Desarrollo de un programa piloto a nivel nacional de mejora genética en dorada (Sparus aurata L.) : estimación de parámetros genéticos de caracteres de crecimiento y calidad e interacción genotipo ambiente

UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA Instituto Universitario de Sanidad Animal y Seguridad Alimentaria TESIS DOCTORAL DESARROLLO DE UN PROGRAMA PILOTO A NIVEL NACIONAL DE MEJORA GENÉTICA EN DORADA (Sparus aurata L.): ESTIMACIÓN DE PARÁMETROS GENÉTICOS DE CARACTERES DE CRECIMIENTO Y CALIDAD E INTERACCIÓN GENOTIPO AMBIENTE Ivonne Lee Montero Las Palmas de Gran Canaria, 2012 ANEXO II UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA Instituto Universitario de Sanidad Animal y Seguridad Alimentaria PROGRAMA DE DOCTORADO TITULADO “ACUICULTURA: PRODUCCIÓN CONTROLADA DE ANIMALES ACUÁTICOS” Tesis Doctoral presentada por Dña. Ivonne Carola Lee Montero Dirigida por el Dr. Juan Manuel Afonso López y la Dra. Ana Navarro y Guerra del Río El Director La Directora La Doctoranda Juan Manuel Ana Ivonne Afonso López Navarro y Guerra del Río Lee Montero Las Palmas de Gran Canaria, 2012 Juan Manuel Afonso López, Profesor Titular de Universidad perteneciente al Departamento de Patología Animal, Producción Animal, Bromatología y Ciencia y Tecnología de los Alimentos e investigador del Instituto de Sanidad Animal y Seguridad Alimentaria de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Ana Navarro y Guerra del Río, Profesora asociada laboral del Departamento de Patología Animal, Producción Animal, Bromatología y Ciencia y Tecnología de los Alimentos e Investigadora del Instituto de Sanidad Animal y Seguridad Alimentaria de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, INFORMAN: Que Ivonne Lee Montero, Bióloga Marina de la Universidad de Concepción y Magister en Ciencias de la Acuicultura de la Universidad de Chile, ambas universidades pertenecientes al Gobierno de Chile, con título homologado por el Ministerio de Educación Español al Grado de Licenciada, ha realizado bajo nuestra dirección y asesoramiento, el presente trabajo titulado Desarrollo de un programa piloto a nivel nacional de mejora genética en dorada (Sparus aurata L.): estimación de parámetros genéticos de caracteres de crecimiento y calidad e interacción genotipo ambiente, el cual consideramos reúne las condiciones y la calidad científica para optar al grado de Doctora. En Las Palmas de Gran Canaria, a 01 de Octubre de 2012. Fdo.: Juan Manuel Afonso López Fdo.: Ana Navarro y Guerra del Río A DIOS y a mi hermosa y gran Familia, a todos con Amor… “Buena es la ciencia con herencia, y provechosa para los que ven el sol” Eclesiastés 7:11 AGRADECIMIENTOS Bien…iré escribiendo los agradecimientos en la medida que se me vayan viniendo a la mente, que te nombre antes o después no tiene ninguna importancia, me siento igual de agradecida por lo que eres, representas o has hecho por mí y este trabajo durante estos años de estudio… Vamos a empezar: ¡Gracias Señor!, sin ti mi sueño no se hubiera hecho realidad, eres lo más importante en mi vida, me siento tu “regalona” por tus cuidados, tus regalos inmerecidos, tu paciencia, tu misericordia y sobre todo por la vida y la salud que me distes y que me permitió terminar este hermoso trabajo (sin presumir, ¡es que a mí me parece hermoso! Lo bueno de esta sección es que uno puede escribir lo que quiera). Gracias a los que me animaron incluso mucho antes de que este proyecto se concretara, y me dieron las fuerzas para soñar. A mis queridos padres, mi papá y mi mamá, Guillermo y Nancy, son los mejores padres del mundo, ustedes reflejan el amor que todos deberíamos entregar al prójimo sin pedir nada a cambio…gracias porque siempre me han apoyado, han sido súper comprensivos a pesar de mis errores, me han enseñado a soñar y que no hay nada que no se pueda lograr con la ayuda de Dios y siendo una buena persona…a ustedes les debo todo en este mundo…¡los amo mucho!...y por supuesto a mis hermanos Pauli, Katy, Vivi y Willi (sí, todos terminados en “i”, pregúntenle a nuestra madre…) y a sus familias…a mis tíos, tías, primas y primos, cuñados, cuñada…la lista es larga. A mi familia chica, en primer lugar a mi esposo y compañero de esta aventura en esta tierra Canaria, gracias por apoyarme siempre sin esperar nada a cambio, ¡sin ti no hubiera podido concretar este proyecto!, gracias por tu paciencia conmigo, por tu contención en los momentos difíciles, por ocuparte de todo cuando yo no tenía tiempo y por esperarme cuando decía que llegaría a una hora y luego llegaba mucho más tarde…en fin ¡muchas gracias por todo!. A mi amado hijo Daniel, que de sus 6 añitos, 4 han sido con su madre trabajando como loca en sus tesis (cada uno trabaja como puede…). A mis suegros Hugo y Eva, gracias por su apoyo y preocupación a la distancia, y a mis cuñados y cuñada. Un sitio especial en esta sección se la dedicaré a la hermosa hija que Dios me dio, a mi querida Carolita: “hermosa a veces la vida no es como quisiéramos, sé que para ti pudo ser difícil todo lo que has pasado… y mantenernos alejadas tanto tiempo, pero mi amor, tú sabes que te amo y que gran parte de las decisiones profesionales y personales que he tomado a lo largo de tus 16 añitos, han sido para que tu estés mejor…¡espero no haberme equivocado!, eres una jovencita con un gran corazón y estoy segura que Dios te ayudará a seguir adelante y conseguir tus sueños, al igual como lo ha hecho hasta ahora… gracias por lo bien que te has portado durante este tiempo lejos, por cuidar de tu padre y cumplir con 2 “sobresaliente” tus deberes, gracias por ser como eres, me siento orgullosa de ti…¡¡te amo del cielo a las estrellas, ida y vuelta!!, tú lo sabes… Bueno, agradezco enormemente a mis directores, Juan Manuel Afonso y Ana Navarro. Juama, desde antes de conocernos y vernos las caras, desinteresadamente tú ya me estabas ayudando, sí, quizá ni te acuerdas, pero tú me ayudaste mucho para arreglar mis papeles de la beca chilena antes de venirme…eres una bellísima persona, un profesional excelente, ¡trabajador como tú solo! y te agradezco por haberme dado la oportunidad de aprender de mejora genética en tu grupo y en tu proyecto estrella…me siento muy agradecida y afortunada de haber sido una de tus becarias…¡gracias por todo tu apoyo, confianza y conocimiento!... Ana, ¡¡eres una súper jefa!!...¡tu apoyo ha sido incalculable!, ¡Millones de gracias!. Siempre me he sentido muy cómoda y segura trabajando contigo, gracias por tus conocimientos ¡eres muy generosa!...te estaré eternamente agradecida por todo lo que me has enseñado, por tu apoyo, por tu tiempo, tus consejos, tu buen rollo, tu paciencia, tu optimismo, que muchas veces me subió el ánimo en los momentos complicados…sé que llegarás lejos en tu carrera científica porque tienes una gran calidad como persona y como investigadora...te extrañaré un montón, enserio…en especial cuando tenga que organizar un muestreo, escribir un informe o un artículo, o ¡diseñar una camiseta!, jaja… eso sí he aprendido a optimizar ¡como no lo veas! y a escribir protocolos, ¡ufff!, ¡eso te lo puedo asegurar!... A mis compañer@s de laboratorio, Davinia gracias por tu apoyo, mucho de tu trabajo está en esta tesis también, gracias por tu claridad, orden, sinceridad y alegría, ¡suerte en tu tesis!. Guaci aunque ya no estás, agradezco tu guía en mis primeros días de laboratorio, también tus extracciones, el apoyo en los muestreos, tu preocupación por los detalles y tu simpatía, sin esto se habría hecho mucho más pesado el trabajo. Sara, elegiste otro camino, pero estoy segura que te irá excelente y eso te hará feliz, gracias por la amistad y por tu actitud relajada, que me ayudaba a relajarme también. Vanessa te agradezco que siempre tuvieras un momento para conversar de la vida y dar algún consejo o buen dato. A Moha, Islam y Rodrigo (mi compatriota) por lo que me enseñaron en mis primeros tiempos en el laboratorio y por vuestra simpatía. A Manolita, gracias por tu buen rollo y por tu apoyo y gran disposición a colaborar. A Silvia ¡eres las mejor compañera para trabajar dando prácticas!. Y a Miguel por tu simpatía, suerte en tu tesis. María Jesús, gracias por la preocupación por los detalles. En un inicio, cuando recién llegue tú fuiste un gran apoyo, ese apoyo con aire maternal que lo tienes a flor de piel, y lo das quizá sin darte cuenta, gracias por darnos a los foráneos ese ambiente de hogar acogedor que extrañamos en la vida laboral y en estas lejanas tierras. A mis amigos que se han marchado pero que quedan en mi corazón, a Fatima Zhara, amiga gracias por tu amistad cuando más la necesité, que Dios te bendiga y logres tus sueños!, a Rachid, Eyad y Julud. A mis compañeros del doctorado, máster y de la nave, Ada, Desy, Lorena, Rubén (¡tienes que visitar Chile!), Dailos, Mónica, Juan Pulpo, Fran, Fefi, Reda, Silvia, Alex, Cristina, Lahusine, Tibi, Gerson, Laura, Mauricio. A todos los colegas del IUSA, Carmen, Yure, Pedro, Silvia, Fátima, Bruno, Lorena, Orestes, Judith, Lita. Al personal del ICCM, a Miguel, Martin, Cristina, Gerardo, Juan de mantenimiento, Tere, María, Kike y a tantos otros que ahora puede que se me escapen, ¡muchas gracias!. A los Seniors del GIA, gracias Pipo, Dani, Javi por todo lo que me enseñaste en el Mesocosmos, Lucía, Rafa por tu gran disposición a ayudarnos con los papeleos para las becas, Juan, Carmen Mari, Mapi y Marisol. A mis amigos en la fé, ¡gracias Sarai!, ¡eres un ángel!, a tus padres Maruchi y Armando, a Ruth y Maggi, gracias por los ricos almuerzos sabatinos acopañados de esas largas tertulias, que nos ayudaron mucho a sentirnos acogidos cuando llegamos. Maribel jefa, ¡gracias! tú sabiduría es enorme. A Herminia, Yaiza y Aron. A Alberto y Dámaris por el gran apoyo siempre en especial cuando recién llegamos. Para qué decir lo agradecida que estoy de ti Tomás, que Dios te bendiga y a Alida también. Gracias Saida y Samuel, por vuestra gran simpatía y amistad. Gracias David y Noemi, por esos momentos navideños en vuestra casa. Gracias José Luis y María Jesús, por los datos de medicina natural par a sanar a mi peque. A José Ángel y Juanita por su sencilles y simpatía. A Maricarmen y Paca por apoyarnos con nuestro pequeño que Dios las bendiga. Agradezco a los jóvenes Israel, Elais, Carolina, Joel, María, Raquel, Elena, Joni, Rosana, Miriam, Cristina, Alexis, Gica, Santiago, Maribel, por los buenos momentos. Gracias Rosy y Miguel Ángel por todos los detalles. Isaí, Pino y Loida, por su gran hospitalidad y alegría. Sonia, Isabel y Cista, que Dios las bendiga y a sus familias. Ana, la venezolana y a Pedro el cubano, los extrañaremos mucho, que Dios les dé lo que necesitan y mucho más. A Víctor y Noralba gracias por su hermosa y rica invitación. A Carmen y Raúl, Jorge y Ángela. A Conchi, a Aide, Maribel y Guillermo y toda su gran familia, a Elias y Angeles, Ciro y Taida. A Desire y a todas su familia, gracias por su cariño y ricas invitaciones. La lista es larga, a todos muchas gracias y siempre tendrán un lugar en mi corazón. Por último agradezco enormemente al programa de la Comisión Nacional de Investigación y Tecnología de Chile (CONYCIT) que dirige el Programa de Becas Chile, por otorgarme la oportunidad de desarrollar este estudio en el extranjero, por el financiamiento y apoyo en otros aspectos de nuestro quehacer como becarios. Y también agradezco muy sinceramente a la Universidad Santo Tomas de Chile, por el gran apoyo, espaldarazo y confianza que depositaron en mí al darme financiamiento y permiso laboral para desarrollar esta tesis doctoral aquí en Las Palmas, espero no defraudarlos y que se vea grandemente recompensado su inversión cuando regrese a Chile. De todos ustedes, me siento eternamente agradecida, ya saben, si falta alguien por favor discúlpenme, no es mi intensión, hagan cuenta que también están, en especial en mi corazón…y demás está decir que el que quiera ir para Chile, ¡allí le esperamos con los brazos abiertos!...¡¡sólo tienen que avisar!! FUENTES DE FINANCIACIÓN El presente trabajo se desarrolló en el marco del proyecto titulado “Desarrollo de un Programa Piloto de Mejora Genética en Dorada (Sparus aurata L.), PROGENSA®”, financiado por el Ministerio de Medio Ambiente, Rural y Marino (MARM) a través de la Secretaría General del Mar y la Junta Nacional Asesora de Cultivos Marinos (JACUMAR) de España. En este proyecto participaron cuatro instituciones españolas: la Universidad de las Palmas de Gran Canaria y el Instituto Canario de Ciencias Marinas cuyo responsable fue el Dr. Juan Manuel Afonso López (coordinador); el Institut De Recerca I Tecnologia Agroalimentàries, de Cataluña cuyo responsable fue la Dra. Alicia Estévez García; el Instituto de Investigación y Formación Agraria y Pesquera del El Toruño, Andalucía, cuyo responsable fue el Dr. Manuel Manchado Campaña y la Universidad de Murcia y el Instituto Murciano de Investigación y Desarrollo Agrario y Alimentario cuyo responsable fue el Dr. Manuel Guillermo Ramis Vidal. El proyecto se llevó a cabo en conjunción con la industria, por lo que también participaron diferentes empresas de cría y engorde de dorada como son Culmasur S.A., Piscimar S.L., Canexmar S.L., Servicios Atuneros del Mediterráneo S.L., PIM S.A. y Cultimar S.A. Este trabajo ha sido también financiado por dos becas concedidas a Ivonne Lee Montero para desarrollar esta tesis doctoral: 1. Beca Presidente de la República, Programa de Formación de Capital Humano Avanzado, concedida por el Gobierno de Chile para estudios de doctorado. 2. Beca de Perfeccionamiento Académico para Estudios en el Extranjero concedida por la Universidad Santo Tomás de Chile. Índice de Tablas vi (LF), área total lateral (ATL), alto máximo (AlM), área total dorsal (ATD), ancho máximo (AnM), área filete (AF), volumen filete (VF), longitud sin cola (LSC), alto cabeza (AlCa), excentricidad cabeza(ExCa) y excentricidad pez (ExP) 72 Tabla 3.10 Heredabilidades (en la diagonal y en negrita, con ± error típico), correlaciones genéticas (en cursiva encima de la diagonal, con ± error típico) y correlaciones fenotípicas (debajo de la diagonal) entre variables de longitud (Long), rendimiento canal (% Canal), rendimiento filete (% Filete), porcentaje de grasa visceral (%GV), Fish Fatmeter (FF), colágeno, lípidos, humedad, proteína, fuerza máxima (F Máx.), a edad de sacrificio (689 dpe), a partir de los datos de los peces engordados en Canarias. 73 Tabla 3.11 Interacción genotipo-ambiente para caracteres de crecimiento y deformidades a talla de sacrificio entre las cuatro comunidades. 74 Tabla 3.12 Interacción genotipo-ambiente para cada carácter, en dorada a talla sacrificio (689 dpe) a través de correlaciones genéticas entre las dos estaciones (± error típico). 75 1 RESUMEN En este estudio, se ha protocolizado la metodología que permite la integración de la selección genética bajo los condicionantes propios del sistema de producción de dorada (Sparus aurata L.) poniéndola en práctica a nivel nacional en colaboración con seis empresas españolas. Se criaron peces descendientes de tres lotes industriales (ICCM: Canarias, CULMASUR S.A.: Andalucía, PISCIMAR S.L.: Valencia), marcados con Passive Integrated Transponder (PIT) y mezclados, en las instalaciones de cuatro centros de investigación y cuatro empresas (ICCM y CANEXMAR S.L.: Canarias; IFAPA y PIM S.A.: Andalucía; IRTA y CULTIMAR S.A.: Cataluña; IMIDA y SERVICIOS ATUNEROS DEL MEDITERRÁNEO: Murcia). Se realizaron muestreos de crecimiento de manera simultánea en las cuatro comunidades autónomas (179, 269, 389 y 539 días), además de un muestreo final de sacrificio (689 días) a talla ración donde se valoraron nuevas e importantes variables fenotípicas, tras unificar criterios. Para la determinación de las relaciones parentales-filiales se pusieron a punto nuevas PCRs múltiplex con marcadores microsatélites del mapa de dorada. Se diseñaron 138 nuevos juegos de cebadores a partir del mapa genético de dorada, con la misma temperatura de hibridación para poder ser combinados en PCRs múltiplex. En los laboratorios de las cuatro comunidades autónomas se genotiparon 16 muestras no relacionadas de dorada para evaluar la variabilidad genética y la facilidad de lectura de todos estos microsatélites, estableciendo antes una normalización para clasificar los errores de genotipado y valorar los microsatélites (GremmProtocol). A partir de los mejores marcadores (Radal) se establecieron 2 nuevas y robustas reacciones de PCR múltiplex, de 11 microsatélites cada una, llamadas SMSa1 y SMSa2, teniendo en cuenta no repetir el grupo de ligamiento y que no se solaparan los amplicones por su color del fluorocromo y rango alélico. Ambas PCRs múltiplex se han propuesto como el primer panel de referencia de marcadores microsatélites en dorada. Usando sólo la SMSa1 se genotiparon todos los reproductores y sus descendientes y se determinaron con éxito las relaciones parentales-filiales. Todos los descendientes procedentes del lote de Canarias y de Cataluña, se asignaron cada uno a una pareja de padres. En los descendientes del lote de Andalucía los resultados fueron igualmente satisfactorios excepto que el 20% era asignado a 2 parejas posibles, debido a que dos reproductores eran casi idénticos genéticamente. Se evaluó la contribución a través de puestas masales controladas a partir de todos los peces analizados. Los mayores valores se obtuvieron en el lote de Canarias (83%), que es de hecho el más utilizado por la empresa, y el mayor número de familias se obtuvo en el lote de Andalucía (193 familias de hermanos carnales), si bien este lote era el más numeroso. De manera general, la contribución media Resumen 2 fue muy buena (68%) y se formaron un total de 297 familias de hermanos carnales con un número de descendientes medio de 17,7, más 53 familias de medios hermanos maternos y 52 de medios hermanos paternos. A partir de los peces engordados en Canarias, se estimaron parámetros genéticos (heredabilidades y correlaciones genéticas y fenotípicas) para caracteres de crecimiento y deformidad a distintas edades, y para caracteres de rendimiento, morfología y calidad de la carne a talla de ración. Y a partir de los peces criados en las cuatro comunidades autónomas se estimaron parámetros genéticos de crecimiento y deformidad al sacrificio. Todo esto con el fin de proporcionar al sector industrial información que le permita tomar decisiones con criterio genético para explotar la rentabilidad de sus poblaciones sin modificar sustancialmente su sistema de producción. Las heredabilidades a distintas edades para caracteres de crecimiento presentaron valores medios (0,16±0,05 – 0,48±0,10), en general aumentando cuanto más cerca de la edad de sacrificio. En cuanto a las correlaciones genéticas, las estimadas entre el peso y la longitud en cada edad fueron altas y positivas (>0,94), como era de esperar. La compacidad con el peso y la longitud presentó valores desde bajas hasta altas (0,10±0,21 – 0,85±0,11). La presencia-ausencia de todo tipo de deformidades, carácter muy importante económicamente para la industria, presentó heredabilidades entre 0,07±0,03 y 0,26±0,06 a las distintas edades. También se estimaron las heredabilidades según el tipo de deformidad, siendo la de columna la que presentó, a la edad de sacrificio, el mayor valor (0,16±0,06). En cuanto a las correlaciones genéticas éstas fueron medias y positivas con los caracteres de crecimiento. A la edad de sacrificio, las heredabilidades fueron de 0,43±0,10 para peso, 0,40±0,09 para longitud y de 0,20±0,05 para la compacidad. En cuanto a los caracteres de rendimiento y calidad, las heredabilidades para las variables de rendimiento mostraron estimas bajas, cuando fueron consideradas como porcentajes, y medias, en valor absoluto. Las correlaciones genéticas del peso canal y peso filete con los caracteres de crecimiento fueron altas y positivas, mientras que las mismas para el porcentaje canal y porcentaje filete fueron, en general, bajas y las de la grasa visceral fueron medias-altas. Aunque el porcentaje canal no presentó casi heredabilidad, su alta y negativa correlación genética con el porcentaje de grasa visceral sugiere que se podría mejorar por esta vía. Las heredabilidades de las variables morfológicas, las cuales fueron obtenidas a través de análisis de imágenes, utilizando una nueva aplicación IMAFISH_ML, estuvieron entre 0,17±0,05 y 0,51±0,10. En general, presentaron correlaciones altas con caracteres de crecimiento y rendimiento filete y medias con caracteres de deformidad. En concreto, el carácter AlCa (alto de cabeza) mostró la mayor heredabilidad, lo que lo predispone como un criterio de selección eficaz y no invasivo para mejorar indirectamente los caracteres de crecimiento y algunos de rendimiento. Las heredabilidades de las variables de calidad de la carne mostraron valores entre 0,01±0,01 y 0,45±0,11. Los lípidos y la humedad presentaron heredabilidad baja-media, mientras que no presentaron determinación genética aditiva el colágeno y la proteína. Todos estos caracteres mostraron Resumen 3 correlaciones genéticas favorables con el crecimiento. El Fish Fatmeter (FF) presentó una correlación genética con el porcentaje de lípidos muscular de 0,99±0,05 e incluso una heredabilidad mayor que éste, lo que lo revela como un método eficaz de medida de lípidos musculares y un buen criterio de selección para este carácter. La fuerza máxima, un parámetro de textura, presentó una heredabilidad de 0,17±0,05. Es importante destacar que en este estudio se analizaron variables para las cuales nunca antes se habían estimado parámetros genéticos en dorada, como las variables de morfología a través del análisis de imágenes, el FF y la textura. Se estimó la interacción genotipo-ambiente, entre las cinco estaciones para el crecimiento y deformidad y entre el ICCM y CANEXMAR para todos los caracteres analizados. Las correlaciones genéticas, fueron en general altas y positivas en todas las variables que presentaron heredabilidad distintas de cero, indicando la ausencia de interacción genotipo-ambiente entre sistemas de engorde y comunidades autónomas. Todos estos resultados revelan el potencial que tienen las empresas de dorada para mejorar su producción a través de la explotación de la variación genética aditiva, y demuestra que es posible implementar un programa de mejora genética en dorada, sin cambiar la idiosincrasia de la industria. Además la no existencia de interacción genotipo-ambiente sugiere que las empresas podrían exportar sus producciones mejoradas genéticamente entre comunidades y por último señalar que estos desarrollos constituyen en sí mismos transferencia de conocimiento, ya que han sido realizados con las propias empresas del sector. 5 1. INTRODUCCIÓN GENERAL ARTURO BOYRAOCEANOGRÁFICA.COM 7 1.1 ANTECEDENTES BIOLÓGICOS DE DORADA Existen numerosos estudios sobre dorada (Sparus aurata, Linnaeus, 1758) a raíz del interés económico que supone su cultivo. A continuación se entregará información básica relacionada con los aspectos generales que caracterizan a la especie. 1.1.1 Taxonomía La dorada es una especie marina, perteneciente a la familia de los espáridos y al género Sparus. Su clasificación taxonómica es la siguiente: Reino : Animal Phylum : Chordata Subphylum : Gnathostomata Clase : Actinopterygii Subclase : Teleostei Superorden : Neognathi Orden : Perciformes Familia : Sparidae Género : Sparus Especie : Sparus aurata Sus nombres vernaculares en los distintos idiomas son los siguientes: Español : Dorada Inglés : Gilthead seabream Francés : Dorade Alemán : Goldbrasse Italiano : Orata 1.1.2 Distribución y Hábitat Se distribuye a través de las costas orientales del océano Atlántico, desde Gran Bretaña hasta Cabo Verde, y por todo el mar Mediterráneo. Debido a sus hábitos eurihalinos y euritérmicos, esta especie habita zonas litorales en ambientes marinos, lagunas costeras y zonas de estuarios, en particular durante las primeras fases del ciclo de vida. Como consecuencia de estos hábitos, las doradas hacen una migración trófica, desovan en el mar en invierno y posteriormente los juveniles migran a principios de primavera en busca de lugares más protegidos, con abundancia de comida y con temperaturas medias. Regresando a mar abierto a finales de otoño para reproducirse (Moretti et al., 1999). Introducción General 8 1.1.3 Anatomía La dorada se caracteriza por tener una forma corporal oval, alta, especialmente en la parte anterior, y aplanada lateralmente. El perfil de la cabeza es convexo, sus ojos son pequeños, preopérculo desnudo y labios anchos. Su cuerpo es de coloración gris plateada con irisaciones doradas que se extienden lateralmente desde la zona anterior a la zona caudal del pez. Aleta caudal ahorquillada. Muestra una característica banda dorada entre los ojos y una mancha oscura al comienzo de la línea lateral, que cubre también la parte superior del hueso opercular (Figura 1.1). Figura 1.1 Visión lateral de una dorada adulta 1.1.4 Alimentación y Reproducción En lo referente a su dieta natural, es preferentemente carnívora, depredadora de especies de fondo (bivalvos y gasterópodos), crustáceos y pequeños peces. En general, se considera una especie de crecimiento rápido en la naturaleza, alcanzando los 300 g en el segundo año y aproximadamente los 600 g en el tercero, pudiendo llegar a tener un tamaño de 70 cm y un peso de 5 Kg (Castelló, 1993). Por otro lado, es una especie hermafrodita proterándrica, primero madura como macho y a partir del segundo o tercer año se convierte en hembra. Su estación reproductiva tiene lugar durante un periodo más o menos extenso, bajo días cortos y decrecientes, ya sea de octubre a diciembre en el Mediterráneo Occidental (Arias, 1980) o un poco más tarde, entre noviembre y febrero, en el Mediterráneo Oriental (Ben-tuvia, 1979). Los huevos de dorada son planctónicos, esféricos y transparentes, de 1 mm de diámetro aproximado y con una o varias gotas de aceite en su interior, pudiendo producirse cantidades variables que fluctúan entre 500.000 y 6.000.000 de huevos∙kg-1 de hembra (Cejas et al., 1992). El desove se produce en aguas de época invernal, normalmente los peces migran hacia las aguas costeras protegidas en busca de alimento abundante y temperaturas más suaves (Migración Tropical). Se trata de una especie muy sensible a las bajas temperaturas (letal por debajo de los 4° C). A finales de otoño vuelven a migrar a mar abierto donde se produce la cría de los peces adultos. 9 1.2 SITUACIÓN ACTUAL DEL CULTIVO DE DORADA En 2010 se produjeron sólo 10,6 millones de toneladas menos de productos de acuicultura en el mundo, frente a la pesca extractiva. La producción global de la acuicultura ha crecido de manera significativa, pasando de 0,6 millones de toneladas en 1950 a 78,9 millones de toneladas en 2010, con un valor comercial que sobrepasó los 100 millones de euros (APROMAR, 2012). La dorada, junto a la lubina (Dicentrarchus labrax), el rodaballo (Psetta máxima) y la corvina (Argyrosomus regius) son las especies más relevantes de peces marinos de cultivo producidos en los países europeos meridionales. La producción acuícola de dorada en el mundo ha sido de 151.346 toneladas en el año 2011, un 2,9% inferior al año anterior, siendo su máximo el 2008 con 178.554 toneladas, explicándose esta situación a desequilibrios sectoriales y la crisis en el entorno económico y financiero, especialmente en Grecia (Figura 1.2). Figura 1.2 Evolución de la producción de dorada en Europa y en el Mediterráneo para el período 1985-2011 (APROMAR, 2012). La producción de dorada se realiza en 19 países siendo sus principales productores Grecia con 60.000 toneladas representando el 39,6% del total, seguido por Turquía con 34.000 toneladas (22,5%) y España con 16.930 toneladas (11,2%) (Figura 1.3). Introducción General 16 et al. (2006) y Borrell et al. (2008), analizando lotes de reproductores de dentón (Dentex dentex), describen que incluso hasta un 80% del total de la puesta puede proceder de sólo dos hembras. Por otro lado, desde el punto de vista genético, la puesta masal tiene la ventaja de que minimiza las fuentes de parecido por ambiente común entre los miembros de la misma familia (Herbinger et al., 1999), e interconecta a los individuos, mediante la formación de familias de medios hermanos, pero tiene el inconveniente de que imposibilita reconocer la genealogía de los peces, cuando la matriz de parentesco entre los individuos es un requisito fundamental para estimar parámetros genéticos de manera exacta en aquellos caracteres de interés económico para el sector industrial. El uso simultáneo de sistemas de marcaje físico (Visible Implant Elatomer, VIE; y Passive Implant Transponder, PIT) y marcadores genéticos microsatélites (intra e interespecíficos), permite inferir y trazar la matriz de parentesco de los peces durante el proceso de cría y engorde de los mismos. En relación a los sistemas de marcaje físico, Astorga et al. (2005) pusieron a punto el sistema VIE para alevines de dorada, útil para el reconocimiento de grupos familiares, estableciendo velocidades altas de marcaje (16 segundos por pez), tasas de retención de la marca máximas y con efectos mínimos sobre la mortalidad de los peces marcados. También en dorada, Navarro et al. (2006) establecieron la metodología para marcar individualmente los peces con el sistema de marcaje PIT, a partir de los 3 g de peso, sin afectar al crecimiento ni a la mortalidad, y encontrando que la tasa de retención puede ser máxima a partir de los 4 gramos, e independiente del manipulador. Ambos sistemas de marcaje permiten marcar a una velocidad aproximada de 200 peces por persona y hora, lo que posibilita su uso en experimentos que requieran del marcaje de un gran número de peces, como sucede en el desarrollo de esquemas de selección. Con respecto a los marcadores genéticos, en el caso de espáridos, ha sido descrito un número considerable de marcadores microsatélites con un alto nivel de polimorfismo en dorada (Batargias et al., 1999; Launey et al., 2003; Brown et al., 2005b; Senger et al., 2006), en dorada japonesa (Takagi et al., 1997), en dorada australiana (Pagrus auratus) (Adcock et al., 2000), en besugos (Stockley et al., 2000; Piñera et al., 2006), en breca (Pagellus erythrinus) (RamSak et al., 2003), y en urta (Ponce et al., 2006). Además, la conservación de regiones flanqueantes de marcadores microsatélites entre grupos de especies de espáridos ha permitido la amplificación interespecífica (Takagi et al., 1997; Oliva et al., 2003; Brown et al., 2005b; Jean et al., 2006; Piñera et al., 2006; Castro et al., 2007; Roques et al., 2007a, 2007b; Navarro et al., 2008). La aplicación de marcadores microsatélites para la determinación de las relaciones de parentesco en poblaciones de cultivo de dorada ha sido demostrada por Batargias et al. (1997), quienes con la utilización de cuatro marcadores específicos asignaron el 98,6% de una muestra de descendientes a 47 parejas, de entre 117 posibles de un stock de reproductores. Estos mismos autores, consiguieron aumentar el número de descendientes asignados a 900, cuando incorporaron dos marcadores más (Batargias et al., 1999). Posteriormente, Piñera et al. (2006) utilizaron un total de 11 Introducción General 17 marcadores microsatélites altamente polimórficos y con una capacidad de exclusión del 99,98% para definir un stock de reproductores en una hatchery de dorada, con el objetivo de gestionar su consanguinidad. Más recientemente, Castro et al. (2007) reconstruyeron la asignación entre un lote de descendientes (996) y reproductores de dorada (159) mediante el uso de 11 marcadores microsatélites, seis de dorada (Batargias et al., 1999) y cinco de besugo (Stockley et al., 2000), con una probabilidad de exclusión combinada del 99,7%. Navarro et al. (2008) evaluó la variabilidad genética de 27 marcadores microsatélites interespecíficos, sobre un total de 148 doradas, (66 reproductores de una empresa y 82 de sus descendientes por puesta masal) 37 bocinegros (Pagrus pagrus) y 125 urtas, obteniendo un probabilidad de exclusión combinada a una única pareja de padres de 0,99. Borrell et al. (2011) evaluaron la contribución parental de 78 reproductores de dos stocks de una empresa española productora de doradas, asignando el 99,2% de sus descendientes a una pareja de padres, utilizando nueve marcadores interespecíficos. Para lograr la reconstrucción de las relaciones de parentesco entre una población de peces utilizando marcadores microsatélites, los peces se deben genotipar mediante el uso de la PCR. En sus inicios el genotipado de los peces se hacía de manera individual para cada marcador, lo que presentaba un alto coste económico, tanto por la amplificación como por la carrera en el secuenciador. Posteriormente, se desarrollaron reacciones de PCR múltiplex que permitieron reducir los costes económicos por reacción y optimizar los análisis de reconstrucción de genealogía y variabilidad genética de las poblaciones de cultivo (Navarro et al., 2008). En dorada, cada vez son más las múltiplex desarrolladas a partir de diferentes microsatélites. El genotipar con distintos marcadores, tiene como consecuencia el no poder comparar poblaciones o estudios, además de crear la incertidumbre entre los investigadores y empresas a la hora de decidir qué marcadores o múltiplex utilizar. Todo esto pone de relieve la necesidad de desarrollar un panel estandarizado de marcadores moleculares para esta especie, que sea eficaz, fiable y repetible. 1.3.3. Caracteres Productivos de Interés para la Mejora Genética Antes de iniciar un programa de mejora genética se deben definir los objetivos u objetivo de mejora, es decir, aquellos caracteres de importancia económica, que pueden variar según la especie e incluso de la población (Gjedrem, 2000). En este sentido, la conversión de alimento es uno de los caracteres más importantes de la producción animal debido a que representa una gran proporción del coste de producción total. Sin embargo, debido a que este carácter es difícil de medir individualmente en condiciones industriales, su mejora se realiza, habitualmente, de manera indirecta, a través del incremento de los caracteres de crecimiento (peso y longitud), dado que presenta una correlación genética elevada y positiva con estos caracteres a sacrificio (McPhee et al., 1979; Afonso, 1996). Así, Gjedrem (2010) indicó que la selección individual para tasa de crecimiento ha sido practicada desde Introducción General 18 hace varios años en especies acuícolas. La idea consiste en alcanzar crecimientos más rápidos, que permitan mejorar la relación coste beneficio e incluirlos en los índices de selección para la preselección prematura de los animales. Estrechamente relacionado con el crecimiento están los caracteres de rendimiento. La elaboración de productos transformados como el fileteado, representa un sector del mercado muy interesante para la industria y para el consumidor, en la medida que se ofrece un producto procesado a un precio asequible y que permite una mayor facilidad para la elaboración del alimento. En España, el porcentaje que supone el consumo de pescado fileteado frente al consumo total de pescado ha oscilado desde el 3,61% en 1993 al 6,27% en 2002. Más aún, dentro del total de los productos transformados de pescado, dichos porcentajes han sido del 7,9% y 12,9%, respectivamente. Para el caso particular de dorada, Luna et al. (2006) han llevado a cabo un estudio exhaustivo sobre la demanda del filete de dorada en el mercado español. En dicho estudio se abordó la influencia de distintos factores en la aceptación por parte del consumidor, como son el precio, el tamaño del filete, la presentación del producto, la promoción del mismo, etc., con el fin de establecer las líneas generales sobre las que deberían enfocarse políticas comerciales que desemboquen en una nueva alternativa de mercado para dorada. Los resultados alcanzados pusieron de relieve que cuanto menor es el precio del filete de dorada mayor cantidad de compradores lo adquieren sin que tuviesen previsto adquirir dorada, siendo más competitivo con otros filetes y pescados. Sin embargo, cuando el precio sube los consumidores que lo adquieren son aquellos a quienes les gusta la dorada y, por tanto, sustituyen la compra de dorada entera en mayor porcentaje. Por otro lado, estos autores hicieron una estima de la demanda según el precio, el cual fue establecido según los empresarios por costes, y según los consumidores por aceptación, sobre los 11 €∙kg-1. Ante dichos resultados, el rendimiento filete parece un carácter a considerar, ya que si el precio estuviese entre 11 a 12 €∙kg-1, la demanda de filete superaría las 7.000 toneladas año con un incremento de la demanda de dorada de más de 6.100 t∙año-1 (Luna et al., 2006). Otro de los caracteres con repercusión en la producción es la calidad del pez, tanto a nivel de alevín como a talla de sacrificio, con respecto a la presencia de anormalidades morfológicas (Afonso y Roo, 2009). En dorada, las deformidades constituyen un problema mayor que afecta tanto a los criaderos como a las empresas de engorde, por comercializar sus productos esencialmente como animales enteros. Así, las empresas de cría se ven obligadas a implantar procesos de criba en sus lotes de producción, lo que añade unos costes asociados a la misma, y que suponen porcentajes variables del precio de venta del alevín, ya que de manera extendida las empresas de engorde no aceptan lotes con más de un 5% de peces deformes. En cuanto a las empresas de engorde, no sólo tienen pérdidas económicas aquellas que comercializan sus productos como animal entero (Beraldo et al., 2003), sino también la industria que comercializa sus productos procesados, a través de los problemas técnicos en la máquina de fileteado que puedan causar los peces menos deformes que externamente se ven Introducción General 19 normales (Gjerde et al., 2005). El grado en que las anormalidades morfológicas afectan a la viabilidad de las empresas es muy variable, debido a que existe mucha variación entre y dentro de las empresas en cuanto al tipo de deformidad, la prevalencia, la repercusión económica y la especie. En especies como lubina, dorada y bocinegro, las malformaciones más relevantes son las que afectan al complejo opercular, neurocráneo y columna vertebral (lordosis y fusión de vértebras) (Koumoundouros et al., 1997; Boglione et al., 2001; Roo et al., 2005). Por otro lado, los consumidores de pescado muestran un interés creciente por productos de calidad a la vez que no están dispuestos a pagar un precio excesivo por ellos (Gjedrem, 1997). Esto, unido a la competitividad de las empresas, está haciendo más y más relevantes los caracteres de calidad. En este sentido la composición del músculo juega un papel principal a través de atributos de calidad como son el sabor, la jugosidad, la textura y la apariencia. Son múltiples los factores que afectan a la apariencia del pescado. Por ejemplo, el color de la piel y la elasticidad de la carne son parámetros que generalmente están incluidos en el análisis sensorial de dorada (Huidobro et al., 2000). La medición instrumental de la textura permite trazar la pérdida de frescura (Ginés et al., 2002). Más aún, es habitual que las empresas incluyan los perfiles nutricionales de sus productos durante el proceso de comercialización de los mismos como un argumento de calidad y trazabilidad. El sabor y la jugosidad están alta y positivamente correlacionados con el contenido de grasa en el músculo (Grigorakis, 2007). Además, los ácidos grasos poliinsaturados del pescado, especialmente el ácido eicosapentaenoico (EPA; 20:5n-3) y el ácido docosahexaenoico (DHA; 22:6n-3), se destacan por su efecto beneficioso para la salud (Sargent et al., 2001). Son esenciales para algunos órganos, tienen un importante papel en la disminución de lípidos en sangre y son precursores en respuestas fisiológicas y bioquímicas. Por otro lado, tienen efectos cardiovasculares favorables, son esenciales en la estructura de las membranas celulares, y juegan un papel importante con respecto a la hipertensión y la diabetes. 1.3.4 Interacción Genotipo - Ambiente El sistema de producción de dorada presenta claras diferencias ambientales entre empresas durante las fases de cría y engorde. Las empresas de cría pueden producir sus alevines desde tecnología intensiva hasta mesocosmos, habiendo entre ambas un espectro de matizaciones de sistemas de producción. Los alevines a su vez son preengordados y engordados fundamentalmente en jaulas, y en coordenadas geográficas muy diferentes, como es el caso de Canarias donde las temperaturas son más elevadas y estables a lo largo de todo el año frente al Mar Mediterráneo. Sin embargo, también se engordan alevines de dorada con el sistema de esteros o estanques en tierra, propio del sur de España. Todas estas variaciones existentes en los sistemas de producción y la localización de las instalaciones de Introducción General 20 dorada imprimen resultados muy dispares a los diferentes caracteres de interés para los piscicultores, y especialmente han sido descritos para el crecimiento y la calidad del pez. También existen otros factores diferenciadores entre empresas que afectan al crecimiento de dorada como son la madurez sexual (Ginés et al., 2003) y el reparto del alimento (Robaina et al., 1997). La dorada alcanza la primera maduración sexual a la edad de uno o dos años, habiendo notables diferencias entre poblaciones. En Eilat (Israel), Zohar et al. (1978) describieron que ya en el primer año de vida todos los individuos que analizaron eran machos perfectamente funcionales, mientras que en otras localizaciones como el sur de Italia, sólo la mitad de los individuos analizados histológicamente alcanzaban algún grado de madurez, aunque sin diferencia macroscópica con los individuos inmaduros (Micale y Perdichizzi, 1990). Por otro lado, la búsqueda de técnicas de alimentación adaptadas a dorada es una estrategia importante para mejorar la ecuación eficacia-coste. Azzaydi et al. (1997) concluyeron que el mejor sistema de alimentación es aquel que permite que los peces determinen cuando y cuanto han de comer. En este sentido, Ginés et al. (2004a) comprobaron que la dorada mejora el crecimiento y la conversión del alimento y disminuye el coeficiente de variación a través de la libre disponibilidad del alimento mediante comederos de autodemanda durante el engorde. Robaina et al. (1997) encontraron diferencias significativas en crecimiento cuando el alimento se reparte una frente a dos, tres o cuatro tomas diarias, ya que en el primer caso crecen menos y convierten peor, mientras que entre los restantes no hay diferencias ni en conversión ni en crecimiento. Sin embargo, las empresas de dorada presentan claras diferencias de localización geográfica y de sistemas de organización y distribución del alimento. En cuanto al sistema de cultivo, de manera general, se ha sido descrito como factor modulador de la aparición de deformidades esqueléticas, fundamentalmente relacionado con la intensificación de las técnicas de cría, asociando el uso de sistemas extensivos y semi-intensivos con la obtención de peces con muy baja incidencia de deformidades esqueléticas, cuando se comparan con ejemplares cultivados mediante técnicas intensivas (Divanach y Kentouri, 1983; Divanach et al., 1996; Boglione et al., 2001; Koumoundouros et al., 2001; Sfakianakis et al., 2004; Giménez y Estévez, 2005; Roo et al., 2005) (Figura 1.6). Todas estas diferencias ambientales pueden producir una desviación ambiental en la varianza fenotípica. Si esta desviación no es independiente del genotipo sobre el que actúa, es porque existe una interacción GxA (Falconer y Mackay, 1996). Por ejemplo, una diferencia específica de ambiente puede tener un efecto mayor sobre algunos genotipos que sobre otros, o puede haber un cambio en el ranking de valores genéticos de una serie de genotipos cuando se miden en distintos ambientes. Introducción General 21 Opérculo Mandíbula Lordosis LSK % Malformación 0 2 4 6 8 10 12 Intensivo Semi-Intensivo Figura 1.6 Distribución de incidencia de deformidades esqueléticas por sistema de cultivo en dorada (Roo et al., 2005). LSK: triple deformidad (lordosis, escoliosis, cifosis) (Afonso et al., 2000). Navarro et al. (2009a y 2009b) estimaron la interacción GxA en caracteres de crecimiento de dorada a través de correlaciones genéticas de los mismos caracteres en dos ambientes (jaulas insulares y tanques) considerados como caracteres distintos (Falconer y Mackay, 1996), obteniendo resultados que mostraban la falta de interacción GxA. Sin embargo, existen evidencias generales de que la interacción GxA aumenta en animales de cultivo con el incremento de las distancias genéticas y de las diferencias entre ambientes (Dunham et al., 2001), pero en la actualidad no existen antecedentes de que esto se haya medido en doradas entre ambientes más distantes y diferentes. 1.3.5 Evaluación Genética y Reposición El nivel de confidencialidad de las empresas españolas y mediterráneas de acuicultura es muy elevado, lo cual hace muy difícil conocer con total exactitud el grado en que éstas tienen implementados sistemas de control genético en su sistema de producción. Aún así, es conocido que el sector posee lotes de reproductores y pre-reproductores, a partir de los cuales se hace la reposición, cuando en los primeros se produce mortalidad o cambio de la proporción sexual de los peces debido al carácter proterándrico de dorada. El uso de criterios genéticos mínimos, como es la consanguinidad individual, no está extendido debido al alto coste económico que supone caracterizar los núcleos de reproductores y pre-reproductores con marcadores genéticos, por lo que, de llevarse a cabo, ésta se produce fundamentalmente en las grandes empresas. Es más, todavía existen empresas que minimizan la consanguinidad de sus stocks de reproductores mediante la inclusión de nuevos ejemplares procedentes de la naturaleza. Introducción General 22 Más lejos aún está la reposición de los núcleos de reproductores con criterios que incluyan el valor mejorante de los peces en las empresas de dorada. Como denotan los similares niveles de variación genética entre poblaciones naturales y de cultivo, la intervención genética es escasa o reciente, cuando es sabido que la implementación de programas de mejora genética desde distintos puntos de vista optimiza las producciones, racionaliza la gestión de la producción y aumenta la competitividad de las empresas, a la vez que preserva las poblaciones naturales. Es más, su implantación da un gran soporte en términos de calidad, trazabilidad y estabilidad. 23 1.4 OBJETIVOS Teniendo en cuenta todo esto, el objetivo del presente estudio es protocolizar y estandarizar las herramientas necesarias para desarrollar un esquema de selección en dorada, bajo condiciones industriales, a la vez que iniciar un programa piloto de mejora genética a escala nacional, a partir de peces criados en jaulas, tanques y esteros, en cuatro de las cinco comunidades autónomas productoras de esta especie, mediante los siguientes objetivos específicos: Objetivos Específicos: 1. Diseñar un panel de referencia de dos nuevas PCRs múltiplex de marcadores microsatélites, que permitan caracterizar de forma fiable y económica stocks de reproductores y descendientes de dorada e inferir sus relaciones de parentesco bajo puesta masal, además de compartir y normalizar resultados de distintas poblaciones. 2. Estimar las heredabilidades de nuevos caracteres de interés y las correlaciones genéticas y fenotípicas entre éstos, con el fin de que el sector industrial disponga de una información que le permita tomar decisiones más adecuadas de cara a explotar la rentabilidad de sus poblaciones sin modificar sustancialmente su idiosincrasia de producción. 3. Cuantificar la interacción genotipo-ambiente a escala nacional a través del cultivo de distintos lotes de descendientes provenientes de distintos stocks de reproductores en diferentes sistemas de engorde (tanques, jaulas flotantes y esteros) y regiones (insular y continental). 25 2. DESARROLLO DEL PRIMER PANEL ESTANDARIZADO DE DOS NUEVAS PCRS MÚLTIPLEX DE MARCADORES MICROSATÉLITES EN DORADA (SPARUS AURATA L.) Lee-Montero, I., Navarro, A., Borrell, Y., García-Celdran, M., Martín, N., Negrín-Báez, D., Sánchez, J.A., Armero, E., Berbel, C., Zamorano, M.J., Sánchez, J., Estévez, A., Ramis, G., Manchado, M., Afonso, J.M. Development of the first standardized panel of two new microsatellites múltiplex PCRs for gilthead seabream (Sparus aurata L.) Animal Genetics, (en prensa). Materiales y Métodos 32 Figura 2.1 Tipos de errores potenciales de genotipado durante el proceso de determinación y redondeado de los alelos del GremmProtocol; a) amplificación inadecuada, b) pérdida de un alelo, c) patrón de bandas confuso, d) alelos intermedios. Se consideraron cuatro tipos de errores: de acuerdo a la determinación del alelo; a) amplificación inadecuada: alturas de la banda menores de 300 Unidades Relativas de Fluorescencia (RFU), con mucho ruido de fondo o morfología alélica confusa (Figura 2.1A; Pompanon et al., 2005), b) pérdida de alelo: amplificación preferencial del alelo ligero con respecto al pesado (Figura 2.1B; Castro et al., 2006); c) patrón de bandas confuso: patrón de bandas tartamudas que tienen la última banda más baja que la penúltima lo que hace difícil distinguir entre un homocigoto y un heterocigoto en alelos adyacentes (Figura 2.1C; Hoffman y Amos, 2005); y de acuerdo al redondeado de los alelos, d) alelos intermedios: loci di-nucleótidos con alelos que difieren en una base entre uno y otro (Figura 2.1D; Castro Desarrollo de nuevas PCRs Múltiplex 33 et al., 2004). Cada microsatétile se evaluó según el GremmProtocol, tras el genotipado de las muestras control. Previamente, se verificó el correcto funcionamiento de los marcadores de peso molecular en todos los electroferogramas, a fin de considerar sólo los errores relacionados con la secuencia de ADN de los cebadores y no con una mala carrera en el secuenciador. 2.2.3 Optimización de las PCRs Súper Múltiplex Después de la evaluación de los microsatélites, se descartaron aquellos marcadores que no amplificaron, los que tuvieron baja variabilidad genética y aquellos valorados negativamente según el GremmProtocol. Finalmente quedó un grupo de 79 marcadores que se consideraron adecuados, al que se le denominó Radal. Sus secuencias, el número de acceso al GenBank y los fluorocromos se muestran en la Tabla 2.1. A partir de estos marcadores, se diseñaron dos PCR Múltiplex, llamadas SMsa1 y SMsa2 (SúperMúltiplex Sparus aurata). El número de marcadores incluidos en cada PCR múltiplex fue el más alto posible teniendo en cuenta su grupo de ligamiento (para que no se repitiera en la misma reacción), rango alélico y color del fluorocromo (la distancia mínima entre marcadores con el mismo color fue de 18 pb para evitar solapamientos). Inicialmente, la concentración de los cebadores en cada PCR múltiplex fue de 0,2 μM, y se fue modificando hasta que las bandas de los alelos tuvieran alturas de entre 600 y 3000 RFU tal y como describieron Navarro et al. (2008). Aquellos marcadores microsatélites que no amplificaron en las PCRs múltiplex se reemplazaron por otros. Toda esta puesta a punto de las múltiplex se realizó sobre las muestras de prueba. Las condiciones de la PCR fueron las mismas que las utilizadas en las PCR simples ya descritas. Una vez más, previo a la carrera en el secuenciador automático, se comprobó la adecuada amplificación de los amplicones, mediante una electroforesis en gel de agarosa al 2% durante 30 min (8v∙cm−1). Las condiciones del secuenciador automático fueron también las mismas que las de las PCRs simples excepto que los productos de la reacción se diluyeron al 50-85% dependiendo del secuenciador utilizado en cada laboratorio. Los electroferogramas se analizaron usando el programa GeneMapper (v.3.7) utilizando dos kit de set de bins creados específicamente para estas reacciones (kit-SMsa1 y kit-SMsa2), los cuales están disponibles en jafo[email protected].es y son una especie de macros que incluyen los rangos alélicos de todos los marcadores de una múltiplex permitiendo su lectura automática. Materiales y Métodos 34 Tabla 2.1. Radal: Listado de marcadores microsatélites seleccionados como adecuados en este estudio: código interno (CI), nombres de los loci, número de acceso al GenBank, fluorocromos y secuencias de los cebadores. Todos los marcadores fueron descritos originalmente por Franch et al. (2006), excepto los que se indican con un asterisco (Argyrokastritis et al., 2002), dos asteriscos (Brown et al., 2005b) o tres asteriscos (Batargias et al., 1999). CI Locus Acceso Secuencia del cebador forward (5′→3′) Secuencia del cebador reverse (5′→3′) 5'6-FAM B 1 CId-24-H DQ851306 AGATCCCTCACTGCAGCAAA gtttAGTCTGCATGTTTATATGAGAGCAA B 3 Gt57 DQ851386 CCTGACTCTTACCCCAGTCG gtttAATTACTCCTGTGCTGCATTCTG C 1 DId-14-H DQ851338 CCTTGAAAAGGACACTCACTGATAG gtttATCCCGCTGTCCGAATGA C 2 Fd-48-F DQ851374 ATTACAGCCAGAGGACTGGAGAG gttTCAGAGAGAGTGTTCTTGTGTATCTG C 3 EId-39-T DQ851367 GAACTGTGTGAGAGAGGACAGTTG GAAGGAAAAATTCTGATTGGAGTTC C 4 Saimbb16 AJ418652* ACCTGTTTCTTTGATTTGTTGC gtttCATAACAGCAGGATAGGTCAGACT D 2 Saimbb26 AJ418656* CAATGGCAAAAGCAATGG gtttAAGTGACGACGCAGTGTGA D 4 P3 DQ851284 GAGGGGACACGTAAATTTGG gtttAACAACAGTCAAATGCTGAGTTGT E 1 Bd-68-T DQ851270 AGGGGCGTTTCAGGTTCT gtttAGGTGAGTCCGTCAATCAGTGTAT E 3 Fd-81-F DQ851377 GGCTGGACATGCTTTCATAGAT gtttAGCGCTTGAAGATAAAACAACTCT F 1 Bt96 DQ851295 TCCAGCTTGGGATCAATAAAGTA GCTAGTTTTCCTGAAACAGTCATTT F 2 CId-26-H DQ851307 ATGTGAAACAGAGTGGAAGAAAAAC gtttAGACGACAGACAAAGACCACAGT G 2 CId-03-F DQ851301 ATGACTAAACATCACGTTCATGGAT 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GTCAGTGATGACATACAGATCACCT gtttAGTTCAACTTAAAAAGGGCAGAGTT E 9 Fd-92-H DQ851379 TAGAGAAAGGCATTTTGTCAATGAG GCATCAGACAGACGGGTACAGT F 7 Hd-77-F DQ851400 CATGTGTTGTTTGTTTGTCAGAGTG gtttCAACATACATGCATACTGAGGAAAG G 9 DId-31-H DQ851345 AACAAACAGCGTTGTCTCAGAAC GAAACCTAAGGCCTCATTTGG H 8 P60 DQ851290 ATGCTGACATAACACAATGTAGCTC GAGAAGTGAGGGGATACCTGAG I 7 Fd-90-H DQ851378 CAGACTGAGGAGATGGAGGAGAC gtttAGACTCTGTGTTTGGTACAGCAGAT I 8 B13b DQ851252 ATGACAGTGTTTGAGCTCAGTGTTA gtttCCTGCATTCCAGCTTCAGAT I 9 At37 DQ851250 GGTTAGGGTAATCAGAAATGCAATG gtttCTTCTCCAGTCACGATCAATAAAG K 4 EId-08-H DQ851358 CTGTTGACGTGGTACTGAATACATC GGAAAGTTCTGAAAGAATAAGAACC K 6 B82b DQ851257 GCAGAGCAGTGGAAGCAAG gttTCCCCTCTCCTGTGTCTTTTACTA M 3 BId-04-F DQ851276 GATCTCATTATGACGGATCATTAGC gtttATCTTTGTCCGCATGTTTCAC M 4 DId-22-F DQ851342 GGTCAGATAGTTCAGTCATGGATTC gtttCTCCCCTCTACCTCCCAATAAGT Desarrollo de nuevas PCRs Múltiplex 35 2.2.4 Genotipado y Asignación Familiar Cuatro laboratorios españoles de genética en acuicultura genotiparon las muestras control con la SMsa1 y la SMsa2, utilizando los kit de set de bins, para validar la robustez de las mismas en el genotipado. Para probar la utilidad de ambas múltiplex en la asignación parental, se genotiparon con la SMsa1 los tres lotes de reproductores y su descendencia, mientras que con la SMsa2 sólo los reproductores del ICCM y sus descendientes. Cada lote de reproductores se genotipó en un laboratorio diferente utilizando el GeneMapper (v.3.7) y el kit de SMsa1-bin. Cada carrera de muestras para genotipar contenía una de las muestras control que se utilizó como muestra de referencia (Ref-sa), disponible si se solicita a [email protected]. Las asignaciones familiares se determinaron utilizando los genotipos de cada múltiplex PCR de manera independiente. 2.2.5 Análisis de Datos La heterocigosidad observada (Ho), heterocigosidad esperada (He) y el contenido de información polimórfica (PIC) de cada marcador fueron estimados usando el programa Cervus (v 3.0.3) (Kalinowski et al., 2007). Los marcadores se ordenaron de acuerdo a su PIC, como altamente informativos (PIC ≥ 0,5), razonablemente informativos (0,5> PIC> 0,25) y ligeramente informativos (PIC ≤ 0,25) (Botstein et al., 1980). La frecuencia real de alelos nulos se calculó a partir de los reproductores que contribuyeron a la puesta, mediante el análisis de segregación. La probabilidad de exclusión combinada (PEC) se estimó en cada PCR múltiplex usando el programa Cervus (v 3.0.3) con la opción parent pair (Jamieson y Taylor, 1997). La Tasa de Asignación Predicha (en inglés: Predicted Assignment Rate o Pall), parámetro propuesto por Vandeputte et al. (2011) para evaluar el poder de asignación de los marcadores microsatélites en análisis de pedigrí de peces, se estimó mediante la ecuación número nueve de estos autores. Las asignaciones parentales entre los reproductores (con sexo desconocido) y sus descendientes se determinaron utilizando el método de exclusión con el programa VITASSING V.8_2.1 (Vandeputte et al., 2006). 36 2.3 RESULTADOS 2.3.1 Evaluación de los Marcadores Microsatélites De los 138 marcadores microsatélites, diez de ellos no amplificaron de forma individual (A3, B9, B11, C5, D8, E7, H3, J4, J12, K12) y dos fueron monomórficos (D3, M1). En los restantes 126 marcadores, la Ho varió de 0,08 a 1, y la He entre 0,121 a 0,976. Aquellos marcadores que mostraron una Ho <0,3 fueron considerados inadecuados (A2, A6, A7, B2, B5, C8, C11, I1, J6, J7, L4, L6, M8). De acuerdo a su valor de PIC, el 77% de los marcadores fueron altamente informativos, el 19,8% fueron razonablemente informativos (A1, A2, A4, A7, A10, B5, B7, B10, C6, C11, D5, E2, E10, I1, J6 , K1, K5, L1, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L12) y el 3,2% fueron ligeramente informativos (B2, C8, J7, L4). Sólo los marcadores altamente informativos fueron considerados adecuados. Según el GremmProtocol, se encontraron errores o potenciales errores en 20 de los 126 marcadores clasificados con 1 ó 2: cinco marcadores mostraron amplificación inadecuada (B10, D1, G8, J6, L3), seis mostraron pérdida de alelo (B4, G1, I3, J5, K1 K11,), dos tenían patrón de bandas confuso (D7, F8) y siete mostraron alelo intermedio en el redondeado de los alelos (C7, H9, K5, K9, K10, L2, M2). Sólo los marcadores clasificados con un 3 se consideraron adecuados. Al final de la evaluación, quedaron 79 microsatélites seleccionados como adecuados (Radal), cuya variabilidad genética y rango alélico se muestra en la Figura 2.2. Los valores medios de estos marcadores fueron 8,2 para el número de alelos (de 3 a 21), 0,762 para Ho (desde 0,364 a 1,0), 0,797 para He (0,589 a 0,976) y 0,737 para el PIC. Todos estos marcadores fueron di-nucleótidos excepto cinco que fueron tetra-nucleótidos (B6, F1, F3, I9, M5). 2.3.2 Optimización de las PCRs Súper Múltiplex A partir del Radal, se diseñaron dos PCR múltiplex de 11 marcadores cada una. De los microsatélites inicialmente elegidos para cada reacción múltiplex, el A9 no amplificó correctamente en la SMsa1 y el G4 en la SMsa2, por lo que el marcador A9 se reemplazó por el F6. Sin embargo, no había ningún marcador adecuado que pudiera reemplazar al G4 teniendo en cuenta su grupo de ligamiento, rango alélico y fluorocromo, por lo tanto, se sustituyó por un marcador razonablemente informativo (L7) que cumplía los otros requerimientos (Locus: Dd-57-T; código del GenBank: DQ851327; secuencia del cebador forward: TCATTGTTCAGATAATGGGACAC; secuencia del cebador reverse: gtTTCAAAATCTTTTGGTCTGTGC). Desarrollo de nuevas PCRs Múltiplex 37 Los marcadores de cada PCR múltiplex y sus concentraciones, alcanzadas después de nueve pasos durante la puesta a punto, se presentan en la Tabla 2.2. Tabla 2.2. Información genética de las Súper Múltiplex optimizadas en este estudio para dorada (SMsa1 y SMsa2): Código interno, fluorocromo, grupo de ligamiento (GL), motivo nucleotídico, concentración de cebadores, rango alélico (en pares de bases), número de alelos, heterocigosidad observada y esperada, contenido de información polimórfica y genotipo de la muestra de referencia (Ref-sa) para cada uno de los marcadores microsatélites Código Interno Fluorocromo GL Motivo Nucleotídico Concentración (µM) Rango Alélico Nº alelos Heterocigosidad Observada Heterocigosidad Esperada Contenido Información Polimórfica Genotipo muestra referencia SMsa1 E1 5' 6-FAM 23 di 0,02 72-90 24 0,829 0,778 0,741 78/84 C3 5' 6-FAM 6 di 0,06 104-164 8 0,907 0,937 0,931 128/140 D4 5' 6-FAM 1 di 0,09 171-207 12 0,698 0,829 0,808 199/203 E4 5* NED 11 di 0,06 64-92 4 0,824 0,837 0,819 78/84 A5 5* NED 20 di 0,03 106-112 27 0,624 0,622 0,547 108/110 M5 5* NED 24 tetra 0,08 128-232 6 0,844 0,884 0,873 136/192 L11 5' PET 10 di 0,07 103-113 7 0,727 0,714 0,661 107/109 F6 5* PET 3 di 0,09 130-144 8 0,488 0,498 0,471 140/140 D11 5* VIC 5 di 0,03 76-92 9 0,800 0,807 0,783 76/90 C12 5* VIC 18 di 0,03 121-137 10 0,600 0,610 0,579 123/131 I9 5* VIC 19 tetra 0,04 142-178 13 0,766 0,790 0,757 154/162 SMsa2 J1 5* 6-FAM 5 di 0,06 76-102 8 0,848 0,828 0,801 84/88 G2 5* 6-FAM 13 di 0,06 113-137 13 0,732 0,808 0,786 117/119 G3 5* 6-FAM 26 di 0,03 150-170 8 0,607 0,667 0,613 164/170 L7 5* NED 16 di 0,05 76-80 3 0,330 0,359 0,312 78/78 H5 5* NED 25 di 0,07 91-123 15 0,884 0,894 0,881 119/119 B6 5* NED 20 tetra 0,05 140-208 16 0,911 0,905 0,893 164/176 F4 5* PET 14 di 0,09 66-90 10 0,670 0,777 0,741 74/82 C10 5* PET 23 di 0,09 127-161 16 0,848 0,858 0,840 135/155 M3 5* VIC 7 di 0,05 83-95 6 0,705 0,702 0,653 87/89 H8 5* VIC 19 di 0,02 108-116 3 0,580 0,664 0,587 114/116 I8 5* VIC 3 di 0,06 128-144 9 0,813 0,757 0,729 134/136 Resultados 38 63 bp 70 bp 80 bp 90 bp 100 bp 110 bp 120 bp 130 bp 140 bp 150 bp 160 bp 170 bp 180 bp 190 bp 200 bp E4-LG11-AC-10-0.867-0.867-0.819 F4-LG14-AC-7-0.667-0.763-0.701 D11-LG5-GT-8-0.938-0.869-0.823 J1-LG5-GT-7-0.938-0.806-0.748 C1-LG9-CA-7-0.375-0.819-0.763 E1-LG23-GT0-5-0.733-0.731-0.649 K4-LG25-TG0-5-0.750-0.645-0.57 K7-LG7-AC-8-0.688-0.813-0.759 B1-LG2-CA-9-0.733-0.816-0.762 F1-LG5-TATC-12-0.833-0.929-0.892 M3-LG7-CA-6-0.667-0.680-0.601 D6-LG11-GT-11-1.000-0.853-0.811 H1-LG14-GT-11-0.813-0.810-0.767 K8-LG3-CA-14-0.867-0.931-0.892 G4-LG15-AC7-6-0.909-0.814-0.768 H6-LG26-GT7-13-0.438-0.915-0.876 E9-LG12-GT-9-0.733-0.876-0.83 G6-LG18-AC-6-0.800-0.779-0.694 K2-LG3-GT-8-0.875-0.855-0.806 D2-LG24-CA-10-0.938-0.897-0.856 D12-LG23-AC-10-1.000-0.887-0.842 J2-LG22-CA-9-0.800-0.857-0.807 E5-LG13-CA-9-0.875-0.917-0.844 J10-LG12-AC-5-0.625-0.732-0.656 H4-LG17-CA-6-0.875-0.758-0.692 M6-LG11-AC-3-0.400-0.628-0.539 A8-LG8-AC-10-0.733-0.890-0.844 F7-LG25-TG-6-0.583-0.660-0.643 I7-LG24-GT7-7-0.750-0.740-0.686 A11-LG25-CA-11-0.750-0.913-0.874 F3-LG14-TAGA-9-0.923-0.887-0.863 C2-LG1-CA-7-0.867-0.749-0.683 E6-LG7-AC-21-0.929-0.976-0.938 K6-LG14-CA-8-0.875-0.835-0.787 L11-LG10-GT-5-0.750-0.669-0.606 B8-LG4-CA-8-0.667-0.649-0.588 I5-LG2-GT-5-0.500-0.611-0.551 H5-LG25-AC-7-0.600-0.694-0.644 A5-LG20-CA-4-0.813-0.696-0.608 Figura 2.2 Variabilidad genética de los marcadores adecuados de este estudio (Radal), ordenados de acuerdo a su rango alélico y etiquetados en el siguiente orden: Nombre (código interno) – Grupo de LigamientoMotivo nucleotídico - Número de alelos – Heterocigosidad observada - Heterocigosidad esperada – Contenido de información Polimórfica. Desarrollo de nuevas PCRs Múltiplex 39 63 bp 70 bp 80 bp 90 bp 100 bp 110 bp 120 bp 130 bp 140 bp 150 bp 160 bp 170 bp 180 bp 190 bp 200 bp J8-LG15-CA-5-0.625-0.613-0.554 C9-LG7-GT-5-0.400-0.687-0.603 K3-LG14-TG-7-0.400-0.772-0.719 I4-LG26-CA-6-0.867-0.805-0.749 G9-LG1-CA-8-0.917-0.790-0.716 C3-LG6-TG-13-0.933-0.920-0.879 H2-LG18-GT-15-0.733-0.947-0.909 I2-LG20-GT-12-0.938-0.923-0.885 H8-LG19-TG-3-0.875-0.677-0.582 F2-LG13-CA-9-0.636-0.797-0.734 I6-LG7-CA-7-0.938-0.859-0.81 M9-LG24-AC0-5-0.800-0.752-0.678 J3-LG5-TG-16-0.938-0.950-0.914 G7-LG14-CA-8-1.000-0.848-0.785 G2-LG13-CA-8-0.700-0.774-0.739 G5-LG24-AC-8-0.800-0.874-0.808 E8-LG4-GT-6-0.364-0.756-0.544 M7-LG18-CA-8-0.800-0.766-0.703 F5-LG6-GT-6-0.500-0.742-0.663 D9-LG3-GT-7-0.750-0.756-0.687 B3-LG17-CT-7-0.467-0.589-0.544 J11-LG2-TG-8-0.813-0.796-0.742 C12-LG18-CT-6-0.813-0.722-0.652 H7-LG1-GT-4-0.625-0.732-0.654 D13-LG10-AC-11-0.600-0.897-0.853 M4-LG8-GT-5-0.571-0.741-0.671 I8-LG3-GT-7-0.938-0.754-0.697 D10-LG18-CA-8-0.563-0.786-0.734 J9-LG1-GT-12-1.000-0.885-0.841 C10-LG23-AC-9-0.800-0.869-0.821 A12-LG5-TG-10-0.875-0.851-0.804 E3-LG10-TG-12-0.867-0.910-0.869 F6-LG3-GT-6-0.938-0.700-0.506 A9-LG2-TG-8-0.667-0.793-0.74 M5-LG24-TAGA-13-0.999-0.897-0.855 B6-LG20-AGAT-12-1.000-0.921-0.877 C4-LG17-CA-8-0.667-0.623-0.574 G3-LG26-TG-8-0.867-0.807-0.736 I9-LG19-TAGA-5-0.500-0.623-0.551 D4-LG1-TG-7-0.800-0.816-0.760 Figura 2.2 (Continuación). Resultados 40 2.3.3 Genotipado y Asignación Familiar El genotipo de la Ref-sa para cada marcador en la SMsa1 y la SMsa2 y la diversidad genética de cada marcador microsatélite de ambas múltiplex se muestran en la Tabla 2.2. Los datos de la SMsa1 se obtuvieron a partir de los genotipos de los reproductores del estudio (ICCM, PMAR Y CSUR), mientras que los de la SMsa2 solo a partir de los genotipos de los reproductores del ICCM más 25 descendientes de PMAR y 25 descendientes de CSUR. Los valores medios para la SMsa1 fueron: número de alelos (NA) = 11,6, Ho = 0,737, He = 0,755 y PIC = 0,725 y para la SMsa2: NA = 10,4, Ho = 0,760, He = 0,786 y PIC = 0,752 (sin L7). La PEC a priori fue máxima (0,999) para las dos múltiplex, mientras que Pall fue 0,899 para SMsa1 y 0,878 para SMsa2. La longitud del amplicón para los loci de ambas múltiplex varió desde 64 a 232 pb y sólo tres marcadores presentaron longitudes superiores a 180 pb. La distancia mínima entre marcadores con el mismo color tras del genotipado fue de 5 pb en la SMsa1 y 11 pb en la SMsa2. La variabilidad genética de la SMsa1 fue similar en cada lote de reproductores. Los valores medios para el ICCM fueron Ho = 0,765, He = 0,758, PIC = 0,722, para PMAR fueron Ho = 0,733, He = 0,754, PIC= 0,715 y para el CSUR fueron Ho = 0,723, He = 0,738, PIC = 0,704. La facilidad de lectura de cada PCR múltiplex se comprobó después de genotipar las muestras control en los cuatro laboratorios. El porcentaje de error, es decir, el porcentaje de las diferencias en la asignación de los alelos entre los laboratorios fue del 1% en la SMsa1 y del 0,5% en la SMsa2. Las asignaciones parentales se determinaron permitiendo tres errores en el programa. El mayor número de errores fueron identificados como alelos nulos. En la SMsa1, la presencia de alelos nulos y sus frecuencias fueron diferentes de acuerdo al lote de reproductores. Los reproductores del ICCM mostraron alelos nulos en los marcadores D4 (0,136) y A5 (0,023), en los de PMAR los marcadores con alelos nulos fueron el D4 (0,611) y C3 (0,833) y en los de CSUR el marcador fue el D4 (0,037). En la SMsa2, sólo presentaron alelos nulos los reproductores del ICCM, en los marcadores M3 (0,045) y G3 (0,028). Las tasas de asignación parental real con la SMsa1 fueron exitosas en todos los lotes de reproductores. En la descendencia del ICCM y de PMAR se logró un 100% de éxito. Inicialmente, el 2,5% de los descendientes del ICCM fueron asignados a dos parejas de posibles padres, pero después de deducir el sexo de los reproductores de las parejas asignadas, dos de estas parejas resultaron incompatibles. El 88% de los descendientes de CSUR fue asignado a una única pareja de padres y el 12% a dos posibles parejas con un reproductor común. La asignación de los padres mediante SMsa2 sólo se llevó a cabo en la descendencia del ICCM, lográndose el 100% de éxito. 41 2.4 DISCUSIÓN 2.4.1 Evaluación de Marcadores Microsatélites Los microsatélites han proporcionado a los genetistas una poderosa herramienta que ha abierto perspectivas interesantes en muchos campos de investigación, como por ejemplo en la acuicultura (Lo Presti et al., 2009). Éstos tienen una alta sensibilidad para la detección de la variabilidad genética dentro y entre poblaciones, sin embargo, antes de ser aplicados necesitan ser estudiados para conocer su real poder informativo (Wilson y Ferguson, 2002). En este estudio, 138 marcadores microsatélites se han diseñado y evaluado de acuerdo a su variabilidad genética en tres poblaciones diferentes de dorada. En análisis parentales a gran escala, la Ho y He son medidas útiles del grado de información que tiene un locus (Nei, 1987). Blouin et al. (1996) determinaron que para estimar la relación entre los individuos, se requieren casi dos veces más microsatélites con He de 0,62 para conseguir la misma precisión conseguida con un número dado de loci con He de 0,75. Los microsatélites también proporcionan información sobre el estatus genético de la población. En poblaciones cultivadas de dorada la heterocigosidad media es alta (Castro et al., 2007; Navarro et al., 2008; Porta et al., 2010; Borrell et al., 2011), y similar a la encontrada en este estudio. El valor del PIC en un microsatélite también es una medida del grado de información (Botstein et al., 1980; Hearne et al., 1992) realmente útil en análisis de parentesco (Piñera et al., 2006). En este estudio, el 77% de los marcadores fueron altamente informativos. Además, ningún valor de PIC ha sido citado para los microsatélites en el mapeo genético (Franch et al., 2006; Senger et al., 2006). En la evaluación de los marcadores microsatélites, la facilidad de lectura o fiabilidad del genotipado es una cuestión tan importante como el grado de polimorfismo (Miquel et al., 2006). Sin embargo, la mayoría de los artículos no hacen mención a la tasa de error obtenida lo que plantea dudas sobre la fiabilidad de algunos de sus genotipos (Bonin et al., 2004). Durante la determinación del genotipo en el electroferograma, surgen dificultades que podrían potencialmente convertirse en errores de genotipado (Pompanon et al., 2005) e influir en las asignaciones parentales (Bonin et al., 2004). En este estudio, los errores de genotipado o potenciales errores, fueron clasificados en cuatro tipos, de acuerdo al nivel de determinación de los alelos y al redondeo de los mismos. La identificación de estos errores o potenciales errores es la clave para una determinación correcta del genotipo. Al mismo tiempo, la facilidad de cada microsatélite genotipado fue evaluado por la cuantificación de estos errores o potenciales errores, mediante el GremmProtocol. Este método representa una poderosa herramienta para valorar la fiabilidad del procedimiento del genotipado y permitirá comparaciones entre loci, estudios, o laboratorios diferentes. En este estudio, se encontraron algunos errores o potenciales 49 3.1 INTRODUCCIÓN El crecimiento y consolidación de la industria de dorada ha venido acompañado por una estabilización en los precios de mercado en los últimos cuatro años, aumentando con ello la competitividad de las empresas que se vuelcan en intensificar su cultivo, minimizar costes y/o dar un valor añadido a su producto. Para llevarlo a cabo, las empresas realizan distintas actuaciones alrededor de la alimentación, del manejo de los lotes, de la prevención de enfermedades e incluso de la ubicación de sus instalaciones. Sin embargo, actualmente, a nivel industrial, son escasas las estrategias que implican programas de mejora genética. El objetivo de un programa de mejora es el incremento simultáneo de varios caracteres de interés, ponderando cada uno de ellos por su respectivo valor económico (Falconer y Mackay, 1996). En acuicultura suelen tenerse en cuenta el crecimiento, la edad a la madurez sexual, la resistencia a enfermedades y la calidad del pez y de la carne (Toro y López-Fanjul, 2009). Sin embargo, depende de la especie e incluso de la población (Gjedrem, 2000). En dorada, al igual que ocurre en otras especies de aptitud cárnica, la conversión del alimento es uno de los caracteres más importantes, desde el punto de vista económico, ya que representa una gran proporción del costo de producción total, alcanzando el 40% del valor final del producto en dorada (Jover, 2007) durante el engorde en jaulas oceánicas. Sin embargo, debido a que este carácter es difícil de medir en condiciones industriales a nivel de individual, su mejora se realiza indirectamente, a través del incremento de los caracteres de crecimiento (peso y longitud) (Navarro et al., 2009a) dado que presenta una correlación genética elevada y positiva con estos caracteres (McPhee et al., 1979; Afonso, 1996). Estrechamente relacionado con el crecimiento están los caracteres de rendimiento. La elaboración de productos transformados como el fileteado, representa un sector del mercado muy interesante para la industria y para el consumidor, en la medida que se ofrece un producto procesado a un precio asequible y que permite una mayor facilidad para la elaboración del alimento. En dorada, aunque esta es una vía de comercialización que aún queda por explotar, estudios de mercado muestran que sería una industria interesante, rentable y de mucha demanda (Luna, 2006). La morfología es también un carácter económicamente relevante. En la producción animal y vegetal la apariencia de los productos (p.ej. forma, tamaño, color y ausencia de defectos como deformidades) cobra una gran importancia a la hora de su comercialización, jugando un papel clave en la decisión final por parte del consumidor (Blonk et al., 2010; Costa et al., 2011). En el ámbito de la mercadotécnica y la publicidad es muy utilizada la frase “todo entra por la vista”, lo cual se acentúa en el caso de los productos de acuicultura y en especial de aquellos productos que como la dorada se Introducción 50 comercializan como pez entero, teniendo influencia en la depreciación (Elvingson y Johansson, 1993). Como variables morfológicas, podemos incluir la compacidad, variables morfométricas y prevalencia de deformidades. Las anormalidades o deformidades en peces, tanto a nivel de alevín como a talla de sacrificio, determinan la calidad del pez y tienen una repercusión económica muy alta (Afonso y Roo, 2009). La industria de dorada, a pesar del rápido crecimiento que ha tenido, no se encuentra en la actualidad exenta de problemas, al igual que muchas otras especies marinas. Uno de ellos es la alta incidencia de malformaciones (Roo et al., 2005; Afonso y Roo, 2009; Izquierdo et al., 2010; Fernández et al., 2012). Las deformidades merman las capacidades fisiológicas para un buen desarrollo, disminuyen la tasa de crecimiento, aumentan la mortalidad y también tienen implicaciones importantes desde el punto de vista del bienestar animal (Karahan et al., 2012.). Además los peces con alguna malformación son menos aceptados por los consumidores (Bardon et al., 2009), lo que repercute en la producción y comercialización (Boglione y Costa, 2011), y con más intensidad en los peces que se venden como pez entero, puesto que las deformidades son evidentes (Beraldo et al., 2003), pudiendo llegar a producir pérdidas del 5% de las ganancias en peces en juveniles y adultos (Andrades, 1996). En general, las deformidades en piscicultura son un problema que ha sido ampliamente estudiado, pero parcialmente comprendido (Witten et al., 2009; Boglione y Costa, 2011), y en los que pueden influir factores físicos, químicos, nutricionales, biológicos, fisiológicos, ambientales y genéticos (Thankappan y Thampy, 1990; Chatain, 1994; Lall y Lewis-McCrea, 2007; Afonso y Roo, 2009; Roo et al., 2009; Izquierdo et al., 2010; Boglione y Costa, 2011). En cuanto a factores técnicos relacionados con los sistemas de cultivo, existe una relación significativa entre desarrollo osteológico y deformidades esqueléticas con la intensidad del sistema de cultivo (Boglione et al., 2001; Roo et al., 2009, 2010a, 2010b), por lo que los peces criados en condiciones extensivas presentan una menor prevalencia de deformidades esqueléticas que aquellos criados en sistemas intensivos y similar a los juveniles salvajes (Roo et al., 2010c). Las principales deformidades en peces pueden agruparse en cinco categorías: forma, pigmentación, escamas, esqueléticas y vejiga natatoria (Divanch et al., 1996). De éstas, las esqueléticas (neurocráneo o cabeza, columna vertebral y esqueleto apendicular) son las más importantes, ya que alteran de manera severa la morfología de los peces cultivados (Afonso y Roo, 2009). Dentro de las deformidades de cabeza, se encuentran las anomalías asociadas al complejo opercular y a la mandíbula (Galeotti et al., 2000; Cobcroft et al., 2001; Beraldo et al., 2003; Cobcroft et al., 2004; Fraser y Nys, 2005; Verhaegen et al., 2007; Morel et al., 2010). Dentro de las de la columna vertebral, las deformidades más comunes son la lordosis (deformidad dorsal, forma en V), escoliosis (deformidad lateral, forma de zigzag), cifosis (deformidad ventral, forma en Ʌ) y fusión de vértebras (Afonso et al., 2000). En dorada, al igual que en otros espáridos como el bocinegro, lubina y dorada japonesa, las malformaciones más Estimas de Parámetros Genéticos 51 relevantes son las que afectan al complejo opercular, neurocráneo y columna vertebral (lordosis y fusión de vertebras) (Afonso y Roo, 2009; Roo et al., 2009). Por otro lado, la calidad de la carne es un parámetro muy valorado actualmente, los consumidores de pescado muestran un interés creciente por productos de calidad a la vez que no están dispuestos a pagar un precio excesivo por ellos (Gjedrem, 1997). Esto, unido a la competitividad de las empresas, está haciendo más y más relevantes los caracteres de calidad. En este sentido la composición del músculo juega un papel principal a través de atributos de calidad como son el sabor, la jugosidad, la textura y la apariencia. El sabor y la jugosidad están alta y positivamente correlacionados con el contenido de grasa en el músculo (Grigorakis, 2007). La fracción lipídica es el componente que presenta una mayor variación, más aún cuando se trata de una especie grasa, o una semigrasa en las que su contenido graso varía entre el 3-15% (Zamil et al., 1992), como es el caso de dorada. La variación en el porcentaje de lípidos se refleja en el porcentaje de agua, ya que ambos son complementarios, debido a la necesidad de los peces para mantener una densidad ligeramente mayor que la del agua (Iles y Wood, 1965). Por lo tanto, la medición de uno puede servir para determinar la del otro, si la relación es conocida. En este sentido el medidor Distell Fish Fatmeter (Distell.com, West Lothian, Escocia) utiliza este hecho para establecer el contenido de grasa. Este aparato, es un método novedoso, rápido y no invasivo que mediante un sensor de microcinta que es sensible al contenido de agua de la muestra y usando datos de calibración de especies, determina el porcentaje de grasa muscular del animal, vivo o muerto. La textura de la carne es otra variable de calidad. Además de ser un trazador de la pérdida de frescura (Ginés et al., 2002), está relacionada con la firmeza y elasticidad de la carne, atributos importantes a valorar en el desarrollo de un análisis descriptivo cualitativo llevado a cabo por jueces entrenados en un panel de cata (Regost et al., 2003; Rincón et al., 2009). La textura puede ser medida de manera instrumental y rápida mediante un texturómetro, o analizando la cantidad de colágeno. Éste forma el principal tejido conectivo entre las células, siendo los filetes más blandos los de menor contenido en colágeno (Hatae et al., 1986), además, cuando son cocinados, son más fibrosos, secos y de menor elasticidad, a diferencia de la de mayor cantidad de colágeno que tras ser cocinados presentan una textura tierna, suculenta y elástica (Sato et al., 1986). Otro aspecto importante de la calidad, es la grasa concentrada dentro de la cavidad visceral, ya que afecta negativamente a la impresión del consumidor sobre el pescado, jugando un papel notable en el sentido visual (Grigorakis, 2007). También significa energía que se desecha, ya que cuando los peces son eviscerados, la grasa visceral es retirada junto con el tracto intestinal (Navarro et al., 2009b). Antes de establecer los objetivos o criterios de selección en un programa de mejora es necesario conocer cuanta de la variación fenotípica de esos caracteres es determinada genéticamente, para saber si se pueden o no mejorar mediante selección genética (Falconer y McKay, 1996). Aunque la tasa de progreso genético pueda parecer pequeña en relación con las atribuibles a los avances en nutrición o Introducción 52 manejo, debe tenerse en cuenta que, a diferencia de estos últimos, la ganancia genética es continua, acumulativa y permanente (Toro y López-Fanjul, 2009). Sin embargo, son pocos los parámetros genéticos que han sido publicados en dorada para estos caracteres económicamente importantes, y menos aún los que se han estimado bajo condiciones industriales: Knibb et al. (1997) estimaron una heredabilidad realizada para el peso al sacrificio, a partir de la respuesta a una selección masal divergente después de una generación. Posteriormente Navarro et al. (2009a y 2009b) estimaron heredabilidades bajo condiciones industriales, a partir de peces engordados en Canarias tanto en tanques como en jaulas insulares, para caracteres de crecimiento, de la canal y de composición de la carne a talla de ración. Estos autores trabajaron en una muestra de descendientes provenientes de un lote de reproductores del Grupo industrial español Tinamenor S.A., a distintas edades de interés comercial (alevín, preengorde, primera maduración incipiente y talla de ración). Acerca de la determinación genética de las deformidades Afonso et al. (2000) describieron inicialmente una asociación familiar estadísticamente significativa para una triple deformidad de columna en sentido antero-posterior, mediante cruces dirigidos. Posteriormente, Astorga et al. (2004) estudiaron 38 tipos de deformidades morfológicas que aparecieron en dicho esquema, simples o combinaciones de éstas, sobre descendientes provenientes de un lote de reproductores con control individual del apareamiento, estimando heredabilidades de 0,85 para el carácter presencia-ausencia de cualquier tipo de deformidad. Thorland et al. (2006), en la empresa griega KEGO S.A., estimaron heredabilidades de 0,12 para la presencia-ausencia de la deformidad de cabeza y deformidades espinales. Por el contrario Castro et al. (2008) a escala experimental, no evidenciaron componente genético para las deformidades lordosis y opérculo. Por último, en un estudio de segregación en dorada, Rodríguez et al. (2011) revelaron a través de análisis fenotípico, un alto y significativo porcentaje de deformidad en descendientes cuando uno de sus padres era deforme, sugiriendo la posibilidad de determinación genética en la incidencia de deformidades para lordosis y fusión de vertebras. El conocimiento de las correlaciones genéticas entre los caracteres de interés también es primordial para un programa de mejora eficiente, ya que la selección de un carácter puede acarrear una respuesta correlacionada no deseada en otro carácter o por el contrario, un carácter puede ser mejorado intencionadamente de manera indirecta a través de otro (Falconer y McKay, 1996). De ahí lo importante de buscar nuevos parámetros rápidos, fáciles de medir y no invasivos que puedan estar correlacionados con los caracteres de interés y que puedan sustituir variables que en algunos casos además de engorrosas y lentas para medir, involucran el sacrificio del animal. Los caracteres morfológicos parecen ser un buen recurso para esto, al igual que se han utilizado en animales terrestres en los que se han encontrado algunos correlacionados con caracteres productivos (Simm, 1998; Conafe, 2012). Estimas de Parámetros Genéticos 53 Para mejorar la eficiencia de selección, los registros de los caracteres deben registrarse objetivamente (sin sesgos personales), de manera precisa y a un bajo costo (Gjedrem, 1997). Tecnologías como el análisis de imágenes han sido desarrolladas exitosamente en animales terrestres y plantas sometidas a mejora genética (Osawa et al., 2008; Rius-Vilarrasa et al., 2009, 2010; Costa et al., 2011). Esta tecnología permite el registro de caracteres de la forma del individuo, tanto de tipo lineal como dimensional, unificándolas en un objetivo, proporcionando una rápida, repetible y fiable información, útil para programas de selección genética. Otra ventaja es que es un método no invasivo que puede analizar los peces in vivo, además de que los peces sufren poca manipulación y estrés influyendo positivamente en su crecimiento, salud y supervivencia (Ruff et al., 1995). El principal obstáculo de este método de análisis en un estudio a gran escala, como es un esquema de selección genética, es que normalmente la etapa de segmentación de la imagen no es totalmente automática, siendo necesaria el anclamiento manual de determinados puntos (Stien et al., 2006). En este sentido, la aplicación de análisis de imagen “IMAFISH_ML” desarrollada en MatLab v.7.5 (The Math-Works Inc, Massachusetts, USA) por Navarro et al. (en preparación), es un método que a partir de sólo dos fotos del pez, analiza los archivos de manera totalmente automática y proporciona más de 25 variables morfométricas. Existen parámetros genéticos publicados para variables morfométricas en algunas especies como carpa común (Kocour et al., 2007), lubina (Costa et al., 2010), solea común (Solea solea) (Blonk et al., 2010), tilapia del Nilo (Rutten et al., 2005) y trucha arcoíris (Gjerde, 1989; Kause et al., 2003), revelando que en general tienen una alta determinación genética y que tienen un gran potencial para ser incluidas en programas de mejora, sustituyendo o no a otras variables productivas. Sin embargo, en dorada no existen estimas de parámetros genéticos para este tipo de variables. Al mismo tiempo, el sistema de producción de dorada presenta claras diferencias ambientales. Las empresas de cría pueden producir sus alevines desde tecnología intensiva hasta mesocosmos, habiendo entre ambas un espectro de matizaciones de producción. Los alevines son preengordados y engordados fundamentalmente en jaulas situadas en el Mar Mediterráneo o en el océano Atlántico, y en coordenadas geográficas muy diferentes, como es el caso de Canarias donde las temperaturas son más elevadas y estables a lo largo de todo el año frente al Mediterráneo. Sin embargo, también se engordan alevines de dorada con el sistema de esteros o tanques en tierra, propio del sur de España. También existen otros factores diferenciadores entre empresas como son la madurez sexual (Ginés et al., 2003) y el reparto del alimento (Robaina et al., 1997). Todas estas variaciones existentes en los sistemas de producción y la localización de las instalaciones de dorada imprimen resultados muy dispares a los diferentes caracteres de interés para los piscicultores, como son las variables de crecimiento, de la canal y de calidad. Si esta desviación fenotípica no es independiente del genotipo sobre el que actúa, es porque existe una interacción GxA (Falconer y Mackay, 1996). Por lo que es de utilidad estimar las interacciones GxA, ya que si éstas existen, y no se tienen en cuenta, pueden limitar o Introducción 54 incluso perjudicar el progreso genético (Saillant et al., 2006; Dupont-Nivet et al., 2008), ya que la evaluación genética de los reproductores debería hacerse dentro de cada ambiente. Incluso, los programas de mejora se pueden ver forzados a desarrollar cepas para condiciones ambientales específicas (Winkelman y Peterson, 1994). Por eso, para desarrollar con eficacia un programa de mejora se requiere el conocimiento de los parámetros genéticos y ambientales, las diferencias entre cepas o animales mejorados y el potencial de cada genotipo por ambiente (Winkelman y Peterson, 1994). En este sentido, Navarro et al. (2009a, 2009b) estimaron en dorada la interacción GxA entre jaulas insulares y tanques, en caracteres de crecimiento, canal y calidad de la carne, a partir de peces engordados sólo en Canarias, a través de correlaciones genéticas de los mismos caracteres en dos ambientes, considerados como caracteres distintos (Falconer y Mackay, 1996), obteniendo resultados que mostraban la falta de interacción GxA. Pero en la actualidad no existen antecedentes de que se haya medido interacción GxA en doradas entre ambientes más distantes y diferentes. Teniendo en cuenta todo esto, el objetivo del presente estudio es estimar en dorada el grado de determinación genética y las relaciones entre ellas, de variables de crecimiento, de la canal, de calidad del pez y de la carne y morfométricas mediante imágenes, a diferentes edades de interés comercial, y su interacción GxA en los diferentes sistemas de engorde industrial propios de la producción española de esta especie. Con el fin, de sentar las bases para un programa de mejora genética a escala nacional, proponiendo los criterios de selección más óptimos para mejorar el máximo de variables de interés económico para esta especie, de la manera más rápida, económica, rentable y automática. 55 3.2. MATERIALES Y MÉTODOS 3.2.1 Material Biológico Huevos procedentes de lotes industriales de tres comunidades autónomas con una combinación de sexos y número de reproductores diferente: ICCM (Instituto Canario de Ciencias Marinas, Canarias) 59 (2♂:1♀), CULMASUR S.A. (Andalucía) 98 (1♂:1♀) y PISCIMAR S.L. (Valencia) 47 (1♂:1♀), se sembraron en las instalaciones de los centros de investigación de acuicultura (CIA) de tres comunidades autónomas (ICCM-Canarias, Instituto de Investigación y Formación Agraria y Pesquera o IFAPAAndalucía, Instituto de Investigación y Tecnología Agroalimentaria o IRTA-Cataluña). El cultivo larvario se inició en abril de 2009 de manera sincronizada entre todas las comunidades autónomas y la metodología aplicada para el cultivo desde la etapa de huevos hasta la de alevines se basó en los protocolos establecidos por Roo et al. (2009). Se utilizó tecnología intensiva en el IFAPA (Andalucía), semi-intensiva en el IRTA (Cataluña) e intensiva en el ICCM (Canarias), sobre la base estándar de uso de enriquecedores, artemia y dietas de destete, ajustados a las necesidades biológicas según estadío del desarrollo. El crecimiento se midió a través de los parámetros morfométricos de longitud total (LT), altura de la cabeza (HC), diámetro del ojo (DO) y estado general de las larvas a los 5, 10, 20, 30, 40, 50 y 65 días post eclosión (dpe) del cultivo. Las medidas se realizaron con un proyector de perfiles (V-12A Nikon, Japan, o similar). A día 84 dpe, una muestra al azar de 1400 peces de cada centro fue remitida a los restantes centros, incluyendo el Instituto Murciano de Investigación y Desarrollo Agrario y Alimentario (IMIDA) de la región de Murcia, por vía aérea o transporte por carretera. A día 179 dpe los alevines fueron marcados con Passive Integrated Transponder (PIT; Trovan Daimler-Benz), en la cavidad abdominal, siguiendo el protocolo de marcaje descrito por Navarro et al. (2006), a la vez que se les extrajo un trozo de aleta caudal para ser conservado en etanol hasta su análisis genético. Cada CIA marcó 2.400 peces, entre los cuales estaban representados proporcionalmente los alevines provenientes de los centros ICCM, IFAPA e IRTA. Posteriormente, los peces marcados en cada CIA fueron divididos en dos lotes, uno de 550 peces que permaneció en cada CIA y otro de 1.900 peces que fue enviado a la empresa colaboradora de cada región: PIM S.A. en esteros (Andalucía), CULTIMAR S.A. (Cataluña) y SERVICIOS ATUNEROS DEL MEDITERRÁNEO S.L. (Murcia) en jaulas continentales, y CANEXMAR S.L. (Canarias) en jaulas insulares. En ambos tipos de lotes estuvieron igualmente representados los peces criados en los diferentes CIA productores de alevines (Figura 3.1). Materiales y Métodos 56 Figura 3.1 Esquema de integración de la mejora genética en el tejido industrial de dorada (PROGENSA®) En Canarias, los peces que quedaron en el ICCM, se mantuvieron en 3 tanques de 1 m3 con flujo abierto de 22 l/min y aireación constante. A medida que los peces fueron creciendo se desdoblaron hasta llegar a 12 tanques de tal manera que la densidad no sobrepasara los 26 kg/m3. La alimentación fue ad libitum y diaria, a través de alimentadores de autodemanda, con alimento balanceado disponible en el mercado, de acuerdo a su tamaño y edad. La medición de los parámetros abióticos de temperatura, oxígeno disuelto y saturación de gases se realizó con un oxímetro portátil (Oxiguard Handy, Point tour Systems Inc., Canada), una vez al día. La extracción de peces muertos se realizaba inmediatamente cuando se detectaba y la limpieza de los tanques una vez a la semana. La temperatura del agua varió entre los 20,2°C en época invernal y 24,2°C en época estival, con una media de 22,04±0,13°C (media ± error típico) la concentración de oxígeno varió entre 4,4 y 7,7 mg/l con una media de 5,61±0,04 mg/l y la saturación de gases estuvo entre los 63 y 97% con una media de 76,37±0,61 %. En la empresa CANEXMAR S.L. los peces se engordaron en una jaula de 12 m de diámetro situada en la zona de Punta del Morro, Gran Canaria, un sistema marino Atlántico insular y oligotrófico. La temperatura media del agua fue de 20,68±0,68°C y con salinidad de 37‰. En la empresa PIM S.A. los Estimas de Parámetros Genéticos 57 peces fueron engordados en la zona de marismas del río Guadalquivir, ecosistema húmedo y terrestre situado a 15 km de la desembocadura y en la mitad sur de la Isla Mayor de este importante río del sur de España, en un estero de 2000 m3. La temperatura media del agua fue de 18,2±0,24°C, la salinidad media de 6,9±0,14 ‰ y la concentración media de oxígeno de 5,73±0,06 mg/l. En la empresa CULTIMAR S.A. los peces se engordaron en el sistema marino continental del mar Mediterráneo, en una jaula de 9 m de diámetro, ubicada en Arenys de Mar, Barcelona. La temperatura media fue de 17,5±3,9°C y la salinidad de 37,8‰. En la empresa Servicios Atuneros del Mediterráneo S.L los peces se engordaron también en un sistema marino en una jaula de 11 m de diámetro en San Pedro del Pinatar, Murcia. La temperatura media fue de 15,7±0,9°C, con una temperatura mínima de 14,3ᵒC y máxima de 17,2ᵒC y la salinidad fue de 37,9±0,1‰. En las cuatro empresas, los peces se engordaron durante 17 meses bajo condiciones industriales. Los peces se alimentaron con alimento balanceado una vez al día, 6 veces a la semana. En ningún momento de esta experiencia, durante la cría o el engorde, los peces fueron sometidos a criba, a diferencia de lo que ocurre a nivel industrial. 3.2.2 Muestreos A los 269, 389 y 539 dpe, todos los peces engordados en el ICCM y una muestra al azar de los criados en CANEXMAR S.L., exceptuando los 269 dpe, se anestesiaron (aceite de clavo al 4%) identificaron, pesaron, midieron (longitud furcal) y se valoraron si presentaban algún tipo de deformidad. Cuando los peces en las cuatro comunidades autónomas, alcanzaron la talla comercial (300-800 g), a los 689 dpe, se sacrificó y se muestreó, de manera simultánea, una muestra de 150 peces del ICCM y una muestra de aproximadamente 1.000 peces de cada empresa, analizando los siguientes caracteres: a) Crecimiento: i. Peso ii. Longitud furcal: Longitud del pez medida en línea recta desde el extremo distal de la mandíbula inferior hasta el radio central (horquilla) de la aleta caudal. iii. Compacidad o factor de condición (FC): Relación entre el peso y la longitud calculado como sigue: 100 ∙ peso ∙ longitud furcal-3 64 3.3 RESULTADOS 3.3.1 Genotipado y Asignación de Paternidad Usando la PCR múltiplex SMsa1 mediante el método de exclusión y permitiendo dos errores, se obtuvo un 100% de éxito en la asignación parental (cada descendiente fue asignado a un solo padre y una sola madre), de los descendientes del ICCM y de PMAR. El 90% de los descendientes de CSUR se asignó también con éxito, pero el 10% se asignó a dos parejas de reproductores posibles. Sin embargo estos individuos no se excluyeron de los análisis genéticos, ya que se incluyeron en la matriz de parentesco con un solo parental conocido. Después de revisar los genotipos, todos los errores se identificaron como alelos nulos. Los reproductores del ICCM mostraron alelos nulos en los marcadores A5 y D4, los de PMAR en los marcadores C3, D4 y F6 y en los de CSUR en los marcadores C12 y D4. En cuanto a la contribución, el número de reproductores que contribuyeron en las puestas por lote y sexo (determinado tras la asignación) y el número de familias de hermanos completos y de medios hermanos, se muestran en la Tabla 3.1. Del total de familias de Canarias (83), 47% dieron lugar a un número de descendientes menor de 10; el 47% a un número de descendientes entre 10 y 100 individuos; y sólo el 6% dio lugar a más de 100 individuos. En el caso de las familias de Andalucía (193) el 84,4% fueron familias con menos de 10 individuos y el 17,6% tuvieron un número de descendientes entre 10 y 100, no existiendo ninguna que diera lugar a más de 100 individuos. Para el lote proveniente de Cataluña (21), el 23,9% de ellas tuvieron menos de 10 descendientes, mientras que el 57,1%, dio lugar un número de descendientes entre 10 y 100. El 19% restante, estuvo conformado por familias de más de 100 individuos. En los peces engordados solo en Canarias, contribuyeron 123 reproductores de los tres lotes (67 machos y 56 hembras) y estuvieron representadas 192 familias de hermanos completos y 81 familias de medios hermanos (39 maternas y 42 paternas). Tabla 3.1. Número de reproductores que contribuyeron, junto a las familias de hermanos completos y medios hermanos por comunidad autónoma. Ítem ICCM CSUR PMAR TOTAL Total ♂ ♀ Total ♂ ♀ Total ♂ ♀ Reproductores totales 59 38 21 98 nd nd 47 21 27 204 Reproductores contribuyeron 50 31 19 78 39 39 11 6 5 139 Familias hermanos completos 83 - - 193 - - 21 - - 297 Familias de medios hermanos - 16 18 - 31 31 - 5 4 105 nd: no determinado, ♂: machos, ♀: hembras Estimas de Parámetros Genéticos 65 3.3.2 Resultados Fenotípicos A continuación se describirán los resultados fenotípicos de crecimiento y deformidades a distintas edades, y a talla de sacrificio caracteres de la canal y rendimiento, caracteres morfológicos a través de imágenes, y caracteres de calidad de la carne. 3.3.2.1 Crecimiento y Deformidad En la Tabla 3.2 se muestran los resultados fenotípicos de las variables de crecimiento (peso, longitud y factor de condición o compacidad) y de prevalencia de deformidades (columna vertebral, cabeza, opérculo y total) a las edades 179, 269, 389, 539 dpe de los peces criados en Canarias (ICCM y CANEXMAR) y a la edad de sacrificio (689 dpe) de los peces engordados en Canarias, además de los engordados en el resto de empresas (PIMSA, CULTIMAR y SERVICIOS ATUNEROS DEL MEDITERRÁNEO). En cuanto a las variables de crecimiento, los peces crecieron más rápidamente en las instalaciones del ICCM que en CANEXMAR. A la edad de sacrificio, se observa la misma diferencia significativa para el peso y la longitud entre el ICCM y el resto de las empresas. Entre CANEXMAR y CULTIMAR, sin embargo, no hay diferencias significativas. La compacidad presenta un patrón un poco distinto, los valores del ICCM y de CULTIMAR no presentan diferencias significativas, al igual que entre CANEXMAR y PIMSA. En cuanto a deformidades a partir de los datos de las 5 estaciones la prevalencia total al sacrificio fue de 23,6%. De las tres deformidades medidas, la mayor prevalencia se observó en la deformidad de columna (15,3%) y la menor prevalencia en la de cabeza (3,7%). Las prevalencias de deformidades en la columna vertebral no mostraron diferencias significativas entre ICCM y CULTIMAR ni entre CANEXMAR y SERVICIOS ATUNEROS DEL MEDITERRÁNEO, siendo los datos de PIMSA los mayores y más distintos al resto (19,8%). En la prevalencia de deformidades de cabeza el ICCM presentó el menor valor (1,4%) mientras que CANEXMAR el mayor (7,7%), las demás empresas no presentaron diferencias significativas. Para la deformidad de opérculo los peces de PIMSA presentaron la mayor prevalencia (9%). En Canarias, durante el crecimiento, la prevalencia siempre fue mayor en tanques (ICCM) que en la jaula (CANEXMAR), y en general, fue menor a edades más tempranas, a excepción de la deformidad de opérculo que fue mayor. En cuanto a la deformidad de opérculo se calculó la Tasa de Recuperación de Opérculo en 469 individuos a los que se les hizo el seguimiento a todas las edades (179, 269, 389, 539 y 689 dpe). La prevalencia de deformidad de opérculo en cada una de las cinco edades, en estos 469 peces, fue cada vez menor: 14,7% (179 dpe), 10,9% (269 dpe), 8,3% (389 dpe), 7,9% (539 dpe) y 5,8% (689 dpe). En el primer muestreo un 1,1% no se detectó. A partir de los 269 dpe, no se encontró ningún pez con opérculo que no lo presentara en el muestreo anterior. Considerando la diferencia en el número de individuos afectados por esta deformidad entre todas las edades y la edad inicial, se calculó la tasa de Resultados 66 recuperación progresivamente: a los 269 dpe el 31,1% de los peces que presentaban deformidad del opérculo a los 179 dpe se habían recuperado, a los 389 dpe el 47,3%, a los 539 dpe el 50% y finalmente a los 689 dpe el 63,5%, siempre comparados con la prevalencia inicial a 179 dpe. Del mismo modo el 55% de los peces que con deformidad de opérculo a la edad de 269 dpe lo recuperaron a los 689 dpe. Tabla 3.2 Peso, longitud furcal, factor de condición (media ± error típico) y prevalencia de deformidades (%) de columna vertebral, cabeza, opérculo y total, a diferentes edades y estaciones de cría y engorde, en dorada. Edad (días post eclosión) Peso (g) Longitud Furcal (cm) Factor de Condición (g cm-3) Deformidades Columna Vertebral (%) Cabeza (%) Opérculo (%) Deformidad Total (%) 179 dpe 15,77±0,14 9,05±0,03 2,00±0,01 0,9 0,3 13,5 14,7 269 dpe ICCM 62,06±0,89 14,13±0,08 2,06±0,01 5,8 0,4 11,5 17,1 Canexmar - - - - - - - 389 dpe ICCM 194,41±1,31a 20,47±0,07a 2,17±0,01a 10,7 a 0,4 a 9,4 a 19,3 a Canexmar 113,90±2,46b 17,38±0,13b 2,07±0,02b 2,3 b 0,8 a 11 a 14,1 a 539 dpe ICCM 456,29±2,90a 27,26±0,08a 2,20±0,01a 12,9 a 1,0 a 8,4 a 20,9 a Canexmar 201,03±2,60b 21,25±0,07b 2,00±0,01b 2,4 b 1,2 a 8,1 a 11,7 b 689 dpe (sacrificio) ICCM 717,21±4,57a 31,44±0,10a 2,27±0,01a 14,5 a 1,4 a 6,0 a 21,5 a Canexmar 326,32±5,19 b 24,38±0,11 b 2,18±0,01 b 9,0 b 7,7 c 6,6 a 21,4 a PIMSA 352,65±3,02c 25,37±0,06c 2,14±0,01b 19,8 c 3,3 b 9,0 b 28,3 b Cultimar 321,69±3,88 b 24,10±0,09 d 2,26±0,01 a 12,9 a 2,2 b 5,1 a 18,4 c Atuneros 231,59±3,33 d 21,77±0,07 e 2,21±0,01 c 12,8 b 4,6 b 5,2 a 21,9 a Total deformidades a sacrificio - - - 15,3 3,7 6,8 23,6 Letras diferentes entre estaciones en cada edad, indican diferencias significativas (P≤0,05) 3.3.2.2 Caracteres de la Canal (peso canal, peso filete, rendimiento canal, rendimiento filete, grasa visceral y porcentaje de grasa visceral) En la Tabla 3.3 se muestran los datos fenotípicos de las variables de la canal a edad de sacrificio en Canarias. Se puede observar que todos los resultados presentaron diferencias significativas entre estaciones. En cuanto a la estación los peces engordados en el ICCM presentaron los mayores valores para todas las variables. Tabla 3.3 Variables de la canal (peso canal, peso filete, grasa visceral, rendimiento canal, rendimiento filete, porcentaje de grasa visceral (media ± error típico) a edad de sacrificio para dorada, por estación, considerando los datos de los peces engordados en Canarias. Estación Peso Canal (g) Peso Filete (g) Grasa Visceral (g) % Canal % Filete % Grasa Visceral ICCM 650,97±5,97a 273,76±2,71a 5,92±0,34a 91,34±0,32a 37,22±0,35a 0,75±0,08a Canexmar 288,17±3,71 b 121,96±1,68 b 1,82±0,21 b 90,57±0,20 b 37,09±0,22 a 0,51±0,05 b Media 389,10±4,23 164,11±1,85 2,92±0,18 90,78±0,17 37,13±0,19 0,58±0,04 Letras diferentes entre estación, indican diferencias significativas (P≤0,05) Estimas de Parámetros Genéticos 67 3.3.2.3 Caracteres Morfológicos a través de Análisis de Imágenes En la Tabla 3.4 se muestran los valores fenotípicos de las 27 variables morfológicas obtenidas tras el análisis de las imágenes. En general los valores de áreas, longitudes y volumen, son mayores en los peces engordados en el ICCM que en CANEXMAR. Con respecto a la longitud furcal medida en el pez mediante un ictiómetro y medida sobre su foto mediante análisis de imagen, se obtuvo una correlación positiva y significativa entre ambas variables (R=0,99, P<0,01). Tabla 3.4 Variables morfológicas de análisis de imágenes (media ± error típico) a edad de sacrificio en los peces engordados en Canarias, por estación. Variables TOTAL ESTACION ICCM CANEXMAR ATD 107,12±0,96 124,07±1,60a 90,17±1,05b LTD 31,90±0,16 34,05±0,27a 29,76±0,18b AnM 5,27±0,03 5,71±0,05a 4,83±0,03b AnA 2,71±0,02 1,28±0,04a 4,13±0,02b AnB 3,87±0,03 3,03±0,05a 4,70±0,03b AnC 4,17±0,03 4,53±0,04a 3,81±0,03b AnD 3,98±0,02 5,60±0,04a 2,37±0,02b AnE 2,77±0,02 4,73±0,03a 0,81±0,02b ATL 226,00±1,17 284,51±1,95a 167,48±1,28b LTL 30,61±0,09 34,11±0,15a 27,10±0,10b AlM 11,26±0,04 12,83±0,06a 9,68±0,04b AlPC 2,67±0,01 3,04±0,02a 2,29±0,01b LSC 23,49±0,07 26,56±0,12a 20,43±0,08b AlCa 9,90±0,03 11,23±0,05a 8,57±0,03b AF 152,24±0,85 193,77±1,42a 110,72±0,93b %AF 66,88±0,12 67,89±0,20a 65,87±0,13b LS 26,33±0,08 29,75±0,14a 22,92±0,09b LMF 16,54±0,06 18,77±0,10a 14,31±0,06b LF 28,43±0,08 31,90±0,14a 24,95±0,09b ExP 0,88±0,00 0,88±0,00a 0,88±0,00b ExCa 0,71±0,00 0,70±0,00a 0,73±0,00b AlA 8,70±0,03 9,86±0,04a 7,53±0,03b AlB 11,09±0,04 12,63±0,06a 9,55±0,04b AlC 10,05±0,04 11,63±0,06a 8,47±0,04b AlD 6,60±0,03 7,99±0,05a 5,21±0,04b AlE 3,70±0,02 4,03±0,03a 3,38±0,02bc VF 209,71±2,16 281,98±3,61a 137,44±2,37b ATD= Área total dorsal, LTD= Longitud Total Dorsal, AnM= Ancho Máximo, AnA= Ancho A, AnB= Ancho B, AnC= Ancho C, AnD= Ancho D, AnE= Ancho E, ATL =Área Total lateral, LTL= Longitud Total lateral, AlM= Alto Máximo, AlPC= Alto Pedúnculo Caudal, LSC= Longitud sin Cola, AlCa= Alto Cabeza, AF= Área Filete, %AF= %Área Filete, LS= Longitud Estándar, LMF= Longitud Máximo Filete, AlMF= Alto Máximo Filete, LF= Longitud Furcal, ExP= Excentricidad Pez, ExCa= Excentricidad Cabeza, AlA= Alto A, AlB= Alto B, AlC= Alto C, AlD= Alto D, AlE= Alto E, VF= Volumen Filete. Unidades de variables de longitud, anchos y altos: cm, de áreas: cm2, de volumen: cm3. Letras diferentes entre estaciones, indican diferencias significativas (P≤0,05) Resultados 68 3.3.2.4 Caracteres de Composición de la Carne Los valores de las variables de composición de la carne y de textura se muestran en la Tabla 3.5. Se puede observar que entre estaciones sólo existen diferencias significativas para porcentaje de proteínas. Con respecto al porcentaje de lípidos en el músculo medido mediante el método NIR y el FF, se obtuvo una correlación positiva y significativa entre ambas variables (R=0,40, P<0,01). Tabla 3.5 Variables de calidad (media ± error típico) a edad de sacrificio en Canarias, por estación: composición de la carne: colágeno, humedad, proteína, lípidos y Fish Fatmeter (FF) y fuerza máxima como variable de textura. Estación COMPOSICION DE LA CARNE TEXTURA Colágeno (%) Humedad (%) Proteína (%) Lípidos (%) FF (%) Fuerza Máxima (kg) ICCM 2,19±0,06a 71,71±0,13a 24,64±0,12a 5,21±0,12a NM 8,59±0,12a Canexmar 2,48±0,04a 71,92±0,08a 23,88±0,07b 5,08±0,08a 10,27±0,12 8,97±0,08a Promedio Canarias 2,40±0,03 71,86±0,07 24,09±0,06 5,12±0,07 - 8,86±0,07 Letras diferentes entre estaciones, indican diferencias significativas (P≤0,05); NM: no medido. 3.3.3 Heredabilidades y Correlaciones 3.3.3.1 Crecimiento y Deformidad Las correlaciones genéticas y fenotípicas entre caracteres de crecimiento y deformidad general (prevalencia de cualquier tipo de deformidad) a las edades de 179, 269, 389, 539 y 689 dpe, a partir de los datos de los peces criados en Canarias (ICCM y CANEXMAR), y sus heredabilidades se muestran en la Tabla 3.6. En cuanto a las variables de crecimiento, como se puede observar, las heredabilidades estuvieron comprendidas entre 0,16 y 0,48 para el peso, entre 0,20 y 0,41 para la longitud y entre 0,17 y 0,43 para la compacidad. Como cabría esperar en cada una de las edades, las correlaciones entre el peso y la longitud fueron cercanas a la unidad, entre 0,94 y 0,99 para las correlaciones genéticas, y entre 0,80 y 0,84 para las correlaciones fenotípicas. Las correlaciones entre pesos y entre longitudes fueron altas, medias y bajas entre edades, pues dichas estimas decrecieron en magnitud a medida que incrementó la diferencia entre las edades. De manera similar, las correlaciones de la compacidad, también decrecieron con el incremento de la edad, sin embargo las correlaciones fenotípicas fueron más bajas que las genéticas. En cuanto a la deformidad, las heredabilidades a las distintas edades estuvieron entre 0,07 y 0,26. La correlación genética de las deformidades con las variables de crecimiento en cada edad fueron de valores bajos a edad de 179 dpe, a valores medios y altos a edades comprendidas entre 269 y 539 dpe, siendo en edad de sacrificio correlaciones no distintas a cero con peso y longitud y alta con compacidad. Estimas de Parámetros Genéticos 69 Peso 179 Long 179 FC 179 Def 179 Peso 269 Long 269 FC 269 Def 269 Peso 389 Long 389 FC 389 Def 389 Peso 539 Long 539 FC 539 Def 539 Peso 689 Long 689 FC 689 Def 689 Peso 179 0,16 ±0,05 0,99 ±0,01 0,22 ±0,23 0,17 ±0,21 0,81 ±0,11 0,72 ±0,14 0,81 ±0,13 0,40 ±0,26 0,45 ±0,18 0,37 ±0,20 0,52 ±0,17 0,44 ±0,24 0,31 ±0,19 0,25 ±0,21 0,42 ±0,18 0,33 ±0,20 0,31 ±0,21 0,27 ±0,24 0,53 ±0,24 0,72 ±0,30 Long 179 0,94 0,20 ±0,06 0,10 ±0,21 0,08 ±0,19 0,76 ±0,11 0,79 ±0,09 0,67 ±0,15 0,30 ±0,26 0,42 ±0,16 0,40 ±0,20 0,43 ±0,18 0,42 ±0,22 0,29 ±0,19 0,25 ±0,20 0,12 ±0,21 0,33 ±0,21 0,32 ±0,22 0,20 ±0,21 0,42 ±0,24 0,73 ±0,18 FC 179 0,35 0,12 0,17 ±0,06 0,25 ±0,27 0,37 ±0,14 0,30 ±0,20 0,82 ±0,14 0,50 ±0,22 0,37 ±0,11 0,10 ±0,27 0,81 ±0,13 0,21 ±0,12 0,51 ±0,23 0,05 ±0,28 0,82 ±0,10 0,30 ±0,26 0,29 ±0,23 0,28 ±0,23 0,76 ±0,15 0,22 ±0,29 Def 179 -0,1 -0,1 0,04 0,07 ±0,03 0,27 ±0,25 0,27 ±0,17 0,36 ±0,25 0,88 ±0,14 0,17 ±0,12 -0,09 ±0,32 0,57 ±0,19 0,92 ±0,08 0,31 ±0,24 0,12 ±0,28 0,39 ±0,27 0,98 ±0,04 0,22 ±0,12 0,06 ±0,31 0,42 ±0,27 0,83 ±0,08 Peso 269 0,83 0,8 0,32 -0,07 0,24 ±0,07 0,97 ±0,02 0,85 ±0,11 0,43 ±0,26 0,78 ±0,10 0,77 ±0,12 0,70 ±0,15 0,54 ±0,20 0,79 ±0,11 0,58 ±0,21 0,52 ±0,17 0,45 ±0,19 0,84 ±0,12 0,52 ±0,20 0,75 ±0,18 0,57 ±0,20 Long 269 0,76 0,78 0,29 -0,06 0,95 0,27 ±0,09 0,74 ±0,21 0,42 ±0,30 0,78 ±0,09 0,67 ±0,14 0,70 ±0,13 0,57 ±0,22 0,82 ±0,09 0,68 ±0,20 0,49 ±0,23 0,46 ±0,21 0,80 ±0,13 0,53 ±0,20 0,60 ±0,25 0,57 ±0,22 FC 269 0,38 0,34 0,42 0,04 0,56 0,35 0,33 ±0,11 0,79 ±0,13 0,83 ±0,11 0,75 ±0,16 0,98 ±0,04 0,78 ±0,16 0,56 ±0,16 0,47 ±0,17 0,77 ±0,22 0,52 ±0,18 0,67 ±0,22 0,61 ±0,17 0,87 ±0,16 0,72 ±0,20 Def 269 -0,07 -0,08 0,11 0,52 -0,07 -0,06 0,13 0,26 ±0,09 0,39 ±0,16 0,18 ±0,28 0,76 ±0,18 0,99 ±0,03 0,49 ±0,22 -0,12 ±0,35 0,39 ±0,36 0,98 ±0,01 -0,19 ±0,33 -0,33 ±0,30 0,67 ±0,20 0,99 ±0,08 Peso 389 0,6 0,6 0,27 -0,05 0,84 0,84 0,46 -0,06 0,34 ±0,09 0,96 ±0,02 0,77 ±0,10 0,54 ±0,15 0,81 ±0,10 0,74 ±0,13 0,68 ±0,14 0,43 ±0,14 0,95 ±0,04 0,83 ±0,09 0,64 ±0,18 0,46 ±0,23 Long 389 0,52 0,56 0,14 -0,07 0,78 0,84 0,33 -0,09 0,92 0,38 ±0,11 0,71 ±0,13 0,44 ±0,21 0,88 ±0,07 0,78 ±0,11 0,62 ±0,14 0,40 ±0,19 0,96 ±0,04 0,91 ±0,07 0,29 ±0,31 0,38 ±0,20 FC 389 0,21 0,16 0,34 0,11 0,32 0,28 0,61 0,18 0,44 0,2 0,43 ±0,11 0,66 ±0,18 0,66 ±0,11 0,50 ±0,16 0,63 ±0,15 0,61 ±0,15 0,66 ±0,14 0,58 ±0,15 0,86 ±0,13 0,78 ±0,15 Def 389 -0,03 -0,03 0,09 0,4 -0,00 -0,01 0,19 0,57 0,01 -0,04 0,3 0,26 ±0,06 0,34 ±0,18 0,22 ±0,28 0,33 ±0,14 0,97 ±0,04 -0,10 ±0,29 -0,27 ±0,29 0,65 ±0,22 0,94 ±0,09 Peso 539 0,35 0,37 0,19 0,01 0,63 0,65 0,41 0,01 0,77 0,82 0,44 0,05 0,48 ±0,10 0,94 ±0,03 0,63 ±0,14 0,55 ±0,16 0,93 ±0,04 0,89 ±0,07 0,47 ±0,15 0,39 ±0,22 Long 539 0,35 0,38 0,06 -0,01 0,57 0,65 0,26 -0,11 0,73 0,81 0,25 -0,03 0,94 0,41 ±0,10 0,36 ±0,21 0,46 ±0,19 0,94 ±0,04 0,96 ±0,03 0,17 ±0,17 0,31 ±0,24 FC 539 0,14 0,05 0,31 0,02 0,15 0,09 0,44 0,11 0,23 0,12 0,51 0,21 0,51 0,2 0,42 ±0,10 0,59 ±0,15 0,72 ±0,15 0,63 ±0,16 0,75 ±0,15 0,43 ±0,16 Def 539 -0,06 -0,06 0,06 0,43 -0,03 -0,05 0,14 0,48 -0,02 -0,04 0,22 0,64 0,07 -0,00 0,2 0,25 ±0,07 0,28 ±0,12 0,15 ±0,17 0,67 ±0,19 0,99 ±0,01 Peso 689 0,32 0,32 0,17 -0,06 0,52 0,5 0,31 -0,12 0,68 0,7 0,3 -0,1 0,85 0,84 0,26 -0,04 0,43 ±0,10 0,98 ±0,01 0,64 ±0,15 0,42 ±0,16 Long 689 0,32 0,34 0,1 -0,1 0,46 0,51 0,17 -0,2 0,65 0,73 0,16 -0,16 0,81 0,85 0,11 -0,14 0,93 0,40 ±0,09 0,44 ±0,18 0,35 ±0,20 FC 689 0,00 -0,05 0,22 0,08 0,04 -0,04 0,29 0,16 0,09 -0,03 0,35 0,13 0,2 0,04 0,35 0,21 0,45 0,11 0,20 ±0,05 0,51 ±0,11 Def 689 -0,03 -0,03 0,06 0,38 -0,00 -0,01 0,19 0,65 -0,01 -0,05 0,25 0,63 -0,00 -0,07 0,22 0,86 0,00 -0,05 0,13 0,17 ±0,05 Tabla 3.6 Heredabilidades (en la diagonal y en negrita, con ± error típico), correlaciones genéticas (en cursiva encima de la diagonal, con ± error típico) y correlaciones fenotípicas (debajo de la diagonal) entre peso, longitud (Long), compacidad (FC) y deformidad (Def) a diferentes edades (días post eclosión) a partir de los datos de los peces criados en Canarias. Resultados 70 Sin embargo, hay que tener en consideración que los errores de estas correlaciones son altos. Sus correlaciones fenotípicas, en cambio, con peso y longitud en cada edad y entre edades fueron negativas y cercanas a cero y con la compacidad fueron bajas, pero positivas. En la Tabla 3.7 se muestra las heredabilidades estimadas para cada tipo de deformidad en cada edad, considerando también sólo los datos de los peces criados en Canarias. Las heredabilidades a la edad de los 179 dpe, en general son bajas excepto para la deformidad de columna la cual además presenta un error muy alto. A edades intermedias de 269, 389 y 539 dpe es cuando se encuentran los mayores valores generales volviendo a bajar a los 689 dpe. La deformidad que presenta mayor variación genética aditiva es la de columna, llegando a los 0,41 a los 539 dpe. Las deformidades de cabeza presentan en todas las edades heredabilidades no distintas de cero y la deformidad de opérculo heredabilidades bajas. Tabla 3.7 Heredabilidades (con ± error típico) para cada tipo de deformidades de dorada estimadas en diferentes edades considerando sólo los datos de Canarias (ICCM y CANEXMAR). Deformidad 179 dpe 269 dpe 389 dpe 539 dpe 689 dpe Columna 0,60±0,32 0,22±0,15 0,40±0,12 0,41±0,13 0,16±0,06 Opérculo 0,06±0,03 0,09±0,05 0,08±0,04 0,11±0,04 0,08±0,04 Cabeza 0,00±0,01 0,05±0,04 0,01±0,02 0,01±0,01 0,00±0,01 General 0,07±0,03 0,26±0,09 0,26±0,06 0,25±0,07 0,17±0,05 dpe: días post eclosión En la Tabla 3.8 se muestran las correlaciones genéticas y fenotípicas entre peso, longitud, compacidad y deformidad general (prevalencia de cualquier tipo de deformidad) y sus heredabilidades a la edad de sacrificio, estimadas a partir de los datos de los peces engordados en las cinco estaciones estudiadas (ICCM, CANEXMAR, PIMSA, CULTIMAR y SERVICIOS ATUNEROS DEL MEDITERRÁNEO). Como se puede observar las heredabilidades de las cuatro variables son medias pero menores a las obtenidas sólo con los datos de Canarias (Tabla 3.6), pero con errores típicos menores. Las correlaciones genéticas y fenotípicas presentan un comportamiento similar a las observadas en la Tabla 3.6. Tabla 3.8. Heredabilidades (en la diagonal y en negrita, con ± error típico), correlaciones genéticas (en cursiva encima de la diagonal, con ± error típico) y correlaciones fenotípicas (debajo de la diagonal) entre peso, longitud (Long), compacidad (FC) y deformidad (Def) para dorada a 689 dpe estimadas a partir de los datos de los peces engordados en cinco estaciones (ICCM, CANEXMAR, PIMSA, CULTIMAR y SERVICIOS ATUNEROS DEL MEDITERRÁNEO). 689 dpe Peso Long FC Def Peso 0,29 ±0,06 0,92 ±0,03 0,40 ±0,14 0,19±0,17 Long 0,90 0,27 ±0,06 0,01 ±0,11 0,18±0,17 FC 0,34 -0,10 0,21 ±0,04 0,49±0,14 Def -0,03 -0,12 0,16 0,16±0,04 dpe: Días post eclosión Estimas de Parámetros Genéticos 71 3.3.3.2 Caracteres de la Canal y Morfológicos con Análisis de Imágenes Las correlaciones genéticas y fenotípicas entre caracteres de crecimiento, de la canal, deformidades y morfológicas de análisis de imágenes a edad de sacrificio (689 dpe), y sus heredabilidades se muestran en la Tabla 3.9. Se seleccionaron 11 de las 27 variables morfológicas medidas, por considerarlas más relevantes y representativas. Respecto a las heredabilidades, para las variables de los caracteres de la canal estuvieron comprendidas entre 0,06 y 0,45, para las variables de morfología entre 0,17 y 0,51, las de crecimiento y deformidades fueron descritas previamente en las tablas 3.6 y 3.7 respectivamente. El peso canal y el peso filete presentaron correlaciones fenotípicas y genéticas altas y positivas con los caracteres de crecimiento. Para el rendimiento canal las correlaciones genéticas con los caracteres de peso, longitud, compacidad, peso canal y peso filete, fueron esencialmente poco consistentes por presentar grandes errores típicos y las correlaciones fenotípicas fueron bajas. Las correlaciones genéticas de rendimiento filete con estas mismas variables fueron positivas y altas (a excepción del rendimiento canal que fue negativa) y las fenotípicas, en general, bajas y medias. Las correlaciones genéticas y fenotípicas del % grasa visceral con las de peso, longitud, peso canal, peso filete y rendimiento de filete fueron medias y positivas, en cambio con rendimiento canal fue media y negativa, y las fenotípicas bajas. Las correlaciones genéticas entre la deformidad de columna y el resto de caracteres, éstas fueron, en general, medias y positivas. Las correlaciones de deformidad de cabeza presentaron errores altos y fueron poco consistentes, mientras que las correlaciones de las deformidades totales presentaron el mismo esquema que la deformidad de columna, aunque con una correlación baja y negativa con la deformidad de cabeza. En general, las correlaciones fenotípicas de los tres tipos de deformidades con las variables de crecimiento y rendimiento, fueron bajas. Respecto a las variables de morfología las correlaciones genéticas y fenotípicas entre éstas y las de crecimiento y canal fueron, en general, altas y positivas. Las correlaciones genéticas entre las variables de deformidades con las de morfología presentaron, en general, valores medios y positivos, mientras que bajos y negativos con las variables de excentricidad. Las correlaciones fenotípicas entre deformidades y variables morfológicas son bajas, cercanas a cero. Entre las correlaciones de las doce variables de morfología observamos valores altos y positivos, con errores pequeños, las correlaciones fenotípicas en general presentan el mismo patrón pero con valores algo menores. Resultados 72 Tabla 3.9 Heredabilidades (en la diagonal y en negrita, con ± error típico), correlaciones genéticas (en cursiva encima de la diagonal, con ± error típico) y correlaciones fenotípicas (debajo de la diagonal) entre variables de crecimiento, calidad de la canal, tipo de deformidades y variables morfológicas analizadas por análisis de imágenes para dorada a edad de sacrificio, a partir de los datos de los peces engordados en Canarias. Longitud (Long), factor de condición (FC), peso canal (PC), peso filete (PF), rendimiento canal (% Canal), rendimiento filete (% Filete), porcentaje grasa visceral (%GV), deformidad de columna (Def Col), de cabeza (Def Ca) y total (Def Tot), longitud furcal (LF), área total lateral (ATL), alto máximo (AlM), área total dorsal (ATD), ancho máximo (AnM), área filete (AF), volumen filete (VF), longitud sin cola (LSC), alto cabeza (AlCa), excentricidad cabeza(ExCa) y excentricidad pez (ExP). Peso Long FC PC PF % Canal % Filete % GV Def Col Def Ca Def Tot LF ATL AlM ATD AnM AF VF LSC AlCa ExCa ExP Peso 0,43 ±0,10 0,98 ±0,01 0,64 ±0,15 0,99 ±0,00 0,99 ±0,00 0,12 ±0,25 0,79 ±0,11 0,47 ±0,16 0,55 ±0,16 0,69 ±0,75 0,42 ±0,16 0,99 ±0,01 0,99 ±0,00 0,98 ±0,01 0,99 ±0,00 0,98 ±0,02 0,99 ±0,00 0,99 ±0,00 0,99 ±0,01 0,98 ±0,01 -0,79 ±0,12 -0,46 ±0,16 Long 0,93 0,40 ±0,09 0,44 ±0,18 0,98 ±0,01 0,96 ±0,02 -0,39 ±0,28 0,79 ±0,12 0,52 ±0,14 0,44 ±0,18 0,80 ±0,33 0,35 ±0,20 0,99 ±0,01 0,99 ±0,01 0,95 ±0,02 0,99 ±0,02 0,95 ±0,03 0,99 ±0,01 0,98 ±0,01 0,99 ±0,00 0,96 ±0,02 -0,70 ±0,14 -0,31 ±0,15 FC 0,45 0,11 0,20 ±0,05 0,74 ±0,11 0,76 ±0,11 -0,42 ±0,23 0,66 ±0,16 0,28 ±0,10 0,50 ±0,19 -0,20 ±0,21 0,51 ±0,11 0,58 ±0,16 0,68 ±0,13 0,76 ±0,11 0,72 ±0,13 0,80 ±0,11 0,72 ±0,13 0,76 ±0,11 0,60 ±0,15 0,70 ±0,11 -0,81 ±0,10 -0,77 ±0,09 PC 0,99 0,93 0,56 0,45 ±0,11 0,99 ±0,00 0,11 ±0,30 0,80 ±0,14 0,43 ±0,16 0,54 ±0,19 0,44 ±0,25 0,39 ±0,17 0,99 ±0,01 0,99 ±0,00 0,99 ±0,01 0,99 ±0,00 0,99 ±0,02 0,99 ±0,00 0,99 ±0,00 0,99 ±0,01 0,98 ±0,01 -0,81 ±0,11 -0,50 ±0,15 PF 0,95 0,86 0,59 0,95 0,41 ±0,09 -0,09 ±0,27 0,89 ±0,08 0,43 ±0,16 0,45 ±0,15 0,18 ±0,67 0,32 ±0,20 0,98 ±0,01 0,98 ±0,01 0,97 ±0,01 0,99 ±0,01 0,99 ±0,01 0,99 ±0,01 0,99 ±0,00 0,98 ±0,01 0,97 ±0,01 -0,83 ±0,10 -0,49 ±0,12 % Canal 0,09 0,11 -0,07 0,18 0,16 0,06 ±0,03 -0,53 ±0,34 -0,43 ±0,22 -0,68 ±0,21 -0,39 ±0,56 -0,51 ±0,19 0,21 ±0,28 0,10 ±0,28 0,10 ±0,28 0,17 ±0,29 0,02 ±0,29 0,15 ±0,28 0,05 ±0,28 0,12 ±0,28 0,13 ±0,28 -0,05 ±0,27 0,09 ±0,26 % Filete 0,43 0,38 0,4 0,48 0,69 0,26 0,08 ±0,03 0,47 ±0,20 0,28 ±0,29 -0,25 ±0,71 0,15 ±0,28 0,79 ±0,12 0,79 ±0,08 0,73 ±0,14 0,85 ±0,11 0,88 ±0,09 0,79 ±0,12 0,84 ±0,10 0,81 ±0,11 0,73 ±0,14 -0,65 ±0,17 -0,24 ±0,10 % GV 0,33 0,32 0,24 0,33 0,32 -0,04 0,18 0,29 ±0,06 0,22 ±0,08 0,39 ±0,52 0,02 ±0,16 0,40 ±0,17 0,41 ±0,17 0,42 ±0,14 0,40 ±0,17 0,44 ±0,16 0,44 ±0,16 0,44 ±0,16 0,42 ±0,17 0,42 ±0,15 -0,42 ±0,17 -0,20 ±0,18 Def Col 0,05 -0,04 0,21 0,07 0,03 -0,08 -0,06 -0,00 0,16 ±0,06 0,94 ±0,20 0,92 ±0,04 0,51 ±0,17 0,51 ±0,19 0,53 ±0,18 0,43 ±0,22 0,49 ±0,20 0,49 ±0,19 0,53 ±0,17 0,54 ±0,18 0,52 ±0,18 -0,24 ±0,25 -0,32 ±0,21 Def Ca 0,01 0,01 -0,00 0,01 0,01 0,01 0,01 0,00 0,03 0,00 ±0,01 -0,16 ±0,16 0,81 ±0,71 0,65 ±0,22 0,44 ±0,62 0,76 ±0,19 0,85 ±0,83 0,75 ±0,15 0,46 ±0,88 0,66 ±0,52 0,42 ±0,18 -0,05 ±0,69 0,15 ±0,67 Def Tot 0,00 -0,05 0,13 0,01 -0,01 -0,03 -0,04 -0,06 0,63 0,37 0,17 ±0,05 0,40 ±0,17 0,35 ±0,19 0,37 ±0,19 0,24 ±0,22 0,31 ±0,21 0,34 ±0,19 0,37 ±0,18 0,36 ±0,19 0,37 ±0,18 -0,15 ±0,21 -0,19 ±0,20 LF 0,95 0,98 0,33 0,95 0,90 0,14 0,41 0,30 -0,00 -0,01 0,01 0,43 ±0,10 0,99 ±0,00 0,96 ±0,02 0,99 ±0,02 0,93 ±0,04 0,99 ±0,01 0,98 ±0,01 0,99 ±0,00 0,97 ±0,01 -0,80 ±0,12 -0,38 ±0,18 ATL 0,97 0,96 0,47 0,98 0,92 0,14 0,42 0,31 0,04 0,01 0,00 0,98 0,46 ±0,10 0,98 ±0,01 0,99 ±0,01 0,95 ±0,03 0,99 ±0,00 0,99 ±0,01 0,99 ±0,00 0,99 ±0,01 -0,83 ±0,10 -0,49 ±0,11 AlM 0,96 0,91 0,56 0,97 0,91 0,12 0,40 0,32 0,07 -0,00 0,01 0,93 0,97 0,45 ±0,10 0,97 ±0,02 0,94 ±0,03 0,99 ±0,01 0,98 ±0,01 0,96 ±0,01 0,99 ±0,00 -0,91 ±0,07 -0,62 ±0,13 ATD 0,71 0,68 0,44 0,73 0,70 0,14 0,36 0,23 0,06 0,00 0,03 0,71 0,73 0,72 0,35 ±0,08 0,98 ±0,01 0,99 ±0,01 0,99 ±0,00 0,99 ±0,01 0,96 ±0,02 -0,95 ±0,07 -0,48 ±0,15 AnM 0,63 0,57 0,48 0,64 0,61 0,08 0,31 0,24 0,12 0,00 0,08 0,59 0,63 0,64 0,94 0,36 ±0,08 0,97 ±0,02 0,99 ±0,01 0,94 ±0,04 0,93 ±0,04 -0,90 ±0,09 -0,55 ±0,15 AF 0,97 0,95 0,47 0,98 0,93 0,15 0,44 0,31 0,01 0,00 -0,00 0,97 0,99 0,96 0,74 0,64 0,45 ±0,10 0,99 ±0,00 0,99 ±0,00 0,98 ±0,01 -0,83 ±0,09 -0,50 ±0,15 VF 0,90 0,87 0,53 0,92 0,88 0,13 0,42 0,31 0,07 0,00 0,04 0,89 0,92 0,91 0,92 0,87 0,93 0,42 ±0,10 0,98 ±0,01 0,98 ±0,01 -0,87 ±0,08 -0,52 ±0,14 LSC 0,94 0,96 0,35 0,95 0,90 0,14 0,42 0,29 -0,00 0,02 -0,03 0,99 0,98 0,93 0,71 0,59 0,97 0,89 0,44 ±0,10 0,97 ±0,01 -0,78 ±0,12 -0,40 ±0,16 AlCa 0,94 0,90 0,53 0,95 0,89 0,10 0,38 0,30 0,11 0,01 0,03 0,92 0,96 0,96 0,69 0,61 0,92 0,87 0,92 0,51 ±0,10 -0,80 ±0,11 -0,62 ±0,12 ExCa -0,35 -0,28 -0,36 -0,37 -0,36 -0,08 -0,21 -0,12 0,00 0,02 -0,08 -0,26 -0,34 -0,38 -0,33 -0,28 -0,43 -0,4 -0,25 -0,26 0,17 ±0,05 0,75 ±0,09 ExP -0,37 -0,20 -0,68 -0,38 -0,36 0,03 -0,12 -0,17 -0,23 0,05 -0,10 -0,2 -0,35 -0,51 -0,3 -0,33 -0,34 -0,37 -0,18 -0,47 0,45 0,35 ±0,07 Estimas de Parámetros Genéticos 73 3.3.3.3 Caracteres de Composición de la Carne Las correlaciones genéticas y fenotípicas entre caracteres de calidad, junto con la de longitud como variable representativa del crecimiento según Navarro et al. (2009a) y de las de rendimiento a la edad de sacrificio (689 dpe), y sus heredabilidades se muestran en la Tabla 3.10. Respecto a las heredabilidades, las estimas estuvieron comprendidas entre 0,01 (colágeno) y 0,45 (FF). En cuanto a las correlaciones genéticas entre la longitud, el rendimiento filete y el % de grasa visceral versus los caracteres de calidad de la carne se observan correlaciones medias-altas y positivas a excepción de las obtenidas con lípidos y fuerza máxima que fueron negativas. En general, las correlaciones genéticas de rendimiento canal fueron medias y con errores altos. El FF presentó correlaciones altas, positiva con lípidos y negativas con la humedad y fuerza máxima. El colágeno presentó correlaciones genéticas altas pero con errores típicos también altos. Los lípidos presentaron una correlación alta y negativa con la humedad. Las correlaciones de la fuerza máxima fueron, en general, altas y negativas, excepto con la humedad. En general las correlaciones fenotípicas fueron medias a bajas. Tabla 3.10 Heredabilidades (en la diagonal y en negrita, con ± error típico), correlaciones genéticas (en cursiva encima de la diagonal, con ± error típico) y correlaciones fenotípicas (debajo de la diagonal) entre variables de longitud (Long), rendimiento canal (% Canal), rendimiento filete (% Filete), porcentaje de grasa visceral (% GV), Fish Fatmeter (FF), colágeno, lípidos, humedad, proteína, fuerza máxima (F Máx.), a edad de sacrificio (689 dpe), a partir de los datos de los peces engordados en Canarias. Long % Canal % Filete % GV FF Colágeno Lípidos Humedad Proteína F Máx. Long 0,40 ±0,09 -0,39 ±0,28 0,79 ±0,12 0,52 ±0,14 0,65 ±0,12 0,84 ±0,56 0,24 ±0,23 -0,64 ±0,17 0,75 ±0,17 -0,52 ±0,19 % Canal 0,11 0,06 ±0,03 -0,53 ±0,34 -0,43 ±0,22 0,04 ±0,29 -0,25 ±0,77 -0,19 ±0,28 0,20 ±0,30 -0,15 ±0,36 0,23 ±0,26 % Filete 0,38 0,26 0,08 ±0,03 0,47 ±0,20 0,51 ±0,20 0,26 ±0,70 0,34 ±0,28 -0,90 ±0,09 0,99 ±0,01 -0,83 ±0,22 %GV 0,32 -0,04 0,18 0,29 ±0,06 0,30 ±0,09 -0,03 ±1,85 0,52 ±0,14 -0,49 ±0,17 0,02 ±0,23 -0,35 ±0,09 FF 0,53 0,10 0,37 0,22 0,45 ±0,11 -0,04 ±0,88 0,99 ±0,05 -0,75 ±0,13 0,30 ±0,30 -0,70 ±0,14 Colágeno 0,01 0,10 0,10 0,04 0,00 0,01 ±0,01 -0,54 ±0,80 0,80 ±0,50 0,96 ±0,29 -0,99 ±0,10 Lípidos 0,05 0,00 0,14 0,12 0,33 -0,12 0,20 ±0,08 -0,99 ±0,02 -0,96 ±0,27 -0,82 ±0,24 Humedad -0,25 -0,12 -0,39 -0,23 -0,55 -0,45 -0,51 0,17 ±0,06 -0,70 ±0,50 0,92 ±0,24 Proteína 0,23 0,11 0,26 0,12 0,54 0,75 -0,23 -0,50 0,06 ±0,04 -0,87 ±0,21 F Máx. -0,10 0,08 -0,12 -0,14 -0,47 0,04 -0,16 0,20 -0,05 0,17 ±0,05 Discusión 80 influir en los otros dos tipos de deformidad, ya que no se observan diferencias significativas entre ambas estaciones en prácticamente todos los puntos de muestreo. Por otro lado, a la edad de sacrificio, las tasas de prevalencia de deformidades de este estudio variaron también según el tipo de deformidad y las estaciones. La mayor media de prevalencia, se observó en las deformidades de columna. Coincidiendo con los datos de Oliva (2008), que valoraron un lote industrial de doradas de 430 g y observaron un 9,80% de peces deformes de columna frente a un 0,8 % deformes de cabeza y opérculo. Con respecto a las diferencias entre instalaciones, en este estudio, a edad de sacrificio se observó que las prevalencias de deformidad de opérculo casi no mostraron diferencias entre instalaciones, las de la cabeza fueron un poco más diferentes y las de la columna las más diferentes, confirmando que estas últimas parecen las más influenciadas por las condiciones ambientales (Karahan et al., 2012). La prevalencia de deformidades totales (% de individuos con cualquier tipo de deformidad) a la edad de sacrificio llegó a 23,6% lo que coincide con Georgakopoulou et al. (2010) quienes indicaron, también en dorada, que las deformaciones afectan entre el 7 y el 20% como promedio a los juveniles producidos, aunque ocasionalmente esta prevalencia puede presentar valores más elevados de entre el 58 y el 83%, como por ejemplo, los descritos para lubina en Dupont-Nivet et al. (2008). 3.4.2.2 Caracteres de la Canal, Morfológicos con Análisis de Imágenes y de Composición de la Carne Las variables de rendimiento son variables muy importantes desde el punto de vista económico y altamente apreciadas en la industria acuícola, tanto en las compañías que desarrollan el procesamiento de sus productos (Neira et al., 2004) como a nivel de los consumidores, porque ellas representan la proporción de la parte comestible de los peces a la que se tendrá acceso con su compra. En este sentido, los valores de rendimiento de canal obtenidos en este estudio fueron altos y están en concordancia con los obtenidos por otros autores en doradas engordadas en la misma zona geográfica. Navarro et al. (2009a) obtuvieron valores medios del 91,7%, Ginés (1997) del 92,4% y Oliva (2008) del 90,9%. El músculo esquelético es el sistema orgánico más grande del pescado, coincidiendo con la parte comestible del mismo (Grigorakis, 2007). Expresado como rendimiento filete, en doradas de talla comercial representa del 34,3% al 48% del peso corporal total (Grigorakis, 2007), al igual que en otras especies como lubina (Saillant et al., 2009), tilapia del Nilo (Nguyen et al., 2010a), carpa común (Cibert et al., 1999) y panga (Pangasianodon hypophthalmus) (Sang et al., 2009). En este sentido, estos datos coinciden con los obtenidos en este estudio, así como con otros autores Navarro et al. (2009a) también en dorada. Estimas de Parámetros Genéticos 81 En cuanto a la grasa visceral, ésta afecta negativamente a la impresión del consumidor sobre el pez, jugando un papel notable en su apreciación (Grigorakis, 2007), además de su efecto de disminuir el rendimiento de la canal (Navarro et al., 2009a). Los valores del porcentaje de grasa visceral descritos para dorada de acuicultura están entre el 0,8 y el 2,5% (Santinha et al., 1999; Grigorakis et al., 2002; Grigorakis, 2007), lo que coincide con los datos del presente estudio. Además, Navarro et al. (2009a) describen una diferencia de porcentaje en doradas engordadas en dos instalaciones diferentes, obteniendo el mayor porcentaje en doradas de mayor peso, lo que concuerda también con lo observado en este estudio. La calidad de la carne está dada por diferentes características como son su frescura, aspecto, olor, sabor, textura, firmeza, jugosidad, e incluso su procesamiento e higiene (Nguyen et al., 2010b). Para determinar estas características se estudian variables de composición de la carne como el contenido de colágeno, proteína, lípidos y humedad en el músculo (Gjedrem, 1997). El contenido proteico, además de encontrarse involucrado en la calidad de la carne, es uno de los objetivos finales de la producción, ya que se desea optimizar el proceso de conversión del alimento en proteína muscular, en lugar de en un exceso de lípidos y desechos del procesamiento (Kause et al., 2011). De las proteínas, el 3-10% es colágeno, que forma el principal tejido conectivo entre las células y que por lo tanto está relacionado con la textura de la carne (Sato et al., 1986). El sabor y la jugosidad están alta y positivamente correlacionados con el contenido de grasa en el músculo y mantiene una relación inversa con la humedad (Grigorakis, 2007). Tradicionalmente, la composición de la carne, se ha analizado mediante métodos bioquímicos. Sin embargo, estos métodos son, en general, largos, costosos, invasivos e involucran el uso de agentes químicos peligrosos para la salud y el medio ambiente. Recientemente se ha introducido y normalizado el método NIR con los métodos químicos en dorada (Proyecto: Caracterización de la Calidad del Pescado de Crianza, financiado por la JACUMAR, convocatoria 2008), ya que es un método no invasivo, económico, simple, rápido y seguro para la salud y el medio ambiente (Weeranantanaphan et al., 2011). Por todo esto está cada vez más integrado en la industria de la seguridad y calidad alimentaria (Berzaghi y Riovanto, 2009). En algunas especies de peces, el método NIR ya ha sido satisfactoriamente evaluado para predecir la composición de la carne (Trocino et al., 2012), pero aún no existen datos publicados en dorada. En este sentido, los valores de este estudio para el porcentaje lípidos y humedad concuerdan con los descritos para dorada de acuicultura (3 y 11 % de grasa y 68,2-75,2% de humedad en Grigorakis, 2007), y con los obtenidos concretamente en doradas engordadas también en canarias por Ginés et al. (2004b) bajo régimen de fotoperiodo artificial (5,4% de lípidos y 71% de humedad) y por Navarro et al. (2009b) en condiciones industriales (9% de lípidos y 70% de humedad). Con respecto a los valores de porcentaje de proteínas, los valores de este estudio se encuentran en torno a los descritos para dorada de acuicultura a talla comercial (18-23% en Grigorakis, 2007), pero ligeramente superiores a los obtenidos en doradas engordadas también en Canarias de 17,7 Discusión 82 % por Robaina et al. (1997) y de 21,6% por Ginés et al. (2004b). Al igual que en contenido de proteínas, los datos de este estudio del porcentaje de colágeno fueron mayores que los descritos para dorada (Suárez et al., 2005; Navarro et al., 2009b; Matos et al., 2010). Corroborando esto, diez muestras de este estudio, se analizaron también para lípidos, humedad y proteínas, mediante métodos químicos (AOAC, 1990) y dieron valores ligeramente diferentes, aunque significativa y altamente correlacionados para los lípidos y humedad, y no significativos para la proteína (datos no mostrados). Esto está en consonancia con las correlaciones altas y significativas encontradas entre ambos métodos en otras especies de peces para la grasa y humedad (Folkestad et al., 2008; McPherson et al., 2011; Trocino et al., 2012) y una correlación más baja para el contenido de proteínas en lubina (Trocino et al., 2012). El Fish Fatmeter (FF), es otro método indirecto, que usa la relación existente entre el contenido de agua y el contenido de grasa para medir de forma no invasiva, rápida, cómoda, fácil y económicamente asequible, el porcentaje de lípidos en el músculo del pez (Nielsen et al., 2005). Sin embargo, no existen datos publicados mediante este aparato en dorada. Los valores obtenidos en este estudio para el porcentaje de grasa muscular mediante el FF fueron mayores que con el método NIR, pero se obtuvo una correlación positiva y significativa entre ambos métodos. Estos resultados concuerdan con los obtenidos en otras especies que han medido ambos métodos obteniendo valores diferentes pero positiva y significativamente correlacionados (Nielsen et al., 2005; Saillant et al., 2009; McPherson et al., 2011). La textura es otra importante característica de la calidad de la carne, la cual es apreciada por los consumidores y las compañías de alimentos (Neira et al., 2004) y está directamente determinada por características estructurales del músculo (Johnston et al., 2000). Una variable de textura, es la dureza, definida como la fuerza requerida para romper la muestra entre los dientes molares (Ginés et al., 2004b). En este estudio se midió la dureza, del pez entero con un texturómetro a través del parámetro “fuerza máxima”, que es la fuerza máxima que el aparato debe ejercer para penetrar el émbolo una distancia fija. Este parámetro es más relevante medirlo directamente en el filete. Sin embargo, en un muestreo de tantos individuos como el del presente estudio hubiera significado haberlo medido días después del sacrificio, y este parámetro se ve afectado a medida que pasan los días (Ginés et al., 2002) y no hubiera sido representativo. Además, en un programa de mejora genética eficaz, se necesita valorar muchos animales de una manera rápida (Saillant et al., 2009; Blonk et al., 2010). Por todo esto, buscar métodos de medida de la textura alrededor de cómo se cotiza el precio del pez en el mercado (como pez entero), es una estrategia adecuada y necesaria. Los datos de este parámetro obtenidos en este estudio fueron mayores que los descritos para dorada en pez entero (1,68 Kg) (Ginés et al., 2002), lo cual era de esperar teniendo en cuenta que estos autores lo midieron con un émbolo de menor diámetro y penetraron menos distancia. Estimas de Parámetros Genéticos 83 La evaluación de la calidad de los productos a través de imágenes incluye su captura, procesamiento y análisis, facilitando el logro de los objetivos de calidad propuestos, con la ventaja de ser una técnica de evaluación no destructiva de los alimentos (Timmermans, 1998). La inspección visual automatizada en la industria alimentaria presenta importantes ventajas desde el punto de vista de su relación coste-eficacia, consistencia, mayor velocidad y precisión (Brosnan y Sun, 2004). Su aplicación en productos del mar es muy importante ya que los rasgos de apariencia para la comercialización de muchas especies de peces pueden influir directamente en la disposición del consumidor a pagar el precio del pescado (Blonk et al., 2010). Grigorakis (2007) indica que el aspecto externo de una dorada refleja en cierta medida su historia de vida. En ejemplares silvestres la biometría del cuerpo muestra diferencias significativas con individuos cultivados en sistemas intensivos, estos últimos presentan cuerpos más compactos, es decir, más cortos, más anchos y más altos (Grigorakis, 2007). El presente estudio es el primero en dorada donde se miden caracteres morfológicos mediante análisis de imagen. Para usar este tipo de sistemas, en estudios de gran escala, es primordial que se analicen las imágenes de manera totalmente automática y que tengan una alta correlación con las medidas estándar de las variables. En este sentido, la aplicación de análisis de imagen “IMAFISH_ML” desarrollada por Navarro et al. (en preparación), utilizada en este estudio, ha permitido a partir de sólo dos fotografías del pez, analizar los archivos de manera totalmente automática y proporcionar más de 20 variables morfométricas. Además la correlación encontrada entre la longitud furcal obtenida con la fotografía y la longitud furcal medida directamente en el pez, fue alta, positiva y significativa, poniendo de relieve la eficacia del sistema de análisis. 3.4.3 Heredabilidades y Correlaciones 3.4.3.1 Crecimiento y Deformidad En dorada, los caracteres de crecimiento son los más importantes desde el punto de vista económico, al igual que sucede en otras especies de peces de aptitud cárnica (Navarro et al., 2009a). El peso y la longitud dependen de factores relacionados con la alimentación y con las condiciones de cría, no obstante, en general suelen presentar también una alta determinación genética en todos los animales (Cardellino y Rovira, 1987). En este sentido, en otras especies de peces se han estimado heredabilidades medias y altas para estos caracteres. Por ejemplo, en el salmón del Atlántico, Rye y Refstie, (1995) obtuvieron un valor de 0,35 para el peso; en tilapia del Nilo de 0,16 después de cinco generaciones en múltiples ambientes (Bentsen et al., 2012); en carpa común, Nielsen et al. (2010) obtuvieron heredabilidades de 0,50 para peso y 0,49 para la longitud, aunque estaban sobreestimadas por las fuentes de parecido debidas al ambiente común; en bacalao del Atlántico (Gadus morhua) se obtuvieron valores de 0,28 para peso (Bangera et al., 2011); en la panga, especie de agua dulce de gran producción en Vietnam, Sang et al. (2012) obtuvieron heredabilidades desde 0,21 a 0,34 también para el Discusión 84 peso. En lubina se obtuvieron heredabilidades de 0,54 para peso y 0,65 para longitud estándar (Volckaert et al., 2012), aunque con altos errores típicos, lo que se puede deber a que los peces procedían de una familia desbalanceada de sólo 10 machos y 2 hembras. En dorada, Navarro et al. (2009a) estimaron heredabilidades para caracteres de crecimiento, a los 130, 165, 330 y 509 dpe, obteniendo valores medios de 0,31 para el peso, de 0,32 para la longitud y de 0,08 para la compacidad a partir de descendientes provenientes de un solo lote de reproductores. Las estimas de este estudio fueron en general mayores que las estimadas por estos autores, llegando a valores de 0,43, 0,40 y 0,20 al sacrificio para el peso, longitud y compacidad, respectivamente. Estos resultados eran de esperar, ya que se estimaron a partir de descendientes de tres lotes de reproductores no sometidos a presión de selección previa. Las correlaciones genéticas del presente estudio entre el peso y la longitud en cada edad, fueron altas y positivas (0,94 a 0,99), coincidiendo con las estimadas por Navarro et al. (2009a) y confirmando la propuesta de estos autores de que el peso o la longitud son criterios igualmente válidos para incluirlos en la selección y que a través de la longitud podría ser más adecuado por su mayor repetibilidad y mayor facilidad de trabajo en condiciones de campo. Por otro lado, las correlaciones genéticas del peso y longitud con el factor de condición fueron en general medias-altas y positivas, pero siempre mayores las del peso que las de la longitud, coincidiendo con las descritas por Navarro et al. (2009a). Las deformidades, que condicionan la calidad del pez, es otro aspecto de suma importancia económica en la producción de dorada (Georgakopoulou et al., 2010) y parecen ser consecuencia de muchas factores que influyen e interactúan (Boglione y Costa, 2011). Galloway et al. (1999) indicaron como una probable causa la temperatura en el proceso de cultivo, al observar cambios en el crecimiento del halibut (Hippoglossus hippoglossus); Kihara et al. (2002) obtuvieron una relación creciente de la corriente de agua con la lordosis en las larvas de doradas japonesas; Fernández et al. (2008) determinaron en dorada el efecto de los componentes de la dieta en la alimentación, como la vitamina A, en la mineralización de los huesos. El tipo de sistema de cultivo ha sido también ampliamente descrito como factor modulador de la aparición de deformidades esqueléticas, fundamentalmente relacionado con los sistemas intensivos de las técnicas de cría (Divanach y Kentouri, 1983; Chatain, 1994; Andrades et al., 1996; Divanach et al., 1996, 1997; Boglione et al., 2001; Koumoundouros et al., 2001; Sfakianakis et al., 2004; Giménez y Estévez, 2005; Roo et al., 2005; Georgakopoulou et al., 2010; Izquierdo et al., 2010). Sin embargo, cada vez son más los estudios que sugieren que las deformidades en peces, o al menos, algunos tipos de ellas, están determinadas por un importante componente genético aditivo. Concretamente, en dorada, Afonso et al. (2000) describieron una asociación familiar estadísticamente significativa para una triple deformidad de columna en sentido antero-posterior. Astorga et al. (2004) estudiaron 38 tipos de deformidades morfológicas sobre un lote de 11038 descendientes no cribados provenientes de un lote de reproductores con control individual del Estimas de Parámetros Genéticos 85 apareamiento, estimando una heredabilidad del 85% para el carácter presencia-ausencia de cualquier tipo de deformidad. Thorland et al. (2006) estimaron una heredabilidad del 5% para la presenciaausencia de deformidades de cabeza y 12% para la de deformidades espinales. Y en un estudio de segregación Rodríguez et al. (2011), revelaron a través de análisis fenotípico, un alto y significativo porcentaje de deformidad en descendientes cuando uno de sus padres era deforme, sugiriendo la posibilidad de determinación genética en la incidencia de deformidades para lordosis y fusión de vértebras. Las heredabilidades de este estudio para la presencia/ausencia de los tres tipos de deformidades fueron bajas y medias (0,07 y 0,26) en las distintas edades, confirmando que en la presencia/ausencia de todo tipo de deformidades, parte de su variación fenotípica tiene una base genética, coincidiendo con Astorga et al. (2004). Con respecto a los tipos de deformidades, las heredabilidades estuvieron entre 0,00 y 0,60. La deformidad de columna fue la que presentó mayores heredabilidades, obteniéndose valore entre 0,16 y 0,60. Si bien, el valor de 0,60 se obtuvo a la edad de 179 días y podría ser una estima no muy precisa, teniendo en cuenta que es un carácter umbral y su prevalencia fue muy baja (Falconer y Mackay, 1996), de hecho fue la estima que presentó el error típico mayor. Todo esto confirma que las deformidades de columna (lordosis, cifosis, escoliosis y fusión de vértebras) en dorada presentan una importante variación genética aditiva, coincidiendo con los estudios de Afonso et al. (2000), Thorland et al. (2006) y Rodríguez et al. (2011), tal y como también se ha descrito para otras especies. Así, en salmón del Atlántico se obtuvieron heredabilidades de hasta 0,36 (McKay y Gjerde 1986; Gjerde et al., 2005), en bacalao del Atlántico Kolstad et al. (2006) estimaron heredabilidades de 0,27 y en lubina se obtuvieron valores de 0,25 (Bardon et al., 2009) y 0,21 (Karahan et al., 2012), ambos mediante la transformación de Dempster y Lerner (1950). No obstante Castro et al. (2008) estimaron heredabilidades no significativas para deformaciones de lordosis (0,02±0,019) en dorada. Esto puede ser explicado porque estos autores realizaron cribas de deformes, tal y como lo hace la industria, sesgando los resultados, a diferencia de los obtenidos en este estudio, donde los peces no se cribaron en ningún momento, aportando robustez a los resultados de prevalencia y estimas genéticas de los caracteres de deformidad. En cuanto a las heredabilidades de la deformidad del opérculo, se obtuvieron heredabilidades bajas, siendo el menor valor el estimado a la edad de 179 dpe, al contrario de lo descrito por Kause et al. (2007) quienes indican que la baja prevalencia está relacionada con estimas de heredabilidades bajas, puesto que fue a esta edad donde la prevalencia de la deformidad de opérculo fue mayor. Estos datos ponen de relieve que a talla pequeña no se aprecia determinación genética para esta deformidad, coincidiendo con los resultados de segregación de Rodríguez et al. (2011) quienes observaron esta deformidad entre los 6 y 28 g y los resultados de Castro et al. (2008) que obtuvieron una heredabilidad no distinta de cero en alevines de dorada también para esta deformidad, si bien estos autores la midieron a la talla de ración y utilizando los procedimiento habituales de la industria. De hecho, a nivel fenotípico, existen estudios en alevines que asocian la prevalencia de esta deformidad con las Discusión 86 condiciones de cultivo (Gapasin y Duray, 2001; Roo et al., 2005). Sin embargo, sí se aprecia determinación genética a otras edades obteniéndose heredabilidades de 0,11 a los 539 dpe. Tal y como se ha demostrado en el presente estudio, la prevalencia de opérculo sobre los mismos peces es mayor a talla pequeña que a talla de sacrifico, debido a la recuperación del opérculo, lo que explica que la estima de la determinación genética para esta deformidad es más precisa a tallas mayores. Con respecto a las heredabilidades de las deformidades de cabeza, en este estudio no se encontraron valores distintos de cero, tal y como se ha visto en otras especies como carpa común (Kocour et al., 2006). Esto puede ser debido por la falta de variación genética aditiva o por la dificultad de reconocer esta deformidad de una manera objetiva. En definitiva, los resultados de heredabilidades para la presencia/ausencia por tipos de deformidades en este estudio, carácter de gran importancia para la industria de dorada, confirman que la deformidad de columna y de opérculo presentan una componente de variación genética aditiva que puede ser explotada en un programa de mejora genética, coincidiendo con los resultados de Astorga et al. (2004) y Thorland et al. (2006). Acerca de las correlaciones de la presencia/ausencia de deformidad entre edades, en este estudio las correlaciones genéticas fueron altas y positivas (0,83 a 0,99), coincidiendo con los resultados de Bardon et al. (2009) en lubina quienes obtuvieron entre cuatro edades (35, 100, 400 y 800g) correlaciones genéticas altas y positivas (0,92 a 0,99) para deformidades de columna. Estos datos sugieren que se podría realizar la selección para esta deformidad a edades intermedias, que junto con la alta heredabilidad para la deformidad de columna, podría ser la edad de 389 dpe la indicada para este tipo de deformidad. Respecto a las correlaciones fenotípicas, éstas fueron medias-altas y positivas (0,38 a 0,86) en este estudio. Esto era de esperar ya que si un pez es deforme a edades tempranas lo sigue siendo durante toda su vida, excepto para la deformidad del opérculo donde a edades tempranas es donde se produce mayor tasa de recuperación, por eso entre edades pequeñas y edades distantes se obtuvieron los menores valores. Además, a edades pequeñas está la desventaja de la dificultad de observar y detectar correctamente las deformidades (Gjerde et al., 2005), sin embargo a edades mayores se obtuvieron las mayores correlaciones demostrando que el personal clasificador utilizado en este estudio estaba bien entrenado no siendo un elemento distorsionador a la hora de las estimas. No obstante, no se puede negar la existencia de peces con deformidades de columnas que aparentemente son normales, pero internamente son deformes, llamados peces falsos negativos (Gjerde et al., 2005). Este hecho sumado con la importancia de tener una alta precisión de las estimas para este carácter, en especial si se desea realizar a edades intermedias, para lograr una eficiente selección individual, no debería depender exclusivamente de la calidad de los clasificadores y tampoco de la observación directa de la espina durante el fileteo, y sería recomendable el uso de metodologías no invasivas como los rayos X, tal y como también recomiendan Bardon et al. (2009) en lubina. Estimas de Parámetros Genéticos 87 En cuanto a las correlaciones genéticas obtenidas en este estudio entre los caracteres de crecimiento con la deformidad, éstas fueron, en general, medias y positivas. Esto contrasta con correlaciones bajas y negativas estimadas para deformidades vertebrales en otras especies como el salmón del Atlántico (Gjerde et al., 2005) y la trucha arcoíris (Kause et al., 2005). Kause et al. (2005) explicaron que es probable que una vez que un pez se deforma, su ganancia de peso se reduce porque la deformidad produce un acortamiento del cuerpo y con ello disminuye su capacidad de natación y acceso al alimento (McKay y Gjerde, 1986). Sin embargo, las correlaciones positivas de este estudio estuvieron en consonancia con las obtenidas en lubina entre deformidades de columna con peso y longitud a distintas edades por Bardon et al. (2009) (0-0,40) y por Karahan et al. (2012) (0,07-0,13). Así como con las obtenida en bacalao del Atlántico por Kolstad et al. (2006) entre peso y deformidades de columna (0,50). Todo esto pone de relieve que un crecimiento rápido debe ser reconocido como un factor de riesgo para la incidencia de deformidades en peces y en concreto en dorada. Por lo que sería de suma importancia incluir este carácter en los índices de selección, si seleccionamos para el crecimiento mediante la longitud como propusieron Navarro et al. (2009a), si no se quiere obtener un aumento en la prevalencia de deformidades tan perjudiciales para la industria. Tal y como se ha visto en animales terrestres donde la selección para el crecimiento ha venido acompañado en muchos casos con desórdenes del desarrollo (Whitehead et al., 2003; Gjerdrem et al., 2005; Kause et al., 2005). Más aun, teniendo en cuenta que, en general, la respuesta a la selección para la tasa de crecimiento de las especies acuáticas es muy buena en comparación con la de los animales de granja terrestres (Dunham, 2011) y que el objetivo de selección de mayor importancia económica en la mayoría de los programas de selección genética en peces es el crecimiento (Gorshkov, 2006). Con respecto a las heredabilidades de este estudio para las variables de crecimiento y presencia/ausencia de deformidades, estimadas a partir de los peces criados en las cuatro comunidades autónomas, a la edad de sacrificio, los valores fueron algo más bajos. Posiblemente, debido al aumento en la variabilidad de la manera de medir, que aumentan la variabilidad ambiental y disminuyen las estimas. Si bien, los errores típicos bajaron debido al aumento en el número de individuos incluidos en la matriz (Falconer y Mackay, 1996). Todo esto, coincide con las heredabilidades estimadas para los mismos caracteres en lubina a partir de los peces criados en distintos lugares, cuyos valores fueron mayores que los estimados a partir de todos los datos juntos (Dupont-Nivet et al., 2008; Karahan et al., 2012). 3.4.3.2 Caracteres de la Canal, Morfológicos con Análisis de Imágenes y de Composición de la Carne Las variables de rendimiento son variables muy importantes desde el punto de vista económico y cada vez más apreciadas en la industria acuícola. En algunos países, la comercialización de filetes en Discusión 88 lugar de pescado entero ha llegado a ser común en mercados internos y externos (Ponzoni et al., 2011), de aquí la importancia de estudiar los parámetros de rendimiento en los programas de mejora genética. En este estudio, el peso de canal y el peso de filete presentaron heredabilidades medias de 0,45 y 0,41 respectivamente, superiores a las estimadas también en dorada por Navarro et al. (2009a). Sin embargo, a diferencia de estos autores, quienes obtuvieron heredabilidades medias de 0,31 para el rendimiento canal y de 0,12 para el rendimiento filete, éstas en este estudio prácticamente no presentaron heredabilidad. Con respecto a las correlaciones de estos caracteres con los de crecimiento, las correlaciones genéticas obtenidas en este estudio para el peso canal y peso filete fueron altas y positivas (0,74-0,99). Estos altos valores son consistentes entre especies (Neira et al., 2004; Doupé y Lymbery, 2005; Rutten et al., 2005; Kause et al., 2007; Kocour et al., 2007; Powell et al., 2008) y coinciden también con las observadas por Navarro et al. (2009a) en dorada. Todo esto corrobora lo indicado por estos autores de que el peso de la canal y del filete aumenta a medida que lo hacen el peso o la longitud de los peces, tanto desde el punto de vista fenotípico como genético. De hecho, Nguyen et al. (2010a) obtuvieron en tilapia del Nilo una respuesta correlacionada del 23%, con respecto a la población control, para el peso filete en la sexta generación, seleccionando a través del peso, longitud y otras medidas corporales, con correlaciones similares a las de este estudio (0,78 a 0,96). En cuanto a las correlaciones del rendimiento filete, estas fueron también altas y positivas (0,66-0,79), que contrastan con las negativas encontradas por Navarro et al. (2009a) en dorada, pero coinciden con las descritas en otras especies como black bream (Acanthopagrus butcheri) (Doupé y Lymbery, 2005), tilapia del Nilo (Rutten et al., 2005) o carpa común (Kocour et al., 2007). Esto pone de relieve que el rendimiento filete también se podría mejorar de manera indirecta seleccionando a través del crecimiento, es decir a través de la longitud. Más aún, la magnitud de las correlación del rendimiento filete frente a la longitud, y sus heredabilidades, predicen una mayor respuesta correlacionada para dicho carácter que la respuesta directa. Esto es relevante porque aunque actualmente la dorada se vende fundamentalmente como pez entero, estudios de mercado sugieren que su comercialización fileteada sería una opción rentable y de mucha demanda (Luna et al., 2006), más aún teniendo en cuenta que en la sociedad actual el consumo de pescado fileteado va en aumento. Por contraste, el rendimiento canal presentó, en general, correlaciones genéticas bajas y negativas con los caracteres de crecimiento, con altos errores típicos. Estas correlaciones coinciden con los valores cercanos a cero obtenidos en dorada (Navarro et al., 2009a) y trucha arcoíris (Kause et al., 2002, 2007). El porcentaje de grasa visceral, mostró una importante componente genética aditiva (0,29), inferior a la descrita en dorada (0,50) por Navarro et al. (2009b) pero en concordancia con la descrita para otras especies (0,10-0,35) (Gjerde y Schaeffer, 1989; Rye y Gjerde, 1996; Kause et al., 2002; Neira et al., 2004). Esta heredabilidad, junto con la correlación media y positiva obtenida con el rendimiento Estimas de Parámetros Genéticos 89 canal, apoya la sugerencia de Navarro et al. (2009b) de que la inclusión de dicho carácter dentro de un programa de selección, permitiría contrarrestar el efecto negativo que tiene para el consumidor la grasa concentrada en la cavidad visceral (Grigorakis, 2007), a la vez que mejoraría el rendimiento canal. Además, si no se incluyera, teniendo en cuenta las negativas correlaciones genéticas del rendimiento canal, con la longitud y con el rendimiento filete, y las positivas correlaciones del porcentaje de grasa visceral con estos mismos caracteres, a la larga se podría producir un detrimento en el porcentaje canal, a costa de un incremento de la grasa visceral, al seleccionar a través del crecimiento. El análisis de imagen para la obtención de mediciones, ha sido ampliamente utilizado en agricultura (Costa et al., 2010) y en producción animal (Mursawa et al., 2008; Osawa et al., 2008; RuisVilarrasa et al., 2010). En un estudio a gran escala, como es un programa de mejora, es importante que la segmentación de la imagen sea automática (Stien et al., 2006). Además, en general, esta metodología reduce la variación entre las mediciones y aumenta la precisión de las estimas de parámetros genéticos (Blonk et al., 2010). En peces, existen estudios que han utilizado el análisis de imágenes para la estima de parámetros genéticos, aunque son escasos. Kause et al. (2008) estudiaron la deposición de lípidos y proteínas en trucha arcoíris alimentadas con distintas dietas, en un corte transversal del pez, a través de una imagen realizada en un escáner, estimando heredabilidades para el color y porcentaje de lípidos en distintas zonas del corte (0,36-0,70); en solea común, Blonk et al. (2010) obtuvieron heredabilidades desde 0,25 a 0,34, para distintas medidas del pez, mediante análisis manual de una foto lateral del pez; en lubina, Costa et al. (2010), estimaron heredabilidades de 0,43 a 0,55, para la morfología del pez, determinada por análisis de puntos de referencia anclados en el contorno del pez en fotos laterales. Todos estos resultados revelan el gran potencial para la mejora genética, que tiene el análisis de imagen, especialmente por correlación que tienen los caracteres tipo con los caracteres productivos. En el presente estudio se eligieron 11 de las 27 variables determinadas por análisis de imagen de manera totalmente automatizada (Navarro et al., en preparación), por la relación que a priori podían tener con los caracteres de interés comercial, para la estima de parámetros genéticos. Sus heredabilidades fueron medias y altas (0,17 y 0,51) y son las primeras estimas para estos caracteres en dorada. Con respecto a las variables dimensionales (área, longitud, ancho, alto y volumen), la magnitud de sus heredabilidades fue, en general, similar a la obtenida para el peso y la longitud del pez. Estas valores, están en consonancia con otras estimas de medidas del pez, obtenidas de manera manual y directa sobre el mismo, en otras especies, como tilapia del Nilo, en la cual, Rutten et al. (2005) estudiaron características del filete y lo relacionaron con medidas del cuerpo, obteniendo heredabilidades para el ancho del pez y la longitud de la cabeza (0,25-0,27) similares al peso y la longitud (0,25-0,26) y Nguyen et al. (2010a) estimaron heredabilidades para el ancho y profundidad del pez (0,20-0,32) también similares al peso y longitud (0,31). En concreto, las variables obtenidas en este 97 4. CONCLUSIONES 99 4. CONCLUSIONES 1. Se ha normalizado un procedimiento de evaluación de marcadores microsatélites (GremmProtocol) basado en la facilidad de lectura, la cual se valoró mediante amplificiación inadecuada, pérdida de un alelo, patrón de bandas confuso y alelos intermedios, que afectan a la determinación y rendondeo de los alelos. 2. Se ha desarrollado una batería de 79 marcadores microsatélites (llamada Radal) a partir del mapa genético de dorada, que son altamente informativos, se ajustan al GremmProtocol, que funcionan bajo las mismas condiciones de amplicación y que por lo tanto permiten diseñar nuevas PCRs múltiplex según las necesidades del usuario. 3. Se han estandarizado dos reacciones de PCRs múltiplex de 11 marcadores microsatélites cada una a partir de Radal, denominadas SMsa1 y SMsa2, las cuales son altamente eficientes en estudios de reconstrucción de las relaciones de parentesco y son propuestas como panel de referencia, o international panel, para dorada. 4. Los caracteres de crecimiento en dorada (peso, longitud y compacidad), en todas las poblaciones incluidas en el proyecto PROGENSA®, presentan heredabilidades medias-altas a las diferentes edades de interés comercial. Siendo la longitud un carácter más repetible y más sencillo de medir en instalación, sobre el que llevar a cabo selección directa. 5. En general, el carácter presencia/ausencia de cualquier tipo de deformidad en dorada presenta una considerable determinación genética aditiva en todas las poblaciones que han sido estudiadas en el contexto del proyecto PROGENSA®. 6. Las deformidades esqueléticas de columna (lordosis, cifosis, escoliosis y fusión de vértebras), en dorada, presentaron heredabilidades medias-altas, según la edad. 7. La deformidad esquelética de opérculo en dorada mostró heredabilidades bajas, presentando los valores más altos a la edad adulta. Mientras que las deformidades esqueléticas de cabeza no muestraron determinación genética aditiva. Conclusiones 100 8. Por primera vez en dorada, se comprueba que la prevalencia de la deformidad esquelética de opérculo decrece con el desarrollo debido a la recuperación de la morfología normal del pez, todo lo que tiene efecto en la estimación de las heredabilidades, e indicando que las empresas pueden minimizar los costes de producción de alevines evitando desechar los peces con opérculo durante los procesos de criba. 9. Las correlaciones genéticas entre los caracteres de crecimiento fueron altas y positivas, mientras que las estimadas entre caracteres de crecimiento y deformidades esqueléticas fueron en general medias en todas las edades de interés comercial, lo que está en consonancia con las altas correlaciones genéticas positivas estimadas entre esas mismas edades para la deformidad. 10. Los caracteres de la canal (peso canal, peso filete y porcentaje de grasa visceral), del presente estudio mostraron componentes genéticas aditivas medias-altas, mientras que los porcentajes canal y filete fueron bajas. 11. En general, todos los caracteres morfológicos analizados mediante el programa de análisis de imágenes IMAFISH_ML mostraron determinación genética aditiva alta. Las correlaciones genéticas entre ellos fueron muy altas y positivas, a la vez que altas y positivas con todas las medidas dimensionales, y altas y negativas con las de excentricidad del pez y de la cabeza. Por otro lado, las correlaciones genéticas entre todos los caracteres morfológicos y los caracteres de crecimiento y de la canal fueron muy altas y positivas, excepto para el porcentaje canal, que mostró valores bajos. 12. De entre todos los caracteres morfológicos analizados mediante el programa de análisis de imágenes IMAFISH_ML, el carácter AlCa (alto de cabeza) mostró la mayor heredabilidad, lo que permite ser utilizado como criterio de selección para mejorar indirectamente los caracteres de crecimiento y la mayoría de los de rendimiento de filete, de manera no invasiva, de bajo coste y altamente eficaz. 13. De los caracteres de composición de la carne, los lípidos y la humedad presentaron heredabilidad baja-media, mientras que no presentaron determinación genética aditiva el colágeno y la proteína. Sin embargo, estos dos últimos caracteres mostraron correlaciones genéticas positivas con el crecimiento, permitiendo su mejora indirecta a través de la longitud. 14. Por primera vez en dorada, la grasa muscular es medida a través del Fish Fatmeter y el NIR, presentando el primero una heredabilidad alta y mucho mayor que el segundo, ambos con una correlación genética altísima. Todo lo cual propone al sistema Fish Fatmeter como un método no invasivo, más económico y rápido para llevar a cabo selección para la calidad de la carne. Estimas de Parámetros Genéticos 101 15. Por primera vez en dorada, se ha estimado la heredabilidad de la textura a través de la fuerza máxima sobre el pez entero, mostrando determinación genética aditiva. 16. Los resultados del presente estudio ponen de manifiesto que para todos los caracteres analizados de crecimiento, de la canal, de calidad de la carne y del pez, no existe interacción genotipo-ambiente, entre tanque (ICCM) y jaula (CANEXMAR) en Canarias, ni entre sistemas de cultivo a escala nacional (jaulas insulares y contientales y esteros) para caracteres de crecimiento y deformidad. 17. Las estimas de parámetros genéticos de este estudio sugieren que la inclusión de caracteres como AlCa (alto de cabeza), el FF, la grasa visceral, y la deformidad de columna, como criterios en programas de mejora genética de dorada, podrían liderar una rápida respuesta a la selección mejorando el crecimiento, el rendimiento y la calidad del pez y de la carne. 103 5. BIBLIOGRAFÍA 105 5. BIBLIOGRAFÍA Abdallah, H., Gilbey, J., 2005. Genetic diversity and differentiation of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) revealed by DNA microsatellites. Aquaculture Research, 36, 1450-1457. Adcock, G.J., Bernal Ramirez, J.H., Hauser, L., Smith, P., Carvalho, G.R., 2000. Screening of DNA polymorphisms in samples of archived scales from New Zealand snapper. J. Fish Biology, 56, 1283-1287. Afonso, J. M., 1996. Programas de Selección Aplicados en Peces. I.T.E.A. 92a,177-184. Afonso, J.M., Montero, D., Robaina, L., Astorga, N., Izquierdo, M.S., Ginés, R., 2000. 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Navarro 1 , Y. Borrell 3 , M. García-Celdran 4 , N. Martín 5 , D. Negrín-Báez 1 , J.A. Sánchez 3 , E. Armero 4 , C. Berbel 5 , M.J. Zamorano 1 , J. Sánchez 6 , A. Estévez 7 , G. Ramis 8 , M. Manchado 5 , J.M. Afonso 1 1 Universidad de Las Palmas de Gran Canaria (ULPGC). Instituto Universitario de Sanidad Animal y Seguridad Alimentaria (IUSA). Instituto Canario de Ciencias Marinas (ICCM). Grupo de Investigación en Acuicultura (GIA). Carretera Trasmontaña s/n, 35413, Arucas, Las Palmas. Spain. 2 Universidad Santo Tomás, Buena Vecindad 91, Puerto Montt, Chile. 3 Universidad de Oviedo. Calle Principado, 3, 33003, Oviedo, Spain. 4 Universidad Politécnica de Cartagena. Plaza del Cronista Valverde, Edificio “La Milagrosa” 30202, Cartagena, Spain. 5 Centro de Investigación y Formación Pesquera y Acuícola El Toruño (IFAPA). Ctra. 5 Km. 654a. Camino de Tiro Pichón, 11500, Puerto de Santa María, Cádiz, Spain. 6 Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses (INT). La Cuesta 38320, La Laguna, Sta. Cruz de Tenerife, Spain. 7 Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (IRTA). Centro de Acuicultura. Ctra. Poble Nou Km 6, 43540, San Carlos de la Rápita, Tarragona. Spain. 8 Universidad de Murcia. Campus de Espinardo, 30100. Instituto Murciano de Investigación y Desarrollo Agrario y Alimentario (IMIDA), C/ Mayor S/N, 30150, Murcia, Spain. CORRESPONDING AUTHOR: J.M. Afonso (Phone: +34 928 459734; Fax: +34 928 451142; E-mail: [email protected].es) Summary The high number of multiplex PCRs developed for gilthead seabream (Sparus aurata L.) from many different microsatellite markers does not allow comparison among populations. This highlights the need of developing a reproducible panel of markers which can be used with safety and reliability by all users. In this study the first standardized panel of two new microsatellites multiplex PCRs was developed for this species. Primers of 138 specific microsatellites from the genetic linkage map were redesigned and evaluated according to their genetic variability, allele size range and genotyping reliability. A protocol to identify and classify genotyping errors or potential errors was proposed to assess the reliability of each marker. Two new multiplex PCRs from the best assed markers were designed with 11 markers in each, named SMsa1 and SMsa2 (SuperMultiplex Sparus aurata). Three broodstocks (59, 47 and 98 breeders) from different Spanish companies and a sample of 80 offspring from each one, were analysed to validate the usefulness of these multiplexes in the parental assignation. It was possible to assign each offspring to a single parent pair (100% success) using the exclusion method with SMsa1 or/and SMsa2. In each genotyped a reference sample (Ref-sa) was used and its DNA is available on request like the Page 1 of 31 Animal Genetics Animal Genetics 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 For Peer Review 2 kits of bin set to genotype by the GeneMapper (v.3.7) software (kit-SMsa1 and kit-SMsa2). This will be a robust and effective tool for pedigree analysis or characterization of populations and will be proposed as an international panel for this species. Keywords: Gilthead seabream; Sparus aurata; Microsatellite; Multiplex PCR; International panel. Introduction Gilthead seabream (Sparus aurata L.) is one of the most important and consolidated species in Mediterranean aquaculture, with a production of 151.346 metric tons (MT) in 2011. Spain is the third largest producer of gilthead seabream with 16.930 MT which represents up to 11.2% of the total worldwide production (APROMAR, 2012). As consequence of the growth and consolidation of the gilthead seabream industry, companies demand further improvement in the production cycles to reduce costs whereas preserving quality. For this purpose, implementation of genetic selection programs is a priority. Gilthead seabream production is mainly carried out by mass-spawning. This prevents to know the fish genealogy (breeders and descendents) which is imperative to estimate genetic parameters. The implementation of breeding programmes in this kind of industrial production system (Navarro et al., 2009a) needs both physical tagging (Navarro et al., 2006) and genetic identification of parent– offspring relationships by analysing molecular markers (Navarro et al., 2008), in order to avoid expensive genetic analysis in all sampling points during on-growing process (Navarro et al., 2009b). Thus, to promote genetic selection schemes in industry is very important to dispose of a standardized system to assign correctly familial relationships. The number of loci needed for an efficient assignment depends on parameters such as, population size and allelic diversity (Bernatchez & Duchesne, 2000; Villanueva et al., 2002), the number of breeders contributing to Page 2 of 31 Animal Genetics Animal Genetics 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 For Peer Review 3 spawning (Blouin et al., 1996; Liu & Cordes, 2004), the level of homozygosity (Marshall et al., 1998), or the existence of null alleles (Borrell et al., 2004; Castro et al., 2007; Navarro et al., 2008). Using a high number of microsatellite markers ensures an efficient relationship assignment in any situation (Navarro et al., 2008) which, combined in a multiplex PCR reaction greatly reduces costs. Multiplex PCR also reduces time and associated errors and it is a powerful technique that can increase the productivity of genetic studies (Neff & Gross, 2000). However, genotyping methods always have associated risks for errors which must be taken into account in the reliability of the results (Taberlet et al., 1996; Borrell et al., 2004; Hoffman & Amos, 2005; Castro et al., 2006). Genotyping errors result from diverse and complex origins, such as, errors linked to the DNA sequence, errors due to the low quality or quantity of the DNA (Borrell et al., 2011), and human factors (Hoffman & Amos, 2005; Pompanon et al., 2005). Genotyping errors due to human mistakes are minimized by multiplex assays, since they reduce steps during the sample analysis process and introduce automation (Bonin et al., 2004). Identify and reduce genotyping errors inherent to each microsatellite (Castro et al., 2004; Hoffman & Amos, 2005; Pompanon et al., 2005; Castro et al., 2006) is also very important, especially for inter-laboratory reproducibility (Sobel et al., 2002; Weeks et al., 2002). The first multiplex PCRs developed for gilthead seabream were by Launey et al. (2003) and Brown et al. (2005). These authors isolated new specific microsatellites and proposed two (three and five dinucleotide markers) and one (four dinucleotide markers) multiplex reactions, respectively. Navarro et al. (2008) developed two robust interspecific multiplex reactions, RimA of ten and RimB of seven redesigned microsatellite markers, achieving 100% of success in parental assignments despite the presence of null alleles. Porta et al. (2010) proposed two specific multiplex reactions of four (SaGT4) and six (SaGT6) dinucleotide microsatellite markers to successfully assign paternity to 95% of the studied offspring. Borrell et al. (2011) developed a multiplex PCR (OVIDORPLEX) of nine microsatellite markers (four of which were interspecific) Page 3 of 31 Animal Genetics Animal Genetics 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 For Peer Review 4 that successfully assigned 99.2 %. Vogiatzi et al. (2011) screened for microsatellite sequences found in coding regions derived from an EST-database of gilthead seabream. They evaluated 63 di-, tri-, tetra-, pentaand hexanucleotide microsatellites for polymorphisms and variations in length. Moreover, these authors proposed combining markers that require identical annealing temperatures to create five multiplex PCRs, whose number of markers ranged from four to nine in each assay. These reactions were tested on only four wild individuals. This high number of multiplex PCRs developed for gilthead seabream from many different microsatellite markers does not allow comparison among populations and data from companies and research groups. This highlights the need of developing a standardized panel of markers which could be used with safety and reliability by all users. An international panel is a set of highly polymorphic, specific and reproducible markers recommended by the International Society for Animal Genetics (ISAG). The set of markers must be previously assessed according to their polymorphism and their genotyping errors by an ISAG Comparison Test (CT) in which several markers are shared among laboratories to be amplified using the same samples and to have international agreement on nomenclature and procedures. The results are discussed at a conference of the ISAG and a summary with the international panel is established by the Standing Committee and reported to the Society. International panels of markers for land species where genetic improvement is well-established are becoming more common. However, in fish no international panels of markers have been published yet. The main objective of this study was to develop multiplex PCRs, from a wide spectrum of specific microsatellite markers, which may be proposed to the International Association for Genetics in Aquaculture (IAGA) as an international panel of markers for gilthead seabream, by following these steps: a) to redesign primers of 138 microsatellite markers from gilthead seabream genetic linkage map in such a way as to be amplified using the same PCR conditions, b) to evaluate these markers according to their genetic variability, allele size range and genotyping reliability, c) to Page 4 of 31 Animal Genetics Animal Genetics 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 For Peer Review 5 propose a protocol to identify and classify potential errors as a method to assess the reliability of each marker, d) to develop two multiplex PCRs with eleven markers in each one as an international panel of markers for gilthead seabream, using the best microsatellites, e) to validate the robustness of these multiplex PCRs by amplifying the same samples in four different laboratories and f) to check their effectiveness in parentage assignment in a sample of offspring from an industrial mass-spawning. Materials and methods Samples A total of three gilthead seabream broodstocks and 256 of their offspring belonging to a selection breeding program (PROGENSA ® , 2009) were analysed. From this 256 fish, six descendents from the Instituto Canario de Ciencias Marinas (ICCM, Canarias, Spain), five from PISCIMAR S.L. (PMAR, Cataluña, Spain) and five from CULMASUR S.A (CSUR, Andalucía, Spain) were used as Control samples to study the genetic variability and reliability of all the microsatellite markers. From these samples, four individuals were also used to optimize the multiplex PCR reactions (Testing samples). Three broodstocks (59 breeders of ICCM, 47 of PMAR and 98 of CSUR) and a sample of 80 offspring from each one were analysed to validate the usefulness of these multiplexes in the parental assignation. DNA was extracted from fin tissue previously preserved in absolute ethanol at room temperature, using the DNAeasy kit (QUIAGEN ® ), and then kept at 4°C following the manufacturer’s recommendations. DNA quality and quantity were determined using a Nanodrop 1000 spectrophotometer v.3.7 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, U.S.A.). DNA integrity was checked by means of electrophoresis in a 1% agarose gel (8 v·cm −1 ) by ethidium bromide staining (0.5 µg·µl −1 ) and analysed with Quantity One© Software (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead Hertfordshire, UK), using Lambda Hind-III as molecular weight marker. Page 5 of 31 Animal Genetics Animal Genetics 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 For Peer Review 6 Microsatellite evaluation Primers design: From all published microsatellites in the genetic map of gilthead seabream (Franch et al., 2006; Senger et al., 2006), 138 primer pairs were designed to amplify markers using the same PCR conditions. The chosen amplicon length ranged from 70 to 200 base pairs (bp) to optimize effectiveness of the multiplex reaction (Dakin & Avise, 2004). Also, the existence of flanking DNA sequences free from interfering polymorphisms, such as nucleotide substitutions in potential primer binding sites, was considered. Sequences with high complexity were avoided during primer design to ensure sensitivity and specificity of the multiplex assay. The aim was to obtain a theoretical melting temperature of 60ºC ± 2ºC at a salt concentration (K + , Na + , Tris + or NH4 + ) of 180 mM. GC content was comprised between 35–60% to avoid palindromes or homopolymers such as poly (dT) longer than five bases. All primer candidates were analysed for hairpin or secondary structures using the software found on-line at Integrated DNA Technologies (http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/mFold/). Stable secondary structures for primer sequences around each microsatellite region were avoided (below the -13 kcal·mol -1 threshold of free energy) (Yuryev et al., 2002). Primer characteristics were selected to ensure equal PCR amplification efficiency for all DNA fragments as previously described (Sánchez et al., 2003). Primers were renamed with an internal code in order to facilitate understanding of this work. PCR reaction: Each microsatellite marker was tested in a single PCR using the Control samples in order to confirm its correct amplification, allele size range, morphology, genetic variability and reliability of genotyping. The PCR conditions consisted of an initial denaturation at 95°C for 10 min, followed by 28 cycles of 94°C for 30 s, 60°C for 1 min and 65°C for 1 min, with a final extension of 60°C for 60 min. Reactions were carried out in a final volume of 12.5 µl with the following component concentrations: 1X GeneAmp PCR Buffer II (100 mM Tris–HCl pH 8.3, 500 mM KCl) Page 6 of 31 Animal Genetics Animal Genetics 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 For Peer Review 7 (Applied Biosystem ® , USA), 3 mM MgCl 2 , 0.2 mM of each dNTP, 0.04 units µl −1 AmpliTaq Gold DNA polymerase (Applied Biosystem ® ), 2.4-6.4 ng·µl −1 of DNA template, and 0.2 µM of each primer. Before running PCR fragments in the automatic sequencer, an aliquot was checked on 2% agarose gel for 30 min (8v·cm −1 ), to test the adequate amplification of multiplex amplicons. Later, 1µl of each reaction product (diluted at 75% with Milli-Q water) was mixed with 9.75 µl of Hi-Di formamide and 0.25 µl of GeneScan LIZ 500 (Applied Biosystem ® , USA) molecular weight marker, and loaded in an ABI Prism ® 3130XL automatic sequencer (Applied Biosystem ® , USA) of 16 capillaries using POP-7 polymer and run conditions of 60°C, 3000 v, 1500 s. The reaction products of each single PCR assay were initially loaded in groups of three markers taking into account their fluorochromes, allelic ranges and the intensity of the band on agarose gel. Electropherograms were analysed using the GeneMapper (v.3.7) software (Applied Biosystem ® , USA). Genotyping reliability: Genotyping reliability of each microsatellite was evaluated by determining the error or potential error rates in the Control samples. A scale assigning a score from 1 to 3 for each microsatellite was established: 1 denoted ambiguous genotypes in more than 30% of the samples, 2 ambiguous genotypes in 30% or less of the samples and 3 unambiguous genotypes in 100% of the samples. Four error types were considered: according to peak scoring; a) inadequate amplification: peak heights less than 300 Relative Fluorescent Units (RFU), with high background or variable allelic morphology (Fig 1A; Pompanon et al., 2005), b) long allele dropout: preferential amplification of the shorter allele (Fig 1B; Castro et al., 2006); c) unclear banding pattern: high stutter bands that make it difficult to distinguish between a homozygote and a heterozygote for adjacent alleles (Fig 1C; Hoffman & Amos, 2005), and according to allele calling, d) intermediate alleles: dinucleotide loci with alleles that differ from each other by 1 bp (Fig 1D; Castro et al., 2004). Page 7 of 31 Animal Genetics Animal Genetics 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 For Peer Review 8 Previously, the right running of the molecular weight markers were checked in all the electropherograms, in order to consider only the errors linked to the DNA sequence primers. SuperMultiplex PCRs optimization After microsatellite evaluation, those microsatellite markers without amplification, bad reliability or very low genetic variability were discarded, remaining 79 optimal markers, named adequate microsatellites. Their sequences, loci accession number in GenBank and fluorochromes of each microsatellite marker are shown in Table 1. From these markers, two SuperMultiplex PCRs were designed and named SMsa1 and SMsa2 (SuperMultiplex Sparus aurata). The number of markers included in each multiplex PCR was as high as possible taking into account their linkage group (in order not to repeat any in each reaction), allele size range and assigned labelling fluorochrome (the minimum distance between markers with the same colour was 18 bp to avoid overlapping in future or unknown samples). Initially, 0.2 µM of each primer was used for each multiplex PCR and primer concentrations were modified subsequently to obtain peak heights between 600 and 3000 RFU for each microsatellite marker as described Navarro et al. (2008). Those microsatellite markers that failed amplification were replaced by new ones. Each set-up was tested on Testing samples. The PCR conditions were the same as those used in the initial single PCR. Again, an aliquot was checked on 2% agarose gel for 30 min (8v·cm −1 ), to test the adequate amplification of the multiplex amplicons. The automatic sequencer conditions were also the same as those used in the single PCR except that the reaction product was diluted at 50-85% depending on each machine (i.e. each laboratory). Electropherograms were analysed using the GeneMapper (v.3.7) software and a kit of bin set were created for each multiplex (kit-SMsa1 and kit-SMsa2, available on request to [email protected]). Genotyping and familial assignments The Control samples were amplified with SMsa1 and SMsa2 in four Spanish genetics laboratories for aquaculture and analysed using the same kit of bin set in order to validate their robustness in Page 8 of 31 Animal Genetics Animal Genetics 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 For Peer Review 9 the genotyping. To test their usefulness in the parental assignation the three broodstocks and their offspring were genotyped with SMsa1 and only the ICCM broodstock and their descendents with SMsa2. Each broodstock was genotyped in a different Spanish genetics laboratory using the kitSMsa1 of bin set for the GeneMapper (In each genotyped one of the Control samples was used as a reference sample (Ref-sa) (DNA available on request to [email protected]). Familial assignments were determined using the genotypes of each multiplex PCR. Analysis data The observed heterozygosity (Ho), expected heterozygosity (He), the Polymorphic Information Content (PIC) of each marker was estimated using Cervus (v 3.0.3) (Kalinowski et al., 2007). Markers were sorted according to their PIC value, as highly informative (PIC≥ 0.5), reasonably informative (0.5>PIC>0.25) and slightly informative (PIC≤0.25) (Botstein et al., 1980). The real frequency of null alleles was calculated from the breeders contributing to the spawning, by analysis of the segregation. Of each multiplex PCR the Combined Exclusion Probability (CEP) for the parent pair option (Jamieson & Taylor, 1997) was estimated by Cervus (v 3.0.3) (Kalinowski et al., 2007). The Predicted Assignment Rate (Pall), a parameter to evaluate assignment power of microsatellites markers for pedigree analysis in fish breeding, proposed by Vandeputte et al. (2011) was estimated using the equation number nine. Parental assignments between breeders (with unknown gender) and their descendents were determined using the exclusion method by VITASSING V.8_2.1 software (Vandeputte et al., 2006). Results Microsatellite evaluation Out of the 138 microsatellite markers, 10 (A3, B9, B11, C5, D8, E7, H3, J4, J12, K12) did not work individually and two were monomorphic (D3, M1). Page 9 of 31 Animal Genetics Animal Genetics 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 For Peer Review 10 In the remaining 126 markers, Ho ranged from 0.08 to 1, and He ranged from 0.121 to 0.976. Those markers that showed a Ho < 0.3 were considered inadequate (A2, A6, A7, B2, B5, C8, C11, I1, J6, J7, L4, L6, M8). According to their PIC value, 77% of the markers were highly informative, 19.8% were reasonably informative (A1, A2, A4, A7, A10, B5, B7, B10, C6, C11, D5, E2, E10, I1, J6, K1, K5, L1, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L12) and 3.2% were slightly informative (B2, C8, J7, L4). Only highly informative markers were considered adequate. Errors or potential errors were found in 20 of the 126 markers which were scored with 1 or 2: five markers showed inadequate amplification (B10, D1, G8, J6, L3), six showed long allele drop outs (B4, G1, I3, J5, K1, K11), two had unclear banding patterns (D7, F8) and seven showed intermediate allele in allele calling (C7, H9, K5, K9, K10, L2, M2). Only the 3-scored markers were considered as adequate. At the end of screening, 79 microsatellites were selected as adequate, whose genetic variability and allele size range are shown in Fig 2. The mean values of these markers were 8.2 for number of alleles (from 3 to 21), 0.762 for Ho (from 0.364 to 1.000), 0.797 for He (0.589 to 0.976) and 0.737 for PIC. All these markers were dinucleotides except five that were tetranucleotides (B6, F1, F3, I9, M5). SuperMultiplex PCRs optimization From the 79 microsatellites selected as adequate markers, two multiplex PCRs of 11 markers each were designed. Out of the microsatellites chosen initially for each multiplex reaction, the A9 in the SMsa1 and the G4 in the SMsa2 did not work properly. The A9 was replaced by the F6. There was not any adequate marker that could replace the G4 taking into account its linkage group, allele size range and fluorochrome. Therefore a reasonably informative marker was included as a replacement (L7) which at least satisfied the other requirements. The final primer sets of each multiplex PCR, and their concentrations, archived after nine genotyping runs, are reported in Table 2. Page 10 of 31 Animal Genetics Animal Genetics 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60