Influencia del polimorfismo del receptor de andrógenos en la masa grasa corporal y la respuesta lipolítica al ejercicio

TESIS DOCTORAL Departamento: EDUCACIÓN FÍSICA Programa de Doctorado: “ACTIVIDAD FÍSICA, SALUD Y RENDIMIENTO DEPORTIVO” Título de la Tesis “INFLUENCIA DEL POLIMORFISMO DEL RECEPTOR DE ANDRÓGENOS EN LA MASA GRASA CORPORAL Y LA RESPUESTA LIPOLÍTICA AL EJERCICIO.” Tesis Doctoral presentada por D. Jesús Gustavo Ponce González Dirigida por: Dr. D. José Antonio López Calbet (C.U.) Dra. Dª. Cecilia Dorado García (C.U.) Dra. Dª. Amelia Guadalupe Grau Los Directores El Doctorando En Las Palmas de Gran Canaria a 26 de Septiembre de 2011. CONTENIDOS Prólogo y agradecimientos ........................................................................................ 3 Lista de publicaciones originales .............................................................................. 5 Fuentes de financiación ............................................................................................. 8 Abreviaturas .............................................................................................................. 9 Resumen general ..................................................................................................... 11 Summary .................................................................................................................. 17 1. Introducción ........................................................................................................ 21 1.1. Ácidos grasos ............................................................................................... 25 1.1.1. Oxidación de ácidos grasos durante el ejercicio ............................... 26 1.1.2. Oxidación mitocondrial...................................................................... 33 1.1.3. Factores determinantes de la oxidación de grasas ............................ 37 1.1.4. Calorimetría indirecta ....................................................................... 43 1.2. Perfil hormonal y masa grasa ....................................................................... 46 1.2.1. Osteocalcina ....................................................................................... 47 1.2.2. Andrógenos ........................................................................................ 48 1.2.3. Leptina................................................................................................ 49 1.2.4. Dimorfismo sexual ............................................................................. 55 1.3. Receptor de andrógenos y masa grasa ......................................................... 56 1.3.1. Polimorfismo del receptor de andrógenos ......................................... 57 2. Objetivos ............................................................................................................. 63 3. Hipótesis .............................................................................................................. 64 4. Metodología ........................................................................................................ 67 4.1. Sujetos .......................................................................................................... 67 4.2. Composición corporal .................................................................................. 69 4.3. Capacidad de salto ........................................................................................ 69 4.4. Capacidad anaeróbica ................................................................................... 69 4.5. Test de velocidad de carrera ......................................................................... 70 4.6. Test de oxidación máxima de grasas (MFO): calorimetría indirecta ........... 70 4.7. Test de tolerancia a la glucosa ...................................................................... 71 4.8. Biopsia muscular .......................................................................................... 71 4.8.1. Análisis bioquímico ............................................................................ 72 4.8.2. Análisis mediante la técnica de Western blot ..................................... 72 4.8.3. Análisis histoquímico ......................................................................... 74 4.8.4. Protocolo de medición de la respiración mitocondrial ...................... 75 4.9. Muestras de sangre ....................................................................................... 75 4.9.1. Análisis de sangre y determinaciones hormonales ............................ 75 4.9.2. Aislamiento de ADN sanguíneo y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la medición de los polimorfismos CAG y GGN del gen del receptor de andrógenos ................................................................................ 76 4.10. Consentimientos y aprobación ética ..................................................... 77 4.11. Estadística ............................................................................................ 77 5. Resultados ........................................................................................................... 79 5.1. Resumen de los resultados del artículo I (Ara et al. 2010) ........................... 81 5.2. Resumen de los resultados del artículo II (Ponce-González et al. 2011) ..... 83 5.3. Resumen de los resultados del artículo III (Ponce-González et al. 2011) .... 84 6. Discusión ............................................................................................................. 89 7. Conclusiones ..................................................................................................... 101 8. Bibliografía ....................................................................................................... 105 Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria 3 Agradecimientos Agradecimientos Puedo decir que este es el apartado de la tesis en el que he necesitado más tiempo para realizarlo, ya que son tantos los agradecimientos que son difíciles de resumir. Comenzaré por recordar cuando aún estaba en la carrera, ya que hubo un punto de inflexión en mi formación antes y después de la asignatura de Fisiología del Ejercicio. Un profesor llamado López Calbet despertaba en mí la curiosidad de querer saber más cada día, además de abrirme los ojos sobre la realidad (llegaba a quinto de carrera y no tenía idea de nada). Gracias por permitirme trabajar a tu lado, abrirme tus grandes fuentes de conocimiento, enseñarme lo que significa el mundo de la investigación y sobre todo por haber confiado en mí para integrarme en la familia que forma el grupo de investigación de Rendimiento Humano, donde cada día que pasa aprendes mil nuevos conocimientos y valores que me acompañarán a lo largo de mi carrera profesional y personal. Gracias a Cecilia Dorado, quién desde el principio (primero de carrera) me enseñó que con esfuerzo se puede conseguir todo lo que te propones (incluso un mortal). El haberme apoyado desde el principio, permitió que pudiera aprender y trabajar con Joaquín Sanchís. Juntos, me ayudaron a escoger cómo dar los primeros pasos en mi carrera profesional, siendo una motivación para mí el llegar a estar a vuestra altura algún día. Una vez en el grupo de investigación de Rendimiento Humano, dar gracias a la suerte, de ponerme a trabajar bajo la tutela de Borja Guerra, que en calidad de jefe, es uno de los grandes responsables de mi progresión en el laboratorio, y en calidad de amistad siempre me ha prestado su ayuda incondicional guiándome cada vez que no encontraba el camino. Gracias por todo, siempre te consideraré como uno de mis directores de tesis. A Amelia Guadalupe, ya que gran parte de los datos que se recogen en esta tesis han sido generados y tratados por ella. Gracias por ayudarme y por tus explicaciones polimórficas. Jesús Gustavo Ponce González 4 Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Agradecimientos Agradecer de corazón a Teresa Fuentes, por hacerme tan fácil la entrada en el laboratorio, enseñarme lo eficiente que se puede llegar a ser (estoy en ello), por el buen trabajo en equipo, compartir la experiencia de tantos congresos y por ayudarme siempre que lo he necesitado como una buena amiga. Muchas gracias. No entiendo mi etapa en el laboratorio sin mi padrino/tutor/amigo Hugo Olmedillas, quién siempre tengo en mente en mis acciones dentro del laboratorio, intentando parecerme a él en todo lo posible. Mis problemas e inquietudes en el laboratorio siempre han sido más llevaderos gracias a tu ayuda infinita. Mil gracias al inspector José Navarro, quién a lo largo de estos años también ha hecho de motivador, siendo el mejor guía en los momentos más difíciles, ayudándome siempre a encontrar el camino correcto. GRACIAS POR TODO. A Nacho Ara, por permitirme participar en el estudio de los post-obesos de Dinamarca, y sobre todo por remarcar que la humildad es un valor indispensable para seguir creciendo. Alfredo Santana, gracias por enseñarme a trabajar meticulosamente en un laboratorio, haciéndome progresar en técnicas de biología molecular, como si fuera tu doctorando. Espero poder seguir aprendiendo de tus conocimientos. A David Morales, quien ha querido siempre compartir conmigo todas y cada una de sus inquietudes, importantes o no, desde la carrera hasta el doctorado, hace ya 10 años. Gracias por tu ayuda. Agradecer a Lorena Rodríguez, quién siempre tiene una buena cara pase lo que pase, haciendo más llevadero todo el trabajo. Gracias por tu amistad. A Rafael Sánchez, quién me ha introducido de pleno en el campo de la fatiga. Gracias por tu gran disponibilidad y ayuda siempre que lo he necesitado. Gracias a José Losa, por tu gran trabajo desarrollado hasta la fecha, acompañado siempre por tu humildad y amigabilidad. Tu límite no tiene techo. Por tu gran amabilidad y colaboración en el laboratorio, gracias Macame. Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria 5 Agradecimientos Por traer energía renovada al laboratorio cargada de positivismo, gracias al trío del Máster en León, inolvidable para mí, Luke, Perico e Ismael. Al igual que pasó con Marta y Andrea durante sus meses de estancia en el laboratorio. Agradecer a Eli, por su gran colaboración en todo momento hasta la fecha. A José Guillén, gracias por ayudarme en nuestro primer año de laboratorio. A Ana, por hacerme partícipe de tu estudio de Pilates, y ser tan comprensible. Gracias al resto de profesores miembros del grupo de investigación de Rendimiento Humano, Rafael Arteaga, Javier Chavarren, José Antonio Serrano, Juan José González. Gracias a Bonifacio Nicolás Díaz Chico, por su magnífica gestión en la medición de los polimorfismos del receptor de andrógenos. Especial agradecimiento a mi tutor de estancia realizada en el “Winter Sport Centre” de Östersund. Thank you very much for everything to Hans-Christer Holmberg, and also, thanks for your help to Hampus, Lina, Maria, Matilda, Martina, Glenn, Kurt, Sture, Maggie…(tack så mycket). Agradecer la colaboración de todos los sujetos que participaron en los estudios, así como a La Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, en especial al equipo del Vicerrectorado de Investigación y al Departamento de Educación Física por su fantástica gestión durante el doctorado. A su vez, a todo el personal de Administración y servicios de Conserjería de la Facultad de Educación Física. Agradecer también a esta tierra canaria, la cual me ha enseñado su cultura y brindado su hospitalidad, que han hecho que me sintiera como en mi propia casa. Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria 13 Resumen general Resumen general El sobrepeso y la obesidad se definen como una acumulación excesiva de grasa que aumenta el peso corporal y puede ser perjudicial para la salud. Actualmente, la obesidad constituye el principal problema de salud comunitaria al que deberá enfrentarse la sociedad occidental y especialmente la sociedad canaria en los próximos años. Además, es considerada como una de las alteraciones metabólicas de mayor repercusión en el ámbito psicológico, social y económico. A su vez, la acumulación excesiva de grasas puede originar diabetes, resistencia a la leptina, enfermedades cardiovasculares y alteraciones metabólicas. El grado de acumulación de grasa puede variar entre personas con vidas similares. Las posibles causas son desconocidas hoy en día, aunque recientemente se ha relacionado la obesidad con problemas en la capacidad de oxidar grasas durante el ejercicio. A su vez, este hecho se ha relacionado con una disfunción de la actividad oxidativa mitocondrial y con la influencia de posibles variaciones genéticas, conocidas como polimorfismos. Por lo tanto, el objetivo principal de esta tesis es dilucidar qué factores podrían estar afectando la acumulación y la oxidación de grasas. Con este fin, realizamos en primer lugar un estudio para comprobar si la disminución en la capacidad de oxidar grasas en personas obesas era explicada por una disfunción mitocondrial o por cambios en la actividad de la vía AMPK/ACC mediada por leptina. A su vez, también quisimos averiguar si esa disminución en la capacidad de oxidación de grasas se podría restaurarse tras un programa de pérdida de peso hasta una composición corporal semejante a los sujetos controles. Para ello, seleccionamos a 10 hombres obesos (O), 10 hombres post-obesos (PO) y 10 hombres sanos controles (C). La metodología llevada a cabo consistió en un test de calorimetría indirecta en cicloergómetro realizado tanto en piernas como en brazos. También se hicieron mediciones basales en el músculo vasto lateral y deltoides (muestra obtenida a través de biopsia muscular) de la fosforilación de AMPK y ACC, expresión proteica de SOCS3, actividad enzimática mitocondrial (CS, HAD y LHS) y del flujo de O2 de la respiración mitocondrial. Los resultados demostraron que la capacidad máxima de oxidar grasas está aumentada en obesos y en post-obesos comparados con los sujetos controles durante el ejercicio Jesús Gustavo Ponce González 14 Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Resumen general de piernas; y en obesos comparados con los controles, en el ejercicio realizado con los brazos. A su vez, la actividad enzimática y la respiración mitocondrial no estaban atenuadas en obesos y post-obesos. Por otro lado, la fosforilación de AMPK y la expresión proteica de SOCS3 fue similar en los tres grupos. Sin embargo, la fosforilación de ACC a nivel basal estaba disminuida en el vasto lateral de los obesos comparado con post-obesos y controles, pero aumentada en el deltoides comparado con controles. Estos resultados se dieron pese a que los tres grupos fueron ajustados por edad, tipo de fibras y VO2max, demostrando que la capacidad de oxidar grasa no está disminuida en obesos, pudiendo estar afectada la acumulación de grasa por factores genéticos. Uno de esos factores genéticos podría ser el polimorfismo del receptor de andrógenos. La testosterona facilita la lipólisis y disminuye la masa grasa actuando a través del receptor de andrógenos, el cual presenta variaciones polimórficas que afectan a la eficacia con la que los andrógenos son capaces de producir sus efectos en las células diana. Por ello, los polimorfismos CAG (poliglutamina) y GGN (poliglicina) del gen del receptor de andrógenos podrían determinar parte de los efectos de esta hormona sobre la adiposidad. Por lo tanto, el objetivo principal de los estudio II y III fue determinar la influencia del polimorfismo del receptor de andrógenos sobre la acumulación de grasa y la respuesta lipolítica al ejercicio. El estudio II se realizó con 319 hombres y con 78 mujeres, a los que se les midió la composición corporal mediante DXA, la longitud del número de repeticiones del polimorfismo CAG y GGN a través de PCR y las hormonas de leptina, testosterona libre y osteocalcina a través de kits de ELISA. Los resultados demostraron que el polimorfismo CAG tiene poca o ninguna relación sobre la masa grasa y los niveles de leptina, testosterona libre y osteocalcina en hombres y mujeres jóvenes. Sin embargo, el polimorfismo GGN demuestra tener una asociación directa con el porcentaje de grasa (r=0.30; p<0.05), el porcentaje de grasa en el tronco (r=0.28; p<0.05), la concentración sérica de leptina (r=0.40; p<0.05) y con la concentración sérica de osteocalcina (r=0.32; p<0.05) en mujeres jóvenes, pero no en hombres. Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria 15 Resumen general Por otro lado, los niveles de testosterona libre en hombres se relacionaron inversamente con la adiposidad y con la concentración sérica de leptina, y positivamente con osteocalcina. Este hecho demuestra que existe un efecto importante de los andrógenos sobre la masa grasa en hombres, por lo que resulta raro no haber encontrado efectos del polimorfismo del receptor de andrógenos sobre el tejido adiposo en hombres. Por lo que nos plantemos realizar el estudio III con hombres que tuvieran polimorfismos extremos del receptor de andrógenos, pudiendo incrementar los posibles efectos. El estudio III comenzó con la medición del polimorfismo CAG y GGN del gen del receptor de andrógenos en 319 hombres. Una vez medido, se seleccionaron aquellos hombres que pertenecían al primer y cuarto cuartil del polimorfismo CAG y GGN del receptor de andrógenos. El metabolismo basal y la capacidad máxima de grasas se midieron mediante un test de calorimetría indirecta, mientras que las hormonas de leptina, testosterona libre y osteocalcina se midieron a través de kits de ELISA. A su vez, se realizó un estudio longitudinal (~7 años) con los mismos sujetos para la determinación de los cambios en la composición corporal mediante DXA. En concordancia con el estudio II, los resultados demuestran que el número de repeticiones polimórficas de CAG tienen poca o ninguna relación con la masa grasa, ya que los grupos con polimorfismos de repetición CAG cortos (CAGS) y largos (CAGL) tuvieron un metabolismo basal y una capacidad máxima de oxidación de grasas comparables, y acumularon cantidades similares de grasa durante el paso de los años. Sin embargo, aquellos sujetos pertenecientes al grupo con un GGN más largo (GGNL) tuvieron menos grasa corporal y troncal que los sujetos del grupo corto de GGN (GGNS). Además, el grupo GGNL obtuvo valores ligeramente superiores en la capacidad máxima de oxidación de grasas (p=0.06), quienes además acumularon menos masa grasa, particularmente en el tronco, tras el paso de los años. Por otro lado, el VO2max (por kg de masa magra de las piernas) pudo explicar un 53% de la varianza en la capacidad máxima de oxidación de grasa. Sin embargo, las diferencias encontradas entre los grupos de GGN no se pueden explicar por este factor, ya que tenían valores similares en VO2max. Por lo tanto, estos dos últimos estudios demuestran que el polimorfismo del receptor de andrógenos, más concretamente el GGN, influye en la acumulación Jesús Gustavo Ponce González 16 Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Resumen general de grasa corporal tanto en hombres como en mujeres. Hemos constatado además, que existe un dimorfismo sexual en la influencia que tiene el polimorfismo del receptor de andrógenos en la acumulación de grasa corporal. Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria 17 Summary Summary Overweight and obesity are defined as an excessive accumulation of fat, which increases body weight and may be harmful to health. At present, obesity is the major community-health problem for Western society and, specially, in Canary Islands' for the next years. Furthermore, it has been considered as one of the greatest metabolic disorders, which affects the psychological, social and economic development. In turn, excessive accumulation of fat can lead to develop diabetes, leptin resistance, cardiovascular disease and metabolic disorders. The degree of fat accumulation can vary among people with similar life style. Possible causes are unknown up to date, but recently the inability to oxidize fat during exercise has been linked to obesity. In turn, it seems to be associated to a dysfunction of mitochondrial activity and the possible influence of genetic variations, called polymorphisms. Therefore, the main aim of this thesis was to determine which factors could be affecting accumulation and oxidation of fat in adults. To this purpose, we performed a study to test whether the ability to oxidize fat in obese individuals is decreased by a mitochondrial dysfunction or changes in the activity of AMPK/ACC pathway mediated by leptin. In turn, we also wanted to determine whether the decreased capacity to oxidize fat could be restored after a weight loss program. For this study, we selected 10 obese men (O), 10 postobese men (PO) and 10 healthy control men (C). Fat oxidation capacity was determined with indirect calorimetry during bicycling and arm cranking exercise. Baseline measurements were also performed on muscle biopsy samples obtained from the vastus lateralis and deltoid muscle to determine the phosphorylation of AMPK and ACC, SOCS3 protein expression, mitochondrial enzyme activity (CS, HAD and HSL) and the O2 flux of mitochondrial respiration (chamber respirometry). The maximal capacity to oxidize fat was increased in obese and postobese compared with control subjects in the leg exercise; and in obese compared with control in the arm exercise. In turn, enzyme activities and mitochondrial respiration were not attenuated in obese and post-obese. On the other hand, AMPK phosphorylation and SOCS3 protein expression was similar in the three groups. However, ACC phosphorylation at baseline was decreased in the vastus lateralis of obese Jesús Gustavo Ponce González 18 Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Summary compared with post-obese and control, but it was increased compared to control in the deltoid muscle. The three groups were matched for age, type of fiber and VO2max, and the ability to oxidize fat was not found reduced in obese humans. Other factors, such as genetic factors, could contribute to explain the variability in fat mass. Androgen receptor (AR) CAGn (polyglutamine) and GGNn (polyglycine) repeat polymorphisms determine part of the androgenic effect and may influence adiposity. Therefore, the main aim of study II and III was to ascertain the influence of the androgen receptor polymorphism on the accumulation of fat mass and the lipolytic response to exercise. Study II was performed with 319 men and 78 women. The length of CAG and GGN repeats was determined by PCR and fragment analysis, and confirmed by DNA sequencing of selected samples. Body composition was measured by DXA, and the serum concentrations of the hormones leptin, free testosterone and osteocalcin through ELISA kits. No association between AR polymorphisms and adiposity or the hormonal variables was observed in men. However, in women, GGN repeat number was linearly related to the percentage of body fat (r=0.30, P<0.05), the percentage of fat in the trunk (r=0.28, P<0.05), serum leptin concentration (r=0.40, P<0.05), and serum osteocalcin concentration (r=0.32, P<0.05). In men, free testosterone was inversely associated with adiposity and serum leptin concentration, and positively with osteocalcin, even after accounting for differences in CAG and GGN length or both. In summary, this study shows that the AR repeat polymorphism has little influence on the absolute and relative fat mass or its regional distribution in physically active men. In young women, the GGN length is positively associated with adiposity, leptin and osteocalcin. This study did not rule out a potential influence of AR repeat polymorphism on fat mass accumulation in men with extreme repeat length of the CAG and GGN AR. Thus, we considered this possibility in study III. The study III began with the assessment of CAG and GGN repeat AR polymorphisms in 319 men. Once measured, we selected men who belonged to the first and fourth quartiles of CAG and GGN polymorphisms of the androgen receptor. The basal metabolic rate and the maximal fat oxidation capacity were Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria 19 Summary measured by indirect calorimetry, while the leptin, free testosterone and osteocalcin serum concentrations were determined using ELISA kits. A longitudinal assessment was performed using retrospective data (about seven years of follow up). In agreement with the study II, the number of polymorphic CAG repeats have little, if any, relation with fat mass, because the groups CAGL and CAGS had similar basal metabolic rate and maximal fat oxidation capacity and accumulated similar amounts of fat over years. However, the subjects who belonged to group with more GGN (GGNL) repeats showed less whole body fat and trunk fat than subjects with short GGN repeats. Moreover, the GGNL group also reached higher maximal fat oxidation capacity (p = 0.06), and accumulated less body fat, particularly in the trunk region. The VO2max (per kg of lower extremity lean mass) could explain 53% of the variance in the maximal fat oxidation capacity. However, the differences between the GGN groups could not be explained by this factor, because both groups had similar values in VO2max. Therefore, these two studies showed that androgen receptor polymorphism, specifically the GGN, has an important effect on fat mass. There is a sexual dimorphism in the GGN polymorphism influence on fat mass. INTRODUCCIÓN Jesús Gustavo Ponce González 28 Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción mente) (Frayn 1983). Sin embargo, para producir la misma cantidad de ATP, la oxidación de AG requiere más cantidad de oxígeno (McGilvery 1975). Durante el ejercicio, la lipólisis (utilización de las grasas) está activada constantemente, con una participación mayor al comienzo del ejercicio, aumentando la concentración plasmática de AGL hasta 20 veces (Havel et al. 1967), ya que se producen varios estímulos que promueven la lipólisis. Los principales estímulos son la actividad simpaticoadrenal, con un aumento de las catecolaminas en sangre, y el descenso de la concentración sanguínea de insulina. Estos estímulos provocan la activación de la enzima lipasa hormono sensible (LHS) (Froberg et al. 1975; Galster et al. 1981; Hales et al. 1978), que cataliza la reacción de triglicéridos a diacilglicéridos y monoglicéridos, liberándose al torrente sanguíneo AG y glicerol. Este último puede usarse como sustrato gluconeogénico en el hígado, o entrar en la célula muscular para incorporarse en la glucólisis anaeróbica (Robinson and Newsholme 1967) (Figura 4). Las catecolaminas tienen un doble efecto sobre la velocidad de la lipólisis en el tejido adiposo actuando sobre los receptores adrenérgicos, el efecto alfaadrenérgico inhibitorio, y el efecto beta-adrenérgico estimulante (Coppack et al. 1994; Fain and Garcija-Sainz 1983). La sensibilidad de los receptores betaadrenérgicos aumenta con el ejercicio, favoreciendo la lipólisis (Wahrenberg et al. 1987). A través de estos receptores adrenérgicos se produce una activación de la adenilato ciclasa que actúa como enzima en la formación de AMPc a partir de ATP. El AMPc estimula la proteinquinasa, la cual activa mediante fosforilación a la LHS (Figura 4). Sin embargo, la insulina estimula las fosfodiesterasas que se encargan de disminuir el nivel de AMPc, desfosforilando a LHS e inhibiéndola. La velocidad de la lipólisis depende entre otros factores de la capacidad de la sangre de transportar AG a través de la proteína trasportadora albúmina (esta unión es lo que se conoce como AGL). El complejo AG-albúmina es necesario para hacerlos solubles en la sangre y para transportarlos hasta el músculo (Bulow et al. 1985). La concentración de albúmina en plasma suele ser bastante constante (~6mmol/l), mientras que la concentración de AG varía entre 0.2 y 1.0 mmol/l (excepto en ayuno prolongado y ejercicio de resistencia de larga duración). Otro Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción 29 factor es el incremento del flujo sanguíneo al tejido adiposo que ocurre con el ejercicio, el cual también favorece la movilización de los AG aumentando la tasa de lipólisis (Bulow et al. 1985). En realidad, la mayor parte de los AG liberados durante el proceso de la lipólisis son esterificados nuevamente más que oxidados (Wolfe et al. 1990). Esta reestirificación puede ocurrir incluso antes de que el AG abandone el citoplasma del adipocito (intracelular), o bien, los AG pueden ser liberados y reesterificados en otros órganos como, por ejemplo, el hígado (reesterificación extracelular). El funcionamiento de este ciclo está regulado por hormonas (Miyoshi et al. 1988) y por sustratos (Wolfe and Peters 1987) siendo estimulado por el ejercicio. Figura 4. Control de la lipólisis en el adipocito humano a través de los recepetores adrenérgicos. Imagen modificada del Informe del Comité Científico de la Agencia Española de Seguridad Alimentaria y Nutrición (AESAN). Jesús Gustavo Ponce González 30 Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción El porcentaje de reesterificación de los AG en reposo es del ~70% de todos los AG liberados en la lipolísis (Wolfe et al. 1990). Durante los primeros 30 minutos del ejercicio moderado (40% VO2max) el porcentaje de reesterificación disminuye a un 25 % (reesterificación casi exclusivamente intracelular), mientras que la liberación de AG por la hidrólisis de TG es triplicada (Wolfe et al. 1990). Hodgetts y col. (1991) obtuvieron valores similares al realizar el ejercicio al 5070% del VO2max. Con el ejercicio submáximo la lipólisis se activa completamente y la reesterificación se inhibe, incrementando los AGL progresivamente con la intensidad del ejercicio (Gollnick et al. 1969; Wolfe et al. 1990). Esta respuesta permite incrementar el suministro de AGL a los tejidos mayormente consumidores de los mismos durante el ejercicio, es decir al hígado, al músculo esquelético y al corazón. Pero, inmediatamente después del ejercicio, el porcentaje de reesterificación aumenta hasta el 90 % (esta reesterificación sucede tanto a nivel intra como extracelular). Estos cambios en el porcentaje de reesterificación, permiten una respuesta metabólica rápida a las necesidades energéticas durante el ejercicio y la recuperación (Wolfe et al. 1990). Sin embargo, a altas intensidades de ejercicio (>80% VO2max) disminuye la concentración de AGL liberados en plasma por parte del tejido adiposo (Romijn et al. 1993). Aunque recientemente se ha demostrado que la oxidación de grasa se activa en el proceso de recuperación tras un ejercicio de alta intensidad como es un test de Wingate (Guerra et al. 2010). Esto puede ser debido a que los niveles de AG en sangre son incrementados tras el ejercicio por el efecto de la activación metabólica, pudiendo llegar a un pico de concentración de AG durante el periodo de recuperación (~2 mmol/l) para después ir disminuyendo hasta valores basales (Jansson 1980). La oxidación de AG depende en gran parte de la concentración de AG en plasma (Hagenfeldt 1979). Los AGL antes de pasar al interior celular requieren ser separados de la albúmina debido a que la pared de los capilares musculares tienen muy poca permeabilidad para el complejo AG-albúmina (Bassingthwaighte et al. 1989). El proceso por el cual los ácidos grasos pueden difundir al interior celular parece estar mediado por alguna proteína transportadora de AG (FATP, FABPPM)(Brinkmann et al. 2002; Calles-Escandon et al. 1996; Glatz and van der Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción 31 Vusse 1989), o una translocasa (FAT) como la CD36 (Abumrad et al. 1999) o una combinación de ambos (McArthur et al. 1999; Nguyen et al. 2008; Potter et al. 1989; Sampath and Ntambi 2005) (Figura 5). Se ha demostrado que las proteínas FATPs se encuentran en las membranas celulares y que su función principal es el transporte de AG a través de la membrana celular (Doege et al. 2006; Jump and Clarke 1999). Este traspaso de AG al interior de la célula muscular está regulado, impidiendo que capte más AG de los que necesita. Por otro lado, el aumento de AGL en el torrente sanguíneo con el ejercicio prolongado parece inducir un aumento en el contenido de TGIM en los músculos no ejercitados (SchrauwenHinderling et al. 2003). Independientemente de la procedencia de los AG, una vez en el interior de la célula muscular, previamente a ser oxidados, los AG sufren un proceso de activación con el que aumentan su nivel energético. Esto se consigue mediante la unión de un coenzima A (CoA) al AG, formando el complejo acil-CoA (Figura 5). Si no fuera necesario oxidar el complejo acil-CoA; éste podría reestirificarse y almacenarse en forma de TGIM (Dagenais et al. 1976). El proceso de formación de acilCoA requiere una molécula de ATP, desprendiéndose AMP. Posteriormente, el acil-CoA se une a una proteína citosólica (proteína que une ácidos grasos -FABP-) que facilita su solubilización y posibilita su transporte a los diferentes compartimentos celulares (Calles-Escandon et al. 1996; Coe and Bernlohr 1998). El acil-CoA es transportado a la matriz mitocondrial a través de carnitinpalmitoil transferasa I (CPTI), una translocasa y carnitin-palmitoil transferasa II (CPTII). El transporte dentro de la mitocondria es carnitina-dependiente, ya que en la membrana externa de la mitocondria convierte el complejo de acil-CoA en acil-carnitina a través de CPTI. Mientras que en la membrana interna, el complejo acil-carnitina vuelve a transformarse en acil-CoA por la CPTII. Por lo que las acil-carnitin transferasas y la carnitina permiten el paso de grupo radical acil y sin perder su valor energético. Este mecanismo de transporte de la membrana mitocondrial no depende del oxígeno, pero sí de la masa mitocondrial, ya que la concentración de acil-carnitin transferasas será mayor cuanto más número y tamaño Jesús Gustavo Ponce González 32 Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción de mitocondrias se posea. Por este motivo, los AG son oxidados principalmente en las fibras tipo I, que son las que tienen más mitocondrias. Aunque en los sujetos entrenados las fibras tipo IIa pueden tener una densidad mitocondrial similar a la observada en las fibras tipo I. Figura 5. Representación del proceso de captación de AG del torrente sanguíneo por parte de la célula muscular y su transporte hasta su oxidación en la mitocondria o su reestifiricación a TGIM. Figura modificada del artículo de Holger Doege and Andreas Stahl del año 2006 (Doege and Stahl 2006). Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción 33 Las acil-carnitin transferasas son inhibidas por malonil-CoA, un intermediario de la biosíntesis de AG y que se forma a través de la acetil-CoA carboxilasa (ACC). Cuando un estímulo aumenta la oxidación de AG, la ACC se fosforila inhibiéndose, disminuyendo la concentración de malonil-CoA, y por tanto permitiendo la captación de AG por parte de la mitocondria a través de la CPT (Guerra et al. 2010). Cuando las concentraciones de glucosa e insulina están aumentadas, se produce un aumento de la actividad de la ACC, y por tanto un aumento de la formación de malonil-CoA (Duan and Winder 1992; Guerra et al. 2010; Saha et al. 1995; Saha et al. 1997). Una vez dentro de la mitocondria, los acil-CoA están preparados para entrar en el proceso de la oxidación mitocondrial. 1.1.2. Oxidación mitocondrial La β-oxidación es un proceso metabólico donde se oxida el radical acilo en el carbono β, que es el que se encuentra en segunda posición, dando de nuevo un acil-CoA (acortado en dos átomos de carbono) más un acetil-CoA. Este proceso consta de cuatro reacciones enzimáticas, convirtiéndose en un proceso cíclico hasta que el acil-CoA que entró en la mitocondria quede dividido en fragmentos de dos átomos de carbono en forma de acetil-CoA (Figura 6). En el transcurso de la β-oxidación, se produce la extracción de átomos de hidrógeno unido a sus electrones, de manera que en cada β-oxidación se reduce un NAD y un FAD, transformándose en NADH+H+ y FADH2 respectivamente (Figura 6). A continuación, el acetil-CoA producido entra en el proceso de ciclo de Krebs, de la misma manera que el procedente del piruvato. A partir de este momento el metabolismo oxidativo es común con el de los HCO. Los hidrógenos obtenidos de la β-oxidación y también en el ciclo de Krebs en forma de NADH+H+ y FADH2 terminarán unidos al oxígeno para forma H2O y la energía liberada en este proceso se empleará para sintetizar ATP. Jesús Gustavo Ponce González 34 Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción La fosforilación oxidativa es el último paso para la obtención de energía e forma de ATP. También transcurre en el interior de la mitocondria y consta de dos procesos: 1.- Un proceso de oxidación espontáneo, exergónico, en el cual el oxígeno es el aceptor final de los electrones que se liberan de los átomos de hidrógeno. 2.- Un proceso de fosforilación, por el cual se incorpora un grupo fosfato al ADP para resintetizar el ATP. A diferencia del primer proceso, este es un proceso endergónico que para poder llevarse a cabo utiliza la energía liberada en la oxidación. La cadena respiratoria consiste en una cadena de enzimas, coenzimas y citocromos en la cual cada componente representa un nivel de oxido-reducción. La Figura 6. Representación de la fase de oxidación mitocondrial de AG, β-oxidación. Imagen obtenida de Recursos de Biología y Geología (www.bioygeo.info). © manuelgvs 2007. Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción 35 cadena o transporte de los electrones se realiza en la membrana interna de la mitocondria y gracias a ella se lleva a cabo el proceso de oxidación, donde los hidrógenos transportados en forma de NADH+H+ y FADH2 son descompuestos en H+ y en un e-. Estos electrones van pasando por cada compuesto de la cadena respiratoria, y a medida que va pasando de un compuesto a otro se libera energía, que sirve para refosforilar el ADP. Finalmente, el oxígeno molecular obtenido del aire atmosférico acepta los electrones, transformándose en oxígeno iónico, el cual se une al H+ para formar H2O (Figura 7). La fosforilación oxidativa está acoplada a la cadena respiratoria, porque al transferir electrones se crea un gradiente importante que permite a la ATPasa mitocondrial generar ATP. A continuación se desglosan todos los pasos de la fosforilación oxidativa por niveles (Figura 7).  Primer nivel: El NADH llega a las crestas mitocondriales, donde se oxida con una "flavoproteína", reduciéndola (o sea cargándola de electrones).  Segundo nivel: Posteriormente la flavoproteína se oxida y reduce a una coenzima denominada "Q". Durante este proceso se libera energía que ejecuta una primera fosforilación oxidativa de ATP.  Tercer nivel: Es en este nivel donde ingresa el FADH. La coenzima Q que se encuentra reducida, se oxida reduciendo así a un compuesto denominado citocromo b. Durante esta oxidación se libera energía para ejecutar la segunda fosforilación oxidativa de ATP.  Cuarto nivel: El citocromo b se oxida, reduciendo así al citocromo c.  Quinto nivel: El citocromo c se oxida, reduciendo así al citocromo a.  Sexto nivel: El citocromo a se oxida con oxigeno, reduciéndolo de esta forma a agua. Durante esta última oxidación se libera la energía para ejecutar la tercera y última fosforilación oxidativa de ATP. Jesús Gustavo Ponce González 36 Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción La metodología actual para medir la función mitocondrial es evaluar en fibras muscularas permeabilizadas con saponina como responde el flujo de oxígeno tras añadir diferentes sustratos e inhibidores. Esta técnica nos permite conocer la capacidad de la mitocondria en los diferentes pasos de la cadena respiratoria (Kuznetsov et al. 2008). Por otro lado, se utiliza como un índice de densidad y actividad mitocondrial la actividad de la enzima citrato sintetasa (CS), la cual cataliza la primera reacción del ciclo de Krebs (Larsen et al. 2009; Stisen et al. 2006). En cuanto a analizar la activación de la β-oxidación de AG dentro de la mitocondria se analiza la actividad de la enzima β-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa (HAD)(Larsen et al. 2009; Stisen et al. 2006), la cual es muy importante, ya que es la encargada de reducir NAD a NADH+H+ en la reacción del paso perteneciente a la β-oxidación de hidroxiacil-CoA dando como producto β-cetoacilCoA. Y a su vez, para evaluar la tasa de lipólisis se suele analizar por la actividad Figura 7. Representación de la fase de fosforilación oxidativa que ocurre en la mitocondria, donde se obtiene finalmente la energía en forma de ATP tras el ciclo de Krebs y la β-oxidación. Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción 37 de la lipasa hormono sensible (LHS) (Lampidonis et al. 2011; Stisen et al. 2006), ya descrita anteriormente. 1.1.3. Factores determinantes de la oxidación de grasas Aunque los depósitos de grasas son relativamente grandes, la capacidad para oxidar ácidos grasos es limitada, y en muchos casos los carbohidratos son el sustrato predominantemente oxidado. Las limitaciones en oxidación de ácidos grasas podrían estar ubicadas a diferentes niveles: 1. Movilización de los ácidos grasos desde el tejido adiposo. 2. El transporte de ácidos grasos hacia el músculo. 3. El consumo de ácidos grasos por parte de la célula muscular. aEl consumo de ácidos grasos plasmáticos. bEl consumo de ácidos grasos desde la unión lipoproteínaTG circulante en plasma. 4. Movilización de ácidos grasos de los “pools” de TGIM. 5. El transporte de ácidos grasos dentro de la mitocondria. 6. La oxidación de ácidos grasos en la mitocondria. Los principales factores externos que contribuyen en el metabolismo oxidativo de las grasas son la intensidad y duración del esfuerzo, así como del tipo de ejercicio, de la dieta habitual y del nivel de entrenamiento. Se ha demostrado que la oxidación de AGL durante el ejercicio correlaciona con la concentración plasmática de AGL (Hagenfeldt and Wahren 1968; Issekutz et al. 1967), que depende de la intensidad y de la duración del esfuerzo. La concentración plasmática de AGL aumenta con la intensidad del esfuerzo, siempre y cuando ésta se mantenga por debajo de la intensidad a partir de la cual se acumula lactato (Paul 1970; Pruett 1970). En efecto, hasta intensidades de esfuerzo cercanas al 60-70 % del VO2max la oxidación de AG aumenta con la intensidad y la duración del esfuerzo (Romijn et al. 1993). A intensidades de esfuerzo más elevadas (~85 % del VO2max), la concentración plasmática de AGL es similar a la de reposo y tiende a disminuir con la duración del esfuerzo, debido a que la res- Jesús Gustavo Ponce González 44 Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción cambio respiratorio (RER), que es similar al cociente respiratorio que ocurre en los tejidos (RQ). Puede ser de 0.69-0.73 cuando se oxidan sólo grasas (dependiendo del largo de la cadena de carbono del ácido graso oxidado), y puede ser 1.0 cuando se oxida sólo glucosa. La oxidación de una molécula de glucosa: C6H12O6 + 6 O2  6 CO2 + 6 H2O RQ = = = 1.00 La oxidación de una molécula de ácido palmítico (ac. graso tipo): C16H32O2 + 23 O2  16 CO2 + 16 H2O RQ = = = 0.70 El rango en el que oscila el valor de RQ comprende las medidas de fuentes de energía mixtas entre HCO y AG. Sin embargo, se pueden encontrar valores por encima de 1.00 durante el ejercicio, pero esto es debido a que se hiperventila y a que se produce un estado de acidosis metabólica. Ambos factores contribuyen a aumentar la producción de CO2 (VCO2) y en consecuencia, los valores de RQ pueden ser superiores a 1.00, ocurriendo principalmente a intensidades de esfuerzo superiores a las correspondientes al umbral anaeróbico. Las contribución de las proteínas al gasto energético se puede estimar midiendo en la orina la concentración de urea, proveniente de la degradación de proteínas. Sin embargo, se ha estimado que el aporte proteico en pruebas de calorimetría indirecta es mínimo, por lo que se suele desestimar (Jeukendrup and Wallis 2005; Wagenmakers 1998). De hecho, las ecuaciones de oxidación de sustratos, provienen de tablas realizadas con valores RQ no proteicos (Peronnet and Massicotte 1991). Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción 45 Los primeros estudios que usaron la calorimetría indirecta a través de los gases, no sólo demostraron que tanto carbohidratos como grasas fueron utilizados durante el ejercicio, sino también que sus contribuciones relativas cambiaron dependiendo de la intensidad, la duración del ejercicio y la dieta previa al mismo (Christensen and Hansen 1939; Edwards et al. 1934; Krogh and Lindhard 1920). Originariamente, los gases expirados eran recolectados dentro de unas bolsas grandes de plástico (saco de Douglas). Más tarde, sobre 1940 aparecieron los primeros equipos portátiles, donde un medidor de gases era fijado en la espalda de los sujetos que recolectaba el volumen de aire expirado. Estos aparatos fueron mejorando su calidad, permitiendo evaluar el aire expirado respiración a respiración, que con la ayuda de computadores permitieron obtener los resultados de forma mucho más rápida (Wilmore et al. 1976). Sin embargo, el saco de Douglas sigue siendo el gold standard para medidas indirectas, aunque los nuevos dispositivos han llegado a ser muy fiables y comparables con el saco de Douglas (Carter and Jeukendrup 2002; Rietjens et al. 2001; Schulz et al. 1997). Existen en la literatura científica varias ecuaciones para el cálculo de oxidación de sustratos. Desde hace 80 años, se ha intentado optimizar estas ecuaciones para hacerlas cada vez más fiables (Consolazio et al. 1963; Ferrannini 1988) (Frayn 1983; Lusk 1924, 1928; Peronnet and Massicotte 1991). Por ejemplo, Lusk (1924, 1928) se basó en los cálculos de oxidación de grasa sobre el análisis de manteca de cerdo, ya que era la mejor información de aquella época. Consolazio y col. (1963) usaron la glucosa y el ácido palmítico como las bases de sus cálculos. Se utilizó el ácido palmítico porque es el AG más común en la dieta humana y también en plasma. Sin embargo, Frayn (1983) usó el palmitoil-oleoilestearoil-glicerol porque este TG era muy similar a la composición media del tejido adiposo humano. Por otro lado, Ferrannini (1988) usó tripalmitoil glicerol ya que se parecía bastante al usado por Frayn (1983) y al ácido palmítico. Finalmente, Peronnet y Massicotte (1991) intentaron ser un poco más preciso, y basaron sus cálculos sobre la media de los pesos de 13 AG diferentes, los cuales representaban el 99% de todos los AG del tejido adiposo humano. Sin embargo, la diferencia entre estas ecuaciones suponen sólo un 6% de variación (Jeukendrup Jesús Gustavo Ponce González 46 Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción and Wallis 2005). Aún así, las ecuaciones más utilizadas en el campo de la investigación son las presentadas por Frayn (1983).  HCO oxidados (g/min) = 4.55*VCO2 (L/min) - 3.21*VO2 (L/min) - 2.87*n  AG oxidados (g/min) = 1.67*VO2 (L/min) – 1.67*VCO2 (L/min) – 1.92*n Siendo n el valor de la excreción urinaria de nitrógeno proveniente de la degradación de proteínas para los casos de que se quiera tener en cuenta. El protocolo de ejercicio para determinar la oxidación máxima de grasa y a qué intensidad de esfuerzo ocurre, han sido validados frente a cargas constantes en días separados (Achten et al. 2002). El protocolo se realizó en cicloergómetro con incrementos de 35-W cada 5 minutos hasta el agotamiento. Al final de cada carga, la oxidación de grasa fue determinada por calorimetría indirecta. Los resultados no mostraron ninguna diferencia al ser comparados con los valores de las cargas constantes realizadas en días diferentes. A su vez, el mismo estudió validó un protocolo más corto, donde se usaban las mismas cargas de 35-W, pero los incrementos sucedían cada 3 minutos, encontrando resultados comparables. La calorimetría indirecta, requiere de una medición en reposo, la cual se debe hacer en una camilla tumbado y relajado para tener el metabolismo basal. La duración de esta medición oscila entre 10 y 30 minutos según la estabilidad de las medidas. La calorimetría indirecta es una de las técnicas más importantes y usadas para el estudio del metabolismo los sustratos energéticos del tanto en reposo como en ejercicio. Sin embargo, con la calorimetría indirecta no se puede determinar de dónde proceden los ácidos oxidados durante el ejercicio. 1.2. Perfil hormonal y masa grasa Como ya comentamos previamente a lo largo del punto 1.1 de la introducción, la acumulación, movilización y oxidación de grasa puede estar determinada por la respuesta hormonal ante diferentes estímulos como puede ser el ejercicio. En este sentido, esta tesis se centrará en los efectos de la osteocalcina, la testosterona y la leptina por su contrastada influencia en el tejido adiposo. Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción 47 1.2.1. Osteocalcina Recientemente, algunas investigaciones descubrieron que la osteocalcina, una proteína producida casi exclusivamente por los osteoblastos -las células responsables de la mineralización de los huesos-, no tiene sólo una función estructural, sino que es una hormona con diferentes funciones (Lee et al. 2007). En efecto, la regulación de la remodelación ósea por parte de la osteocalcina, implica que el hueso puede ejercer un feedback que controla la regulación de la homeostasis energética, y por tanto de la masa grasa (Ferron et al. 2008; Lee et al. 2007; Pittas et al. 2009). Este artículo realizado por Lee y col. (2007), publicado en la revista Cell, demuestra que las células óseas liberan una hormona llamada osteocalcina, que controla la regulación de la glucosa en sangre y el depósito de grasas. La osteocalcina aumenta tanto la secreción como la sensibilidad a la insulina, además de aumentar la capacidad de reducir las reservas de grasa, evitando el desarrollo de diabetes tipo 2 y obesidad en ratones (Lee et al. 2007). Los animales con niveles elevados de osteocalcina son resistentes a desarrollar obesidad y diabetes aunque consuman una dieta alta en grasas (Lee et al. 2007). Al contrario, los ratones cuya hormona esquelética no funciona desarrollan diabetes tipo 2, aumentan de peso, almacenan más grasa corporal, tienen menos insulina y una menor cantidad de células beta productoras de insulina (Lee et al. 2007). A su vez, la osteocalcina podría actuar sobre los adipocitos afectando la regulación de hormonas como la leptina y la adiponectina, que podrían inducir la sensibilidad a la insulina y la oxidación de AG en músculo e hígado (Ahn et al. 2010; Guadalupe-Grau et al. 2009; Hinoi et al. 2008; Yamauchi et al. 2002). En efecto, la osteocalcina y la leptina correlacionan negativamente, al igual que con la masa grasa (Guadalupe-Grau et al. 2009; Kindblom et al. 2009; Pittas et al. 2009). Por otro lado, los niveles de osteocalcina sérica están relacionados también con los niveles de testosterona en mujeres (Ahn et al. 2010), y en hombres la Jesús Gustavo Ponce González 48 Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción osteocalcina estimula la producción de testosterona actuando en las células de Leydig en los testículos (Oury et al. 2011). 1.2.2. Andrógenos Los andrógenos son hormonas sexuales masculinas, cuyos principales componentes son la testosterona, la androsterona y la androstendiona. Los andrógenos son esteroides del tipo C-19 secretados principalmente por los testículos y las glándulas adrenales, y en las mujeres en menor medida por los ovarios. El andrógeno más importante en los hombres es la testosterona (T), que circula por el torrente sanguíneo unida a albúmina y una proteína específica del plasma, la globulina transportadora de hormonas sexuales (SHBG). La testosterona es una hormona anabólica, teniendo un efecto contrastado sobre la masa muscular y tejido adiposo. Los andrógenos estimulan la síntesis de proteínas y el crecimiento muscular (Bhasin et al. 1997; 2001). Además, los andrógenos inhiben la capacidad de formación y diferenciación de adipocitos, reduciendo su capacidad para almacenar lípidos bloqueando a través del receptor de andrógenos la activación de factores genéticos relacionados con la adipogenesis (Singh et al. 2006). Además, la testosterona también inhibe la actividad de LPL y la captación de lípidos en los adipocitos (Ramirez et al. 1997), y también inhibe la secreción de leptina (Behre et al. 1997; Luukkaa et al. 1998; Wabitsch et al. 1997). Los hombres con deficiencia en los niveles plasmáticos de andrógenos (hipogonadismo) o deficiencia en el receptor de andrógenos, presentan mayor ganancia de masa grasa y pérdida de masa muscular que los sujetos normales (Matsumoto et al. 2003; Mauras et al. 1998). Por otro lado, las personas obesas presentan niveles de testosterona circulantes inferiores a los observados en sujetos delgados, permitiendo un exceso plasmático de la hormona leptina, pudiendo llegar a desarrollar resistencia a la leptina (Knight et al. 2010). Sin embargo, al contrario de lo que ocurre en hombres, la obesidad en mujeres aumenta la incidencia de hiperandrogenismo, a pesar del incremento de los Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción 49 niveles de leptina (Gambineri et al. 2002; Pusalkar et al. 2010). El hiperinsulinismo provocado por la obesidad se ha relacionado con el desarrollo de hiperandrogenismo en las mujeres premenopáusicas a través de sus efectos directos sobre el ovario (Nader et al. 1993). Por lo que los efectos de los andrógenos y su paradoja sobre la masa grasa y la leptina en las mujeres deben ser estudiados más a fondo. 1.2.3. Leptina El descubrimiento de la leptina a finales del año 1994 (Zhang et al.), supuso un paso muy importante en el conocimiento de los mecanismos moleculares mediados por los diferentes factores producidos por el tejido adiposo sobre la homeostasis energética. La leptina es una hormona de 16 KDa producida por los adipocitos en proporción directa a la masa grasa y actúa disminuyendo el apetito y aumentando el metabolismo basal a nivel del sistema nervioso central (SNC) (Figura 9) (Dulloo et al. 2002; Friedman and Halaas 1998; Muoio et al. 1999; Wauters et al. 2002). Se ha observado cómo una mutación en el gen ob, el cual codifica la leptina, produce obesidad en ratones (Campfield et al. 1995; Halaas et al. 1995; Pelleymounter et al. 1995; Zhang et al. 1994). Esta mutación, muy poco frecuente en humanos, produce hiperplasia del tejido adiposo, obesidad mórbida e hipogonadismo hipotalámico (Montague et al. 1997; Rau et al. 1999; Strobel et al. 1998). Figura 9. Estructura de la Leptina. La proteína madura de 146 aminoácidos tiene un peso molecular de 16 kDa y posee una estructura terciaria con un conjunto de cuatro hélices, similar a las citoquinas de cadena larga. Jesús Gustavo Ponce González 50 Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción Los niveles circulantes de leptina correlacionan directamente con el índice de masa corporal (IMC) y con la cantidad total de masa grasa (Banks 2004; Fruhbeck 2001; 1998). Por lo tanto, cualquier aumento en la masa grasa total producirá mayores niveles circulantes de leptina (Considine and Caro 1997; Friedman and Halaas 1998), y viceversa. La reducción de las reservas de grasa corporal por la práctica regular de actividad física o por la dieta produce un descenso en las concentraciones plasmáticas de la hormona (Houmard et al. 2000; Perusse et al. 1997; Thong et al. 2000). Aunque la leptina es mayoritariamente producida y secretada al torrente sanguíneo por los adipocitos, esta no es la única fuente potencial de la hormona. Existen otros tejidos que son capaces de producir pequeñas cantidades de leptina en determinadas circunstancias; entre ellos cabe destacar la placenta, la mucosa gástrica, la médula ósea, el epitelio de la glándula mamaria, el músculo esquelético, la pituitaria, el hipotálamo y el hueso (Ahima and Flier 2000; Bado et al. 1998; Masuzaki et al. 1997; Morash et al. 1999). Inicialmente se pensó que los efectos de la leptina se producían únicamente a nivel central, sin embargo, actualmente se sabe que la leptina es una hormona pleiotrópica que ejerce funciones fisiológicas tanto en el SNC como en múltiples tejidos periféricos (Akerman et al. 2002; Baratta 2002; Bjorbaek and Kahn 2004; Fruhbeck 2001, 2002; Harvey and Ashford 2003; Muoio and Lynis Dohm 2002). La leptina controla el apetito a nivel hipotalámico a través de la estimulación de la expresión de péptidos anorexigénicos como POMC (Proopiomelanocortin) y CART (Cocaine and Amphetamine Regulated Transcrip) y la inhibición de la expresión de péptidos orexigénicos como NPY (Neuropeptide Y) y AGRP (Agouti Related Peptide) (Elmquist et al. 1999; Flier and Maratos-Flier 1998; Sawchenko 1998). Entre los diferentes tejidos periféricos diana de la acción de la leptina se encuentra el músculo esquelético, principal tejido regulador del metabolismo basal y uno de los principales moduladores del metabolismo de los ácidos grasos y de la glucosa (Steinberg and Dyck 2000). En este tejido, la hormona actúa incrementando la oxidación de ácidos grasos, reduciendo la acumulación de grasa intramuscular y aumentando la captación de glucosa y el gasto energético Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción 51 (Argiles et al. 2005; Berti and Gammeltoft 1999; Ceddia et al. 2001; Muoio and Lynis Dohm 2002; Steinberg et al. 2002; Yaspelkis et al. 2001). El descubrimiento de esta hormona ha permitido en los últimos años un gran avance en el conocimiento de la regulación de la ingesta de alimentos (apetito) y del control del peso corporal, de la diabetes, el metabolismo, la reproducción, la respuesta immune, la fisiopatología cardiovascular, la función respiratoria y el crecimiento y desarrollo (Ahima and Flier 2000; Fruhbeck 2006). El hecho de que esta hormona ejerza acciones sobre múltiples tejidos ha supuesto que en los últimos años se haya realizado un gran esfuerzo investigador con el objeto de profundizar en el conocimiento de las diferentes vías bioquímicas y moleculares activadas por la leptina y que gobiernan los diferentes efectos de la hormona, lo cual podría tener importantes implicaciones en el tratamiento de algunas patologías, como la obesidad. 1.2.3.1. Receptores de leptina La naturaleza pleiotrópica de las acciones de la leptina se debe a la distribución universal de su receptor. La hormona ejerce sus acciones, tanto a nivel central como a nivel periférico (Considine and Caro 1997; Friedman and Halaas 1998; Gallagher et al. 2005; Guerra et al. 2007), interaccionando con receptores transmembrana (OB-Rs) que poseen una estructura muy similar a los pertenecientes a la familia de receptores de citokinas de la clase I (Tartaglia 1997; White and Tartaglia 1996). Existen al menos seis isoformas de OB-Rs, designadas como: OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc, OB-Rd, OB-Re y Ob-Rf; generadas por procesamiento alternativo de un único ARNm y/o por procesamiento proteolítico de los productos proteicos subsecuentes (Chua et al. 1997; Lee et al. 1996; Tartaglia 1997). Todas estas isoformas poseen en común un dominio extracelular de unos 800 aminoácidos y un dominio transmembrana de 34 aminoácidos; y difieren en el dominio intracelular que es característico de cada isoforma (Chua et al. 1997; Lee et al. 1996; Tartaglia 1997). En función de estos dominios, las isoformas puede clasificarse en: corta, secretada o soluble y larga, siendo esta última la isoforma funcional del receptor (Chua et al. 1997; Tartaglia 1997; Tartaglia et al. 1995). Jesús Gustavo Ponce González 52 Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción Se ha observado que la ausencia de OB-Rb es la responsable del fenotipo obeso del ratón db/db y de la rata fa/fa (Chua et al. 1996). Además, recientemente nuestro grupo de investigación ha demostrado que los sujetos obesos tienen disminuida la expresión de OB-Rb comparados con sujetos controles, siendo una posible causa del desarrollo de resistencia a la leptina (Fuentes et al. 2010). Otros estudios han demostrado que la eliminación selectiva de todas las isoformas de OB-R en neuronas produce obesidad en ratones, lo que evidencia la importancia de la acción neuronal de la leptina en lo que se refiere a la modulación del peso corporal (Cohen et al. 2001). El ejercicio regular en ratas llevado a cabo durante doce semanas redujo la cantidad de ARNm de OB-Rb en el nucleo arcuato del hipotálamo (Kimura et al. 2004). En cuanto a la influencia del entrenamiento crónico sobre los receptores de leptina en músculo esquelético humano, en nuestro grupo de investigación hemos demostrado que la expresión proteica de OB-Rb en el tríceps braquial del brazo dominante de tenistas profesionales es mayor que en brazo no dominante (Olmedillas et al. 2010), lo que sugiere que el entrenamiento podría modular positivamente la expresión del receptor. En los últimos años se han aportado numerosas evidencias experimentales que documentan ampliamente la oxidación de grasas y captación de glucosa a través de la AMPK (5’-AMP-Activated Protein Kinase), mediado por la cascada de señalización de la leptina. Un estudio particularmente interesante ha demostrado que la inyección intravenosa de leptina incrementa la fosforilación de la AMPKα2 en músculo esquelético, efecto que es más acusado en las fibras de contracción lenta (Minokoshi et al. 2002) y que depende de la unión de la leptina al receptor OB-Rb (Guerra et al. 2011; Minokoshi et al. 2002). 1.2.3.2. AMPK y oxidación de grasa El nombre de AMPK fue adoptado en 1987 (Carling et al.), no obstante, la enzima fue descubierta en 1973 (Carlson and Kim 1973). La AMPK es una enzima heterotrimérica compuesta por una subunidad catalítica (α) y dos subunidades reguladoras (β y γ) (Kahn et al. 2005), cuya expresión está regulada por múltiples Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción 53 genes que codifican cada una de las subunidades (α1, α2, β1, β2, γ1, γ2, γ3) (Mahlapuu et al. 2004). En total se pueden formar 12 heterotrímeros diferentes de AMPK, cuyo patrón de expresión muestra gran pleiotropismo (Barnes et al. 2004) (Steinberg and Jorgensen 2007). La función específica de cada uno de los heterotrímeros aún no ha sido aclarada, pero se ha demostrado que los ratones knockout para AMPKα2 desarrollan obesidad y diabetes tipo 2 (Viollet et al. 2003). En el músculo esquelético la mayoría de los complejos contienen α2 y β2 (Steinberg and Jorgensen 2007). Un 20% de estos complejos α2/β2 están asociados a γ3, mientras que el resto se encuentran mayoritariamente asociados a γ1 (Wojtaszewski et al. 2005). Aunque la isoforma α1 se ha encontrado en extractos musculares, existe evidencia experimental para sugerir que procede de otras células diferentes a las fibras musculares (Fujii et al. 2000). En este tejido, la actividad de la AMPK depende principalmente de la fosforilación de la treonina 172 en el asa de activación de la subunidad α por la quinasa LKB1 (Hawley et al. 2003) (Alessi et al. 2006; Sriwijitkamol et al. 2006), antes llamada quinasa de AMPK (AMPKK). La LKB1 también se activa por AMP (Ponticos et al. 1998). Los ratones transgénicos que carecen de LKB1 tienen una muy escasa actividad AMPKα2 (Sakamoto et al. 2005), lo que confirma la importancia de esta quinasa para la activación de AMPK. Además, también se ha demostrado que el AMP es incapaz de activar a la AMPK en ausencia de LKB1 (Sakamoto et al. 2005). La activación de LKB1 también depende de su fosforilación en el residuo Ser431 a través de la vía de las MAPK, concretamente de la última efectora de esta vía, que es ERK (Extracellular Regulated Kinases) (Banks et al. 2000). La fosforilación de ERK inducida por la unión de la leptina con OB-R viene determinada previamente por la fosforilación directa de JAK2 (Janus Kinase 2) del Box1 y de la tirosina 985 del OB-R que podría estimular la señalización de MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) (Fruhbeck 2006; Guerra et al. 2011). La AMPK es activada por tanto, ante cualquier estrés celular que produzca un incremento del ratio AMP/ATP, como por ejemplo el ejercicio de sprint en músculo esquelético humano (Guerra et al. 2010). Jesús Gustavo Ponce González 60 Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción Hernandez et al. 2008; Nielsen et al. 2010; Skjaerpe et al. 2010; Stiger et al. 2008; Van Pottelbergh et al. 2001), ni cuando los grupos fueron separados por cuartiles (Andersen et al. 2011). A su vez, un mayor número de repeticiones de los polimorfismos CAG parece asociarse a un mayor nivel de leptina en plasma y masa grasa (Nielsen et al. 2010; Stanworth et al. 2008; Zitzmann et al. 2003), pudiendo ser explicado por un nivel más alto de las concentraciones de testosterona en plasma (Bogaert et al. 2009). Sin embargo, otros autores han comunicado que el polimorfismo CAG no tiene ninguna correlación con la masa grasa ni con los niveles de leptina en sangre (Gonzalez Hernandez et al. 2008; Goutou et al. 2009; Lapauw et al. 2007). Sin embargo, el polimorfismo GGN del AR ha sido menos estudiado. Parece, por un lado, que existe una asociación positiva entre el polimorfismo de GGN y los niveles de testosterona (Bogaert et al. 2009). Sin embargo, por otro lado, no se han encontrado en otros estudios ningún tipo de relación entre GGN y los niveles de testosterona (Skjaerpe et al. 2010), creando la misma controversia que con CAG. Gustafson y col. (2003) observaron en hombres edad media y avanzada que poseían un polimorfismo de GGN diferente a 17 y un CAG corto (≤23) mostraban mayores ratios de valores antropométricos relacionados con la obesidad. Sin embargo, deben realizarse más estudios que describan por un lado la posible interacción entre las posibles combinaciones de repeticiones del polimorfismo CAG y GGN con la masa grasa, leptina, osteocalcina y testosterona. Y por otro lado, para dilucidar el efecto de polimorfismos extremos sobre la acumulación de grasa, la respuesta lipolítica al ejercicio, leptina, osteocalcina y testosterona. A su vez, ningún estudio longitudinal ha sido descrito hasta la fecha para ver la posible interacción entre el polimorfismo del AR y la masa grasa. Estos dos últimos puntos, serán gran parte del contenido de los objetivos que se desarrollarán a lo largo de esta tesis. OBJETIVOS E HIPÓTESIS Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Objetivos 63 2. Objetivos 1. Determinar tanto en brazos como en piernas la capacidad máxima de oxidación de grasas, y su relación con la actividad enzimática mitocondrial, así como con la fosforilación basal de AMPK y ACC, en sujetos obesos, postobesos y controles. (Estudio I). 2. Determinar si los polimorfismos del receptor de andrógenos están asociados a la masa grasa y su distribución regional en hombres y mujeres sanos. (Estudio II). 3. Evaluar si los polimorfismos del receptor de andrógenos están asociados a los valores basales en suero de osteocalcina, andrógenos y leptina en hombres y mujeres sanos. (Estudio II y III). 4. Determinar en hombres sanos si los polimorfismos extremos cortos del receptor de andrógenos (<25 percentil) tienen mayor capacidad de oxidación de grasas que aquellos que poseen los polimorfismos extremos largos del receptor de andrógenos (<75 percentil). (Estudio III). 5. Determinar en hombres sanos, si los polimorfismos extremos cortos del receptor de andrógenos (<25 percentil) tienen menos acumulación de grasa, tanto en el cuerpo entero como en la región del tronco, tras el transcurso de los años, comparados con aquellos que poseen los polimorfismos extremos largos del receptor de andrógenos (<75 percentil). (Estudio III). Jesús Gustavo Ponce González 64 Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Hipótesis 3. Hipótesis 1. La capacidad de oxidación de grasas está disminuida en sujetos obesos comparados con sujetos controles y post-obesos. (Estudio I). 2. Las diferencias en la capacidad de oxidación de grasas en sujetos obesos, post-obesos y controles es debida a una disminución en la actividad enzimática mitocondrial y a una menor fosforilación de AMPK o ACC a nivel basal. (Estudio I). 3. Los polimorfismos de repetición CAG y GGN largos del gen que codifica el receptor de andrógenos se asocian a una mayor masa grasa en hombres y mujeres. (Estudio II y III). 4. Los polimorfismos de repetición CAG y GGN cortos del gen que codifica el receptor de andrógenos se asocian a concentraciones séricas aumentadas de andrógenos (T) y osteocalcina, así como a concentraciones séricas de leptina disminuidas. (Estudio II y III). 5. La acumulación de grasa tras un período aproximado de 7 años será mayor en los sujetos con polimorfismos de repetición CAG y GGN largos del gen que codifica el receptor de andrógenos. (Estudio III). 6. La oxidación máxima de grasa estará aumentada en aquellos sujetos que posean polimorfismos de repetición CAG y GGN largos del gen que codifica el receptor de andrógenos. (Estudio III). METODOLOGÍA Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Metodología 67 4. Metodología Todos los sujetos fueron instruidos para que no realizaran actividad física vigorosa, ni tomarán cafeína y/o derivados, bebidas energéticas, alcohol ni tabaco desde el día antes de los experimentos con test sensibles a estos factores como son la extracción de sangre, biopsia muscular y test relacionados con medidas de gases ventilatorios y de tolerancia a la glucosa. Además, los sujetos debieron pasar una noche en ayunas previo a estos test, pudiendo comer una vez finalizados. 4.1. Sujetos Los valores medios de los parámetros edad, talla, peso corporal y porcentaje de grasa de los sujetos que participaron en cada estudio realizado se describen en la tabla 1. Estudio I Un total de 30 sujetos participaron en este estudio, y fueron divididos en 10 sujetos por cada grupo: post-obesos (PO), obesos (O) y controles (C). Los criterios de inclusión en el grupo post-obesos fueron los siguientes: 1) un índice de masa corporal (IMC) por debajo de 30 kg·m-2; 2) la pérdida de peso que no tuviera originada a través de fármacos o terapias quirúrgicas de al menos 10% de su peso corporal; y 3) peso estable en el momento del estudio (± 2 kg y al menos 1 mes antes de comenzar los experimentos). Intencionadamente, los tres grupos fueron ajustados por edad, y además los grupos C y PO fueron ajustados también por IMC. Además, los sujetos de cada grupo obtuvieron valores similares en talla, masa libre de grasa y consumo máximo de oxígeno (VO2max). Este último parámetro muy tenido en cuenta por su gran influencia en la capacidad de oxidación de grasas. Estudio II En este estudio participaron 309 hombres y 78 mujeres caucásicos. Ellos fueron reclutados entre los estudiantes universitarios, clubes deportivos y policía local de Gran Canaria. El reclutamiento de sujetos comenzó en Febrero del 2003 Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Metodología 68 Edad (años) 31.5 ± 1.6 30.4 ± 2.3 31.2 ± 1.5 28.3 ± 7.6 24.8 ± 6.2 34.5 ± 8.0 30.2 ± 7.6 Talla (cm) 184 ± 2 184 ± 3 184 ± 3 177 ± 6 165 ± 6 177 ± 5 176 ± 6 Peso (kg) 90.2 ± 3.1 115.0 ± 5.4* 91.0 ± 4.2 77.8 ± 10.2 59.8 ± 7.5 83.3 ± 11.6 79.2 ± 10.5 Grasa corporal (%) 22.8 ± 1.8 34.9 ± 1.6* 24.7 ± 1.8 18.8 ± 7.4 28.0 ± 6.4 21.3 ± 6.3 19.9 ± 6.2 Datos representados como Media ± SD. * (P<0.05) obesos comparados con postobesos y controles. Hombres Mujeres Hombres (n=319) Tabla 1. Características de los sujetos. Long (n=36) n=10 n=10 n=10 n=309 n=78 Transv (n=46) Estudio I Estudio II Estudio III Postobesos Obesos Control y terminó en Marzo del 2010. Todos los sujetos se sometieron a un examen médico. Los criterios de inclusión fueron: 1) edad comprendida entre 18 y 60; 2) IMC por debajo de 35; 3) realizar algún tipo de actividad física-deportiva al menos una vez a la semana; 4) no fumadores, sin toma de medicamentos ni enfermedades crónicas, hipertensión o limitaciones ortopédicas. Estudio III Inicialmente este estudio comenzó con 319 hombres caucásicos, y fueron reclutados entre estudiantes universitarios, clubes deportivos y policía local de Gran Canaria. Todos los sujetos se sometieron a un examen médico. Los criterios de inclusión fueron los mismos que para el estudio II. Tras la determinación del polimorfismo del receptor de andrógenos, se volvió a llamar sólo a aquellos sujetos con casos extremos del polimorfismo del receptor de andrógenos (primer y cuarto cuartil) para participar en este estudio. Conseguimos volver a evaluar a aproximadamente el 50% de los posibles candidatos. Este estudio realizado con casos de polimorfismos extremos se compone a su vez de dos partes: 1) estudio transversal; y 2) estudio longitudinal que comenzó las primeras medidas en Febrero del 2003 y terminó con unas segundas medidas en Agosto del 2010. Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Metodología 69 4.2. Composición corporal La composición corporal de los sujetos se analizó mediante absorciometría fotónica de rayos X (DXA) (Hologic QDR-1500, Hologic, software versión 7.10, Waltham, MA), tal como se describe en numerosos trabajos publicados por nuestro grupo de investigación (Ara et al. 2004; Guadalupe-Grau et al. 2010). 4.3. Capacidad de salto Las fuerzas generadas durante el salto vertical se midieron mediante una plataforma de fuerza (Kistler, Winterthur, Suiza). Cada sujeto realizó dos tipos diferentes de saltos verticales máximos en los que se eliminó la contribución de los brazos: 1) Squat jump (SJ): Es un tipo de salto en el que hay que saltar desde una posición de salida con las piernas flexionadas, la rodilla a 90º, y durante el cual no se puede realizar contramovimiento previo. Un goniómetro digital (Lafayette Instrument Company, Lafayette, IN) fue utilizado para verificar la flexión de rodilla a 90º antes de realizar el SJ. 2) Salto con contramovimiento (CMJ): Es un tipo de salto en el que se parte de la posición de pie y se realiza un contramovimiento flexionando rápidamente las rodillas hasta unos 90º para conseguir impulso previo. A partir de los datos recogidos con la plataforma de fuerza se determinó la altura de vuelo (VJH), la fuerza máxima (Fp), siendo Fp = fuerza máxima – masa corporal, la potencia media (MP), el impulso mecánico positivo (PI) y la velocidad de desarrollo de fuerza (RFD) entre otras variables. Para ambos tipos de salto se empleó el mejor de tres intentos. La RFD media fue calculada a través de regresión lineal mediante la relación de la fuerza-tiempo durante la fase de impulso en el SJ y CMJ entre el 25 y 75% del pico de fuerza. 4.4. Capacidad anaeróbica Para estimar la capacidad anaeróbica se utilizó un test de carrera de 300 m. Este test fue elegido debido a que la capacidad anaeróbica es el principal determinante del rendimiento en esfuerzos máximos que llevan al agotamiento entre Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Metodología 76 6.7% y 6.7% para osteocalcina, 2.6% y 3.7% para leptina, 6.5% y 3.1% para testosterona libre, 3.9% para adiponectina, y 3.2 % para interleukina-8. También se midieron las concentraciones plasmáticas de glucosa a través de un analizador automático (Hitachi, 612 Automatic Analyzer, Roche, Switzerland); el NEFA plasmático fue medido usando un kit Wako NEFA-C (Wako Chemical, Neuss, Germany); y la hemoglobina fue analizada a través de un analizador Bayer DCA 2000+ (Bayer Healthcare, Elkhart, IN, USA). 4.9.2. Aislamiento de ADN sanguíneo y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la medición de los polimorfismos CAG y GGN del gen del receptor de andrógenos El ADN fue aislado y purificado a partir de 200µl de sangre periférica usando el sistema High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Indianapolis, USA). Para la determinación de la longitud de las repeticiones de los tripletes CAG y GGN, las correspondientes regiones, localizadas en el exón 1 del gen del Receptor de Androgenos (GeneBank M27423) se amplificaron usando primers previamente descritos por otros grupos de investigación (Rodriguez et al. 2006). Uno de los primers fue marcado con FAMO o VIC. La amplificación se llevó a cabo en un volumen final de 25µl usando 50ng de ADN genómico, 200 µM de cada desoxinucleótido trifosfato, tampón para regiones ricas en GC al 1X (Roche, Indianapolis, USA), tampón de reacción de la polimerasa de ADN al 1X y 1U de Taq polimerasa (Fast Start, Roche). La concentración de cada par de primers fue de 1´2 μM (para CAG) y 1´5 μM (para GGN). Las condiciones de la PCR fueron: 30 ciclos de 95ºC durante 45seg, 56ºC durante 30seg y 72ºC durante 30seg para la amplificación de CAG. Para la amplificación de GGN se usaron 30 ciclos de 95ºC durante 1min, 55ºC durante 2min y 72ºC durante 2min. Cada PCR fue iniciada con un ciclo de desnaturalización a 95ºC durante 5min y terminada con un paso de expansión a 72ºC durante 5min. Los productos de PCR fueron diluidos a 1:100 con agua destilada y 1 μl de la dilución fue mezclado con 10 μl de formamida y 0´3 μl del estándar de peso Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Metodología 77 molecular (GeneScan 500LIZ Size Standard, Applied Biosystems). Tras desnaturalización a 98ºC durante 5min la mezcla fue enfriada rápidamente en hielo previamente a la electroforesis capilar mediante el uso del secuenciador ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) y análisis de fragmentos mediante el Gene Scan Analysis Software (versión 3.7) (Applied Biosystem). La longitud exacta de los fragmentos fue corregida mediante un estándar de peso molecular de fabricación propia. 4.10. Consentimientos y aprobación ética Todos los sujetos analizados en los estudios fueron informados acerca de los procedimientos y objetivos del estudio así como de los posibles riesgos y beneficios, tras lo cual firmaron la correspondiente autorización. Los estudios se desarrollaron de acuerdo a lo regulado para los estudios clínicos en la Declaración de Helsinki de 1975, y bajo la aprobación del comité ético u órganos competentes de la ULPGC y del Comité de Ética de Copenhague (KF 01 304792). 4.11. Estadística Como estadísticos descriptivos se presentan los valores de la media y la desviación estándar (SD). La homogeneidad de las varianzas se estableció mediante el test de Levene. La distribución normal fue comprobada con el test de Kolmogorov-Smirnov y Shapiro-Wilk, cuando fue necesario, el análisis estadístico fue realizado con los datos transformados logarítmicamente. Las diferencias entre sujetos de grupos diferentes se establecieron mediante la prueba ANOVA para medidas repetidas, analizando también los cambios en función del tiempo, género, edad, talla, masa total libre de grasa y VO2max. Las diferencias entre los polimorfismos cortos y largos en el estudio II se realizaron mediante el test tStudent. Los efectos longitudinales, y los cambios entre el inicio y el final del estudio III se establecieron mediante la prueba ANOVA para medidas repetidas, analizando también los cambios en función del tiempo pasado entre las dos medidas, grasa corporal al inicio, edad, talla, masa total libre de grasa, oxidación de grasa a nivel basal, MFO y VO2max. También se utilizó en el estudio III un análisis de regresión múltiple para determinar qué variables tenían el mayor valor predictivo para MFO. Además, se examinó la existencia de relaciones lineales Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Metodología 78 ente variables usando el test de correlación de Pearson. Las correlaciones del polimorfismo con masa grasa y leptina fueron ajustadas por testosterona libre, osteocalcina y VO2max en el estudio II. La influencia de la longitud de las repeticiones del polimorfismo CAG y GGN en la composición corporal, MFO, hormonas y variables de condición física fue determinada tomando los polimorfismos como variables continuas o dicotómicas mediante límites alélicos correspondientes a la mediana de las distribuciones de las longitudes de CAG y GGN. Estudio II: puesto que el gen del receptor de andrógenos está localizado en el cromosoma X y uno de los dos alelos está aleatoriamente inactivado en las mujeres (Lyon 1999), decidimos calcular la media de los dos alelos como una medida representativa de cada par en mujeres (Gonzalez et al. 2007) (Jaaskelainen et al. 2008). El valor medio que mostró el mejor balance entre los grupos de mujeres y hombres se usó como punto de corte, en consecuencia, los sujetos que tuvieran un número de repeticiones ≤21 en hombres y ≤22 en mujeres se clasificaron como CAG cortos (CAGS), y aquellos sujetos que mostraran un número de repeticiones >21 en hombres y >22 en mujeres, fueron clasificados como CAG largos (CAGL). En el caso de GGN, aquellos sujetos que tuvieron un número de repeticiones ≤23 tanto en hombres como en mujeres fueron clasificados como GGN cortos (GGNS), el resto de los sujetos fueron clasificados como GGN largos (GGNL). Además, los sujetos fueron también clasificados según mostraran las siguientes combinaciones de haplotipos: CAGS+CGNL, CAGL+CGNS, CAGL+CGNL y CAGS+CGNS. Estudio III: este estudio se realizó con los sujetos pertenecientes al primer (números extremos de repeticiones cortas) y cuarto (números extremos de repeticiones largas) cuartil, de entre los incluidos en el estudio II. Por lo que los sujetos seleccionados por cada grupo tuvieron números de repeticiones de CAG y GGN: CAGS (cortos ≤ 19 repeticiones), CAGL (largos ≥ 24 repeticiones), GGNS (cortos ≤ 22 repeticiones), y GGNL (largos ≥ 25 repeticiones). El análisis estadístico se realizó con el paquete informático SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Se han asumido diferencias significativas para P < 0.05. RESULTADOS Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Resultados 81 5. Resultados En el siguiente apartado se resumen los resultados más relevantes de cada uno de los artículos. La descripción detallada de los resultados se encuentra en las publicaciones anexas que forman parte de esta tesis doctoral. 5.1. Resumen de los resultados del artículo I (Ara et al. 2010) Ara I, Larsen S, Stallknecht B, Guerra B, Morales-Alamo D, Andersen JL, PonceGonzalez JG, Guadalupe-Grau A, Galbo H, Calbet JA, Helge JW. (2010). Normal mitochondrial function and increased fat oxidation capacity in leg and arm muscles in obese humans. Int J Obes (Lond). Composición corporal, VO2max y tipo de fibra muscular La edad, talla, masa magra total, VO2max y los tipos de fibras (tipo I, IIA y IIX) fueron similares en los tres grupos, tanto en brazos como en piernas (Ver tabla 1 y 2 del estudio I). Además, no hubo diferencias en área y capilarización de las fibras musculares de los brazos y de las piernas (Ver tabla 2 del estudio I). De acuerdo con el diseño del estudio, los obesos tuvieron mayor peso corporal, grasa corporal y IMC que los otros grupos (p<0.05); sin embargo, el IMC fue similar entre post-obesos y controles (Ver tabla 1). Tolerancia a la glucosa, ácidos grasos libres y hormonas La tolerancia a la glucosa fue menor en obesos que en controles y postobesos, tanto antes como después del test de tolerancia a la glucosa oral (p<0.05). A su vez, la glucosa, NEFA y la insulina plasmática medidas en ayunas y en reposo fueron mayores en obesos que en los otros dos grupos (p<0.05). Las concentraciones de leptina plasmática fue mayor en los obesos comparados con controles y post-obesos (p<0.05) (Ver figura 1a del estudio I), mientras que la adiponectina fue mayor en post-obesos que en controles y obesos (p<0.05) (Ver figura 1b del estudio I). No hubo diferencias significativas entre grupos en la hormona de interleukina-8. Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Resultados 82 Oxidación máxima de grasas durante el ejercicio de piernas y brazos El valor de MFO durante el ejercicio de piernas fue mayor y ocurrió a una mayor intensidad relativa (FatMax) en obesos y post-obesos que en controles (p<0.05) (Ver figura 2a del estudio I). A su vez, el MFO durante el ejercicio de brazos fue mayor en obesos que en controles (p<0.05), mientras que se encontró una tendencia (p=0.08) con valores mayores en obesos comparados con postobesos. El FatMax de los brazos en intensidad relativa fue mayor en obesos que en post-obesos y controles (p<0.05). Actividad de enzimas mitocondriales y respiración mitocondrial La actividad de CS fue similar entre grupos en el músculo vasto lateral de la pierna. Sin embargo, la actividad de CS fue menor en obesos que en post-obesos y controles en el músculo deltoides del brazo (p<0.05) (Ver tabla 2 del estudio I). En los tres grupos, la actividad de CS fue menor en los músculos del brazo que de la pierna (p<0.05) (Ver tabla 2 del estudio I). No se encontraron diferencias significativas entre grupos en la actividad de HAD, sin embargo, en obesos y controles demostraron tener menos actividad de HAD en el brazo que en la pierna (p<0.05) (Ver tabla 2 del estudio I). Los tres grupos obtuvieron valores similares de la actividad de LHS en el vasto lateral (Ver tabla 2 del estudio I). Los depósitos de glucógeno muscular fueron similares tanto en brazos como en piernas en los tres grupos (Ver tabla 2 del estudio I). Sin embargo, los depósitos de TGIM en al vasto lateral fueron mayores en obesos que en controles, y en el deltoides fue mayor en obesos comparados con los otros dos grupos (p<0.05) (Ver tabla 2 del estudio I). El flujo de O2 mitocondrial por mg de tejido muscular no fue diferente entre los tres grupos, incluso tras normalizarla por CS como índice de densidad mitocondrial (Ver figura 3 del estudio I). Fosforilación de AMPK y ACC y expresión proteica de SOCS3 Los tres grupos obtuvieron valores similares en la fosforilación de AMPK y expresión proteica de SOCS3 a nivel basal (Ver tabla 2 del estudio I). Sin embar- Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Resultados 83 go, la fosforilacion de ACC en el vasto lateral fue menor en obesos que en postobesos y controles (p<0.05), mientras que en el deltoides fue menor en controles que en obesos (p<0.05) (Ver tabla 2 del estudio I). Además, cuando el músculo deltoides fue comparado con el vasto lateral, el grupo control tuvo valores similares en la expresión proteica de SOCS3 y en la fosforilación de AMPK y ACC; mientras que obesos tuvo valores más bajos en la expresión proteica de SOCS3 y en la fosforilación de AMPK y ACC en el músculo deltoides comparados con el vasto lateral (p<0.05) (Ver tabla 2 del estudio I). Los sujetos post-obesos tuvieron mayores niveles de fosforilacion de AMPK y ACC (p<0.05), pero no de expresión proteica de SOCS3 en el deltoides comparado con el vasto lateral (Ver tabla 2 del estudio I). 5.2. Resumen de los resultados del artículo II (Ponce-González et al. 2011) Jesús Gustavo Ponce-González, Amelia Guadalupe-Grau, Francisco Germán Rodríguez-González, Cecilia Dorado, Hugo Olmedillas, Teresa Fuentes, Lorena Rodríguez-García, Bonifacio Nicolás Díaz-Chico, José A L Calbet. (2011). Androgen receptor gene polymorphisms and the fat-bone axis in healthy young men and women. J Androl. (In press). Efectos del polimorfismo del AR sobre la masa grasa y respuesta hormonal Tanto en hombre como en mujeres, los grupos CAGS y CAGL tuvieron valores similares en composición corporal y en la concentración plasmáticas de leptina, osteocalcina y testosterona (Ver tabla 1 del estudio II); y a su vez, los grupos GGNS y GGNL tuvieron valores similares en la concentración plasmática de leptina, osteocalcina y testosterona (Ver tabla 2 del estudio II). No se encontraron correlaciones del polimorfismo CAG y las variables de composición corporal y hormonas, ni en hombres ni en mujeres. El polimorfismo GGN tampoco tuvo relación con las variables de composición corporal y hormonas en hombres. Sin embargo, en mujeres se encontró una asociación directa entre GGN y el logaritmo del porcentaje de grasa (r=0.30, p<0.05); el logaritmo del Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Resultados 84 porcentaje de grasa en el tronco (r=0.28, p<0.05); el logaritmo de la concentración sérica de leptina (r=0.40, p<0.05); y el logaritmo de la concentración sérica de osteocalcina (r=0.32, p<0.05). Estas correlaciones permanecieron significativas tras hacer los cálculos ajustando por testosterona libre, osteocalcina y VO2max en mujeres (Ver tabla 3 del estudio II). En hombres, el logaritmo de testosterona libre se asoció inversamente con la adiposidad y con la concentración sérica de leptina, y positivamente con la concentración sérica de osteocalcina (Ver tabla 4 del estudio II). La adiposidad, junto con las concentraciones séricas de leptina, testosterona libre y osteocalcina fueron similares cuando se realizaron los cálculos por grupos de haplotipos del polimorfismo del AR, con las combinaciones de alelos: CAGL+GGNL, CAGS+GGNS, CAGS+GGNL, y CAGL+GGNS. 5.3. Resumen de los resultados del artículo III (Ponce-González et al. 2011) Jesús Gustavo Ponce-González, Amelia Guadalupe-Grau, Francisco Germán Rodríguez-González, Cecilia Dorado, Rafael S. de Torres-Peralta, David Morales-Alamo, Lorena Rodríguez-García, Bonifacio Nicolás Díaz-Chico, José A L Calbet. (2011b). Androgen receptor gene polymorphisms fat mass accumulation, and maximal fat oxidation capacity. A longitudinal study. Int J Obes (Lond). (En revisión). Parte transversal: efectos del polimorfismo del AR sobre MFO y masa grasa Los grupos extremos de CAG y GGN tenían valores similares en composición corporal y condición física, incluso tras ajustar por la edad (Ver tabla 1 del estudio III). No existieron diferencias entre grupos de CAG para la tasa metabólica basal, MFO y gasto energético diario. Sin embargo, tras ajustar por la edad y la talla, la grasa acumulada en el tronco (p=0.09) y MFO por kg de masa magra de las piernas (p=0.06) tendió a ser mayor en GGNS comparado con GGNL (Ver figura 2 del estudio III). Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Resultados 85 El número de repeticiones de GGN tendió a ser asociado negativamente con el logaritmo de leptina sérica (r=-0.32, p=0.07), logaritmo de porcentaje de grasa corporal (r=-0.31, p=0.08), logaritmo de la masa grasa del tronco (r=-0,32, p=0.07), y una asociación positiva con MFO por kg de masa magra de las extremidades inferiores por la altura al cuadrado (r=0.31, p=0.08). Además, se observó una correlación negativa entre los niveles de leptina y osteocalcina plasmáticas (r=-0.44, p<0.05). La leptina se asoció positivamente con la grasa corporal total (r=0.56, p<0.01), mientras que la correlación entre la osteocalcina y la grasa corporal total fue negativa (r=0,41, p<0.05). Asociaciones similares se encontraron entre los niveles séricos de leptina y la osteocalcina, con la masa grasa del tronco (r=0.48, p<0.01 y r=-0.35, p<0.05, respectivamente), y con el porcentaje de grasa corporal (r=0.63, p<0.01 y r=-0.44, p<0.05, respectivamente). Se observó una correlación negativa entre la testosterona libre y la leptina (r=-0.43, p<0.05). Por otra parte, la testosterona libre en suero se correlacionó inversamente con el porcentaje de grasa corporal (r=-0.45, p<0.05). Parte longitudinal: efectos del polimorfismo del AR sobre la acumulación de masa grasa Los sujetos pertenecientes a los grupos de CAGS y CAGL acumularon respectivamente 3.4 ± 5.1 y 2.0 ± 4.4 kg de grasa corporal total en un período de 6.4 ± 1.0 años de seguimiento (p=NS). A su vez, los sujetos pertenecientes a los grupos de GGNS y GGNL acumularon respectivamente 3.2 ± 4.5 y 0.5 ± 4.3 kg de grasa corporal total en un período de 6.9 ± 1.1 años de seguimiento (p=0.13) (Ver tabla 2 del estudio III). Sin embargo, se encontró una tendencia a una diferencia estadísticamente significativa en la acumulación de masa grasa corporal después de ajustar por el porcentaje inicial de grasa corporal, la altura, y el tiempo transcurrido entre las dos mediciones (p=0.08); y también cuando se ajustó por el porcentaje inicial de grasa corporal, estatura, oxidación de grasa a nivel basal, y el tiempo transcurrido entre las dos mediciones (p=0.08). Por otro lado, los sujetos pertenecientes a los grupos de GGNS y GGNL acumularon respectivamente 2.0 ± 2.7 y 0.3 ± 2.9 kg de grasa en la región del tronco en un período de 6.9 ± 1.1 años de seguimiento (p=0.19) (Ver tabla 2 Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Discusión 92 Estudio II: Androgen receptor gene polymorphisms and the fat-bone axis in young men and women. J Androl. (In press). En contraste con nuestra hipótesis, no se observó asociación entre las variaciones de longitud polimórfica del AR y la adiposidad o la concentración de leptina sérica en hombres jóvenes. Por otra parte, esta falta de asociación se mantuvo después de ajustar por la osteocalcina, testosterona libre y la capacidad cardiorespiratoria (VO2max). Sin embargo, encontramos una asociación positiva entre la longitud de repetición GGN con la adiposidad y la concentración de leptina sérica en mujeres. Esta asociación fue aún más fuerte después de considerar la osteocalcina, testosterona libre y VO2max como covariables. Al igual que en los hombres, no se encontró relación entre la longitud de repetición CAG con la adiposidad o la concentración sérica de leptina en las mujeres. Estos resultados indican, que el polimorfismo del receptor de andrógenos tiene poca o ninguna influencia sobre la masa grasa corporal, o su distribución regional. En contraste, un estudio previo realizado con 106 hombres de Alemania, con una edad media similar (28 años) a nuestros sujetos, encontró que la longitud del polimorfismo CAG se asoció con el porcentaje de grasa corporal (evaluado con bioimpedancia: r=0.27) (Zitzmann et al. 2003). Del mismo modo, en un estudio con jóvenes daneses (20-29 años), demostró una asociación estadísticamente significativa entre el número de repeticiones de CAG y el porcentaje de grasa corporal medida por DXA (Nielsen et al. 2010). En este último caso, tampoco se encontró asociación entre el número de repeticiones de CAG y la grasa visceral medido mediante resonancia magnética en 393 sujetos (Nielsen et al. 2010). Stanworth y col. (2008) demostraron una asociación positiva del polimorfismo de CAG con los niveles plasmáticos de leptina, el perímetro en la cintura y el índice de masa corporal (IMC) en 232 hombres con diabetes tipo 2 (Stanworth et al. 2008). Sin embargo y de acuerdo con nuestros resultados, se ha demostrado que no existe asociación entre el número de repeticiones de CAG y el porcentaje de grasa (medido por bioimpedancia) en 170 hombres de Grecia (Goutou et al. 2009). A su vez, tampoco se encontró relación entre el número de repeticiones de CAG y Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Discusión 93 masa grasa medido por DXA en 159 personas de edad avanzada (75-89 años) (Lapauw et al. 2007). De acuerdo a resultados de estudios previos (Gonzalez Hernandez et al. 2008), nosotros no encontramos en la presente investigación ninguna correlación entre las repeticiones de CAG y la concentración de leptina en ambos sexos. Por lo tanto, parece que las repeticiones del polimorfismo de CAG tienen poca o ninguna influencia sobre el tejido adiposo y la leptina sérica tanto en hombres como en mujeres. De acuerdo con estudios publicados previamente en hombres (Krithivas et al. 1999; Stiger et al. 2008; Van Pottelbergh et al. 2001), tampoco encontramos una asociación entre la longitud de CAG o GGN con la concentración de testosterona libre en sangre. A su vez, parece que las repeticiones polimórficas de GGN tienen poca o ninguna relación con la adiposidad o leptina en los hombres de nuestro estudio. Sin embargo, parece que en mujeres existe una fuerte asociación positiva entre el número de repeticiones de GGN con la masa grasa y con la concentración sérica de leptina, la cual no puede ser explicada por diferencias en la concentración de testosterona libre. Por otro lado, recientemente se ha demostrado que el número de repeticiones de GGN podría estar asociado positivamente con una mayor concentración de testosterona plasmática (Bogaert et al. 2009). Este hecho podría explicar el posible efecto de la testosterona sobre la masa grasa y leptina en las mujeres, ya que al contrario de lo que ocurre en hombres, las mujeres que poseen un alto porcentaje de grasa corporal y leptina plasmática se asocian a una mayor cantidad de testosterona sérica comparadas con mujeres delgadas (Gambineri et al. 2002; Pusalkar et al. 2010). El hecho de que las mujeres con mayor masa grasa, presenten mayores niveles de andrógenos podría estar relacionado con la hormona de la osteocalcina, ya que se ha descrito un aumento en los niveles de osteocalcina en mujeres obesas comparadas con delgadas (Ostrowska et al. 1998). La osteocalcina parece estimular la producción de testosterona plasmática, actuando sobre las células de Leydig en modelos transgénicos (Oury et al. 2011). En concordancia, nosotros encontramos una asociación entre osteocalcina y testosterona libre en nuestro estudio, Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Discusión 94 como previamente se había demostrado en otro estudio realizado en mujeres (r=57, n=23) (Guadalupe-Grau et al. 2009). A su vez, el receptor de andrógenos juega un papel importante en los niveles de osteocalcina y testosterona, ya que ratones knockout para AR (ARKO) desarrollan osteoporosis y obesidad (Kawano et al. 2003; Tsai et al. 2011). De hecho, nosotros encontramos una asociación positiva entre el número de repeticiones de GGN y los niveles de osteocalcina plasmática. A su vez, la posible interacción entre el polimorfismo de CAG y GGN con la masa grasa no ha sido estudiado previamente. La combinación CAGS+GGNS se ha asociado a una mayor señalización de andrógenos en otros estudios (Gonzalez Hernandez et al. 2008; Navarro et al. 2002). Sin embargo, nuestros resultados indican la falta de interacción entre el polimorfismo de CAG y GGN con la adiposidad en nuestros sujetos, estudiando todas las posibles combinaciones alélicas. Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Discusión 95 Estudio III: Androgen receptor gene polymorphisms fat mass accumulation, and maximal fat oxidation capacity. A longitudinal study. Int J Obes (Lond). (En revisión). Este estudio demuestra que los polimorfismos extremos de CAG (<19 vs >23) en hombres sanos parecen no estar asociados a la masa grasa, su distribución regional, oxidación basal y máxima de grasa, y niveles hormonales de testosterona, leptina y osteocalcina. A su vez, la acumulación de grasa en el estudio longitudinal fue similar entre el grupo CAGS y CAGL. Estos resultados, concuerdan con otros estudios de sujetos pertenecientes al primer y cuarto cuartil del polimorfismo de CAG (Andersen et al. 2011; Goutou et al. 2009; Zitzmann et al. 2001). Sin embargo, nuestros resultados están en contraste con varios estudios previos, donde ven una asociación entre el número de repeticiones de CAG y el porcentaje de masa grasa (Nielsen et al. 2010; Zitzmann et al. 2003). Este hecho podría estar explicado por la influencia del polimorfismo de CAG sobre los niveles de testosterona plasmática, ya que se conoce el efecto inhibitorio de esta hormona sobre la masa grasa (Mauras et al. 1998; Woodhouse et al. 2004). No obstante, Crabbe y col. encontraron que existe una asociación directa de CAG y testosterona descrita previamente (Crabbe et al. 2007). Además, se encontró una relación lineal positiva entre el número de repeticiones de CAG con los niveles de testosterona y de leptina sérica en hombres con diabetes tipo 2 (Stanworth et al. 2008), por lo que el efecto del polimorfismo del grupo CAGL sobre la masa grasa a través de un incrementado nivel de testosterona es contradictorio. Por otro lado, otros estudios demostraron que no existía asociación entre el polimorfismo de AR y los niveles de testosterona libre (Krithivas et al. 1999) (Stiger et al. 2008), tal y como ocurre en este estudio. De acuerdo con nuestros resultados, no hay asociación entre el número de repeticiones de CAG y la grasa visceral medida mediante resonancia magnética en 393 sujetos (Nielsen et al. 2010). Además, también se ha comunicado que no existe asociación entre la longitud de CAG y los niveles séricos de leptina (Gonzalez Hernandez et al. 2008; Lenz et al. 2011). Por lo tanto, en hombres jóvenes, el número de repeticio- Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Discusión 96 nes de CAG tiene poco o ningún impacto en la adiposidad, con pequeñas diferencias entre los países, lo que podría deberse a diferencias genéticas y ambientales. Por otro lado, en contraste con nuestra hipótesis de partida, los polimorfismos extremos de GGN (<22 vs >24) parecen influir en la masa grasa y su distribución regional en hombres sanos. Nuestros resultados demuestran que el grupo GGNL presentó menos masa grasa en todo el cuerpo y en la región abdominal comparado con el grupo GGNS. A su vez, el grupo GGNL demostraba una tendencia a tener una mayor capacidad de oxidación de grasa que el grupo GGNS. Estos efectos se confirmaron con los resultados longitudinales, ya que el grupo GGNL mostró una menor acumulación de grasa corporal que el GGNS a lo largo de los años (~7 años). Este efecto, no había sido estudiado con anterioridad. Nuestros datos indican que el grupo GGNL tienen menos acumulación de tejido adiposo a lo largo de los años, explicado por el aumento en la oxidación de grasas por kg de masa magra de las piernas en este grupo, obteniendo una correlación negativa entre GGN y porcentaje de grasa, MFO por kg de masa magra de las piernas y logaritmo de grasa en el tronco. Este hecho, se relaciona con el encontrado en el Estudio II de esta tesis, donde encontramos una asociación negativa entre GGN y masa grasa sólo en mujeres. Este hecho, confirma un dimorfismo sexual en la acción de este polimorfismo del AR sobre la masa grasa, pudiendo estar explicado por los diferentes efectos que tiene los niveles de testosterona en hombres y mujeres, ya que el polimorfismo de GGN se asocia positivamente con la testosterona plasmática (Bogaert et al. 2009). En concordancia, nosotros encontramos valores aumentados en el grupo GGNL comparado con GGNS, pero que no alcanzaron significación estadística, por lo que no podemos excluir un error de tipo II. A diferencia del estudio II, aquí encontramos efectos del polimorfismo de GGN sobre la masa grasa en hombres. Esto puede ser debido a que en este estudio tratamos con sujetos de casos extremos del polimorfismo del receptor de andrógenos (del primer y cuarto cuartil), lo que facilita poner de manifiesto posibles diferencias. Sin embargo, en el estudio II se pudo observar esta influencia del Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Discusión 97 GGN sobre la masa grasa en las mujeres, sin necesidad de tratar los datos por cuartiles. A su vez, en concordancia con nuestros resultados, ha sido descrito que el factor principal que puede influir sobre la capacidad máxima de oxidar grasas es el VO2max (Nordby et al. 2006). Los cambios producidos con el paso del tiempo en el VO2max de los datos longitudinales de este estudio, se asociaron con la oxidación máxima de grasas. Este hecho indica que una mejora en VO2max podría producir un incremento en la capacidad de oxidar grasas y por tanto una reducción de grasa corporal y de grasa del tronco. Sin embargo, las diferencias encontradas en VO2max no explicó la asociación encontrada entre el número de repeticiones de GGN y la acumulación de tejido adiposo. Este hecho, nos indica que el polimorfismo de GGN tiene una influencia directa sobre las diferencias encontradas en masa grasa. CONCLUSIONES (CONCLUSIONS) Jesús Gustavo Ponce González Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Conclusiones 101 7. Conclusiones 1) Los sujetos obesos muestran una mayor capacidad de oxidación de grasa durante el ejercicio de piernas y brazos comparados con sujetos controles. 2) Los sujetos post-obesos tienen una mayor capacidad de oxidación de grasa sólo durante el ejercicio de piernas comparado con sujetos controles, a pesar de la pérdida de peso. 3) La función y la capacidad de oxidación mitocondrial no se encuentra atenuadas en sujetos obesos y post-obesos comparados con controles en el músculo vasto lateral de la pierna, pero si en el deltoides de obesos comparado con post-obesos y controles. 4) La capacidad máxima de oxidación de grasas de las piernas es superior a la capacidad máxima de oxidación de grasas de los brazos. 5) La fosforilación basal de ACC se encuentra reducida en el vasto lateral de los obesos comparado con los post-obesos y controles, pudiendo ser una de las causas del aumento de la masa grasa corporal en los obesos. 6) El polimorfismo CAG del gen del receptor de andrógenos parece no influir en la masa grasa, en su distribución regional, en su acumulación a lo largo de los años y en la capacidad máxima de oxidar grasas ni en hombres ni en mujeres jóvenes. 7) El polimorfismo GGN del gen del receptor de andrógenos está relacionado positivamente con la adiposidad y con la leptina y osteocalcina plasmática en mujeres jóvenes. 8) Los sujetos varones con casos extremos largos del polimorfismo GGN del receptor de andrógenos (4º cuartil) acumulan menos grasa con el paso de los años, especialmente en la masa grasa del tronco, debido en parte a su mayor capacidad de oxidar grasas. Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Bibliografía 108 Calbet JA, Chavarren J, Dorado C (1997) Fractional use of anaerobic capacity during a 30and a 45-s Wingate test. Eur J Appl Physiol Occup Physiol 76: 308-313 Calbet JA, De Paz JA, Garatachea N, Cabeza de Vaca S, Chavarren J (2003) Anaerobic energy provision does not limit Wingate exercise performance in endurance-trained cyclists. J Appl Physiol 94: 668-676 Calles-Escandon J, Sweet L, Ljungqvist O, Hirshman MF (1996) The membraneassociated 40 KD fatty acid binding protein (Berk's protein), a putative fatty acid transporter is present in human skeletal muscle. Life Sci 58: 19-28 Campfield LA, Smith FJ, Guisez Y, Devos R, Burn P (1995) Recombinant mouse OB protein: evidence for a peripheral signal linking adiposity and central neural networks. Science 269: 546-549 Carling D, Zammit VA, Hardie DG (1987) A common bicyclic protein kinase cascade inactivates the regulatory enzymes of fatty acid and cholesterol biosynthesis. 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