Estudio de metabolitos secundarios de especies del género "Eupatorium" endémicas de Santo Domingo

 1 ESTUDIO DE METABOLITOS SECUNDARIOS DE ESPECIES DEL GÉNERO EUPATORIUM ENDÉMICAS DE SANTO DOMINGO MEMORIA Presentada para obtener el grado de Las Palmas de Gran Canaria 2016 Doctor en Ciencias Químicas por: Quírico A. Castillo Perdomo  2   3  DEDICATORIAS A mi esposa, Evelyn Almánzar Germosén. A mis hijos Quírico Manuel y Alejandro Andrés. A mi madre Doña Ana Margarita Perdomo Figuereo Vda. Castillo. A la memoria de mi padre Don Quírico Castillo Pérez (1943-2003).  4  Tesis doctoral Quírico A. Castillo P.  11  Desde los inicios de la civilización, el hombre ha encontrado en el reino vegetal, no solamente alimento para su sustento, material con que construir sus hogares, utensilios y medios de transporte entre otros, sino también sustancias que les han permitido aliviar sus dolencias y en ocasiones curar sus enfermedades. Las plantas constituyen en realidad verdaderos laboratorios químicos en donde se sintetizan un sinnúmero de compuestos que, sin embargo, podemos agrupar en dos grandes tipos: metabolitos primarios y metabolitos secundarios. Los metabolitos primarios constituyen un conjunto de compuestos con funciones bien definidas dentro de las plantas cuyos objetivos son los más básicos de todos los organismos: proveer soporte, alimento y perpetuidad de las especies que los producen; entre ellos tenemos los carbohidratos, las proteínas y las grasas; todos estos sirven de alimento a los seres humanos y los animales. Los metabolitos secundarios, por el contrario, son sustancias a veces producidas en muy pequeñas cantidades, que aparentemente no tienen ninguna función vinculada de manera directa con el mantenimiento de la vida de la especie en cuestión, pero que se ha observado, juegan roles muy diversos, tales como servir de disuasores a animales e insectos, bien por su sabor, por su aroma o por el efecto provocado después de su ingesta, haciendo que las especies del reino animal no se sirvan de ellas como alimento; en muchos casos estas sustancias son verdaderos venenos mortales para aquellas especies que por error, o inexperiencia las consuman o bien son esparcidas por la planta en su medio ambiente circundante, evitando de esta manera la proliferación de otras especies que podrían competir con ellas por alimento y espacio vital. En ciertas ocasiones los metabolitos secundarios, por el contrario, son segregados para atraer a ciertos tipos de otros organismos, tales como insectos, los que, una vez en contacto con el órgano de la planta en donde se originan, sirven de portadores de elementos, dentro de plantas de una misma especie, que posibilitan la reproducción de las mismas. Los metabolitos secundarios, a los que también se les llama comúnmente productos naturales, a lo largo de milenios los ha identificado el hombre como sustancias con propiedades de diversa índole: curativas (penicilinas), aromáticas (aceites esenciales de flores), narcóticas (morfina, cocaína), estimulantes (cafeína, nicotina), etc. Muchas de las especies que poseen productos naturales con tales características son conocidas desde hace siglos por distintas culturas que las han utilizado, otras han sido descubiertas recientemente y con seguridad muchas otras están aún por descubrirse. Cuando el producto natural (generalmente puro) es usado como medicamento, entonces suele hablarse de principio activo. Introducción 12  Dos aspectos importantes a ser tomados en cuenta a la hora de iniciar un estudio fitoquímico con miras a encontrar nuevos principios activos son la etnobotánica y la quimiotaxonomía. Se ha definido la etnobotánica como el estudio de las relaciones entre el hombre y las plantas, incluyendo las aplicaciones y usos medicinales de estas últimas, para determinar su valor cultural o científico; de ahí que tradiciones ancestrales que incluyen el uso de determinadas plantas para tratar tales o cuales afecciones representan una información valiosa al momento de seleccionar una especie objeto de estudio; la quimiotaxonomía por su parte podemos definirla como el método de clasificación biológica basado en las similitudes de las estructuras químicas de los metabolitos secundarios de los organismos a ser clasificados; de esta forma podemos inferir que, por ejemplo, especies de una misma familia de plantas producirán similares metabolitos secundarios y por ende, de forma probable, principios activos con igual, o incluso, mejor acción contra determinado tipo de enfermedades; además, después de aislar e identificar los metabolitos secundarios de una cierta especie objeto de estudio, al compararlos con los de otra, se adquiere información de la pertenencia o no de ambas al mismo género, familia, etc., aportando evidencias sobre la correcta inclusión de un individuo en el grupo botánico al que se le ha asignado. En algunos casos, la información quimiotaxonómica es la única de la que se puede echar mano, ya que de ciertas especies puede no disponerse de información etnobotánica alguna. Con ayuda de personal especializado (Lic. Teodoro Clase, botánico del Jardín Botánico Nacional “Dr. Rafael Ma. Moscoso, Santo Domingo, República Dominicana), se recolectaron tres especies endémicas dominicanas del género Eupatorium, familia Asteraceae, las cuales se citan a continuación: Eupatorium obtusissmum, Eupatorium illitum y Eupatorium dictyoneurum. Las especies antes nombradas se seleccionaron atendiendo, bien a su uso folklórico y popular (etnobotánica), o bien a su sola pertenencia a la familia en cuestión (quimiotaxonomía). La tribu Eupatorieae (Asteraceae) comprende aproximadamente 2200 especies, 17 subtribus y unos 1821 géneros, constituyendo de hecho la tribu más rica en cuanto a número de especies se refiere. En la revisión de la tribu llevada a cabo por King y Robinson (King y Robinson, 1987)2, la subtribu Eupatoriinae incluye los cuatro géneros Eupatorium (45 especies), Austroeupatorium  1 Schmidt, G.J. Schilling, E.E. (2000). Phiyogeny and Biogeography of Eupatorium (Asteraceae: Eupatorieae) based on nuclear ITS sequence data. American Journal of Botany, 87(5), 716-726. 2 King, R.M. (1987). The Genera of Eupatorieae (Asteraceae). Missouri Bot. Gard. (Monographs in Systematics Botany, Vol. 22). Tesis doctoral Quírico A. Castillo P.  13  (13 especies), Stomatanthes (15 especies) y Hatschbiella (2 especies). El centro de distribución de tres de estos géneros, Austroeupatorium, Stomatanthes y Hatschbiella es Brasil, con Austroeupatorium extendiéndose por el oeste hasta Bolivia y una de las especies que se extiende desde el norte de Bolivia hasta Colombia incluyendo Panamá y Venezuela, mientras que tres especies de Stomatanthes han sido encontradas en África. El género Eupatorium L., representativo de la tribu, que en un principio abarcaba unas 1200 especies, en la actualidad se encuentra dividido en diferentes géneros (King y Robinson 1997; Funk, V. et al, 2009), limitándose el género Eupatorium a unas 48 especie de plantas anuales o perennes concentradas en América del Norte y que se extiende desde los escarpes orientales de las Montañas Rocosas hacia el este incluyendo las Antillas. La especie tipo, E. cannabinum ha extendido su distribución desde la Europa oriental y norte de África hasta la India, mientras que otro núcleo de distribución de Eupatorium se encuentra en el este de Asia. Taiwán y las islas Filipinas. La distribución geográfica general del género se ha denominada arcto-terciaria según de King y Robinson del año 19703. Sin embargo, a pesar del tiempo transcurrido desde la publicación de los trabajos de King y Robinson, esta segregación no ha sido completamente aceptada y sigue provocando controversias entre los investigadores. Como resultado de esta distribución los químicos han prestado una mayor atención al género Eupatorium, particularmente a los especies presentes en América del Norte, que a los otros tres géneros de la subtribu y de hecho los datos químicos solo se refieren a las especies más comunes de Austroeupatorium como son A. chaparense y A. inualefolium, y también para dos especies de Stomatanthes, S. africanus y S. carumbensis. De hecho los estudios químicos de las especies de Austroeupatorium estudiadas hasta ahora muestran un comportamiento químico totalmente diferente de la química de las especies de Eupatorium estudiadas presentando compuestos tipo labdano y norlabdano totalmente inusuales como los que se indican para el A. inulaefolium, y asimismo en las dos únicas especies de Stomatanthes que se han estudiado no se han encontrado ni lactonas sesquiterpénicas ni diterpenos de ningún tipo, A. inulaefolium también presenta diterpenos comunes del tipo Kaurano.  3 King, R.M., Robinson, H. (1970). Eupatorium a Compositae genus of Arcto-Tertiary distribution. Taxon, 19(5), 769-774. Introducción 14  Las especies de Eupatorium de América del Norte según la propuesta de King y Robinson no incluyen dos taxones del grupo Uncasia como son el E. lechaefolium Greene y el E. petaloideum Britton de los cuales solamente este último, geográficamente muy restringido, ha sido estudiado desde un punto de vista químico. Estos dos taxones difieren claramente de otros miembros del grupo Uncasia por el hecho de no elaborar lactonas sesquiterpénicas presentando varios ácidos tipo ent-kaurano. Los estudios sobre la sistemática molecular de Eupatorieae son escasos y ninguno de los análisis que ya se han publicado son concluyentes debido al limitado número de muestras de géneros o especies y los cladogramas presentan resultados contradictorios. A pesar de todo ello, algunos géneros son apoyados desde el punto de vista taxonómico y se pueden explicar algunas relaciones filogenéticas. Sin embargo, debido a la fragilidad de los límites taxonómicos empleados, la mayoría de los géneros propuestos son difíciles de reconocer. Por ello, son necesarios estudios complementarios que permitan establecer una mejor delimitación de los nuevos géneros establecidos, de forma que a partir de estudios basados en la estructura, citología, geografía y química de las plantas proporcione un mejor sistema para su clasificación. El género Eupatorium se encuentra englobado en la tribu Eupatoriae, una de las trece que constituyen la familia Asteraceae. Algunas de las plantas de este género tienen un “agradable olor cuando se les corta el tallo y por ese motivo se dice que son plantas aromáticas”. Durante mucho tiempo algunas de las especies de este género han sido empleadas en la medicina popular para combatir enfermedades como la malaria y como agentes antibacterianos, antifúngicos y antiinflamatorios. De los extractos de diferentes especies del género Eupatorium se han identificado un gran número de metabolitos secundarios con actividad biológica, principalmente lactonas sesquiterpénicas, que constituyen compuestos que representan fuentes prometedoras para el desarrollo de posibles fármacos y productos de valor añadido. Una combinación de datos morfológicos y biogeográficos permite la distribución dentro de la clasificación de Eupatorium según King y Robinson, de las diferentes especies reconocidas en cuatro grupos distintos. Un primer grupo denominado Eutrochium, el cual también es reconocido como Eupatoriadelphus (Eupatorium sect. Verticillata), constituido por cinco especies, E. dubius Tesis doctoral Quírico A. Castillo P.  15  (Willd. ex Poit.), E. fistulosus (Barratt), E. maculatus (L.), E. purpureus (L.) y E. steelei (E. Lamont) las cuales se distribuyen principalmente por América del Norte oriental. El segundo grupo llamado Uncasia comprende 14 especies, E. álbum L., E. altissimum L., E. anomalum Nash, E. cuneifolium Willd., E. godfreyanum Cronq., E. hyssopifolium L., E. lancifolium (Torr. & A. Gray), E. leucolepis (DC.), E. mikanioides Chapm., E. mohrii Greene, E. perfoliatum L., E. pilosum Walter, E. quinqueflorum Urb. & Eckman, E. recurvans Small, E. resinosum DC., E. rotundifolium L., E. semiserratum DC., E. serotinum Michx., E. sessilifolium L., que se distribuyen principalmente por el este de América del Norte (y las Antillas) y presenta una mayor diversidad por la llanura costera del sudeste. El grupo Traganthes comprende tres especies, E. capillifolium (Lam.) Small, E. compositifolium Walter, E. leptophyllum DC., las cuales son muy abundantes en la llanura costera del sudeste de América del Norte. El cuatro grupo estaría constituido por las especies Euroasiáticas, incluyendo la única especie europea, E. cannabinum y las especies asiáticas, E. amabile Kitam., E. benguetense C. Robinson, E. camiguinense Merr., E. chinense L., E. formosanum Hayata, E. fortunei Turcz., E. lindleyanum DC., E. luchuense Nakai, E. nodiflorum DC., E. quaternum DC., E. sambucifolium Elmer, E. shimadai Kitam., E. squamosum D. Don, E. tashiroi Hayata, E. toppingianum Elmer, E. variabile Makino, E. yakushimaense Masam. & Kitam., y recientemente se ha descrito una nueva especie asiática, concretamente de las islas Filipinas, el E. leonardii. Figura 1. Distribución del género Eupatorium según King y Robinson. Introducción 16  Las relaciones entre los grupos y el rango taxonómico de los mismos dentro de Eupatorium siguen sin estar claras, e incluso algunos estudios muestran que muchas de las especies de los diferentes grupos pueden hibridar. Las islas del Caribe constituyen uno de los llamados diez puntos calientes insulares de biodiversidad, los cuales se caracterizan por presentar un altos niveles de endemicidad, una masiva pérdida de hábitat y una elevada vulnerabilidad y extinción. Las especies de Asteraceae endémicas de los territorios insulares han proporcionado ejemplos muy bien conocidos de radiación vegetal a nivel mundial, los cuales ilustran el importante papel que desempeñan los sistemas insulares en los estudios evolutivos y de conservación. Los géneros endémicos de las islas han proporcionado un excelente ejemplo de especiación a través de la radiación adaptativa. Los más conocidos se encuentran en las islas de la Macaronesia (ejemplo, Argyrantemum, Gonospermum, Allagopappus,), archipiélago de Hawai, las islas galápagos, Isla de Santa Helena y la isla de Juan Fernández. Un estudio comparativo pone de manifiesto que las Islas del Caribe presentan un mayor número de géneros endémicos en el mayor número de tribus y poseen la única tribu de la familia endémica en islas, la tribu Feddeeae. Estas características de diversidad exclusiva de las Islas del Caribe determinan que constituyan el área de endemismos insulares más importante para la familia Asteraceae. Los puntos calientes de biodiversidad de las Islas del Caribe incluyen las islas Bahamas, Grandes Antillas, Pequeñas Antillas, y varias de las islas situadas en la costa norte de Venezuela. 17 2. OBJETIVOS  Objetivos 18   Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P.  19  El Grupo de investigación de Productos Naturales Química Orgánica I ha venido desarrollando en los laboratorios del Departamento de Química de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, un programa del estudio de los componentes químicos de la flora canaria, en especial la correspondiente a la familia Compositae (Asteraceae). Los objetivos que se pretenden alcanzar en este trabajo son: 1. Realizar el estudio químico de especies endémicas de la República Dominicana pertenecientes al género Eupatorium (Asteraceae) mediante el aislamiento e identificación de los metabolitos secundarios presentes en dichas especies. 2. Obtener resultados que ayuden a clarificar la posición taxonómica de dichas especies. 3. Realizar ensayos de actividad biológica con los productos obtenidos en los estudios químicos de dicho género, así como sus derivados, que pudieran ser de interés para su aplicación desde el punto de vista farmacológico. Objetivos 20    Química del Género Eupatorium  27  Los labdanos aislado de plantas y organismos marinos presentan una variedad de actividades biológicas como agentes antibacterianos, antivirales y antifúngicos, así como actividad citotóxica, como lo muestra el hecho de que algunos han sido empleados contra ciertos tumores humanos como la leucemia, lo cual los convierte en potenciales compuestos de interés farmacológico. Asimismo se ha demostrado su capacidad para actuar como agentes antiinflamatorios y como inhibidores de la agregación de plaquetas procesos que están implicados en afecciones como asma bronquial y alergias agudas. OPP OPP CH2 H HH - H+ OPP H H H H Núcleo ent-labdano OPP H H H H Núcleo labdano Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 28  Hemos de tener en cuenta que tanto para las lactonas sesquiterpénicas como para los diterpenos no solo los tipos de esqueleto son importantes desde un punto de vista taxonómico, sino también los patrones de sustitución y la estereoquímica. Los componentes que se encuentran más frecuentemente en las especies de Eupatorium en sentido estricto en los núcleos de América del Norte y el este de Asia, son además de los terpenoides y triterpenoides comunes, las lactonas sesquiterpénicas del tipo germacrano, heliangólido y guayanólido, así como un elemadienólido aislado de E. serotinum. De hecho, todas las especies de Asia oriental estudiadas hasta ahora, incluyendo las diferentes subespecies o variedades de E. chinense han presentado uno o más de los tres tipos de lactonas indicados como todas las especies del grupo Uncasia con las excepción de E. álbum y E. petaloideum que solamente elaboran diterpenos y E. leucolepis que no presenta ningún tipo de terpenoides. Otra excepción es el E. pilosum que no presenta lactonas sesquiterpénicas sino un derivado acetilado y un único tipo de lactonas (ver estructura). Un estudio químico de diferentes especies de Eupatorium ponen de manifiesto que dos especies de E.chinense así como E. rotundifolium se caracterizan por elaborar guayanólidos, mientras que E. formosanum , F. fortunei, E. lancifolium, E. mikanioides, E. semiserratum y E. serotinum parecen haberse especializado en la elaboración de germacranólidos, por otro lado E. formosanum y E. lindleyanum se caracterizan por la presencia de heliangólidos, mientras que el resto de las taxa producen dos o los tres tipos de compuestos. Otro grupo de compuestos químicos aislados de las diferentes especies de Eupatorium lo constituyen los flavonoides. Un amplio estudio químico de este tipo de compuestos pone de manifiesto que no hay una clara diferenciación entre los mismos que permita sacar conclusiones. Por todo ello vamos a centrar el análisis químico de las diferentes especies de Eupatorium que han sido estudiadas en aquellos compuestos más complejos que requieren un cierto grado de especificidad por parte de la planta y que en nuestro caso serán las lactonas sesquiterpénicas y los diterpenos. 29 4. GÉNERO EUPATORIUM L.  Género Eupatorium L. 30   Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 31  4.1 Descripción Botánica del Género Eupatorium. Se trata de hierbas anuales o perennes que pueden formar arbustos o árboles pequeños y que ocasionalmente pueden trepadoras o escandentes. Hojas opuestas o con menos frecuencia alternas. Los capítulos se encuentran formando panículas corimbosas. Los capítulos son poco numerosos, homógamos, discoides, Los involucros campanulados o angostamente cilíndricos. Las filarias en 3-10 series, imbricadas a subimbricadas, raramente eximbricadas. Receptáculos planos o convexos. Flósculos poco a numerosos, perfectos. Las corolas son 5-lobuladas y con una coloración que va del blanco al rosado o lila, siendo raramente rojizas o amarillas. Los apéndices de las antenas son ovados. Las ramas del estilo bastante exertas en la antesis, con apéndices apicales abultados o agrandados. Los aquenios generalmente 4-5 angulados, los carpopodios variables. Los vilanos presentan de 20 a 60 cerdas capilares en una o raramente más series. El género fue descrito por Carlos Linneo en 1763. El término Eupatorium es de origen griego y significa “de padre noble”. Parece ser que toma este nombre en referencia al Mitridates el Grande rey del Ponto en el siglo I A. C. de quién se cuenta que encontró un antídoto contra un veneno de la época en una planta de este género y a quién se le atribuye el primer uso en medicina, Reino: Plantae División: Tracheophyta Subdivisión: Spermatophytina Clase: Magnoliopsida Superorden: Asteranae Orden: Asterales Familia; Compositae Giseke Tribu: Eupatorieae Cass. Subtribu: Eupatoriinae Género Eupatorium L. 32  4.2 Etnofarmacología. Muchas especies de Eupatorium son ricas en lactonas sesquiterpénicas que tienen el agrupamiento α-metilen--lactona. Dichos compuestos pueden causar la desgranulación de los mastocitos y liberar histamina. Por lo tanto, los procesos tóxicos en los rumiantes que pastan especies de Eupatorium que contienen lactonas sesquiterpénicas pueden ser debidas a estos y a otros metabolitos secundarios presentes de dichas plantas. Los cuadros clínicos que se manifiestan dependerán de la abundancia relativa de las diferentes toxinas en las especies predominantes, en una particular región geográfica. Diferentes plantas del género Eupatorium5 se han utilizado en métodos tradicionales de medicina en diferentes partes del mundo. Extractos de E. cannabinum se han utilizado contra dolencias biliares, del bazo y el hígado y contra la diarrea, mordeduras de serpientes, úlceras, para la cicatrización de heridas, combatir la fiebre, como un diurético, antihelmíntico y como repelente contra los animales venenosos. Los extractos de hojas y raíces tienen actividad colerética, laxante y estimulante del apetito. Los extractos acuosos de E. cannabinum tiene actividad colerética y hepatoprotectora en ratones contra hepatotoxidad inducida por tetracloruro de carbono. Las partes aéreas de E. cannabinum son empleadas como agentes inmunoestimulantes en casos de infección por gripe, como un remedio contra el estreñimiento, produciendo una disminución del nivel del colesterol y como diurético. Esta planta es empleada como ingrediente en medicinas inmunoestimulantes. Extractos de E. perfoliatum han sido empleados contra fiebres, infecciones bronquiales, migraña, gusanos intestinales, resfriados, catarros, gripe, reumatismo, malaria y estreñimiento. Otras propiedades que presenta la planta son diaforéticas, laxativa, emética y catártica. Extractos de E. cannabinum y E. perfoliatum son conocidas como estimulantes de los mecanismos de defensa contra infecciones víricas. Ambas especies son empleadas en sistemas de medicina homeopática contra fiebres, enfermedades hepatobiliares y reumatismo. E. buniifolium, una planta medicinal encontrada en el noroeste y el centro de Argentina, es empleada como tintura por sus propiedades hepatoprotectoras y desinfectantes. El extracto etanólico de dicha planta muestra una  5 Sharma, O.P., Dawra, R.K., Kurade, N.P., Sharma, P.D. (1998). A Review of the Toxicosis and Biological Properties of the genus Eupatorium. Natural Toxins, 6, 1-14. Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 33  buena actividad antiherpética contra virus del herpes simple. E. rotundifolium, E. cuneifolium y E. semiserratum han sido empleadas tradicionalmente para el tratamiento del cáncer. La especie E. formosanum es empleada en la medicina popular de Formosa por sus propiedades antileucémicas, antipiréticas, anti-inflamatorias y antitumorales. Los constituyentes bioactivos de las especies de este género pertenecientes a los grupos de lactonas sesquiterpénicas, sesquiterpenos en general y flavonoides han sido investigados en diferentes plantas. Las lactonas sesquiterpénicas son conocidas por tener actividad antitumoral, citotóxica, antimicrobiana, fototóxica y fagorrepelente. Estos productos naturales son conocidos por producir envenenamiento en el ganado y dermatitis de contacto. Compuestos como el eupatólido y eupaformin que presentan actividad citotóxica y la eupaformosanin que actúa como principio antileucémico han sido aislados de E. formosanum recolectada en Taiwán. Un análisis de las partes aéreas de E. lancifolium dio como resultado la obtención de los compuestos eupacunin, eupacunolin y desacetileupacunin que presentan actividad citotóxica y antileucémica. De las diferentes especies del género se han aislado una gran variedad de lactonas sesquiterpénicas con diferentes tipos de actividad biológica lo que las convierte en una prometedora fuente de productos de interés. En la medicina tradicional del Perú y Ecuador una decocción de las hojas y ramas del E. glutinosum se emplea como astringente, antirreumático y antimicrobiano, así como para la cura de ulceras de estómago, diarrea y dolor de cabeza. También el E. salvia se emplea en la medicina popular. De estas especies se han aislado diterpenos del tipo labdano. Asimismo del E. macrocephalum recolectado en el Paraguay y utilizado en la medicina popular como antiinflamatorio, sedativo y para afecciones cardiacas se han aislado diterpenos derivados del kaurano. Todo ello ha determinado un interés por el estudio de las especies de este género debido principalmente a la relevante actividad farmacológica que poseen muchos de estos compuestos. Género Eupatorium L. 34  4.3 Consideraciones Taxonómicas del Género Eupatorium. Se define por carácter todo atributo, propiedad o particularidad de un organismo que es susceptible de evaluarse. Decimos que son caracteres taxonómicos cuando hacemos uso de ellos para llevar a cabo una clasificación. Las características de morfología macroscópica que son fácilmente apreciables constituyen la base principal para la mayoría de las clasificaciones botánicas. Sin embargo, cuando el estudio comparado se realiza con mayor profundidad, para realizar una buena clasificación se recurre al examen y evaluación de las propiedades anatómicas, citológicas, fisiológicas y también químicas. Todas estas propiedades, estrictamente hablando, son características del fenotipo y en la mayoría de los casos la semejanza fenética sigue siendo fundamental para suponer la existencia de una relación. Por ello, decimos que un buen carácter es aquel que es relativamente estable porque revela escasa variación de una generación a otra y baja sensibilidad a los posibles cambios ambientales. Si bien los caracteres exomorfológicos constituyen la base principal para realizar una clasificación, cada vez con más frecuencia la sistemática moderna tiende a apoyarse en los resultados obtenidos por diferentes líneas de trabajo, ya que pueden aportar más elementos de juicio y permiten establecer relaciones de parentesco sobre bases más amplias. Una de estas posibles líneas de trabajo es la Quimiotaxonomía cuya función es proceder al estudio de la composición química de las plantas, partiendo del supuesto de que aquellas plantas que contienen un determinado tipo de sustancias pueden estar emparentadas entre sí. No se puede negar que a veces los datos químicos pueden presentar algunos problemas, pero hay ejemplos en la bibliografía que ponen de manifiesto que en algunos casos han sido utilizados para resolver problemas taxonómicos a nivel genérico y que ponen de manifiesto que pueden proporcionar algunas ventajas únicas para los fines de la sistemática. Se parte del concepto de que cuando se identifica un determinado compuesto químico en una especie, este representa de alguna manera una característica inequívoca de la misma. Además, se pueden establecer relaciones entre una determinada clase de compuestos químicos a partir de la consideración de aspectos biosintéticos. A Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 35  partir de estos datos de los procesos de biosíntesis se pueden establecer relaciones más directas entre aquellas características fitoquímicas de una forma interpretable más directa que para otros tipos de datos taxonómicos, ya que sobre la base de la biosíntesis sería posible interpretar el hecho de que compuestos que a priori parecería que no están relacionados, se puede establecer vía procesos químicos la transformación de unos en otros. El estudio químico de las diferentes especies del género Eupatorium estudiadas, tomando como base de partida la clasificación llevada a cabo por King y Robinson, pero considerando otras especies que en la bibliografía siguen siendo consideradas como pertenecientes a dicho género, se refleja en la siguiente tabla donde nos centramos en las lactonas sesquiterpénicas y en los diterpenos como caracteres taxonómicos. Como se puede observar hay un gran predominio de las lactonas sesquiterpénicas y dentro de ellas son abundantes los germacranólidos y los guaianólidos, datos que si nos centramos en la clasificación llevada a cabo por King y Robinson podemos ver que, de forma general, apoyarían dicha propuesto tomando como caracteres los compuestos lactónicos con la excepción del E. álbum, especie en la que los metabolitos secundarios presentes son diterpenos del tipo kaurano. Hay dos especies, E. capillifolium y E. semialatum donde se detectan también lactonas sesquiterpénicas pero en este caso con esqueleto de tipo eudesmanólido y guayanólido. Otro grupo estaría constituido por aquellas especies que se caracterizan por la elaboración de diterpenos con predominio de los que elaboran derivados del labdano y dos especies que presentan diterpenos derivados del kaurano. Todas estas especies a excepción del E. álbum están situadas geográficamente en América del Sur y estarían químicamente relacionadas con un género segregado de Eupatorium por King y Robinson pero que desde un punto de vista botánico está estrechamente relacionado con el mismo, nos referimos al término Austroeupatorium donde especies como el A. inulaefolium también presentan un predominio de diterpenos como metabolitos secundarios. Género Eupatorium L. 36  Especie TIPO DE ESTRUTURA Zona Americana Germacrano Guaiano Eudesmano Labdano Kaurano Otros comp. E. album L. + E.altissimum L. + + E. anomalum + + E. capillifolium (Lam.) Small + + E. cuneifolium Willd. + E. hyssopifolium L. + E. lancifolium (Torr. & A. Gray) Small + E. leptophyllum DC. flavonoides E. leucolepis (DC.) Torr & A. Gray flavonoides E. mikanioides Chapm. + E. mohrii Greene + + E. perfoliatum L. + + E. petaloideum E. pilosum Walt. Ácidos - lactonicos E. recurvans Small + E. rotundifolium L. + + E. semiserratum DC. + E. serotinum Michx. + + E. sessilfolium L. + + Zona Europa, Norte Africa, India E. cannabinum + + + Zona Asiatica E. chinense L. + + E. glehnii ( = E. chinense) + + E. japonicum (= E. chinense) + E. sachalinense (= E. chinense) + E. formosanum Hoyata + E. fortunei Turcz. + E. lindleyanum + + Otras especies E. arnottianum flavonoides E. ascherbonianum cromenos E. buniifolium + E. betonicaeforme + E. coelestinum benzofuranos E. glandulosum flavonoides E. glutinosum + E. hualinense + E. kiirunense + E. macrocephalum + E. maculatum + E. semialatum + + E. salvia + E. turbinatum + E. villousm + Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 43                                                  24Herz, W., de Groote, R., Murari, R., Kumar, N., Blount, J.F. (1979). Sesquiterpene lactones of Eupatorium serotinum. J. Org. Chem. 44, 27842788.  25Herz, W., Sharma, R.P. (1976) Sesquiterpene lactones of Eupatorium hyssopifolium. A germacranolide with an unusual lipid ester chain. J. Org. Chem. 41, 1015-1020.  8  -acetoxi-15-hidroxi costunolido  O CH 2 OH O OAc E. serotinum8 8  -angeloiloxi-15hidroxicostunolido  O CH 2 OH O O O E. serotinum8 Eupahyssopilin E. hyssopifolium22 Euserotin E. serotinum24 E. serotinum23 Eupahyssopin     E. hyssopifolium25 O O O O O O COOH O O O O O O O O OH O O O O OH O Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 44                                                    26Lee, K.H., Kimura, T., Okamoto, M., Cowherd, C.M., McPhail, A.T., Oman, K.D. (1976). The structure and stereochemistry of eupahyssopin, a new antitumor germacranolide from Eupatorium hyssopifolium. Tetrahedron Letters, 17, 1051-1054.  E. hyssopifolium22 8  -hidroxipartenolido E. serotinum7, 8 8β-angeloiloxi-15hidroxicostunolido E. serotinum7 E. hyssopifolium25, 26 E. serotinum7  E. serotinum7 O O O O O O O HO O OH O O O HO O O O O HO O O O OH O O O O HO O Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 45                                                    27Ito, K., Sakakibara, Y., Haruna, H. (1979). New sesquiterpene lactones from Eupatorium sachalinense (Fr. Schimidt) Makino. Chem. Lett. 1503-1506.   Eupahyssifilin      R = O OC H OH (CH 2 ) 14 CH 3 E.hyssopifolium25  O O OR   R = O OC H OH (CH 2 ) 14 CH 3 E.hyssopifolium23 Eupafortunin  O O O OAc O OH OH E. fortunei11 Sachalin  O O OH OH  E. sachalinense (= E. glehnii)27 O O OR HO O Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 46  Sachalinin  O O O OH OH OH  E. sachalinense ( = E. glehnii)26 Peroxisachalinin  O O O OH OH OOH  E. sachalinense (= E. glehnii)26 Hiyodorilactona A  O O O AcO O OH OH  E. sachalinense (= E. glehnii)28  Hiyodorilactona B  O O O AcO O OH  E. sachalinense (= E. glehnii)27 E. lindleyanum48 Hiyodorilactona C   O O OH AcO E. sachalinense (= E. glehnii)27 Hiyodorilactona D  O O O HO OOH OAc E. sachalinense (= E. glehnii)27,29 Hiyodorilactona F  O O O AcO O OAc OAc  E. sachalinense (= E. glehnii)28    28Takahashi, T., Ito, H., Ichimura, ., Murae, T. (1978). Hiyodori lactones A and B, new tumor inhibitory germacradienolides from Eupatorium sachalinense Makino. Chem. Lett, 1345-1348.  29Takahashi, T., Ichimura, ., Murae, T. (1979). Hiyodori lactones D, E and B, new cytotoxic sesquiterpene lactones from Eupatorium sachalinense Makino. Chem. Lett, 1345-1348.  Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 47  Hiyodorilactona E  O HO O O O AcO OH  E. sachalinense (= E. glehnii)28 4´-O-acetato de 4E-deacetil chromolaenide   O O O HO O OAc  E. glehnii30 Deacetilhiyodorilactona D  O O O HO O OH OH  E. glehnii29 5´-deoxi eupatoriopicrin  O O O O OH  E. glehnii27 4-O´-acetato de eupatoriopicrin  O O O OOH OAc  E. glehnii29 4´-deoxo eupatoriopicrin  O O O OOH  E. glehnii29  30Motoo, T., Norie, M., Naoko, H., Saito, Y., Katsuyuki, N., Masakazu, S., Masami, T., Akiko, U., Hiroshi, H. (2008). New Sesquiterpenoids isolated from Eupatorium glehnii. Isolation of Guaiaglehnin A, structure revision of Hiyodorilactone B, and genetic comparison. Chem. Pharm. Bull. 56(5), 677-681.  Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 48  2α-hidroxi epitulipinolido   O O OAcHO  E. glehnii29 2β-acetoxi epitulipinolido  O O OAcAcO  E. glehnii29,31 Eupaglehnin A   O O O OOCH 3 OH  E. glehnii30 Eupaglehnin B   O O O O OH OAc  E. glehnii30 Eupaglehnin C   O O O OOH  E. glehnii30 Eupaglehnin D   O O O O H 3 CO OH  E. glehnii30     31Motto, T., Yoshiko, T., Hiroe, K., Katsuyuki, N., Masakazu, S. (2002). Seven germacranolides A, B, C, D, E, and F, and 2αAcetoxyepitulipinolide from Eupatorium glehnii. Chem. Pharm. Bull., 50(9), 1250-1254.   Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 49  Eupaglehnin E   O O OAcHO Cl OH  E. glehnii30  Eupaglehnin F   O O OAcAcO Cl OH  E. glehnii30     8-O-tiglatoeupaformin  O HO O O O  E. altissimum10   Deacetil 8-O-(4´-hidroxi tiglato)eupaformin  O HO O O O OH  E. altissimum10   Deacetil-8-O-(4´,5´-dihidroxi tiglato)eupaformin  O HO O O O OH OH  E. altissimum10   O HO O O O  E. altissimum10   O AcO O O O OH  E. chinense var.simplicifolium32      32Takahashi, T., Utagawa, S., Murae, T. (1980). The antitumor agents eupasimplicin A and B of Eupatorium chinense simploflium. Koen Yoshishu-Koryo. Terupen oyobi Seiyo Kagaku ni, hansuru. Toronkai 23rd 1979, 276-278. Chemical Abstracts 93, 114734t. Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 50  Eupaformosanin  O AcO O O O OH OH  E. formosanum33 E. chinense44 Eupaformonin  O AcO O OH  E. formosanum34   O AcO O OH  E. cannabinum5 E. chinense var. sachalinense27, 28   O AcO O O O  E. cannabinum5   AcO O O O O OH E. chinense var. simpliciforum31   AcO O O O O OH  E. altissimum10 E. cannbinum5   AcO O O O O OH OH  E. altissimum10 E. cannabinum5 E. chinense var. sachalinense. (= E. glehnii)27, 28      33McPhail, A.T., Onan, K.D., Lee, K.H., Ibuka, T., Huang, H.C. (1974). Structure and stereochemistry of eupaformin, a novel cytotoxic sesquitepene lactone from Eupatorium formosanum Teterahedron Letters, 15, 3203-3206.  34Lee, k.H., Kimura, T., Haruna, M., McPhail, A.T., Onan, K.D., Huang, H.C. (1977). Structure and stereochemistry of eupaformosanin, a new antileukemic and antisarcoma germacranolide from Eupatorium formosanum. Phitochemistry 16, 1068-1070.  Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 51    AcO O O O O OH OAc  E. chinense var. Sachalinense. (= E. glehnii)27, 28   AcO O O O OOH  E. chinense var. Sachalinense. (= E. glehnii)27, 28 Eupacunin  AcO O O O O OH  E. cuneiifolium19, 35 Eupacunoxin   AcO O O O O OH H O  E. cuneifolium19, 34   AcO O O O O OH  E. recurvans36   Desacetoxi-3-oxoeupaformin  O O O O O  E. altissimum14   Desacetoxi-3-oxochromaloenide  O O O O O OH  E. altissimum14   35Kupchan, S.M., Maruyama, M., Hemingway, R.J., Hemingway, J.C., Shibuya, S., Fujita, T., Cradwick, P.D., Hardy, A.D.U., Sim. G.A. (1971). Epacunin, a novel antileukemic sesquiterpene lactone from Eupatorium cuneifolium. J. Am. Chem. Soc., 93, 4914-4916. 36Herz, W., De Groote, R., Murari, R., Blount, J.F. (1978). Sesquiterpene lactones of Eupatorium recurvans. J. Org. Chem., 43, 3559-3564.  Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 52  E. hyssopifolium22 E. hyssopifolium22 E. chinense var. simplifolium37 E. lindleyanum38 E. lindleyanum37 E. lindleyanum37  E. lindleyanum37  37Ito, K., Sakakibara, Y., Haruna, M. (1979). New sesquiterpene lactones from Eupatorium chinense var. simplicifolium (Makino) Kitam. Chem. Lett. 1473-1476. 38Ito, K., Sakakibara, Y., Haruna, M., Lee, K.H. (1979). Four new germacranolides from Eupatorium lindleyanum DC. Chem. Lett. 1469-1472. HOCH2 O O O O OH AcOCH2 O O O O OH CHO O O O O HO O O O O AcO O OH O O O O AcO O OH O O O O AcO OOH O O O O AcO OOH Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 59   Eupalinin C E. chinense44, 50 3,14-dihidroxi-8-(2´- metilbutiriloxi)- heliango-1(10),4,11(13)- trien-6,12-olida E. chinense44 3β-hidroxi-8sarraceniloxi-germacra1(10),4,(11(13)-trien -6,12-olida E. chinense44 3-acetoxi-8sarraceniloxi-helianga1(10),4,11(13)-trien6,12-olida E. chinense44 3β-hidroxi-8-acetoxisarraceniloxi-germacra1(10),4,(11(13)-trien -6,12-olida E. chinense44 3β-hidroxi-8-(2´- metilbutiriloxi)-14oxomelampa-1(10),4dien-6,12-olida  E. chinense44  O O O O AcO OOH O O O O HO OH O O O HO O OH O O O O AcO OH O O O O HO OH O HO CHO O O O Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 60   Eupalinolido A   O AcO O O OAc O OH  E. lindleyanum46  Eupalinolido B   O O O O AcO OH OAc  E. lindleyanum45 Eupalinolido C   O AcO O O OH O OH  E. lindleyanum45 Eupalinolido D   O AcO O O OAc O OAc  E. lindleyanum45 Eupanolido E   O O O O AcO OAc CHO  E. lindleyanum45 3β-acetoxi-8βhidroxitigloiloxi)-14hidroxicostunolido   O O O O AcO OH OH  E. lindleyanum45  46Yang, N.Y., Qian, S.H., Duan, J.A., Li, P., Tian, L.J. (2010). Cytotoxic sesquiterpene lactones from Eupatorium lindleyanum. Journal of Asian Natural Products, 9(4), 339-345. Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 61     3-deacetileupalinin E. lindleyanum47 Heliangine E. lindleyanum46 8β-(4´-hidroxitigloiloxi)- 3β,14-dihidroxi-6βH, 7αH-germacra1(10)Z,4Z,11(13)-trien6,12-olida E. lindleyanum46 8β-tigloiloxi-3β,14dihidroxi-6βH,7αHgermacra1(10)Z,4E,11(13)-trien6,12-olida E. lindleyanum46 Ácido 8β-tigloiloxi-2,3seco-6βH,7αHhelianga-4z,11(13)- diene-3-10β-6,12-oico E. lindleyanum46 Eupalinolido F  E. lindleyanum 48     47Huo, J., Yang, S.P., Ding, J., Yue, J.M. (2004). Cytotoxic sesquiterpene lactones from Eupatorium lindleyanum. J. Nat. Prod., 67, 1470-1475. 48Wu, S.Q., Xu, N.Y., Sun, Q., Hau, H.Y., Zhang, J. (2012). Six new sesquiterpenes from Eupatorium lindleyanum. Helvetica Chimica Acta, 95, 1637-1644. OO O HO O O OH OO O HO O O OO O HO O OH OH O O O O OH HO O O HO O O O O O O O O OH AcO OH O Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 62    Eupalinolido G  O O O OAc AcO OH O E. lindleyanum47 Eupalinolido H  O O O OH AcO OH O E. lindleyanum47 Eupalinolido I  O O O OAc AcO OH O E. lindleyanum47 Eupalinolido J  O O O HO OH O E. lindleyanum47 Eupalinolido K  O O O AcO OH O E. lindleyanum46 3  -acetoxi-8  -(4´- oxotigloiloxi)-14hidroxiheliangolido  O O AcO OH O O CHO E. lindleyanum 49 3  -acetoxi-8  -(4´- oxotigloiloxi)-14hidroxicostunolido  O AcO O OH O O CHO E. lindleyanum48    49Yang, N.Y., Duan, J.A., Shang, E.X., Tian, L.J. (2010). Analysis of sesquiterpene lactones in Eupatorium lindleyanum by HPLC-PDA-ESIMS/MS. Phytochemical Analysis, 21, 144-14 Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 63   3  -acetoxi-8  -(4´- hidroxitigloiloxi)- costunilido  O AcO O O O OH E. lindleyanum48 Eupatinilide L  O O H 3 CO O O CHO O OH E. lindleyanum50 Eupalinin B  O O AcO O O OH O E. lindleyanum51 Eupalinin D  O O AcO O O OH O E. lindleynum50 Eupahualin A  O CHO O OOH O E. hualinense52 Eupahualin B  O CHO O O O OH E. hualinense51   50Huo, J., Yang, S.P., Ding, J, Yue, J.H., Tian, L.J. (2006). Two new sesquiterpenoids from Eupatorium lindleyanum. Journal of Integrative Plant Biology, 48(4), 473-477. 51Ito, K., Sakakibara, Y., Haruna, M., Lee, K.S. (1979). Four new germacranolides from Eupatorium lindleyanum. Chemistry Letters, 1469-1472. 52Shen, Y.C., Jang, J.Y., Khalil, A.T., Chiang, L.C. (2005). New germacranolides from Eupatorium hualinense. Chemistry & Biodiversity, 2, 244-252.  Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 64    Eupahualin C E. hualinense51 Eupahualin D E. hualinense51 Eupahualin E E. hualinense51 15-acetoxiheliangin E. kiirunense39 3-epi-heliangin E. kiirunense39 Heliangin E. kiirunense39 O CHO O O O OH O O O O OH OH AcO O COOH O O O OH OAc H HO O O O O O HO H O O O O O H HO O O O O O Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 65     Eupaheliangolida A E. kiirunense39 3α,14-dihidroxi-8βtigloiloxi-6βH,7αH, 11αH-germacra1(10)Z,4Z-dien-6,12olida E. perfoliatum53 E. recurvans35 E. recurvans35          53Maas, M., Hensel, A., Batista da Costa, F., Brun, R., Kaiser, M. (2011). An inusual dimeric guaianolide with antiprozoal activity and further sesquiterpene lactones from Eupatorium perfoliatum. Phytochemistry, 72, 635-644.   O O O O HO O O HO O O OH O O O AcO O O OH O O AcO OH O O Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 66     LACTONAS TIPOS GUAIANOLIDA Peroxieupahakonin A E. chinense var. hakonense54 Peroxieupahakonin B E. chinense var. Hakonense53 Eupahakonin A E. chinense var. Hakonense53 Eupahakonin B E. chinense var. Hakonense53 Eupahakonenin A E. chinense var. Hakonense53 Eupahakonenin B  E. chinense var. Hakonense53    54Ito, K., Sakakibara, Y., Haruna, M. (1982). Seven guaianolides from Eupatorium chinense. Phytochemistry, 21, 715-720.  O O HOO O O O O HOO O O O O HO O O OH OH O O HO O O OH OH O O O O OH OH H O O H O O OH OH Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 67      8  -tigloiloxipreeupatindin  O O HO O O H  E. altissimum14   8  -(4´-hidroxitigloiloxi) preeupatindin  O O HO O O H OH  E. altissimum14   8  -(4´,5´-dihidroxitigloiloxi) preeupatindin  O O HO O O H OH OH  E. altissimum14   O O HO O O H E. rotundifolium ssp. ovatum22 Eupahakonesin   O O AcO O O HOH OH  E. chinense var. hakonense53 E. cannabinum5 Eupachifolin C   O O O O H AcO OH  E. chinense var. Simplifolium37 Eupatundin   O O O HO O HO O  E. rotundifolium55 E. scabridum21  55Kupchan, S. M., Kelsey, J. E., Masao, M., Cassady, J. M., (1968). Eupachlorin acetate, a novel chloro-sesquiterpenoid lactone tumor inhibitor from Eupatorium rotundifolium. Tetrahedron Letters, 31, 3517-3520.  Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 68   Euparotin E. rotundifolium54 E. scabridum21 Acetato de Euparotin E. rotundifolium54 Acetato de Eupachlorin E. rotundifolium54 Eupachlorin E. rotundifolium54 Eupachloroxin E. rotundifolium54 E. scabridum21 Eupatoroxin  E. rotundifolium54 E. scabridum21   O O HO O O O H HO O O AcO O O O H HO O O AcO HO O O H HO Cl O O HO HO O O H HO Cl O O HO HO O O H HO Cl O O O HO HO O O H HO O Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 75  Eupatochinilide II E. chinense43 Eupatochinilide III E. chinense43 Eupatochinilide IV E. chinense43 Eupatochinilide V E. chinense43 Eupatochinilide VI E. chinense43 Eupatochinilide VII  E. chinense43     O O O O HO O O O O O O O HO O OH O O O O Cl HO HO O O O O OHC HO O O O O OHC HO O O O O OHC HO O Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 76     8β-(4´-hidroxi Tigloiloxi)-5-desoxi-8desacetileupatorin  O O O O HO O OH E. chinense43 Eupanilide B E. chinense43 E. lindleyanum Eupalinilide A E. lindleyanum46 Eupalinilide B E. lindleyanum46 Eupalinilide C E. lindleyanum46 Eupalinilide D  E. lindleyanum46  O O O O OH HO O O O O HO H H Cl OH OH O O O O HO H H OH O O O O H H OH OH O O OH O H H Cl OH HO Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 77  Eupalinilide E E. lindleyanum46 Eupalinilide F E. lindleyanum46 Eupalinilide G E. lindleyanum46 Eupalinilide H E. lindleyanum46 Eupalinilide I E. lindlyanum46 Eupalinilide J  E. lindleyanum46    O O O H H Cl OH HO O O O O H H Cl OH HO O OH O O O H H O HO O OH O O O O H H Cl OH HO O O O O O H H Cl OH HO O O OH O O O H H Cl OH AcO O O OH Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 78  8β-angeloiloxi-2-oxo Guai-1(10),3,11(13)- trien6,12-olida  O O O O O O E. chinense var. Tozanense41 11,13α-dihidro euperfolid  O O O O H O HO O E. perfoliatum63 Ácido 2-oxo-8Tigloiloxiguaia-1(10) ,3-diene-6,12-olida-14carboxílico  O O O H O HO O O E. perfoliatum52 2,14-dioxo-8-tigloiloxiguaia1(10), 3-diene-6,12-olida  O O O H O HO O E. perfoliatum52 14-hidroxi-2-oxo-8tigloiloxiguaia-1(10), 3diene-6,12-olida.  O O O H O HO O E. perfoliatum52 2,14-dioxo-8-tigloiloxiguai3-ene-6,12-olida  O O O H O O O H E. perfoliatum52     63Bohlman, F., Grenz, M. (1977). Naturally occurring terpene derivatives. Part. 82. Constituents from representatives of the Eupatorium groups. Chemische Berichte, 110, 1321-1329. Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 79  Guaiaglehnin A  O O O H OAc O OH OH E. glehnii30 3β-hidroxi-8β-[4-hidroxi5-(5-hidroxi Tigloiloxi)tigloiloxi]-4αmetoxi-10(14) ,11(13)-guaiadien-6,12olida  O O O O H 3 CO H H O HO OH O OH E. semialatum64 Diguaiperfolin  O O O HO O O HO H O O O O O E. perfoliatum52 8-acetoxiarteminolido  O O H OOAc O HO O E. capillifolium60 Cumambrin B  O H H OH OH O E. maculatum65  E. altissimum14   64Lang, G., Passreiter, C.M., Medinilla, B.E., Castillo, J.J. (2001). Further sesquiterpene lactones from Eupatorium semialatum. Z. Naturforsch, 57c, 282-286. 65Wiedenfeld, H., Hösch, G., Roeder, E., Dingermann, Th. (2009). Lycopsamine and cumambrin B from Eupatorium maculatum. Pharmazie, 64(6), 415-416. O O O H H HO O OH OH Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 80   LACTONAS TIPO EUDESMANOLIDO 8β-[4-hidroxi-5-(5hidroxitigloiloxi)tigloiloxi] reynosin  O OH H O O O OH O O OH E. semialatum63 8β-[4-hidroxi-5-(5hidroxitigloiloxi)tigloiloxi] magnonialido  O OH H O O O OH O O OH E. semialatum63 8β-[5-hidroxi-4-[5hidroxitigloiloxi)tigloiloxi] balchanin  O OH H O O O O OH O OH E. semialatum63 8β-[5-hidroxi-4-(5hidroxitigloiloxi)tigloiloxi] magnonialido  O OH H O O O O OH O OH E. semialatum63 8β-[4-hidroxi-5-(5hidroxitigloiloxi)tigloiloxi] reynosin  O OH H O O O OH E. semialatum63      Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 81  8β-[5-hidroxi-4-(5hidroxitigloiloxi)tigloiloxi] reynosis  O OH H O O O OH E. semialatum63  O OH O O O OH O O OH E. semialatum63 Reynosin  O OH H O E. capillifolium60 Santamarin  O OH H O E. capillifolium60 Eupalinilide K  O OH H O HO OH E. lindleyanum49        Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 82      LACTONAS TIPO SECO-GUAIANOLIDAS Iso-seco-tanapartholide E. capillifolium60 Seco-tanapartholido B E. capillifolium60 E. semialatum63 OTROS SESQUITERPENOS Eupalinilide M E. lindleyanum66        66Ye, G., Huang, X.Y., Li, Z.X., Fan, M.S., Huang, C.G. (2008). A new cadinane type sesquiterpene from Eupatorium lindleyanum (Compositae). Biochemical Systematics and Ecology, 36, 741-744.  O O O O HO O O H O HO O O O H O OH O O H OH O HO OO OH Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 83  DITERPENOS TIPOS LABDANO Metil-ent-labd-8(17)-en18oic acid-15-oate E. buniifolium67 Ácido 15-hidroxi-entlabd-8(17)-en-18-oico E. buniifolium66 Ácido 15,16-epoxy15-metoxi-ent-labd8(17)-en-18-oic E.buniifolium66 Metil éster 15,16-olida de 15-metoxi-ent-labd8(17)-13-dien-18-oico E. buniifolium66 Ácido polialthico (ácido 15,16-epoxi-entlabd-8(17),13(16)-14trien-18-oico E. buniifolium66 Ácido nivenolido (ácido 15,16-olida-entlabd-8(17),13-dien-18oic)  COOH O O  E. buniifolium66  67Carreras, C.K., Rossomando, R.C., Giordano, O.S. (1998). Ent-labdanes in Eupatorium buniifolium. Phytochemistry, 48(6), 1031-1034.  COOH COOCH3 COOH CH2OH COOH O OCH3 COOCH3 O OCH3 O COOH O Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 84       Cannaclerodanolido E. cannabinum5 Ácido Dihidroxi-entlabd-7-en-oico  HO OH COOH E. glutinosum68 3-O-β-D-glucosido del ácido dihidroxi-entlabd-7-en-17-oico  GlucosylO OH COOH E. glutinosum67 Ácido 15-hidroxi-7labden-17-oico  OH COOH E. glutinosum69 Ácido 15-acetoxi-7labden-17-oico OAc COOH E. glutinosum68       68El-Seedi, H.R., Sata, N., Torssell, K.B.G., Nishiyama, S. (2002). New labdanes diterpenes from Eupatorium glutinosum. J. Nat. Prod., 65, 728729.  69El-Seedi, H.R., Ohara, T., Sata, N., Nishiyama, S. (2002). Antimicrobial diterpenoids from Eupatorium glutinosum (Asteraceae). Journal of Ethnopharmacology, 81, 293-296.  H O O O O Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 91  1.44, 1.74) se correlacionan con C-10; el protón a δH 0.91 (Me-18) se correlaciona con las señales a δH 3.52 (H-3) y δC 37.7 (C-4); los protones a δH 0.95 (Me-19) se correlacionan con C-5 (δC 46.1) y Me-18 (δC 21.5); ambos protones de C-6 (δH 2.36) se correlacionan con la señal a δC 212.0 (C-7). También en el HMBC se observó que el protón a δH 2.14 (H-8) se correlaciona con C-7; la señal a δH 1.68 (H-9) se correlaciona con la de H-8 (δH 2.14) y los protones a δH 1.06 (Me-20) se correlacionan con C-1, C-5, C-9 y C-10. Todas las correlaciones previamente mencionadas permitieron formar un esqueleto tipo decalina, según se ve en la Figura 3. HO O O O H  Figura 3. Correlaciones importantes en el COSY (▬) y el HMBC (→) de EUO-1 La señal a δH 1.11 (C-17) fue designada como un grupo metilo exocíclico debido a la correlación observada, en el espectro COSY, con el protón a δH 2.14 (H-8). Las correlaciones observadas en el COSY entre H-9 (δH 1.68) con uno de los protones de C-11 (δH 2.07), la del otro protón de C11 (δH 1.22) con H-12 (δH 4.79) y la correlación entre H-12 y H-14 (δH 5.79) permiten establecer la estructura de un anillo furanoico y su unión a la decalina. Estas asignaciones se ven reforzadas por las correlaciones observadas en el HMBC entre C-13/C-14 y C-14/C-15. La asignación de los protones a δH 2.09 como grupo metilo en C-16 es debido a las correlaciones observadas en el espectro HMBC de esos protones con C-13 y C-16 así como con las correlaciones vistas en el COSY entre H-12/H-16 y H-14/H-16. La configuración relativa de C-18 se determinó mediante la correlación observada en el espectro NOESY de los protones a δH 1.06 (Me-20) con los protones a δH 0.91 (Me-18). Desafortunadamente ninguna otra correlación útil se observó de los espectros NOESY o ROESY. Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 92  HO O O O H 1 2 345 67 817 9 10 20 11 12 13 14 15 16 18 19  Estructura química de EUO-1 Sin embargo, de una mezcla de acetonitrilo-agua, se obtuvieron cristales de EUO-1 y un análisis cristalográfico de rayos-X (radiación Cu Kα) confirmó la estructura de este compuesto, dio su configuración absoluta como 3S, 5S, 8R, 9R, 10S, 12R, siendo así identificado como un diterpeno tipo ent-labdano. Una búsqueda bibliográfica (Sci-finder) reveló que este compuesto no se encuentra reportado en la literatura, por lo que se trata de un compuesto nuevo, mismo que fue nombrado como uasdlabdano A. Un dibujo de perspectiva a partir de los datos cristalográficos para este compuesto se ofrece en la Figura 4. Figura 4. Dibujo de perspectiva para EUO-1 a partir de los datos cristalográficos Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 93  SUSTANCIA EUO-2 Esta sustancia se aisló de la fracción 8 de la cromatografía general de donde finalmente se le obtuvo en forma de cristales incoloros. Mostró la fórmula molecular C20H30O4, según el análisis de masas de alta resolución (HRESIMS) en modo de ion positivo, indicando seis grados de insaturación. Su espectro de IR reveló la presencia de un grupo hidroxilo (3454 cm-1) y una lactona conjugada (1726 cm-1). El espectro de 1H-RMN (Figura 5, Tabla 2) mostró, entre otras señales, la presencia de cinco grupos metilo, de los cuales cuatro aparecen como singuletes a δH 0.89 (Me-18), 0.96 (Me-19), 0.99 (Me-20), y 2.10 (Me-16), mientras que el quinto se muestra en forma de doblete a δH 1.19 (Me-17, J = 6.81 Hz). Además se observaron un protón hidroximetínico como singulete a δH 3.50 (H-3) y un protón de olefina trisustituída como singulete a δH 5.81 (H-14). Figura 5. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 500 MHz) de la sustancia EUO-2 El espectro de 13C-RMN (Tabla 2) mostró 20 señales, las cuales incluían 5 grupos metilo (δC 13.6, 13.8, 14.0, 21.5, 27.7), cuatro grupos metileno (δC 25.2, 30.9, 33.7, 37.9), seis grupos metino (δC 46.5, 48.4, 53.1, 75.2, 84.8, 117.1) y cinco carbonos cuaternarios (δC 37.6, 38.0, 168.3, 172.7, 211.8). El análisis de los espectros COSY y HMBC de esta sustancia (Figuras 6 y 7) revelaron que su estructura era similar a la de EUO-1. Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 94  Figura 6. Espectro gCOSY (CDCl3, 500 MHz) de la sustancia EUO-2 Figura 7. Espectro gHMBC (CDCl3, 500 MHz) de la sustancia EUO-2 HO O O O H  Estructura química de EUO-2 Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 95  El espectro ROESY de EUO-2 mostró picos cruzados entre H-5/Me-19 y H-3/Me-18. De una mezcla de acetonitrilo-agua, se obtuvieron cristales de EUO-2, y la cristalografía de rayos-X (radiación Cu Kα) reveló su configuración absoluta como 3S, 5S, 8R, 9R, 10S, 12S (Figura 8). Por lo que esta sustancia fue inequívocamente identificada como un diterpeno tipo ent-labdano. Una búsqueda bibliográfica (Sci-finder) reveló que este compuesto no se encuentra reportado en la literatura, por lo que se trata de un compuesto nuevo, mismo que fue nombrado como uasdlabdano B. Figura 8. Dibujo de perspectiva para EUO-2 a partir de los datos cristalográficos SUSTANCIA EUO-3 Esta sustancia se aisló de la fracción 9 de la cromatografía general de donde finalmente se le obtuvo en forma de líquido aceitoso. Mostró la fórmula molecular C20H30O4, según el análisis de masas de alta resolución (HRESIMS) en modo de ion positivo, indicando seis grados de insaturación. Su espectro de IR reveló la presencia de un grupo hidroxilo (3502 cm-1), una lactona (1741 cm-1) y un grupo cetónico (1707 cm-1). El espectro de 1H-RMN (Figura 9, Tabla 3) mostró, entre otras señales, la presencia de cinco grupos metilo, de los cuales cuatro aparecen como singuletes a δH 0.96 (Me-18), 0.92 (Me-19), 1.07 (Me-20), y 2.10 (Me-16), mientras que el quinto se muestra en forma de doblete a δH 1.14 (Me-17, J = 6.59 Hz). Además se observaron un protón hidroximetínico como singulete ancho a δH 3.53 (H-3) y un protón de olefina trisustituída como singulete a δH 5.80 (H-14). Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 96  Figura 9. Espectro de 1H-RMN (CDCl3, 800 MHz) de la sustancia EUO-3 El espectro de 13C-RMN (Tabla 3) mostró 20 señales, las cuales incluían 5 grupos metilo (δC 13.3, 13.5, 14.1, 21.5, 27.6), cuatro grupos metileno (δC 24.9, 31.6, 32.3, 38.1), seis grupos metino (δC 46.1, 47.2, 53.2, 75.2, 85.4, 117.1) y cinco carbonos cuaternarios (δC 37.7, 38.3, 168.1, 172.5, 211.9). El análisis de los espectros COSY y HMBC de esta sustancia (Figuras 10 y 11) revelaron que su estructura era similar a las de EUO-1 y EUO-2. Figura 10. Espectro gCOSY (CDCl3, 800 MHz) de la sustancia EUO-3 Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 97  Figura 11. Espectro gHMBC (CDCl3, 800 MHz) de la sustancia EUO-3 El espectro NOESY de las sustancia EUO-3 (Figura 12) mostró, entre otras, correlaciones entre Me-20/Me-18, Me-19/H-3, Me-19/Me-17, Me-17/H-9 y H-9/H-12 sugiriendo que Me-20 y Me19 están en caras opuestas del sistema decalina, mientras que H-3, H-9, H-12, Me-17 y Me-19 son cofaciales, sustentando así la estructura propuesta por nosotros. Una búsqueda bibliográfica (Sci-finder) reveló que este compuesto no se encuentra reportado en la literatura, por lo que se trata de un compuesto nuevo, mismo que fue nombrado como uasdlabdano C. Figura 12. Espectro NOESY (CDCl3, 800 MHz) de la sustancia EUO-3 Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 98  HO O O O H  Estructura química de EUO-3 SUSTANCIA EUO-4 La sustancia EUO-4 se aisló de la fracción 9 de la cromatografía general de donde finalmente se le consiguió en forma de líquido aceitoso. Mostró la fórmula molecular C22H32O5, según el análisis de masas de alta resolución (HRESIMS) en modo de ion positivo, indicando siete grados de insaturación. Su espectro de IR reveló la presencia de grupo hidroxilo (3514 y 3476 cm-1) y una lactona conjugada (1730 cm-1) entre otros. El espectro de 1H-RMN (Figura 13, Tabla 4) mostró, entre otras señales, la presencia de cinco grupos metilo, los que aparecen como singuletes a δH 0.71 (Me-20), 0.82 (Me-18), 0.92 (Me-19), 2.05 (COMe), y 2.09 (Me-16). También pudieron verse la presencia de un protón a δH 4.94 (H-17a) como doblete (J = 1.10) y otro protón a δH 5.27 (H-17b) como singulete, los cuales se asignaron a un grupo metilén exocíclico. Además se observaron un protón hidroximetínico como triplete a δH 3.46 (H-3, J = 2.47) y un protón de olefina trisustituída como singulete a δH 5.75 (H-14). Figura 13. Espectro de 1H-RMN (CDCl3, 500 MHz) de la sustancia EUO-4 Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 99  El espectro de 13C-RMN (Tabla 4) mostró 22 señales; 5 grupos metilo (δC 13.2, 14.8, 21.5, 21.8, 28.2), cinco grupos metileno (δC 25.8, 27.0, 28.6, 31.5, 113.3), seis grupos metino (δC 42.1, 47.5, 75.5, 75.9, 83.6, 113.3) y seis carbonos cuaternarios (δC 37.3, 39.5, 144.3, 169.2, 170.1, 172.9). El análisis de los espectros COSY y HMBC de esta sustancia (Figuras 14 y 15) revelaron que su estructura era similar a las de los tres compuestos anteriores (EUO-1, 2, 3), pero ahora incluyendo la presencia de un grupo acetato en C-7 y también mostrando en C-8, en lugar de un grupo metilo, un grupo metileno exocíclico, que aparece comúnmente en muchos diterpenos tipo labdano.76,77,78 Figura 14. Espectro gCOSY (CDCl3, 500 MHz) de la sustancia EUO-4  76Xiao, P.; Sun, C.; Zahid, M.; Ishrud, O.; Pan, Y. Fitoterapia. 2001, 72, 837-838.  77Chokchaisiri, R.; Chaneiam, N.; Svasti, S.; Fucharoen, S.; Vadolas, J.; Suksamrarn, A. J. Nat. Prod. 2010, 73, 724-728.  78Li. D. Z.; Tang, C.; Quinn, R. J.; Feng, Y.; Ke, C. Q.; Yao, S.; Ye, Y. J. Nat. Prod. 2013, 76, 1580-1585.  Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 100  Figura 15. Espectro gHMBC (CDCl3, 500 MHz) de la sustancia EUO-4 La configuración relativa de EUO-4 se estableció por medio de un experimento ROESY, donde se observaron (Figura 16) correlaciones entre Me-20/Me-18, Me-18/H-3, Me-20/H-6α (δH 1.63), H-6α/H-7, H-5/H-9 y H-9/H-12, de donde se dedujo que 3-OH, 7-OAc y H-12 eran cofaciales y orientados con configuración beta (β), sustentando así la estructura asignada. Una búsqueda bibliográfica (Sci-finder) reveló que este compuesto no se encuentra reportado en la literatura, por lo que se trata de un compuesto nuevo, mismo que fue nombrado como uasdlabdano D. Figura 16. Espectro ROESY (CDCl3, 500 MHz) de la sustancia EUO-4 Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 107  (Figura 25, Tabla 7) mostró, entre otras señales, la presencia de tres grupos metilo, los que aparecen como singuletes a δH 1.28 (Me-9), 1.48 (Me-10), 1.79 (Me-11). También pudieron verse, la presencia, como doble doblete ancho, de un protón a δH 1.54 (H-2a, J = 3.4, 14.7 Hz) y de otro protón, como doble triplete a δH 1.98 (H-2b, J = 2.5, 14.7 Hz). Los protones asignados a C-4 se observaron, uno como multiplete a δH 1.79 (H-4a) y el otro como doble triplete a δH 2.47 (H-4b, J = 2.5, 14.2 Hz). Además se observaron un protón hidroximetínico como quintuplete a δH 4.34 (H-3, J = 3.4), y un protón de olefina trisustituída como singulete a δH 5.70 (H-7). El espectro de 13C-RMN (Tabla 7) mostró 11 señales; tres grupos metilo (δC 26.28, 26.79, 30.45), dos grupos metileno (δC 45.40, 47.10), dos grupos metino (δC 66.64, 112.72) y cuatro carbonos cuaternarios (δC 35.71, 86.44, 171.30, 182.15). Los datos espectroscópicos de RMN antes mencionados, así como la espectrometría de masas de alta resolución (HRESIMS, modo de ion positivo) de EUO-7 fueron comparables con valores publicados para una sustancia conocida como loliólido.80 Estas asignaciones fueron confirmadas a su vez por los experimentos HSQC-DEPT y HMBC (Figuras 26 y 27). Figura 25. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 500 MHz) de la sustancia EUO-7  80He, Z.; Zhang, A.; Ding, L.; Lei, X.; Sun, J.; Zhang, L. Fitoterapia. 2010, 81, 1125-1128.  Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 108  Figura 26. Espectro HSQC-DEPT (CDCl3, 500 MHz) de la sustancia EUO-7 Figura 27. Espectro HMBC (CDCl3, 500 MHz) de la sustancia EUO-7 O O HO 1 3 11 9 10 67 8 5  Estructura química de EUO-7 Eupatorium obtusissmum Parte Experimental 109  5.2 Eupatorium obtusissmum. Parte Experimental. Material Vegetal Las partes aéreas de E. obtusissmum se colectaron en Noviembre de 2010 en Cabrera, Provincia María Trinidad Sánchez, República Dominicana. El material Vegetal fue identificado por el Lic. Teodoro Clase, botánico del Jardín Botánico Nacional “Dr. Rafael Ma. Moscoso”, Santo Domingo, República Dominicana, donde el voucher de espécimen JBSD 121705 (Figura 28) fue depositado. Figura 28. Voucher de espécimen JBSD 121705. E. obtusissmum Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 110   Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 111  Extracción y Aislamiento Las partes aéreas de E. obtusissmum se secaron al aire y a la sombra, y se trituraron hasta conseguir un polvo fino. El material pulverizado (372 g) se extrajo con EtOH 95% en un aparato Soxhlet hasta agotamiento. El extracto crudo resultante (57 g) se disolvió en EtOH 95% (500 mL) y se trató con una solución acuosa de acetato de plomo al 5% P/V (500 mL) para precipitar la clorofila. Después de 24 horas, la mezcla se filtró sobre papel, se concentró a vacío para remover la mayoría del EtOH, y se extrajo sucesivamente con hexano (4 × 500 mL) y con CH2Cl2 (3 × 500 mL). El residuo de CH2Cl2 se lavó con una solución acuosa de NaCl al 1% P/V, y se secó sobre Na2SO4 anhidro obteniéndose 4.4 g de extracto soluble en CH2Cl2 el cual fue sometido a cromatografía sobre una columna de gel de sílice (0.040-0.063 mm) y eluido con mezclas de hexano-acetato de etilo con polaridad creciente consiguiéndose 10 fracciones (F1F10). La fracción 7 (186 mg) se sometió a cromatografía sobre una columna de gel de sílice (0.015-0.040 mm) con mezclas de hexano-acetona con polaridad creciente para dar 23 subfracciones. La subfracción F7-12 (16 mg) se trató con HPLC semipreparativo (MeCN/H2O, 19-52%, a 4 mL/min, columna Phenomenex semipreparativa, 4μm, 10 mm × 250 mm, RP synergi-hydro C18aq) obteniéndose las sustancias EUO-6 (0.5 mg) y EUO-7 (1.0 mg). Una parte de la fracción 8 (394.6 mg) se sometió a cromatografía sobre una columna de gel de sílice (0.015-0.040 mm) con mezclas de hexano-acetona de polaridad creciente consiguiéndose 52 subfracciones. La subfracción F8-4 (10.5 mg) se sometió a una cromatografía preparativa en capa fina sobre una placa de gel de sílice, empleando una mezcla de éter etílico-acetato de etilo (7:3), obteniéndose la sustancia EUO-5 (0.5 mg). La subfracción F8-10 (13 mg) se trató con HPLC semipreparativo (MeCN/H2O, 30-60%, a 5 mL/min, columna Phenomenex, 4μm, 10 mm × 250 mm, RP synergi-hydro C18aq) obteniéndose la sustancia EUO-2 (0.4 mg). La fracción 9 (611.4 mg) se sometió a cromatografía sobre una columna de gel de sílice (0.015-0.040 mm) con mezclas de hexano-acetona de polaridad creciente consiguiéndose 66 subfracciones. Las subfracciones desde F9-10 a F9-14 se reagruparon según su perfil observado en TLC (149.9 mg) y se trataron con HPLC semipreparativo (MeCN/H2O, 40%, a 5 mL/min, columna Phenomenex 5μm, 10 mm × 250 mm, Luna C18(2)) obteniéndose las sustancias EUO-1 (22 mg) y EUO-4 (0.5 mg). La subfracción F9-20 (7.4 mg) se sometió a HPLC semipreparativo (MeCN/H2O, 1555%, a 4 mL/min, columna Phenomenex 4μm, 10 mm × 250 mm, RP synergi-hydro C18aq) obteniéndose la sustancia EUO-3 (0.5 mg). Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 112  El siguiente cuadro resume el trabajo cromatográfico realizado sobre el extracto de diclorometano de E. obtusissmum. ORGANIGRAMA DE FRACCIONES FRACCIONES ELUYENTES SUSTANCIAS FRACCIÓN 1 HEXANOAcOEt 10% FRACCIÓN 2 HEXANOAcOEt 20% FRACCIÓN 3 HEXANOAcOEt 30% FRACCIÓN 4 HEXANOAcOEt 40% FRACCIÓN 5 HEXANOAcOEt 50% FRACCIÓN 6 HEXANOAcOEt 60% FRACCIÓN 7 HEXANOAcOEt 70% EUO-6, EUO-7 FRACCIÓN 8 HEXANOAcOEt 80% EUO-2, EUO-5 FRACCIÓN 9 HEXANOAcOEt 90% EUO-1, EUO-3, EUO-4 FRACCIÓN 10 AcOEt 100% Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 113  Análisis Cristalográfico de rayos-X de las sustancias EUO-1 y EUO-2 Los datos de difracción de rayos-X para EUO-1 y EUO-2 se midieron en un sistema Bruker D8 Venture PHOTON 100 CMOS equipado con una fuente micro-foco INCOATEC Imus de Cu Kα (λ = 1.54178 Å). La indexación se llevó a cabo usando APEX281 (método de Diferencia de Vectores). La integración de los datos y la reducción se llevaron a cabo usando SaintPlus 6.0182. La corrección de la absorción se llevó a cabo por un método multi-scan implementado in SADABS83. Los grupos espaciales fueron determinados usando XPREP implementado en APEX2. La estructura se resolvió usando SHELXS-97 84 (métodos directos) y fue refinada usando SHELXL-201585 (matriz completa de mínimos cuadrados en F2) a través del programa de interfaz OLEX286. Todos los átomos distintos del hidrógeno fueron refinados anisotrópicamente. Los átomos de hidrógeno de los grupos -CH, -CH2 y -CH3 se colocaron en posiciones geométricamente calculadas y fueron incluidos en el proceso de refinamiento usando un modelo que trabaja con los siguientes parámetros térmicos: Uiso(H) = 1.2(1.5)Ueq(-CH,- CH2(-CH3)). Los átomos de hidrógeno de los grupos –OH se han encontrado a partir de la diferencia de mapa de Fourier y fueron refinados libremente. Para EUO-1 los átomos de hidrógeno de la molécula de agua fueron encontrados a partir de la diferencia de mapa de Fourier y fueron refinados usando las restricciones SADI y DANG.  81 Bruker AXS Inc. Madison, Wisconsin, USA. APEX2 (Version 2013. 6-2). 2014.  82 Bruker AXS Inc. Madison, Wisconsin, USA. SAINT-V8.32A. Data Reduction Software. 2013.  83Sheldrick, G. M. SADABS. Program for Empirical Absorption Correction. University of Göttingen: Göttingen, Germany, 1996.  84Sheldrick, G. M. Acta Cryst. 2008, 64, 112-122.  85Sheldrick, G. M. Acta Cryst. 2015, C71, 3-8.  86Dolomanov, O. V.; Bourhis, L. J.; Gildea, R. J.; Howard, J. A. K.; Puschmann, H. J. Appl. Crystallogr. 2009, 42, 339-341.  Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 114  Datos cristalográficos de rayos-X para EUO-1: C20H32O5 (formula molecular C20H30O4∙H2O), pf 352.45, ortorrómbico, tamaño de cristal 0.22 × 0.13 × 0.03 mm3, grupo espacial P212121, a = 7.2954(2) Å, b = 15.3248(3) Å, c = 16.6251(4) Å, V = 1858.70(8) Å3, Z = 4, T = 100.0 K, Dcalcd = 1.260 g/cm3, μ = 0.719 mm-1, F(000) = 768.0, reflecciones colectadas 22553 (7.846º ≤ 2Θ ≤ 137.936º), reflexiones independientes 3443 (Rint = 0.0773, Rsigma = 0.0422), índices R finales para I ≥ 2σ(I), R1 = 0.0375, wR2 = 0.0920, índices R finales para todos los datos R1 = 0.0419, wR2 = 0.0951, la bondad-de-ajuste sobre F2 es 1.049, y el parámetro Flack 0.07(10). Los datos cristalográficos para EUO-1 se han depositado en el Cambridge Crystallographic Data Center (CCDC) con el depósito no. CCDC 1428964. Datos cristalográficos de rayos-X para EUO-2: C20H30O4, pf 334.44, ortorrómbico, tamaño del cristal 0.08 × 0.05 × 0.04 mm3, grupo espacial P212121, a = 8.3265(2) Å, b = 12.4915(4) Å, c = 17.0449(5) Å, V = 1772.85(9) Å3, Z = 4, T = 99.99 K, Dcalcd = 1.253 g/cm3, μ = 0.684 mm-1, F(000) = 728.0, reflexiones colectadas 8468 (8.776º ≤ 2Θ ≤ 133.188º), reflecciones independientes 2937 (Rint = 0.0402, Rsigma = 0.0422), índices R finales para I ≥ 2σ(I), R1 = 0.0392, wR2 = 0.0868, índices R finales para todos los datos R1 = 0.0493, wR2 = 0.0918, la bondad-de-ajuste sobre F2 es 1.065, y el parámetro Flack -0.02(15). Los datos cristalográficos para EUO-2 se han depositado en el Cambridge Crystallographic Data Center (CCDC) con el depósito no. CCDC 1428963. Los datos físicos y espectroscópicos de las sustancias aisladas se exponen a continuación: Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 115  Diterpenos: Datos físicos de la sustancia EUO-1 (Uasdlabdano A). Sólido Cristalino (MeCN/H2O). [α]20D +72.00 (c 0.1, CHCl3). UV (EtOH) λmáx: (log ε) 210 (0.41) nm. IR νmáx: 3499, 2992, 2944, 2925, 2877, 1722, 1700, 1644, 1182, 1067, 851 cm-1. HRESIMS m/z: 357.2046 [M + Na]+ (calcd para C20H30O4Na, 357.2042). Tabla 1. Datos de RMN (CDCl3, 1H 500 MHz; 13C 125 MHz) para EUO-1 Posición δ 13C (ppm) DEPT δ 1H (ppm) Multiplicidad J (Hz) 1 31.6 CH2 1.44 1.74 m m - - 2 24.9 CH2 1.70 1.97 m m - - 3 75.1 CH 3.52 m - 4 37.7 C - - - 5 46.1 CH 1.91 dd 4.7, 13.5 6 38.1 CH2 2.36 m - 7 212.0 C - - - 8 47.1 CH 2.14 m - 9 53.2 CH 1.68 m - 10 38.3 C - - - 11 32.2 CH2 1.22 2.07 dd m 2.9, 4.9 - 12 85.4 CH 4.79 br d 10.8 13 168.3 C - - - 14 117.0 CH 5.79 s - 15 172.6 C - - - 16 14.1 CH3 2.09 s - 17 13.4 CH3 1.11 d 6.4 18 21.5 CH3 0.91 s - 19 27.6 CH3 0.95 s - 20 13.3 CH3 1.06 s - HO O O O H 1 2 345 67 817 9 10 20 11 12 13 14 15 16 18 19 Tesis Doctoral Quírico A. Castillo P. 116  Datos físicos de la sustancia EUO-2 (Uasdlabdano B). Sólido Cristalino (MeCN/H2O). [α]24D +7.53 (c 0.04, CHCl3). UV (MeCN) λmáx: (log ε) 207 (0.26) nm. IR νmáx: 3454, 2925, 2858, 1726, 1514, 1461, 1298, 1249, 1160, 1048, 996, 836 cm-1. HRESIMS m/z: 335.2217 [M + H]+ (calcd para C20H31O4, 335.2222). Tabla 2. Datos de RMN (CDCl3, 1H 500 MHz; 13C 125 MHz) para EUO-2 Posición δ 13C (ppm) DEPT δ 1H (ppm) Multiplicidad J (Hz) 1 30.9 CH2 1.40 1.69 m m - - 2 25.2 CH2 1.66 1.93 m m - - 3 75.2 CH 3.50 s - 4 38.0 C - - - 5 46.5 CH 1.92 m - 6 37.9 CH2 2.35 m - 7 211.8 C - - - 8 48.4 CH 2.35 m - 9 53.1 CH 1.69 m - 10 37.6 C - - - 11 33.7 CH2 1.63 m - 12 84.8 CH 4.77 br d 10.9 13 168.3 C - - - 14 117.1 CH 5.81 s - 15 172.7 C - - - 16 14.0 CH3 2.10 s - 17 13.8 CH3 1.19 d 6.8 18 21.5 CH3 0.89 s - 19 27.7 CH3 0.96 s - 20 13.6 CH3 0.99 s - HO O O O H 123  6. EUPATORIUM ILLITUM URB. Eupatorium illitum Parte Teórica  124   Eupatorium illitum Parte Teórica  125  6.1 Eupatorium illitum. Parte Teórica. Eupatorium illitum Urb. (Asteraceae) es una especie endémica de la isla La Española. Es un arbusto de hasta 3 m, con ramitas resinosas, pardas; hojas aovado-elípticas a elípticas o aovadolanceoladas, de 5-13 por 2.5-5 cm, obtusas en la base, estrechadas hacia el ápice obtuso o agudo, raras veces corto-acuminado, penninervias, los nervios laterales 8-9 pares, reticuladoanastomosados, promínulos en el haz, prominentes en el envés, el margen aserrado, glabras, glandulosas en ambas caras; inflorescencias corimbosas de 4-6 cm de diámetro; cabezuelas de 6 mm con 14-16 flósculos, brácteas involucrales subbiseriadas, lineares, de hasta 4 mm, 1-3nervias, obtusas a subtruncadas en el ápice, fimbriado-denticuladas en el margen, glandulosas dorsalmente; corola blanca de 4 mm; aquenios de 2.5 mm, glandulosos, vilano de 3 mm. Es algo frecuente en bosques de pinos a 1,200-2600 m de altura. En la República Dominicana se le encuentra en la Cordillera Central y la Sierra de Bahoruco. Del residuo de acetato de etilo (10.7 g) proveniente del extracto etanólico de E. illitum, se pudieron aislar, empleando los procedimientos cromatográficos descritos en la parte experimental, cinco sustancias (EUI 1-5), que, de acuerdo con sus estructuras químicas, resultaron ser cuatro flavonoides y un derivado del ácido benzoico. Todos los compuestos aislados se encuentran reportados previamente en la literatura y se describen a continuación. Eupatorium illitum Parte Teórica  126  SUSTANCIA EUI-1. Esta sustancia se aisló de la fracción 15 de la cromatografía general de donde finalmente se le obtuvo en forma de un sólido amarillo. Mostró la fórmula molecular C17H14O6, según el análisis de masas de alta resolución (HRESIMS) en modo de ion negativo, indicando once grados de insaturación. Su espectro de IR reveló la presencia de grupos hidroxilo (3236 cm-1), grupo carbonilo conjugado (1656 cm-1), y aromaticidad (1600, 1583, 1497 cm-1). Los desplazamientos UV contribuyeron a la elucidación estructural de la molécula y se presentan a continuación. Tabla 8. Espectro UV de (EUI-1) Disolvente Banda I (nm) Banda II (nm) Asignación MeOH 352 302 i Flavonol No 2OR en anillo B MeOH/NaOMe 394 281 303 i 4´- OH MeOH/AlCl3 396 281 302 i ---- MeOH/AlCl3/HCl 395 284 302 i 5 – OH MeOH/NaOAc 345 285 303i No 7 – OH MeOH/NaOAc/H3BO3 345 305 ----- El espectro de 1H-RMN (Figura 29, Tabla 12) mostró, entre otras señales, un singulete a δH 12.69, el cual se asignó a un grupo hidroxilo fenólico sobre C-5 y un singulete ancho a δH 10.31, mismo que se asignó a un grupo hidroxilo sobre C-4´; dos dobletes a δH 7.99 (J= 8.9 Hz) y 6.97 (J= 8.6 Hz) ambos con intensidad de dos protones, que denotan la existencia de un anillo aromático disustituído en posición para y que se asignaron al anillo B del flavonoide; dos dobletes a δH 6.76 (J= 1.6 Hz) y 6.39 (J= 1.6 Hz) que integran a un protón cada uno. Además pudo observarse la presencia de dos grupos metoxilo, los que aparecen como singuletes a δH 3.87 (7-OMe), y 3.81 (3-OMe). Eupatorium illitum Parte Teórica  127  Figura 29. Espectro de 1H-RMN (DMSO-d6, 700 MHz) de la sustancia EUI-1 El espectro de 13C-RMN (Tabla 12) mostró 15 señales, las cuales, con ayuda de los experimentos DEPT 90 y 135 se clasificaron como dos grupos metoxilo (δC 56.6, 60.2), cuatro grupos metino (δC 92.8, 98.2, 116.1, 130.7) y nueve carbonos cuaternarios (δC 105.7, 120.9, 138.3, 156.4, 156.8, 160.8, 161.4, 178.5). Los datos espectroscópicos antes presentados fueron similares a los publicados para el flavonoide conocido como kumatakenina.87, 88 Las asignaciones se confirmaron con los experimentos COSY, HSQC y HMBC. O OH O OH OMe MeO  Kumatakenina  87Zhang, X.; Li, B.; Zhou, M.; Yuan, X.; Zhang, G. Chin. J. Appl. Environ. Biol. 2006, 12, 338-341.  88Villaflores, O. B.; Macabeo, A. P. G.; Gehle, D.; Krohn, K.; Franzblau, S. G.; Aguinaldo, A. M. Phcog. Mag. 2010, 6, 339-344.  Eupatorium illitum Parte Teórica  128  SUSTANCIA EUI-2. Esta sustancia también se aisló de la fracción 15 de la cromatografía general como un sólido de color amarillo, e igual que la anterior, presentó la fórmula molecular C17H14O6, según el análisis de masas de alta resolución (HRESIMS) en modo de ion negativo, indicando once grados de insaturación. Su espectro de IR reveló la presencia de grupos hidroxilo (3130 cm-1), carbonilo conjugado (1650 cm-1), y bandas correspondientes a anillos aromáticos (1604, 1498 cm-1). Los desplazamientos UV contribuyeron a la elucidación estructural de la molécula y se presentan a continuación. Tabla 9. Espectro UV de (EUI-2) Disolvente Banda I (nm) Banda II (nm) Asignación MeOH 350 284 292 i Flavonol No 2 OR en anillo B MeOH/NaOMe 400 287 302 i 4´- OH MeOH/AlCl3 402 289 302i 5 – OH MeOH/AlCl3/HCl 401 289 303 i No OH en orto MeOH/NaOAc 367 290 302 i 7 – OH MeOH/NaOAc/H3BO3 350 294 ---- El espectro de 1H-RMN (Figura 30, Tabla 13) mostró un singulete a δH 12.65, el cual se asignó a un grupo hidroxilo fenólico sobre C-5; dos dobletes a δH 8.03 (J= 8.8 Hz) y 7.14 (J= 9.1 Hz) ambos con intensidad de dos protones, los que sugieren la presencia de un anillo aromático disustituído en posición para, asignados al anillo B del flavonoide; dos dobletes a δH 6.46 (J= 1.7 Hz) y 6.21 (J= 1.9 Hz) que integran a un protón cada uno y además pudieron observarse la presencia de dos grupos metoxilo, los que aparecen como singuletes a δH 3.87 (4´-OMe), y 3.80 (3-OMe). Eupatorium illitum Parte Teórica  129  Figura 30. Espectro de 1H-RMN (DMSO-d6, 700 MHz) de la sustancia EUI-2 El espectro de 13C-RMN (Tabla 13) mostró 15 señales, las cuales, con ayuda de los experimentos DEPT 90 y 135 se clasificaron como dos grupos metoxilo (δC 55.5, 59.8), cuatro grupos metino (δC 93.9, 98.7, 114.3, 130.0) y nueve carbonos cuaternarios (δC 104.2, 122.2, 138.0, 155.2, 156.5, 161.3, 161.4, 178.0). Los datos espectroscópicos antes presentados fueron similares a los publicados para el flavonoide conocido como ermanina.89, 90 Las asignaciones se confirmaron con los experimentos COSY, HSQC y HMBC. O OH O OMe OMe HO  Ermanina  89Calvert, D. J.; Cambie, R. C.; Davis, B. R. Org. Magn. Reson. 1979, 12, 583-586.  90Kim, B. G.; Kim, H.; Kim, J. H.; Lim, Y.; Ahn, J. H. Bull. Korean Chem. Soc. 2006, 27, 357-358.  Eupatorium illitum Parte Teórica  130  SUSTANCIA EUI-3. Esta sustancia se aisló de la fracción 16 de la cromatografía general como un sólido de color amarillo. Presentó la fórmula molecular C16H14O6, según el análisis de masas de alta resolución (HRESIMS) en modo de ion negativo, indicando diez grados de insaturación. Su espectro de IR reveló la presencia de grupos hidroxilo (3144 cm-1), carbonilo (1716 cm-1), y bandas correspondientes a anillos aromáticos (1616, 1573, 1443 cm-1). Los desplazamientos UV contribuyeron a la elucidación estructural de la molécula y se presentan a continuación. Tabla 10. Espectro UV de (EUI-3) Disolvente Banda II (nm) Asignación MeOH 292 325 i dihidroflavonol No 2 OR en anillo B MeOH/NaOMe 395 281 306 i 4´- OH MeOH/AlCl3 278 306 i 5 – OH MeOH/AlCl3/HCl 279 306 i No OH en orto MeOH/NaOAc 291 305 i No 7 – OH MeOH/NaOAc/H3BO3 279 303 i ----- En el espectro de 1H-RMN (Figura 31, Tabla 14) pueden verse dos singuletes a δH 11.88 y 9.57, que se asignaron a grupos hidroxilo fenólicos sobre C-5 y C-4´ respectivamente; dos dobletes a δH 7.33 (J= 8.2 Hz) y 6.80 (J= 8.5 Hz) ambos con intensidad de dos protones, los que sugieren la presencia de un anillo aromático disustituído en posición para, y que asignamos al anillo B del flavonoide; cuatro dobletes a δH 6.12 (J = 2.1 Hz), 6.10 (J = 1.9 Hz), 5.82 (J = 6.4 Hz) y 5.11 (J = 11.3 Hz) todos los que integran a un protón cada uno. Además se observaron un doble doblete a δH 4.66 (J = 6.3, 11.5 Hz) y un grupo metoxilo como singulete a δH 3.79 (7-OMe). Eupatorium illitum Parte Teórica  131  Figura 31. Espectro de 1H-RMN (DMSO-d6, 700 MHz) de la sustancia EUI-3 El espectro de 13C-RMN (Tabla 14) mostró 15 señales, las que, empleando los experimentos DEPT 90 y 135 fueron clasificadas como un grupo metoxilo (δC 56.4), seis grupos metino (δC 72.0, 83.5, 94.3, 95.4, 115.4, 130.0) y siete carbonos cuaternarios (δC 101.8, 127.9, 158.2, 163.0, 163.4, 168.0, 199.0). Los datos espectroscópicos antes presentados fueron similares a los publicados para el flavonoide conocido como 7-metoxi-aromadendrín.91 Las asignaciones se confirmaron con los experimentos COSY, HSQC y HMBC. O OH O OH OH MeO  7-metoxi-aromadendrín  91Chiappini, I.; Fardella, G.; Menghini, A.; Rossi, C. Planta Med. 1982, 44, 159-161.  Eupatorium illitum Parte Teórica  132  SUSTANCIA EUI-4. Esta sustancia también se aisló de la fracción 16 de la cromatografía general como un sólido de color amarillo. Presentó la fórmula molecular C15H12O5, según el análisis de masas de alta resolución (HRESIMS) en modo de ion negativo, indicando diez grados de insaturación. Su espectro de IR reveló la presencia de grupos hidroxilo (3115 cm-1), carbonilo (1627 cm-1), y bandas correspondientes a anillos aromáticos (1600, 1586, 1496 cm-1). Los desplazamientos UV contribuyeron a la elucidación estructural de la molécula y se presentan a continuación. Tabla 11. Espectro UV de (EUI-4) Disolvente Banda II (nm) Asignación MeOH 288.5 350.0 i Flavanona MeOH/NaOMe 332.0 245.5 i 5 – OH 7 - OH MeOH/AlCl3 309.5 371.0 i --- MeOH/AlCl3/HCl 309.5 369.5 i 5 – 0H MeOH/NaOAc 325.0 --- MeOH/NaOAc/H3BO3 289.0 --- En el espectro de 1H-RMN (Figura 32, Tabla 15) pueden verse un singulete a δH 12.16 el cual se asignó a un grupo hidroxilo en C-5, dos singuletes anchos a δH 10.80 y 9.59, que se asignaron a grupos hidroxilo fenólicos sobre C-7 y C-4´ respectivamente; dos dobletes a δH 7.32 (J= 8.5 Hz) y 6.80 (J= 8.3 Hz) ambos con intensidad de dos protones, los que sugieren la presencia de un anillo aromático disustituído en posición para, y que asignamos al anillo B del flavonoide; un singulete a δH 5.88 que integró a dos protones y cuya asignación correspondió a C-6 y C-8. Además se observaron tres dobles dobletes a δH 5.45 (J = 2.8, 12.8 Hz), 3.28 (J = 12.9, 17.0 Hz), y 2.69 (J = 2.9, 17.1 Hz) todos los que integran a un protón cada uno. Eupatorium illitumParte Experimental  139  FLAVONOIDES: Datos físicos de la sustancia EUI-1 (Kumatakenina). Sólido Amarillo.  IR νmáx 3236, 2948, 2362, 2337, 1656, 1600, 1583, 1497 cm-1. HRESIMS m/z: 313.0663 [M – H]- (calcd para C17H13O6, 313.0712). Tabla 12. Datos de RMN (DMSO-d6, 1H, 700 MHz; 13C, 175 MHz) para EUI-1 Posición δ 13C (ppm) DEPT δ 1H (ppm) Multiplicidad J (Hz) 2 156.4 C - - - 3 138.3 C - - - 4 178.5 C - - - 5 161.4 C - - - 6 98.2 CH 6.39 d 1.6 7 165.6 C - - - 8 92.8 CH 6.76 d 1.6 9 156.8 C - - - 10 105.7 C - - - 1´ 120.9 C - - - 2´, 6´ 130.7 CH 7.99 d 8.9 3´, 5´ 116.1 CH 6.97 d 8.6 4´ 160.8 C - - - 3-OMe 60.2 CH3 3.81 s - 7-OMe 56.6 CH3 3.87 s - 5-OH - - 12.69 s - 4´-OH - - 10.31 br s -        O OH OOH OMe MeO 2 4 2´ 5´ 1´ 9 7 5 Eupatorium illitumParte Experimental  140  Datos físicos de la sustancia EUI-2 (Ermanina). Sólido Amarillo.  IR νmáx 3130, 2936, 2840, 2361, 2050, 1650, 1604, 1498 cm-1. HRESIMS m/z: 313.0706 [M – H]- (calcd para C17H13O6, 313.0712). Tabla 13. Datos de RMN (DMSO-d6, 1H, 700 MHz; 13C, 175 MHz) para EUI-2 Posición δ 13C (ppm) DEPT δ 1H (ppm) Multiplicidad J (Hz) 2 155.2 C - - - 3 138.0 C - - - 4 178.0 C - - - 5 161.3 C - - - 6 98.7 CH 6.21 d 1.9 7 164.4 C - - - 8 93.9 CH 6.46 d 1.7 9 156.5 C - - - 10 104.2 C - - - 1´ 122.2 C - - - 2´, 6´ 130.0 CH 8.03 d 8.8 3´, 5´ 114.3 CH 7.14 d 9.1 4´ 161.4 C - - - 3-OMe 59.8 CH3 3.80 s - 4´-OMe 55.5 CH3 3.87 s - 5-OH - - 12.65 s -          O OMe OOH OMe HO Eupatorium illitumParte Experimental  141  Datos físicos de la sustancia EUI-3 (7-Metoxi-aromadendrín). Sólido Amarillo.  IR νmáx 3144, 2939, 2258, 1716, 1636, 1616, 1595, 1573, 1501, 1443 cm-1. HRESIMS m/z: 301.0717 [M – H]- (calcd para C16H13O6, 301.0712). Tabla 14. Datos de RMN (DMSO-d6, 1H, 700 MHz; 13C, 175 MHz) para EUI-3 Posición δ 13C (ppm) DEPT δ 1H (ppm) Multiplicidad J (Hz) 2 83.5 CH 5.11 d 11.3 3 72.0 CH 4.66 dd 6.3, 11.5 4 199.0 C - - - 5 163.4 C - - - 6 95.4 CH 6.12 d 2.1 7 168.0 C - - - 8 94.3 CH 6.10 d 1.9 9 163.0 C - - - 10 101.8 C - - - 1´ 127.9 C - - - 2´, 6´ 130.0 CH 7.33 d 8.2 3´, 5´ 115.4 CH 6.80 d 8.5 4´ 158.2 C - - - 7-OMe 56.4 CH3 3.79 s - 3-OH - - 5.82 d 6.4 5-OH - - 11.88 s - 4´-OH - - 9.57 s -          O OH OOH OH MeO Eupatorium illitumParte Experimental  142  Datos físicos de la sustancia EUI-4 (Naringenina). Sólido Amarillo.  IR νmáx 3115, 3055, 2919, 2831, 2700, 2349, 2286, 2051, 1898, 1627, 1600, 1586, 1519, 1496 cm-1. HRESIMS m/z: 271.0603 [M – H]- (calcd para C15H11O5, 271.0606). Tabla 15. Datos de RMN (DMSO-d6, 1H, 700 MHz; 13C, 175 MHz) para EUI-4 Posición δ 13C (ppm) DEPT δ 1H (ppm) Multiplicidad J (Hz) 2 78.9 CH 5.45 dd 2.8, 12.8 3 42.4 CH2 2.69 (cis) 3.28 (trans) dd dd 2.9, 17.1 12.9, 17.0 4 196.8 C - - - 5 163.9 C - - - 6 96.3 CH 5.88 s - 7 167.2 C - - - 8 95.5 CH 5.88 s - 9 163.4 C - - - 10 102.2 C - - - 1´ 129.3 C - - - 2´, 6´ 128.8 CH 7.32 d 8.5 3´, 5´ 115.6 CH 6.80 d 8.3 4´ 158.2 C - - - 5-OH - - 12.16 s 7-OH - - 10.80 br s - 4´-OH - - 9.59 br s -         O OH OOH HO Eupatorium illitumParte Experimental  143  Datos físicos de la sustancia EUI-5 (Ácido 4-hidroxibenzoico). Sólido blanco.  IR νmáx 3400, 2255, 2128, 1654, 1049, 1023, 999, 824, 762, 625, 614 cm-1. HRESIMS m/z: 137.0242 [M – H]- (calcd para C7H5O3, 137.0239). Tabla 16. Datos de RMN (DMSO-d6, 1H, 700 MHz; 13C, 175 MHz) para EUI-5 Posición δ 13C (ppm) DEPT δ 1H (ppm) Multiplicidad J (Hz) 1 121.8 C - - - 2, 6 132.0 CH 7.79 d 8.5 3, 5 115.6 CH 6.82 d 8.7 4 162.0 C - - - COOH 167.6 C - - - OH COOH 144             7. EUPATORIUM DICTYONEURUM URB. Tesis DoctoralQuírico A. Castillo P.  146   Tesis DoctoralQuírico A. Castillo P.  147  7.1 Eupatorium dictyoneurum. Parte Teórica. Eupatorium dictyoneurum Urb. (Asteraceae) es una especie endémica de la isla La Española. Es un arbusto de hasta 2 m, las ramitas resinosas, glabras; hojas oblongo-lanceoladas a lanceolineares de 5-11 por 1.5-3.5 cm, penninervias, densamente reticuladas, los nervios laterales 9-12 de cada lado, el margen denticulado a dentado o subentero, obtusas a redondeadas en la base, estrechadas hacia el ápice y largo-acuminadas, glabras, glandulosas en el envés; inflorescencia de 3-5 cm, las cabezuelas de 6.5-7 mm, brácteas involucrales en una serie, lineares, 5-6, obtusas a redondeadas en el ápice, de 3-4 mm, denticeladas en el ápice, glabras o pelositas y glandulosas, 3-5-nervias; corola blancuzca de 4-5 mm, aquenios de 2.5 mm, 5-acostillados, pelositos; vilano de 3 mm. Se encuentra en bosques de montañas, entre los 400 y 1,600 metros de altura. En la República Dominicana es frecuente en la Cordillera Central, Sierra de Neiba y Sierra del Bahoruco. Tal y como se describe en la parte experimental, la extracción de esta planta se realizó con etanol hasta agotamiento y posterior tratamiento del extracto, del que obtuvimos un material de aspecto siruposo que por posterior cromatografía en columna empleando mezclas de polaridad creciente, dio como resultado la siguiente relación de sustancias cuyo estudio pasamos a describir, en función de sus relaciones estructurales. FLAVONOIDES: EUD 1-7. DITERPENOS: EUD 8-10. Tesis DoctoralQuírico A. Castillo P.  148  FLAVONOIDES. Sustancia EUD-1. De la fracción 27-38 de la cromatografía general se obtuvo un sólido cristalino de con un punto de fusión de 240-245ºC, y que en cromatografía de capa fina y tras revelado con óleum presenta una coloración amarilla. Su espectro de masas presenta el ion molecular a m/z 340 que se corresponde con una fórmula empírica C16H12O6. Su espectro UV presenta dos bandas de absorción características a 350.5 nm (banda I) y 268.5 (banda II), que mediante la prueba realizada adicionando NaOH donde se observaba que el color amarillo se intensificaba puso de manifiesto la naturaleza flavonoide del compuesto y en particular un flavonol. La adición de reactivos de desplazamiento (ver tabla adjunta) nos permitió asignar la posición de los grupos hidroxilo en la molécula. Tabla 17. Espectro UV de (EUD-1) Disolvente Banda I (nm) Banda II (nm) Asignación MeOH 358.0 260.0 Flavonol No 2 OR en anillo B MeOH/NaOMe 417.0 263.0 3 - OH MeOH/AlCl3 421.0; 353.0 262.0 3 - OH 5 - OH MeOH/AlCl3/HCl 421.0; 353.0 267.0 3 - OH 5 - OH MeOH/NaOAc 361.0 263.0 No 7 - OH MeOH/NaOAc/H3BO3 361.0 265.0 --- En el espectro de 1H-RMN (Figura 35, Tabla 22) presentar las siguientes señales: un singulete ancho a H 12.48 el cual asignamos a un grupo hidroxilo fenólico en posición C-5; dos dobletes a H 8.09 (J = 7.2 Hz) y 6.94 (J = 7.2 Hz) de intensidad dos protones cada uno, característicos de un anillo aromático sustituido en posición para; dos dobletes a H 6.74 (J = 1.76 Hz) y 6.35 (J =