Evaluación de nuevos compuestos como potenciales agentes antileucémicos

Departamento de Química y Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Fisiología, Genética e Inmunología TESIS DOCTORAL EVALUACIÓN DE NUEVOS COMPUESTOS COMO POTENCIALES AGENTES ANTILEUCÉMICOS Fernando Torres Andón Las Palmas de Gran Canaria 2010 El tratamiento del cáncer ha evolucionado mucho en los últimos años y aunque se ha conseguido aumentar la supervivencia frente aalgunos tipos de cáncer, no se ha logrado la efectividad deseada debido fundamentalmente a una limitada actividad terapéutica o a una excesiva toxicidad. La lucha contra esta enfermedad sólo podrá solucionarse seleccionando las mejores dianas terapéuticas. Las neoplasias hematológicas forman uno de los grupos de cáncer más estudiados yel análisis de los mecanismos implicados en la supervivencia omuerte de estas células tumorales ha proporcionado en numerosas ocasiones nuevas dianas terapéuticas eficaces en el tratamiento de éste yotros tipos de cáncer. Los principios activos obtenidos de fuentes naturales osus derivados semisintéticos han dado lugar alos principales fármacos utilizados contra el cáncer. Los flavonoides son compuestos con una estructura fenilbenzo-γpirona de origen natural, que abundan en frutas, verduras ybebidas derivadas de plantas, yademás poseen propiedades antitumorales. Los datos del presente estudio proporcionan evidencias acerca del mecanismo por el que el trifolín acetato yla 3´,5,7-trihidroxi-3,4´-dimetoxiflavona inducen apoptosis en diferentes líneas celulares tumorales humanas ysientan las bases científicas para la utilización de estos compuestos en el desarrollo de nuevos fármacos antitumorales. 9 ÍNDICE “¿Que cómo veo el futuro?... El futuro no se ve, el futuro se hace.” J. M. Keynes 10 ÍNDICE Este trabajo ha sido financiado por: - Ministerio de Educación y Ciencia de España y FEDER. Plan Nacional de Biomedicina. SAF 2004-07928 y SAF 2007-62536. - Subvención para equipamiento e infraestructura científico-tecnológica.Dirección General de Universidades e Investigación. Resoluciones de 21 de diciembre de 2006 y 21 de diciembre de 2007. - Beca del Gobierno Autónomo de Canarias. Resolución de 30 de diciembre de 2005. BOC 7 feb 2006. - Consejería de Educación, Cultura y Deportes. Gobierno de Canarias y FEDER. GRUP 2004-44. - Agencia Canaria de Investigación, Innovación y Sociedad de la Información del Gobierno de Canarias. PI 2007/045. - Instituto Canario de Investigación del Cáncer. RED PRODNATCANCER2008 y 2009. Ilustración de portada: Microfotografías de una célula HL-60 normal (izquierda) y una célula en apoptosis (derecha) obtenida mediante microscropía electrónica de transmisión. Ilustración de contraportada: Estructura química de la 3´,5,7-trihidroxi-3,4´-dimetoxiflavona (izquierda) y del trifolín acetato (derecha). 1 AGRADECIMIENTOS ÍNDICE ABREVIATURAS 13 ABREVIATURAS ∆Ψm Potencial de membrana mitocondrial µM Micromolar ADN Ácido desoxirribonucleico AIF Factor inductor de apoptosis Akt Quinasa involucrada en la supervivencia celular Apaf-1 Factor activador de proteasas apoptóticas ARC Inhibidor general de la apoptosis ARN Ácido ribonucleico ATP Adenosín trifosfato Bad Proteína pro-apoptótica perteneciente a la familia Bcl-2 Bak Proteína pro-apoptótica perteneciente a la familia Bcl-2 Bax Proteína pro-apoptótica perteneciente a la familia Bcl-2 Bcl-2 Proteína anti-apoptótica Bcl-xL Proteína anti-apoptótica perteneciente a la familia Bcl-2 Bid Proteína pro-apoptótica BIR Dominio de interacción proteína-proteína presente en las IAPS CAK Proteína quinasa constitutiva activadora de CDK CARD Dominio de reclutamiento de caspasa CAT Catalasa CCCP Carbonil Cianuro m-ClorofenilHidrazona CDK Proteína quinasa dependiente de ciclina CIP Proteínas inhibidoras de CDKs CKI Inhibidores de las quinasas dependientes de ciclinas CoA Coenzima A DAG Diacilglicerol DED Dominio efector de muerte DETAPAC Ácido dietilen-triamina-penta-acético DEVD-pNA Sustrato específico de caspasa -3/-7 DGK Diacilglicerol quinasa DISC Complejo inductor de muerte DMSO Dimetilsulfóxido DNA-PK Proteína quinasa dependiente de ADN DTT Ditiotreitol EDTA Ácido etilen-diamin-tetra-acético EGFR Receptores del factor de cremiento epidérmico EGTA Ácido etilenglicol-bis-N,N'-tetraacético ERK1/2 Proteína quinasa regulada por señales extracelulares 1 y 2 ETO Etopósido FADD Dominio de muerte asociado a Fas Fas Receptor de muerte, también llamado Apo1 o CD95 FasL Ligando del receptor de muerte Fas FBS Suero bovino fetal GlcCer Glucosilceramida GPCR Receptor asociado a proteína G GTP Guanosín trifosfato GW4869 Inhibidor de la esfingomielinasa neutra H2-DCF-DA Diacetato 2´,7´-dicloro-dihidro-fluoresceína HEPES N-[2-hidroxietil] piperazino N'-[2-etanosulfanílico] IAP Proteína inhibidora de apoptosis IC 50 Concentración de producto que inhibe el crecimiento celular a la mitad IP Yoduro de propidio JC-1 Yodurode5,5',6,6'–tetracloro-1,1',3,3'- tetraetilbenzimidazolocarbocianina 14 ABREVIATURAS JNK Proteína quinasa N-terminal de jun Jun Factor de transcripcion de la familia de AP-1 MAPK Proteina quinasa activada por mitógenos MEK Proteína quinasa MAPK MIF Factor inhibitorio de la migración MK Proteínas quinasas activadas por MAPKs MKP MAP quinasas fosfatasas MMP Metaloproteinasa de la matriz extracelular MSK Proteína quinasa activada por mitógenos y estrés MTT Bromuro de 3-[4,5Dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio MYT1 Factor de transcripción de mielina Na3VO4 Ortovanadato sódico NAC N-acetil-L-cisteína NaCl Cloruro de sodio NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato NaOH Hidróxido de sodio NF-κB Factor nuclear - κB NO p21 Inhibidor de quinasas dependientes de ciclinas p38MAPK p53 Proteína supresora de tumores PA Plasminógeno tisular PARP-1 Poli (ADPribosa) polimerasa-1 PBMC Células mononucleares humanas de sangre periférica PBS Tampón fosfato salino PD98059 Inhibidor específico de la quinasa reguladora MEK1 PHA Fitohemaglutinina PI3K Fosfatidil inositol 3quinasa PK Proteína quinasa PL Fosfolipasa PMSF Fluoruro de metilsulfonilfenilo pRB Proteína retinoblastoma PVDF Fluoruro de Poli-vinilideno Raf MAPKKK Ras Proteína G pequeña RING Dominio interacción proteína-proteína RIP Proteína de interacción con el receptor ROS Especies reactivas de oxígeno RTK Receptores de tirosina quinasas S1P Esfingosina 1-fosfato SB203580 Inhibidor específico de p38MAPK SDS Dodecil sulfato sódico Ser Serina SIDA Síndrome de inmunodeficiencia adquirida SK Esfingosina quinasa Smac Segundo activador de caspasas derivado de la mitocondria SMasa Esfingomielinasa SOD Superóxido dismutasa SOS Factor de intercambio de nucleótidos de guanina SP600125 Inhibidor específico de JNK TA Trifolín heptaacetato TBST 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 137 mM NaCl, 0,1 % Tween-20 TEMED N,N,N,N,-tetrametil-etilendiamina THDF 3´,5,7-Trihidroxi-3,4´-dimetoxiflavona 15 ABREVIATURAS Thr Treonina TLC Cromatografia en capa fina. TNF Factor de necrosis tumoral TNFR1 Receptor 1 del factor necrótico tumoral TRADD Dominio de muerte asociado al TNFR TRAF2 Factor asociado a al receptor de TNF TRAIL Ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF U0126 Inhibidor selectivo de las quinasa reguladoras MEK1 y MEK2 UV Ultravioleta VEGF Factor de crecimiento endotelial vascular Wee1 Tirosina quinasa Wee1 XIAP Proteína inhibidora de la apoptosis z-DEVD-fmk Inhibidor específico de caspasa-3 y -7 z-IETD-fmk Inhibidor específico de caspasa-8 z-LEHD-fmk Inhibidor específico de caspasa-9 z-VAD-fmk Inhibidor general de caspasas z-VDVAD-fmk Inhibidor específico de caspasa-2 z-VEID-fmk Inhibidor específico de caspasa-6 z-YVAD-fmk Inhibidor específico de caspasa-1 17 FIGURAS Y TABLAS FIGURAS Y TABLAS 19 FIGURAS Y TABLAS INTRODUCCIÓN Figura 1 Clasificación de los flavonoides. 26 Figura 2 Esquema de las quinasas dependientes de ciclina implicadas en el paso de la fase G2 a la mitosis. 30 Figura 3 Vías de activación de la apoptosis. 35 Figura 4 Intercciones entre los miembros más importantes de la familia Bcl-2. 41 Figura 5 (A) Estructura de las caspasas implicadas en la apoptosis. (B) Activacíón de las caspasas por procesamiento proteolítico. 43 Figura 6 Vías de activación de las MAPKs. 46 RESULTADOS Tabla 1 Estructura química de los flavonoides evaluados. 78 Tabla 2 Efectos de los flavonoides sobre el crecimiento de células tumorales humanas. 79 Figura 7 Estructura química del trifolín acetato. 80 Figura 8 Efectos del TA sobre la inducción de apoptosis. 81 Figura 9 Efecto del TA en la proliferación de células mononucleares humanas de sangre periférica (PBMC) y de células HL-60. 82 Figura 10 Influencia de la activación de caspasas en la apoptosis inducida por TA en células tumorales. 83 Figura 11 El tratamiento con TA induce liberación de citocromo cen células tumorales. 85 Figura 12 A) El TA no disminuye el potencial de membrana mitocondrial (∆Ψm) (B) El TA no es capaz de inducir apoptosis en líneas celulares que sobreexpresan Bcl-2 y Bcl-xL 86 Figura 13 Papel de la vía de las MAPKs en al apoptosis inducida por TA en células HL-60. 87 Figura 14 TA aumenta la generación de ROS en células HL-60 89 Figura 15 Estructura química del THDF. 90 Tabla 3 Efecto del THDF sobre la proliferación de células tumorales humanas. 90 Figura 16 (A) Efecto del THDF sobre la viabilidad de las células HL-60 y SK-MEL-1 (B) Efecto del THDF sobre la proliferación de células mononucleare humanas de sangre periférica. 91 Figura 17 Evaluación mediante citometría de flujo del efecto del THDF sobre la inducción de apoptosis en células HL-60 y U937. 92 Figura 18 Efecto del THDF sobre la inducción de apoptosis en células HL-60 y U937. 93 Figura 19 Estudio de la apoptosis inducida por THDF en células HL-60 y U937. 94 Figura 20 Evaluación de la activación de caspasas en células de leucemia HL-60 y U937. 95 Figura 21 Evaluación del papel de las mitocondrias en la apoptosis inducida por THDF en células HL-60 y U937. 97 Figura 22 (A) THDF induce la fosforilación de MAPKs. (B) Impacto de 20 FIGURAS Y TABLAS los inhibidores de MAPKs en la apoptosis inducida por THDF 99 Figura 23 ROS no está involucrado en la muerte celular inducida por THDF. 101 Tabla 4 Efecto del THDF sobre las diferentes fases del ciclo celular en HL-60 y U937. 102 Figura 24 Distribución del ciclo celular durante la incubación en presencia o ausencia de THDF en células HL-60 previamente sincronizadas en fase M. 103 Figura 25 THDF induce parada en mitosis. 103 Figura 26 Efecto de THDF en los niveles de expresión de las proteínas que regulan el ciclo celular. 104 Figura 27 THDF inhibe la polimerización de la tubulina en células HL-60 y U937. 106 Figura 28 (A) THDF induce la despolimerización de tubulina in vitro (B) Ensayo de competición entre [3H]-colchicina y THDF por la unión a la tubulina. 107 Figura 29 Efecto de THDF sobre la vía de la esfingomielina en células HL-60. 109 INTRODUCCIÓN 23 INTRODUCCIÓN El cáncer puede ser considerado una epidemia. Su incidencia y prevalencia están aumentando rápidamente, debido entre otras causas, al crecimiento y envejecimiento de la población. Alrededor de 2,3 millones de nuevos casos de cáncer se contabilizaron en la Unión Europea en el año 2006, y el número de casos aumenta cada año. Una de cada cuatro muertes en la Unión Europea se atribuye al cáncer, y en el rango de edad entre 45 y 64 años, la proporción es cercana al 50% [1]. Proporciones similares se han observado en los Estados Unidos, dónde se detectaron en el año 2009 un total de 1,5 millones de casos y alrededor de 500.000 muertes [2]. La Organización Mundial de la Salud ha estimado que alrededor de 12 millones de personas morirán, en todo el mundo, a causa de esta enfermedad en el año 2030 [3]. El cáncer se produce como consecuencia de una acumulación de errores en el material genético de las células, que adquieren la capacidad de propagarse de forma indefinida (generando sus propias señales mitógenas), en su localización normal o en otras zonas (invadiendo otros tejidos y/o produciendo metástasis), como consecuencia de una pérdida de control de su proliferación, diferenciación o de la respuesta ante señales de apoptosis (muerte celular programada). Existen más de 200 tipos diferentes de cáncer, la mayoría de los cuales deben su nombre al órgano o al tejido en el que se forman, y pueden ser agrupados en las siguientes categorías: - Carcinoma – tejido epitelial. - Sarcoma – tejido conjuntivo (hueso, cartílago, grasa, músculo, vasos sanguíneos u otros). - Glioma – tejido nervioso. - Neoplasias hematológicas (Leucemia, Linfoma y Mieloma) – tejido sanguíneo, médula ósea y ganglios linfáticos. - Otros – melanoma, hepatoma, etc. En la mayoría de estos tipos de cáncer las células no se mueren y se forman nuevas células innecesarias para el organismo, formando una masa llamada tumor (“tumor maligno”). En cambio algunos tipos de cáncer, como la leucemia, pueden no formar un tumor. La leucemia es un grupo de enfermedades de la médula ósea y de la sangre, que implica un aumento incontrolado de glóbulos blancos (leucocitos). Es el cáncer más frecuente en los 24 INTRODUCCIÓN niños menores de 15 años a nivel mundial [4], y en Estados Unidos en hombres menores de 40 años y mujeres menores de 20 años [2]. De acuerdo con la población leucocitaria que afecten, se clasifican en: leucemia mieloide crónica, leucemia linfoide crónica, leucemia linfoide aguda, leucemia mieloide aguda ó leucemia de células pilosas. 1. Tratamiento del cáncer. 1.1. Selección de nuevas dianas terapéuticas. El tratamiento del cáncer ha evolucionado mucho en los últimos años, y se ha conseguido aumentar la supervivencia frente a algunos tipos de cáncer (por ejemplo, leucemias o linfomas), pero no se ha conseguido la efectividad deseada debido fundamentalmente a una insuficiente actividad terapéutica (30%) ó a una excesiva toxicidad (30%). Estos problemas sólo podrán solucionarse seleccionando las mejores dianas terapeúticas y mediante el uso de biomarcadores para identificar a los pacientes apropiados para recibir cada tratamiento [5,6]. El conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en el cáncer ha mejorado de forma significativa, y actualmente, el desarrollo de nuevos fármacos antitumorales está dirigido al estudio de los mecanismos moleculares y genéticos implicados, con el objetivo de desarrollar una medicina “personalizada”. La activación de oncogenes y la inactivación de genes supresores de tumores en la célula tumoral implican una modificación de las vías de señalización induciendo: la falta de respuesta frente a factores homeostáticos, la pérdida del control del ciclo celular y la proliferación descontrolada, el aumento de la supervivencia celular, la disminución de la apoptosis, la inmortalización y la estimulación de procesos como invasión, angiogénesis y metástasis (propagación a otras partes del cuerpo por vía sanguínea o linfática). Todos estos procesos presentan potenciales dianas desde el punto de vista de una intervención terapéutica [7]. El gran avance que se ha producido en el conocimiento de la muerte celular por apoptosis, mecanismo mediante el cual las células son eliminadas con el propósito de controlar la proliferación celular ó en respuesta a un daño en el ADN, nos proporciona las líneas a seguir en el desarrollo de nuevas terapias dirigidas, induciendo la muerte de las células tumorales de forma específica o sensibilizándolas frente a los tratamientos antitumorales actuales. Las neoplasias hematológicas forman uno de los grupos de cáncer más estudiados. En 1980 se descubrió que los glucocorticoides inducen fragmentación del ADN y apoptosis en los timocitos, y desde entonces el sistema hematopoyético ha desvelado numerosas situaciones en 31 INTRODUCCIÓN la familia inhibidora de CDK (CIP/KIP) como p21, p27 y p57 que son capaces de inhibir a todas las CDKs [40] en todas las fases del ciclo. Además, la activación de las CDKs puede estar inhibida mediante fosforilación por las quinasas Wee1 y MYT1. Las moléculas inhibidoras se unen a las CDKs e inhiben su actividad, regulando negativamente la progresión del ciclo [41,42]. La CDK1, que es la única proteína no-redundante de su familia (Figura 2), para ser activada deberá formar un complejo con la ciclina B1 (CDK1-ciclina B1), y ser fosforilada por una quinasa (CAK). Aún así, su actividad será inhibida por la fosforilación de un par de aminoácidos en el sitio activo llevado a cabo por la proteína Wee1. Esta inhibición sólo podrá suprimida por las fosfatasas Cdc25C que pueden desfosforilar estos residuos aumentando la actividad CDK. CHK1 inactiva Cdc25C mediante su fosforilación. Este efecto de CHK1 previene la desfosforilación de CDK1, manteniendo el complejo CDK1-ciclina B1 en un estado inactivo. Un daño en el ADN activa CHK1, que luego inactivará Cdc25C dejando al complejo CDK1-ciclina B1 en un estado inactivo fosforilado. Por lo tanto, la activación de la proteína Cdc25C, es un evento muy importante en la progresión del ciclo celular desde la fase G2 a la fase M [43]. Además, los inhibidores de CDK1 son capaces de parar el ciclo celular en este punto induciendo una acumulación de células, y posterior muerte por apoptosis. Cuando se produce un error o un daño en el ADN, como hemos visto, la célula dispone de puntos de control que permiten detectarlo y detener la progresión del ciclo celular, poniéndo en marcha el sistema de reparación. En el caso de no producirse la reparación la célula induce su propia muerte por apoptosis. La apoptosis se convierte así, una vez más, en un proceso esencial para la correcta progresión del ciclo celular, protegiendo a los organismos multicelulares y permitiéndoles una eliminación selectiva de las células dañadas [36]. Un amplio porcentaje de cánceres humanos (25-30%) está asociado con hiperactividad de las CDKs, cuya expresión suele estar aumentada como resultado de una mutación [44]. La alteración y pérdida de regulación en la actividad de las CDKs son marcas inequívocas de neoplasia [45]. Los inhibidores o moduladores de las CDKs representan un nuevo arsenal de agentes terapéuticos contra el cáncer [45], entre ellos, algunos flavonoides como la quercetina, la silimarina, la daidzeina, la luteolina, kaempherol, la apigenina y la genisteína, que presentan actividad inhibitoria sobre varias quinasas [46,47]. 32 INTRODUCCIÓN 3.2. Interacción con los microtúbulos. Los microtúbulos son polímeros dinámicos en continua polimerización y despolimerización que juegan un papel crucial en funciones celulares como: el crecimiento, la división celular, la movilidad, la fagocitosis, el transporte o la localización intracelular de orgánulos. Los filamentos del citoesqueleto interaccionan con un gran número de proteínas que en condiciones normales podrían estar secuestrando e inhibiendo su función. Al producirse cualquier cambio en la dinámica de los microtúbulos, estas proteínas pueden liberarse y participar de forma decisiva en la modulación de múltiples procesos de señalización celular [48]. El papel vital de los microtúbulos en la mitosis unido a que son la única diana celular con la que interaccionan directamente los agentes que afectan a los microtúbulos, los convierte en una diana muy atractiva para el desarrollo de fármacos antitumorales. Estos fármacos poseen un gran interés y se utilizan habitualmente en quimioterapia. Los microtúbulos juegan un papel crucial en la regulación de la mitosis, y su desorganización puede inducir la parada del ciclo celular en la fase M, formación de un huso mitótico anormal y muerte celular por apoptosis [49]. Teniendo en cuenta su función, estos compuestos pueden clasificarse en: - Inhibidores de la polimerización: colchicina, dolastatina, nocodazol y alcaloides de la Vinca (vincristina y vinblastina). - Potenciadores o estabilizantes de la polimerización: taxanos (paclitaxel) y epotilonas. Además, podríamos aguparlos basándonos en sus sitios de unión a la tubulina. Los taxanos y el nocodazol se unen a la β-tubulina; los alcaloides de la Vinca, se unen en un lugar cercano al sitio de unión del GTP en la β-tubulina, y la colchicina en la interfase entre los dímeros de αy β-tubulina. Aunque el mecanismo de acción de estos fármacos no se conoce con detalle, todos ellos inducen una acumulación de células mitóticas asociada y muerte celular. El daño de los microtúbulos inhibe la degradación de la ciclina B1 por el proteasoma e induce la expresión de CDK1, originando una activación continuada del complejo CDK1-ciclina B1 y parada del ciclo celular en G2/M. La inhibición de CDK1 por olomoucina o la inhibición de CDKs por medio del inhibidor endógeno p21, previenen la apoptosis inducida por taxol. La 33 INTRODUCCIÓN activación de CDK1-ciclina B1 es necesaria para la fosforilación de Bcl-2, poniendo de manifiesto la vinculación entre la alteración de la dinámica de los microtúbulos, la activación de CDKs y proteínas reguladoras de la apoptosis. Bcl-2 se inactiva por fosforilación, y Bax o Bad se pueden activar disparando la apoptosis por via mitocondrial [50]. El tratamiento con agentes que afectan a los microtúbulos también provoca un aumento de la expresión de p53 y del inhibidor de quinasas dependientes de ciclinas p21, activación de proteínquinasas como Ras/Raf y MAPKs, aumento en la expresión de c-Mos, Mcl-1, DR4 y DR5, COX-2 y TNF-α [51,52,53]; y una disminución de los niveles de c-FLIPL o XIAP [54]. Estos compuestos pueden inducir apoptosis, o sensibilizar las células tumorales frente a otras drogas ancancerígenas. Algunos flavonoides ejercen su actividad antiproliferativa mediante interacción con la tubulina [55], siendo uno de los requerimientos estructurales la presencia de un grupo metoxilo en C-3. Por ejemplo, la casticina que se comporta como inhibidor de la polimerización produciendo una parada en la fase G2/M y activando la apoptosis. No obstante, esta no parece ser una condición indispensable, ya que existen ejemplos como la quercetina que no cumple esta condición, y sin embargo, es capaz de unirse a la tubulina impidiendo así la polimerización de los microtúbulos. Se ha descrito que la quercetina se comporta como el antimitótico colchicina, tiene afinidad por el mismo sitio de unión, induce la actividad GTPasa de la tubulina soluble y perturbando la polimerización de los microtúbulos por inducción de cambios conformacionales en la tubulina [56]. 4. Apoptosis. Los organismos multicelulares dependen de la apoptosis para un apropiado desarrollo y mantenimiento de sus tejidos. Este proceso permite la eliminación de las células que no están en su sitio, que no se necesitan o que están dañadas de manera irreparable [57]. La apoptosis se puede definir como el conjunto de reacciones bioquímicas que tienen lugar en la célula, que concluyen con la muerte de la célula de una forma ordenada y silenciosa, sin producir ningún tipo de alteración en el resto del tejido. La apoptosis es un proceso de autodestrucción celular controlada, que permite al organismo su correcta morfogénesis y la eliminación de las células que amenacen su supervivencia, además de ser necesaria para evitar la sobreproducción celular. Este proceso es de vital importancia, tanto durante el desarrollo embrionario como en la vida adulta [58,59], y podemos observar su aparición en algunas 34 INTRODUCCIÓN reacciones inmunes, o cuando las células son dañadas por alguna enfermedad o por la acción de un agente nocivo [60]. Existe una gran variedad de estímulos y condiciones, fisiológicas o patológicas, que pueden desencadenar la apoptosis: ligandos que actúan sobre receptores específicos (TRAIL ó TNF), carencia de factores de crecimiento, la radiación, golpe de calor, hipoxia, toxinas, fármacos, la luz ultravioleta, la presencia de radicales libres, una infección viral o bacteriana, o un desprendimiento de la célula de su tejido habitual [61]. Pero no todas las células mueren irremediablemente en respuesta a estos estímulos. Los corticoesteroides inducen apoptosis en timocitos, mientras otras células no resultan afectadas. La sensibilidad de la célula a un estímulo dependerá del equilibrio entre la expresión de proteínas proy anti-apoptóticas, de la potencia del estímulo y del estado del ciclo celular en el que se encuentre la célula. La función crítica de la apoptosis en la regulación de la homeostasis tisular tiene importantes implicaciones en la salud. Niveles excesivos de apoptosis contribuyen al desarrollo de múltiples patologías, como el SIDA [62], trastornos neurodegenerativos como el Alzheimer [63] y la enfermedad de Huntington [64], isquemia cardíaca [65] y daño renal [66], mientras que la deficiencia de apoptosis es clave en el desarrollo de enfermedades autoinmunes [67] y del cáncer [68]. Esto hace que todos los estudios que contribuyan al conocimiento y manipulación de la apoptosis tengan un inmenso potencial, siendo la búsqueda de nuevos fármacos antitumorales una de las áreas más prolíficas. Durante la apoptosis, la célula sufre una serie de cambios bioquímicos que afectan en último término a la morfología celular: - Cambios bioquímicos: Se produce hidrólisis de proteínas, jugando un papel esencial las caspasas, y rotura del ADN en fragmentos de 180 a 200 pares de bases. También se produce la externalización de fosfatidilserina, anexina I y calreticulina que actúan como marcadores de fagocitosis. Aumentan los niveles de calcio iónico libre y hay una deshidratación celular [69]. - Cambios morfológicos: En el inicio de la apoptosis temprana podemos observar una contracción celular y la condensación y fragmentación de la cromatina. Las células se hacen más pequeñas, el citoplasma más denso y los orgánulos están más apretados. En la membrana plasmática se van formando evaginaciones, el núcleo se fragmenta y se forman cuerpos apoptóticos, fragmentos de la membrana celular que incluyen citoplasma con orgánulos densamente empaquetados con o sin fragmentos nucleares. Estos cuerpos apoptóticos son 35 INTRODUCCIÓN rápidamente fagocitados por macrófagos o por células vecinas debido a la exposición de marcadores de fagocitosis en la superficie celular como la fosfatidilserina, evitando la exposición del material intracelular al sistema inmune que podría desencadenar una respuesta inflamatoria [57]. La activación de la apoptosis es controlada por dos vías de señalización diferentes pero interrelacionadas, las vías extrínseca e intrínseca. Figura 3: Vías de activación de la apoptosis. 4.1. Vía extrínseca: receptores de muerte celular. La activación de la vía extrínseca se inicia mediante la unión de ligandos específicos a sus receptores de muerte, provocando la agregación del receptor y el reclutamiento de proteínas adaptadoras, que mediante la interacción proteína-proteína transmiten la señal de muerte hasta las moléculas efectoras. Pro-caspasa-8 Receptor Caspasa-8 APOPTOSIS Caspasa-3 Receptor + Ligando TIPO I TIPO II BH3 Bid Bcl2 tBid Mitocondria ∆Ym Bax Bax Bcl2 Bak BH3 Pro-caspase-9 ATP Apoptosoma Caspasa-9 Apaf-1 Citocromo c Bax Pro-caspasa-3 Pro-caspasa-6 Caspasa-6 Pro-caspasa-7 Caspasa-7 Lamina A, B e ICAD PARP IAPs 36 INTRODUCCIÓN Los receptores de muerte pertenecen a la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNF), cuyos miembros tienen en común un dominio extracelular rico en cisteína y un dominio intra-celular que permite al receptor acoplarse con el resto de la maquinaría apoptótica. Los receptores de muerte mejor caracterizados y sus correspondientes ligandos son: TNFR1/TNF-α, FasR/FasL, DR3/Apo3L, DR4/TRAIL y DR5/TRAIL [70,71,72,73,74]. 4.1.1. Receptor Fas (CD95). Cuando se une FasR y Fas-L se produce la trimerización del complejo ligando/receptor, reclutando otras moléculas adaptadoras asociadas al dominio de muerte como FADD (proteína con dominio de muerte asociado a Fas) o RIP (proteína de interacción con el receptor). Estas últimas, a su vez promueven el reclutamiento de las procaspasas iniciadoras - 8 y -10, formándose así el complejo inductor de muerte (DISC). En la vía extrínseca existen dos mecanismos de señalización intracelular, que dependen del tipo celular [75,76]: - Tipo I: la expresión de caspasa-8 es suficiente para activar las caspasas efectoras (-3, -6 y -7) y llevar a la célula a su muerte por apoptosis. Este tipo de inducción no precisa la mitocondria y por tanto no está inhibida por factores como Bcl-2 o Bcl-xL, ya que no requiere la amplificación de la señal mediante factores pro-apoptóticos mitocondriales. - Tipo II: la expresión de caspasa-8 no es suficiente para activar eficientemente otras caspasas y se hace necesaria la amplificación de la señal. En estas células la caspasa-8 provoca la activación proteolítica de Bid, que se trasloca a la mitocondria e interacciona con moléculas anti-apoptóticas de la familia Bcl-2 como son Bax y Bak, induciendo la liberación de citocromo c y otros factores pro-apotóticos al citosol. En este compartimento, el citocromo c se une al dominio C-terminal de la proteína Apaf-1 (factor de activación de la apoptosis) y esta unión produce un cambio conformacional en Apaf-1 que es ahora más flexible, facilitando la unión del ATP a sus dominios de unión a nucleótidos. Se forma así el apoptosoma, un complejo formado por siete moléculas de Apaf-1 interaccionando por los extremos N-terminal, a las que se une dATP, citocromo c y, finalmente caspasa-9 en su zona central por interacción de dominios CARD (dominios de reclutamiento de caspasas), provocando un cambio conformacional a una forma activa, capaz de activar a caspasas ejecutoras (-3, -6 y -7) [77]. 37 INTRODUCCIÓN 4.1.2. Receptor de TNF-α: TNFR1. El receptor de TNF-α (TNFR1) es una proteína de aproximadamente 55 kDa que se expresa en la mayoría de las líneas celulares. Comparte con CD95 los tres subdominios ricos en cisteina situados en la región extracelular, pero a diferencia de la pareja formada por CD95/CD95L, el par TNFR1/TNF-α es capaz de trasmitir a la célula dos tipos de señales muy distintas entre sí. Tras la unión de TNF-α a su receptor, el dominio intracelular es reconocido por una molécula que lleva un dominio de muerte asociado, TRADD, la cual puede unirse a FADD, RIP o a TRAF-2 (TNF-R-asociado al factor 2). FADD se une a caspasa -8/-10 activándola mediante autoproteolísis e induciendo apoptosis. TRAF2 recluta proteínas inhibidoras de la apoptosis como cIAP-1 y cIAP-2, aunque tambien puede activar MAPKKKs, activando la cascada de quinasas y JNK. Si TRADD se une a la proteina RIP se induce la transcripción de los factores NF-kB y AP-1 promoviendo la inducción de genes de carácter proinflamatorio e inmunomodulador, oponiéndose a la acción pro-apoptótica del TNF. La unión del ligando al receptor puede dar lugar a dos tipos de complejos: Complejo I formado por TRADD unido a RIP y a TRAF2 que dará lugar a la señalizacion de NF-kB, y Complejo II: formado por TRADD unido a FADD que induce la autoproteolísis de caspasa - 8/10 promoviendo la apotosis. Los niveles de c-FLIP van a determinar la activación de una vía u otra. En el caso de TNFR1, la unión de su ligando sólo induce apoptosis en algunas líneas celulares cuando la síntesis de proteínas ha sido bloqueada. De aquí se deduce la existencia de algún factor que bloquea las señales apoptóticas derivadas de TNFR1, por lo que se podría sugerir que la expresión de este factor estará probablemente controlada a través de NFkB y JNK/AP-1[78]. Además TNFR1, como veremos más adelante, puede activar dos tipos de esfingomielinasas (SMasas) [79] que a su vez podrían activar una serie de MAP-quinasas que activan la ruta de las caspasas. 4.2. Vía intrínseca: inicio de la señal de apoptosis en la mitocondria. La vía intrínseca, puede ser activada por una gran variedad de estímulos, como compuestos citotóxicos, radiación, estrés celular o la ausencia de factores de crecimiento [80], que actúan directamente sobre la mitocondria o a través de moléculas mediadoras. Además, la mitocondria como hemos visto, puede ser esencial en la amplificación de la señal apoptótica de la vía extrínseca. Esta vía es controlada por el equilibrio entre los miembros proy antiapoptóticos de la familia de proteínas Bcl-2. 38 INTRODUCCIÓN Los miembros pro-apoptóticos pueden provocar la permeabilización de la membrana mitocondrial externa y liberar moléculas solubles al citosol, como: - Citocromo c: estimula la formación del apoptosoma, seguida de la activación de caspasa9 e hidrólisis de las caspasas efectoras -3, -6 y -7 [81]. - Smac/DIABLO: se une a las proteínas inhibidoras de la apoptosis (IAPs) impidiendo su unión a las caspasas [82]. - Endonucleasa G: principal nucleasa responsable de la degradación del ADN, se transloca al núcleo tras su liberación de la mitocondria, está involucrada en la fragmentación del ADN y junto con exonucleasas y ADNasa I, producen el típico patrón en escalera [83]. - Htr/Omi: serínproteasa que funciona también como inhibidor de IAPs, mediante la inactivación por corte [84]. Como resultado se produce la ruptura de la cadena de transporte de electrones, la liberación de iones superóxido [85,86] y la hiperpolarización de la membrana mitocondrial interna (que puede terminar con la dilatación de la matriz y la ruptura de la membrana). Además, se abren los poros mitocondriales permitiendo la entrada de agua y solutos a la matriz, produciéndose un choque osmótico y la liberación del factor inductor de apoptosis (AIF), que se transloca al núcleo y provoca la condensación y rotura del ADN en fragmentos de alto peso molecular (50Kb). A nivel de la membrana celular, AIF activa a la flipasa e inhibe a la translocasa haciendo que la fosfatidilserina que en células normales se encuentran en la cara interna de la membrana se exponga ahora al exterior [87]. La actividad de AIF es inhibida por la sobreexpresión de Bcl-2, pero no por los inhibidores de caspasas, es decir su efecto es indedependiente de las caspasas [88]. También se induce la activación de Bax que puede formar un canal en la membrana mitocondrial. Además, de estas dos vías, existen señales apoptóticas que tienen su origen en el núcleo celular. La más importante, es la proteína supresora de tumores p53, que se activa en el contexto de un daño celular irreparable, en respuesta a diferentes tipos de estrés. Esta proteína nuclear puede inducir la expresión de numerosos factores pro-apoptóticos (ej. Puma, noxa, Bax, Apaf-1, Fas y DR5) [89]. 39 INTRODUCCIÓN 4.3. Proteínas reguladoras de la apoptosis. 4.3.1. Proteínas de la familia Bcl-2. El primer miembro y que da nombre a la familia, Bcl-2, fue clonado a partir del punto de corte en la translocación cromosomal t(14:18), presente en el 85% de los linfomas foliculares de células B humanas, y se caracteriza por inhibir la muerte celular por apoptosis [80]. Posteriormente, fue identificada toda una familia de proteínas relacionadas por su homología de secuencia y su participación en el control de la apoptosis. Los factores Bcl-xL, Bcl-w, Mcl1, Bcl-B y Bfl-1 comparten con Bcl-2 una actividad anti-apoptótica y una homología estructural en cuatro regiones α-hélice homólogas a Bcl-2, BH1-BH4. Bax, Bak y Bok, con función pro-apoptótica, comparten sólo los dominios BH1, BH2 y BH3. Finalmente, Bid, Bim, Bad, Bik, Puma, Noxa, Bmf, Hrk, Bk1, BNIP3 y Skipe, sólo poseen el dominio BH3 necesario y suficiente para promover la apoptosis [90]. Los miembros de la familia Bcl-2 interactúan de forma dinámica para regular la apoptosis, mediante homo/hetero-dimerización o mediante fosforilación y desfosforilación. Los miembros que sólo poseen el dominio BH3, necesitan heterodimerizar para ejercer su acción, uniéndose a las proteínas anti-apoptóticas. Además, los miembros pro-apoptóticos como Bax pueden heterodimerizar con los anti-apoptóticos como Bcl-2 ó Bcl-xL y bloquear su actividad anti-apoptótica. Cuando Bcl-2 está en exceso, las células están protegidas de la muerte celular, y cuando Bax está en exceso la célula está avocada a entrar en apoptosis. Por tanto la relación de los niveles de expresión entre los miembros proy anti-apoptóticos de la familia Bcl-2 determina el destino celular [80]. Estas proteínas, poseen localizaciones subcelulares diferentes. Los miembros anti-apoptóticos suelen aparecer como proteínas integrales en las membranas del núcleo, del retículo endoplásmico y fundamentalmente de la mitocondria, estabilizando la membrana mitocondrial y evitando la liberación de citocromo c. En cambio los miembros proapoptóticos se encuentran en el citosol o asociados al citoesqueleto. En respuesta a un estímulo de muerte estos sufren un cambio conformacional que les permite integrarse en la membrana mitocondrial externa donde interactúan con los miembros anti-apoptóticos, inhibiéndolos, permeabilizando la membrana mitocondrial externa y activando la apoptosis [91]. 40 INTRODUCCIÓN Miembros anti-apoptóticos más representativos de la familia Bcl-2: - Bcl-2 - : es la proteína prototipo de la familia, su peso molecular es de 26 KDa y posee los cuatro dominios que la definen (BH1-BH4). Es una proteína integral y forma una estructura similar a un poro, pudiendo modificar el flujo de moléculas o proteínas pequeñas de un lado a otro de la membrana. Su sobre-expresión puede evitar, o retrasar, la muerte celular inducida por la carencia de factores de crecimiento, irradiación, glucocorticoides y drogas quimioterápicas, y promover la tumorigénesis mediante la prevención de la muerte celular [92]. Bcl-xL: Miembros pro-apoptóticos más representativos de la familia Bcl-2: es una proteína muy similar a Bcl-2, tanto en su estructura como en su función. Posee los cuatro dominios BH y su peso molecular es de 30 KDa. Su sobre-expresión puede mediar una resistencia significativa a la muerte celular por apoptosis dependiente de una deprivación de factores de crecimiento. Bcl-xL puede ejercer su acción anti-apoptótica mediante la interacción con moléculas pro-apoptóticas como Bax. Además, puede regular la permeabilidad de la membrana mitocondrial impidiendo la liberación del citocromo c al citosol [93]. - Subfamilia Bax: Bax es uno de los miembros pro-apoptóticos más importantes, su peso molecular es de 21 KDa y posee los dominios BH1, BH2 y BH3, aunque son BH1 y BH2 los que guardan una estrecha homología con Bcl-2. En condiciones normales Bax se encuentra en el citosol o en el citoesqueleto en forma monomérica, y en respuesta a estímulos apoptóticos se transloca a la membrana mitocondrial externa o interna, formando homoo heterooligómeros con Bak, y puede ser que con otros factores. No está claro su mecanismo pero sí que su regulación se lleva a cabo mediante fosforilación, y que su sobre-expresión acelera la apoptosis mediante la permeabilización de la membrana mitocondrial externa [80]. Subfamilia BH3: son proteínas pro-apoptóticas, que sólo muestran homología con Bcl-2 por su dominio BH3. Para ejercer su actividad pueden formar heterodímeros con los miembros anti-apoptóticos de la familia: Bcl-2 y Bcl-xL. Para ello, el dominio BH3 de los miembros de este grupo puede introducirse en el hueco hidrofóbico formado por la asociación de las regiones BH1, BH2 y BH3 de los miembros anti-apoptóticos. Bad se activa mediante desfosforilación, cuando está fosforilada se encuentra inactiva en el citosol pudiendo estar unida a la proteína 14-3-3. La hidrólisis de la proteína 14-3-3 durante la apoptosis promueve la 47 INTRODUCCIÓN Existen dos isoformas, ERK1 y ERK2, que presentan diferentes niveles de expresión en diferentes tejidos y pueden actuar sobre más de 150 sustratos diferentes en todos los compartimentos celulares, incluyendo proteínas citosólicas y de membrana, sustratos nucleares y proteínas del citoesqueleto. Además ERK1/2 puede fosforilar y activar otras quinasas. La activación de la vía ERK1/2 estimula los factores de transcripción implicados en la síntesis de ciclinas tipo D, y también puede controlar su expresión a nivel post-transcripcional. Estabiliza mediante fosforilación a c-myc, un factor de transcripción, que desempeña un papel importante en la regulación del crecimiento y la progresión del ciclo celular y la apoptosis, a través de un aumento de la expresión de ciclina D, p21 y cdc25, proteínas ribosómicas y factores de traducción, disminuyendo la expresión de genes antiproliferativos [105]. La vía ERK1/2 no funciona normalmente en aproximadamente un tercio de los cánceres humanos, una mutación activadora en los genes implicados provoca la oncogénesis [104]. Además de en la proliferación celular, otros sustratos de ERK1/2 juegan un papel clave en la angiogénesis, la migración celular, la invasión y la metástasis. La señalización de ERK1/2 puede promover más el fenotipo maligno del cáncer, interrumpiendo las vías de señalización Rho, fosforilando proteínas implicadas en la migración celular y regulando la expresión de proteasas implicadas en la degradación de la membrana basal. Una alta actividad de ERK1/2 reduce la tasa de apoptosis de las células del carcinoma de colon e induce la detención del ciclo celular al aumentar los niveles de inhibidores de CDK, p21 y p27. ERK1/2 puede inhibir la activación de las caspasas citosólicas y la liberación del citocromo c de la mitocondria. Además, ERK1/2 puede fosforilar a Bad, secuestrándolo en el citosol e impidiéndole actuar en la mitocondria previniendo la apoptosis [104]. La activación de ERK1/2 está implicada además, en la muerte celular inducida por factores tales como las especies reactivas de oxígeno (ROS), las toxinas de E.coli, y el zinc, y también por la deprivación de factores de supervivencia. Los inhibidores de MEK-ERK como U0126 o PD98059 suprimen la apoptosis inducida por la quercetina en células A549 [106], mientras que PD98059 aumenta la resistencia al cisplatino en células de carcinoma cervical humano SiHa y en células de hepatoblastoma HepG2 [107]. Los mecanismos mediante los cuales la vía ERK1/2 media la apoptosis no se conocen en detalle, pero parece producirse a diferentes niveles. ERK1/2 puede actuar antes de la liberación del citocromo c y de la activación de la caspasa -3 como se ha observado con cisplatino. ERK1/2 puede aumentar los niveles de Bax y 48 INTRODUCCIÓN p53, e incluso fosforilar directamente a p53, aumentando la apoptosis [108,109,110]. ERK1/2 puede tener un papel relevante en la inducción de la apoptosis por vía extrínseca aumentando la respuesta a TNF-α e induciendo la activación de caspasa-8. La promoción de la muerte celular por esta vía también puede ser el resultado de la represión de la señal de supervivencia mediada por Akt [104,111]. 4.4.2. Familia JNK. La vía JNK posee una actividad principalmente pro-apoptótica [112]. Las MAPKKs que activan JNK, son MKK4 y MKK7, las cuales pueden ser activadas por una gran diversidad de estímulos externos: citoquinas, radiación ultravioleta, agentes que dañan el ADN, y en menor medida, en respuesta a receptores acoplados a proteína G, suero, y factores de crecimiento. La activación de la vía puede producir la translocación de JNK del citoplasma al núcleo y producir alteraciones en la expresión de los genes, en la muerte y/o en la proliferación celular [104]. Entre los sustratos de JNK se encuentran principalmente factores de transcripción y receptores nucleares de hormonas, que tienen un efecto directo en la expresión génica: proteínas nucleares, receptores nucleares de hormonas, proteínas no nucleares, proteínas mitocondriales de la familia Bcl-2, proteínas del citoesqueleto y Akt [104]. JNK tiene un papel muy importante en la degradación de proteínas y en la tumorogénesis. Una función importante de c-Jun es la represión transcripcional de p53, y su pérdida o la mutación de alguno de sus sitios de fosforilación para JNK puede reducir el número y tamaño de algunos tumores [113]. El mecanismo mediante el cual JNK induce la apoptosis depende del estímulo y del tipo celular implicados. JNK se une y degrada a p53 por ubiquitinización [116-117], pero la activación de JNK por estrés inhibe la degradación dependiente de ubiquitina debido a la formación de un complejo estable. JNK inhibe mediante fosforilación a las proteínas antiapoptóticas Bcl-2 y Bcl-xL, y activa Bax y 14-3-3, pro-apoptóticas. JNK está involucrado en la degradación del inhibidor de la caspasa-8, c-FLIPL, y en la activación de la variante de histona 2 (H2AX), que es esencial en la fragmentación del ADN. Y además, la caspasa-3 puede amplificar la activación de JNK, mediante la activación de MEKK1 [104]. Aunque JNK está asociado con acciones pro-apoptóticas [112] y señales que inhiben el crecimiento [114], también existen evidencias de que JNK puede actuar como señal de 49 INTRODUCCIÓN supervivencia en células de carcinoma hepático [115] y en líneas celulares de cáncer gástrico y colorrectal [116]. Otra hipótesis, es que la activación prolongada de JNK pueda inducir apoptosis, mientras que la activación transitoria promociona la supervivencia celular, debido a la duración o a la magnitud de la activación de la vía y en parte a la activación de otras vías de supervivencia [117]. 4.4.3. Familia p38. La vía p38 regula principalmente la apoptosis, la respuesta inflamatoria y transmite señales inhibidoras del crecimiento, estando implicada en respuestas a estímulos de estrés extracelular, en la regulación del ciclo celular y en la osmorregulación. La vía p38, al igual que la vía JNK, se activa por estrés ambiental, y citoquinas inflamatorias, y es activada de forma contraria en menor medida por la insulina y factores de crecimiento; pero a diferencia de JNK, p38 también se activa en la isquemia por reperfusión [118]. Se conocen cuatro isoformas de p38 (α, β, γ y δ) y sus sustratos son: factores de transcripción, otras quinasas y proteínas citosólicas como fosfolipasa A2, proteínas de movilidad, Tau (proteína asociada a microtúbulos) y queratina 8, entre otros [104]. p38 está presente tanto en el núcleo como en el citoplasma de las células quiescentes, y aunque existen evidencias de que a raíz de su activación se transloca del citoplasma al núcleo, p38 también está presente en el citoplasma [119]. p38 también participa en la respuesta de los macrófagos y neutrófilos, la quimiotaxis, la exocitosis granular, la adhesión, y la apoptosis; y también en la diferenciación y apoptosis de células T [120]. El papel de p38 en la apoptosis depende de la línea celular y del estímulo inducido [121]. La activación de p38 es necesaria para la apoptosis inducida por cadmio, retirada de factor trófico e isquemia [122,123,124,125], sin embargo, su activación no se produce en la apoptosis inducida por la radiación ultravioleta en células U937 [126] ni por S-nitrosoglutatión en macrófagos RAW 264.7 [127] ni en células Jurkat T tratadas con Fas y/o UV [128]. Muchos agentes quimioterapéuticos inducen la apoptosis mediante la activación de p38 [129,130], mientras que la supresión de su activación aumenta la apoptosis en respuesta al daño del ADN inducido por la doxorrubicina o el cisplatino [131]. p38 es activada por diferentes tipos de estrés celular y actúa en un paso previo a la disfunción de la mitocondria y a la activación de la cascada de caspasas. Sin embargo, p38 también puede funcionar como un supresor de tumores, posiblemente mediante la activación de p53 50 INTRODUCCIÓN [104]. En células endoteliales, p38 induce fosforilación y disminución de los niveles de BclxL y aumenta la expresión de p53. Además, p38 es uno de los potenciales reguladores de Bax [132] y un mediador de la respuesta a los puntos de control de G2/M [133,134]. El punto de unión entre p38 y el control del ciclo celular parece ser la regulación de los sustratos HBP1 y p21 [135]. Muchos de los efectos de p38 sobre el ciclo celular están mediados por otras quinasas, las cuales fosforilan diversos sustratos que influyen en la expresión génica. 4.5. Esfingolípidos. Los esfingolípidos son una familia de lípidos presentes en la membrana que contribuyen a la regulación de su fluidez y a su estructura de bicapa lipídica. Además, los esfingolípidos bioactivos, como son la ceramida, la glucosilceramida y la esfingosina generalmente median respuestas antiproliferativas como inhibición del crecimiento, parada del ciclo celular, senescencia y apoptosis. Mientras que la esfingosina 1-fosfato (S1P) juega un papel opuesto induciendo la supervivencia y la proliferación celular. El equilibrio entre los niveles intracelulares de cada uno de estos esfingolípidos está controlado por las enzimas que los producen. La esfingosina quinasa (SK) es uno de los reguladores esenciales de este balance, cataliza la formación del metabolito pro-supervivencia esfingosina 1-fosfato y reduce el contenido de los metabolitos pro-apoptóticos [136]. Existen varias rutas de entrada a la vía de los esfingolípidos que convergen en la formación de ceramidas, que desempeña un papel clave en la generación de otros esfingolípidos activos: - La primera ruta de entrada es la biosíntesis de novo: la serina y el palmitoil CoA se condensan y conducen a la formación de ceramida en el retículo endoplásmico y en el aparato de Golgi. La ceramida puede ser convertida en esfingosina, S1P, o bien formar esfingomielina y glicoesfingolípidos complejos. Esta es la única ruta bioquímica de eliminación de ceramidas y demás esfingolípidos de la célula, ya que se requiere la transformación final en S1P, mediada por la SK. Esta vía puede ser activada por agentes quimioterápicos, choque térmico y LDL oxidadas. La ceramida formada de novo está involucrada en la respuesta al estrés y en la apoptosis. - La segunda ruta implica la hidrólisis de esfingomielina por acción de las esfingomielinasas. La hidrólisis de esfingomielina es considerada la principal vía para la producción de ceramida como transductor de señales que regulan la muerte celular [6, 141][137]. En primer término se forma ceramida, que es hidrolizada por la acción de 51 INTRODUCCIÓN ceramidasas para formar esfingosina, que a su vez es transformada por la SK en S1P. Esta vía es estimulada en respuesta al TNF-α, al ligando Fas o al estrés oxidativo [137,138]. - Un tercer mecanismo más complejo de formación y acumulación de ceramidas, es la vía de salvamento. Este mecanismo se relaciona con el catabolismo de esfingolípidos complejos que se transforman en esfingosina, y mediante reacilación son reutilizados para producir ceramida. Está mediada por una serie de enzimas claves: esfingomielinasas, posiblemente glucocerebrosidasas (ácido β-glucosidasa), ceramidasas, y (dihidro) ceramida sintasas. La ceramida generada por esta vía es transformada por la ceramidasa ácida para formar esfingosina y ácidos grasos libres, que son capaces de dejar el lisosoma [7, 143][139], mientras la ceramida no sale del lisosoma. Una vez liberados de los lisosomas pueden entrar en la vía de la síntesis de ceramida o en la síntesis de S1P (mediante esfingosina quinasas). Esta vía, se cree que es la responsable de las funciones de la ceramida generada en situaciones como la detención del crecimiento, la apoptosis, y la señalización celular [140]. La diferente activación de cada una de las vías de formación de ceramidas es posible gracias a la separación espacial de las enzimas que contribuyen a su formación. El metabolismo de los esfingolípidos, es específico del tipo celular, y es regulado a diferentes niveles, mediante la expresión de enzimas, modificaciones post-traduccionales y mecanismos alostéricos. 4.5.1. Ceramidas. La ceramida también se conoce como lípido supresor de tumores, debido a su efecto apoptótico en respuesta a estímulos de estrés celular, y su acumulación en respuesta a agentes pro-apoptóticos [141]. Está implicada en la regulación de parada del ciclo y muerte celular, y/o apoptosis, actuando sobre fosfatasas y quinasas como Akt, proteínquinasa C (PKC), MAPKs, la proteína retinoblastoma Rb, la quinasa dependiente de ciclina p21 y la quinasa dependiente de ciclina CDK2. Su influencia en la senescencia se atribuye a fallos en la vía fosfolipasa C/proteínquinasa C, enzimas que son inhibidas por ceramida [142]. La hidrólisis de esfingomielina da lugar a la liberación de ceramidas, y se han identificado al menos cinco subtipos diferentes de esfingomielinasas dependiendo de su pH óptimo, su localización subcelular y su dependencia de cationes: Smasa neutra dependiente de magnesio y unida a membrana (N-SMasa), SMasa neutra independiente de magnesio, SMasa ácida presente en los lisosomas (A-SMasa), una forma secretada y soluble de SMasa ácida 52 INTRODUCCIÓN dependiente de zinc y una SMasa alcalina. El papel específico de cada una no se conoce con detalle siendo la N-SMasa y la A-SMasa las más estudiadas. La N-SMasa es activada por el receptor de TNF a través de una proteína adaptadora denominada FAN asociándose al dominio NSD del receptor [6, 141][137], y provocando la atracción y activación de numerosas proteínas implicadas en rutas de señalización [137]. La A-SMasa, puede ser también activada por el receptor de TNF a través de otras proteínas adaptadoras como FADD y TRADD que se unen al dominio de muerte (DED) del receptor [143], y su expresión es imprescindible para que se produzca la muerte celular en respuesta a una gran variedad de estímulos que inducen la acumulación de ceramidas como: la luz ultravioleta, la irradiación y el estrés. En respuesta a estos estímulos se produce una translocación de la A-SMasa desde las vesículas intracelulares en que se encuentra a la membrana celular donde se fusiona con la misma y se produce una liberación de ceramidas [144]. Estudios recientes señalan a la mitocondria como un lugar de generación y actuación de las ceramidas [145,146,147]. La ceramida mitocondrial parece generarse a través de la vía de síntesis de novo, y/o a través de la actividad de la A-SMasa, que se encuentra entre la membrana externa e interna de la mitocondria [148]. En la mitocondria, la apoptosis inducida por la ceramida puede ser bloqueada por Bcl-2, indicando que la produción de ceramidas en la apoptosis es un evento anterior al punto de control de Bcl-2 [146]. La ceramida está implicada en la formación de poros mitocondriales que favorecen la salida de factores pro-apoptóticos como el citocromo c, AIF, Smac/Diablo y la Endonucleasa G; así como en la activación de numerosas vías de transducción de señales, mediante la interacción con diferentes proteínas. Otro mecanismo por el cual la ceramida puede inducir apoptosis es la regulación del potencial redox, induciendo estrés oxidativo a través de la disfunción mitocondrial, sobreexpresión de NO sintasa, activación de la NADPH oxidasa y desregulación de enzimas antioxidantes. 53 OBJETIVOS OBJETIVOS 55 OBJETIVOS 1. Evaluar la actividad antitumoral de una serie de flavonoides utilizando como modelo de estudio diversas líneas celulares tumorales humanas. 2. Seleccionar los compuestos más citotóxicos e investigar su mecanismo de acción. 57 MATERIAL Y MÉTODOS MATERIAL Y MÉTODOS 59 MATERIAL Y MÉTODOS 1. Agentes farmacológicos. Los estudios correspondientes al aislamiento, elucidación estructural y derivatizaciones de los productos naturales fueron llevados a cabo en el Instituto Universitario de Bio-Orgánica “Antonio González”, La Laguna, Tenerife, bajo la dirección del Dr. Jesús M. González Díaz. Los compuestos naturales utilizados en este estudio se aislaron de Consolida oliveriana (DC) Schrod, que fue recogida e identificada en el este de Turquía (Pazarkik) a una altitud de 980 metros por el Prof. Julián Molero Briones, del Departamento de Botánica, de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Barcelona, donde ha sido depositado un espécimen (BCF37810) [149]. Partiendo de las partes aéreas de Consolida oliveriana se aislaron los siguientes compuestos: hiperósido, 2´-acetilhiperósido (2), 6´-acetilhiperósido (3), kaempferol, quercetina, trifolín, 7glucotrifolín, robinina y biorobinina. A partir de algunos de ellos, mediante acetilación, se obtuvieron los siguientes compuestos: hiperósido acetato (1), kaempferol tetraacetato (5), trifolín hexaacetato (11), trifolín heptaacetato (12), glucotrifolín decaacetato (13), quercetín pentaacetato (15), biorobina nonaacetato y robinina undecaacetato. Finalmente, mediante metilación del trifolín se obtuvo el heptametiltrifolín (14). La identificación de las estructuras se realizó por espectroscopía de resonancia magnética nuclear (1H-NMR y 13C-NMR) y espectrometría de masas de alta resolución (HR-MS), la pureza de todos los compuestos fue del 99%. Los compuestos de origen sintético fueron los siguientes: kaempferol (4), 3´,4´,7,8tetrahidroxiflavona (6), 3´,4´,5-trihidroxi-6,7-dimetoxiflavona (7), 3´,5,7-Trihidroxi-3,4´- dimetoxiflavona (8), 3-metoxiflavona (9), 6-metoxiflavonol (10), quercetín-3,7,3´,4´- tetrametiléter (16), robinetina (17), siringetina (18), tamarixetina (19) y tangeretina (20), todos ellos suministrados por Extrasynthese (Lyon Nord, France). 2. Productos y material: Los medios de cultivo RPMI 1640 y Dulbecco´s MEM (DMEM), el suero bovino fetal (FBS), la tripsina, el HEPES (N-[2-hidroxietil] piperazino N'-[2-etanosulfanílico]), la Lglutamina, el azul de tripán, el bicarbonato sódico y los antibióticos (estreptomicina, gentamicina y penicilina G) fueron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Las botellas de cultivo de 75 cm2 y las placas de 48 y 96 pocillos estériles, así como el resto del material estéril utilizado fueron de Becton-Dickinson. 66 MATERIAL Y MÉTODOS presentan el doble de contenido en ADN que una célula normal y aparecerán como un segundo pico. Las células que contienen ADN hipodiploide (menor contenido de ADN que el contenido diploide de las células normales) son consideradas apoptóticas, y se localizan a la izquierda del pico G1 constituyendo la fracción SubG1 [150]. Después de los tratamientos, las células se lavaron con PBS frío y se fijaron durante al menos una hora en etanol al 70 %, a -20ºC. A continuación se lavaron dos veces con PBS, se centrifugaron a 500 g durante 10 minutos y se incubaron con 1 ml de PBS (1h a 37ºC en oscuridad) conteniendo 100 µg/ml de RNasa A y 50 µg/ml de yoduro de propidio. La sonda fue excitada a 488nm y la fluorescencia emitida por el complejo propidio-ADN (617nm) se determinó en un citómetro Coulter Epics XL-MCL, (Beckman Coulter) usando el detector FL3 (620±15nm). Se analizaron 10.000 células en cada muestra y los resultados se analizaron con el software EXPO 32 ADC Sofwaretm (Beckman Coulter) [153].. 4.2.4. Determinación de las células apoptóticas mediante el análisis de la externalización de fosfatidilserina. La fosfatidilserina es un fosfolípido que normalmente se encuentra en la cara interna de la membrana plasmática y se transloca a la cara externa de dicha membrana en los estadíos tempranos del proceso de apoptosis. La proteína Anexina V se une a fosfatidilserina en presencia de Ca2+ y permite detectar las células apoptóticas por citometria de flujo, previa incubación de las células con Anexina V unida a un fluorocromo (FITC). De esta manera distinguimos: a) células viables, no unen anexina V y excluyen yoduro de propidio, b) células en apoptosis temprana, unen anexina V y excluyen yoduro de propidio, c) células en apoptosis tardía, unen anexina V e incorporan yoduro de propidio y d) células necróticas, unen anexina V e incorporan yoduro de propidio, o sólo incorporan yoduro de propidio. Las células (1x106 por muestra) una vez tratadas se lavaron con PBS frío, y se resuspendieron en el tampón 1X (10 mM Hepes/NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2). Se transfirieron 100 μl de la suspensión (1 x 105 células) a un tubo de cultivo de 5 ml, y se le añadió 5 μl de Anexina V-FITC y 5 μl de yoduro de propidio. Mezclamos suavemente las células e incubamos durante 15 minutos a temperatura ambiente (25°C) en la oscuridad. Se añadió 400 μl del anterior tampón 1X a cada tubo, y se analizó cada muestra por citometría de flujo. Cuando las células en cultivo sufren apoptosis, al no poder ser fagocitadas, sufren necrosis 67 MATERIAL Y MÉTODOS secundaria al proceso apoptótico, por lo que puede aumentar el número de células que dan positivo a yoduro de propidio. 4.2.5. Microscopía Electrónica de Transmisión (MET). Para el procesado de muestras en microscopía electrónica de transmisión, las células se centrifugaron, se resuspendieron y se fijaron en glutaraldehído al 2.5 % en tampón fosfato (0.1M, pH 7,2) durante 24 horas. La post-fijación se realizó en OsO4 al 1% en tampón fosfato. Las células se deshidrataron con una serie de concentraciones crecientes de etanol. El sedimento se incluyó en resina EMBed 812 que polimerizó a 70º C. Los cortes fueron realizados con un ultramicrotomo Reichert Ultracut s (Leica). Los cortes semifinos fueron teñidos con azul de toluidina, mientras que los ultrafinos fueron contrastados con acetato de uranilo y plomo. Las fotografías fueron tomadas en un microscopio electrónico de transmisión Zeiss EM 910 (Carl ZEISS, Germany) equipado con cámara digital Proscan Slow-scan CCDCamera for TEM (Fa. Proscan Elektronische Systeme GmbH, Germany) y software Soft Imaging System (Germany) del Servicio de Microscopía Electrónica de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. 4.3. Determinación de la actividad caspasa. Las células tratadas se centrifugaron a 1.000 g durante 5 min a 4 °C, se lavaron con PBS y se incubaron en hielo. Las células se resuspendieron en tampón de lisis (50 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM dithiothreitol, 0,1 mM EDTA, 0.1% Chaps) y se dejaron 5 min en hielo. Se centrifugaron durante 10 min at 16.000 g a 4°C, se determinó la concentración de proteínas en los sobrenadantes mediante el método de Bradford y se almacenaron a −20 °C hasta que se usaron para el estudio de la actividad enzimática de las caspasas. Se utilizó una cantidad equivalente de proteínas de los diferentes tratamientos (~20 µg). El incremento de la absorbancia a 405 nm después de la incubación a 37 °C durante 1 hora fue indicativo de la actividad enzimática de las caspasas. El sustrato colorimétrico específico utilizado en el ensayo para la actividad caspasa -3/7 fue N-acetil-Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilina (DEVDpNA). 4.4. Inmunodetección de proteínas (western blot). Las células (1-10 x 106) se incubaron en medio de cultivo con los productos de interés durante distintos tiempos a 37 ºC. A continuación se recolectaron por centrifugación (500 g, 10 minutos, 4ºC) y se lavaron dos veces con PBS. En este punto, las células se procesaron de 68 MATERIAL Y MÉTODOS distinta forma: en función de si se necesitaba el lisado celular o las diferentes fracciones subcelulares (fracción nuclear, citosólica y mitocondrial). - Obtención del lisado celular: El precipitado celular se resuspendió en 100 µl de tampón de lisis [Tris-HCl (pH 7,4), 2 mM EDTA, 137 mM cloruro sódico, 10% glicerol, 1% Triton X-100, 2 mM de pirofosfato de sodio, 20 mM glicerofosfato de sodio, 10 mM fluoruro sódico, 2 mM ortovanadato sódico, 1 mM PMSF, leupeptina (5 µg/ml), aprotinina (5 µg/ml) y pepstatina A (5 µg/ml)] e incubó durante 15 min a 4ºC. Los lisados se sonicaron (cuatro ciclos de cinco segundos) y se centrifugaron a 11,000 x g durante 10 min a 4ºC. El precipitado resultante (membranas y demás restos celulares) se descartó, mientras el sobrenadante se analizó [150,152]. - Fraccionamiento subcelular: El precipitado celular (∼ 107 células) se resuspendió en 100 µl de tampón de homogeneización [20 mM HEPES-KOH (pH 7,5), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 250 mM sacarosa] con inhibidores de proteasas (0,1 mM PMSF, 10 µg/ml de leupeptina, 10 µg/ml aprotinina y 10 µg/ml pepstatina A), y se incubó durante 15 min a 4 ºC. Las células se lisaron usando una aguja de 21G y el extracto resultante se centrifugó a 1.000 x g durante 5 min a 4 ºC. El precipitado (fracción nuclear) se resuspendió en 100 µl de tampón de homogeneización y se sonicó 3 veces durante 10 segundos a 4 ºC. El sobrenadante resultante se centrifugó a 22.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. El precipitado (fracción mitocondrial) se resuspendió en 50 µl de tampón de homogeneización mientras que el sobrenadante fue utilizado como fracción citosólica. Las diferentes fracciones se congelaron a -20 ºC hasta su utilización [150]. La concentración de proteínas se determinó por el método de Bradford, y todas las muestras se ajustaron a la misma concentración utilizando el tampón anterior. Los lisados celulares se hirvieron en tampón de electroforesis [50 mM Tris-HCl (pH 6,8), 15% sacarosa, 2 mM EDTA, 3% SDS, 5 mM β-mercaptoetanol y 0,01% azul de bromofenol] a 100 ºC durante 5 min [150]. Las muestras se sometieron a electroforesis en un gel de poliacrilamida (del 7,5% al 15%, dependiendo del peso molecular de la proteína a estudiar) conteniendo 0,1% SDS y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con 10% de leche 69 MATERIAL Y MÉTODOS desnatada en tampón TBST [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 137 mM NaCl, 0,1 % Tween-20] durante 1 h a temperatura ambiente (o toda la noche a 4 ºC), seguido de una incubación con el anticuerpo específico. Los anticuerpos utilizados en este estudio se diluyeron en TBST conteniendo 3% de leche desnatada y las membranas se incubaron en presencia del anticuerpo de interés, durante 24 h con agitación suave y a 4 ºC. Las membranas se lavaron con TBST tres veces durante 15 min cada vez y se incubaron con el anticuerpo secundario apropiado durante 1 h a temperatura ambiente. Finalmente las membranas se lavaron nuevamente con TBST en las mismas condiciones anteriores y la detección de las proteínas específicas se determinó por emisión de quimioluminiscencia, utilizando un kit comercial y posterior exposición de las membranas sobre películas de autorradiografía. Las imágenes fueron capturadas con un escáner y analizadas con el programa Adobe Photoshop 7.0. Como control de que se ha cargado y transferido la misma cantidad de proteínas, las distintas muestras se analizaron con un anticuerpo específico anti-β-actina. 4.5. Análisis de la tubulina por western blot. Las células (∼ 0,5x106 células) se incubaron a las concentraciones indicadas de 3´,5,7Trihidroxi-3,4´-dimetoxiflavona (THDF), paclitaxel y colchicina durante el tiempo seleccionado. Las células se recolectaron por centrifugación (500 g, 10 min, 4 ºC) y se lavaron tres veces con PBS. Los precipitados celulares se resuspendieron en 100 µl de tampón de homogeneización [20 mM Tris-HCl (pH 6,8), 1 mM MgCl2, 2 mM EGTA, 5 µg/ml leupeptina, 5 µg/ml aprotinina, 1 mM PMSF, 1 mM ortovanadato y 0,5% Nonidet], se incubaron a 4 º C durante 5 min y se centrifugaron a 15.000 g durante 10 min a 4 ºC. En el sobrenadante obtenido tendremos la tubulina soluble y en el precipitado la tubulina insoluble. La fracción insoluble se solubilizó con 100 µl de tampón de homogeneización mediante sonicación. Se determinó la concentración de proteínas en cada una de las fracciones obtenidas mediante el método de Bradford y se igualaron posteriormente las concentraciones de todas las muestras. Cantidades equivalentes de cada muestra se mezclaron con tampón de electroforesis [50 mM Tris-HCl (pH 6,8), 15% sacarosa, 2mM EDTA, 3% SDS, 5 mM βmercaptoetanol y 0,01% azul de bromofenol] y se hirvieron a 100 ºC durante 3 minutos. Las muestras se sometieron a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 10% y las proteínas se transferieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con 5% leche desnatada en tampón TBST [50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl] con 1% Tween 20, 70 MATERIAL Y MÉTODOS fueron incubadas con un anticuerpo monoclonal anti-α-tubulina (Sigma) y luego con un anticuerpo secundario (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden). El complejo antígeno-anticuerpo se visualizó mediante quimioluminiscencia [150]. 4.6. Determinación de la generación de especies reactivas de oxígeno intracelular. La generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelular se midió fluorimétricamente usando la sonda diacetato 2´,7´-dicloro-dihidro-fluoresceína (H2-DCFDA). Las células fueron expuestas a los tratamientos correspondientes y se incubaron con 8 µM de H2-DCF-DA durante los últimos 30 minutos antes de finalizar el ensayo, a 37 ºC. Inmediatamente después, las muestras se analizaron mediante citometría de flujo con el equipo Coulter Epics XL-MCL (Beckman Coulter), excitando la sonda con un láser de argón a 488 nm y recogiendo la emisión fluorescente de la diclorofluoresceína (529 nm), con el detector FL1 (525±20 nm). La distinta intensidad de la emisión fluorescente indica la mayor o menor presencia de ROS en el interior de la célula. Los resultados se analizaron con el EXPO 32 ADC Sofwaretm (Beckman Coulter) [154,155]. 4.7. Análisis de la despolarización de la membrana mitocondrial ( ∆Ψ m). Las células HL-60 (1 x 106 células) se incubaron a 37 ºC en la oscuridad, con la sonda JC-1 (10 µg/ml) durante los últimos 30 minutos antes de finalizar el ensayo y se analizaron mediante citometría de flujo utilizando el canal FL1 (527 nm) para detectar la fluorescencia verde de los monómeros de la sonda y el canal FL2 (590 nm) para la fluorescencia roja de los agregados. La cuantificación de la despolarización mitocondrial (∆Ψm) se obtuvo a partir de la representación gráfica de los datos recogidos por el detector FL1 frente a los recogidos por el detector FL2. La división de las gráficas en cuadrantes permite estimar el porcentaje de células con potencial de membrana intacto (cuadrantes superiores) de aquellas que sufren despolarización mitocondrial (cuadrantes inferiores). El ionóforo de protones carbonil cianuro m-clorofenil hidrazona (CCCP) se utilizó como control positivo de la disipación del potencial de membrana. La despolarización de la membrana mitocondrial inducida por CCCP (10 µM) se ve reflejada por un incremento del número de células que emiten mayor fluorescencia verde y menos roja respecto a las células control y que se sitúan en el cuadrante inferior derecho. Para el análisis se usó citómetro Coulter Epics XL-MCL (Beckman Coulter). 71 MATERIAL Y MÉTODOS 4.8. Análisis de la red de microtúbulos por microscopía de fluorescencia. Las células (~1x106) se lavaron con PBS y se fijaron con 70 µl de paraformaldehído (3%, en PBS) durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación se centrifugaron (16.000 g, 1 min), se lavaron con PBS y se bloquearon con una disolución de PBS conteniendo un 3 % de BSA (albúmina de suero bovino) y 0,1% de triton X-100 durante 1 hora a 4°C. Las células se lavaron dos veces durante 5 minutos con PBS y se incubaron durante 24 h a 4 ºC con anti-α-tubulina (1/2000) en PBS, 3% BSA, 2% NGS (suero normal de cabra). Las células se lavaron con PBS, se añadió el anticuerpo secundario (1/200), Anti–IgG de ratón (H+L)- Cy2TM, (de cabra) en PBS, 3% BSA, 2% NGS e incubaron durante 1 h a 4 ºC. Se realizaron tres lavados con PBS durante 10 minutos y se añadió 10 µL VECTASHIELD®. Tras una incubación de 15 minutos se fijaron las células en un portaobjetos y se analizó la morfología nuclear (en azul se tiñeron los núcleos) y la red de microtúbulos (en verde se visualizó la tubulina), en un microscopio de fluorescencia LSM 5 PASCAL de ZEISS. 4.9. Análisis de la polimerización de tubulina in vitro. La tubulina (>99% de pureza) a una concentración final de 3 mg/ml fue resuspendida en 100 µl de tampón [80 mM PIPES, pH 6,9, 2 mM MgCl2, 0,5 mM EGTA, 1 mM GTP, 10,2% glicerol] en ausencia o presencia del compuesto ensayado a 4ºC. La mezcla se transfirió a una placa de 96 pocillos a 37ºC, y la polimerización de tubulina se determinó midiendo los cambios en la absorbancia a 340 nm cada minuto durante 100 minutos en un lector de fluorescencia (DTX 880 Multimode Detector, Beckman Coulter). 4.10. Ensayo de competición por la unión a tubulina. La unión de la [3H] colchicina a la tubulina se determinó utilizando filtros de DEAE-celulosa (DE81), tal y como fue descrito previamente [156]. El ensayo se llevó a cabo en 100 µl de mezcla, conteniendo 1 mM (0,1 mg/ml) tubulina, 1 M glutamato monosódico, 0,1 M glucosa1-fosfato, 1 mM MgCl2, 1 mM GTP, 0,5 mg/ml albúmina de suero bovino, 5% (v/v) dimetilsulfóxido, 5,0 µM [3H] colchicina (75,5 Ci/mmol, Perkin-Elmer), en ausencia o presencia de diferentes concentraciones del compuesto estudiado. Estas condiciones de reacción se llevaron a cabo para estabilizar fuertemente la unión de la tubulina y la colchicina [157]. Incubamos las muestras durante 10 minutos a 37ºC, y para lavar la [3H] colchicina no unida utilizamos 2 ml de agua fría 5 veces. Finalmente la colchicina retenida por el filtro se 72 MATERIAL Y MÉTODOS midió usando un contador de centelleo líquido. Cada determinación se realizó 3 veces por triplicado. 4.11. Determinación de la actividad esfingomielinasa ácida y neutra. Los ensayos de determinación la actividad SMasa se realizaron utilizando [14C-metil-colina] esfingomielina [158]. Las células HL-60 se trataron por triplicado en ausencia o en presencia del compuesto. A los tiempos indicados de tratamiento se paró por inmersión en un baño de hielo seco con metanol, las células se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 min a 4ºC y se lavaron dos veces con PBS, separando la mitad de las células para determinar la actividad SMasa ácida y la otra mitad para la actividad SMasa neutra. - Determinación de la actividad esfingomielinasa neutra. Las células se resuspendieron en 50 µl de tampón que contenía 20 mM Hepes (pH 7,4), 10 mM MgCl2, 2 mM EDTA, 5 mM DTT, 0,1 mM ortovanadato sódico, 0,1 mM molibdato sódico, 30 mM p-nitrofenilfosfato, 10 mM β-glicerofosfato, 750 µM ATP, 1 mM PMSF, 10 µM de leupeptina, 10 µM pepstatina y 0,2% Triton X-100. Después de incubar durante 5 minutos a 4ºC, las células se homogeneizaron con una aguja de 21G y se obtuvo la fracción citosólica mediante centrifugación. Se determinó la concentración de proteínas mediante el método de Bradford y aproximadamente 30 µg de cada muestra se incubó durante 2 horas a 37ºC en un tampón que contenía 20 mM HEPES (pH 7,4), 1 mM MgCl2, 2,25 µl de [N-metil14C] esfingomielina (0,2 µCi/ml, con una actividad específica de 56,6 mCi/mmol). La cantidad de [14C] esfingomielina hidrolizada no excedió del 10% de la cantidad de esfingomielina radiactiva añadida. La fosforilcolina fue extraída con 800 µl de cloroformo: metanol 2:1 (v/v) y 250 µl de agua. La fosforilcolina radiactiva producida a partir de [14C] esfingomielina fue determinada en la fase acuosa utilizando un contador de centelleo líquido. - Determinación de la actividad esfingomielinasa ácida. Las células se resuspendieron en 50 µl de 0,2% Triton X-100 y fueron incubadas durante 5 minutos a 4ºC. Las células se homogeneizaron con una aguja de 21G y se obtuvo la fracción citosólica mediante centrifugación. Todas las muestras se ajustaron a la misma concentración de proteínas (~30 µg) y se incubaron durante 2 h a 37 ºC en un tampón que contenía 250 mM acetato de sodio (PH 5,0), 1 mM EDTA, y 2,25 µl de [N-metil-14C] esfingomielina. La cantidad de fosforilcolina producida a partir de [14C] esfingomielina fue determinada en la fase acuosa mediante un contador de centelleo líquido. 73 MATERIAL Y MÉTODOS 4.12. Determinación de la cantidad de ceramidas. Las células se incubaron a 37 ºC durante diferentes tiempos con THDF. Para determinar la cantidad de ceramidas intracelulares recogemos las células totales, mientras que para estudiar la fracción mitocondrial procederemos a la separación como hemos indicado en la sección de western blot (fraccionamiento subcelular) quedándonos sólo con la fracción mitocondrial. En ambos casos, el contenido lipídico (1×106 células por tubo) se extrajo en tubos de cristal de 12x75mm, con 1 ml de “solución de parada” (CHCl3 500:MeOH 500:1N HCl 5), 270 µl de tampón salino (135 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1,5 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 5,6 mM glucosa y 10 mM HEPES pH 7,2) y 30 µl de EDTA 100 mM. Todo ello se mezcló y se separó mediante centrifugación 500 g 5 min a 4ºC. La fase orgánica (400 µl) se transfirió a tubos de cristal de 12x75 mm que se secaron bajo nitrógeno. La cantidad de ceramida generada se determinó mediante cromatografía en capa fina después de su conversión a [32P] ceramida-1-fosfato por la diacilglicerol quinasa de Escherichia coli [159,160]. - Hidrólisis alcalina. En cada tubo se añadieron 500 µl de 0.1M KOH/MeOH y se incubaron durante 1 hora y media a 37 ºC) para eliminar los glicerofosfolípidos. Los lípidos se extrajeron con 500 µl de CHCl3, 270 µl de tampón salino y 30 µl de EDTA 100 mM, colocando la fase lipídica en nuevos tubos de cristal de 13x100 mm que se secaron bajo nitrógeno. - Ensayo diacilglicerol quinasa. En un tubo de cristal, preparamos la siguiente mezcla (µl por muestra): añadimos 6 µl de cardiolipina (25 mg/ml) y lo secamos con nitrógeno, luego añadimos 20 µl de DETAPAC 1 mM (ácido dietilenetriamina-pentaacético) y los lípidos se solubilizaron mediante sonicación durante 2 minutos en un baño, posteriormente añadimos 6,2 µl de una disolución acuosa de Octyl-β-D-glucopiranósido (825 mM), 50 µl de tampón de reacción 2X (100 mM imidazol, 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 25 mM MgCl2, pH 6,5), 8 µl de imidazol/DETAPAC (10 mM/1 mM), 2 µl de DTT 100 mM, 1 µl de ATP 100 mM, 8,3 µl de agua bidestilada y 3,5 µl de diacilglicerol quinasa (1 mg/ml). Mezclamos e incubamos durante 30 minutos a temperatura de laboratorio y luego añadimos 1 µl [γ-32P] ATP (3.000 Ci/mmol). 74 MATERIAL Y MÉTODOS De la mezcla final, añadimos 100 µl por muestra e incubamos a temperatura ambiente durante 30 minutos. Paramos la reacción añadiendo 1 ml de solución de parada, 170 µl de tampón salino y 30 µl de EDTA 100 mM. Extraemos la fase orgánica que colocamos en nuevos tubos (13x100mm) y la secamos bajo nitrógeno. Luego, resuspendimos cada muestra en 50 µl de CHCl3/MeOH y separamos los lípidos mediante cromatografía en capa fina (TLC) desarrollada en CHCl3/MeOH/HAc (65:15:5) durante 45-75 min. Las placas cromatográficas fueron reveladas por autorradiografía y se extrajeron las bandas correspondientes a ceramida, para determinar la radiactividad mediante un contador de centelleo líquido. 5. Métodos estadísticos. En todos los casos las determinaciones para cada grupo experimental se realizaron por triplicado o cuadruplicado, y los valores representados se corresponden a datos de tres experimentos como mínimo (Media ± S.E.M). La comparación entre los distintos tratamientos se realizó por el método de la t de Student o análisis de la varianza, considerando significativos los valores de P < 0,05. 75 MATERIAL Y MÉTODOS RESULTADOS 83 RESULTADOS selectivo de caspasa -1 ( z-YVAD-fmk), el inhibidor selectivo de caspasa -2 (z-VDVADfmk), el inhibidor selectivo de caspasa -6 (z-VEID-fmk) y el inhibidor selectivo de caspasa -8 (z-IETD-fmk). Figura 10. Influencia de la activación de caspasas en la apoptosis inducida por TA en células tumorales. (A) Células HL-60 se pretrataron con diferentes concentraciones de z-VAD-fmk y luego se les añadió TA (10 µM). El porcentaje de células apoptóticas se determinó mediante citometría de flujo. (B) Las células se incubaron con TA (10 µM) durante 12 horas, en ausencia o presencia del inhibidor de caspasa -8 (z-IETD-fmk, 50 µM), el inhibidor de caspasa -2 (z-VDVAD-fmk, 50 µM), el inhibidor de caspasa-9 (z-LEHD-fmk, 50 µM), el inhibidor de caspasa -6 (z-VEID-fmk, 50 µM ), el inhibidor de las caspasas -3 y -7 (z-DEVD-fmk, 50 µM) y el inhibidor de caspasa -1 (z-YVAD-fmk, 50 µM). Las células apoptóticas fueron determinadas mediante citometria de flujo. Los valores representan las medias ± SE de dos experimentos realizados por triplicado. *P < 0,05, significativamente diferentes del control sin tratar. (C) Células HL-60 y SK-MEL-1 se incubaron en presencia de TA (10 µM) y los lisados celulares se analizaron mediante western blot para determinar la hidrólisis de procaspasa -9, -6, -3 y PARP. La β-actina fue usada como control de carga. #P< 0,05, significativamente diferentes del tratamiento con TA solo. 84 RESULTADOS Los resultados (Figura 10B) revelaron que las células pretratadas con z-LEHD-fmk, z-DEVDfmk o z-VEID-fmk son significativamente más resistentes a sufrir apoptosis por el TA. El porcentaje de células hipodiploides disminuyó desde 33 ± 2 % en las células tratadas con TA hasta un 20 ± 2 % en las células pretratadas con z-LEHD-fmk o z-DEVD-fmk, y el efecto del inhibidor z-VEID-fmk resultó ser el más importante cuantitativamente reduciendo el porcentaje de apoptosis hasta un 10 ± 1 %. El pretratamiento con los inhibidores, z-IETD-fmk y z-VDVAD-fmk no mostró ningún efecto, lo cual nos indica que las caspasas -8 y -2 no están implicadas en la muerte celular inducida por el TA. Sorprendentemente el pretratamiento con z-YVAD-fmk sensibilizó las células HL-60 frente a la apoptosis inducida por el TA. Teniendo en cuenta los resultados anteriores, estudiamos el efecto del TA sobre la activación de las caspasas en células HL-60 y SK-MEL-1 mediante western blot, y demostramos que el TA promueve la hidrólisis de las procaspasas -3, -6 y -9 en ambas líneas celulares (Figura 10C). Para determinar si el procesamiento de procaspasa -3 está asociado con un aumento de la actividad enzimática examinamos también la hidrólisis de PARP, sustrato de caspasa -3 que juega un papel fundamental en la reparación del ADN. Los resultados demuestran que TA induce el procesamiento de PARP (116 kDa), dando lugar a la aparición de un fragmento de 85 kDa (Figura 10C). 4. Trifolín acetato induce liberación de citocromo c al citosol, sin producir cambios en el potencial de membrana mitocondrial. La liberación de citocromo c de la mitocondria al citosol es uno de los eventos principales en la vía intrínseca de la apoptosis. Para determinar si esta vía está implicada en la apoptosis inducida por TA en células HL-60 y SK-MEL-1, realizamos experimentos variando el tiempo de tratamiento y analizamos los extractos citosólicos mediante western blot. Como se muestra en la Figura 11, detectamos un aumento de citocromo c en el citosol a las 6 horas de tratamiento, que persiste tras 12 horas en ambas líneas celulares. Para determinar si la liberación de citocromo c está asociada con una pérdida del potencial de membrana mitocondrial (∆Ψm), tratamos las células HL-60 durante diferentes tiempos (3, 6, 12 y 24 h) con TA, a continuación con la sonda JC-1 durante 30 minutos y finalmente analizamos las células mediante citometría de flujo. Los resultados indican que el ∆Ψm 85 RESULTADOS permanece intacto por lo menos durante las primeras 24 h de tratamiento (Figura 12A), en contraste con la caída del potencial de membrana producida por el ionóforo de protones carbonil cianuro m-clorofenil hidrazona (CCCP), sugiriendo que la alteración del potencial de membrana no está implicada en la apoptosis inducida por TA. Figura 11. El tratamiento con TA induce liberación de citocromo c en células tumorales. Las células se incubaron en presencia de TA (10 µM) durante los tiempos indicados y los extractos citosólicos y mitocondriales se ensayaron mediante western blot para determinar la liberación de citocromo c. βactina y citocromo c oxidasa (COX IV) se usaron como controles de carga en la fracción citosólica y mitocondrial, respectivamente. 5. Trifolín acetato no induce apoptosis en líneas celulares de leucemia humana que sobreexpresan Bcl-2 o Bcl-xL Bcl-2 y Bcl-xL pertenecen a una familia de proteínas que inhiben la apoptosis, regulando el potencial de membrana mitocondrial e impidiendo la liberación de citocromo c necesaria para la activación de caspasa -9 [161,162]. Por tanto, investigamos si estas proteínas son capaces de proteger a las células frente al efecto citotóxico del TA. Para ello usamos líneas celulares que expresan altos niveles de las proteínas anti-apoptóticas Bcl-xL (HL-60 / Bcl-xL) o Bcl-2 (U937 / Bcl-2). La cuantificación del número de células hipodiploides nos indica que efectivamente, ambas proteínas confieren protección a las líneas celulares ensayadas (Figura 12B). 86 RESULTADOS Figura 12. (A) El TA no afecta al potencial de membrana mitocondrial ( ∆Ψ m). Las células fueron incubadas con TA durante 24 h y el ∆Ψm se analizó por citometría de flujo utilizando la sonda JC-1. Resultados similares fueron obtenidos en dos experimentos independientes realizados por triplicado. Como control positivo se utilizó 10 µM de CCCP. (B) El TA no es capaz de inducir apoptosis en líneas celulares que sobreexpresan Bcl-2 y Bcl-xL. Comparación de la apoptosis inducida por TA en células HL-60/neo y HL-60/Bcl-xL, así como en células U937 y U937/Bcl-2. Las células se incubaron durante 24 h, en ausencia o presencia de TA. El porcentaje de células hipodiploides se determinó mediante citometría de flujo. Los valores representan la media ± SE de tres experimentos independientes realizados por triplicado. *P < 0.01, significativamente diferente del control. 6. Trifolín acetato activa la vía MAPKs. La vía de las MAPKs actúa como mediadora de una serie de señales que promueven o inhiben el crecimiento de células leucémicas. Las quinasas ERK, JNK y p38 juegan un importante papel en el crecimiento y la proliferación celular, la diferenciación y la apoptosis. Por lo tanto estudiamos el efecto del TA sobre la activación de estas proteínas (Figura 13A). Los resultados muestran que se produjo una fosforilación rápida (<15 min) de ERK1/2, JNK y p38MAPK en células HL-60 y U937. La fosforilación de ERK1/2 y JNK permaneció elevada en ambas líneas celulares durante al menos 6 horas, mientras la activación de p38 disminuyó a partir de las 4 horas en células HL-60, pero no en células U937. El tratamiento de las células 0 5 10 15 20 Control Células apoptóticas (%) TA * Control TA HL-60/neo HL-60/Bcl-x L U937 U937/Bcl-2 * 10 1 10 2 10 3 10 1 10 2 10 3 10 1 10 2 10 3 FL1-H FL2-H 10 1 10 2 10 3 Control TA CCCP 80,4%84,3%2,0% 78,9% 8,3%6,8% A B 87 RESULTADOS HL-60 y U937 con TA produjo una activación de ERK1/2, JNK y p38, siguiendo cinéticas similares. Figura 13. Papel de la vía de las MAPKs en la apoptosis inducida por TA en células HL-60. (A) TA induce la fosforilación dependiente del tiempo de ERK 1/2, JNK y p38. Las células se trataron con TA a los tiempos indicados y los extractos de proteínas se analizaron mediante inmunoblot utilizando anticuerpos específicos para determinar la fosforilación de las diferentes MAPKs. β-actina fue utilizada como control de carga. (B) Las células se preincubaron con U0126 (10 µM), SP600125 (10 µM) y SB203580 (2 µM) durante 1 h y se trataron posteriormente con TA. El porcentaje de células apoptóticas se cuantificó mediante citometria de flujo. Los valores representan las medias ± SE de tres experimentos realizados por triplicado. *P < 0,05, significativamente diferentes del control. #P< 0,05, significativamente diferentes del tratamiento con TA solo. 88 RESULTADOS Para determinar si la fosforilación de las MAPKs juega un papel importante en la apoptosis inducida por TA, examinamos el efecto de los inhibidores específicos de cada una de las MAPKs en células HL-60 (Figura 13B). El tratamiento con U0126 (10 µM), un inhibidor específico de la quinasa reguladora MEK1/2 que bloquea la activación de ERK1/2, redujo parcialmente la apoptosis inducida por TA, lo cual sugiere que ERK1/2 está implicado en la citotoxicidad inducida por TA. En contraste con estos resultados, existen estudios previos que demuestran los efectos sinérgicos entre diferentes agentes quimioterápicos y fármacos que inhiben la activación de MAPKs, inhibiendo el crecimiento e induciendo apoptosis en células leucémicas [163,164]. Además, mediante experimentos llevados a cabo en nuestro laboratorio, se ha demostrado que los inhibidores específicos de ERK1/2 pueden aumentar la sensibilidad de las células leucémicas frente a la apoptosis inducida por el tetraacetato de 3metil-éter de quercetina [155]. La inhibición farmacológica de p38 usando el inhibidor SB203580 disminuyó la muerte celular inducida por el TA desde un 30% hasta un 15%, sugiriendo que la activación de p38 puede estar implicada en la apoptosis inducida por TA. El pretratamiento de células HL-60 con SP600125, inhibidor específico de JNK, parece exhibir efectos sinérgicos con la apoptosis desencadenada por el TA. Este resultado es sorprendente, ya que la vía de JNK ha sido descrito que es activada por varios agentes quimioterápicos que inducen apoptosis y son utilizados habitualmente en el tratamiento de la leucemia aguda [165,166]. Este resultado sugiere que la inhibición de la vía de JNK podría sensibilizar las células tumorales al TA. 7. Las especies reactivas de oxígeno no están involucradas en la muerte celular inducida por el trifolín acetato. Dado que las especies reactivas de oxígeno (ROS) pueden dar lugar a la activación de las MAPKs y provocar la muerte celular [167,168,169,170], estudiamos su implicación en la apoptosis inducida por TA mediante el uso de la sonda fluorescente diacetato 2´,7´-diclorodihidro-fluoresceína (H2-DCF-DA). Los resultados demuestran que el trifolín acetato induce generación de ROS después de 1 h de tratamiento (Figura 14A). Para determinar si la generación de ROS está implicada en la muerte celular inducida por TA se estudió el efecto de los siguientes antioxidantes: ácido ascórbico (vitamina C, 100 µM), el precursor de glutatión N-acetil-L-cisteína (NAC, 10 mM), α-tocoferol (vitamina E, 25 µM), el 89 RESULTADOS derivado hidrosoluble de la vitamina E trolox (2 mM), el inhibidor de xantina oxidasa alopurinol (100 µM) y la superóxido dismutasa (SOD, 400 unidades/ml). Ninguno de estos antioxidantes fue capaz de bloquear la muerte celular, indicando que la apoptosis inducida por el TA es independiente de la producción de ROS (Figura 14B). Figura 14. TA induce la generación de ROS en células HL-60. (A) Las células se incubaron durante 1 h en presencia de TA y la fluorescencia obtenida por la oxidación de H2-DCF-DA fue determinada mediante citometria de flujo. (B) Las células se pretrataron con ácido ascórbico (vitamina C, 100 µM), el precursor de glutatión N-acetil-L-cisteína (NAC, 10 mM), α-tocoferol (vitamina E, 25 µM), trolox (2 mM), alopurinol (100 µM) y superóxido dismutasa (SOD, 400 unidades/ml) durante 1 h y luego tratadas con TA (10 µM, 24 h). Las células también fueron incubadas con cada inhibidor en ausencia de TA. El porcentaje de células apoptóticas se evaluó mediante citometría de flujo. Los valores representan la media ± SE de tres experimentos independientes realizados por triplicado. 90 RESULTADOS 8. THDF inhibe la viabilidad de células tumorales humanas y no presenta citotoxicidad frente a linfocitos normales. De todos los compuestos estudiados, la 3´,5,7-trihidroxi-3,4´-dimetoxiflavona (THDF) resultó ser el más citotóxico. Estudiamos su efecto sobre el crecimiento de nueve líneas celulares tumorales humanas (Figura 15) y observamos que presenta actividad citotóxica frente a todas ellas (Tabla 3). Figura 15. Estructura química del THDF. Las líneas celulares tumorales mieloides de origen humano (HL-60 y U937) y linfoides (Jurkat y Molt-3), junto con las líneas celulares que sobreexpresan las proteínas Bcl-2 (U937/Bcl-2) y Bcl-xL (HL-60/Bcl-xL) son altamente sensibles al efecto citotóxico del THDF, mientras que las células de adenocarcinoma humano A549 (IC50= 10,8 ± 2,4 μM) y las células de melanoma humano SK-MEL-1 (IC50= 13,9 ± 2,5 μM) son las más resistentes (Figura 16A). Como experimento control usamos células mononucleares de sangre periférica (PBMC) quiescentes, que se encuentran en un estado G0. Además usamos PBMC cultivados en presencia de fitohemaglutinina (PHA) que actúa como mitógeno induciendo una respuesta proliferativa en los linfocitos [171]. Los resultados nos indican que el THDF no es citotóxico Tabla 3. Efecto del THDF sobre la proliferación de células tumorales humanas. IC50 (µM) HL-60 HL-60/neo HL-60/Bcl-x L U937 U937/Bcl-2 Jurkat Molt-3 SK-MEL-1 A549 0,3 ± 0,02 0,59 ± 0,02 3,0 ± 1,2 1,4 ± 0,5 4,3 ± 1,7 0,43 ± 0,05 0,27 ± 0,01 13,9 ± 2,5 10,8 ± 2,4 Las células fueron cultivadas durante 72 h y los valores de IC 50 se calcularon como se describe en la sección de material y métodos. Los datos representan la media ± S.E.M. de 3-5 experimentos independientes con tres determinaciones en cada uno. 91 RESULTADOS hasta una concentración de 10 μM durante 24 h en los linfocit os quiescentes, mientras que concentraciones superiores a 3 μM inhiben el crecimiento de los linfocitos que proliferan (Figura 16B). Figura 16. (A) Efecto del THDF sobre la viabilidad de las células HL-60 y SK-MEL-1. Las células se trataron con las concentraciones de THDF indicadas durante 72 h y la viabilidad celular fue determinada por el ensayo del MTT, tal como se describe en la sección de material y métodos. Se muestran los valores de un experimento representativo en el que cada punto representa la media de tres determinaciones. (B) Efecto del THDF sobre la proliferación de células mononucleares humanas de sangre periférica. Se cultivaron células quiescentes PBMC y células PBMC activadas con fitohemaglutinina (+PHA) en presencia de las concentraciones indicadas de THDF durante 24 h. Los valores representan la media ± SE de dos experimentos independientes realizados por triplicado. *P < 0,05 significativamente diferente al control. 9. THDF induce apoptosis en células de leucemia mieloide humana. Para evaluar si la apoptosis está implicada en el efecto citotóxico inducido por el THDF en las células de leucemia mieloide humana HL-60 y U937, utilizamos una serie de métodos complementarios. El análisis mediante citometría de flujo revela que ambas líneas celulares sufren apoptosis (Figura 17). El porcentaje de células hipodiploides (fracción SubG1) aumentó en las células THDF (μM) 0 25 50 75 100 10 10 100 Viabilidad celular (%) 0.1 HL-60 SK-MEL-1 A B THDF (μM) Viabilidad celular (%) 00.3 1 3 0 25 50 75 100 PBMC PBMC (+PHA) 10 ** THDF (μM) 0 25 50 75 100 10 10 100 Viabilidad celular (%) 0.1 HL-60 SK-MEL-1 A B THDF (μM) Viabilidad celular (%) 00.3 1 3 0 25 50 75 100 PBMC PBMC (+PHA) 10 THDF (μM) 0 25 50 75 100 10 10 100 Viabilidad celular (%) 0.1 HL-60 SK-MEL-1 A B THDF (μM) Viabilidad celular (%) 00.3 1 3 0 25 50 75 100 PBMC PBMC (+PHA) 10 THDF (μM) Viabilidad celular (%) 00.3 1 3 0 25 50 75 100 PBMC PBMC (+PHA) 10 ** 92 RESULTADOS HL-60 y U937, desde un 4,4% y un 3,2% hasta un 21,5% y 27,6%, respectivamente, después del tratamiento con 3µM de THDF durante 24 h. Figura 17. Evaluación mediante citometría de flujo del efecto del THDF sobre la inducción de apoptosis en células HL-60 y U937. Las células fueron tratadas con las concentraciones indicadas de THDF durante 24 h, y analizadas usando ioduro de propidio. La región marcada con una flecha indica las células hipodiploides (% de células apoptóticas). El análisis del ADN por electroforesis en gel de agarosa, muestra un patrón de fragmentación típico (hidrólisis de cromatina internucleosómica) en las células tratadas con THDF, confirmando el efecto sobre la inducción de la apoptosis en ambas líneas celulares (Figura 18ª). Mediante microscopía de fluorescencia (Figura 18B) detectamos cambios morfológicos característicos de las células apoptóticas (condensación y fragmentación de la cromatina). El THDF provoca la externalización de fosfatidilserina desde la cara interna de la membrana plasmática, evaluado mediante citometría de flujo con tinción con Anexina-V en ambas líneas celulares (Figura 19A). Por último, mediante microscopía electrónica de transmisión visualizamos con mayor detalle los cambios que se producen en una célula apoptótica. En la Figura 19B podemos ver la fragmentación y condensación nuclear acompañada de una densa condensación perinuclear y la abundancia de vacuolas en las células tratadas con THDF. Contenido en ADN (→) Nº de células (→) Control 0,3 μM THDF 1 μM THDF 3 μM THDF 4,4% 2,3% 16,9% 21,5% 3,2% 27,6%17,9%4,6% U937 HL-60 Contenido en ADN (→) Nº de células (→) Control 0,3 μM THDF 1 μM THDF 3 μM THDF 4,4% 2,3% 16,9% 21,5% 3,2%3,2% 27,6%27,6%17,9%17,9%4,6%4,6% U937 HL-60 99 RESULTADOS de ERK1/2 fosforilada aumentaron de nuevo y se mantuvieron por lo menos durante 6 h (Figura 22A). Estos resultados indican que la vía de ERK1/2 se activa rápidamente en respuesta al tratamiento con THDF en las células HL-60 y que la activación ocurre de forma bifásica. El THDF induce la activación de JNK, p38 y ERK1/2 siguiendo diferentes cinéticas. Para establecer si la fosforilación de las MAPKs juega un papel fundamental en la apoptosis inducida por este compuesto, examinamos los efectos de una serie de inhibidores específicos. Figura 22. (A) THDF induce la fosforilación de las MAPKs. Las células HL-60 y U937 se trataron con THDF (10 µM) a los tiempos indicados y los extractos de proteínas se analizaron mediante western blot usando anticuerpos específicos para determinar la fosforilación de las diferentes MAPKs. Las membranas se analizaron también con anticuerpos de ERK1/2, JNK y p38 total, como control de carga. (B) Impacto de los inhibidores de las MAPKs en la apoptosis inducida por THDF. Las células fueron preincubadas con SP600125 (SP, 10 µM), PD98059 (PD, 10 µM), U0126 (U0, 10 µM) y SB203580 (SB, 2 µM) durante 1 h y luego fueron tratadas con THDF (3 µM, 24 h). La apoptosis se cuantificó por citometría de flujo, y las barras representan la media ± SE de tres experimentos independientes cada uno de ellos realizado por triplicado. *P < 0,05, significativamente diferente del control sin tratar. #P < 0,05, significativamente diferente del tratamiento con THDF solo. A 38 kDa 38 kDa 57 kDa 46 kDa 42-44 kDa 42-44 kDa 57 kDa 46 kDa Tiempo p38 JNK P-JNK ERK1/2 P-ERK1/2 P-p38 4h15´30´1h 2h 0 6h HL-60 U937 4h15´30´1h 2h 0 6h 42 kDa β-actina B SP PD U0 SB C THDF + THDF 0 10 20 30 Célulashipodiploides(%) HL-60 SP SB C THDF + THDF U937 # # # # 100 RESULTADOS El pretratamiento de células HL-60 y U937 con SB203580 (2 μM) no altera significativamente el porcentaje de apoptosis inducido por THDF (Figura 22B), lo cual sugiere que la activación de p38MAPK no está involucrada en la apoptosis inducida por THDF. Sin embargo, el pretratamiento con el inhibidor específico de JNK SP600125 (10 μM) bloqueó parcialmente la apoptosis inducida por THDF en ambas líneas celulares. Finalmente estudiamos el impacto de ERK1/2 en la muerte celular inducida por THDF en las células HL-60 usando los inhibidores específicos de la quinasa extracelular activada por mitógenos 1/2 (MEK1/2) y observamos que tanto PD98059 como U0126 atenúan los niveles de muerte celular inducida por THDF (Figura 22B). 15. THDF aumenta los niveles de las especies reactivas de oxígeno intracelulares. La producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) es considerada como uno de los mediadores claves en la apoptosis inducida por la mayoría de los agentes antitumorales. Evaluamos entonces la generación de estas especies químicas en células HL-60 mediante el uso de la sonda fluorescente sensible a la oxidación diacetato 2´,7´-dicloro-dihidrofluoresceína (H2-DCF-DA). Los resultados muestran una rápida generación de ROS a los 15 min de tratamiento con THDF (resultados no mostrados), aunque los niveles más altos (~2,2 veces los niveles del control) se alcanzaron tras 1 h de tratamiento (Figura 23). Para determinar si la generación de ROS es esencial en la apoptosis inducida por THDF pretratamos las células con diferentes antioxidantes: trolox (2 mM), NAC (10 mM), vitamina E (25 µM), alopurinol (100 µM), ácido ascórbico (100 µM) y las enzimas degradantes de ROS catalasa (400 unidades/ml) y superóxido dismutasa (400 unidades/ml). El trolox fue el único antioxidante capaz de disminuir la generación de ROS, pero no evitó la muerte celular (Figuras 23B y 23C). En conjunto, estos resultados sugieren que la apoptosis inducida por THDF es independiente de la producción de ROS. 16. THDF induce parada del ciclo celular en fase M. Fijándonos en el análisis por citometría de flujo (ver Figura 17), podemos ver que THDF acumula células en la fase G2-M del ciclo celular, a expensas de un descenso en la cantidad de células en fase G1. Al tratar las células HL-60 y U937 con una dosis de 3 µM de THDF y observando lo que pasa a lo largo del tiempo (Tabla 4), vemos que este efecto se produce ya a las 6-12 h de tratamiento en ambas líneas celulares. 101 RESULTADOS Figura 23. ROS no está involucrado en la muerte celular inducida por THDF. (A) Las células HL-60 se incubaron durante 1 h en presencia de 10 µM THDF y la fluorescencia obtenida por la oxidación de H2-DCF-DA se determinó mediante citometria de flujo. Resultados similares se obtuvieron en tres experimentos independientes. (B) Las células se preincubaron con trolox (2 mM) durante 1 h y posteriormente incubadas con THDF (10 µM) durante 1 h. Los niveles de ROS se determinaron mediante citometría de flujo usando la sonda H2-DCF-DA. (C) Las células se pretrataron con trolox y tratadas con THDF (3 µM) durante 24 h, la apoptosis se determinó mediante citometria de flujo. Los valores representan la media ± S.E. de tres experimentos independientes realizados por triplicado. *P < 0,05, significativamente diferente del control. #P < 0,05, significativamente diferente del tratamiento con THDF solo. En HL-60 el porcentaje de células en fase G2-M aumenta desde un ~ 25% (control), hasta un ~ 44% después del tratamiento con THDF durante 12 h. Mientras que el porcentaje de células hipodiploides (fracción SubG1) se multiplica por 5 en las células tratadas con 3 µM de THDF en comparación con las células control tras 24 h (Figura 17). A 64 48 32 16 10 3 10 2 10 1 10 0 0 FL1-H Control Nº de células THDF 102 RESULTADOS Tabla 4. Efecto del THDF sobre las diferentes fases del ciclo celular en HL-60 y U937. Las células se incubaron con THDF (3 µM) a los periodos de tiempo mencionados y la distribución en cada fase del ciclo celular se determinó por citometría de flujo. Los valores representan la media ± S.E. de dos experimentos independientes. Los asteriscos indican una diferencia significativa (*P < 0,05) en comparación con los controles correspondientes. En las células U937 la acumulación de células en fase G2-M se mantiene hasta las 24 h y los niveles máximos de apoptosis (aproximadamente 5 veces con respecto al control) se pueden observar a las 12 h de tratamiento (Tabla 4). Para determinar si las células HL-60 se acumulan en la fase M, sincronizamos las células tratándolas con nocodazol (100 ng/ml) durante 24 h. De este modo se obtiene una población rica en células en fase M (aproximadamente el 90%). Luego, liberamos las células del bloqueo en fase M, lavando con RPMI y resuspendiendo las células en nuevo medio de cultivo con o sin THDF (3 µM). El análisis mediante citometría de flujo indica que las células tratadas con THDF no son capaces de continuar el ciclo celular (Figura 24), lo cual sugiere que el THDF bloquea las células en fase M. Para confirmar estos resultados, cultivamos las células HL-60 y U937 con 3 µM de THDF durante 6, 12 y 24 h y el porcentaje de células en mitosis lo cuantificamos mediante microscopía de fluorescencia, tras realizar una tinción con Hoechst 33258 (Figura 25). % SubG1 % G1 % S % G2-M HL-60 6h Control 5,7 ± 0,6 40,6 ± 2,4 21,6 ± 0,8 33,3 ± 3,6 THDF 6,3 ± 2,2* 28,4 ± 4,5* 23,1 ± 2,2 42,8 ± 4,8* 12h Control 4,3 ± 1,5 46,6 ± 3,3 24,9 ± 2,6 25,1 ± 3,1 THDF 11,3 ± 3,4* 22,5 ± 2,5* 16,5 ± 5,1 44,3 ± 0,5* 24h Control 4,4 ± 1,8 46,8 ± 3,1 23,9 ± 2,3 25,4 ± 2,9 THDF 21,5 ± 3,8* 30,6 ± 1,7* 17,8 ± 3,9* 26,5 ± 1,0* U937 6h Control 4,9 ± 1,9 48,8 ± 3,6 20,4 ± 1,5 24,1 ± 4,6 THDF 5,0 ± 1,3 36,5 ± 2,1* 22,6 ± 0,8 33,4 ± 5,3* 12h Control 4,8 ± 1,1 51,8 ± 5,2 20,3 ± 2,5 22,4 ± 3,0 THDF 23,6 ± 4,8* 20,5 ± 5,5* 10,1 ± 3,6 38,6 ± 8,7* 24h Control 5,4 ± 1,5 51,3 ± 3,6 19,7 ± 2,4 22,6 ± 2,1 THDF 21,4 ± 0,6* 20,9 ± 0,6* 14,6 ± 4,6 35,8 ± 3,2* 103 RESULTADOS Figura 24. Distribución del ciclo celular durante la incubación en presencia o ausencia de THDF en células HL-60 previamente sincronizadas en fase M. Las células fueron sincronizadas en mitosis mediante tratamiento con nocodazol (100 ng/ml) durante 24 h, se lavaron con medio de cultivo y se incubaron con 0,03% DMSO o 3 µM de THDF a los tiempos indicados. El análisis del ciclo celular fue determinado mediante citometría de flujo. El porcentaje de células HL-60 en mitosis aumentó desde un 7 ± 3,1 % (control) hasta un 26,0 ± 5,7 % (∼4 veces) y un 25,5 ± 10 % (3,6 veces) al tratarlas con THDF durante 6 y 12 h, respectivamente. En las células U937, el porcentaje de células en mitosis aumentó desde un 3,6 ± 0,6 % (control) hasta un 27,0 ± 4,0 % (∼8 veces) y 42,0 ± 6,2 % (∼12 veces) después de 6 y 12 h de tratamiento con THDF, respectivamente. Figura 25. THDF induce parada en mitosis. (A) Las células HL-60 y U937 fueron cultivadas en presencia de 3 µM de THDF a los tiempos indicados. El porcentaje de células normales, mitóticas y apoptóticas fue analizado mediante microscopía de fluorescencia usando Hoechst 33258, y los porcentajes se calcularon después de contar 500 células. Los datos representan la media de los valores obtenidos de tres experimentos independientes y las barras representan las desviaciones estándar. THDF (-) THDF (+) 3h 6h 9h 12h 24h 3h 6h 9h 12h 24h 0h 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Control 6h 12h 24h % c e l u l a s Tiempo (h.) Células normales Células mitoticas Células apoptóticas HL-60 Tiempo (h) 6 12 U937 240 6 12 240 Tiempo (h) Células(%) Normales Mitóticas Apoptóticas 104 RESULTADOS P-CiclinaB1 MPM2 HL-60 U937 HL-60 U937 65kDa Cdk1 P-Cdk1 P-Cdc25c Cdc25c CiclinaB1 p21 48kDa 92kDa 36kDa 80kDa 56kDa 21kDa 32kDa 04 6 2412 THDF (μM) 00,3 1103 Tiempo (h) 04 6 2412 30 00,3 110330 Tubulinasoluble 50kDa 17. Efectos del THDF sobre la expresión y fosforilación de las proteínas reguladoras de la fase M. Teniendo en cuenta que THDF inhibe la proliferación de las células de leucemia HL-60 y U937 induciendo parada del ciclo celular en fase M, estudiamos la expresión de las proteínas reguladoras de esta fase del ciclo celular. Mediante western blot (Figura 26) podemos observar que los niveles de ciclina B1, fosfociclina B1 (fosfo S126) y el inhibidor de CDK p21 aumentaron en las células HL-60 después de 4 h de tratamiento con 3 µM de THDF mientras que en U937 los niveles de ciclina B1 y fosfo-ciclina B1 aumentaron a partir de las 6 h. El efecto del THDF sobre la expresión y fosforilación de ciclina B1 es dependiente de la concentración. El aumento de la expresión de p21 tras el tratamiento de las células HL-60 y U937 con THDF, concuerda perfectamente con el hecho, demostrado previamente (Figura 25), de que THDF activa la vía MEK 1/2 / ERK 1/2, ya que la transcripción de p21 es ERK 1/2 dependiente [13]. Figura 26. Efecto del THDF sobre la expresión de las proteínas que regulan el ciclo celular. Las células HL-60 y U937 se incubaron en presencia de THDF durante 24 h utilizando las concentraciones indicadas, y con 3 µM de THDF a los tiempos indicados. Se recolectaron las células y los lisados totales se analizaron mediante western blot. Se muestran los resultados de un experimento representativo. Se usó α-tubulina como control positivo. 105 RESULTADOS La disminución de los niveles de Cdc25c es consistente con el aumento de la fosforilación de esta proteína, que podemos detectar usando un anticuerpo específico fosfo-Cdc25c (Thr48). La activación de CDK1 se controla en diferentes etapas, incluyendo la unión de ciclinas y la fosforilación de la treonina 161. No obstante, un paso crítico en la activación de CDK1 durante la mitosis es la desfosforilación de T14 e Y15, función que desempeña la fosfatasa de actividad dual Cdc25c. Al usar un anticuerpo que reconoce la forma fosforilada de la CDK1 (pTpY 14/15), demostramos que THDF induce desfosforilación en ambas líneas celulares y consecuentemente activación de CDK1 (Figura 26). El uso del anticuerpo MPM-2 nos permite evaluar el estado de polipéptidos fosforilados que sólo se encuentran en las células mitóticas. Este anticuerpo reconoce un epítopo (ST/T)P que aparece en fosfoproteínas como MAP2, HSP70, Cdc25c y ADN topoisomerasa IIα, la mayoría de las cuales se fosforilan en la mitosis. Los experimentos dependientes del tiempo muestran un aumento de las proteínas MPM-2 a partir de las 4 h y 6 h en las células HL-60 y U937, respectivamente. Mientras que después de 24 h de tratamiento con THDF, podemos observar un aumento significativo de los niveles de MPM-2 a partir de una concentración de 1 µM en ambas líneas celulares. 18. THDF desestabiliza la polimerización de los microtúbulos. Ya que THDF produce una acumulación de células en la fase M del ciclo celular, estudiamos si este compuesto afecta a la polimerización de tubulina en células HL-60 y U937. El análisis mediante western blot nos muestra que una baja concentración de THDF (3 µM) es suficiente para inhibir la polimerización de tubulina en ambas líneas celulares (Figura 27A). Como controles positivos de la inhibición y estimulación de la polimerización de tubulina utilizamos colchicina y paclitaxel, respectivamente. Además, examinamos el efecto del THDF sobre la red de microtúbulos celular mediante inmunofluorescencia. Como se observa en la Figura 27B, el tratamiento con 3 µM de THDF provoca una disminución de la red de microtúbulos similar a la inducida por la colchicina, mientras que el paclitaxel aumenta la densidad de los microtúbulos. 19. THDF inhibe la polimerización de la tubulina in vitro. Estudiamos el efecto del THDF sobre la formación de los microtúbulos evaluando la polimerización de la tubulina in vitro mediante los cambios en la absorbancia de la mezcla de 106 RESULTADOS reacción. Los resultados indican que THDF inhibe la polimerización de tubulina y que es dependiente de la concentración de compuesto utilizado (Figura 28A). Este resultado indica que la actividad biológica del THDF es debida al menos en parte a su interacción con la tubulina. Figura 27. THDF inhibe la polimerización de la tubulina en células HL-60 y U937. Las células fueron incubadas en ausencia o presencia de 3 µM de THDF a los tiempos indicados, colchicina (50 nM) o paclitaxel (100 nM) durante 24 h. (A) Las células fueron lisadas y los microtúbulos polimerizados se separaron de los dímeros de tubulina mediante centrifugación. Se detectó la α-tubulina mediante western blot. (B) Las células se recolectaron y se fijaron, para ser incubadas con el anticuerpo monoclonal anti-α-tubulina a temperatura ambiente durante 2 h y posteriormente con un anticuerpo secundario conjugado con Cy2TM. La red de microtúbulos celular se analizó usando un microscopio fluorescente Zeiss. Las microfotografías son representativas de tres experimentos independientes. Colchicina y paclitaxel fueron utilizados como controles positivos, como agentes despolimerizante y polimerizante de microtúbulos, respectivamente. HL-60 U937 Tubulina soluble Tubulina insoluble Tiempo(h) Pac6 12 24 Col0 A 50 kDa 50 kDa Tiempo(h) Pac6 12 24 Col0 U937 HL-60 Tiempo(h) Pac6 12 24 Col0 B 107 RESULTADOS Figura 28. (A) THDF inhibe la polimerización de la tubulina “in vitro”. Tubulina purificada se incubó en el tampón de reacción a 37 ºC en ausencia (control) o en presencia de paclitaxel (10 µM), colchicina (5 µM) o diferentes concentraciones de THDF (3-10 µM). El aumento de absorbancia a 340 nm se midió en un lector de microplacas (DTX 880 Multimode Reader, Beckman Coulter). (B) Ensayo de competición entre [3H]-colchicina y THDF por la unión a la tubulina. Se muestran los valores de un experimento representativo en el que cada punto representa la media de tres determinaciones. -0,05 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 1 21 41 61 81 Absorbancia (340nm) Tiempo (min) 10 µM Paclitaxel Control 3 µM THDF 10 µM THDF 5 µM Colchicina A 20 40 60 80 B 108 RESULTADOS 20. THDF se une específicamente al sitio de unión de la colchicina. En un intento de precisar el sitio de acción del THDF, evaluamos su capacidad de competir con la unión de la [3H]-colchicina a la tubulina. Como podemos observar en la Figura 28B, THDF inhibió la unión de la colchicina a la tubulina de forma dosis dependiente, con una IC50 de aproximadamente 40 µM. 21. THDF induce la generación de ceramidas y la activación de SMasa. Evaluamos la capacidad de este compuesto de inducir cambios en los niveles de ceramida endógena en las células de leucemia humana HL-60. El ensayo de la diacilglicerol quinasa es un método ampliamente utilizado para estimar el contenido de ceramidas en los extractos lipídicos. Para ello, tratamos las células con 3 µM de THDF durante diferentes tiempos y cuantificamos la cantidad de ceramidas. Cualquier aumento de ceramidas en los extractos lipídicos sería indicativo de la producción celular de ceramidas. Como podemos observar (Figura 29A), THDF indujo un aumento significativo en la concentración de ceramidas intracelulares a partir de las 2 h de tratamiento que permaneció elevado por lo menos hasta las 24 h. Para evaluar si la acumulación de ceramidas se produce, por lo menos en parte, en la mitocondria, tratamos las células HL-60 con THDF, y determinamos los niveles de ceramidas en la fracción mitocondrial. Como observamos en la Figura 29B, los niveles de ceramidas de la fracción mitocondrial de las células tratadas con THDF fue significativamente mayor que el de las células control. Además, evaluamos la implicación de las esfingomielinasas (SMasas), tanto la SMasa ácida como la neutra están implicadas en la generación de ceramidas en respuesta al estrés. Tratamos las células HL-60 con 3 µM de THDF durante diferentes períodos de tiempo y analizamos los lisados libres de núcleos a pH 5,0 ó 7,4 para determinar la actividad esfingomielinasa ácida (A-SMasa) y la actividad esfingomielinasa neutra (N-SMasa), respectivamente. Como se muestra en la Figura 29C, los resultados revelan que el THDF induce activación de A-SMasa a partir de las 2 h de tratamiento, que continúa aumentando hasta las 24 h. En cambio no detectamos cambios en la actividad N-SMasa en el mismo marco de tiempo aunque sí con TNFα utilizado como control positivo. 116 DISCUSIÓN z-YVAD-fmk, lo que sugiere que la caspasa-1 está involucrada en la supervivencia de las células estimuladas con el TA. Existen estudios que demuestran que la caspasa-1 promueve la supervivencia celular mediante un mecanismo en el que están implicadas las proteínas de unión a elementos que regulan el esterol (SREBPs) y la biogénesis lipídica. La inhibición selectiva de la caspasa-1 con zYVAD-fmk o mediante ARN de interferencia aumentó la muerte celular en respuesta a toxinas formadoras de poros [192]. Por lo tanto, sería un interesante objeto de estudio la implicación de la caspasa-1 en la biogénesis lipídica en células tratadas con TA. Tal y como esperábamos, las procaspasas -3 y -6 se hidrolizan dando lugar a las formas activas de las enzimas en respuesta al TA. También se induce la hidrólisis de la proteína nuclear PARP, reconocido sustrato de caspasa-3 que está implicado en la reparación del ADN y que es importante en el mantenimiento de la viabilidad celular [193,194,195]. Puesto que la hidrólisis de PARP garantiza el desensamblaje celular, este parece ser un elemento regulador clave en la apoptosis inducida por el TA [195]. La mitocondria juega un papel clave en la muerte celular cuando su membrana externa se permeabiliza [196], y los miembros de la familia Bcl-2 regulan la permeabilización de la membrana mitocondrial externa que constituye un punto de regulación crítica en la vía intrínseca de la apoptosis [197]. Los resultados demuestran que el TA induce la redistribución de citocromo c al citosol que podemos detectar a las 6 h de tratamiento. No obstante, este evento temprano no está asociado con una pérdida en el ∆Ψm, ya que no detectamos cambios por lo menos en las primeras 24 h de tratamiento. En este aspecto, estudios previos han demostrado que los cambios en el ∆Ψm no son imprescindibles para que se produzca la liberación de citocromo c desde la membrana mitocondrial externa [198]. La activación de Bax y/o Bak puede conducir a la formación de poros en la membrana mitocondrial externa [199]. Para profundizar en el estudio del papel de la mitocondria en la acción citotóxica del TA, utilizamos células HL-60 y U937 que sobreexpresan proteínas anti-apoptóticas. Las células HL-60/Bcl-xL y U937/Bcl-2 resultaron ser completamente resistentes al compararlas con las líneas celulares parentales, lo cual sugiere que la mitocondria desempeña un papel central en la muerte celular inducida por el TA. 117 DISCUSIÓN En conjunto, nuestros resultados indican que el TA induce apoptosis por un mecanismo que implica la vía mitocondrial y que la caspasa-6 parece activarse antes que la caspasa-9. Las MAP quinasas forman parte fundamental de la maquinaria de transducción de señales y desempeñan un papel esencial en el crecimiento celular, la diferenciación y la muerte celular. Aunque JNK está asociado con acciones pro-apoptóticas [112] y con señales que inhiben el crecimiento [114], hemos demostrado que el TA induce la activación de JNK y que la utilización del inhibidor SP600125, para suprimir su actividad, aumenta la apoptosis. Estudios previos han demostrado que el efecto pro-apoptótico del inhibidor de la histona deacetilasa D1 aumenta en presencia de SP600125 en líneas celulares de leucemia mieloide humana aguda [200]. Evidencias adicionales de que JNK pueda actuar como señal de supervivencia las podemos encontrar en células de carcinoma hepático [115] y en líneas celulares de cáncer gástrico y colorrectal [116]. La muerte celular en algunas líneas celulares está directamente asociada con la activación de p38, aunque también se ha descrito que esta proteína promueve la supervivencia, el crecimiento celular y la diferenciación. Así pues, el papel de p38 en la apoptosis depende de la línea celular y del estímulo [121]. La p38 parece estar implicada en la activación de la apoptosis inducida por el TA ya que el inhibidor específico SB203580 atenua la muerte celular. La activación de p38 es también necesaria para la apoptosis inducida por cadmio y en la isquemia [122,123,124,125]. Nuestros datos, también indican que el inhibidor U0126 atenua el efecto apoptótico del TA, sugiriendo que ERK1/2 está implicado en la señalización de la muerte celular. Resultados similares han sido descritos por otros autores con la quercetina en células A549 [106]. Además, la supresión de la vía de señalización MEK-ERK utilizando el inhibidor PD98059 produjo un aumento de la resistencia al cisplatino en células de carcinoma cervical humano SiHa y en células de hepatoblastoma HepG2 [107]. Además, la acroleína, un aldehído α,β - insaturado altamente reactivo generado por peroxidación lipídica, induce fosforilación de ERK mientras que la inhibición de su actividad con PD98059 y U0126 bloquea la apoptosis inducida por la acroleína [201]. A modo de comparación, el tetraacetato de 3-metil éter de quercetina, compuesto químicamente muy similar al TA, aumenta la activación de la vía MEK/ERK [155] y los inhibidores de ERK potencian los efectos apoptóticos del tetraacetato de 3-metil éter de quercetina. Esto demuestra que compuestos estructuralmente muy similares pueden activar diferentes vías de señalización en el mismo modelo celular. 118 DISCUSIÓN La producción de ROS en células de leucemia, podría ser la causa de la activación de las MAPKs [167,168,169]. Aunque la generación de ROS intracelular es evidente con tan sólo 1 h de tratamiento con TA, no parece estar implicada en la apoptosis inducida por el TA, ya que diferentes antioxidantes fueron incapaces de proteger a las células. 5,7,3´-TRIHIDROXI-3,4´-DIMETOXIFLAVONA En este estudio hemos seleccionado, además, un análogo del 3-metil éter de quercetina, THDF, que contiene un grupo metoxilo adicional en la posición 4´ del núcleo fenilbenzo-γpirona y hemos evaluado su actividad citotóxica en nueve líneas celulares tumorales. Los resultados claramente demuestran que el THDF presenta propiedades citotóxicas frente a todas las líneas celulares ensayadas, pero con diferente intensidad. Las células de leucemia humana (HL-60, U937, Molt-3 and Jurkat) fueron las más sensibles, mientras que las células SK-MEL-1 y A549 presentaron una resistencia. La realización de experimentos con linfocitos humanos quiescentes (PBMC) nos reveló que son más resistentes al THDF que los linfocitos humanos proliferantes, tratados con fitohemaglutinina. El análisis del ciclo celular nos demuestra que la inhibición de la viabilidad celular inducida por el THDF está asociada con una significante acumulación de células en la fase G2-M, y con un aumento en la fracción SubG1 y externalización de fosfatidilserina, características de la muerte celular por apoptosis. Estos resultados son similares a los obtenidos recientemente con el derivado semisintético tetraacetato de 3-metil éter de quercetina en células de leucemia humana [155], ambos compuestos inducen apoptosis y parada del ciclo celular en fase G2-M, pero es interesante destacar que la potencia del THDF es significativamente mayor. Nuestros resultados, además, revelan que el efecto antiproliferativo inducido por el THDF es dependiente de la activación de caspasas, ya que la muerte celular puede ser inhibida por el inhibidor general de caspasas z-VAD-fmk. Además, el THDF inicia la redistribución del citocromo c al citosol, que se correlacionará con la disipación del ∆Ψm y con la activación de caspasa -9 y caspasa -3, enfatizando que la vía intrínseca juega un papel muy importante en la muerte celular. El THDF también estimula el procesamiento proteolítico y consecuentemente la activación de otras caspasas ejecutoras, como la caspasa-7 y la caspasa-6, así como la disminución de los niveles citosólicos de Bax. Sin embargo, los niveles de Bcl-2 permanecen inalterados en la mitocondria y en el citosol. 119 DISCUSIÓN En conjunto, parece que el mecanismo citotóxico inducido por el THDF es claramente diferente al causado por otras fenilbenzo-γ-pironas estudiadas previamente, como el 3-metil éter de betuletol que induce apoptosis en células HL-60 a través de un mecanismo dependiente de la activación de caspasa-8 [202]. Estudios previos han demostrado que un aumento en la expresión de Bcl-2 y/o Bcl-xL está asociado con la aparición de quimiorresistencia, particularmente en el caso de las enfermedades hematológicas [203] y que el pronóstico empeora notablemente al verse aumentada la expresión de Bcl-xL [204]. Para determinar con más detalle el papel de la mitocondria en la citotoxicidad inducida por el THDF, incluimos en el estudio células HL-60 y U937 que sobreexpresan factores anti-apoptóticos. Así, las células HL-60/Bcl-xL y U937/Bcl-2 demostraron ser parcialmente resistentes respecto a las líneas celulares parentales, confirmando que la mitocondria desempeña una función central en la muerte celular inducida por el THDF. No obstante, la protección parcial que proporcionan estas proteínas podría ser explicada por diferentes mecanismos, como la inactivación de Bcl-2 o la activación de la vía extrínseca de la apoptosis. El hecho de que el THDF también sea capaz de inducir la muerte celular de células de leucemia que sobreexpresan las proteínas Bcl-2 y Bcl-xL tiene gran interés como potencial agente terapéutico. Es bien conocido que las MAPKs como JNK y p38 juegan un importante papel provocando la apoptosis como respuesta a diferentes tipos de estrés celular, incluyendo el estrés oxidativo [205]. La p38 es activada por la luz ultravioleta, hiperosmolaridad, golpe de calor o citoquinas proinflamatorias, y actúa en un paso previo a la disfunción de la mitocondria y a la activación de la cascada de caspasas. Además, la p38 es uno de los potenciales reguladores de Bax [132] y un mediador de la respuesta a los puntos de control de G2-M [133]. En relación con esto, la activación de p38 en las células de mamíferos como respuesta al desbaratamiento del citoesqueleto, induce cambios en los puntos de control de G2-M [134], y estudios previos han demostrado que flavonoides con un grupo 3-metoxilo podrían inhibir la polimerización de la tubulina [206]. Aunque nuestros estudios indican que la activación de p38 no está implicada en la muerte celular inducida por el THDF, podría estar implicada en el papel fundamental del punto de control de G2-M mediante una perturbación de los microtúbulos. Se ha descrito un papel pro-apoptótico de JNK en la apoptosis inducida por diferentes agentes quimioterápicos, como la vinblastina, la doxorubicina y el etopósido [207,208]. Además, la apoptosis inducida por el 2-metoxiestradiol es inhibida por SP600125 en células de mieloma múltiple [209]. 120 DISCUSIÓN En nuestro estudio, demostramos que la muerte celular inducida por el THDF está asociada con la fosforilación de diferentes miembros de las MAPKs siguiendo diferentes cinéticas, y este efecto es dependiente de la línea celular, ya que la activación de ERK1/2 se detectó en células HL-60 pero no en U937. El THDF induce una fosforilación bifásica de ERK1/2, aunque no conocemos el mecanismo que provoca esta respuesta. Una posible explicación podría ser la implicación de alguna de las fosfatasas de espeficidad dual (MKPs), que están codificadas por genes cuya transcripción es activada por ERK1/2 creándose un bucle de retroalimentación que disminuye la actividad de ERK1/2 [210]. Además, la actividad enzimática de las MKPs es sensible a la oxidación e inactivación reversible debida a la presencia de un residuo de cisteína en la hendidura catalítica [211], mediada por la generación de especies reactivas de oxígeno como H2O2 [212]. THDF induce ROS y podría inhibir a las MKPs explicándose así el segundo pico de fosforilación de ERK1/2 inducida por el THDF. Otra posible explicación podría ser que una rápida activación de ERK1/2 aumente la expresión de potenciales dianas que amplifiquen la respuesta al THDF produciéndose así una fosforilación de ERK1/2 secundaria, al igual que ocurre con el factor de crecimiento TGF-β [213]. Aunque la vía de JNK está íntimamente relacionada con la apoptosis [214], ello depende del tipo celular y del estímulo. En las células HL-60 el porcentaje de células hipodiploides en respuesta al THDF es atenuado mediante la utilización de inhibidores específicos de JNK y ERK 1/2, sugiriendo que ambas MAPKs están implicadas en la muerte celular. Estos resultados están de acuerdo con trabajos previos donde se demuestra que la inhibición de MEK-ERK con U0126 o PD98059 suprime la apoptosis inducida por la quercetina en las células A549 [106]. Además, la inhibición de ERK1/2 también atenuó la muerte celular inducida por el trifolín acetato. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) están implicadas como segundos mensajeros en múltiples vías de señalización celular [215]. Aunque el efecto antiproliferativo del THDF está asociado con un aumento de los niveles intracelulares de ROS, esto no parece jugar un papel crucial en el proceso apoptótico. La generación de especies reactivas de oxígeno no es una característica general de los compuestos polifenólicos que contienen un núcleo fenilbenzo-γpirona, tal y como sucede con el tetraacetato de 3-metil éter de quercetina que induce apoptosis en células de leucemia humana sin producirse generación de ROS [155], mientras que el trifolín acetato induce ROS, pero no es necesario para la indución de la muerte celular. 121 DISCUSIÓN El estudio de la influencia del THDF sobre el ciclo celular en células tumorales, indica que la inhibición de la viabilidad celular está causada por una parada del ciclo celular en la fase M y posterior muerte celular por apoptosis. Entre las posibles causas de la acumulación de las células en la fase M del ciclo celular están la inhibición de la formación de los microtúbulos y también una inducción de cambios en la expresión y/o actividad de proteínas clave en la regulación del ciclo celular en esa fase M. Estas proteínas reguladoras son la quinasa dependiente de ciclina-1 (CDK1), el inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina (p21) y las isoformas de ciclina tipo B y Cdc25C. Los agentes antitumorales que afectan a las propiedades dinámicas de los microtúbulos poseen un gran interés y se utilizan habitualmente en quimioterapia. Los microtúbulos juegan un papel crucial en la regulación de la mitosis y su desorganización puede inducir la parada del ciclo celular en la fase M, formación de un huso mitótico anormal y muerte celular por apoptosis [49]. El bioflavonoide mejor estudiado, la quercetina, inhibe la proliferación celular reduciendo los microtúbulos celulares e inhibiendo su polimerización al unirse a la tubulina [56]. De modo similar, el THDF, análogo de la quercetina, inhibe la polimerización de la tubulina e induce cambios en la red de microtúbulos celular siguiendo un patrón similar a la colchicina. El THDF induce además fosforilación de la ciclina B1, acumulación de p21, y activación de CDK1 mediante la desfosforilación de fosfoT14-Y15. Estudios previos indican que la desorganización de la estructura de los microtúbulos mediante el uso de agentes que se unen a la tubulina conduce a una inducción de diferentes proteínas, entre ellas p21 [49]. El aumento de la expresión de p21 es un evento importante en el efecto antiproliferativo inducido por el THDF y conforma una vía independiente de p53, ya que las células HL-60 y U937 carecen de p53 funcional. Este hecho, aumenta el interés del THDF como potencial agente quimiopreventivo o quimioterapéutico destinado al tratamiento del cáncer, ya que aproximadamente el 50% de los tumores humanos poseen mutaciones de p53 [216,217]. Además, el aumento en la expresión de la quinasa dependiente de ciclina p21 concuerda con la activación de ERK1/2 inducida por THDF, ya que la transcripción de p21 es dependiente de ERK1/2 [218]. 122 DISCUSIÓN Al tratar las células de leucemia mieloide humana con THDF se inicia una cascada de fosforilación, activando la fosfatasa de especificidad dual Cdc25C [219] y estimulando directamente su actividad fosfatasa. Esta fosforilación es necesaria para activar los complejos CDK1-ciclina B que regulan importantes eventos durante la transición por la fase G2-M [220] y durante la progresión de la mitosis [221]. Los cambios en la actividad CDK1 y Cdc25C inducidos por THDF coinciden con la aparición de fosfoepítopos reconocidos por un marcador de mitosis, MPM-2, anticuerpo que reconoce polipéptidos fosforilados que sólo podemos encontrar en las células mitóticas [222]. Estos cambios en la fosforilación de las proteínas concuerdan con la parada del ciclo celular en mitosis inducido por algunos agentes anti-tubulina [223]. La vía de la esfingomielinasa, la vía de novo y la vía de salvamento, son tres vías que contribuyen de forma individual o de forma coordinada a la síntesis de ceramidas. La ceramida, un esfingolípido que actúa como segundo mensajero se origina por la hidrólisis de la esfingomielina asociada a la membrana, promueve la muerte celular por apoptosis en las células de leucemia mieloide humana [224] y a menudo se genera después de la exposición a agentes quimioterapéuticos mediante la activación de SMasa [141,225,226]. El THDF induce un aumento importante de los niveles de ceramida celular y mitocondrial, activación de A-SMasa pero no de N-SMasa. El inhibidor de la esfingomielinasa, desipramina, es capaz de disminuir la apoptosis inducida por el THDF, sugiriendo que la muerte celular implica la activación de la esfingomielinasa ácida y aumenta la producción de ceramidas. Estudios recientes señalan a la mitocondria como un lugar de generación y actuación de las ceramidas [145,146,147]. En la mitocondria, la apoptosis inducida por las ceramidas puede ser bloqueada por Bcl-2, indicando que la produción de ceramidas en la apoptosis es un evento anterior al punto de control de Bcl-2 [146]. Aunque THDF es capaz de inducir apoptosis en células U937 que sobreexpresan Bcl-2, lo que indica que aunque se incremente la expresión de Bcl-2, la generación de ceramidas inducida por el THDF podría ser capaz de desencadenar la apoptosis. 123 MATERIAL Y MÉTODOS CONCLUSIONES 125 CONCLUSIONES 1. Hemos evaluado la actividad antitumoral de 20 flavonoides en cuatro líneas tumorales humanas y seleccionado los más citotóxicos. Las líneas de leucemia mieloide humana fueron, en general, las que mostraron mayor sensibilidad a estos compuestos. 2. Los flavonoides, 3´,5,7-trihidroxi-3,4´-dimetoxiflavona y trifolín acetato, exhiben propiedades citotóxicas selectivas frente a células tumorales, a concentraciones que se podrían alcanzar in vivo, mientras no afectan a los linfocitos normales humanos. 3. El trifolín acetato induce apoptosis a través de un mecanismo que es dependiente de la actividad caspasa. Las caspasas -3 y -9, y fundamentalmente la caspasa -6, desempeñan un papel principal, mientras que las caspasas -8 y -2 no están involucradas. 4. La apoptosis inducida por el trifolín acetato está asociada con la liberación de citocromo c a través de un mecanismo que es independiente de la despolarización de la membrana mitocondrial, y puede ser inhibida mediante la expresión de niveles elevados de Bcl-2 y Bcl-xL. 5. La vía de las proteínas quinasas activadas por mitógenos juega un papel muy importante en la apoptosis inducida por el trifolín acetato, induciendo una rápida fosforilación de ERK1/2 y p38MAPK que desempeñan en este caso una función pro-apoptótica, mientras que la también rápida fosforilación de JNK promueve la supervivencia celular. 6. La fosforilación de las proteínas quinasas activadas por mitógenos es independiente de la generación de especies reactivas de oxígeno, ya que la utilización de diferentes antioxidantes es incapaz de proteger a las células de la apoptosis inducida por el trifolín acetato. 7. La 3´,5,7-trihidroxi-3,4´-dimetoxiflavona induce apoptosis, en las líneas celulares de leucemia mieloide humana HL-60 y U937, a través de un mecanismo que implica activación de las caspasas -3, -6, -7 y -9. 8. La 3´,5,7-trihidroxi-3,4´-dimetoxiflavona induce liberación de citocromo c mitocondrial, disminución de los niveles de Bax citosólico, y disipación del potencial de membrana mitocondrial (∆Ψm), mientras que la expresión de niveles elevados de las proteínas mitocondriales Bcl-2 y Bcl-xL confiere resistencia parcial frente a la apoptosis inducida por este compuesto. 126 CONCLUSIONES 9. La 3´,5,7-trihidroxi-3,4´-dimetoxiflavona activa a las proteínas quinasas activadas por mitógenos siguiendo diferentes cinéticas, por un mecanismo independiente de la generación de especies reactivas de oxígeno, ya que la utilización de diferentes antioxidantes es incapaz de proteger a las células de la apoptosis inducida por este compuesto. 10. La 3´,5,7-trihidroxi-3,4´-dimetoxiflavona induce acumulación de las células HL-60 y U937 en la fase M del ciclo celular y aumento de los niveles de ciclina B1, fosfo-ciclina B1, p21 y MPM-2. Además, promueve la fosforilación de Cdc25C y la desfosforilación y activación de CDK1. 11. La 3´,5,7-trihidroxi-3,4´-dimetoxiflavona desestabiliza la polimerización de los microtúbulos in vivo, e inhibe la polimerización de tubulina in vitro, uniéndose específicamente al sitio de unión de la colchicina. 12. La 3´,5,7-trihidroxi-3,4´-dimetoxiflavona induce aumento de los niveles de ceramida celular y mitocondrial y activación de la esfingomielinasa ácida en las células HL-60, pero no induce activación de la esfingomielinasa neutra. 13. Puesto que las líneas celulares HL-60 y U937 carecen de p53 funcional, nuestros resultados indican que la apoptosis inducida por el trifolín acetato y la 3´,5,7-trihidroxi-3,4´- dimetoxiflavona se produce de forma independiente a los eventos celulares mediados por p53. Los datos del presente estudio proporcionan evidencias acerca del mecanismo por el que el trifolín acetato y la 3´,5,7-trihidroxi-3,4´-dimetoxiflavona inhiben el crecimiento de las células tumorales mieloides humanas e inducen apoptosis, sugiriendo que estos flavonoides podrían ser utilizados para el desarrollo de futuros fármacos antitumorales. 134 SUMMARY that caspase-1 activates caspase-6 in serum-deprived human neurons and results in neuronal cell death [191]. Paradoxically, we find that the percentage of hypodiploid cells significantly increased in presence of the caspase-1 inhibitor z-YVAD-fmk, which suggests a survival role of caspase-1 in TA-stimulated cells. Interestingly, caspase-1 has been reported to promote cell survival through a mechanism that involves activation of sterol regulatory element binding proteins (SREBPs) and lipid biogenesis. Thus, selective inhibition of caspase-1 by z-YVADfmk or si-RNA mediated knockdown resulted in higher levels of cell death in response to pore-forming toxins [192]. Whether caspase-1 is activated in TA-stimulated cells and displays a mechanism that involves lipid biogenesis remains to be elucidated. As expected, given the roles of caspases-3 and -6 in TA-induced cell death, there was also an increase in the proteolytic processing of both pro-enzymes to form activated enzymes. Thus, apoptosis was accompanied by cleavage of the nuclear protein PARP, a recognized caspase-3 substrate which is involved in DNA repair and it is important for maintaining cell viability [193,194,195]. Therefore, hydrolysis of PARP guarantees cellular disassembly and supports a role for this protein as a key regulator of apoptosis in TA-treated cells [195]. Mitochondria play a key role in cell death when their membranes become permeabilized [196]. Outer mitochondrial membrane permeabilization is regulated by different members of the Bcl-2 family which constitutes a critical cellular checkpoint in the intrinsic pathway of apoptosis [197]. Here we have shown that TA initiated redistribution of cytochrome c into the cytosol which was already detected at 6 h. However, this early event is not associated with a loss in ∆Ψm which remains unchanged for at least 24 h. In this regard, previous studies have shown that changes in ∆Ψm are not required for the complete release of cytochrome c upon the mitochondrial outer membrane permeabilization [198]. To further investigate the role of mitochondria upon treatment with TA, HL-60 and U937 cells over-expressing antiapoptotic factors were included in the study. HL-60/Bcl-xL and U937/Bcl-2 were completely resistant compared with the parental cell lines, which suggest a central role of mitochondria in TA-induced cell death. Taken together, our results suggest that TA induces apoptosis through a mechanism that involves the mitochondrial pathway in which caspase-6 seems to operate upstream to caspase9. 135 SUMMARY In addition to apoptosis, MAP kinases regulate diverse cellular programs including proliferation and differentiation. Although the JNK has generally been associated with proapoptotic actions [112] and growth inhibitory signals [114], here we show that TA induces JNK activation and its inhibition by SP600125 enhances apoptotic cell death. Previous studies have shown that the pro-apoptotic effect of the histone deacetylase inhibitor D1 increased in the presence of SP600125 in human acute myeloid leukemia cell lines [200]. Additional evidence that JNK can be a prosurvival signal has been also demonstrated in hepatocellular carcinoma cells [115] and in gastric and a colorectal cancer cell lines [116]. Cell death is promoted by p38 signaling in some cell lines, and also enhances survival, cell growth and differentiation. Therefore, the role of p38 in apoptosis is dependent on cell type and stimulus [121]. The p38 appears to be involved in the activation of TA-induced apoptosis, since the specific inhibitor SB203580 attenuated cell death. Activation of p38 is also a prerequisite for apoptosis induced by cadmium, trophic factor withdrawal and ischemia [122,123,124,125]. However, the activation of p38 is not involved in apoptosis induced by ultraviolet radiation in U937 cells [126] or by S-nitrosoglutathione in RAW 264.7 macrophages [127] and/or in Fasand ultraviolet-treated Jurkat T cells [128]. Our data also indicate that the inhibitor U0126 attenuated the apoptotic effects of TA, which suggested that ERK1/2 is involved in cell death signals. Our results are in agreement with previous work that has shown that inhibition of MEK-ERK activation with U0126 or PD98059 abolishes quercetin-induced apoptosis in A549 cells [106]. In addition, the suppression of MEK-ERK signal pathway by the MEK inhibitor PD98059 resulted in an increase in cisplatin-resistance in human cervical carcinoma SiHa cells and hepatoblastoma HepG2 cells [107]. Moreover, acrolein, a highly reactive α,β-unsaturated aldehyde generated by lipid peroxidation, induced phosphorylation of ERK and the inhibition of its activity by PD98059 and U0126 blocked acrolein-induced apoptosis [201]. Quercetin 3-methyl ether acetate, which is chemically similar to TA, enhances the activation of the MEK/ERK pathway [155]. In contrast, ERK inhibitors potentiate the apoptotic effects of quercetin 3-methyl ether. Therefore, different pathways can be activated in the same cell line by these similar compounds. Previous reports have demonstrated that production of ROS in leukaemic cells may lead to cell death via MAPKs activation [167,169,238]. Although intracellular ROS generation was observed within 1 h after exposure to TA, different anti-oxidants were unable to abrogate cell 136 SUMMARY death. These results indicate that ROS generation does not seem to be involved in TA triggered apoptosis. 3´,5,7-TRIHYDROXY-3,4´-DIMETHOXIFLAVONE In addition, we have specifically selected an analog of quercetin 3-methyl ether, THDF, which contains an additional methoxyl group on position 4´ of the phenylbenzo-γ-pyrone core and evaluated its potential cytotoxic properties using nine tumor cell lines. Interestingly, we found that THDF displays cytotoxic properties in a cell-type specific manner. Human leukemia cells (HL-60, U937, Molt-3 and Jurkat) were highly sensitive to THDF cytotoxicity while SK-MEL-1 and A549 cells were more resistant than hematopoietic cells. Moreover, dose-response studies revealed that PBMC were more resistant to THDF than PBMC treated with phytohemaglutinine. Cell cycle analysis showed that inhibition of cell viability by THDF was caused by a significant cell cycle arrest at the G2-M phase, accompanied by an increase in sub-G1 fraction and phosphatidylserine externalization, indicating apoptotic cell death. Similar results were recently reported by the semi-synthetic quercetin 3-methyl ether tetracetate in human leukemia cells [155], although the potency of THDF was the highest, both in arresting the cells at the G2-M phase and as an apoptotic inducer. Our results also indicate that THDF´s antiproliferative effect is dependent on caspase, since cell death was inhibited by the general caspase inhibitor z-VAD-fmk. The intrinsic apoptotic pathway (mitochondrial pathway) involves the release of cytochrome c and the assembly of apoptosome. THDF initiated redistribution of cytochrome c into the cytosol which was correlated with the dissipation of ∆Ψm and caspase-3 activation. We also observed a concentrationand time-dependent activation of caspases-9 and -3, in accordance with the cytochrome c release experiments, emphasizing that the intrinsic pathway plays an important role in the cell death. Moreover, THDF induced PARP cleavage, a hallmark of apoptosis that indicates activation of caspase. Although PARP is also degraded in other forms of cell death like necrosis [239], this did not seem to be the case with THDF in accordance with the fluorescence microscopy and the flow cytometric analyses of Annexin V-FITC and propidium iodide-stained cells experiments. The results clearly demonstrate that THDF also stimulates the proteolytic processing of other executioner caspases, namely caspase-7 and caspase-6 to form activated 137 SUMMARY enzymes. There was also a clear concentrationand time-dependent decrease of the Bax levels in the cytosol in both cell lines. However, the levels of Bcl-2 in mitochondria and in cytosol remain unchanged. Therefore, it appears that the mechanism of cytotoxicity displayed by THDF is clearly different to that caused by previously described phenylbenzo-γ-pyrones, such as betuletol 3methyl ether which induces apoptosis in HL-60 cells by a caspase-8 dependent mechanism [153]. In contrast, quercetin 3-methyl ether tetracetate, a flavonoid obtained by acetylation of the natural product quercetin 3-methyl ether, triggers apoptosis which is prevented by the general caspase inhibitor z-VAD-fmk, but not by the specific caspase-8 inhibitor [155]. Previous studies have shown that increased expression of Bcl-2 and/or Bcl-xL is associated with chemoresistance particularly in the case of hematologic malignancies [203] and there is also poor prognostic outcome with increased Bcl-xL expression [204]. To further investigate the role of mitochondria in THDF-induced cytotoxicity, HL-60 and U937 cells overexpressing antiapoptotic factors were included in this study. Our results indicate that HL60/Bcl-xL and U937/Bcl-2 were partially resistant compared with the parental cell lines, which suggest that mitochondria play an important role in THDF-induced cell death. However, the partial protection by these proteins could be explained by various mechanisms, including inactivation of Bcl-2 or the activation of the extrinsic apoptotic pathway. The fact that THDF induces cell death also in leukemic cells over-expressing Bcl-2 and Bcl-xL could have important clinical implications for the use of this compound as potential therapeutic agent. Recent studies suggest that MAPKs such as JNK and p38 play a key role in triggering apoptosis in response to various cellular stressors including oxidative stress [205]. The p38 is activated by a variety of cellular stresses including ultraviolet light, hyperosmolarity, heat shock and proinflammatory cytokines, and acts at early step prior to dysfunction of mitochondria and caspase activation. Moreover, p38 is a potential upstream regulator of Bax [132] and a mediator of the G2-M checkpoint response [133]. In this regard, activation of p38 in mammalian cells in response to the disruption of the microtubule cytoskeleton initiates G2-M checkpoint [134] and also previous studies have shown that flavonoids containing a 3-methoxyl group may inhibit tubulin polymerization [206]. Although our studies indicate that the activation of p38 is not involved in THDF-induced cell death, this 138 SUMMARY could be involved in the initiation of the G2-M checkpoint through a perturbation of the microtubules. A proapoptotic role of JNK has been described in apoptosis induced by different chemotherapeutic agents, such as vinblastine, doxorubicin and etoposide [207,208]. Furthermore, 2-methoxyestradiol-induced apoptosis was inhibited by SP600125 in multiple myeloma cells [209]. In our study, we show that THDF-induced cell death was also associated with the phosphorylation of the members of MAPKs following different kinetics and this effect was cell specific, since ERK1/2 activation was observed in HL-60 but not in U937 cells. Moreover, THDF induced a biphasic phosphorylation of ERK1/2. Although the mechanisms by which THDF caused this response is unkown, one possible explanation could be the involvement of dual specificity threonine/tyrosine MAPK phosphatases (MKPs) because some of these MKPs are encoded by genes that are transcriptionally activated by ERK1/2 and this can provide a feedback loop to downregulate ERK1/2 activity [210]. In addition, the enzymatic activity of MKPs is sensitive to reversible oxidation and inactivation due to the presence of the catalytic cysteine residue in the catalytic cleft [211]. The reversible oxidation of this cysteine residue that inactivates the phosphatase may be mediated by the generation of reactive oxygen species such as H2O2 [212]. THDF induces ROS and might inhibit the MKPs and therefore explain the second peak of ERK activation triggered by THDF. Another possible explanation could be that the early activation of ERK1/2 may enhance the expression of potential targets which amplify the THDF response and induce a secondary phosphorylation of ERK1/2, as previously reported for transforming growth factor-β-1 [213]. Although the JNK pathway has been shown to be closely linked to apoptosis [214], its exact role seems to depend on the cell type and stimulus. Interestingly, in HL-60 the percentage of hypodiploid cells in response to THDF was attenuated by inhibition of JNK and by inhibition of ERK1/2, which suggests that both MAPKs are required for cell death. Our results also indicate that the mitogen-activated extracellular kinases (MEK) 1/2 inhibitors PD98059 and U0126 attenuated the apoptotic effects of THDF, which suggest that ERK1/2 is involved in cell death signals. These findings are in agreement with previous work that has shown that inhibition of MEK-ERK activation with U0126 or PD98059 abolishes quercetin induced apoptosis in A549 cells [106]. In addition, as we have seen previously, the inhibition of ERK1/2 attenuates cell death induced by trifolin acetate. 139 SUMMARY Reactive oxygen species (ROS) have been implicated as second messengers in multiple signaling pathways [215]. Although the antiproliferative effect of THDF is associated with an increase in the intracellular level of ROS, this did not seem to play a pivotal role in the apoptotic process. The generation of reactive oxygen species is not a general feature of polyphenolic compounds containing a phenylbenzo-γ-pyrone core. In this regard, we have previously demonstrated that quercetin 3-methyl ether tetracetate induces apoptosis in human leukemia cells without ROS formation [155], while that trifolin acetate induces ROS, but they are not necessary to trigger cell death. Antitumor agents that affect microtubule dynamics are of great interest and are now commonly used in current chemotherapy. Microtubules play crucial roles in the regulation of mitosis, and the disruption of microtubules can induce cell cycle arrest in M phase, formation of abnormal mitotic spindles and apoptotic cell death [49]. The best-studied bioflavonoid quercetin has been shown to inhibit cancer cell proliferation by depleting cellular microtubules and inhibiting microtubule polymerization through tubulin binding [56]. Since THDF is an analogue of quercetin, the cell cycle phase arrest might be explained by the inhibition of microtubule formation. We demonstrated herein that THDF inhibits tubulin polymerization and promotes changes on cellular microtubule network following a similar pattern to the microtubule-targeting drug colchicine. In this study we found that THDF blocks the cell cycle in the M phase which was associated with induction and phosphorylation of cyclin B1, accumulation of p21, and also activation of Cdk1 via dephosphorylation of phosphoT14-Y15. The marked up-regulation of the Cdk inhibitor, p21, might be the consequence of tubulin disorganization. In this regard, previous studies indicate that the disruption of microtubule structure by tubulin-binding agents results in induction of different proteins including p21 [49]. Up-regulation of p21 appears to be an important event in THDF-induced antiproliferative effect and involves a p53-independent pathway, since HL-60 and U937 cells lack functional p53. These results might have important implications for developing THDF as a chemopreventive or as a chemotherapeutic agent in treatment of cancer, because approximately 50% of human cancers harbor p53 mutations [216,217]. Up-regulation of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 is in accordance with our previous studies of ERK1/2 activation by THDF, since p21 transcription is ERK1/2 dependent [218]. 140 SUMMARY THDF treatment initiates a phosphorylation cascade resulting in the phosphorylation of the dual-specificity phosphatase Cdc25C [219]. This phosphorylation directly stimulates its phosphatase activity and this is necessary to activate Cdk1-cyclin B complexes which regulate several events during both the G2-M transition [220] and progression through mitosis [221]. There was also a clear concentrationand time-dependent decrease of the P-Cdk1 levels in both cell lines. The changes in Cdk1 and Cdc25C induced by THDF coincide with the appearance of phosphoepitopes recognized by a marker of mitosis, MPM-2, which is an antibody that recognizes phosphorylated polypeptides found only in mitotic cells [222]. These changes in protein phosphorylation are consistent with cell cycle arrest in mitosis induced by anti-tubulin agents [223]. Three pathways, the SMase pathway, the de novo pathway and the salvage pathway, individually or coordinately contribute to ceramide synthesis. Ceramide, a sphingolipid second messenger generated by the hydrolysis of membrane-associated sphingomyelin, promotes apoptotic cell death in the human myeloid leukemia cells [224] and is often generated after exposure to chemotherapeutic agents [141] through the activation of SMase [225,226]. In our study we show that THDF led to a very pronounced increase in both, cellular and mitochondrial ceramide levels, induces activation of ASMase, but not NSMase and the ability of the sphingomyelinase inhibitor, desipramine, to diminish THDF-mediated apoptosis confirms that the cell death involves activation of acidic sphingomyelinase and enhanced ceramide production. Recent studies point to the mitochondria as a site of ceramide generation and action [145,146,147]. In the mitochondria, ceramide-induced apoptosis could be blocked by Bcl-2, indicating that ceramide production is upstream of the Bcl-2 control point [146]. As we have seen previously, THDF effectively induces apoptosis in U937 cells over-expressing Bcl-2, suggesting that ceramide generation induced by THDF could trigger apoptosis in Bcl-2 overexpressing cells. 141 MATERIAL Y MÉTODOS CONCLUSIONS 143 CONCLUSIONS 1. We have evaluated the antitumoral activity of 20 flavonoids in four human tumor cell lines and selected the most cytotoxic. Myeloid leukemia cell lines were, in general, the most sensitive to these compounds. 2. 3´,5,7-Trihydroxy-3,4´-dimethoxyflavone and trifolin acetate showed selectively citotoxic properties against tumoral cells, since human peripheral blood mononuclear cells were resistant to used concentrations with both compounds. 3. Trifolin acetate induces apoptosis through a caspase-dependent mechanism. The caspase-3, -9 and primarily caspase-6 play an important role in that mechanism, while caspase-8 and -2 are not involved. 4. Apoptosis-induced by trifolin acetate is associated with cytochrome c release, which was not accompanied by dissipation of the mitochondrial membrane potential (∆Ψm), and could be inhibited by overexpression of Bcl-2 and Bcl-xL. 5. Mitogen-activated protein kinases play an important role in trifolin acetate-triggered apoptosis, inducing a fast phosphorylation of ERK1/2 and p38 associated with proapoptotic actions, while the fast phosphorylation of JNK enhances cell survival. 6. Phosphorylation of mitogen-activated protein kinases is independent of reactive oxygen species generation, since different anti-oxidants were unable to abrogate trifolin acetate-induced cell death. 7. 3´,5,7-Trihydroxy-3,4´-dimethoxyflavone induces apoptosis, in the human leukemia cell lines HL-60 and U937, through a mechanism dependent on caspases -3, -6, -7 and -9. 8. 3´,5,7-Trihydroxy-3,4´-dimethoxyflavone induces release of mitochondrial cytochrome c, decrease of Bax levels in the cytosol, and dissipation of the mitochondrial membrane potential (∆Ψm), while overexpression of the protective mitochondrial proteins Bcl-2 and Bcl-xL conferred partial resistance to apoptosis. 144 CONCLUSIONS 9. 3´,5,7-Trihydroxy-3,4´-dimethoxyflavone activated mitogen-activated protein kinases following different kinetics, through a mechanism independent of reactive oxygen species generation, since different anti-oxidants were unable to abrogate apoptosis. 10. 3´,5,7-Trihydroxy-3,4´-dimethoxyflavone induced cell cycle arrest in M phase in HL-60 and U937 cells, increasing the levels of cyclin B1, phospho-cyclin B1, p21 and MPM-2. Moreover, THDF induced Cdc25C phosphorylation with dephosphorylation and activation of Cdk1. 11. 3´,5,7-Trihydroxy-3,4´-dimethoxyflavone induces disruption of microtubules in vivo, and inhibits in vitro tubulin polymerization by binding specifically at the colchicine binding site. 12. 3´,5,7-Trihydroxy-3,4´-dimethoxyflavone led to a very pronounced increase in both cellular and mitocondrial ceramide levels, and induced acidic sphingomyelinase, but not neutral sphingomyelinase, activation in HL-60 cells. 13. Since HL-60 and U937 cell lines lack functional p53, our results suggest that trifolin acetate and 3´,5,7-trihydroxy-3,4´-dimethoxyflavone induced apoptosis involve a p53-independent pathway. These studies provide new insights into the signaling pathways by which trifolin acetate and 3´,5,7-trihydroxy-3,4´-dimethoxyflavone inhibit human leukemia cells growth, induce apoptosis and suggest that these compounds have an important potential in the development of preventive chemotherapy and probably as new therapeutic agents against cancer. 152 BIBLIOGRAFÍA soluble survival factors up-regulates Akt and prevents apoptosis. J Biol Chem 279: 10962-10972. 112. Cross T, Scheel-Toellner D, Henriquez N, Deacon E, Salmon M, et al. (2000) Serine/threonine protein kinases and apoptosis. Exp Cell Res 256: 34-41. 113. Schreiber M, Kolbus A, Piu F, Szabowski A, Mohle-Steinlein U, et al. (1999) Control of cell cycle progression by c-Jun is p53 dependent. Genes Dev 13: 607-619. 114. Platanias LC (2003) Map kinase signaling pathways and hematologic malignancies. Blood 101: 4667-4679. 115. Kuntzen C, Sonuc N, De Toni EN, Opelz C, Mucha SR, et al. 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Revista: Molecular Carcinogenesis DOI 10.1002/mc.20619 162 ANEXOS CONTRIBUCIONES A CONGRESOS: Autores: Fernando Torres, Javier Cabrera, Juan Loro, Sara Rubio, José Quintana, Francisco León, Jaime Bermejo, Francisco Estévez. Título: Síntesis y evaluación de compuestos con un agrupamiento alfa-metilén-gammabutirolactona como potenciales compuestos antitumorales. Tipo de participación: Póster Congreso: X Congreso Nacional de la Asociación Española de Investigación sobre el Cáncer. Publicación: Clinical & Translational Oncology Vol 7, Suppl. 3, 52, 2005. Lugar celebración: Pamplona Fecha: 13 al 16 de octubre de 2005 Autores: Juan Loro, Sara Rubio, Javier Cabrera, Francisco Estévez, Fernando Torres, José Quintana. Título: Efecto Antitumoral de la Melatonina en células promielocíticas humanas HL-60. Tipo de participación: Póster Congreso: X Congreso Nacional de la Asociación Española de Investigación sobre el Cáncer. Publicación: Clinical & Translational Oncology Vol 7, Suppl. 34, 2005. Lugar celebración: Pamplona Fecha: 13 al 16 de octubre de 2005 Autores: Fernando Torres, José Quintana, Jesús G.Díaz, Armando J.Carmona y Francisco Estévez. Título: Efectos citotóxicos e inducción de apoptosis por compuestos derivados de la fenilbenzopirona. Tipo de participación: Póster Congreso: XXIX Congreso de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular. Publicación: Libro de resúmenes del Congreso Lugar celebración: Elche Fecha: 7 al 10 de septiembre de 2006 Autores: Fernando Torres, José Quintana, Jesús G.Díaz, Armando J.Carmona y Francisco Estévez. Título: Inducción de apoptosis en células leucémicas humanas por el acetato de trifolin: papel de las MAP quinasas. Tipo de participación: Póster Congreso: X Semana Científica “Antonio González”. Lugar celebración: La Laguna (Tenerife) Fecha: 2 al 6 de octubre de 2006 Autores: Fernando Torres, Juan C.Hernández, Francisco León, Ignacio Brouard, Sara Rubio, José Quintana, Francisco Estévez and Jaime Bermejo. Título: Synthesis and evaluation of saponins on human tumoral cells. Tipo de participación: Póster Congreso: 3rd Meeting of Young Cancer Investigators of the Canaries (3rd YCIC) & 1st Meeting of Young Biomedical Investigators of the Macaronesia (1st YBIM). Lugar celebración: La Laguna (Tenerife) Fecha: 9 al 10 de noviembre de 2006