Utilización nutritiva de fuentes de proteína alternativas a la harina de pescado en dietas de engorde para dorada (Sparus aurata)

UTILIZACIÓN NUTRITIVA DE FUENTES DE PROTEÍNA ALTERNATIVAS A LA HARINA DE PESCADO EN DIETAS DE ENGORDE PARA DORADA (Sparus aurata) Lidia Esther ROBAINA ROBAINA Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Apdo. 550/35017 -Las Palmas de Gran Canaria / ESPAÑA Investigadora Asociada del Instituto Canario de Ciencias Marinas Apdo. 56/35200 -Telde / Gran Canaria / ESPAÑA Original Entregado en Febrero de 1998 INFORMES TÉCNICOS DEL INSTlTIJTO CANARIO DE CIENCIAS MARINAS Número 4 , Telde (Gran Canaria), 1998 1"f.Tk.11Ul.CtDuuio Ciac.MIIr. ".-1 RESUMEN Utilización nutritiva de fuentes de proteína alternativas a la harina de pescado en dietas de engorde pan donda (Sparus arma). En los últimos 30 años la Acuicultura ha experimentado un gran desarrollo, con el fin de abastecer a una población en continuo crecimiento, con unas demandas cada vez más altas de pescado. Desde un punto de vista nutricional, la proteína es el ingrediente dietario más importante en los piensos para peces (3Q-6001o del peso seco), siendo en la actualidad la harina de pescado la fuente proteica utiJiU'da en mayor proporción en los mismos. La producción de harina de pescado viene determinada por el nivel de recursos disponibles. En este sentido, la producción de harina y aceite de pescado se prevee que descienda bruscamente hacia el año 2000 mientras que, para ese mismo año, se estima una duplicación de la cantidad de harina de pescado necesaria en la producción de dietas para acuicultura, de seguir los piensos las fórmulas actuales. Actualmente, diferentes equipos de investigación concentran sus esfuerzos en la selección de ingredientes proteicos altematiws, tanto de origen animal como vegetal, con los que sustituir parcialmente la cantidad de harina de pescado a incluir en los alimentos para peces. Ello permitiría no sólo la posibildad de abaratar costes sino, lo que quizá es más importante, aseguraría el suministro a los productores acuícolas de piensos de calidad elevada y relativamente estable, no dependientes de los problemas de suministro, calidad y fluctuación de precios de las harinas de pescado . ... Dentro de este contexto, en el presente trabajo se estudia la utilización nutritiva de niveles crecientes de cuatro fuentes proteicas, harina de soja, harina dealtram~ harina de gluten de maíz y harina de carne y huesos, alternativas a la harina de pescado en dietas de engorde para dorada, especie que junto con la lubina ha experimentado uno de los mayores índices de crecimiento en el terreno de la acuicultura en los últimos 20 años en Europa De manera general, los resultados muestran que, a los niveles de sustitución ensay~dos, las cuatro fuentes proteicas presentan tanto una buena utilización nutritiva como digestiva por los peces. Sin embargo, implicaciones a nivel histológico y aumentos en los niveles de excreción amoniacal al medio, limitan el nivel de inclusión recomendable de alguna de las harinas utilizadas en dietas para esta especie. 1"f.Tk.l"stCtullU'io Cienc.MIU'. ,,·4 ABSTRACf Nutritional use 01 altemative protein sources to fish meal lor pthead seabream (Sparus aurma) on-growin diets. Aquaculture has experienced a sinificant deve10pment during last 30 years, due to overexploitation of fisheries stocks and a steady growth in world population with an increasing demand of aquatic products for consumption. From a nutritional point of view, protein is the most important ingredient for fish diets (30-60% on a dry weigbt basis), being fish meal the feedstuff used in a higber proportion as dietaly protein source. The world fish mea! production is directly affected by availability of pri.mmy resources, having been predicted a heavy decrease of fish mea! and fish oil production arround the year 2000, in conjunction with a doubled demand for these products for aquaculture feeds if . present diet contents are maintained At present, difIerent research groups concentrate on the study of altemative protein sources, both animal and vegetable, in order to partially substitute the amount of fish mea! employed for fish diets. This would allow not only for decreased production costs, but also to ensure not to depend solely on fish mea! availability, quality and price fluctuations. The present work studies the nutritional value of difIerent diets containing increasing. levels of four difIerent protein sources: soybean, lupin, com gluten and meat and bone mea!s, as partíal replacers of fish meal in diets for the on-growing of gilthead seabream, a species with the highest rate of culture development in the Mediterranean region in the last 20 years. In general, the results suggest that all altemative protein sources assayed show both a good nutritional and digestive use by the fish, for the substitution levels assayed However, results on histology and ammonia excretion levels suggest severallimitations to fish mea! substitution for some of the feedstufIs studied 1"f.Tk.lnsLCtuuIrio Ciac.MtIr. "." ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN . ............................ . ... 7 1.1. El cultivo de Dorada. Importancia del estudio de la nutrición de esta especie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1.2. Importancia de las proteínas en la dieta de los peces . . . . . .. ..9 1.3. Evaluación de las proteínas dietédcas.. . . . . . . . . . . . . .. . 12 1.4. Importancia y problemática de la harina de pescado como fuente proteica en piensos para peces.. . . . . . . . . . . . . . . . . .. . 17 1.S. Fuentes alternativas de proteínas en piensos para peces . . . .. . 20 1.6. Utilización metabólica de las proteínas; impacto ambiental de la acuicultura . 31 1.7. Objetivos. . . . . . . . 34 2. MATERIAL Y MÉTODOS. .35 2.1. Ingredientes. . . . . . . 35 2.1.1. Selección. . . . . 35 2.1.2. Tratamientos y controles de calidad . 38 2.2. Preparación de las dietas. . 38 2.2.1. Fonnulación . . . . . . . . . . . . . 38 2.2.2. Elaboración . . . . . . . . . . . . . 39 2.3. Condiciones experimentales generales y toma de muestras. . . 42 2.3.1. Condiciones experimentales en ensayos de crecimiento y utilización nutritiva del alimento . . . . . . . . . . . 47 2.3.2. Condiciones experimentales en ensayos de utilización digestiva del alimento . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 2.3.2.1. Recolección y tratamiento de heces.. . . . . . 47 2.3.3. Condiciones experimentales en ensayos de excreción de amonio . . . . . . . . . . 48 2.4. Parámetros biológicos utilizados . . 48 2.4.1. Crecimiento . . . . . . . . . 48 2.4.2. Eficacia bruta del alimento. . 49 2.4.3. Utilización de la proteína . . 49 2.4.3.1. Coeficiente de eficacia proteica. . 49 2.4.3.2. Valor productivo de la proteína. . 49 2.4.4. Retención energética. . . . . . . . . . . . SO 2.4.5. Indice hepatosomático ....... ~ . . . SO 2.4.6. Detenninación de coeficientes de digestibilidad aparente. . SO 2.S. Métodos analíticos de composición. . SO 2.5. 1. Humedad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 Inf.Téc.lnstCluuuio Cietu:.MII1'. n·" 2.5.2. Ceniza . . . 2.5.3. Proteínas.. . 2.5.4. Lípidos totales. 2.5.5. Fibra. . . . . . 2.5.6. Carbohidratos . 2.5.7. Determinación de óxido crómico. 2.5.8. Energía bruta ...... . ... . 2.5.9. Determinación de la actividad antitripsica . 2.5. 10. Determinación de la solubilidad de las proteínas en KOH(0.2 %) ................. . 2.6. Determinación de la actividad de enzimas digestivas .. 2.6.1. Preparación de extractos .. 2.6.2. Actividad tripsica .............. . 2.6.3. Actividad amilásica . . . . . ... . . . . . . 2.7. Determinación de niveles de excreción de amonio. 2.8. Métodos histológicos.. . . 2.9. Tratamientos estadísticos ............. . · 51 · 51 · 51 .52 .52 .53 .53 .53 .53 .54 .54 .54 .54 .55 .55 .55 3. EFECTO DE LA INCLUSIÓN DIHTÉTICA DE HARINAS DE SOJA, ALTRAMUZ, GLUTEN DE MAÍZ Y CARNE Y HUESOS EN · EL · CRECIMIENTO Y UTILIZACIÓN DEL ALIMENTO DE LOS JUVENILES DE DORADA. . . . . . . . . . . . .56 3.1. Justificación y objetivos 3.2. Experimento 1. Soja y altramuz .. 3.2.1. Introducción . . . . . . . . 3.2.2. Condiciones experimentales. 3.2.3. Resultados ......... . 3.2.4. Discusión y conclusiones .. . 3.3. Experimento 2. Gluten de maíz y harina de carne y huesos. 3.3.1. Introducción . . . . . . . . . 3.3.2. Condiciones experimentales . 3.3.3. Resultados ......... . 3.3.4. Discusión y conclusiones .. . 3.4. Experimento 3. Mejora de soja en base al experimento 1 . 3.4.1. Introducción ........ . 3.4.2. Condiciones experimentales . 3.4.3. Resultados ....... . 3.4.4. Discusión y conclusiones. . . 4. UTILIZACIÓN DIGESTIVA DE LAS DIETAS . 4.1. Justificación y objetivos . . . . . . . . . . . " ". .56 .57 .57 .59 .63 .71 .74 .74 .76 .79 .86 .89 .89 .96 . ·101 110 114 114 4.2. Experimento 4. Soja y altramuz.. . 4.2.1. Introducción ........ . 4.2.2. Condiciones experimentales . 4.2.3. Resultados . . . . . . . . . . 4.2.4. Discusión y conclusiones. . . 1"f.Tk.lruLCiuuuio CiDlc.Mtu. ".-1 4.3. Experimento S. Gluten de maíz y harina de carne y huesos 114 114 115 116 116 121 121 121 122 126 127 127 127 131 4.3.1. Introducción .. . ..... . 4.3. 2. Condiciones experimentales . 4.3.3. Resultados . . . . . . . . 4.3.4. Discusión y conclusiones. . . 4.4. Experimento 6. Mejora de soja . ~ . 4.4.1. Condiciones experimentales . 4.4.2. Resultados . . . . . . . . 4.4.3. Discusión y conclusiones. . . 5. EXPERIENCIAS DE EXCRECIÓN DE AMONIO. 5.1. Justificación y objetivos .... . . . 5.2. Experimento 7. Soja y altramuz ... . 5.2.1. Condiciones experimentales . '. 5.2. 2. Resultados . . . . . . . . 5.2.3. Discusión y conclusiones ... 5.3. Experimento 8. Gluten y carne. . . 5.3.1. Condiciones experimentales. 5.3.2. Resultados . . . . . . . . 5.3.3. Discusión y conclusiones. 6. CONCLUSIONES GENERALES . 7. BIBLIOGRAFÍA . . . 8. LISTA DE TABLAS. 9. LISTA DE FIGURAS 10. ANEXOS . ..... ' 137 137 138 138 138 141 144 144 144 147 149 151 185 189 191 l,,¡'Tk.lrut.CtmIlrio Cienc.Mtu. "." l. INTRODUCCIÓN. 1.1. EL CULTIVO DE DORADA. IMPORTANCIA DEL ESTUDIO DE LA NUTRICIÓN DE ESTA ESPECIE. La demanda de pescado Y otros productos acuícolas ha experimentado un incremento mundial particularmente pronunciado en Europa y otras áreas desarrolladas. Durante el período 1967-1989, el consumo mundial aparente de productos pesqueros se ha incrementado aproximadamente de 10 a 13 kg per cápita y año (RHODES, 1993), sin embargo, la productividad total del océano es limitada, considerándose un máximo sostenible estimado de 150 millones de toneladas métricas (Tm) por año, probablemente sólo suficiente para suministrar el 10% de la proteína necesaria para el sostenimiento de la población mundial (MORROW, 1992). En base a este déficit en el suministro de productos del mar con el que abastecer a una población en continuo crecimiento, la acuicultura ha experimentado un gran auge en los últimos 30 años. Esto ha sido posible gracias al enonne esfuerzo dedicado a la investigación, al desarrollo de nuevas tecnologías, a la introducción de un número considerable de especies nuevas y a la gran inversión realizada en los sectores público y privado. Así, en 1990 la producción mundial en acuicultura llegó a duplicar la producción que había en 1975 (RHODES, 1993). Las Naciones Unidas, a través de su Organización para el Alimento y la Agricultura (F AO), han estimado que la demanda de peces y crustáceaos cultivados podría incrementarse de 5 a 11 millones de Tm entre los años 1986 y 2000 (FAO, 1987). Aunque todavia las especies más tradicionales producidas en acuicultura tales como la carpa, la trucha, anguila y otros peces de agua dulce suponen más del 80% de la producción global, durante los últimos 20 años en Europa la producción se ha diversificado hacia otras especies como el salmón, rodaballo, dorada y lubina Las empresas dedicadas al cultivo de estas dos últimas son las que han experimentado el mayor crecimiento en el sector, con una producción que sobrepasó las 14000 toneladas en 1992 (SWEETMAN, 1993), estimándose en unas 35000 toneladas para 1995 (STEPHANIS y DIV ANACH, 1993). La dorada, Sparus aurata (Linnaeus, 1758), es un pez carnívoro marino típico de aguas templadas, siendo la temperatura óptima para su desarrollo del orden de 23 a 25 oC. Es, por tanto, una especie que a nivel comercial presenta un gran potencial para el desarrollo de su cultivo en regiones cálidas, encontrándose éste bien desarrollado en los países ribereños del Mediterráneo (principalmente en España, Francia, Italia, Grecia e Israel), y en clara expansión en otros como Turquía, Túnez y Marruecos, en la región suratlántica de la Península Ibérica y Canarias. Hoy en día existen en España diversas explotaciones de dorada, tanto de caracter semiintensivo en estanques en tierra (esteros), 7 lnf.Téc.lnst.Canarjo Cienc.Mar. n· 4 como intensivo (bien enjaulas flotantes o bien en tanques en tierra). Los datos de producción industrial, publicados por la Secretaria General de Pesca Maritima del :Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, indican que de un total de 2753.5 Tm de peces marinos cultivados en España en 1991, 1072.9 Tm (el 38.96%) correspondieron a dorada, que es desde 1988 la especie ictiológica más cultivada en nuestro país. En 1991 España produjo el 20% de las 6000 Tm de espáridos (fundamentalmente dorada) que se estima se comercializaron en el mercado europeo (lEO, 1992; FLOS, 1992). Por lo que respecta a Canarias, existen cinco empresas dedicadas al engorde de dorada, con una producción aproximada a las 300 Tm en 1992. A nivel comercial, el principal objetivo de la producción de peces es el de maximizar el crecimiento y la supervivencia al mínimo costo (KNIGHTS, 1985), siendo condición necesaria la óptima satisfacción de los requerimientos fisiológicos y metabólicos de los organismos objeto de cultivo, proveyéndolos de unas condiciones ambientales favorables y alimentándolos con dietas adecuadas (STEFFENS, 1987). Sin embargo, una de las principales limitaciones para el desarrollo de la acuicultura la suponen el coste. y la disponibilidad del alimento (JAMES, 1992). Puesto que la alimentación representa uno de los mayores gastos en la producción intensiva de peces, el desarrollo de dietas comerciales capaces de satisfacer los requerimientos de la especie cultivada bajo unas condiciones detenninadas y con el menor coste posible, es considerado como uno de los principales objetivos en las investigaciones en acuicultura (TIEWS et al., 1979; HARDY, 1989). El conocimiento sobre las necesidades nutricionales de la dorada es muy limitado, basándose una gran parte de ellos en los determinados para la dorada japonesa, Chrysophrys major. Las primeras investigaciones fueron encaminadas a determinar los requerimientos cuantitativos de proteína, encontrándose que era necesario un nivel del '40% para el crecimiento óptimo de peces de 3 g (SABAUT y LUQUET, 1973). Los mismos autores determinaron los niveles mínimos necesarios para cinco aminoácidos esenciales expresados como porcentaje de la proteína dietaria: arginina <2.6, lisina 5.0, metionina + cistina 4.0 y triptófano 0.6 (LUQUET y SABAUT, 1974). Posteriormente, los requerimientos de proteína determinados para esta especie en alevines de 0.8 g Y juveniles de 60 g de peso medio inicial fueron de 55% y 42% respectivamente (VERG~ 1992); este autor sugiere que las diferencias de resultados con trabajos anteriores fueron debidas posiblemente a la utilización de distintas técnicas para el análisis de los datos obtenidos. KISSIL y KOVEN (1987), ensayaron dietas semipurificadas y purificadas para dorada encontrando que la adición de suplementos aminoacídicos a dietas base con caseína como fuente de proteínas, mejoraba el crecimiento. Otros estudios (YONE y FUro, 1975a; KANAZAWA et al., 1979; YAMADA et al., 1980) sugieren que la dorada, al igual que la dorada japonesa, parece utilizar mejor aceites de origen marino (KOVEN y KISSIL, 1984). En este sentido, 8 1"f.Tk.lnstCtuuuio CiDu:.Mtu. ,,·4 MARAIS y KISSIL (1979) no encontraron una mejora en el crecimiento cuando usaron aceite de soja como principal fuente de lípidos, ni tampoco KALAGEROPOULOS et al. (1992), quienes sustituyeron el aceite de pescado por aceite de maíz. De todo ello se deduce que esta especie necesita ácidos grasos pollinsaturados de más de 20 carbonos de la familia dellinolénico, n-3 HUF A El requerimiento de ácidos grasos esenciales para los alevines y juveniles de esta especie se estima entre 0.9 y 1.9 % respectivamente de n-3 RUFA (KALAGEROPOULOS et al., 1992; IBEAS et al., 1994). KISSIL y GROPP (1984) mostraron que la mejor relación proteína/energía (p:E) para doradas de 45 g era de 25 mgIkJ (40% proteína /5% lípidos), y 23 mgIkJ (44110) para alevines de 3 g. Posteriormente, PEREIRA et al. (1987) obtuvieron para esta misma relación un valor de 51/14 para doradas de 1 a 6 g. Finalmente, en el área de los requerimientos vitamínicos se dispone sólo de información sobre aquellos para piridoxina (Vitamina B6), 3 a 5 mglkg de dieta seca (KISSIL, 1981). Aparte de estas investigaciones muy poco más se sabe sobre los requerimientos dietarios para dorada, siendo sus piensos comerciales formulados, como ocurre en otras especies cultivadas, en base a los requerimientos establecidos para salmónidos. 1.2. IMPORTANCIA DE LAS PROTEÍNAS EN LA DIETA DE LOS PECES. El valor de una dieta depende de los niveles y disponibilidades de más de 40 nutrientes necesarios para los peces. Entre ellos, las proteínas constituyen el material orgánico más abundante en el tejido de los peces, representando entre un 65-75% del total; .. corporal en peso seco (HAL VER, 1989). Las necesidades de proteínas y aminoácidos para los peces han sido revisadas por diferentes autores (NRC, 1977; HAL VER Y TIEWS, 1979; TACON y COWEY, 1985). En general, los peces necesitan un alto contenido de proteínas en la ración que oscila entre un 35-55%, o lo que es lo mismo, un equivalente del 45-75% del contenido en energía bruta de la dieta deberla estar incluído en forma de proteína (T ACON y COWEY, 1985). Cuando se formula un pienso comercial para peces carnívoros cultivables, la proteína como · componente dietario tiene una especial relevancia tanto cuantitativa como cualitativamente. En este sentido, establecer los requerimientos de proteína en la dieta de la especie a cultivar (mínimo nivel de proteína expresado como porcentaje del peso seco de la dieta que produce un máximo crecimiento, PANDIAN y VIVEKANANDAN, 1985), es esencial para poder diseñar un pienso artificial bien equilibrado con el que obtener una alimentación rentable (DE LA mGHERA, 1989). 9 Inf.Tic.lnsLClI1Iario Cienc.Mar. n-" materia orgánica (pIMENTELRODRIGUEZ, 1994). Por otro lado, WILSON et al. (1981) encontraron la existencia de una razonable semejanza entre los valores de digestibilidad aparente de las proteínas y los valores medios de digestibilidad aparente de los aminoácidos que las componían; sin embargo, las digestibilidades de los aminoácidos individuales fueron diferentes en las distintas fuentes proteicas ensayadas. De esta manera, para la harina de soja mostraron que la digestibilidad aparente media de los aminoácidos era de 83.7% Y la digestibilidad aparente de la proteína era del 76.6%; para la harina de carne y huesos la digestibilidad aparente media de los aminoácidos fue de 74.3%, lo cual estaba de acuerdo con los valores obtenidos por HASTINGS (1966) de digestibilidad de esta fuente proteica (75%). En resumen, se puede asumir según estos resultados, que a la hora de formular una dieta, el valor de digestibilidad de su proteína sugerirá de manera razonable una medida de la digestibilidad media aparente de sus aminoácidos, aunque se debe tener en cuenta que las digestibilidades de los aminoácidos individuales son diferentes para las distintas materias primas. La Tabla 1 muestra los coeficientes de digestibilidad aparente así como los valores de energía digestible para diferentes ingredientes medidos en trucha arco iris. En cualquier caso, factores diversos bi~ de tipo nutricional (volumen total de la ingesta, proporción de proteína en dieta, velocidad de tránsito a través del tracto digestivo, etc.) o bien inherentes al diseño y metodología experimentales, hacen que en la bibliografia aparezcan datos de digestibilidad muy diferentes para una misma fuente proteica, por lo que los valores usados como referencia han de emplearse siempre a titulo orientativo. Por otro lado, el valor nutricional de las proteínas puede verse también afectado considerablemente por la sensibilidad de las enzimas digestivas a las posibles sustancias inhibidoras, frecuentes sobre todo en alimentos de origen vegetal. Por último, reacciones tales como las de Maillard (tx1-4) que pueden tener lugar durante el período de almacenamiento, y los tratamientos con calor a que son sometidos con frecuencia las materias primas, también pueden hacer disminuir la disponibilidad de los aminoácidos contenidos en los ingredientes por fonnación de aminoácidos azucarados no asimilables y destrucción de los aminoácidos más sensibles al calor. La lisina, cistina y arginina son los principales aminoácidos afectados por estos procesos. Por último, otra fonna de evaluación no sólo de las proteínas dietéticas sino de cualquier alimento en general, es a través del estudio de las posibles implicaciones a nivel histológico que pudieran estar relacionadas con la ingestión de los mismos. Atendiendo a los resultados de diversos trabajos (SAKAMOTO, 1981; MOSCONI-BAC 1987 1990· . ' , , STORCH y JUARIO, 1983), la principal característica morfológíca a nivel histológico ocasionada por una alimentación artificial mal balanceada es la acumulación de gotas de grasa. Los peces, en contraste con los mamíferos en los cuales, el tejido adiposo qonstituye 16 1"f.Tk.lnst.CIuuIrio Cieu:.MtII'. ,,- 4 el principal lugar de almacenamiento de lípidos, acumulan los lípidos en depósitos periviscerales y también en el hígado y músculo de forma intensa (WEATHERLEY y GILL, 1987). Las alteraciones en los hepatocitos inducidas por una alimentación artificial, han sido interpretadas de diferente forma por distintos autores. Estudios sobre las alteraciones hepáticas, inducidas por una alimentación artificial en lubinas durante su primer año de vida, reflejan que estas amonalías pueden ser dos tipos. Por un lado estarían la formación de gotas lipídicas en los hepatocitos que van aumentando de tamaño y densidad con el tiempo de alimentación, lo cual no se puede considerar más que una medida de almacenar las grasas no metabolizadas (insaturadas o pollinsaturadas, por no poder elongarlas y desaturarlas), particularmente el ácido oleico. Y por otro lado estarían unas verdaderas modificaciones estructurales intracelulares, bien a nivel del núcleo (densidad de la cromatina) o del citoplasma (segregación del retículo, vacuo1ización de mitocondrias), que si pueden ser consideradas como verdaderas patologías nutricionales (MOSCONI-BAC, 1987). De esta forma, la presencia en los hepatocitos de numerosas y voluminosas gotas lipídicas pueden aparecer inicialmente como una simple respuesta fisiológica del hígado, en la forma de almacenar los lípidos en exce.so, representando de esta forma un almacenamiento de energía y no una respuesta patológica 1.4. IMPORTANCIA Y PROBLEMÁTICA DE LA HARINA DE PESCADO COMO FUENTE PROTEICA EN PIENSOS PARA PECES. La harina de pescado es una materia prima de origen animal de elevada concentración proteica, con un valor nutritivo relativamente superior a otras harinas, tanto de origen animal como vegetal, por su excelente equilibrio en la composición de aminoácidos, su adecuada composición en ácidos grasos para todos los peces, su contenido en vitaminas del grupo B, elevadas concentraciones de ácido fosfórico e incluso la posible existencia de un "factor de crecimiento no identificado". Todas estas cualidades le confieren un importante papel en el mercado mundial de alimentación animal en piensos para peces, cerdos, aves, vacas productoras de leche y visones, principalmente en la alimentación de las etapas más tempranas de las diferentes especies para las que se utiliza. La harina de pescado requerida para la producción de piensos para acuicultura (crustáceos inc1uídos) supone alrededor de un 10% de la producción mundial de esta materia prima, y se espera que se duplique hacia el año 2000 (pIKE, 1990). 17 1"¡:Téc.l,,áCtllltII'io Cimc.MtII'. ,,·4 Tabla 1. Coeficientes de digestibilidad aparente y valores de energía digestible de diferentes ingredientes medidos en trucha arco iris· (CHO, 1991). Coeficientes de digem"ilidad •• . - a_a ••••• D.E .•• Ingredientes N> M.S. Prot. Líp. G.E. Mjlkg Intemac. % % % % Harina de alfalfa 1-00-023 39 87 71 43 7.7 Harina de sangre 5-00-381 91 99 89 19.4 Levadura de cerveza seca 7-05-527 76 91 77 13.9 Maíz 4-02-935 23 95 . 39 6.6 Harina de gluten de maíz 5-09-318 80 96 83 17.6 Harina de plumas 5-03-795 7~ 58 70 15.7 Harina de pescado (arenque) 5-02-000 85 92 97 91 18.8 Harina de carne y huesos 5-09-321 78 85 73 85 15.0 Harina de subproductos de pollería 5-03-798 52 68 79 71 13.9 Harina de semillas de colza 5-03-871 35 77 45 8.1 Harina de soja 5-04-597 78 96 94 85 19.0 Harina de soja desengrasada 5-04-612 74 96 75 13.5 Harina de trigo 5-05-205 35 92 46 7.6 Suero deshidratado 4-01-182 97 96 94 13.4 Almidón crudo 37 49 8.6 Almidón gelatinizado 86 86 13.3 Concentrado proteico de pescado 90 95 94 17.2 Concentrado proteico de soja 77 97 84 15.4 • Todos los valores son medias de datos recopilados. •• Coeficientes de digestibilidad aparente de la materia seca (MS .), proteínas (Prot.), lípidos (Líp.) y energía bruta (G.E.). Energía digestible de los ingredientes (O.E.). 18 1"f.Tk.lnsLCtmllTio Cimc.MIIT. ,,·4 Según BARLOW (1989), se estima que si en el futuro la formulación y producción de dietas prácticas para peces sigue las tendencias actuales, los requerimientos de harina y aceite de pescado para alimentos en acuicultura alcanzarán de 1 a 1.5 millones de Tm en el año 2000. La producción de harina de pescado viene determinada por el nivel de recursos disponibles. Los relativamente pocos productores y exportadores de harina de pescado se concentran en la explotación de Wl pequeño número de especies, siendo por consiguiente la producción anual de harina de pescado dependiente del comportamiento de esas especies. Este tipo de producción trae consigo Wl tipo de mercado muy inestable, con unas disponibilidades y precios fluctuantes entre un año y otro. Después de años de continua expansión, las capturas mundiales de pescado descendieron en 1990. En ese año se notificó una captura de 97 millones de Tm, que constrasta con los casi 100 millones de Tm que fueron producidas en 1989. El factor principal que contribuyó a este descenso fue la reducción de casi 2 millones de toneladas en la captura del pelágico pequeño en el Pacífco sudoriental, las cuales se utilizan nonnalmemte para producir harina de pescado. Las capturas totales de origen pesquero comenzaron a fluctuar en la década de los sesenta y alcanzaron una fase critica en la década de los setenta, debido principalmente al colapso de los stocks de anchoveta peruana En la década de los 80, las capturas empezaron a incrementarse de nuevo, alcanzando un pico en 1989. Este resurgimiento de las pesquerías a nivel mundial no fue debido a un incremento general de lo~ stocks de peces marinos, sino más bien a la renovada explotación de los stocks pelágicos de especies del tipo del arenque y del bacalao. Los factores (SPINELLI et al., 1979; COLL MORALES, 1986) que tienden a disminuir la oferta relativa de harina de pescado en el mercado mundial son: -Limitación de la exportación de harina de anchoveta peruana en 1973. Inicio de la crisis. -Crecimiento de las actividades en acuicultura -Aumento del consumo directo de peces de bajo valor. -Disminución de capturas. -Establecimiento de la Zona Económica Exclusiva de las 200 millas en muchos países. La producción de harina y aceite de pescado se espera disminuya en un 5% para el año 2000 (BARLOW, 1989). En la actualidad el mercado mundial de harina de pescado se caracteriza por un pequeño número de exportadores especializados que suministran a un gran número de países importadores. Europa y Japón son los mercados con mayor 19 Inf.Tk.lnst.Cantll'io Cienc.MtII'. n· <1 demanda de esta harina Aunque Japón .es uno de los mayores productores mundiales de harina de pescado, su excesiva demanda le obliga a ser también uno de -los mayores compradores (6% de las importaciones mundiales) (MOYANO, 1990). A pesar del descenso en el suministro de harina de pescado, y del incremento de la demanda, a partir de finales de los 80 los precios han bajado sustancialmente, aunque se obsevó un pequeño aumento en la segunda mitad de 1990. La razón para estos precios tan bajos se debe al incremento en la producción de harina de soja, la ~ se ha erigido_ como principal competidor de la harina de pescado. En este sentido, desarrollQs tecnológicos en el campo de la agricultura han permitido un aumento considerable en la producción de harinas de semillas de oleaginosas en todo el mundo, super~~o incluso la demanda de las mismas. En este sentido, la producción mundial de soja se incrementó de 45 millones de Tm en 1969-1971 a 101 millones de Tm en 1985 (VOHRA y KRATZER, 1991). A comienzos de octubre de 1990 se produjeron records en los stocks de soja en los tres principales paises productores (USA, Brasil y Argentina), siendo la producción: un 33% más alta que en el año anterior. Aún con todo ello, aunque el precio de la harina de pescado no sube de manera proporcional de acuerdo con la relación ofertaldemandade la misma, las características inherentes a ésta hacen que su precio sea siempre superior al de la harina de soja (MOY ANO, 1990). Al inconveniente del elevado costo de las harinas de pescado habría que sumar los problemas añadidos por su variabilidad en cuanto a disponibilidad y a composición a lo largo del año, y entre unos años y otros (COLL MORALES, 1986). Todos estos problemas en el mercado de la harina de pescado afectan directamente a los productores de peces. Así tenemos que después de una fase inicial eufórica en la que. , primaba la falta de competencia de los productos producidos en acuicultura, la relación oferta/demanda ha sufrido un gran cambio, con el consecuente abaratamiento de los .precios de mercado. Esta reducción de los precios ha producido el que los beneficios esperados por las empresas se hayan visto mermados. Entre 1987 y 1991 los costes de producción aumentaron una media de alrededor de un 17% anual, mientras que los precios de venta de los productos sólo subieron aproximadamente un 6% anual. Como consecuencia de ésto, los márgenes de ganancia comparados con los niveles de 1987 se han visto reducidos a casi la mitad para la lubina y a 1/3 para la dorada. En adición a ésto, la competitividad de estos productos se ve agravada durante los meses de septiembre a marzo, época en que aumentan las capturas pesqueras de estas especies (STEPHANIS y DIVANACH,1993). 1.5. FUENTES ALTERNATIVAS DE PROTEÍNAS EN PIENSOS PARA PECES. Como se ha visto anteriormente, desde un punto ~e vista nutricion~ ha sido 20 establecido que, independientemente de la especie, la proteína es el ingrediente dietario más importante (30-60% del peso seco) y dentro de ella, la harina de pescado continúa siendo la mayor fuente utilizada (20-60% de la dieta). A la vista del elevado costo de las harinas de pescado no es de sorprender que el coste del alimento suponga de entre un 4060 % del total de los costes de producción en empresas dedicadas a la acuicultura intensiva (FAO, 1983), lo cual supone uno de los mayores inconvenientes para una mayor expansión de la acuicultura Dentro de este contexto se vienen haciendo serios esfuerzos en diferentes países con el fin de reducir el coste de la harina de pescado en dietas prácticas para peces, tanto desde el punto de vista de la reducción del nivel de proteína en si mismo a través de sustituciones con otros nutrientes (protein-sparing), como a través del uso de fuentes alternativas de proteínas de elevado valor nutricional como sustitutos de la harina de pescado (LUQUET y KAUSHIK, 1978; KAUSHIK, 1989). Hoy en día muchos nutricionistas y productores de piensos concentran sus esfuerzos en la selección entre la amplia variedad de productos disponibles en la industria de alimentación animal, de aquellos que pueden ser usados para la elaboración de alimentos de menor costo para la producción de peces. TACON y JACKSON (1985) entre otros, han hecho una revisión de las fuentes proteicas, tanto convencionales como no convencionales, usadas en dietas prácticas para peces. Debemos considerar, como vimos anterionnente, que la harina de pescado es la fuente de proteína disponible cuyo perfil de aminoácidos más se aproxima a los requerimientos dietarios de los peces. Consecuentemente, no es de sorprender que los intentos por reemplazar toda la harina de pescado con cualquier otra fuente de proteína alternativa" individual no hayan sido muy fructíferos. Aunque en algunos casos, la sustitución parcial de la harina de pescado por otras fuentes de proteína en las dietas para peces no llegase a reducir el precio del alimento, si reduciría la dependencia total de la harina de pescado en las industrias productoras de piensos. Con ello se aseguraría el suministro a los productores de peces de dietas de calidad elevada y relativamente estable, no dependiente de los defectos en el suministro, calidad y fluctuación de precios de la harina de pescado como única fuente de proteínas (TACON y JACKSON, 1985). En principio, las fuentes de proteína susceptibles de ser usadas como alternativas a la harina de pescado en piensos para peces podrían clasificarse de la siguiente manera: a) Proteínas de origen animal, entre las que se incluirían desperdicios de matadero (carne, huesos, plumas y sangre), ensilados de peces, derivados lácteos y algunas proteínas menos convencionales como las harinas de krill, lombriz y pupa de 21 /nf.Téc./nsLCcurtzrio Cienc.Mtzr. n4 gusano de seda. b) Proteínas de origen vegetal, entre las que se incluyen una amplia gama de harinas de semillas y hojas. c) Proteínas de organismos unicelulares, levaduras, algas, bacterias y hongos. d) Fuentes de nitrógeno no proteico, como la úrea o el ácido úrico. Comparadas con la harina de pescado, la rDayoria de las fuentes proteicas disponibles presentan alguna deficiencia en un aminoácido específico o un desequilibrio aminoacídico general. Niveles desproporcionados de los mismos pueden dar lugar a antagonismos entre aminoácidos como leucina/isoleucina, arginina/lisina y cistina/metionina, por ejemplo (TACON y JACKSON, 1985). A esto hay que añadir la presencia de factores endógenos antinutricionales, principalmente en ingredientes de origen vegetal, que limitan el nivel de inclusión de los mismos en piensos para peces y otros animales. Sin embargo, muchos de estos antinutrientes son termolábiles. Actualmente, los adelantos tecnológicos permiten someter los ingredientes vegetales a tratamientos de procesado con calor seco o calor húmedo que además de facilitar la destrucción de los factores antinutritivos termolábiles, mejoran la digestibilidad de los nutrientes mediante el incremento del área superficial de las partículas (micronización, extrusión y expansión). La Tabla 2 muestra una clasificación de algunas de las sustancias antinutritivas más frecuentes encontradas en ingredientes proteicos, así como los posibles mecanismos de disminución o destrucción de los mismos. Para maximizar la digestión y absorción de los nutrientes en las dietas para peces y minimizar desechos y costo, es necesario asegurarse de que las enzimas digestivas del pez operan en todo su potencial. Es bien conocido por ejemplo, que existen componentes inhibidores de la tripsina y quimiotripsina en la soja Esos componentes pueden ser generalmente destruí dos mediante tratamientos de la harina con calor antes de su uso, pero el proceso es muy variable y frecuentemente partidas de harina de soja con niveles considerables de inhibidores llegan a los productores de piensos (MITCHELL et al., 1991). Para la eliminación de tales factores antinutritivos, los fabricantes de piensos cuentan además (VARNISH y CARPENTER., 1975), con una cada vez más amplia variedad de plantas genéticamente mejoradas con las que elaborar sus productos. En este sentido se intenta incrementar el contenido en proteínas (DOLL, 1984; JULIANO, 1985), Y en metionina (NIELSEN, 1984; JA YNES et al., 1986) de algunos cereales, pudiéndose conseguir en la actualidad, por ejemplo, semillas de colza con bajo contenido en glucosinolatos o altramuces con bajo nivel de alcaloides (DE LUMEN, 1990). Otra forma de mejorar el valor nutritivo de los vegetales consiste en la suplementación en las dietas con los nutrientes esenciales que pudieran estar en defecto como consecuencia de los antinutrientes (KAUSHIK, 1989). 22 ¡"f.Tk.lnstCuuuio Cienc.Mtu. ,,·4 Tabla 2. Clasificación de algunas sustancias antinutritivas comúnmente encontradas en diferentes ingredientes proteicos y posibles medios de destrucción o de limitación de sus efectos peIjudiciales (CHUBB, 1982 en Kaushik, 1989). PRINCIPALES "AClORES INGREDIENTES Interaccionan con la nutrición proteica Inhibidores proteásicos (Tripsina) soja Hemaglutininas (Lectinas) soja Saponinas Polifenoles Guisantes, aIfa1fa (Taninos) sorgo MECANISMOS DE DESTRUCCIÓN O DE LIMITACIÓN Calor, autoclave Calor, autoclave Extracción con alcohol Suplementación con compuestos clorogénicos colina o metionina Interaccionan con la dis,pomoilidad de los minerales Acido fitico Soja Acido oxálico Glucosinolatos Go sip 01 Proteína de hojas Semillas de colza Semillas de algodón Interaccionan con la dis,pomoilidad de las vitaminas Anti-vitaminas liposolubles Vit A (lipoxigenasa) VitD Vit E (oxidasa) Anti-vitaminas B Vit B 1 (Tiaminasa) Anti-ácido nicotínico Anti-piridoxina Anti-vit B 12 Cianógenos Soja Soja Judías Carne cruda Maíz Harina de semillas Soja cruda Mandioca, sorgo 23 Suplementación Calor Variedades nuevas Variedades nuevas Calor, autoclave Calor, autoclave Suplementación, autoclave Suplementación, calor Extracc. acuosa, calor Calor Calor 1"f.Tk.l"st.CIllfIUW Cienc.MIU. ,,·4 A continuación se intentará exponer una visión general de las fuentes proteicas más usadas en dietas para peces, mostrando algunos de los múltiples, y en ocasiones contradictorios, resultados obtenidos con cada una de ellas para las diferentes especies de peces. El valor de los subproductos animales tales como las harinas de came ha sido revisado por KAUSIDK (1989) y por MOY ANO et al. (1989) para diferentes especies de salmónidos; encontrándose que rara vez se incluyen en piensos comerciales a niveles superiores al 200!o (MURAl, 1992). Son muchos los trabajos experimentales existentes en la bibliografia que hacen referencia a este tipo de ingredientes. En el caso de la trucha arco iris, Salmo gairdneri, se ha visto que la sustitución total de la harina de pescado por harina de carne en dietas no afectaba al crecimiento cuando se utilizó en individuos de 213 g; sin embargo, en peces de 13 g el aumento de peso con respecto al control de harina de pescado fue significativamente menor (COELHO et al., 1989). Las harinas de came y huesos están compuestas principalmente por subproductos de matadero no utilizables para el consumo humano, por lo que sus precios son altamente competitivos. El elevado contenido en grasas (8 a 11 %) de esta harina ayuda a proteger el contenido en lisina durante el procesado. Sin embargo, uno de los principales inconvenientes de esta harina es su alto contenido en cenizas, normalmente entre un 20 y un 30% en peso seco (HALVER, 1978). Se ha mostrado también la posibilidad de incluir esta materia prima en dietas prácticas para tilapia, Oreochromis mossambicus, (DA VIES et al. 1989, 1990) Y para trucha arco iris (DE MÜLDER GROUP, 1988). En el caso de la carpa, Cyprinus carpio, el valor nutritivo de la harina de carne y huesos como única fuente de proteínas frente a dietas con harina de pescado, mostró que la harina de carne y huesos produce un menor crecimiento, utilización del alimento y digestibilidad aparente de las proteínas frente a la harina de pescado (PONGMANEERAT y WATANABE, 1991). Por otro lado, una combinación dietaria de harina de carne y huesos y harina de sangre sólo dió buenos resultados en dietas para tilapia, Oreochromis niloticus, cuando el nivel de sustitución de la proteína de la harina de pescado era menor del 50% (TACON et al., 1984). Sin embargo han sido realizadas muy pocas investigaciones con harinas de carne y harinas de carne y huesos con peces marinos· cultivados, particularmente aquellos asociados con la región mediterránea Una combinación dietaria de harina de subproductos de poDeria y harina de plumas hidrolizada ha dado buenos resultados reemplazando hasta un 75% la proteína de harina de pescado en dietas para truchas (GROPP et al., 1979; ruGGS et al., 1979; TIEWS et al., 1979), Y salmón coho (ruGGS et al., 1979). 24 1"f.Téc.l"st.CtutlD'io CiDrc.Mtu. ,,·4 La harina de pupa de gusano de seda como componente en una dieta para alevines de Clarlas batrachus, resultó en buenos índices de crecimiento y utilización del alimento a niveles de sustitución de hasta un 100% de la harina de pescado (HABm et al., 1993). Por el contrario, para el pez gato, Heteropneustes fossilis Bloch, sólo dió buenos resultados por debajo de un 75% de sustitución (HOSSAIN y JAUNCEY, 1991). Respecto de las harinas vegetales, se observa que este tipo de materias primas están adquiriendo cada vez más importancia en la fabricación de piensos para peces. Las harinas de semillas de leguminosas son alternativas interesantes como fuentes de proteína frente al harina de pescado. De todos los ingredientes proteicos vegetales, la soja, Glycine maxima, es considerada como la más nutritiva, siendo la más ampliamente utilizada en dietas para peces (LOVELL, 1988). Por ello se presentará un comentario más amplio acerca de sus características y utilización en los piensos. La soja fue introducida en Europa como semilla oleaginosa a principios de 1900, llegando a convertirse en la principal fuente de aceite vegetal en todo el mundo (AMERICAN SOYBEAN ASSOCIATION, 1982). La torta de soja, residuo que queda al extraer la mayor parte del aceite de las semillas, es una de las fuentes proteicas más barata para su uso en la alimentación tanto .de animales acuáticos como terrestres. Diferentes productos de soja son usados comúnmente como fuente de proteínas en la producción de trucha arco iris (REITNIZ et al., 1978b), siendo también incluí dos a bajos niveles en dietas para salmones (RUMSEY y KETOLA, 1975; SPINELLI et al., 1979; KROGDAHL, 1989), y pez gato (LIEBOWITZ, 1981), aunque otros autores han encontrado un crecimiento y utilización proteica bajos con la inclusión de esta harina en dietas tanto para trucha (SANDHOLM et al., 1976; DABROWSKI et al., 1989),como ' para pez gato (WILSON y POE, 1985b). El elevado contenido proteico de la harina de soja (aproximadamente un 35% en la semilla), unido a su bajo costo la convierten en un importante candidato como sustituto de la harina de pescado (KAUSHIK, 1989). Sin embargo uno de los principales problemas a la hora de incluir esta harina en alimentos para peces estriba en la posible presencia de elementos antinutritivos en la misma, principalmente inhíbidores proteásicos. En la soja han sido encontrados dos tipos de inhibidores tripsicos. Uno de ellos es el inhibidor tripsico (STI) aislado por KUNITZ (1947), que es una proteína globular cristalina de peso molecular 21.500 dalton y 181 aminoácidos residuales (KAKADE et al., 1973; LIENER Y KAKADE, 1980) Y que constituye aproxirnádamente el 6% de la proteína total presente en la soja (KAKADE et al., 1973). El otro es el inhibidor Bowmann-Birk (BBI), con un ,peso molecular de 8.000 dalton. Ambos tipos de inhibidores actúan tanto sobre la tripsina como sobre la quimiotripsina (REED, 1975). La enzima digestiva tripsina, sobre la que actúa el STI es importante no sólo por su elevada actividad proteolítica, sino por ser el línico activador conocido para otras enzimas (BLACKBURN, 1976). 2S Inf.Téc.lnst.ClUUUio Cm.c.MIU. n· 4 pequeño comparado con el incremento en la producción. Mejoras en la composición del alimento y en las técnicas de alimentación son los principales motivos de estos resultados (ENELL, 1994). La retención neta de N por el pez es aproximadamente del 40% . Valores más altos han sido obtenidos para dietas de elevada relación proteína/energía usadas corrientemente en la producción de salmón atlántico (CHO, 1991). Este valor del 40% es similar al de los pájaros y mamíferos omnívoros, existiendo sin embargo, importantes diferencias en el metabolismo de las proteínas de los peces y los animales de sangre caliente. El músculo del pez , el cual comprende aproximadamente el 60% de su peso total, es muy blanco y glucolítico y aunque las tasas de síntesis de proteínas en él son muy bajas, mucha de la proteína allí sintetizada es retenida Consecuentemente, muchas de las pérdidas de N por el pez probablemente ocurren como resultado de una oxidación directa de los aminoácidos, principalmente en el hígado, después de que sean asimilados. Por el contrario, pájaros y mamíferos omnívoros tienen mayores tasas de renovación proteica que los peces, siendo ésta la principal causa de las pérdidas de N en este tipo de animales. Los componentes nitrogenados excretados en las heces consisten, por una parte, en nitrógeno no absorbido o no digerido del alimento y, por otra, en una fracción originada en el cuerpo compuesta por residuos de la bilis y otros jugos digestivos, células epiteliales desprendidas del tracto alimentario al pasar el alimento a través de él y residuos bacterianos. Este tipo de excreción, conocida como excreción endógena, como distinción del nitrógeno no digerido del alimento, se basa en la presencia de componentes nitrogenados en las heces de peces alimentados con dietas libres de nitrógeno y en los teleósteos se situa entre 100y 200 mgN/kglh (KAUSHIK, 1990). En consecuencia habrá que diferenciar entre digestibilidad real y digestibilidad aparente de las proteínas, según se considere o no respectivamente la presencia de este N fecal endógeno. Mientras . que la cantidad de nitrógeno del no digerido está determinada por la digestibilidad del nitrógeno en el alimento, la tasa de excreción del nitrógeno metabólico está determinada en parte por la cantidad total de materia seca consumida y la digestibilidad de ésta, así como por el tamaño del pez, entre otros factores. Por otro lado, el incremento de la excreción de nitrógeno metabólico con el aumento del alimento ingerido es fácil de entender teniendo en cuenta que a mayor alimento ingerido, mayor será la secreción de jugos digestivos (WATANABE, 1988). La toxicidad de los componentes nitrogenados excretados por los peces constituy( uno de los principales factores limitantes en acuicultura intensiva (COLT ~ ARMSTRONG, 1981). El amonio se encuentra presente en el agua tanto en la form~ ionizada (NH/) como no ionizada (NH3)' siendo el equilibrio del amonio en el agu~ fuertemente dependiente del pH del medio. La toxicidad del amonio para los organismol acuáticos es atribuída principalmente a la forma no ionizada (THURSTON et al., 1981) . . 32 El amoniaco es, con mucho, el principal producto final del catabolismo nitrogenado en teleósteos, representando usualmente más del 70% del nitrógeno excretado, aunque en ocasiones puede llegar incluso hasta el 90% (VAN WAARDE, 1983; BEAMISH Y THOMAS, 1984; WALTON, 1987; KAUSHIK y COWEY, 1991). Del resto de la fracción la mayor parte la constituye la urea, aunque también se excretan otros compuestos nitrogenados tales como ácido úrico, aminoácidos, trimetilamina, óxido de trimetilamina, creatina y creatinina (FORSTER y GOLDSTEIN, 1969). En el caso de la dorada, PORTER et al. (1986, 1987), encontraron que expresado como porcentaje del alimento consUmido, la excreción de N se realizó de la siguiente manera: 30% como amonio disuelto (DA) N-NH/, 30% como N orgánico disuelto (DON), 30% en crecimiento y 10% en heces, siendo la urea no detectable. Trabajos posteriores (KROM y NEO&¡ 1989), corroboran estos resultados. Han sido propuestos tres mecanismos principales por los que se llevarla a cabo la excreción branquial de amoniaco en los peces (EVANS, 1984): difusión pasiva de NH 3 (no ionizado), intercambio iónico de NH/ por Na+, y difusión pasiva de NHt. · El amoniaco se disuelve fácilmente en el agua, experimentando el 99% de él disociación iónica cuando el pH del medio y el sanguíneo son casi neutros (HEPHER, 1988). Debido a que el amonio es el principal producto de la excreción soluble originado por el metabolismo de las proteínas, representando casi el 60% del N total ingerido, en muchas especies de peces una gran parte de la literatura referida a la excreción de N hace referencia exclusivamente a esta porción de las pérdidas metabólicas. De acuerdo con SOLOMON y BRAFIELD (1972), la consideración de que todo el nitrógeno es excretado como amonio podría dar un error de menos de un 0.5%. Sin embargo, a partir de estudios de balances de N parece que esta consideración no es válida y que una significante información se pierde midiendo sólo amonio y/o urea (KAUSHIK, 1980; KAUSHIK y DABROWSKI,1983). En cuanto al N no ingerido del alimento o excreción particulada, muchos piensos de los usados en la alimentación de salmónidos dan lugar a unas liberaciones al medio de alrededor del 10% para el N y al menos una tercera parte del P, dependiendo del tipo de ingredientes usados en la fabricación del pienso. Según COWEY (1994), los peces tienen poca capacidad metabólica para regular la actividad de los enzimas que desaminan aminoácidos, por lo tanto el alcance de reducir la excreción de N principalmente como NH 3 mediante medios dietarios es muy limitado. Sin embargo, WATANABE et al. (1983) indicaron que las excreciones branquiales y urinarias de nitrógeno se ven ampliamente influenciadas por la calidad de la proteína dietaria, el nivel de alimento ingerido y la temperatura del agua en especies como la trucha arco iris. 33 IntTéc.lnáCllllario Cimc.Mar. n4 1.7. OBJETIVOS. Con la finalidad de buscar fuentes proteicas potencialmente alternativas a la harina de pescado en dietas para engorde de doradas, se han establecido los siguientes objetivos: 1. -Selección de posibles fuentes alternativas. 2. -Determinación de los efectos de las dietas que incluyen las fuentes previamente seleccionadas sobre el crecimiento. 3.- Determinación de la utilización nutritiva de las dietas con cada una de las fuentes seleccionadas a distintos niveles de inclusión. 4.- Determinación de la utilización digestiva de las dietas con cada una de las fuentes seleccionadas a distintos niveles de inclusión. 5.- Detenninación de la utilización metabólica de las dietás con cada una de las fuentes seleccionadas a distintos niveles de inclusión. 6.- Recomendacion de las fuentes proteicas alternativas a la harina de pescado a utilizar en dietas de engorde para dorada, indicando los niveles recomendables de sustitución de cada uno de ellos. 34 1"f.Tk.lnsLCtuuuio Cielu:.MtII'. ,,- 4 2. MATERIAL Y MÉTODOS. 2.1. INGREDIENTES. 2.1.1. Selección. Por razones económicas y prácticas las dietas deben contener fuentes de proteína localmente disponibles, preferiblemente aquellas que no sean apropiadas para el consumo humano directo (JACKSON et al., 1982). Además de una alta disponibilidad a 10 largo del año, los ingredientes seleccionados deben cumplir las siguientes condiciones: -Contenido proteico medio o alto. -Perfil de aminoácidos adecuado (sobre todo de los aminoácidos esenciales). -Ausencia de factores antinutritivos. -Digestibilidad alta -Precio relativamente bajo y 10 más estable posible. A la hora de seleccionar los ingredientes a ensayar en los experimentos llevados a cabo en este trabajo, se intentó en principio recabar información sobre la posibilidad de utilizar aquellos que fuesen producidos en la islas. En este sentido, el único producto encontrado fue el maíz, con una producción aproximada de unas 140 Tmlaño, siendo su uso destinado casi en exclusiva al consumo humano (Dpto. Estadística, Consejeria de . Agricultura y Pesca del Gobierno de Canarias). El siguiente paso fue buscar entre los productos cuya entrada a los puertos canarios fuese representativa Para ello se partió de los datos de entrada al Puerto de la Luz y de Las Palmas en los años 88/89 (Tabla 3). Puesto que el maíz y el trigo blando, productos de máxima importación a nivel local, se destinan al consumo humano directo una vez molidos, se optó por seleccionar otros ingredientes, de origen vegetal o animal, en función de sus caracteristicas composicionales (NRC, 1983; HUGHES, 1988) y de su utilización como ingredientes proteicos en dietas para otras especies de peces. De esta forma fueron elegidos la HARINA DE SOJA, HARINA DE ALTRAMUZ, HARINA DE GLUTEN DE MAÍZ Y HARINA DE CARNE Y HUESOS, como fuentes alternativas de proteínas a la proteína de pescado a ensayar en todos los experimentos realizados en este trabajo 3S lnf.Tk.lnst.Ouuzrio Cienc.Mar. n·-I Tabla 3. Ingredientes proteicos de máxima entrada al Puerto de La Luz y de Las Palmas en los años 1988 / 89 (Infmnación cedida pe.- S.EN.P.A, (Delegación del Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentacioo). INGREDffiNTES AÑo 1988 Maíz Trigo blando Harina de soja Harina de trigo Cebada AÑo 1989 Maíz Trigo blando Harina de soja Harina de trigo Sémola de maíz Cebada N.D.- Datos no disponibles. TMlAÑO 84.783 73.769 4.803 4.760 3.884 83.664 58.569 6.722 4.904 2.084 1.446 PTSIKG 20.490 17.590 32.670 N.D. 18.080 23.180 22.630 . 44.460 N.D. 19.750 23.000 La Tablas 4 y 5 muestran el cómputo químico calculado para el primer aminoácido limitante de cada una de las materias primas seleccionadas, y la composición general de las mismas respectivamente. Tabla 4. Cómputo químico y pcn:entaje de deficiencia calculados para el primer aminoácido limitante de las materias primas a utilizar en los diferentes experimentos, frente a las necesidades en AAE para dorada. Harina de Harina de Harina de Gluten de Harina de pescado soJa altramuz maíz carne y huesos Cómputo químico 67.75 75.47 41.25 33.86 64.70 % deficiencia 32.25 24.53 58.75 66.14 35.30 Primer AAE De Met Met Lys Met 36 Tabla S. COOlposiciÓll general (% peso seco) de los ingredientes proteicos seleccionados con los que se realizaron los distintos experimentos de este trabajo. N·lnt. Humedad Prot. Llp . Fibra Ceniu Ca P Ara lúa lIe Lcu Lyw Md Phe Thr Trp Val w -...J Harina de aoj.· S..()4.6()() 10.0 47 .7 S.3 6.6 6.7 0.29 0.68 . 3. 41 1.26 2.92 4.02 3.10 0.72 2. '" 1.92 0.68 2.n Harina de .Iu-u~ S-20-293' 10 .0 40.0 14 .0 3.0 4. S7 0.78 1.S6 2. S6 1.78 0.33 1.22 1.34 1.00 l.4S Harina de a1uten de malz" S-28-241 9.0 46.8 2.4 4.8 3.4 0. 16 O. SO 1.S3 U16 2.46 7.92 0. 87 1. 14 3. 0' 1.S6 0. 23 2.40 Harina de c:_ y huaos" S-OO-388 7.0 S4 .1 10.4 2.4 31.S 10 .30 ' . 10 3. 7' 1.04 1.76 3.29 3.11 0.70 1.83 1. 77 0. 32 2. 63' ¡¡o ~ Harina de pac:acIo ' S-02-OOO 8.0 78.3 9.2 0.7 11 .4 24.0 1.82 4. 11 2.0S 2.30 4.10 4. 6' 1.6, 2.37 3.06 0. 83 2. 37 ~ ¡ (a) NRC (1983). 1 (b) HUGHES (1988). (c) NRC (1983) excepto los aminoácidos, que fueron determinados analíticamente (Lab.Agroalimentario, Subdirección General de Calidad Agroalimentaria, Madrid). r- (d) VIOLA et al. (1989). ~ :a • ~ Inf.Téc.lnsLCIUIlD'io Cienc.MID'. n· 4 En principio se partiÓ como primer ingrediente a ensayar de la harina de soja, por ser una harina de uso generalizado en la producción comercial de piensos para peces. La segunda fuente proteica seleccionada fue la harina de altramuces, la cual, como se reflejó en el Apdo. 1.5., aunque es una harina cuya utilización en dietas para peces es relativamente reciente, ha dado muy buenos resultados en especies como la trucha Por último, las dos harinas restantes (gluten y carne y huesos) fueron elegidas en función tanto de su composición, como de la revisión de los resultados obtenidos con diferentes especies de peces. 2.1.2.· Tratamientos y controles de calidad. Dos de las cuatro fuentes proteicas alternativas seleccionadas fueron tratadas antes de ser incluídas en las dietas: la soja y el altramuz. La soja a utilizar fue torta de soja groseramente particulada, por lo que se molió en un triturador Cyclotec de la marca Tecator, Hoganas, Suecia (1093 Sample Mill), haciendola pasar a través de una rejilla de 0.5 mm de luz de malla, con el fin de mejorar la disponibilidad de sus nutrientes. En el caso del altramuz se partió de semillas secas de la especie Lupinus angustifolius, caracterizadas por un elevado contenido en alcaloides. Por ello, en primer lugar se trató de eliminar esos antinutrientes, para lo cual las semillas se hidrataron en agua dulce durante un periodo de 24 h, renovando el agua en varias ocasiones. Posteriormente se secaron durante 12 h a 40°C y finalmente se molieron las semillas en un molino de agua, debido a la dificultad que conlleva la trituración de los granos secos . obtenidos, tanto por su dureza como el alto contenido en lípidos de los mismos. Se consideró apropiado para la harina de soja someterla a un control de su calidad nutritiva ya que, como se ha visto en apartados anteriores, ésta puede variar de manera considerable según el tratamiento al que ha sido sometida durante el procesado para la extracción del aceite. Los análisis que se utilizaron para ello fueron la determinación de su composición en inhibidores de la tripsina y la solubilidad de las proteínas en KOH según los métodos especificados en los Apdos. 2.5.9. y 2.5.10., respectivamente. 2.2. PREPARACIÓN DE LAS DIETAS. 2.2.1. Formulación. Todos los ingredientes fueron obtenidos a nivel local, excepto el gluten de maíz que fue proporcionado por la empresa CAMPOEBRO INDUSTRIAL, S.A La harina de 38 1"f.Tk.lIU1.CIuuuio Cienc.MID'. ,,·4 pescado utiljzada es harina provinente de sardina, procesada mediante un primer paso de cocción a 90°C, seguida de prensado y posterior secado a 120-150°C (AGRAMAR S.A, comun. personal). Una vez analizada la composición de las materias primas a utilizar, se formularon las dietas en base a los resultados obtenidos. Ante la imposibilidad de determinar analíticamente el contenido en aminoácidos de los ingredientes a ensayar, los perfiles de aminoácidos dietarios fueron calculados en función de los datos contenidos en la Tabla 5 (valores seleccionados tras una amplia revisión bibliográfica), y comparados con la composición de aminoácidos esenciales en alevines de doradas (LUQUET y SABAUT, 1974; VERG~ 1992), tomando este último como referencia de las necesidades de aminoácidos de esta especie, con el objeto de determinar posibles aminoácidos limitantes en las dietas a ensayar (COWEY y TACON, 1983; OGATA et al., 1983; COWEY y LUQUET, 1983; WILSON y POE, 1985c). En ningún caso se consideró necesario suplementar con aminoácidos cristalinos, máxime cuando la utilización de los mismos por los peces según la revisión previa es muy variable. Todos los piensos fueron formulados para ser aproximadamente isocalóricos en energía bruta y similares en el contenido en proteínas y lípidos. Las Tablas 6 y 7 muestran las mezclas de vitaminas y minerales usadas en los distintos ensayos. Se usó una dieta control con harina de pescado como única fuente proteica en todos los ensayos, como base de comparación de resultados frente a los tratamientos experimentales. 2.2.2. Elaboración. En la elaboración de las dietas se comenzó por mezclar en primer lugar todos los ingredientes secos (harinas, fuentes de carbohidratos, minerales, vitaminas hidrosolubles y aglutinantes) durante unos 20 min, en una mezcladora de la marca Danamix (Mod BM 330), añadiendo a continuación el aceite o los aceites con las vitaminas liposolubles y el etoxiquin, seguido de la cantidad de agua suficiente (en la que era disuelta la colina) como para permitir el granulado de la mezcla resultante en una peletizadora Mobba de 2 HP (Mod. 8.3), a través de una matriz para 3 mm de diámetro de gránulos. Los granos así obtenidos se secaron a una temperatura inferior a los 40°C durante unas 12 h y se guardaron a -20°C, desde donde una vez por semana se iba sacando (y conservando a 4°C), la cantidad necesaria con la que ir alimentando a los peces. Se guardaron también muestras secas de cada uno de los piensos a -20°C para los análisis bioquímicos. 39 /,,¡'Tk./IULCtllllII'io Cienc.MIII'. "." Tabla 6. Mezclas de vitaminas y minerales usadas en la elaboración de los piensos ensayados en los experimentos 1 y 4. Mezcla de vitaminas (mg/kg o U.I./kg de dieta) Tiamina (B1) Riboflavina (Bl) Piridoxina (B6) Pantotenato cálcico Ácido nicotinico Biotina (H) Ácido fólico Cianocobalamina (B 1l ) Cloruro de colina Mio-inositol Ácido ascórbico (C) «-tocoferol (E) Menadiona (~) Coleca1ciferol (D 3 )· Retinol acetato (A)· Etoxiquina • Expresado en U.l 37.0 48.0 20.0 74.0 300 .. 0 0.5 10.0 0.1 1700.0 337.0 240.0 300.0 110.0 2000.0 5000.0 130.0 40 Mezcla de minerales (mg/kg de dieta) Mn Cu Co 9.3 0.9 2.2 2.0 1 Zn 44.0 Tabla 7. Mezclas de v:itaminas y minerales usadas en la elaboración de los piensos ensayados en todos los experimentos excepto en el 1 y 4. Mezcla de vitaminas Mezcla de minerales (mglkg o U. l/kg de dieta) (g/kg de dieta) Tiamina (B1) 40.0 ~.hCa 1.605 Riboflavina (B2) 50.0 CaCO, 4.000 PiridoxÍna (B6) 40.0 FeSO." 7H2O 1.500 Pantotenato cálcico 117.0 MgSO.·7H 2O 1.605 Ácido nicotín.ico 200.0 J91PQ. 2.800 Biotina (H) 1.0 N~."~O 1.000 Ácido fólico 10.0 Al2 (SO.h " 6~0 0.020 Cianocobalamina (B 12 ) 0.5 ZnSO." 7H2O 0.240 Cloruro de colina 2700.0 CuSO." 5H 2O 0.120 Mio-inositol 600.0 MnSO." H20 0.080 Ácido ascórbico (C) 1000.0 KI 0.020 IX-tocoferol (E) 250.0 CoSO." 7H2O 0.080 Menadiona (K,) 20.0 Colecalciferol (D,)· 2000.0 Retinol acetato (A)· 5000.0 Etoxiquina 100.0 • Expresado en u.I. 41 Inf.Tic.lnsLCanario Cienc.Mar. n·-I 2°_ Cierre de las entradas de aire, después de la última toma de alimento, durante unos 10-15 min para facilitar la deposición de posibles restos de comida y heces en el fondo de los tanques. 3°_ Limpieza de los tanques mediante vaciado cuidadoso de las dos terceras partes del agua de los mismos a través de las columnas de decantación. 4°_ Reposición rápida de los niveles de agua habituales y apertura de las llaves de rure. 5°_ Colocación de los tubos para recogida de heces que serán retirados la mañana siguiente. Este proceso se debe realizar cada día aproximadamente a la misma hora, siendo las heces recogidas una muestra representativa de las excreciones a lo largo de las 24 h del día Una vez recogidas las heces, se centrifugan (Sigma, Milwaukee, USA, 3K20) durante 20 min a 1 0000 rp~ se deshecha el sobrenadante y se pesan, liofilizan (Heto, Birkerod, Dinamarca, CD8) y conservan a -80DC hasta el momento de su análisis. Antes de ser analizadas, las heces ya secas son primero tamizadas con .el fin de liberarlas de posibles escamas. Posteriormente son molidas en un triturador Cyclotec de la marca Tecator, Roganas, Suecia (1093 Sample Mill), al que se le adapta una rejilla de 0.5 mm de luz de malla 2.3.3. Condiciones experimentales en ensayos de excreción de amonio. Los tanques utilizados para la realización de estos experimentos fueron los troncocónicos mostrados en la Fig. 4. La rutina de toma de muestras consistió .en .· alimentar a los peces con sus respectivas dietas experimentales a primera hora de la mañana, limpiando a continuación los tanques cuidadosamente con la ayuda del vaciado de las tres cuartas partes de los mismos, volviéndolos a llenar lo más rápidamente posible. Una vez hecho ésto se procede a cerrar las entradas de agua de cada uno de los tanques, vigilando cada hora la concentración de oxígeno y el comportamiento de los peces en el interior de los mismos. Cada dos horas a partir de la hora de alimentación se mide el pH y se toman muestras de agua de cada uno de los tanques en recipientes de plástico oscuros llenándolos en toda su capacidad, los cuales se guardan inmediatamente a 4DC hasta el momento de su análisis. 2.4. PARÁMETROS BIOLÓGICOS UTILIZADOS. 2.4.1. Crecimiento. Una vez cuantificada la ingesta total de cada dieta, se valora el crecimiento en peso 48 de cada lote experimental, como primera medida para estudiar los índices de eficacia del alimento. El crecimiento se puede expresar en términos absolutos, o bien como porcentaje respecto del peso inicial. Crecimiento (% sobre el peso inicial) = (Peso final -Peso inicial) x 100 Peso inicial 2.4.2. Eficacia bruta del alimento. La eficacia del alimento (FE) se define como la relación entre el peso corporal ganado (g peso húmedo) por alimento seco consumido (g). La FE varía con el nivel de alimentación y el tamaño de los peces. FE = Incremento de peso (g) Alimento ingerido (g) 2.4.3. Utilización de la proteína. 2.4.3.1. Coeficiente de eficacia proteica. El coeficiente de eficacia proteica (PER) se define como la relación entre el peso corporal ganado (g peso húmedo) por proteína ingerida (g) y representa una medida de la habilidad del pez para utilizar la proteína dietaría (OSBORNE et al., 1919). Este índice es el método más utilizado para determinar la calidad de la proteína PER = Incremento de peso (g) Proteína ingerida (g) 2.4.3.2. Valor productivo de la proteína (%). El valor productivo de la proteína (pPV) se define como la relación porcentual entre la ganancia de nitrógeno corporal y nitrógeno ingerido por el pez. PPV = N corporal final - N corporal inicial x 100 N total ingerido (g) La energía metabolizable que no es disipada como calor, es retenida en el cuerpo en forma de nuevos elementos tisulares. En animales en crecimento, parte de esa energía se retiene en forma de proteína y parte en forma de grasa En este sentido, proteínas con un alto valor biológico promueven mayor deposición proteica que las de peor calidad. 49 I"¡'Tic.I,,stCanario Cienc.Mar. ,,·4 2.4.4. Retención energética (%). La retención energética (RE) se define como la relación porcentual entre la ganancia de energía corporal y la energía ingerida por el pez: RE = Energía comoral final -Energía corporal inicial x 100 Energía ingerida (kJ) Para el cálculo del contenido energético corporal se siguió el método indirecto basado en el análisis de los componentes del mismos, seguido de la aplicación de los valores calóricos estándar para cada uno de ellos. Valores medios generalmente aceptados para la completa combustión de carbohidrato s, proteínas y lípidos son 17.2, 23.6 Y 36.2 kJ/g, respectivamente (BRAFIELD, 1985). 2.4.5. Indice hepatosomático. El índice hepatosomático (HSI) se define como la relación existente entre el peso del hígado y el peso corporal total y viene definido por la siguiente expresión: HSI = Peso hígado (g) x 100 Peso pez (g) 2.4.6. Determinación de coeficientes de digestibilidad aparente. Para la detenninación de los coeficientes de digestibilidad aparente (ADC) se optó _. por un método de detenninación indirecto, utilizando Cr 203 (0.5%) en las dietas como marcador inerte. Según como se indicó previamente los cambios en las proporciones de nutrientes y marcador en el alimento y las heces, penniten el cálculo indirecto de las digestibilidades aparentes de dichos nutrientes. Para ello se utiliza la siguiente expresión: ADC (%) = 100 -(100 x Nutriente en heces(%) x CrlOl.(%) en dieta) Nutriente en dieta(%) Crl03 (%)en heces La digestibilidad total de las dietas vendrá dada por la ecuación: Digestibilidad Total (%) = 100 -(100 x ~!b (%) en la dieta) Crl03 (%) en las heces 2.5. MÉTODOS ANALÍTICOS DE COMPOSICIÓN. En este apartado se describen los métodos de análisis utilizados con las diferentes so ll1f.Tk.lnst.Ciuuuio CienGMar. 11·-1 muestras. Todos los análisis se hicieron por triplicado, sal"lo en algún caso excepcional en el que el tamaño de muestra sólo permitió hacer duplicados. Todas las muestras excepto los tejidos y órganos de los peces, por su alto contenido en lípidos y/o humedad, fueron homogeneizadas en un Cyclotec de Tecator, Hoganas, Suecia (1093 Sample MilI), a través de una rejilla de 0.5 mm de luz de malla Para el análisis de la composición corporal de los peces, se muestrearon 10 animales al azar al inicio de los ensayos y 3 por cada tanque al final de los mismos. Los peces fueron pesados, secados a 105°C durante 24 h y triturados hasta obtener una harina fina 2.5.1. Humedad. La humedad de las muestras se determinó por desecación en estufa a 1050C hasta peso constante según el método de la AOAC (1985). 2.5.2. Ceniza. El contenido en ceniza fue detenninado mediante la incineración de la muestra en horno Mufla a 450°C hasta peso constante según el método de la AOAC (1985). 2.5.3. Proteínas. El contenido en proteínas (AOAC, 1985) se calculó a partir de la composición.enN total de las muestra detenninada mediante la técnica Kjeldhal. El método consiste en la digestión de las muestras con ácido sulfúrico concentrado a 420°C en presencia de un catalizador de mercurio, seguido de una destilación con Na(OH) al 40%, con ácido bórico como sustancia receptora, en una unidad destiladora Tecator (Hoganas, Sweden, Kjeltec System 1003). Por último se realiza una valoración con HCl O.IN. La conversión a porcentaje de proteína bruta se realizó mediante la siguiente fórmula, Proteínas(%)= Cvalor.mIvalor media patrón mI) x 0.1 x 14.007 x 6.25 x 100 peso de la muestra (mg) 2.5.4. Lípidos totales. El contenido en lípidos totales de las muestras fue detenninado mediante el método Soxhlet de extracción en caliente de grasas usando eter de petróleo (40-60°). Este sistema 'se empleó para el análisis de muestras tales como los ingr~dientes, dietas y c~casas. SI Inf.Téc.lnstCanario Cienc.Mar. n4 En aquellas muestras en las que se necesitó extraer los lipidos en frío para la determinación de su composición en ácidos grasos, o bien en las que se disponía de una pequeña cantidad de muestra como en el caso de las heces y de los hígados de los peces, el método utilizado fue el de extracción con una mezcla de cloroformo-metanol (2: 1) (FOLCH et al., 1957). Para la determinación de ácidos grasos, los lípidos obtenidos por el método de Folch fueron posteriormente saponificados con etanol y KOH (50%), y metilados con BFl 3. Los ésteres metílicos fueron identificados y cuantificados mediante cromatografia de gases bajo las siguientes condiciones operativas: Aparato: Shimadzu (Analytical instrument division, Kyoto, Japan, GC-14-A). Integrador: Shimadzu C-RSA Columna: capilar en sílice fundida cOn Supelco-l0 (30 m x 0.32 mm ID.). Gas portador: Helio. Presión del gas: H~ 1, H2 0.5, N2 0.5 Y aire 0.5 kglcm2• Temperatura: detector 250, inyector 250 y columna 208°C. 2.5.5. Fibra. El contenido en fibra (AOAC, 1985) fue determinado mediante una digestión ácida de las muestras con H2 S0 4 (0.225 N), seguida de una digestión básica con NaOH (0.313 N) en un sistema de digestión Fibertec System 1020 de la marca Tecator (Hoganas, Suecia). A continuación se seca el residuo obtenido en una estufa a 105°C durante toda la noche, se pesa, se incinera a 600°C durante 2 h y se vuelve a pesar. La proporción de . fibra vendrá dada por la expresión: Fibra (%) = peso (recipi ente+resi duo ) - peso (recipiente + ceniza) x 100 peso de la muestra 2.5.6. Carbohidratos. Para la determinación de los carbohidrato s se utilizó el método de la antrona, consistente en medir a 620 nm la coloración azul-verdosa producida por los compuestos derivados de la reacción entre los productos de la degradación de los carbohidratos y compuestos poliaromáticos tales como la antrona Para ello se trata a las muestras de la siguiente forma: 1Precipitación de las proteínas contenidas en las muestras con ácido tricloroacético (5% p/v) en un baño a 90°C durante 1 h. 52 1"f.Tk.lrut.Cuuuio Cienc.MtI1'. ,,·4 2Centrifugación a 3000 rpm durante 5 min. 3Recuperación del sobrenadante mediante filtración a través de fibra de vidrio. 4Incubación a 100°C durante 7 min de 0.5 mI de sobrenadante, 0.5 mI del estándar de calibración (100 ",g de glucosa/mI H2 0) y 5 mI del reactivo de antrona (0.05% en H2 S0 4 con H20 y alcohol etílico). 5Lectura a 620 nm frente a un blanco. 2.5.7. Determinación de óxido crómico. El porcentaje de óxido crómico contenido en las muestras fue determinado mediante la digestión de las mismas con ácidos nítrico y perclórico concentrados, evaluando en espectrofotómetro a 350 nm la coloración amarilla obtenida como consecuencia de la solubilización del cromo (FURUKA WA y TSUKAHARA, 1966). 2.5.8. Energía bruta. La energía bruta de las muestras fue detenninada mediante combustión de las mismas en una bomba calorimétrica incluí da en un sistema de calorimetria !KA C-700 (Heitersheim-Germany). 2.5.9. Determinación de la actividad antitrípsica. La determinación de la tripsina inhibida (UTI) sólo se utilizó para el análisis de la harina de soja, basándose en la disminución del grado de hidrólisis de un sustrato natural o sintético causado por la presencia del inhibidor en la muestra El método envuelve la extracción de los inhibidores de la muestra mediante agitación continua con agua destilada, añadiendo a continuación la solución de la enzima tripsina (bovine trypsine, SIGMA T-0134) dejando durante 7 min en un baño a 37°C. La actividad de la tripsina remanente es medida entonces por adición del sustrato benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide (BAPNA, SIGMA B-3133) a 37°C durante 10 min; la p-nitroanilida liberada es medida por espectrofotometria a 410 nm (LRJ y MARKAKIS, 1989). Se consideran aceptables para la inclusión en dietas para peces niveles de inhibidor de la tripsina de 1-3 mg por g de harina de soja (AKIY AMA, 1988). 2.5.10. Determinación de la solubilidad de las proteínas en KOH (0.2%). La determinación de la solubilidad de las proteínas permite conocer si durante el procesado de un ingrediente, éste ha sufrido un sobrecalentamiento que pudiera alterar a 53 lnf.Téc.lnstCiuuuio Cienc.Mar. n· 4 la disponibilidad de las proteínas, especialmente en aquellos aminoácidos tales como la lisina o la arginina que son muy susceptibles al calor. El método sólo se utilizó para análisis del harina de soja y está basado en la relación inversa encontrada entre la solubilidad de las proteínas en KOH (0.2%) y el calor a que es sometida la muestra. La determinación de la proteína soluble final se hace mediante el análisis del contenido en nitrógeno por el método Kjeldhal. Un valor de índice de solubilidad de la proteína entre 60-80 se puede considerar óptimo en los alimentos para peces (AKIYAMA, 1988). 2.6. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS DIGESTIVAS. 2.6.1. Preparación de extractos. El estudio de la actividad de los enzimas digestivos fue realizado en 9 peces de cada tratamiento. Para ello se extrajo de cada uno una porción de aproximádamente 1. cm del - digestivo medio, conteniendo los ciegos pilóricos y parte del intestino proximal. Se pesó y homogeneizó (1: 10 p/v) en buffer Tris-HCl (300 mM, pH 8.1) enfriado previamente, centrifugando a continuación a 14.000 r¡)m (4°C, 15 min). Los sobrenadantes así obtenidos fueron utilizados para medir las actividades. 2.6.2. Actividad tripsica. La actividad trípsica fue medida a 25°C con BAPNA (N-benzoyl-L-arginine-pnitroanilide) como sustrato específico. La mezcla de reacción consistió en 50 J.lI de BAPNA (0.25 nM en buffer Tris-HCI, 0.1 M, pH 8.1, conteniendo 20 mM de CaCI2 ), 430 J.lI de buffer Tris-HCl y 20 J.ll de extracto enzimático. El tiempo de reacción fue de 10 min, calculándose la actividad por el incremento de absorción a 25°C y 405 nm (HOFER y UDDIN, 1985). La actividad se expresó como mUnidadeslmg de proteína soluble. La proteína soluble de los extractos fue determinada de acuerdo con BRADFORD (1976). 2.6.3. Actividad amilásica. La actividad amilásica se realizó mediante la agregación de 0.1 mi de cada uno de los sobrenadantes a 1 mi de almidón soluble (1 % p/v en agua destilada). La mezcla de reacción fue incubada a 25°C durante 10 mino Una vez pasado este tiempo se añadieron 5 mI de reactivo de maltosa (ADNS) , volviendo a incubar durante 5 min en agua hitviendo. Las lecturas se hicieron a 540 nm, expresando los resultados como unidadeslmg de proteína soluble. La proteína soluble fue determinada según BRADFORD (1976). S4 2.7. DETERMINACIÓN DE NIVELES DE EXCRECIÓN DE AMONIO. Las muestras de agua de los tanques recogidas durante los ensayos de excreción de amonio fueron procesadas usando un analizador por inyección de flujo de la marca Tecator, H6ganás, Suecia, modelo FIA star 5010. El método (aplicación de Tecator ASN 50-01/84), con algunas modificaciones para adaptarlo a agua salada, consiste en someter a la muestra a un pH básico (NaOH 1.5M), con lo que se convertirá el NH,.+ en NH 3 gas, que pasará por difusión a través de una membrana de intercambio iónico. A continuación se le hace reaccionar con un colorante (indofenol), determinándose su concentración por espectrofotometria a 590 nm. 2.8. MÉTODOS mSTOLÓGICOS. Las muestras utilizadas para estudios histológicos fueron fijadas por inmersión en formalina tamponada al 10% y pH 7. PosteriOrtnente las muestras de hígado fueron procesadas e incluí das en parafina mediante procedimiento de rutina De los bloques de parafina se obtuvieron cortes de 4-6 f..lll1 tiñiendo con los métodos de la hematoxilina y eosina o con ácido peryódico-reactivo de SchifI (P AS), para posteriores observaciones al núcroscopio. Las tinciones o reacciones ~ AS positivas aportan información principalmente sobre las deposiciones de glucógeno y mucopolisacáridos en el tejido estudiado (MARTOJA y MARTOJA-PIERSON, 1970). Los estudios de este tipo se realizaron principalmente en muestras de hígado, ya que son muchos los autores que afirman que los cambios hepáticos pueden ser usados como un indicador del estado fisiológico del animal (HIBIY A, 1982; STORCH y, JUARIO, 1983; SEGNER y JUARIO, 1986). Según ORACHUNWONG et al. (1988), la comparación de observaciones entre la histología del hígado y el crecimiento de los peces ayudan a un mejor entendinúento sobre la utilización de las dietas por estos animales. 2.9. TRATAMIENTOS ESTADÍSTICOS. Los datos en todos los experimentos fueron sOInetidos a análisis de varianza de una entrada (ANOV A), siendo las diferencias entre medias comparadas por el test de Tukey con un intervalo de confianza del 95% (P~0.05) (ZAR, 1984). En los casos en que se obtuvo un valor para P~0 . 05 en el test de Bartlett de homogeneidad de las varianzas, los datos fueron transfonnados previamente y luego analizados según el test de Tukey. Por último, aquellos datos cuyas tramonnadas no mejoraban el valor de la P de Bartlett fueron sometidos al test no paramétrico de KruskalWallis (ZAR, 1984). 55 ¡"f.Tic.¡"st.Canario Cienc.Mar. ,,·4 3. EFECTO DE LA INCLUSIÓN DIETÉTICA DE HARINAS DE SOJA, ALTRAMUZ, GLUTEN DE MAÍz, y CARNE Y HUESOS EN EL CRECIMIENTO Y UTILIZACIÓN DEL ALIMENTO DE LOS JUVENILES DE DORADA. 3.1. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS. A nivel comercial, el principal objetivo de la producción acuícola es el de maximizar el crecimiento y la supervivencia al mínimo costo·(KNIGHTS, 1985). La importancia, tanto cualitativa como cuantitativa, de la proteína como ingrediente en dietas para peces ha sido enfatizada por los nutricionistas en multitud de trabajos (NRC, 1977, 1983; COWEY, 1979; HALVER Y TIEWS, 1979; PANDIAN Y VIVEKANANDAN, 1985; TACON y COWEY, 1985; WILSON y HALVER, 1986; STEFFENS, 1987; DE LA IDGUERA, 1989; KAUSHIK, 1990). En régimen de producción animal la proteína de cualquier dieta se utiliza fundamentalmente con fines de mantenimiento y crecimiento. Desde un punto de vista práctico, lo que interesa evidentemente, es destinar la mayor parte de la proteína dietaria hacia el crecimiento, minimizando el costo proteico de mantenimiento, que incluye síntesis de proteínas funcionales, gluconeogénesis y energía Como se ha mencionado en apartados anteriores, el aprovechamiento de la proteína dietaria por el pez, es decir, la relación existente entre la proteína acumulada y la proteína consumida, se ve influída por multitud de factores (COWEY, 1975, 1980; STEFFENS, 1981). Aunque, como se ha expuesto anterionnente, está ampliamente demostrada la utilidad de la harina de pescado como fuente de proteína en los piensos para acuicultura . .debido~. _. a los excelentes resultados de crecimiento y utilización nutritiva a que da lugar, los problemas que últimamente conlleva su empleo han determinado que multitud de investigadores orienten sus esfuerzos hacia la búsqueda de otras fuentes de proteína capaces de reemplazar total o parcialmente a esta materia prima en la formulación de las dietas. En este sentido, es posible encontrar una amplia variedad de trabajos en los que se estudia de manera comparada el valor nutritivo de diferentes tipos de ingredientes proteicos, tanto de origen vegetal como animal en relación a la harina de pescado, valorando los resultados de su utilización en el crecimiento y aprovechamiento del alimento por distintas especies de peces. En el presente capítulo se estudia el efecto de incluir las cuatro materias primas cuya selección se justifica en el capítulo anterior en piensos para dorada, y se presentan resultados relativos al crecimiento y utilización nutritiva de las distintas fórmulas. Se cqxlrtan evidencias además de posibles alteraciones histológicas relacionadas con el uso nutritivo de determinados ingredientes. Con este objeto se llevaron a cabo una serie de S6 11lf.Tk.lllsLCturtuio Cienc.Mar. 11-" experimentos en los que dichas materias primas fueron incluí das a distintos niveles en dietas experimentales para juveniles de esta especie. 3.2. EXPERIMENTO 1. SOJA Y ALTRAMUZ. 1 3.2.1. INTRODUCCIÓN. Los ensayos realizados con harina de soja como único o principal componente proteico de las dietas para trucha han dado como resultado pobres índices de crecimiento y conversión del alimento, así como elevadas tasas de mortalidad (RUMSEY y KETOLA, 1975; SPINELU et al., 1979). Sin embargo, o~os autores (LIEBOWITZ, 1981) muestran que en piensos para pez gato la soja puede llegar a sustituir totalmente a la harina de pescado mientras se cubran las necesidades de P y energía Por otro lado, la sustitución parcial de la harina de soja en dietas para peces aparece ampliamente documentada en la bibliografia, observándose resultados contradictorios en diferentes trabajos. Así tenemos que SPINELLI et al., (1979) encontraron que niveles de sustitución del 50% de la harina de pescado por harina de soja en una dieta OMP (Oregon Moist Pellet) para salmón cobo de 30 g de peso medio inicial resultaron en una reducción del crecimiento y la conversión de alimento de un 20% y un 23% respectivamente. Niveles de sustitución mayores al 50% resultaron completamente inadecuados. En el caso de la trucha arco iris, ALEXIS et al. (1985), comprobaron que las sustitucuiones de hasta un 30% de la proteína dietaria (45%) resultaron en tasas de cremiento y conversión del alimento semejantes a las obtenidas para la proteína de pescado. Estos resultados fueron corroborados por BUDDINGTON y HIL TON (1987), quienes obtuvieron buenos índices de crecimiento en truchas arco iris de 25 g alimentadas con 26,7% de harina de soja en' . una dieta conteniendo un 49% de proteína durante 20 semanas. Posteriormente, MOY ANO et al., 1992, comprobaron que niveles de sustitución de hasta un 45% de la proteína de harina de pescado por harina de soja no afectaron al crecimiento, aceptación y conversión del alimento, así como a las propiedades organolépticas de los peces, con respecto a aquellos alimentados con un pienso comercial o con una dieta control a base de harina de pescado como única fuente proteica Para tilapias sometidas a condiciones prácticas de cultivo en Israel, sustituciones de la mitad de la harina de pescado por harina de soja, sin ningún tipo de suplementación, resultaron en dietas nutricionalmente equivalentes (VIOLA y ARIELI, 1983). Por otra parte, sustituciones completas de la harina de pescado por harina de soja, si se suplementa la soja con 3% de fosfato di-cálcico y 2% de aceite de aves, dieron resultados de crecimiento iguales a aquellos que se obtuvieron para el harina de pescado (VIOLA et al., 1988). (1) .... de las nsultlldas del pnseDR uperirneafo han sido pubUcados en la mista Aquacalture, 1995, voL 130 : 219-233. 57 .,.. • a: ~ ~ ti .§ U .9 ;¡ ~ lit ~ .~ ~ ~ ~ Tabla 12. CreciDÚento, utilización nutritiva de la dieta y de la proteína e índice hepatosomático para los piensos experimentales con harinas de soja y altramuz. e 810 820 830 AlO A20 A30 Peso medio inicial (g) 38.37-=t:1.99 40. 29-z0.82 39. 3S-=t:0. 75 37 . 0O-Z0 . 9S 3S . 55-=t:1.94 3S.6S-=t:0 .76 39.63-=t:0 .79 Peso medio final (g) 60. ()9M>±2 . 92 64.46C±2. 33 62 . 02bc:± 1.31 56.49-z 1.36 60. 2S ab±2.39 59.06ab±0.56 61.46bc:±3.21 Incremento peso 56.7Q111>±6 .19 59.97b±5.68 57.5oe±3. 20 52. 67 ab ±2. 1S 56.4 2 ab ±3 . 23 52. 77 ab±4.20 51. 76-=t:5.26 (% peso inicial) Ingesta total (g) 42S . 66-=t:14 .36 462. 97-=t:21 . 90 446. 09-=t:21. 70 427: 32-=t:51. 77 416.39-z15.24 462. 3211:t25.92 441.46-=t:35 . 12 Ingesta proteica (g) 227.2O-Z3.73 24S.76-=t:lI.77 225. 51-=t:1O.97 210.90-=t:25 . 55 219.64-=t:S .04 23S.l1-=t:13.35 20S . 77-=t: 17 .56 FE 0. 6I ob±0.07 0. 63 b±0.04 0.61 ab ±0. 05 0. 55 ab±0.06 0.63b±0. 04 0. 53-=t:0.03 0.56ab±0.06 PER 1.15ab±0.12 1. 16 ab ±0. OS l.21b±0.09 1.12 ab ±0. 12 1. lSab±O . 07 1.03-=t:0.05 1.l~±0 . 12 PPV 24.91~2.3S 22 . 39bc:± 1.04 19. 70 ab ± 1. 10 21. 95 a bc:±2. 9S 19 . 011l:t0.51 24.S7 cd ±1.40 27. 66d±2. 22 H81 1.31-=t:0 . 31 1. 29"±0 .26 1.2SII:t0 . 13 1.3S-=t:0 .lS 1. 4511:t0 . 23 1.6O-Z0 . 23 I.3S-=t:0 . 16 ·Valores en una misma línea con distinto superíndice difieren significativamente (Ps; 0. 05). ~ ~ .- s .- u f u 70 60 50 40 30 20 lO O O I .. c +SIO -$-S20 -S3O XLIO .... L20 *L30 15 30 45 60 Días Fig. 6. Incremento de peso (% sobre el peso inicial). Inf.Téc.lnsLCanlU'io Cienc.MIU'. n· 4 COMPOSICIÓN CORPORAL DE LOS PECES. Los resultados obtenidos para la composición corporal final de los peces utilizados en el presente experimento aparecen en la Tabla 13 (la composición media inicial se muestra en el anexo 111). En dicha tabla se observa que la inclusión de materias primas vegetales en la ración no afectó de forma significativa a la composición corporal de los peces, excepto en el caso de los peces alimentados con la dieta AlOque presentaron un contenido en proteínas significativamente menor que los peces control; y en el caso de aquellos alimentados con las dietas A20 y A30, cuya composición ~ ~pidos también resultó ser significativamente menor que la de los peces control. Por otro lado, se apreció un significativo aumento del nivel de proteína en los peces alimentados con piensos de alto contenido en harina de altramuz (dietas A20 y A30), siendo éstos superiores a los de los peces alimentados con harina de soja a los mismos niveles de sustitución. En relación a la humedad los valores obtenidos fueron muy homogéneos para los diferentes tratamientos. Los valores calculados de retención energética (Tabla 13) oscilaron entre un 25% y un 34% para todos los grupos experimentales, existiendo diferencias significativas sólo entre los peces alimentados con la die~ S20, que resultó mayor que en los peces alimentados con la dieta A20. ACTIVIDADENZnMÁTICA Los valores obtenidos para la actividad de la tripsina muestran grandes variaciones entre los diferentes grupos experimentales, variando entre 8 y 180 mUnidadestmg'~de'~' . proteína soluble (Tabla 14). Los valores de la actividad proteásica en los peces alimentados con las dietas en las que se incluyó harina de altramuz, decrecieron al incementar el nivel de sustitución. También se observó una reducción significativa en la actividad de la tripsina en los peces alimentados con dietas que incluían un 30% de harina de soja La actividad amilásica (Tabla 14) medida en peces alimentados con dietas que incluían soja fue claramente mayor que la obtenida en peces que consumieron piensos con altramuz. Por otra parte, se apreció como dicha actividad era más reducida en aquellos peces alimentados con raciones que incluían una mayor cantidad de harina vegetal en la dieta y por consiguiente, consumían una mayor proporción de carbohidratos. Este efecto se hizo especialmente patente cuando el pienso incluía altramuz. 66 01 -..l Tabla 13. Composición corporal y tasa de retención energética de los peces utilizados en el experimento con harinas de soja y altramuz. COMPOSICIÓN C S10 S20 S30 AI0 A20 A30 (% peso seco) Proteínas 56 . OSbcd..± 1.2S 56 . 96<Xl.±2 .42 52.S7 ab ±3 .19 53 . 64a~0.92 51.9S"±3.03 5S. 22<l±3 .02 57. 67<l±O. 73 Lípidos 3 1. SSb± 1. 64 29. 39"b±2 . 71 32.55b ±1.02 30 . 16 ab ±1.61 30. 46 ab ± 1. S5 27. 60"±2. 56 2S.56"±1.54 Humedad 67.06"±0.S5 67.65"±1.00 66.SS"±0.95 6S.25"±0.92 66.9S"±l.SO 6S.57"±1.43 6S.43"±O.20 RETENCIÓN 33. S5 bc ±3.95 30 .29 abc ±l.S3 34.0s c±1.32 27.0Sab±2.S9 32.35 abc ±1.91 25.63"±1.36 2S.24abc ±3 .14 ENERGÉTICA (%) • Valores en una misma línea con distinto superíndice difieren significativamente (P~ 0.05). Tabla 14. Actividades enzimáticasdigestivas determinadas en peces alimentados con las dietas experimentales (mU/mg proteína so1uble). Actividad tripsica Actividad amilásica C O.12<l±0 .06 13 . 22"±2. 77 S10 O. 09<Xl.±0.04 11.2S"±2.60 S20 0.15<l±O.07 IS. S0<l±4.25 S30 O.02 ab ±0 .01 4.400b ±0 .S9 • Valores en una misma línea con distinto superíndice difieren significativamente (P~ 0.05). AI0 A20 A30 0.04~O.02 O.OI"±O .0004 O.01"±O.0003 2. 16"±O.67 /nf.Téc./nstCanario Cienc.Mar. n° 4 ESTUDIO mSTOLÓGICO. Se compara la morfología del parénquima hepato-pancreático de 9 peces alimentados con las harinas vegetales (soja y altramuz) con aquellas de peces alimentados con la dieta control (Fig. 7), mostrando diferencia significativa entre ambos grupos. Se observó un mayor número de depósitos lipídicos alrededor del tejido pancreático en los peces alimentados con las dietas que contenían harina de soja (Fig. 8), encontrándose además núcleos polarizados en los hepatocitos de los mismos cuando el nivel de sustitución de la harina de soja en la dieta fue igual o mayor al 20% (Fig. 9). También se constató una reducción en las deposiciones de sustancias PAS positivas (presumíblemente glucógeno) en los hepatocitos, que se difuminaban a medida que la proporción de harina de soja se incrementaba en la dieta. Por otra parte, en algunas muestras de peces alimentados con la dieta S30 se presentaron áreas con elevados niveles de vacuolización, desorganización y necrosis aisladas de hepatocitos. Sin embargo, la histología del hígado de los peces que habían sido alimentados con dietas en las que se incluyó harina de altramuz fue muy similar a la de los peces alimentados con la dieta control. Se observó un pequeño número de gotas lipídicas, junto con alguna reducción de la presencia de glucógeno en el citoplasma de los hígados de los peces alimentados con las dietas A20 y A30 (Figs. 10 Y 11). Fig. 7. Histología del parénquima hepato-pancreático de peces alimentados con la dieta control. 68 /nf.Téc./nst.Canario Cienc.Mar. n° 4 Fig. 8. Depósitos peripancreáticos de lípidos de peces alimentados con la dieta S30. Fig. 9. Polarización de núcleos en hepatocitos de peces alimentados con la dieta S30 . 69 Fig. 10 ~.Jjis!C? I9gí : a del p~én9~jm~ hel?~o.pancreático~epe~~s . alimeJ1tados con la dieta A20. F'g. -1 J .. Depósitos peri,pancreáticos . de tí pidos d~ . p~es alimentados con la dieta A30. 70 l"¡'Tk.l,,st.CtmIll'io Cieltc.MIIr. ,,·4 3.2.4. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES. En primer lugar se debe resaltar la buena aceptación de todos los tratamientos experimentales, teniendo en cuenta que las dietas con mayor nivel de sustitución contuvieron del total de las fórmulas un 30 y un 35% de harina de soja y de altramuz respectivamente. En contraposición, diferentes autores (REINITZ, 1980; JACKSON et al., 1982; ROSELUND, 1986; VIYAKARN et al., 1992; HAJEN et al., 1993) han observado en distintas especies una reducción importante en la ingesta de las dietas que contienen niveles crecientes de ingredientes proteicos vegetales. Estas observaciones parecen estar asociadas principalmente con la gran' sensibilidad del pez a las propiedades organolépticas de sus dietas (BONE y MARSHALL, 1982). En juveniles de salmon chinook, por ejemplo, se tuvieron ingestas extremadamente bajas para dietas conteniendo niveles de un 15% y 30% de harina de soja y concentrados proteicos de soja, los cuales fueron relacionados con una mala palatabilidad de esos productos (HAlEN et al.,1993). Esta mala palatabilidad de la soja había sido encontrada también en trabajos previos por otros autores (FOWLER y BANKS, 1967; FOWLER, 1980). Según MURAl et al. (1989), el tratamiento de los productos de la soja con metanol reduce este problema de mala palatabilidad Por otra parte, los buenos niveles de ingesta encontrados para las dietas con harina de altramuz en el presente experimento concuerdan con aquellos descritos previamente en salmónidos (DE LA IDGUERA et al., 1988; GOMES y KAUSIDK, 1989a; HUGHES, 1991; MOY ANO, 1990). En contraste con la harina de soja hay que reseñar, (LIENER, 1980), que los factores antinutricionales de la harina de altramuz que podrían afectar a la mala palatabilidad de la misma por los peces (principalmente alcaloides) ' son hidro solubles y se eliminan fácilmente. Atendiendo a todo esto, la evaluación nutricional de ambas proteínas vegetales no estuvo condicionada por una reducción en la ingesta alimenticia de los peces sometidos a los diferentes tratamientos experimentales. En cuanto al crecimiento, aunque no se encontraron diferencias significativas, se observó una reducción global de éste a medida que se incrementó el nivel de proteína vegetal en las dietas, lo cual pudo ser debido a diferentes factores, entre ellos factores antinutricionales que pueden limitar el uso de elevados niveles de ingredientes vegetales en dietas para peces (CHUBB, 1982; RICHARDSON et al., 1985; GATLIN y PHILLIPS, 1989). En este sentido, en el caso de los tratamientos con soja se tuvo que el nivel máximo pennisible de sustitución por esta fuente proteica, con las condiciones experimentales de este trabajo, fue del 20%. Este resultado se contrapone al 30% encontrado en piensos para seriola (LEE et al., 1991; VIYAKARN et al., 1992; SHIMENO et al:, 1992), y al 40% determinado para platija (COWEY et al., 1971). Por otro lado, los buenos resultados obtenidos para los piensos con harina de semillas de altramuz concuerdan con aquellos mostrados por MOY ANO (1990) para trucha arco iris, quien ~contró que el óplÍmo nivel 71 lnf.Téc.lnst.Canario Cienc.Mar. n4 de sustitución para esta especie era del 30%, si bien posteriprmente, MORALES (1993) llegó a conseguir resultados satisfactorios desde el punto de vista productivo con sustituciones del 40% de la proteína de pescado por proteína de altramuz en piensos para esa misma especie. Según los resultados de FE, PER Y PPV, el valor nutricional de ambas proteínas vegetales es semejante. No obstante, se pudo observar en conjunto una reducción en ese valor conforme el nivel de harina de soja se incrementaba en la dieta, aunque no fueron detectadas diferencias significativas entre las dietas de cada serie. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por ALLIOT et al. (1979) para lubinas y SlDMENO et al. (1992, 1993) para seriola Un resultado que merece especial mención es el elevado PPV que se obtuvo para los peces alimentados con los tratamientos A20 y A30, los cuales estarían relacionados con el mayor porcentaje en proteínas corporales encontrado para estos peces. La explicación de estos valores de PPV tan altos no se puede hacer en función de la calidad proteica del altramuz, en relación a su composición en aminoácidos esenciales, puesto que aunque " presenta una elevada proporción en lisina, es pobre en aminoácidos sulfurados. Según MOY ANO (1990), coincidiendo con la hipótesis emitida por HUGHES, (1985), la explicación a los sorprendentemente buenos resultados encontrados para el altramuz en piensos para trucha podría estar relacionada con la capacidad del animal para utilizar eficientemente el aminoácido glutámico contenido en altas proporciones en esta materia prima (20-25% de la proteína), como fuente de aminoácidos no esenciales. Se sabe que una gran parte de la proteína dietaria es utilizada por los peces con fines energéticos, existiendo una cierta predisposición de los mismos a utilizar las cadenas . carbonadas de los aminoácidos como sustrato energético. En este sentido, la existencia en la dieta de una elevada proporción de glutámico podría representar un "ahorro" importante en la síntesis de aminoácidos no esenciales, pudiendo además ser utilizado para la síntesis de ácidos grasos y para el engorde. Así un alto contenido' en glutámico en la proteína podría contribuir a un mejor aprovechamiento general de la energía dietaria Por otra parte, hay que tener en cuenta que la harina de altramuz contiene otros nutrientes energéticos, lípidos y carbohidratos, cuya buena calidad nutritiva podría favorecer la deposición de proteínas. En cuanto a las actividades enzimáticas, se encontró una reducción significativa de la actividad de las tripsinas a medida que se incrementaba el contenido en harina de soja, lo cual no puede ser explicado en este caso por la presencia de inhibidores tripsicos en la soja, ya que como resultado de la analítica previa, la presencia de este tipo de inhibidores fue descartada. En el caso de los tratamientos con harina de altramuz también fue encontrada esta disminución de la actividad tripsica a medida que la incorporación de 72 1"¡'Téc.l,,st.CtllllI1'io Cimc.MIIr. ,,·4 harina de altramuz en el pienso aumentaba; estos resultados podrían sugerir, comparados con los obtenidos para para la dieta control, la presencia de algún tipo de inhibidor de tripsinas en la harina de altramuz. Sin embargo, no ha sido notificada la existencia en el altramuz de ningún factor antitrípsico. En el caso de los peces alimentados con soja, la reducción de la actividad enzimática puede haber estado asociada con la presencia de otro tipo de factores antinutritivos generalmente presentes en esta materia prima vegetal, los fitatos, los cuales pueden afectar entre otras cosas a la utilización de la proteína de las dietas. RICHARD SON et al. (1985), encontraron que niveles elevados de este ácido en piensos para salmones producía una reducción del crecimiento, conversión alimenticia y utilización de las proteínas. Este tipo de compuestos no son utilizables por la mayoría de los peces y animales monogástricos terrestres, debido a la ausencia en estos organismos del enzima fitasa, que cataliza la conversión de los fitatos en sustancias disponibles más simples. Teniendo en cuenta que la harina de soja tiene aproximadamente un 75% del fósforo en la forma de ácido fitico (1.0-1.5% de la harina), es posible que la disponibilidad del fósforo disminuya a medida que el nivel de harina de soja se incremente en los piensos experimentales. Por otro lado, el incremento en los depósitos lipídicos en hígado y músculo, así como la disminución en el contenido de glucógeno en el hígado, han sido señalados como signos de deficiencia de fósforo en peces (SAKAMOTO y YONE, 1978; SAKAMOTO, 1981). Estas observaciones estarían de acuerdo con los resultados obtenidos en el presente estudio, donde el análisis histológico de los hígados de los peces alimentados con los niveles más altos de soja en las dietas mostraron mayor presencia de lípidos junto con una disminución de glucógeno. El hecho de que las inclusiones crecientes de soja en las dietas no. viniesen. . acompañadas por un aumento en los índices hepatosomáticos de los peces sometidos a esos tratamientos, podría estar relacionado con la existencia de áreas con degeneración hepática observadas en estos peces. Estos resultados según MOSCONI-BAC (1987, 1990) supondrían algo más que un mero proceso reversible reflejo de una desviación en el metabolismo de los ácidos grasos. Los resultados obtenidos en cuanto al contenido en lípidos en carcasa total concuerdan con los descritos por SHIMENO et al. (1993), que no encontraron un efecto significativo de los altos niveles de inclusión de harina de soja en las dietas para seriola Por otra parte las lectinas o aglutininas, proteínas presentes en las semillas de soja que tienen la capacidad de aglutinar eritrocitos, pueden formar precipitados con polisacáridos y oligosacáridos (NIELSEN, 1985; HENDRIKS et al., 1990), reduciendo aún más su disponibilidad. Por otro lado, HENDRIKS et al. (1990) encontraron como característica adicional de las aglutininas de la soja (SBA), la capacidad de unión de las mismas a la membrana del borde piloso o células en cepillo de los entero citos en salmones, 73 ~ • &: ~ ~ ~ .§ U ·5 ~ 1I .!; .~ ~ ~ .!; Tabla 19. Crecimiento, utilización nutritiva de la dieta y de la proteína e índice hepatosomático para los piensos experimentales con harinas de gluten de maíz y carne y huesos. e G20 G30 G40 M20 M30 M40 Peso medio inicial (g) 41.06~2 . 44 40 . 93~2.80 40 . 74~3 . 02 41.45~2 . 55 41.7~2 . 57 40.50-%2.62 40 . 41~2 . 77 Peso medio final (g) I 83.3~4.23 82.15~4.40 84 . 03~0 . 97 83 . 54~2 . 95 86. 10-%5 .20 80 . 62~2 . 49 82 . 82~1.99 Incremento peso 103.10-%10.24 lOO . 67~9.26 1 06. 36~6 . 90 10 1.54~4 . 99 106 . 47~12.43 99 . 06~6.00 104.95~1.54 (% peso inicial) Ingesta total (g) 1024.73ob±32.97 1029.87ob±36.98 1 06 1.5 QII>± 3 1. 14 1177.97b±39. 13 1038.53ob±98.37 936 . 6~79 . 19 985. 30-%43 .25 logesta proteica (g) 422. 52ob± 13 . 59 438.4lb±15.74 433.62b±12.74 470.60b±15. 73 43 1. 62ob±40. 88 368. 08~31.12 406. 34ob± 17 .84 FE 0.67~0 . 05 0 . 64~0 . 06 0 . 64~0 . 03 0 . 58~0 . 05 0 . 68~0 . 02 0 . 6~0.04 0 . 6~0 . 04 PER 1.4Q11>±0 .10 l.33ob ±0 . 12 1. 43ob±0.07 1.26~0 . 10 1. 46ob±0. 05 1. 54b ±0 .08 1. 48ob±0.09 PPV 25.36~1.64 23 . 36~1.95 24 . 67~1.22 21.96~1.79 24 . 83~0 . 82 25.38°±1.30 25 . 57~1.57 HSI 1.4~0 . 21 1.97~0.23 1.81~0 . 12 1.75~0 . 49 1.96~0 . 31 1.88~0 . 20 1.74~0.18 • Valores en una misma línea con distinto superindice difieren significativamente (Ps: 0. 05). o 00 00 -e = ~ .. S .. y f! u 120 100 80 60 40 20 o l+e +G20 -a-G30 -G40 XM20 · .·M30 *M40 o 30 45 60 Días Fig. 12. Incremento de peso (% sobre el peso inicial). :r ~ ~ :r III 75 90 i i' (\ f a 4 , Inf.Téc.lnsLCturario Cienc.Mar. n4 COMPOSICIÓN CORPORAL DE LOS PECES. La Tabla 20 muestra la composición corporal de los peces al final del periodo experimental (la composición media .inicial ~ muestra en el Anexo Ill). Tanto ~~ composición en pr~teína, .como .en líp~dos, cem~ y hume~ de los peces n~ .se VIO influenciada por el mvel o tlpo de mgrediente alternatIvo a la harma de pescado utilizados en las dietas. Comparando entre las dietas de un mismo grupo, únicamente los pece.s alimentados con las dietas a base de harina de carne y huesos muestran una tendenCIa, aunque no significativa, a aumentar los niveles de proteínas, ceniza y humedad y a disminuir los lípidos a medida que aumentó la proporción de este ingrediente en la dieta. . . En cuanto a la retención energética observada para los peces alimentados con los distintos piensos, a nivel general se tuvo que aquellos obtenidos para los tratamientos que incluyeron harina de carne y huesos fueron relativamente superiores al resto, siendo significativamente mayores para los peces alimentados con las dietas M20 y M30 con respecto a los que fueron tratados con G40. Un aspecto a considerar en cuanto a los peces alimentados con dietas en lás que se incluyó gluten de maíz, fue la aparición de un peculiar color amarillo-anaranjado en los opérculos y bases da las aletas, cuya intensidad aumentó con el incremento de gluten en la dieta. Esta especial coloración no se encontró para los peces alimentados con el resto de los tratamientos, incluí do el control. ESTUDIO mSTOLÓGICO. De igual forma que en el experimento con harinas de soja y de altramuz, las muestras de los hígados de los peces alimentados con las dietas que contuvieron las proteínas alternativas fueron comparadas con aquellas de la dieta control (Fig. 7). En el caso de las dietas con gluten de maíz no fueron encontradas alteraciones histológicas incluso a niveles del 40% de sustitución, destacando un aumento del tamaño celular conforme se incrementaba el porcentaje de esta harina en el pienso, pero sin producir alteraciones ni depósitos de origen lipídico apreciable (Figs. 13 Y 14). Por el contrario, niveles de sustitución de la proteína de pescado por proteína de harina de carne y huesos igual o superior al 30%, sí que dieron lugar a depósitos lipídicos notables, además de polarización y necrosis aisladas en los hepatocitos para un 40% de sustitución. En este caso, también se observaron acúmulos de grasa en el tejido peripancreático (Figs. 15 Y 16). Por otro lado, los peces alimentados con la dieta control se caracterizaron por presentar hepatocitos con gran afinidad al P AS. También se observó en general. una reacción P AS positiva más acusada en los peces alimentados con harina de gluten de maíz que en aquellos alimentados con las dietas que incluyeron harina de carne y huesos. Además, tanto para uno como para otro grupo de dietas, un aumento en el nivel de inclusión de ambas harinas vino acompañado por una reducción en la presencia de glucógeno en el hígado. . 82 00 w Tabla 20. Composición corpocal y tasa de retención energética de los peces utilizados en el experimento con harinas de gluten de maíz y carne y huesos. COMPOSICIÓN C G20 G30 G40 M20 M30 M40 (% peso seco) Proteínas 57.53"±2.13 55.87"±1.84 53 . 99"±O.14 56. 04"±O . 50 54.61"±1.51 55.8oa±1.54 56.43"±1.21 Lípidos 27. 16"±2:09 29.35"±0. 74 30. 74"±O .50 29. 68"± 1. 95 30.21"±1.30 29. 77"± 1.08 28.07"±1. 75 Ceniza 12 . 54"±0 . 23 12.47"±0.36 1 1. 69"±O . 25 12.1oa±O .44 1 1. 92"±0. 50 12 . 58"±0 . 05 12. 71 "±0.49 Humedad 69. 27"±0 . 21 68. 84"±0 .79 68. 12"±0.51 69. 1oa±O . 51 68 . 73"±0. 73 68. 9oa±O.33 69.42"±0.57 RETENCIÓN 27.66ab±1.81 28. 74ab±2.28 30. 86b± 1.40 25. 27"±2.02 30.50b±0. 93 3 1. 92b± 1.69 29.35ab±1.80 ENERGÉTICA (%) * Valores en una misma línea con distinto superindice difieren significativamente (ps: 0.05). Si" ~ ~ 1'1 Si" iIl i ~. ~ 1'1 ~ :a • '" Inf.Téc.lnstCanario Cienc.Mar. n° 4 Fig. 13. Histología del parénquima hepato-pancreático de peces alimentados con la dieta G30. Fig. 14. Histología del parénquima hepato-pancreático de peces alimentados con la dieta G40. 84 /nf.Téc./nst.Canario Cienc.Mar. n° 4 Fig. 15. Histología del parénquima hepato-pancreático de peces alimentados con la di e ta M30. Fig. 16. Histología del parénquima hepato-pancreático de peces alimentados con la di e ta M40. 85 Inf.Téc.lnstCanario Cienc.Mar. n4 3.3.4. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES. Los óptimos resultados obtenidos en cuanto a la ingestión de las dietas indican la buena aceptación de los ingredientes proteicos alternativos ensayados, tal como ya ha sido descrito para otras especies (MOYANO, 1990; DA VIES et al., 1990). El incremento de la ingestión total observado con la inclusión creciente de gluten de maíz podría estar relacionada con una disminución en la misma de la energía digestible, como consecuencia del aumento de carbohidrato s parcialmente digestibles procedentes del gluten de maíz, que se corresponde con el incremento en el contenido de carbohidrato s de esas dietas (Tabla 16). Son muchos los autores que suponen a los peces capaces de controlar los niveles de ingestión dietaria en función del contenido calórico de la misma (ROZIN y MA YER, 1961; GROVE et al., 1978; MARAIS Y KISSIL, 1979; WEISBERG Y LOTRICH, 1982), aunque otros autores como CHO y KAUSIDK (1985) manifiestan que el verdadero factor detenninante de la autorregulación de la ingesta es el nivel de energía digestible, y no el de energía bruta del alimento. A pesar de estas diferencias encontradas en las tasas de ingesta, el hecho de que los resultados de crecimiento fueran semejantes para todas las dietas, pudiera ser reflejo de la buena utilización del alimento una vez éste ha sido absorbido del tracto gastrointestinal, sobre todo en el caso de los tratamientos que incluyeron harina de carne y huesos. Ello queda reflejado en la homogeneidad de resultados en relación a la eficacia del alimento obtenidos para las distintas fórmulas ensayadas. Aunque sin presentar diferencias con la dieta control, los menores valores de PER encontrados en los peces alimentados con un nivel de sustitución del 40% de la proteína de pescado por gluten de maíz, respecto a los alimentados con un 30% de proteína de harina de carne y huesos, reflejan las mayores ingestas observadas para la primera, sugiriendo también en este caso una utilización nutritiva del alimento ligeramente superior para los piensos que incluyen harina de carne y huesos. Esta hipótesis resulta mucho más evidente si comparamos las ingestas proteicas de los peces alimentados con las dietas de gluten de maíz con respecto a las de carne y huesos. De este modo se tiene que, aunque a nivel general y significativamente para la dieta M30, las ingestas proteicas en gramos fueron menores para los peces sometidos a las fórmulas con harina de carne y huesos en relación a las que incluyeron gluten de maíz, los valores de aprovechamiento proteico medidos por el PPV resultaron muy homogéneos para los distintos tratamientos. Todo ello podrla estar relacionado con un perfil de aminoácidos menos adecuado a las necesidades de esta especie en las dietas con mayor nivel de sustitución de gluten de maíz. Así tenemos que, niveles crecientes de gluten de maíz en las fórmulas traen consigo una composición en aminoácidos esenciales reducida en isoleucina, lisina, treonina y valina, mientras que los niveles más altos de inclusión de harina de carne y huesos sólo presentaron defecto de isoleucina (Tabla 17). Aún con todo esto, el crecimiento de los peces no se vió afectado por los niveles crecientes de gluten en el pienso lo que podría 86 1"f.Tk.lIU!l.Ctm.io Cimc.M •. ,,·4 estar relacionado, como en el caso de la harina de altramuz, con el elevado contenido en el aminoácido glutámico de esta harina el cual, según la explicación detallada en el Apdo. 3.2.4. podria influir en el "ahorro" energético de la síntesis de aminoácidos no esenciales a partir de los esenciales. Estas observaciones concuerdan con los resultados obtenidos para seriola (SHIMENO et al., 1993) en los que para un mismo nivel de sustitución, la harina de carne y huesos dió mejores resultados de utilización de la dieta que el gluten de maíz, siendo recomendados unos niveles máximos de inclusión en la dieta del 10% para el gluten y del 20% para la harina de carne y huesos. En general, de la revisión bibliográfica prévia (Apdo. 3.3.1) se puede deducir una mejor conveniencia del uso de la harina de carne y huesos frente al gluten de maíz. Así tenemos que para el gluten son recomendados niveles de un 20-25% (GROPP et al., 1979; ALEXIS et al., 1985; FAUCONNEAU, 1988) e incluso un 40% (MOYANO, 1990; MORALES, 1993) en dietas para trucha arco iris; y un 20% en dietas para lubinas (ALUOT et al., 1979), mientras que para la harina de carne se recomiendan niveles de hasta un 75% para tilapia (DA VIES et al., 1989). En el caso concreto de la dorada, los resultados del presente experimento concuerdan con los de DA VIES et al. (1991), quienes sustituyeron un 38% de la proteína de pescado por proteína de harina de carne y huesos en .dietas para alevines de 5 g sin obtener alteraciones en el crecimiento y utilización nutritiva del alimento respecto a los peces alimentados con un control sólo con harina de pescado. Por otra parte, no se encontró una influencia clara del contenido en proteína de gluten y carne de las dietas sobre la composición corporal de los animales. No obstante, los peces alimentados con niveles crecientes de harina de carne y huesos mostraron un aumento del contenido corporal en proteínas y cenizas a expensas del contenido en lípidos. Esto estaría de acuerdo con los valores más altos de utilización proteica obtenidos para estas dietas con respecto a las dietas que incluyeron gluten de maíz, lo cual podría estar también relacionado con el mejor o más adecuado perfil de aminoácidos de esas dietas. En cuanto a los piensos que incluyeron gluten de maíz, no se observó una disminución significativa en el contenido de lípidos de los peces al incrementar la inclusión de dicho ingrediente, tal como ha sido descrita por SHIMENO et al. (1993) para juveniles de seriola Esta diferencia, posiblemente, es debida al mayor contenido lipídico, proteico y energético en las dietas experimentales para seriola y especialmente en un mayor contenido de lípidos proveniente del gluten de maíz y, por lo tanto, no esenciales para peces mannos . Los estudios histológicos realizados en el presente experimento indican una mayor presencia de lípidos y menor de glucógeno en los hígados de los peces alimentados con . los tratamientos que incluyeron harina de carne y huesos. ~sto podría estar re'acionado 87 Inf.Tic.lnstClllflll'io Cienc.MIII'. n-" con un desequilibrio entre los ácidos grasos saturados e insaturados, como consecuencia del elevado contenido en grasas saturadas de esta harina Estos resultados concuerdan con aquellos de SHIMENO et al . (1993) para seriola, quienes encontraron un mayor contenido de lípidos en los hígados de peces alimentados con harina de carne y huesos que en aquellos alimentados con harina de gluten de maíz. Por otro lado, se pudo apreciar también la presencia en los cortes histológicos de los hígados de necrosis aisladas en hepatocitos indicativos, según MOSCONI-BAC (1987, 1990), de posibles efectos irreversibles sobre la salud de los peces originados por desequilibrios en el alimento. Por último, una observación que merece especial mención es la coloración amarilloanaranjada que apareció, principalmente a nivel de opérculos y aletas, en los peces alimentados con las dietas que incluyeron gluten de maíz. Esto pudiera estar relacionado con la presencia de algún carotenoide del tipo de las xantofilas presente en la harina de gluten principalmete la zeaxantina y la luteína que son los que producen ese característico color amarillento (LATSCHA, 1990). Muchos peces son selectores de xantofilas, siendo éste el principal carotenoide presente en su alimento natural (T ACON, 1981). Diferentes estudios indican que los carotenoides dietarios producen coloración amarillenta en el músculo y piel de los peces, relacionándose de forma lineal la intensidad de coloración con el contenido en carotenoides en la dieta (LEE, 1987). A nivel comercial, en Japón, se vienen usando las xantofilas (principalmente de langostinos), que son absorbidas y depositadas en la piel, en dietas para la dorada japonesa (KORRINGA, 1976), con el fin de aumentar la coloración rojiza del pez previamente a su comercialización. Finalmente, aunque se sabe muy poco sobre posibles efectos secundarios ocasionados por la inclusión de la harina de gluten de maíz en las dietas para peces, BLAZER (1992) muestra un incremento del estrés no específico (BKD) en peces alimentados con gluten de maíz, que se reflejó en la disminución del metabolismo de las proteínas, junto con el incremento de la depleción renal de ascorbato. En resumen, los máximos niveles de sustitución de la harina de pescado por harina de gluten de maíz y harina de carne y huesos que podrían ser recomendados en función de los resultados del presente experimento, sugieren niveles de hasta un 40% para la harina de gluten de maíz y del 30% para la harina de carne y huesos. Aún considerando el hecho de que la utilización de la harina de carne y huesos fue en cualquier caso algo mejor que la de la harina de gluten, los peores resultados obtenidos a nivel histológico para la harina de carne podrían limitar el nivel de inclusión de la misma en el pienso. De los resultados también se desprende que podría ser muy interesante seguir profundizando en la utilización del gluten de maíz en piensos para esta especie, de acuerdo con la coloración que producen, ya que ésto podría influir de manera positiva en la aceptación del producto final en el mercado. 88 1"f.Tk.lmt.Ctuuuio Cienc.Mtu. ,,-4 3.4. EXPERIMENTO 3. MEJORA DE SOJA EN BASE AL EXPERIMENTO 1. 3.4.1. INTRODUCCIÓN. A la vista de los resultados obtenidos en los dos experimentos anteriores, se podría concluir que todas las materias primas empleadas pueden constituirse en sustitutos potenciales de la harina de pescado en piensos para esta especie. No obstante, la comparación morfológica del parénquima hepato-pancreático entre los peces alimentados con elevados niveles de inclusión de soja en el pienso y los alimentados con la dieta control, mostraron claras diferencias. Estas diferencias podrían llegar a alterar las funciones metabólicas de los hepatocitos si la alimentación con este tipo de dietas se prolonga durante largo tiempo (MOSCONI-BAC, 1987). En función de ésto, y dado el indudable interés en emplear la harina de soja en piensos para peces, se planteó el diseño de un nuevo experimento cuyo objetivo fue tratar de encontrar qué factor o factores presentes en la soja pueden ocasionar las diferencias morfológicas encontradas a nivel histológico cuando se compara con peces control y ver si realmente estas diferencias se pueden disminuir. Para ello, y teniendo en cuenta los resultados del Exp. 1, en los que fue descartado tanto un posible efecto de los inhibidores antitripsicos, como un posible desequilibrio de aminoácidos en los piensos fonnulados con harina de soja, se estudió la posible presencia de otros factores antinutritivos en esta materia prima (Tabla 21). Tabla 21. Posibles nutrientes limitantes y factores antinutritivos en la harina de soja PROBLEMAS A. Nutrientes limitantes 1. Metionina y Cistina 2. P no disponible (unido con fitina). 3. Minerales traza (disponibilidad o alteración). B. Factores antinutritivos 1. Inhibidores de tripsina 2. Inhibidores de quimiotripsina 3. I;Iemaglutininas. 4. Acido fitico. 5. Factores no identificados que reducen la digestibilidad de proteínas y lípidos. C. Palatabilidad SOLUCIONES 1. Suplementar (Met y Cys) o mezclar con otros ingredientes. 2. Suplementar con P. 3. Suplementar o defitinizar. 1. Tratamiento con calor. 2. Tratamiento con calor. 3. Inactivada por los ácidos en el estómago. 4. Autoclave o suplementación. 5. No conocidas. Mezclar con atractantes u otros ingredientes. 89 /nf.Tic./nsLCanario Cienc.Mar. n· 4 3.4.2. CONDICIONES EXPERIMENTALES. Partiendo de las consideraciones reseñadas en la introducción anterior, se formularon una serie de dietas en las que se intentó suplementar a la soja con aquéllos nutrientes o compuestos cuya adición podría ayudar a una mejor utilización de los piensos que incluyen soja en elevadas proporciones, con el objeto de evitar o minimizar las alteraciones histológicas hepáticas observadas en el Exp. 1. Para llevar a cabo la presente experiencia se diseñaron 6 dietas con las siguientes características: Dieta 1 (C) .- Control positivo, con harina de pescado como única fuente de proteínas. Dieta 2 (S30).- Control negativo, en la que un 30% de la proteína de pescado se sustituyó por proteína de soja Dieta 3 (S30+P).- S30 suplementada con P en la forma de KH 2 P0 4 hasta alcanzar el porcentaje teórico de P disponible en la dieta C. Dieta 4 (S30+Zn).- S30 suplementada con Zn en la forma de ZnS0 4 ·7H 20 hasta un nivel de 200 mglkg (GATLIN y PHILLIPS, 1989). Dieta 5 (S30+fitasas).- S30, a la que se añadieron fitasas exógenas en la cantidad suficiente para liberar el P contenido en el ácido titico. Dieta 6 (S3O+n-3/n-6).- S30, en la que se corrigió la relación de ácidos grasos n-3/n-6 en función de la que se obtiene en la dieta control positivo. Los dos ingredientes proteicos utiJizados en este experimento fueron obtenidos a nivel local .. En primer lugar, se tomó una muestra de la soja para el análisis de su actividad antitrípsica, que resultó ser inferior a 3 TIA (mg de tripsina inhibida/g de harina de soja), valor que se considera adecuado para su inclusión en dietas para peces. A continuación se detemúnó la composición de ambos ingredientes. En este caso fue preciso además, el análisis de los ácidos grasos contenidos en las dos harinas, así como en el aceite de pescado (sardina), utilizado como fuente de lípidos en las dietas (Tabla 24). 96 Tabla 24. Canposición de las materias primas utiljzadas en la elaboración de los piensos del experimento de mejora de soja (g/loog peso). INGREDIEN1ES HARlNADE HARINA DE SOJA ACEITE DE PESCADO PESCADO Proteínas 69.58 43.77 Lípidos 8.35 1.18 100 Ceniza 15.98 6.89 Ca* 2.20 0.26 P* 1.68 0.61 Zn* 0.0132 . 0.006 I:n-3-HUF ASa 3.24 0.19 36.44 I:n-6a 0.34 1.15 4.15 n-3/n-6a 9.53 0.17 8.78 Humedad 7.64 11.37 * Datos extraídos del N.RC. (1983). Para la soja se tomó el ingrediente clasificado como 5-04-600, y para la harina de pescado el 5-02-000. a Valores en g/lOO g de peso seco del ingrediente. La cantidad total de Ca, P Y Zn calculados, así como sus relaciones entre las dietas control positivo y control negativo, teniendo en cuenta la cantidad de los mismos aportada por las mezclas de minerales, quedaría resumida en la siguiente tabla (Tabla 25). Tabla 25. Composición estimada en Ca, P Y Zn de las dietas C y S30 utilizadas en el experimento de mejora de soja. INGREDIEN1ES DIETAC DIETAS30 Ca(%) 1.546 1.206 P(%) 1.16 1.01 Zn (mg/kg) 140.0 128.5 CaIP 1.33:1.00 1.19:1.00 ZnlCa 1:110 1:94 97 /nf.Tic./nsLCanario Cienc.Mar. n4 En esta tabla se puede observar que el tratamiento S30 presenta un déficit de minerales con respecto al control. Este hecho se ve agravado por la presencia de ácido titico en la harina de soja En este sentido, hay que tener en cuenta que aunque las relaciones Zn:Ca sean similares en ambas dietas, la presencia de ácido fitico disminuiría la disponibilidad del Zn en el pienso S30, la cual se ve agravada en presencia de Ca Haciendo cálculos con los valores obtenidos en la tabla anterior, y considerando que sólo un 70% del P presente en la harina de pescado es disponible para los peces, se obtiene para la dieta S30 un porcentaje de P disponible del 0.66%, superior al 0.6% recomendado por Watanabe (comunicación personal). Por lo tanto se ajustó la dieta S30+P al 0.9% de P disponible teórico que tiene el control positivo, añadiendo una sal monovalente (KHJ>04) de la que suponemos que todo el P puede ser absorbido por el pez. Para la formulación del pienso S30 + fitasas se partió de la información bibliogáfica recoplilada, según la cual en cada kg de harina de soja hay entre 15-16 g de fitatos. De esta cantidad únicamente entre un 35-38% (fracciones soluble e insoluble) es hidrolizable por las fitasas, lo que supone unos 5.66 g de fitato por cada kg de harina de soja Utilizando fitasa cruda de Aspergillus ficuum (SIGMA P-9792),la cual es capaz de liberar por cada unidad de enzima 0.001 moles de P de cada 42 milimoles de fitato, y teniendo en cuenta que el PM del fitato es de 720.4 g Y que 1 mol de fitato contiene 6 moles de P inorgánico, se puede calcular que se necesitan 798.86 unidades de fitasa por kg de la dieta S30 (296 g SBMIkg de dieta). Por último, para la formulación de la dieta S3O+n-3/n-6, se hizo preciso desengrasar previamente toda la harina de soja a utilizar, puesto que a pesar de que la cantidad de aceite aportada por esta harina era muy poca, su elevada proporción de ácidos grasos de la serie n-6 haria que se desequilibrase rápidamente la relación n-3/n-6 de la dieta resultante. Para ello se utilizó cloroformo, en el cual es completamente insoluble el ácido fitico (MERCK, catálogo). La composición lipídica de los ingredientes analizados por cromatografia se muestra en la tabla siguiente (Tabla 26). Tabla 26. Composición lipídica de los ingredientes utilizados en la elaboración de las dietas ensayadas en el experimento de mejora de soja INGREDIENTES n-3 HUFA TL .n-3 n-6 %LÍPIDOS ACEITE DE SARDINA 29.83 36.44 4.15 100.00 HARINA DE SARDINA 2.71 3.24 0.34 9.04 98 HARINA HARINA DE DE SOJA SOJA DESENGRASADA 0.01 0.00 0.19 0.00 1.15 0.00 2.57 0.00 1"f.Téc,I,,"Csuuuio Cinu:.MIII'. " • ., Lo que se hizo fue ajustar la formulación de la dieta 83O+n-3/n-6 en base a la relación n-3/n-6 que se obtiene para el control positivo. Atendiendo a ésto, la composición lipídica de los diferentes piensos quedaría según la Tabla 27. Tabla 27. Composición lipídica de las dietas experimentales utilizadas en el experimento de mejora de sOJa DIETA CONTROL 830 830 EQUILIBRADA Aceite de sardina 6.60 7.30 8.00 Harina de sardina 57.08 39.25 39.25 Harina de soja 0.00 26.23 0.00 Harina de soja 0.00 0.00 26.23 %LÍPID08 11.76 11.52 11.55 Ln-3 4.25 3.98 4.19 Ln-6 0.47 0.74 0.40 n-3/n-6 9.09 5.39 9.00 . La formulación definitiva de todas las dietas a ensayar en el presente experimento así como la composición de las mismas aparecen en la Tabla 28. Para la realización de este ensayo se utilizaron doradas de unos 50 g de peso medio inicial, repartidas al azar en grupos de 15 peces en los tanques experimentales, tras un peóodo previo de aclimatación. Los tanques fueron provistos de flujo continuo (11/min) de agua de mar (18.4 ± 0.45 OC), siendo las concentraciones medias de O2 y pH medidos a los largo del periodo experimental de 7.25±O.65 y 7.8±O.2 respectivamente. Los peces fueron alimentados hasta la saciedad, cuatro veces al día, seis días por semana, a 10 largo de los 75 días de duración del ensayo. En el caso de los peces alimentados con los tratamientos Control y 830 se consideró apropiado continuar el experimento hasta los 90 días, con el fin de comprobar que realmente no se producen diferencias en el crecimiento de los peces como consecuencia de la alimentación con es~ dos dietas. 99 1"f.T¿c.I"áCtuflll'io Cimc.MIII'. ,,- 4 Tabla 28. Famulación y composición de las dietas ensayadas en el experimento de mejora de la harina desoja INGREDIENTES e S30 S30 S30 S30 S30 (% peso húmedo) + + + + P Zn Filasa n-3/n-6 Harina de pescado 61.80 42.50 42.50 42.50 42.50 42.50 Harina de soja 29.60 29.60 29.60 29.60 29.60· Aceite de pescado 6.60 7.30 7.30 7.30 7.30 8.00 Almidón de maíz 12.07 12.07 8.01 12.07 12.07 12.07 Dextrina 4.03 4.03 2.68 4.03 4.03 4.03 Vitaminasl 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 Minerale~ 2.00 . 2.00 1.32s 2.00 2.00 1.32s CMC3 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 u-Celulosa 11.00 P[KH:zPO.] 6.106 Zn [ZnSO. • 7H:zO] 0. 03 6 Fitasas 0.026 COMPOSICIÓN (% peso seco) Humedad 7.78 6.65 7.49 6.77 7.99 6.59 Proteínas 44.78 47.99 48.47 48.22 48.38 47.11 Lípidos 11.17 11.00 11.00 10.98 10.81 11.01 Ceniza 10.93 10.44 15.70 10.70 10.26 10.35 Fibra 13 .00 4.96 4.38 4.89 5.05 4.77 Carbohidratos 7 20. 12 25 . 61 20.45 25.21 25.50 26.76 Energía bruta (kJ/g) 19.01 19 .39 18.40 18.82 19.42 19.31 (1) Y (2) Composición de las mezclas en la Tabla 7. (3) Carboximetil celulosa (4) Harina de soja desengrasada (5) Mezcla de minerales sin u-celulosa (6) Cantidad añadida a expensas de la u-celulosa de la mezcla de minerales. (7) Calculados por diferencia (1 OO-resto ingredientes). 100 lnf.Tic.lnstCanario Cienc.Mar. n· 4 3.4.3. RESULTADOS. CRECIMIENTO y UTll..IZACIÓN DEL ALIMENTO. Los valores obtenidos para el crecimiento y utilización del alimento de los peces alimentados con los diferentes piensos experimentales tras 75 días de tratamiento aparecen en la Tabla 29. En los resultados se observa la no existencia de diferencias significativas entre los pesos corporales finales de los peces alimentados con las diferentes dietas, así como en el crecimiento en porcentaje con respecto a los pesos medios iniciales (Fig. 17), siendo ambos ligeramente inferiores en el caso de la dieta S30+P. Se pudo comprobar que tras un periodo de 90 días de experimentación el crecimiento de los peces alimentados con las dietas control (90.70%) Y S30 (91.58%), no mostraron tampoco diferencias significativas. En cuanto a las ingestas totales y proteicas de los peces, únicamente se observaron diferencias en los peces alimentados con el control, que resultó ser superior al resto de los tratamientos. Cabria destacar en este sentido que la dieta S30+P fue la peor aceptada por los peces al principio del experimento. La utilización de las diferentes dietas en base a los valores de FE y PER mostró ser muy homogénea para todos los piensos experimentales, siendo los resultados obtenidos para ambos índices bastante bajos. La diferencia más notable encontrada estuvo en los valores de los índices hepatosomáticos. Así se tuvo que la inclusión de P en la dieta base con un 30% de soja disminuía significativamente el peso de los hígados de los peces. COMPOSICIÓN CORPORAL DE LOS PECES. La composición corporal de los peces alimentados con los diferentes piensos experimentales se muestra en la Tabla 30. Comparando los resultados obtenidos entre el control con harina de pescado y la dieta S30 se tiene que para ambos casos la composición de los peces fue muy homogénea con la excepción de los lípidos que fueron significativamente mayores en los peces control. Por otro lado, realizando la comparación entre los peces alimentados con los tratamientos que incluyeron harina de soja se observa que únicamente los peces que ingirieron la dieta S30+Fitasas mostraron una composición muy similar a los de la dieta S30. Por el contrario, los tratamientos S30+Zn y S3O+n-3/n-6 soportaron con respecto al S30 un mayor contenido en lípidos corporal y menor en proteínas, mientras que la dieta S30+P dió lugar a peces cuya composición fue significativamente inferior en lípidos y superior en proteínas. La composición corporal lipídica osciló entre aproximadamente un 15% para los peces alimentados con la dieta S30+P y un 22% para los de la dieta S3O+n-3/n-6. El contenido en humedad mostró una tendencia contraria a los lípidos, aunque sin diferencias significativas entre los diferentes piensos que incluyeron soja En cuanto a la composición en cenizas, se tuvo que ésta resultó significativamente menor que para la S30 en los peces alimentados con las dietas S30+Zn y S30+n-3/n-6. 101 . i . . Tabla 29. Crecimiento, utilización nutritiva de la dieta y de la proteína e índice hepatosomático para los piensos experimentales del ensayo de mejora de soja. e S30 S30+P S30+Zn S30+Fit.s.s S3O+n-3/n-6 : N Peso medio inici.l (g) S2 . 31~9.72 SI.78~8.33 SI.0~9 . 54 50 . 56~9 . 85 52.60"±9. 81 SI.93~8.49 o - Peso medio fin.1 (g) 87.68~14 . 00 8S. 95~ 13 .99 79 . 65~15 . 65 82 . 35~13 . 66 86 . 96~15 . 36 86.14~12 . 93 Incremento peso 67.73~7.33 65 . 84~5.59 55.94~2.73 62 . 6~6 . 74 65. 77"±5.02 66 . 01~5.71 (% peso inici.l) ~ Ingest. tot.1 (g) 141 1. 1 Ob±40 . 20 109S.57~73.22 1042. 57"±59. 14 11 1 9. 63"±68. 59 1 I 53. 67"±86. 34 1 1 25. 20"±44. 69 • 11: S83.27b ±18.73 513.50""±38.45 ~ Ingest. proteica (g) 490.83"±32. 81 467.50"±26.52 502.S0"±30.67 495 . 20~19 . 66 ~ FE 0. 41"±O .05 O. 50"±O . 05 0.45~O . 04 O. 46"±O .06 O.4~O . O3 O.4~O . OS IJ ~ PER 0 . 92~O . 11 1.04~O.10 0 . 92~0 . 08 0.94"±0. 12 1.01"±O . O7 1.04"±O . ll '5 HSI 1. 82b±0. 08 1.59b±0. 05 l.3oa±O. 17 1. 67b±0. 03 1.58b ±O.12 1. 57ob ±0 .07 ~ bI • Valores en una misma línea con distinto superíndice difieren significativamente (P s: 0.05). .!; ~ ~ ~ .!; 100 I .. c +S3O -a-S30 + P.830 + Zo *" S30 + fitasas ... S30 + 0-3/0-6 80 .- ~ 60 '-' e - = ~ ..... ·s o w .... u 40 - ~ s.. U 20 o o 30 60 75 90 Días Fig. 17. Incremento de peso (% sobre el peso inicial). Tabla 30. Composición de los músculos de los peces utilizados en el experimento de mejora de la harina de soja (g/lOO g de peso seco). C S30 S30+P S30+Zn S30+Fitasas S3O+n-3/n-6 Proteinas 73.88·±1.41 75 . 31 b±1.99 79.26C±2.81 74 .06·±1.36 75. 24b±0. 80 72.06~0 . 77 Lipidos 19 . 86~0 . 91 17.57b±1.82 15 . 40~0 . 84 20 . 0~±1.37 18.87bc±0.85 22 . 8~0 . 84 Ceniza 5.22~0 . 12 5 . 51~0 . 13 5. 551l±0 . 05 5. 14 b±0. 10 5 . 28~0 . 35 4 . 78~0.12 'o:t Humedad 71.83·±1.42 72. 28*±1.37 73 .56c±0. 73 71.3W'±0.76 72.4Sbc±1.03 70.88~1.21 o - • Valores en una misma línea con distinto superindice difieren significativamente (ps: 0.05). Tabla 31. Composición de los hígados de los peces utilizados en el experimento de mejora de la harina de soja (g/lOO g peso seco). C S30 S30+P S30+Zn S30+Fitasas S3O+n-3/n-6 Lipidos 18.12~1.57 17.1~2.92 15 . 97~2 . 51 16 . 1~0 . 69 16 . 81~1.90 17 . 0~1.90 Humedad 69.48~1.24 70 . 87~1.37 71.17~0 . 36 71.01~0 . 84 71.08~0 . 75 • Valores en una misma línea con distinto superindice difieren significativamente (ps: 0.05). lnf.Téc.lnsLCanario Cienc.Mar. n# 4 Por otro lado, la compoS1Clon de los hígados alimentados con los diferentes tratamientos se muestra en la la Tabla 31. En ella se observa que únicamente el tratamiento con la dieta S30+P produjo alteraciones en la composición con respecto a los peces alimentados con la S30. Así se tuvo un aumento significativo en la humedad de las muestras para la dieta S30+P a expensas del contenido en lipidos, aunque sin diferencias significativas en este último caso. ESTUDIO mSTOLÓGICO. De manera general, al igual que en los experimentos anteriores, los hígados de los peces alimentados con la dieta control mostraron unas caracteristicas histológicas que habíamos considerado como normales, si bien en el presente ensayo se encontró en los mismos algunos depósitos muy ligeros de grasa. Por otro lado, comparando los diferentes tratamientos con respecto al S30 se observó que únicamente el S30-tn-3/n-6 (Figs. 24 y 25), Y en menor medida el S30+P parecieron mejorar las peores condiciones que, como se vió en el Exp. 1, caracterizaban a los hígados de los peces alimentados con la dieta S30. En el presente experimento también se obtuvieron en los peces tratados con el pienso S30 cortes histológicos hepato-pancreáticos con abundantes zonas en las que se observó polarización de núcleos en los hepatocitos, así como necrosis aisladas en los mismos (Figs. 18 y 19). En el caso de la dieta S30+P (Fig. 20), los hígados presentaron solamente ligeros depósitos lipídicos y citoplasmas más condensados con células más pequeñas que para el resto de los tratamientos. Para el pienso S30+Zn en algunos peces se apreciaron zonas con grandes acúmulos de lipidos (Fig. 21), además de áreas con degeneración lipídica (Fig. 22). Por otro lado, el tratamiento S30+fitasas produjo unas caracteristicas histológicas hepáticas muy similares a las encontradas para la dieta S30 del Exp. 1, con bastantes depósitos grasos, destacando además la presencia de relativamente abundantes áreas de degeneración grasa y necrosis aisladas en los hepatocitos (Fig. 23). En cuanto a las tinciones P AS positivas, éstas fueron bastante más intensas para la dieta S30+P que para el resto de los tratamientos, incluído el control. 105 ¡n¡'Téc.¡nstClUlario Cinrc.Mar. n· 4 en los hígados. Por otro lado, tampoco se encontraron diferencias en los índices hepatosomáticos de los animales alimentados con las dietas control y S30, es decir, que las diferencias encontradas en los depósitos de grasa no repercuten en establecer posibles diferencias hepatosomáticas. Todo ello sugiere que los lípidos existentes se acumulan o concentran en determinadas zonas. Estos resultados coinciden con aquellos de ALEXIS et al., (1985), quienes encontraron que niveles crecientes de soja en dietas para truchas no producían alteraciones bioquímicas hepáticas en truchas de 20 g de peso inicial. Otros autores, sin embargo, observan una reducción en el contenido de lípidos en hígado acompañando la inclusión de soja en las dietas (WATANABE et al., 1992; SHIMENO et al., 1993), mientras que en otros trabajos se han observado resultados en los que la inclusión de soja en el alimento da lugar a un elevado contenido en lípidos, tanto en hígados (ALEXIS, 1990; SHIMENO et al., 1992; VIYAKARN et al., 1992), como en carcasa total (ALEXIS, 1990). La mejor calidad de los lípidos de la dieta S3O+n-3/n-6 con respecto a la S30, favoreció una mejor utilización de las grasas hepáticas, reduciendo considerablemente la lipomatosis peripancreática y alteraciones histológicas en el hígado. Esta observación podria estar asociada con una relación n-3/n-6 en los fosfolípidos (PL) de las membranas hepáticas más favorable (ACKMAN, 1980), que afectarla sustancialmente al funcionamiento de las mismas (BELL et al., 1986). Además, la mayor importancia relativa de los PUF A dietéticos a su vez podría ejercer un efecto inhibidor de la lipogénesis hepática, como ha sido demostrado en otros vertebrados (JEFFCOAT et al., 1979; SARGENT et al., 1989). Por otra parte, la mejor composición n-3/n-6 en los PL hepáticos podría favorecer la : síntesis de HDL (lipoproteína de alta densidad), principallipoproteína sérica encontrada en peces (pERRIER et al., 1979), encargada de transportar los lípidos a los tejidos extrahepáticos y formada en un 50% por fosfolípidos (NELSON y SHORE, 1974), incrementando la deposición lipídica en el músculo como se observa en la Tabla 30. Por otro lado, y de acuerdo con SAKAMOTO y YONE (1978) y SAKAMOTO (1981), las deficiencias de P en las dietas pueden inhibir la beta-oxidación de los ácidos grasos y/o la gluconeogénesis en el pez, resultando en la transformación de las proteínas y/o carbohidratos en lípidos. Así mismo, de acuerdo con estos autores, la activación de la beta-oxidación de los ácidos grasos en el músculo de los peces alimentados con S30+P seria responsable de la reducción en el contenido lipídico del mismo. Según HENDERSON (1994, comunicación personal), todo este efecto producido por la adición de P a la dieta también podría estar relacionado con la síntesis de fosfolipoproteínas, las cuales al actuar como transportadores a través del torrente 112 1,.f.Téc.lrut.Ctuuuio Cienc.MID'. ,.·4 sanguíneo podóan incidir sobre la distribución tisular de Jos lípidos evitando de esta forma la deposición de los mismos en el tejido hepático, como en el caso del tratamiento S3O+n-3/n-6. El resultado de una posible mejora de la utilización de la soja por adición dé P a las dietas ha sido obtenido también por otros autores. Así, KErOLA (197Sb) encontró que enriqueciendo las dietas que incluyen soja como principal fuente proteica con fosfato dicálcico (3.33% de la dieta), mejoraba el crecimiento de la trucha arco iris, concluyendo que la SBM; es una fuente muy pobre de Ca y P. Posteriormente PFEFFER y BECKMANN (1991), corroboraron esta buena utilización de la soja con la adición de P inorgánico en dietas para esta misma especie. Resultados similares fueron obtenidos por . LIEBOWITZ (1981), en alimentos para pez gato. En resumen, de todos estos resultados se deduce el que únicamente el equilibrio en la relación de ácidos grasos de las series n-3/n-6 y la adición de P a las dietas que incluyen elevados niveles de harina de soja disminuyó los depósitos lipídicos y otras alteraciones encontradas a nivel histológico en los hígados de los peces alimentados con la dieta S30. El hecho de que los resultados de ·crecimiento y conversión del alimento obtenidos para los peces alimentados con la dieta control no difieran de los obtenidos para los alimentados con la dieta S30, puede ser debido a que el nivel de P resultante o disponible en esta dieta no alcanzara lo que podóamos llamar según HARDY et al. (1991) un nivel clínico, manteniéndose dentro de un nivel subclínico, que según esos autores no tiene obligatoriamente que producir crecimientos inferiores. Por otro lado, SHEARER y HARDY (1987) habían encontrado que esos niveles subclínicos de P en la dieta pueden existir durante un largo periodo de tiempo en trucha arco iris, antes de que los signos clínicos de deficiencia sean evidentes. Por último cabria mencionar a la vista de los resultados composicionales, el hecho de que a nivel práctico pueda ser modificado significativamente el contenido graso del pez unicamente variando dos ingredientes en una dieta estandar S30. Así, sobre un contenido de grasa en peso fresco de un 4.30% para los peces alimentados con el tratamiento S30, se puede pasar a peces con un porcentaje de grasa en el músculo de 3.2% ó 6.4% adicionando 6 g/kg de una sal monovalente de P o mejorando el equilibrio n-3/n-6 de la dieta, respectivamente. Este tipo de manipulación sobre el contenido en lípidos del mUsculo podría tener un cierto interés desde una perspectiva comercial, ya que en última instancia se estaría actuando sobre las propiedades organolépticas del pescado que se vende. 113 Inf.Téc.lnst.ClUluio Cienc.Mu. n·-I 4. EXPERIMENTOS DE UTILIZACIÓN DIGESTIVA DEL AUMENTO. 4.1. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS. El análisis de los nutrientes provee una estimación del potencial de las materias primas con el que poder alcanzar unos requerimientos nutricionales determinados a la hora de formular una dieta. Este potencial, sin embargo, tendrá validez sólo si los nunientes pueden ser digeridos y asimilados por el animal. Por lo tanto, la determinación de los coeficientes de digestibilidad permiten realizar una buena estimación sobre el valor nutricional de una fuente particular de proteína que se pretenda ensayar en dietas para peces o cualquier otro animal. Con esta finalidad, se diseñaron tres experimentos en cada uno de los cuales se evaluó desde el punto de vista de las digestibilidades que soportan, las diferentes dietas ensayadas en los experimentos anteriores. 4.2. EXPERIMENTO 4. SOJA Y ALTRAMUZ. 1 4.2.1. INTRODUCCIÓN. La digestibilidad de la soja, como la de cualquier otra materia prima, depende en gran medida del tratamiento al que haya sido sometida (SANDHOLM et al., 1976), a lo que habria que sumar la propia variabilidad de los métodos empleados para su determinación. De ahí quizá derive como consecuencia principal la diferencia de resultados encontrada en los diferentes trabajos que tratan sobre la utilización de este ingrediente en dietas. para -- peces. Así tenemos que elevados valores de digestibilidad de la proteína de soja han sido mostrados en diferentes especies de peces: 80% y 93% en trucha,(SANDHOLM et al., 1976 Y GRABNER Y HOFER 1985, respectivamente, 77% para pez gato (AK.IY AMA, 1991) Y 91% para tilapia (HANLEY, 1987). W AT ANABE et al. (1992), encontraron que la sustitución del 50% de la harina de pescado por harina de soja en piensos para seriola, no ocasionaba una disminución aparente de la digestibilidad de las proteínas utilizando el método de las columnas de decantación. Unicamente mostraron diferencias las digestibilidades de la energía con respecto a la dieta control, reflejándose ésto en una menor digestibilidad de los lípidos y de loS carbohidratos. HUGHES (1988), encontró que el porcentaje de digestibilidad aparente de las proteínas era mayor para la harina de altramuz que para la harina de soja sin desengrasar, 85.2 y 79.5% respectivamente, cuando se incluían en piensos para trucha arco iris. (2) Parte de los nsuI ...... del pnseoae uperinRam haa sido pubDcados ea la ...... Aquacaltare, 1995, 'VOL 130 : 21'-%33. 114 lnf.Tic.lnst.ClUlario Cimc.Mar. "- 4 Posterionnente, GOMES y KAUSHIK (1989b) mostraron también en truchas, que la digestibilidad de las proteínas no se vió afectada con niveles de sustitución de hasta un 30% de la harina de pescado por harina de altramuz. Continuando en esta linea . PONGMANEERAT y WATANABE (1992), observaron que niveles de harina de soja por encima del 30% en fónnulas para trucha arco iris resultaron en un crecimiento y eficiencia del alimento inferiores al control conteniendo sólo harina de pescado, lo que podria ser atribuido a una menor ingesta de energía digestible en las dietas con harina de soja Sin embargo, la digestibilidad de la proteína fue alta para todas las dietas, indicando que la soja era bien digerida por esta especie. La digestibilidad aparente de los carbohidratos y de la energía en los piensos con harina de soja fue menor que la del control, el cual contenía sólo almidón como fuente de carbohidratos; según estos autores, esto se debió probablemente a la proporción de carbohidratos no digestibles de la harina de soja, que tienden a reducir el contenido en energía digestible de las dietas . En el caso de juveniles de lubina, sustituciones sólo de hasta un 20% de la harina de pescado por harina de soja y gluten de maíz, no afectaron prácticamente a la digestibilidad aparente de las proteínas (ALLIOT et al., 1979). En cuanto a la harina de altramuz, son bastantes menos los trabajos que podemos encontrar que hacen referencia a la digestibilidad de este ingrediente proteico en dietas para peces. En carpas se determinó para altramuces dulces groseramente troceados una digestibilidad proteica del 84%; en cambio, cuando el fragmento era muy fino, se llegaba incluso hasta el 93%. Del mismo modo, para los carbohidratos se obtuvieron digestibilidades del 50 y 71 % según que los altramuces fueran grosera o finamente troceados (MANN, 1948 citado en STEFFENS, 1987). 4.2.2 CONDICIONES EXPERIMENTALES. Para la realización de este experimento se utilizaron doradas de 72 g de peso medio inicial repartidas al azar en grupos de 10 peces por tanque, las cuales fueron aclimatadas a los tanques experimentales durante una semana, antes de comenzar con la recogida de heces. Los peces fueron alimentados cuidadosamente hasta la saciedad, dos veces al día (09:00 y 15:00), durante 21 días, con las dietas experimentales que aparecen en la Tabla 9. Los tanques fueron provistos de un flujo continuo (1 l/min) de agua de mar cuya temperatura osciló entre 19 ± 0.5°C a 10 largo del periodo experimental. La rutina de toma de muestras y el procesado de las mismas se llevó a cabo según se detalla en el Apdo. 2.3.2.1. 115 lnf.Téc.lnstCanario Cienc.Mar. n4 4.2.3. RESULTADOS. La Tabla 32 muestra la composición de las heces obtenidas en el presente experimento. Los valores de digestibilidad aparente, calculados tanto para las proteínas como para los lipidos, resultaron elevados en todas las dietas experimentales oscilando entre el 86% y el 95% en el primer caso y no siendo nunca menor del 92% en el segundo (Tabla 33). No se observaron diferencias significativas entre los coeficientes de digestibilidad aparente de las proteínas para raciones que incluían altramuz al compararlos con el valor obtenido para la dieta control (Tabla 33). Estos buenos resultados se confirman también al comparar dichos valores con los obtenidos para piensos que incluían harina de soja, los cuales resultaron ser un 10% menores y en algunos casos significativamente bajos (820 y S30) al ser comparados con la dieta control. Se comprobó que en casi todas las fórmulas que incluían harina vegetal, la digestibilidad de los lipidos resultaba mayor, que la calculada para la dieta control. Este parámetro se mostró menos afectado por el tipo y cantidad de materia prima vegetal utilizada en el pienso, aunque fue posible establecer una correlación positiva entre la cantidad de harina de soja presente en el pienso y la digestibilidad de los lípidos totales (Tabla 33). 4.2.4. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES. Los valores de digestibilidad aparente de las proteínas para los dos grupos de dietas pueden ser considerados como bastante altos en función de los valores recopilados a nivel bibliográfico. El elevado porcentaje de digestibilidad aparente de las proteínas obtenido para el control, en el que todas las proteínas proceden de la harina de pescado concuerda con los resultados que para esa misma fuente proteica han sido encontrados por diferentes autores: 90% para anguila europea (KÜHNE, 1973), 86% para pez gato (BROWN et al., 1985), 89-95% para carpa (OGINO y CHEN, 1973a; KIM, 1974; HOSSAIN y JAUNCEY, 1989),85-92% para trucha arco iris (OGINO y CHEN, 1973a; GOUVEIA et al ., 1991), 95% para doradas (VERGARA, 1992). También los elevados valores de ~C obtenidos para los tratamientos en los que se incluyó harina de altramuz concuerdan con los que han sido determinados para otras especies tales como la trucha arco iris o la anguila (DE LA IDGUERA et al, 1988; HUGHES, 1988; GOUVEIA et al., 1991; HIDALGO, 1988). 116 - - ~ Tabla 32. Composición de las heces obtenidas en el experimento de digestibilidad con los piensos experimentales que incluyeron harinas de soja y altramuz. COMPOSICIÓN C S10 S20 S30 AIO AlO A30 (% peso seco) Proteínas 14 .1l"±1.61 16 .46ob±5.23 25 . 79"± 1. 98 23 . 43 bc ±2 .98 12 .88"±1.52 1 5. 62"±0.60 13 . 49"±0 . 22 Lipidos 3. 52 b±0.07 3.50b±0. 27 l.80"±0.21 1.21"±0 . 23 1.81"±0.20 3. 71 b±O. 66 1. 98"±0.35 Ceniza 34 . 5~±0 . 65 34. 92 oc1 ±2. 47 31.29bc±0. 93 35 . 72 d±1.88 31.82bc±0.87 27 . 39"±0 .30 28.56ob ±O . 58 CrlO) l.30b±0. 10 1.22b±0. 17 0. 73"±0 .02 1.10""±0 . 21 1.17 ob±0. 03 1.08ob±0.09 1.03 ob±0. 29 • Valores en una misma línea con distinto superindice difieren significativamente (P~ 0. 05). Tabla 33. Coeficiente de digestibilidad aparente de las proteínas y Iípidos de las dietas experimentales que incluyeron harinas de soja y de altramuz. ADC Pro~ínas ADC Lípidos C 92. 95""±0 . 99 92.59"±0.43 SIO S20 S30 93 . 63 c±2. 76 86. 22"± 1.1 3 87. 64 ob ±3. 70 93.16"±0. 73 . 95 .89 oc1 ±0. 55 • Valores en una misma línea con distinto superindice difieren significativamente (P~ 0. 05). AIO 9S.49"±0.56 97. 16 de±0.26 AlO 94.SS C±0.30 93. 9S ob±0. 62 A30 92. 96bc± 1. 95 95.35bc±0. 54 IIl¡'Téc.lllsLCtlllfU'io Cienc.MfU'. 11-4 Algunos de estos trabajos comparan la digestibilidad de la soja con la del altramuz, obteniendo resultados en concordancia con los del presente experimento. Así , en el caso de la carpa y la tilapia, VIOLA et al. (1989) encontraron mejores resultados de utilización del alimento para las dietas que contenían harina de altramuz (45%), en comparación con las que incluían harina de soja, lo cual, según estos autores, podría ser debido a wia mejor digestibilidad de los carbohidratos contenidos en la harina de altramuz que en los de la harina de soja, lo que se traduciría en un mejor aprovechamiento de la proteína en el primer caso. Por otro lado, HUGHES (1988) encontró que el porcentaje de digestibildad aparente de las proteínas era mayor para la harina de altramuz que para la harina de soja sin desengrasar, 85.2 y 79.5% respectivamente, cuando se incluían en piensos para trucha arco iris, aunque posteriormente, GOUVEIA et al. (1991), mostraron que la digestibilidad de la proteína de altramuz podía llegar hasta el 90% si las semillas eran sometidas a calor/expansión. Para esta misma especie, GOMES y KAUSHIK (1989b) encontraron que la digestibilidad aparente de las proteínas no se veía afectada con respecto a un control con sólo harina de pescado, cuando se sUstituía hasta un 20% de esta proteína por proteína de altramuz (26% en la dieta), mientras que para un 30% de sustitución la digestibilidad de las proteínas resultó significativamente mayor que la del control, 90.2% y 85.7% respectivamente. Sin embargo todos estos valores de digestibilidad proteica resultaron inferiores a las obtenidas en el presente trabajo. Esto podría estar relacionado principalmente con la diferentes técnicas usadas para la determinación de los coeficientes. Así, en el caso de HUGHES, el método utilizado fue el de alimentación forzada en cámaras metabólicas, mientras que DE LA IllGUERA y colaboradores realizaron las determinaciones mediante presión abdominal. Ambos métodos han sido rebatidos en diferentes trabajos por proveer estimaciones supuestamente por debajo de las reales. De esta forma, los coeficientes obtenidos por GOMES y colaboradores para la misma especie mediante el mecanismo de CHOUBERT de los coladores rotatorios, resultaron ligeramente superiores. La metodología utilizada en el presente experimento, según se detalla en el Apdo . 2.3.2.1., permitirla realizar unas estimaciones de las digestibilidades aparentes más próximas a las reales que aquellos métodos que implican alguna interferencia en la alimentación y/o defecación natural de los peces objeto de estudio. Frente a los elevados resultados encontrados para el control y las dietas que contuvieron harina de altramuz, los tratamientos con harina de soja mostraron una relativamente menor digestibilidad aparente de las proteínas, lo cual concuerda con los resultados también significativamente menores de actividad enzimática de las proteasas obtenidos en el experimento previo de engorde. OLLI et al. (1989) Y ARNESEN et al. (1989), también mostraron que dietas conteniendo harina de soja, con o sin tostar, resultaron en una baja digestibilidad de las proteínas en trucha y salmon . La explicación de la disminución de la digestibilidad de las proteínas dietéticas con la inclusión de harina de soja en el pienso debe ser atribuída, como se dijo en el experimento de valoración 118 1"f.Tic.lnst.Cantuio Cimc.Mtu. ,,·4 nutritiva de este ingrediente, a otros factores antinutritivos presentes en la soja que no sean la simple presencia de inhibidores de la tripsina, puesto que la actividad determinada para los antitripsicos fue prácticamente despreciable. En este sentido, SPINELLl et al. (1983) mostraron que los fitatos dietarios representan uno de los principales problemas para la utilización de la soja por los peces, pudiendo llegar a reducir notablemente la digestibilidad de las proteínas en truchas arco lSlS. Por otro lado según ATHERTON y AITKEN (1970), el porcentaje de la proteína absorbida que se destina al metabolismo energético puede variar dependiendo de la proporción y calidad en la dieta de otros nutrientes energéticos. De esta manera, también se debe tener en cuenta el que la presencia de materias primas de origen vegetal en las dietas, aporta normalmente grandes cantidades de azúcares complejos, celulosas o hemicelulosas, que contribuyen a aumentar los desechos fecales derivados de su ingestión (KAUSIDK,1990). En este sentido, quizá una de las explicaciones más sencillas en relación a esta disminución de la digestibilidad de las proteínas en las dietas a base de soja pudiera estar en relación con el contenido en carbohidrato s de la misma, los cuales parecen tener una elevada proporción de carbohidrato s no digestibles por los animales monogástricos. De esta forma este material hidrocarbonado pasaría realmente a formar parte o a engrosar la proporción de fibra indigestible de las dietas (ARNESEN et al., 1989; OLLl et al., 1989). Los oligosacáridos pueden comprender más de un 10% de las semillas de leguminosas, entre ellas las de la soja y el altramuz. Según ARNESEN et al. (1989), prácticamente todos los oligosacáridos de la soja pueden ser considerados como fibra, de acuerdo con la definición dada por TROWELL et al. (1976) quienes consideraron como fibra dietaría a la proporción de las plantas que no puede ser digerida por los enzimas digestivos en el canal alimentario del animal, no pudiendo por tanto ser absorbida del intestino. De acuerdo con ésto, SCERBINA (1973) trabajando con carpas encontró que de los carbohidratos contenidos en la soja (25.4% en peso seco), la digestibilidad de los mismos era del 51 %, mientras que para el altramuz, con un contenido del 22.8% la digestibilidad fue del orden del 57%. También VIOLA et al. (1989), parecen estar de acuerdo con esta teoría, concluyendo estos autores que el hecho de que la digestibilidad de los carbohidratos del altramuz sea más alta que los de la soja, puede influir en los buenos resultados para la utilización de las proteínas en los piensos de altramuz. De forma similar podrían ser explicados los resultados obtenidos en el presente experimento. Según SMIrn y LOVELL (1973), elevadas cantidades de fibra bruta influyen perjudicialmente sobre la digestibilidad de las proteínas. La fibra que forma parte de las 119 /nf.Téc./nsLClI1IlU'io Cieac.MIU'. n-" paredes celulares de las plantas puede actuar por una parte como aislante entre los nutrientes y el medio digestivo, y por otra como inhibidores frente a la actuación de los enzimas digestivos disminuyendo así la actuación de los mismos. En este último modo de actuación la · fibra puede unirse a los enzimas por mecanismos de absorción (KROGDAHL, 1989). Además, HILTON y ATKINSON (1982) demostraron que tasas crecientes de fibra bruta, aceleran el tiempo de vaciado estomacal, haciendo que la digestibilidad de la materia seca descienda. TAKll et al. (1989) de acuerdo con ello, concluyeron que para la digestión de la soja por la seriola se requiere un mayor tiempo que para la harina de pescado. Por otro lado, GOMES y KAUSHIK (1989b) y WATANABE et al. (1992), observaron una disminución en la energía digestible de las dietas a medida que aumentaba el nivel de .inclusión de materias primas vegetales. ANDERSON et al. (1991) profundizando aún más sobre este tema, encontraron que la energía digestible de distintas materias primas disminuye conforme aumenta su contenido en fibra En cuanto a la mejora en la digestibilidad de los lípidos dietaríos observada con la inclusión de harinas vegetales, este efecto podría estar relacionado con las diferencias en cuanto a composición de ácidos grasos de las fuentes lipídicas utilizadas. Como se puede observar en las tablas de los Anexos 1 y n, un 51.43% de los ácidos grasos provenientes de la harina de pescado utilizada son saturados, mientras que en las harinas de soja y altramuz sólo alrededor de un 13-15% de sus ácidos grasos son saturados. También el contenido en grasas saturadas del aceite de sardina es menor que el de la harina de pescado. Las grasas saturadas, con puntos de fusión elevados son menos digestibles por los peces que las poliinsaturadas (pHILLIPS, 1969; WATANABE, 1982). TAKEUCm et al. (1979), mostraron cómo la digestibilidad de las grasas para carpa y trucha arco iris disminuía a medida que su punto de fusión y su grado de saturación incrementaban: Este efecto era potenciado con la disminución en talla de los peces por debajo de los 50 g. Sin embargo, en dichas experiencias no se observó un efecto negativo de las grasas saturadas en el crecimiento, supervivencia o utilización nutritiva de las proteínas dietarías por los peces, en concordancia con los resultados del presente experimento. Por otra parte, estudios recientes (KOVEN et al., 1994) sugieren una especificidad enzimática para la hidrólisis de ácidos grasos poliinsaturados y una absorción más efectiva de éstos ácidos grasos que de saturados o monoinsaturados. En efecto, la harina de soja tiene cerca de un 47% de poliinsatrurados frente al 27% de la harina de pescado, lo que podría potenciar el incremento gradual de la digestibilidad de los lípidos encontrados en las dietas con soja Por último, cabria mencionar el hecho de que las mejores digestibilidades de la grasa observadas en los tratamientos con soja pudieran haber contrarrestado de alguna forma la mala utilización digestiva de los carbohidratos contenidos en la harina de soja (BECKERY NEIlRlNG, 1965; SCERBINA, 1973; ARNESEN etal., 1989), haciendo que los resultados finales de utilización del alimento no fuesen tan . malos como era d~ esperar. 120 1"¡'Tk.I,,stClUltuio Cielfc.Mtu. ,,·4 4.3. EXPERIMENTO 5. GLUTEN DE MAÍZ Y HARINA DE CARNE Y HUESOS. 4.3.1. INTRODUCCIÓN. Los valores de digestibilidad para la proteína de gluten de maíz detenninados en diversas especies han sido en general elevados, encontrándose valores entre un 91% y 96% para carpa y trucha respectivamente. Sin embargo para esas mismas especies la digestibilidad para la harina de carne y huesos ha sido menor en cualquier caso (54% a 78%). Estos menores valores para la harina de carne y huesos están en estrecha relación con la propia variabilidad intrinseca en la composición de esta materia prima Todo ello queda reflejado en las digestibilidades obtenidas cuando estas dos materias primas son utilizadas como única fuente proteica en las dietas. Así, PONGMANEERAT y WATANABE (1991) observaron que el valor de digestibilidad aparente de las proteínas en dietas para carpa que contenían harina de gluten de maíz como única fuente proteica fue excelente, siendo incluso superior al de la harina de pescado, a pesar de los pobres resultados en crecimiento y utilización del alimento en los peces alimentados con gluten de maíz. Sin embargo, la evaluación de la calidad de la harina de carne y huesos en dietas experimentales para trucha arco iris usándola como única fuente de proteína (WATANABE y PONGMANEERAT, 1991), dio lugar a una digestibilidad de las proteínas bastante baja, como también encontraron PONGMANEERATy WATANABE (1991) en dietas para carpa Por otro lado, son muy pocos los trabajos que hacen referencia a la utilización digestiva de estas dos fuentes proteicas como sustitutos parciales de la harina de pescado en dietas para peces, aunque la utilización nutritiva de las mismas aparece mejor documentada, dando en general bastante buenos resultados en los dos casos para niveles de inclusión menores del 40% en diferentes especies. ALLIOT et al. (1979) encontraron que sustituciones de hasta un 20% de la harina de pescado por gluten de maíz no afectaron prácticamente a la digestibilidad aparente de las proteínas en juveniles de lubinas. 4.3.2. CONDICIONES EXPERIMENTALES. En el desarrollo del presente experimento se introdujeron modificaciones respecto al ensayo similar realizado con harinas de soja y altramuz: Por una parte se acortó el período 121 100 Y = 38.95 -0.32 I ( r = - 0.888, P < 0.05) . • """' 90 • ~ '-' • 111 l1li ,S .a 00 e N ~ • - u ~ 80 • 70 8 8,5 9 9,5 10 10,5 11 11,5 12 12,5 13 13,5 14 14,5 15 Ceniza en dieta (0,..) Fig. 26. Relación entre la composición en ceniza de las dietas y la ADC de las proteínas en el experimento de gluten y carne. 1,,¡'Tk.lnsLCfUUIrio CiDu:.MIIr. ,,·4 Tabla 37. Formulación y composición de las dietas ensayadas en el experimento de digestibilidad de mejora de la harina de soja INGREDIENTES C S30 S30 S30 S30 S30 (% peso húmedo) + + + + P Zn Fitasas n-3/n-6 Harina de pescado ó1.80 42.50 42.50 42.50 42.50 42.50 Harina de soja 29.60 29.60 29.60 29.60 29.60· Aceite de pescado 6.60 7.30 7.30 7.30 7.30 8.00 Almidón de maíz 12.07 12.07 8.01 12.07 12.07 12.07 Dextrina 4.03 4.03 2.68 4.03 4.03 4.02. Vitaminasl 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 Minerales2 1.31 1.31 1.31 1.31 1.31 1.31 CMC3 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 «-Celulosa 11.69 0.69 0.66 0.67 P[KH2 P0 4] 6.105 Zn [Znso 4 • 7H2O] 0.035 Fitasas 0.025 Cr203 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 COMPOSICIÓN (% peso seco) Humedad 5.50 7.24 6.54 8.95 7.11 8.47 Proteínas 46.79 48.40 47.55 48.28 47.53 48.15 Lípidos 11.20 10.94 10.95 11.02 11.03 11.47 Ceniza 11.92 11.16 16.26 11.28 11.14 11.25 Fibra 11.70 4.22 3.39 3.90 3.79 3.11 Carbohidratos6 10.61 16.16 13.91 15.03 16.07 15.86 Energía bruta (kJ/g) 19.01 19.39 18.40 18.82 19.42 19.31 (1) Y (2) Composición de las mezclas en la Tabla 7. (3) Carboximetil celulosa (4) Harina de soja desengrasada (5) Cantidad añadida a expensas de la m-celulosa de la mezcla de minerales. (6) Determinados analíticamente. 129 ~ • &: ~ ~ el .§ U .Si ~ a l:t .!; .~ ~ ~ .!; Tabla 38. Cuantificación media diaria de heces y de alimento ingerido para cada uno de los tratamientos ensayados en el experimento de digestibilidad de mejora de la harina de soja. e S30 S30+P S30+Zn S30+Fitasas S30+0-3/0-6 Ingesta (g) 224.3-±14.8 186.8'±34.3 174.4-±12.8 183.6-±9.6S 181.2'±9.S7 1 92.4'± 1 5.86 Ingesta diaria (% peso) 2.S1-±0.21 2. 04'±0 . 26 1.98-±0.13 1. 99-±0.08 2. OO"±O . 09 2. 14'±0. 10 Heces (g peso Seco/dia) 1.40"±0.44 0. 98 b ±0 .S7 0.46-±0. 20 0.73"b ±0 .38 0.47-±0. 26 0.SS'±0.33 • Valores en una misma línea con distinto superíndice difieren significativamente (ps; 0.05) . o ff"I - l"¡'Téc.l,,stCtmario Cimc.Mar. ,,·4 Se puede observar que tanto las ingestas totales como las ingestas medias diarias expresadas en porcentaje del peso, fueron similares independientemente de los tratamientos experimentales. Por el contrario, si que existieron diferencias en la cantidad de heces recogidas, siendo éstas mayores en los peces alimentados con el control respecto a las demás dietas; sin embargo, hay que considerar el hecho de las grandes variaciones que se tuvieron para las desviaciones estandar de estos valores. La composición de las heces se muestra en la Tabla 39. El contenido en proteínas resultó significativamente más bajo para el control que para el resto de los tratamientos, ocurriendo todo lo contrario con las heces obtenidas para los peces alimentados con el pienso S30+P. Por otro lado, la composición en lípidos y carbohidratos mostró una tendencia similar, resultando las heces de las dietas control y S30+P con un porcentaje más bajo de estos dos macronutrientes, en comparación con el resto de los piensos. El contenido en ceniza fue muy homogéneo para las diferentes fórmulas ensayadas, a excepción de la S30+P que fue significativamente más alto. - Todos estos resultados concuerdan completamente con las digestibilidades calculadas para las proteínas, lípidos, carbohidratos y energía de los distintos tratamientos (Tabla 40). Los coeficientes de digestibilidad aparente de las proteínas, lípidos y energía resultaron estadísticamente similares para todas las dietas experimentales. Por el.contrario, si que se observaron diferencias significativas claras en el caso de los carbohidratos observándose dos grupos de valores: uno muy superior correspondiente a las dietas ., control y S30+P, y otro inferior en el que se incluirían el resto de las dietas. 4.4.3. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES. Los resultados indican que las ingestas, expresadas tanto en gramos de peso seco como en porcentaje del peso corporal día fueron bastante altas y muy homogéneas para los distintos tratamientos, siendo los valores adecuados para la especie y tamaño de los peces experimentales. La dieta S30+P, lo mismo que ocurrió en el ensayo previo de engorde, presentó una aceptación menor por los peces durante los primeros días de experimentación, recuperándose seguidamente hasta alcanzar el nivel de ingesta observado para el resto de los piensos. 131 Tabla 39. Composición (g/lOO g peso seco) y contenido en energía de las heces obtenidas para los distintos tratamientos ensayados en el ~ • 1:: ~ ~ el ~ '5 ~ experimento de digestibilidad de mejora de la harina de soja. e S30 S30+P Protemas 1 1. 19-±O . 23 12.60b ±O . 55 14 . 0s c ±O.54 . Lipidos 5.05-XO.49 1.05c ±O.21 5.5()M>±1.31 , , Carbohidratos 2. 6S-X1.00 17 . 3s c ±1.01 7. 66b± 1.44 Ceniza 33 . 14-XO . 74 32.03"±O .29 4 1. S3 b ±O . SO : CrlO) I.02-XO.14 1.11-XO.17 1.19-±O . O9 Energia (kJ/g) 11 . 65 b ±O.66 12 . 19 b ±O .26 9. 43-XO . 7 1 l · Valores en una misma línea con distinto superíndice difieren significativamente (P~ 0.05). el ~ ~ ~ S30+Zn S30+Fitasas S3O+n-3/n-6 12.66b ±O .39 12 .46b ±O.46 12.12b ±O.55 6. 62 bc ±O . 61 7. 19"±O. 71 1. 15 c ±O.25 IS.44c±2.57 1 6. 93 c± 1.44 19 . 11 c ±1.41 31.2O-X 1. 54 3 1. 59-± 1. 59 31. 73-X1.5S I.OO-XO .42 1.2S-XO . 13 1.2S-XO . 14 11. 96b ±O . 63 11.7S b ±O.47 1 1. 94b ±O . 61 N M - - w w Tabla 40. Coeficientes de digestibilidad aparente, energía digestible y digestibilidad total para los diferentes tratamientos ensayados en el experimento de mejora de la harina de soja. e S30 S30+P S30+Zn S30+Fitasas S30+0-3/0-6 ADe proteínas (%) 90.81~1.23 91.23~0.85 90.16~0.53 90.76~1.61 91.95~.60 91.86~0.80 ADe lipidos (%) 83.3~3.22 78.16~2.29 83.25~4.54 77.24~4.52 79.49"±1.21 80.8~3.02 ADe carbohidratos (%) 90. 90"±2. 20 65. 12""±5.35 81. 70 bc±2. 93 53.27~16.05 67.8 1 ""±3. 74 62. 88"±6.15 DE (kJ/g) 14.77~0.44 15.27"±0.22 15.26"±0.28 14.46"±1.l5 I 5.82"±0. 30 IS.63"±O.60 DE(%) 77.69"±2.31 78. 73"± 1.11 82.93"±1.53 76.81~6.12 8 1.48"±1. 55 80 . 94"±3.1 O D total (%) 64.43"±5.52 66.15"±2.42 66. 75"±0.58 64.21~7.ll 69.49"± 1. 32 69.29"±3. 81 • Valores en una misma línea con distinto superindi~ difieren significativamente (P~ O.OS) . ;¡o ~ ~ 1 i ~. W' f :a • ~ En cuanto a la cantidad de heces recogidas, los pesos medios variaron notablemente tanto entre diferentes tratamientos, como entre los distintos días para un mismo tratamiento, siendo los menores obtenidos de 0.42 g peso seco/día para los peces alimentados con el tratamiento S30+P y los mayores de 1.40 g peso seco/día para el control, lo cual estaría en cierta medida en concordancia con las relativamente más altas ingestas obtenidas para esas dietas. Las diferencias en la cantidad de heces recogidas indican, probablemente, una diferente densidad de las heces, provocada por los diferentes ingredientes con que se formularon las dietas. Se podría pensar, en principio, que estas cantidades no fueran suficientes de acuerdo con el volumen de dieta ingerida; sin embargo, si expresamos la cantidad de excretas recogidas diariamente como gramos de heces en peso húmedo por kg de animal, los valores resultantes (considerando una humedad para las mismas del 75-80%) son similares al valor máximo orientativo que CHO y colaboradores obtuvieron para el Sistema Guelph original (lg/kg peso). Los resultados de los coeficientes de digestibilidad aparente de proteinas y lipidos obtenidos en el presente experimento para las dietas ContrQl y S30, corroboran aquellos elevados valores que se mostraron en el Exp.' 1. Se comprueba una vez más tras el presente ensayo la homogeneidad encontrada para la digestibilidad aparente de las proteínas entre ambas dietas, si bien los valores en el anterior experimento fueron algo mayores, lo cual seguramente podria estar relacionado tanto por una mejora en la relación flujo de agua/decantación de heces, como en todo lo que supone el propio proceso de recogida diaria de excrementos, que se ha ido perfeccionando con la experiencia Por otro lado, las diferencias observadas para las digestibilidades aparentes de los lipidos entre los dos experimentos pudieran estar relacionadas con distintas composiciones relativas, tanto de los ingredientes proteicos como del propio aceite de pescado utilizados en la elaboración de los piensos, ya que ni uno ni otro fueron los mismos para los dos experimentos. Merecen especial mención, por cuanto que en el experimento previo no se pudieron analizar, las digestibilidades aparentes de los carbohidratos. Esta fracción de las dietas es la que más se vió influida por los diferentes tratamiento. Así, se tuvieron los mayores valores para el control, rondando el 90%, mientras que todos los piensos que incluyeron harina de soja vieron mermada notablemente la digestibilidad de sus carbohidratos. Todo ello evidentemente podría estar relacionado con la composición en carbohidratos no digestibles o parcialmente digestibles contenidos en la soja (COWEY et al., 1971; 134 1"f.Tk.lnsLCuuuio Cimc.Mtu. "." ARNESEN et al., 1989; SAINI, 1989; PFEFFER Y BECKMANN, 1991), como se comentó en la discusión del experimento previo de utilización nutritiva de esta harina Otros autores, entre ellos WATANABE et al. (1992), encontraron también que con elevados niveles de inclusión de soja en el pienso no se alteraba la digestibilidad de las proteínas con respecto a una dieta control con sólo harina de pescado, mientras que la digestibilidad de los carbohidratos si que se veía disminuída enormemente. De todos los ingredientes o tratamientos con los que se intentó mejorar la utilización de la harina de soja, la adición de P inorgánico fue la que pareció influir en mayor medida sobre la utilización digestiva de la dieta S30 y concretamente sobre la digestibilidad de los carbohidrato s de la misma De acuerdo con HENDERSON (comun. pers.), la mejora en la utilización digestiva de la dieta S30 como consecuencia de la adición de P en la forma de fosfato, pudiera estar relacionada a nivel del tracto digestivo con un efecto buffer del fosfato añadido, de tal fonna que se vean favorecidos los procesos de hidrólisis de los constituyentes de la dieta. En cuanto a la utilzación de las fitasas exógenas a nivel digestivo se pudo comprobar que fue nula si se comparan los resultados obtenidos para la dieta S30+Fitasas con la S30. Esto vendría a corroborar los también nulos resultados obtenidos para esta dieta en el ' experimento previo de engorde lo que, como fue explicado en la discusión de dicho ensayo, pudo estar ralacionado con el que a nivel del digestivo no se alcanzara la temperatura adecuada necesaria para una óptima actuación de las fitasas. Sin embargo, si tenemos en cuenta los resultados de SPINELLI y colaboradores (1983), y HOSSAIN y JAUNCEY (1991), quienes demostraron que un alto contenido en fitatos condicionaba principalmente la disponibilidad de las proteínas, vemos que no es precisamente el caso encontrado en la dieta S30 ensayada en estos experimentos, puesto que las digestibilidades aparentes obtenidas para las proteínas fueron bastante altas de acuerdo con la revisión bibliográfica previa Atendiendo a ésto, en principio podríamos rebajar importancia a la influencia de los fitatos sobre la utilización de las proteínas, y centramos más en la importancia que a nivel digestivo y/o metabólico pudiera dejar de tener el P que aparece unido al ácido fitico. En este sentido, resultaría conveniente seguir investigando con el uso de fitasas exógenas, que por otra parte han dado muy buenos resultados en 135 Inf.Téc.lnstCanario Cienc.Mar. n4 otros trabajos (BROWN, 1991; RODEHUTSCORD y PFEFFER, 1994a; SCHÁFER et al., 1994). Como se mostró en la introducción general, la investigación con enzimas exógenas es un área relativamente reciente en estudios relacionados con la nutrición de peces. Sin embargo, los resultados que pudieran conllevar el uso de fitasas a nivel comercial en los piensos serían prometedores por cuanto que, aunque según se ha podido comprobar (CAMPBELL y BEDFORD, 1992), las mejoras en la digestibilidad no son muy altas, la correspondiente reducción en las excreciones de P fecal si son considerables. Según SCHÁFER et al. (1994), el uso de fitasas mejora la utilización del P procedente de ingredientes vegetales reduciendo las excreciones de este nutriente en un 30% comparado con las dietas en las que para alcanzar lor requerimientos de P se suplementa con fosfato monocálcico. En este sentido hay que tener en cuenta que una gran proporción del P ingerido no es retenido por el pez (WIESMANN et al., 1988; HARDY et al., 1991), Y que el P absorbido en exceso a partir de la dieta se welve a excretar enseguida principalmente en forma hidrosoluble, sobre todo a través de la orina (pODOLIAK, 1961; PODOLIAK y McCORMICK, 1967; NAKASHIMA Y LEGGETT, 1980; TOMIYAMA et al., 1956). Aproximadamente el 60% del P excretado se hace en forma particulada, correspondiendo ...... , -- el resto a la forma soluble, en la que se incluirían los ortofosfatos (aprox. 6%), que es de fundamental importancia para la producción primaria de las aguas (STEFFENS, 1987). Por todo ello, aunque de los resultados obtenidos en los experimentos de este trabajo se desprende que la adición de niveles apropiados de P a las dietas que contienen elevadas cantidades de soja puede, efectivamente, mejorar la utilización de las mismas, resultaría más apropiado desde el punto de vista de la actual problemática medioambiental, ya que la excreción de P está en relación directa con la ingesta del mismo (NAKASHIMA y LEGGETT, 1980), el uso de cualquier otro constituyente del tipo de las fitasas, que pudiera mejorar la utilización del P sin necesidad de añadir estos perjudiciales suplementos minerales a las dietas. 136 lrif.Tk.l"st.CIIIUU'io Cierrc.MII1'. ,,·4 5. EXPERIMENTOS DE EXCRECIÓN DE AMONIO. - 5.1. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS. La proporción de nitrógeno dietario que es excretado o retenido depende inicialmente de la eficacia de asimilación del propio organismo, pero además se sabe que también varia con la composición de la dieta (ELLIOT, 1976a; PAULSON, 1980; RYCHL Y, 1980; BEAMISH y TROMAS, 1984; KAUSHIK y OLIVA TELES, .198.5; KAUSHIK y COWEY, 1991), tamaño del alimento (ELLIOT, 1976b; DURBIN Y DURBIN, 1981), Y condiciones medioambientales (NTIMI y BEAMISH, 1974). Existen numerosos trabajos sobre la influencia del nivel de proteína en la dieta y la excreción total de N producida por la misma, estando generalmente correlacionados directamente (COULTON, 1978; GARCIA et al., 1981; CARDENETE y MOYANO, 1988; FORSBERGy SUMMERFELT, 1992; CHAKRABORTY, 1992). Sin embargo, se puede decir que no hay practicamente trabajos en los que se estudie la excreción de N en función del tipo de proteína dietaría La calidad de una proteína dietaría generalmente se evalúa en función de su composición en aminoácidos esenciales, .de tal forma que, si la composición en aminoácidos esenciales presenta deficiencias, excesos o desequilibrios con respecto a los requerimientos del pez, puede reducirse considerablemente la eficacia en la utilización del alimento por el animal, pudiendo provocar un aumento en la excreción amoniacal (OGINO y CEIEN, 1973b; KAUSHIK, 1990). Una proteína de baja calidad debido a un desequilibrio en su perfil de aminoácidos, podría favorecer una situación en la que los aminoácidos limitantes establecieran el nivel de síntesis proteica, mientras que el resto de los aminoácidos podrían ser desaminados para producir energía (MOY ANO, 1990). De los muy pocos trabajos encontrados, quizá el que más se aproxime al tema que se viene tratando en el presente trabajo es el llevado a cabo por LUMENTA (1985), quien observó que la inclusión de un 26% de harina de soja con baja cóncentración de inhibidores trípsicos, en dietas para trucha arco iris, producía un aumento en la digestibilidad de la materia seca, nitrógeno, lípidos y energía, aumentando la retención y disminuyendo la excreción de N, con la consiguiente mejora de la calidad del medio ambiente. Una completa valoración de nuevas fórmulas alimenticias para peces debe considerar no sólo la valoración nutricional de las mismas, sino también las posibles descargas de nutrientes al medio como resultado de su utilización. Esto es particularmente importante cuando se trata de evaluar una nueva combinación de fuentes proteicas, puesto que cualquier desequilibrio en la composición en aminoácidos puede resultar en una activa desaminación y por consiguiente, elevados niveles de excreción de amonio al medio. El objetivo de estos experimentos, por tanto, consiste en completar el estudio de la 137 Inf.Téc.lnst.ClUIlI1'io CiDrc.MII1'. n4 5.3. EXPERIMENTO 8. GLUTEN Y CARNE. 4 5.3.1. CONDICIONES EXPERIMENTALES. Para la realización de este experimento se utilizaron dos tanques por tratamiento albergando doradas de 34 a 37 g de peso medio inicial en grupos de 25 peces por tanque, siendo éstos provistos de un flujo continuo (6 IImin) de agua de mar cuya temperatura osciló entre 22.0:!::0.5°C. Los valores medios de pH y O2 durante el periodo experimental fueron de 6.8 y 7.7 mgll respectivamente. La rutina de toma de muestras y el análisis de las mismas se llevaron a cabo según se detalló en los Apdos. 2.3.3. y 2.7., respectivamente. Las medidas de amonio disuelto se llevaron a cabo en muestras del agua de los tanques después de alimentar a los peces nOlmalmente a primera hora de la mañana con las dietas experimentales cuya formulación y composición se muestran en la Tabla 34. Se tomaron muestras de agua cada dos horas, durante un periodo de 12 horas. El muestreo se realizó en tres días alternativos a 10 largo de los 22 días que duró el ensayo. 5.3.2. RESULTADOS. La Figura 30 muestra la evolución de la excreción de amonio disuelto para los peces alimentados con los diferentes tratamientos experimentales. En primer lugar se observa que tanto los peces alimentados con harina de gluten de maíz, como los alimentados con harina de carne y huesos presentaron modelos de excreción diferentes de los obtenidos con la alimentación exclusiva con harina de pescado. En general se observaron dos claros picos de excreción a las 4 y 8 h para los piensos que incluyeron fuentes de proteína alternativa, mientras que con el control esos picos aparecían aproximádamente a las 6 y 10 h después de la ingesta Cabe destacar que aunque las diferencias no fueron significativas, los niveles de excreción de amonio de los peces alimentados con dietas que contenían gluten de maíz fue en general superior a los de aquellos alimentados con harina de carne y huesos para los mismos niveles de sustitución. La Figura 31 muestra la concentración acumulada de N-NH/ alcanzada en los tanques a lo largo de un periodo de 12 h. Con el fin de comparar los niveles de excreción en peces alimentados con diferente cantidad de proteína, los datos se refirieron a N ingerido en gramos. Las cantidades de N-NHt en el agua después de este tiempo variaron entre 255 y 363 mg NIkg pez y g N ingerido. Aunque todos los valores de excreción de N-NH,t obtenidos de los peces alimentados con fuentes de proteína alternativas a la harina de pescado son superiores a las obtenidas con la dieta control, sólo pudieron ser establecidas diferencias significativas cuando se comparó la excreción obtenida por los peces alimentados con los niveles más altos de sustitución de ambas fuentes proteicas (G40 y M40), con respecto del resto de los tratamientos incluido el control (Tabla 42). (4) Parte de los resaltados del presente experimento han sido presentados en el Blntern.~. on NutriCional san ... _ '" Manacernent of Aquaculture Waste, April, 24-27, 1994, Aalbor¡, Demnark. . , 144 120 l+e +G20 ~30 -G40 *M20 +M30 *M40 Q 100 -= ·C ~ DO = 80 .- Z DO N- ~ c:a.. 60 - ~ +!!. v. ~ = 40 Z I +" z DO a 20 - o 2 4 6 8 10 12 Tiempo (h) Fig. 30. Evolución de la excreción de N-NH4 + de los peces alimentados con las dietas experimenta1es de gluten y carne. 400 \ ... c +G20 -a-G30 -G40 ' xM20 ' .'M30 *M40 = ." ·C ~ 300 .ff z DI) Ñ" ~ ¡:a". 200 ~ + ;; Z I Z 100 DI) ~ Ea • a: ~ ~ cJ ~ .S ~ o o 4 12 6 8 2 10 Tiempo (h) lA ~ .~ .,.; ~ ~ Fig. 31. Excreción acumulada de N-NH4 + de los peces alimentados con las dietas experimentales de gluten y carne, 1"f.Tlc.lnsLCmtuio Cielu:.Mtu. ,,·4 Tabla 42. Excreción de nitrógeno soluble por gramo de nitrógeno ingerido por Kg de pez, para los peces alimentados CXlO las dietas experimentales de harinas de gluten de maíz y carne y huesos, a las 12 horas post ingesta. C G20 G30 G40 M20 M30 M40 N soluble/g N ingerido 225±51& 288±26& 268±6& 364±2b 293±8& 306±4oa 334±8b • Valores en una misma línea con distinto superindice difieren significativamente (P~ 0.05). 5.3.3. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES. Comparando los resultados obtenidos por PORTER et al. (1987), quienes trabajaron con la misma talla y especie de peces, se observa que en aquel caso los valores mostrados para la excreción de N-NH 4+ fueron de 1.5 a 1.8 veces menores a los obtenidos·en el presente experimento. Estas diferencias pudieran estar relacionadas con menores niveles de N ingerido, ya que en aquél trabajo no se hace mención alguna acerca de este dato. Por otro lado, la influencia de la calidad de la proteína sobre los picos de excreción amoniacal resulta evidente a partir de la Fig. 30. Al igual que en el experimento anterior con harinas de soja y de altramuz fue obtenido un modelo de "dos picos" para las excreciones de N-NH 4 +. El primer pico, obtenido 4 horas después de la ingestión del alimento, se corresponderla con aquel descrito para otras especies de peces como salmón sockeye (BRETT y ZALA, 1975), trucha aco iris (KAUSHIK y OLIVA TELES, 1985; KAUSHIK, 1990) o dorada (pORTER et al., 1987). Por otro lado, cuando se alimenta a los peces con dos tomas al día diferentes autores, como KAUSHIK (1980) en trucha arco iris y RAMNARINE et al. (1987) en bacalao, han encontrado también el modelo de "dos picos" observado en el presente experimento. ECHEV ARRIA et al. (1993), trabajando con doradas encontraron además que la excreción postpandrial era bifásica, con picos a las 2 y a las 6-8 h. En dicha experiencia, los peces sin alimentar durante un periodo de 24 y 48 h mostraron los picos a las mismas horas pero con una intensidad mucho menor, lo cual según esos autores sugiere la existencia de un ritmo biológico en la excreción de amonio. En este sentido la excreción de amonio en truchas de 100 g fue de 12.4 J.1g/g peso fresco/h a 12°C, densidad de 4 kglm3 y alimentación 1.2% con una dieta comercial conteniendo aproximadamente 47% de proteína cruda. Las mismas truchas excretaron 4.6 J.1g/g peso fresco/h de amonio en condiciones de no alimentación (BERGERO et al., 1993). 147 Inf. T ic.lna CIIIJIII'W Cienc.MIII'. n· 4 Alimentar a los peces a la misma hora todos los días puede promover una conducta anticipada en los peces que les hace "prepararse" para recibir el alimento. Esto explicaría el porqué aún en ausencia de alimento, la mayoría de los ritmos digestivos y metabólicos continuan oscilando como en condiciones previas al suministro del alimento. De hecho se observó una mayor ingesta en la segunda toma que en la primera, lo cual podría estar relacionado con la mayor intensidad observada en los segundos picos. En la Tabla 17 se muestra el perfil teórico de aminoácidos de cada una de las dietas ensayadas en este experimento. En ella se observa que la composición en aminoácidos de las dietas con un 30% de sustitución, tanto para el gluten como para la carne, es intermedia entre las que tienen un 20% y un 40% de sustitución, las cuales muestran niveles comparativamente menores o mayores de algunos aminoácidos esenciales con respecto a las necesidades para esta especie. Todo ello concuerda con la Tabla 19, en la que los valores más altos de excreción se tienen para los niveles de sustitución del 40% para ambos grupos de dietas, y también con los valores de utilización proteica encontrados en el experimento previo de engorde, en el que los valores mayores observados, aunque sin diferencias significativas con respecto del resto de las dietas dentro del mismo grupo, se obtuvieron para los tratamientos que incluyeron un 30% de sustitución (G30 y M30). 148 ¡"f.Téc.¡"áC4llario Cienc.Mar. ,,·4 6. CONCLUSIONES GENERALES. 1. - Se demuestra la excelente calidad de la proteína de la harina de soja, 10 cual queda reflejado en las buenas tasas de crecimiento y utilización nutritiva y metabólica de las dietas en corcondancia con la buena digestibilidad aparente y el adecuado perfil de aminoácidos de esta proteína Sin embargo, el nivel máximo de inclusión recomendable para esta harina en piensos para engorde de dorada se situa en tomo al 20% del peso seco de la fórmula, pues niveles superiores determinan la presencia de acúmulos grasos peripancreáticos y lipidosis en el hígado de los peces. 2. -Se confirma la pobre disponibilidad de los carbohidratos de la harina de soja por la disminución de la digestibilidad de los mismos con el incremento de este ingrediente vegetal en el pienso, provocando una menor presencia de glucógeno a nivel histológico en hígado y una disminución del contenido en lípidos en músculo. 3. - Se confirma la baja disponibildad del fósforo presente en la harina de soja, que ocasiona la aparición de acúmulos grasos y reducción de la presencia de glucógeno en el hígado a elevados niveles de inclusión de esta harina. La adición de fósforo inorgánico en la dieta con mayor nivel de sustitución por harina de soja disminuye los depósitos de grasa en el parénquima hepatopancreático y reduce el contenido de lípidos en el músculo de los peces. 4.- No se observó un efecto significativo de la adición de zinc o fitasas en las dietas con un nivel de sustitución del 30% de la proteína de pescado por proteína de soja 5.- Se demuestra la desfavorable composición de ácidos grasos de la harina de soja en relación con el elevado contenido en ácido linolénico escasamente utilizado por los peces marinos y que contribuiría a la degeneración grasa del hígado. Así la sustitución de los lípidos de la soja por aceite de pescado, pobre en ácido linolénico, corrigió completamente las alteraciones histológicas en el hígado, incrementando el contenido de lípidos en el músculo. 6. -Las harinas de altramuz y gluten de maíz pueden ser utilizadas como ingredientes proteicos en piensos para engorde de dorada a niveles que representan hasta un 30% de la proteína de la fórmula Si se excede esta proporción, a pesar de mantenerse el crecimiento dentro de valores aceptables, se intensifican los pro~esos de 149 Inf.Téc.lnsl.Canario Cienc.Mar. n--I desaminación indicativos de un peor uso metabólico de la proteína y que determinan una mayor eliminación al medio de N amoniacal. 7.- Los resultados encontrados en los diferentes ensayos de evaluación nutritiva de la harina de carne y huesos ponen de manifiesto que en conjunto se trata de una materia prima de mediana calidad aunque su proteína presenta un excelente perfil aminoacídico. Elevados niveles de esta harina en el pienso produjeron necrosis aisladas y otras alteraciones hepáticas. Si existen condicionantes favorables a su utilización se recomienda que su nivel en la fórmula no represente más de un 20% de la proteína total. 8.- El empleo en los piensos para dorada de algunos de los ingredientes ensayados puede presentar otros aspectos de interés comercial relacionados con la calidad del producto final. Entre ellos cabria destacar los siguientes: -La utilización de harina de gluten de maíz determina la aparición de una llamativa coloración amarillo-anaranjada a nivel de opérculos y aletas, rasgo que podría repercutir positivamente en su comercialización. - Si se emplean piensos con soja, la adición de P disminuye el contenido graso del músculo en un 25%, en tanto que la adición de ácidos grasos n-3 lo aumenta en un 50%. ISO 7. BIBLIOGRAFÍA ACKMAN, RG. (1980). En: Advances in Fish Science and Technology, J.J. ConneD (Ed). 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