Ensayos de inmunización en ganado caprino con tiol-proteinasas procedentes de productos de excreción-secreción (E/S) de vermes adultos de "Teladorsagia circumcincta"

Jessica Quesada Rodríguez INSTITUTO UNIVERSITARIO DE SANIDAD ANIMAL Y SEGURIDAD ALIMENTARIA LAS PALMAS DE GRAN CANARIA, 2015 ENSAYO DE INMUNIZACIÓN EN GANADO CAPRINO CON TIOL-PROTEINASAS PROCEDENTES DE PRODUCTOS DE EXCRECIÓN-SECRECIÓN (E/S) DE VERMES ADULTOS DE TELADORSAGIA CIRCUMCINCTA A mis padres ÍNDICE Índice I INTRODUCCIÓN........................................................................................ 1 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA.................................................................. 6 1.Introducción............................................................................................. 6 2.Generalidades Teladorsagia circumcincta............................................... 8 2.1. Taxonomía y descripción morfológica........................................... 8 3.Biología de los nematodos gastrointestinales.......................................... 11 4.Epidemiología de la ostertagiosis............................................................. 13 5.Patogenia y lesiones................................................................................. 16 6.Signos clínicos......................................................................................... 19 7.Diagnostico.............................................................................................. 21 8.Tratamiento.............................................................................................. 22 8.1.Resistencia a antihelmínticos.......................................................... 24 9.Control y profilaxis.................................................................................. 26 9.1.Medidas de manejo......................................................................... 26 9.2.Quimioprofilaxis............................................................................. 27 9.3.Métodos complementarios.............................................................. 27 9.3.1.Control biológico................................................................... 28 9.3.2.Suplementación nutricional.................................................... 29 9.3.3.Respuesta inmune................................................................... 30 9.3.4.Vacunación............................................................................. 30 9.3.5.Utilización de la selección genética....................................... 31 10.Respuesta inmune frente a los nematodos gastrointestinales................. 35 10.1.Introducción.................................................................................. 35 10.2.Factores que modulan la respuesta inmune................................... 35 10.2.1.Edad...................................................................................... 36 10.2.2.Sexo...................................................................................... 36 10.2.3.Especie, raza, individuo....................................................... 36 10.2.4.Estado hormonal................................................................... 37 10.2.5.Nutrición.............................................................................. 38 10.2.6.Tratamiento antihelmínticos................................................. 39 10.3.7.Patogenicidad de la cepa parasitaria.................................... 39 10.3.Inmunidad innata frente a los parásitos......................................... 40 10.4.Inmunidad adaptativa frente a los parásitos.................................. 42 10.4.1.Presentación del antígeno y orientación de la respuesta inmunológica........................................................................ 43 10.4.2.Respuestas linfocitarias........................................................ 47 10.4.3.Mecanismos efectores.......................................................... 50 10.5.Manifestaciones de la respuesta inmune frente a los nematodos GI................................................................................................... 68 10.5.1.Frente a los estadios larvarios.............................................. 68 10.5.2.Frente a estadio adulto......................................................... 71 10.6.Evasión de la respuesta inmune.................................................... 74 11.Inmunización frente a los nematodos GI............................................... 76 Índice II 11.1.Vacunas atenuadas........................................................................ 76 11.2.Vacunas frente Antígenos expuestos al sistema inmune............... 77 11.2.1.Antígeno Excreción/secreción (E/S).................................... 77 11.2.2.Hc-Sl3.................................................................................. 80 11.2.3.Hc40..................................................................................... 81 11.2.4.Hcp26/23.............................................................................. 81 11.3.Vacunas frente antígenos ocultos al sistema inmune.................... 82 10.3.1.H11....................................................................................... 82 10.3.2.H-gal-GP.............................................................................. 83 10.3.3.Proteinasas tipo cisteína....................................................... 84 10.3.4.Otros antígenos ocultos........................................................ 86 10.4.Vacunación frente a Teladorsagia circumcincta.......................... 86 MATERIAL Y METODOS........................................................................ 89 1.Animales.................................................................................................. 89 2.Parásitos................................................................................................... 89 2.1.Protocolo de obtención de L3 de Teladorsagia circumcincta........ 90 2.2.Protocolo de obtención de vermes adultos y cultivo in vitro.......... 91 2.3.Preparación de los homogenizados del parásito.............................. 93 2.4.Purificación de las fracciones proteolíticas a partir de productos de E/S............................................................................................. 94 2.5.Determinación de la concentración y perfil proteico...................... 96 3.Protocolo experimental............................................................................ 97 3.1.Inoculación experimental................................................................ 97 3.2.Recogida de muestras a lo largo del experimento........................... 98 3.3.Recogida de muestras tras el sacrificio........................................... 99 3.3.1.Recogida de muestras para el estudio histológico e inmunohistoquímico............................................................... 99 3.3.2.Recogida de muestras para el estudio de expresión de citoquinas................................................................................ 100 3.3.3.Recogida del mucus abomasal............................................... 101 3.3.4.Recogida del contenido abomasal.......................................... 101 3.3.5.Recogida de la mucosa gástrica.............................................. 102 4.Análisis hemotológico.............................................................................. 102 4.1.Hematocrito..................................................................................... 102 4.2.Proteínas plasmáticas...................................................................... 102 4.3.Recuento total de leucocitos............................................................ 102 4.4.Recuento diferencial de leucocitos en sangre periférica................. 103 5.Evaluación del pepsinógeno sérico.......................................................... 104 5.1.Evaluación del pepsinógeno sérico por micrométodo..................... 105 5.2.Transformación de los valores de absorbancias en unidades de tirosina............................................................................................ 106 6.Estudios parasitológicos........................................................................... 108 Índice III 6.1.Recuentos fecales de huevos........................................................... 108 6.2.Recuentos de vermes adultos en abomaso...................................... 109 6.3.Digestión de la mucosa gástrica y recuentos de vermes inmaduros 110 7.Respuesta inmune sistémica y local......................................................... 111 7.1.ELISA para la detección de inmunoglobulinas específicas de suero................................................................................................. 111 7.2.ELISA para la detección de inmunoglobulinas específicas de mucus............................................................................................... 115 7.3.Inmunoblotting................................................................................ 117 7.4.Estudio de la expresión de citoquinas............................................. 127 8.Respuesta inmune local............................................................................ 136 8.1.Estudio inmunohistoquímico........................................................... 136 8.2.Estudio histológico.......................................................................... 139 9.Análisis estadístico................................................................................... 143 9.1.Normalidad y homocedasticidad de las variables........................... 143 9.2.Diferencia entre variables puntuales............................................... 143 9.3.Modelo general lineal de medidas repetidas................................... 143 9.4.Coeficiente de correlación de Spearman......................................... 144 RESULTADOS............................................................................................. 145 1.Introducción.............................................................................................. 145 2.Estudio del perfil proteico del inmunógeno............................................. 146 3.Estudio parasitológico.............................................................................. 146 3.1.Recuentos de vermes adultos.......................................................... 146 3.2.Longitud de los vermes hembras y recuento de huevos en útero.... 148 3.3.Recuento de larvas en la mucosa..................................................... 148 4.Recuento fecal de huevos en heces.......................................................... 149 5.Estudio hematológico............................................................................... 152 5.1.Hematocrito..................................................................................... 152 5.2.Proteínas plasmáticas...................................................................... 152 5.3.Recuento de eosinófilo, linfocitos y neutrófilos en sangre............. 153 6.Niveles de pepsinógeno en suero............................................................. 156 7.Respuesta inmune humoral sistémica....................................................... 157 7.1.Detección de inmunoglobulinas IgG específica en suero............... 157 7.2.Detección de inmunoglobulinas IgA específica en suero............... 158 7.3.Estudio mediante Western-Blot de IgG específica.......................... 159 8.Respuesta inmune local............................................................................ 160 8.1.Detección de inmunoglobulinas específica en el mucus................ 160 8.2.Correlaciones de los niveles de inmunoglobulinas específicas....... 161 Índice IV 8.3.Estudio mediante Western-Blot de IgG e IgA específica en el mucus............................................................................................... 162 8.4.Estudio de expresión de citoquinas................................................. 163 8.4.1.Expresión relativa de citoquinas en nódulos linfáticos abomasales.............................................................................. 165 8.4.2.Expresión relativa de citoquinas en la mucosa abomasal....... 165 8.5.Estudio inmunohistoquímico de la mucosa abomasal..................... 166 8.6.Correlaciones entre variables parasitológicas y poblaciones celulares locales.............................................................................................. 168 8.7.Estudio histológico de la mucosa.................................................... 169 8.8.Correlaciones entre variables parasitológicas y células efectoras abomasales....................................................................................... 170 DISCUSIÓN.................................................................................................. 172 1.Introducción................................................................................................ 172 2.Estudio del perfil proteico del inmunógeno................................................ 175 3.Estudio de parámetros parasitológicos, hematológicos y de respuesta inmune sistémica generada tras la inmunización........................................... 177 3.1.Nivel de inmunoprotección conferida por la fracción inmunógena 177 3.2.Efecto de la inmunización sobre los parámetros hematológicos..... 187 3.3. Efecto de la inmunización sobre la respuesta inmune humoral sistémica........................................................................................ 191 3.4. Efecto de la inmunización en la respuesta inmune local................ 194 CONCLUSIONES........................................................................................ 207 RESUMEN.................................................................................................... 209 SUMMARY................................................................................................... 211 AGRADECIMIENTOS............................................................................... 213 BIBLIOGRAFÍA.......................................................................................... 216 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Revisión bibliográfica 6 1. INTRODUCCIÓN Los nematodos gastrointestinales (NGI), considerados los parásitos más frecuentes de los rumiantes en todo el mundo, son causantes de las denominadas gastroenteritis parasitarias, que se caracterizan por ser procesos generalmente endémicos, de curso crónico y mortalidad baja. En este tipo de nematodosis se encuentran involucradas distintos grupos parasitarios que se localizan en el estómago e intestino, entre los cuales destaca el Orden Strongylida, y más concretamente la familia Trichostrongylidae (Balic et al., 2000). Dentro de los géneros que se localizan en el abomaso, Haemonchus spp., Ostertagia (Teladorsagia) spp. y Trichostrongylus axei se consideran los más relevante; los de mayor importancia en intestino delgado son Trichostrongylus spp. y Nematodirus spp.; mientras que en el intestino grueso Oesophagostomum spp. y Chabertia spp. son los más prevalentes de mayor patogenicidad. En los rumiantes domésticos, y en concreto en el ganado caprino, uno de los géneros más prevalentes es el género Teladorsagia, constituyendo la especie T. circumcincta el agente parasitario más frecuente en muchas regiones geográficas españolas (Cordero del Campillo et al., 1994), incluyendo la Comunidad Canaria (Molina et. al., 1997). A esta elevada frecuencia de presentación se le une un importante potencial patógeno, derivado del ciclo endógeno del parásito en la mucosa gástrica (Urquart et al. 1996), lo que lo convierte en una de los parásitos más relevantes desde el punto de vista económico entre los que afectan a esta especie ganadera. Actualmente el control de las nematodosis gastrointestinales se realiza mediante tratamientos estratégicos con antihelmínticos, lo que se estima corresponde al 10% del gasto mundial en fármacos veterinarios (Kassai, 1999). Las pérdidas económicas debidas a los nematodos de la familia Trichostrongylidae son especialmente severas en países en vías de desarrollo. En Etiopía, Biffa y colaboradores, en 2007, cuantificaron en 82 millones de dólares Revisión bibliográfica 7 anuales las pérdidas causadas por NGI en pequeños rumiantes y, sólo en fármacos, se calculó que estas parasitosis podrían provocar gastos anuales del orden de 46 y 103 millones de dólares en Sudáfrica e India, respectivamente (Mcleod, 2004; Waller y Chandrawathani, 2005). En Australia, un país con una gran cabaña ovina, Sackett y colaboradores, en 2006, valoraron en 369 millones de dólares las pérdidas debidas a NGI. A las pérdidas debidas a la disminución de las producciones, muertes y decomisos, hay que sumarle los gastos originados por las medidas de control tradicionales, incluyendo la aplicación de tratamientos antihelmínticos, manejo de pastos y otras. Los antihelmínticos han sido y continúan siendo una importante medida de control, pero la aparición de cepas resistentes a estos productos en ganado ovino y caprino (Magona y Musisi, 1999; FAO, 2004; van Wyk et al., 2006), los problemas medioambientales y de salud alimentaria que originan sus residuos y la creciente demanda por parte de los consumidores de productos animales libres de residuos farmacológicos (Kassai, 1999) han estimulado a la comunidad científica a la búsqueda de nuevos métodos de diagnóstico y de control que sean más fiables y precoces, y que eviten los inconvenientes y pérdidas asociados al uso de antihelmínticos. Dentro de estas alternativas destacan los estudios basados en la eficacia de la modificación de la dieta (Waller, 1997b; Bricarello et al., 2005; Valderrábano et al., 2006), la utilización de hongos vermicidas para el control de los estadios preparasíticos (Waller et al., 2004), o el uso de vacunas que tratan de potenciar la respuesta inmunológica del hospedador frente a determinados antígenos parasitarios (Newton y Munn, 1999; Knox y Smith, 2001; Knox et al., 2003; Newton y Meeusen, 2003). Revisión bibliográfica 8 2. GENERALIDADES SOBRE TELADORSAGIA CIRCUMCINCTA Y OTROS NEMATODOS GASTROINTESTINALES DEL GANADO CAPRINO 2.1 CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA Y DESCRIPCIÓN MORFOLÓGICA 2.1.1 Superfamilia Trichostrongyloidea Cram, 1927 Esta superfamilia es la más amplia entre los nematodos que cuentan con bolsa copuladora (Anderson, 1992). Se caracterizan por presentar una cápsula bucal reducida o rudimentaria y carecer de corona radiada. Pueden tener entre 36 labios o bien carecer de ellos, presentan un cuerpo delgado y cuentan, en la mayoría de los casos, con una bolsa copuladora (Anderson, 1992; Urquhart et al., 2001). 2.1.2 Familia Trichostrongylidae Leiper, 1912 Los nematodos pertenecientes a esta familia son de pequeño tamaño, con una cápsula ausente o muy pequeña, sin coronas radiadas y normalmente sin dientes. La fase adulta se localiza en el tracto digestivo de los rumiantes, équidos y otros vertebrados. El aparato reproductor está bien desarrollado en ambos sexos. El aparato genital de las hembras es doble y la vulva se localiza en el tercio posterior del cuerpo, presentando en algunos géneros una solapa o lengüeta vulvar. Los machos presentan una bolsa copuladora bien desarrollada, con dos lóbulos laterales y un pequeño lóbulo central. Los géneros más importantes son Trichostrongylus, Graphidium, Ostertagia (Teladorsagia), Marshallagia, Cooperia, Nematodirus, Haemonchus y Mecistocirrus (Soulsby, 1988; Bowman, 1995, Cordero del Campillo, 2000). Su distribución es mundial (Kassai, 1999). Revisión bibliográfica 9 2.1.3 Género Ostertagia Ransom, 1907 Las especies pertenecientes a este género se localizan en su mayoría en el abomaso, y ocasionalmente en el intestino delgado, de ovejas, cabras, vacas y otros rumiantes (Soulsby, 1988; Anderson, 1992). Se caracterizan por ser nematodos delgados y poseer una cutícula externa dotada de estrías transversales en su extremo anterior. El resto de su cutícula corporal lleva 25-35 estrías longitudinales y ninguna transversal. Son de color pardo y de ahí que se les conozcan vulgarmente como gusano pardo del estómago. El macho posee una bolsa copuladora con dos lóbulos laterales y uno dorsal y una membrana bursal accesoria. Sus espículas son cortas, y su extremo posterior termina en 2 ó 3 procesos. La hembra muestra una vulva que puede ir cubierta con una pequeña solapa anterior (Soulsby, 1988). Generalmente miden menos de 14 mm de longitud (Georgi y Georgi, 1990). Los huevos poseen una morfología típica estrongiloide (Georgi y Georgi, 1990; Bowman, 1995). Los adultos pertenecientes a este género pueden ser visibles mediante una exhaustiva inspección o mediante lavados gástricos. Las larvas se desarrollan en las glándulas gástricas del abomaso y sólo podemos apreciarlas mediante el uso del microscopio (Urquhart et al., 1996). Dichas larvas pueden sufrir secuestros larvarios en los estadios tempranos de la cuarta fase larvaria (Anderson, 1992), fenómeno que se denomina hipobiosis. Morfológicamente, Ostertagia y Teladorsagia son prácticamente indistinguibles, denominándose Teladorsagia a los vermes de este género que afectan a pequeños rumiantes y Ostertagia a los que afecta al ganado vacuno (Bowman, 1995; Georgi y Georgi, 1990). La diferenciación entre especies puede llevarse a cabo a partir de la morfología de las espículas (Urquhart et al., 1996). Revisión bibliográfica 10 2.1.4 Teladorsagia circumcincta Stadelmann, 1984 Es un parásito del abomaso del ganado ovino y caprino que muestra una gran adaptación a estos hospedadores (Borgsteede, 1981b), aunque también se ha localizado en el abomaso de ciervos, llamas, muflones, etc. (Anderson, 1992). Los machos miden entre 7,5 y 8,5 mm de longitud. Muestran unas espículas finas (0,28 – 0,32 mm) que terminan en un abultamiento y un pequeño proceso agudo. La hembra mide entre 9,8 y 12,2 mm, presenta una vulva que normalmente está cubierta con una solapa. Muestran, cerca del extremo de la cola, una banda engrosada que contiene de 4 a 5 estrías transversales (Soulsby, 1988). Los huevos miden entre 80-100 x 40-50 µm y tienen una forma elíptica regular de polos simétricos no muy anchos. Las paredes laterales son simétricas. Poseen una cápsula delgada, quitinosa y de superficie lisa, tapizada en su interior por una delgada membrana (Thiendepont et al., 1979). Eclosionan a las 18 – 24 horas y el primer estadio larvario mide 350 µm de longitud (Anderson, 1992). La L3 infectante mide entre 797 y 866 µm incluyendo la vaina que la recubre (Dikmans y Andrews, 1933). Fig.1 Macho de T. circumcincta. Bolsa copuladora Fig.2 Solapa vulvar de la hembra de T. circumcincta Revisión bibliográfica 11 3 BIOLOGÍA DE LOS NEMATODOS GASTROINTESTINALES Teladorsagia presenta un ciclo biológico directo muy parecido al de otros tricostrongílidos. Los huevos, de la morfología típica de los tricostrongílidos, salen con las heces de forma no embrionada, siendo su excreción variable dependiendo de factores relacionados con el hospedador (edad, estado inmunitario, consistencia fecal), así como de la propia prolificidad individual del parásito. Los huevos suelen ser bastante resistentes a las condiciones adversas y presentan una gran capacidad de adaptación. Pueden eclosionar en intervalos de temperatura que oscilan entre los 4-38ºC (Crofton, 1965; Crofton y Whitlock, Fig.3 L3 infectante de T. circumcincta Fig.4 Extremo anterior L3 T. circumcincta Fig.5 Huevo de T. circumcincta Revisión bibliográfica 12 1965), variando el tiempo que invierten en eclosionar en función de la temperatura y de la cepa parasitaria. En el medio se produce el desarrollo de la L1 que, en condiciones óptimas, eclosiona desarrollándose la L2 y posteriormente la L3, que es la forma infectante para el hospedador. Este proceso tiene lugar en aproximadamente dos semanas, aunque el desarrollo puede retrasarse varios meses si la temperatura y la humedad no son las óptimas. Las dos primeras fases larvarias permanecen en las heces, alimentándose de materia orgánica y microorganismos presentes en las mismas. La L3 conserva la cutícula del estadio anterior, lo que la aísla del medio externo y la hace más resistentes al frío y la desecación que las fases previas. Asimismo, las L3 están dotadas de movilidad, lo que les permite desplazarse, en condiciones ambientales desfavorables como la falta de humedad y las altas temperaturas, hacia las partes más bajas de la vegetación o del pasto para evitar el efecto de la desecación (Machen et al., 1994; Schoenian, 2005). Las larvas L3 infectantes migran de las heces a la hierba cuando las condiciones de humedad son idóneas, lo cual facilita que el hospedador rumiantes las ingiera (Urquhart et al., 1996). Una vez ingerida, pierde la vaina en el rumen y penetra en las glándulas gástricas de la mucosa del abomaso (preferentemente en su región fúndica), formando nódulos de color blanquecino a los 3-4 días de la infección. A los 7 – 10 días, las larvas ya han madurado a L4 (hembras con 7 mm y machos con 5 mm de longitud) y a los 14-42 días alcanzan su fase adulta (Threlkeld, 1934; Sommerville, 1953; 1954; Armour et al., 1966), a menos que sufran el fenómeno de hipobiosis o arresto larvario. En tal caso, las L4 pueden quedar secuestradas en las glándulas gástricas (Armour et al., 1966) hasta un periodo de 6 meses, lo cual permite a esta especie, como a otros tricostrongilidos, superar condiciones medioambientales adversas (Dunsmore, 1960,1963; Georgi y Georgi, 1990; Bowman, 1995;). También se ha demostrado que una gran exposición larvaria favorece el fenómeno de hipobiosis, y que el empleo de antiparasitarios que reducen la carga de nematodos adultos parece estimular el que una parte las larvas secuestradas Revisión bibliográfica 13 reanude su desarrollo para reestablecer la población de vermes en el abomaso. La hipobiosis jugaría, por tanto, un papel en el mantenimiento de la población de vermes adultos. Finalmente, este fenómeno también puede considerarse como una consecuencia de la respuesta inmune del hospedador (Balic et al., 2000b). La exposición continua al antígeno parasitario sería crítica para detener el desarrollo parasitario ya que, en ausencia de más L3 infectantes, el secuestro de las L4 es breve (Smith, 2007). Cuando no tiene lugar el fenómeno de arresto larvario el periodo de prepatencia es de unas tres semanas (Soulsby, 1988; Urquhart et al., 1996). 4 EPIDEMIOLOGÍA DE LA OSTERTAGIOSIS La magnitud de la parasitación por T. circumcincta en un rebaño está condicionada por su ciclo biológico, así como por factores ambientales y factores relacionados con el hospedador. Todo ello determina una cantidad variable de estadios infectantes (L3) en el medio y, por tanto, de la carga parasitaria en los animales y de las fuentes de infección, lo cual se traduce en distintos modelos epidemiológicos, con sus correspondientes ritmos de infección y de contaminación del medio (Cordero del Campillo, 2000). La presencia de huevos de Teladorsagia en el medio procedente de animales parasitados no es constante. Así, en torno al periparto - dos semanas antes y seis semanas después del nacimiento de las crías - se produce normalmente un incremento del número de huevos (Dunsmore, 1965; Andrews et al., 1995; Dorny et al. 1995; Urquhart et al., 1996; Kassai, 1999). Este incremento se considera consecuencia de ciertos cambios hormonales asociados al parto que implican una relajación en la respuesta inmune del hospedador (Barger, 1993; Urquhart, 1996). Como resultado se favorece el desarrollo de las larvas hipobióticas y se incrementa la fecundidad de los vermes hembras alojados en el abomaso. La eliminación masiva de huevos aseguraría una elevada Revisión bibliográfica 14 presencia de L3 infectantes en el momento en que los animales destetados salgan al pasto (Soulsby, 1987). La activación de las larvas quiescentes parece que no se debe exclusivamente a una reducción de la respuesta inmune del hospedador, sino que está también relacionada con la mejora de las condiciones ambientales en el exterior, aunque los mecanismos que median esta activación son aún desconocidos (Blitz y Gibbs, 1971; Gibbs, 1986). Lógicamente, los momentos del año con climatología más favorable suelen coincidir con las parideras, por lo que los efectos del incremento de la movilización larvaria durante el periparto y la activación de las larvas hipobióticas asociadas a las mejores condiciones climatológicas se suman. En zonas de climas templados, en los que ninguna larva puede sobrevivir en el pasto durante el invierno, esta combinación de factores parece determinante para el mantenimiento de la población parasitaria en los rebaños (Capitini et al., 1990; Waller y Chandrawathani, 2005). La carga infectante de los pastos también se sustenta partir de las L3 que superaron el invierno (Urquhart et al., 1996). De hecho, la supervivencia de las L3 durante tres meses a -10ºC y por periodos mucho mayores a 4ºC justifican esta capacidad de hibernación (Gibson y Everett, 1972) y explican la posibilidad de que inicien una nueva infección en primavera cuando los animales vuelvan al pasto (Waller y Thomas, 1978). En general, la disponibilidad de larvas infectantes en los pastos suele presentar una variación estacional, aunque en lugares con escasos cambios estacionales se pueden mantener ritmos de infección prácticamente constantes a lo largo de todo el año (Urquhart et al., 2001). En áreas de clima templado, como por ejemplo Europa, el número de L3 de T. circumcincta que están en la vegetación se incrementa sensiblemente a mitad de verano y es entonces cuando aparece la enfermedad (Urquhart et al., Revisión bibliográfica 21 edematosa, al tiempo que puede haber una necrosis superficial conjuntamente con un exudado inflamatorio. En ganado ovino y caprino, el signo clínico que aparece con mayor frecuencia es una marcada pérdida de peso. La diarrea, cuando se manifiesta, suele ser intermitente y generalmente no tan acuosa como en bovino (Uquhart et al., 1996). En climas tropicales y subtropicales, donde no suelen desarrollarse ciclos biológicos tan marcados, y donde las L3 viables permanecen en el medio durante periodos más prolongados, el desarrollo de una ostertagiosis clínica es mucho menos frecuente. De producirse formas clínicas, el tipo I tendría lugar a finales del invierno (enero-marzo), y las formas tipo II en otoño, con el comienzo de la estación de lluvias (septiembre-diciembre) (Kassai, 1999). 7 DIAGNÓSTICO Se puede establecer a partir de datos clínicos, así como del historial epidemiológico, y posteriormente confirmado mediante distintos tipos de análisis laboratoriales (Soulsby, 1988). El diagnóstico atendiendo a los signos clínicos es difícil ya que los síntomas más frecuentes (diarrea, pérdida de peso y falta de apetito) pueden aparecer también en otros procesos. Sin embargo, todos estos signos, acompañados de datos epidemiológicos como la salida al pasto de los animales más jóvenes, pueden hacer sospechar al clínico de un cuadro de gastroenteritis parasitaria (Urquhart et al., 2001). El análisis coprológico, mediante la observación directa de huevos en las heces, es la técnica indicada para confirmar la presencia de NGI en el rebaño. Los huevos de las distintas especies de Trichostrongylidae, salvo los del género Nematodirus spp., son prácticamente indistinguibles entre sí. Por este motivo, una vez evidenciada la presencia de huevos con morfología compatible con T. circumcincta sería necesario llevar a cabo su identificación mediante Revisión bibliográfica 22 coprocultivo e identificación de los caracteres morfológicos de las L3 que se desarrollan a partir de los huevos (Molento et al., 2004; Urquhart et al., 2001; Van Vyk, 2001; Van Vyk et al., 2006). El número de huevos presentes en las heces del animal es orientativo, en cierta medida, del grado de parasitación. La técnica habitual para cuantificar el número de huevos en heces es el método de McMaster (MAFF, 1989). Los recuentos fecales pueden ser elevados en la enfermedad tipo I, pero muy bajos e incluso negativos en animales que padecen la enfermedad tipo II (Soulsby, 1988). En cualquier caso, los recuentos de huevos no siempre son proporcionales a la carga parasitaria ni a los signos clínicos. De hecho, corderos, cabritos y terneros pueden sufrir de forma fatal la enfermedad coincidiendo con la fase larvaria, siendo en ese momento el recuento de huevos insignificante. Se estima, de modo orientativo, que 250-2000 h.p.g. de T. circumcincta corresponden a un grado de parasitación intermedio (Kassai, 1999). La determinación de las proteínas séricas (Meana y Rojo, 2000), los niveles de pepsinógeno sanguíneo (Anderson et al., 1965) y los niveles séricos o en la leche de inmunoglobulinas específicas (Molina et al., 2009) pueden ser también de interés pronóstico. Finalmente, hallazgos en la necropsia concordantes con una ostertagiosis (presencia de vermes, gastritis, etc.) pueden ayudar a completar el diagnóstico. El diagnóstico se confirma a menudo por la respuesta al tratamiento con antihelmínticos. La enfermedad tipo I responde rápidamente y en 48 horas se recobra el apetito y se produce una rápida regeneración de los cambios en el abomaso. El tipo II responde de manera menos espectacular, siendo necesaria a menudo la repetición del tratamiento (Soulsby, 1988). 8 TRATAMIENTO El tratamiento y el control de las nematodosis gastrointestinales se han Revisión bibliográfica 23 basado fundamentalmente en el uso de fármacos antihelmínticos, en combinación con determinadas medidas de manejo en el pastoreo que reduzcan el riesgo de infección. La aplicación a gran escala de antihelmínticos de probada eficacia ha transformado la industria ganadera, especialmente en el caso de los rumiantes. Se llega a afirmar que la ganadería de rumiantes en su forma actual no sería posible sin fármacos antihelmínticos (Stear et al., 2000). Los fármacos más utilizados son los bencimidazoles y probencimidazoles, los imidazotiazoles y las lactonas macrocíclicas. En el pasado también se utilizaron los organofosforados, que dejaron de emplearse debido a su elevada toxicidad. - Bencimidazoles y probencimidazoles. Se administran por vía oral, absorbiéndose con rapidez y alcanzando sus niveles plasmáticos más altos a las 2-3 horas de la administración. Los más utilizados son: albendazol, oxibendazol, mebendazol, oxfendazol, fenbendazol, flubendazol y cambendazol (Cordero del Campillo, 2000; Ostlind et al., 2006; Álvarez-Sánchez et al., 2006). - Imidazotiazoles. Dentro este grupo de fármacos se encuentran el tetramisol y el levamisol. Estos dos fármacos son eficaces frente a la forma adulta de los NGI, siendo menor su eficacia sobre los estadios larvarios. Se recomienda periodos de supresión de dos días para el consumo de leche y una semana en el caso de la carne (Cordero del Campillo, 2000; Ostlind et al., 2006; Martin y Robertson, 2007). - Lactonas macrocíclicas. Dentro de este grupo se encuentra la ivermectina, fármaco que a dosis muy bajas (0,2 mg/k.p.v.) suele presentar una efectividad del 100% (Ostlind et al., 2006). También se clasifica en este grupo la doramectina que, administrada a la misma dosis en cabras, es efectiva frente a la haemonchosis, y su efecto persiste entre los 14-25 días post-tratamiento (Molina et al., 2005). Este mismo compuesto en ovino también se ha Revisión bibliográfica 24 demostrado eficaz frente a otros NGI como Teladorsagia circumcincta, Nematodirus battus, Nematodirus filicollis, Oesophagostomun venulosum y Trichuris spp. (Dorchies et al., 2001). Ambos fármacos tienen una gran eficacia frente a adultos y estadios larvarios, incluso en hipobiosis; además, son eficaces frente ectoparásitos. Sin embargo, el periodo de supresión en muy alto, en el caso de la carne 21 días y en el caso del ganado lechero no se puede administrar (Cordero del Campillo, 2000). Otro fármaco perteneciente a este grupo es la epinomectina, cuya eficacia se ha demostrado frente a NGI tanto en cabras como en ovejas. En cabras, resulta eficaz frente a Teladorsagia circumcincta, Haemonchus contortus y Trichostrongylus colubriformis (Hoste et al., 2004). La eficacia de este fármaco también ha sido constatada por otros autores (Cingloli et al., 2003) en ovinos frente a Haemonchus contortus, Teladorsagia circumcincta, Trichostrongylus vitrinus, Trichostrongylus capricola, Nematodirus spp y Chabertia ovina. Una ventaja de este fármaco es que puede utilizarse en animales en fase de lactación. En este apartado cabe considerar también a la moxidectina, una milbemicina que ha demostrado ser altamente eficaz frente a Haemonchus contortus, llegando a reducir los recuentos fecales de huevos entre un 90% y un 100% a las 48 horas del tratamiento (Tyrrel-Acosta y Jacobs, 1999). 8.1. RESISTENCIA A ANTIHELMÍNTICOS El uso incontrolado de antihelmínticos ha favorecido el desarrollo de cepas resistentes en todo el mundo. La administración frecuente, el uso repetido del mismo fármaco o grupos de antihelmínticos, la administración de dosis subterapéuticas, unido al elevado potencial biótico de los parásitos y las condiciones climáticas favorables para la supervivencia de los estados larvarios, son algunos de los factores que han favorecido la aparición creciente de Revisión bibliográfica 25 resistencia antihelmíntica (Cordero del Campillo, 2000). El fenómeno de resistencia se debe esencialmente a un cambio en la frecuencia de un gen de una población de vermes, asociado a una selección inducida por drogas, que determina una reducción de la eficacia por debajo del 95% (Kassai, 1999). En España, la primera cita sobre la existencia de cepas de NGI resistentes a antihelmínticos es de 1960 (Prichord et al., 1980). Posteriormente, diversos estudios han confirmado la aparición de resistencias a las tres grandes familias de antihelmínticos, sin que la situación, por ahora, parezca tan grave como en otros países (Álvarez Sánchez et al., 2006; Díez Baños et al., 2008; M. Martínez-Valladares et al., 2011). Este problema no fue valorado en su momento, al confiar en que las empresas farmacéuticas comercializarían nuevos fármacos. Sin embargo, durante 25 años han sido muy escasos los nuevos antihelmínticos destinado a animales de abasto, fundamentalmente por razones económicas (van Wyk el al., 2006). Recientemente, han sido descubiertos nuevos grupos farmacológicos con efecto antihelmíntico, lo que permitirá disponer de fármacos, al menos temporalmente, libres de resistencias. Se pueden destacar los derivados del amino-acetonitrilo, en concreto el monepantel (Kaminsky et al., 2008), cuya comercialización ya ha sido aprobada en Europa para ganado ovino. Otros grupos de fármacos con estas características son los ciclooctadepsipéptidos (von Sammson Himmelstjerna et al., 2005), los spiroindoles (Sangster, 2009) o el derquantel (Little et al 2010). En cualquier caso, se hace necesaria una nueva política en el tratamiento de estos parásitos, que implique un uso correcto y racional de los fármacos, con rotaciones de los mismos (Urquhart et al., 1996; van Wyk, 2001; Sangster, 2009) y tratamiento selectivo de los animales (van Wyk et al., 2006), todo ello Revisión bibliográfica 26 acompañado de diferentes medidas de control. 9 CONTROL Y PROFILAXIS El control de la parasitación por NGI pretende evitar la aparición de la enfermedad en los momentos en que los animales son más susceptibles (Kassai, 1999) y, en la medida de lo posible, fomentar también el desarrollo de la inmunidad frente al parásito, mejorando con ello el rendimiento productivo de los animales Las medidas de manejo encaminadas a minimizar los riesgos de infección y la realización de tratamientos estratégicos con antihelmínticos son dos de los métodos tradicionales para controlas las enfermedades por NGI (Urquhart et al., 1996). 9.1 MEDIDAS DE MANEJO Si se dispone de datos medioambientales de la región (pluviometría, temperatura, humedad y otros relacionados con la epidemiología de la enfermedad) es posible estimar cuando existen más riesgos de acumulación de larvas e incluso intuir cuál será la severidad previsible de la infección en el rebaño (Kassai, 1999). Todo ello imposibilita aplicar una misma pauta profiláctica en todas las explotaciones ganaderas (Georgi y Georgi, 1990). Las medidas de manejo en pastoreo se basan en la especificidad de hospedador (pastoreo mixto por especies), en la resistencia adquirida (pastoreo separado por edades), o en el empleo de pastos poco o nada contaminados (pastoreo rotacional, uso de barbechos, quema de pastos, etc.). Estas medidas complementan el uso de antihelmínticos. Su objetivo es lograr que los animales pasten en hierba no contaminada por especies de parásitos frente a los que son susceptibles. En general, la buena gestión del pastoreo no puede llegar a significar el control absoluto de las infecciones por NGI, pero, cuando menos, Revisión bibliográfica 27 debería suponer una medida complementaria fundamental para que dicho control sea efectivo (Stear et al., 2007). 9.2 QUIMIOPROFILAXIS El control de las parasitosis producidas por NGI depende en su mayoría del uso como profilácticos de los antihelmínticos. Existen otros métodos complementarios o alternativos, pero a pesar de ello, hoy en día es indispensable el uso de fármacos eficaces para un control adecuado de las gastroenteritis parasitarias, y es muy posible que la quimioprofilaxis siga jugando un importante papel, al menos a corto-medio plazo (van Wyk et al., 2006). El objetivo del tratamiento profiláctico con antihelmínticos es eliminar las dos fuentes principales de contaminación del pasto: los huevos eliminados en periparto y las larvas que han sobrevivido al invierno en climas templados, o al verano en zonas tropicales o subtropicales (Soulsby, 1987). Pero el empleo de antihelmínticos como estrategia de profilaxis es, sin embargo, costoso ya se suelen tratar todos los animales del rebaño; además, se favorece el desarrollo de resistencias, como ya se mencionó anteriormente. 9.3 MÉTODOS COMPLEMENTARIOS El uso combinado de antihelmínticos y medidas de manejo en pastoreo debería ser suficiente para controlar los NGI. Sin embargo, en la actualidad existen algunos elementos que han comprometido la eficacia de dichos métodos. A la aparición del fenómeno de resistencia antihelmíntica ante considerado, se une la preocupación del consumidor por la presencia de residuos farmacológicos en los alimentos de origen animal, y crece la demanda de productos de ganadería ecológica, en la que la administración de fármacos está Revisión bibliográfica 28 restringida. Estas razones han llevado a buscar métodos alternativos para el control de las gastroenteritis parasitarias o, al menos que complementen la profilaxis mediante el uso de antihelmínticos. 9.3.1 Control biológico Todos los organismos vivos, y por tanto también los parásitos, tienen un desarrollo limitado por factores abióticos (especialmente el clima y los requerimientos nutritivos), o por factores bióticos, esencialmente los parásitos, los depredadores y los competidores. Uno de los métodos alternativos de control biológico con el que se han obtenido exitosos resultados es el uso de microsporas del hongo nematocida Duddingtonia flagrans (FAO, 2002; Waller et al., 2004; Waller y Chandrawathani, 2005, Gómez-Rincón et al., 2006, 2007). Diversos ensayos han demostrado que los estadios larvarios de los NGI pueden quedar atrapados por Duddingtonia flagrans, por lo que el hongo tendría capacidad potencial de disminuir el número de larvas en los pastos, reduciendo con ello la intensidad y gravedad de las infecciones producidas por estas especies parásitas (Waller et al., 2004; Campos et al., 2008). El uso de hongos nematocidas representa una opción prometedora para el control de los nematodos gastrointestinales, aunque no está exenta de algunos inconvenientes cuando se quiere conseguir un rendimiento óptimo; en tal caso se requiere la incorporación diaria de esporas, así como de suplementos en la dieta que satisfagan las necesidades de los propios hongos (Waller y Thamsborg, 2005; Stear et al., 2007). Otro método alternativo consiste en influir en la tasa de descomposición Revisión bibliográfica 29 de la materia fecal, circunstancia que depende del tipo de forraje, así como de la densidad y distribución espacial de las heces (Niezen et al., 1998; Williams y Warren, 2004). Las etapas de vida libre de los nematodos se desarrollan en las heces, de modo que un aumento en la tasa de la degradación de la materia fecal podría exponer a las larvas a las inclemencias del tiempo, reduciendo con ello su viabilidad (Williams y Warren, 2004). También se ha constatado, tanto in vivo como in vitro, la existencia de especies vegetales que poseen actividad antihelmíntica, como por ejemplo la achicoria (Cichorium intybus), la lotera (Lotus corniculatus) (Waller et Thamsborg, 2005), la “serícea” (Lespedeza cuneata) (Guija et al., 2013) o la ruda salvaje (Ruta pinnata) (Ruiz et al., 2010). La actividad antihelmíntica de los extractos vegetales puede ser debida a compuestos activos de diversa naturaleza, pero comúnmente parece estar asociada a la presencia de taninos y polifenoles (Waller et Thamsborg, 2005). 9.3.2 Suplementación nutricional Una alimentación adecuada es necesaria para mantener la salud y el bienestar de los animales, y es determinante para evitar el desarrollo de cuadros clínicos en los animales parasitados. Sin embargo, a los beneficios de la alimentación suplementada deben sumarse inconvenientes de carácter económico, como el costo de dichos suplementos y el incremento de trabajo que supone (Stear et al., 2007). Diversas experiencias han demostrado que incrementos en la concentración de proteínas y/o oligoelementos en la dieta permiten al hospedador minimizar los efectos del parásito y aumentar la productividad (Waller, 1997b; Strain y Stear, 2001; FAO, 2004; Stear et al., 2007), tal y como se ha demostrado en infecciones por H. contortus (Abbott et al., 1984, 1986, 1988; Wallace et al., 1999). Del mismo modo, las hembras gestantes que Revisión bibliográfica 30 mantienen una adecuada condición corporal, gracias a los aportes energéticos extras, muestran una reducción de los recuentos de huevos en heces durante el periodo del periparto (Valderrábano et al., 2006). 9.3.3 Respuesta inmune Además del medio ambiente y la suplementación nutricional, la respuesta inmunitaria desarrollada por los hospedadores frente al parásito interviene de forma decisiva en el desarrollo del nematodo. Los animales resistentes suelen tener menor carga parasitaria y los nematodos hembra que se desarrollan en estos animales son, por lo general, son menos prolíficas (Stear y Bishop, 1999). Asimismo, los huevos producidos son menos viables (Jorgensen et al., 1998) y en el caso de llevarse a término su eclosión, las larvas desarrolladas suelen requerir un periodo más prolongado para completar su ciclo en el medio (Stear et al., 2007). 9.3.4 Vacunación Debido a las dificultades a la hora de controlar las infecciones por NGI, quizás ningún área de investigación se ha potenciado de forma tan intensa como la vacunación (Emery, 1996; Smith, 1999; Dalton et al., 2003; Knox et al., 2003; Vercruysse et al., 2004). En el desarrollo de vacunas frente a este grupo de parásitos se han usado, básicamente, las siguientes estrategias:  Vacunas con larvas atenuadas (Anon, 1959; Jarrett et al., 1960; Armour, 1967; Burger y Pfeiffer, 1969; Smith y Christie, 1979; Stear et al., 1999; Bain, 1999).  Vacunas basadas en la inmunidad natural (antígenos somáticos Revisión bibliográfica 37 (Huntley et al., 1995, Hoste et al., 2008). Las cabras, en particular, muestran dificultades para establecer una respuesta inmunitaria protectora tras inoculaciones repetidas de L3 de H. contortus y T. circumcincta, a diferencia de lo que ocurre en las ovejas (González, 2002). Estos aspectos deben ser tenidos en cuenta a la hora de aplicar programas de control en sistemas de explotación en los que conviven ambas especies, circunstancia muy habitual en la ganadería de las Islas Canarias. Evidentemente, este hecho diferencial deberá valorarse al escoger métodos de control alternativos al uso de fármacos. Existe una variación importante entre razas e individuos en la resistencia a NGI, probablemente causada por diferencias genéticas (Sayers y Sweeney, 2005; Stear et al., 2007). Diversas experiencias en corderos han estimado que existe una alta heredabilidad (0,3) en los recuentos fecales de huevos de NGI en la primera y segunda estación de pastoreo, lo que indica que corderos con recuentos bajos probablemente serán adultos con recuentos bajos de huevos en heces (Stear et al., 2000a). Esta circunstancia puede ser aprovechada para disminuir los niveles de parasitación en el rebaño mediante selección reproductiva, como quedó reflejado anteriormente. 10.2.4. Estado hormonal La compleja interacción que se establece entre el sistema endocrino del hospedador y los agentes parasitarios puede llegar a modificar la respuesta inmune (Suárez, 2007). Algunas especies parásitas se benefician directamente del efecto de determinadas hormonas que estimulan su crecimiento y multiplicación (Escobedo et al., 2005) o bien lo hacen indirectamente, al inducir determinados estados hormonales o situaciones de inmunodepresión de las que se benefician los parásitos. Actualmente no se conocen con exactitud los mecanismos inmunitarios implicados en la influencia hormonal sobre el desarrollo parasitario, pero sí se sabe que durante el periparto se produce un incremento de la susceptibilidad de Revisión bibliográfica 38 los animales a adquirir nuevas infecciones, así como un incremento de la fecundidad de los vermes adultos, además de una maduración de las larvas hipobióticas (Soulsby, 1987). Algunos autores atribuyen a la prolactina algún papel en este fenómeno que experimentan las ovejas en torno al parto, puesto que, al administrarla en corderos antes o después de ser inoculados con H. contortus, induce un aumento en los recuentos fecales de huevos y de la fecundidad de las hembras del parásito (Fleming, 1993). Sin embargo, no existe acuerdo unánime, puesto que otros autores no han logrado reproducir estos efectos en ovinos inoculados con T. circumcincta (Jeffcoate et al., 1990; Barger, 1993). La influencia de las hormonas adrenales en las infecciones por otras especies parásitas como Plasmodium falciparum, Entamoeba histolytica y Schistosoma mansoni también es un hecho reconocido (Escobedo et al., 2005). 10.2.5. Nutrición La respuesta inmune del hospedador eleva los requerimientos nutricionales y modifica la distribución de los recursos (Colditz, 2008; Greer et al., 2008). Por ello, una adecuada alimentación es importante para mantener una respuesta inmune adecuada frente a los parásitos. Al ser el metabolismo proteico el más afectado durante las infecciones por NGI, un aumento de proteína metabolizable en la dieta puede mejorar la resistencia y la tolerancia a la parasitación, aunque no pueda prevenir el establecimiento inicial del parásito. Por lo que, cuando se suministran dietas con bajos aportes proteicos, las consecuencias de la enfermedad se agravan (Kassai, 1999; Coop y Kyriazakis, 2001) y los genotipos más resistentes pueden no mostrar diferencias en su capacidad defensiva en comparación con individuos más susceptibles (Bricarello et al., 2005; Martínez Valladares et al., 2005b). Este aporte proteico repercute directamente en la mejora de distintas respuestas efectoras, aumentando los niveles de mastocitos, eosinófilos y leucocitos Revisión bibliográfica 39 globulares en la mucosa, e incrementando los niveles de anticuerpos sanguíneos (Athanasiadou y Huntley, 2008). 10.2.6. Tratamientos antihelmínticos Cuando los tratamientos profilácticos se administran de forma excesiva, puede suceder que no exista contacto entre el parásito y el hospedador, impidiendo el desarrollo de una respuesta inmune adecuada. Por ello se aconseja plantear una quimioprofilaxis que permita cierto grado de parasitación (Claerebout, 2002; Taylor et al., 2007). Así, por ejemplo, programas de control que combinen el tratamiento antihelmíntico de los animales jóvenes con el traslado a pastos limpios, pueden provocar que el hospedador no desarrolle ninguna respuesta inmunitaria frente a NGI, siendo estos individuos más susceptibles en sucesivas estaciones de pastoreo que otros animales que no se hayan tratado previamente (Claerebout et al., 1998 a,b, 1999a). 10.2.7. Patogenicidad de la cepa parasitaria La selección por resistencia a fármacos puede haber generado distintos genotipos con diferencias en la inmunogenicidad y patogenicidad de determinadas cepas parasitarias (Barret et al., 1998). En ocasiones, resistencia frente a antihelmínticos y mayor patogenicidad pueden ir asociadas, como reflejaron Kelly et al., 1978 al comparar ovinos inoculados con cepas de H. contortus resistentes o susceptibles a los benzimidazoles. Sin embargo, no se trata de una regla fija, puesto que Maclean et al., 1987 observaron justamente lo contrario con una cepa de T. colubriformis resistente a benzimidazoles. Sin embargo, no se han podido constatar diferencias en la inmunogenicidad de las distintas cepas que afectan a los ovinos, aunque sí en su acción patógena, su establecimiento larvario y su fecundidad (Barret et al., 1998; Aumont et al., 2003). Revisión bibliográfica 40 10.3. INMUNIDAD INNATA FRENTE A PARÁSITOS La inmunidad innata constituye la primera línea de defensa frente a los parásitos. Comprende una serie de mecanismos celulares y moleculares, presentes antes del encuentro con el agente patógeno, capaces de activarse rápidamente, de modo previo a la aparición de respuestas adaptativas. Estos mecanismos pueden reconocer los antígenos sin gran capacidad de discriminación, es decir, con independencia del tipo de antígeno identificado, aunque no parecen estar capacitados para desarrollar memoria inmunológica. Una serie de barreras físicas, químicas o biológicas previenen la entrada del agente infeccioso o parasitario; una vez que éste ha superado estas barreras, y ha entrado en el organismo, intervienen células y factores solubles (Cutuli, 2007; de Veer et al. 2007). En el aparato digestivo hay múltiples mecanismos de inmunidad innata; dentro de las barreras externas, el pH gástrico y las enzimas contenidas en el mucus, así como la flora bacteriana, constituyen las principales. En el caso de que algunos agentes patógenos superen estas barreras, entran en acción las células fagocitarias (macrófagos y neutrófilos), una subpoblación de linfocitos conocidos como células asesinas naturales (NK, del inglés Natural Killer), y diversos factores solubles, tales como los componentes de la vía alternativa del complemento, citoquinas y otros mediadores químicos de la inflamación (Cutuli, 2007; Collado et al., 2008). Entre los componentes que constituyen la inmunidad innata, serán mencionados a continuación aquellos que podrían tener un papel relevante en la respuesta frente a NGI, al menos teóricamente, los receptores tipo Toll, los linfocitos T γδ y la subpoblación de linfocitos B-1a. Los receptores tipo Toll (TLR, del inglés toll-like receptors) presentes en la membrana de células presentadoras de antígeno (APC, del inglés antigen- Revisión bibliográfica 41 presenting cells), tales como macrófagos, células dendríticas y algunas células epiteliales, son los encargados del reconocimiento del antígeno y activación de los fagocitos. Estos receptores detectan moléculas expresadas frecuentemente por los agentes exógenos que no están presentes en los hospedadores, denominadas Patrones Moleculares Asociados a Patógenos (PAMP, del inglés pathogen-associated molecular patterns) (Tizard, 2009). Inducen señales internas que promueven, entre otras acciones, la destrucción microbiana en el fagosoma, la liberación de citoquinas estimuladoras de la inflamación, y la activación de los leucotrienos (Werling et al., 2006). El papel de los TLR en el reconocimiento de antígenos parasitarios y la activación de la respuesta efectora ha sido poco estudiada hasta el momento, y algunos autores sugieren que podrían tener gran relevancia en el desarrollo de este tipo de respuestas (Jackson et al., 2006; Vanhoutte et al. 2007). En ovinos y bovinos se han identificado homólogos de los diez TLR reconocidos hasta el momento en humanos (Menzies e Ingham, 2006). Dentro de los linfocitos B existe una subpoblación importante a la que se asigna un papel específico en la inmunidad innata, son los denominados linfocitos B-1a. Estas células expresan, junto con otras, el marcador CD5, estimándose en el vacuno que un 5-35% de los linfocitos B de sangre periférica corresponde a esta subpoblación (Howard y Morrison, 1994). Sintetizan principalmente IgM de baja afinidad y especificidad antigénica. Estos anticuerpos podrían jugar un papel importante como primera barrera frente a agentes invasores o componentes dañados del organismo, activando respuestas independientes de linfocitos T (Arjona, 2007). Los linfocitos T γδ, denominados así por el tipo de cadenas presentes en su receptor TCR (del inglés, T-cell receptor), intervienen en las respuestas innatas llevando a cabo funciones efectoras y secretando citoquinas que estimulan la respuesta inmune adaptativa de base celular (Cutuli, 2007). En los rumiantes, los linfocitos T γδ son especialmente abundantes, pudiendo constituir Revisión bibliográfica 42 el 60 % de los linfocitos circulantes en animales jóvenes, frente al 5-15 % habitual en la especie humana y en ratones (Tizard, 2000). Gran parte de los linfocitos T γδ expresan en su superficie un marcador de activación específico denominado WC-1 (del inglés, Workshop cluster). Las funciones de esta molécula no se conocen en profundidad, pero las células que los expresan son siempre T CD4CD8- (Howard y Morrison, 1994). El aumento de la población de linfocitos B y T γδ en la mucosa, en detrimento de la de linfocitos T αβ, es un hallazgo frecuente en vacunos durante el curso de una infección primaria por O. ostertagi, aunque no siempre asociado a protección (Almería et al., 1997a). En el ovino y caprino se han realizado estudios histopatológicos de la mucosa abomasal en animales inoculados primariamente con H. contortus en los que se han encontrado elevadas cantidades de linfocitos T γδ entre los días 3 y 13 pi, sugiriéndose la intervención de este tipo de linfocitos en respuestas rápidas frente al parásito (Balic et al. 2000a; Pérez et al., 2008). Sin embargo, un estudio anterior en ovinos parasitados con T. colubriformis reveló que la depleción de linfocitos T WC1+, realizada con anticuerpos monoclonales, mejoraba la respuesta frente a una inoculación desafío en un 88% (McClure et al., 1996). Estos resultados son difíciles de comparar, debido a la variedad de especies parásitas y protocolos utilizados en cada caso, si bien señalan que la población de linfocitos T γδ estaría jugando un papel importante en la respuesta inmune frente a NGI, ya sea favoreciendo o dificultando la implantación de los parásitos. 10.4. INMUNIDAD ADAPTATIVA FRENTE A PARÁSITOS La respuesta inmune adaptativa es un mecanismo de defensa mucho más evolucionado que la inmunidad innata. Sus respuestas son específicas frente al antígeno que han reconocido, y tienen la capacidad de desarrollar una memoria inmunológica. Se activa cuando los agentes patógenos han superado las barreras Revisión bibliográfica 43 de la inmunidad innata y han penetrado en el organismo. Tarda varios días en instaurarse, tiempo necesario para que el hospedador reconozca el antígeno y se produzca la diferenciación de los linfocitos T y B (McClure et al., 2000). Tradicionalmente, se considera que la inmunidad adaptativa contiene dos tipos de mecanismos con la finalidad común de eliminar los agentes extraños del hospedador. Por una parte, la inmunidad celular, mediada fundamentalmente por los linfocitos T, y por otra, la inmunidad humoral, mediada por los anticuerpos. Independientemente del tipo de mecanismo que se ponga en marcha, su desarrollo se divide en tres fases: reconocimiento del antígeno, activación de los linfocitos y respuesta efectora. 10.4.1 Presentación del antígeno y orientación de la respuesta inmunológica El inicio de la respuesta inmune adaptativa se produce con el reconocimiento del antígeno por parte de los linfocitos T CD4+; este antígeno es presentado a los linfocitos por células presentadoras de antígeno, unido a las moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad de clase II (MHC II, del inglés major histocompatibility complex). El reconocimiento por el TCR específico, desencadena una señal de activación que permite establecer interacciones de alta afinidad entre el TCR y el MHC II, tras lo cual, otras moléculas de membrana contribuyen a la activación del linfocito T que ha contactado con su antígeno específico. Estas moléculas, denominadas coestimuladoras, desencadenan una segunda señal de activación que amplifica la primera. De estas moléculas, la más importante es el CD28. En ausencia de esta segunda señal se produce un efecto contrario a la activación, en un proceso de anergia en el que los linfocitos T específicos del antígeno se vuelven refractarios a cualquier activación. Revisión bibliográfica 44 Los linfocitos T CD4+ activados, tanto por las primeras como por las segundas señales, quedan alojados en el órgano linfoide secundario en el que han contactado con el antígeno, multiplicándose durante 4-6 días, periodo durante el cual no se pueden detectar linfocitos T específicos circulantes. Posteriormente podrán ser detectados en sangre y linfa, ya como células activadas. Otro tipo de presentación antigénica se produce cuando las células infectadas presentan antígenos específicos unidos a moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad de clase I (MHC I), expresado por casi todas las células del organismo. En este caso los linfocitos que reconocen el antígeno son los T CD8+. El resultado de esta interacción es la activación de los linfocitos T CD8+, y su transformación en células con alta capacidad citotóxica denominadas linfocitos citolíticos. Este tipo de linfocitos produce la lisis de la célula diana mediante la liberación de una serie de moléculas, principalmente perforinas y granzimas, presentes en vesículas de secreción, o bien a través de la activación de los mecanismos de apoptosis (Aparicio, 2007); ambos constituyen los principales mecanismos defensivos frente a virus y bacterias intracelulares que infectan diversos tipos de células (González, 2007). Las células dendríticas son células presentadoras de antígeno, y sus características funcionales y morfológicas las convierten en indispensable para la interacción entre la inmunidad innata y adquirida. Están especializadas en capturar y presentar antígenos, siendo las únicas capaces de activar la subpoblación de linfocitos T (Akesson et al., 2008; McNeilly et al., 2009). Algunos autores señalan que este tipo de células podrían tener un papel crucial en la orientación de la respuesta hacia Th1 o Th2 (Belkaid y Oldenhove, 2008; Diebold, 2008). De modo excepcional, las células dendríticas no infectadas pueden presentar antígenos en el contexto del MHC I, produciendo la activación del linfocito T CD8+, pero sin desencadenar la destrucción de la célula, en un mecanismo denominado “presentación cruzada” (Albert et al., 1998). Revisión bibliográfica 45  Orientación de la respuesta inmune adaptativa (Th1/Th2, Treg, Th17) Se ha demostrado que los linfocitos T colaboradores (Th, del inglés Thelper) se subdividen en dos subpoblaciones claramente diferenciadas, denominadas Th1 y Th2 (Urban et al., 1992). Este tipo de linfocitos se diferencian fundamentalmente por las citoquinas que producen, que orientarán la respuesta inmune hacia mecanismos efectores para la destrucción de patógenos intracelulares, fundamentalmente (respuesta Th1) o extracelulares (Th2) (Paul y Seder, 1994; van den Ham et al., 2013). Inicialmente se ha asociado una respuesta Th1 a una mayor susceptibilidad a las infecciones con NGI, mientras que la respuesta del tipo Th2 se relacionaría a una mayor resistencia (Nakamura et al., 2002). Sin embargo, el que el balance entre estas dos respuestas determine el grado de susceptibilidad/resistencia a este tipo de nematodos ha sido recientemente revisado (Venturina et al., 2013), ya que habitualmente se observa una expresión de INFγ e IL-12 a pesar de predominar una respuesta Th2 (Almería et al., 1997b; Meeusen et al., 2005; Pernthaner et al., 2005). Del mismo modo, en ovinos infectados con T. circumcincta, además de observase una respuesta Th2 en el curso de la infección (con un aumento en los niveles de IL-4, IL-5 e IL-13 en los linfonódulos abomasales) (Craig et al., 2007), se detectaron incrementos de citoquinas asociadas a una respuesta Th1 temprana, además de un aumento en los niveles de expresión de IL-10 y TGFβ, citoquinas que están relacionadas con los linfocitos Treg, al menos en la especie humana y en roedores (Beissert et al., 2006; Askenasy et al., 2008). Recientemente, la subpoblación linfocitaria Th17 también se ha sugerido que podría intervenir en el curso de las infecciones por NGI. Este tipo de respuesta se ha descrito asociada a infecciones bacterianas a nivel de las mucosas (Korn et al., 2009), así como en enfermedades inflamatorias autoinmunes (Peck y Mellins, 2009). En corderos infectados con T. Revisión bibliográfica 46 circumcincta, se observó en los seleccionados por su susceptibilidad a la infección (alto recuento de vermes adultos y huevos fecales, bajos niveles de IgA) mayores daños patológicos, asociados con una fuerte infiltración inflamatoria en el abomaso y con un aumento de los niveles de citoquinas asociadas a la respuesta Th17 (IL-6, IL-21 e IL-23A) en los linfonódulos abomasales, los cuáles se correlacionaron positivamente con la carga de vermes adultos y con los recuentos fecales (Gossner et al., 2012). Estos datos apoyan la hipótesis según la cual las ovejas con infecciones crónicas por NGI desarrollarían una repuesta inflamatoria Th1 o Th17 que inhibiría la producción de anticuerpos, permitiendo la persistencia de la infección (Venturina et al., 2013).  Teoría común de la mucosa Estudios realizados en roedores han demostrado interacciones entre determinadas estructuras de la mucosa y los linfonódulos locales. Estos circuitos de migración celular se exponen en la denominada “teoría común de la mucosa”. Su extrapolación a los rumiantes ha de ser realizada con precaución, dado que aún no hay suficientes estudios que la confirmen. Este hecho implicaría una migración linfocitaria desde los tejidos linfoides de la mucosa a los linfonódulos locales y posterior retorno a su lugar de origen en la mucosa. En este modelo jugarían un papel fundamental las denominadas células M, células epiteliales especializadas que se localizan sobre las placas de Peyer, capaces de capturar antígenos y transportarlos hacia el interior de la placa, donde se produce la estimulación linfocitaria (Owen, 1999; Nicoletti, 2000; Kanaya, 2007). Posteriormente, los linfocitos B y T viajan a los linfonódulos locales donde se multiplican. Estos linfocitos diferenciados, especialmente las células de memoria, son capaces de retornar a la mucosa digestiva, coordinando una respuesta local específica (González et al., 2003). Revisión bibliográfica 53 globulares significativamente mayores en los abomasos de las razas resistentes que en las susceptibles, sin que hubiera diferencias en los recuentos de mastocitos (Gamble y Zajac, 1992; Bricarello et al., 2004). Del mismo modo, en otros estudios se han encontrado correlaciones negativas entre carga parasitaria y número de leucocitos globulares (Douch et al., 1986; Stear et al., 1995b). Sin embargo, la acción de estas poblaciones sobre la expulsión de los NGI son bastantes contradictorias. Por un lado, Emery et al., 1993 observaron una activación de estas células en el proceso de expulsión del parásito en el ganado ovino, mientras que otros autores como, Huntley et al., 1992 sugieren que el aumento de los mastocitos no es necesario para la expulsión del parásito, ya que hallaron altos niveles de resistencia considerables sin incrementos en los recuentos de este tipo celular. Por consiguiente, parece bastante probable que la eficacia de la acción de los mastocitos dependa de la localización tisular del parásito, siendo más efectivos frente a especies o estadios que se alojen en la mucosa del órgano diana que frente a aquellos que se localicen en la luz del órgano (Anthony et al., 2007). Algunos autores sugieren también que el papel de los mastocitos y de los leucocitos globulares está limitado a la expulsión inmediata de los vermes, siendo muy poco efectivos en la expulsión larvaria más retardada (Balic et al., 2002), y que la presencia de mastocitos y leucocitos globulares no es indicativa de su funcionalidad (Rothwell, 1989; Miller, 1996; Balic et al., 2000b). Se puede constatar su activación, y el grado de degranulación, si se detectan los distintos mediadores químicos que liberan estas células. Por ejemplo, el estudio de los niveles de proteasas derivadas de los mastocitos (SMCP) en el mucus y en los tejidos muestra su relación con la expulsión inmediata de NGI en animales inmunizados. La mayor susceptibilidad del caprino frente a los NGI podría deberse, al menos parcialmente, a que presentan niveles más bajos de SMCP tisular que el ovino (Huntley et al., 1995). Revisión bibliográfica 54  Eosinófilos Los eosinófilos constituyen una población celular homogénea, que una vez maduros son transferidos desde la médula ósea a la sangre y de ahí a los tejidos, en los que se pueden encontrar habitualmente, de modo especial en la mucosa digestiva. En infecciones por helmintos es frecuente observar un incremento de los eosinófilos tanto en sangre como en tejidos (Balic et al., 2000b; Gill et al., 2000; Bricarello et al., 2002). Dentro de la composición de sus gránulos existen unas proteínas fuertemente catiónicas, como son la proteína básica mayor, la peroxidasa eosinofílica, la proteína catiónica de los eosinófilos y la neurotoxina derivada de eosinófilos, e hidrolasas lisosomales. También producen lisofosfolipasa, arilsulfatasa, fosfatasa ácida y peroxidasa (Serrano y Uceda, 2007). Los eosinófilos activados producen también metabolitos tóxicos derivados de oxígeno y sintetizan un amplio rango de mediadores lipídicos, como prostaglandinas, factor activador plaquetario y leucotrienos. También se ha demostrado su capacidad para producir una serie de citoquinas (IL-1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, GM-CSF, TNF-α, TGF-β, IFN-γ) y quimoquinas (MIP-1α, RANTES, eotaxina) (Balic et al., 2000b; Rothenberg y Hogan, 2006). Otra molécula liberada por los eosinófilos es la galectina-14, considerada como un buen indicador de la actividad de estas células (Young et al., 2009). Los niveles de esta molécula en el mucus aparecen elevados en animales parasitados en comparación con los controles, así como en animales sometidos a un protocolo de inoculaciones repetidas en comparación con los que reciben una inoculación única (Kemp et al., 2009; Robinson et al, 2011). Revisión bibliográfica 55 o Activación de los eosinófilos La IL-5 es la citoquina responsable de la eosinofilia dependiente de linfocitos T en sangre y tejidos tras la infección por helmintos (Balic et al., 2000b). Los eosinófilos tienen receptores para algunas proteínas del complemento y para las inmunoglobulinas IgG IgA e IgE (Balic et al., 2000b; Salinas, 2007). Es por ello, que se requiere normalmente de una inmunidad adquirida que permita desarrollar anticuerpos específicos para que los eosinófilos puedan adherirse a los parásitos y desarrollar, de este modo, su acción efectora (Meeusen y Balic, 2000; Salinas, 2007). La acción efectora del eosinófilo sobre los helmintos parece estar basada en la degranulación celular sobre el parásito, mediada por la unión de los receptores de membrana a anticuerpos específicos frente a los vermes. o Eosinofilia en infecciones primarias La eosinofilia en infecciones primarias por NGI se produce fundamentalmente en asociación a los estadios larvarios, más que a la presencia de los vermes adultos, lo que podría deberse al elevado poder quimiotáctico de las larvas sobre los eosinófilos (Adams y Colditz, 1991; Wildblood et al., 2005). Sin embargo, la repercusión de la eosinofilia sobre el asentamiento y desarrollo larvario es escasa, probablemente porque se requiere una mayor activación de los eosinófilos mediada por anticuerpos tal y como sugieren Meeusen y Balic, 2000 y Terefe et al., 2009. Las infecciones primarias de larvas de NGI producen una moderada eosinofilia. En concreto, en infecciones con T. circumcincta se observa una eosinofilia tisular a los 10 y 21 dpi (Stevenson et al., 1994). En el caso de Revisión bibliográfica 56 ovinos primoinfectados con H. contortus, los máximos niveles de eosinófilos en el tejido se observan a los 5 dpi, siendo a los 27 ó 36 dpi la eosinofilia menor, aunque con recuentos mayores que los observados en animales control (Balic et al., 2000a). Por otra parte, Gill et al., 2000, hallaron a los 28 días de una primoinfección con L3 de H. contortus mayores concentraciones de eosinófilos y mastocitos en la mucosa abomasal de los animales genéticamente más resistentes, sugiriendo estos datos que la resistencia de los animales podría estar relacionada con la presencia de eosinófilos en el tejido (Gill et al., 2000; Shakya et al., 2009; 2011). En el caso de los helmintos con fases larvarias, como por ejemplo O. columbianum, se ha podido observar un aumento en los recuentos de los eosinófilos en el momento de la salida de las L 4, a los 5 dpi (Shelton y Griffiths, 1967). También se han encontrado mayores niveles de eosinófilos tras la salida al exterior de nematodos adultos (21-23 dpi) de sus estructuras quísticas, como el caso de Nematodirus battus (Winter et al., 1997). o Eosinofilia en infecciones secundarias. Inmunidad adquirida Se ha observado que en las infecciones secundarias por NGI existe un incremento de eosinófilos tanto en sangre como en los tejidos, sensiblemente superior al observado en animales primoinfectados, existiendo una estrecha asociación con las larvas del parásito localizadas en la mucosa (Shelton y Griffiths, 1967; Stevenson et al., 1994; Balic et al., 2003, 2006). La acción de los eosinófilos se relaciona de forma importante con un estado de resistencia (Gill et al., 2000; Shakya et al., 2011) y con la observación histológica o in vitro de su efecto lesivo sobre las larvas del parásito (Rainbird et al., 1998; Balic et al., 2006). Revisión bibliográfica 57 Se ha comprobado también cómo los eosinófilos se concentran alrededor de las larvas de H. contortus en ovinos previamente inmunizados. Estas larvas presentan diferentes grados de lesión, indicando que los eosinófilos pueden dañar o incluso matar las larvas de nematodos in vivo (Balic et al., 2006). Además de este efecto directo en la larva, los eosinófilos también liberan otras moléculas, como los leucotrienos, capaces de provocar efectos similares a los leucotrienos liberados por los mastocitos (Costa et al., 1997; Weller, 1997). Por otra parte, se han hallado niveles elevados de eosinófilos en los tejidos de razas e individuos genéticamente más resistentes a la infección (Gill et al., 2000; Bricarello et al., 2002, 2004). En otros casos los recuentos entre razas resistentes y susceptibles han sido similares, a pesar de observarse correlaciones negativas entre los eosinófilos en abomaso y los recuentos de huevos en heces en las razas resistentes (Amarante et al., 2005; González et al., 2008). Por el contrario, diversos autores sugieren que el medio ambiente generado por los eosinófilos podría ser beneficioso para los parásitos, debido al daño que producen las enzimas que liberan en los tejidos del hospedador. Los propios eosinófilos son atraídos mediante un efecto quimiotáctico de los productos de E/S tanto de las larvas como de los adultos sobre los eosinófilos (Klion y Nutman, 2004; Wildblood et al., 2005; Turner et al., 2008). Este hecho es especialmente relevante en especies parásitas cuyas fases evolutivas se alojan en las criptas gástricas, como por ejemplo T. circumcincta (Balic et al., 2000b). Algunos autores han evidenciado relaciones positivas entre los recuentos de eosinófilos sanguíneos y la longitud de los parásitos adultos, sugiriendo que la presencia de estas células podría favorecer el desarrollo de T. circumcincta (Henderson y Stear, 2006), aunque también podría demostrar simplemente un mayor reclutamiento celular ante una mayor biomasa parasitaria. Revisión bibliográfica 58 Los nematodos adultos no suelen inducir eosinofilia, y su expulsión está mediada por los mastocitos. Diferentes estudios sí han demostrado que los eosinófilos están implicados en un fenómeno de expulsión tardía de las larvas que han alcanzado la mucosa. Debido a que los diferentes estadios del parásito expresan distintos antígenos, se requieren varios contactos con el parásito para adquirir inmunidad, explicándose así la mayor efectividad de los eosinófilos en las reinfecciones (Meeusen y Balic, 2000).  Células mucosas y caliciformes Las células caliciformes se encuentran situadas en el intestino y aparato respiratorio. El abomaso carece prácticamente de ellas, y en su lugar existe un conjunto de células productoras de mucus que tapiza las fosillas en las que se abren las glándulas gástricas y las crestas situadas entre ellas. Se encuentran también células similares en el cuello de las glándulas (Fawcett, 1991). Estas células liberan a la luz el mucus que protege la pared abomasal del efecto del HCl y la pepsina. La hiperplasia de células mucosas y caliciformes, y la modificación de la composición del mucus son fenómenos frecuentes en las infecciones por NGI y parecen estar mediados por las células T (Nawa et al., 1994; Balic et al., 2000b; Khan y Collins, 2004). Sin embargo, no existe un acuerdo unánime (Khan et al., 1995). En el ovino, la inoculación tanto de L3 como de adultos de T. circumcincta produce un aumento de las células mucosas de la pared gástrica, así como una reducción de la actividad de las células parietales, aumentando el pH del estómago que favorecería la supervivencia larvaria (Scott et al., 1998a). En el caso de infecciones por H. contortus, la hiperplasia de células productoras de mucus puede acompañarse de una adaptación de las células principales, productoras habitualmente de zimógeno, que podrían producir también mucus Revisión bibliográfica 59 (Scott et al., 1998b).  Efecto del mucus y de la motilidad gastrointestinal El mucus localizado sobre el epitelio gastrointestinal tiene una consistencia altamente viscosa, la cual parece ejercer un efecto negativo sobre los parásitos, disminuyendo su motilidad y dificultado su alimentación (Douch et al., 1983; Miller, 1987; Rothwell, 1989). El mucus libera diferentes sustancias que aumenta su acción nociva sobre el parásito, de entre ellas cabe destacar la histamina, los leucotrienos y las lectinas; estas últimas han sido particularmente estudiadas en los últimos años (Young y Meeusen, 2004). Un ejemplo de la importancia del mucus en el control de la infección por NGI se ha demostrado en diversos estudios desarrollados en ganado ovino, donde el mucus de ovejas inmunes parece capaz de paralizar las larvas de nematodos (Douch et al., 1983; Jones et al., 1994). Dentro de las sustancias presentes en el mucus destacan la galectina-14 y la galectina-15. La galectina-14 la producen los eosinófilos (Dunphy et al., 2002) y, aunque se expresa habitualmente en los tejidos sanos, se libera espontáneamente en la mucosa gastrointestinal ante la infección por NGI, siendo su concentración mayor en animales reinfectados con H. contortus. Por ello, su actividad se relaciona tanto con mecanismos de inmunidad innata como adquirida (Kemp et al., 2009; Young et al., 2009; Robinson et al., 2011), siendo capaz de generar un aumento de la viscosidad del mucus y, como consecuencia, provocar la inmovilización parasitaria (Young et al., 2009). La galectina-15 la producen las células del epitelio mucoso del abomaso y tiene una función similar a la anterior. Tras la inoculación con H. contortus, aparece mayor concentración de esta molécula en los animales que han sufrido Revisión bibliográfica 60 repetidas infecciones, en comparación con animales primoinfectados (Meeusen et al., 2005). En un estudio reciente con terneros infectados con O. ostertagi, se observó que aunque los cambios en la biosíntesis del mucus empezaron temprano durante la infección, los mayores efectos se produjeron cuando los adultos estuvieron presentes en la superficie de la mucosa abomasal. Se detectaron incrementos en la expresión de algunos genes encargados de regular la producción de mucus en los animales inoculados, así como cambios en la glucosilación de éste (Rinaldi et al., 2011). El peristaltismo también juega un papel esencial en la expulsión de los vermes. El mucus impide la adhesión de los vermes a la mucosa, mientras que las contracciones de la musculatura lisa los hacen avanzar hacia regiones más distales del aparato digestivo. En diversos estudios se ha observado que en infecciones por NGI existe un aumento tanto de la motilidad del aparato digestivo como de la producción de mucus, sugiriéndose una base inmunológica común (Vallance et al., 1998, 1999; Zhao et al., 2003, Finkelman et al., 2004; Khan y Collins, 2004, 2006).  Efecto de las citoquinas en la respuesta inmune frente a NGI. Las citoquinas son proteínas producidas fundamentalmente por células del sistema inmune cuando y se consideran como vehículos de comunicación entre los distintos componentes del mismo para su actuación coordinada. Entre sus características peculiares cabe destacar la escasa especificidad para su producción (existe una gran diversidad de células capaces de sintetizar una misma citoquina) y la capacidad que tienen de inducir distintas respuestas en función de la célula que activen (Gómez Lucía et al., 2007). Revisión bibliográfica 61 Se conocen más de cien citoquinas, destacando las siguientes en los estudios realizados en infecciones por NGI (Lacroux, 2006; García, 2007; Beetz et al., 2008; Tizard, 2009): - Interleuquina 2 (IL-2): es producida fundamentalmente por los linfocitos T CD4+ y, en menor medida, por los CD8+, e induce la proliferación de linfocitos Th1 y CD8+ previamente activados por la IL-12, así como una elevación de la actividad de las células NK. - Interleuquina 4 (IL-4): es producida principalmente por linfocitos Th2, mastocitos, basófilos y, secundariamente, también por los eosinófilos. Estimulan la proliferación de los mastocitos, promueven la diferenciación de los linfocitos T hacia la subpoblación Th2, e inducen el cambio de isotipo a IgE e IgG1 en los linfocitos B. Esta citoquina induce hiperplasia de las células productoras de mucus y estimula la motilidad de la musculatura lisa. - Interleuquina 5 (IL-5): es sintetizada mayormente por linfocitos y mastocitos, y es capaz de promover una hiperplasia de eosinófilos, la producción de IgE e IgA, e inducir hiperplasia de las células productoras de mucus. - Interleuquina 10 (IL-10): es producida fundamentalmente por linfocitos B y Th2; su principal característica es la capacidad de inhibir la producción de citoquinas propias de la respuesta Th1 y promover la actividad de los mastocitos. - Interleuquina 12 (IL-12): es sintetizada principalmente por macrófagos, aunque también por los linfocitos B, monocitos y células dendríticas. Inhibe la producción de IL-4, y con ello la de IgE. Promueve la respuesta inmune de base celular al estimular la producción de IFN- e IL-2 y aumentar la capacidad citotóxica de los linfocitos T CD8+ y células NK. Revisión bibliográfica 62 - Interleuquina 13 (IL-13): es producida fundamentalmente por los linfocitos T CD4+ Th2, promueve la producción de IgE, la contracción del músculo liso y la hiperplasia de las células productoras de mucus. - Interferón γ (IFN-γ): es sintetizada por los linfocitos Th1, γδ+, por las células NK, y algunos CD8+. Entre sus funciones destaca la inhibición de la producción de IL-4, y con ello la de IgE, la inducción de la producción de IgG2 en los linfocitos B y el aumento de la capacidad antimicrobiana de los macrófagos y de la actividad de las células NK. - Eotaxina 1: es sintetizada por los linfocitos T activados y se caracteriza por ejercer un efecto quimiotáctico sobre los eosinófilos. - Factor de necrosis tumoral α (TNF-α): es sintetizada por varios grupos celulares, entre los que se destacan los linfocitos T (αβ y γδ) y B, los macrófagos, y los mastocitos. Son capaces de promover la apoptosis de células tumorales e infectadas por virus e interviene en las respuestas inflamatorias. - Factor β de crecimiento transformante (TGF-β): es producido por plaquetas, macrófagos activados y linfocitos T y B. Interviene en la división celular, generando inmunosupresión y acelerando la fibrosis y la cicatrización. - Interleuquina 17A (IL-17A): es producida por linfocitos Th17. Promueve la inflamación mediada por neutrófilos, como parte de la inmunidad innata, e inicia la producción de citoquinas proinflamatorias por las células endoteliales, epiteliales y macrófagos. Regula las respuestas inmunes adaptativas destinadas a la eliminación de bacterias extracelulares y hongos. El INFγ suprime el desarrollo de linfocitos Th17 y así inhibe la inflamación mediada por IL-17A. Revisión bibliográfica 69  Hipobiosis Consiste en el paro temporal del ciclo del nematodo en un momento preciso del desarrollo parasitario, que sirve para sincronizar el desarrollo del parásito con las condiciones del hospedador y del ambiente (Soulsby, 1987). El secuestro larvario (hipobiosis) en la mucosa del hospedador es un fenómeno frecuente en las infecciones por NGI en rumiantes. Se ha asociado a la resistencia frente a O. ostertagi (Michel, 1963) y Haemonchus placei (Roberts, 1957) en vacuno, y H. contortus (Barger et al., 1985), T. circumcincta (Seaton et al., 1989a, Halliday et al., 2007)), T. colubriformis (Barnes y Dobson, 1993) y Trichostrongylus vitrinus en el ovino (Seaton et al., 1989b). Diferentes trabajos han relacionado la hipobiosis con la estacionalidad, la cepa del parásito o la carga parasitaria de vermes adultos (Blitz y Gibbs, 1971; Eysker, 1997). La importancia de la hipobiosis deriva en que promueve una alta presencia en el pasto de L3 infectantes en momentos en los que hay gran disponibilidad de hospedadores susceptibles, tras la activación masiva de un elevado número de larvas que se encontraban quiescentes, desencadenando patologías más graves en los hospedadores (Urquhart, 1996). En infecciones por T. circumcincta se ha observado que el fenómeno de secuestro larvario tiene un mayor protagonismo en los animales inmunizados, actuando como un mecanismo de resistencia frente al parásito, aunque no estén claros los mecanismos que provocan esta situación (Stear et al., 1995b; Halliday et al., 2007). Esta circunstancia tampoco se considera una regla constante, pues en algunos estudios realizado también con T. circumcincta, no se llegó a observar ninguna asociación entre la hipobiosis larvaria y la resistencia parasitaria (Halliday et al., 2007). En infecciones naturales de animales en pastoreo, la renovación paulatina de la carga parasitaria adulta por las larvas quiescentes permite un nivel de Revisión bibliográfica 70 eliminación de huevos en el pasto que asegura el mantenimiento de la población parasitaria. El hecho de que la hipobiosis sea un fenómeno frecuente en distintas especies de NGI podría sugerir que el secuestro larvario sería más una estrategia de supervivencia efectiva que el resultado de un mecanismo defensivo del hospedador (Balic et al., 2000b).  Fallo en el establecimiento larvario La manifestación principal de la inmunidad adquirida frente a los NGI es la reducción del número de larvas en la mucosa gastrointestinal (Balic et al., 2000b). En este resultado influyen una serie de elementos: - El fallo en el establecimiento larvario se expresa fuertemente tras contactos repetidos con el parásito, tal y como se ha observado en infecciones por diferentes NGI, entre ellos H. contortus (Barger et al., 1985), Trichostrongylus vitrinus (Seaton et al., 1989b), T. circumcincta (Seaton et al., 1989a), T. colubriformis (Dobson et al., 1989b) y O. ostertagi (Michel, 1973; Claerebout et al., 1996). - Una vez adquirida la resistencia frente al establecimiento de las larvas de una determinada especie tras varias reinfecciones, la expresión de resistencia puede afectar a diferentes especies presentes en el mismo tejido. De esta manera, animales que han adquirido inmunidad mediante inoculaciones con larvas de T. colubriformis pueden expulsar otras larvas de nematodos intestinales, como Nematodirus spathiger o Trichostrongylius vitrinus, pero no las de los nematodos gástricos T. circumcincta o H. contortus (Dineen et al., 1977; Barnes y Dobson, 1993; Emery et al., 1993). - Existen mecanismos específicos de resistencia para cada fase de desarrollo del parásito. Además, las distintas fases larvarias estimulan en Revisión bibliográfica 71 distinto grado la respuesta inmune y activan distintos mecanismos efectores. Por ejemplo, animales inmunizados con inoculaciones repetidas de L3 de diferentes especies de la familia Trichostrongylidae adquieren antes la capacidad de inhibir el establecimiento larvario que de reducir la carga parasitaria adulta (Chiejina y Sewell, 1974; Dobson et al., 1990b). - La infección natural de los animales a través de los pastos tiene una intensidad muy variable, lo que activa diferentes mecanismos de expulsión larvaria. La expulsión de las larvas es un proceso en el que intervienen los leucocitos globulares, capaces de impedir el acceso de las larvas a la mucosa en caso de infecciones repetidas, en un mecanismo mediado por IgE. Cuando los niveles de leucocitos globulares no son suficientes para la expulsión, las larvas consiguen alcanzar la mucosa, desencadenando una respuesta que se caracteriza por la presencia abundante de eosinófilos y linfocitos en las mucosas y la liberación de citoquinas (principalmente del tipo Th2). Los eosinófilos destruyen las larvas alojadas en la mucosa mediante el contenido de sus gránulos, en un proceso de expulsión retardada del parásito (Meeusen et al., 2005). 10.5.2. Frente a estadio adulto  Cambios en la morfología del verme Los cambios morfológicos descritos más importantes consisten en la alteración de la solapa vulvar en las hembras en respuesta a la inmunidad adquirida por parte del hospedador (Balic et al., 2000b). Estos cambios han sido Revisión bibliográfica 72 observados tras sucesivas infecciones en bovinos con O. ostertagi (Michel, 1969) y T. circumcincta (Denham, 1969). Reducciones en el tamaño de los vermes adultos también se han descrito en ovejas infectadas con T. circumcincta (Smith et al., 1985a; Seaton et al., 1989a; Stear et al., 1995a), H. contortus (Coyne y Smith, 1992) y T. colubriformis (Douch, 1988), y en bovinos con O. ostertagi (Michel, 1969; Gasbarre et al., 2001), como resultado del desarrollo de inmunidad adquirida por parte del hospedador. La reducción en el tamaño de los vermes se ha asociado a una respuesta de IgA en ovinos inmunes a la infección de T. circumcincta (Smith et al., 1985a; Halliday et al., 2007).  Reducción de la fecundidad Una reducción en la fecundidad de las hembras adultas, aparte de ser una consecuencia de la inmunidad adquirida, es influida por la carga parasitaria, que de ser muy elevada puede provocar una competencia intraespecífica, o alcanzar un nivel umbral que desencadene una respuesta inmunológica específica (Balic et al., 2000b). Los mecanismos mediante los cuales se lleva a cabo la reducción de la fecundidad de los vermes son variados. Debido a la existencia de una estrecha asociación entre la longitud de los vermes y su fecundidad, tanto en H. contortus como en T. circumcincta (Stear et al., 1999; Martínez Valladares et al., 2005a; Lacroux et al., 2006; Rowe et al., 2008), se ha llegado incluso a plantear la hipótesis de que el control de la fecundidad de los vermes tenga lugar de forma indirecta, mediante la regulación inmunológica del desarrollo de los mismos, en un proceso mediado por IgA (Strain y Stear, 2001; Rowe et al., 2008). Sin embargo, la IgA u otras inmunoglobulinas también podría tener un efecto directo sobre la fecundidad mediante el bloqueo directo de los órganos sexuales del parásito (Salinas et al., 2007). Revisión bibliográfica 73 El fenómeno de reducción de la fecundidad de los vermes hembras se ha descrito tras infecciones repetidas con T. circumcincta (Smith et al., 1985; Stear et al., 1995b) en ovinos, y con T. colubriformis en caprino (Pomroy y Charleston, 1989), así como en vacuno infectado con O. ostertagi (Michel, 1963), T. colubriformis (Gibson y Parfitt, 1973; Barnes y Dobson, 1990; Bisset et al., 1996) y H. contortus (Dineen y Wagland, 1966); en general se acepta como una de las consecuencias de la respuesta inmune protectora (Coyne et al., 1991; Coyne y Smith, 1992).  Expulsión de los vermes adultos La expulsión de los vermes adultos es dependiente del número de larvas infectantes, al menos en las infecciones por H. contortus y T. colubriformis (Barger et al., 1985; Dobson et al., 1990b), siendo necesario un umbral mínimo para que se desencadene el proceso de eliminación. En ocasiones, en la parasitación por H. contortus la expulsión de los vermes adultos se desarrolla mediante un fenómeno denominado “autocura”, atribuido a un mecanismo de hipersensibilidad inmediata desencadenado por la entrada de larvas, que afecta de modo inespecífico a los adultos (incluso de especies distintas a la de las larvas infectantes); sin embargo, no necesariamente implica la adquisición de inmunidad frente a futuras infecciones (Soulsby, 1987; Cordero del Campillo et al., 1999). La expulsión de los vermes adultos en inoculaciones primarias es un fenómeno raro en rumiantes (Behnke et al., 1992), con la excepción de las infecciones por Nematodirus battus (Lee y Martin, 1976; Winter et al., 1997). En cambio, la expulsión de la población adulta como resultado de infecciones repetidas es un fenómeno frecuente en las infecciones por H. contortus, (Barger et al., 1985), T. circumcincta (Seaton et al., 1989a), Ostertagia leptospicularis Revisión bibliográfica 74 (Hertzberg et al., 1995), T. vitrinus (Seaton et al., 1989b) y T. colubriformis (Dobson et al., 1990b), y en terneros, por O. ostertagi (Michel, 1963). Por lo que en general, la expulsión de los nematodos adultos sería el resultado de mecanismos inespecíficos, inducidos por larvas infestantes, y de mecanismos específicos, inducidos por los propios vermes adultos (Balic et al., 2000b). 10.6. EVASIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE Los parásitos han desarrollado múltiples sistemas para evitar la respuesta inmune del hospedador. En algunos casos existen mecanismos de resistencia frente a los sistemas efectores del hospedador, en otros se dificulta el reconocimiento de antígenos, e incluso pueden llegarse a liberar sustancias que producen inmunosupresión, haciendo que la respuesta inmune sea menos efectiva (Gómez-Lucía et al., 2007). Esta evasión de la respuesta inmune del hospedador es una capacidad variable, característica de cada especie parásita.  Mecanismos de resistencia a los sistemas efectores del hospedador Los vermes parásitos poseen una gruesa cutícula que los protege frente al daño causado por la mayoría de las células defensivas (Salinas, 2007).  Mecanismos que evitan el reconocimiento de los antígenos. Muchos helmintos imitan proteínas del hospedador para evitar ser reconocidos por los mecanismos inmunes (Tizard, 2009). Otra forma de evasión de la respuesta inmune la desarrollan nematodos que son contenidos en estructuras que aíslan las etapas larvarias y las hacen poco accesibles a los mecanismos efectores y de reconocimientos. Por ejemplo, en O. Revisión bibliográfica 75 ostertagi y T. circumcincta las formas larvarias ocupan las fosas gástricas distendidas antes de emerger como jóvenes adultos. En el caso de H. contortus se sugiere que es la motilidad la estrategia de supervivencia, ya que al moverse el verme dificulta el contacto con las células defensivas del hospedador. (Balic et al., 2000b). Además, las diferentes formas de desarrollo de los NGI muestran diversos antígenos somáticos y de E/S, comportándose, a efectos de reconocimiento antigénico, como parásitos distintos, lo que dificulta la generación de una respuesta inmune efectiva por parte del hospedador (Cox et al., 1990; Balic et al., 2000b; Salinas, 2007).  Mecanismos que producen inmunomodulación Las infecciones crónicas con helmintos están asociadas frecuentemente con una inmunomodulación de la respuesta inmune celular, presumiblemente para prolongar la supervivencia del parásito (Nisbet et al., 2010). En muchos casos, la actividad inmunosupresora se atribuye a moléculas que son secretadas por los nematodos parásitos (Grainger et al., 2010). Por ejemplo, se ha demostrado un efecto inmunosupresor por parte de antígenos procedentes de L4 de Ostertagia sobre la proliferación de linfocitos abomasales (De Marez et al., 1997; Gómez-Muñoz et al., 2004). Otro claro ejemplo lo observaron McNeilly et al., (2013), quienes identificaron actividad inmunosupresora en los productos de E/S derivados de L4 de T. circumcincta en ovinos, la cual se vio reducida en los animales que desarrollaron inmunidad. También se ha propuesto que algunos helmintos podrían alterar las respuestas inmunitarias secretando algunas moléculas que imitan a citoquinas propias del hospedador (Salinas, 2007). Por ejemplo, en ovinos infectados Revisión bibliográfica 76 con T. circumcincta se le atribuye un posible papel inmunomodulador a un homólogo de la citoquina MIF (factor inhibidor de macrófagos) (Nisbet et al., 2010). 11 INMUNIZACIÓN FRENTE A LOS NEMATODOS GASTROINTESTINALES Como se mencionó anteriormente una de las estrategias de control frente a las enfermedades parasitarias producidas por nematodos es la inmunoprofilaxis. Actualmente se reconocen tres tipos principales de vacunas: vacunas atenuadas (Bain, 1999), vacunas frente a antígenos expuestos al sistema inmune (Meeusen y Piedrafita, 2003) y vacunas frente a antígenos ocultos (Knox et al., 2003). 11.1 VACUNAS ATENUADAS Este tipo vacunas emplean como antígenos larvas atenuadas y han sido utilizadas desde hace más de 40 años en ganado vacuno contra el nematodo pulmonar Dictyocaulus viviparus (Jarret y Sharp, 1963; Johnson et al., 2003). La inmunización de ovinos con larvas atenuadas de H. contortus sólo ha obtenido resultados positivos en animales adultos, que por otra parte suelen ser más resistentes al parásito (Smith y Christie, 1979; Stear et al., 1999), probablemente debido a la necesidad de mecanismos naturales de inmunidad del hospedador desarrollados (Stear et al., 2007). También se han realizado algunos ensayos de vacunación con larvas irradiadas en otros nematodos gastrointestinales de rumiantes, como los llevadas a cabo por Smith et al. (1982) frente a T. circumcincta en ovinos adultos. Revisión bibliográfica 77 11.2 VACUNAS FRENTE ANTÍGENOS EXPUESTOS AL SISTEMA INMUNE Con este término se hace referencia a las inmunizaciones en las que se utilizan como inmunógenos antígenos nativos del parásito, a los que tienen acceso el sistema inmune del hospedador. Cuenta como principal ventaja el hecho de no necesitar de revacunaciones, ya que se produce una estimulación cuando el hospedador contacta con el parásito. Como inconveniente, se encuentra la posibilidad de que su uso continuado determine la aparición de cepas resistentes a la inmunización por mecanismos similares a los que acontecen en la aparición de cepas resistentes a los antihelmínticos. Durante muchos años se ha intentado inducir la inmunidad frente a nematodos gastrointestinales con antígenos nativos, así como con sus formas recombinantes. Se han utilizado diferentes tipos, entre ellos antígenos cuticulares, antígenos de E/S larvarios y de vermes adultos (totales y fraccionados), etc. Utilizando este tipo de antígenos se han conseguido reducciones en los recuentos fecales y en el número de vermes en abomaso; así, en protocolos de inmunización con H. contortus se obtuvo una reducción de hasta el 75% en los recuentos fecales y en el número de vermes en abomaso (Emery, 1996). No obstante, por el momento ninguno de estos antígenos ha dado lugar a un producto registrado (Newton y Meeusen, 2003). 11.2.1 Antígenos de E/S Dentro de las funciones más relevantes desempeñadas por los productos de E/S de los NGI destacan las siguientes: permitir la penetración de las formas larvarias en el tejido, facilitar la degradación de proteínas del hospedador para alimentarse (Cox et al., 1990; Karanu et al., 1993), regular la respuesta inmune del hospedador y evitar la coagulación de la sangre, entre otras. Todas estas Revisión bibliográfica 78 actividades o cambios que inducen en el hospedador los hacen candidatos idóneos para el desarrollo de vacunas efectivas frente a los NGI (Joshi y Singh, 2000; Suchitra y Joshi, 2005). Dentro de los antígenos de E/S más estudiados destacan los denominados ES15 y ES24 de H. contortus en ovinos, que se caracterizan por su bajo peso molecular y por ser expresados tanto por las L4 como por los vermes adultos. En inmunizaciones con preparaciones enriquecidas con este tipo de antígenos se redujeron los recuentos fecales en animales inmunizados entre un 32% y un 77%, y la media de vermes adultos en el abomaso se redujo entre un 64% y un 85% (Schallig y van Leeuwen, 1997; Vervelde et al., 2002). El mecanismo inmunitario conferido por este tipo de antígenos no ha sido definido aún, pero se ha relacionado con una respuesta proliferativa de células T (Schallig y van Leeuwen, 1997), el incremento de los niveles de anticuerpos específicos en suero (IgG1, IgA o IgE) (Vervelde et al., 2002), y la presencia de mastocitos en abomaso (Schallig et al., 1997). Se han realizado ensayos con antígenos ES15 recombinantes con buenos resultados, aunque la eficacia no siempre fue evidente (Vervelde et al., 2002). Sin embargo, las respuestas protectoras siempre se han detectado en animales adultos, mientras que tanto los antígenos naturales como los recombinantes ES15 y E24 parecen no inducir protección en corderos (Vervelde et al., 2002). Se ha identificado otros productos de E/S de vermes adultos de H. contortus que podrían ser capaces de inducir protección en animales inmunizados. Es el caso de una proteína de 66k Da (p66), que es capaz de estimular la proliferación de células mononucleares periféricas, así como inducir una reducción de la motilidad de los parásitos adultos in vitro. La concentración de anticuerpos específicos anti-p66 en los animales vacunados se encontraron correlacionados de forma negativa con la carga parasitaria (Rathore et al., 2006), lo que demostraría el papel de la respuesta inmune en la protección observada. Revisión bibliográfica 85 que algunas de ellas podrían ser catalogadas como antígenos ocultos, por no ser accesibles al sistema inmune del hospedador. En los trabajos de Knox et al., (1999), a partir de homogeneizados de vermes adultos de H. contortus, utilizando detergentes capaces de extraer proteínas integrales de las membranas celulares (Triton X-100), y posteriormente enriquecidos mediante cromatografía en columnas de thiol-sepharosa, pudieron obtenerse extractos con actividad proteinasa capaces de inducir un elevado grado de protección frente al parásito en ovinos inmunizados con el producto obtenido. Dicha protección se tradujo en una reducción del 52% en el número de vermes adultos, así como del 95% en los recuentos fecales. Esta fracción, además de mostrar actividad cisteína-proteinasa, se localizó mediante inmunofluorescencia con anticuerpos específicos en la superficie intestinal del parásito. Otro componente de esta fracción es una proteína cuyo peso molecular es de aproximadamente 60 KDa (glutamato deshidrogenasa -GDH-) (Skuce et al., 1999a); sin embargo, esta proteína no parece contribuir a la protección inducida por el extracto completo (Redmond y Knox, 2004; Knox et al., 2005). En O. ostertagi Geldhof et al., (2002) también realizaron inmunizaciones en vacuno con una fracción S3-thiol procedente de vermes adultos, de forma similar a los trabajos anteriores, pero no se obtuvo ningún nivel de protección. Los productos recombinantes expresados en bacterias de este tipo de proteinasas sólo han mostrado una protección parcial (Redmond y Knox, 2006), por lo que se ha propuesto la posibilidad de obtener vacunas recombinantes utilizando sistemas eucariotas como Caenorhabditis elegans (Murray et al., 2007). Aunque se ha demostrado que las proteinasas extraídas son enzimáticamente activas y están glicosiladas, hasta el momento no hay datos de efectividad in vivo. Revisión bibliográfica 86 11.3.4 Otros antígenos ocultos  Contortina: es obtenida a partir de adultos del parásito, siendo capaz de reducir la carga parasitaria en un 78% en ovinos vacunados (Munn et al., 1987).  Antígenos p52 y p46: forman parte de una poliproteína denominada GA1 (Jasmer et al., 1993; Jasmer et al., 1996) e inducen protección en cabras y ovejas reduciendo la carga de vermes adultos en el abomaso (33% en ovino y 60% en caprino) y el recuento de huevos en heces (78% en ganado ovino y 50% en caprino) (Jasmer et al., 1993; Smith et al., 2000b).  Antígenos p45, p49 y p53: son de tres proteínas que fueron separadas de la denominada H11 por cromatografía de intercambio iónico y son capaces de reducir en aproximadamente un 70% los recuentos fecales, y en torno al 30% los recuentos de vermes de H. contortus (Smith et al. 1993b); actualmente se incluyen dentro del denominado complejo p150.  Antígeno p26/23: también se han obtenido resultados positivos a partir de fracciones somáticas purificadas de bajo peso molecular, las denominadas p26/23, que fueron capaces de estimular la respuesta inmune tanto a nivel local como general, con reducciones en torno al 60% tanto en los recuentos fecales como en la carga parasitaria (Domínguez-Toraño et al., 2000; Domínguez-Toraño et al., 2003). 11.4 VACUNACIÓN FRENTE T. CIRCUMCINCTA También se han llevado a cabo estudios de inmunoprotección frente a T. circumcincta utilizando como inmunógenos diferentes antígenos no ocultos y Revisión bibliográfica 87 ocultos. Un ejemplo sería el estudio llevado a cabo por Smith et al., 2001, en el cuál desarrollaron un doble ensayo en el que pretendían observar si se generaba alguna protección cruzada entre H. contortus y T. circumcincta. Para ello utilizaron como antígeno glicoproteínas de membrana tanto de H. contortus como de T. circumcincta. En dichos trabajos observaron que los animales inmunizados con glicoproteínas de membrana de H. contortus no generaban ninguna protección cruzada frente a T. circumcincta y sí para H. contortus; y aquellos que recibieron glicoproteínas de T. circumcincta no confirieron ninguna protección frente a su homologo, pero si existió una protección cruzada frente a H. contortus. Otro intento por reproducir la exitosa protección generada frente a H. contortus mediante diferentes antígenos fue el llevado a cabo recientemente por Halliday y Smith et al., 2011. En su estudio utilizaron como inmunógeno una fracción soluble de la membrana de L4 de T. circumcincta que incluía un conjunto de proteínas de peso moleculares de 40, 60 y 200 kDa. Se seleccionó este inmunógeno por el éxito generado en ensayos previos en bóvidos frente a O. ostertagi. En el estudio se generó una respuesta específica frente al antígeno (aumento de IgG específica), pero no se observó ninguna reducción significativa de los recuentos fecales de huevos ni del número de vermes. Las proteínas del tipo H11, H-gal-GP y TBSP también se han ensayadas como inmunógeno frente a T. circumcincta, con disparidad de resultados. Por ejemplo, en el ensayo de inmunoprotección desarrollado por Mc Gillivery et al. 1992, donde se utilizó como inmunógeno proteínas de L3 de 31 kDa, se consiguió una fuerte protección frente al verme. Se obtuvo una reducción significativa de los recuentos de huevos en heces y del número de vermes, y se detectaron anticuerpos específicos desde el cuarto día post inmunización hasta la tercera semana pi. Asimismo, los animales inmunizados también experimentaron un incremento del número de larvas en las criptas, estando dichas larvas rodeadas por linfocitos y eosinófilos. Estos resultados no fueron reproducibles Revisión bibliográfica 88 en los ensayos llevados a cabo por Morton et al., 1995 tras seguir un protocolo similar de inmunización. Los autores sólo detectaron un aumento de anticuerpos específicos antes del reto los animales inmunizados, pero no originó ninguna protección. Las discrepancias podrían explicarse por las diferencias en la composición del complejo de 31kDa empleado como inmunógeno en cada estudio. Otro ensayo de inmunoprotección frente T. circumcincta fue el desarrollado por Knox et al. 1995, quienes tras la inmunización de corderos con TBSP frente a T. circumcincta obtuvieron unos exitosos resultados de protección, con reducciones de un 71% en los recuentos de huevos en heces y de un 65% en el número de vermes; sin embargo, estos prometedores resultados no fueron reproducibles en ensayos posteriores. En general, los resultados obtenidos en los diferentes ensayos frente a T. circumcincta han sido mucho menos consistentes que el caso de H. contortus (Smith et al., 2000; Knox et al., 2001). La combinación de algunos de estos productos sí parece determinar mejores resultados, tal vez porque sea necesaria el reconocimiento de varias proteínas para que tengan lugar el inicio de las respuestas protectoras (Nisbet et al., 2013). MATERIAL Y MÉTODOS Material y métodos 89 1. ANIMALES En esta experiencia se han utilizado un total de 9 cabritos de raza Majorera que en el momento de adquisición contaban con aproximadamente 6 meses de vida. Los animales fueron alojados en instalaciones desinfectadas convenientemente, situadas en la Facultad de Veterinaria de la Universidad de las Palmas de Gran Canaria y fueron mantenidos en condiciones libres de nematodos desde su llegada hasta el momento del inicio de la experiencia. Los animales fueron alimentados a base de concentrado, forraje y agua ad libitum. Tras la ubicación de los animales, y antes de iniciar la fase experimental, se realizó una serie de controles para determinar su estado sanitario desde un punto de vista parasitológico. Así, se llevó a cabo un estudio coprológico mediante técnicas de concentración (flotación en solución saturada de cloruro sódico) (Hendrix, 1999), observándose la presencia de ooquistes de Eimeria spp. A tenor de estos resultados los animales se trataron con una dosis de 3,5 ml de Vecoxan (diclazuril 2,5mg/ml) por vía oral. 2. PARÁSITOS Los vermes adultos y las larvas 3 (L3) necesarios para las pruebas de inmunoprotección y producción de antígeno (excreción-secreción E/S) se obtuvieron mediante la inoculación vía intrarruminal de animales donantes con L3 de una cepa de T. circumcincta que actualmente se mantiene en el Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria del Gobierno de Aragón en Zaragoza. Esta cepa fue inoculada en animales donantes ubicados en las instalaciones de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Las Palmas, siguiendo el mismo protocolo que en experiencias similares realizadas con anterioridad por nuestro grupo de investigación (Molina et al., 1999; Ruiz et al., 2004). Material y métodos 90 2.1. PROTOCOLO DE OBTENCIÓN DE L3 DE Teladorsagia circumcincta Las L3 de T. circumcincta utilizadas en el desarrollo de esta experiencia fueron cedidas por el Dr. Uriarte del Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón. Un total de 8000 L3 de T. circumcincta fueron inoculadas a cabritos donantes por punción intrarruminal. A partir de la inoculación se realizaron controles coprológicos semanalmente mediante flotación en solución saturada de cloruro sódico (Hendrix, 1999) hasta que comenzó la liberación de huevos. En ese momento, los controles coprológicos se hicieron 3 veces por semana mediante una técnica cuantitativas (Mc Master modificado -Paracount-EPG TM-) (Maff, 1989; Colville, 1991; Sloss et al., 1994). Adicionalmente, se recogieron heces para su posterior cultivo y obtención de L3. Para ello, uno de los cabritos se trasladó a una jaula individual durante 1 semana, recogiéndose las heces diariamente. Una vez recolectadas las muestras fecales, se procedió a disgregarlas y mezclarlas con turba estéril con ayuda de una espátula, humedeciéndolas y evitando un exceso de agua. Las heces se introdujeron en recipientes de plásticos protegidos con una gasa tupida para favorecer su aireación. Las muestras fueron entonces incubadas a 22ºC durante 12-14 días. A lo largo del periodo de incubación, se procedió durante días alternos a remover el material fecal cultivado para así facilitar la aireación de las capas más profundas, añadiéndoles agua para humedecerlas en caso necesario. El aislamiento de las L3 obtenidas en el coprocultivo se llevó a cabo mediante el método Baerman. Las larvas aisladas de este modo quedaban retenidas en papel de filtro, que una vez seco se depositaba de nuevo en el aparato de Baerman. Una vez recogida la suspensión limpia de L3 en agua, se mantenía a 4ºC hasta su uso (Fleck y Moody, 1988; Maff, 1989; Colville, 1991). Material y métodos 91 2.2. PROTOCOLO DE OBTENCIÓN DE VERMES ADULTOS Y CULTIVO IN VITRO La técnica utilizada para la recogida de adultos de T. circumcincta se basa en la capacidad de los vermes para migrar activamente desde una película semisólida de agar hacia un medio mantenido a 37ºC. Para ello, tras abrir el abomaso de los animales donantes, se llevó a cabo el lavado del mismo con 700 ml de agua destilada a 37ºC. Tras haber recogido una alícuota de 100 ml para el recuento de vermes adultos, se le añadió al volumen restante los 700 ml de la solución de agar a 43ºC (Sigma-Aldrich) 2 % (p/v), cuya función es permitir a los vermes que queden adheridos a los paños para su aislamiento. En 700 ml de agua destilada se añadió 14 g de agar y se llevó a ebullición tantas veces como fuera necesario hasta que no quedaran grumos. Posteriormente, se introdujo el agar en hielo para bajar la temperatura hasta los 43ºC, mezclándose bien. A continuación, la mezcla se depositó en bandejas que contenían los paños de material poroso. Una vez solidificada la mezcla, se introdujeron los paños verticalmente en las urnas que contenían PBS 0.01 M a 37ºC. - Phosphate-buffered saline (PBS) 0,01M; pH 7,2 REACTIVO FÓRMULA MOLARIDAD Cloruro sódico (Sigma-Aldrich) NaCl 0,123 M Dihidrógeno fosfato de potasio (Sigma-Aldrich) KH2PO4 0,003 M Fosfato disódico (Sigma-Aldrich) Na2HPO4 0,01 M Tras introducirlas en una estufa a 37ºC (PSelecta®), se incubaron durante 2 horas permitiendo con ello que los vermes viables emergieran de la mezcla agar-contenido gástrico y migraran al fondo de la urna. A continuación, se retiraron los paños con los nematodos menos viables así como los restos de contenido gástrico. Material y métodos 92 Finalmente, se procedió a la recogida y lavado de los vermes que quedaron en el fondo de las urnas mediante centrifugación (50 x g/5 min). Para el lavado se realizaron tres centrifugaciones, los dos primeros en PBS 0,01 M estéril y la última en medio RPMI 1640 con antibióticos y antifúngicos. - Medio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich): Para 500 ml de RPMI 1640 (Gibco; 041-02409 M): REACTIVO L-glutamina (200mM) (Sigma-Aldrich) 10 ml de 100mM D glucosa (100mg/ml) (Sigma-Aldrich) 50 ml Penicillin/streptomycin (P 0906) (Sigma-Aldrich) 5 ml de10000iu/10000µg/ml Amphoteracin B (25µg/ml) (Sigma-Aldrich) 62,5 mg Gentamycin sulphate (10mg/ml) (Sigma-Aldrich 12,5 mg Hepes (1 M) (Sigma-Aldrich) 10 ml Se disolvieron todos los aditivos en el medio en condiciones de esterilidad, filtrándolo primero por un filtro 0,45µm y otro de 0.2µm de diámetro de poro (VWR) y conservándose finalmente a 4ºC hasta su uso. Material y métodos 93 Finalmente se procedió al cultivo de los vermes bajo condiciones de esterilidad, para lo cual se trabajó bajo una campana de flujo laminar (Telstar Mini-V/PCR). Los vermes contenidos en el medio de cultivo fueron recogidos con una lanceta y se introdujeron en frascos de cultivo de 160 ml (Nunc). Los frascos se mantuvieron 24 horas en estufa a 37ºC con una saturación de CO2 del 5% (Shel Lab, CO2 Incubator). Transcurrido este tiempo, se recogió con una pipeta el medio de cultivo que se conservó en frío para su procesado posterior. El medio se renovó y se incubaron los vermes otras 24 horas en las mismas condiciones, tras las cuales se repitió el proceso. El medio de cultivo así obtenido, que contenía productos de excreción-secreción (ES) de los vermes, se filtró a través de un filtro de 0.45 µm de diámetro de poro (VWR) y se sometió a un proceso de concentración centrífuga con un punto de corte de 10 KDa (Amicon Ultra, 10KDa, MWCO) (3000 x g, 20 min, 4ºC), hasta obtener un volumen aproximado de 5 ml. Una vez determinada la concentración proteica (Pierce® BCA Protein Assay) del producto obtenido, el antígeno excreciónsecreción (ES) se conservó a -20ºC para su posterior fraccionamiento en columnas de Thiol-Sepharose (Geldhof, et al., 2000). Los vermes adultos que se mantuvieron en cultivo durante 48 h, se lavaron con PBS 0,01 M y se congelaron a -20ºC para su uso posterior como antígeno en distintos ensayos. 2.3. PREPARACIÓN DE LOS HOMOGENIZADOS DEL PARÁSITO Para ello, una vez descongelados, los vermes adultos se homogeneizaron sobre hielo en la siguiente solución, a razón de 300 vermes/ml a 4ºC: Material y métodos 100 Para el estudio inmunohistoquímico se recogió otra muestra de tamaño similar del abomaso. Las muestras fueron recubiertas previamente con O.C.T. (Optimal Cutting Temperature, Tissue Tek®; Sakura Finetek Europe B.V., Zoeterwoude, Holanda) y congeladas durante unos minutos en un recipiente que contenía isopentano (PRS Panreac Química SA), el cual se había mantenido previamente a -80ºC durante unas horas. El isopentano actúa como crioprotector al mantener la morfología celular e impedir la destrucción tisular por choque térmico. Una vez que el O.C.T. adquirió una consistencia sólida, los bloques con las muestras se almacenaron en cámara a -80ºC hasta su posterior procesado. A partir de estos bloques, y con la ayuda de un criostato (Reichert-Jung 2800 Frigocut N) a -20ºC, se obtuvieron cortes histológicos con un grosor de 5 μm. 3.3.2. Recogida de muestras para el estudio de expresión de citoquinas Para el estudio de la expresión de citoquinas se recogieron muestras de nódulos linfático abomasales y mesentéricos, así como de la curvatura mayor del abomaso de cada animal de aproximadamente. Las muestras, de aproximadamente 0,5x1x1cm, se introdujeron en criotubos con trizol (Sambrook et al., 1989b), se sumergieron en nitrógeno líquido y posteriormente se mantuvieron a -80ºC. dH2O 900 ml Formalina pura (Panreac) 100 ml Fosfato sódico monobásico (Merck) 4 g Fosfato sódico dibásico (Merck) 6,5 g Tabla 1: Preparación del formol tamponado al 10% Material y métodos 101 3.3.3. Recogida del mucus abomasal La recogida de mucus se realizó suavemente de la región fúndica del abomaso con la ayuda de un portaobjetos. Estas muestras se utilizaron para la posterior determinación de anticuerpos específicos locales (isotipos IgG e IgA). Para proteger las muestras en su degradación, cada gramo de mucus se suspendió en 2,5 ml de buffer con inhibidores de proteinasas a pH 7,1, según el siguiente protocolo: 3.3.4. Recogida del contenido abomasal A fin de determinar la carga parasitaria de los animales inoculados, el abomaso se abrió a través de la curvatura mayor, procediéndose al lavado de la superficie gástrica con 700 ml de agua destilada a 37ºC, raspando cuidadosamente la superficie. A continuación, se agitó la suspensión para obtener una mezcla homogénea, y se recogieron alícuotas de 100 ml, que fueron conservadas hasta su posterior procesado añadiendo formaldehido (35-40%, Panreac) hasta conseguir una concentración final del 10% (modificado de MAFF, 1989). REACTIVO CONCENTRACIÓN Fosfato disódico (Sigma-Aldrich) Na2HPO4 0,1 M Cloruro sódico (Sigma-Aldrich) NaCl 0,05 M Ázida de sodio (Sigma-Aldrich) NaN3 3 mM Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) (Sigma-Aldrich) C7H7FO2S 1 mM Ácido etilen diamino tetraacético (EDTA) (Sigma-Aldrich) C10H14N2Na2O8·H2O 5 mM Material y métodos 102 3.3.5. Recogida de mucosa gástrica Con la ayuda de un portaobjetos, se realizó un raspado profundo de la totalidad de la mucosa gástrica para estimar la población de vermes inmaduros presentes en la mucosa en el momento del sacrificio. Las muestras recogidas de cada animal fueron posteriormente pesadas y conservadas en congelación a - 20ºC hasta su posterior procesado. 4. ANÁLISIS HEMATOLÓGICOS Durante el periodo experimental, se valoraron diversos parámetros hematológicos en todos los animales. 4.1. HEMATOCRITO Las muestras de sangre se centrifugaron (Mixtasel, Selecta) a 8000 r.p.m. durante 7 min en capilares de microhematocrito (Marienfeld, Glassware). La determinación de este parámetro tras la centrifugación se llevó a cabo con la ayuda de una escala comercial (J.P. Selecta, S.A). 4.2. PROTEÍNAS PLASMÁTICAS La concentración de las proteínas plasmáticas (g/dl) se determinó con ayuda de un refractómetro (Comecta SA) a partir de las muestras plasmáticas obtenidas al analizar el hematocrito. 4.3. RECUENTO TOTAL DE LEUCOCITOS Tras realizar una dilución de las muestras sanguíneas de cada animal investigado (1:20) en líquido de Türck (Panreac SA), (Voigt, 2003), se llevó a cabo el recuento total de los glóbulos blancos con ayuda de una cámara de Neubauer (Tiefe) de un volumen de 0,02 l de muestra diluida. El resultado se multiplicó por 50 y de este modo se obtuvo el nº de leucocitos/ml de sangre. Material y métodos 103 4.4. RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS EN SANGRE PERIFÉRICA Para realizar el recuento diferencial de leucocitos se llevaron a cabo extensiones de sangre de cada animal que posteriormente se tiñeron con panóptico rápido (Panreac SA). A continuación se procedió al recuento diferencial de 100 leucocitos en cada preparación, discriminando entre neutrófilos, basófilos, eosinófilos, linfocitos y monocitos. A partir de este dato y del número total de leucocitos/ml de sangre, se calculó el número de células de cada tipo leucocitario/ml de sangre. Fig. 2: Recuento de leucocitos en cámara de Neubauer Material y métodos 104 5. EVALUACIÓN DEL PEPSINÓGENO SÉRICO La medida de la concentración del pepsinógeno en suero ha sido recomendada como un método para valorar la carga parasitaria en las infecciones por Ostertagia/Teladorsagia sp. (Berghen et al., 1993). Las L3 de T. circumcincta, así como las de otros nematodos gástricos, penetran en las glándulas gástricas, donde mudan y se transforman en L4 y posteriormente a L5 (preadultos). En este proceso lesionan las glándulas gástricas encargadas de producir HCl. El aumento del pH gástrico determina un acúmulo de pepsinógeno que no se transforma en pepsina. Los daños de la mucosa gástrica favorecen el paso de este compuesto al torrente sanguíneo, donde de se detecta de forma proporcional al daño tisular ocasionado por el parásito (Cordero del Campillo, 1999). La estimación de los niveles de pepsinógeno se llevan a cabo mediante un micrométodo (Dorny & Vercruysse, 1998), basado en la medición de la actividad proteolítica del suero en relación a un estándar de concentración de aminoácidos (L-tirosina) conocida (Edwards et al, 1960; Jennings et al, 1966; Berghen et al, 1987). Fig. 3: Frotis sanguíneos (400x) en los que se pueden observar un linfocito y un neutrófilo (a), y un eosinófilo (b). a) b) Material y métodos 105 5.1. EVALUACIÓN DEL PEPSINÓGENO SÉRICO POR MICROMÉTODO (Dorny & Vercruysse, 1998). 5.1.1. Material a) Muestra: suero obtenido según lo reflejado en el apartado 3.2. b) Sustrato: albúmina sérica bovina al 2% (p/v) en una solución de glicinaNaCl-HCl (0,1M) con un pH final de 2,5. c) Ácido tricloroacético: utilizado para precipitar el sustrato no digerido en la digestión peptídica, a una concentración del 4% (p/v) en agua destilada. d) Diluyente: solución de NaOH 0,25N. e) Solución estándar: diluciones de una solución de L-tirosina 0,01M en HCl 0,1N. f) Colorante: reactivo Folin-Ciocalteu (Sigma-Alldrich) diluido a una concentración 1:3 (v/v) en agua destilada. 5.1.2. Procedimiento Tras su descongelación, se añadieron 50µl de cada una de de las muestras a viales de poliuretano de 1,5ml que contenían 250µl del sustrato. A continuación se agitaron los viales y se procedió a su incubación durante 24 h a 37ºC. Tras la incubación, la digestión peptídica se detuvo y el sustrato no digerido se precipitó añadiendo 500µl de ácido tricloroacético (4% p/v) e incubando durante 10 min, tras los cuáles se procedió a centrifugar los viales durante 5 min a 10000 x g en una microcentrífuga (P Selecta). Una vez efectuada la centrifugación, se transfirieron por triplicado 20µl del sobrenadante a viales que contenían 200µl del diluyente. Cada uno de los Material y métodos 106 viales se agitó durante 2 min, y se añadió a cada uno 30µl del colorante diluido. Se volvieron a agitar durante 2 min, para posteriormente mantenerlos a temperatura ambiente (20-25ºC) durante 30 min. Tras la incubación, se procedió a la distribución de las muestras (200µl) en una placa de poliestireno (CORNING Dispensable Sterile ELISA Plates, Corning Glass Works). En cada placa, tres pocillos quedaron reservados como blanco de referencia de la reacción colorimétrica final, en cuyo caso, los 20µl de suero se sustituyeron por agua destilada. Para calcular la cantidad de tirosina liberada durante la incubación de las muestras con el sustrato se utilizaron tres diluciones de la solución estándar: 0,1µm/ml, 0,2µm/ml y 0,3µm/ml. De cada disolución se transfirieron 20µl a viales que contenían 200µl del diluyente. Se agitaron los viales y se añadió el colorante, siguiendo el mismo procedimiento empleado sobre cada una de las muestras de suero. Finalmente, se procedió a la medida de las absorbancias o densidades ópticas mediante un lector de placas de ELISA (Thermo Labsystems Multiskan Ascent) a una longitud de onda de 690 nm. 5.2. TRANSFORMACIÓN DE LOS VALORES DE ABSORBANCIAS EN UNIDADES DE TIROSINA (UTYR). Con objeto de eliminar las fluctuaciones que presentan las densidades ópticas de una misma muestra obtenidas en los diferentes ensayos, los valores de absorbancia se transformaron en Unidades de tirosina (U tyr) a partir de las diluciones del estándar de tirosina con las que se obtuvo una curva estándar. Material y métodos 107 5.2.1. Corrección de la tirosina del suero El suero no incubado contiene pequeñas cantidades de tirosina, por lo que se usó un factor fijo para corregirlo. Este factor se obtuvo de la medida del contenido de tirosina de 100 muestras de suero caprino no incubado con el sustrato, utilizando el mismo método. La absorbancia obtenida en las muestras no incubadas fue notablemente constante y presentó un valor medio de 0,059 a una densidad óptica de 690 nm. El factor 0,059 se incluyó en los cálculos para la obtención de la concentración de pepsinógeno en las muestras analizadas. 5.2.2. Procedimiento El resultado de las tres medidas de densidad óptica de cada muestra de suero se transformó a Unidades de tirosina (U tyr), es decir, micromoles de tirosina liberados por litro de suero por minuto, usando una curva estándar preparada a partir del estándar de tirosina. Los cálculos de la concentración de pepsinógeno fueron los siguientes: Donde: U tyr: unidades de tirosina expresadas en micromoles de tirosina liberados por litro de suero por minuto. OD: media aritmética de la densidad óptica de los tres pocillos. 0.059: factor de corrección por la presencia de tirosina en muestras no incubadas. U tyr = (OD muestra – 0.059) x F x 11,11 Material y métodos 108 F: factor calculado derivado de la curva estándar preparada del estándar de tirosina: F = ( 0,1/(OD tyr 0,1 µmol/ml) + 0,2/(OD tyr 0,2 µmol/ml) + 0,3/(OD tyr 0,3µmol/ml) )/3 11.11: factor de conversión de la dilución de los sueros y el tiempo de incubación. 6. ESTUDIOS PARASITOLÓGICOS En este estudio se utilizaron diversas técnicas parasitológicas que permitieron determinar el número de vermes adultos y formas larvarias en el contenido abomasal, el número de formas inmaduras de la pared del cuajar, así como parámetros relacionados con la fecundidad (longitud y número de huevos intrauterinos) y recuentos fecales de huevos. 6.1. RECUENTOS FECALES DE HUEVOS Tras el periodo prepatente, los controles coprológicos se hicieron 3 veces por semana, realizándose técnicas cualitativas de concentración y la técnica cuantitativa de McMaster modificado (Paracount-EPGTM). - Métodos cualitativos Se realizó una técnica de concentración con solución saturada de cloruro sódico (Fleck & Moody, 1988; Colville, J., 1991; Sloss et al., 1994) con todas las muestras de heces recogidas de los animales infectados, con objeto de determinar la duración del periodo prepatente de la infección experimental. Material y métodos 109 - Métodos cuantitativos La concentración de huevos de T. circumcincta en las heces se estimó utilizando el método McMaster modificado (Paracount-EPGTM) (Thienpont, et al., 1979; MAFF, 1989; Sloss et al., 1994). 6.2. RECUENTO DE VERMES ADULTOS EN ABOMASO Se contabilizaron todos los vermes adultos presentes en cada alícuota de 100 ml de contenido abomasal, diferenciando entre hembras y machos (Cordero del Campillo, 1999), con ayuda de una lupa binocular (Wild, Heerbrugg) a 16x. El número total de vermes de cada animal se calculó considerando el volumen total de líquido recogido en el lavado, tal y como se describió en el apartado correspondiente (Wood et al., 1995). De las hembras totales se recogieron 30 al azar, se depositaron en un porta y se midieron en una lupa binocular que disponía de una regla graduada en uno de los oculares, (9x), expresándose los resultados en milímetros. Posteriormente, se procedió al recuento de huevos intrauterinos de cada una de estos vermes. Fig.4: Huevo de T. circumcincta. Material y métodos 116 obtenido según el apartado 3.3.3 se suspendió en 2,5 ml de buffer con inhibidores de proteinasas a pH 7,1, según el siguiente protocolo: REACTIVO CONCENTRACIÓN Fosfato disódico (SigmaAldrich) Na2HPO4 0,1 M Cloruro sódico (Sigma-Aldrich) NaCl 0,05 M Ázida de sodio (Sigma-Aldrich) NaN3 3 mM Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) (Sigma-Aldrich) C7H7FO2S 1 mM Ácido etilen diamino tetraacético (EDTA) (SigmaAldrich) C10H14N2Na2O8·H2O 5 mM Tras centrifugar la mezcla a 5000 x g (Eppendorf Centrifuge 5804R) durante 1 hora, se recogió el sobrenadante y se conservó en congelación a -20ºC hasta su posterior. El método utilizado fue el mismo para la determinación de los niveles de IgA e IgG séricas detallados en el apartado 7.1., con ligeras modificaciones. Así, las muestras usadas en este caso fueron los sobrenadantes resultantes de la centrifugación del mucus. Estas muestras se diluyeron, al igual que el suero, en PBS 0,01M a la dilución recogida en la Tabla 4. El “pool +” se obtuvo con las muestras que mostraron una densidad óptica más elevada, y el “pool –” con las procedentes de los animales controles negativos no inoculados. Del mismo modo, se ajustaron las concentraciones usadas del antígeno y el conjugado. Material y métodos 117 7.3. INMUNOBLOTTING 7.3.1. Inmunoblot (Western blot)-IgG sérico anti-Teladorsagia circumcincta. La transferencia de proteína o “blotting”, consiste en la inmovilización de las proteínas sobre membranas sintéticas, seguido de la detección con sistemas diseñados para la tinción de estos “blots”. En este caso la tinción fue una reacción inmune, ya que se detectaron las fracciones proteicas transferidas a través de anticuerpos específicos. 7.3.1.1.Material inmunológico A) Antígeno El extracto antigénico empleado se preparó mediante la homogeneización de los vermes adultos de T. circumcincta siguiendo el protocolo referido en el apartado 7.1.1. La concentración de dicho extracto fue de 2,24 mg/ml. B) Marcadores de peso molecular Se usó un marcador de bajo peso molecular (Pierce Blue Prestained Molecular Weight Marker, Thermo Scientific), que se preparó según las instrucciones del fabricante. El marcador contenía 7 proteínas con unos pesos moleculares de: Isotipo Tipo de antígeno Concentración del antígeno Dilución del mucus Dilución del conjugado IgG Somático adulto 3 g/ml 1:100 1:1000 IgA Somático adulto 5 g/ml 1:25 1:5000 Tabla 4: Tabla resumen de la técnica de ELISA para detección de anticuerpos específicos en mucus empleada en esta experiencia. Material y métodos 118 C) Control positivo Se usó como control positivo el “pool +” utilizado en el test ELISA-IgG anti-T. circumcincta (apartado 7.1.1.) Este control positivo se diluyó a razón de 1/50 en PBS con azida de sodio a una concentración de 0,02% (p/v). D) Control negativo Se usó el “pool” utilizado en el test ELISA-IgG anti-T. circumcincta, diluido de la misma manera que el control positivo. PROTEÍNA PROCEDENCIA P.M. (KDA) Miosina Músculo de conejo 215 Fosforilasa B Músculo de conejo 120 Albumina (BSA) Suero bovino 84 Ovoalbumina Huevo de gallina 60 Anhidrasa carbónica Eritrocitos bovinos 39.2 Inhibidor de la tripsina Semilla de soja 28 Lisozima Huevo de gallina 18,3 Tabla 5. Marcador molecular usado en la electroforesis Material y métodos 119 E) Suero problema A la hora de llevar a cabo el Western-blot se utilizó un “pool” de sueros de algunas muestras séricas seleccionadas según los resultados obtenidos en los tests ELISA IgG anti-T. circumcincta (semanas -4, -2, 0, 3 y 6). La dilución de los diferentes “pool” de sueros, como en el caso del control positivo y negativo, se llevó a cabo a razón de 1/50 en PBS 0.01M con ázida de sodio (NaN3) (Sigma-Aldrich) a una concentración final del 0,02% (p/v). F) Conjugado En el análisis de los diferentes sueros se utilizó como conjugado una antiIgG caprina aislada en conejo y marcada con peroxidasa (Sigma-Aldrich), a una dilución 1/1000 en PBS 0,01M. 7.3.1.2. Reactivos para la electroforesis A) Solución de acrilamida La electroforesis del extracto antigénico se realizó sobre geles de Tris/glicina SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) preparados a partir de acrilamida y N,N’-metilen bisacrilamida a una concentración del 29,2% (p/v) y del 0,8% (p/v), respectivamente, como queda reflejado en el siguiente cuadro Material y métodos 120 La solución final se conservó a 4ºC hasta su uso. B) Tampón del gel separador El gel separador se elaboró a partir de un tampón 1,5 M de Tris, con un pH de 8,8 que fue ajustado con ácido clorhídrico (HCl). El tampón se preparó de la siguiente forma, conservándose a continuación a 4ºC: C) Amonio persulfato El amonio persulfato (APS) ((NH4)2S2O8) (Merck) proporciona los radicales libres que favorecen la polimerización de la acrilamida y de la bisacrilamida. Se empleó a una concentración del 10% (p/v) en agua destilada. La solución se alicuotó y conservó a -20ºC. REACTIVO CANTIDAD CONCENTRACIÓ N Acrilamida (SigmaAldrich) C3H5NO 11,52 g 29,2% (p/v) Bis-acrilamida N,N’- metilen bis-acrilamida (Sigma-Aldrich) C7H10N2O2 0,32 g 0,8% (p/v) Agua bidestilada 40 ml REACTIVO CANTIDAD SDS. Dodecil sulfato sódico (Sigma-Aldrich) C12H25O4SNa 0,5 g Trizma base-TRIS (Tris-(hidroximetil) aminometano) (Sigma-Aldrich) C4H11NO3 22,75 g Agua bidestilada 125 ml Material y métodos 121 D) TEMED El TEMED o N,N´,N´-tetrametilenediamina (C6H16N2) (Sigma-Aldrich) acelera la polimerización de la acrilamida y de la bis-acrilamida al catalizar la formación de los radicales libres procedentes del amonio persulfato. E) Tampón del gel concentrador El gel concentrador se elaboró a partir de un tampón 1,0 M de Tris, con un pH de 6,8 que fue ajustado con ácido clorhídrico (HCl). El tampón se preparó de la siguiente forma, conservándose a continuación a 4ºC: REACTIVO CANTIDAD SDS. Dodecil sulfato sódico (Sigma-Aldrich) C12H25O4SNa 0,5 g Trizma base-TRIS Tris-(hidroximetil) aminometano (Sigma-Aldrich) C4H11NO3 7,55 g Agua destilada 125 ml F) Tampón de la cubeta de electroforesis Para la realización de la electroforesis se dispensó un tampón 25 mM de Tris y 25 mM de glicina con un pH de 8,3 en los depósitos superior e inferior de la cubeta de electroforesis. El tampón se elaboró de la siguiente forma, y antes de su utilización se atemperó a 4ºC: Material y métodos 122 REACTIVO CANTIDAD SDS. Dodecil sulfato sódico (Sigma-Aldrich) C12H25O4SNa 1 g Trizma base-TRIS Tris-(hidroximetil) aminometano (Sigma-Aldrich) C4H11NO3 3 g Glicina (Sigma-Aldrich) C2H5NO2 14,4 g Agua destilada 1 litro G) Diluyente de la muestra o tampón de carga Como diluyente del extracto antigénico se empleó un tampón 0,5 M de Tris que fue ajustado a un pH de 6,8 con ácido clorhídrico (HCl) y al que se le añadió glicerina, duodecil sulfato sódico (SDS) (10%) (p/v) y azul de bromofenol (0,05%) (p/v). Se elaboró de la siguiente forma: REACTIVO CANTIDAD SDS 10% (p/v) (Sigma-Aldrich) C12H25O4SNa 4 ml TRIS 0.5M-ClH (pH 6.8) (Sigma-Aldrich) C4H11NO3 2,5 ml Glicerina (Panreac) C3H8NO3 2 ml Azul de bromofenol (0.05%) (p/v) (Sigma-Aldrich) C19H10Br4O5S 0,5 ml H) Tinción de geles Tras la realización de la electroforesis algunos geles se tiñeron con un kit de tinción de plata (Pierce® Silver Stain Kit. Thermo SCIENTIFIC). Material y métodos 123 7.3.1.3.Reactivos para la trasferencia A) Tampón de transferencia Para la realización de la transferencia a membranas de nitrocelulosa de las diferentes fracciones polipeptídicas separadas durante la electroforesis se empleó el siguiente tampón: SOLUCIÓN REACTIVO CANTIDAD A Glicina (Sigma-Aldrich) C2H5NO2 16,8 g (1.44%) Trizma base-TRIS (SigmaAldrich) C4H11NO3 3,53 g (0.3%) Agua destilada 500 ml B Metanol (Panreac) CH3OH 233,3 ml (20%) Agua destilada 433,3 ml Las soluciones A y B se elaboraron por separado y se conservaron a 4ºC, mezclándose momentos antes de llevar a cabo la transferencia. La mezcla se dispensó en la cubeta de transferencia. B) Solución de Ponceau S Se usó para teñir un trozo de la membrana de nitrocelulosa y así confirmar que la transferencia se había llevado a cabo correctamente. La solución de Ponceau S contenía un 0,1% de Ponceau S (p/v) en una solución al 5% de ácido acético (v/v) (C2H4O2) (Sigma-Aldrich). 7.3.1.4. Reactivos para la reacción inmunoenzimática A) Solución de lavado El tampón empleado en los lavados, PBS-Tween 20, se elaboró según el Material y métodos 124 protocolo descrito en el apartado 7.1.2. B) Agente saturador Se empleó albúmina sérica bovina (BSA, Sigma-Aldrich) a una concentración del 3% (p/v) en PBS. C) Sustrato El kit de revelado fue el AEC Chromogen kit (AEC Staining Kit, SigmaAldrich). En dicho kit la reacción positiva viene determinada por la precipitación del AEC Chromogen (3-amino-9-ethylcarbazole). 7.3.1.5.Procedimientos  Electroforesis Las proteínas del extracto antigénico se separaron mediante geles de Tris/Glicina SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) al 12%, que permitían la separación de las proteínas en función de su peso molecular (gel separador). Tras la polimerización del gel durante unos 20 min, se elaboró el gel concentrador, cuya función es concentrar las proteínas en la línea de unión con el gel separador. REACTIVO SEPARADOR CONCENTRADOR Solución de acrilamida 6 ml 0,83 ml Buffer separador o concentrador 3.8 ml 0,63 ml SDS al 10% 0.15 ml 0,05 ml APS al 10% 0.15 ml 0,05 ml TEMED 0.006 ml 0,005 ml Agua destilada 5 ml 3,4 ml Material y métodos 125 Una vez formado, el gel se introdujo en la cubeta que contenía el tampón de electroforesis y se cargó el extracto antigénico en condiciones no reductoras a razón 1:3 con tampón de carga, así como el marcador. Se conectó la cubeta (Mini-Protean® Tetra Cell BioRad) a la fuente de alimentación y se aplicó un voltaje de 100V constantes a 4ºC. La electroforesis se detuvo cuando el frente de la electroforesis, teñido con azul de bromofenol, se encontraba a 0,5 cm del borde de la placa del gel.  Transferencia de las proteínas Tras la electroforesis, las proteínas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa (Pure Nitrocellulose Blotting Membrane, Bio Trace® NT, Life Sciences) mediante la aplicación de un campo eléctrico perpendicular al gel y a la membrana. Antes de montar la cámara de transferencia, se separó el gel concentrador del gel separador. El gel separador se puso en contacto con la membrana de nitrocelulosa, seis papeles de filtro y dos almohadillas y el conjunto se incubó durante 15 min. en el tampón de transferencia a 4ºC. Tras estos 15 min se procedió al montaje del “cassette” de transferencia, siguiendo las instrucciones del fabricante (Mini Trans Blot, BioRad). Cerrada la rejilla, evitando la formación de burbujas entre el gel y la membrana, se introdujo en la cubeta, que se llenó con tampón de transferencia a 4ºC. La transferencia se realizó a 100V constantes durante 1 h a la misma temperatura. Al finalizar el proceso de transferencia se tiñó la parte de la membrana que contenía el marcador de peso molecular con la solución de Ponceau S, para confirmar que se había llevado a cabo con éxito la transferencia. El resto de la membrana se secó, se cortó en tiras de 6 mm de ancho y se inició la reacción inmunoenzimática. Material y métodos 132 Master Mix y como fluoroforo BRYT Green® dye, el cual se une más específicamente y mejor a la doble cadena de ADN que el SYBR Green®. La mezcla de reacción se preparó según instrucciones del fabricante. Se evaluó la expresión de las siguientes citoquinas: interleucina 2 (IL-2), IL-4, IL-10, INF-γ e IL-17. Como gen de expresión constante utilizado en este estudio se empleó la β-actina; de esta forma, los resultados se normalizaron en función de las copias amplificadas de β-actina de cada una de las muestras analizadas, con la ayuda del software iQTM5 Optical System Software Versión 2.0 para Windows 2000 y sistemas que operen con XP (BioRad). Las parejas de cebadores (“primers”) utilizados en cada caso, fueron suministrados por Invitrogen. Sus secuencias se encuentran recogidas en la siguiente tabla, donde se indica la secuencia del primer, la longitud del producto, las condiciones óptimas de amplificación y la referencia bibliográfica de estudios anteriores. Cuando fue necesario su diseño, se utilizó la información publicada en el NCBI BLAST. Para todas las parejas de cebadores, la temperatura (Tm) óptima seleccionada mediante ensayos previos fue de 61ºC. Los ciclos de amplificación para todos los genes analizados quedan recogidos en el siguiente esquema: Paso Temperatura Tiempo Nº de ciclos Desnaturalización 95ºC 2’ 1 Replicación del ADN 94ºC 61ºC 72ºC 15’’ 20’’ 15’’ 45 Elongación final 72ºC 2’ 1 Tabla 6: Ciclos de amplificación Material y métodos 133 En la mezcla de reacción se usó el kit GoTaq qPCR Master Mix 2X (Promega), que incluye todos los componentes necesarios para llevar a cabo las copias de ADN a partir del ADNc (buffer, MgCl2, nucleótidos, GoTaq hot start polimerasa, niveles bajos de carboxy-x-rhodamine reference dye y SYBR green), salvo los cebadores y la muestra. Aunque, en relación a la concentración de cloruro de magnesio, para la mayoría de los ensayos se tuvo que suplementar una cantidad mayor a partir de una solución de MgCl2 con una concentración 50 mM (BioRad). En el caso de los cebadores, la concentración de partida fue de 20 µM. Las amplificaciones se realizaron en placas, por triplicado para cada una de las muestras, y en todos los casos la preparación de la mezcla se llevó a cabo a 4ºC y en condiciones de esterilidad. Para cada gen se estandarizó cada componente de la reacción de PCR hasta optimizar el proceso de amplificación, en un volumen total de 25 µl, tal y como se detalla en el siguiente cuadro: βactina IL-2 IL-4 γ-IFN IL-17 IL-10 Master 10 10 10 10 10 10 dH2O 9 6.5 6.5 6.5 8 6.5 Cl2Mg 2.5 1.5 2.5 1.5 0 1.5 Primer R 0.5 1 0.5 1 1 1 Primer F 0.5 1 0.5 1 1 1 DNA 2.5 5 5 5 5 5 En todas las PCR se incluyó un control negativo, que incluía todos los componentes de la solución de amplificación excepto el ADNc, también se incluyó un control positivo. La curva estándar se elaboró con un “pool” del ADNc de las muestras de todos los animales analizados. Con esta curva se calculó la eficiencia de cada ensayo a través de una regresión lineal. En función de esta curva, se determinó diluir las muestras ADNc de nuestro experimento a razón de 1:5 con agua libre de DNAasa. Tabla 7: Características de la mezcla de amplificación para cada cebador utilizado. Material y métodos 134 7.4.5.1.Obtención de los controles positivos. Para la obtención de controles positivos para los distintos genes se estimularon linfocitos procedentes de aislados ganglionares. Estos controles se emplearon para confirmar la amplificación y especificidad de los pares de cebadores. Se aislaron linfocitos de nódulos abomasales de cabras sacrificadas en el matadero. La viabilidad de las células antes del cultivo se determinó mediante la técnica de exclusión con Trypan blue. Una vez ajustada la concentración, se cultivaron en placas de 12 pocillos (Nunc, Apgent), a razón de 5x106 células/ml en 2 ml de medio de cultivo RPMI 1640 (Gibco) con L-glutamina 2 mM suplementado con penicilina/estreptomicina (10000U penicilina - 10mg estreptomicina/ml) (Sigma-Aldrich) y suero fetal bovino inactivado 20% (v/v). El cultivo in vitro se llevó a cabo a 37ºC durante 6 h en una atmósfera que contenía un 5% de CO2. Una vez transcurrido este tiempo las células se recogieron y congelaron con buffer de lisis (EZNATM RNA Isolation Systems). Para incrementar la producción de citoquinas durante el cultivo, las células se estimularon con mitógenos. Los cultivos destinados a la obtención de controles positivos de IL-2, IL-10 e INF-γ se estimularon con CoA a una concentración de 10 µg/ml, mientras que para los controles de IL-4 e IL-17A se utilizó Phorbol a una concentración de 5 ng/µl (Gohin et al., 1997). Material y métodos 135 7.4.5.2.Chequeo de amplicones Tras la RT-PCR a tiempo real se realizó una curva de disociación que comenzó a 55ºC hasta alcanzar los 95ºC, para asegurar que el resultado positivo se correspondía con el fragmento deseado y no se trataba de dímeros de cebadores o bien de fragmentos inespecíficos. Temperatura Tiempo Nº de ciclos 95ºC 30’’ 1 55ºC 1’ 1 55º-95ºC 30’’ 81 22ºC 1’ 1 Los resultados positivos se analizaron también en geles de agarosa al 2,4% (p/v) preparados con TBE 1X y fueron secuenciados. Secuencia de Primers 5´ a 3´ Tamaño producto PCR (pb) Condiciones MgCl2 (mM) Óptimas Tm producto (ºC) Temperatura anillamiento (ºC) Referencia N. accession βactina CCAACCGTGAGAAGATGACCC CCCAGAGTCCATGACAATGCC 122 5 85 61 AF481159 IL-2 GTGAAGTCATTGCTGCTGGA TGTTCAGGTTTTTGCTTGGA 202 3 81 61 Craig et al., 2007 IL-4 GCTGGTCTGCTTACTGGTATG CGATGTGAGGATGTTCAGC 100 5 80 61 FJ936316 IL-10 GTGGAGCAGGTGAAGAGAGTC TGGGTCGGATTTCAGAGG 198 3 82 61 AJ458378 IFN-γ AGATAACCAGGTCATTCAAAGGAG GGCGACAGGTCATTCATCAC 180 3 82.5 61 U34232 IL17A TGCTACTGCTTCTGAGTCTGGTGGC TGACCCTCACATGCTGTGGGAAGTT 111 0 83.5 61 Yan et al., (2011) Tabla 8: Secuencia y características de los cebadores utilizados para la amplificación de cada gen. Tabla 9: Curva de disociación. Material y métodos 136 REACTIVO FÓRMULA CANTIDAD Trizma base-TRIS 2 M (Tris-(hidroximetil) aminometano (Sigma-Aldrich) C4H11NO3 242 gr EDTA 0.5 M Ácido etilen diamino tetraacético (Sigma-Aldrich) C10H13N2O8Na3 100 ml Para esto último, el producto de PCR fue purificado usando un kit de producto de PCR (Roche Diagnostics GmbH) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las secuencias fueron de nuevo chequeadas usando el NCBI BLAST y presentaron homología entre el 99 y 100% con las secuencias de ARNm/ADNc que codifican citoquinas en ovino publicadas en las bases de datos. 7.4.5.3. Cálculos Los datos se obtuvieron con la ayuda del programa informático iQTM5 Optical System Software Versión 2.0 para Windows 2000 y sistemas que operan con XP. Se realizó una cuantificación relativa, siguiendo el método propuesto por Pfaffl, 2001 tras determinar el ratio entre los resultados obtenidos en animales “problemas” (inmunizados y testigos) y los controles. Cada muestra se analizó por triplicado, descartando resultados con una desviación estándar igual o mayor a 0,700. 8. RESPUESTA INMUNE LOCAL 8.1. ESTUDIO INMUNOHISTOQUÍMICO 8.1.1. Preparación de los cortes A partir de las muestras de abomaso en congelación se obtuvieron secciones Material y métodos 137 de 4 m en un criomicrotomo (Frigocut N 2800, Reichert Jung). Tras secarse durante 30-45 min se conservaron a -80 ºC. Los portaobjetos sobre los que se depositaron las secciones fueron tratados previamente con poli-L-Lisina (Sigma). 8.1.2. Anticuerpos primarios Los anticuerpos monoclonales primarios (anti-MHCII, anti-CD4, anti-CD8, anti-CDR45, anti- y anti-WC1) fueron cedidos por la Profesora Els Meeusen de la MONASH University (Melbourne, Australia). Como anticuerpos primarios se utilizaron un suero policlonal biotinado anti-IgG caprino (VECTOR) y otro suero policlonal anti-IgA humana (DAKO), obtenidos en conejos en ambos casos. CLON CÉLULAS IDENTIFICADAS DILUCIÓN Anti-CD 4 SBU-T4 pool Linfocitos T colaboradores 1:15 Anti-CD 8 SBU-T8; 36.65 Linfocitos T citotóxicos 1:15 Anti-CD 45R SBU-P220; 20.96 Linfocitos B 1:5 Anti- 86D Linfocitos T  1:10 Anti-WC-1 19.19 Linfocitos T  activados 1:5 Anti-MHCII SBU-II; 28.1 Células presentadoras de antígeno 1:20 Anti-IgA Células IgA+ 1:5000 Anti-IgG Células IgG+ 1:500 Tabla 10: Anticuerpos utilizados para el estudio inmunohistoquímico de la mucosa abomasal Material y métodos 138 8.1.3. Procedimiento Los cortes se descongelaron a 4ºC durante 20 min con el fin de evitar condensaciones que dificultaran los recuentos. Posteriormente se mantuvieron 15 min a temperatura ambiente y se fijaron durante 5-10 min en etanol 100%. Finalmente se añadió H2O2 al 1% v/v para bloquear la peroxidasa endógena. Tras dejar secar, las preparaciones se incubaron con suero normal de conejo (Dako Cytomation) diluido en PBS 1:100 v/v, bloqueando con ello los lugares inespecíficos de unión del anticuerpo primario. Posteriormente se dispensó sobre las preparaciones el correspondiente anticuerpo primario diluido en un medio compuesto por RPMI (RPMI-1640 Medium, Dutch Modification, Sigma) y suero fetal bovino (Biochrome AG) al 5% v/v. El tiempo de incubación fue de 90 min a temperatura ambiente. Seguidamente se realizó una incubación de 30 min con el anticuerpo secundario biotinado anti-IgG de ratón (Dako) diluido 1:20 v/v en RPMI-suero fetal bovino a una concentración final del 5%. En los ensayos en los que se utilizó el anticuerpo primario anti-IgA se utilizó un anticuerpo policlonal secundario diluido 1:200 en PBS anti-IgG de conejo (Dako) obtenido en cerdo. Los cortes incubados con anti-IgG biotinado no recibieron anticuerpo secundario, por estar biotinado el suero primario. Posteriormente se procedió a la incubación de las muestras con el complejo avidina-biotina peroxidasa (Vector) diluido 1:100 v/v en PBS. Este procedimiento tuvo lugar en oscuridad durante 1 hora. El revelado se llevó a cabo con una solución de 3,3´-Tetrahidrocloruro de diaminobenzidina hidratada (Sigma Aldrich), diluida al 0,035% p/v, a la que se añadió H2O2 al 30% diluida al 0,1% v/v en el momento previo a la incubación. La contratinción se realizó con hematoxilina de Harris (Thermo). Finalmente, tras Material y métodos 139 deshidratar las preparaciones, se procedió a su montaje en medio DPX (Panreac). 8.1.4. Recuentos celulares Los recuentos de cada tipo celular se realizaron a 400 aumentos en 40 campos de 0,044 mm2 situados en los tercios superior e inferior de la mucosa. 8.2. ESTUDIO HISTOLÓGICO 8.2.1. Preparación de cortes en parafina. Las muestras de mucosa del fundus del abomaso de cada animal se tallaron y se embebieron en parafina. La pared del abomaso se orientó de modo que las glándulas fúndicas del abomaso se cortaran longitudinalmente, lo que permitió diferenciar fácilmente las distintas capas de la mucosa. A continuación se prepararon secciones de 4 m con un microtomo (RM 3135, Leica) para su posterior tinción. Fig.11: Estudio inmunohistoquímico de la mucosa abomasal (400x). Las células aparecen marcadas con anticuerpos frente a linfocitos T CD4+ (a) y frente a linfocitos T CD8+ (b). a) b) Material y métodos 140 8.2.2. Desparafinado Tras mantener los cortes en una estufa a 100ºC durante 30 minutos, se procedió al desparafinado mediante dos pases sucesivos de dos minutos en xilol, otros dos en etanol 100º, y tres pases sucesivos en etanol 70º y agua destilada. 8.2.3. Tinciones  Tinción con hematoxilina-eosina Las secciones teñidas con hematoxilina y eosina permitieron contabilizar los eosinófilos y los leucocitos globulares de la mucosa del abomaso. Tras el desparafinado, los cortes se tiñeron con hematoxilina de Harris (Thermo) durante 15 min a continuación se diferenciaron mediante 4 pases en alcohol clorhídrico (solución al 1% de HCl en etanol al 70%). Después de un breve lavado con agua corriente se realizaron 15 pases en agua amoniacal (solución de amoniaco al 0,2%) y se volvieron a lavar las secciones con agua corriente durante 15 minutos. A continuación se tiñeron las preparaciones con eosina-floxina (100 ml de eosina al 1% (p/v), 10 ml de floxina al 1% (p/v), 4 ml de ácido acético glacial y 780 ml de etanol al 95%) durante 4 minutos.  Tinción de Giemsa Esta tinción permite reconocer los mastocitos gracias al fenómeno de metacromasia, por el que los gránulos de estas células son teñidos por los derivados del azul que contiene el colorante, proporcionando un color violáceo, distinguible del azul que normalmente se obtiene con este colorante en el resto del tejido. Como solución de Giemsa se utilizó una gota de solución madre de Giemsa (Merck) por cada ml de agua destilada. Las preparaciones se mantuvieron en esta solución durante 25 minutos. Material y métodos 141 8.2.4. Deshidratación y montaje Tras la tinción de las secciones, se procedió a la deshidratación de las mismas mediante dos pases sucesivos de 2 min cada uno en etanol 96º, etanol 100º y xilol. El montaje se realizó en medio DPX (Panreac). 8.2.5 Recuentos celulares  Eosinófilos de la pared gástrica En las muestras de mucosa abomasal teñidas con hematoxilina-eosina se procedió al recuento de eosinófilos en, al menos, 30 campos de 0,044 mm2, en un área de tejido situada sobre la unión de la capa muscular de la mucosa y la lámina propia, utilizando para ello 400 aumentos. El resultado final se expresó en eosinófilos /mm2.  Mastocitos A partir de las preparaciones de abomaso teñidas con Giemsa se realizó el recuento de mastocitos en, al menos, 30 campos de 0,044 mm2, en un área de tejido situada sobre la unión de la capa muscular de la mucosa y la lámina propia, a 400 aumentos. El resultado final se expresó en mastocitos /mm2. Bibliografía 237  Gómez-Rincón, C., Uriante, J., Valderrábano, J. (2006): Efficiency of Duddingtonia flagans against Trichostongyle infections of sheep on mountain pastures. Vet. Parasitol. 141: 84-90.  Gómez-Rincón, C., Uriante, J., Valderrábano, J. (2007): Effect of nematophagous fungus Duddingtonia flagans and energy suplemmentation on the epidemiology of naturally infected kids. Vet. Res. 38: 141-50.  González, J.F. (2002): Respuesta inmune celular y humoral en la ostertagiosis experimental caprina. Tesis Doctoral. 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