10 días en los grupos que recibieron tratamiento salvo en el de ADSC en el que se ha observado un descenso de su expresión a los 10 días (p=0,071) y a los 20 días (p=0,020). A continuación se muestra gráficamente la expresión del gen Tgfβ-1 con significación estadística (*). Tabla XXX. Expresión de Tgfb en el muñón bronquial postneumonectomía Figura 45. Expresión de Tgfβ-1 control vs ADSC * * Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban RESULTADOS 104 3.5.- Vegfa Los datos de la expresión de Vegfa se muestran en la siguiente tabla: Vegfa Grupo Mediana p 10días Control 1,00 (0,92-1,61) Tissucol® 1,00 (0,53-5,04) 1,000 Plasma 0,94 (0,84-1,56) 1,000 ADSC 0,30 (0,23-0,70) 0,524 Tissucol®+ADSC 0,95 (0,36-1,77) 1,000 20días Control 1,00 (0,38-5,43) Tissucol® 0,95 (0,28-1,20) 1,000 Plasma 1,52 (0,75-3,33) 0,524 ADSC 0,78 (0,46-2,13) 0,048 Tissucol®+ADSC 1,50 (0,57-1,87) 1,000 No se han observado cambios significativos en la expresión de Vegfa a los 10 días en los grupos que recibieron tratamiento. Se ha observado un descenso de su expresión en el tratamiento con Tissucol® a los 20 días (p=0,020). A continuación se muestra gráficamente la expresión del gen Vegfa con significación estadística (*). Tabla XXXI. Expresión de Vegfa en el muñón bronquial postneumonectomía * * Figura 46. Expresión de Vegfa, control vs ADSC Vegfa Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban RESULTADOS 105 3.6.- Igf-1 Los datos de la expresión de Igf-1 se muestran en la siguiente tabla: Igf-1 Grupo Media±SD p 10dias Control 1,00±0,17 Tissucol® 0,26±0,21 0,020 Plasma 1,74±1,02 0,302 ADSC 0,41±0,33 0,039 Tissucol®+ADSC 0,45±0,20 0,039 20dias Control 1,00±1,19 Tissucol® 0,48±0,15 0,796 Plasma 1,28±0,80 0,439 ADSC 0,05±0,03 0,020 Tissucol®+ADSC 0,40±0,20 0,724 Se ha observado un descenso en la expresión de Igf-1 en los grupos tratados con Tissucol® (p=0,020), ADSC (p=0,039) y la combinación de Tissucol®+ADSC (p=0,039) a los 10 días. Sin embargo, el descenso en su expresión fue significativo exclusivamente en el tratamiento con ADSC a los 20 días (0,020). A continuación se muestra gráficamente la expresión del gen Igf-1 con significación estadística (*). Tabla XXXII. Expresión de Igf-1 en el muñón bronquial postneumonectomía Figura 47. Expresión de Igf-1, control vs. ADSC, Tissucol® y Tissucol®+ADSC Igf-1 * * * * * * * * Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban RESULTADOS 106 3.7.- Agc-1 Los datos de la expresión de Agc-1 se muestran en la siguiente tabla: Agc-1 Grupo Media±SD p 10dias Control 1,31±0,57 Tissucol® 1,60±0,73 0,512 Plasma 098±0,35 0,190 ADSC 1,60±0,31 0,039 Tissucol®+ADSC 1,44±0,43 0,278 20dias Control 1,00±0,45 Tissucol® 0,73±0,21 0,197 Plasma 0,74±0,21 0,439 ADSC 0,96±0,08 0,439 Tissucol®+ADSC 1,09±0,22 0,724 Se ha observado un incremento en la expresión de Agc-1 en el tratamiento con ADSC (p=0,039) los 10 días. No se ha observado cambios en su expresión en ninguno de los grupos que recibieron tratamiento a los 20 días. A continuación se muestra gráficamente la expresión del gen Agc-1 con significación estadística (*). Tabla XXXIII. Expresión de Agc-1 en el muñón bronquial postneumonectomía Figura 48. Expresión de Agc-1, control vs ADSC Agc-1 * * Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban DISCUSIÓN 107 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban DISCUSIÓN 108 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban DISCUSIÓN 109 En la actualidad, la FBP contínúa siendo una temible complicación postquirúrgica, a pesar de los avances experimentados en los cuidados perioperatorios y postoperatorios, así como de las técnicas quirúrgicas empleadas en Cirugía Torácica. Por otro lado, los avances médicos en el campo de la quimioterapia y la radioterapia, que han permitido que pacientes oncológicos con tumores avanzados puedan ser intervenidos quirúrgicamente, han influido también en la incidencia de aparición de las FBP. La FBP compromete de una forma muy seria la vida del paciente y sus posibilidades de recuperación total tras la intervención, pues causa una disrupción de la vía aérea que contamina el espacio pleural y anega de líquido el pulmón o pulmones remanentes, originando una neumonía por aspiración (de máximo riesgo en el caso de pulmón único), sepsis y en muchos casos un fatal SRDA, que pone en peligro la vida del enfermo, relegando a un segundo plano todos lo esfuerzos quirúrgicos y médicos realizados por tratar y en última medida curar al paciente de la neoplasia que amenza su vida. De hecho, las FBP postquirúrgicas son una de las causas que originan más reingresos hospitalarios tras las resecciones pulmonares. En concreto, en algunas series es la segunda causa de reingreso (un 10% del total de los mismos), por detrás del empiema pleural74. La mortalidad de una FBP perioperatoria tras una resección pulmonar mayor, esté acompañado o no de empiema de la cavidad es alta, desde un 27,2% hasta un 50% según las series43,59,65,66. Ésta variabilidad depende de la etiología, la técnica quirúrgica, la experiencia del cirujano67-69 y de las condiciones del paciente, ya que la incidencia de FBP es menor cuanto mejor sean las condiciones del paciente y es mayor en las neumonectomías (4,5-20%) que en las lobectomías (0.5%)65. Además hay que añadir que si el paciente requiere una intervención quirúrgica de urgencia para resolver la FBP, se estima que ello incrementa el riesgo de fallecimiento en un 10% más74. A pesar de que en la práctica clínica y de forma preventiva y en algunas ocasiones con base empírica, los cirujanos realizan coberturas del muñón bronquial con colgajos musculares pediculados en pacientes con alto riesgo como los sometidos a terapia neoadyuvante, para proteger al muñón bronquial de la isquemia adicional y la necrosis47 o con otros materiales descritos como la pleura, la grasa pericárdica y algunos sellantes biológicos de uso comercial como el Tisuscol® o Bioglue®, ninguno de los tratamientos ha demostrado ser óptimo y eficaz para prevenir la FBP. Como ya hemos comentado el mejor tratamiento de la FBP es su prevención. Una lesión que altera la continuidad de la superficie de un tejido desencadena diversas reacciones celulares y mecanismos de reparación. Para restablecer la integridad del área lesionada se cuenta con diversos procesos de acción simultánea conocidos como Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban DISCUSIÓN 110 fases de la reparación. Las fases identificadas son la inflamatoria, la proliferativa y la de remodelación tisular200-206. Los distintos mecanismos que se producen en momentos diferentes provocan la liberación de señales químicas, que sirven para modular ordenadamente la migración, proliferación y diferenciación de las células, así como las síntesis y degradación de las proteínas de la matriz extracelular (MEC). Éstas no tienen límites estrictos en el tiempo y generan como resultado un tejido con características similares, pero no idénticas, al tejido ileso202,204. Qué ocurre con el muñón bronquial remanente tras una resección pulmonar y qué mecanismos moleculares están implicados en las fases de reparación del mismo es algo que aún no se conoce. El bronquio presenta sus peculiaridades en cuanto a la respuesta a una injuria, ya que es abundante en cartílago. Al ser el cartílago avascular, este presenta algunas modificaciones con respecto a la respuesta de los tejidos vascularizados ante la agresión. Así, en el cartílago hialino articular, la fase de necrosis postraumática es similar a la de los tejidos vascularizados, caracterizándose por la muerte celular y la interrupción de la matriz, en grado variable dependiendo de la extensión y la naturaleza del traumatismo. Sin embargo, la fase de inflamación está ausente, ya que está fundamentalmente mediatizada por el sistema vascular y la fase de reparación estará condicionada al número de células capaces de responder al traumatismo. Es así que nos encontramos con numerosos estudios207-210 que muestran la relativa incapacidad de respuesta del cartílago articular al traumatismo, y su escasa capacidad de regeneración208,210,211 donde sólo cabe demostrar un aumento temporal de la actividad mitótica en las células cartilaginosas adyacentes a los márgenes del defecto, actividad asociada a un aumento de la síntesis celular de los componentes de la matriz. Existe escasa información sobre la reparación del cartílago bronquial a diferencia de lo que ocurre con el cartílago articular, teniendo ambos en común el que pertenecen al mismo tipo de cartílago, sin embargo el bronquio es más que cartílago, es una estructura dinámica con multitud de tipos celulares y por tanto distintas respuestas a la agresión. Si estás respuestas pueden ser moduladas por agentes biológicos externos, tampoco se conoce. En este sentido, la aplicación de adhesivos biológicos como sustitutos o refuerzo de las suturas fue introducida en 1975 en Austria y posteriormente se han extendido y utilizado como agentes selladores y hemostáticos en múltiples campos de la cirugía212,213. Chevrel en 1990214 describió la utilización del adhesivo de fibrina Tissucol® en las eventroplastias abdominales para mejorar la adherencia de la malla a los tejidos y reducir el espacio muerto. Desde entonces el Tissucol® ha sido utilizado ampliamente en casi todos los campos de la cirugía como la Cirugía Torácica, para el sellado de laceraciones de parénquima pulmonar y hemostasia quirúrgica215,216, dado que forma un coágulo fisiológico hemostático, adhesivo e impermeable. Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban DISCUSIÓN 111 Sin embargo, a pesar de los muchos estudios clínicos que se han realizado, ninguno hasta ahora, ha valorado los fenómenos histológicos que se producen en el muñón bronquial cuando se aplica localmente Tissucol®, ni los cambios que puede inducir en la expresión génica. En nuestro estudio, a nivel macroscópico observamos que el coágulo de fibrina sella el muñón bronquial a los 20 días del tratamiento; sin embargo, microscópicamente no muestra signos de protección del mismo ya que induce la aparición de necrosis de la mucosa y submucosa y no disminuye la aparición de necrosis de la pared, siendo en este sentido el menos eficaz de los tratamientos valorados en nuestro estudio y por la tanto no parecería recomendable para prevenir la FBP. De acuerdo con ello y con los malos resultados obtenidos con Tissucol® en el tratamiento endoscópico de FBP , descritos por Matthew y col217, su uso para el tratamiento endoscópico de la FBP establecida debería desaconsejarse y valorarse otro tipo de sellantes. La respuesta inflamatoria del muñón bronquial observada en todos los grupos de tratamiento, puede tener una doble lectura. Por un lado, la inflamación es una reacción de la microvasculatura caracterizada por el desplazamiento de líquido y leucocitos de la sangre hacia el compartimiento extravascular. Ésta es un intento del huésped por localizar y eliminar células metabólicamente alteradas, partículas extrañas, o antígenos218. En ésta reacción tiene lugar una interrelación entre muchos tipos celulares y mediadores como citocinas, factores de crecimiento (Vegfa, Tgfβ-1, entre otras) y otros tipos de moléculas como las quimioquinas. Ésta fase de la cicatrización es importante debido a que actúan, entre otras células, los macrófagos que son encargados de coordinar la liberación de citocinas y estimular muchos de los procesos subsiguientes de la cicatrización de una herida. Sin la actividad de los monocitos o macrófagos, la herida evoluciona lentamente con un desbridamiento inadecuado y una proliferación tardía de los fibroblastos y células endoteliales204,206 que puede facilitar la necrosis219-224 como en el caso del Tissucol® y por otro lado, la gran liberación de mediadores puede actuar de forma protectora contra la necrosis como es el caso de los grupos de PPP autólogo y ADSC. Por otro lado, durante la última década se ha desarrollado lo que hoy parece ser una nueva opción de tratamiento: la aplicación en la zona a regenerar de preparados plasmáticos. Se están usando para mejorar la regeneración de tejidos en periodoncia, ortopedia, cirugía maxilofacial y cirugía plástica. Nunca antes se había probado ni como tratamiento de la FBP ni en su prevención, como es nuestro caso. El plasma rico en plaquetas (PRP) fue introducido por Whitman113 en 1997. Se decía que a través de la activación de las plaquetas, se liberaban factores de crecimiento que mejorarían la regeneración de tejido al aumentar la mitosis, la producción de colágeno o la diferenciación celular, cruciales en la reparación de las heridas. Basándose en la idea de que si pocos son buenos, muchos serán mejor, se Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban CONCLUSIONES 118 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban CONCLUSIONES 119 “Los hallazgos histológicos demostraron que el tratamiento del muñón bronquial tras una neumonectomía con sellantes biológicos induce un mayor grado de inflamación y lo protege de la aparición de necrosis. Ello indica que de forma general, es preferible proteger al muñón bronquial con sellantes biológicos tras una resección pulmonar para evitar la aparición de una FBP”. “Los hallazgos histológicos demostraron que el tratamiento con Tissucol® induce la aparición precoz de necrosis y menor grado de fibrosis del muñón. Estos hallazgos unidos al coste del producto hacen que probablemente, desde un punto de vista traslacional, sea el menos apropiado de los tratamientos biológicos empleados para prevenir la aparición de FBP y que su uso en el tratamiento endoscópico de la FBP establecida debería evitarse”. “Los hallazgos histológicos demostraron que el tratamiento con PPP autólogo protege al muñón bronquial de la aparición de necrosis, lo que evitaría la aparición de FPB. Su fácil obtención y procesamiento, aplicación, bajo coste y escaso riesgo, dado que es autólogo, le confiere las características adecuadas para valorar su uso en humanos”. “Los hallazgos histológicos demostraron que el tratamiento con ADSC disminuye la presencia de necrosis y ulceraciones en el muñón bronquial, protegiéndolo de la FBP. Su adhesividad tisular, capacidad de proliferación y diferenciación permiten su aplicación directa sobre el muñón bronquial, incluso en una gran cavidad como la de neumonectomía sin restarle eficacia”. 1º 2º 3º 4º Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban CONCLUSIONES 120 “La concentración de Igf-1 en el PPP autólogo y su nivel de expresión en el muñón bronquial indican que probablemente este factor de crecimiento está implicado en los beneficiosos efectos de este tratamiento biológico en la prevención de la FBP”. “El tratamiento con ADSC induce significativamente cambios en la expresión de Col2a1 y TgfB1 en el muñón bronquial. Muchas de las actividades de estos genes están íntimamente relacionadas con los procesos biológicos de reparación. Además, Tgfb1 presenta una potente acción antiinflamatoria. La disminución en la expresión de Tgfb1 podría estar implicada en el mayor grado de inflamación que produce su aplicación sobre el muñón bronquial”. “El aumento de expresión Agc-1 observado en el tratamiento con ADSC, podría estar implicada en la actividad proteolítica de la matriz extracelular que facilitaría la migración y proliferación de las ADSC en el tejido conectivo del muñón bronquial, mientras que la sobreexpresión de Sox 6, podría estar implicada en su diferenciación hacia las líneas celulares mesénquimales que participan en los fenómenos de reparación y protección del muñón bronquial”. 5º 6º 7º 8º “Los hallazgos histológicos demostraron que el tratamiento combinado de ADSC y Tissucol® protege al muñón de la FBP ya que reduce la aparición de necrosis y úlceras. Las propiedades intrínsecas de las ADSC para reparar los tejidos revierten los efectos del Tissucol® y lo convierten en una combinación efectiva. La dificultad tecnológica y el coste económico que conlleva la extracción y preparación de ADSC hace que no sea un método disponible en la mayoría de los hospitales y que su uso traslacional en la actualidad esté más restringido que el del PPP autólogo”. Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban CONCLUSIONES 121 “La variación de los niveles de expresión de los genes Col2a1, Tgfb-1, Sox6, Igf1, Vegf y Agc-1 en el muñón bronquial indica que estos genes están involucrados en los fenómenos de reparación inducidos por los sellantes biológicos utilizados. Desde el punto de vista traslacional, podrían ser analizados como potenciales biomarcadores del estado de la reparación del muñón bronquial en los pacientes neumonectomizados mediante biopsias endoscópicas, lo que ayudaría a identificar si el proceso de reparación podría evolucionar hacia la fistulización y por lo tanto, ser tratado de forma precoz. Son necesarios más estudios que nos ayuden a valorar su papel dentro de la fisiopatología de la regeneración del muñón bronquial inducido por estos sellantes biológicos”. 9º Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban BIBLIOGRAFÍA 122 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban BIBLIOGRAFÍA 123 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban BIBLIOGRAFÍA 124 Tesis Doctoral Pedro R. Llontop Santisteban BIBLIOGRAFÍA 125 1. Tresguerres JAF. Fisiología humana. 3era ed, 2005. 2. Stephen RA. Tratado de neumología. 2da ed. Madrid, España: Harcourt, 2001. 3. Frandson RD, Spurgeon TL. Anatomía y fisiología de los animales domésticos. 5ta ed: Interamericana, 1995. 4. Des Jardins TR. Cardiopulmonary anatomy and physiology: essencials for respiratory care. 3era ed: Thomson Delmar Learning, 1999. 5. Davies A, Moores C. The respiratory system: Basisc science and clinical conditions. 1era ed. United Kingdom: Elsevier science, 2003. 6. Kristic RV. Human microscopic anatomy. 3era ed. 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