Estudio etiopatogénico del circovirus porcino tipo 2 asociado a virus y bacterias en una infección natural

Estudio Etiopatogénico del Circovirus Porcino Tipo 2 Asociado a Virus y Bacterias en una Infección Natural I. Óscar Quesada Canales Las Palmas de Gran Canaria Julio 2015 Tesis Doctoral Anexo II UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA Departamento: Instituto Universitario de Sanidad Animal y Seguridad Alimentaria. Programa de Doctorado: Sanidad y Patología Animal Título de la Tesis “ESTUDIO ETIOPATOGÉNICO DEL CIRCOVIRUS PORCINO TIPO 2 ASOCIADO A VIRUS Y BACTERIAS EN UNA INFECCIÓN NATURAL” Tesis Doctoral presentada por: D. I. Óscar Quesada Canales Dirigida por la Dra. Marisa Andrada y codirigida por el Dr. Antonio Fernández El Director, El Codirector, El Doctorando Las Palmas de Gran Canaria, a 15 de mayo de 2015 UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA FACULTAD DE VETERINARIA DIVISIÓN DE HISTOLOGÍA Y PATOLOGÍA ANIMAL INSTITUTO UNIVERSITARIO DE SANIDAD ANIMAL Y SEGURIDAD ALIMENTARIA PROGRAMA DE DOCTORADO DE SANIDAD Y PATOLOGÍA ANIMAL “ESTUDIO ETIOPATOGÉNICO DEL CIRCOVIRUS PORCINO TIPO 2 ASOCIADO A VIRUS Y BACTERIAS EN UNA INFECCIÓN NATURAL” I.Óscar Quesada Canales Las Palmas de Gran Canaria, mayo de 2015 UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA FACULTAD DE VETERINARIA DIVISIÓN DE HISTOLOGÍA Y PATOLOGÍA ANIMAL INSTITUTO UNIVERSITARIO DE SANIDAD ANIMAL Y SEGURIDAD ALIMENTARIA PROGRAMA DE DOCTORADO: SANIDAD Y PATOLOGÍA ANIMAL “ESTUDIO ETIOPATOGÉNICO DEL CIRCOVIRUS PORCINO TIPO 2 ASOCIADO A VIRUS Y BACTERIAS EN UNA INFECCIÓN NATURAL” Tesis doctoral presentada por D. I. Óscar Quesada Canales para optar al grado de Doctor en Veterinaria. Fdo: I. Óscar Quesada Canales Las Palmas de Gran Canaria, mayo de 2015 MARISA ANDRADA BORZOLLINO, PROFESORA CONTRATADA DOCTORA DE UNIVERSIDAD DEL ÁREA DE CONOCIMIENTO DE ANATOMÍA Y ANATOMÍA PATOLÓGICA COMPARADAS DEL DEPARTAMENTO DE MORFOLOGÍA DE LA FACULTAD DE VETERINARIA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA. INFORMA: Que D. I. Óscar Quesada Canales, Licenciado en Veterinaria, ha realizado bajo mi dirección y asesoramiento el presente trabajo titulado “Estudio Etiopatogénico del Circovirus Porcino Tipo 2 Asociado a Virus y Bacterias en una Infección Natural”, el cual considero reúne las condiciones y calidad científica para optar al grado de Doctor en Veterinaria. FDO.: DRA. MARISA ANDRADA LAS PALMAS DE GRAN CANARIA, MAYO DE 2015 ANTONIO FERNÁNDEZ RODRÍGUEZ, CATEDRÁTICO DE UNIVERSIDAD DEL ÁREA DE CONOCIMIENTO DE ANATOMÍA Y ANATOMÍA PATOLÓGICA COMPARADAS DEL DEPARTAMENTO DE MORFOLOGÍA DE LA FACULTAD DE VETERINARIA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA. INFORMA: Que D. I. Óscar Quesada Canales,, Licenciado en Veterinaria, ha realizado bajo mi dirección y asesoramiento el presente trabajo titulado “Estudio Etiopatogénico del Circovirus Porcino Tipo 2 Asociado a Virus y Bacterias en una Infección Natural”, el cual considero reúne las condiciones y calidad científica para optar al grado de Doctor en Veterinaria. FDO.: DR. ANTONIO FERNÁNDEZ RODRÍGUEZ LAS PALMAS DE GRAN CANARIA, MAYO DE 2015 ÍNDICE Introducción y Objetivos 3 El Síndrome Multisistémico de Adelgazamiento Postdestete (PMWS, Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome) se considera una enfermedad multifactorial, siendo el circovirus porcino tipo 2 (PCV2) el agente imprescindible para su desarrollo. Dicho síndrome, también denominado ahora enfermedad sistémica por PCV2 (PCV2 systemic disease, PCV2-SD) fue descrito por primera vez en 1991 en Canadá, siendo identificado posteriormente en todos los continentes. El PMWS/PCV2-SD afecta principalmente a cerdos de 2-4 meses de edad y los principales signos clínicos incluyen pérdida de peso o reducción en la tasa de ganancia de peso, emaciación, dificultad respiratoria, diarrea y palidez o ictericia. Las lesiones macroscópicas incluyen, principalmente, un aumento del tamaño de los linfonodos así como ausencia de colapso pulmonar, mostrando los pulmones una consistencia elástica. También se puede observar punteado blanco en los riñones o úlceras gástricas, entre otros hallazgos. Histológicamente, a nivel de los tejidos linfoides, se caracteriza por depleción linfoide, infiltrado histiocítico con células gigantes multinucleadas, así como la presencia de cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos botrioides. Además se ha descrito neumonía intersticial, hepatitis linfohistiocítica, nefritis intersticial y enteritis linfohistiocítica, e infiltrado linfohistiocítico en cualquier otro tejido. Aparte del PMWS/PCV2-SD, el PCV2 se ha asociado a otras presentaciones clínicas, como infección subclínica, enfermedad respiratoria, enteritis o enfermedad intestinal, fallo reproductivo y el síndrome de dermatitis y nefropatía porcina. Todas estas presentaciones han sido englobadas bajo el término de enfermedades por circovirus porcino (Porcine circovirus diseases, PCVD). El PCV2 se considera un virus ubicuo, presente en la mayoría, sino en todas, las poblaciones porcinas, en los cinco continentes. El cerdo parece ser el hospedador natural aunque también se ha detectado en jabalíes, produciendo una enfermedad similar al PMWS. Aunque se considera que el PCV2 es el agente esencial para el desarrollo de la enfermedad, éste puede estar presente en cerdos sanos, sugiriendo la existencia de factores desencadenantes para pasar del estado de infección a enfermedad clínica. Esto explicaría las dificultades para reproducir experimentalmente el PMWS/PCV2-SD usando sólo PCV2, y por tanto la falta de un modelo experimental consistente y eficaz. Estos factores pueden ser Introducción y Objetivos 4 variaciones genéticas del virus, estado inmunitario del animal, momento de la infección, tipo de manejo en la explotación, o coinfecciones, entre muchos otros. Los animales afectados de PCVD muestran un amplio espectro de coinfecciones. Entre los agentes implicados se incluyen virus, bacterias, micoplasmas y otros patógenos oportunistas. Esto sugiere que no hay un único copatógeno que pueda ser atribuido a una mayor prevalencia y severidad de la enfermedad. Lo más probable es que diversos agentes patógenos y no patógenos conocidos y desconocidos, que varían de una región geográfica a otra, sean los factores desencadenantes de la progresión de la infección de PCV2 a PCVD. Los criterios de diagnóstico de PMWS/PCV2-SD son: 1. Signos clínicos incluyendo retraso del crecimiento y adelgazamiento, frecuentemente con disnea y aumento del tamaño de los linfonodos. 2. Presencia de lesiones histológicas características en los tejidos linfoides (depleción linfocitaria, histiocitosis y presencia de cuerpos de inclusión) y/o inflamación linfohistiocítica en otros órganos (pulmón, hígado, riñón, intestino, páncreas, etc.). 3. Detección, moderada a elevada, de PCV2 en las lesiones. Dado que la infección por PCV2 es ubicua en la población porcina mundial, el diagnóstico no puede basarse únicamente en la detección del virus o de anticuerpos frente a él. Esto hace que la elección y la interpretación de los test de diagnóstico sean importantes para la confirmación de PCVD. De igual forma, la variación de los órganos afectados y por tanto las diferentes manifestaciones clínicas de PCVD, determina la necesidad de tomar muestras de diversos órganos de varios animales, puesto que animales clínicamente enfermos pueden tener lesiones severas en un sistema orgánico y no presentar lesiones en otros. Debido a que el diagnóstico de PCVD se basa en la demostración de las lesiones características asociadas a antígeno o ácido nucleico de PCV2 en los respectivos órganos, la inmunohistoquímica (IHQ) o la hibridación in situ (ISH) se consideran las pruebas principales (gold standard) para su detección como parte del diagnóstico de PCVD. Ni los signos clínicos ni las lesiones macroscópicas observadas son suficientes para diagnosticar la enfermedad, aunque si son indicativas. Sin embargo, la presencia de sintomatología, lesiones macroscópicas compatibles con PCVD y la demostración de altos niveles de PCV2 o anticuerpos frente a PCV2 por diferentes métodos, pueden ser consideradas Introducción y Objetivos 5 diagnósticas en caso de no poder realizar estudio histopatológico. Por otro lado, la detección de ADN de PCV2 por PCR convencional sólo es diagnóstica de PCVD si se interpreta junto con las lesiones histológicas características. Las circovirosis porcinas tienen un gran impacto sobre la producción porcina, estimándose un coste de entre 562-900 millones de euros anuales para la Unión Europea, siendo el coste por animal de 2,31 a 16,19 euros según sea su presentación moderada o severa. Por ello es fundamental realizar un diagnóstico correcto para poder aplicar las estrategias necesarias para minimizar su impacto. Con estos antecedentes surge la necesidad de profundizar en el conocimiento del papel patogénico de PCV2 en la infección natural, de forma aislada o en asociación con otros patógenos víricos y/o bacterianos y las diferentes presentaciones clínicas, así como su caracterización a partir de modelos que surgen de inoculaciones experimentales utilizando diferentes métodos diagnóstico. Para ello se establecieron los siguientes objetivos: Objetivos: 1. Estandarizar la técnica inmunohistoquímica para la detección del PCV2 y ADV utilizando anticuerpos monoclonales en muestras de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina. 2. Estudiar la presencia en sangre y la distribución del PCV2 en tejido mediante diferentes técnicas (IHQ, PCR-ELISA). 3. Estimar el estadio y severidad de la infección por PCV2 a partir de una clasificación basada en modelos experimentales. 4. Evaluar la asociación de PCV2 con otros agentes etiológicos mediante la utilización de diferentes técnicas diagnósticas directas e indirectas. 7 2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Revisión Bibliográfica 9 2.1 Antecedentes Históricos El circovirus porcino (Porcine Circovirus, PCV) fue descrito por primera vez en 1974 por Tischer y colaboradores como un contaminante vírico no citopático similar a un picornavirus, de los cultivos celulares de riñón porcino PK/15, o línea celular continua de riñón de cerdo PK-15 (ATCC-CCL31) (Tischer et al., 1974 y 1982). Ocho años más tarde, este agente fue definido como un nuevo virus de mamífero, pequeño, sin envoltura e icosaédrico, con un genoma constituido por una cadena simple circular de ADN, pasando a denominarse circovirus porcino (Tischer et al., 1982). Desde entonces, el PCV ha sido asignado a la familia Circoviridae . En Canadá en 1991, en granjas de alto estatus sanitario, se identificó una enfermedad aparentemente nueva, que se denominó Síndrome Multisistémico de Adelgazamiento Postdestete (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS) (Clark, 1996a, Harding, 1996). Dicho síndrome se asoció a PCV (Daft et al., 1996; Clark, 1997; LeCann et al., 1997; Segalés et al., 1997). A finales de los años 90, un virus similar a PCV fue aislado por primera vez en cerdos con enfermedad debilitante en el oeste de Canadá (Ellis et al., 1998). Poco después, virus prácticamente idénticos al aislado canadiense fueron detectados en cerdos enfermos en Estados Unidos (EEUU) y Europa (Allan et al., 1998a). Mediante el uso de anticuerpos policlonales y monoclonales, y el análisis de la secuencia genómica, se demostró que esos virus eran antigénica y genéticamente diferentes al PCV contaminante de los cultivos celulares PK-15. Por lo tanto, se propuso que el PCV aislado de cerdos clínicamente enfermos se denominara Circovirus Porcino tipo 2 (PCV2) y el PCV original contaminante de los cultivo celulares PK-15, Circovirus Porcino tipo 1 (PCV1). (Allan et al., 1998b; Meehan et al., 1998; Morozov et al., 1998). Estudios retrospectivos realizados sobre tejido y/o suero, utilizando distintas técnicas, han puesto de manifiesto que el PCV2 podría haber estado presente en la población porcina, en diferentes regiones y/o países con bastante anterioridad a la primera descripción. En Alemania, la detección de ADN de PCV2 en tejido mediante hibridación in situ (in situ hybridization, ISH) fue del 2.77% entre los años 1961-1984, incrementándose a 32.14% entre 1985-1998 (Jacobsen et al., 2009). Revisión Bibliográfica 10 En sueros obtenidos en 1969, 1975 y 2000 en mataderos belgas que fueron testados mediante ensayo de inmunoperoxidasa en monocapa (immunoperoxidase monolayer assay, IPMA) se encontró positividad a anticuerpos específicos de PCV2 en el 100% de las muestras (Sánchez et al., 2001b). En Inglaterra se han identificado retrospectivamente casos esporádicos de PMWS en tejidos fijados en formalina y archivados desde 1970, antes de la detección del PMWS en los años 90 (Grierson et al., 2004a). Se ha encontrado ácido nucleico específico de PCV2 en muestras de tejidos archivados en el 41% de los casos de los años 90, en el 31% de los casos de los 80, y en el 32% de los casos de los 70. La secuenciación de PCV2 de 5 de estas muestras reveló una alta homología con los aislados de PCV2 obtenidos de una caso de Síndrome de Dermatitis y Nefropatía Porcina (Porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS) en el 2000, indicando que un aislado similar de PCV2 ha estado presente en la población porcina del Reino Unido durante más de 30 años (Grierson et al., 2004a). En Irlanda del Norte se han detectado anticuerpos de PCV2 en la mayoría de las muestras de suero recogidas desde 1973 hasta 1999 (Walker et al., 2000). El porcentaje de sueros positivos a PCV2 mostró un marcado incremento en las muestras recogidas en 1988 (100%) y 1999 (92,1%) comparativamente a los obtenidos en 1973 (69,1%), 1981 (61,3%), y 1984 (55%) (Walker et al., 2000). En Canadá se analizaron muestras de suero obtenidas en mataderos mediante inmunofluorescencia indirecta (indirect immunofluorescence assay, IFA) frente a anticuerpos de PCV1 y PCV2 (Magar et al., 2000b). Se observó que en 1985, un 8% (14/177) de sueros fueron positivos a PCV1 y un 13,6% (24/177) a PCV2. En 1989, el 41,4% (60/145) fue positivos a PCV1 y el 72,4% (105/145) a PCV2. En 1997, el 38,1% (56/147) de los sueros fueron positivos a PCV1 y 66,7% (98/147) a PCV2 (Magar et al., 2000b). Estos resultados señalan al PCV2 como el principal tipo circulante en la población porcina de Canadá, incluso antes de las primeras descripciones de PMWS. En España, se analizaron muestras de tejidos de 189 cerdos y sueros de 388 cerdos recogidos desde 1985 hasta 1997, para determinar la presencia de ADN de PCV2 mediante ISH en tejidos y de anticuerpos específicos de PCV2 mediante IPMA en suero. Un 41,3% de los tejidos y un 72,7% de los sueros fueron positivos, lo que indica una infección enzoótica en España desde 1985 (Rodríguez-Arrioja et al., 2003b). Revisión Bibliográfica 11 2.2 Taxonomía Ambos, PCV1 y PCV2, son miembros de la familia Circoviridae (Todd et al., 2005). La familia Circoviridae está dividida en el género Circovirus (“Circo” indica que el genoma viral tiene una conformación circular) y el género Gyrovirus (“Gyro” deriva del griego gyrus que significa anillo o circuito). El género Circovirus contiene las siguientes 11 especies: virus de la enfermedad del pico y las plumas (Beak and Feather Disease Virus, BFDV), circovirus del canario, el circovirus del pato, circovirus del pinzón, circovirus del ganso, circovirus de la gaviota, circovirus de la paloma, PCV1, y PCV2, circovirus del estornino, y circovirus del cisne. El género Gyrovirus solo contiene el virus de la anemia del pollo (Chicken Anemia Virus, CAV) (www.ictvonline.org). Los viriones de la familia Circoviridae muestran una simetría icosaédrica y ausencia de envoltura. El genoma es circular covalentemente cerrado, con una cadena simple de ADN, cuyo tamaño varia de 1,8 a 2,3 Kb. La polaridad del genoma del CAV posee un sentido negativo, mientras que el resto de circovirus lo es en ambos sentidos (Todd et al., 2005). CAV, PCV2 y BFDV tienen una estructura icosaédrica con una cápside de 60 moléculas de proteína dispuestas en 12 unidades agrupadas en pentámeros (Crowther et al., 2003). Los circovirus son específicos de hospedador o tienen un estrecho rango de hospedadores, y la mayoría de los circovirus conocidos infectan especies de aves (Todd et al., 2005). Las infecciones subclínicas son comunes; sin embargo, las infecciones solo por circovirus están asociadas, en algunos casos, con enfermedades tales como CAV, BFD, y la enfermedad por circovirus en palomas. La infección por circovirus, en muchas especies, causa varios grados de depleción linfoide y se piensa que es inmunosupresora (Todd et al., 2005). El análisis filogenético de PCV1 lo clasificó como el más cercano a BFDV (Niagro et al., 1998). Más aún, se ha sugerido que el predecesor de PCV1 y BFDV podría haberse originado de un nanovirus de plantas que infectó a un huésped vertebrado y se recombinó con un virus ARN infectante de vertebrados, posiblemente un calicivirus (Gibbs y Weiller, 1999). Investigaciones recientes han mostrado que los aislados de PCV2 pueden agruparse en dos grupos mayores, PCV2 grupo 1 y PCV2 grupo 2, que pueden dividirse a su vez en clusters: PCV2 grupo 1 puede dividirse en 3 clusters (1A-1C), y PCV2 grupo 2 en 5 clusters (2A-2E) Revisión Bibliográfica 12 (Olvera et al., 2007). De forma simultánea a la introducción de los términos PCV2 grupo 1 y PCV2 grupo 2, Gagnon y colaboradores, en 2007, en EEUU empezaron a agrupar los aislados de campo de PCV2 en aislados similares a los europeos o PCV2b (sería PCV2 grupo 1), y en asilados similares a los norteamericanos o PCV2a (PCV2 grupo 2). Algunos laboratorios de EEUU han aportado datos moleculares por lo que la mayoría de los aislados encaja en uno de los dos patrones de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (Restriction fraction length polymorphism, RFLP) designados 422 y 321 (DeLay et al, 2005; Carman et al., 2006). Los aislados con el patrón RFLP 422 encajan en PCV2 grupo 2 (PCV2a o aislados similares a los norteamericanos), mientras que los aislados con un patrón RFLP 321 pueden ser tanto PCV2 grupo 2 (PCV2a o aislados similares a los norteamericanos) o PCV2 grupo 1 (PCV2b o aislados similares a los europeos). Esto ha llevado al uso del término clásico 321, que está asociado con PCV2 grupo 2, y el nuevo 321, que está asociado con PCV2 grupo 1 que puede ser verificado solo por secuenciación. En Dinamarca se ha aislado un genotipo distinto, que ha sido clasificado como PCV2c (Dupont et al., 2008). Para unificar la nomenclatura existente a nivel internacional, Segalés y colaboradores en 2008, han propuesto la nomenclatura estandarizada PCV2a, PCV2b y PCV2c (tabla 2.1). Recientemente se ha descrito el PCVd y PCVe, identificados hasta el momento solamente en China (Wang et al., 2009), si bien, hay dudas, de que se trate de nuevos genotipos (Cortey et al., 2011). Tabla 2.1. Relación de las diferentes propuestas de nomenclatura utilizadas en referencia a los dos principales genotipos de PCV2. Modificado de Grau-Roma y colaboradores, 2011. Propuesta Segalés et al., 2008 Grau-Roma et al., 2008 Gagnon et al., 2007 Martins Gomes de Castro et al., 2007 Olvera et al., 2007 DeLay et al., 2005 Timmusk et al., 2005 De Boissésson et al., 2004 PCV-2a PCV-2 genotipo 2 PCV-2a Grupo B Grupo 2 Patrón 422like SG1/SG2 II PCV-2b PCV-2 genotipo 1 PCV-2b Grupo A Grupo 1 Patrón 321like SG3 I PCV-2c Revisión Bibliográfica 19 Un estudio longitudinal llevado a cabo sobre los perfiles de anticuerpos frente a PCV en 2 camadas de cerdos en Irlanda del Norte mostró que los anticuerpos séricos maternales frente a PCV desaparecían a las 8-9 semanas tras el nacimiento. Los anticuerpos séricos volvían a aparecer a las 13-15 semanas, indicando una exposición al virus entre la 11ª y 13ª semana de vida. Esta escala temporal coincidía con el movimiento de los cerdos desde la unidad de cría a la de engorde dentro de la granja (Allan et al., 1994c). En Canadá, tanto en granjas con grandes unidades de engorde libres de patógenos específicos (specific pathogen free, SPF), como en pequeñas granjas familiares, se detectó, mediante inmunofluorescencia indirecta, una amplia distribución de anticuerpos séricos frente a PCV2 en todos los tipos de granja ocurriendo la seroconversión a las 3-4 semanas postdestete (Cotrell et al., 1999). Los primeros estudios serológicos se llevaron a cabo utilizando PCV1 como antígeno. Sin embargo, diversos estudios han revelado reacción cruzada entre anticuerpos de PCV1 y PCV2 (Allan et al., 1998a; Mahé et al., 2000, Pogranichnyy et al., 2000; Rodríguez-Arrioja et al., 2000). Por tanto, las primeras estimaciones sobre la prevalencia de infección por PCV1 y PCV2 necesitarían ser nuevamente evaluadas. Mediante el uso de una PCR múltiple, que permite la tipificación de los PCV, se demostró que el PCV2 es el principal tipo de PCV que circula en la población porcina (Larochelle et al., 1999a; Ouardani et al., 1999; Ellis et al., 2000a). Sólo entre el 4% y el 6% de los virus de campo identificados fueron PCV1 independientemente del estado sanitario de los cerdos y sin estar correlacionada con ninguna enfermedad concreta (Larochelle et al., 1999a; Ouardani et al., 1999). Bajo condiciones experimentales, los cerdos inoculados con PCV1 seroconvirtieron el día 7 postinoculación y los títulos de anticuerpos continuaron aumentando durante 5 semanas después de la inoculación. El virus se detectó en diversos tejidos y se excretó por secreciones nasales y heces (Tischer et al., 1986) sugiriendo que los cerdos desprovistos de inmunidad eran susceptibles al PCV1 (Allan et al., 1995). Sin embargo, la inoculación experimental del PCV1 no fue capaz de inducir cambios patológicos o enfermedad clínica en los cerdos, sugiriendo que el PCV1 no era patógeno para el cerdo (Krakowka et al., 2000). Aunque se reprodujeron temblores en cerdos muy jóvenes infectados con PCV y se aisló circovirus de cerdos recién nacidos con temblor congénito, clínicamente con contracciones clónicas de los músculos esqueléticos, el aislado vírico no fue caracterizado genética o Revisión Bibliográfica 20 antigénicamente (Hines y Lukert, 1994). Posteriormente, en lechones que presentaron de forma natural temblor congénito tipo A2 se detectó PCV2 (Stevenson et al., 2001). El PCV2 ha sido implicado en numerosos síndromes de enfermedad, tales como el Síndrome Multisistémico de Adelgazamiento Postdesdete (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS), el Síndrome de Dermatitis y Nefropatía Porcina (porcine dermatitis and nephropaty syndrome, PDNS), enteritis granulomatosa, linfoadenitis necrotizante, epidermitis exudativa y trastornos reproductivos, aunque el papel causal del PCV2, en alguna de estas enfermedades, no se ha demostrado de forma concluyente (Chae, 2005; Segalés et al., 2005a). 2.5.1 Especies Susceptibles El cerdo parece ser el hospedador natural del PCV1 y PCV2 (Segalés y Domingo, 2002). También se han detectado anticuerpos frente a PCV2 en el suero de jabalíes, siendo positivos el 33% y 37% de los animales examinados en 1993 y 2000 respectivamente en Bélgica, y el 48% en España entre 2000 y 2003 (Sánchez et al., 2001b; Vicente et al., 2004). Una enfermedad similar al PMWS también ha sido descrita en jabalíes en Norteamérica y en Europa (Ellis et al., 2003; Schulze et al., 2004; Vicente et al., 2004). Los genomas de los PCV2 aislados de los jabalíes enfermos en dos de los estudios fueron secuenciados mostrando una homología en nucleótidos casi idéntica a otros PCV2 caracterizados de cerdos domésticos (Ellis et al., 2003; Schulze et al., 2004). No se han encontrado anticuerpos séricos frente a PCV2 en vacas, ovejas, pollos, pavos, cabras, ratones, cobayas, conejos, caballos, perros, gatos y humanos (Tischer et al., 1982; Allan et al., 1994c y 2000c; Ellis et al., 2001; Rodríguez-Arrioja et al., 2003a). El estudio serológico en la población humana expuesta tampoco ha mostrado anticuerpos anti-PCV2 (Ellis et al., 2000b). Sin embargo, en Alemania, mediante la combinación de técnicas de inmunofluorescencia indirecta y ELISA, se han detectado anticuerpos anti-PCV en humanos (30.2%), ratones (12-69%) y vacas (35%) (Tischer et al., 1995a). Si bien el PCV es capaz de infectar in vitro células mononucleares de bovino (Allan et al., 1994b), y ratones bajo condiciones experimentales (Kiupel et al., 2001; Cságola et al., 2008), la implicación de especies no porcinas en la transmisión del PCV a los cerdos queda aún por determinar. Las pruebas actuales disponibles indican que el PCV2 no representa un riesgo zoonótico para las personas (Segalés et al., 2005a). Revisión Bibliográfica 21 2.5.2 Transmisión Se piensa que la transmisión del PCV2 ocurre a través de contacto directo vía oronasal, fecal y urinaria (Magar et al., 2000a; Bolin et al., 2001). El contacto directo con cerdos que habían sido inoculados con PCV2 42 días antes, produjo la transmisión del virus a cerdos control (Bolin et al., 2001). Para valorar la diseminación del PCV2, Shibata y colaboradores, en 2003, inocularon intranasalmente 16 lechones extraídos por cesárea y privados de calostro con PCV2. Mediante PCR se identificó ADN del virus sobre muestras de hisopos orofaríngeos y nasales, heces, sangre entera y suero desde el día 1 al 70 postinoculación. Mediante el uso de PCR cuantitativa a tiempo real, se analizaron hisopos tonsilares, nasales, traqueobronquiales, urinarios y fecales de cerdos sin y con signos de enfermedad, detectándose ADN de PCV2 en un alto porcentaje de las muestras (el % varía según muestras y tipos), sugiriendo que el virus es excretado a través de las secreciones respiratorias, orales, orina y heces de cerdos tanto sanos como clínicamente afectados de PCVD, con una mayor carga viral en estos últimos (Segalés et al., 2005b). Otros investigadores analizaron, mediante PCR convencional, muestras de intestino y heces procedentes de animales con y sin enfermedad entérica, detectando ADN viral en 14/54 intestinos y 4/9 muestras de heces de animales enfermos, en 3/14 intestinos y 16/20 muestras de heces de animales sin enfermedad, proponiendo los autores la vía oro-fecal como el mecanismo de transmisión del PCV2 (Yang et al., 2003). La transmisión vertical ha sido demostrada en cerdas tanto de forma natural como experimental (Ladekjaer-Mikkelsen et al., 2001; O´Connor et al., 2001; Johnson et al., 2002). West y colaboradores, en 1999, describieron la transferencia vertical intrauterina de PCV2 dando lugar a lechones virémicos o persistentemente infectados al nacimiento. En la inoculación intranasal con PCV2 de machos de 7 meses de edad se detectó ADN en muestras de suero a los 4 días post-inoculación en 3 de 4 machos. Sucesivas muestras fueron positivas hasta los 35 post-inoculación, pero negativas a los 90 días post-inoculación. El ADN del virus se detectó en muestras de semen a los 5 días post-inoculación en 2 de los machos y de forma intermitente hasta los 47 días post-inoculación en los 4 machos (Larochelle et al., 2000). Revisión Bibliográfica 22 En 46 granjas en Corea se analizó el semen de 98 machos de un año de edad utilizando técnicas de biología molecular y aislamiento viral. Mediante PCR convencional se detectó ADN en 13 muestras, por PCR semianidada en 26 y en 11 muestras se aisló PCV2. Conjuntamente se analizaron las distintas fracciones del semen, determinándose que la mayor cantidad de ADN de PCV2 se encontraba en el fluido seminal y fracción no espermática (Kim et al., 2003e). En Canadá, en machos infectados naturalmente, el porcentaje de identificación de ADN de PCV2 mediante PCR anidada fue bajo y esporádico, no detectándose en muestras de semen procedentes de machos mayores de 17,5 meses de edad, aunque habría que considerar la posibilidad de que machos seropositivos se comporten como diseminadores continuos (McIntosh et al., 2006). En cuanto a los posibles efectos del virus sobre la composición del semen, no parece afectar a el porcentaje de células espermáticas vivas ni a su morfología (McIntosh et al., 2006). Se ha demostrado experimentalmente que PCV2 puede ser transmitido vía inseminación artificial dando lugar a viremia en las cerdas causando fallos reproductivos (Madson et al., 2009). 2.6 Patogenia de PCVD Todavía no existe un total conocimiento de la patogenia de enfermedad por PCV2. La depleción linfoide y la linfopenia en sangre periférica es una característica constante en los cerdos que desarrollan clínicamente PCVD (porcine circovirus diseases, enfermedades por circovirus porcino). Las técnicas de IHQ e ISH (in situ hybridization, hibridación in situ) muestran grandes cantidades de antígeno o ácido nucleico de PCV2 en el citoplasma de macrófagos y células dendríticas reemplazando a los linfocitos en los folículos deplecionados (Allan y Ellis, 2000; Sorden, 2000; Chianini et al., 2003). Sin embargo, la presencia de antígeno de PCV2 en linfocitos es esporádica (Chianini et al., 2003), y aún se desconoce si la reducción de linfocitos en cerdos afectados por PCVD es debida a una producción reducida en la médula ósea, a una reducción de la proliferación en los tejidos linfoides secundarios o a un incremento de la pérdida de linfocitos en médula ósea, sangre periférica, o en tejidos linfoides secundarios vía necrosis o apoptosis inducida por el virus (Opriessnig et al., 2007). Revisión Bibliográfica 23 A pesar de la presencia de PCV2 en macrófagos y células dendríticas, estudios in vitro sugieren que las células monocíticas no representan la célula blanco principal de la replicación del PCV2 (Gilpin et al., 2003). En dichos estudios se analizó la capacidad de los monocitos y los macrófagos de mantener la replicación de PCV2 in vitro , y no se observó replicación en las mismas; sin embargo, el PCV2 no fue degradado en el citoplasma de las células (Gilpin et al., 2003). Otros autores no encontraron evidencia de replicación in vitro en células dendríticas; sin embargo, el PCV2 persistía en las células dendríticas sin perder infectividad o inducir la muerte celular (Vincent et al., 2003). Es posible que el PCV2 se replique en una pequeña subpoblación de dicho tipo celular, aun no adecuadamente identificadas. Una hipótesis sostiene que debido a su capacidad migratoria, las células dendríticas podrían proporcionar un vehículo para el transporte del virus a través del hospedador (Vincent et al., 2003). Otros trabajos realizados in vitro e in vivo sugieren que el PCV2 sí podría replicarse en macrófagos (Pérez-Martín et al., 2007; Rodríguez-Cariño y Segalés, 2009). La ruta de entrada del PCV2 en las células diana todavía no ha sido determinada. Sin embargo, algunos resultados preliminares obtenidos in vitro usando una línea celular monocítica porcina han mostrado que el PCV2 entra en dichas células mediante endocitosis dependiente de clatrina en un ambiente ácido (Misinzo et al., 2005). Además, se ha demostrado que las células dendríticas (dendritic cell, DC) maduras e inmaduras permiten la internalización del PCV2 mediante micropinocitosis en ausencia de replicación vírica (Vincent et al., 2005). Cuando el PCVD clínico es evidente, el daño en el sistema inmune es la principal característica en los cerdos afectados (Nielsen et al., 2003, Darwich et al., 2004). La depleción linfocitaria de los tejidos linfoides, cambios en las subpoblaciones de células mononucleares de la sangre periférica (PBMC, peripheral blood mononuclear cell) y la alteración de los patrones de expresión de citoquinas, han sido todos ellos demostrados en cerdos afectados naturalmente y experimentalmente de PCVD sistémico (Clark, 1997; Rosell et al., 1999; Darwich et al., 2002 y 2003a, Nielsen et al., 2003). Aunque muchos aspectos de la patogenia del PCV2 están aún pendientes de una confirmación e identificación definitiva, se ha propuesto un esquema de la patogenia de los cerdos afectados de PCVD sistémico e infectados subclínicamente por PCV2 en relación a los aspectos inmunológicos de la enfermedad (Darwich et al., 2004). Revisión Bibliográfica 24 Se han publicado múltiples intentos dirigidos a reproducir experimentalmente PCVD sistémico. Algunos de los ensayos experimentales iniciales en los que se utilizaron inóculos de tejidos homogenizados (Balasch et al., 1999) o PCV2 aislados y propagados en cultivos celulares (Ellis et al., 1999b, Magar et al., 2000a, Pogranichiniy et al., 2000) solo reprodujeron lesiones histológicas de intensidad leve a moderada similares a las del PCVD sistémico, pero no el síndrome clínico de adelgazamiento. Sin embargo, en estudios realizados en cerdos privados de calostro e inoculados solo con PCV2 se describió, en un lechón, la enfermedad clínica y lesiones compatibles con PMWS (Allan et al., 1999a; Kennedy et al., 2000; Bolin et al., 2001, Harms et al., 2001; Okuda et al., 2003). Consecuentemente, se ha sugerido que la infección por PCV2, necesita de otros cofactores para el desarrollo de la enfermedad clínica completa en cerdos. Retrospectivamente, se ha observado que diversos factores, tales como la edad y el origen de los cerdos, condiciones ambientales, la genética de los animales y la naturaleza del inóculo de PCV2 pueden jugar un importante papel en la reproducibilidad experimental de la enfermedad (Segalés et al., 2005a). Se han descrito modelos de enfermedad de PMWS más consistentes y repetibles usando cofactores infecciosos (Allan et al., 1999a; Krakowka et al., 2000; Allan et al., 2003) y no infecciosos (Krakowka et al., 2001). La reproducción de la enfermedad clínica completa ha sido descrita en un alto porcentaje de cerdos privados de calostro y gnobióticos co-inoculados con PCV2 y el parvovirus porcino (PPV), o inoculados con un potente inmunoestimulante como la hemocianina en adyuvante incompleto de Freund. Para aclarar el papel del PCV2 en PCVD sistémico y otras manifestaciones clínicas atribuidas solamente a la infección por PCV2, se desarrolló un clon ADN infeccioso de PCV2 (Fenaux et al., 2002). Mediante este clon ADN infeccioso se ha asegurado la pureza y homogeneidad del inóculo en estudios in vivo y ha permitido evaluar los efectos biológicos de los cambios genéticos (Fenaux et al., 2002, 2003 y 2004b; Opriessnig et al., 2006g). Cerdos libres de patógenos específicos (SPF) infectados con el clon ADN de PCV2 desarrollaron lesiones linfoides asociadas a PCV2 (Fenaux et al., 2002). Clínicamente no se observó evidencia de debilidad durante los 35 días de duración del experimento, pero sí se determinó que el PCV fue el causante de las lesiones linfoides características de PCVD (Fenaux et al., 2002). Revisión Bibliográfica 25 Un grupo francés demostró que cerdos SPF inoculados con un clon ADN de PCV2 desarrollaron lesiones compatibles con PCVD sistémico (Grasland et al., 2005). Los trabajos con el clon ADN infeccioso apoyan la hipótesis de que el PCV2 es esencial para el desarrollo de PCVD; sin embargo, la mayoría de cepas de PCV2 requieren otros cofactores o elementos para inducir el espectro completo de signos clínicos y lesiones asociadas con casos avanzados de PCVD. Todo esto se ve respaldado por las pruebas de campo, que apoyan la idea de que PCVD posee una causalidad multifactorial y que no todos los cerdos infectados con PCV2 desarrollarán PCVD clínico (Opriessing et al., 2007). Los factores que actualmente se piensa puedan influir en el desarrollo de la infección por PCV2 pueden desglosarse en 4 grupos: virus, hospedador, coinfecciones y modulación inmune. Los trabajos experimentales han confirmado que al menos estos 4 componentes, identificados hasta la fecha, son claves en los modelos etiopatogénicos de PCVD (Opriessing et al., 2007). 2.6.1 Factores Dependientes del Virus Es sabido que un alto porcentaje de cerdos clínicamente sanos están infectados por PCV2, mientras que otros desarrollan una enfermedad severa. Hasta la fecha, los análisis genéticos y la comparación de secuencias de aislados de PCV2 no han podido explicar plenamente las diferencias en las manifestaciones clínicas. Los genomas completos de 10 aislados holandeses de PCV2 de granjas afectadas y no afectadas de PCVD fueron secuenciados y cuando se compararon se encontró que tenían una homología del 95,6 % al 100% (Grierson et al., 2004b). No hubo evidencia de ningún patrón constante entre los aislados de PCV2 de cerdos afectados y no afectados, llevando a los autores a la conclusión que las diferencias en las manifestaciones clínicas eran debidas probablemente a otros factores aparte del virus (Grierson et al., 2004b). Del Éste de Canadá se secuenciaron 34 aislados de PCV2 de granjas con diferentes manifestaciones clínicas de la enfermedad y se encontró que estaban estrechamente relacionadas entre sí y con otras cepas de Canadá, EEUU, Europa y Asia (Larochelle et al., 2002). Revisión Bibliográfica 26 Más tarde, en Francia, se determinó la secuencia completa de 38 aislados de PCV2 de granjas afectadas y no afectadas de PCVD, sin embargo, los autores no lograron identificar marcadores moleculares de virulencia. Se concluyó que todas las granjas estudiadas estaban infectadas con aislados de PCV2 estrechamente relacionadas pero diferentes, y que los brotes recientes de PCVD no fueran debidos probablemente a la aparición de un nuevo genotipo de PCV2 (de Boisseson et al., 2004). En Suecia se describió una cepa del virus que había persistido durante 10 años en una granja SPF sin causar PCVD clínico. La misma fue capaz de inducir la enfermedad sistémica en cerdos bajo condiciones experimentales (Allan et al., 2003; Hasslung et al., 2005). Cuando la compararon con una cepa de referencia reciente de PCV2 de Canadá (PCV2-1010), se encontró que ambos aislados eran altamente virulentos en el modelo de coinfección PCV2-parvovirus porcino (PPV), esto llevó a la conclusión general de que la virulencia del aislado sueco era igual o incluso mayor al de la cepa de referencia más reciente encontrada en Canadá (Hasslung et al., 2005). Los estudios sobre la elaboración y caracterización de 2 clones quiméricos de ADN infecciosos de PCV1 y PCV2 han proporcionado mayor entendimiento sobre los factores dependientes del virus (Fenaux et al., 2004a). El virus quimérico PCV1-2 (contiene el gen de la cápside de PCV2 clonado en el genoma del PCV1 no patógeno) indujo experimentalmente una fuerte respuesta especifica de anticuerpos frente al antígeno de cápside del PCV2 patogénico con lesiones mínimas o sin lesiones, nivel bajo y reducida duración de viremia, y bajos o no detectables niveles de antígeno viral en tejidos linfoides (Fenaux et al., 2003 y 2004a). Un grupo de investigadores describió dos mutaciones de aminoácidos en la proteína de la cápside de PCV2 después de 120 pases seriados en cultivo celular que dieron lugar a la atenuación del virus in vivo (Fenaux et al., 2004b). Igualmente se observaron diferencias significativas en las lesiones macro y microscópicas de los cerdos inoculados con el aislado salvaje de PCV, siendo más graves que las causadas por aislados atenuados. Esto demostró que cambios mínimos en el genoma de aislados de PCV2 pueden alterar considerablemente la virulencia del virus (Fenaux et al., 2004b). Revisión Bibliográfica 27 También se han estudiado las posibles diferencias de virulencia entre los aislados de campo de PCV2 del Medio Oeste de USA con una homología del 98% en ácidos nucleicos y 96,1% en aminoácidos en ORF2 (Opriessnig et al., 2006g). Uno de los aislados, el PCV2 ISU40895 fue obtenido de un caso con severa depleción linfoide e inflamación asociados a gran cantidad de antígeno de PCV2 compatible con PCVD. El aislado PCV2 ISU-4838 fue identificado de un caso sin lesiones asociadas a PCV2. Cuando ambos fueron utilizados en experiencias in vivo usando cerdos SPF, los autores observaron que los aislados de PCV2 con mínimas diferencias genómicas pueden diferir de manera importante en virulencia, medida ésta por los niveles de carga viral en suero y tejidos, así como la gravedad de las lesiones asociadas a PCV2 (Opriessnig et al., 2006g). Desde finales de 2004, se ha observado en Ontario, Canadá, un aumento de la incidencia y gravedad, y un cambio en las manifestaciones clínicas de PCVD. Veterinarios clínicos, e investigadores han manifestado la observación de nuevas lesiones patológicas en Ontario, incluyendo edema pulmonar, enteritis granulomatosa, depleción linfoide más severa con gran cantidad de cuerpos de inclusión y necrosis linfoide asociadas a antígeno de PCV2. El análisis de los aislados de PCV2 demostró un cambio en la secuencia génica (DeLay et al., 2005; Gagnon et al., 2007; Carman et al., 2008). Posteriormente se han realizado descripciones similares de aumento de la incidencia y severidad de PCVD asociada con un reciente genotipo emergente en EEUU, el PCV2 tipo 1 (PCV2b) (Cheung et al., 2007). No se han descrito aislados de dicho genotipo en EEUU antes de 2005, pero parece estar asociado con los brotes de PCVD en 2006 en Kansas, Carolina del Norte e Iowa (Cheung et al., 2007). El PCV2 tipo 1 (PCV2b) ya había sido descrito con anterioridad en Europa y Asia (Mankertz et al., 2000; Wen et al., 2005). Se desconoce si el aumento de la detección de PCV2 tipo 1 (PCV2b) se debe a un cambio de su virulencia, a una nueva introducción en el área (p.e., vía semen, etc.), o si otro factor X puede apoyar el aumento de replicación de un genotipo PCV2 previamente insignificante (Opriessnig et al., 2007). La teoría del factor X se basa en un estudio realizado en 116 granjas inglesas entre 2003 y 2004 (Woodbine et al., 2007). Las principales conclusiones de este trabajo fueron que el PMWS se comportó como un proceso epidémico a través de una población no expuesta previamente sin asociación causal obvia entre PMWS y antígenos y anticuerpos de PCV2 e Revisión Bibliográfica 28 indicativa de un agente infeccioso nuevo. De forma similar, un grupo de investigación de Nueva Zelanda, encontró que el PMWS puede ser transmitido a cerdos sanos vía contacto directo o indirecto, pero la exposición de cerdos solo a PCV2 no causó enfermedad, lo que indica que un agente transmisible distinto al PCV2 es necesario para el PMWS (Jaros et al., 2006). 2.6.2 Factores Dependientes del Hospedador Existen varios trabajos que pretenden determinar la susceptibilidad a la infección por PCV2 en las distintas razas de cerdos, habiéndose observado PCVD clínico en una amplia variedad de cerdos de raza pura e híbridos (Opriessnig et al., 2007). Para ello, se llevó a cabo un estudio de cohorte para investigar una supuesta susceptibilidad reducida de los cerdos Pietrain a PCVD en 4 granjas afectadas de PMWS. La mitad de las hembras fueron inseminadas con semen de Pietrain, mientras que el resto de las hembras recibieron el semen que se usaba habitualmente en esas granjas. La enfermedad asociada a PCV2 en los lechones Pietrain no se diferenciaba de la observada en otros cerdos en esas granjas en términos de seroconversión a PCV2, morbilidad y mortalidad (Rose et al., 2004). En contraposición, un estudio de campo usando 2 piaras iguales de 5000 cerdas con 3 líneas genéticas paternas diferentes (100% Pietrain, 50% Large White/50% Pietrain, 25% Large White/75% Duroc) demostró que, bajo las condiciones de dicho estudio de campo, la genética del hospedador influía en la expresión de PCVD manifiesta como incremento de la mortalidad en los lechones de la línea paternal Large White/ Duroc comparada con los lechones de las otras dos líneas (López-Soria et al., 2004). Un proyecto piloto controlado ha investigado la susceptibilidad del hospedador y su efecto en el desarrollo de la infección por PCV2 (Opriessnig et al., 2006a). En dicho estudio se compararon tres razas: Duroc, Landrance, y Large White. La incidencia del PCVD sistémico basado en las lesiones macro y microscópicas fue de 0% (0/23) en Duroc, 15,8% (3/19) en Landrace, y 0% (0/21) en Large White. Los cerdos de raza pura Landrace fueron claramente más susceptibles a las enfermedades asociadas a PCV2, interpretada y medida en la severidad de los signos clínicos y lesiones microscópicas asociadas a PCV2 (Opriessnig et al., 2006a). Revisión Bibliográfica 35 2.7.2 Interacción entre PCV2 y el Sistema Inmune en PCVD El efecto del PCV2 sobre el sistema inmune en cerdos afectados de PMWS y cerdos infectados subclínicamente por PCV2 no ha sido caracterizado completamente. Se ha demostrado experimentalmente que la estimulación y/o activación del sistema inmune de los cerdos infectados con PCV2 por parte de algunos virus o factores no infecciosos favorece la replicación de PCV2 e incrementa la carga viral en tejidos y suero (Allan et al., 1999a; Krakowka et al., 2000 y 2001; Harms et al., 2001; Rovira et al., 2002), indicando que la infección de PCV2 y la inmunoestimulación pueden ser eventos cruciales en el desarrollo del PMWS (Krakowka et al., 2001). En cambio, las lesiones microscópicas típicas en los tejidos linfoides de los cerdos afectados por PMWS (Clark, 1997; Rosell et al., 1999), la asociación de la enfermedad con patógenos oportunistas (Clark, 1997; Carrasco et al., 2000; Núñez et al., 2003; Segalés et al., 2003b), y otros cambios en las subpoblaciones celulares inmunes de los tejidos linfoides y en las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) (Segalés et al., 2001; Darwich et al., 2002 y 2003b; Chianini et al., 2003; Nielsen et al., 2003) son características frecuentes del PMWS en cerdos afectados de forma grave, sugiriendo un estado de inmunosupresión en los cerdos enfermos (Segalés et al., 2004a). Estudios de casos naturales de PMWS han mostrado que los cerdos con enfermedad clínica tienen una evidente y significativa alteración de los patrones de expresión del mRNA de diversas citoquinas pro-inflamatorias y reguladoras en diferentes tejidos linfoides (Darwich et al., 2003b). Sin embargo, no está claro si estos perfiles alterados están relacionados con el desarrollo del PMWS o son consecuencia de la dinámica de la población celular gravemente afectada en los tejidos linfoides de los animales enfermos, cuando se compara con animales no enfermos (Segalés et al., 2005a). Se ha descrito una sobreexpresión significativa del mRNA de IL-10 en el timo de cerdos afectados de PMWS comparado con animales no enfermos, que se ha asociado con depleción tímica y atrofia de dicho órgano (Darwich et al., 2003b). Por el contrario, Sipos y colaboradores en 2004, no encontraron diferencias significativas en la expresión de citoquinas en sangre y tejidos procedentes de casos de campo de cerdos afectados de PMWS cuando se compararon con cerdos no afectados, y concluyeron que la respuesta inmune a PMWS no se caracterizaba por un perfil de citoquinas basada en Th1 ni por un perfil indicativo de inmunosupresión de Revisión Bibliográfica 36 células T. Sin embargo, los mismos autores sugieren que los animales estudiados probablemente estaban en la fase de remisión de la enfermedad (Sipos et al., 2004). Estudios sobre muestras secuenciales de sangre de cerdos infectados experimentalmente con PCV2 han indicado un incremento en la producción de IL-10 en los animales afectados de PMWS en comparación con los infectados subclínicamente. Este incremento solo se detectó de forma tardía en el curso de la infección y coincidía con el inicio de la enfermedad, no pudiéndose determinar si esto contribuye, distingue o define el desarrollo del PMWS o solo es una consecuencia de la enfermedad (Stevenson et al., 2004 y 2006). También se observó un descenso prematuro de interferón en los cerdos infectados que desarrollaron PMWS, comparativamente con los cerdos que se mantenían infectados subclínicamente. Se concluyó que la incapacidad de algunos cerdos infectados por PCV2 para producir interferón en las primeras etapas de la infección podría ser un factor clave en la respuesta inmune inadecuada frente a la infección por PCV2, lo que favorecería el desarrollo de la enfermedad (Stevenson et al., 2004 y 2006). La reducción en la producción de interferón y el aumento en la producción de IL-10 en cerdos infectados experimentalmente por PCV2 y que han desarrollado PMWS ha sido confirmada por otros autores usando diferentes modelos experimentales (Hasslung et al., 2005). Estos efectos están probablemente relacionados con genes identificados en el genoma de PCV2 que inhiben la producción de interferón alfa (IFN-α) (Hasslung et al., 2003). Estudios in vitro de PBMC de cerdos sanos y afectados de PMWS han revelado efectos sustanciales y específicos (alteración y/o disminución) en la capacidad funcional de PBMC de cerdos afectados de PMWS en términos de liberación de citoquinas (Darwich et al., 2003a). Por otro lado, no se han visto diferencias especificas en la expresión de marcadores de superficie celular de PBMC o de macrófagos alveolares expuestos in vitro a PCV2 cuando se comparaban con los grupos control (Gilpin et al., 2001; Vincent et al., 2003). La infección in vitro por PCV2 de células dendríticas (DC) sanguíneas y plasmocitoides así como de precursores de DC, ha mostrado que el virus no inhibe la diferenciación de DC y que dichas células mantienen la capacidad de producir citoquinas proinflamatorias, de procesar y presentar antígenos a los linfocitos T (Vincent et al., 2005). Sin embargo, el PCV2 parece ser capaz de dañar el efecto de CpG-ODN (secuencias dinucleótidas de citosina fosfato guanina, que se encuentran en el genoma de las bacterias y algunos virus y son reconocidas como Revisión Bibliográfica 37 señales de peligro por el sistema inmune) sobre las DC plasmocitoides (células productoras de interferón natural, NIPC, natural interferon-producing cells,) mediante la inducción de la inhibición de IFN-α y TNF-α. Las defensas innatas dependientes de IFN-α y TNF-α, tales como efectos antivirales directos, maduración de DC, activación de las células natural killer (NK), así como la promoción de las respuestas específicas de células T y B, se volverían ineficaces o inefectivas (Fitzgerald-Bocarsly, 2002; Fonteneau et al., 2004; Liu, 2004; Vincent et al 2005). Mientras que esto podría tener un valor potencial para la supervivencia del PCV2, también daría lugar a una reducción de la eficiencia frente a infecciones adicionales. Por lo tanto, la supresión de la función de las NIPC por parte del PCV2 afectaría a la capacidad del hospedador para combatir infecciones secundarias o paralelas (Vincent et al., 2005). Se ha reconocido que la etiología de las enfermedades asociadas a PCV2 puede incluir la infección por agentes secundarios o la activación del sistema inmune (Allan et al., 1999a; Krakowka et al., 2000 y 2002). El medio por el cual esto ocurre podría estar relacionado con el hecho de que las DC y macrófagos acumulan el virus (Gilpin et al., 2003; Vincent et al., 2003) proporcionando un medio de transporte del PCV2 a diversos lugares del cuerpo, lo que explicaría el hecho de que animales sintomáticos muestren histiocitos positivos a PCV2 en la mayoría de tejidos y órganos (Rosell et al., 1999; Krakowka et al., 2002). Esta extensa distribución del virus facilitaría la interacción con otras células tales como NIPC en las mucosas, donde la eficacia de la actividad de las NIPC es esencial para el control de la entrada de patógenos (Vincent et al., 2005). Los mecanismos responsables de la depleción linfocitaria e inmunodeficiencia asociadas a la infección por PCV2 han sido poco estudiados. Algunos autores han señalado a la apoptosis como el mecanismo de depleción de células B en los linfonodos (Shibahara et al., 2000), sin embargo, otros estudios no apoyan esta hipótesis, demostrando que la apoptosis no es una característica notable en el desarrollo de las lesiones linfoides en el PMWS (Mandrioli et al., 2004; Resendes et al., 2004a). Por otra parte, hay evidencias de que la proliferación linfocítica podría estar inhibida en el timo y en los órganos linfoides secundarios (Darwich et al., 2003b; Mandrioli et al., 2004). De la misma manera, se dispone de poca información respecto a la interacción entre el sistema inmune y PCV2 en otras PCVD. Se ha sugerido que un excesivo título de anticuerpos frente a PCV2 puede desencadenar el desarrollo de PDNS (Wellenberg et al., 2004b), pero por el momento no se ha podido demostrar experimentalmente. Por otra parte, el perfil de Revisión Bibliográfica 38 citoquinas y las variables hematológicas de los cerdos con PDNS indicarían un estado proinflamatorio, apoyando una tendencia Th1 en estos animales (Sipos et al., 2005). Sin embargo, en dicho estudio no se dio una descripción patológica detallada de los animales, y no se observó diferencia en los niveles de urea y creatinina entre PDNS y PMWS (Segalés et al., 2005a; Sipos et al., 2005). La forma reproductiva de PCVD parece ser bastante infrecuente en condiciones de campo. Esto podría ser debido a la seroprevalencia generalizada frente a PCV2 en los cerdos adultos, que daría como resultado que las piaras de reproductores fueran inmunes al virus y, por lo tanto, no susceptibles a la enfermedad clínica (Sánchez et al., 2001b; Pensaert et al., 2004). 2.8 Enfermedades Asociadas a PCV: Signos Clínicos y Lesiones 2.8.1 PCV1 El PCV1 se considera un virus no patogénico (Tischer et al., 1986; Allan et al., 1995). Sin embargo, dicho virus se ha aislado de lechones nacidos muertos. La ausencia de anticuerpos frente a PCV1 en el suero fetal sugiere que la infección transplacental es extremadamente rara y ocurre antes de la inmunocompetencia fetal. (Allan et al., 1995). En cuanto a la inoculación experimental con PCV1, si bien se observó seroconversión, ningún animal mostró signos clínicos de enfermedad ni presentó lesiones macro ni microscópicas (Tischer et al., 1986). En un estudio similar no se logró reproducir la enfermedad clínica, sin embargo, en este caso se pudo demostrar, mediante inmunofluorescencia, la presencia de antígeno viral en tejidos del sistema linfoide, pulmón e intestino. El virus se localizó principalmente en el bazo, timo y pulmón, y se asoció a células monocíticas/macrofágicas, por lo que se concluyó que la infección por PCV1 podría comprometer el sistema inmune porcino (McNeilly et al., 1996). Revisión Bibliográfica 39 2.8.2 PCV2 En 1996 se publicó la descripción de un síndrome de adelgazamiento o desmedro identificado, por primera vez en 1991, en granjas de alto estatus sanitario (SPF) en el oeste de Canadá (Clark, 1996b; Harding, 1996). Este síndrome se caracterizaba por la pérdida progresiva de la condición corporal junto con la presencia de lesiones en múltiples órganos, los autores propusieron el término de “Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome” (PMWS, síndrome multisistémico de adelgazamiento postdestete). En las lesiones multisistémicas se detectó ácido nucleico y antígeno de PCV2, al tiempo que se pudo aislar y caracterizar el virus. (Ellis et al., 1998). La asociación de PCV con neumonía intersticial y linfoadenopatía fue descrita en California en 1996 al detectarse, mediante ISH, ADN de PCV en muestras de pulmón y linfonodo en un cerdo de 6 semanas de edad (Daft et al., 1996). Posteriormente el aislamiento del virus y su caracterización demostró que se trataba del PCV2 (Allan et al., 1998a). En Francia en 1996, se describió una enfermedad debilitante, aunque inicialmente, no se pudo identificar el agente causal (Albina et al., 1996). Posteriormente, se identificó PCV2 en los animales afectados (Allan et al., 1998a). Un año más tarde en España, también fue descrita una enfermedad asociada al PCV2 que cursaba con adelgazamiento (Segalés et al., 1997). En Canadá, PMWS ha sido diagnosticado principalmente en granjas de alto estatus sanitario, libres de las principales enfermedades digestivas y respiratorias que afectan al ganado porcino incluyendo neumonía por Actinobacillus spp., Mycoplasma spp., rinitis atrófica, salmonelosis, disentería porcina, gastroenteritis transmisible y pseudorabia. Dichas granjas así como muchas otras en las que se ha diagnosticado el PMWS eran negativas al virus del síndrome respiratorio y reproductor porcino (PRRSV), de ciclo cerrado, 1 o 2 fases, de cría de lechones y cebaderos con un número de 50 a 1200 madres (Ellis et al., 1998; Harding et al., 1998). Desde estos primeros casos descritos de PMWS asociado a PCV2, dicha enfermedad ha sido identificada en casi todos los países productores de porcino en el mundo (Clark, 1997; Harding, 1997; LeCann et al., 1997; Segalés et al., 1997; Kiupel et al., 1998; Spillane et al., 1998; Choi y Chae, 1999; Hinrichs et al., 1999; Onuki et al., 1999; Choi et al., 2000b; Kiss et al., 2000; Vyt et al., 2000; Wellenberg et al., 2000; Borel et al., 2001; Trujano et al., 2001; Revisión Bibliográfica 40 Celer y Carasova, 2002; Sarradell et al., 2002; Saoulidis et al., 2002; Lawton et al., 2004; Wallgren et al., 2004). En España, Reino Unido y Japón, los estudios retrospectivos realizados en muestras de cerdos procedentes de archivos histológicos desde 1986 y 1989, en los cuales se diagnosticaron lesiones de PMWS, se detectó abundante antígeno de PCV2 (Mori et al., 2000; RodríguezArrioja et al., 2003b; Grierson et al., 2004a). En otras valoraciones retrospectivas, se han encontrado evidencias de infección por PCV2 en cerdos desde 1969 (Sánchez et al., 2001b). Por lo tanto, hay quien piensa que el PMWS no debería considerarse una nueva enfermedad, ni el PCV2 un nuevo virus. Dado que el PCV2 es ubicuo en la población porcina y la infección no equivale necesariamente a enfermedad, Sorden, en 2000, propuso una definición de caso de PMWS. Basándose en dicha definición, el diagnóstico de PMWS requiere 1) la presencia de signos clínicos tales como debilidad, pérdida de peso, con o sin disnea o ictericia; 2) la presencia de lesiones microscópicas típicas asociadas a PCV2 (depleción linfoide y/o infiltrado histiocítico en tejidos linfoides u otros órganos), y 3) antígeno o ácido nucleico de PCV2 asociado a las lesiones microscópicas, detectado mediante IHQ o ISH (Sorden, 2000). Al poco tiempo se hizo evidente que el PMWS describía solo una porción de las enfermedades asociadas a PCV2. Por ejemplo, se puede detectar gran cantidad de antígeno de PCV2 en cerdos adultos o incluso fetos y neonatos que no manifiestan debilidad, o se puede encontrar antígeno de PCV2 únicamente en un sistema orgánico que no sea tejido linfoide, como pulmón o intestino. Por tanto, en 2002, se propuso que las abreviaciones existentes, incluido el PMWS, deberían sustituirse por la de “Enfermedad por Circovirus Porcino” o PCVD (porcine circovirus disease) (Allan et al., 2002a). Esta nomenclatura se usa en Europa para englobar las enfermedades asociadas a PCV2 (Segalés et al., 2005a). Así mismo, en 2012 se propuso una terminología para los diferentes síndromes o expresiones de PCVD y que incluye la infección subclínica (PCV2 subclinical infection, PCV2-SI); enfermedad sistémica (PCV-2 systemic disease, PCV2-SD), donde se incluiría el PMWS; enfermedad respiratoria (PCV-2 lung disease, PCV2-LD) que incluiría también PNP; enfermedad entérica o enteritis (PCV-2 enteric disease,PCV2-ED); enfermedad o fallo reproductivo (PCV-2 reproductive disease PCV2-RD); y síndrome de dermatitis y nefropatía porcina (PDNS) (Segalés, 2012). Revisión Bibliográfica 41 En Norte América, consideraban que cualquier término nuevo usado en conexión con PCV2 debería incluir la palabra “asociado”, lo cual llevó a la creación e introducción del término “enfermedad asociada al circovirus porcino” o PCVAD (porcine circovirus associated disease), propuesto en marzo del 2006 por la Asociación Americana de Veterinarios de Porcino (American Association of Swine Veterinarians, AASV). Hay muchas razones por las cuales el término debilidad o debilitante ha sido eliminado de la definición de caso y categorizaciones: 1) debilidad o debilitante es un término clínico subjetivo usado normalmente en referencia a la pérdida de peso, 2) la pérdida de peso o incapacidad para ganar peso es común en animales con una amplia variedad de diferentes enfermedades infecciosas y no infecciosas, y 3) el término debilidad o debilitante podría asociarse incorrectamente con encefalopatías espongiformes transmisibles observadas en cérvidos (Opriessnig et al., 2007). Basándose en la definición de caso de la AASV de octubre de 2006, PCVAD puede ser subclínica o incluir una o más manifestaciones clínicas tales como enfermedad multisistémica con pérdida de peso, alta mortalidad (doblando la tasa de mortalidad sin introducción de un nuevo patógeno conocido), síntomas respiratorios, PDNS, síntomas digestivos incluyendo diarrea, y trastornos reproductivos individuales o en combinación en una piara o grupo de cerdos. En la base de datos del Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de la Universidad del Estado de Iowa, PCVAD ahora incluye una infección sistémica (categoría que incluye el PMWS), neumonía asociada a PCV2, enteritis asociada a PCV2, fallos reproductivos asociados a PCV2, y PDNS asociado a PCV2. Los casos que son categorizados de esta forma, pueden tener lesiones asociadas a PCV2 que varíen en severidad de moderada a severa y tales descripciones son añadidas a los informes del caso (Opriessnig et al., 2007). 2.8.2.1 Infección Subclínica por PCV2, PCV2-SI La infección subclínica por PCV2 implica que, aunque el PCV2 está presente, no es el responsable de la enfermedad que padezca el cerdo (es decir, baja cantidad de antígeno de PCV2 asociada a lesiones mínimas o sin lesiones). Basándose en cerdos inoculados experimentalmente con PCV2, se sabe que la infección y lesiones por PCV2 pueden estar limitadas a 1 o 2 linfonodos sin causar ningún aparente signo clínico (Opriessnig et al., 2004b y 2006c). Sin embargo, también se ha demostrado experimentalmente que la infección subclínica Revisión Bibliográfica 42 por PCV2 puede estar asociada a efectos indirectos como una disminución en la eficacia de la vacunación frente a PRRSV (Opriessnig et al., 2006e). También se ha descrito la linfoadenitis necrotizante asociada a PCV2 en linfonodos individuales en cerdos clínicamente sanos. La principal lesión en esta forma de presentación es la necrosis centrofolicular, normalmente limitado a 1 o 2 linfonodos. Su importancia se desconoce y se limita a los casos de canales con linfonodos aumentados de tamaños que son requisadas o declaradas no aptas para consumo humano, donde el diagnóstico histopatológico se corresponde con una linfoadenitis necrotizante (Kim y Chae, 2005; Opriessnig et al., 2006c). 2.8.2.2 PCVD Sistémico, PCV2-SD o PMWS PCV2-SD/PMWS afecta principalmente a cerdos de 2-4 meses de edad, aunque también ha sido descrito en animales de 1 a 6 meses. Así mismo existe una sola descripción de un caso natural de PCV2-SD/PMWS en lechones de 3 días de edad (Hirai et al., 2001). El PMWS ha sido descrito en casi todos los tipos de granjas, desde 30 a 10000 madres. La morbilidad y mortalidad en las granjas afectadas de PCV2-SD/PMWS es variable, dependiendo del tipo de granja, práctica de cría y manejo, coinfecciones, etc. Las tasas de morbilidad observadas en las granjas afectadas varían de 4 a 30%, y las de mortalidad entre 4 y 20%, con tasas excepcionales de 50-60% de morbilidad y 70-80% de mortalidad; (Segalés y Domingo, 2002; Segalés et al., 2005a). Factores medioambientales tales como hacinamiento, aire de mal calidad, mezcla de grupos de diferentes edades, y otros factores estresantes podrían exacerbar la severidad de la infección (Harding y Clark, 1997). También se han observado esporádicamente cerdos afectados de PMWS, de forma aislada, en granjas con muy buenos índices de producción y mínima mortalidad postdestete (Segalés et al., 2005a). Por otra parte, en algunas granjas, la mayoría de los cerdos que desarrollan PCV2SD/PMWS pertenecen a unas pocas camadas, sugiriendo un potencial efecto camada (Madec et al., 2000). También se ha descrito que los cerdos machos castrados son más susceptibles a PCV2-SD/PMWS que las hembras (Corrégé et al., 2001; Rodríguez-Arrioja et al., 2002). Los cerdos con un menor peso al nacimiento y al destete tienden a desarrollar PMWS con mayor Revisión Bibliográfica 43 frecuencia, al igual que los cerdos más delgados al inicio del periodo de engorde (Corrégé et al., 2001). Otras enfermedades o infecciones coexisten más frecuentemente en las granjas afectadas de PCV2-SD/PMWS cuando las comparamos con las granjas no afectadas (Ellis et al., 2004). Estas enfermedades incluyen pseudorrabia (enfermedad de Aujeszky), síndrome respiratorio y reproductor porcino (PRRS), parvovirus porcino (PPV), enfermedad de Glässer, meningitis streptocócica, salmonelosis, colibacilosis postdestete, diarreas no especificas, hepatosis dietética, y neumonía bacteriana. Si el incremento de la carga de enfermedades que se encuentra en las granjas afectadas de PCV2-SD/PMWS es consecuencia primaria de PCV2SD/PMWS y la disfunción inmune asociada de los animales afectados, o la causa de PCV2SD/PMWS en asociación con la infección por PCV2 todavía no ha podido ser determinado. Es posible que el desenlace clínico final observado en las granjas afectadas de PMWS sea la suma de los efectos de varias enfermedades concurrentes (Segalés et al., 2005a). El principal signo clínico de PCV2-SD/PMWS es el adelgazamiento, pero se suele ver acompañado de otros signos clínicos, tales como palidez de la piel, distress respiratorio, diarrea, y, en ocasiones, ictericia (Harding and Clark, 1997). Las principales lesiones de PMWS tienen lugar en los tejidos linfoides aunque también se ha detectado infiltrado inflamatorio asociado a la infección por PCV2 en una gran variedad de tejidos de animales afectados. Una característica llamativa de los cerdos en las fases clínicas iniciales de PCV2SD/PMWS es el incremento en tamaño de los linfonodos subcutáneos, principalmente inguinal superficial, aunque no siempre se ve (Segalés et al., 2004b). Este incremento en el tamaño también se distingue fácilmente en los linfonodos bronquial, mediastínicos y mesentéricos. Asimismo, otros linfonodos pueden estar comprometidos. La superficie de corte de los linfonodos es marrón pálido homogéneo o blanquecina, y ligeramente edematosa. En un pequeño número de cerdos afectados, aproximadamente un 2% de los casos, se observa linfoadenitis necrotizante (Segalés et al., 2004b). En otros casos se han observado linfonodos normales e incluso atróficos en fases más avanzadas de PCV2-SD/PMWS (Segalés et al., 2004b) y el timo está normalmente atrófico en los cerdos enfermos (Ladekjaer-Mikkelsen et al., 2002; Darwich et al., 2003b). Un resumen de las lesiones macroscópicas y microscópicas más frecuentes ha sido publicado por Segalés y Domingo, 2002. Revisión Bibliográfica 44 Las lesiones microscópicas en el tejido linfoide de los cerdos afectados de PCV2SD/PMWS son muy características (Clark, 1997; Rosell et al., 1999). Éstas consisten en infiltración de los senos subcapsulares por numerosas células histiocíticas y células gigantes multinucleadas y una pérdida de celularidad en los folículos linfoides (células B). Las células gigantes multinucleadas también pueden aparecer en los folículos linfoides y en la zona parafolicular. Esto es seguido por una depleción de linfocitos en la zona parafolicular (células T) que puede variar en intensidad, desde leve a muy marcada (Clark, 1997; Rosell et al., 1999). En el timo, un hallazgo muy significativo es la atrofia cortical (Darwich et al., 2003b). En un gran número de casos se han observado inclusiones citoplasmáticas en histiocitos y/o células dendríticas. Dichas inclusiones son basófilas o anfófilas, redondeas y de muy diferente tamaño. Estos cambios están asociados con, a menudo, grandes cantidades de antígeno PCV2 intracitoplasmático en células de la línea monocito-macrofágica incluyendo células dendríticas. Los estadios finales de depleción muestran un tejido linfoide vacío, con un estroma prominente y células accesorias (Rosell et al., 1999; Segalés et al., 2005a). Los pulmones pueden estar aumentados de tamaño, no colapsados y de consistencia elástica, siguiendo una distribución difusa, irregular o multifocal. Estos hallazgos se corresponden microscópicamente con una neumonía intersticial, con infiltrado mononuclear peribronquial, peribronquiolar y alveolar. No se observa un daño evidente en las células epiteliales que tapizan las vías aéreas o los alvéolos. En casos avanzados puede haber fibrosis peribronquial y bronquiolitis obliterante (Clark, 1997; Segalés et al., 2004b). Los septos pulmonares intersticiales suelen estar distendidos y llenos de líquido (edema intersticial). Otras lesiones pulmonares frecuentes son bronconeumonía catarral-purulenta de los lóbulos anteriores, o incluso neumonía necrotizante, atribuible a infecciones bacterianas secundarias (Segalés et al., 2005a). Estos cambios histológicos están asociados con la presencia de antígeno PCV2, el cual se encuentra a veces intranuclear en células epiteliales y principalmente intracitoplasmático en fagocitos mononucleares (Allan y Ellis, 2000). El hígado en la mayoría de los cerdos afectados de PCV2-SD/PMWS puede aparecer sin cambios o ligeramente pálido. En unos pocos casos, el hígado está aumentado de tamaño, pálido, con consistencia firme y con una superficie finamente granular (Rosell et al., 2000a). En los casos más avanzados, los cerdos pueden tener el hígado reducido de tamaño, con pérdida marcada de hepatocitos, un aumento de la cantidad de tejido fibroso e infiltrado inflamatorio difuso (Krakowka et al., 2000; Rosell et al., 2000a). Revisión Bibliográfica 51 2007; Segalés, 2012). La bronquiolitis asociada a PCV2 puede parecerse a la producida por SIV o por el coronavirus respiratorio porcino (Opriessnig et al., 2007). La enfermedad respiratoria asociada a PCV2 caracterizada por neumonía broncointersticial y lesiones linfoides típicas de PCV2-SD/PMWS ha sido reproducida en cerdos SPF inoculados con PCV2 (Magar et al., 2000a). Posteriormente, se indujo una enfermedad respiratoria más leve con neumonía intersticial multifocal en cerdos nacidos por cesárea y privados de calostro, inoculados con PCV2 (Bolin et al., 2001). También se indujo neumonía intersticial leve y rinitis linfoplasmocitaria en cerdos convencionales inoculados con PCV2 (Rovira et al., 2002), así como neumonía broncointersticial granulomatosa o histiocítica de leve a moderada en cerdos convencionales cuando se utilizó un clon infeccioso ADN de PCV2 (Fenaux et al., 2002). Según la clasificación de Segalés en 2012, la neumonía proliferativa y necrotizante (proliferative and necrotizing pneumonia, PNP) quedaría incluida dentro de PCV2-LD. PNP es una forma severa de neumonía intersticial descrita por primera vez en Canadá en 1990 (Morin et al., 1990). Afecta a animales entre los 15 días y los 4 meses de edad, con un pico entre las 4 y 10 semanas. Clínicamente se caracteriza por fiebre, disnea, respiración abdominal y ocasionalmente tos. Los animales que sobreviven muestran adelgazamiento y retraso en el crecimiento (Morin et al., 1990; Szeredi and Szentirmai, 2008). Macroscópicamente se observa ausencia de colapso pulmonar, presentado los pulmones un color rojo oscuro grisáceo, aspecto húmedo y consistencia elástica. A nivel histológico la PNP se caracteriza por infiltrado intersticial linfohistiocítico con hiperplasia de neumocitos tipo 2 y, grupos de restos celulares necróticos en la luz alveolar (Morin et al., 1990; Drolet et al., 2003). Otras lesiones que también pueden encontrarse son membranas hialinas, infiltrado linfoplasmocitario y macrófagos intraalveolares, necrosis bronquiolar y células gigantes multinucleadas (Morin et al., 1990). Inicialmente, la etiología de la PNP fue atribuida a una nueva cepa del virus de la influenza porcina tipo A (swine influenza virus, SIV) (Girard et al., 1992). Posteriormente, se aisló de manera repetida PRRSV a partir de lesiones de PNP en ausencia de SIV, por lo que el PRRSV fue propuesto como el principal agente de dicha patología (Larochelle et al., 1994). Fue a finales de los años 90, cuando algunos autores sugirieron la posible participación del PCV2 en Revisión Bibliográfica 52 la PNP (Ellis et al., 1999a), y posteriormente, otro estudio indicó que la PNP era el resultado de la coinfección de PRRSV y PCV2 (Pesch et al., 2000). El papel que el PCV2 juega en la PNP es contradictorio. Mientras que el estudio llevado a cabo por Drolet y colaboradores en 2003 en Canadá sugiere que el PRRSV es el principal causante de la PNP, descartando al PCV2 como agente importante en su desarrollo, basándose en que en los casos estudiados nunca se detectó PCV2 como agente único, en Europa señalan al PCV2 como principal agente etiológico de la PNP (Grau-Roma y Segalés, 2007; Szeredi y Szentirmai, 2008). Sin embargo, en el estudio realizado por Morandi y colaboradores en 2010, en Italia, el PRRSV estuvo más asociado a las lesiones de PNP que el PCV2, aunque la coinfección con ambos virus parecía incrementar la severidad de la enfermedad. Estas diferencias en la etiología podrían deberse a diferencias potenciales en la patogenicidad de distintas cepas del PRRSV (Halbur et al., 1995 y 1996b) y/o PCV2 (Opriessnig et al., 2006f), contexto epidemiológico, susceptibilidad del hospedador y factores ambientales o de manejo. 2.8.2.4 Enteritis asociada a PCV2, PCV2-ED Los casos de enteritis asociada a PCV2 son cada vez más frecuentes. La mayoría de los casos ocurre en cerdos de 6 a 16 semanas de edad (Kim et al., 2004b; Chae, 2005; Opriessnig et al., 2007). La enteritis asociada a PCV2 es similar clínica y anatomopatológicamente a la ileitis subaguda o crónica asociada a Lawsonia intracellularis . La mucosa intestinal está macroscópicamente engrosada y los linfonodos mesentéricos están aumentados de tamaño (Jensen et al., 2006). El examen microscópico confirma la presencia de enteritis granulomatosa caracterizada por atrofia de vellosidades con infiltrado linfohistiocítico transmural, con variable desprendimiento y/o regeneración de las células epiteliales de las glándulas y criptas. Estas lesiones están frecuentemente asociadas a abundante antígeno de PCV2, que se localiza en las células epiteliales de la mucosa afectada y en células monocito-macrofágicas en la mucosa, submucosa, túnica muscular, subserosa, vasos linfáticos y tejido linfoide asociado. Las placas de Peyer presentan las lesiones histológicas características de PCVD (Allan y Ellis, 2000; Jensen et al., 2006). Dado que se han descrito casos de enteritis asociada a PCV2 en una granja aparentemente libre de PCV2-SD/PMWS y PDNS en animales postdestete mediante histopatología y aislamiento de PCV2 e ISH, pero sin presentar depleción linfoide ni sustitución Revisión Bibliográfica 53 histiocítica en los folículos linfoides, se propuso que el diagnóstico de enteritis asociada a PCV2 se caracteriza solamente por, 1) si hay diarrea, 2) si las lesiones linfoides características están presentes en las placas de Peyer, pero no en otros linfonodos, y 3) si antígeno o ácido nucleico de PCV2 está presente en las lesiones (Kim et al., 2004b). 2.8.2.5 Síndrome de Dermatitis y Nefropatía Porcina, PDNS El síndrome de dermatitis y nefropatía porcina (porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS) puede afectar a cerdos en transición y en cebo y, esporádicamente, a animales adultos (Drolet et al., 1999). La prevalencia de este síndrome en las explotaciones afectadas es relativamente baja, siendo menor de un 1%, normalmente entre un 0,05 y un 0,5% (Segalés et al., 1998). Sin embargo, se han detectado prevalencias mayores en el Reino Unido y otros países con un historial de mortalidad en las explotaciones afectadas oscilando entre 0,25 y 20% (Gresham et al., 2000). La mortalidad entre los cerdos de 3 meses de edad o mayores, se acerca al 100%, mientras que en los cerdos afectados de entre 1,5 y 3 meses de edad, es de aproximadamente un 33% (Segalés et al., 1998). Los cerdos con enfermedad aguda severa mueren a los pocos días del inicio de los signos clínicos (Drolet et al., 1999). Los cerdos que sobreviven tienden a recuperar y ganar peso de 7 a 10 días después del comienzo del síndrome (Segalés et al., 1998). Los cerdos afectados de PDNS muestran anorexia, depresión, postración, andar rígido y/o reluctancia al movimiento, y temperatura normal o leve pirexia (Segalés et al., 1998; Drolet et al., 1999). Sin embargo, el signo más obvio en la fase aguda de la enfermedad es la presencia de máculas y pápulas de morfología irregular y color rojo a violáceo con centro negro, localizadas principalmente en las extremidades posteriores y zona perineal, con tendencia a coalescer, pudiendo tener una distribución generalizada en los animales afectados de manera más severa. Con el tiempo, dichas lesiones se cubren por una costra oscura y desaparecen gradualmente, normalmente en 2-3 semanas, dejando en ocasiones cicatrices (Thibault et al., 1998; Drolet et al., 1999). La causa de la muerte en los cerdos afectados de PDNS es un fallo renal agudo (Smith et al., 1993; Helie et al., 1995; Segalés et al., 1998), normalmente con un marcado aumento de Revisión Bibliográfica 54 los niveles de creatina y urea en suero (Drolet et al., 1999). En la piel, las máculas y pápulas de color rojo a oscuras se corresponden microscópicamente con tejido necrótico asociado a vasculitis necrotizante de los capilares y arteriolas de dermis e hipodermis, y amplias hemorragias (Helie et al., 1995; Segalés et al., 1998; Thibault et al., 1998). La vasculitis necrotizante es, además, una característica sistémica, dado que estas lesiones se pueden presentar en cualquier tejido, aunque son más destacadas en la piel, pelvis renal, mesenterio y bazo (Segalés et al., 1998; Thibault et al., 1998). Aparte de las lesiones en piel, los cerdos que mueren de forma aguda con PDNS tienen ambos riñones aumentados de tamaño, los cuales presentan consistencia firme, una superficie cortical finamente granular y edema en pelvis renal (Helie et al., 1995; Ramos-Vera et al 1997; Segalés et al., 1998). La corteza renal presenta múltiples lesiones puntiformes rojizas y de pequeño tamaño, similares a hemorragias petequiales. Las lesiones microscópicas características de PDNS son la vasculitis generalizada y glomerulonefritis, que es indicativa de una reacción de hipersensibilidad tipo 3, que se caracteriza por el depósito de complejos antígeno-anticuerpo o inmunocomplejos en ciertos tejidos. Los glomérulos están aumentados de tamaño, con fibrina, células inflamatorias necróticas y eritrocitos dentro del espacio de Bowman, lo que define una glomerulitis fibrinonecrotizante. Histológicamente, también se puede observar una nefritis intersticial no purulenta, de moderada a severa, con dilatación de los túbulos renales. Los cerdos con un curso prolongado de la enfermedad pueden mostrar una glomerulonefritis crónica, probablemente como resultado de la progresión del daño glomerular inicial (Segalés et al., 1998). Normalmente, tanto las lesiones en piel como las renales están de manera conjunta presentes en el PDNS, pero en algunos casos, pueden aparecer solas, en piel o en riñones (Drolet et al., 1999). Los linfonodos renales, así como otros linfonodos, pueden estar aumentados de tamaño y de color rojo debido al drenaje de sangre desde las zonas afectadas con hemorragias, principalmente en la piel. Microscópicamente, se pueden observar con frecuencia lesiones similares a PCV2-SD/PMWS como depleción linfoide y cierto grado de infiltrado histiocítico y/o células gigantes multinucleadas en los tejido linfoides de los cerdos afectados de PDNS (Ramos-Vera et al., 1997; Segalés et al., 1998; Thibault et al., 1998; Rosell et al., 2000b). Revisión Bibliográfica 55 También puede haber infartos esplénicos como resultado de la vasculitis necrotizante de arterias o arteriolas esplénicas (Wellenberg et al., 2004b). Muchos patógenos, incluidos virus (PRRSV) (Choi y Chae, 2001; Thibault et al., 1998) y bacterias ( Pasteurella multocida , Streptococcus suis tipo 1 y 2, Escherichia coli , Proteus spp., Haemophilus parasuis , Actinobacillus pleuropneumoniae , Bordetella bronchiseptica , Arcanobacterium pyogenes , Staphylococcus aureus , o Salmonella spp.) (Lainson et al., 2002; Thomson et al., 2002) han sido implicados como posibles agentes etiológicos del PDNS. La asociación del PCV2 con el PDNS fue descrita, por primera vez, en el 2000 (Rosell et al., 2000b). El estudio de casos de PDNS observados en Irlanda del Norte en 1990, que en esa época era libre de PRRSV, demostró la presencia de antígeno de PCV2 asociado con linfoadenitis granulomatosa (Allan et al., 2000b). Un estudio caso-control de PDNS en los Países Bajos demostró que existía una asociación significativa entre títulos altos de anticuerpos anti-PCV2 y el desarrollo de PDNS sugiriendo que la base fisiológica causante del PDNS podría ser el excesivo nivel de anticuerpos frente a PCV2 (Wellenberg et al., 2004b). Aunque no se pudo demostrar la presencia de antígeno de PCV2 mediante IHQ en todos los casos de PDNS, si se confirmó la presencia de ADN de PCV2 mediante PCR en todos ellos. También se demostró que no había presencia de ácido nucleico de PPV o PRRSV mediante PCR en muchos de los casos de PDNS (Wellenberg et al., 2004b). Cuando se comparó la carga viral en suero de PCV2 en casos de PMWS y PDNS se observó que los casos de PDNS tenían una cantidad significativamente menor de ADN de PCV2 en suero en relación con cerdos con lesiones moderadas o severas de PMWS. Este estudio también confirmó que los cerdos con PDNS estaban infectados con PCV2 (Olvera et al., 2004). Sin embargo, un estudio mas reciente ha conseguido reproducir experimentalmente el PDNS sin la participación de PCV2. Según los autores, el PDNS sería la manifestación de una coagulación intravascular diseminada (CID), y representaría una coagulopatía sistémica de comienzo súbito que se expresaría clínicamente como microtrombosis de la vasculatura renal y de la dermis. Cualquier agente etiológico epiteliotropo y toxinas bacterianas activarían la cascada de la coagulación y podrían potencialmente iniciar un CID, que desencadena posteriormente un PDNS (Krakowka et al., 2008). Revisión Bibliográfica 56 2.8.2.6 Fallo Reproductivo asociado a PCV2, PCV2-RD Se han descrito fallos reproductivos asociados a PCV2 desde la primera descripción por West y colaboradores en Canadá en 1999 (West et al., 1999; Ladekjaer-Mikkelsen et al., 2001; O`Connor et al., 2001). Las manifestaciones clínicas en las granjas afectadas incluyen abortos, nacidos muertos, momificaciones fetales, y un aumento de la mortalidad predestete. Las explotaciones afectadas son principalmente de cerdas primerizas o de nueva introducción. Los neonatos nacidos muertos o no viables presentan congestión pasiva crónica hepática e hipertrofia cardiaca con áreas multifocales de decoloración del miocardio (West et al., 1999; O´Connor et al., 2001). La lesión microscópica típica en los nacidos muertos o neonatos en infecciones naturales es una miocarditis que puede variar de no supurativa a necrotizante o fibrótica asociada con moderada-abundante cantidad de antígeno o genoma de PCV2 (West et al., 1999; O´Connor et al., 2001; Mikami et al., 2005). La infección experimental intrauterina de fetos con PCV2 dio lugar a la replicación del virus en los fetos y confirma que el corazón es el lugar primario de replicación del PCV2 en los fetos (Sánchez et al., 2001a). Cuando se inocularon fetos en el útero a los 57, 75, y 92 días de gestación, se encontró que la replicación del virus era significativamente mayor en los fetos inoculados a los 57 días de gestación que a los 75 y 92 días de gestación. Todos los fetos fueron sacrificados a los 21 días postinoculación y solo se observaron lesiones macroscópicas consistentes en edema, congestión, hemorragias y hepatomegalia, en los fetos inoculados a los 57 días de gestación (Sánchez et al., 2001a). En otro estudio, 37 fetos de 3 cerdas fueron inoculados intramuscularmente a los 86, 92, y 93 días de gestación, observándose en el momento del parto, 24 lechones normales, 6 nacidos muertos, 5 débiles y 2 momificados, confirmando que el PCV2 puede infectar fetos a término y causar alteraciones reproductivas (Johnson et al., 2002). Estos trabajos han demostrado que las células diana del PCV2 van cambiando de cardiomiocitos, hepatocitos y macrófagos durante la vida fetal a solo macrófagos tras el nacimiento (Sánchez et al., 2003). Sin embargo, como en PCV2-SD/PMWS, no se sabe realmente si los macrófagos mantienen la replicación viral del PCV2, o simplemente acumulan partículas víricas. Revisión Bibliográfica 57 También se ha sugerido, que los títulos altos de PCV2 en los órganos linfoides de fetos infectados de forma intrauterina podrían llevar al desarrollo de lesiones histológicas similares a aquellas observadas en cerdos con PCV2-SD/PMWS sin causar enfermedad (Sánchez et al., 2004). Se ha demostrado experimentalmente la transmisión transplacentaria del PCV2 mediante la inoculación intranasal de reproductoras seronegativas a PCV2 tres semanas antes de la fecha prevista de parto. De estas cerdas, cuatro abortaron y las otras dos parieron prematuramente, y en los lechones nacidos vivos y mortinatos se detectó ácido nucleico y antígeno de PCV2 en tejido linfoide y no linfoide. Sin embargo, no se observaron lesiones histológicas linfoides parecidas a las de PCV2-SD/PMWS ni lesiones cardiacas en los fetos procedentes de las cerdas que habían abortado o que habían parido prematuramente (Park et al., 2005). Esto podría explicarse por el hecho de que la infección por PCV2 tuvo lugar al final de la gestación, dado que las alteraciones cardiacas macroscópicas han sido descritas cuando los fetos eran infectados a la mitad de la gestación (Sánchez et al., 2001a). Más recientemente, otro estudio experimental con inoculación intrauterina con semen infectado con PCV2, dio lugar a fallos reproductivos (mortinatos y fetos momificados), así como viremia en las cerdas y lechones, detectándose antígeno de PCV2 principalmente en el miocardio de los lechones (Madson et al., 2009). Aunque las descripciones experimentales son convincentes sobre el PCV2 como patógeno reproductivo, los datos de casos de campo sugieren que las mayorías de las granjas de reproducción son aparentemente inmunes y que los fallos reproductivos asociados a PCV2 son relativamente raros (Opriessnig et al., 2007). 2.8.2.7 Encefalitis y Temblor Congénito asociado a PCV2 El PCV2 ha sido asociado a sintomatología nerviosa que incluye apatía, ataxia, pedaleo, opistótonos, nistagmo y convulsiones (Corrêa et al., 2007; Seeliger et al., 2007). Macroscópicamente, las lesiones observadas se centraban principalmente a nivel de cerebelo y consistían principalmente en petequias en leptomeninges y edema (Corrêa et al., 2007), así como hiperemia y hemorragias tanto en meninges como en parénquima Revisión Bibliográfica 58 predominantemente en la materia gris y blanca del cerebelo (Bukovsky et al., 2007; Seeliger et al., 2007). Las lesiones histológicas incluyen leptomeningitis, meningoencefalitis y encefalitis, caracterizadas por vasculitis necrotizante linfohistiocitaria en arterias y venas de pequeño a mediano calibre, hipertrofia del endotelio, infiltrado linfohistiocítico perivascular con depósito de fibrina, degeneración y necrosis neuronal, espongiosis, apoptosis de células endoteliales y edema del neuropilo todo ello a nivel de cerebelo. Además se ha observado, infiltrado linfohistiocítico y vasculitis en plexos coroideos, gliosis en médula oblongada, coroiditis linfohistiocítica, meningitis mononuclear asociada a infiltrado perivascular linfohistiocítico y vasculitis (Bukovsky et al., 2007; Corrêa et al., 2007; Seeliger et al., 2007). En cuanto a la demostración del PCV2, mediante IHQ se ha detectado antígeno de PCV2 en el núcleo y citoplasma de macrófagos perivasculares intralesionales, así como en el citoplasma de células endoteliales de los vasos de pequeño y mediano calibre tanto en zonas afectadas como no afectadas del cerebelo y ocasionalmente en leucocitos intra y perivasculares, así como en células similares a fibroblastos (Allan et al., 1999a; Kennedy et al., 2000; Fenaux et al., 2002; Corrêa et al., 2007; Seeliger et al., 2007). Con la técnica de ISH se ha detectado el genoma de PCV2 en el citoplasma de las células endoteliales de los pequeños vasos afectados, y en menor medida en los vasos no afectados, principalmente en cerebelo, y en leucocitos perivasculares. También en células endoteliales de las meninges y en la materia blanca de la médula espinal (Seeliger et al., 2007), así como en células gliales, endoteliales y células con el fenotipo de macrófagos perivasculares y meníngeos o en macrófagos de meninges y perivasculares, en mesencéfalo, cerebelo y médula oblongada (Bukovsky et al., 2007). El tropismo endotelial del PCV2 detectado mediante ISH e IHQ, y la falta de inmunocomplejos detectables en los vasos afectados apunta directamente a un daño vascular del PCV2 (Seeliger et al., 2007). En los casos descritos por Seelinger y colaboradores en 2007, los datos morfológicos e inmunohistoquímicos de presencia de apoptosis en las células endoteliales cerebelares afectadas, indicarían un papel de la apoptosis durante la infección del PCV2. No obstante, no se puede descartar en este caso que la apoptosis de las células endoteliales sea secundaria a la hipoxia local resultante del daño vascular. Revisión Bibliográfica 59 De forma más reciente, Drolet y colaboradores en 2011, han descrito una meningoencefalitis linfohistiocítica-granulomatosa multifocal con células gigantes multinucleadas asociada a PCV2 en dos cerdos en edad de sacrificio. El temblor congénito (CT, congenital tremor) está asociado con hipomielinogénesis o desmielinización del cerebro y médula espinal. El tipo A2 es el más común y se ha asociado a ADV o a infecciones virales sin identificar. Este tipo se caracteriza por contracciones clónicas de diversa intensidad que decrecen con el tiempo, y suelen resolverse normalmente a las cuatro semanas de edad. La mortalidad en los cerdos afectados puede llegar hasta el 50%, como resultado de la incapacidad de los lechones para mamar (Kennedy et al., 2003; Chae, 2005). Stevenson y colaboradores en 2001, detectaron ácido nucleico y antígeno de PCV2 en el encéfalo y médula espinal de animales con CT mediante ISH, inmunofluorescencia indirecta y PCR, principalmente en grandes neuronas y células de Purkinje. Aunque también se detectó en animales clínicamente sanos, la cantidad de células positivas fue mayor en los animales con CT. En ninguno de los dos grupos, afectados y clínicamente sanos, hubo lesiones macro ni microscópicas (Stevenson et al., 2001). Por otro lado, otros estudios no han podido detectar PCV2 en animales con CT (Kennedy et al., 2003; Ha et al., 2005). Por lo tanto, la asociación entre PCV2 y CT es, hoy en día, controvertida y son necesarios más estudios para aclarar el papel del PCV2 en CT. 2.9 Diagnóstico 2.9.1 Diagnóstico de Enfermedad Sistémica por PCV2 Los criterios de diagnóstico de enfermedad sistémica por PCV2 (PCV2-SD/PMWS) están muy bien definidos (Sorden, 2000; Segalés, 2002). Se considera que un cerdo o grupo de cerdos presentan PCV2-SD si cumplen los siguientes criterios (Sorden, 2000): 1. Signos clínicos incluyendo retraso del crecimiento y adelgazamiento, frecuentemente con disnea y aumento del tamaño de los linfonodos inguinales, y ocasionalmente ictericia. Revisión Bibliográfica 60 2. Presencia de lesiones histológicas características en los tejidos linfoides (depleción linfocitaria junto con inflamación granulomatosa-linfohistiocítica y presencia de cuerpos de inclusión en cierto número de cerdos afectados) y/o inflamación granulomatosa-linfohistiocítica en otros órganos (pulmón, hígado, riñón, intestino, páncreas, etc.). 3. Detección, de moderada a elevada, de una cantidad de PCV2 en las lesiones en los tejidos linfoides y otros tejidos de los cerdos afectados. Para diferenciar las diferentes manifestaciones clínicas de PCVD es importante evaluar las lesiones histopatológicas y la presencia de PCV2 en intestinos, pulmones, y tejidos linfoides (Segalés, 2012). Esta definición de caso no excluye la presencia concomitante de otras enfermedades o coinfecciones con PCV2-SD/PMWS. Esto también significa que ni los signos clínicos ni las lesiones macroscópicas observadas en cerdos sospechosos de estar afectados de PCVD son suficientes para diagnosticar la enfermedad, aunque si son indicativas. Sin embargo, la presencia de signos clínicos, lesiones macroscópicas compatibles con PCVD y la demostración de elevada cantidad de PCV2 por diferentes métodos (inmunocitoquímica, captura cuantitativa de antígenos o ELISA de captura o PCR cuantitativa) pueden ser consideradas diagnósticas en ausencia de estudio histopatológico (Segalés et al., 2005a). El diagnóstico de PCVD a nivel de granja tiene que tener en cuenta 1) el porcentaje de cerdos diagnosticados con PCVD de todos los remitidos y 2) un aumento de la mortalidad en la granja estudiada. Por lo general, se considera al PCVD como un problema de granja si se diagnostica PCVD en el 50% o más de los cerdos de una muestra representativa de la granja y si hay un aumento significativo de la mortalidad comparada con parámetros previos de la granja. Se considera como PCVD esporádico si se diagnostica PCVD en menos del 50% de una muestra representativa, simultáneamente con un aumento de la mortalidad o si se diagnostica PCVD en más del 50% de una muestra representativa sin aumento de mortalidad de forma simultánea (Segalés, 2006). Revisión Bibliográfica 67 1. PCR múltiple. Se detecta más de una secuencia diana en un solo paso de PCR. Se ha descrito diversas PCR múltiples: PCV2/PCV1 (Larochelle et al., 1999a; Ouardani et al., 1999; Pogranichnyy et al., 2000), PCV2/PPV (Kim et al., 2001c), PCV2/PPV/ADV (Cao et al., 2005), PCV1/PCV2/ADV/PPV (Huang et al., 2004), PCV2/Mh/ Mycoplasma hyorhinis /PRRSV cepa europea y americana/influenza virus tipo A (Harder y Huebert, 2004), PCV2/CSFV/ASFV/PRRSV/PPV (Giammarioli et al., 2008), PCV2/CSFV/PPV/PRRSV (Jiang et al., 2010) y PCV2/PPV/ADV/PPRSV (Yue et al., 2009). 2. PCR anidada. Permite amplificar un segmento específico de muy pequeño tamaño incluido dentro de fragmentos de ADN más extensos. Hay varias técnicas descritas en la literatura (Larochelle et al., 2000; Kim y Chae, 2001b; Kim et al., 2004a). 3. PCR múltiple anidada para la detección simultanea de PCV1/PCV2/PPV (Kim y Chae, 2003a; Kim et al., 2003e) y PCV1/PCV2 (Kim et al., 2001d). 4. PCR cuantitativa a tiempo real. Permite cuantificar el número de copias del genoma de PCV2 en suero y tejido. La reacción de PCR y detección están combinadas en un paso, lo que reduce el tiempo empleado en la técnica (Brunborg et al., 2004; Chung et al., 2005; Ladekjaer-Mikkelsen et al., 2002; Liu et al., 2000; Olvera et al., 2004; Opriessnig et al., 2003; Rovira et al., 2002). 5. PCR múltiple cuantitativa a tiempo real, para detectar y diferenciar los genotipos 2a y 2b de PCV2 (Gagnon et al., 2008). 6. PCR de transcripción inversa. Se usa para detectar ARN de PCV2, que solo está presente si el PCV2 se replica. Es necesaria la transcripción inversa del ARN para hacer el ADN complementario para una posterior amplificación (Yu et al., 2005). La mayoría de los cerdos en condiciones naturales han tenido contacto con el PCV2 en algún momento de sus vidas. Por lo tanto, el uso de la PCR, que teóricamente puede detectar una copia del genoma, es considerada por muchos investigadores como demasiada sensible. La demostración de ácido nucleico de PCV2 por PCR no puede sustituir la valoración clínica de los cerdos ni el examen microscópico de los tejidos, dado que el PCV2 es ubicuo, y muchos cerdos pueden ser positivos a ADN específico de PCV2 sin estar, necesariamente, clínica y lesionalmente afectados de PCVD (Kim y Chae 2004a). Además, la detección de ácido nucleico de PCV2 en el suero o linfonodo inguinal superficial ha mostrado no tener correlación con las lesiones linfoides microscópicas típicas de PCVD cuando se comparaba con la HIS (Calsamiglia et al., 2002). Revisión Bibliográfica 68 Sin embargo, Caprioli y colaboradores observaron, mediante PCR convencional, que se detectaba ADN de PCV2 con más frecuencia en el suero y plasma de cerdos con cantidades moderadas y elevadas de antígeno de PCV2 en tejidos lesionados (por tanto enfermos), por lo que la PCR podría ser una herramienta útil para el diagnóstico precoz de PCVD en animales vivos (Caprioli et al., 2006). Una excepción podría ser el uso de la PCR para la detección de ácido nucleico de PCV2 en semen, y así asegurar mejor el estatus negativo. Se han descrito varios tipos de PCR para detectar PCV2 en semen (Larochelle et al., 2000; Kim et al., 2001d y 2003e; Pal et al., 2008). La cantidad de ácido nucleico de PCV2 en suero y tejido determinada por PCR cuantitativa a tiempo real es predictiva del resultado clínico y de este modo, puede ser utilizada por los veterinarios en el diagnóstico tanto de clínico como experimental (Brunborg et al., 2004; Olvera et al., 2004). Se ha demostrado que un umbral de 107 o mayor de copias genómicas de PCV2 por mililitro de suero, se correlaciona bien con lesiones graves y enfermedad asociadas a PCV2 y, por tanto, con un mal pronóstico (Brunborg et al., 2004; Olvera et al., 2004). Un resultado de PCR podría ser por lo tanto negativo; positivo sin PCVAD (<106 copias de ADN de PCV2); positivo con sospecha de PCVAD (106 copias de ADN de PCV2); o positivo PCVAD (107 o más copias de ADN de PCV2) (Brunborg et al., 2004). Otros autores han propuesto umbrales de 104.7 (Harding et al., 2008), 106.21 (Grau-Roma et al., 2009), 106.93 (Fort et al., 2007), 107 (Segalés et al., 2005b) y 107.43 (Grau-Roma et al., 2009) copias genómicas/ml de suero, como indicativos de PCVD. Estas variaciones dependen tanto del laboratorio como de la técnica empleada. Por lo tanto, esta PCR no puede sustituir al examen histopatológico y a la detección del PCV2 en tejidos para el diagnóstico de PCVD a nivel individual (Grau-Roma et al., 2009), pero si es de utilidad para el diagnóstico a nivel de granja (Grau-Roma et al., 2011). Los análisis moleculares de ácidos nucleicos se han realizado habitualmente utilizando ADN procedente de tejido fresco o congelado (Kim y Chae 2001b). En el campo del diagnóstico patológico, no siempre se dispone de tejido fresco o en congelación. En la patología veterinaria, la fijación en formalina es el método estándar para la preservación de los tejidos, y son estos los que constituyen la mayor fuente de material para los numerosos estudios a realizar sobre enfermedades del ganado porcino (Kim y Chae, 2004a). Además, este método de fijación permite el envío a los laboratorios de muestras bien preservadas y en un estado no infeccioso (Kim y Chae, 2001b). Revisión Bibliográfica 69 La recuperación de ADN de tejido fijado en formalina y embebido en parafina y el desarrollo de la PCR para la amplificación de regiones especificas han aumentado la posibilidad para los análisis moleculares de tejido embebidos en parafina, teniendo un gran impacto en el campo del diagnóstico patológico. De esta forma se pueden realizar estudios retrospectivos sin necesidad de disponer de tejido fresco o congelado. En comparación con otros métodos de identificación tales como aislamiento viral o ISH, la PCR de tejido fijado en formalina y embebido en parafina es un método sencillo y sensible (Kim y Chae, 2003a). Aunque se considera que dichos tejidos son una fuente pobre de ADN debido a los supuestos daños que ocurren durante el procesado de los tejidos (Greer et al., 1991b) se pueden realizar protocolos optimizados de extracción con pequeñas modificaciones para obtener suficiente ADN de calidad para realizar la PCR y poder realizar estudios retrospectivos. La calidad del ADN y por tanto el éxito de la PCR va a depender de factores como tiempo transcurrido entre la obtención del tejido y su fijación, tipo de fijador, tiempo de fijación, niveles de nucleasas, tiempo de almacenamiento del tejido en el bloque de parafina y longitud del fragmento de ADN a amplificar (Goelz et al., 1985; Ben-Ezra et al., 1991; Greer et al., 1991b; Greer et al., 1994). La presencia de inhibidores de la PCR en tejidos fijados en formalina y embebidos en parafina es un problema que frecuentemente lleva a resultados falsos negativos (An y Fleming, 1991; Bascuñana y Belák, 1996). Para eliminar estos inhibidores, algunos investigadores utilizan complejos protocolos de purificación (An y Fleming, 1991). Sin embargo, habría que sopesar su utilización ya que se incrementa el riesgo de contaminación en cada manipulación. Utilizando como fijador el formol tamponado al 10%, se consiguió amplificar fragmentos de ADN de hasta 1327 pb en muestras fijadas durante 24h y embebidas en parafina, mientras que pasados 30 días, solo se pudieron amplificar fragmentos de 268 pb. (Greer et al., 1991a). Según Bogdan y colaboradores en 2001, la fijación de las muestras hasta 7 días en formalina no afectó a la amplificación de un fragmento de 481 pb de PCV2 (Bogdan et al., 2001). La detección de PCV2 en tejido fijado en formol y embebido en parafina es un método sencillo y sensible que permite una detección fiable en el diagnóstico patológico (Kim y Chae, 2001b), aunque en ocasiones puede haber fallos en la amplificación que dé lugar a falsos negativos (Kiatipattanasakul-Banlunara et al., 2002). Hay que tener en cuenta que la detección Revisión Bibliográfica 70 de ADN de PCV2 por PCR solo es diagnóstica de PCVD si se interpreta junto con las lesiones histológicas características (Chae, 2004) 2.10.1.7 Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restricción (Restriction fraction length polymorphism, RFLP). En el campo de la patología del ganado porcino, la diferenciación de las cepas por RFLP se hace de manera rutinaria para el PRRSV (Wesley et al., 1998) mostrando ser una herramienta epidemiológica útil para determinar si se ha introducido una nueva cepa en la granja, aunque la estabilidad del patrón RFLP de un determinado PRRSV está en duda debido a los continuos cambios genéticos (Cha et al., 2004). Un test PCR-RFLP basado en ORF2 usando las enzimas Hinf I, Hin P1I, Kpn I, Mse I, y Rsa I fue capaz de diferenciar distintas cepas de PCV2 (PCV2A, B, C, D, y E) (Hamel et al., 2000). Por otra parte, el uso de la enzima Nco I sirve para diferenciar PCV1 de PCV2 (Fenaux et al., 2000). Posteriormente, mediante una PCR-RFLP basada en ORF2 y utilizando las enzimas Sau 3AI, Ban II, Nsp I, Xba I, y Cfr I se diferenciaron 9 patrones de PCV2 (Wen et al., 2005). Por lo general, el análisis de los patrones RFLP ofrece un rápido medio para categorizar de forma general las cepas de PCV2; sin embargo, los genomas a menudo varían entre sí, fuera de los sitios de restricción, por lo que se debe tener cautela con la interpretación de los resultados (Opriessnig et al., 2007). 2.10.1.8 Secuenciación. Con el análisis de secuencia es posible caracterizar la información genética y comparar las cepas entre sí (Choi et al., 2002; de Boisséson et al., 2004; Fenaux et al., 2000; Grierson et al., 2004b; Kim y Lyoo, 2002). El PCV2 tiene dos genes principales que están orientados en direcciones opuestas y que representan el 93% de todo el genoma: gen rep (asociado a la replicación; ORF1) y el gen cap (cápside; ORF2) (Kim y Lyoo, 2002; de Boisseson et al., 2004). La diferencia genética entre los aislados de PCV2 se debe principalmente a la variabilidad en ORF2 (90,1-100% de la identidad de secuencia de aminoácidos (de Boisseson et al., 2004; Fenaux et al., 2000). El gen ORF1 parece estar bastante conservado entre los aislados de PCV2 (99-100% de la identidad de secuencia de aminoácidos) (de Boisseson et al., 2004). Para investigar posibles diferencias entre los aislados de PCV2, los laboratorios de diagnóstico e investigación deberían secuenciar solamente el gen ORF2 o la secuencia del genoma entero de PCV2 (de Boisseson et al., 2004; Fenaux et al., 2000). Actualmente, los Revisión Bibliográfica 71 resultados de secuenciación pueden ser una herramienta epidemiológica útil, pero por el momento, no permiten identificar características de virulencia (Opriessnig et al., 2007). 2.10.1.9 Hibridación in situ (ISH). La ISH para PCV2 usa sondas de ADN marcadas que se corresponden con una porción especifica del genoma de PCV2 (Kim y Chae, 2003b; McNeilly et al., 1999; Rosell et al., 1999; Sirinarumitr et al., 2000). Dicha técnica permite visualizar la localización del PCV2 en los tejidos, proporcionando detalles de la arquitectura tisular y celular, correlacionando las lesiones con la presencia de PCV2. Dicha técnica es menos susceptible que la IHQ a las alteraciones estructurales causadas por la fijación en formalina cuando se utilizan tejidos fijados en formalina y embebidos en parafina (Kim y Chae, 2001a). Se han descrito diversas ISH para la detección de múltiples virus en una misma sección de tejido: PCV1/PCV2 (Nawagitgul et al., 2000; Kim y Chae, 2001a), PCV2/PRRS (Sirinarumitr et al., 2001), y PCV2/PPV (Kim y Chae, 2002). 2.10.2 Técnicas Indirectas. Detección de antígenos anti-PCV2. Estudios serológicos La serología se usa principalmente nivel de granja para determinar el momento de infección/contacto por PCV2, mediante análisis secuencial o estudio transversal en la población. Los estudios serológicos han mostrado que los anticuerpos frente a PCV2 están presentes globalmente en casi todas las granjas porcinas estudiadas y en, hasta el 100% de los cerdos en dichas granjas (Magar et al., 2000b; Walker et al., 2000; Opriessnig et al., 2004c). 2.10.2.1 Ensayo Indirecto con Anticuerpos Fluorescentes o Inmunofluorescencia Indirecta (indirect immunofluorescence antibody assay, IFA). Esta técnica ha sido descrita para PCV2 por varios autores (Tischer et al., 1995a; Allan et al., 1998a; Pogranichnyy et al., 2000). Posteriormente se ha descrito una IFA basado en ORF2 (Racine et al., 2004). Al comparar esta nueva técnica con la IFA normal, basada en el PCV2 completo, se determinó que esta última tenía solo una sensibilidad relativa del 57,1% en comparación con la IFA basada en la proteína ORF2 utilizada como referencia (Racine et al., 2004). Los ensayos de inmunofluorescencia también han sido descritos para anticuerpos contra Revisión Bibliográfica 72 el PCV1 no patogénico y parecen ser específicos (Fenaux et al., 2003). Los estudios muestran que hay un bajo nivel de reacción cruzada entre PCV1 y PCV2 en los ensayos IFA (Allan et al., 1998a; Pogranichnyy et al., 2000). 2.10.2.2 Ensayo de Inmunoperoxidasa en Monocapa (indirect immunoperoxidase monolayer assay, IPMA). Dicha técnica es utilizada frecuentemente (Ellis et al., 1998; Blanchard et al., 2003). Una investigación interlaboratorial, en Europa y Canadá, comparó los resultados de IFA e IPMA en 20 muestras de suero. Los resultados revelaron una gran variación de títulos entre los laboratorios, siendo, de manera general, mas altos con IPMA que con IFA. Dichas diferencias pueden atribuirse a las distintas metodologías empleadas en cada laboratorio (McNair et al., 2004). 2.10.2.3 Ensayo de Inmunoabsorción Ligado a Enzima (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA). El ELISA es una técnica sensible para la detección y medida de anticuerpos séricos. Hay diversas publicaciones que describen ELISAs para PCV2 (Nawagitgul et al., 2002; Blanchard et al., 2003; Liu et al., 2004;). En Europa se ha desarrollado un ELISA de captura comercial que detecta PCV2 IgG e IgM (Ingezim® PCV IgG/IgM, Ingenasa, España). La comparación de los niveles de IgG e IgM es útil para determinar el momento de la infección por PCV2: valores de IgM ≥ IgG: infección temprana activa (dentro de los primeros 21 días postinoculación); valores de IgM < IgG: infección activa ya establecida (aproximadamente entre 20 y 50 días postinoculación); valores altos de IgG sin IgM: infección tardía o convaleciente (aproximadamente 2 meses después de la infección) (Segalés et al., 2005c). También hay disponible un ELISA por competición específico contra anticuerpos de PCV2 (SERELISA® PCV2 Ab Mono Blocking, Synbiotics Europe, Francia). Este ELISA también se puede utilizar para detectar anticuerpos específicos de PCV2 en heces (López et al., 2005). 2.10.2.4 Seroneutralización. Dado que el PCV2 no induce un efecto citopático visible en las células infectadas, la seroneutralización requiere o anticuerpos fluorescentes o tinción de inmunoperoxidasa al final Revisión Bibliográfica 73 del test para determinar la presencia o ausencia de replicación del virus. Los requisitos para el pretratamiento de las células para sincronizar el ciclo celular hacen que estos test de neutralización de virus en suero sean difíciles de realizar, y que los valores de la lectura final sean menos exactos (Opriessnig et al., 2007). Se han detectado anticuerpos neutralizantes entre los 15 y 28 días (Pogranichnyy et al., 2000; Meerts et al., 2005b) después de la infección experimental por PCV2. La presencia de anticuerpos neutralizantes se ha correlacionado con la protección o eliminación de la infección por PCV2 en cerdos gnobióticos (Meerts et al., 2006). 2.11 Prevención y Control Las circovirosis porcinas tienen un gran impacto sobre la producción porcina. Se ha estimado que su coste varía entre 562-900 millones de Euros anuales para la Unión Europea, siendo el coste por animal de 2,31 a 16,19 Euros según su presentación sea moderada o severa (Armstrong y Bishop, 2004; Tucker, 2006; Burch, 2007). Las pérdidas pueden ser directas o indirectas. Las directas son debidas a cerdos no viables, incapaces de llegar al peso de mercado. Las pérdidas indirectas vienen dadas por el aumento en el uso de antibióticos en un intento de controlar las infecciones bacterianas concurrentes, y los cambios en las prácticas de manejo de la granja en un intento de reducir el impacto de las PCVD (Segalés et al., 2005a). Por ello se hace necesario aplicar una serie de estrategias de actuación para minimizar su impacto. 2.11.1 Buenas Prácticas de Manejo Antes de la disponibilidad de vacunas para PCV2 en 2006 en Norteamérica, el éxito del tratamiento y control de PCVD estaba principalmente enfocado en asegurar buenas prácticas de producción que minimizasen el estrés, eliminaran las coinfecciones o minimizaran su efecto, y eliminaran los potenciales factores desencadenantes que inducen la estimulación inmune y desencadenan la progresión de infección por PCV2 a PCVD (Opriessnig et al., 2007). Revisión Bibliográfica 74 Estudios prospectivos llevados a cabo en Francia desde 1998, han mostrado claramente que se han producido cambios en el manejo de las granjas severamente afectadas de PCV2SD/PMWS. En este tiempo, se propuso el llamado plan de 20 puntos de Madec para el control de PCVD en las granjas gravemente afectadas (Madec et al., 1999 y 2000). Los principales puntos de este plan han sido resumidos en las 4 reglas de oro e incluyen 1) limitar el contacto cerdo-cerdo, 2) reducción del estrés, 3) buena higiene y 4) buena nutrición. Se han obtenido resultados positivos significativos cuando dichas medidas de manejo han sido aplicadas y se han conseguido mejoras significativas en las tasas de pérdidas cuando el grado de cumplimiento de las medidas recomendadas fue alto (Guilmoto y Wessel-Robert, 2000). En un estudio para determinar los factores de riesgo para PCVD en 62 granjas de España se observó que, la vacunación de las cerdas primerizas contra PRRSV aumentaba la probabilidad de expresión de PCVD y que la vacunación de las cerdas contra la rinitis atrófica disminuía la probabilidad de enfermedad, aunque pudieran ser solo variables de confusión sin una clara razón que pueda explicar estos efectos (López-Soria et al., 2005). La investigación de los factores de manejo asociados con el estatus de las granjas, realizado en 61 explotaciones en Manitoba, Canadá, dio lugar a una fuerte asociación entre el incremento de la mortalidad en lechones y la infección por PCV2, Mh, PRRSV, diarrea causada por E. coli K88, proximidad de otras granjas, múltiples proveedores, amplio rango de edades dentro del mismo grupo de cerdos, y el no uso de plasma seco pulverizado en la primera ración en la transición (Dewey et al., 2006). 2.11.2 Desinfección Una desinfección adecuada de las instalaciones es otro de los puntos clave para el control de PCVD. Se recomienda el uso, en edificios y medios de transporte, de los desinfectantes que han mostrado ser eficaces contra el PCV2. Se ha observado una reducción estadísticamente significativa de los títulos víricos in vitro con hidróxido sódico, Virkon® S (agente oxidante), lejía Clorox® (agente oxidante), Roccal® D Plus (amonio cuaternario), Fulsan® (amonio cuaternario), 1-Stroke Environ® (compuesto fenólico), y Tek-Trol® (compuesto fenólico) (Royer et al., 2001), así como con cloro activo, aldehídos con o sin amonio cuaternario y monopersulfato potásico en condiciones laboratoriales controladas (Martin et al., 2008). Revisión Bibliográfica 75 La efectividad real de los desinfectantes en condiciones de campo se desconoce. En las instalaciones de la Universidad del Estado de Iowa, se sigue habitualmente el siguiente protocolo: tras retirar los animales, las salas y corrales se cubren con un producto detergente desengrasante, aplicado en forma de espuma a una dilución de 1:64. Tras 10 minutos, el producto detergente desengrasante se aclara con agua caliente aplicada a presión. La descontaminación se realiza con la aplicación de Virkon® S a una dilución de 1:30 dejando actuar el producto durante 10 minutos, seguido de un aclarado con agua caliente. Antes de la llegada de nuevos animales, las instalaciones son nebulizadas con Clidox® S (agente oxidante) a una dilución de 1:5:1 y se deja secar. Para minimizar la corrosión, las instalaciones son aclaradas con agua de 6 a 12 horas después de la nebulización y se dejan secar antes de introducir nuevos cerdos (Opriessnig et al., 2007). 2.11.3 Control de Coinfecciones Las coinfecciones juegan un importante papel en PCVD, tanto a nivel experimental como en infecciones naturales (Allan et al., 1999a; Krakowka et al., 2000; Harms et al., 2001; Rovira et al., 2002; Opriessnig et at., 2004b; Grau-Roma et al., 2011) y los diferentes estudios realizados indican que el diagnóstico y control de otros agentes infecciosos encontrados en cerdos con PCVD disminuyen la gravedad del cuadro clínico-lesional (Opriessnig et al., 2007). Como se ha dicho anteriormente, aunque la activación inmune puede ser un importante factor desencadenante de PCVD y un hecho crucial en la patogenia de la enfermedad, desde el punto de vista práctico, el excluir el uso de las vacunas de los programas sanitarios puede ser inadecuado, en la medida que el riesgo de eliminar vacunas eficaces, es mayor que el riesgo de inducir PCVD en un bajo porcentaje de cerdos en la población porcina. Por lo tanto, en base a los resultados disponibles, los productores con granjas afectadas de PCVD deberían determinar el momento aproximado de la infección por PCV2, con el objetivo de replanificar las vacunaciones como un potencial plan para minimizar la enfermedad (Opriessnig et al., 2003). Desde un punto de vista práctico, los intentos de controlar las PCVD mediante la vacunación frente a PPV en cebaderos en EEUU, con circulación confirmada de PPV, han sido repetidamente exitosos (Halbur, 2001). Sin embargo, el efecto positivo de la vacunación frente a PPV en la reducción de la incidencia clínica de PCV2-SD/PMWS no se ha probado experimentalmente (Opriessnig et al., 2004a). El efecto del PRRSV puede ser eliminado o minimizado mediante vacunación frente a PRRSV de las granjas de cría y en los lechones, Revisión Bibliográfica 76 mejorando el estado sanitario y la productividad, reduciendo los efectos de PCVD (Mavromatis et al., 1999; Alexopoulos et al., 2005; Kritas et al., 2007). Un estudio evaluó las pérdidas o ganancias asociadas con el uso de 3 bacterinas comerciales de Mh con diferentes coadyuvantes en cerdos coinfectados experimentalmente con Mh y PCV2 (Halbur et al., 2006). Un total de 296 cerdos negativos a Mh fueron asignados aleatoriamente a uno de los 4 grupos de tratamiento. Se probaron tres vacunas comerciales, administradas según indicaciones del fabricante: 2 bacterinas con adyuvante oleoso, y 1 bacterina con adyuvante acuoso. El desafío frente a Mh indujo lesiones macroscópicas y microscópicas graves en los cerdos no vacunados. Los cerdos de todos los grupos vacunados tuvieron una media de peso corporal y una ganancia media diaria significativamente mayor a los 100 y 131 días postinoculación comparados con los controles no vacunados (Halbur et al., 2006). Por el contrario, otro estudio de campo con 930 cerdos de cebo de 53 a 54 días de edad, no encontró diferencias en la incidencia del PCV2-SD/PMWS (pérdida de peso o adelgazamiento, lesiones histopatológicas características, antígeno de PCV2 intralesional) entre los cerdos vacunados frente a Mh y los vacunados con placebo (Haruna et al., 2006). Se ha demostrado que para minimizar el efecto potenciador de los productos adyuvantes de las vacunas de Mh sobre la replicación del PCV2 y lesiones asociadas a PCV2, los cerdos deberían ser vacunados de 2 a 4 semanas antes de la exposición estimada al PCV2 (Opriessnig et al., 2006b). Las infecciones bacterianas específicas ( S.suis, H. parasuis, P. multocida, L. intracellularis, Salmonella spp.) tienen que ser confirmadas y pueden ser minimizadas mediante el uso de antimicrobianos y bacterinas apropiadas. El uso de clortetraciclina (Aureomycin) a una dosis aproximada de 22mg/Kg en la comida de cerdos experimentalmente coinfectados con Mh y PCV2, aportó pruebas de que dicho tratamiento es altamente eficaz en reducir las lesiones producidas por la coinfección de PCV2 y Mh (Opriessnig et al., 2006h). El uso de antiinflamatorios también podría ser de utilidad. Se ha demostrado que el uso en la comida de ácido acetilsalicílico reduce significativamente la incidencia de tratamiento antibiótico en cerdos tratados comparados con cerdos no tratados en granjas, con una mortalidad postdestete del 10 al 15% (Fruergaard et al., 2006). Material y Métodos 83 3.1 Material En el presente estudio se utilizaron 25 animales procedentes de una explotación de porcinos híbridos, de 130 madres y ciclo cerrado, ubicada en Gran Canaria. Esta explotación tenía un plan sanitario que incluía la vacunación de las reproductoras frente a ADV (AD live Suivax, Fatro Iberica), MR y PPV (Parvosuin-MR, Hipra), y de los lechones frente a Mh (Stellamune Uno, Pfizer).Presentaba un estado sanitario de nivel 2 según los parámetros descritos por Muñóz y colaboradores en 2007, siendo la mortalidad esperada en transición o postdestete para este nivel de un 1.5-2%. En dicha explotación se produjo un aumento de la tasa de mortalidad en lechones de 2 meses de edad llegando la misma a un 17%. Los principales signos clínicos observados fueron retraso en el crecimiento, adelgazamiento, taquipnea, disnea y, en algunos casos, diarrea. Se remitieron 14 animales vivos con esta sintomatología al Servicio de Necropsias del Departamento de Morfología e Instituto Universitario de Sanidad Animal y Seguridad Alimentario (IUSA) de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria (ULPGC) y fueron sacrificados mediante sedación profunda por vía endovenosa con tiobarbital (Grupo B.Braun, Barcelona, España). De estos animales, previamente al sacrificio, se extrajo sangre a partir de la vena cava craneal, que fue depositada en tubos, con y sin anticoagulante (EDTA). En el presente estudio también se incluyeron 11 animales hallados muertos en la explotación donde se les practicó la necropsia, siempre dentro de las 24 horas posteriores a su muerte, o se trasladaron a la Facultad de Veterinaria con igual fin, igualmente, dentro de las 24 horas posteriores a su muerte. A cada animal se le practicó una necropsia completa y reglada (King et al., 1989), y del mismo se recogieron sistemáticamente muestras para su posterior estudio. Las muestras tomadas para su posterior estudio histológico, histoquímico e inmunohistoquímico, se fijaron en formol tamponado al 10% durante 24-48 horas, y después se procesaron rutinariamente, en un procesador automático de tejidos (Leica TP-1050, Leica Instruments, Gmbh, Nussloch, Alemania) hasta su inclusión en parafina. Para los estudios microbiológicos y de biología molecular las muestras tisulares y de exudados se almacenaron en congelación a -80°C. Los tubos con sangre sin anticoagulante se centrifugaron a 5000 rpm durante 10 minutos para Material y Métodos 84 separar el suero de la fracción celular. Dicho suero se recogió en Eppendorf y se almacenó en congelación a -80ºC. La sangre con anticoagulante se conservó también en congelación a -80°C. 3.2 Métodos 3.2.1 Estudio Histológico Las muestras fijadas en formol tamponado al 10% e incluidas en parafina se cortaron con un microtomo (Leica RM 2135, Leica Instruments, Gmbh, Nussloch, Alemania) a 5 µm de grosor para, posteriormente, ser desparafinadas, rehidratadas y teñidas con hematoxilinaeosina (protocolo de H-E). Todas las muestras se analizaron con un microscopio óptico, con objetivos ópticos de diferentes aumentos, con el fin de valorar las posibles lesiones y realizar un diagnóstico histopatológico. De forma específica, en el tejido linfoide (linfonodos inguinal superficial, iliaco, mediastínico y mesentérico, tonsila y bazo), se evaluó el grado de depleción linfoide (- normal, + leve pérdida de celularidad, ++ moderada, +++ severa con pérdida de la estructura folicular), el grado de infiltrado histiocítico-granulomatoso (- ausencia, + leve infiltrado, ++ moderado, +++ severo con reemplazamiento de folículos), y la presencia de células gigantes multinucleadas y de cuerpos de inclusión (Quintana et al., 2001; Opriessnig et al., 2004b). Para determinar en qué órgano-tejido linfoide (linfonodos, tonsila y bazo) había mayor grado de depleción linfoide y/o de histiocitosis, a cada grado de lesión se le asignó un valor (0: ausencia, 1: leve, 2: moderado, 3: severo), y se sumaron los valores de cada tejido en el total de los 25 animales, por lo que la puntuación máxima para un tejido sería 75 (3x25). Material y Métodos 85 3.2.2 Estudio Histoquímico Para la demostración del Cilia Associated Respiratory Bacillus (CAR-bacillus) se utilizó la técnica argéntica de Warthin-Starry (W-S). Para ello se emplearon muestras de pulmón y tráquea fijadas en formol tamponado al 10% e incluidas en parafina. Dichas muestras fueron cortadas con un microtomo a 4 µm de grosor para, posteriormente, aplicar sobre los cortes tisulares la técnica (protocolo W-S). El CAR-bacillus se visualizó como estructuras bacilares de color negro en la superficie ciliar del epitelio respiratorio. La presencia de CAR-bacillus se valoró como ausencia (-), leve (+), moderada (++), y severa (+++). 3.2.3 Estudio Inmunohistoquímico Para la detección inmunohistoquímica de los diferentes agentes patógenos se utilizaron tejidos fijados en formol tamponado al 10%, procesados e incluidos en parafina. Dichas muestras se cortaron en un microtomo a 3 µm y se recogieron en portaobjetos tratados con Poly-L-lysina, manteniéndolos, al menos durante 18 horas, en estufa a 37°C para lograr una mejor adherencia del corte, a fin de evitar su desprendimiento durante la realización de la técnica. La demostración de los antígenos se realizó utilizando la técnica del Complejo Streptavidina-Biotina-Peroxidasa (SBP) (Dako-StreptAB-Complex/HRP, Dako, Glostrup, Dinamarca), siguiendo los métodos básicos descritos anteriormente por otros autores (Halbur et al. 1994; McNeilly et al., 2001). Previamente al inicio de la técnica, las muestras se desparafinaron y rehidrataron mediante pases sucesivos por xilol y alcoholes de graduación decreciente. La inhibición de la peroxidasa endógena tisular se realizó mediante la inmersión de los cortes en una solución constituida por peróxido de hidrógeno diluido en metanol al 3% durante 30 minutos. En función del antígeno a detectar, se utilizaron diferentes anticuerpos primarios monoclonales y/o sueros policlonales, y anticuerpos secundarios (Tabla 3.1 y 3.2). Material y Métodos 86 Tabla 3.1. Relación de anticuerpos primarios utilizados en el estudio. Anticuerpo Tipo Especificidad Pretratamiento Dilución Fuente C2-36A9 Monoclonal Anti-PCV2 Sin pretratamiento 1/200 Ingenasa 1AC7 Monoclonal Anti-PRRSV Pronasa 8 min a 37°C 1/250 Ingenasa Mh Policlonal Anti-Mh Pronasa 5 min 1/800 Danish Vet. Lab. E.Aujeszky Policlonal Anti-ADV Sin pretratamiento 1/800 Dr. Poveda 2CF2 Monoclonal Anti-ADV Sin pretratamiento 1/10 Ingenasa Pasteurella Policlonal Anti-Pasteurella spp. Mannheimia haemolitica y P. multocida Pronasa 5 min 1/200 Ball, H.J (Veterinary Research Laboratories, Stormont, Belfast) Tabla 3.2. Relación de anticuerpos secundarios utilizados en el estudio. Anticuerpo Secundario Anticuerpo Primario Dilución Fuente Anti-IgG de ratón biotinado desarrollado en conejo C2-36A9 (Anti-PCV2) 1/20 Dako, Glostrup, Dinamarca 1AC7 (Anti-PRRSV) 2CF2 (Anti-ADV) Anti-IgG de conejo biotinado desarrollado en cerdo Mh (Anti-Mh) 1/200 Dako, Glostrup, Dinamarca E. Aujeszky (Anti-ADV) Pasteurella (Anti-Pasteurella spp.) Material y Métodos 87 3.2.3.1 Técnica Inmunohistoquímica para la Detección de Antígenos de PCV2 Para la selección del anticuerpo adecuado para la detección antigénica de PCV2 mediante técnicas inmunohistoquímicas, se realizó una estandarización preliminar utilizando 16 anticuerpos monoclonales (C2-34H6, C2-34F3, C2-36G7, C2-34F11, C2-35D11, C2-34C9, C231F9, C2-33G1, C2-36A9, C2-35H1, C2-36F1, C2-36A3, C2-37E9, C2-33H4, C2-21H7, C2-23H8) específicos contra este virus, elaborados y cedidos por los laboratorios Ingenasa S.A. (Madrid), quienes solicitaron su valoración para posteriormente ser comercializados. La técnica empleada fue la Streptovidina-Biotina-Peroxidasa (SBP) y revelado con Diaminobencidina (DAB) (3,3’, tetrahidrocloruro de diaminobencidina) (Sigma Chemical Company, St. Louis MO, EEUU). La dilución del anticuerpo primario fue de 1/1, 1/10, 1/50, 1/100 y 1/200, con y sin pretratamiento para el desenmascaramiento antigénico (recuperación antigénica enzimática con proteasa y tratamiento térmico con buffer citrato). Posteriormente, se empleó suero normal de cabra y de conejo como procedimiento de preincubación, y luego, se utilizó el anticuerpo primario (anti-PCV2) que se incubó 18 horas a 4°C, o durante 4 horas a temperatura ambiente. Las pruebas se realizaron sobre muestras, cedidas por el Dr. Segalés de la Universidad Autónoma de Barcelona, de tonsila y linfonodo de cerdos infectados naturalmente con PCV2, y la infección se confirmó mediante ISH. El anticuerpo monoclonal seleccionado fue el C2-36A9, a una dilución de 1/200 en suero normal de conejo, sin pretratamiento e incubación de 18 horas a 4°C. Éste fue el procedimiento de elección al presentar los mejores resultados inmunohistoquímicos. La inmunorreacción positiva se detectó como un granulado de color marrón oscuro, localizado principalmente en el citoplasma de células linfohistiocíticas. Dicho anticuerpo fue el utilizado en las muestras problema y se seleccionó como cromógeno el 3-amino-9-aetilcarbazol (AEC) (Sigma Chemical Company, St. Louis MO, EEUU) para minimizar las interferencias con pigmentos hemáticos (Protocolo PCV2). La inmunorreacción frente al antígeno de PCV2 en los diferentes tejidos estudiados se valoró como ausencia (-), leve (+) (<15%), moderada (++) (15-50%), y severa (+++) (>50%) (Modificado de Rosell et al., 1999; Quintana et al., 2001; Opriessnig y cols. 2004b). Material y Métodos 88 Para determinar en qué tejido se detectó mayor porcentaje de inmunorreacción frente a PCV2, se asignó un valor (0: ausencia, 1: leve, 2: moderado, 3: severo), y se sumaron los valores de cada tejido en el total de los 25 animales, por lo que la puntuación máxima para un tejido sería 75 (3x25). 3.2.3.2 Criterios de Clasificación de la Severidad de PCV2-SD/PMWS Los criterios utilizados se basaron en el sistema de puntación descrito por Opriessnig y colaborares, (2004b y 2007). En nuestro estudio, se seleccionaron 6 tejidos linfoides (linfonodos inguinal superficial, iliaco, mediastínico y mesentérico, tonsila y bazo). De cada tejido se valora la depleción linfoide, histiocitosis e IHQ de PCV2, dando valores de 0 a 3 para cada uno de dichos parámetros (0: ausencia, 1: leve, 2: moderado, 3: severo), por lo que la máxima puntuación de cada tejido sería 9. La puntuación individual de los 6 tejidos se suma y se divide entre 6. Según el valor obtenido, los animales se dividen en cuatro categorías: Categoría I 0: normal (sin lesiones asociadas a PCV2) Categoría II 1-3: leve Categoría III 4-6: moderado Categoría IV 7-9: severo Para diagnosticar enfermedad sistémica asociada a PCV2, es necesario, al menos, demostrar antígeno de PCV2 en más de un tejido linfoide (linfonodo, tonsila, bazo), o en un tejido linfoide y en, al menos, otro sistema (pulmón, hígado, riñón, intestino), o en dos sistemas. Si se asocia abundante cantidad de antígeno de PCV2 sólo con un sistema u órgano específico, debería denominarse enfermedad respiratoria asociada a PCV2, enteritis asociada a PCV2, o fallo reproductivo asociado a PCV2, más que enfermedad sistémica asociada a PCV2. Si hay una cantidad limitada de antígeno de PCV2 y lesiones severas, esto es compatible con PCVD crónica severa. Mediante la combinación de la puntuación de las lesiones y cantidad de antígeno de PCV2, es posible determinar el estadio de la infección (Opriessnig et al., 2004b y 2007) (Tabla 3.3). Material y Métodos 89 Tabla 3.3. Estimación del estadio de infección por PCV2. Agudo Subagudo Crónico Resolución (7– 14 dpi)* (10–21 dpi) (21–28 dpi) (28–49 dpi) Depleción 0-1 2-3 3 2-3 Histiocitosis 0-1 1 2-3 2-3 Antígeno PCV2 3 3 2-3 0-1 *dpi: días post-infección con PCV2. Adaptado de Opriessnig y colaboradores, 2007. 3.2.3.3 Técnica Inmunohistoquímica para la Detección de Antígenos de PRRSV Para la detección de antígeno del virus del síndrome respiratorio y reproductor porcino (PRRSV), se utilizó un anticuerpo monoclonal identificado como 1AC7 suministrado por Ingenasa S.A. (Madrid), a una dilución de 1/250, con pretratamiento (proteasa al 0.1% en PBS) mediante inmersión durante 8 minutos a 37°C, revelado con 3-amino-9-aetilcarbazol (AEC) (Sigma Chemical Company, St. Louis MO, EEUU) (Protocolo PRRSV). Como control positivo se utilizaron muestras de pulmón de cerdo infectado experimentalmente con el virus del PRRS y cedidas por el Dr. Segalés de la Universidad Autónoma de Barcelona. En dicho control se observó inmunorreacción granular positiva a PRRSV de color rojo en el citoplasma de células histiocíticas presentes en los septos alveolares y en la luz de las vías aéreas. La inmunorreacción frente al antígeno de PRRSV en los diferentes tejidos estudiados se valoró como ausencia (-), leve (+) (<15%), moderada (++) (15-50%), y severa (+++) (>50%) (modificado de Narita e Ishii, 2004). 3.2.3.4 Técnica Inmunohistoquímica para la Detección de Antígenos de ADV Para la detección de antígeno del virus de la Enfermedad de Aujeszky (ADV, Aujeszky Disease Virus) mediante la técnica inmunohistoquímica se utilizó un suero policlonal y un anticuerpo monoclonal. Material y Métodos 90 Suero Policlonal Se utilizó un suero policlonal creado en conejo contra el virus de la Enfermedad de Aujeszky (antígenos vacunales del ADV), creado por el Dr. Poveda en la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Córdoba. Este suero policlonal se empleó a una dilución 1/800, sin pretratamiento, y se reveló con diaminobenzidina (DAB) (3,3’, tetrahidrocloruro de diaminobencidina) (Sigma Sigma Chemical Company, St. Louis MO, EEUU) (Protocolo ADV). Como control positivo se utilizó tejido nervioso de un cerdo inoculado experimentalmente con ADV. En dicho control se observó inmunorreacción granular positiva a ADV de color marrón oscuro en el citoplasma y núcleo de neuronas y astrocitos de la corteza cerebral. Anticuerpo Monoclonal De forma previa a la aplicación de esta técnica en las muestras problema, se procedió a la selección de un anticuerpo monoclonal suministrado por Ingenasa S.A. (Madrid). Los anticuerpos empleados se identificaron como 2CF2, 2EF1, 2CG6, 2BD1, 2AE11. Se procedió a la estandarización de los anticuerpos utilizando la técnica SBP, revelando con diaminobenzidina (DAB) (3,3’, tetrahidrocloruro de diaminobencidina) (Sigma Chemical Company, St. Louis MO, EEUU) a una dilución de anticuerpo primario de 1/10, 1/50, 1/100 y 1/200, sin pretratamiento, y con pretratamiento para el desenmascaramiento antigénico (recuperación antigénica enzimática con proteasa al 0,1% en PBS). La técnica se realizó sobre el tejido control positivo descrito anteriormente. Con el anticuerpo 2CF2, sin pretratamiento, y a una dilución de 1/10, 1/50, 1/100, 1/200, se detectó inmunorreacción positiva, (fino granulado de color marrón) en el citoplasma y, en menor medida en el núcleo de neuronas y astrocitos de la corteza cerebral. La dilución 1/10 mostró una reacción más evidente que el resto de diluciones. No se observó reacción con los demás anticuerpos. Por lo tanto, el anticuerpo 2CF2 a una dilución de 1/10 sin pretratamiento, y revelado con 3-amino-9-aetilcarbazol (AEC) (Sigma Sigma Chemical Company, St. Louis MO, EEUU) fue la técnica seleccionada (Protocolo ADV). Material y Métodos 91 3.2.3.5 Técnica Inmunohistoquímica para la Detección de Antígenos de Mh Para la detección de antígeno de Mycoplasma hyopneumoniae (Mh) se utilizó un suero policlonal suministrado por Danish Vet. Lab., a una dilución de 1/800 con pretratamiento (recuperación antigénica enzimática con proteasa al 0,1% en PBS) durante 5 minutos y revelado con 3-amino-9-aetilcarbazol (AEC) (Sigma Chemical Company, St. Louis MO, EEUU) (Protocolo Mh). Como control positivo se utilizó pulmón de cerdo inoculado experimentalmente con Mh (Tesis doctoral Dr. Lorenzo). En dicho control se observó inmunorreacción granular positiva a Mh con un color rojo en la superficie del epitelio ciliado de bronquios y bronquiolos. La inmunorreacción frente al antígeno de Mh en pulmón y tráquea se valoró como ausencia (-), leve (+) (<15%), moderada (++) (15-50%), y severa (+++) (>50%) (modificado de Opriessnig et al., 2004b). 3.2.3.6 Técnica Inmunohistoquímica para la Detección de Antígenos de la familia Pasteurellaceae Para la detección de antígeno de la familia Pasteurellaceae se utilizaron sueros policlonales suministrados por el Dr. Ball (Veterinary Research Laboratories, Stormont, Belfast), frente a Pasteurella spp, Mannheimia haemolitica (Pasteurella haemolitica) , y Pasteurella multocida a una dilución de 1/200 con pretratamiento (recuperación antigénica enzimática con proteasa al 0,1% en PBS) durante 5 minutos y revelado con 3-amino-9-aetilcarbazol (AEC) (Sigma Chemical Company, St. Louis MO, EEUU) (Protocolo Pasteurella). Como control positivo se utilizaron pulmones de cerdos infectados naturalmente con Pasteurella spp , Mannheimia haemolitica , y Pasteurella multocida cuya presencia se confirmó mediante cultivo microbiológico. En dichos controles se observó reacción positiva de forma bacilar-granular de color rojo, de forma extracelular en el exudado presente en bronquios y bronquiolos, así como en el citoplasma de células histiocíticas. Material y Métodos 92 La inmunorreacción frente a antígenos de Pasteurella spp., Mannheimia haemolitica (P. haemolitica) , y P. multocida en pulmón se valoró como ausencia (-), leve (+) (<15%), moderada (++) (15-50%), y severa (+++) (>50%) 3.2.4 Estudio Microbiológico Muestras de diversos tejidos (pulmón, tonsila, encéfalo, riñón, hígado y linfonodos) y exudados (pericárdico y articular), conservadas a -80°C, procedentes de 20 animales se remitieron al Laboratorio de Vigilancia Sanitaria Veterinaria (VISAVET) de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid, donde se realizó el correspondiente estudio microbiológico. Para llevar a cabo el mismo, la superficie de las muestras se esterilizó mediante calor y posteriormente se accedió al interior del tejido mediante un corte con bisturí estéril, zona de la que se tomaron muestras mediante un hisopo estéril. Posteriormente, estos hisopos se utilizaron para la siembra, en condiciones de aerobiosis a 37°C durante 24 horas, en un medio de agar Columbia con 5% de sangre de cordero (agar-sangre) (Biomerieux, Madrid, España). Tras dicho periodo de incubación se procedió a resembrar de nuevo en agar-sangre e incubar a 37°C, durante 24 horas, aquellas colonias de mayor crecimiento o aquellas sospechosas de ser Streptococcus spp. y/o Pasteurella spp . Las colonias se identificaron mediante pruebas bioquímicas básicas (Gram, oxidasa y catalasa) y galerías API multisustrato (Biomerieux, Madrid, España). Finalmente se procedió a realizar un antibiograma de la bacteria identificada. Igualmente, se sembró en un medio específico, agar chocolate Polivitex (Biomerieux, Madrid, España), en condiciones de microaerofília y se incubaron a 37°C durante 48 horas. Transcurrido dicho tiempo, las colonias sospechosas de Actinobacillus spp. y/o Haemophilus spp. se resembraron en el mismo medio de cultivo y se mantuvieron en las mismas condiciones anteriormente descritas. 48 horas después de su incubación, se procedió a realizar la prueba del CAMP, sembrando las colonias en agar sangre junto con Staphylococcus aureus y se incubaron durante 24 horas a 37°C en condiciones de microaerofilia. Cuando esta prueba resultó negativa, la colonia se identificó como Haemophilus spp. y, en caso contrario, se Material y Métodos 99 Tris Buffer Salino (TBS) pH 7,6 • 180 ml de suero salino 0,85%: mezclar 8,5 g de cloruro sódico (NaCl) (Panreac, Química S. A., Barcelona, España) en1000 ml de agua destilada. • 20 ml de Tris madre: mezclar 60,57 g de Trizma base (Sigma Chemical Company, St. Louis MO, EEUU) con 500 ml de agua destilada. Añadir 300-400 ml de ácido clorhídrico (ClH) 1N, hasta conseguir un pH de 7,6. Solución reveladora Diaminobencidina (DAB) • Diluir 0,07 g de diaminobencidina (DAB) (3,3’, tetrahidrocloruro de diaminobencidina) (Sigma Chemical Company, St. Louis MO, EEUU) en 200 ml de TBS. • Filtrar con doble papel de filtro en oscuridad. • Añadir 200 µl de peróxido de hidrógeno (Panreac, Química S. A., Barcelona, España) al 3% justo antes de utilizar la solución. 3.4 Protocolos Empleados Tinción de Hematoxilina-Eosina (H-E) Protocolo de desparafinado • Poner los cristales en estufa a 100°C, durante 30 minutos, lo que favorece la adhesión del corte de tejido al portaobjetos y el licuado de la parafina circundante. • 2 pases de 2 minutos por xilol. • 2 pases de 2 minutos por alcohol de 100°. • 1 pase de 2 minutos por alcohol de 70°. • 3 pases de 2 minutos por agua destilada. Batería de Tinción • Hematoxilina de Harris (Thermo Electron Corporation, Pittsburg PA, EEUU) durante 15 minutos. • Aclarado en agua corriente. • 4 pases rápidos por alcohol clorhídrico. Material y Métodos 100 • Aclarado en agua corriente. • 15 pases rápidos por agua amoniacal. • Lavado en agua corriente durante 15 minutos. • Eosina durante 4 minutos. • 2 pases de 2 minutos por alcohol de 96°. • 2 pases de 2 minutos por alcohol de 100°. • 3 pases de 2 minutos por xilol. • Montaje con resina DPX (Panreac, Química S. A., Barcelona, España). Técnica de Warthin-Starry (W-S) Soluciones utilizadas: Agua Acidificada: • 1000 ml de agua bidestilada. • Añadir una solución de ácido cítrico (Probus, Badalona, España) al 1% (1 mg en 100 ml de agua destilada) hasta pH 4,0. Nitrato de Plata al 1%: • 1 g de nitrato de plata (AgNO3) (Panreac, Química S. A., Barcelona, España). • 100 ml de agua acidificada. Nitrato de Plata al 2%: • 2 g de nitrato de plata (AgNO3) (Panreac, Química S. A., Barcelona, España). • 100 ml de agua acidificada. Gelatina al 5%: • 5 g de gelatina (Merck, Darmstadf, Alemania). • 100 ml de agua acidificada. Solución de Hidroquinona al 0,15%: • 0,15 g de hidroquinona (Sigma Chemical Company, St. Louis MO, EEUU). • 100 ml de agua acidificada. Material y Métodos 101 Procedimiento: • Desparafinar los cortes. • Mantener el nitrato de plata al 2%, la gelatina al 5% y la hidroquinona al baño María en estufa a una temperatura de 54°C. • Simultáneamente colocar en estufa a 43°C, el nitrato de plata al 1% durante 30 minutos, con las preparaciones. Cumplido el tiempo de incubación de las preparaciones en la estufa, se debe preparar una solución compuesta por los siguientes reactivos a 54°C en las siguientes proporciones y orden de mezcla: • Nitrato de plata al 2%.................. 1,5 ml. • Solución de Gelatina 5%............. 3,75 ml. • Hidroquinona al 0,15%................ 2,0 ml. No es recomendable procesar más de 8 muestras (incluido el control positivo y negativo), con el fin de evitar que en el breve tiempo de quelación de la plata en los tejidos no se sobresature, dificultando posteriormente la visualización microscópica de los bacilos. El vaso de precipitado en el que se realiza la mezcla se ha de lavar y aclarar con agua destilada si se pretende reutilizar para otra mezcla. • Impregnar los cortes en esta solución y controlar al microscopio. • Una vez que en el control positivo se observan las estructuras bacilares en la superficie del epitelio respiratorio, se lavan rápidamente las preparaciones con agua bidestilada a 56°C. • Contrastar con verde luz al 1% durante 2 minutos. • Lavar con agua destilada. • Deshidratar y montar con resina DPX (Panreac, Química S. A., Barcelona, España). Hacer pases rápidos por alcohol de 96° controlando que no se pierde el verde. Los pases por alcohol de 100° y xilol serán de 2 minutos, siguiendo el protocolo normal de deshidratación. Material y Métodos 102 Técnica Inmunohistoquímica PCV2 • Un pase de 10 minutos y 2 pases de 5 minutos en xilol. • Un pase de 5 minutos en alcohol 100°. • Tratamiento de inhibición de la peroxidasa endógena con una solución de peróxido de hidrógeno (Panreac, Química S. A., Barcelona, España) al 3% en metanol (Panreac, Química S. A., Barcelona, España) durante 30 minutos en agitación suave. • Un pase de 5 minutos en alcohol 100°. • Un pase de 5 minutos en alcohol 96°. • Un pase de 5 minutos en alcohol 70°. • 2 lavados de 5 minutos en agua destilada. • 2 lavados de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Incubación en cámara húmeda a temperatura ambiente con suero normal de conejo (Dako, Glostrup, Dinamarca) al 10% en PBS durante 30 minutos. • Incubación con el anticuerpo primario monoclonal 36A9 a una dilución de 1:200 en suero normal de conejo (Dako, Glostrup, Dinamarca) al 1% en PBS, en cámara húmeda durante 18 horas a 4°C. • Retirar la cámara húmeda de la nevera 1 hora antes de continuar la técnica para atemperar las muestras. • 3 lavados de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Incubación con el anticuerpo secundario biotinado, conejo-antiratón (Dako, Glostrup, Dinamarca) a una dilución 1:20 en suero normal de conejo (Dako, Glostrup, Dinamarca) al 1% en PBS, en cámara húmeda durante 30 minutos a temperatura ambiente. • 3 lavados de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Incubación con el Complejo Streptavidina-Biotina-Peroxidasa (SBP) (Dako StreptABComplex/HRP, Dako, Glostrup, Dinamarca), (45 µl de A y 45 µl de B en 5000 µl de PBS), en cámara húmeda y en oscuridad durante 1 hora a temperatura ambiente. • 2 lavados de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Un lavado de 10 minutos en tampón acetato sódico 0,1 M pH 5,2. • Revelado de la reacción por inmersión en la solución constituida por 0,025 g de 3amino-9-aetilcarbazol (Sigma Chemical Company, St. Louis MO, EEUU), 5 ml de N,Ndimethylformamide (Sigma Chemical Company, St. Louis MO, EEUU), 70 ml de tampón acetato sódico 0,1 M pH 5,2 y 75 µl de peróxido de hidrógeno al 30% (Panreac, Química S. A., Barcelona, España) durante 1-2 minutos observando el control positivo. • Lavado en agua corriente durante 5 minutos. Material y Métodos 103 • Contratinción con Hematoxilina de Mayer (Panreac, Química S. A., Barcelona, España) durante 5 minutos. • Lavado en agua corriente durante 10 minutos. • Poner en agua destilada y realizar el montaje en medio acuoso (Immuno-Mount, Thermo Electron Corporation, Pittsburg PA, EEUU). Técnica Inmunohistoquímica PRRSV • Un pase de 10 minutos y 2 pases de 5 minutos en xilol. • Un pase de 5 minutos en alcohol 100°. • Tratamiento de inhibición de la peroxidasa endógena con una solución de peróxido de hidrógeno (Panreac, Química S. A., Barcelona, España) al 3% en metanol (Panreac, Química S. A., Barcelona, España) durante 30 minutos en agitación suave. • Un pase de 5 minutos en alcohol 100°. • Un pase de 5 minutos en alcohol 96°. • Un pase de 5 minutos en alcohol 70°. • 2 lavados de 5 minutos en agua destilada. • Un lavado de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Desenmascaramiento antigénico con proteasa (Sigma Chemical Company, St. Louis MO, EEUU) al 0,1% en PBS por inmersión durante 8 minutos a 37°C. • Un lavado de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Incubación en cámara húmeda a temperatura ambiente con suero normal de cabra (Dako, Glostrup, Dinamarca) al 10% en PBS durante 30 minutos. • Incubación con el anticuerpo primario monoclonal 1AC7 a una dilución de 1:250 en suero normal de cabra (Dako, Glostrup, Dinamarca) al 1% en PBS, en cámara húmeda durante 18 horas a 4°C. • Retirar la cámara húmeda de la nevera 1 hora antes de continuar la técnica para atemperar las muestras. • 3 lavados de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Incubación con el anticuerpo secundario biotinado conejo-antiratón (Dako, Glostrup, Dinamarca) a una dilución 1:20 en suero normal de cabra (Dako, Glostrup, Dinamarca) al 1% en PBS, en cámara húmeda durante 30 minutos a temperatura ambiente. • 3 lavados de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Incubación con el Complejo Streptavidina-Biotina-Peroxidasa (SBP) (Dako StreptABComplex/HRP, Dako, Glostrup, Dinamarca), (45 µl de A y 45 µl de B en 5000 µl de PBS), en cámara húmeda y en oscuridad durante 1 hora a temperatura ambiente. Material y Métodos 104 • 2 lavados de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Un lavado de 10 minutos en tampón acetato sódico 0,1 M pH 5,2. • Revelado de la reacción por inmersión en la solución constituida por 0,025 g de 3amino-9-aetilcarbazol (Sigma Chemical Company, St. Louis MO, EEUU), 5 ml de N,Ndimethylformamide (Sigma Chemical Company, St. Louis MO, EEUU), 70 ml de tampón acetato sódico 0,1 M pH 5,2 y 75µl de peróxido de hidrógeno al 30% (Panreac, Química S. A., Barcelona, España), durante 2-3 minutos observando el control positivo. • Lavado en agua corriente durante 5 minutos. • Contratinción con Hematoxilina de Mayer (Panreac, Química S. A., Barcelona, España) durante 5 minutos. • Lavado en agua corriente durante 10 minutos. • Poner en agua destilada y realizar el montaje en medio acuoso (Immuno-Mount, Thermo Electron Corporation, Pittsburg PA, EEUU). Técnica Inmunohistoquímica Mh • Un pase de 10 minutos y 2 pases de 5 minutos en xilol. • Un pase de 5 minutos en alcohol 100° • Tratamiento de inhibición de la peroxidasa endógena con una solución de peróxido de hidrógeno (Panreac, Química S. A., Barcelona, España) al 3% en metanol (Panreac, Química S. A., Barcelona, España) durante 30 minutos en agitación suave. • Un pase de 5 minutos en alcohol 100° • Un pase de 5 minutos en alcohol 96° • Un pase de 5 minutos en alcohol 70° • 2 lavados de 5 minutos en agua destilada. • Un lavado de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Desenmascaramiento antigénico con proteasa (Sigma Chemical Company, St. Louis MO, EEUU) al 0,1% en PBS durante 5 minutos. • Un lavado de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Incubación en cámara húmeda a temperatura ambiente con suero normal de cabra (Dako, Glostrup, Dinamarca) al 10% en PBS durante 30 minutos. • Incubación con el anticuerpo primario policlonal a una dilución de 1:800 en suero normal de cabra (Dako, Glostrup, Dinamarca) al 1% en PBS, en cámara húmeda durante 18 horas a 4°C. • Retirar la cámara húmeda de la nevera 1 hora antes de continuar la técnica para atemperar las muestras. Material y Métodos 105 • 3 lavados de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Incubación con el anticuerpo secundario biotinado cerdo-anticonejo (Dako, Glostrup, Dinamarca) a una dilución 1:200 en suero normal de cabra (Dako, Glostrup, Dinamarca) al 1% en PBS, en cámara húmeda durante 30 minutos a temperatura ambiente. • 3 lavados de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Incubación con el Complejo Streptavidina-Biotina-Peroxidasa (SBP) (Dako StreptABComplex/HRP, Dako, Glostrup, Dinamarca), (45 µl de A y 45 µl de B en 5000 µl de PBS), en cámara húmeda y en oscuridad durante 1 hora a temperatura ambiente. • 2 lavados de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Un lavado de 10 minutos en tampón acetato sódico 0,1 M pH 5,2. • Revelado de la reacción por inmersión en la solución constituida por 0,025 g de 3amino-9-aetilcarbazol (Sigma Chemical Company, St. Louis MO, EEUU), 5 ml de N,Ndimethylformamide (Sigma Chemical Company, St. Louis MO, EEUU), 70 ml de tampón acetato sódico 0,1 M pH 5,2 y 75 µl de peróxido de hidrógeno al 30% (Panreac, Química S. A., Barcelona, España), durante 4 minutos observando el control positivo. • Lavado en agua corriente durante 5 minutos. • Contratinción con Hematoxilina de Mayer (Panreac, Química S. A., Barcelona, España) durante 5 minutos. • Lavado en agua corriente durante 10 minutos. • Poner en agua destilada y realizar el montaje en medio acuoso (Immuno-Mount, Thermo Electron Corporation, Pittsburg PA, EEUU). Técnica Inmunohistoquímica para Suero Policlonal frente a ADV • Un pase de 10 minutos y 2 pases de 5 minutos en xilol. • Un pase de 5 minutos en alcohol 100° • Tratamiento de inhibición de la peroxidasa endógena con una solución de peróxido de hidrógeno (Panreac, Química S. A., Barcelona, España) al 3% en metanol (Panreac, Química S. A., Barcelona, España) durante 30 minutos en agitación suave. • Un pase de 5 minutos en alcohol 100° • Un pase de 5 minutos en alcohol 96°. • Un pase de 5 minutos en alcohol 70°. • 2 lavados de 5 minutos en agua destilada. • 2 lavados de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Incubación en cámara húmeda a temperatura ambiente con suero normal de cabra (Dako, Glostrup, Dinamarca) al 10% en PBS durante 30 minutos. Material y Métodos 106 • Incubación con el anticuerpo primario policlonal Rabbit anti-Aujeszky a una dilución de 1:800 en suero normal de cabra (Dako, Glostrup, Dinamarca) al 1% en PBS, en cámara húmeda durante 18 horas a 4°C. • Retirar la cámara húmeda de la nevera 1 hora antes de continuar la técnica para atemperar las muestras. • 3 lavados de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Incubación con el anticuerpo secundario biotinado cerdo-anticonejo (Dako, Glostrup, Dinamarca) a una dilución 1:200 en suero normal de cabra (Dako, Glostrup, Dinamarca) al 1% en PBS, en cámara húmeda durante 30 minutos a temperatura ambiente. • 3 lavados de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Incubación con el Complejo Streptavidina-Biotina-Peroxidasa (SBP) (Dako StreptABComplex/HRP, Dako, Glostrup, Dinamarca), (45 µl de A y 45 µl de B en 5000 µl de PBS), en cámara húmeda y en oscuridad durante 1 hora a temperatura ambiente. • 2 lavados de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Un lavado de 10 minutos en TBS (Tris Buffer Salino) (1 parte TRIS madre/9 partes suero salino al 0,85%). • Revelado de la reacción por inmersión, previo filtrado, en una solución constituida por 0,07 g de diaminobenzidina (DAB) (Sigma Chemical Company, St. Louis MO, EEUU), 200 ml de tampón TBS y 200 µl de peróxido de hidrógeno (Panreac, Química S. A., Barcelona, España) al 3%. Se revela durante 5 minutos aproximadamente observando el control positivo. • Lavado en agua corriente durante 10 minutos. • Contratinción con Hematoxilina de Harris (Thermo Electrón Corporation, Pittsburg PA, EEUU) durante 30 segundos. • Lavado en agua corriente durante 10 minutos. • Deshidratar mediante 2 pases de 2 minutos cada uno en alcohol de 96° y 100°. • Dos pases de 2 minutos en xilol. • Montaje con resina DPX (Panreac, Química S. A., Barcelona, España). Técnica Inmunohistoquímica para Anticuerpo Monoclonal frente a ADV • Un pase de 10 minutos y 2 pases de 5 minutos en xilol. • Un pase de 5 minutos en alcohol 100°. • Tratamiento de inhibición de la peroxidasa endógena con una solución de peróxido de hidrógeno (Panreac, Química S. A., Barcelona, España) al 3% en metanol (Panreac, Química S. A., Barcelona, España) durante 30 minutos en agitación suave. Material y Métodos 107 • Un pase de 5 minutos en alcohol 100°. • Un pase de 5 minutos en alcohol 96°. • Un pase de 5 minutos en alcohol 70°. • 2 lavados de 5 minutos en agua destilada. • 2 lavados de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Incubación en cámara húmeda a temperatura ambiente con suero normal de conejo (Dako, Glostrup, Dinamarca) al 10% en PBS durante 30 minutos. • Incubación con el anticuerpo primario monoclonal 2CF2 a una dilución de 1:10 en suero normal de conejo al 1% en PBS, en cámara húmeda durante 18 horas a 4°C. • Retirar la cámara húmeda de la nevera 1 hora antes de continuar la técnica para atemperar las muestras. • 3 lavados de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Incubación con el anticuerpo secundario biotinado conejo-antiratón (Dako, Glostrup, Dinamarca) a una dilución 1:20 en suero normal de conejo al 1% en PBS, en cámara húmeda durante 30 minutos a temperatura ambiente. • 3 lavados de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Incubación con el Complejo Streptavidina-Biotina-Peroxidasa (SBP) (Dako StreptABComplex/HRP, Dako, Glostrup, Dinamarca), (45 µl de A y 45 µl de B en 5000 µl de PBS), en cámara húmeda y en oscuridad durante 1 hora a temperatura ambiente. • 2 lavados de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Un lavado de 10 minutos en tampón acetato sódico 0,1 M pH 5,2. • Revelado de la reacción por inmersión en la solución constituida por 0,025 g de 3amino-9-aetilcarbazol (Sigma Chemical Company, St. Louis MO, EEUU), 5 ml de N,Ndimethylformamide (Sigma Chemical Company, St. Louis MO, EEUU), 70 ml de tampón acetato sódico 0,1 M pH 5,2 y 75µl de peróxido de hidrógeno al 30% (Panreac, Química S. A., Barcelona, España), durante 5 minutos, observando el control positivo. • Lavado en agua corriente durante 5 minutos. • Contratinción con Hematoxilina de Mayer (Panreac, Química S. A., Barcelona, España) durante 5 minutos. • Lavado en agua corriente durante 10 minutos. • Poner en agua destilada y realizar el montaje en medio acuoso (Immuno-Mount, Thermo Electron Corporation, Pittsburg PA, EEUU). Material y Métodos 108 Técnica Inmunohistoquímica frente a Pasteurella spp , Manheimeia haemolitica y Pasteurella multocida • Un pase de 10 minutos y 2 pases de 5 minutos en xilol. • Un pase de 5 minutos en alcohol 100°. • Tratamiento de inhibición de la peroxidasa endógena con una solución de peróxido de hidrógeno (Panreac, Química S. A., Barcelona, España) al 3% en metanol (Panreac, Química S. A., Barcelona, España) durante 30 minutos en agitación suave. • Un pase de 5 minutos en alcohol 100°. • Un pase de 5 minutos en alcohol 96°. • Un pase de 5 minutos en alcohol 70°. • 2 lavados de 5 minutos en agua destilada. • Un lavado de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Desenmascaramiento antigénico con proteasa (Sigma Chemical Company, St. Louis MO, EEUU) al 0,1% en PBS durante 5 minutos. • 2 lavados de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Incubación en cámara húmeda a temperatura ambiente con suero normal de cerdo (Dako, Glostrup, Dinamarca) al 10% en PBS durante 30 minutos. • Incubación con el suero primario policlonal a una dilución de 1:200 en suero normal de cerdo (Dako, Glostrup, Dinamarca) al 1% en PBS, en cámara húmeda durante 18 horas a 4°C. • Retirar la cámara húmeda de la nevera 1 hora antes de continuar la técnica para atemperar las muestras. • 3 lavados de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Incubación con el anticuerpo secundario biotinado cerdo-anticonejo (Dako, Glostrup, Dinamarca) a una dilución 1:200 en suero normal de cerdo (Dako, Glostrup, Dinamarca) al 1% en PBS, en cámara húmeda durante 30 minutos a temperatura ambiente. • 3 lavados de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Incubación con el Complejo Streptavidina-Biotina-Peroxidasa (SBP) (Dako StreptABComplex/HRP, Dako, Glostrup, Dinamarca), (45 µl de A y 45 µl de B en 5000 µl de PBS), en cámara húmeda y en oscuridad durante 1 hora a temperatura ambiente. • 2 lavados de 5 minutos en PBS en agitación suave. • Un lavado de 10 minutos en tampón acetato sódico 0,1 M pH 5,2. Resultados 115 Fig. 4.2. A: Consolidación difusa del parénquima pulmonar con ausencia de colapso (neumonía intersticial). Caso 19. B: Consolidación craneoventral (bronconeumonía) del parénquima pulmonar y edema intersticial. Caso 20. C: Adherencias pleurales a pared costal (pleuritis fibrinosa crónica) con focos necrótico-hemorrágicos. Caso 9. D: Consolidación del parénquima pulmonar con patrón en tablero de ajedrez (neumonía intersticial), y edema intersticial. Caso 2. E: Abscesos multifocales en lóbulos pulmonares craneales. Caso 10. F: Absceso focal en superficie ventrolateral del lóbulo caudal izquierdo. Caso 1. A C D E F B D C Resultados 116 Fig. 4.3. A: Exudado fibrinoso en la superficie pleural (pleuritis fibrinosa). Caso 17. B: Adherencias pleurales a pared costal (pleuritis fibrinosa crónica). Caso 14. C: Exudado fibrinoso en saco pericárdico (pericarditis fibrinosa). Caso 3. D: Exudado fibrinopurulento en saco pericárdico (pericarditis fibrinopurulenta). Caso 12. E: Severa ascitis y peritonitis. Caso 17. F: Poliserositis fibrinosa. Caso 17. F A B C D E A Resultados 117 Tabla 4.1. Presencia de linfoadenomegalia en los diferentes linfonodos estudiados. Animal IS IL MD MS 01 X X X X 02 X X X X 03 X X X X 04 X X X 05 X X 06 07 X X X X 08 X X 09 X X X 10 X 11 X X 12 X 13 X X 14 X X 15 X X X 16 X 17 18 X X X X 19 X X 20 X X 21 X X X X 22 23 24 X X X X 25 X Total 14 16 11 14 Resultados 118 Tabla 4.2. Resumen de las principales lesiones macroscópicas observadas en los animales de estudio. Lesiones Nº Animales % Linfoadenomegalia 21 84 Linfoadenitis necrotizante 3 12 Consolidación pulmonar difusa 14 56 Consolidación pulmonar craneoventral 9 36 Áreas pulmonares multifocales necrotizantes 1 4 Patrón pulmonar tablero ajedrez 1 4 Abscesos pulmonares 3 12 Exudado vías aéreas 4 16 Pleuritis 11 44 Adherencias con pared costal 6 24 Hidrotórax 2 8 Hidropericardio 11 44 Pericarditis 8 32 Ascitis 6 24 Peritonitis 9 36 Úlceras gástricas 2 8 Poliartritis 7 28 Resultados 119 B Tabla 4.3. Lesiones macroscópicas más relevantes por animal. Animal Linfoadenomegalia Linfoadenitis purulenta Consolidación difusa Consolidación craneoventral Áreas multifocales necrotizantes Patrón tablero ajedrez Abscesos Exudado vías aéreas Pleuritis Adherencias pleurales Hidrotórax Hidropericardio Pericarditis Ascitis Peritonitis Úlceras gástricas Artritis 01 X X X X X X 02 X X X X X 03 X X X X X X X X X X 04 X X X X 05 X X X X X X X 06 X X X X X 07 X X X X 08 X X 09 X X X X X 10 X X X X 11 X X X X X 12 X X X X 13 X X 14 X X X X X X 15 X X X 16 X X X X 17 X X X X X X X X X 18 X X X X X X X X 19 X X X X X X 20 X X X 21 X X X X X 22 X 23 X 24 X X X 25 X X X X X X Total 21 3 14 9 1 1 3 4 11 6 2 11 8 6 9 2 7 Resultados 120 4.2 Hallazgos Anatomopatológicos Microscópicos 4.2.1 Linfonodos Las lesiones histológicas observadas a nivel de linfonodos consistieron principalmente y de forma general, en depleción linfoide e histiocitosis y, en menor medida, en la presencia de células gigantes multinucleadas y de cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos basófilos y botrioides en células macrofágicas. También se observó, en algunos casos, infiltrado de polimorfonucleares neutrófilos, así como linfocitolisis y focos de necrosis. La depleción linfoide varió de leve a severa, y se caracterizaba por una pérdida de celularidad a nivel de folículos linfoides y de la zona parafolicular (Fig. 4.4). La histiocitosis consistió en el infiltrado, multifocal a difuso, de células histiocíticas en el parénquima linfoide, variando el grado de leve a severo (Fig. 4.5). Fig. 4.4. Linfonodos. A: Normal. B, C y D: Depleción linfoide. Pérdida de celularidad con pérdida de folículos y despoblación en la zona parafolicular. B. Inguinal superficial. Caso 7. HE. 2x. C. Iliaco. Caso 15. HE. 4x. D. Mesentérico. Caso 4. HE. 4x. A B C D Resultados 121 Fig. 4.5. Linfonodos. A y B: Histiocitosis. Infiltrado de células histiocíticas en el parénquima linfoide. A. Iliaco. Caso 10. HE. 10x. B. Inguinal superficial. Caso 17. HE. 10x. C: Infiltrado de células histiocíticas a nivel centrofolicular. Iliaco. Caso 11. HE. 20x. D: Histiocitosis con presencia de células gigantes multinucleadas. Inguinal superficial. Caso 17. HE. 10x. En 24 (96%) de los animales analizados, se observó depleción linfoide que variaba de leve (7), moderada (8), a severa (9). Todos los animales presentaron algún grado de histiocitosis, 16 leve, 7 moderada y 2 intensa. En 6 animales (24%) se observaron células gigantes multinucleadas, y en 4 (16%), cuerpos de inclusión (Fig. 4.6. A y B). Así mismo, 15 animales (60%) presentaron infiltrado de polimorfonucleares neutrófilos en distinto grado, 5 (20%) linfocitolisis y 3 (12%) áreas de necrosis (Fig. 4.7). A B C D Resultados 122 En cuanto a la presencia de células gigantes multinucleadas (Tabla 4.4), estas se observaron en los cuatro linfonodos estudiados en similar proporción, en 4 (16%) linfonodos inguinales superficiales, y en 3 (12%) iliacos, mediastínicos y mesentéricos. Se observaron cuerpos de inclusión en 3 (12%) linfonodos inguinales superficiales y en un solo (4%) iliaco y mediastínico (Tabla 4.4). Fig. 4.6. Linfonodos. A y B: Histiocitosis con presencia de células gigantes multinucleadas. A. Iliaco. Caso 17. HE. 10x. B. Inguinal superficial. Caso 17. HE. 10x. C y D: Cuerpos de inclusión. Presencia de cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos basófilos en células histiocíticas. C. Iliaco. Caso 7. HE. 20x. D. Inguinal superficial. Caso 7. HE. 40x. A B C D Resultados 123 Tabla 4.4. Presencia de células gigantes multinucleadas y cuerpos de inclusión en linfonodos/animal. Animal IS IL MD MS Cel. gigantes CI Cel. gigantes CI Cel. gigantes CI Cel. gigantes CI 01 - - + - - - - - 02 - - - - - - - - 03 - - - - - - - - 04 - - - - - - + - 05 - + - - - - - - 06 - - - - - - - - 07 - + - + - - - - 08 - - - - - - - - 09 - - - - - - - - 10 - - - - - - - - 11 + - - - - - + - 12 - - - - - - - - 13 - - - - - - - - 14 - - - - - - - - 15 - - - - - - - - 16 - - - - - - - - 17 + + + - + - + - 18 - - - - - - - - 19 + - - - + + - - 20 + - + - + - - - 21 - - - - - - - - 22 - - - - - - - - 23 - - - - - - - - 24 - - - - - - - - 25 - - - - - - - - IS: Inguinal superficial; IL: Iliaco; MD: Mediastínico; MS: Mesentérico. CI: cuerpos de inclusión. +: presencia. -: ausencia. Un total de 15 animales (60%) mostraron linfoadenitis supurativa en alguno de los linfonodos estudiados, caracterizada por un infiltrado, de multifocal a difuso, de polimorfonucleares neutrófilos en el parénquima linfoide. El principal linfonodo afectado fue el mediastínico (14 animales) y en menor medida el inguinal superficial (2 animales) y el iliaco (1 animal), y con una intensidad que variaba de leve (2 animales), moderada (5 animales), a severa (8 animales). También se observaron áreas de necrosis en 3 animales (12%), 2 en linfonodos mediastínicos, y uno en inguinal superficial. Resultados 124 Fig. 4.7. Linfonodos. A: Linfoadenitis supurativa. Severo y difuso infiltrado de polimorfonucleares neutrófilos en el parénquima linfoide. Mediastínico. Caso 9. HE. 20x. B: Linfocitolisis. Iliaco. Caso 11. HE. 20x. C y D: Focos de necrosis del parénquima linfoide. A. Mediastínico. Caso 1. HE. 2x. B. Mediastínico. Caso 6. HE. 4x. C D A B Resultados 131 En cuanto a los animales que presentaron depleción linfoide leve, un 4% (1/24) (24) presentó depleción linfoide en los cuatros linfonodos, así como otro 4% (3) en tres de ellos. Un 21% (5/24) (1, 8, 10, 12, 22) de los animales presentó uno o dos linfonodos (principalmente mediastínicos y mesentéricos) con depleción linfoide leve conjuntamente con otros grados de depleción linfoide en los otros linfonodos. En la gráfica 4.4 se representa el grado de depleción linfoide por animal y linfonodo. Teniendo en cuenta que por linfonodo, la depleción leve tiene un valor de 1, la moderada 2, y la severa 3, la máxima puntuación por animal será de 12. Gráfica 4.4. Grado de depleción linfoide por animal y linfonodo. IS: Inguinal Superficial. IL: Iliaco. MD: Mediastínico. MS: Mesentérico. Resultados 132 Valoración de la histiocitosis En cuanto a la histiocitosis, de los 4 linfonodos estudiados, el más frecuentemente afectado, independiente del grado, fue el linfonodo iliaco (100%, 25 animales) seguido del inguinal superficial (96%, 24 animales), mediastínico (68%, 17 animales) y mesentérico (52%, 13 animales) (Gráfica 4.5). Gráfica 4.5. Porcentaje de linfonodos con histiocitosis independientemente del grado. IS: Inguinal Superficial. IL: Iliaco. MD: Mediastínico. MS: Mesentérico. En cuanto al grado de histiocitosis (Tabla 4.7 y Gráfica 4.6), el que presentó mayor severidad fue el iliaco (56), seguido por el inguinal superficial (46), mediastínico (20) y mesentérico (18). Resultados 133 Tabla 4.7. Grado de histiocitosis por linfonodo y puntuación. IS: Inguinal superficial; IL: Iliaco; MD: Mediastínico; MS: Mesentérico. -=0; +=1; ++=2; +++=3. (Modificado de Quintana et al., 2001; Opriessnig et al., 2004b). Animal IS IL MD MS 01 ++ ++ - - 02 +++ ++ + - 03 + + + + 04 +++ +++ + +++ 05 ++ ++ + ++ 06 + ++ + + 07 ++ ++ - - 08 + + - - 09 +++ +++ + + 10 ++ +++ - - 11 +++ +++ - + 12 ++ +++ - - 13 + +++ - - 14 - +++ + - 15 +++ +++ + - 16 + ++ + + 17 ++ ++ + + 18 ++ ++ ++ + 19 ++ +++ ++ +++ 20 ++ +++ + + 21 ++ ++ ++ - 22 ++ ++ + - 23 + + + + 24 ++ ++ + + 25 + + - - Puntuación 46 56 20 18 Resultados 134 Gráfica 4.6. Puntuación del grado de histiocitosis por linfonodo. IS: Inguinal superficial; IL: Iliaco; MD: Mediastínico; MS: Mesentérico. Valorando los grados de histiocitosis en leve, modera y severa (Gráfica 4.7), se observó severa (+++) histiocitosis en un 40 % (10/25) de los linfonodos iliacos, en un 20% (5/25) de los inguinales superficiales, y en un 8% (2/25) de los linfonodos mesentéricos, no habiéndose observado ningún caso de histiocitosis severa en los linfonodos mediastínicos. En cuanto a la histiocitosis moderada (++), el mayor porcentaje se observó en los linfonodos inguinales superficiales (48%, 12 animales), seguido por los iliacos (44%, 11 animales), y en menor porcentaje, en los linfonodos mediastínicos (12% 3 animales) y mesentéricos (4%, 1 animal). Los linfonodos que en mayor porcentaje tuvieron un grado leve (+) de histiocitosis fueron los linfonodos mediastínicos (56%, 14 animales), seguidos de los linfonodos mesentéricos (40%, 10 animales), inguinal superficial (28%, 7 animales) e iliaco (16%, 4 animales). Resultados 135 Gráfica 4.7: Clasificación de la histiocitosis por grado de intensidad y por linfonodo. IS: Inguinal Superficial. IL: Iliaco. MD: Mediastínico. MS: Mesentérico. En relación a la histiocitosis intensa, ningún animal mostró dicho grado en los cuatro linfonodos estudiados. Un 4 % (1/25) (4) de los animales lo presentó en tres de los linfonodos valorados, y un 16% (4/25) (9,11, 15, 19) en dos, incluyendo de forma constante al linfonodo iliaco. Por otra parte un 20 % (5/25) (2, 10, 12, 13, 14) de los animales presentó histiocitosis intensa en un solo linfonodo (inguinal superficial ó iliaco) conjuntamente con otros linfonodos con menor grado de histiocitosis. Un 12 % de los animales (3/25) (5, 18, 21) presentó histiocitosis moderada en tres de los linfonodos, incluyendo de forma constante los linfonodos inguinales superficiales e iliacos. Un 16% (4/25) (1, 7, 17, 22) mostró dicho grado en dos linfonodos incluyendo también de forma constante al inguinal superficial e iliaco. En este caso, tampoco ningún animal presentó histiocitosis moderada en los cuatros linfonodos valorados. En cuanto a los animales que presentaron histiocitosis leve, un 8% (2/25) (3, 23) presentó este grado en los cuatro linfonodos, así como un 12% (3/25) (6, 16, 24) en tres de ellos incluyendo de forma constante a los linfonodos mediastínicos y mesentéricos. Igualmente, otro 12% (3/25) (8, 20, 25) de los animales presentó dos linfonodos con histiocitosis leve, principalmente inguinal superficial e iliaco. Resultados 136 En la gráfica 4.8 se representa el grado de histiocitosis por animal y linfonodo. Teniendo en cuenta que por linfonodo, la histiocitosis leve tiene un valor de 1, la moderada 2, y la severa 3, la máxima puntuación por animal será de 12. Gráfica 4.8. Grado de histiocitosis por animal y linfonodo. IS: Inguinal Superficial. IL: Iliaco. MD: Mediastínico. MS: Mesentérico. Resultados 137 En la gráfica 4.9 se presenta de forma conjunta la puntuación del grado de depleción linfoide e histiocitosis por linfonodo. Gráfica 4.9. Puntuación de depleción linfoide e histiocitosis por linfonodo. IS: Inguinal superficial; IL: Iliaco; MD: Mediastínico; MS: Mesentérico. Resultados 138 4.2.2 Tonsila El principal hallazgo fue la depleción linfoide, en grado variable, caracterizada por una pérdida de celularidad a nivel de folículos linfoides y de la zona parafolicular, así como histiocitosis, consistente en un infiltrado, multifocal a difuso, de células histiocíticas en el parénquima linfoide. En ocasiones se observaron células gigantes multinucleadas y cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos basófilos y botrioides, en células macrofágicas, y, en menor medida, linfocitolisis a nivel de centros germinales (Fig. 4.9). En cuanto al número de animales, 23 (92%) presentaron depleción linfoide que variaba de leve (13 animales, 52%), moderada (2, 8%) a severa (8, 32%), y 8 (32%) histiocitosis, leve (5, 20%) y moderada (3, 12%) (Gráfica 4.10). En 3 animales (12%) se observaron células gigantes multinucleadas, y solo en 2 casos (8%) se detectaron cuerpos de inclusión (Tabla 4.8). Gráfica 4.10. Clasificación de la depleción linfoide e histiocitosis por grado de intensidad en tonsila. Resultados 139 Fig. 4.9 Tonsila. A: Depleción linfoide. Pérdida de celularidad a nivel de folículos linfoides y de la zona parafolicular. Caso 17. HE. 4x. B: Presencia de células gigantes multinucleadas. Caso 17. HE. 10x. C: Histiocitosis. Infiltrado de células histiocíticas en el parénquima linfoide. Caso 17. HE. 20x. D: Linfocitolisis a nivel centrofolicular. Caso 7. HE. 20x. E y F: Cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos en células histiocíticas. Caso 19. HE. 40x y 60x C D E F A B Resultados 140 Tabla 4.8. Grado de depleción linfoide e histiocitosis y presencia de células gigantes multinucleadas y cuerpos de inclusión en tonsila por animal. Animal Depleción Histiocitosis Cél. gigantes CI 01 + - 02 + - 03 + - 04 +++ ++ 05 +++ + 06 +++ - 07 + - 08 + - 09 + - 10 + - 11 + + + 12 + - 13 + - 14 + - 15 +++ + 16 +++ + 17 +++ - + 18 +++ ++ + 19 +++ ++ + + 20 + - 21 ++ - 22 + - 23 - - 24 - - 25 ++ + Puntuación 41 11 -=0 (negativo); +=1 (leve); ++=2 (moderado); +++=3 (severo). (Modificado de Quintana et al., 2001; Opriessnig et al., 2004b). Abreviaturas 243 RFLP: restriction fraction length polymorphism, polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción. rpm: revoluciones por minuto. SBP: Complejo Streptavidina-Biotina-Peroxidasa. SIV: swine influenza virus, virus de la influenza porcina. SNC: Sistema nervioso central. SPF: specific pathogen free, libre de patógenos específicos. Spp: Especies. TBE: Tris Borate EDTA V: voltio. W-S: Warthin Starry. 245 10 AGRADECIMIENTOS Agradecimientos 247 Creo que es bien sabido que una tesis no es trabajo de uno solo sino que es fruto del esfuerzo, buen hacer y empeño de numerosas personas. Por ello quisiera expresar mi más profundo agradecimiento a la Dr. Marisa Andrada, directora de esta tesis, por haber creído en mi más que yo mismo, y por haber confiado en el buen fin de todo este trabajo. Al Prof. Dr. Antonio Fernández por haberme dado la oportunidad de entrar en este mundo de la Anatomía Patológica Veterinaria y haber tenido la paciencia necesaria para ver finalizada esta tesis. A los Profs. Drs. Antonio Espinosa de los Monteros, Pedro Herráez y Francisco Rodríguez, por sus enseñanzas. Les debo gran parte de mi formación. Así mismo quisiera agradecer a mi familia y a todas esas personas que ha estado a mi lado en uno u otro momento, tanto a nivel profesional como personal, que me han ayudado, apoyado, animado, soportado y sufrido. Sabéis quienes sois. A ninguno nombro y a ninguno olvido. 249 11 BIBLIOGRAFÍA Bibliografía 251 Alarcon P, Rushton J, Wieland B. 2013. Cost of post-weaning multi-systemic wasting syndrome and porcine circovirus type-2 subclinical infection in England - An economic disease model. Prev Vet Med. 2013. 110(2): 88-102. Albina E., Cariolet R., Eveno E., Hutet E., Madec F. 1996. Premiers Resultats du Cneva Sur de Deperissement Fatal du Porcelet en Fin De Post-Sevrage. La semaine vétérinaire des filières (Suppl Sem Vet). 834: 1-2. Alexopoulos C, Kritas SK, Kyriakis CS, Tzika E, Kyriakis SC .2005. Sow performance in an endemically porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS)-infected farm after sow vaccination with an attenuated PRRS vaccine. Vet Microbiol. 111(34):151–157. 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