Alteraciones genéticas y epigenéticas en el cáncer de endometrio

DEPARTAMENTODEBIOQUÍMICAYBIOLOGÍAMOLECULAR, FISIOLOGÍA,GENÉTICAEINMUNOLOGÍA UNIVERSIDADDELASPALMASDEGRANCANARIA PROGRAMADEDOCTORADO CÁNCER:BIOLOGÍAYCLÍNICA Alteracionesgenéticasyepigenéticas enelcáncerdeendometrio Memor OCTORiaparaoptaralgradodeD RaquelRamírezMoreno Fdo.ElDirector LasPalmasdeGranCanariaa2 deSeptiembrede2010 Fdo.ElDoctorando RaquelRamírezMoreno Fdo.ElDirector Fco.GermánRguezGonzález Fdo.ElDirector JuanCarlosDíazChico B.NicolásDíazChico D. JUAN CARLOS DÍAZ CHICO, PROFESOR TITULAR DE BIOQUÍMICA DEL DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR, FISIOLOGÍA, GENÉTICA E INMUNOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA. CERTIFICA, Que Dª. Raquel Ramírez Moreno, licenciada en Biología, ha realizado bajo mi dirección y asesoramiento el trabajo de investigación titulado: “ALTERACIONES GENÉTICAS Y EPIGENÉTICAS EN EL CÁNCER DE ENDOMETRIO” Una vez revisada la presente memoria, la encuentra apta para su defensa ante el tribunal para la obtención del título de Doctor, mención Doctor Europeo, por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. Y para que así conste y surta los efectos oportunos, extiende la presente certificación en Las Palmas de Gran Canaria a 2 de Septiembre de 2010. Fdo. D. Juan Carlos Díaz Chico D. B. NICOLÁS DÍAZ CHICO, CATEDRÁTICO DE FISIOLOGÍA DEL DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR, FISIOLOGÍA, GENÉTICA E INMUNOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA. CERTIFICA, Que Dª. Raquel Ramírez Moreno, licenciada en Biología, ha realizado bajo mi dirección y asesoramiento el trabajo de investigación titulado: “ALTERACIONES GENÉTICAS Y EPIGENÉTICAS EN EL CÁNCER DE ENDOMETRIO” Una vez revisada la presente memoria, la encuentra apta para su defensa ante el tribunal para la obtención del título de Doctor, mención Doctor Europeo, por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. Y para que así conste y surta los efectos oportunos, extiende la presente certificación en Las Palmas de Gran Canaria a 2 de Septiembre de 2010. Fdo. D.B. Nicolás Díaz Chico D. Fco. GERMÁN RODRÍGUEZ GONZÁLEZ, POSTDOCTORAL RESEARCHER. MEDICAL ONCOLOGY DEPARTMENT. JOSEPHINE NEFKENS INSTITUTE, ERASMUS MEDICAL CENTER, ROTTERDAM. CERTIFICA, Que Dª. Raquel Ramírez Moreno, licenciada en Biología, ha realizado bajo mi dirección y asesoramiento el trabajo de investigación titulado: “ALTERACIONES GENÉTICAS Y EPIGENÉTICAS EN EL CÁNCER DE ENDOMETRIO” Una vez revisada la presente memoria, la encuentra apta para su defensa ante el tribunal para la obtención del título de Doctor, mención Doctor Europeo, por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. Y para que así conste y surta los efectos oportunos, extiende la presente certificación en Rotterdam a 2 de Septiembre de 2010. Fdo. D. Fco. Germán Rodríguez González Alteracionesgenéticasyepigenéticas enelcáncerdeendometrio RaquelRamírezMoreno LasPalmasdeGranCanaria,2010 UNIVERSIDADDELASPALMASDEGRANCANARIA  Índice Capítulo 1 Introducción General 17 1. El Endometrio: anatomía, morfología y función 19 2. El carcinoma de endometrio 23 2.1 Epidemiología y etiología 23 2.2 Factores de riesgo 24 2.3 Factores pronóstico y tratamiento 25 3. Bases moleculares del carcinoma endometrial 29 3.1 Principales alteraciones moleculares 29 3.2 La inestabilidad microsatélite (MSI) 30 3.3 La inestabilidad cromosómica (CIN) 33 3.4 Alteraciones de los genes PTEN, PI3K, KRAS y P53 34 4. La ruta de señalización celular Wnt en el carcinoma endometrial 39 4.1 Generalidades 39 4.2 Alteraciones de los genes β-Catenina, APC y E-Cadherina 41 5. Referencias 44 Capítulo 2 Planteamiento y objetivos 55 Capítulo 3 Alta incidencia de mutaciones del gen EPHB2 en tumores gástricos pero no en los de endometrio con inestabilidad de microsatélites Oncogene. 2007 Jan 11; 26 (2):308-11 59 I   II  Capítulo 4 Los genes reparadores de roturas en la doble cadena del ADN son frecuentes dianas de la inestabilidad de microsatélites en el cáncer de endometrio Eur J Cancer. 2010 Jul 16. [Epub ahead of print]. 69 Capítulo 5 El silenciamiento epigenético del gen EPHB4 es un posible marcador pronóstico en cáncer de endometrio 87 Capítulo 6 La metilación conjunta de los genes SFRP1, 2 y 5 está asociada con una peor evolución clínica de las pacientes con cáncer de endometrio 103 Capítulo 7 La metilación del gen PITX2 es un marcador de peor pronóstico en los tumores de endometrio con un contenido diploide de ADN 123 Capítulo 8 Abstract in English 139 Capítulo 9 Conclusiones/Conclusions 147 Anexos I. Información suplementaria I II. Curriculum Vitae III III. Financiación VI IV. Agradecimientos/Acknowledgements VII  Capítulo1 Capítulo1 Introduccióngeneral    Capítulo1  Capítulo1 las glándulas suprarrenales y en el tejido adiposo, como consecuencia de la actividad aromatasa que transforma los andrógenos en estradiol (12). Así, una dieta rica en grasas animales, la falta de ejercicio físico y el sobrepeso aumentan entre 2 y 10 veces el riesgo de padecer esta enfermedad. Otros factores, asociados con la obesidad, como la hipertensión y la diabetes, lo elevan 1,5 y 3 veces respectivamente. La menarquia temprana en combinación con una menopausia tardía, y la nuliparidad favorecen, también, el desarrollo del tumor por la prolongada exposición a los estrógenos durante la edad reproductiva de la mujer. La mitad de los CE debutan en pacientes que no han estado embarazadas, y su riesgo relativo es mayor de 2 si se acompaña de infertilidad. La anovulación hace que el endometrio esté menos expuesto al efecto de la progesterona, permaneciendo en un estado proliferativo con niveles máximos de estrógenos (13, 14). Otro factor de riesgo es la administración exógena de sustancias con actividad estrogénica. Como ejemplos, los tratamientos hormonales sustitutivos prescritos a las mujeres perimenopaúsicas (a base de estrógenos sin progestágenos), o el Tamoxifeno usado como tratamiento adyuvante en cáncer de mama que ejercen, ambos, una acción proliferativa en el endometrio (6, 7, 15). Las hiperplasias endometriales, el síndrome de ovarios poliquísticos y factores hereditarios como el síndrome de Linch, también pueden contribuir a elevar el riesgo de una mujer a desarrollar esta enfermedad (16, 17). Para los CE de Tipo II, no asociados a una historia de hiperestrogenismo, no existen factores de riesgo definidos (3). 2.3 Factores pronósticos y tratamiento En cáncer, las características clínico-patológicas y biológicas del tumor son usadas como factor pronóstico porque aportan información precisa acerca del comportamiento clínico de la paciente. Así es posible la identificación de grupos de alto riesgo y evita los tratamientos adyuvantes innecesarios en pacientes de buen pronóstico. Los factores a los que clásicamente se le ha dado un valor pronósticos en 25   Capítulo1 CE son: el estadiaje, la edad, el tipo histológico, el grado de diferenciación tumoral y la invasión miometrial, vascular y linfática (3). El estadiaje del CE es quirúrgico de acuerdo con las recomendaciones de la FIGO (Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia, 1988) (18, 19). Los carcinomas, según esta clasificación, se dividen en cuatro estadios: (I) tumor limitado al cuerpo uterino, (II) extensión del tumor a la cérvix, (III) extensión a los órganos pélvicos y (IV) extensión más allá de los órganos pélvicos. Además, cada uno de ellos se divide en subestadios (Tabla 2). El estadio varía el pronóstico del tumor, con una supervivencia a los 5 años de aproximadamente: 83% para el estadio I, 73% para el estadio II, 52% para el estadio III y 27% para el estadio IV. Afortunadamente, el 80% de todos los CE están confinados al útero en el momento del diagnóstico (20). Tabla 2. Clasificación FIGO ( 1988 ) . Estadia j e q uirúr g icop atoló g ico de los CE Estadio Características IA G123 tumor limitado al endometrio. IB G123 invasión menor de 50% del miometrio IC G123 invasión ma y or de 50% del miometrio IIA G123 com p licación g landular endocervical solamente IIB G123 invasión estromática cervical IIIA G123 el tumor invade la serosa o anexos o citolo g ía p eritoneal p ositiva IIIB G123 metástasis va g inales IIIC G123 metástasis a g an g lios linfáticos p élvicos o p araaórticos IVA G123 invasión tumoral de la mucosa vesical o intestinal o de ambas IVB G123 metástasis a distancia incluso a g an g lios linfáticos intraabdominales o in g uinales o a ambos Conjuntamente con el estadio, uno de los indicadores más sensibles de la diseminación tumoral es el grado de diferenciación histológico. La FIGO establece tres grados (G1: diferenciados, G2: moderadamente diferenciados, G3: Indiferenciados), basándose en la extensión del tumor y las características nucleares, como el tamaño y forma del núcleo, distribución de la cromatina, el tamaño de los nucléolos y el nivel mitótico (18, 19). 26   Capítulo1 A medida que el tumor pierde su diferenciación y aumenta el grado, hay una tendencia mayor a una invasión miometrial profunda, riesgo de diseminación abdominal y afectación de los ganglios pélvicos-paraaórticos, reduciéndose considerablemente las probabilidades de supervivencia. A los 5 años, las pacientes con tumores G1 muestran un 94% de supervivencia libre de enfermedad, 84% para el G2 y un 72% para el G3. La mitad de las lesiones con G3 muestran una invasión miometrial mayor del 50%, y el 20-30% metastatizan los nódulos linfáticos. La mayoría de los carcinomas endometrioides son bien o moderadamente diferenciados, mientras los no endometrioides son indiferenciados (21-25). En función del tipo celular presente en el área tumoral se define el tipo histológico. Los tipos histológicos de alto riesgo, son los no endometrioides, principalmente los tumores serosos, de células claras y escamosas, los indiferenciados y algunas variedades mixtas. La supervivencia global de este grupo de tumores, poco frecuentes, es menor del 35% independientemente del estadio (26). Otros factores pronóstico son la profundidad de infiltración del miometrio y la invasión vascular, capaces de predecir una mayor probabilidad de metástasis ganglionar, fracaso en el tratamiento, recidiva y menor supervivencia. Los CE se dividen, en función de la profundidad de infiltración, en menor o mayor al 50% de infiltración miometrial. La afectación de los ganglios pélvicos-paraaórticos constituye también, un factor pronóstico importante, relacionado con el estadio, grado e infiltración miometrial de los tumores (20, 27-32). Diversos trabajos publicados han descrito la importancia de la determinación de los niveles de receptores de estrógenos y progesterona como marcador pronóstico significativo. La disminución en la expresión de estos receptores se asocia con una peor evolución clínica de las pacientes con CE (33, 34). El tratamiento de las pacientes con CE es inicialmente con cirugía (histerectomía total y salpingo-ooforectomía bilateral), mientras que el postoperatorio toma en cuenta el estadiaje quirúrgico. Las pacientes son clasificadas en tres categorías: aquellas con alta probabilidad de cura sin terapia post-operatoria (riesgo bajo), las que tienen una reducida tasa de cura quirúrgica pero que pueden, o no, beneficiarse de una terapia adicional (riesgo intermedio) y las de alto riesgo, con 27   Capítulo1 muy pocas probabilidades de cura sin terapia post-operatoria (Tabla 3) (35). Ensayos clínicos en curso estudian la respuesta a tratamientos de radioterapia, quimioterapia y hormonoterapia en pacientes con diferentes estadios de CE (36, 37). Riesgo Estadio Tratamiento post-operatorio Bajo IA G1 2 Ninguno IA G3 IB G1 2 3 IC G1 2 3 IIA G1 2 3 IIB G1 2 3 IIIA G1 2 3 IIIB G1 2 3 IIIC G1 2 3 IVA G1 2 3 IVB G1 2 3 Intermedio Alto Tabla 3. Tratamiento post-operatorio de las pacientes se g ún los g ru p os de ries g o de recidiva Radiación vaginal (posible radiación pélvica y abdominal vs. Quimioterapia) Radiación vaginal, pélvica, para-aórtica y abdominal 28   Capítulo1 3. Bases moleculares del carcinoma endometrial El desarrollo y progresión tumoral es consecuencia de la adquisición de diversas alteraciones que incluyen activación de oncogenes e inactivación de genes supresores de tumores y un incremento de la inestabilidad genética. El estudio de estas alteraciones moleculares ha permitido ampliar los conocimientos acerca de la tumorigénesis y reforzar los subgrupos clínico-patológicos, originalmente definidos por rasgos morfológicos y clínicos. 3.1 Principales alteraciones moleculares Diversos estudios moleculares apoyan el modelo dual, propuesto por J. Brokhman, para la carcinogénesis endometrial (38-42). En los tumores endometrioides es frecuente observar inestabilidad de microsatélites (MSI), abundancia de receptores de estrógenos y progesterona, mutaciones activantes en los oncogenes KRAS y β-Catenina y mutaciones inactivantes en el gen supresor PTEN. En cambio, los no endometrioides son, en su mayor parte, aneuploides lo que indica la presencia de inestabilidad cromosómica (CIN), que va acompañada de altos niveles del receptor Her2/neu, mutaciones inactivantes del gen supresor de tumores P53, reducción de la expresión del gen E-Cadherina y, con frecuencia, bajo contenido de receptores de estrógenos y/o progesterona (43-45) (Tabla 4). Así pues, las alteraciones moleculares implicadas en el desarrollo de ambos tipos tumorales difieren significativamente. Sin embargo, la existencia de tumores que muestran características morfológicas, inmunológicas y moleculares solapadas, junto con la detección de MSI en tumores no endometrioides y la falta de correlación inversa entre P53 y MSI, descritas en la literatura, contradicen este modelo (39, 40, 42, 46). Matias-Guiu y col. sugieren que los tumores de tipo no endometrioide pueden desarrollarse a partir de dos vías: 1) de novo a partir de un estado CIN, con pérdidas de heterocigocidad en numerosos loci, mutaciones inactivantes en el gen P53 y otras alteraciones aún por determinar; 2) a partir de la desdiferenciación de un CE endometrioide preexistente. Esto explicaría la existencia 29   Capítulo1 de CE con características mixtas y la presencia de alteraciones típicas de tumores de tipo endometrioide en los CE no endometrioides (40). Tabla 4. Princi p ales alteraciones moleculares de los CE Características Tipo I Tipo II Niveles de RE y RP Altos Bajos Sobre-expresión de HER2/neu <2% 18-80% Instabilidad microsatélite (MSI) 20-40% <5% Ploidía ≥75% Diploides ≥50% Aneuploides Pérdida de Heterocigocidad (LOH) Baja Alta Mutaciones inactivantes del PTEN 35-50% 10% Mutaciones inactivantes del P53 <20% 90% Mutaciones activantes del KRAS 10-30% <5% Mutaciones activantes de β-Catenina 25-40% <5% Reducida expresión de E-Cadherina 22-43% >75% 3.2 Inestabilidad microsatélite (MSI) Las secuencias microsatélites son repeticiones cortas, de no más de 150 bases, dispersas a lo largo de todo el genoma. Contienen unidades mínimas repetidas de una, dos, tres, y hasta seis bases. Durante la replicación del ADN, debido al apareamiento erróneo de las hebras (fenómeno conocido como slippage) se generan inserciones y/o deleciones en estas regiones. Sin embargo, la actividad correctora de la ADN polimerasa junto con el sistema MMR (reparador de apareamientos incorrectos o mismatch repair) permiten a la célula mantener estable su material genético. Los genes del sistema MMR, hasta ahora identificados en mamíferos, son: MLH1/3, PMS1/2, MSH2/3/4/5 y 6. Éstos interactúan formando complejos y heterodímeros que median en las distintas funciones de reparación. Defectos en el sistema MMR generan en la célula el fenotipo mutador de microsatélites o MSI, caracterizado por la progresiva acumulación de miles de mutaciones en las secuencias repetidas (47-49). 30   Capítulo1 Aunque el MSI fue inicialmente descubierto en pacientes con HNPCC o síndrome de Linch, está presente en un porcentaje de tumores esporádicos (47, 50, 51). Las pacientes con HNPCC tienen mutaciones germinales en los genes del sistema MMR, frecuentemente MLH1y MSH2. En estas pacientes, con un alelo defectuoso, la mutación del alelo sano inactivaría definitivamente el gen reparador. Lo que originaría un defecto en el sistema de reparación del ADN que aceleraría la adquisición de MSI. De esta manera el genoma se inundaría de mutaciones en los tractos repetidos, incluidos aquellos localizados en las secuencias codificantes de genes del cáncer (oncogenes y genes supresores). En estos casos, la alteración provoca un cambio en la pauta de lectura de la proteína (mutaciones frameshift) que da como resultado una proteína truncada o defectuosa. Debido a estas alteraciones, la célula se transformaría en neoplásica, siendo inevitable, a partir de este momento, su multiplicación clonal para dar lugar al tumor (52). El CE es la enfermedad extracolónica más comúnmente observada en las familias con HNPCC. Entre un 30-60% de las pacientes con esta patología hereditaria desarrollan un CE (53, 54). La gran mayoría de estos tumores (75%), así como un cierto porcentaje de los CE esporádicos (17-20%), muestran MSI (55, 56). Esta alteración genética aparece también en lesiones precancerosas, como las hiperplasias, lo que indica que es un fenómeno temprano en la carcinogénesis (57, 58). Sin embargo, en los tumores de endometrio esporádicos con MSI, la frecuencia de mutaciones en los genes del sistema MMR es muy baja (59-61). En estos casos, la hipermetilación de la región promotora del gen MLH1, que hace que se inhiba su expresión, es la responsable del MSI. Esta alteración epigenética está presente en la mayoría de ellos (70-95%) y en un grupo reducido de tumores con microsatélites estables (MSS) (6-10%) (62-64). Además, se ha observado en hiperplasias y en tejido normal adyacente al tumor, pero no en tejido endometrial sano (65-67). Como se ha mencionado ya, el MSI es una característica propia de los CE endometrioides o de Tipo I (20-40%), mientras que en los tumores no endometrioides o de Tipo II es poco frecuente (<5%) (55, 56). Algunos de los genes 31   Capítulo1 con tractos repetidos, dianas de MSI, que presentan altas frecuencias de mutación en los CE endometrioides son: BAX, TGFβRII, IGFIIR, MSH3, MSH6, Axina-2, Caspase-5 y PTEN. En general en los CE, la incidencia de MSI y de mutaciones de los genes diana es menor que en los tumores gastrointestinales (44, 68). Nuestro grupo ha determinado el estado MSI en una serie de más de 200 muestras de CE, usando cinco marcadores quasimonomórficos (BAT25, BAT26, NR21, NR24 y NR27), de acuerdo con las condiciones y el criterio publicado en la literatura (ver sección material y métodos en el capítulo 4) (69, 70). La incidencia de MSI en esta serie es de un 20% y está dentro del rango descrito por otros autores. El 95% de los tumores MSI muestran metilación del promotor del gen MLH1 y además, una batería de genes, dianas de MSI, también presentan mutaciones en sus tractos repetidos (Fig. 3) (68, 71). 0 5 10 15 20 25 30 35 40 BAX TGFβRII IGFIIR PTEN casp-5 B2MG RIZ HDAC2 MSH3 MSH6 MLH3 ATR MED-1 TCF4 axina-2 DVL Frecuencia mutacional (%) Genes diana Figura 3. Frecuencia mutacional de algunos genes diana de MSI estudiados en nuestra serie. No obstante, las frecuencias mutacionales obtenidas para estos genes dianas, en los diversos estudios publicados, muestran una gran variabilidad. Si bien, el fenotipo mutador es un proceso que parece extenderse de manera indiscriminada por todo el genoma, también hay evidencias que indican la existencia de una presión selectiva sobre determinados genes diana que participan en la tumorigenesis. Así, actualmente, existe un amplio debate para establecer los criterios más adecuados que 32   Capítulo1 permitan discernir entre genes diana relevantes o irrelevantes en la carcinogénesis de un determinado tumor (70, 72, 73). La presencia de MSI en tumores colorrectales predice un pronóstico favorable independientemente del estadio (74). Pero esto no ocurre en CE, la asociación de MSI con parámetros clínico-patológicos y la evolución clínica de las pacientes es controvertida (75-80), exceptuando su relación con los tumores endometrioides y diploides (40). El estado MSI en nuestra serie, también se asocia con tumores endometrioides y diploides, y además, con estadios avanzados, invasión vascular y un peor pronóstico. Resultados preliminares muestran que esta inestabilidad se comporta como un marcador predictivo independiente, que indica una peor evolución de los CE endometrioides con estadios iniciales tratados con radioterapia (81). Estas y otras evidencias, ponen de manifiesto la implicación de diferentes dianas de MSI en la carcinogénesis y en la progresión tumoral, además de su posible valor pronóstico y/o predictivo en el CE que sería interesante estudiar en profundidad (73). 3.3 Inestabilidad cromosómica (CIN) La inestabilidad genómica tiene un importante papel en el desarrollo del cáncer, no solo a nivel del ADN (mutaciones puntuales o MSI), sino también a nivel cromosómico. La anomalía en el número y/o estructura (traslocaciones, deleciones y amplificaciones) de los cromosomas se conoce como inestabilidad cromosómica (CIN). La determinación de la ploidía permite estimar los cambios cuantitativos en el contenido de ADN de las células tumorales frente a una población celular control. Aunque no sea posible obtener información específica del tipo de alteración cromosómica (numérica y/o estructural), el cambio en el contenido de ADN es un indicador de la existencia de la CIN. Los tumores diploides son aquellos con un contenido normal de ADN y los aneuploides por el contrario, muestran alteraciones en la ploidía. 33   Capítulo1 La alteración de los genes implicados en la regulación de los puntos de control del ciclo celular (checkpoints), que aseguran el orden de los procesos dentro del ciclo e integran la reparación del ADN con la progresión de las diferentes etapas, podrían ser responsables de la CIN (82). La aneuploidía se observa en un 20-35% de los CE, la mayoría de ellos con una histología no endometrioide (83). Parece que los genes BUB1, CCNB2 y STK15 implicados en el checkpoint del huso mitótico están sobre-expresados en este tipo tumoral, especialmente el gen STK-15, esencial en la segregación de los cromosomas y en la función de los centrosomas (43). La alteración de este gen está presente en el 60% de los CE no endometriodes (84). La aneuploidía es considerada por varios autores como un marcador de peor pronóstico en CE (85, 86). En nuestra serie de CE hemos determinado la ploidía mediante citometría de flujo. Los tumores con un índice de ADN <0,85 ó >1,25 se han considerado aneuploides (68, 87). La aneuploidía está presente en el 20% de los casos y se asocia con estadios avanzados, grado más indiferenciado, invasión vascular, tipo histológico no endometrioide y una peor evolución clínica de la enfermedad (68). La CIN se ve reflejada también por pérdidas/ganancias alélicas en numerosos loci (LOH o pérdida de heterocigocidad). Se ha comparado el perfil de LOH en los diferentes tipos de tumores de endometrio, mostrando que este fenómeno es más frecuente en los CE no endometrioides (45). 3.4 Alteraciones en los genes PTEN, PI3K, KRAS y P53 El gen supresor de tumores PTEN (Phosphatase and tensin homolog) está localizado en el cromosoma 10q23-24. Codifica una proteína pten, con 9 exones y 403 aminoácidos, con actividad fosfatidilinositol, tirosina, serina/treonina y fosfatasa. Está implicado en varios procesos celulares, principalmente bloquea el ciclo celular e induce apoptosis. Interviene también, en la migración celular, en la adhesión entre células y con la matrix extracelular, y en la angiogénesis (88). Su relación con el cáncer parece estar centrada principalmente en su capacidad de modular negativamente la ruta PI3K/AKT (Phosphatidylinocitol 3,4,534   Capítulo1 familia DKK (Dickkopf). Estos se unen a los receptores LRP5/6, favorecen su endocitosis, alteran su capacidad de formar dímeros con los Fz y así, la ruta canónica se ve específicamente alterada (147). Se han identificado numerosos genes diana de la ruta Wnt, algunos específicos del tipo celular y otros, miembros de la propia vía de señalización (ver Wnt homepage: www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.html) (148). 4.2 Alteración de los miembros Wnt: β-Catenina, APC y E-Cadherina La proteína β-Catenina es uno de los miembros principales de la ruta Wnt. Está codificada por el gen CTNNB1, localizado en el cromosoma 3p21. Las mutaciones de este gen evitan que la proteína pueda ser fosforilada por GSK3β. Así se desestabiliza el equilibrio que existe entre su degradación, su unión a los complejos de adhesión celular y su papel como co-activador de la transcripción. Como resultado, aumenta su nivel en el citoplasma y pasa al núcleo donde mantiene constitutivamente activa la transcripción de los genes diana Wnt (149). Algunos de los genes que se ven sobre-expresados por esta anormal activación son CD1 (cyclin D1), c-myc y MMP7 (matrix metalloproteinase-7)(150-153). Entre un 14-44% de los CE endometrioides tienen una β-Catenina alterada debido a mutaciones en el exón 3 del gen, las mutaciones fuera de este exón son infrecuentes (151, 154-157). Suelen ser tumores con estadio inicial y buen pronóstico. A menudo, en los tumores colorectales, esta alteración está asociada con el estado MSI, sin embargo en los CE endometrioides no existe esta relación (158). En este caso, las alteraciones en la β-Catenina, el MSI y el estado mutacional de PTEN y KRAS parecen formar parte de rutas independientes (151). En nuestra serie de CE la frecuencia mutacional del exón 3 de la β-Catenina (17%) está dentro del rango descrito en la literatura (15-20%)(151, 154, 158-160). Todas las mutaciones encontradas afectan a residuos diana de fosforilación, lo que indica que la proteína alterada es resistente a la degradación. Además, no se observa asociación entre la alteración genética de la β-Catenina y el estado MSI o las mutaciones del gen PTEN. Esto sugiere que estas alteraciones pueden ser conjuntamente seleccionadas y contribuir en la carcinogénesis endometrial. Los 41   Capítulo1 tumores con mutaciones en β-Catenina en general, son de buen pronóstico, con histología endometriode y diferenciados (grado 1) (68). Aproximadamente el 25% de los CE tienen una alta actividad del complejo β-Catenina/TCF/LEF en ausencia de mutaciones en β-Catenina, lo que hace suponer que otros miembros de la ruta Wnt deben estar implicados en el proceso tumoral (154). A diferencia de lo que ocurre en tumores de colon, las mutaciones en otros miembros de esta cascada de señalización, como APC son infrecuentes en CE. Pero sí se han encontrado otras alteraciones como, LOH (5q21) en aproximadamente el 25% o hipermetilación del promotor del gen APC en el 22-47% de los casos, aunque su asociación con una acumulación de la β-Catenina en el núcleo no ha podido ser demostrada (160-163). La alteración epigenética de APC ocurre temprano en el proceso carcinogénico pues se ha observado en hiperplasias endometriales (163). Además, es frecuente en tumores endometrioides y con MSI, fenómeno que se observa también en nuestra serie de CE, donde la frecuencia de metilación del APC es de un 35% (ver anexo I) (160, 163). La molécula de adhesión E-Cadherina está codificada por el gen supresor de tumores CDH1, localizado en el cromosoma 16q22.1. En CE y otras neoplasias, la pérdida parcial o completa de esta proteína se asocia con una menor diferenciación tumoral y mayor capacidad de invasión y metástasis (162, 164-166). La disminución de la expresión es más frecuente en tumores con una histología no endometrioide y en aquellos endometrioides de mayor grado y estadio (165-167). Se han descrito mutaciones de este gen en un pequeño número de CE (168). Un porcentaje mayor de tumores presentan LOH de la región 16q (34-40%), que se asocia con una diferenciación menor, un tipo histológico no endometrioide y con un peor pronóstico. Esta alteración genética no se ha observado en hiperplasias endometriales lo que supone que podría no estar implicada en la tumorigenesis pero sí en la progresión de los CE (165, 169). Entre un 14-44% de los tumores de endometrio muestran hipermetilación del promotor de CDH1. Su aparición está relacionada con la adquisición de la capacidad invasiva del tumor. Aunque existen datos contradictorios, este mecanismo parece estar relacionado también, con la disminución de los niveles de E-Cadherina en los CE más agresivos (161, 162, 165, 42   Capítulo1 166, 170). De acuerdo con lo descrito por otros autores, en nuestra serie de CE el 14% de los casos muestran esta alteración epigenética (Ver anexo I). Extracelul Intracelular ar WNT WNT WNT WNT DKK FZ FZ GSK3β GSK3β AXINA AXINA APC APC β-Catenina β-Catenina β-Catenina β-Catenina β-Catenina β-Catenina LEF/ TCF DVL RHO RAC NFAT Reorganización del citoesqueleto CamKII PKC Actina β-Catenina LPR5-6 Ub JNK JNK P P P P P P Ca 2+ ROR2 Núcleo GENES DIANA Efecto en la célula: Proliferación Diferenciación Transformación Migración Adhesión SFRPs WIF1 Algunos genes diana WNT AXIN2 Cyclin D1 MYC EPHB PITX2 Dickkopf1 TCF1 CD44 MMP7 VEGF Endothelin1 RUNX2 Ausencia de ligandos WNT α-Catenina E-Cadherina WNT canónica WNT no canónica  g ura 4. Esquema simplificado de la ruta de señalización WNT (canónica y no canónica) Fi 43   Capítulo1 5. Referencias 1. Kronenberg M.D. HM, Melmed S., Polonsky M.D., Larsen P.R. ed. 2009 Williams tratado de endocrinología. 11ª ed: Elsevier/Saunders. 2. Moore KL PT ed. 2008 Embriología Clínica. 8ª ed: Elsevier/Saunders. 3. Simón C. 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Tsuda H, Jiko K, Yajima M, Yamada T, Tanemura K, Tsunematsu R, Ohmi K, Sonoda T, Hirohashi S 1995 Frequent occurrence of c-Ki-ras gene mutations in well differentiated endometrial adenocarcinoma showing infiltrative local growth with fibrosing stromal response. Int J Gynecol Pathol 14:255-259. 50   El cáncer de endometrio es el tumor ginecológico pélvico más frecuente en los países desarrollados. Generalmente se diagnostica en estadios iniciales, pero a pesar de su buen pronóstico, aproximadamente el 20% de las pacientes mueren a causa de la enfermedad. Capítulo2 El pronóstico y tratamiento actual del cáncer de endometrio se fundamenta en el uso de variables clínico-patológicas, tales como el grado histológico, infiltración miometrial, tipo histológico, etc. Junto a estas, se han descrito nuevas variables moleculares implicadas en la tumorigenesis y en la progresión de este tipo tumoral. Su uso en la práctica clínica podría ser de gran ayuda para mejorar la clasificación de los tumores, el pronóstico y el tratamiento de las pacientes. Nuestro grupo, en colaboración con el Servicio de Patología y la Unidad de Ginecología Oncológica del Servicio de Ginecología y Obstetricia del Complejo Hospitalario Universitario Materno-Insular, lleva veinte años desarrollando proyectos de investigación encaminados al conocimiento de las alteraciones moleculares que suceden en el desarrollo y evolución de esta enfermedad. A esta iniciativa se unió en el año 2000 el Laboratorio de Genética y Epigenética del Cáncer, dirigido por el Dr. Manuel Perucho (The Burnham Institute, La Jolla, CA, USA), descubridor de la inestabilidad microsatélite, de la ruta mutadora y de su implicación en diversas neoplasias. A partir de ese momento nuestras investigaciones se centraron en el estudio de esta anomalía genética, y de otras relacionadas con ella, en el cáncer de endometrio. Esta Tesis Doctoral pretende dar continuidad a la línea de investigación desarrollada por nuestro grupo. Los objetivos planteados han sido estimar la incidencia, la relación con las características clínico-patológicas y moleculares, y con la supervivencia de las pacientes, de las siguientes alteraciones genéticas y epigenéticas: 57   58  1) mutaciones en los tractos repetidos del gen EPHB2 (Capítulo 3). 2) mutaciones en los tractos repetidos de los genes miembros del sistema de reparación de roturas de la doble cadena de ADN (Capítulo 4). Capítulo2 3) metilación del promotor de los genes EPHB2 y EPHB4 (Capítulo 5). 4) metilación del promotor de los genes SFRPs (Capítulo 6). 5) metilación del promotor del gen PITX2 (Capítulo 7). De esta manera hemos querido profundizar en el conocimiento de algunas variables moleculares posiblemente asociadas al desarrollo y progresión del cáncer de endometrio.  Capítulo3  AltaincidenciademutacionesdelgenEPHB2entumores gástricosperonoenlosdeendometrio    coninestabilidademicrosatélites    Capítulo3     aloVerónicaDáv s HiginioDopeso  ira SérgiaVelho AnaMonteiroFerre ico LuisCirnes NicolásDíaz‐Ch CristinaBilbao z ez RaquelRamíre GermánRodrígu OrlandoFalcón nLaureanoLeó ReneeNiessen r ‐Hellweg GiselaKelle GiselaDallenbach EloyEspín golManelArmen ManuelPerucho KohzohImai HiroyukiYamamoto  ico JohannesF.Gebert JuanCarlosDíaz‐Ch tra r RobertM.Hofs StefanM.Woerne  Jr RaquelSeruca SimóSchwartz DiegoArango Oncogen.2007Jan11;26(2):30811    Capítulo3  Resumen En el epitelio intestinal, la familia de receptores EPH, con actividad tirosinquinasa, regula la adhesión y la migración celular. Recientemente se ha demostrado que la inactivación del gen EPHB2 acelera la formación de tumores colorrectales. Un 41% de ellos, con inestabilidad de microsatélites (MSI), presentan mutaciones en el tracto repetido A9 del exón 17, provocando un cambio en la pauta de lectura que da lugar a la inactivación del EPHB2. En este estudio hemos analizado la longitud del tracto A9, en tumores extracolónicos con MSI. El 39% (25/64) de los tumores gástricos y el 14% (8/56) de los carcinomas de endometrio (CE) presentan este tipo de alteración. La introducción de los resultados obtenidos en nuestro modelo matemático de regresión, identifica al EPHB2 como un gen diana, que sufre mutaciones en el tracto A9 sólo en los cánceres gástricos pero no en los de endometrio con MSI. Estos resultados sugieren que el receptor EPHB2 desempeña un papel funcional en la progresión de los tumores gástricos y además pone de manifiesto las diferencias que existen entre los tumores MSI, gástricos y de endometrio. Capítulo3 61   Capítulo3   Alta incidencia de mutaciones del gen EPHB2 en tumores gástricos pero no en los de endometrio con inestabilidad de microsatélites EPHB2 es un miembro de la familia de receptores con actividad tirosínquinasa (RTK). Recientemente se ha descrito como un gen supresor de tumores, especialmente en cáncer colorrectal (4, 5). Junto con otros miembros EPH y sus ligandos las efrinas (EFN) regulan numerosos procesos en el desarrollo del sistema nervioso y del sistema cardiovascular (6, 7). En varios tipos celulares, como las neuronas, las células endoteliales y los enterocitos, la interacción entre los receptores EPH y sus ligandos, desempeñan diversos procesos a nivel celular, controlando la organización del citoesqueleto, la migración celular y la adherencia al sustrato (810). Capítulo3 En ratones transgénicos APC-/+ con cáncer colorrectal, la inactivación del gen EPHB2 parece acelerar el proceso tumoral iniciado por mutaciones en el gen APC. A su vez, éstos presentan menores niveles de expresión del EPHB2 en comparación con el epitelio normal y las lesiones premalignas (5, 11). Se ha descrito recientemente que el 41% de los tumores colorrectales con MSI adquieren mutaciones somáticas en el tracto A9 del exón 17 del EPHB2(4). El MSI ocurre en el 10-20% de los tumores gastrointestinales y de endometrio. Este fenómeno de inestabilidad, se origina como resultado del mal funcionamiento de los sistemas de reparación del ADN, y da como resultado la acumulación de errores, tanto deleciones como inserciones, en los tractos microsatélites, secuencias repetidas de mononucleótidos, di-nucleótidos y trinucleótidos del genoma. La inactivación de genes importantes, por la acumulación de errores en estos tractos repetidos, contribuye sin duda al desarrollo de determinados tumores. En cáncer gastrointestinal y endometrial, las mutaciones de algunos genes con tractos microsatélites, como TAF1B y BAX, se producen con alta frecuencia. En cambio otros, como TGFBR2, muestran diferencias significativas en función del tipo tumoral (2, 12). Las diferentes frecuencias de mutación de los genes diana del MSI que se observan entre tumores, pone de manifiesto la existencia de 63   distintas vías oncogénicas dependiendo del órgano en el que se desarrolle el tumor (12). En un panel de 64 tumores gástricos y 56 CE con MSI se determinó la longitud del tracto A9 del EPHB2 (NM_017449) mediante PCR y posterior análisis de fragmentos (SSCP y electroforesis capilar en un ABI 3100). Los resultados obtenidos, fueron confirmados mediante secuenciación. (Ver Anexo I, Tabla 1). Capítulo3 El 39,1% (25/64) de los tumores gástricos con MSI presentaron mutaciones en el tracto A9 del EPHB2 (Tabla 1 y Fig. 1). Éstas no se asociaron con otros factores clínico-patológicos como la edad, el sexo, el grado de diferenciación, la localización (proximal, media y distal) y el estadio (TNM). Tumor nº casos nº mutaciones % Referencia Colon 246 101 41,1 Alazzouzi y col (2005)4 Gástrico 64 81 39,1 Endometrio 56 52 14,3 Tabla 1. Frecuencia de mutación en el tracto A9 del gen EPHB2 en diferentes tipos de tumores con MSI c) Endometrio; EPHB2 WT d) Endometrio; EPHB2 M a) Gástrico; EPHB2 WT b) Gástrico; EPHB2 M Figura 1. Mutaciones del EPHB2 en tumores gástricos y de endometrio con MSI. Los paneles (a) y (b) muestran un ejemplo representativo de secuenciación, mediante electroforesis capilar, donde se muestra claramente el cambio producido en el tumor. Los paneles (c) y (d) representan las diferencias de longitud del tracto A9 de los CE con el tipo salvaje (WT) y mutante (M) respectivamente, determinados mediante análisis de fragmentos (rojo: tumor; azul: control, negro: marcador interno). Las flechas indican deleciones (A9 a A8). El estado de MSI de estos tumores se caracterizó mediante el análisis de los marcadores descritos previamente (1-3). 64   La expresión del EPHB2 está regulada por el complejo βCatenina/TCF/LEF, una ruta que controla la proliferación y diferenciación del epitelio gastrointestinal (8). La mucosa sana presenta altos niveles de expresión del EPHB2 (13). Su actividad inhibe la formación de tumores gastrointestinales, pero su inactivación confiere una ventaja proliferativa a las células tumorales (5, 11). Previamente se ha demostrado que el 41% de los tumores colorrectales con MSI tienen mutaciones en el tracto A9 (Tabla 1) (4). Aunque las células epiteliales normales del estómago expresan altos niveles de EPHB2, más del 85% de los tumores gástricos muestran una reducción o pierden la expresión del gen. Esto sugiere que su inactivación, en el estómago, debe contribuir a la formación y progresión de este tipo tumoral (13). Capítulo3 Para el análisis de los resultados, hemos incluido la frecuencia de mutaciones del tracto A9 del EPHB2, en un modelo de regresión que cuenta con la frecuencia mutacional de 1700 tractos repetitivos en regiones codificantes y no codificantes de más de 300 genes (2). Los resultados demuestran que la frecuencia de mutación observada para el EPHB2, en tumores gástricos con MSI, es muy superior a lo que se podría esperar por azar (Fig. 2a). Esto sugiere que las mutaciones son clonalmente seleccionadas y confieren a las células tumorales una ventaja proliferativa. La frecuencia de mutaciones del tracto A9 en los CE con MSI fue un 14,3% (8/56) (Tabla 1 y Fig. 1c-d). No se encontró asociación entre las mutaciones de EPHB2 y otras variables clínico-patológicas como la edad, el grado, la invasión miometrial y el tipo histológico (endometrioide o no endometrioide). Dado que la frecuencia de mutaciones en estos tumores es considerablemente más baja (2, 14), se dificulta la comparación de las frecuencias entre tumores gastrointestinales y de endometrio, (Figura 2). El modelo de regresión utilizado reveló que la incidencia de mutaciones observadas en los CE no son significativamente superiores a la frecuencias de mutaciones esperadas por azar (Figura 2b). Esto sugiere que las mutaciones del EPHB2 no otorgan una ventaja de crecimiento a las células tumorales del endometrio, sino que más bien se acumulan como resultado de un proceso estocástico no selectivo. Sin embargo, son necesarios análisis funcionales 65   para confirmar el papel oncogénico del EPHB2, tanto en los tumores gástricos como en los de endometrio. En conclusión, en este estudio mostramos que las mutaciones del tracto A9 del EPHB2 son más frecuentes en los tumores gástricos (39,1%), que en los CE con MSI (14,3%). Estos resultados sugieren que el EPHB2 es un gen supresor de tumores tanto en tumores gástricos como colorrectales, y pone de manifiesto la existencia de diferentes vías oncogénicas entre los tumores gastrointestinales y de endometrio. Capítulo3 66   Introducción La inestabilidad de microsatélite (MSI) es el fenotipo de los tumores que presentan deficiencias en los sistemas de reparación del apareamiento incorrecto de bases del ADN (MMR). Estas deficiencias hacen que se acumulen cientos de miles de mutaciones causadas por inserciones o deleciones que afectan a los tractos repetidos denominados microsatélites (1). Son importantes aquellas presentes en los microsatélites localizados en la región codificante de genes implicados en el proceso tumoral, que controlan la división celular, la supervivencia y especialmente, los encargados de reparar los daños causados en el ADN (1, 2). El MSI es una característica común de la mayoría de los tumores colorrectales hereditarios no polipósicos (HNPCC), y de un subgrupo de tumores esporádicos de colon, gástricos y de endometrio (2, 3). Esta alteración genética está presente en aproximadamente el 20% de los CE, y como en la mayoría de los tumores esporádicos, está causada por el silenciamiento epigenético del gen reparador MLH1 (4). Capítulo4 La respuesta al daño del ADN (DDR) consiste en complejos sistemas de señalización que detectan las lesiones del ADN y promueven la puesta en marcha de diferentes mecanismos de reparación, preservando así la estabilidad del genoma. Entre los mecanismos de reparación que forman el sistema de DDR se encuentran MMR, de roturas de doble cadena (DSB) y de escisión de bases (BER), entre otros (5). Defectos en la capacidad de detección y en la reparación de los daños aumentan el riesgo del desarrollo tumoral. La célula usa dos mecanismos de reparación de DSB, dependiendo del tipo de rotura de doble cadena y de la fase del ciclo celular. Así, para las roturas de doble cadena que causan extremos no homólogos se activa el sistema de unión de extremos no homólogos (NHEJ), funcional durante todas las fases del ciclo celular. Para las roturas que causan extremos homólogos en la fase S ó G2 del ciclo se activan los mecanismos para la recombinación homóloga (HR) (5). Los genes que componen el sistema de reparación de DSB son potenciales dianas de MSI. En cáncer de colon (CC) existe una alta proporción de tumores con uno o más genes, miembros de NEHJ y HR, alterados (6). A pesar de que se han 73  descrito mutaciones en algunos de estos genes, no se ha realizado un análisis de forma exhaustiva en CE con MSI (7-9). En este trabajo, hemos investigado 14 genes miembros del sistema de reparación de DSB como posibles dianas del MSI en CE. Así como la asociación entre las mutaciones y las variables clínico-patológicas. Entre ellos, incluimos al gen MCPH1/BRIT1 (Microcephalin-1), como un nuevo gen supresor de tumores que nunca ha sido estudiado como diana de MSI en cáncer. MCPH1 se identificó inicialmente como un gen implicado en la determinación del tamaño del cerebro. Sin embargo, estudios recientes sugieren que participa en procesos biológicos esenciales como la regulación de la entrada en mitosis, el mantenimiento de la estabilidad genómica y en los mecanismos de reparación de DSB (10-12) . Además, se ha descrito una disminución de su expresión en tumores de ovario, próstata y mama (11). Capítulo4 Material y métodos Muestras tumorales y clasificación MSI Para la realización de este estudio, aprobado por el comité ético y tras el consentimiento informado de las pacientes, usamos 41 muestras de CE con MSI pertenecientes a nuestra serie tumoral descrita previamente (13). Para la determinación y clasificación de MSI se usaron cinco marcadores de mononucleótidos quasimonomórficos (BAT25, BAT26, NR21, NR24 y NR27) de acuerdo con las condiciones y los criterios previamente publicados, con ligeras modificaciones (14). Usando la secuencias de primers descritas (ver anexo I), se realizó la amplificación simultáneamente (pentaplex), mezclando 20ng de ADN, 240nM de cada primer, excepto para BAT26 que fue de 1μM, 200μM de dinucleótidos trifosfato, 2mM de MgCl2, 1x de buffer Biotaq y 1U de Biotaq DNA polimerasa (Bioline) en un volumen final de reacción de 25μl. Las condiciones de amplificación fueron: un paso inicial a 94ºC durante 5min, seguido de 12 ciclos de 30seg a 94ºC, 30seg a 72ºC y 30seg a una temperatura de anillamiento que decrece 2ºC cada tres ciclos (comenzando a 61ºC en los tres primeros ciclos y disminuyendo 74  a 55ºC en los tres últimos) y 25 ciclos de 30seg a 94ºC, 30seg a 72ºC y 30seg a 55 ºC, seguido de un paso de extensión final de 10min a 72ºC. Los productos de PCR se diluyeron 1:50 en agua destilada y 1μl de la dilución se mezcló con 9,75μl de formamida y 0,25μl de GeneScan 500 LIZ Size Standard (Applied Biosystems). La mezcla se desnaturalizó durante 5min a 98ºC y enfrió en hielo. Los fragmentos se separaron mediante electroforesis capilar en un ABI PRISM 3100 16-capillary genetic analyser (Applied Biosystems) y se analizó su longitud mediante el uso de Peak Scanner software v1.0 (Applied Biosystems). Capítulo4 Detección de mutaciones que alteran la pauta de lectura de los genes del sistema de reparación de DSB Mediante PCR (monoplex) y usando primers específicos, se analizaron las mutaciones de los tractos microsatélites de 14 genes implicados en los mecanismos de reparación de DSB. En un volumen final de reacción de 25μl se mezclaron 20ng de ADN, 240nM de cada primer, 200μM de dinucleótidos trifosfato, 2mM de MgCl2 , 1x de buffer Biotaq y 1U de Biotaq DNA polimerasa (Bioline). El primer con sentido, de cada pareja, está marcado con el fluorocromo 6-FAM. Las condiciones de amplificación fueron: 94ºC durante 5min, seguido por 35 ciclos de 30seg a 94ºC, 30seg a la correspondiente temperatura de hibridación y 30seg a 72ºC, con un ciclo final de 10min a 72ºC. La tabla 1 muestra la secuencia de los primers y las condiciones de amplificación para el gen MCPH1. El análisis de fragmentos se determinó de la misma manera que para los marcadores de MSI descritos anteriormente. Para la identificación de las inserciones o deleciones, se comparó el patrón de picos de las muestras tumorales con el de muestras control, que no presentaban alteración en los tractos analizados. La figura 1 muestra el patrón de picos de diferentes tractos microsatélites del gen MCPH1 en el tumor comparado con el control. 75  Análisis estadístico La relación entre la frecuencia mutacional y las variables clínicopatológicas se llevó a cabo usando los test no paramétricos χ2 y Fisher. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando los niveles de significación bilateral eran p<0,05. Los análisis se realizaron utilizando el paquete estadístico GraphPad Prism v5. Primers* Tracto repetido (exón) Tamaño del producto de PCR (pb) F: 5'-TATACAGATGCAGGACAGCTG-3' R: 5'-TGCCATTATCTACATTGAAATC-3' F: 5'-AAATGTATGCAGCCCAAAGA-3' R: 5'-GGACACAAATGCAAAGAACTG-3' F: 5'-TCTAAGAAGGAGAGAACAAGC-3' R: 5'-GACTGGAGATGGTTTTTGCTG-3' Abreviaturas: F: con sentido, R: sin sentido, pb: pares de bases *Temperatura de anillamiento: 61ºC A7 (8) 127 153 109 Ta bl a 1 . Detalles de las condiciones de PCR para el análisis de los tractos repetidos del gen MCPH1 A9 (4) A6 (5) Capítulo4 pb pb pb pb pb pb Figura 1. Ejemplo de tumores con mutaciones, que alteran la pauta de lectura, en los tractos repetidos de la región codificante del gen MCPH1. Las flechas indican las deleciones de un monomucleótido en los tractos a) A7, b) A9, c) A6 localizados en los exones 8, 4 y 5, respectivamente. En rojo: tumor, en azul: control, en naranja: marcador de peso molecular, pb: pares de bases. Se indica el código de referencia de la muestra tumoral. 76  Resultados La incidencia de mutaciones en los tractos microsatélites de los genes implicados en la reparación de DSB se muestra en la figura 2. Los genes con una mayor frecuencia de mutaciones fueron el DNAPKcs (también conocido como PRKDC), con un 34% (14/41), 17% para RAD50, 15% para MRE11, ATR y BRCA1 y 12% para CtIP (RBBP8) y MCPH1. El resto de los genes (CHK1, XRCC2, WRN, TOPBP1, CDC25C, BLM y BRCA2) presentaron una frecuencia mutacional menor al 7%. Respecto a las alteraciones del tracto T11 del gen MRE11, localizado en una región no codificante, sólo se tuvieron en cuenta aquellas que afectan de manera significativa a la expresión de la proteína (ver discusión). En cuanto a las mutaciones encontradas en el gen MCPH1, dos tumores presentaron deleciones simultáneas de un nucleótido, en el tracto A9 del exón 4 y en el tracto A6 del exón 5. Otros dos tumores presentaron deleciones en el tracto A7 del exón 8 (Fig. 1). Este gen también se analizó en 62 muestras de CE con estabilidad de microsatélites (MSS) y no se encontraron mutaciones en los microsatélites analizados (datos no mostrados). Capítulo4 El 71% de los tumores (29/41) presentaron alterado alguno de los tractos microsatélites de los genes de reparación de DSB analizados. Casi la mitad de ellos (48%, 14/29) presentaron alteraciones en dos o más componentes del sistema. De los 29 tumores con mutaciones, los miembros de los mecanismos de reparación de NHEJ y HR se encontraron mutados en 14 (48%) y 24 (83%) de los tumores, respectivamente. De acuerdo con las características clínico-patológicas de las pacientes, la presencia de mutaciones en dos o más genes de reparación de DSB se asoció significativamente con un alto grado (p=0,03) e invasión vascular (p=0,02) y marginalmente con un estadio avanzado (p=0,07) de los tumores (Tabla 2). 77  DNAPK RAD5 MRE1 ATR BRCA CtIP MCPH CHK1 XRCC2 WRN TOPBP1 CDC25 BLM BRCA A10 A9 T11 A10 A8 A9 A6, A7, A9 A9 T8 A8 A8 A8 A9 A8, A8 nº de casos Código del tumor cs 0 1 1 1 C 2 1266 -1-2 +1 -1 +1 -1 5 2835-1 -1 -1-2 -1 4 32356+1 +1 -1-1 -1 4 41971-1-1 -1-1 +1 -1 4 52450 -1 -1 -1 -1 4 62293+1 +1 +1 -1 3 71513-1 -2 -1 3 82297-1 -1-1 +2 3 9294 +1 -1 -1 3 10 1000 +1 -2 2 11 1357 -1 -1 -1 2 12 1936 -1 -1 -1 2 13 1128 -1 -1 2 14 744 -1 -1 2 15 1346 -1 -1 1 16 518 -1 1 17 2113 -1 -1 1 18 1647 +1 1 19 1802 -1 1 20 1731 -1 -1 1 21 1861 -1 -1 1 22 2422 -1 1 23 1001 -1 1 24 1911 -1 1 25 2035 -1 -1 1 26 2111 -1 1 27 1401 -1 -1 1 28 2122 -1 -1 1 29 1440 -1 1 30 863 +1 1 31 1740 0 32 2098 +1 0 33 2189 0 34 2041 0 35 738 -1 0 36 1389 -1 0 37 1398 -1 0 38 1640 -1 0 39 1658 0 40 2445 0 41 2480 0 147666553221110 34% 17% 15% 15% 15% 12% 12% 7% 5% 5% 2% 2% 2% 0% nº de genes mutados nº mutaciones Frecuencia Capítulo4 Figura 2. Mutaciones que alteran la pauta de lectura en los tractos de mononucleótidos de los genes que reparan las DSB en tumores de endometrio con MSI. En negro: mutación; en blanco: sin mutación; en gris: mutaciones con un pequeño o desconocido efecto en la expresión de la proteína. -1, deleción de 1pb; -2, deleción de 2pb; +1, inserción de 1pb; +2, inserción de 2pb. Los casos con deleciones en homocigosis (-1/-1) no se pueden distinguir de los casos con mutaciones en hemicigosis y LOH en el otro alelo. 78  Discusión Un número importante de los tumores de nuestra serie presentaron mutaciones en DNAPKcs. La frecuencia mutacional (34%) fue significativamente mayor en comparación con otras series de CE con MSI (13%, 7/54, p=0,02) (7, 15). Del mismo modo, la tasa de alteraciones detectadas en RAD50 (17%) fue significativamente superior a la descrita para CE con MSI (2,4%, 1/42, p <0,01) (7). Finalmente, el 15% de los tumores presentan BRCA1 mutado, esta frecuencia contrasta con la ausencia de mutaciones encontrada en otras series de CE con MSI referidas en la literatura (8, 16, 17). Estas discrepancias podrían deberse al bajo número de casos analizados y a los falsos negativos, debidos a la falta de sensibilidad de los métodos de detección. Los genes TOPBP1 y XRCC2 no han sido estudiados anteriormente en CE, pero sí en CC, donde la tasa de mutación observada es muy baja igual que en nuestra serie de CE (6). Capítulo4 Se sabe que no todas las mutaciones presentes en el tracto no codificante T11 del gen MRE11 tienen un impacto funcional. Las deleciones monoalélicas de dos o más nucleótidos, reducen drásticamente la cantidad de la proteína MRE11, mientras que las deleciones de un nucleótido provocan solo una ligera o nula reducción en los niveles de expresión de la proteína (18-20). Las deleciones bialélicas de una base también se han asociado a una pérdida de expresión de la proteína, tanto en tumores como en líneas celulares (19-22). Por lo tanto, sólo consideramos las mutaciones bialélicas y las deleciones de dos o más nucleótidos (Fig. 1). Hasta la fecha, no se habían analizado ningún tracto microsatélite localizado en las regiones codificantes del gen MCPH1 en tumores MSI. En este estudio, el 12% de los tumores presentaron deleciones en los tractos repetidos analizados de este gen. Dos tumores presentaron deleciones de un nucleótido en el tracto A9 del exón 4 y otra en el tracto A6 del exón 5. En ambos casos, estas mutaciones generan una proteína truncada, presumiblemente no funcional, de 145 aminoácidos. La inserción de una A en el tracto A6 en el exón 5 se asocia al síndrome de microcefalia primaria o también conocido como PCC (postnatal short stature and premature chromosome condensation) descrito por primera vez en dos 79  hermanos con esta alteración en línea germinal. Esta mutación cambia la pauta de lectura generando una proteína truncada de 146 aminoácidos, solo con el dominio BCRT del extremo N-terminal (23). Dos tumores más de nuestra serie presentaron deleciones de un solo nucleótido en el tracto A7 del exón 8 que da lugar también, a una proteína truncada de 499 aminoácidos sin los dos dominios BCRT del extremo C-terminal, importantes para su correcto funcionamiento en DDR (24). En cáncer de mama, debido a la deleción de 38 bases en el exón 10, se ha encontrado esta proteína truncada, no funcional, sin estos dos dominios BCRT C-terminales (11). Teniendo en cuenta que las mutaciones en el gen MPCH1 solo las observamos en tumores con MSI y no en aquellos MSS, proponemos que este gen sea considerado un gen diana de MSI en CE. Capítulo4 De acuerdo con las características de los tumores MSI, la mayoría de las mutaciones que se observan son monoalélicas (25). Sabemos que las mutaciones heterocigóticas de algunos genes que reparan DSB afectan dramáticamente al funcionamiento de este sistema de reparación, en células (21, 26, 27). Un ejemplo es DNAPKcs, que juegan un papel central en los mecanismos de reparación de NHEJ a través del reclutamiento y activación de las enzimas de procesamiento final, como son las ADN polimerasas y ligasas (28). Un subclón de la línea celular HCT-8, portadora de una deleción heterocigota en el tracto A10 del exón 5, tiene una alta sensibilidad al tratamiento combinado con bleomicina (inhibidor enzimático), comparándola con la línea celular original. Esto sugiere que la inactivación de uno de los dos alelos del gen es suficiente para que se pierda la actividad del sistema de reparación de DSB en las células (21). El sistema de reparación de HR también parece sensible a la haploinsuficiencia. Se ha demostrado que las alteraciones heterocigóticas de algunos de sus miembros, como los genes ATR, RPA1 o RFC2, provocan pérdida de la capacidad de responder al daño del ADN (26, 27). Las mutaciones monoalélicas del gen ATR, en el tracto A10 del exón 10, están asociadas con un peor pronóstico en los CE con histología endometrioide y MSI (9). Por tanto, sugerimos que estos tumores con haploinsuficiencia en alguno de los componentes que forman parte de 80  los mecanismos de reparación de DSB pueden adquirir algún tipo de ventaja que les permita una mayor supervivencia. Cabe preguntarse si las mutaciones de genes que muestran una baja frecuencia mutacional realmente contribuyen a la reducción de la eficiencia de los mecanismos de reparación de DSB. De acuerdo con el modelo de la haploinsuficiencia propuesto para los tumores MSI, las alteraciones monoalélicas de varios genes cuyos productos participan en la misma ruta de señalización, podrían dar lugar a una anormal actividad de la misma (25, 29). En nuestra serie, casi la mitad de los tumores mostraron alguna alteración en más de un miembro del sistema de reparación de DSB. Además, aquellos con dos o más genes alterados mostraron un comportamiento diferente, se asociaron con un alto grado e invasión vascular y mostraron una tendencia con estadios avanzados. Sin embargo, esta relación entre la alteración simultánea de dos o más genes y las variables clínico-patológicas, no se modificó cuando se descartaron del análisis los genes con una frecuencia mutacional menor al 8%, punto de corte recomendado por algunos autores para el CE con MSI (7). Capítulo4 Las deficiencias en los mecanismos de reparación de DSB juegan un papel importante en el tratamiento del cáncer. Su estado puede afectar a la respuesta al tratamiento de quimioterapia y radioterapia. Estudios in vitro demuestran que las mutaciones en los genes que componen el sistema de reparación de DSB sensibilizan a la célula frente a agentes usados en quimioterapia, incluidos los que generan DSB en el ADN (21, 22, 30). Por otro lado, hemos observado que la presencia de MSI predice una peor respuesta a la radioterapia en pacientes con estadios iniciales de CE endometrioide, como ocurre también en pacientes con CC (31, 32). En los carcinomas escamosos de cabeza y cuello, son frecuentes las deleciones en el cromosoma 11q, que implican la pérdida de tres genes importantes para la reparación de DSB (MRE11, ATM y H2AFX) esto se asocia con la sensibilidad a la radioterapia (33). Independientemente de su función en el sistema MMR, el gen MLH1 también participa en los mecanismos de reparación del ADN que implican recombinación genética. Concretamente, MLH1 evita que se acumulen errores en 81  los procesos de HR. En este sentido, la ausencia de este gen, además de generar defectos en el sistema MMR aumentando así, la probabilidad de desarrollar MSI, influye en la eficiencia del sistema de reparación de DSB (34, 35). En resumen, nuestros resultados sugieren que las alteraciones de los tractos microsatélites, presentes en los genes implicados en la reparación de DSB, son dianas directas de MSI en CE, y que la acumulación de alteraciones monoalélicas en varios genes de este sistema de reparación podría contribuir a una peor evolución clínica de la enfermedad. Capítulo4 0-1 ≥2 (%) P-valor † Edad de diagnóstico* <67 20 13 7 (35) 1,000 ≥67 21 14 7 (33) Estadio I22 17 5 (23) II 10 6 4 (40) III 9 4 5 (56) Grado 114 12 2 (14) 2 12 8 4 (33) 3 15 7 8 (53) Inf. Miometrial <50% 30 21 9 (30) ≥50% 11 6 5 (45) Inv. Vascular No 25 20 5 (20) Sí 16 7 9 (56) * Mediana= 67 años, † Test χ2 o Fisher. 0,020 nnº de genes mutados Ta bl a 2 . Relación entre las características clinico-patológicas y los tumores con ≥ 2 genes del sistema de reparación de DSB Características 0,070 0,030 0,460 82  89 Resumen Los receptores EPHB2 y EPHB4 interactúan con sus ligandos las efrinas, generando una comunicación entre células que controla la adhesión, la morfología y la movilidad celular. Su expresión está regulada por la ruta Wnt/β-Catenina, alterada en diferentes tipos tumorales incluido el carcinoma de endometrio (CE). En cáncer de colon, mama y próstata son considerados genes supresores de tumores y su pérdida de expresión, por alteraciones genéticas y epigenéticas, se asocia con la carcinogénesis y la progresión tumoral. En este estudio, determinamos si el estado de metilación de los promotores de EPHB2 y EPHB4 se relaciona con otras variables tumorales y con la progresión del CE. La metilación del promotor de EPHB2 se observó solo en uno de los 203 CE analizados. En cambio, el 8% de los tumores mostraron metilado el promotor del gen EPHB4. Ninguna de las 40 muestras incluidas en el grupo control presentó esta alteración para ambos genes. El estado metilado de EPHB4 se relacionó positivamente con la edad de las pacientes (p=0,005) y la metilación del gen de la E-Cadherina (p=0,005). El análisis univariante de supervivencia determinó que las pacientes con EPHB4 metilado morían antes a causa del cáncer (p=0,003). En conclusión, la metilación del promotor de EPHB2 no está relacionada con la carcinogénesis ni la progresión del CE. El silenciamiento epigenético del gen EPHB4 sí está presente en este tipo tumoral, aunque en una frecuencia menor que en tumores de colon. Los CE con EPHB4 metilado aparecen en pacientes de mayor edad con una peor evolución clínica de la enfermedad. Capítulo5  Capítulo5  Introducción Los genes EPHB2 y EPHB4 (Erythropoietin-producing human hepatocellular carcinoma B2 and B4) forman parte de una extensa familia de receptores transmembrana tirosín-quinasa. Éstos se agrupan en dos subclases: EPHA y EPHB dependiendo de la homología de sus secuencias y la especificidad en la unión a sus ligandos las efrinas (EFN), ancladas también en la membrana plasmática de la célula. Las EFN-A interactúan preferiblemente con los receptores EPHA, y las EFN-B con receptores del tipo EPHB (1, 2). Así se genera una comunicación entre células adyacentes, que en el caso de los receptores EPHB y sus ligandos es bidireccional (3, 4). Esta interacción regula la adhesión, la morfología y la movilidad celular, la angiogénesis y también la tumorigenesis (5). En diferentes tipos tumorales, incluido el CE, la ruta de señalización celular Wnt/β-Catenina está alterada, debido tanto a modificaciones genéticas como epigenéticas. Esto provoca, en muchos casos, un aumento de la expresión de sus genes diana (6-8). Capítulo5 La transcripción de EPHB2 y EPHB4 está regulada por la ruta Wnt/βCatenina (9, 10). Se ha observado un aumento de la expresión de estos genes en diferentes tipos tumorales como, gastrointestinales, de mama, ovario, vejiga y en CE (11-17). Sin embargo, EPHB2 y EPHB4 son considerados genes supresores de tumores en cáncer de colon, mama y próstata, pues se ha demostrado que la pérdida de su expresión está implicada en la progresión tumoral (9, 18-21). Niveles bajos de estos receptores se asocian, en colon, con estadios avanzados y con un peor comportamiento clínico del tumor, y en mama, con tumores de alto grado (9, 18-20). Los mecanismos que inhiben o reducen la expresión de estos genes no están claros. En cáncer de colon, gástrico y de próstata, se han descrito mutaciones inactivantes y pérdidas de heterocigocidad (LOH) del gen EPHB2 (21-28). Diversos autores afirman que el silenciamiento, por metilación del promotor, de EPHB2 y EPHB4, es un proceso frecuente en tumores de colon (19, 22, 29). El objetivo de este trabajo fue determinar el estado de metilación de los promotores de los genes EPHB2 y EPHB4 en CE, su relación con variables clínico91  patológicas y moleculares de los tumores y su papel en la evolución de la enfermedad. Material y métodos Las pacientes Realizamos un estudio retrospectivo en una serie de 203 muestras de CE y 40 de endometrio sano, usado como tejido control (TC), previo consentimiento informado de las pacientes, que fueron diagnosticadas y tratadas entre octubre de 1990 y junio de 1999, en el Departamento de Obstetricia y Ginecología del Complejo Hospitalario Universitario Insular-Materno Infantil de Gran Canaria. Todas las pacientes fueron sometidas a una laparotomía exploratoria con histerectomía total, y salpingo-ooforectomía bilateral. Ninguna de ellas recibió radiación o quimioterapia preoperatoria. Todas eran de raza blanca (caucásicas), y la edad media del diagnóstico fue de 64 años, con un rango de edades comprendido entre 29 y 90 años. Las muestras de TC contenían mayoritariamente tejido epitelial endometrial en fase proliferativa o secretora, y fueron obtenidas de pacientes sometidas a una histerectomía por enfermedades ginecológicas benignas. Capítulo5 Del total de la serie, el 68% de los tumores fueron diagnosticados en estadio I, la mayoría de tipo histológico endometrioide (89%), el 74% estaban bien o moderadamente diferenciados, y el 60% no presentaban ni infiltración miometrial ni invasión vascular. El periodo de seguimiento osciló entre los 12 y los 190 meses, con una media de 93,5 meses. De estas, el 22% fallecieron a causa del CE. Determinación del estado de metilación de los genes EPHB2 y EPHB4 Tratamiento con bisulfito sódico El ADN fue tratado con bisulfito sódico utilizando el Kit comercial MethylampTM One-Step DNA Modification Kit (Epigentek Group Inc). Siguiendo las recomendaciones del fabricante, se inició el protocolo con una cantidad de 0,5µg de ADN, siendo el volumen final de elución de 10µl y la concentración final aproximada de 50ng/µl. 92  MSP (Methylation-Specific Polymerase Chain Reaction) El ADN modificado se usó para estudiar el estado de metilación de los promotores de los genes EPHB2 y EPHB4 por MSP, en un termociclador MyCycler (BioRad) (30). Las condiciones de amplificación, ligeramente modificadas, y los primers fueron los descritos en la literatura (ver anexo I, Tabla 3) (19, 22). Cada reacción contenía 50ng de ADN genómico modificado, 1x de GeneAmp PCR Gold Buffer y una unidad de AmpliTaq Gold polimerase (Applied Biosystems), 200µM de dinucleótidos trifosfato (dNTPs), 2mM de MgCl2 y 400nM de cada primer, en un volumen final de reacción de 25μl. En cada carrera se empleó el kit EpiTect PCR Control DNA Set (QIAGEN) que contenía: ADN humano metilado y no metilado, ambos tratados con bisulfito sódico, como control positivo (C+) y negativo (C-), respectivamente. También, ADN humano sin modificar (NT) usado como control del tratamiento con bisulfito sódico y una reacción sin ADN, como control de la contaminación (H2O). Los productos de MSP se corrieron en un gel de agarosa al 2% durante 45min a 100 voltios. Posteriormente se observaron y fotografiaron en un transiluminador con luz ultravioleta (ChemiDoc XRS+, BioRad). Capítulo5 Análisis estadístico La relación entre el estado de metilación y las variables clínico-patológicas y moleculares se llevó a cabo usando los test χ2 y Fisher (dependiendo del tamaño de la muestra) para aquellas variables categóricas y el test de t-Student para la edad, variable continua con una distribución normal. El tiempo transcurrido desde la cirugía hasta la fecha de la muerte, fue definido como la supervivencia específica del cáncer. Las curvas de supervivencia se construyeron usando el método de Kaplan Meier y comparadas con el test Log-rank. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando los niveles de significación bilateral eran p<0,05. Todos los análisis se realizaron con el paquete estadístico SPSS versión 15.0 para Windows (SPSS Inc. Chicago). 93  Resultados La metilación del gen EPHB2 sólo se observó en una muestra de CE. En cambio, el 8% (16/202) de los tumores mostraron metilado el promotor del gen EPHB4 (Fig. 1). Ninguna de las 40 muestras incluidas en el grupo control presentó esta alteración para ambos genes. El estado metilado de EPHB4 se relacionó con pacientes de más edad (p=0,005), pero no con otras variables clínico-patológicas como el estadio, el grado, la infiltración miometrial, la invasión vascular o el tipo histológico. Los tumores con EPHB4 metilado mostraban frecuentemente metilación del gen de la E-Cadherina (p=0,005). Ninguna otra variable molecular, como la inestabilidad microsatélite (MSI) , la ploidía o la alteración genética y epigenética de otros miembros de la ruta Wnt (β-Catenina y APC) se relacionaron con esta alteración (Tabla 1). El análisis de supervivencia, visualizado mediante las curvas de Kaplan Meier, mostró que los tumores con el EPHB4 metilado tenían un peor comportamiento clínico, las pacientes morían antes a causa de la enfermedad (p=0,003) (Fig. 2). El bajo número de eventos (n=16) no nos permitió realizar un análisis multivariante robusto. Capítulo5 2394 NTCH 2 O 2298 2350 2351 2356 2358 2368 2386 2387 2388 2391 2393 C+ MW 200 pb 100 pb 200 pb 100 pb (121 pb) U M (123 pb) EPHB2 150 pb 300 pb 150 pb 300 pb H 2 ONTC-C+ MW 1401266 294 835 863 1000 1001 1128 1346 1357 1389 1398518 738 744 M U (218 pb) (218 pb) EPHB4 Figura 1. Resultados representativos del estado de metilación de los promotores de los genes EPHB2 y EPHB4 en tumores de endometrio. U: ADN amplificado no metilado; M: ADN amplificado metilado; C+: control positivo para metilación; C-: control negativo para metilación; NT: ADN control no tratado con bisulfito sódico; H2O: control de la MSP; MW: marcador de peso molecular; pb: pares de bases. Las flechas indican los tumores metilados. Se muestra el código de referencia de las muestras tumorales. 94  Nn (%) P-valo r Edad (años) media ± DS U 63 ± 10 0,005 M70 ± 8 Estadio I1389 (6,5) II 33 4 (12) III 31 3 (10) Grado 1966 (6) 2546 (11) 3524 (7,7) Inf. Miometrial <50% 147 11 (7,5) ≥50% 55 5 (9) Inv. Vascular No 149 12 (8) Sí 53 4 (7,5) Tipo histológico Endometrioide 179 15 (8) No endometrioide 23 1 (4) MSS 161 10 (6) MSI 41 6 (15) Ploidía Diploide 152 11 (7) Aneuploide 37 3 (8) β-Catenina No mutado 168 14 (8) Mutado 34 2 (6) APC No metilado 131 10 (8) Metilado 69 6 (9) E-Cadherina No metilado 172 10 (6) Metilado 28 6 (21) Tabla 1. Relación entre las características clinico-patológicas y moleculares, y el estado de metilación del gen EPHB4 Características EPHB4 metilado Inestabilidad microsatélite 0,075 0,739 0,388 0,641 0,707 1,000 1,000 Abreviaturas: N= número de casos totales, n= número de casos con EPHB4 metilado, MSS= estables, MSI= inestables, DS= desviación standard , U= no metilado, M= metilado. 0,973 0,005 1,000 Capítulo5 95  024 48 72 96 120 20 40 60 80 100 Tiempo (meses) Supervivencia específica del cáncer (% ) U M Pacientes en riesgo 182 16 158 15 138 10 117 5 93 4 53 3 Eventos: U: (36/182) 20% M: (8/16) 50% p=0,003 U M Figura 2. Análisis de Kaplan-Meier basado en el estado de metilación de EPHB4, para la supervivencia específica del cáncer. U: pacientes con EPHB4 no metilado; M: pacientes con EPHB4 metilado. Capítulo5 Discusión La expresión de los genes EPHB2 y EPHB4 se encuentra alterada en cáncer, y parece estar relacionada con la tumorigenesis y la evolución de la enfermedad. El gen EPHB2 está localizado en el cromosoma 1p35-36. Aproximadamente un 20-33% de los tumores gastrointestinales presentan (LOH) en esta región (25-27). Estudios recientes, han puesto de manifiesto que un 41% de los carcinomas de colon, un 39% de los tumores gástricos y un 14% de los CE con MSI poseen mutaciones en el tracto A9 del exón 17 de EPHB2 (22, 23). Pero en estos tumores el estado MSI no supera el 20%. Así que debido a la baja incidencia de estas alteraciones, es probable que otro mecanismo sea el responsable de la pérdida de expresión de este gen. Trabajos recientes han estudiado el silenciamiento epigenético, por metilación del promotor, del gen EPHB2 en diferentes tipos tumorales (Tabla 2). A 96  pesar de las discrepancias encontradas, debidas probablemente a la metodología usada y al número de casos analizados, el estado de metilación del promotor EPHB2 no parece ser el responsable de la inhibición transcripcional de este gen en tumores de colon, gástrico y de ovario (20, 22, 26, 29, 31-33). Tabla 2. Estado de metilación del promotor del gen EPHB2 en diferentes tipos tumorales Tumor Referencia Método nº casos Posición Metilación (%) Alazzouzi y col. (22) MSP 101 -501 a -381 53,4 Laiho y col. (31) MSP 8 -501 a -381 63,0 Nosho y col. (32) QM-PCR 307 7,5 Guo y col. (20) BGS 35 -423 a -116 0,0 Fu y col. (30) MSP 64 -501 a -378 0,0 BGS 33 -423 a -116 0,0 Gástrico Song y col. (26) MSP 81 -501 a -381 1,2 Ovario Wu y col. (33) MSP 52 -501 a -381 0,0 En dom e t ri o Nuestro grupo MSP 202 -501 a -378 0,5 Colon A breviaturas: MSP: M ethylation Specific PCR, QM-PCR: Quantitative MethyLight real timePCR, BGS: Bisulphite genomic sequencing Capítulo5 El gen EPHB2 se expresa en el tejido endometrial sano, sin embargo existen datos contradictorios acerca del nivel de expresión en CE (12, 34). En nuestra serie, solo una de las muestras analizadas mostró metilación del promotor de EPHB2. Estos resultados indican que el silenciamiento epigenético de este gen no es común en este tipo de cáncer, igual que ocurre en la mayoría de los tumores gastrointestinales y de ovario. La metilación del promotor de EPHB2 no está relacionada con la carcinogénesis ni la progresión del CE. EPHB4 es considerado un gen supresor de tumores y un marcador pronóstico en cáncer de colon. Los pacientes con bajos niveles de este receptor recaen y mueren antes a causa de la enfermedad (19). Se ha demostrado que la inhibición de su expresión da lugar a un cambio en los patrones de expresión de genes implicados en la remodelación de la matriz extracelular, que incrementa la capacidad de invasión y migración de las células tumorales (35). La metilación del promotor inhibe la transcripción del EPHB4. Aproximadamente la mitad de los tumores de colon muestran esta alteración, que además se asocia con pacientes de 97  edad avanzada (19). En cambio en cáncer de ovario esta anomalía epigenética es poco frecuente (Tabla 3) (33). Tabla 3. Estado de metilación del promotor del gen EPHB4 en diferentes tipos tumorales Tumor Referencia Método nº casos Posición Metilación (%) Colon Dávalos y col. (19) MSP 112 -793 a -34 42,8 Ovario Wu y col. (33) MSP/BGS 52 -793 a -34 1,9 En dom e t ri o Nuestro grupo MSP 202 -793 a -34 8,0 Abreviaturas: MSP: Methylation Specific PCR, BGS: Bisulphite genomic sequencing En el endometrio sano, el receptor EPHB4 parece estar confinado en la membrana plasmática de las células epiteliales glandulares. En el tejido tumoral, se localiza en las células malignas próximas al estroma, donde la formación de nuevos vasos sanguíneos es importante para la progresión del tumor (17). Tanto en hiperplasias como en CE se ha observado un incremento en los niveles de expresión con respecto al tejido sano, poniendo de manifiesto su relación con el proceso carcinogénico. Además, se asocia con el estado post-menopáusico de las pacientes y con tumores más agresivos, de alto grado y estadio (17, 34, 36, 37). Capítulo5 A pesar de esta posible actividad oncogénica, nuestro estudio muestra que el 8% de los CE presentan metilado el promotor de EPHB4 (Tabla 3). Igual que ocurre en tumores de colon, esta alteración se asocia con pacientes de más edad y peor pronóstico (19). Además, se observa una asociación con la metilación del gen de la E-Cadherina. El silenciamiento de ambos genes podría seleccionar a un grupo de tumores con mayor capacidad proliferativa e invasiva. Conclusión La metilación del promotor de EPHB2 es prácticamente inexistente en CE. En cambio, el silenciamiento epigenético del gen EPHB4 si está presente en estos tumores, aunque en una frecuencia menor que en los colorrectales. Aparece en pacientes de mayor edad y con un peor pronóstico, lo que indica que la metilación del EPHB4 debe estar implicada en la evolución del CE como ocurre en cáncer de colon. 98  Resumen La ruta Wnt juega un papel importante en la proliferación, diferenciación y en la apoptosis celular, en los tejidos adultos. En varios tipos tumorales se observa una inapropiada activación de esta vía de señalización debido a alteraciones en algunos de sus miembros. Los genes SFRPs son reguladores negativos de esta ruta y se consideran supresores de tumores. A menudo sufren inactivación epigenética en tumores gastrointestinales y de mama entre otros, y están implicados en la carcinogénesis y en la progresión de la enfermedad. En este trabajo, evaluamos mediante MSP, el estado de metilación de los promotores de los genes SFRP1, SFRP2, SFRP4 y SFRP5, en una serie de 203 carcinomas de endometrio (CE) y 40 muestras de endometrio sano, usadas como tejido control (TC). Estudiamos su relación con variables clínico-patológicas y moleculares y, con la evolución clínica de las pacientes. Los porcentajes de metilación de los inhibidores Wnt en el grupo de tumores fue de un 33,5%, 51,5%, 24,4% y 52%, y en el TC de un 5%, 10%, 15% y 17,5% para SFRP1, SFRP2, SFRP4 y SFRP5, respectivamente. Los CE mostraron una frecuencia de metilación significativamente más elevada que el TC (p<0,0001), excepto para el gen SFRP4, para el que no se observaron diferencias en ambos grupos. No se encontró relación entre la metilación de los genes SFRP1, SFRP2 y SFRP5, de forma individualizada, y las variables clínico-patológicas. No obstante, los tumores con inestabilidad microsatélite (MSI) mostraban a menudo los genes SFRP1 y SFRP5 metilados (p=0,042 y p<0,0001, respectivamente), y aquellos con el gen SFRP1 metilado tenían frecuentemente el gen β-Catenina mutado (p=0,048) y el APC metilado (p=0,007). No se observó ninguna otra relación con las características moleculares de los tumores, ni con la supervivencia de las pacientes. La metilación conjunta de los genes SFRP1/2/5 se asoció con estadios avanzados (p=0,022), infiltración miometrial (p=0,002), invasión vascular (p=0,019) y con una menor supervivencia específica del cáncer (p=0,015) en el análisis univariante. Estos datos ponen de manifiesto que la metilación conjunta de los genes SFRPs tiene un posible papel como biomarcador epigenético en CE. Capítulo6 105  Capítulo6  Introducción La ruta Wnt regula diferentes procesos celulares implicados en el desarrollo y en el mantenimiento de los tejidos adultos. La familia SFRP (Secreted frizzledrelated proteins) está formada por cinco glicoproteínas (SFRP1-5), identificadas como antagonistas de esta vía de señalización celular. A través de su dominio amino terminal, rico en cisteínas (CRD), las proteínas SFRP interactúan con los ligandos Wnt impidiendo su unión al receptor Fz (Frizzled), o bien, se unen directamente al receptor Fz formando un complejo no funcional. Como consecuencia de ello, la βCatenina intracelular es degradada, evitando su acumulación en el núcleo de la célula e impidiendo su unión al complejo de transcripción TCF/LEF (T-Cell factor/Lymphoid enhancer-binding factor). De esta manera, la expresión de genes dependientes del complejo TCF/LEF se ve inhibida (1). En varios tipos de cáncer los miembros de la ruta Wnt se encuentran genética y/o epigenéticamente alterados, causando una inapropiada activación de esta vía de señalización (2-4). El silenciamiento, por metilación del promotor de los genes SFRPs, excepto para el SFRP3 que no presenta islas CpG en su región promotora, es frecuente en tumores gastrointestinales y de mama, entre otros (5-9). En cáncer colorrectal, esta alteración epigenética ocurre en etapas iniciales, durante la transición de adenoma a carcinoma, lo que indica que debe estar implicado en la carcinogénesis (6, 8). Por esta razón, los SFRPs son considerados genes supresores de tumores y su pérdida favorece la progresión tumoral (10). En el CE, se han observado niveles bajos de expresión de SFRP1 y SFRP4, que en el caso del SFRP1 se ha asociado con la metilación de su promotor (11). Capítulo6 Este trabajo analiza el silenciamiento epigenético, por metilación del promotor de los genes SFRP1, SFRP2, SFRP4 y SFRP5, y su relación con la alteración de otros miembros de la ruta Wnt, como β-Catenina, APC y E-Cadherina. Se estudia también, su asociación con otras variables clínico-patológicas y moleculares, así como su implicación en la progresión de la enfermedad. 107  Material y métodos Análisis del estado de metilación de los genes SFRP1, SFRP2, SFRP4 y SFRP5 El estado de metilación de los promotores de los genes SFRPs se determinó en nuestra serie de 203 CE y 40 TC. Después del tratamiento con bisulfito sódico, la MSP fue la metodología usada para este análisis (12). Se usaron las condiciones de amplificación, ligeramente modificadas, y los primers descritos en la literatura (Ver anexo I, Tabla 2) (8). Los productos de MSP se corrieron en un gel de agarosa al 2% durante 45min a 100 voltios. Posteriormente se observaron y fotografiaron en un transiluminador con luz ultravioleta (ChemiDoc XRS+, BioRad). Análisis estadístico La relación entre el estado de metilación de los genes SFRPs y las variables clínico-patológicas y moleculares se llevó a cabo usando los test χ2 y Fisher (dependiendo del tamaño de la muestra) para aquellas variables categóricas y el test de t-Student para la edad de diagnóstico de las pacientes. El tiempo transcurrido desde la cirugía hasta la fecha de la muerte, a causa de la enfermedad, fue definido como la supervivencia específica al cáncer. Las curvas de supervivencia se construyeron usando el método de Kaplan Meier y comparadas con el test Log-rank. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando los niveles de significación bilateral eran p<0,05. Todos los análisis se realizaron con el paquete estadístico SPSS versión 15.0 para Windows (SPSS Inc. Chicago). Capítulo6 108  Resultados El estado de metilación de los genes SFRP1, SFRP2, SFRP4 y SFRP5 Los porcentajes de metilación de los promotores de los genes SFRPs fueron de un 33,5%, 51,5%, 24,4% y 52% en los CE y de un 5%, 10%, 15% y 17,5% en el TC para SFRP1, SFRP2, SFRP4 y SFRP5, respectivamente (Tabla 1). La frecuencia de metilación fue más elevada en los tumores vs. el grupo control (p<0,0001), excepto para el gen SFRP4, para el que no se observaron diferencias significativas entre ambos grupos (Tabla 1). La Figura 1 muestra un ejemplo representativo de los resultados obtenidos para cada uno de los genes, en el grupo de tumores analizados. 1819 1820 2022 2036 2063 2099 2106 2107 2112 2113 2115 NTCH2O 2114 C+ MW 1658 1802 1647 SFRP1 (135 pb) (126 pb) U M 164 166 266 270 290 294 298 303 307 346 521 NTCH2O 347 C+ MW 134 155110 SFRP2 Capítulo6 (138 pb) (145 pb) M U 164 166 266 270 290 294 298 307 346 521 NTCH2O 347 C+ MW 134 155110 525 (111 pb) (115 pb) M U SFRP4 1125 1128 1130 1131 1277 1340 1346 1347 1350 1353 1357 NTCH2O 1356 C+ MW 874 1001835 SFRP5 (141 pb) U M (136 pb) Figura 1. Resultados representativos del estado de metilación de los promotores de los genes SFRPs en tumores de endometrio. U: ADN amplificado no metilado; M: ADN amplificado metilado; C+: control positivo para metilación; C-: control negativo para metilación; NT: ADN control no tratado con bisulfito sódico; H2O: control de la MSP; MW: marcador de peso molecular; pb: pares de bases. Las flechas indican los tumores metilados. Se muestra el código de referencia de las muestras tumorales. 109  P-valor P-valor Nn (%) Nn (%) Nn (%) Nn (%) Nn (%) SFRP1 28 10 (35,7) 101 16 (15,8) 27 2 (7,4) 0,3594 201 67 (33,5) 40 2 (5,0) <0,0001 SFRP2 105 54 (51,4) 25 4 (16,0) 0,0015 202 104 (51,5) 40 4 (10,0) <0,0001 SFRP4 103 5 (4,9) 27 0 (0,0) 0,5830 201 49 (24,4) 40 6 (15,0) 0,2782 SFRP5 105 50 (47,6) 22 4 (18,2) 0,0164 202 105 (52,0) 40 7 (17,5) <0,0001 Tumor (MSP) Nuestra serie Control Risinger y Col; 2005 Tumor Control (MSP y COBRA) (Ref. 36) Suehiro y Col; 2008 Tabla 1. Frecuencias de metilación de los promotores de los genes SFRPs en endometrio (Tumor vs. Control) Abreviaturas: MSP= M ethylation specific PCR, COBRA= Combined bisulfite restriction analysis, N= número de casos totales, n= número de casos metilados, Ref.= referencia. Gen Tumor (MSP) (Ref. 11) Capítulo6 110  Relación entre el estado de metilación de los genes SFRP1, SFRP2 y SFRP5, y las variables clínico-patológicas, moleculares y la supervivencia No se encontró relación entre la metilación de los genes SFRP1, SFRP2 y SFRP5, de forma individualizada, y las variables clínico-patológicas, como la edad de las pacientes, el estadio, el grado de diferenciación, la infiltración miometrial, la invasión vascular o el tipo histológico (endometrioide o no endometrioide) de los tumores (Tabla 2). El estado metilado de los genes SFRP1 y SFRP5 se relacionó con el estado MSI de los CE (p=0,042 y p=0,000, respectivamente). La alteración epigenética del gen SFRP1 fue más frecuente en aquellos tumores con el gen β-Catenina mutado (p=0,048) y el gen APC metilado (p=0,007). No se observó ninguna otra relación con las características moleculares de los tumores (Tabla 2). En el análisis univariante, la metilación de estos genes tampoco se relacionó con un cambio significativo en la supervivencia específica del cáncer (p=0,601, p=0,241, p=0,585, para SFRP1, SFRP2 y SFRP5, respectivamente). Capítulo6 Relación entre la metilación conjunta de los genes SFRP1/2/5, y las variables clínico-patológicas, moleculares y la supervivencia Para conocer el efecto del silenciamiento conjunto de los genes SFRP1/2/5, se dividieron las muestras tumorales en dos grupos: uno denominado metilado (M) donde se incluyeron las que mostraban estos tres genes metilados, y otro grupo con el resto, denominado no metilado (U). Los tumores M mostraron estadios avanzados (p=0,022), infiltración miometrial (p=0,002) e invasión vascular (p=0,019), además de una asociación positiva, marginalmente significativa, con la edad de las pacientes (p=0,056). Sin embargo, la metilación conjunta no se relacionó con ninguna de las variables moleculares estudiadas, como el estado MSI, la ploidía o las alteraciones genéticas y epigenéticas de miembros de la ruta Wnt (β-Catenina, APC y E-Cadherina) (Tabla 3). El análisis univariante de supervivencia mostró que las pacientes con metilación conjunta de los genes SFRP1/2/5 tenían una peor evolución clínica de la 111  enfermedad (p= 0,015) (Fig. 2). El bajo número de eventos (n=10) no nos permitió uun análisis multivariante robusto. Se hace necesario ampliar el número de casos de nuestra serie para confirmar su papel como marcador pronóstico independiente Nn (%)P-valor n (%) P-valor n (%) P-valor Edad (años) media ± DS U 63 ± 11 64 ± 9 64 ± 11 M 66 ± 9 64 ± 10 64 ± 10 Estadio I 138 47 (34) 69 (50) 70 (51) II 32 10 (31) 17 (53) 15 (46) III 31 10 (32) 18 (58) 20 (65) Grado 1 96 34 (36) 49 (51) 50 (52) 2 54 16 (30) 28 (52) 25 (46) 3 52 17 (33) 27 (52) 30 (58) Inf. Miometrial <50% 146 48 (33) 71 (48) 71 (48) ≥50% 55 19 (34) 33 (60) 34 (62) Inv. Vascular No 149 50 (34) 74 (49) 74 (50) Sí 52 17 (33) 30 (58) 31 (59) Tipo histológico Endometrioide 179 63 (35) 95 (53) 93 (52) No endometrioide 23 4 (17) 9 (39) 12 (52) MSS 161 48 (30) 79 (49) 73 (45) MSI 41 19 (46) 25 (61) 32 (78) Ploidía Diploide 151 52 (34) 81 (54) 81 (53) Aneuploide 37 8 (22) 16 (43) 17 (46) β-Catenina No mutado 169 51 (30) 88 (52) 89 (53) Mutado 33 16 (50) 16 (49) 16 (48) APC No metilado 131 35 (27) 70 (53) 64 (49) Metilado 69 32 (46) 34 (49) 41 (60) E-Cadherina No metilado 172 57 (33) 87 (51) 87 (51) Metilado 28 10 (36) 17 (61) 18 (67) 0,909 0,300 0,271 Abreviaturas: N= número de casos totale , n= número de casos metilados, U= no metilado, M= metilado, DS= desviación standard, MSS= estables, MSI= inestables. Tabla 2. Relación entre las características clinico-patlógicas y moleculares, y la metilación de los genes SFRPs Características SFRP1 metilado SFRP2 metilado SFRP5 metilado 0,386 0,290 0,631 0,912 0,626 0,842 0,140 0,088 0,029 0,707 0,661 0,086 0,577 0,822 0,102 0,209 0,984 0,790 0,005 0,577 0,126 0,789 0,321 0,121 Inestabilidad microsatélite 0,048 0,174 0,000 0,159 0,258 0,424 Capítulo6 112  Nn (%)P-valor Edad (años) media ± DS U 64 ± 10 M 67 ± 7 Estadio I 137 14 (10) II 16 5 (16) III 26 8 (26) Grado 1 94 11 (12) 2179 (17) 3527 (13) Inf. Miometrial <50% 145 13 (9) ≥50% 55 14 (25) Inv. Vascular No 148 15 (10) Sí 52 12 (23) Tipo histológico Endometrioide 177 26 (15) No endometrioide 23 1 (4) MSS 159 18 (11) MSI 41 9 (22) Ploidía Diploide 151 21 (14) Aneuploide 36 2 (5) β-Catenina No mutado 169 22 (13) Mutado 31 5 (16) APC No metilado 131 15 (11) Metilado 68 12 (31) E-Cadherina No metilado 172 22 (13) Metilado 27 5 (18) Abreviaturas: N= número de casos totales, n= número de casos metilados, U= no metilado, M= metilado, DS= desviación standard, MSS= estables, MSI= inestables. 0,276 0,420 0,579 Inestabilidad microsatélite 0,120 0,259 0,056 0,326 0,022 Ta bl a 3 . Relación entre las características clinico-patológicas y moleculares y, la metilación conjunta de SFRP1/2/5 Características SFRP1/2/5 metilados 0,677 0,002 0,019 Capítulo6 113  100 Figura 2. Análisis de Kaplan-Meier para la supervivencia específica del cáncer basada en el estado de metilación conjunto de los SFRP1/2/5. U: no metilado, M: metilado. U M Pacientes en riesgo 170 26 149 22 131 14 109 10 86 8 50 5 Eventos: U: (34/170) 20% M: (10/26) 38% p=0,015 U M 024 48 72 96 120 40 60 80 Tiempo (meses) Supervivencia específica del cáncer (%) Capítulo6 114  121 46. Veeck J, Niederacher D, An H, Klopocki E, Wiesmann F, Betz B, Galm O, Camara O, Durst M, Kristiansen G, Huszka C, Knuchel R, Dahl E 2006 Aberrant methylation of the Wnt antagonist SFRP1 in breast cancer is associated with unfavourable prognosis. Oncogene 25:3479-3488. 47. Veeck J, Noetzel E, Bektas N, Jost E, Hartmann A, Knuchel R, Dahl E 2008 Promoter hypermethylation of the SFRP2 gene is a high-frequent alteration and tumor-specific epigenetic marker in human breast cancer. Mol Cancer 7:83. 48. Zhao CH, Bu XM, Zhang N 2007 Hypermethylation and aberrant expression of Wnt antagonist secreted frizzled-related protein 1 in gastric cancer. World J Gastroenterol 13:2214-2217. Capítulo6  Capítulo6  Capítulo7  LametilacióndelgenPITX2esunmarcadordepeor pronósticoenlostumoresdeendometrio    conuncontenidodiploidedeADN                 Capítulo7 RaquelRamírez RuymánSantana RudolfNapieralski GermánRodríguez ertsAnietaM.Sieuw LeandroFernández CristinaBilbao OrlandoFalcón LaureanoLeón   ManfredSchmitt JohnW.M.Martens JohnA.Foekens NicolásDíaz‐Chico JuanCarlosDíazChico  Capítulo7  Resumen PITX2 (Paired-like homeodomain 2) es un factor de transcripción, miembro de la familia RIEG/PITX homeobox, que regula la diferenciación de la hipófisis y el establecimiento de una adecuada asimetría en la organogénesis durante el desarrollo embrionario. El estado de metilación de su promotor P2 es un marcador pronóstico validado en pacientes con cáncer de mama y próstata. El objetivo de este estudio fue determinar la posible asociación entre el estado de metilación de PITX2 con las variables clínico-patológicas y moleculares, y el comportamiento clínico de las pacientes con carcinoma de endometrio (CE). Los niveles de metilación del promotor P2 de PITX2 se estimaron por QM-PCR (Quantitative MethylLight real time Polymerase Chain Reaction), en una serie de 203 muestras de CE y 40 de endometrio sano usadas como tejido control (TC). Tomando la metilación del PITX2 como una variable continua, se observó que el nivel de metilación en los CE fue significativamente más elevado que en el TC (p=0,03). Dado que el valor del cuartil más alto en la serie tumoral (6,57%) superó el valor de metilación más elevado en TC (5,96%), se categorizó esta variable en dos grupos denominados: de bajo (<6,6%) y de alto nivel de metilación (≥6,6%). No se encontró ninguna asociación entre el estado de metilación del PITX2 y las variables clínicopatológicas y moleculares estudiadas, excepto una asociación positiva con la inestabilidad microsatélite (MSI) (p=0,006). No obstante, aquellas pacientes con CE, un alto nivel de metilación de PITX2 y un contenido diploide de ADN tenían una peor evolución clínica de la enfermedad tanto en el análisis univariante como multivariante de supervivencia (p=0,007; HR: 1,60; 95% CI: 1,02-2,53; p=0,04, respectivamente). Este es el primer trabajo que estudia la alteración epigenética de PITX2 en tumores de endometrio, muestra su relación con el estado MSI y su posible utilidad pronostica en pacientes con CE con un contenido diploide de ADN. Capítulo7 125  Capítulo7  Introducción Los genes homeobox juegan un importante papel controlando el destino celular en el desarrollo embrionario, y la expresión específica de genes en adultos. Entre ellos se encuentra la familia RIEG/PITX, formada por tres genes PITX1, 2 y 3 (1). El gen PITX2 (paired-like homeodomain 2), también llamado RIEG1 o ARP1, está evolutivamente conservado, en humanos se localiza en el cromosoma 4q25 y codifica para cuatro isoformas (PITX2A, B, C y D). Su expresión está bajo el control de dos promotores (P1 y P2). A partir de P2 se generan PITX2A y B, y a partir de P1 PITX2C y D (2-5) (Fig 5-1). Estas proteínas actúan como factores de transcripción y están implicadas en numerosos procesos: proliferación y diferenciación celular, hematopoyesis y en la organogénesis (4, 6-11) . La ruta Wnt/β-catenina regula la expresión de PITX2A y B, que parece estar relacionada con el desarrollo normal de la hipófisis (8). Pero PITX2 no es solo un gen diana de la ruta Wnt/β-catenina, sino que además coopera en esta vía de señalización, formando un complejo con la β-catenina y LEF/TCF. Así, regula la proliferación celular y establece un proceso de retroalimentación positiva. Es capaz también, de inducir directamente la expresión de genes reguladores del ciclo celular como las ciclinas D1/D2 y de otros factores de transcripción como c-Myc (8, 12-14). En humanos, las mutaciones de este gen causan el síndrome de AxenfeldRieger, una alteración autosómica dominante que produce principalmente malformaciones faciales, oculares y dentales (5, 15, 16). No se ha encontrado ninguna asociación de este síndrome con el desarrollo de tumores. Aunque sí parece existir una alteración en la expresión de PITX2 en diferentes adenomas hipofisarios (17). Capítulo7 En líneas celulares de cáncer de mama se ha observado que la metilación del promotor P2 de PITX2 inhibe la expresión de las isoformas PITXA y B, sin embargo se desconoce si esto ocurre también en los tumores (18). A pesar de no conocerse el papel que juega el PITX2 en la carcinogénesis y en la progresión tumoral, estudios recientes han demostrado que la metilación del promotor P2 es un marcador de peor pronóstico en pacientes con cáncer de mama y próstata (18-22). 127  El propósito de este estudio fue determinar la posible relación entre los niveles de metilación del promotor P2 del gen PITX2 con las variables clínicopatológicas y moleculares, y el comportamiento clínico de las pacientes con CE. Material y métodos Las pacientes Este estudio retrospectivo se realizó en nuestra serie de 203 muestras de CE y 40 de endometrio sano, usadas como tejido control (TC), cuyas características se detallan en el capítulo 5 de este manuscrito. Determinación del estado de metilación del promotor del gen PITX2 El ADN modificado con bisulfito sódico se usó para cuantificar el nivel de metilación del promotor P2 del gen PITX2 por QM-PCR (Quantitative MethylLight real time-Polymerase Chain Reaction), en un ABI Prism 7000 Sequence Detection System con Sequence detection software v1.2.3 (Applied Biosystems)(23). Cada reacción contenía 1x de EpiTect MethyLight Master Mix (QIAGEN), 1x de EpiTect MethyLight Assay: Hs PITX2 (QIAGEN) y 100ng de ADN genómico modificado, en un volumen final de reacción de 20μl. Los ciclos de PCR se iniciaron con una desnaturalización de 95ºC durante 5 minutos seguida de 45 ciclos de, 95ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 1 minuto. En un experimento inicial, la especificidad de la prueba se midió con el kit EpiTect PCR Control DNA Set (QIAGEN). Este kit contiene ADN humano metilado y no metilado, ambos tratados con bisulfito sódico, y ADN humano sin modificar. Además, en cada una de las carreras de PCR se incluyó una reacción con ADN no modificado y otra sin ADN, como control de la contaminación. Cada muestra se analizó por triplicado. Capítulo7 128  El porcentaje de metilación o la abundancia relativa de copias de ADN metilado se determinó usando los valores Ct (cycles thrershold value), basados en la señal de fluorescencia de cada sonda (Ctm y Ctu para la sonda M y U, respectivamente), y aplicando la siguiente ecuación: Metilación (%) =100[100/(1 +2[Ctm-Ctu])]. La media de los triplicados determinó el valor final del porcentaje de metilación de la muestra (18). Análisis estadístico Se usó el test Mann-Whitney para comparar los grupos tumor/control, usando el porcentaje de metilación de las muestras como variable continua. Para dicotomizar esta variable se tomó el valor del percentil 75 como punto de corte. La relación entre el estado de metilación del PITX2, como variable dicotómica, y las variables clínico-patológicas y moleculares se llevó a cabo usando los test χ2 y Fisher (dependiendo del tamaño de la muestra) para aquellas variables categóricas y el test de t-Student para las variables continuas con una distribución normal. La supervivencia específica del cáncer corresponde al tiempo transcurrido desde la cirugía hasta la fecha de la muerte a causa de la enfermedad. Las curvas de supervivencia se construyeron usando el método de Kaplan Meier y comparadas con el test Log-rank. Para determinar el Hazard ratios (HR) y su intervalo de confianza (95% CI), en el análisis univariante y multivariante, se usó la regresión de Cox. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando los niveles de significación bilateral eran p<0,05. Todos los análisis se realizaron con el paquete estadístico SPSS versión 15.0 para Windows (SPSS Inc. Chicago). Capítulo7 Resultados El nivel de metilación del promotor del gen PITX2 en el grupo de tumores fue significativamente más elevado que en el grupo control [mediana (rango); CE: 1,93 (0-78) vs. TC: 1,49 (0-6)] (p=0,03) (Fig. 1). Dado que el porcentaje de metilación que corresponde al percentil 75 en el grupo tumor (6,57%) superó el valor de metilación más alto del grupo control 129  (5,96%), las pacientes de los tres primeros cuartiles se agruparon en un grupo denominado de bajo nivel de metilación (Bajo<6.6%) y se compararon con el grupo de pacientes del cuartil más alto (Alto≥6.6%). No se encontró ninguna relación entre un alto nivel de metilación del promotor del PITX2 y las variables clínicopatológicas y moleculares, excepto una asociación positiva con el estado MSI (p=0,006) (Tabla 1). El análisis univariante mostró que el estado de metilación de este gen no modificaba el tiempo de supervivencia específica del cáncer en el total de la serie (p=0,142). En cambio, los tumores con niveles altos de metilación del PITX2 y un contenido diploide de ADN tenían una peor evolución clínica (p=0,007) (Fig. 2). Para determinar si el nivel de metilación de PITX2 poseía un valor pronóstico independiente en este grupo de pacientes, se realizó un análisis multivariante. Se diseñó un modelo básico, donde se incluyeron los factores pronósticos tradicionales para el CE con una significancia ≤0,1 en el análisis univariante, al que se le añadió el estado de metilación del PITX2. En este análisis se observó que el estado de metilación del PITX2 persistía como variable independiente en el modelo de supervivencia (HR: 1,60; 95%CI: 1,02-2,53; p=0,042) (Tabla 2). 80 Control Capítulo7 Metilación del gen PITX2 (%) 60 40 20 0 Tumor Figura 1. Distribución del estado de metilación del promotor del gen PITX2 en el grupo Control vs. Tumor. Cada círculo representa una muestra. La línea horizontal es el valor del p ercentil 75 ( 6 , 6% ) . 130  15. Alward WL, Semina EV, Kalenak JW, Heon E, Sheth BP, Stone EM, Murray JC 1998 Autosomal dominant iris hypoplasia is caused by a mutation in the Rieger syndrome (RIEG/PITX2) gene. Am J Ophthalmol 125:98-100. 16. Espinoza HM, Cox CJ, Semina EV, Amendt BA 2002 A molecular basis for differential developmental anomalies in Axenfeld-Rieger syndrome. Hum Mol Genet 11:743-753. 17. Pellegrini-Bouiller I, Manrique C, Gunz G, Grino M, Zamora AJ, Figarella-Branger D, Grisoli F, Jaquet P, Enjalbert A 1999 Expression of the members of the Ptx family of transcription factors in human pituitary adenomas. J Clin Endocrinol Metab 84:2212-2220. 18. Maier S, Nimmrich I, Koenig T, Eppenberger-Castori S, Bohlmann I, Paradiso A, Spyratos F, Thomssen C, Mueller V, Nahrig J, Schittulli F, Kates R, Lesche R, Schwope I, Kluth A, Marx A, Martens JW, Foekens JA, Schmitt M, Harbeck N 2007 DNA-methylation of the homeodomain transcription factor PITX2 reliably predicts risk of distant disease recurrence in tamoxifen-treated, node-negative breast cancer patients--Technical and clinical validation in a multi-centre setting in collaboration with the European Organisation for Research and Treatment of Cancer (EORTC) PathoBiology group. Eur J Cancer 43:1679-1686. 19. Harbeck N, Nimmrich I, Hartmann A, Ross JS, Cufer T, Grutzmann R, Kristiansen G, Paradiso A, Hartmann O, Margossian A, Martens J, Schwope I, Lukas A, Muller V, Milde-Langosch K, Nahrig J, Foekens J, Maier S, Schmitt M, Lesche R 2008 Multicenter study using paraffin-embedded tumor tissue testing PITX2 DNA methylation as a marker for outcome prediction in tamoxifen-treated, node-negative breast cancer patients. J Clin Oncol 26:5036-5042. 20. Hartmann O, Spyratos F, Harbeck N, Dietrich D, Fassbender A, Schmitt M, Eppenberger-Castori S, Vuaroqueaux V, Lerebours F, Welzel K, Maier S, Plum A, Niemann S, Foekens JA, Lesche R, Martens JW 2009 DNA methylation markers predict outcome in node-positive, estrogen receptor-positive breast cancer with adjuvant anthracycline-based chemotherapy. Clin Cancer Res 15:315-323. 21. Nimmrich I, Sieuwerts AM, Meijer-van Gelder ME, Schwope I, Bolt-de Vries J, Harbeck N, Koenig T, Hartmann O, Kluth A, Dietrich D, Magdolen V, Portengen H, Look MP, Klijn JG, Lesche R, Schmitt M, Maier S, Foekens JA, Martens JW 2008 DNA hypermethylation of PITX2 is a marker of poor prognosis in untreated lymph node-negative hormone receptor-positive breast cancer patients. Breast Cancer Res Treat 111:429-437. Capítulo7 22. Weiss G, Cottrell S, Distler J, Schatz P, Kristiansen G, Ittmann M, Haefliger C, Lesche R, Hartmann A, Corman J, Wheeler T 2009 DNA methylation of the PITX2 gene promoter region is a strong independent prognostic marker of biochemical recurrence in patients with prostate cancer after radical prostatectomy. J Urol 181:1678-1685. 23. Martens JW, Nimmrich I, Koenig T, Look MP, Harbeck N, Model F, Kluth A, Boltde Vries J, Sieuwerts AM, Portengen H, Meijer-Van Gelder ME, Piepenbrock C, Olek A, Hofler H, Kiechle M, Klijn JG, Schmitt M, Maier S, Foekens JA 2005 Association of DNA methylation of phosphoserine aminotransferase with response to endocrine therapy in patients with recurrent breast cancer. Cancer Res 65:41014117. 24. Martens JW, Margossian AL, Schmitt M, Foekens J, Harbeck N 2009 DNA methylation as a biomarker in breast cancer. Future Oncol 5:1245-1256. 25. Goodfellow PJ 2009 Clinicopathologic significance of DNA mismatch repair defects in endometrial cancer: the devil is in the details. Gynecol Oncol 113:151152. 137  26. Ionov Y, Peinado MA, Malkhosyan S, Shibata D, Perucho M 1993 Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequences reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis. Nature 363:558-561. 27. Esteller M, Levine R, Baylin SB, Ellenson LH, Herman JG 1998 MLH1 promoter hypermethylation is associated with the microsatellite instability phenotype in sporadic endometrial carcinomas. Oncogene 17:2413-2417. 28. Esteller M, Catasus L, Matias-Guiu X, Mutter GL, Prat J, Baylin SB, Herman JG 1999 hMLH1 promoter hypermethylation is an early event in human endometrial tumorigenesis. Am J Pathol 155:1767-1772. 29. Kanaya T, Kyo S, Maida Y, Yatabe N, Tanaka M, Nakamura M, Inoue M 2003 Frequent hypermethylation of MLH1 promoter in normal endometrium of patients with endometrial cancers. Oncogene 22:2352-2360. 30. Kang S, Lee JM, Jeon ES, Lee S, Kim H, Kim HS, Seo SS, Park SY, Sidransky D, Dong SM 2006 RASSF1A hypermethylation and its inverse correlation with BRAF and/or KRAS mutations in MSI-associated endometrial carcinoma. Int J Cancer 119:1316-1321. 31. Zysman M, Saka A, Millar A, Knight J, Chapman W, Bapat B 2002 Methylation of adenomatous polyposis coli in endometrial cancer occurs more frequently in tumors with microsatellite instability phenotype. Cancer Res 62:3663-3666. Capítulo7 138  Capítulo8 AbstractinEnglish               Capítulo8          Capítulo8  Endometrial cancer (EC) is the most common pelvic gynecologic tumor in developed countries. It is usually diagnosed in early stages, but despite its good prognosis, approximately 20% of patients die from the disease. The prognosis and current treatment of endometrial cancer is based on the use of clinical-pathological variables such as grade, myometrial infiltration, histological type, etc. Along with these, have been described new molecular variables involved in the tumorigenesis and progression of this tumor type. Its use in clinical practice could be helpful to improve the classification of tumors, prognosis and treatment of patients. Our group, in collaboration with the Pathology Department and Gynecologic Oncology Unit of Gynecology and Obstetrics Department of the Hospital Universitario Materno-Insular, has been twenty years developing research projects aimed toward understanding the molecular alterations that occur in the development and evolution of this disease. In 2000, The Cancer Genetics and Epigenetics Laboratory led by Dr. Manuel Perucho (The Burnham Institute, La Jolla, CA, USA), discoverer of microsatellite instability, mutator route and their involvement in various malignancies joined the initiative. From that moment our research is focused on the study of this genetic anomaly, and others related to it, in EC. This doctoral thesis aims to continue the research line developed by our group. The proposed objectives were to estimate the incidence, the relationship with clinicopathological and molecular variables and survival of patients, of the following genetic and epigenetic changes: Capítulo8 1) Mutations in the repeated tracts of EPHB2 gene (Chapter 3). 2) Mutations in double strand break repair components (Chapter 4). 3) Methylation of EPHB2 and EPHB4 gene promoter (Chapter 5). 4) Methylation of SFRPs gene promoter (Chapter 6). 5) Methylation of PITX2 gene promoter (Chapter 7). 141  In this way, we have wanted to deepen the understanding of molecular variables, which possibly, are associated with the development and progression of EC. Chapter 3 High EPHB2 mutation rate in gastric but not endometrial tumors with microsatellite instability The EPH/EFN family of receptor tyrosine kinases regulates cell adhesion and migration and has an important role in controlling cell positioning in the normal intestinal epithelium. Inactivation of EPHB2 has recently been shown to accelerate tumorigenesis in the colon and rectum, and we have previously demonstrated frequent frameshift mutations (41%) in an A9 coding microsatellite repeat in exon 17 of EPHB2 in colorectal tumors with microsatellite instability (MSI). In this study we extended these analyses to extracolonic MSI cancers, and found frameshift EPHB2 mutations in 39% (25/64) of gastric tumors and 14% (8/56) of endometrial tumors. Regression analysis of these EPHB2 mutation data on the basis of our previously proposed statistical model identified EPHB2 as a Selective Target of frameshift mutations in MSI gastric cancers but not in MSI endometrial carcinomas. These results suggest a functional role for EPHB2 in gastric tumor progression, and emphasize the differences between the tumorigenic processes in MSI gastrointestinal and endometrial cancer. Capítulo8 Chapter 4 Double strand break repair components are frequent targets of microsatellite instability in endometrial cancer DNA double strand break (DSB) repair is a central cellular mechanism of the DNA damage response to maintain genomic stability. DSB components are frequently mutated in colorectal cancer with microsatellite instability (MSI). We investigated whether DSB repair is involved in endometrial cancer (EC) with MSI. 142  Mononucleotide microsatellite tracts of 14 genes of the DSB repair system were analysed in a series of 41 EC with MSI. Among these genes, the microcephalin 1 (MCPH1/BRIT1) has never been tested as target of MSI in tumour series.The most frequently mutated gene was DNAPKcs (n=14.34%) followed by RAD50 (n=7.17%), MRE11, ATR and BRCA1 (n=6.15%), and by CtIP and MCPH1 (n=5.12%). While DSB biallelic mutations were infrequent, a high proportion of tumours (n=30.73%) presented mutations at some component of the DSB repair pathway, and almost half of them showed alterations at two or more components. Tumours with mutations in two or more genes were significantly associated with advanced grade (p=0.03) and vascular invasion (p=0.02) and marginally associated with advanced stage (p=0.07). Our results suggest that in EC, the DSB repair is a relatively common mutational target of MSI and might contribute to tumour progression, and also that MCHP1 may be a novel target gene of MSI. Chapter 5 Epigenetics silencing of EPHB4 gene as a potential prognostic marker in endometrial cancer EPHB4, EPHB2 receptors and their ligands Ephrins, are involve in cell morphology, adhesion, and motility. Its expression is regulated by Wnt/β-catenin pathway. In colon, breast and prostate cancer are considered as tumor suppressor genes. Loss of expression by genetic or epigenetic alterations, are associated with carcinogenesis and tumor progression. In this study, we determine if the methylation status of EPHB2 and EPHB4 genes is related to endometrial cancer (EC) progression. The EPHB2 promoter methylation was found only in one of the 203 EC analyzed. In contrast, 8% of the tumors had methylated EPHB4 promoter. For both genes, none of the 40 samples used as a control group showed this alteration. Furthermore, EPHB4 methylated status was positively associated with patients age (p= 0.005) and E-Cadherin promoter methylation (p= 0.005). In univariate survival analysis, patients with methylated EPHB4 died earlier than those with unmethylated EPHB4 (p=0.003). In conclusion, EPHB2 promoter methylation is not related eith er Capítulo8 143  to EC carcinogenesis or progression. EPHB4 silencing is also present in EC, but it methylation frequency is lower than in colon cancer. This alteration appears in elderly patients with a worse clinical outcome. Chapter 6 Simultaneus methylation of SFRP1, 2 and 5 genes is associated with poor outcome in endometrial cancer patients In adult tissues, Wnt pathway plays an important role in cell proliferation, differentiation and apoptosis. In some tumor types alterations of its members cause an inappropriate activation of this signaling. The SFRPs members act as negative regulators of Wnt pathway, and are considered tumor suppressors genes. The epigenetic inactivation of thes genes is frequent in breast and gastrointestinal cancer. This alteration is involved in carcinogenesis and cancer progression. In this work, we evaluated by MSP, the methylation status of SFRP1, SFRP2, SFRP4 and SFRP5 gene promoters in a series of 203 endometrial carcinomas (EC) and 40 healthy endometrium samples as tissue control (TC). We studied the relation the epigenetic alteration with molecular and clinicopathologic variables and clinical outcome of patients. The methylation percentages of Wnt inhibitors was in the tumor group 33.5%, 51.5%, 24.4% and 52%, and in TC group 5%, 10%, 15% and 17,5%, for SFRP1, SFRP2, SFRP4 and SFRP5 respectively. The EC had a significantly higher methylation frequency than the TC (p <0.0001), except for SFRP4 gene. No relationship was found between methylation of SFRP1, SFRP2 and SFRP5 genes, individually, and clinicopathologic variables. However, the methylation status of SFRP1 and SFRP5 genes was frequent in tumors with microsatellite instability (MSI), (p=0.042 and p <0.001, respectively). Furthermore, tumors with SFRP1 methylated also were carriers of β-Catenin mutations (p=0.048) and methylation of APC gene promoter (p=0.007). Other molecular characteristics of tumors or survival of patients were unrelated with the methylation status of these genes. In univariate analysis, simultaneous inactivation of SFRP1, 2 and 5 was associated with advanced stages (p = 0.022), myometrial infiltration (p = 0.002), vascular invasion (p = Capítulo8 144  145 0.019) and lower cancer-specific survival (p = 0.015). Our data suggest the SFRP1, 2 and 5 simultaneous methylation is a possible epigenetic biomarker in EC. Chapter 7 PITX2 methylation status as a novel prognostic marker in endometrial tumors with diploid DNA content Paired-like homeodomain 2 (PITX2) is a member of RIEG/PITX homeobox family and acts as a transcription factor. It plays substantial roles in pituitary differentiation and normal embryonic asymmetry. The P2 promoter methylation status of PITX2 gene is a validated prognostic marker in patients with breast and prostate cancer. The aim of this study was to determine the possible association between PITX2 methylation status with clinicopathologic and molecular variables, and clinical behavior of endometrial carcinoma (EC) patients. The PITX2 promoter methylation levels were obtained by QM-PCR (real time MethylLight Quantitative Polymerase Chain Reaction), in a series of 203 EC samples and 40 healthy endometrium samples used as tissue control (TC). As a continuous variable, PITX2 methylation levels were significantly higher in tumor than control group (p=0.03). In tumor samples, the upper quartile methylation values (6.57%) exceeded the highest value of TC (5.96%) so this variable was categorized into two groups known as: low (<6.6 %) and high (≥ 6.6%) methylation level. There was no association between PITX2 methylation status and clinicopathologic and molecular variables studied, except a positive association with microsatellite instability (MSI) (p=0.006).However, those patients with EC, with a high PITX2 methylation level and diploid DNA content had a worse clinical outcome in survival univariate and multivariate analysis (p= 0.007, HR 1.60, 95 % CI: 1.02-2.53, p = 0.04, respectively).This is the first report that studies the PITX2 epigenetic alteration in EC. It shows the relationship with MSI status and the potential prognostic utility in patients with tumors with diploid DNA content. Capítulo8                  Capítulo8   Anexos Anexos    Anexos  Anexo I. Información suplementaria F: T AC CAG GT G GCA AAG GGC A R: HEX-TGC ATT TTA ACT ATG GCT C F: CTG CGG TAA TCA AGT TTT TAG R: 6-FAM-AAC CAT TCA ACA TTT TTA ACC C F: AGT CGC TGG CAC AGT TCT A R: 6-FAM-CTG GTC ACT CGC GTT TAC AA F: CTG AAT TTT ACC TCC TGA C R: NED-ATT GTG CCA TTG CAT TCC AA F: AAC CAT GCT TGC AAA CCA CT R: HEX-CGA TAA TAC TAG CAA TGA CC Abreviaturas: F= con sentido, R= sin sentido. Buhard y col. (2006) J Clin Oncol 24:241-251. NR-27 NR-21 NR-24 Tabla 1. Secuencia de primers para el análisis del estado MSI Secuencia de primers (5'-3') BAT -26 BAT -25 Condiciones PCR * F: 6-FAM-CAC GAG ACG TCA CCA AGA AA R: CGC AAG AAC AGT CAT TGC TTT F: CCT CCT GGT GCT CTA TCC AC R: TGG ACA CAT CGC ATG AAT CT 35c/59ºC 30c/55ºC Tabla 2. Secuencia de primers y condiciones de PCR para el estudio mutacional del tracto A9 del gen EPHB2 Genotipado Secuenciación * (c=número de ciclos/ temperatura de anillamiento). Abreviaturas: F= con sentido, R= sin sentido. Alazzouzi y col. (2005) Cancer Res 65:10170-10173 Secuencia de primers (5'-3') Anexos  I   Gen Secuencia de primers F (5'-3') Condiciones PCR * Referencia MLH1 UF: GAA GAG TGG ATA GTG ATT TTT AAT GT UR: ATC TCT TCA TCC CTC TTC CAA AAA CAA AAC A MF: AGC GGA TAG CGA TTT TTA ACG C MR: TCT TCG TCC CTC CCT AAA ACG MGMT UF: TTT GTG TTT TGA TGT TTG TAG GTT TTT GT UR: AAC TCC ACA CTC TTC CAA AAA CAA AAC A MF: TTT CGA CGT TCG TAG GTT TTC GC MR: GCA CTC TTC CGA AAA CGA AAC G APC UF: GTG TTT TAT TGT GGA GTG TGG GTT UR: CCA ATC AAC AAA CTC CCA ACA A MF: TAT TGC GGA GTG CGG GTC MR: TCG ACG AAC TCC CGA CGA E-Cadherina UF: GGT AGG TGA ATT TTT AGT TAA TTA GTG GTA UR: ACC CAT AAC TAA CCA AAA ACA CCA MF: GGT GAA TTT TTA GTT AAT TAG CGG TAC MR: CAT AAC TAA CCG AAA ACG CCG EPHB2 UF: TGT TTT TGT TAG TTG TGT TAG ATG T UR: CAA TAA TCT CTC CCA ACA CT MF: TTG TTT TTG TTA GTC GCG TTA GAC MR: CAA TAA TCT CTC CCG ACG CT EPHB4 UF: TTT ATT AGA GGG TGG TGG GTG T UR: CTA TCC AAA ACC AAA CAT ATC AAA MF: GTT TAT TAG AGG GTG GTG GGC MR: TAT CCA AAA CCG AAC ATA TCG A SFRP1 UF: GTT TTG TAG TTT TTG GAG TTA GTG TTG TGT UR: CTC AAC CTA CAA TCA AAA ACA ACA CAA ACA MF: TGT AGT TTT CGG AGT TAG TGT CGC GC MR: CCT ACG ATC GAA AAC GAC GCG AAC G SFRP2 UF: TTT TGG GTT GGA GTT TTT TGG AGT TGT GT UR: AAC CCA CTC TCT TCA CTA AAT ACA ACT CA MF: GGG TCG GAG TTT TTC GGA GTT GCG C MR: CCG CTC TCT TCG CTA AAT ACG ACT CG SFRP4 UF: GGG GGT GAT GTT ATT GTT TTT GTA TTG AT UR: CAC CTC CCC TAA CAT AAA CTC AAA ACA MF: GGG TGA TGT TAT CGT TTT TGT ATC GAC MR: CCT CCC CTA ACG TAA ACT CGA AAC G SFRP5 UF: GTA AGA TTT GGT GTT GGG TGG GAT GTT T UR: AAA ACT CCA ACC CAA ACC TCA CCA TAC A MF: AAG ATT TGG CGT TGG GCG GGA CGT TC MR: ACT CCA ACC CGA ACC TCG CCG TAC G 35c/65ºC 35c/66ºC 35c/66ºC * (c=número de ciclos/ temperatura de anillamiento). Abreviaturas: U: primers específicos para el ADN no metilado, M: primers específicos para el ADN metilado, F: con sentido, R: sin sentido. 35c/64ºC 35c/66ºC 35c/69ºC 40c/65ºC 35c/65ºC 40c/65ºC Tabla 3. Secuencia de primers y condiciones de MSP para el estudio del estado de metilación 30c/55ºC 35c/60ºC 35c/65ºC 35c/58ºC 35c/60ºC Deng y col. (1999) Cancer Res 59:2029-2033 Esteller y col. (2000) Cancer Res 60:2368-2371 Esteller y col. (2000) Cancer Res 60:4366-4371 35c/57ºC 40c/58ºC 35c/65ºC 35c/58ºC 40c/64ºC 40c/61ºC Lind y col. (2004) Mol Cancer 3:28 Alazzouzi y col. (2005) Cancer Res 65:10170-10173 Suzuki y col. (2004) Nat Genet 36:417-422 Suzuki y col. (2004) Nat Genet 36:417-422 Suzuki y col. (2004) Nat Genet 36:417-422 Suzuki y col. (2004) Nat Genet 36:417-422 Davalos y col. (2006) Cancer Res 66:8943-8948 Anexos II   Anexo II. Curriculum Vitae Lcda. En Ciencias Biológicas (Universidad de La Laguna, 2002) Máster en Oncología Molecular (Universidad de Las Palmas de GC, 2005) Diploma de Estudios Avanzados (Universidad de Las Palmas de GC, 2006) Estancias/Stays Medical Oncology Department. Josephine Nefkens Institute. Erasmus Medical Centre. Rotterdam, Netherland (01/05/2009-06/03/2010). Klinikums Rechts der Isar (Technischen Universität München). Munich, Germany (03/12/2008-16/12/2008). Instituto de productos naturales y agrobiología (Consejo superior de Investigaciones Científicas). Tenerife, España (01/09/2000-31/05/2001). Publicaciones/Publications Double strand break repair components are frequent targets of microsatellite instability in endometrial cancer Bilbao C, Ramírez R, Rodríguez G, Falcón O, León L, Díaz-Chico BN, Perucho M, DíazChico JC. Eur J Cancer. 2010 Jul 16. [Epub ahead of print]. Microsatellite instability predicts clinical outcome in radiation-treated endometrioid endometrial cancer Bilbao C, Lara PC, Ramírez R, Henríquez-Hernández LA, Rodríguez G, Falcón O, León L, Perucho M, Díaz-Chico BN, Díaz-Chico JC. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2010 Jan 1;76 (1):9-13. The GGN and CAG repeat polymorphisms in the exon-1 of the androgen receptor gene are, respectively, associated with insulin resistance in men and with dyslipidemia in women Rodríguez-González G, Ramírez-Moreno R, Pérez P, Bilbao C, López-Ríos L, Díaz-Chico JC, Lara PC, Serra-Majem L, Chirino R, Díaz-Chico BN. J Steroid Biochem Mol Biol. 2009 Feb; 113 (3-5):202-8. Epub 2008 Dec 30. Short alleles of both GGN and CAG repeats at the exon-1 of the androgen receptor gene are associated to increased PSA staining and a higher Gleason score in human prostatic cancer Rodríguez-González G, Cabrera S, Ramírez-Moreno R, Bilbao C, Díaz-Chico JC, Serra L, Chesa N, Cabrera JJ, Díaz-Chico BN. Anexos J Steroid Biochem Mol Biol. 2009 Jan; 113 (1-2):85-91. Epub 2008 Nov 27.  III   Androgens and androgen receptors in breast cancer Díaz-Chico BN, Germán Rodríguez F, González A, Ramírez R, Bilbao C, Cabrera de León A, Aguirre Jaime A, Chirino R, Navarro D, Díaz-Chico JC. J Steroid Biochem Mol Biol. 2007 Jun-Jul; 105 (1-5):1-15. Epub 2007 May 17. Review. High EPHB2 mutation rate in gastric but not endometrial tumors with microsatellite instability Davalos V, Dopeso H, Velho S, Ferreira AM, Cirnes L, Díaz-Chico N, Bilbao C, Ramírez R, Rodríguez G, Falcón O, León L, Niessen RC, Keller G, Dallenbach-Hellweg G, Espín E, Armengol M, Plaja A, Perucho M, Imai K, Yamamoto H, Gebert JF, Díaz-Chico JC, Hofstra RM, Woerner SM, Seruca R, Schwartz S Jr. Arango D. Oncogene. 2007 Jan 11; 26 (2):308-11. La inestabilidad microsatélite y la hipermetilación del promotor MLH1 se asocian con la aparición tardía del cáncer de endometrio R Ramírez-Moreno, FG Rodríguez, C Bilbao, O Falcón, L León, BN Díaz-Chico, JC Díaz-Chico. Vector plus (FULP). 2006 Ene-Jun 27; 55:61. The relationship between microsatellite instability and PTEN gene mutations in endometrial cancer Bilbao C, Rodríguez G, Ramírez R, Falcón O, León L, Chirino R, Rivero JF, Falcón O Jr. Díaz-Chico BN, Díaz-Chico JC, Perucho M. Int J Cancer. 2006 Aug 1; 119 (3):563-70. Alleles with short CAG and GGN repeats in the androgen receptor gene are associated with benign endometrial cancer Rodríguez G, Bilbao C, Ramírez R, Falcón O, León L, Chirino R, Falcón O Jr. Díaz BP, Rivero JF, Perucho M, Díaz-Chico BN, Díaz-Chico JC. Int J Cancer. 2006 Mar 15; 118 (6):1420-5. Últimas presentaciones a congresos/The last presentations KRAS and BRAF mutation status analysis: Primary tumor versus metastasis and circulating tumor cells in 42 patients with colorectal cáncer J. Jiang, B. Mostert, Z. Lalmahomed, R. Ramírez-Moreno, A. Sieuwerts, J. Kraan, J. IJzermans, C. Verhoef, Y. Wang, S. Sleijfer; Veridex LLC, Raritan, NJ. ASCO-NCI-EORTC Annual Meeting on Molecular Markers in Cancer. Póster Hollywood, Florida EEUU, Octubre 2010 Anexos IV  D. ENRIQUE CASTRO LÓPEZ-TARRUELLA SECRETARIO DEL DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR, FISIOLOGÍA, GENÉTICA E INMUNOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA. CERTIFICA, Que el Consejo de Doctores del Departamento en su sesión con fecha 16 de Septiembre de 2010 tomó el acuerdo de dar consentimiento para su tramitación y obtención de la mención de Doctorado Europeo a la tesis doctoral titulada: “ALTERACIONES GENÉTICAS Y EPIGENÉTICAS EN EL CÁNCER DE ENDOMETRIO” presentada por la doctoranda Dª Raquel Ramírez Moreno y dirigida por los Doctores: D. Juan Carlos Díaz Chico, D. B. Nicolás Díaz Chico y D. Fco. Germán Rodríguez González. Y para que así conste, y a efectos de lo previsto en el Artº 73.2 del Reglamento de Estudios de Doctorado de esta Universidad, firmo la presente en Las Palmas de Gran Canaria, a 16 de Septiembre de 2010 Fdo. D. Enrique Castro López-Torruella  Clinical relevance of measuring mRNA's and microRNA's in circulating tumor cells Anieta M. Sieuwerts, Bianca Mostert, Joan Bolt-de Vries, Jaco Kraan, Anne van Galen, Vanja de Weerd, Petra van der Spoel, Raquel Ramírez-Moreno, Jack Yu, Yixin Wang, Jan-Willem Gratama, John A. Foekens, Stefan Sleijfer and John W.M. Martens. Developments in Real-Time PCR, Research and Molecular Diagnostics Tipo de Presentación oral Götenborg, Sweden, Mayo 2010 PITX2 methylation as a novel prognostic factor in endometrial cancer Ramírez-Moreno R, Rodríguez-González FG, Santana Farré R, Bilbao C, Torres S, Martens JW, Napieralski R, León L, Falcón O, Schmitt M, Foekens JA, Fernández Pérez L, Díaz Chico BN, Díaz Chico JC 6th Meeting of Young Cancer Investigators of the Canaries (6th YCIC) Póster Las Palmas de GC, Diciembre 2009 Microsatellite instability predicts clinical outcome in radiation treated endometrioid endometrial cancer Bilbao C, Lara PC, Ramírez-Moreno R, Henríquez Hernández LA, Rodríguez-González FG, Fontes F, Pinar B, León L, Falcón O, Perucho M, Díaz Chico BN, Díaz Chico JC 6th Meeting of Young Cancer Investigators of the Canaries (6th YCIC) Presentación oral Las Palmas de GC, Diciembre 2009 Predictive role of microsatellite instability in radiation response in sporadic endometrial carcinoma C. Bilbao, PC. Lara, O. Falcón, L. León, F. Fontes, R. Ramírez, G. Rodríguez, LA, Henríquez, B. Pinar, BN. Díaz Chico, JC. Díaz Chico. XV Congreso Nacional de la Sociedad Española de Oncología Radioterápica (SEOR). Póster Castellón, Octubre 2009 Genetics and epigenetics profile of unestable endometrioid endometrial cancer Ramírez-Moreno R, Rodríguez González FG, Bilbao C, Falcón O, León L, Díaz Chico BN, Díaz Chico, JC 5th Meeting of Young Cancer Investigators of the Canaries (5th YCIC). 3rd Meeting of Young Biomedical Investigators of the Macaronesia (3rd YBIM) Presentación oral La Laguna, Tenerife, Noviembre 2008 Anexos  V   Anexo III. Financiación El presente proyecto de Tesis Doctoral ha sido posible gracias a la financiación concedida por: 1. Fundación Universitaria de Las Palmas (FULP). Beca de postgraduado. 2. Instituto Canario de Investigación del Cáncer (ICIC). Beca de postgraduado y PI04/2007, PI Red Epicancer. 3. Dirección General de Universidades e Investigación del Gobierno de Canarias (DGUI). Beca de postgrado y PI 2002/055. 4. Agencia Canaria de Investigación, Innovación y Sociedad de la Información del Gobierno de Canarias (ACIISI). Beca para la realización de estancias breves en centros de investigación extranjeros. 5. Fundación Canaria de Investigación y Salud (FUNCIS). PI 68/05, PI53/07. Anexos VI    VII  Anexo IV. Agradecimientos/Acknowledgements Gracias: A Juan Carlos Díaz por su dedicación, paciencia y sus críticas siempre constructivas. A Nicolás Díaz por permitirme empezar, por ser un buen ejemplo a seguir, por su optimismo e inquietudes. A Orlando Falcón y a Laureano León, ginecólogo y patólogo respectivamente, del complejo Hospitalario Materno-Insular, por su gran labor a la hora de recolectar las muestras y las variables clínico-patológicas, por contribuir y apoyar así a la investigación del cáncer. A mis compañeros por compartir tantos buenos ratos: Cristina Bilbao, Ruymán Santana, Carlos Díaz, Dionisio Lorenzo, Laura López, Yeray Brito, Julia Wiebe, Luis Henríquez, Rubén Pérez, Jorge Marrero, María Claudia Sandoval, Mercedes Mirecky, Patricia Martín, Elisa Bordón, Maira Almeida, Ahinara Asín, de genética, de bioquímica y del ICIC. Y a los profesores y personal de la Universidad por su ayuda y apoyo: Soraya Pérez, Pilar Bracero, Alejandro González, Pilar Díaz, Isabel Marrero, Leandro Fernández, Pilar Fernández, Ricardo Chirino, Domingo Navarro, Antonio López, Santiago Torres, Manolo Zumbado, Luis Domínguez y Octavio Pérez. Thanks for your hospitality and teaching to all Dutch friends, John Foekens, Mar, Renee, Jordi, John Martens, Jenny, Anieta, Albert, Vanja, Anne, Wendy, Chyntia, NingQing, Mohammed, Joan, Sharmilee and the other colleagues from Foekens’s Lab and JNI Institute, also to my German friends Rudolf, Manfred and Elisabeth. A mis amigos, también a los de la querida etapa lagunera, por conservar nuestra amistad y porque sé que siempre están. A Germán por su apoyo y ayuda en la elaboración de este trabajo, y por todo lo demás... A mi pequeña y gran familia, a los que están y a los que han marchado al “País de Jauja”, por ser mi referente y una fuente inagotable de buena energía. Gracias también, a todas las pacientes porque ellas son la razón por la que me ilusiona este trabajo. "No es grande el que siempre triunfa, sino el que jamás se desalienta". J.L. Martín Descalzo Raquel, Las Palmas de Gran Canaria, 2010 Anexos