Estudio morfológico e inmonohistoquímico de glóbulos hialinos en hígado de cetáceos varados

Anexo II UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA Departamento: INSTITUTO UNIVERSITARIO DE SANIDAD ANIMAL Y SEGURIDAD ALIMENTARIA Programa de Doctorado: SANIDAD ANIMAL Título de la Tesis ESTUDIO MORFOLÓGICO E INMUNOHISTOQUÍMICO DE GLÓBULOS HIALINOS EN HÍGADO DE CETÁCEOS VARADOS. Tesis Doctoral presentada por Dª Ana Isabel Alves Godinho Tesis doctoral dirigida por el Dr. Antonio Jesús Fernández Rodríguez y codirigida por el Dr. Antonio Espinosa de los Monteros y Zayas. El Director, El Codirector, La Doctoranda, LAS PALMAS DE GRAN CANARIA, 14 DE ENERO DE 2010 División de Histología y Anatomía Patológica INSTITUTO UNIVERSITARIO DE SANIDAD ANIMAL Y SEGURIDAD ALIMENTARIA PROGRAMADE DOCTORADO: SANIDAD ANIMAL ESTUDIO MORFOLÓGICO E INMUNOHISTOQUÍMICO DE GLÓBULOS HIALINOS EN HÍGADO DE CETÁCEOS VARADOS. ANA ISABEL ALVES GODINHO LAS PALMAS DE GRAN CANARIA, 14 DE ENERO 2010 ANTONIO FERNÁNDEZ RODRÍGUEZ, CATEDRÁTICO DE UNIVERSIDAD DEL ÁREA DE CONOCIMIENTO DE ANATOMÍA Y ANATOMÍA PATOLÓGICA COMPARADAS DEL DEPARTAMENTO DE MORFOLOGÍA DE LA FACULTAD DE VETERINARIA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA. INFORMA: Que Ana Isabel Alves Godinho, Licenciada en Veterinaria, ha realizado bajo mi dirección y asesoramiento el presente trabajo titulado “ESTUDIO MORFOLÓGICO E INMUNOHISTOQUÍMICO DE GLÓBULOS HIALINOS EN HÍGADO DE CETÁCEOS VARADOS”, el cual considero que reúne las condiciones y calidad científica para optar al grado de Doctor en Veterinaria. Fdo.: Dr. Antonio Jesús Fernández Rodríguez LAS PALMAS DE GRAN CANARIA, 14 DE ENERO DE 2010 ANTONIO ESPINOSA DE LOS MONTEROS Y ZAYAS, PROFESSOR TITULAR DE UNIVERSIDAD DEL ÁREA DE CONOCIMIENTO DE ANATOMÍA Y ANATOMÍA PATOLÓGICA COMPARADAS DEL DEPARTAMENTO DE MORFOLOGÍA DE LA FACULTAD DE VETERINARIA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA. INFORMA: Que Ana Isabel Alves Godinho, Licenciada en Veterinaria, ha realizado bajo mi dirección y asesoramiento el presente trabajo titulado “ESTUDIO MORFOLÓGICO E INMUNOHISTOQUÍMICO DE GLÓBULOS HIALINOS EN HÍGADO DE CETÁCEOS VARADOS”, el cual considero que reúne las condiciones y calidad científica para optar al grado de Doctor en Veterinaria. Fdo.: Dr. Antonio Espinosa de los Monteros y Zayas LAS PALMAS DE GRAN CANARIA, 14 DE ENERO DE 2010 Este trabajo fue realizado como becaria de la Agencia Canaria de Investigación Innovación y Sociedad de la Información, por la resolución de 30 de diciembre de 2005, publicada en el Boletín Oficial de Canarias núm. 26, martes 7 de febrero de 2006. “La ciencia apenas sirve nada más que para darnos una idea de la existencia de nuestra ignorancia." Felicite Robert De Lamennais (1782-1854) Esta tesis está dedicada a mi abuela Margarida Vinagreiro i Índice 1 Agradecimientos....................................................................................................... 1 2 Abreviaturas ............................................................................................................. 5 3 Introducción y Objetivos.......................................................................................... 9 4 Resumen ................................................................................................................. 15 Resumo........................................................................................................................... 15 Summary......................................................................................................................... 15 5 Revisión Bibliográfica............................................................................................ 23 5.1 Morfofisiología hepática ................................................................................ 25 5.1.1 El Hígado de los Cetáceos...................................................................... 27 5.2 Fisiopatología hepática................................................................................... 28 5.3 Glóbulos hialinos............................................................................................ 30 5.3.1 Tipos de glóbulos ................................................................................... 31 5.3.1.1 Pale Bodies (PBs)............................................................................... 32 5.3.1.2 Mallory Bodies (MBs)........................................................................ 32 5.3.1.3 Deficiencia de Alfa-1-antitripsina...................................................... 34 5.3.1.4 Cuerpos Hialinos Intracitoplasmáticos (Intracytoplasmatic Hyaline Bodies, IHBs) ..................................................................................................... 36 5.3.1.5 Enfermedad de Almacenamiento en Retículo Endoplasmático. ........ 36 5.3.1.6 Enfermedad de Almacenamiento de Fibrinógeno.............................. 37 5.3.1.7 Cuerpos de Lafora (CL)...................................................................... 38 5.3.1.8 Cuerpos Esmerilados (“Ground-glass Inclusions”)............................ 39 5.3.1.9 Factores Hemodinámicos ................................................................... 39 5.3.1.10 Otros ............................................................................................... 40 5.4 Microscopía Electrónica (ME) ....................................................................... 41 5.5 Glóbulos Hialinos en Cetáceos....................................................................... 42 5.6 Proteínas de Fase Aguda (PFAs).................................................................... 42 5.6.1 Clasificación de las Proteínas de Fase Aguda ........................................ 43 5.6.1.1 Proteínas de Fase Aguda incluidas en el presente estudio ................. 45 5.6.1.2 Principales Mediadores (citoquinas) .................................................. 46 5.6.2 Proteínas de Fase Aguda en Cetáceos .................................................... 46 5.7 Técnicas Complementarias............................................................................. 47 ii 6 Material y Métodos................................................................................................. 51 6.1 Material........................................................................................................... 53 6.2 Métodos.......................................................................................................... 68 6.2.1 Técnica de necropsia .............................................................................. 68 6.2.1.1 Hígado ................................................................................................ 72 6.2.1.2 Preparación de las muestras................................................................ 72 6.2.2 Técnicas de histoquímica........................................................................ 73 6.2.2.1 Tinción de Hematoxilina-Eosina (H&E)............................................ 74 6.2.2.2 PAS-Diastasa...................................................................................... 75 6.2.3 Técnicas de inmunohistoquímica ........................................................... 75 6.2.4 Microscopía Electrónica......................................................................... 78 6.2.5 Observación y fotografiado de las muestras con Microscopía Optica y Electrónica.............................................................................................................. 80 6.3 Procedimiento para el desarrollo del presente trabajo.................................... 80 6.4 Técnicas Complementárias (Glicobiología y Proteómica)............................. 82 6.4.1 Glicobiología.......................................................................................... 83 6.4.2 Proteómica.............................................................................................. 84 6.4.2.1 Western Blot....................................................................................... 84 6.4.2.2 Espectrometría de Masas.................................................................... 85 7 Resultados............................................................................................................... 89 7.1 Resultados preliminares para la selección de muestras.................................. 91 7.2 Resultados obtenidos en los cetáceos incluidos en el estudio........................ 93 7.2.1 Informes de necropsia............................................................................. 93 7.2.2 Estado Nutricional, Patológico y presencia de Glóbulos Hialinos....... 214 7.2.3 Resultados Histoquímicos e Inmunohistoquímicos.............................. 216 7.3 Microscopía Electrónica............................................................................... 233 7.4 Animales Atrapados en Redes (“Bycatch”).................................................. 238 7.5 Glicobiología................................................................................................ 243 7.5.1 Histoquímica......................................................................................... 243 7.5.2 Detección de carbohidratos utilizando Lectinas................................... 244 7.6 Proteómica.................................................................................................... 249 7.6.1 Western Blot......................................................................................... 249 7.6.2 Espectrometría de masas por MALDI-TOF:........................................ 250 Abreviaturas 8 Proteínas de Fase Aguda PFA Síndrome de Estrés de Varamiento SEV Sambucus nigra lectin SNA Solución sol. Ubiquitina Ub. Wheat Germ Agglutinin WGA Introducción y Objetivos 9 3 . Introducción y Objetivos Introducción y Objetivos 11 Una de las grandes riquezas de las Islas Canarias es, sin duda, su patrimonio natural representado por los cetáceos, tanto por las poblaciones residentes, como por las que utilizan las aguas de Canarias en sus rutas de migración. Los cetáceos están en el más alto de la cadena trófica, y como tales, constituyen un excelente bioindicador del estado del medio marino, constituyendo en la actualidad, uno de los grupos de mamíferos marinos sobre los que se centra gran parte del interés social y científico para su conservación. Todo el conocimiento que se obtiene de estos animales nos permitirá trabajar con fundamentos científicos en los objetivos de su conservación y detectar problemas, que directa o indirectamente pueden afectar a los ecosistemas marinos y al mismo tiempo a la salud animal y, a veces, humana. Por tratarse de animales silvestres, que engloban numerosas especies, con una importante variedad de comportamientos, rutas migratorias, alimentación, ciclos reproductivos, etc., existen numerosas y profundas lagunas en el conocimiento de estos animales, tanto desde el punto de vista biológico como sanitario. Este trabajo pretendió añadir un grano más a los conocimientos científicos en cetáceos silvestres, a través del estudio de los animales varados. Esta tesis se centró en intentar entender el significado de unas estructuras vacuolares microscópicas, que se presentan con frecuencia en hepatocitos de diferentes especies de cetáceos varados y que reciben la denominación de glóbulos hialinos intracitoplasmáticos. Introducción y Objetivos 12 La presencia de glóbulos hialinos en el citoplasma de hepatocitos ha sido observada y descrita microscópicamente en el hígado del hombre y de animales (Zatloukal y cols., 2007; Li y cols., 2003; Yamada y cols., 2002; Boyd y Latimer, 2001). En la literatura científica se ha referenciado una serie de inclusiones eosinofílicas, morfológicamente parecidas, que han recibido diferentes denominaciones, atendiendo a su morfología, naturaleza o descubridores. Así se presentan los “Pale Bodies” (PBs), “Mallory Bodies”(MBs), “Glóbulos de Alfa-1-Antitripsina” y los “Cuerpos de Lafora”, entre otros (Moon y cols., 2000; Mallory, 1911; Sharp y cols., 1969; Hashimoto y cols., 2001). Este tipo de glóbulo hialino intracitoplasmático no es un hallazgo histológico específico del hígado, ya que se puede observar en células de tumores ováricos y uterinos, carcinoma hepatoide en pulmón, en células epidermales en biopsias de piel congestiva, o en los denominados “cuerpos de Lewy” en células nerviosas, entre otros (al-Nafussi y cols.,1993; Reymundo, y cols.,1993; Carlinfante y cols., 2000; Tsai y cols., 2001; Strnad y cols., 2008). En cetáceos, estos glóbulos hialinos en hepatocitos se describieron, por vez primera, a principio de los 90, durante los estudios histológicos realizados en delfines listados que murieron durante la epizootia causada por un morbillivirus en el mar mediterráneo. En este trabajo, se demostró que los glóbulos no contenían antígenos víricos (Domingo y cols., 1992); al tiempo que otros autores, los relacionaron con lesiones hepáticas derivadas de la posible acción tóxica, por las altas concentraciones de contaminantes presentes en delfines listados (Aguilar y cols., 1994), dando lugar a una importante discusión científica sobre la naturaleza y etiología de estos glóbulos. Introducción y Objetivos 13 Posteriormente, Jaber y cols., en 2004, describieron, en su trabajo sobre patologías hepáticas en cetáceos varados en las Islas Canarias, que estas inclusiones, no solo se observan en delfines listados, sino que se pueden presentar en el hígado de otras especies de odontocetos y así como de misticetos. La naturaleza y los mecanismos que participan en la aparición de estos glóbulos en cetáceos es, en gran medida, desconocida (Kennedy y cols., 1993; Jaber y cols., 2004), lo que contribuye a la originalidad de los resultados presentados en esta tesis doctoral. Este trabajo pretendió abordar estos objetivos, desde el punto de vista morfológico (estructural y ultraestructural), así como su posible etiopatogenia, utilizando técnicas histoquímicas e inmunohistoquímicas, microscopía electrónica, Western Blot, estudios de glicobiología y espectrometría de masas. Con los siguientes objetivos específicos: 1. Estudio morfológico estructural y ultraestructural de los glóbulos hialinos intracitoplasmáticos en hepatocitos de cetáceos varados. 2. Estudio inmunohistoquímico de los glóbulos hialinos intracitoplasmáticos en hepatocitos de cetáceos varados. 3. Estudio complementario utilizando técnicas de glicobiología y proteómica en muestras de hígados de cetáceos varados. Resumen 15 4 . Resumen Resumo Summary Resumen 17 La presencia de glóbulos hialinos en el citoplasma de hepatocitos ha sido observada y descrita microscópicamente en el hígado del hombre y de animales. En la literatura científica se ha referenciado una serie de inclusiones eosinofílicas, morfológicamente parecidas, que han recibido diferentes denominaciones, atendiendo a su morfología, naturaleza o descubridores. En cetáceos, estos glóbulos hialinos en hepatocitos se describieron, por vez primera, a principio de los 90, en delfines listados que murieron durante una epizootia causada por un morbillivirus. Otros autores, relacionaron la presencia de glóbulos con lesiones hepáticas derivadas de altas concentraciones de contaminantes en delfines listados, con lo que se abrió una importante discusión científica sobre la naturaleza y etiología de estos glóbulos. Posteriormente, se describió que estas inclusiones se pueden presentar en el hígado de varias especies de odontocetos y misticetos. La naturaleza y los mecanismos que participan en la aparición de estos glóbulos en cetáceos es, en gran medida, desconocida, lo que contribuye a la originalidad de los resultados presentados en esta tesis doctoral. Este trabajo pretendió abordar estos objetivos desde el punto de vista morfológico (estructural y ultraestructural), y de su etiopatogenia, utilizando técnicas histoquímicas e inmunohistoquímicas, microscopía electrónica, Western Blot, estudios de glicobiología y espectrometría de masas. De 115 cetáceos varados en las Islas Canarias pertenecientes a 16 especies diferentes de ballenas y delfines, el 82,6% mostraron glóbulos hialinos intracitoplasmáticos y un 17,4% no presentaron este cambio morfológico. El 95,0% de las muestras con glóbulos se asociaron a congestión hepática aguda/subaguda y mayoritariamente al varamiento activo de los cetáceos. Como mecanismos que pudieran explicar la morfogénesis de los glóbulos hialinos durante el varamiento activo, y que participarían individual o sinérgicamente hemos Resumen 18 considerado los siguientes: 1) Cambios hemodinámicos representados por la congestión intrasinusoidal. 2) Mecanismos locales y/o sistémicos asociados al Síndrome de Estrés de Varamiento. 3) Condiciones individuales previas o adquiridas durante el varamiento en cada animal. Inmunohistoquímicamente, de los 95 cetáceos con glóbulos hialinos, un 89,9%, 96,8% y 53,7% fueron positivos a Alb, FB y A1AT, respectivamente. Los parámetros comunes en los cetáceos positivos a FB y A1AT fueron preferentemente el varamiento activo y un estado nutricional/corporal bueno, asociado a procesos inflamatorios e infecciosos. En cambio, la característica más común en los cetáceos sin glóbulos fue mayoritariamente el varamiento no activo y un estado corporal/ nutricional pobre. Los cetáceos muertos por atrapamiento en red presentaron, en su gran mayoría, glóbulos hialinos positivos al FB, pero no a la A1AT. La presencia de FB, se explicaría en estos casos, por un proceso de estrés y muerte por asfixia en animales con una buena condición nutricional / corporal y sanitaria. Ultraestructuramente, los glóbulos se presentan con y sin membrana, lo que indicaría la existencia diferentes mecanismos de formación y variedad de contenido, según el tipo o la fase de su morfogénesis. Las técnicas complementarias demostraron preliminarmente que, en cetáceos, la glicosilación de las distintas cadenas proteicas de FB y de A1AT, pueden ser diferentes a las actualmente conocidas en otros mamíferos; y/o que estas pueden modificarse por factores metabólicos. Los estudios de glicobiología y proteómica confirman la relación de los glóbulos hialinos y las PFA con situaciones de estrés, enfermedad y protección celular, lo que abre nuevas vías de investigación en cetáceos, especies ubicadas en lo mas alto de la cadena trófica y verdaderos bioindicadores del estrés medioambiental marino. Resumen 19 Resumo A presença de glóbulos hialinos no citoplasma de hepatócitos foi observada e descrita microscopicamente no fígado de humanos e animais. Na literatura científica tem sido referenciado um número variado de inclusões eosinofílicas, morfologicamente semelhantes, que receberam nomes diferentes, dependendo de sua morfologia, a natureza ou descobridores. Nos cetáceos, estes glóbulos hialinos em hepatócitos foram descritos pela primeira vez no início dos anos 90, em golfinhos riscados que morreram durante uma epidemia causada por um morbillivirus. Outros autores relacionaram a presença de glóbulos com danos no fígado resultante de altas concentrações de contaminantes nos golfinhos riscados, que abriu um importante debate científico sobre a natureza e etiologia desses glóbulos. Posteriormente, foi relatado que estas inclusões podem estar presentes no fígado de várias espécies de golfinhos e baleias. A natureza e os mecanismos envolvidos no surgimento de tais glóbulos em cetáceos são praticamente desconhecidos, o que contribui para a originalidade dos resultados apresentados nesta tese. Este estudo procurou abordar esses objetivos do ponto de morfológicos (estrutural e ultra-estruturalmente), e sua etiopatogénese, utilizando histoquímica e técnicas imuno-histoquímicas, microscopia electrónica, Western Blot, estudos de glicobiologia e espectrometria de massa. Dos 115 cetáceos arrojados nas Ilhas Canárias, pertencentes a 16 espécies de baleias e golfinhos, 82,6% mostraram glóbulos hialinos intracitoplasmáticos e 17,4% não possuíam essa alteração morfológica. 95,0% das amostras com glóbulos apresentaram congestão hepática aguda / subaguda, principalmente em cetáceos com arrojamento activo. Os mecanismos que podem explicar a morfogénese dos glóbulos hialinos relacionados com arrojamentos activos são: 1) Alterações hemodinâmicas Resumen 20 intrasinusoidais provocadas por congestão. 2) Mecanismos locais e / ou síndrome de stress sistémico associado com o arrojamento 3) Condições individuais prévias, ou adquiridas durante o arrojamento em cada animal. Imunohistoquimicamente, de 95 cetáceos com glóbulos hialinos, 89,9%, 96,8% e 53,7% foram positivos para Albumina (Alb), Fibrinogénio (FB) e Alfa 1-antitripsina (A1AT), respectivamente. Os factores comuns em cetáceos com FB y A1AT foram o arrojamento activo e um bom estado nutricional / condição corporal, associada a processos inflamatórios e infecciosos. Por outro lado, as características mais comuns em cetáceos sem glóbulos foram uma condição corporal pobre / má nutrição e o arrojamento passivo. Os 36 cetáceos mortos em redes de pesca apresentaram glóbulos hialinos, na sua maioria, positivos para FB, mas não para A1AT. A presença de FB, nestes casos, pode ser explicada por um processo de stress e morte por asfixia de animais com bom estado nutricional / condição corporal e saudáveis. Ultra-estruturalmente, os glóbulos aparecem com e sem membrana, sugerindo a existencia de mecanismos diferentes na sua formação e conteúdos distintos, que dependem aparentemente do tipo ou fase da sua morfogénese. As técnicas complementares mostraram, como resultados preliminares, que em cetáceos, a glicosilação de algumas cadeias protéicas de FB e A1AT podem ser diferentes das conhecidas atualmente noutros mamíferos, e / ou que estas podem estar modificadas por fatores metabólicos. Estudos de proteómica e glicobiologia também confirmam a relação dos glóbulos hialinos e proteínas de fase aguda com o stress, patologias e proteção da célula, o que abre novas vias de investigação sobre os cetáceos, espécies estas localizadas no topo da cadeia alimentar e bioindicadores reais de factores de stress no ambiente marinho. Revisión Bibliográfica 28 auxiliaría el retorno venoso en el caso de aumento de la presión intraabdominal, que podría originar el fenómeno de Valsalva (Rommel y cols., 2006). Estos animales carecen de vesícula biliar pero presentan un conducto hepático común bien desarrollado que se conecta con el duodeno (Yamasaki y cols., 1972; Harrison y King, 1980). Histológicamente, el hígado presenta grandes senos venosos y esfínteres musculares portales (Simpson y Gardener, 1972) lo que podría denotar alguna adaptación vascular a la vida acuática. Figura 5.1.1. Hígado de cetáceo en el que se observa una organización pentagonal o hexagonal semejante a la observada en otras especies. Lobulillo clásico. VC-vena central; EP-espacio porta. H&E (10x) 5.2 Fisiopatología hepática El hígado es uno de los órganos con mayor capacidad de adaptación a distintas situaciones o exigencias orgánicas. Estas pueden manifestarse de varias formas, como la hiperplasia o hipertrofia hepática, principalmente en animales jóvenes, o cambios en el Revisión Bibliográfica 29 almacenamiento de glucógeno, almacenamiento y transporte de lípidos, aumento de la actividad del retículo endoplasmático liso, alteración de los transportadores de membrana, actividad de los lisosomas y peroxisomas, y producción de proteínas de estrés (Ham, 1975; Dellmann, 1993). Los cambios vasculares relacionados con la insuficiencia cardiaca están en el origen de alguna de las modificaciones observadas a nivel hepático. Cuando ocurre una insuficiencia cardiaca izquierda, se desarrolla una congestión hepática pasiva crónica que se manifiesta por esteatosis, edema intersticial, peliosis y trombosis sinusoidal hasta desarrollar fibrosis intersticial. La insuficiencia cardiaca derecha suele originar una sintomatología clínicamente, aún más importante (Ham, 1975). En casos de isquemia y reperfusión hepática el daño hepático puede ser amortiguado por el aumento de expresión de mioglobina. Tanto la necrosis como la apoptosis de hepatocitos son señales de lesión celular (Nitta y cols., 2003). La localización de las células dañadas puede ser indicativa del proceso patológico existente. Así, se puede observar necroinflamación multifocal, que suele derivar de problemas embólicos procedentes del tracto digestivo, y necrosis zonal o masiva como resultado de afecciones tóxicas o isquémicas. La necrosis de la zona 1 es más rara, pero puede estar presente por la entrada de sustancias directamente hepatotóxicas desde el tracto digestivo. En otros casos, los productos tóxicos pueden dañar la zona 3. Cuando la necrosis focal no presenta un patrón determinado, esta puede estar relacionada con una inflamación local (hepatitis) de origen bacteriano o parasitario, que en la mayoría de los casos, no compromete gravemente la funcionalidad del hígado (Ham, 1975; Dellmann, 1993). La esteatosis hepática puede tener un origen fisiológico o patológico. El primer caso ocurre en animales gestantes o lactantes, y en el segundo, por patologías asociadas Revisión Bibliográfica 30 a la diabetes mellitus, cetoacidosis e hiperlipidemia por ayuno. Cuando los hepatocitos pierden la capacidad de metabolizar o secretar los triglicéridos, estos se acumulan en el citoplasma tanto en forma de macro como microvesículas. La esteatosis es considerada una degeneración hepática cuando se observa simultáneamente con daño celular y filtrado inflamatorio (Ham, 1975). La vacuolización hepática observada en casos de hepatotoxicidad está muchas veces relacionada con la acumulación de glucógeno como mecanismo de defensa celular y no conlleva obligatoriamente el inicio de degeneración hidrópica (Nayak y cols., 1996). El acúmulo de lipofuscina en los lisosomas de los hepatocitos o células de Kupffer ocurre en casos de desgaste celular por la edad o prematuramente, como consecuencia de una enfermedad hepática crónica. La colestasis, puede producirse por causas tóxicas u obstructivas de los conductos biliares (Ham, 1975). 5.3 Glóbulos hialinos Muchas de las enfermedades conocidas en humanos y animales son caracterizadas por alteraciones proteicas y agregaciones de las mismas. Entre estas, tenemos la enfermedad de Alzheimer, Parkinson, enfermedad de Huntington, la deficiencia de α1-Antitripsina (A1AT), Amiloidosis, así como la esteatohepatitis alcohólica y no alcohólica (Janig y cols., 2005). Las agregaciones proteicas suelen ser el resultado de modificaciones estructurales de las proteínas, tanto por mutaciones como por daño oxidativo celular. El ejemplo clásico, es el de los Cuerpos de Mallory que aparecen tanto en las Revisión Bibliográfica 31 esteatohepatitis (alcohólicas o no alcohólicas) como en la colestasis o en algunos carcinomas hepatocelulares (Janig y cols., 2005). Existen también casos de proteínas sin alteraciones estructurales que son sobrexpresadas y consecuentemente se agregan. Estos agregados pueden ser identificados como estructuras con una mala conformación, provocando que chaperones como la ubiquitina (Ub) las identifiquen y las integren en las vías de degradación protéica (Janig y cols., 2005). Estas acumulaciones de proteínas mal conformadas o que se encuentran en exceso, suelen localizarse en el retículo endoplasmático, y se acumulan por mecanismos que impiden el transporte normal de las mismas hasta el aparato de Golgi (Nadanaka y cols., 2004). 5.3.1 Tipos de glóbulos Actualmente se han descrito varios tipos de acumulaciones de proteínas en los hepatocitos humanos y animales. Entre ellos están los Pale Bodies (PBs) (Moon y cols., 2000), los Mallory Bodies (MBs), los glóbulos de Alfa-1-Antitripsina (A1AT) o los Cuerpos Hialinos Intracitoplasmáticos (IHBs) que se asemejan a los MBs, pero su caracterización aún no está bien definida (Stumptner y cols., 1999). Los glóbulos hialinos en hepatocitos han sido identificados en varias especies como loros (Boyd y Latimer, 2001), ratones (Li y cols., 2003), bovinos (Yamada y cols., 2002) y humanos (Janig y cols., 2005). Se ha demostrado que estos glóbulos hialinos poseen distintas composiciones. Entre ellos están los PBs, que están constituidos esencialmente por fibrinógeno (Moon y Revisión Bibliográfica 32 cols., 2000), los MBs, que se componen principalmente de citoqueratinas, los glóbulos de A1AT y los IHBs que contienen al menos p62. (Stumptner y cols., 2006). Los mecanismos de formación de los glóbulos hialinos aun no son bien conocidos. Se ha descrito, que los agregados proteicos ocurren por la mala conformación de proteínas derivada de estrés térmico u oxidativo, alteraciones primarias a nivel de RNA, mutaciones o modificaciones post-traducción. Estos agregados suelen ser insolubles y se ha propuesto que se forman por el transporte retrogrado a través de microtúbulos de las proteínas agregadas, que se encuentran en la periferia de la célula, hasta un punto de agregación común (Microtubule organization center – MTOC) rodeado de vimentina (Kopito, 2000). 5.3.1.1 Pale Bodies (PBs) Los PBs se han descrito en algunos carcinomas hepáticos. Estos glóbulos contienen fibrinógeno y algo de albúmina y, aparentemente, corresponden a formaciones en las que el retículo endoplasmático rugoso está implicado (Moon y cols., 2000). 5.3.1.2 Mallory Bodies (MBs) Los cuerpos de Mallory son un tipo de acumulación hepática bien estudiado. Estos se describieron, por primera vez, en 1911 por Frank B. Mallory, en casos de hepatitis por alcoholemia (Mallory, 1911). En 2007, Zatloukal y cols. propusieron denominarlos cuerpos Mallory-Denk (MDBs) en base al trabajo de Helmut Denk Revisión Bibliográfica 33 (Zatloukal y cols., 2007). En este artículo de revisión se clasificaron los componentes de los MDBs en cinco grandes grupos, de los que destacan los asociados a citoqueratinas, los chaperones, los fosfoepitopes/kinasas y a la maquinaria de degradación proteica. De estas, la citoqueratina 8 (CK8), la citoqueratina 18 (CK18), la ubiquitina (Ub) y la p62 son las encontradas con mayor frecuencia y suelen estar asociadas a hepatocitos balonizados (Hanada y cols., 2008; Zatloukal y cols., 2007). El incremento de p62 en hepatocitos se presenta en animales sanos formando MBs, pero estos no incluyen la CK8 (Nan y cols., 2004). En estas formaciones se identifican la Hsp70, HSP90 y Hsp25 que presentan una función de chaperona (Janig y cols., 2005; Strnad y cols., 2008). Inicialmente, los componentes de los MBs estaban divididos en 2 grupos: las citoqueratinas y las proteínas de estrés. Estas proteínas están relacionadas con la respuesta celular en casos de estrés celular agudo. En casos crónicos, estos mecanismos de defensa alcanzan su límite de acción y se producen agregados proteicos. La p62 fue identificada como un factor común a los agregados proteicos en varias enfermedades crónicas o degenerativas (Zatloukal y cols., 2002). Estas proteínas alteradas y agregadas pueden ser nocivas, o no, para las propias células (Zatloukal y cols., 2002; Cerón y cols., 2005). Los MBs han sido asociados a otros trastornos hepáticos como esteatohepatitis no-alcohólica, colestasis, enfermedades inducidas por fármacos, almacenamiento de cobre, deficiencia de A1AT o neoplasias benignas y malignas (Denk y cols., 2000; French, 1983; Jensen y Gluud, 1994; Jensen y Gluud, 2005). En cambio, estos no aparecen en hepatitis viral aguda o en la mayoría de las intoxicaciones hepáticas agudas (Zatloukal y cols., 2007; Fickert y cols., 2003). Revisión Bibliográfica 34 Morfológicamente estos glóbulos eosinofílicos presentan una forma irregular y se localizan junto al núcleo (French, 1983; Zatloukal y cols., 2007; Denk y cols., 2000). La ultraestructura es mas variable, observándose tres tipos de formaciones filamentosas: tipo I, formado por filamentos paralelos; tipo II, presenta filamentos de distribución aleatoria; tipo III, constituidos por material granuloso amorfo electro-denso y rodeados por filamentos tipo II en la periferia (Yokoo y cols., 1982). De la revisión realizada por Zatloukal y cols., en 2007, se puede concluir que la presencia de los MBs no provoca daño celular y podrían considerarse como un mecanismo de protección. 5.3.1.3 Deficiencia de Alfa-1-antitripsina La deficiencia de A1AT asociada a una patología pulmonar crónica se descubrió por primera vez en 1963 (Laurell y Eriksson, 1963) y en 1969, también se asoció a una patología hepática (Sharp y cols., 1969). En los casos de deficiencia de A1AT, los glóbulos pueden ser observados sin la presencia de patología hepática (Cohen y cols., 1975; Teckman y cols., 2002), pero en casos de estrés metabólico, como es un déficit alimentario, se produce una esteatosis hepática y un incremento del número de glóbulos; el envejecimiento, a su vez, aumenta el tamaño de los mismos (Teckman y cols., 2002). Se ha descrito que la deficiencia de A1AT puede acelerar el Síndrome de Shock Tóxico (Nakede y cols., 1999). La deficiencia de A1AT aumenta la proliferación de hepatocitos sin glóbulos, lo que es factor de riesgo de carcinoma hepatocelular, principalmente en ratones macho, Revisión Bibliográfica 35 una vez que la testosterona parece incrementar la expresión génica de esta proteína (Rudnick y cols., 2004). También se ha descrito la presencia de glóbulos hialinos positivos a A1AT sin la existencia de la enfermedad (Bradfield y cols., 1977). En 1981, Pariente y cols., describieron la existencia de glóbulos hialinos, PAS-diastasa resistente y positivos a la A1AT, en muestras de hígado de pacientes alcohólicos, sin deficiencia de α1Antitripsina (Pariente y cols., 1981). En un estudio realizado en 1980 se concluyó que los glóbulos positivos a PAS y resistentes a la diastasa podían ser divididos en dos grupos. Por un lado, los que se localizaban en la región periportal, positivos a la A1AT, mientras que los glóbulos posicionados en la región centrolobulillar o en los bordes de áreas isquémicas fueron negativos, asociándose a áreas de anoxia o congestión (Qizilbash y cols., 1983). Se ha observado que en problemas de conformación de la A1AT, esta proteína forma glóbulos rodeados por membrana, en el citoplasma de la célula. En estos glóbulos se pueden detectar elementos de RE como es la proteína disulfito isomerasa. Si este mecanismo fallara, la deposición de A1AT en el RE sería nociva para la célula, con alteración de las vías de secreción. Por esta razón, se piensa que la formación de glóbulos parece ser un mecanismo de protección celular (Granell y cols., 2008). La deficiencia de A1AT es, en la actualidad, uno de los mejores modelos para el estudio del control de calidad de proteínas en el retículo endoplasmático y vías de degradación de proteínas (Termine y cols., 2004). Los glóbulos hialinos con A1AT pueden ser encontrados en otros tejidos que no el hígado, como pasa en algunos casos de tumores ováricos y uterinos. (al-Nafussi y cols.,1993; Reymundo y cols., 1993). Revisión Bibliográfica 36 5.3.1.4 Cuerpos Hialinos Intracitoplasmáticos (Intracytoplasmatic Hyaline Bodies, IHBs) Los cuerpos hialinos intracitoplasmáticos (IHBs) se presentan en casos de carcinomas hepáticos (Stumptner y cols., 1999). Son estructuras intracitoplasmáticas, de redondas a ovales, con un contenido homogéneo, eosinofílico y con un halo circundante. Para su formación es necesario que ocurra la sobrexpresión de la p62 y la ubiquitina. En casos de sobrexpresión de citoqueratina 8, se pueden formar los MBs, por lo que la aparición de estos dos tipos de inclusiones intracitoplasmáticos se interpreta como resultado de un proceso o fenómeno de estrés oxidativo (Stumptner, 2006; Denk y cols., 2006). 5.3.1.5 Enfermedad de Almacenamiento en Retículo Endoplasmático. Esta es una condición patológica que consiste en el acúmulo anormal de proteínas en el retículo endoplasmático, en el que se engloba la deficiencia de A1AT, Enfermedad de Almacenamiento de Fibrinógeno y la deficiencia de Alfa-1Antiquimotripsina (Callea y cols., 1992). Esta enfermedad puede ser congénita o adquirida. En el primer caso, se observa el acúmulo de una solo proteína estructuralmente modificada, como es el caso de la deficiencia de A1AT, mientras la adquirida (o secundaria) aparece por causas externas o por la existencia de otras enfermedades asociadas (Simsek y cols., 2005). Revisión Bibliográfica 37 Los glóbulos de fibrinógeno han sido identificados en la enfermedad de almacenamiento en retículo endoplasmático, conjuntamente con factores de complemento C3 y C4 (Ng y cols., 1989). Estas estructuran han sido identificadas en terneros negros Japoneses con signos clínicos de enfermedad. En este estudio se observó una membrana que delimitó a los glóbulos (Yamada y cols., 2002). En los casos de saturación de proteínas en el RE, existen mecanismos para la extracción de las mismas, como la eliminación de las porciones solubles por la vía de su biosíntesis o la autofagia, alternativa ésta, que aún no está suficientemente investigada (Kruse y cols., 2006). 5.3.1.6 Enfermedad de Almacenamiento de Fibrinógeno La Enfermedad de Almacenamiento de Fibrinógeno está relacionada con el acúmulo de esta proteína en forma de glóbulos hialinos en hepatocitos y se presenta en tres tipos. El tipo I, que está relacionado con hipofibrinogemia hereditaria acumulándose en el retículo endoplasmático rugoso (Brennan y cols., 2000) en forma de glóbulos de bordes irregulares con un halo (Simsek y cols., 2005). El tipo II y III, se presentan con menos frecuencia (Brennan y cols., 2000). El tipo II son cuerpos hialinos esmerilados de gran tamaño. El tipo III son redondos, eosinofílicos con un halo (Simsek y cols., 2005). En esta enfermedad los glóbulos hialinos son negativos para la A1AT y la Albúmina (Pfeifer y cols. 1981). Revisión Bibliográfica 44 . Figura 5.6.1. Proteínas de fase aguda positivas y proteínas negativas. Una segunda clasificación se basa en el mecanismo de inducción de la producción. Así, tenemos las proteínas de tipo I que son estimuladas por citoquinas like IL-1 mientras que las de tipo II son inducidas por citoquinas de la familia de la IL-6 (Whicher y cols., 1989; Moshage, 1997) (Figura 5.6.2). Figura 5.6.2. Resumen de la clasificación de las proteínas de fase aguda Tipo I y II. IL-6 IL-1 IFNγ TNFα He p atocito DAÑO DESIQUILIBRIO Proteínas Fase Aguda Positivas •proteína c reactiva •amiloide A •haptoglobulina •glicoproteínas acidas alfa-1 •ceruloplasmina Negativa •albúmina •transferrina Fibrinogeno Haptoglobina α1 antiquimotripsina α 1 antitripsina α2 macro g lobulina IL-6 IL-11 Oncostatina M F neutrofilico ciliar Cardiotrofina 1 SAA PCR Complemento C3 Haptoglobina α1 glicoproteína acida IL-1 α IL-1β TNFα TNFβ Tipo I Tipo II + 0 / - Revisión Bibliográfica 45 5.6.1.1 Proteínas de Fase Aguda incluidas en el presente estudio Fibrinógeno (FB) Esta proteína hepática pertenece a la cascada de coagulación sanguínea y sus alteraciones se asocian a trastornos congénitos o adquiridos. Así, se puede presentar una producción insuficiente, una utilización excesiva, como en la coagulación intravascular diseminada o fibrinolisis primaria o secundaria (Vu y cols., 2005). El fibrinógeno, que está presente en la sangre puede aumentar 2 a 3 veces cuando existe un estímulo adecuado. Al contrario que otras proteínas de estrés, su cantidad se mantiene elevada en la sangre después de la retirada del estimulo inicial, pudiendo tardar hasta 1 semana en normalizarse (Ham, 1975). Esta proteína tiene un índice de recuperación de 3,5 días, lo que indica una considerable producción comparativamente con otras proteínas (Sraub, 1963). Alfa 1 Antitripsina (A1AT) La A1AT es una proteína de fase aguda que aumenta su concentración en el plasma a las 24 horas del daño celular (Lozano y cols., 2005). Esta inhibe las proteasas de los neutrófilos y actúa en los mecanismos de producción de enfisema. Una baja concentración de esta proteína está, muchas veces, asociada a un trastorno genético que se manifiesta con casos de enfisema pulmonar o de cirrosis. Estas patologías son provocadas por enzimas (elastasa) liberadas por glóbulos blancos, que en condiciones normales, no provocan daño por la presencia de A1AT (Whicher y cols., 1989; Marcus y cols., 1998). Revisión Bibliográfica 46 Albúmina La albúmina es la principal proteína del plasma, seguida de las globulinas y fibrinógeno. Es la responsable de establecer la presión coloidosmótica, evitando así la perdida de plasma por los capilares (Guyton y Hall, 1996). Cuando ocurre una respuesta de fase aguda, la concentración de la albúmina en la sangre disminuye, perteneciendo a las proteínas de fase aguda negativas (Martínez, 1998). 5.6.1.2 Principales Mediadores (citoquinas) La producción de proteínas de fase aguda está regulada por citoquinas. A través de la cuantificación de las citoquinas, se puede valorar en suero la inducción de la repuesta sistémica del organismo ante un proceso inflamatorio o infeccioso. En medicina humana, esta valoración está siendo substituida por la cuantificación directa de las proteínas de fase aguda que, aparentemente, es más efectiva (Cerón y cols., 2005). 5.6.2 Proteínas de Fase Aguda en Cetáceos Actualmente existe escasa información científica específica sobre proteínas de fase aguda en Mamíferos Marinos y específicamente en cetáceos. Hasta el momento el conocimiento sobre proteínas de fase aguda en cetáceos procede de estudios clínicos en los que se han identificado proteínas, como la SAA, la haptoglobina y el fibrinógeno. La SAA ha sido identificada como un buen marcador de Revisión Bibliográfica 47 inflamación en manatís, mientras que bajos niveles de fibrinógeno están relacionados con un cuadro de Coagulación Intravascular Diseminada (CID), fallo hepático y/o caquexia en cetáceos (Harrison y King, 1980; Harr y cols., 2006). En otro estudio preliminar sobre la existencia de proteínas de estrés en la piel de cetáceos no mostró resultados concluyentes, si bien, se demostró, que las técnicas de inmunohistoquímica pueden ser utilizadas para su detección en tejidos (Southern y cols., 2002). 5.7 Técnicas Complementarias La Proteómica La Proteómica es la ciencia que estudia el conjunto de las proteínas contenidas en un organismo y que son determinadas por el genoma de las células. Esta ciencia se basa en la separación de las proteínas por electroforesis en gel uni y bidimensional. En el mismo se realiza la separación de proteínas por focalización isoeléctrica, en un primer paso, seguido de la separación de proteínas por su masa molecular. La migración de proteínas en el gel permite que se puedan extraer las bandas de interés y con el espectrómetro de masas es posible identificar la proteína, rompiéndola en diversos péptidos que son identificados por su masa y mediante la utilización una base de datos de secuencias de péptidos (Cooper, 1984) Revisión Bibliográfica 48 La Glicobiología Las cadenas de carbohidratos, denominados glicanos u oligosacáridos, poseen diversas funciones esenciales en el desarrollo de los organismos dada su participación como intermediarios en funciones entre células, entre la célula y la matriz extracelular, en intercambios entre elementos nucleares y citoplasmáticos y el transporte de moléculas intra e inter-organelas. Los oligosacáridos son igualmente importantes en las relaciones entre organismos (como por ejemplo, entre parásitos y hospedadores). La unidad de los oligosacáridos son los monosacáridos, moléculas que no pueden ser hidrolizadas y que aparecen en forma linear o en anillo. Estas unidades pueden formar conexiones α o β entre sí, lo que define distintas características biológicas. En la formación de glicoconjugados (oligosacárido + proteína o lípido) la proporción de azúcar puede ser sustancialmente más grande que la del sustrato. Por otro lado, el hecho de conexiones α o β conjuntamente con la posibilidad de agregación de oligosacáridos a diversos dominios de una misma proteína, hace que el estudio de estas moléculas sea de una complexidad más grande que en el caso del DNA o RNA. Los monosacáridos más comunes que forman los oligosacáridos son: acido sialico, hexosas (glucosas-Glc, galactosas-Gal y manosa-Man), hexoaminas (GlcNAc y GalNAc), deoxihexosas (fucosa-Fuc), pentosa (xilosa-Xyl) y el acido uronico (acido glucorónico-GlcA y acido iduronico-IdA). Estas moléculas pueden sufrir fosforilación, sulfación, metilación u O-acetilación. Los grupos amino pueden quedar libres o ser Nacetilados o N-sulfatados. Las clases de oligosacáridos están muchas veces definidas por el tipo de conexiones existentes entre los azucares y los aglicanos (lípidos o proteínas). Así, tenemos los N-glican que son cadenas de los azucares que se conectan a un residuo de Revisión Bibliográfica 49 asparagina que está en una cadena de polipéptidos con la estructura Asn-X-Ser/Thr. En los glicolipidos la conexión se realiza vía una glucosa o galactosa al grupo hidroxil del lípido. La biosíntesis de las distintas clases de glicanos suele ocurrir por vía Retículo Endoplasmásmico (RE)-Golgi-plasmalema. Los carbohidratos son sintetizados en su mayoría en el interior del RE y Complejo de Golgi, pero también puede ocurrir en el citoplasma. Los glicoconjugados pueden estar presentes tanto en el núcleo como en el citoplasma. Las lectinas son proteínas de distintos tamaño y conformación con tienen diversas funciones en los organismos vivos (tanto vegetales como animales), a través de las conexiones reversibles que realizan con carbohidratos específicos. La importancia de estas proteínas reside en el hecho de que nos permite un estudio más completo de las glicoproteínas. Cada lectina tiene afinidad para un determinado carbohidrato y es posible saber cual es el tipo de glicosilación que se produjo en la proteína, y si esta es normal, o tiene posee alguna alteración como se produce en diversas patologías (Varki y cols., 1999). Material y Métodos 51 6 . Material y Métodos Material y Métodos 53 6.1 Material Para la realización de este trabajo se han utilizado muestras de hígado de cetáceos varados en distintas localizaciones geográficas, preferentemente del archipiélago canario. El mayor grupo de muestras está constituido por hígados de 18 especies diferentes de ballenas y delfines varados en las costas de las Islas Canarias entre los años 1992 y 2008 (Tabla 6.1.1). Estos tejidos se encuentran almacenados en el banco de tejidos de la Unidad de Investigación de Cetáceos, de la División de Histología y Patología Animal del Instituto Universitario de Sanidad Animal, perteneciente a la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria (ULPGC). Las muestras de estudio proceden de necropsias realizadas en los cetáceos varados que se indican en la Tabla 6.1.1. Figura 6.1.1. Delfín listado (Stenella coeruleoalba) en la sala de necropsias de la Facultad de Veterinaria de la ULPGC. Material y Métodos 54 Tabla 6.1.1. Listado de animales sometidos a los diferentes análisis en el presente trabajo. Código Ref. AP Num/año Especie Sexo Edad Estado varamiento Cet 1 027/92 Delphinus delphis ND ND Vivo Cet 2 104/92 Delphinus delphis ND ND Muerto Cet 3 309/93 Physeter macrocephalus Hembra ND Muerto Cet 4 310/93 Physeter macrocephalus Macho ND Muerto Cet 5 009/94 Grampus griseus ND ND Muerto Cet 6 010/94 Lagenodelphis hosei ND ND Muerto Cet 7 058/94 Delphinus delphis Macho ND Muerto Cet 8 192/94 Delphinus delphis ND ND Muerto Cet 9 089/95 Delphinus delphis ND ND Muerto Cet 11 099/95A Stenella coeruleoalba ND Juvenil Muerto Cet 12 206/95 Ziphius cavirostris Hembra Adulto Vivo Cet 13 275/95 Stenella frontalis Macho Adulto Muerto Cet 14 018/96 Stenella coeruleoalba Hembra Adulto Muerto Cet 15 155/96 Delphinus delphis Macho Adulto Vivo Material y Métodos 55 Tabla 6.1.1. Listado de animales sometidos a los diferentes análisis en el presente trabajo (Continuación). Código Ref. AP Num/año Especie Sexo Edad Estado varamiento Cet 16 156/96 Delphinus delphis Macho ND Vivo Cet 17 159/96 Delphinus delphis Hembra Cria Vivo Cet 18 258/96 Pseudorca crassidens Macho Adulto Muerto Cet 19 272/96 Delphinus delphis Hembra Adulto Vivo Cet 21 283/96 Stenella frontalis Macho Adulto Vivo Cet 22 300/96 Stenella frontalis Macho Juvenil Muerto Cet 23 301/96 Delphinus delphis Hembra Adulto Muerto Cet 27 340/96 Stenella frontalis Hembra ND Muerto Cet 28 341/96 Delphinus delphis Hembra ND Muerto Cet 29 342/96 Delphinus delphis ND ND Muerto Cet 30 343/96 Stenella frontalis Hembra ND Muerto Cet 31 344/96 Stenella coeruleoalba Macho Adulto Muerto Cet 32 369/96 Stenella frontalis Macho Adulto Muerto Cet 34 508/96 Globicephala macrorhynchus Macho Juvenil Vivo Material y Métodos 62 Tabla 6.1.1. Listado de animales sometidos a los diferentes análisis en el presente trabajo (Continuación). Código Ref. AP Num/año Especie Sexo Edad Estado varamiento Cet 238 i037/04 Stenella frontalis Macho Juvenil Muerto Cet 243 i092/04 Mesoplodon densirostris Macho Adulto Vivo Cet 245 i094/04 Stenella coeruleoalba Macho Juvenil Muerto Cet 246 i113/04 Stenella frontalis Hembra Juvenil Muerto Cet 248 i111/04 Stenella coeruleoalba Macho Adulto Muerto Cet 251 i114/04 Delphinus delphis Macho Adulto Muerto Cet 259 i127/04 Mesoplodon europaeus Hembra Juvenil Muerto Cet 260 i130/04 Stenella coeruleoalba Hembra Juvenil Vivo Cet 261 i132/04 Stenella frontalis Hembra Adulto Vivo Cet 267 i144/04 Stenella coeruleoalba Macho Adulto Vivo Cet 269 i145/04 Steno bredanensis Macho Juvenil Vivo Cet 270 i149/04 Stenella longirostris Macho Juvenil Muerto Cet 271 i150/04 Stenella longirostris Macho Juvenil Muerto Cet 272 i151/04 Stenella longirostris Macho Adulto Vivo Material y Métodos 63 Tabla 6.1.1. Listado de animales sometidos a los diferentes análisis en el presente trabajo (Continuación). Código Ref. AP Num/año Especie Sexo Edad Estado varamiento Cet 274 i154/04 Stenella coeruleoalba Macho Juvenil Muerto Cet 281 i023/05 Stenella coeruleoalba Hembra Adulto Muerto Cet 288 i032/05 Stenella coeruleoalba Hembra Adulto Muerto Cet 293 i097/05 Stenella frontalis Macho Adulto Muerto Cet 296 i105/05 Tursiops truncatus Macho Subadulto Vivo Cet 299 i151/05 Stenella coeruleoalba Hembra Subadulto Muerto Cet 305 i225/05 Tursiops truncatus Hembra Subadulto Vivo Cet 307 i263/05 Stenella frontalis Macho Adulto Vivo Cet 308 i265/05 Stenella coeruleoalba Hembra Juvenil Vivo Cet 309 i266/05 Mesoplodon densirostris Hembra Cría Vivo Cet 317 i129/06 Stenella frontalis Macho Adulto Muerto Cet 320 i131/06 Stenella frontalis Macho Adulto Muerto Cet 324 i058/06 Stenella coeruleoalba Macho Subadulto Muerto Cet 327 i153/06 Delphinus delphis Hembra Adulto Muerto Material y Métodos 64 Tabla 6.1.1. Listado de animales sometidos a los diferentes análisis en el presente trabajo (Continuación). Código Ref. AP Num/año Especie Sexo Edad Estado varamiento Cet 333 i132/06 Mesoplodon europaeus Hembra Subadulto Vivo Cet 334 i133/06 Mesoplodon europaeus Hembra Subadulto Vivo Cet 339 i145/06 Globicephala macrorhynchus Hembra Adulto Vivo Cet 345 i164/06;i168/06 Globicephala macrorhynchus Hembra Juvenil Muerto Cet 352 i191/06 Ziphius cavirostris ND Juvenil Muerto Cet 357 i230/06 Kogia breviceps Hembra Adulto Muerto Cet 358 i231/06 Phocoena phocoena Macho Cría Muerto Cet 360 i262/06 Globicephala macrorhynchus Macho Cría Vivo Cet 362 i370/06 Stenella frontalis Hembra Adulto Vivo Cet 363 i086/07 Stenella frontalis Hembra Subadulto Muerto Cet 364 i022/07 Delphinus delphis Macho Subadulto Muerto Cet 366 i072/07 Stenella coeruleoalba Macho Cría Muerto Cet 368 i051/07 Stenella frontalis Macho Juvenil Muerto Cet 370 i052/07 Stenella coeruleoalba Macho Adulto Vivo Material y Métodos 65 Tabla 6.1.1. Listado de animales sometidos a los diferentes análisis en el presente trabajo (Continuación). Código Ref. AP Num/año Especie Sexo Edad Estado varamiento Cet 371 i056/07 Stenella frontalis Hembra Adulto Muerto Cet 373 i071/07 Delphinus delphis Hembra Adulto Vivo Cet 374 i080/07 Stenella coeruleoalba Macho Adulto Muerto Cet 375 i097/07 Stenella coeruleoalba Macho Neonato Muerto Cet 376 i089/07 Stenella coeruleoalba Hembra Adulto Muerto Cet 380 i091/07 Stenella coeruleoalba Macho Subadulto Muerto Cet 381 i160/07 Stenella coeruleoalba Macho Subadulto Muerto Cet 382 i098/07 Delphinus delphis Macho Adulto Muerto Cet 393 i234/07 Stenella frontalis Hembra Adulto Muerto Cet 395 i283/07 Stenella frontalis Macho Adulto Muerto Cet 400 i318/07 Stenella coeruleoalba Macho Adulto Muerto Cet 404 i373/07 Kogia breviceps Macho Adulto Vivo Cet 405 i406/07 Globicephala macrorhynchus Hembra Neonato Vivo Cet 406 i103/08 Delphinus delphis Macho Cría Muerto Material y Métodos 66 Tabla 6.1.1. Listado de animales sometidos a los diferentes análisis en el presente trabajo (Continuación). Código Ref. AP Num/año Especie Sexo Edad Estado varamiento Cet 407 i088/08 Tursiops truncatus Hembra Adulto Muerto Cet 409 i137/08 Stenella coeruleoalba Macho Juvenil Muerto Cet 411 i104/08 Delphinus delphis Macho Cría Muerto Cet 412 i095/08 Stenella coeruleoalba Macho Cría Vivo Cet 413 i102/08 Pseudorca crassidens Macho Juvenil Vivo Cet 418 i127/08 Stenella frontalis Hembra Adulto Muerto Cet 421 i134/08 Stenella frontalis Macho Cría Muerto Cet 429 i223/08 Stenella coeruleoalba Hembra Juvenil Muerto Cet 431 i149/08 Grampus griseus Macho Juvenil Vivo Cet 443 i232/08 Stenella frontalis Hembra Cría Muerto Cet 450 i208/08 Tursiops truncatus Hembra Subadulto Muerto Cet 456 i237/08 Grampus griseus Hembra Adulto Vivo Cet 459 i238/08 Kogia breviceps Macho Adulto Muerto Cet 463 i256/08 Physeter macrocephalus Hembra Neonato Vivo Material y Métodos 67 El segundo grupo de muestras fueran cedidas generosamente por el Dr. Paul Jepson del Marine Mammal Strandings Research, de la Sociedad Zoológica de Londres, del Reino Unido. Estas consistieron en muestras procedentes de 40 hígados de marsopas (Phocoena phocoena) varadas en las costas del Reino Unido. De este grupo, 29 marsopas murieron atrapadas en redes de pesca (“Bycatch”) y 11 fallecieron por otras causas no relacionadas con la interacción con pesca. También se valoraron 7 cetáceos (no marsopas) de otras especies, atrapados en redes: 5 delfines comunes (Delphinus delphis), 1 delfín listado (Stenella coeruleoalba) y 1 delfín de hocico blanco (Lagenorhynchus albirostris) (Tabla 6.1.2). Todas las muestras se fijaron en formaldehído tamponado al 4% hasta su procesamiento e inclusión en parafina. Tabla 6.1.2. Listado de cetáceos varados en las costas de Reino Unido y que fueran objeto del presente estudio. Nº Inves. Especie Edad Causa de muerte i412/05 Phocoena phocoena Adulto “Bycatch” i413/05 Phocoena phocoena Adulto “Bycatch” i414/05 Phocoena phocoena Adulto “Bycatch” i415/05 Phocoena phocoena Adulto “Bycatch” i416/05 Phocoena phocoena Juvenil “Bycatch” i417/05 Phocoena phocoena Adulto “Bycatch” i418/05 Phocoena phocoena Juvenil “Bycatch” i419/05 Phocoena phocoena Adulto “Bycatch” i420/05 Phocoena phocoena Juvenil “Bycatch” i421/05 Phocoena phocoena Adulto “Bycatch” i422/05 Phocoena phocoena Adulto “Bycatch” i423/05 Phocoena phocoena Neonato “Bycatch” i424/05 Phocoena phocoena Adulto “Bycatch” i425/05 Phocoena phocoena Adulto “Bycatch” i427/05 Phocoena phocoena Adulto “Bycatch” i428/05 Phocoena phocoena Juvenil “Bycatch” i429/05 Phocoena phocoena Juvenil “Bycatch” i430/05 Phocoena phocoena Adulto “Bycatch” i431/05 Phocoena phocoena Adulto “Bycatch” i432/05 Phocoena phocoena Adulto “Bycatch” i433/05 Phocoena phocoena Juvenil “Bycatch” i434/05 Phocoena phocoena Juvenil “Bycatch” i435/05 Phocoena phocoena Adulto “Bycatch” i436/05 Phocoena phocoena Adulto “Bycatch” Material y Métodos 68 Tabla 6.1.2. Listado de cetáceos varados en las costas de Reino Unido y que fueran objeto del presente estudio (Continuación). Nº Inves. Especie Edad Causa de muerte i437/05 Phocoena phocoena Juvenil “Bycatch” i438/05 Phocoena phocoena Adulto “Bycatch” i439/05 Phocoena phocoena Adulto “Bycatch” i326/06 Phocoena phocoena Adulto “Bycatch” i334/06 Phocoena phocoena Adulto “Bycatch” i282/06 Lagenorhynchus albirostris Juvenil “Bycatch” i284/06 Delphinus delphis Juvenil “Bycatch” i292/06 Stenella coeruleoalba ND “Bycatch” i299/06 Delphinus delphis Juvenil “Bycatch” i300/06 Delphinus delphis Adulto “Bycatch” i301/06 Delphinus delphis Adulto “Bycatch” i303/06 Delphinus delphis Adulto “Bycatch” i272/06 Phocoena phocoena Juvenil (Meningo) encefalitis i279/06 Phocoena phocoena Juvenil Trauma Físico i290/06 Phocoena phocoena Juvenil Trauma Físico i291/06 Phocoena phocoena Adulto Disocia i298/06 Phocoena phocoena Adulto Neumonía i302/06 Phocoena phocoena Juvenil Varamiento Vivo i322/06 Phocoena phocoena Juvenil Infección Bacteriana Generalizada i327/06 Phocoena phocoena Adulto Infección Bacteriana Generalizada i330/06 Phocoena phocoena Adulto Neumonía, Parasitaria i332/06 Phocoena phocoena Juvenil Neumonía, Parasitaria i333/06 Phocoena phocoena Neonato Infección Bacteriana Generalizada 6.2 Métodos 6.2.1 Técnica de necropsia A los animales varados, cuyas condiciones de conservación y circunstancias logísticas lo permitieron, se les realizó una necropsia completa o parcial. El protocolo básico para el desarrollo de la necropsia en cetáceos fue el estandarizado y publicado por la Sociedad Europea de Cetáceos por Thijs Kuiken y Manuel García Hartmann (Proceedings of the first ECS workshop on Cetacean Material y Métodos 69 Pathology: Dissection Techniques and Tissue Sampling. Leiden, Netherlands, 13-14 September 1991. Newsletter Nº17-Special Issue). Este protocolo se ha innovado, utilizando procedimientos referenciados en el manual publicado por Geraci y Lounsbury en 2006, añadiendo algunas modificaciones propias de los protocolos utilizados para la necropsia de mamíferos terrestres domésticos del libro de Necropsia de los animales domésticos del Profesor King y colaboradores (Necropsy Book, Veterinary School, Cornell University, New York, EEUU. 1989). Igualmente, y a medida que la experiencia adquirida y el hallazgo de nuevas patologías no descritas anteriormente lo requirieron, se introdujeron las modificaciones o prioridades pertinentes atendiendo a las sospechas de una patología o según la especie. Antes del inicio de una necropsia los animales son identificados, se toman los datos de la especie, sexo y son fotografiados externamente, poniendo especial interés en las posibles lesiones. Se toman las medidas básicas (al menos, longitud y perímetro mayor), se cuenta el número de dientes y se pesan los animales, en aquellos casos en lo que es posible. Todos estos datos constituyen los denominados datos biológicos indicados en el protocolo (Fernández y cols., 2008; Arbelo, 2007). El informe de necropsia debe indicar datos generales de la historia del animal y su varamiento. Estos incluyen localización, fecha y hora del varamiento, número de animales varados, comportamiento de los animales antes de varar, tiempo que transcurrió desde el varamiento hasta la muerte, si la muerte ocurrió de forma natural o por eutanasia, condiciones climáticas, como tormentas previas al varamiento, traumas pre o post mortem y la existencia de cuerdas o cuerpos extraños relacionados con interacción humana, etc. (Fernández y cols., 2008; Arbelo, 2007). La necropsia puede realizarse en diferentes ubicaciones por cuestiones logísticas. Aquellas condicionan, obviamente, el nivel de cumplimiento del protocolo Material y Métodos 70 estandarizado para una adecuada realización de una necropsia con finalidad diagnóstica (Arbelo, 2007). Sistemáticamente, se toman muestras tisulares, de aproximadamente 2-3 cm3, de piel y grasa subcutánea, músculo esquelético, tiroides, tráquea, pulmón, corazón y grandes vasos, diafragma, esófago, compartimentos estomacales, intestino, páncreas, hígado, riñón, glándulas adrenales, bazo, nódulos linfoides, timo, vejiga urinaria, testículo/ovarios, útero, glándula mamaria, cerebro, cerebelo, tronco del encéfalo, médula espinal, hipófisis, mucosa de senos paraóticos y sacos aéreos, grasa acústica del melón y mandibular y los complejos timpano-perióticos (enteros) que son conservadas en formaldehido tamponado al 4% para posterior estudio histopatológico. Las muestras son tomadas tanto, de los órganos aparentemente sanos como de aquellos que puedan estar lesionado (Fernández y cols., 2008; Arbelo, 2007). Igualmente, se toman muestras, por duplicado, de piel, músculo, pulmón, hígado, riñón, bazo, nódulos linfoides y sistema nervioso central (SNC) que se conservan por congelación a -80ºC para la realización de estudios virológicos y/o bacteriológicos, así como hisopos de mucosas y muestras de fluidos en las cavidades corporales, orina, sangre, humor vítreo u otros necesarios para la realización de un diagnóstico de la causa de varamiento y/o muerte del cetáceo sometido a este estudio (Fernández y cols., 2008; Arbelo, 2007). Para el análisis de contaminantes químicos se toman muestras rutinarias, por duplicado, de al menos piel y grasa hipodérmica, músculo, pulmón, hígado, riñón, glándula mamaria y cerebro que son envueltas en papel de aluminio y/o en bolsas de plástico para posteriormente almacenarlas a -20 ºC o -80ºC (Fernández y cols., 2008; Arbelo, 2007). Material y Métodos 71 Los parásitos observados durante la necropsia que se encuentren en buen estado de conservación o sea necesaria la identificación de la especie se almacenan en botes con alcohol al 70%. (Fernández y cols., 2008). El estado de conservación del cadáver se determina siguiendo los parámetros y la clasificación establecida en el protocolo de la necropsia de cetáceos de la Sociedad Europea de Cetáceos (Kuiken T. & García Hartmann, 1991), la cual es la siguiente: - grado 1: muy fresco (minutos después de la muerte). - grado 2: fresco (inicio de la pérdida de la epidermis). - grado 3: autolisis moderada (cambios de coloración de los órganos pero se mantiene su consistencia; en machos el pene puede estar visible). - grado 4: autolisis avanzada (perdida de consistencia de los órganos). - grado 5: autolisis muy avanzada (imposible la identificación correcta de la especie y la visualización de órganos). El estado nutricional de los animales se establece morfológicamente atendiendo a parámetros anatómicos, como la presencia de determinados relieves óseos, la masa muscular dorso-axial y el perímetro circular torácico relacionado con la especie, tamaño y edad del animal. Igualmente, también se tiene en cuenta la cantidad de de grasa corporal altamente metabolizable. En relación al establecimiento de la edad, en nuestros casos la misma se ha determinado morfológica y morfométricamente, atendiendo a la especie en cuestión y, adicionalmente, se emplea el estudio histológico para comprobar su estado madurez reproductora. Material y Métodos 78 6.2.4 Microscopía Electrónica La preparación, observación y fotografiado de las muestras mediante microscopía electrónica (ME) se realizó en el Servicio de Microscopia Electrónica de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. Los cetáceos seleccionados para el estudio de ultraestructural se presentan en la tabla 6.2.1. CODIGO CODIGO MUESTRAS ESPECIE ESTADO H&E A1AT FB CET 16 156/96 Delphinus delphis Vivo + + + CET 21 283/96 Stenella frontalis Vivo + + + CET 47 467/97 Tursiops truncatus Muerto + + + CET 88 530/99 Stenella frontalis Vivo + + + CET 110 339/00 Delphinus delphis Vivo + + + CET 132 i241/01 Stenella frontalis Vivo + + + CET 195 i154/02 Stenella coeruleoalba Vivo + - + I300/06 Delphinus delphis “Bycaght” + - + i326/06 Phocoena phocoena “Bycaght” + - + i334/06 Phocoena phocoena “Bycaght” + - + Tabla 6.2.1. Cetáceos seleccionados para el estudio ultraestructural (Microscopia Electrónica). Las muestras de hígado, fijadas en formaldehído al 4%, se lavaron en agua corriente para su posterior refijación con glutaraldehído e inclusión en resina: Reactivo Tiempo Glutaraldehido (1%-3%) hasta 8 hrs Tampón fosfato I 5 min Tampón fosfato II 5 min Tampón fosfato III 5 min Tetróxido de Osmio (1%-2%) 4 hrs en nevera. Agua destilada I 5 min Agua destilada II 5 min Material y Métodos 79 Agua destilada III 5 min Acetato de Uranilo sol. Acuosa (1%-2%) “over night” en nevera. Etanol 20% I 5 min Etanol 20% II 5 min Etanol 20% III 5 min Etanol 40% I 5 min Etanol 40% II 5 min Etanol 40% III 5 min Etanol 60% I 5 min Etanol 60% II 5 min Etanol 60% III 5 min Etanol 70% I 5 min Etanol 70% II 5 min Etanol 70% III 5 min Etanol 96% I 10 min Etanol 96% II 10 min Etanol 96% III 10 min Etanol 100% I 10 min Etanol 100% II 10 min Etanol 100% III 10 min Óxido de Propileno-Etanol 100% I 10 min Óxido de Propileno-Etanol 100% II 10 min Óxido de Propileno-Etanol 100% III 10 min Óxido de Propileno I 10 min Óxido de Propileno II 10 min Óxido de Propileno III 10 min Óxido de Propileno – EMbed 812 3 hrs EMbed 812 4hrs – 8hrs. Moldes en Estufa 70ºC 48 hrs De los bloques se realizaran cortes semifinos que se tiñeron con Azul de Toluidina (AT) para su observación al microscopio óptico, lo que facilita la selección de Material y Métodos 80 la zona de mayor interés, para su posterior estudio ultraestructural. Una vez realizados los cortes ultrafinos se contrastaron con una solución de Acetato de Uranilo y Plomo. 6.2.5 Observación y fotografiado de las muestras con Microscopía Optica y Electrónica Los cortes teñidos con las técnicas histoquímicas e inmunohistoquímicas se analizaron microscópicamente utilizando un Microscopio Óptico Olympus y se realizaron las correspondientes fotografías con una cámara digital. Los cortes ultrafinos se observaron con un Microscopio Electrónico de Transmisión Zeiss EM 910, equipado con una cámara digital Proscan Slow-scan CCDCamara for TEM, con la que se realizaron las microfotografias. 6.3 Procedimiento para el desarrollo del presente trabajo En el presente estudio se desarrollaron varias fases preliminares para la selección del material de estudio:  La primera fase de este trabajo consistió en la observación microscópica rutinaria de 283 muestras de hígado teñidas con H&E. En esta fase se valoró el estado de conservación de los tejidos y la presencia de cambios morfológicos hepáticos.  En una segunda fase se seleccionaron muestras atendiendo a su estado de conservación “muy fresco” y “fresco”, sin congelación previa. Los resultados Material y Métodos 81 preliminares de esta fase demostraron la inviabilidad de los tejidos previamente congelados o con un estado de conservación moderado o de avanzada autolisis, al observarse falsos negativos al utilizar las técnicas inmunohistoquímicas. Estas dos fases preliminares permitieron seleccionar 115 cetáceos, excluyéndose 168. En el esquema 1, presentamos la selección de muestras y el número total de animales valorados en cada fase. Esquema 1. Numero total de muestras 283 (cetáceos) N º de muestras para l a realización de técnicas de PAS-d e inmunohistoquímica: 115 N º de muestras valoradas únicamente morfológicamente atendiendo a la p resencia de glóbulos hialinos: 67 N º de muestras en las que no ha sido posible la valoración morfológica: 101 Material y Métodos 82 Para el estudio ultraestructural (ME) las muestras se seleccionaron en base a su estado de conservación y los resultados previos obtenidos mediante técnicas histoquímicas e inmunohistoquímicas. 6.4 Técnicas Complementárias (Glicobiología y Proteómica) Con la finalidad de realizar una valoración de la especificidad de los anticuerpos empleados con las técnicas inmunohistoquímicas, mejorar la caracterización de los glóbulos hialinos, así como hacer una aproximación a la naturaleza de los “pink point”, se recurrió a la glicobiología y proteómica, técnicas de electroforesis en gel de poloacrilamida con tinción de Comassi, Western Blot y espectrometría de masa. Estos estudios se realizaron en el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la ULPGC y en el Instituto de Patología e Inmunología Molecular de la Universidade do Porto (IPATIMUP). Para seleccionar las muestras que se sometieron a análisis complementarios, se consideraron casos con una historia clínico-patológica de estrés, varamiento activo, enfermedad crónica, enfermedad aguda y/o relacionadas con actividades antropogénicas (como p. e., interacción con pesca). Las técnicas histoquímicas de PAS-d, reticulina, Halls, Chromotrope aniline blue trichrome (CAB) y Perls se realizaron en el servicio de Anatomía Patológica del Hospital de São João do Porto, de Portugal. Material y Métodos 83 6.4.1 Glicobiología La técnica de identificación de carbohidratos se inició utilizando cortes de 3m en parafina, que se desparafinaron e hidrataron previamente. En este apartado se utilizaron seis anticuerpos monoclonales (Vector Laboratories) (Tabla 6.4.1). Las muestras se incubaron en albúmina sérica de bovino (BSA) al 10% durante 30 minutos, a lo que siguió la incubación con los respectivos anticuerpos primarios durante 1 hora a temperatura ambiente. Los cortes se lavaron 3 veces, 5 minutos en PBS y se incubaron durante 45 min en Strept ABC Complex (Vector Laboratories). Tras hacer 2 lavados de 5 minutos en PBS se reveló con 3,3'- Diaminobenzidine (DAB) (Sigma). Tabla 6.4.1 Anticuerpos utilizados para detección de lectinas y sus respectivos puntos de reconocimiento en carbohidratos (Gabius y cols., 2004; Pinho y cols., 2009 a y b). Lectina Puntos de reconocimiento Sambucus nigra lectin (SNA) NeuAcα2,6Galo NeuAcα2,6GalNAcPhaseolus vulgaris Erythroagglutinin (PHA-E) Bisecting GlcNAc Wheat Germ Agglutinin (WGA) N-acetyllucosamine (GlcNAc) y acido sialico. Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin (PHA-L), Galβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,4GlcNAcβ1,2)ManαDatura stramonium lectin (DSL) (α-1,4) linked N-acetylglucosamine(GlcNAc) Galanthus nivalis agglutinin (GNA) Manα1,2ManManα1,6ManManα1,3Man- Material y Métodos 84 6.4.2 Proteómica Las muestras de hígado se prepararon para la extracción de proteínas. Esto se llevó a cabo homogenizando muestras de hígados congeladas, para evitar la acción de las proteasas. Para ello se empleó una solución tapón de Hepes sucrosa (985 µl), PMSF (10 µl) y DTT (5 µl) a baja temperatura, lo que permitió la lisis de las células sin desnaturalización proteica. Posteriormente, se centrifugó a 7000 rpm a 4ºC durante 10 min, para recuperar el sobrenadante. A continuación se cuantificaron las proteínas en un lector de placas de ELISA utilizando el método de Bradford mediante una absorbancia de 595 nm. Para la realización de la electroforesis se preparan 3 geles de poliacrilamida al 10% para la separación de las moléculas por su punto isoeléctrico. Dos se utilizaron para la realización de la técnica de Wester Blot, mientras que otro se tiñó con Azul de Comassi para los estudios de espectrometría de masa. 6.4.2.1 Western Blot Una vez realizada la electroforesis, los geles destinados a la técnica de Wester Blot se colocaron en agitación, en nevera durante una noche, a 20 voltios y 90 amperios, para su transferencia. Al día siguiente, se retiró la membrana con las proteínas y se tiñeron con Rojo Ponceau con la finalidad de detectar las bandas y seleccionar los pesos moleculares de interés. Después de los lavados en agua destilada y en TBST, se bloqueó con leche al 10% durante 1 hora, y se procedió a la incubación de los anticuerpos primarios (FB y Material y Métodos 85 A1AT) durante toda una noche. Al día siguiente, se lavaron las membranas con TBST y se bloqueó con leche al 0,5% durante 20 min. Seguidamente, se incubó con el anticuerpo secundario (anti-conejo a 1:3000) durante 1 hora. Se procedió al revelado, lavando las membranas en TBST y se añadió Supersignal, en agitación y oscuridad 5 min. y se procedió al revelado. 6.4.2.2 Espectrometría de Masas Para realizar el análisis espectrométrico de masa se recortaron las bandas de mayor interés del gel de poliacrilamida una vez teñido con Azul de Coomasie (Cooper, 1984). La selección se fundamentó en localizar las bandas con mayor cantidad de proteínas y aquellas bandas, que no aparecían de forma constante en todas las muestras. Tabla 6.4.2. Cetáceos utilizados para el estudio de proteómica. Orden del gel CODIGO MUESTRAS ESPECIE ESTADO A1AT FB Diagnóstico 1 i144/04 Stenella coeruleoalba Vivo + + Sinusitis parasitaria por Nasitrema 2 i262/06 Globicephala macrorhynchus Vivo + + Meningitis infecciosa. 3 i260/01 Stenella coeruleoalba Muerto + + Septicemia. 4 i101/05 Tursiops truncatus Vivo + + Encefalitis infecciosa. 5 i149/08 Grampus griseus Vivo - + Infección vírica. - i256/08 Physeter macrocephalus Vivo - 0 Separación maternal. Las muestras de gel se sometieron al siguiente procedimiento (protocolo utilizado en el departamento de proteómica del IPATIMUP): Se rompió el gel con 100 µl de la solución 1 y se agitan durante 15 min. Se elimina el sobrenadante y se repite 2 veces la operación con la solución 2. Se retira el Material y Métodos 86 sobrenadante, y se añaden 100 µl de solución 3. Se utiliza el SpeedVac durante 20 minutos para secar las muestras.  Solución 1: 50 mM bicarbonato de amonio + 5% acetonitrilo.  Solución 2: 50 mM bicarbonato de amonio + 50% acetonitrilo.  Solución 3: 100% acetonitrilo. A continuación se procedió a la digestión: Se añadió a cada muestra, 10 ng/µl de tripsina con un volumen ajustado a la cantidad de muestra (5 a 20 µl por muestra). Se añadió 50 µl de bicarbonato de amonio al 20 Mm y se incubó durante toda la noche a 37ºC. Extracción de péptidos y cristalización: Las muestras se centrifugan ligeramente y el sobrenadante se recogió en otro tubo. Se añadió 60 µl de solución 4 al tubo inicial con el gel. Se agitó durante 30 minutos, a temperatura ambiente y se repitió el procedimiento 2 veces. El sobrenadante que se recogió y se secó durante 2 horas en el Speedvac. Una vez secadas las muestras se procedió al lavado con 4 a 10 µl de TFA 0,1% y se realizaron aspirados con una punta de pipeta Ziptop c18, que aspiró previamente acetonitrilo al 100% y TFA 0,1%. Después de aspirar cuidadosamente entre 5 a 7 veces, la muestra con la puntera, se aspiró 1,2 µl de la solución 5 y se aplicó en la placa para su cristalización y análisis mediante espectrometría de masa. Para esta fase se utilizó:  Solución 4: 60% acetonitrilo + 0,1% ácido trifluoroacético (TFA) Material y Métodos 87  Solución 5: acido cianohidroxicinámico al 5mg/ml en solución de 50% acetonitrilo + 0,1% (TFA) Los resultados obtenidos mediante espectrometría de masas por MALDI-TOF fueron introducidos en dos bases de datos (SwissProt y nrNCBI) para identificación de péptidos y correspondientes proteínas utilizando, la selección taxonómica (Other mammals). Resultados 96 Informe de Necropsia Especie: Physeter macrocephalus - Cachalote Estado nutricional: ND Sexo (M/H): M Edad: Cría Varamiento: ND Gestante (S/N): Conservación: 2 Lugar Varamiento: ND Longitud (cm): ND Estado (V/M): M Fecha Muerte: ND Perímetro (cm): ND Peso (kg): ND Fecha Necropsia:15-12-1993 Observaciones: Hijo de la hembra 309/93. Diagnóstico morfológico: Pulmones: edema y congestión. Aparato digestivo: enteritis linfoplasmocitária con hiperplasia del GALT. Diagnóstico etiológico: Edema y congestión pulmonar Entidad patológica: Patología neonatal/perinatal Análisis histológico del hígado: Histoquímica: el hígado presenta congestión hepática aguda moderada; en el interior de algunos hepatocitos se observan glóbulos hialinos eosinofílicos de pequeño tamaño (semejantes a los núcleos de los hepatocitos) con presencia de “pink point” en su interior. Necrosis de algunos hepatocitos aislados con citoplasma claro. Presencia de escasos neutrófilos en los sinusoides hepáticos. Presencia de glóbulos de pequeñas dimensiones resistentes a PAS-d. Inmunohistoquímica: presencia de glóbulos positivos a FB y en menor número a la A1AT. CET 4 310/93 Resultados 97 Informe de Necropsia Especie: Grampus griséus - Calderón gris Estado nutricional: ND Sexo (M/H): ND Edad: ND Varamiento: ND Gestante (S/N): Conservación: 2 Lugar Varamiento: ND Longitud (cm): ND Estado (V/M): M Fecha Muerte: ND Perímetro (cm): ND Peso (kg): ND Fecha Necropsia:11-01-1994 Diagnóstico morfológico: Congestión pulmonar y renal. Diagnóstico etiológico: Congestión generalizada Entidad patológica: No determinada Análisis histológico del hígado: Histoquímica: congestión hepática aguda predominantemente centrolobulillar; presencia de glóbulos hialinos intracitoplasmáticos en hepatocitos. Algunos glóbulos con contenido granular, mientras otros presentan contenido más homogéneo y diferente tamaño. Presencia de “pink point”. Inmunohistoquímica: presencia de escasos glóbulos positivos a FB. CET 5 09/94 Resultados 98 Informe de Necropsia Especie: Lagenodelphis hosei - Delfin de Fraser Estado nutricional: ND Sexo (M/H): ND Edad: ND Varamiento: ND Gestante (S/N): Conservación: 2 Lugar Varamiento: ND Longitud (cm): ND Estado (V/M): M Fecha Muerte: ND Perímetro (cm): ND Peso (kg): ND Fecha Necropsia:11-01-1994 Diagnóstico morfológico: Congestión aguda generalizada. Calcificación de la mucosa de los bronquios. Bronconeumonía focal mononuclear. Enteritis parasitaria. Tubulonefrosis Diagnóstico etiológico: Tubulonefrosis Entidad patológica: No determinado Análisis histológico del hígado: Histoquímica: congestión hepática aguada moderada generalizada; ligera hepatitis periportal purulenta con presencia de algunos focos de necrosis. Presencia de gran numero de glóbulos hialinos intracitoplasmáticos de diferente tamaña en hepatocitos. La mayoría presenta contenido fibrilar y algunos con contenido homogéneo. Presencia de “pink point”. Escasos glóbulos resistentes a la técnica de PAS-d. Inmunohistoquímica: presencia de glóbulos positivos a FB, pero con distinta intensidad. CET 6 10/94 Resultados 99 Informe de Necropsia Especie: Delphinus delphis - Delfín común Estado nutricional: ND Sexo (M/H): ND Edad: Adulto-viejo Varamiento: ND Gestante (S/N): Conservación: 2 Lugar Varamiento: ND Longitud (cm): ND Estado (V/M): M Fecha Muerte: ND Perímetro (cm): ND Peso (kg): ND Fecha Necropsia:01-06-1994 Diagnóstico morfológico: Edema pulmonar y neumonía intersticial linfo-plasmocitaria moderada. Abundantes placas hemosideroticas en bazo. Hematopoyesis en bazo. En cerebelo presencia de manguitos perivasculates mononucleares. Satelitosis marcada en cerebro; meningoencefalitis no purulenta. Diagnóstico etiológico: Patología senil Meningoencefalitis no purulenta Entidad patológica: Patología consuntiva de origen natural Análisis histológico del hígado: Histoquímica: Hepatitis periportal linfoplasmocitária moderada y presencia del mismo tipo celular en los sinusoides hepáticos. Colestasis. Presencia de numerosas células en necrosis. CET 8 192/94 Resultados 100 Informe de Necropsia Especie: Delphinus delphis - Delfín común Estado nutricional: ND Sexo (M/H): M Edad: Adulto-viejo Varamiento: ND Gestante (S/N): Conservación: 2 Lugar Varamiento: ND Longitud (cm): ND Estado (V/M): M Fecha Muerte: ND Perímetro (cm): ND Peso (kg): ND Fecha Necropsia:10-03-1995 Diagnóstico morfológico: Neumonía granulomatosa parasitaria subaguda. Hiperplasia reactiva ganglionar. Placas hemosideroticas en bazo. Gastro-enteritis linfoplasmocitaria. Diagnóstico etiológico: Patología senil Entidad patológica: Patología consuntiva de origen natural Análisis histológico del hígado: Histoquímica: congestión hepática aguda moderada, predominantemente centrolobulillar; estiatosis multifocal macrovesicular y microvesicular difusa, asociada a hepatitis y necrosis de hepatocitos. Hepatocitos balonizados con estructuras eosinofílicas, “councilman body like” con predominio centrolobulillar. Colestasis. Presencia de glóbulos hialinos intracitoplasmáticos en hepatocitos. Algunos glóbulos de contenido granular mientras otros, presentan contenido más homogéneo y diferentes tamaños. Presencia de “pink point”. Pequeño numero de glóbulos de pequeñas dimensiones resistentes a PAS-d. Inmunohistoquímica: Escasos glóbulos positivos a FB. CET 9 089/95 Resultados 101 Informe de Necropsia Especie: Ziphius carivostris - Zifio de cuvier Estado nutricional: ND Sexo (M/H): H Edad: Adulto Varamiento: ND Gestante (S/N): N Conservación: 1 Lugar Varamiento: Gran Canaria Longitud (cm): ND Estado (V/M): V Fecha Muerte: 21-06-1995 Perímetro (cm): ND Peso (kg): 1600 Fecha Necropsia:22-06-1995 Observaciones: Presentaba marcas de redes y fractura de la mandíbula compatible con interacción con pesca. Diagnóstico morfológico: Neumonía intersticial mononuclear y eosinofílica; presencia de sincisios. Ligera satelitosis y neurofagia en SNC. Diagnóstico etiológico: Interacción con pesca Entidad patológica: Patología no consuntiva de origen antropogénica. Análisis histológico del hígado: Histoquímica: Congestión hepática moderada, centrolobulillar. Presencia de macrófagos con hemosiderina en las áreas mas congestivas. Presencia de glóbulos hialinos de distinto tamaño, contenido bien granular u homogéneo. Se observan “pink point”. Con la técnica de PAS-d se observan escasos glóbulos con intensa reacción positiva. Inmunohistoquímica: Se observan algunos glóbulos positivos a FB en las áreas más congestivas. También se observan glóbulos positivos a A1AT. CET 12 206/95 Resultados 102 Informe de Necropsia Especie: Stenela frontales - Delfín moteado Estado nutricional: ND Sexo (M/H): M Edad: Adulto Varamiento: ND Gestante (S/N): N Conservación: 2 Lugar Varamiento: ND Longitud (cm): ND Estado (V/M): M Fecha Muerte: ND Perímetro (cm): ND Peso (kg): ND Fecha Necropsia:10-11-1995 Diagnóstico morfológico: Glomerulonefritis membranofroliferativa. Nefritis intersticial mononuclear. Presencia de pequeños quistes renales. Bronconeumonia purulenta secundaria. Células sinciciales. Enteritis catarral. Satelitosis neuronal. Diagnóstico etiológico: No determinado Entidad patológica: Patología de origen natural Análisis histológico del hígado: Histoquímica: ligera congestión centrolobulillar; ligero infiltrado inflamatorio peri-portal y en sinusoides hepáticos con algunas células en apoptosis. Presencia de estatosis microvesicular difusa. Presencia de escasos glóbulos hialinos intracitoplasmáticos. Inmunohistoquímica: glóbulos hialinos positivos a FB. CET 13 275/95 Resultados 103 Informe de Necropsia Especie: Stenella coeruleoalba - Delfín listado Estado nutricional: ND Sexo (M/H): H Edad: Adulto Varamiento: ND Gestante (S/N): N Conservación: 2 Lugar Varamiento: ND Longitud (cm): ND Estado (V/M): M Fecha Muerte: ND Perímetro (cm): ND Peso (kg): ND Fecha Necropsia:13-01-1996 Diagnóstico morfológico: En riñón se observa congestión aguda y nefrosis tubular moderada. En SNC se observa satelitósis y neurofágia; leucocitosis severa en los vasos sanguíneos de las meninges (neutrofilos y eosinófilos). Diagnóstico etiológico: Nefrosis tubular Entidad patológica: No determinado Análisis histológico del hígado: Histoquímica: ligera congestión hepática; presencia de hepatitis periportal y leucocitosis arterial en espacio porta; infiltrado mixto en sinusoides hepáticos. Ausencia de glóbulos hialinos. CET 14 018/96 Resultados 104 Informe de Necropsia Especie: Delphinus delphis - Delfín común Estado nutricional: ND Sexo (M/H): H Edad: ND Varamiento: ND Gestante (S/N): N Conservación: 1 Lugar Varamiento: Playa del hombre, GC Longitud (cm): ND Estado (V/M): V Fecha Muerte: 06-03-1996 Perímetro (cm): ND Peso (kg): ND Fecha Necropsia:07-03-1996 Observaciones: Presentaba heridas de las rocas; murió a las 4 horas de varar. Diagnóstico morfológico: Congestión pulmonar severa; áreas alternadas de enfisema pulmonar con áreas de atalectasia; neumonía intersticial mononuclear multifocal con presencia de células multinucleadas. Ligera enteritis eosinofílica; Congestión renal aguda con nefrosis tubular multifocal; presencia de calcio en los túbulos dístales y proteinuria; ligera nefritis membranoproliferativa. En SNC se observan hemorragias, satelitosis y lipofuscinosis severa en las neuronas. Diagnóstico etiológico: Neumonía de posible origen vírica Nefritis membranoproliferativa Hemorragia cerebral Entidad patológica: Patología de origen natural Análisis histológico del hígado: Histoquímica: congestión hepática moderada; esteatosis microvesicular desimanada y presencia de cuerpos apoptóticos; colestais intracitoplasmática; hepatitis con presencia de infiltrado inflamatorio mixto en espacio porta. Presencia de algunos glóbulos hialinos intracitoplasmáticos en hepatocitos de contenido homogéneo, PAS-d resistente y presencia de “pink point” Inmunohistoquímica: escasos glóbulos positivos a FB y A1AT. CET 15 155/96 Resultados 105 Informe de Necropsia Especie: Delphinus delphis - Delfín común Estado nutricional: ND Sexo (M/H): M Edad: ND Varamiento: ND Gestante (S/N): Conservación: 1 Lugar Varamiento: San Cristobal GC Longitud (cm): ND Estado (V/M): V Fecha Muerte: ND Perímetro (cm): ND Peso (kg): ND Fecha Necropsia:08-03-1996 Diagnóstico morfológico: Congestión pulmonar aguda; bronconeumonía purulenta ligera y áreas de neumonía intersticial mononuclear localizada; presencia de un granuloma parasitario bien delimitado y calcificación de los epitelios respiratorios. Congestión renal aguda y proteinúria. Hemosiderosis en ganglios y bazo. Ligero infiltrado mononuclear en mucosa de la vejiga. Amiloidosis en ganglio, Congestión aguda del miocardio con cambios isquémicos agudos; lipofuccinosis. Hemorragia en SNC y meninges; balonización astrocitica; satelitosis; lipofuscinosis neuronal; engrosamiento de los plexos coronoides. Diagnóstico etiológico: No determinada Entidad patológica: Patología de origen natural Análisis histológico del hígado: Histoquímica: hepatitis periportal mononuclear moderada con fibrosis del espacio porta y engrosamiento de las paredes arteriales. Congestión hepática aguda severa; estasis biliar moderada; presencia de gran número de glóbulos hialinos intracitoplasmaticos con distinta morfología, tamaño e intensidad de coloración. Presencia de “pink point”. Con la técnica de PAS-d se observan glóbulos de distinta intensidad, siendo los mas pequeños, los que tienen tinción mas intensa. Inmunohistoquímica: presencia de glóbulos positivos a FB, principalmente en las áreas centrolobulillares con mayor congestión hepática. Algunos glóbulos, dispersos, positivos a la A1AT. CET 16 156/96 Resultados 112 Informe de Necropsia Especie: Stenella frontalis - Delfín moteado Estado nutricional: ND Sexo (M/H): H Edad: ND Varamiento: ND Gestante (S/N): N Conservación: 2 Lugar Varamiento: ND Longitud (cm): ND Estado (V/M): M Fecha Muerte: 14-02-1996 Perímetro (cm): ND Peso (kg): ND Fecha Necropsia:19-04-1996 Diagnóstico morfológico: Congestión y edema pulmonar; bronconeumonia linfoplasmocitarias con áreas purulentas. Presencia de múltiples granulomas, bien delimitados, con centro calcificado. Hiperplasia folicular en bazo. Diagnóstico etiológico: Bronconeumonia Entidad patológica: Patología de origen natural Análisis histológico del hígado: Histoquímica: cogestión hepática ligera. Hepatitis periportal mononuclear con hiperplasia de conductos biliares. Presencia de algunos glóbulos hialinos eosinófilicos intracitoplasmáticos con “pink point” en su interior, Inmunohistoquímica: Presencia de algunos glóbulos positivos a FB. CET 30 343/96 Resultados 113 Informe de Necropsia Especie: Stenella coeruleoalba - Delfín listado Estado nutricional: ND Sexo (M/H): M Edad: Adulto Varamiento: ND Gestante (S/N): N Conservación: 2 Lugar Varamiento: ND Longitud (cm): ND Estado (V/M): M Fecha Muerte: 05-05-1996 Perímetro (cm): ND Peso (kg): ND Fecha Necropsia:06-05-1996 Diagnóstico morfológico: Bronconeumonia linfoplasmocitarias severa. Edema pleural y pulmonar severo. Calcificación de las mucosas de los bronquios. Adrenalits linfoplasmocitaria multifocal. Presencia de cuerpos de inclusión eosinofílicos en el citoplasma de las células de la corteza. Numerosas células binucleadas. Ligera gastritis linfoplasmocitarias en segundo estómago. Nefritis intersticial linfoplasmocitaria. Pancreatitis parasitaria severa. Microhemorragias en SNC; satelitosis neuronal intensa; manguitos perivasculares. Diagnóstico etiológico: Parasitosis multiorganica. Encefalitis no purulenta. Entidad patológica: Patología de origen natural Análisis histológico del hígado: Histoquímica: congestión hepática aguda severa con predominio centrolobulillar. Infiltrado inflamatorio perioportal mononuclear que se extiende por los sinusoides hepáticos. Presencia de células en apoptosis. Granulomas parasitarios. Glóbulos hialinos intracitoplasmáticos eosinofílicos, de distintos tamaños y distintas intensidades de coloración. Presencia de “pink point”. Escasos glóbulos resistentes a PAS-d. Presencia de estructuras globulares positivas a PAS-d en el interior de los sinusoides hepáticos. Inmunohistoquímica: Gran número de glóbulos positivos a FB. Pocos glóbulos positivos a A1AT. CET 31 344/96 Resultados 114 Informe de Necropsia Especie: Stenella coeruleoalba - Delfín listado Estado nutricional: ND Sexo (M/H): H Edad: Juvenil Varamiento: ND Gestante (S/N): N Conservación: 2 Lugar Varamiento: Maspalomas GC Longitud (cm): 201 Estado (V/M): M Fecha Muerte: ND Perímetro (cm): ND Peso (kg): ND Fecha Necropsia:12-02-1997 Diagnóstico morfológico: Ligera dermatitis purulenta. Tranqueitis linfoplasmocitaria. Bronconeumonia parasitaria severa. Microhemorragias en adrenal. Gastrilis linfoplasmocitaria ligera en primer estomago. Nefritis intersticial linfoplasmocitaria. Meningoencefalitis no purulenta. Diagnóstico etiológico: Meningoencefalitis no purulenta. Bronconeumonia parasitaria severa. Entidad patológica: Patología de origen natural Análisis histológico del hígado: Histoquímica: Congestión hepática moderada. Dilatación de las arterias portales. Presencia de ligero infiltrado inflamatorio periportal y sinusoidal, linfoplasmocitario. Presencia de pigmento (posiblemente lipofucsina) en el interior de hepatocitos y macrófagos. CET 37 072/97 Resultados 115 Informe de Necropsia Especie: Stenella coeruleoalba - Delfín listado Estado nutricional: ND Sexo (M/H): M Edad: Juvenil Varamiento: 20-04-1997 Gestante (S/N): N Conservación: 3 Lugar Varamiento: Gran Canaria Longitud (cm): 143 Estado (V/M): M Fecha Muerte: ND Perímetro (cm): ND Peso (kg): ND Fecha Necropsia:21-04-1997 Diagnóstico morfológico: Edema pulmonar; ligera neumonía intersticial linfoplasmocitaria. Linfadenitis parasitaria. Granulomas parasitarios en vías urogenitales. Meningitis no purulenta. Diagnóstico etiológico: Meningitis no purulenta. Parasitosis intensa. Entidad patológica: Patología de origen natural Análisis histológico del hígado: Histoquímica: congestión hepática de moderada a severa con predominio centrolobulillar. Esteatosis microvacuolar. Hepatitis periportal mononuclear. Leucocitosis mononuclear en los sinusoides hepáticos. Presencia de células en apoptosis, balonizadas. Presencia de glóbulos hialinos intracitoplasmáticos de distintos tamaños. Glóbulos de pequeño tamaño positivos al PAS-D Inmunohistoquímica: Glóbulos negativos a A1AT. Presencia de glóbulos positivos a FB. CET 40 184/97 Resultados 116 Informe de Necropsia Especie: Tursiops truncatus - Delfín mular Estado nutricional: ND Sexo (M/H): H Edad: Adulto Varamiento: 29-07-1997 Gestante (S/N): N Conservación: 2 Lugar Varamiento: Puerto Rico, GC Longitud (cm): 224 Estado (V/M): M Fecha Muerte: 29-07-1997 Perímetro (cm): ND Peso (kg): 140 Fecha Necropsia:30-07-1997 Diagnóstico morfológico: Erosiones en la lengua; parasitosis externa moderada. Fractura de costillas Ascitis Diagnóstico etiológico: Trauma Entidad patológica: Interacción intra-inter especifica. Análisis histológico del hígado: Histoquímica: congestión hepática de moderada a severa con predominio centrolobulillar. Hepatitis periportal con infiltrado predominantemente mononuclear. Esteatosis microvacuolar. Presencia de glóbulos hialinos de diferentes intensidad y tamaño. Presencia de células en apoptosis balonizadas. Presencia de pequeños glóbulos positivos a PAS-d. Inmunohistoquímica: presencia de glóbulos de pequeño tamaño positivos a A1AT y glóbulos positivos a FB. CET 41 287/97 Resultados 117 Informe de Necropsia Especie: Tursiops truncatus - Delfín mular Estado nutricional: Caquéctico. Sexo (M/H): H Edad: Adulto Varamiento: 17-08-1997 Gestante (S/N): ND Conservación: 2 Lugar Varamiento: Buenavista, Tenerife Longitud (cm): ND Estado (V/M): M Fecha Muerte: 17-08-1997 Perímetro (cm): ND Peso (kg): ND Fecha Necropsia: 18-08-1997 Diagnóstico morfológico: Hematomas subcutáneos en la región ventral. Poca grasa en hipodermis. Quistes parasitarios en subcutáneo. Parásitos (nemátodos) en el estómago glandular. Inflamación eosinofílica difusa en mucosa, submucosa y túnica muscular intestinal. Efusión sero-sanguinolenta en cavidad pleural. Presencia de parásitos (nemátodos) desde la glotis hasta los bronquios terminales. Pequeños focos multifocales de inflamación mononuclear en miocardio. Hemorragias en la unión córtico-medular de la adrenal así como infiltrado linfocitario multifocal tanto en corteza como en médula. Balonización astrocítica perivascular en médula y encéfalo. Diagnóstico etiológico: Parasitosis multiorgánica. Miocarditis mononuclear Adrenalitis linfocítica multifocal Hepatitis multifocal granulomatosa Entidad patológica: Patología consuntiva de origen natural. Análisis histológico del hígado: Histoquímica: congestión hepática de moderada a severa con predominio centrolobulillar. Presencia de edema y burbujas en parénquima hepático. Presencia de infiltrado inflamatorio mononuclear principalmente en la zona centrolobulillar, con presencia de algunas células polimorfonucleres en los sinusoides hepáticos. Hepatitis granulomatosa y fibrosis portal. Presencia de glóbulos hialinos de distinto tamaño e intensidad de tinción. Pequeños glóbulos resistentes al PAS-d. Inmunohistoquímica: glóbulos negativos a A1AT y positivos a FB. CET 43 302/97 Resultados 118 Informe de Necropsia Especie: Stenella frontales - Delfín moteado Estado nutricional: ND Sexo (M/H): M Edad: Adulto Varamiento: 12-11-1997 Gestante (S/N): N Conservación: 2 Lugar Varamiento: Tenerife Longitud (cm): 178 Estado (V/M): M Fecha Muerte: 12-11-1997 Perímetro (cm): 100 Peso (kg): ND Fecha Necropsia:13-11-1997 Diagnóstico morfológico: Pulmones congestivos y no colapsados con marcas de las costillas Hígado con bordes redondos. Vasos coronarios muy demarcados y dilatación marcada de la cavidad derecha del corazón. Diagnóstico etiológico: Insuficiencia cardiaca Entidad patológica: Patología de origen natural Análisis histológico del hígado: Histoquímica: congestión hepática moderada. Infiltrado inflamatorio linfoplasmocitario en la capsula hepática, espacio periportal y parénquima hepático con necrosis multifocal. Presencia de huevos de parásitos en la capsula de Glisson. CET 46 414/97 Resultados 119 Informe de Necropsia Especie: Tursiops truncatus - Delfín mular Estado nutricional: ND Sexo (M/H): H Edad: ND Varamiento: ND Gestante (S/N): N Conservación: 2 Lugar Varamiento: Tenerife Longitud (cm): 240 Estado (V/M): M Fecha Muerte: ND Perímetro (cm): ND Peso (kg): ND Fecha Necropsia:18-12-1997 Diagnóstico morfológico: Neumonía parasitaria severa. Gastritis y enteritis parasitaria. Meningoencefalitis no purulenta. Diagnóstico etiológico: Parasitosis multiorgánica severa. Meningoencefalitis no purulenta. Entidad patológica: Patología de origen natural Análisis histológico del hígado: Histoquímica: congestión hepática de moderada a severa con predominio centrolobulillar. Presencia de escaso infiltrado inflamatorio mononuclear periportal. Gran número de glóbulos hialinos intracitoplasmáticos de distinto tamaño e intensidad de coloración. Presencia de células balonizados; degeneración hidrópica de células aisladas en el parénquima hepático. “pink point” de pequeño tamaño. La mayoría de los glóbulos presentan intensa coloración con la técnica del PAS-d. Inmunohistoquímica: A1AT positiva en pocos glóbulos. Predominio de glóbulos positivos al FB. CET 47 467/97 Resultados 120 Informe de Necropsia Especie: Stenella frontales - Delfín moteado Estado nutricional: ND Sexo (M/H): H Edad: Cría Varamiento: 13-02-1998 Gestante (S/N): N Conservación: 1 Lugar Varamiento: Jandía Fuerteventura Longitud (cm): 150 Estado (V/M): V Fecha Muerte: 13-02-1998 Perímetro (cm): ND Peso (kg): ND Fecha Necropsia:13-02-1998 Observaciones: necropsia realizada a las 4 horas de la muerte del animal Estado general: presencia de parásitos en aleta dorsal y caudal. Diagnóstico morfológico: Enfisema pulmonar. Presencia de parásitos en estomago; sin contenido. Diagnóstico etiológico: Entidad patológica: Patología de origen natural Análisis histológico del hígado: Histoquímica: congestión hepática de moderada a severa con predominio en la zona centrolobulillar. Infiltrado inflamatorio predominantemente mononuclear perivascular, tanto en los espacios porta como en la zona de la vena centrolobulillar y en los sinusoides hepáticos. Hepatocitos con degeneración hidrópica. Presencia de escasos glóbulos hialinos, la mayoría de pequeño tamaño, en los que se observa un halo blanco, mientras que otros, presentan contenido fibrilar. Glóbulos con distinta intensidad de coloración y “pink point” muy positivo con la técnica del PAS-d. Inmunohistoquímica: escasos glóbulos positivos a A1AT y a FB. CET 49 064/98 Resultados 121 Informe de Necropsia Especie: Tursiops truncatus - Delfín mular Estado nutricional: ND Sexo (M/H): H Edad: Adulto viejo Varamiento: 16-02-1998 Gestante (S/N): N Conservación: 1 Lugar Varamiento: Aldea de San Nicolás GC Longitud (cm): 240 Estado (V/M): V Fecha Muerte: 16-02-1998 Perímetro (cm): ND Peso (kg): ND Fecha Necropsia:16-02-1998 Observaciones: varamiento masivo coincidente con mar malo y calima. Necropsia realizada a las 6 horas post-morten. Estado general: presencia de parásitos en la piel, ulceras en lengua y encías. Diagnóstico Anatomopatológico. Diagnóstico morfológico: Sinusitis parasitaria Diagnóstico etiológico: Varamiento masivo Entidad patológica: Varamiento masivo Análisis histológico del hígado: Histoquímica: congestión hepática ligera. Infiltrado inflamatório mononuclear sub-capsular y periportal. Presencia de polimorfonucleares en los sinusoides hepáticos. Hepatocitos con degeneración hidrópica. Colestasis. Presencia de glóbulos hialinos. Algunos presentan contenido fibrilar. Presencia de escasos glóbulos positivos de pequeña dimensió y homogéneos al PAS-d. Inmunohistoquímica: escasos glóbulos positivos a A1AT. La mayoría de los glóbulos son positivos al FB. CET 50 067/98 Resultados 128 Presencia de glóbulos hialinos intracitoplasmáticos con “pink point” de grandes dimensiones, de contenido fibrilar. Con la técnica de la PAS-d se observa una ligera resistencia en los glóbulos más homogéneos. Inmunohistoquímica: concentración de glóbulos positivos a FB en las áreas centrolobulillares. Presencia de pocos glóbulos positivos a A1AT. Resultados 129 Informe de Necropsia Especie: Delphinus delphis - Delfín común Estado nutricional: ND Sexo (M/H): M Edad: Adulto Varamiento: 19-09-1999 Gestante (S/N): ND Conservación: 3 Lugar Varamiento: Lanzarote Longitud (cm): ND Estado (V/M): V Fecha Muerte: ND Perímetro (cm): ND Peso (kg): ND Fecha Necropsia:19-09-1999 Diagnóstico morfológico: Dermatitis crónica reactiva severa. Bronconeumonia purulenta y parasitaria. Placas hemosideroticas en bazo, formación de granulomas con células gigantes multinucleadas. Número abundante de pigmento. Presencia de megacariocitos. Enteritis parasitaria severa. Calcificación masiva de la pelvis renal. Lipofuccinosis neuronal y presencia de numerosos gránulos eosinofílicos refringentes. Meningoencefalitis no purulenta. Diagnóstico etiológico: Septicemia. Meningoencefalitis no purulenta. Entidad patológica: Patología de origen natural. Análisis histológico del hígado: Histoquímica: hepatitis parasitaria severa con presencia de parásitos adultos en el interior de vasos sanguíneos de gran calibre. Fibrosis en espacios porta. Presencia de burbujas en el interior del parénquima hepático. CET 79 339/99 Resultados 130 Informe de Necropsia Especie: Kogia Breviceps - Cachalote pigmeo Estado nutricional: Pobre Sexo (M/H): M Edad: Juvenil Varamiento: 19-11-1999 Gestante (S/N): N Conservación: 2 Lugar Varamiento: Fuerteventura Longitud (cm): 205 Estado (V/M): M Fecha Muerte: ND Perímetro (cm): 128 Peso (kg): ND Fecha Necropsia: 19-11-1999 Diagnóstico morfológico: Fractura conminuta de la base del cráneo y hematoma subdural con compresión de tejido nervioso. Diagnóstico etiológico: Trauma. Entidad patológica: Interacción con pesca. Análisis histológico del hígado: Histoquímica: Esteatosis hepática difusa severa; perdida de la estructura hepática. CET 82 464/99 Resultados 131 Informe de Necropsia Especie: Stenella frontales - Delfín moteado Estado nutricional: Bueno Sexo (M/H): H Edad: Juvenil Varamiento: 07-12-1999 Gestante (S/N): N Conservación: 1 Lugar Varamiento: Corralejo GC Longitud (cm): 165 Estado (V/M): V Fecha Muerte: 08-12-1999 Perímetro (cm): 94 Peso (kg): ND Fecha Necropsia: 08-12-1999 Diagnóstico morfológico: Abundante agua en el esófago y la porción queratinizada del estómago. Degeneración multifocal de fibras musculares esqueléticas y cardiacas. Enteritis fibrinonecrótica superficial multifocal. Hiperplasia folicular esplénica. Linfadenomegalia generalizada por hiperplasia linfoide reactiva. Hemorragias en adrenales. Edema alveolar difuso severo. Diagnóstico etiológico: Septicemia. Entidad patológica: Patología no consuntiva de origen natural. Varamiento activo. Análisis histológico del hígado: Histoquímica: congestión hepática moderada con predominio centrolobulillar. Ligera hepatitis periportal linfoplasmocitaria. Presencia de escasos glóbulos hialinos intracitoplasmáticos eosinofílicos de contenido homogéneo. Presencia de hepatocitos en apoptosis dispersos por el parénquima. Fuerte resistencia de los glóbulos a la técnica del PAS-d. Inmunohistoquímica: presencia de algunos glóbulos positivos a la A1AT y escasos glóbulos positivos a FB. CET 88 530/99 Resultados 132 Informe de Necropsia Especie: Stenella frontales - Delfín moteado Estado nutricional: Pobre Sexo (M/H): H Edad: Adulto Varamiento: 15-12-1999 Gestante (S/N): N Conservación: 4 Lugar Varamiento: Playa del Jober Tenerife Longitud (cm): 187 Estado (V/M): M Fecha Muerte: ND Perímetro (cm): 86 Peso (kg): ND Fecha Necropsia: 17-12-1999 Diagnóstico morfológico: Región ventral con extensas hemorragias. Corte con pérdida de tejido en la porción caudal del dorso. Hemorragias en músculo. Quistes tiroideos. Linfoma linfoblástico multicéntrico. Sinusitis parasitaria. Diagnóstico etiológico: Linfoma linfoblástico multicéntrico caracterizado inmunocitoquímicamente como del tipo “célula B”. Entidad patológica: Patología consuntiva de origen natural. Análisis histológico del hígado: Histoquímica: congestión hepática ligera. Hepatitis periportal linfoplasmocitaria. Presencia de células inflamatorias mononucleares en los sinusoides hepáticos. Presencia de pocos glóbulos hialinos intracitoplasmáticos, de distinto tamaño y contenido eosinofílico y fibrilar. Con la técnica del PAS-d se observa la presencia de pocos glóbulos resistentes y de escasa tinción. Inmunohistoquímica: Presencia de glóbulos positivos a FB. Escasos glóbulos positivos a A1AT. CET 89 541/99 Resultados 133 Informe de Necropsia Especie: Stenella coeruleoalba - Delfín listado - Estado nutricional: Pobre Sexo (M/H): M Edad: Adulto Varamiento: 30-01-2000 Gestante (S/N): N Conservación: 1 Lugar Varamiento: Fuerteventura Longitud (cm): 225 Estado (V/M): V Fecha Muerte: 30-01-2000 Perímetro (cm): 105 Peso (kg): 102 Fecha Necropsia: 30-01-2000 Bacteriología: Aerococcus viridans. Pulmón: Psychrobacter submarinus, Corynebacterium grupo G, Lactobacillus divergens. Diagnóstico morfológico: Cirrosis biliar multifocal y pericolangitis granulomatosa parasitaria severa. Bronconeumonía verminosa y bacteriana. Miocarditis linfocítica focal. Orquitis purulenta parasitaria. Leptomeningitis no purulenta. Diagnóstica etiológico: Parasitosis multiorgánica. Bronconeumonia bacteriana por Corynebacterium sp. Entidad patológica: Patología consuntiva de origen natural. Análisis histológico del hígado: Histoquímica: hepatitis linfoplasmocitaria severa con formación de folículos linfoides en los espacio porta, que muestran una marcada fibrosis. Perdida de casi la totalidad de la estructura del parénquima hepático. Presencia de numerosos huevos de parásitos (trematodos). Congestión severa en áreas de hepatocitos. Presencia de glóbulos hialinos de distinto tamaño. PAS-d ligeramente positiva en algunos glóbulos. Inmunohistoquímica: mayoría de los glóbulos positivos a FB CET 97 61/00 Resultados 134 Informe de Necropsia Especie: Stenella coeruleoalba - Delfín listado Estado nutricional: Pobre Sexo (M/H): M Edad: Adulto Varamiento: 29-02-2000 Gestante (S/N): N Conservación: 1 Lugar Varamiento: La Graciosa Longitud (cm): 236 Estado (V/M): V Fecha Muerte: 29-02-2000 Perímetro (cm): 106 Peso (kg): ND Fecha Necropsia: 29-02-2000 Bacteriología: Hígado: Staphylococcus lentus, Vibrio sp. Pulmón: Vibrio sp. Músculo: Flavobacterium sp. Diagnóstico morfológico: Dermatitis protozoaria. Encefalitis no purulenta. Congestión pasiva hepática. Glóbulos hialinos intracitoplasmáticos hepatocelulares. Siderofibrosis esplénica. Lipofuscinosis neuronal. Hialinosis de plexos coroideos. Diagnóstico etiológico: Dermatitis protozoaria. Encefalitis infecciosa. Patología senil. Entidad patológica: Patología consuntiva de origen natural. Análisis histológico del hígado: Histoquímica: congestión hepática moderada con predominio centrolobulillar. Hepatitis periportal mononuclear. Moderada cantidad de glóbulos hialinos eosinofílicos de contenido homogéneo y fibrilar. Se observa pigmento biliar en el interior de los hepatocitos. Presencia de células en apoptosis. Presencia de escasos glóbulos resistentes al PAS-d y de pequeño tamaño. Inmunohistoquímica: glóbulos pequeños positivos a FB. CET 98 141/00 Resultados 135 Informe de Necropsia Especie: Steno bredanensis - Delfín de dientes rugosos Estado nutricional: Pobre Sexo (M/H): M Edad: Adulto Varamiento: 06-04-2000 Gestante (S/N): N Conservación: 2 Lugar Varamiento: El Medano Tenerife Longitud (cm): 247 Estado (V/M): M Fecha Muerte: ND Perímetro (cm): 118 Peso (kg): ND Fecha Necropsia: 06-04-2000 Bacteriología: Pulmón: Enterococcus francium, Flavobacterium sp. Encéfalo: Pseudomona fluorescens. Riñón: Flavobacterium sp. Músculo: Flavobacterium sp. Diagnóstico Anatomopatológico. Diagnóstico morfológico: Sinusitis parasitaria. Leptomeningitis no purulenta. Parasitosis pulmonar, gástrica, hepática, pancreática y testicular. Hepatite periportal. Diagnóstico etiológico: Parasitosis multiorgánica. Leptomeningitis infecciosa. Entidad patológica: Patología consuntiva de origen natural. Análisis histológico del hígado: Histoquímica: congestión hepática moderada con dilatación de los sinusoides hepáticos por células inflamatorias linfoplasmocitarias. Presencia de numerosos glóbulos hialinos eosinofílicos, muy homogéneos, algunos con forma de media luna y con halo blanco alrededor. “pink point” de grandes dimensiones. La mayoría de los glóbulos son positivos al PAS-d. Inmunohistoquímica: glóbulos positivos a FB. Escasos glóbulos positivos a A1AT. CET 100 217/00 Resultados 136 Informe de Necropsia Especie: Stenella frontales - Delfín moteado Estado nutricional: Bueno Sexo (M/H): M Edad: Juvenil Varamiento: 28-04-2000 Gestante (S/N): N Conservación: 2 Lugar Varamiento: Tenerife Longitud (cm): 125 Estado (V/M): M Fecha Muerte: ND Perímetro (cm): 76 Peso (kg): 30 Fecha Necropsia: 28-04-2000 Diagnóstico Anatomopatológico. Diagnóstico morfológico: Cortes superficiales en el morro y las aletas. Erosiones longitudinales y simétricas en la piel. Abundante contenido alimenticio fresco en esófago y estómago. Hemorragias pulmonares petequiales subpleurales multifocales. Edema alveolar difuso severo. Sinisutis parasitaria. Diagnóstico etiológico: Enmallamiento. Entidad patológica: Interacción con pesca. Análisis histológico del hígado: Histoquímica: congestión hepática predominantemente centrolobulillar. Ligero infiltrado inflamatorio linfoplasmocitario en los espacio porta. Presencia de glóbulos hialinos eosinofílicos, intracitoplasmáticos, tanto de contenido fibrilar como homogéneo, principalmente en las áreas más congestivas. “pink point” de gran tamaño. Presencia de algunos glóbulos resistentes al PAS-d. Inmunohistoquímica: escasos glóbulos positivos a A1AT y algunos a FB con distinta intensidad de tinción. CET 106 266/00 Resultados 137 Informe de Necropsia Especie: Delphinus delphis - Delfín común Estado nutricional: Bueno Sexo (M/H): H Edad: Adulto Varamiento: 13-06-2000 Gestante (S/N): N Conservación: 1 Lugar Varamiento: Las Canteras GC Longitud (cm): 210 Estado (V/M): V Fecha Muerte: 13-06-2000 Perímetro (cm): 104 Peso (kg): 88 Fecha Necropsia: 13-06-2000 Bacteriología: Vibrio sp. Diagnóstico morfológico: Linfoma linfoblástico primario en sistema nervioso central. Diagnóstico etiológico: Linfoma linfoblástico primario en sistema nervioso central caracterizado inmunocitoquímicamente como de tipo “célula T”. Entidad patológica: Patología no consuntiva de origen natural. Análisis histológico del hígado: Histoquímica: congestión hepática moderada con predominio centrolobulillar. Fibrosis moderada de los espacios porta con presencia de ligero infiltrado inflamatorio, predominantemente linfoplasmocitario. Presencia de algunas células inflamatorias mononucleares en los sinusoides hepáticos. Glóbulos hialinos intracitoplasmáticos eosinofílicos homogéneos y fibrilares, de distinto tamaño, con predominio en las áreas mas congestivas. Presencia de numerosos glóbulos resistentes al PAS-d, con distinta intensidad de coloración y tamaño. Inmunohistoquímica: glóbulos positivos a A1AT y algunos a FB. CET 110 339/00 Resultados 144 Informe de Necropsia Especie: Globicephala macrorhynchus - Calderón tropical Estado nutricional: Pobre Sexo (M/H): M Edad: Cría Varamiento: 24-06-2001 Gestante (S/N): Conservación: 2 Lugar Varamiento: Los Gigantes Tenerife Longitud (cm): 148 Estado (V/M): M Fecha Muerte: ND Perímetro (cm): 88 Peso (kg): ND Fecha Necropsia: 25-06-2001 Diagnóstico Anatomopatológico. Diagnóstico morfológico: Pancreatitis intersticial parasitaria moderada. Lipidosis tubular renal difusa. Depleción linfoide generalizada. Leptomeningitis no purulenta ligera. Diagnóstico etiológico: Patología del comportamiento (separación social). Entidad patológica: Patología consuntiva de origen natural. Análisis histológico del hígado: Histoquímica: congestión hepática ligera. Esteatosis macrovacuolar severa. CET 133 I244/01 Resultados 145 Informe de Necropsia Especie: Mesoplodon europaeus - Zifio de Gervais Estado nutricional: Pobre Sexo (M/H): H Edad: Neonato Varamiento: 28-06-2001 Gestante (S/N): N Conservación: 1 Lugar Varamiento: Playa del Águila, GC Longitud (cm): 179 Estado (V/M): V Fecha Muerte: 28-06-2001 Perímetro (cm): 75 Peso (kg): ND Fecha Necropsia: 29-06-2001 Bacteriología: Riñón: Enterococcus faecium. Bazo: Enterococcus faecium. Pulmón: Enterococcus faecium. Virología: negativo. Diagnóstico Anatomopatológico. Diagnóstico morfológico: Atelectasia pulmonar difusa. Presencia de meconio intraalveolar. Diagnóstico etiológico: Sufrimiento fetal. Debilidad neonatal. Separación maternal. Entidad patológica: Patología perinatal/neonatal. Análisis histológico del hígado: Histoquímica: cogestión hepática de moderada a severa generalizada. Macroesteatosis hepática difusa. Presencia de algunos glóbulos hialinos de contenido fibrilar con presencia de “pink points” de pequeño tamaño. Inmunohistoquímica: Algunos glóbulos positivos a FB. CET 134 I245/01 Resultados 146 Informe de Necropsia Especie: Stenella coeruleoalba - Delfín listado Estado nutricional: Bueno Sexo (M/H): H Edad: Adulto Varamiento: 09-07-2001 Gestante (S/N): N Conservación: 3 Lugar Varamiento: Papagayo, Lanzarote Longitud (cm): 220 Estado (V/M): M Fecha Muerte: ND Perímetro (cm): 110 Peso (kg): ND Fecha Necropsia: 10-07-2001 Diagnóstico Anatomopatológico. Diagnóstico morfológico: Pleuritis fibrinosa. Linfadenomegalia y depleción linfoide generalizada. Diagnóstico etiológico: Pleuritis bacteriana. Septicemia. Entidad patológica: Patología no consuntiva de origen natural. Análisis histológico del hígado: Histoquímica: congestión hepática severa con predominio centrolobulillar. Hepatitis reactiva crónica inespecífica. Hepatitis portal de ligera a moderada, linfoplasmocitaria y necrosis multifocal de hepatocitos. Glóbulos hialinos intracitoplasmáticos eosinofílicos homogéneos y fibrilares de distinto tamaño, con predominio en las áreas mas congestivas. Se observan “pink point”. Presencia de numerosos glóbulos resistentes al PAS-d de distinta intensidad de coloración y tamaño. Inmunohistoquímica: glóbulos positivos a A1AT con baja intensidad de coloración y mayoría de glóbulos positivos a FB. CET 136 I260/01 Resultados 147 Informe de Necropsia Especie: Tursiops truncatus - Delfín mular Estado nutricional: Bueno Sexo (M/H): M Edad: Cría Varamiento: 03-10-2001 Gestante (S/N): Conservación: 1 Lugar Varamiento: Pozo Izquierdo, GC Longitud (cm): 167 Estado (V/M): V Fecha Muerte: 04-10-2001 Perímetro (cm): 98 Peso (kg): ND Fecha Necropsia: 04-10-2001 Observaciones: Varamiento masivo de un grupo de Tursiops truncatus de aproximadamente 15 animales. Diagnóstico morfológico: Congestión hepática aguda. Glóbulos hialinos intracitoplasmáticos. Lipidosis hepática. Diagnóstico etiológico: Patología del comportamiento (cohesión social). Entidad patológica: Varamiento masivo. Análisis histológico del hígado: Histoquímica: congestión hepática aguda. Ligero infiltrado inflamatorio, predominantemente linfoplasmocitario en los espacio porta. Esteatosis macrovacuolar. Algunos glóbulos hialinos intracitoplasmáticos. Se observan “pink point” de pequeño tamaño. Escasos glóbulos resistentes a PAS-d. Inmunohistoquímica: escasos glóbulos positivos a FB. CET 144 I299/01 Resultados 148 Informe de Necropsia Especie: Tursiops truncatus - Delfín mular Estado nutricional: Bueno Sexo (M/H): H Edad: Adulto Varamiento: 03-10-2001 Gestante (S/N): N Conservación: 1 Lugar Varamiento: Pozo Izquierdo, GC Longitud (cm): 280 Estado (V/M): V Fecha Muerte: 04-10-2001 Perímetro (cm): 167 Peso (kg): ND Fecha Necropsia: 04-10-2001 Observaciones: Varamiento masivo de un grupo de Tursiops truncatus de aproximadamente 15 animales. Diagnóstico Anatomopatológico. Diagnóstico morfológico: Edema pulmonar difuso severo. Bronconeumonía parasitaria difusa. Neumonía intersticial difusa. Gastritis ulcerativa parasitaria. Endometritis crónica. Sinusitis parasitaria severa. Hemorragias en leptomeninges. Diagnóstico etiológico: Sinusitis parasitaria severa por Nasitrema sp. Patología del comportamiento (cohesión social). Entidad patológica: Varamiento masivo. Análisis histológico del hígado: Histoquímica: congestión hepática moderada con predominio centrolobulillar. Espacio porta con presencia de infiltrado inflamatorio ligero, predominantemente linfoplasmocitario. Glóbulos hialinos intracitoplasmáticos eosinofílicos homogéneos y fibrilares, de distinto tamaño con predominio en las áreas mas congestivas. Se observan “pink point”. Presencia de numerosos glóbulos resistentes al PAS-d, de distinta intensidad de coloración y tamaño con “pink point” muy marcados. Inmunohistoquímica: algunos glóbulos positivos a FB. CET 145 I300/01 Resultados 149 Informe de Necropsia Especie: Stenella frontales - Delfín moteado Estado nutricional: Pobre Sexo (M/H): M Edad: Adulto viejo Varamiento: 19-11-2001 Gestante (S/N): Conservación: 1 Lugar Varamiento: Las Palmas de Gran Canaria Longitud (cm): 194 Estado (V/M): V Fecha Muerte: 19-11-2001 Perímetro (cm): 98 Peso (kg): 74 Fecha Necropsia: 19-11-2001 Observaciones: Animal encontrado dentro del muelle León y Castillo a primeras horas de la mañana, al observar comportamiento autolesivo se decidió sacarlo del agua y llevarlo al centro de recuperación en Taliarte, murió durante la operación de rescate. Bacteriología: Riñón: Proteus sp. Encéfalo, hígado y bazo: Enterococcus facium. Riñón, hígado y bazo: Salmonella 0704552. Pulmón: Aerococcus viridans. Diagnóstico morfológico: Severa sinusitis paraótica parasitaria. Microhemorragias multifocales en SNC. Extensa atelectasia pulmonar asociada a la presencia de coágulos de sangre en la luz bronquial. Lesiones histológicas seniles multiorgánicas. Diagnóstico etiológico: Infección por Salmonella sp. Septicemia. Patología senil. Entidad patológica: Patología consuntiva de origen natural. Análisis histológico del hígado: Histoquímica: Fibrosis moderada de los espacio porta con presencia de ligero infiltrado inflamatorio, predominantemente linfoplasmocitario. Presencia de pigmento amarillento en el interior de hepatocitos. CET 147 I354/01 Resultados 150 Informe de Necropsia Especie: Stenella coeruleoalba - Delfín listado Estado nutricional: Bueno Sexo (M/H): M Edad: Adulto Varamiento: 26-11-2001 Gestante (S/N): Conservación: 2 Lugar Varamiento: Corralejo Fuerteventura Longitud (cm): 220 Estado (V/M): M Fecha Muerte: ND Perímetro (cm): 112 Peso (kg): ND Fecha Necropsia: 26-11-2001 Bacteriología: Pulmón: Nocardia farcinica. Diagnóstico Anatomopatológico. Diagnóstico morfológico: Piogranulomatosis sistémica. Diagnóstico etiológico: Infección por Nocardia farcinica. Septicemia. Entidad patológica: Patología no consuntiva de origen natural. Análisis histológico del hígado: Histoquímica: congestión hepática moderada con predominio centrolobulillar. Hepatitis piogranulomatosa multifocal. Glóbulos hialinos intracitoplasmáticos eosinofílicos homogéneos y fibrilares, de distinto tamaño con predominio en las áreas mas congestivas. Se observan “pink point” de gran tamaño. Presencia de algunos glóbulos resistentes al PAS-d, con ligera coloración y con “pink point” muy marcados. Inmunohistoquímica: la mayoría de los glóbulos son positivos a FB. Se observa positividad alrededor de los “pink point”. Algunos glóbulos son positivos a A1AT. CET 148 I357/01 Resultados 151 Informe de Necropsia Especie: Stenella coeruleoalba - Delfín Listado Estado nutricional: Pobre Sexo (M/H): M Edad: Adulto Varamiento: 27-11-2001 Gestante (S/N): Conservación: 2 Lugar Varamiento: Costa Teguise, Lanzarote Longitud (cm): 218 Estado (V/M): M Fecha Muerte: ND Perímetro (cm): 94 Peso (kg): ND Fecha Necropsia: 27-11-2001 Diagnóstico morfológico: Dermatitis nodular piogranulomatosa ulcerativa asociada a la presencia de protozoos flagelados. Neumonía, gastritis, pancreatitis, hepatitis y linfadenitis crónicas parasitarias. Adrenalitis linfoplasmocitaria. Nefritis intersticial. Hiperplasia folicular tiroidea. Diagnóstico etiológico: Infección por protozoos flagelados. Parasitosis multiorgánica. Entidad patológica: Patología consuntiva de origen natural. Análisis histológico del hígado: Histoquímica: congestión hepática moderada con predominio centrolobulillar. Fibrosis ligera de los espacio porta con presencia de intenso infiltrado inflamatorio, predominantemente linfoplasmocitario. Presencia de pocos glóbulos hialinos intracitoplasmáticos, la mayoría de contenido fibrilar de distinto tamaño, con predominio en las áreas mas congestivas. Presencia de gran cantidad de pigmento amarillento intracitoplasmático (pigmento biliar). Escasos glóbulos resistentes a PAS-d. Inmunohistoquímica: Algunos glóbulos son positivos a FB y A1AT. CET 149 I358/01 Resultados 152 Informe de Necropsia Especie: Stenella coeruleoalba - Delfín listado Estado nutricional: Caquexia Sexo (M/H): M Edad: Juvenil Varamiento: 27-12-2001 Gestante (S/N): Conservación: 1 Lugar Varamiento: La Graciosa Longitud (cm): 150 Estado (V/M): V Fecha Muerte: 27-12-2001 Perímetro (cm): 72 Peso (kg): ND Fecha Necropsia: 28-12-2001 Diagnóstico Anatomopatológico. Diagnóstico morfológico: Lesiones dermo-epidérmicas lineales. Dermatitis linfoplasmocitaria e hiperqueratosis paraqueratósica. Atrofia serosa de la grasa subcutánea. Fracturas óseas craneoencefálicas. Linfadenomegalia generalizada. Hemorragias perivasculares cerebrales. Diagnóstico etiológico: Enmallamiento. Entidad patológica: Interacción con pesca. Análisis histológico del hígado: Histoquímica: Ligero infiltrado inflamatorio, predominantemente linfoplasmocitario en los espacio porta. CET 151 I380/01 Resultados 153 Informe de Necropsia Especie: Delphinus delphis - Delfín común Estado nutricional: Pobre Sexo (M/H): H Edad: Adulto Varamiento: 22-02-2002 Gestante (S/N): N Conservación: 2 Lugar Varamiento: Puerto Calero, Lanzarote Longitud (cm): 195 Estado (V/M): M Fecha Muerte: 22-02-2002 Perímetro (cm): 114 Peso (kg): ND Fecha Necropsia: 23-02-2002 Bacteriología: Nódulo linfoide mesentérico: Salmonella 4704552. Diagnóstico Anatomopatológico. Diagnóstico morfológico: Poliserositis fibrinosa. Efusión pleural y peritoneal severa. Diagnóstico etiológico: Poliserositis por Salmonella sp. Septicemia. Entidad patológica: Patología consuntiva de origen natural. Análisis histológico del hígado: Histoquímica: hepatitis subcapsular linfoplasmocitaria que se extiende por el parénquima con abundantes hepatocitos necróticos. CET 156 I046/02 Discusión 257 variables que pueden condicionar la investigación morfológica e inmunohistoquímica, respecto a su fiabilidad y reproducibilidad. Dentro de esta fase metodológica, y como se describe en Material y Métodos, se utilizó la técnica de Western Blot (Cooper, 1984), para confirmar la especificidad de los anticuerpos de A1AT y FB en muestras de cetáceos, demostrando que los anticuerpos anti-A1AT y anti-FB utilizados en el presente trabajo y creados contra esas proteínas humanas, reaccionan cruzada y específicamente con las correspondientes proteínas de cetáceos a demostrar inmunohistoquímicamente en los hígados de cetáceos sometidos al presente estudio. Igualmente, en esta etapa metodológica, se empleó la técnica rutinaria de la Hematoxilina – Eosina (H&E), con la que se identificó, sin dificultad, la presencia de glóbulos hialinos en los hepatocitos de cetáceos varados con distinto grado de conservación (desde muy frescos, grado 1, hasta muy autolíticos, grado 4). A pesar de la diferencia de conservación, se pudieron observar las características básicas microscópicas, previamente descritas por otros autores, de estos glóbulos (Kennedy y cols., 1993: Jaber y cols., 2004). Si bien los glóbulos intrahepatocíticos acidofílicos se pueden detectar en cetáceos varados con diferente grado de conservación, durante la puesta a punto de los métodos histoquímicos e inmunohistoquímicos, se demostró la necesidad de excluir todos aquellos tejidos procedentes de animales en avanzado estado de autolisis, o de aquellas Discusión 258 muestras, que, aunque procedían de cetáceos frescos, se congelaron previamente a ser fijados en formol tamponado, para proceder a su estudio histológico rutinario con H&E. Estos fenómenos de autolisis en hígado fueron aún mas manifiestos al estudiarlos con el ME, lo que también ha sido observado en muchos estudios ultraestructurales previos (Quing y cols., 1998). Si bien en ambas situaciones (autolisis y precongelación) se podían observar glóbulos hialinos en los hígados estudiados, las técnicas histoquímicas e inmunohistoquímicas pusieron de manifiesto falsos negativos, lo que determinó, que se seleccionaran para el presente estudio 115 cetáceos, de los 182 que inicialmente se evaluaron histológicamente con H&E. Metodológicamente, esta selección de material, llevada a cabo por razones de conservación y fijación, también se ha descrito en otros trabajos, en los que se utilizaron técnicas (histoquímicas e inmunohistoquímicas) con el objetivo de determinar e identificar proteínas en tejidos fijados (Bancroft y cols; 1996). 8.2 Glóbulos hialinos en hepatocitos de cetáceos varados Los glóbulos hialinos en los hepatocitos de cetáceos se referenciaron, como tales inclusiones eosinófilicas, en 1993. Kennedy y cols., al estudiar dos delfines listados (Stenella coeruleoalba) infectados por Morbillivirus, describieron, la existencia de estas estructuras globulares en el interior de hepatocitos, asociadas a la presencia de congestión hepática sinusoidal, periconlangitis mononuclear y una ligera necrosis hepática en uno de los dos animales. Las inclusiones presentaron resistencia a la técnica Discusión 259 histoquímica de PAS-diastasa y los “pink point” mostraron una fuerte reacción a la PTAH. En nuestro caso, una vez seleccionado el material de estudio y estandarizada la metodología inmunohistoquímica se analizaron nuevamente con la técnica de H&E, 115 cetáceos, de los que, el 82,6% (95) mostraron glóbulos hialinos intracitoplasmáticos y un 17,4% (20) no presentaron este cambio morfológico. La intensidad de coloración con la técnica de hematoxilina-eosina fue variada, observándose glóbulos hialinos muy eosinófilos con evidentes PP, hasta glóbulos ligeramente teñidos, que podrían ser confundidos con depósitos de lípidos, al ser observados con el microscopio óptico a bajos aumentos (x40 y x100). Un 76,8% de las muestras con glóbulos hialinos mostraron positividad al utilizar la técnica histoquímica del PAS-d, demostrando que los glóbulos están compuestos por glicoproteínas o glicolípidos (Bancroft y Stevens, 1996), como también habían concluido Kennedy y cols., en 1993. Morfológicamente, los glóbulos hialinos observados en este trabajo fueron, en su mayoría, redondos u ovales, aunque algunos mostraron forma de media luna, en que una parte del glóbulo mostró eosinofília, mientras la otra, no mostró contenido. Esto podría deberse a los efectos de la fijación y procesamiento de las muestras, por lo que en nuestros casos, lo consideramos como un artefacto. Discusión 260 La mayoría de estos glóbulos presentaron diferentes tamaños, desde 3 a 8 µm de diámetro, lo que coincide con las 4 a 8 micras referenciadas por Kennedy y cols., en 1993. No obstante, en muestras con congestión hepática severa los glóbulos adquieren mayores dimensiones, ocupando casi la totalidad del citoplasma, con desplazamiento marcado del núcleo hacia la periferia de la célula. Los 95 cetáceos en los que se detectaron glóbulos hialinos, se incluyen en 16 especies diferentes de ballenas y delfines, variabilidad ya descrita por otros autores (Jaber y cols., 2004). Estas especies incluyen cetáceos odontocetos y misticetos, de diferentes dimensiones corporales, biología, comportamiento (p.e. diferentes perfiles de buceo) (Dierauf and Gulland, 2001). Esto nos permite afirmar que los glóbulos hialinos intracitoplasmáticos se presentan, con independencia de la especie de cetáceo, tal como también ocurre, en diferentes especies terrestres representadas por humanos, ratones, terneros o loros. (Mallory, 1911; Boyd yLatimer, 2001; Yamada y cols., 2002; Li y cols., 2003). En relación al sexo de los animales que presentan glóbulos, no se observó una diferencia significativa en los casos del presente estudio (50 machos, 45 hembras y 5 de sexo no determinado), parámetro que si parece condicionar su presencia en animales terrestres, en los que existe una mayor tendencia a su aparición en machos de ratones (Li y cols., 2003). Respecto al parámetro de edad, de los 115 cetáceos, 57 fueron animales adultos, 8 subadultos, 18 juveniles, 14 crías, 1 neonato y en 17, no se determinó la edad. El Discusión 261 número de glóbulos fue más evidente en los animales adultos y subadultos en relación al resto de edades. Si bien adultos y subadultos, en condiciones normales, tienen una mayor capacidad de respuesta hepática (Guyton y Hall, 1997), ésta se encontraría condicionada al estado nutricional / corporal y sanitario de los animales varados, lo que luego discutiremos. Sin embargo, hemos de destacar que en todas las edades, fue posible observar este tipo de alteración, incluso en animales neonatos, lo que reflejaría que cetáceos varados de cualquier edad tendría la capacidad de activar de los mecanismos conducentes a la formación de estos glóbulos hialinos. Teniendo en cuenta el estado corporal/nutricional de los animales en el presente estudio, se observó que los cetáceos con un pobre estado corporal, mostraron una menor cantidad de glóbulos, comparativamente con aquellos, que sí poseían un buen estado nutricional. Esto podría ser atribuido a la menor capacidad orgánica de producir proteínas, especialmente a nivel hepático, de los animales que se encuentran en un estado de malnutrición general (Guyton y Hall, 997). Los valores de albúmina y consecuentemente, la proporción albúmina/globulina son altos en cetáceos comparados con los animales domésticos (Dierauf and Gulland, 2001). Es bien conocido que, en casos de caquexia o de marcada malnutrición, la producción de proteínas se ve alterada. En esa situación las PFA positivas (entre ellas, el FB y A1AT) aumentan, mientras que las PFA negativas (p.e., albúmina) disminuyen (Barber y cols., 2004). Discusión 262 8.2.1 Varamiento activo (encontrados vivos) versus Varamiento pasivo (encontrados muertos). Del 82,6% (95 de 115 cetáceos) que presentaron glóbulos hialinos intracitoplasmáticos, el 46,3% (44 de 95 cetáceos) se observó que vararon vivos. Nuestro trabajo indica que la gran mayoría de los animales identificados como varados vivos presentaron una congestión hepática, de moderada a severa, asociada a diferentes cantidades de glóbulos hialinos. En estos casos, hemos podido observar que a mayor congestión, mayor número y tamaño de glóbulos en los hepatocitos, lo que claramente relaciona ambos cambios, glóbulos hialinos y fenómeno hemodinámico intrahepático, caracterizado por la congestión sinusoidal de diferente grado. Por otra parte, el 53,7%, (51 cetáceos) que se registraron como varados muertos, y mostraron congestión hepática, es altamente probable, que un número indeterminado de estos, pudieran haber varado vivo y morir posteriormente, lo que se deduce de las evidencias lesionales erosivas, lacerantes y ulcerativas en la piel de la cabeza y el cuerpo características de animales varados vivos (Arbelo, 2007). Como mecanismos que puedan explicar la morfogénesis de los glóbulos hialinos relacionados con el varamiento activo, podemos considerar las siguientes circunstancias: - (1) primera, los cetáceos son animales anatómica y fisiológicamente adaptados al medio marino y no, a estar apoyados largos periodos sobre superficies firmes, con la consiguiente compresión corporal. Discusión 263 - (2) segunda, el varamiento se asocia íntimamente al Síndrome de Estrés de Varamiento (SEV); - (3) tercera, las condiciones individuales previas o adquiridas durante el varamiento de cada animal varado (especie, edad, estado nutricional/corporal, sanitario) pueden participar en este proceso de formación de glóbulos hialinos. (1) La compresión corporal durante el varamiento activo, disminuye la circulación venosa de retorno, favoreciendo la congestión abdominal y por tanto, el aumento de la presión sanguínea intrasinusoidal, por lo que es posible, que los hepatocitos puedan, al menos parcialmente, facilitar el paso de plasma a los espacios de Disse, contribuyendo a la formación de vacuolas en hepatocitos de ratones (Li y cols., 2003). Esta compresión venosa en ratones, da lugar a la formación de glóbulos dentro de las 3-6 horas, pero tras la descompresión, ya, a las 24 horas se observan muy pocos glóbulos (Shibayama y cols., 2009), lo que confirma la reversibilidad del proceso. En humanos también ha sido descrita la presencia de glóbulos asociada a congestión pasiva en individuos muertos por compresión tras derrumbamiento (Saukko, 2004). Estos y otros estudios experimentales, ponen en evidencia la importancia de los trastornos hemodinámicos en la aparición de glóbulos, asociados al aumento de presión en la vena cauda inferior (Shibayama y cols., 1991) y consiguiente inducción de congestión hepática. Discusión 264 (2) Una vez que se produce el varamiento, debemos considerar los mecanismos que se activan para mantener la hemostasia corporal durante el Síndrome de Estrés de Varamiento (Arbelo, 2007). Durante este estado de choque se produce un fenómeno de vasoconstricción periférica, lo que produce una hipoxia local en algunos órganos, al tiempo que mantiene la irrigación de órganos vitales como el cerebro y el corazón (Cowan y Curry, 2008). Si estos mecanismos persisten, la congestión venosa mencionada, junto a la vasoconstricción arterial periférica provocaran una hipoxia isquémica en distintos órganos, lo que pensamos ocurre en el hígado de los cetáceos varados. Simultáneamente, y adicionalmente a estos cambios hemodinámicos, es frecuente el desarrollo de hipertermia o estrés térmico durante el varamiento, que estimula los mecanismos defensivos inespecíficos agudos del organismo, como es la producción de proteínas de fase aguda o de estrés (Lei y cols., 2009) que tienen en el hígado su principal productor, lo que, en nuestros casos, se vería reflejado morfológicamente con la aparición de los glóbulos hialinos. (3) Y en tercer lugar, las condiciones de salud de los animales varados también participarían en la morfogénesis de los glóbulos hialinos. Así, se ha descrito, que en casos de septicemia, el hígado aumenta la producción de proteínas de fase aguda positivas, como el FB y la A1AT, así como otros factores de coagulación (Dhainaut y cols., 2001). En este sentido, en el presente trabajo hemos intentado correlacionar el varamiento y las entidades patológicas presentes en estos cetáceos con la presencia o Discusión 265 ausencia de glóbulos hialinos, así como en lo relativo a la composición de los mismos en lo que a las proteínas como la Alb, FB y A1AT se refiere. De los 95 cetáceos con glóbulos hialinos intracitoplasmáticos en hígado, un 89,9%, 96,8%, 53,7% y fueron positivos frente a anticuerpos para la detección de Albúmina, FB y A1AT, respectivamente. La Albúmina sérica es la proteína más abundante en el plasma de mamíferos. Es una proteína formada por un polipéptido y, en casos de mutaciones, puede presentar dominios glicosilados (Kragh-Hansen y cols., 2001; Sugio y cols., 1999). Los mamíferos marinos, así como los animales terrestres, parecen tener un importante capacidad de producción de albúmina hepática, por lo que la albúmina no destaca como un marcador de enfermedad hepática (Dierauf and Gulland, 2001). No obstante, en casos de deshidratación y choque se produce un elevado nivel de albúmina en sangre, fenómenos que participan en el Síndrome de Estrés de Varamiento (Arbelo, 2007). En cambio, esta disminuye en casos de malnutrición, neuropatías, enfermedades entéricas crónicas y enfermedades hepáticas crónicas o graves (Barner y cols., 2004). En contraposición, las alfa-globulinas, entre la que se encuentran la haptoglobulina, lipoproteínas y la antitripsina, son importante marcadores de enfermedad inflamatoria aguda en algunos mamíferos marinos, de forma que se pueden encontrar elevadas en Discusión 266 enfermedades inflamatorias e infecciosas, incluso, antes de la aparición de signos clinico-patológicos (Dierauf and Gulland, 2001). Estas referencias se pudieron comprobar al utilizar las técnicas inmunohistoquímicas que demostraron, al menos, la presencia de dos glicoproteínas (FB y A1AT), a su vez clasificadas como proteínas de fase aguda (PFA) (Pareiente y cols., 1981; Abukawa y cols., 2001), como respuesta hepática en situaciones de estrés y enfermedad. Este tipo de reacciones defensivas inespecíficas es muy amplia, y el número de PFA es muy numeroso (Whicher y cols., 1989), por lo que es muy probable, que otras PFA, también se encuentren formando parte de estos glóbulos hialinos. 92 de 95 cetáceos con glóbulos fueron positivos a la técnica inmunohistoquímica para la detección de FB. Los glóbulos hialinos se tiñeron positivamente, tanto de forma homogénea como granular. El tamaño de los glóbulos fue muy variable y la mayoría, se localizaron en las áreas centrolobulillares más congestivas, lo que claramente parece estar relacionado con cambios hemodinámicos que hemos indicado anteriormente (Klatt y cols., 1988). En este trabajo, el 97,7% de los cetáceos varados vivos con glóbulos fueron positivos para el FB. Dado que el varamiento activo conlleva a alteraciones circulatorias y choque térmico, es de prever que se produzcan los fenómenos apuntados anteriormente de aumento de las PFA positivas (Soulsbury y cols., 2008), lo que favorece la aparición de glóbulos conteniendo fibrinógeno. Discusión 273 producidos por las catecolaminas y las consecuencias del Síndrome de miopatía de captura (Siebert y cols., 2006; Soulsbury y cols., 2008), pueden jugar un papel esencial en la muerte de estos animales, pero hemos de destacar aquí los cambios hemodinámicos y de hipoxia que se producen durante ésta fase de estrés, una vez se instaura la vasoconstricción periférica durante un choque aguado, que tiene como objetivo el mantener activos los órganos vitales del cerebro y el corazón, en detrimento de otros órganos (Cowan y Curry, 2008), entre los que se encontraría el hígado. Entre otros resultados con un cierto interés, hemos de destacar que todos los glóbulos presentaron una reacción inmunohistoquímica negativa a las citoqueratinas, por lo que en este caso podemos identificar una diferencia proteica respecto a los cuerpos de Mallory Bodies, que si la almacenan (Zatloukal y cols., 2007). Igualmente, la ubiquitina (resultados no presentados) tampoco se detectó en los cetáceos de estudio. Esta proteína forma parte de los Cuerpos de Mallory y de los Cuerpos Hialinos Intracitoplasmáticos (Denk y cols., 2006; Stumptner y cols., 2006; Zatloukal y cols., 2007; Hanada y cols., 2008), lo que establece, con respecto a su naturaleza y posible morfogénesis, ninguna similitud con glóbulos hialinos intrahepatocíticos en cetáceos. 8.2.3 “pink point” (PPs) Estas estructuras “puntiformes” también fueron descritas previamente en cetáceos (Kennedy y cols., 1993; Jaber y cols., 2004). Lo más semejante a estas estructuras Discusión 274 podrían ser los glóbulos hialinos de fibrinógeno tipo III, en los que se describe un “núcleo” en el centro de los glóbulos (Simsek y cols., 2005), o los Mallory Bodies tipo III formados por material granular electro-denso, rodeado por filamentos tipo II (Denk y cols., 2006). No obstante, su descripción más pormenorizada aparece en humanos con deficiencia cardiaca (Underwood, 1972) y ratones por fenómenos de autolisis (Li y cols., 2003), siendo su significado desconocido. Los resultados positivos de los “pink point” al tricrómico, con una fuerte intensidad de tinción rojo refringente, es compatible con megamitocondrias (Junge, 1980) Pero, el estudio con microscopía electrónica descartó esta posibilidad, dada la ausencia de semejanza con organelas (Underwood, 1972). De los resultados obtenidos por las diversas técnicas histoquímicas fue posible confirmar que los “pink point” son estructuras compuestas por sustancias glicosiladas, que aparecen tanto en glóbulos con FB como con A1AT. No obstante, las pruebas realizadas con lectinas han dado negativas, por lo que se concluye que el tipo de glicolisación es diferente a las analizadas en este trabajo.En nuestra opinión, estas microestructuras glicosiladas serian parte de los mecanismos de agregación proteica (Kopito, 2000). 8.3 Microscopía Electrónica De los estudios ultraestructurales realizados, tanto en las muestras de cetáceos varados en las Islas Canarias, como de las marsopas atrapadas en redes de pesca, se Discusión 275 observó la existencia de glóbulos con algunas diferencias morfológicas ultraestructurales. En este trabajo hemos observado estructuras globulares de diferente tamaño, que llegan incluso a desplazar el núcleo hacia la periferia de la célula; algunas veces, con más de un glóbulo con diferentes morfologías. Se han observado glóbulos de contenido moderadamente electrodenso, granular fino, sin la presencia de membrana delimitante, y rodeado por organelas. Se han observado otros, incluso en el mismo animal, de contenido menos electrodenso, de forma oval y membrana delimitante, mientras que otros, presentaron un contenido granular disperso, igualmente con delimitación membranosa. Los glóbulos hialinos asociados a diversas patologías, en los que se han realizado estudios ultraestructurales describen, que la mayoría poseen un contenido filamentoso (Denk y cols., 2006). En nuestro estudio, solo se ha observado contenido granular, pero el estado de conservación de las muestras puede haber distorsionado la verdadera ultraestructura de los mismos. Sin embargo, es conocido que en los casos de mala conformación de A1AT, los glóbulos en el citoplasma de la célula están rodeados por una membrana (Granell y cols., 2008); así como ocurre también con los globulos de FB (Simsek y cols., 2005). En este trabajo hemos observado glóbulos sin y con membrana, lo que nos indica la existencia de posibles mecanismos distintos de morfogénesis globular; así como con seguridad, la existencia de contenido globular, hasta el momento, desconocido. Discusión 276 Esta características morfológicas ultraestructurales necesitarán de estudios posteriores adicionales, ya que, está descrito que el 30% de las proteínas recién sintetizadas están mal conformadas y pueden quedar retenidas en el Retículo Endoplasmático (Ji, 2008). Según esto, podríamos hipotetizar con la participación de este fenómeno en la morfogénesis de glóbulos hialinos observados en cetáceos varados, en concreto, en aquellos, en los que hemos detectado estructuras membranosas formando parte de los glóbulos. 8.4 Análisis Complementarios Con el objetivo de complementar los estudios morfológicos e inmunohistoquímicos en la presente tesis doctoral, y con la finalidad de profundizar en la formación metodológica de la doctorando y contribuir a la apertura de nuevas vías de investigación en estas especies marinas aún bastante desconocidas, se llevarán a cabo en un reducido grupo de cetáceos varados análisis de glicobiología y proteómica. 8.4.1 Glicobiología El estudio de los carbohidratos permite conocer con mayor especificidad los diferentes mecanismos metabólicos celulares (Varki y cols., 1999). Por ejemplo, se conoce, que la A1AT mal conformada necesita de la alteración de una manosa para modificar la estructura de carbohidratos y poder ser reconocida para su degradación (Hosokawa y cols., 2003). Discusión 277 En este trabajo hemos utilizado las lectinas para la identificación de estructuras de carbohitrados, dado que aquellas constituyen son un grupo de proteínas y glicoproteínas con capacidad de conectarse a cadenas de azucares (McMillan y cols., 1988). En casos de estrés e hipoxia isquémica, hay un aumento de glucosa, lo que contribuye a la síntesis de O-GlcNac (O-link β-N-acetylglucosamine) (Chatham y Marchase, 2009). En ratones fue demostrado que este tipo de glicosilación ayuda a la preservación de las mitocondrias disminuyendo la muerte celular (Jones y cols., 2008). Por otro lado, la O-GlcNac también aumenta la termotolerancia, aumentando sus niveles antes que ocurra el aumento de la síntesis de HSPs (Sohn y cols., 2004). Esto condiciona la regulación de HSPs, particularmente con la HSP90 y otras proteínas inducidas por estrés, favoreciendo la estabilización de algunas proteínas y evitando su agregación (Zachara y cols., 2004), En nuestro estudio hemos utilizado la lectina (WGA) para detección de GlcNac, que participa en mecanismos anti-estrés (Housley y cols., 2008). Los glóbulos hialinos fueron negativos para esta lectina. Sin embargo, la misma se detectó en el citoplasma de hepatocitos con glóbulos, especialmente en una marsopa muerta por atropamiento en redes de pesca. Esto se puede interpretar como una respuesta celular frente a una situación de estrés, como fue la captura en redes de pesca. Este resultado complementa afirmativamente los resultados e interpretaciones, que con relación a situaciones de estrés, se expusieron previamente, en este apartado de discusión Discusión 278 De los resultados obtenidos y teniendo en cuenta las glicosilaciones conocidas para el FB, era de esperar que los glóbulos fueran positivos a la SNA, pero negativos a la PHA-E (L`Hote y cols., 1995). No obstante, se verificó que 8 de 15 animales estudiados, presentaron valores positivos a la SNA y 13 a la PHA-E. Esto significa que los 7 animales negativos a la SNA podrían estar expresando solamente la cadena α del FB, en base al tipo de glicosilación. Como conclusión preliminar de estos análisis con técnicas de glicobiología se podría postular, que en cetáceos, la glicosilación de las distintas cadenas proteicas de FB como de A1AT, pueda ser diferente a la conocida en otros mamíferos y/o que estas estén modificadas por factores metabólicos. Esta pregunta podría aclararse en el futuro, mediante la identificación de cadenas de azucares en el FB de y A1AT en cetáceos. 8.4.2 Proteómica En el hígado de mamíferos un 74% de las proteínas son de membrana y solamente, el 11% corresponden a proteínas de citosol. En nuestro trabajo, la mayoría de las proteínas identificadas pertenecían al citosol y a organelas (Lee y cols., 2008). La Carbamoyl-phosphate synthetase 1 es una enzima mitocondrial que suele estar aumentada en casos de septicemia, lo que se confirmó en nuestro estudio. Cuando se detecta en suero es señal de daño mitocondrial, y consecuentemente, celular (Elliot y cols., 2006). Discusión 279 Una de las proteínas con mayor relieve para este estudio es la endoplasmina, también denominada HSP90, por estar directamente relacionada con situaciones de estrés celular, como el estrés oxidativo, y asociado normalmente al estrés térmico (Spees y col., 2002). Esta proteína se identificó por espectrometría de masas en nuestro estudio, y estaría relacionada con cetáceos varados vivos, expuestos a temperatura ambiental que, en las Islas Canarias, es superior a la temperatura del mar. Debemos considera que la hipertermia es uno de los signos clínicos que participa del Síndrome de Estrés de Varamiento (Arbelo, 2007). Igualmente, en este estudio se han identificado dos tipos de proteína disulfito isomeraza (PDI). De ellas, la proteína disulfito isomeraza-asociada 3, es una de las proteínas de estrés pertenecientes al RE que actúa en los casos de estrés oxidativo (Huang y cols., 2009). Estas proteínas pertenecen a una familia de isomerazas y la A1AT ha sido identificada como uno de los sustratos para estas enzimas (Horibe y cols., 2004). También se identificó calreticulina (AG 4) que es una proteína soluble del RE (Ellgaard y Helenius, 2001). Esta proteína actúa a través de conexiones a proteínas con problemas de conformación o que tienen que ser degradadas (tal como la A1AT) (Horibe y cols., 2004; Wickner y cols., 1999; Ellgaard y Helenius, 2001). Ambos resultados corroboran la presencia abundante de A1AT en los glóbulos hialinos de los cetáceos varados y confirma, que los hepatocitos de cetáceos se comportarían de forma similar a otras especies que muestran agregación de esta PFA (Horibe y cols., 2004; Wickner y cols., 1999; Ellgaard y Helenius, 2001). Discusión 280 Estos resultados complementarios obtenidos con técnicas de glicobiología y proteómica, confirman la relación de los glóbulos hialinos y las PFA con situaciones de estrés, enfermedad y protección celular, lo que abre nuevas vías de investigación en cetáceos silvestres, especies ubicadas en lo mas alto de la cadena trófica y verdaderos bioindicadores del estrés medioambiental marino. Conclusiones 281 9 . Conclusiones Conclusões Conclusiones 283 1. Se demostró que los anticuerpos anti-Albumina, anti-Fibrinógeno (FB) y antiAlfa-1-Antitrípsina (A1AT) humanos, reaccionan cruzada y específicamente, con las correspondientes proteínas de cetáceos, a demostrar inmunohistoquímicamente en tejidos fijados en formol tamponado al 4% e incluidos en parafina. 2. Las muestras de hígados procedentes de cetáceos con una grado moderado o superior de conservación / autolisis (grado 3, 4 y 5) y aquellas precongeladas procedentes de animales frescos (grado 1 o 2) deben ser descartadas para estudios de detección inmunohistoquímica de proteínas de fase aguda (PFA), específicamente, FB y A1AT. 3. De 115 cetáceos varados pertenecientes a 16 especies diferentes de ballenas y delfines, el 82,6% (95) mostraron glóbulos hialinos intracitoplasmáticos y un 17,4% (20) no presentaron este cambio morfológico. El 95,0% (90 de 95) de las muestras con glóbulos se asociaron a congestión hepática aguda/subaguda y mayoritariamente, al varamiento activo de los cetáceos. 4. Como mecanismos que pudieran explicar la morfogénesis de los glóbulos hialinos durante el varamiento activo, y que participarían individual o sinérgicamente hemos considerado los siguientes: 1) Cambios hemodinámicos representados por la congestión intrasinusoidal. 2) Mecanismos locales y/o sistémicos asociados al Síndrome de Estrés de Varamiento (principalmente, hipertermia e hipoxia isquémica derivada de una vasoconstricción periférica). 3) Bibliografía 291 Abbas A., Lichtman A. (2004). Inmunología celular y molecular: Citocinas. 5ª Ed, (243-317). Madrid. Elsevier España. Abe K, Shimoda T, Shikata T. (1980). Cytoplasmic blood plasma inclusions of canine hepatocytes demonstration by immunoperoxidase-labeling method. Am J Vet Res, issue of September ;41(9):1507–11. 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