Agentes de contraste basados en lantánidos para la obtención de bioimágenes mediante técnicas de resonancia magnética a alto campo y en modo dual T1-T2

Agentes de contraste basados en lantánidos para la obtención de bioimágenes mediante técnicas de resonancia magnética a alto campo y en modo dual T1-T2 Memoria presentada por: Elísabet Gómez González Para aspirar al título de doctor Directores de tesis: Dr. Manuel Ocaña Jurado Dra. Nuria Ofelia Núñez Álvarez Tutora: Dra. María Dolores Alcalá González Departamento de Química Inorgánica Universidad de Sevilla Instituto de Ciencia de Materiales de Sevilla. CSIC-US Sevilla, Diciembre 2023 AGRADECIMIENTOS Es ahora el momento de expresar mi agradecimiento a aquellas personas que me han apoyado de una forma u otra durante la realización de esta tesis. En primer lugar, me gustaría darles las gracias a mis directores de tesis Manolo y Nuria. Gracias Manolo, por toda la enseñanza que he podido recibir de ti durante estos cuatro años, por tu paciencia y por tu dedicación en todo momento. Gracias Nuria, por toda tu ayuda prestada, especialmente en los aspectos más prácticos. Sin vosotros, esta tesis hubiera sido totalmente distinta. Muchas gracias por guiarme a través de este camino que era totalmente nuevo para mí. También quiero agradecerle a Ana todos sus consejos y el ánimo que me ha dado, sin los cuales, por ejemplo, difícilmente habría decidido realizar las estancias. Gracias por invertir tu tiempo desinteresadamente en multitud de ocasiones. Por supuesto, quiero darle las gracias a Encarna, mi compi de laboratorio que, desde el primer momento en que entré en el grupo, no ha dudado en ayudarme en cada momento que lo necesitaba. Gracias por poner la radio justo en el momento más oportuno, por los descansitos propuestos cuando más falta hacían, por cada vez que te pedí que lavaras una muestra o prepararas una rejilla y nunca me negaste el favor. Gracias por tu disposición a responderme pacientemente cada vez que te decía: “Tengo una duda…” (incluidas las que te he preguntado mientras escribía esta sección y de las cuales he perdido ya la cuenta). Sin ti, todo habría sido bastante diferente. ¡Gracias! Muchas gracias, también, a Dani y Rosalía, sin los cuales no existiría coffee time. Gracias por vuestra diligencia incansable al venir y proponernos un descanso cada día a las 11 para que desconectáramos, aun cuando os lo solíamos negar repetidamente. Además, toda esta aventura, seguramente no hubiera comenzado de la misma manera si no hubiera sido por Mdol y su grupo que me que me abrieron las puertas en el Instituto de Ciencia de Materiales de Sevilla a través de aquella JAE-Intro con la que empezó todo allí. Gracias por contribuir a que me familiarizara con una nueva rutina que era totalmente desconocida para mí. También me gustaría agradecerles a todos los técnicos, personal de administración y limpieza por facilitar nuestro trabajo en cicCartuja. Yéndonos ahora fuera del entorno conocido, y viajando un poco… Me gustaría agradecerles a Jesús del Instituto de Nanociencia y Materiales de Aragón, a su equipo y, en especial a Bea, por hacer posible que mi estancia en Zaragoza fuera un tiempo fructífero de gran aprendizaje. Y como no, no podía olvidarme de Mélody, Ana Izquierdo, JJ y Benji que me apoyaron durante ese tiempo en Zaragoza. Gracias por hacerme sentir como en casa. Agradezco, por supuesto, a Marisa y a Carlos por haberme permitido realizar una estancia en su grupo en el Instituto de Investigación Biomédica de Málaga y Plataforma en Nanomedicina (Málaga) para que pudiera aprender de primera mano cómo realizaban la parte in vivo de la experimentación. Me gustaría darle las gracias a Edu y a su grupo por darme la oportunidad de ser uno más de ellos durante algunos meses en Trinity College Dublin. Especialmente, quiero agradecerle a Almu por enseñarme tanto en tan poco tiempo y por su paciencia con mi pulso mientras “hacíamos células”. Gracias por facilitarme mi estancia allí y seguir estando dispuesta a que nuestra investigación siga adelante. I would also like to thank Okiki & Joel, Yasmin & Callum, Ed & Miriam, Leanne, Vicki, Lily, Tanya, Misato, and every person from Grosvenor Road Baptist Church who during my stay in Dublin included me in their big family and took care of me. Y volviendo ahora a un ambiente más cercano… Quiero agradecerles a todos aquellos que forman parte de la Iglesia Bautista El Olivar y en especial a los Hayes, Lidia & Diego, César & Sonia, Maggie & Alfonso, María, Ana Mari, Francielle, por toda su guía y cariño en cada momento. Gracias por ser familia. En especial, quiero por supuesto darle las gracias a “las Maris” que, aunque aparecieron en mi vida recientemente, me han apoyado cada día, me han enseñado mucho, y me siguen enseñando cada día. Gracias Yessica. Gracias Lydia. Por último, me gustaría transmitirle mi agradecimiento a mi familia. Particularmente le doy las gracias a mis padres, mi hermana, mi tía Encarni y mi tío José por alentarme a empezar y completar lo que termina aquí hoy y da comienzo a una nueva etapa. ÍNDICE Resumen………………………………………………………… 11 Lista de abreviaturas……………………………………………. 21 Capítulo I: Antecedentes, motivación y objetivos……………… 25 1.1. Introducción……………………………………………. 27 1.2. Obtención de imágenes mediante resonancia magnética para el diagnóstico clínico……………………… 27 1.2.1. Imagen por resonancia magnética a alto campo…………………………………………. 31 1.2.2. Imagen por resonancia magnética en modo dual T1-T2…………………………… 34 1.2.3. Imagen multimodal mediante resonancia magnética y luminiscencia……………………. 36 1.3. Características requeridas para el uso de nanopartículas en la obtención de imágenes biomédicas…………………... 38 1.3.1. Control del tamaño y forma de partícula………………………………………. 40 1.3.2. Control de dispersabilidad: funcionalización………………………………. 42 1.3.3. Biocompatibilidad…………………….. 44 1.4. Objetivos……………………………………………….. 46 1.5. Bibliografía……………………………………………. 48 Capítulo II: Procedimientos experimentales………………………... 55 2.1. Síntesis de nanopartículas……………………………… 57 2.1.1. Síntesis de nanopartículas de fase única……………………………………… 57 2.1.2. Síntesis de nanopartículas con arquitectura núcleo-corteza…………………… 62 2.1.3. Purificación de las nanopartículas sintetizadas……………………………………. 63 2.2. Funcionalización……………………………………….. 63 2.2.1. Funcionalización con ácido poliacrílico…………………………………….. 65 2.2.2. Funcionalización con polietilenglicol ………………………………... 67 2.3. Caracterización………………………………………….69 2.3.1. Análisis morfológico………………….. 69 2.3.2. Análisis estructural……………………. 69 2.3.3. Análisis de composición química……... 70 16 de relajatividad transversal elevados. Para MRI dual T1-T2 son igualmente interesantes los compuestos basados en iones Dy3+ como componente T2, y como componente T1, suelen emplearse iones Gd3+ los cuales poseen un alto momento angular de espín (7/2) que permite alcanzar un alto valor de relajatividad longitudinal. En la bibliografía se han reportado distintos ACs, tanto para MRI de alto campo como para MRI dual T1-T2, basados en NPs basadas en diversos fluoruros de los elementos lantánidos anteriormente mencionados, los cuales se caracterizan por presentar cierta solubilidad en medio acuoso que da lugar a la liberación de iones fluoruro que son potencialmente tóxicos. Por último, en los últimos años se están desarrollando sondas que sean útiles para la obtención de bioimágenes mediante distintas técnicas que permitan obtener información complementaria para así mejorar la precisión del diagnóstico. Entre las distintas combinaciones posibles, destacan aquellas que son adecuadas para la obtención de imágenes mediante MRI y mediante luminiscencia, especialmente en la región del infrarrojo cercano (NIR, siglas en inglés) por ser este tipo de radiación menos dañina y tener mayor poder de penetración en los tejidos. Esta última técnica es muy útil para profundizar en el conocimiento de patologías a nivel celular o subcelular debido a su alta sensibilidad, la cual complementa a la información anatómica proporcionada por la técnica MRI, haciendo de esta combinación de técnicas una herramienta muy potente de diagnóstico médico. La disponibilidad de una única sonda que sea capaz de actuar como agente de contraste para ambos tipos de técnicas es obviamente de gran interés ya que reduciría posibles efectos no deseados y aumentaría la comodidad para el paciente. Hasta el momento, la mayoría de sondas reportadas en la bibliografía para la obtención de imágenes multimodales también están basadas en nanopartículas de matriz fluoruro cuya problemática ya ha sido comentada. Estos antecedentes justifican la pertinencia de esta tesis doctoral cuyos principales objetivos son el desarrollo de agentes de contraste químicamente 17 estables para MRI monomodal a alto campo, para MRI dual T1-T2 y para imagen multimodal mediante MRI a alto campo e imagen luminiscente en el NIR. Para conseguir estos objetivos ha sido necesario considerar diferentes composiciones, desarrollar diversos métodos de síntesis de nanopartículas y analizar sus características morfológicas y estructurales, su estabilidad química, su dispersabilidad, su relajatividad magnética, sus propiedades luminiscentes (en el caso de las sondas multimodales) y su viabilidad celular. En concreto, en el caso de los ACs para MRI de alto campo, se han estudiado distintas composiciones que incluyen vanadatos, molibdatos, volframatos y fosfatos de Dy3+. Como resultado de estos estudios se concluye que, el sistema óptimo es el constituido por nanopartículas de DyPO4 funcionalizadas con ácido poliacrílico. En el caso de los ACs para MRI dual T1-T2, se han explorado diversas arquitecturas (fase única, núcleo-corteza) de sistemas constituidos por DyVO4 como componente T2 y por GdVO4 como componente T1, siendo el diseño óptimo el constituido por nanopartículas de DyVO4 recubiertas con una corteza de GdVO4, y funcionalizadas con ácido poliacrílico. Por último, en el caso de los ACs para la obtención de imágenes multimodales mediante MRI de alto campo y luminiscencia en la región infrarroja, se ha desarrollado un sistema constituido por nanopartículas funcionalizadas con ácido poliacrílico de DyVO4 (componente magnético) recubiertas por una corteza inactiva de LaVO4 y una corteza exterior de LaVO4 dopado con iones Nd3+ (componente luminiscente). En todos los casos en los que ha sido posible, se ha evaluado el comportamiento in vivo de las sondas óptimas en un modelo animal, que ha permitido establecer la idoneidad de dichas sondas como agentes de contraste para la obtención de bioimágenes mediante las técnicas de MRI de alto campo, MRI dual T1-T2 y mediante el uso combinado de MRI de alto campo y luminiscencia en el NIR. 19 ABSTRACT Magnetic Resonance Imaging (MRI) allows the visualization of organs and tissues for medical diagnosis. This technique is non-invasive, does not require the use of radioactive agents or high-energy electromagnetic waves, and has a high spatial resolution and a great image depth. Despite these advantages, in order to increase the contrast in these images between the region of interest and its surroundings, it is often necessary to use contrast agents (CAs), which are composed of magnetically active substances that shorten T1 and T2 proton relaxation times. CAs that shorten T2 darken the region of interest, while those that decrease T1 value result in an increased brightness of the region of interest. The commercial and more efficient T1 CAs, are based on different Gd3+ compounds. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles are among the most studied T2 CAs. Although MRI is well established in clinics, several modifications of this technique are being currently addressed with the aim of improving diagnostic reliability. In particular, high-field MRI and T1-T2 dual mode MRI have been proposed. The first one improves image resolution by using higher magnetic fields than those involved in conventional scanners (≤ 3 T). T1-T2 dual mode MRI involves recording bright and dark images simultaneously. By so doing, cross-validation of both types of images can be carried out, so that false positives can be excluded, and complementary information can be also obtained. Both advantages allow to increase diagnostic sensitivity and accuracy. Unfortunately, the conventional CAs used in clinics are not suitable for these novel techniques, for which, it is imperative to develop new contrast agents. For the high-field MRI technique, several alternatives have been considered. The most promising candidates are compounds based on Dy3+, since this ion has a very high magnetic moment (10.6 μB), which leads to high transverse relaxivity values. For T1-T2 dual mode MRI, compounds based on Dy3+ ions as T2 component are equally interesting, and as T1 component, Gd3+ 20 ions are usually used, which have a high spin angular momentum (7/2) that allows high values of longitudinal relaxivity. Different CAs have been reported in the literature, both for high-field MRI and T1-T2 dual mode MRI, consisting of fluoride-based nanoparticles containing Dy3+ and Gd3+. The main drawback of these fluoride-based nanoparticles is their solubility in aqueous media, which result in the release of potentially toxic fluoride ions. Finally, an increasing activity can be detected in literature regarding with the development of multimodal bioimaging probes, which can be used for two or more imaging techniques that allow to obtain complementary information thus improving diagnosis accuracy. Among the different possible combinations, MRI and luminescence have been widely studied. This combination of techniques is very useful for medical diagnosis since luminescent imaging gives information on pathologies at the cellular or subcellular level due to its high sensitivity, which is complementary to the anatomical information provided by MRI technique. For the former technique, working in the near-infrared (NIR) region is advantageous because this type of radiation is not harmful for biological specimens and has a high penetration deep. For multimodal bioimaging, the development of single probes that wok properly for all involved techniques would reduce undesired effects and would be more comfortable for the patient. So far, most of the probes reported in literature for MRI and NIR luminescent bioimaging are also fluoride-based nanoparticles, whose drawbacks for in vivo applications has been already discussed. The main objectives of this doctoral thesis are the development of chemically stable contrast agents for high-field single-modal MRI, for T1-T2 dual mode MRI and for multimodal imaging by using high-field MRI and nearinfrared luminescent imaging. To achieve these objectives, it has been necessary to consider different CAs compositions, developing various methods of nanoparticle synthesis and to analyzing their morphological and structural characteristics, their chemical 21 and colloidal stability, their magnetic relaxivity, their luminescent properties (in the case of multimodal probes) and their cell viability. In the case of CAs for high-field MRI, vanadates, molybdates, tungstates and phosphates containing Dy3+ have been addressed. As a result of these studies, it is concluded that the optimal system is the one constituted by DyPO4 nanoparticles functionalized with polyacrylic acid. In the case of CAs for dual T1-T2 dual mode MRI, different architectures (single-phase, core-shell) based on DyVO4 as T2 component and GdVO4 as T1 component, have been explored, the optimal design being the one consisting of DyVO4 nanoparticles coated with a GdVO4 shell, and functionalized with polyacrylic acid. Finally, in the case of CAs for multimodal imaging by high-field MRI and luminescence in the infrared region, a system consisting of polyacrylic acid-functionalized DyVO4 nanoparticles (magnetic component) coated with an inactive LaVO4 shell and an outer LaVO4 shell doped with Nd3+ ions (luminescent component) has been developed. In all cases, the in vivo behavior of the optimal probes was evaluated in animal model, which allowed to establish the suitability of these probes as contrast agents for bioimaging by high-field MRI, T1-T2 dual mode MRI and by the combined use of high-field MRI and near-infrared luminescence. . LISTA DE ABREVIATURAS 25 LISTA DE ABREVIATURAS AC(s): agente(s) de contraste CA(s): contrast agent(s) DAPI: 4′,6-diamidino-2-fenilindol Dh: diámetro hidrodinámico DLS: dynamic light scattering DMEM: Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium DRX: difracción de rayos X EDC: 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil carbodiimida EDS: espectroscopía de energías dispersivas de rayos X EG: etilenglicol FDA: Food and Drug Administration FSN: fibrosis sistémica nefrogénica FTIR: espectroscopía infrarroja de absorción por transformada de Fourier ICP-AES: espectrometría de emisión atómica con plasma acoplado inductivamente I0: intensidad de luminiscencia a tiempo cero I0i: componente de la intensidad de luminiscencia λem: longitud de onda de emisión λexc: longitud de onda de excitación Ln: lantánido MRI: imagen por resonancia magnética MTT: bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio MW: horno asistido por microondas CAPÍTULO I: MOTIVACIÓN Y OBJETIVOS 32 observa en algunos pacientes con enfermedad renal grave o tras un trasplante de hígado.16, 17 Por ello, se han llevado a cabo diversas investigaciones en los últimos años encaminadas a buscar alternativas a estos ACs. Entre ellas, se ha propuesto la sustitución del Gd3+ por Mn2+, cuyo valor de S, aunque menor que el del Gd3+, es también alto (S = 5/2) por lo que es adecuado como ACs T1. De hecho, dos agentes basados en Mn(II), el conocido como Mn-DPDP que es específico para el hígado (Teslascan)18 y un contraste oral que contiene cloruro de Mn(II) (LumenHance)19, están disponibles comercialmente en la actualidad para uso en humanos, no habiéndose encontrado hasta ahora ninguna relación entre el Mn2+ y la FSN. No obstante, y aunque es cierto que pequeñas cantidades son esenciales para la salud humana, la sobreexposición a iones de Mn2+ libres puede provocar el trastorno neurodegenerativo conocido como "manganismo", con síntomas parecidos a los de la enfermedad de Parkinson. Debido a estos posibles efectos secundarios, se ha sugerido el uso de diversas nanopartículas (NPs) inorgánicas como ACs para MRI ya que estas presentan una serie de ventajas interesantes frente a los complejos.7, 20, 21 Entre ellas destaca el hecho de que mediante el control del tamaño de las mismas es posible controlar su tiempo de circulación y sus vías de eliminación del organismo.22 Además, las NPs pueden funcionalizarse y bioconjugarse con facilidad para que puedan ser acumuladas preferentemente en el órgano de interés y no se diseminen por todo el organismo. De esta forma, se pueden disminuir las dosis necesarias, con el consiguiente beneficio para el paciente.23 En cuanto a los ACs superparamagnéticos, en su mayoría están basados en NPs superparamagnéticas de óxido de hierro (conocidas como SPION, en inglés) que presentan un alto valor de r2 y, por tanto, son útiles como ACs negativos. Estos agentes presentan características atractivas tales como su biocompatibilidad, fácil metabolización, magnetización de saturación elevada que puede controlarse ajustando el tamaño y la composición de las partículas, y una fácil funcionalización de la superficie.24 CAPÍTULO I: MOTIVACIÓN Y OBJETIVOS 33 A pesar de que la técnica MRI está muy bien establecida en el ámbito clínico y de la disponibilidad de ACs adecuados para mejorar el contraste de las imágenes, se están abordando en la actualidad diversas modificaciones de esta técnica con el objetivo de mejorar la fiabilidad del diagnóstico. En concreto, se han propuesto recientemente la técnica de MRI a alto campo, la técnica de MRI dual T1-T2 y el uso combinado de imágenes obtenidas mediante MRI y mediante otras técnicas que aportan información complementaria, como es el caso de la imagen luminiscente. El fundamento de estas técnicas, así como las ventajas que presentan frente a la MRI convencional se presentan en las siguientes secciones en los que se establecerá la pertinencia de la investigación propuesta en esta tesis doctoral. 1.2.1. Imagen por resonancia magnética a alto campo. La técnica de MRI a alto campo supone emplear campos magnéticos más altos que los implicados en los escáneres usados en clínica, los cuales funcionan a campos menores de 3 T. Una de las ventajas más importantes de utilizar campos altos es la mejora de la resolución (Fig. 2). Así, cuanto más intenso es el campo magnético, mayor es la relación señal/ruido y, por consiguiente, la resolución también aumenta.25 Prueba de ello es que mientras que con los escáneres clínicos de 1,5 y 3 T se pueden obtener imágenes con una resolución máxima de 1 mm, a 7 T es posible obtener una resolución de hasta 0,5 mm.25 Otra ventaja importante de usar campos altos es la disminución de los tiempos de adquisición de imágenes, lo cual implica una mayor comodidad para el paciente.26, 27 Hay que señalar que, aunque este tipo de escáneres de alto campo no son utilizados de forma generalizada en clínica actualmente, en el ámbito de la investigación en modelos animales, su empleo ha crecido de forma significativa en los últimos años. Ello es debido a que la alta relación señal-ruido es de especial importancia para la obtención de imágenes preclínicas de modelos animales pequeños como los ratones, para lo cual se requiere una alta resolución. De hecho, los sistemas de MRI para animales suelen estar CAPÍTULO I: MOTIVACIÓN Y OBJETIVOS 34 equipados con imanes que proporcionan campos entre 7 y 9,4 T.29 Es destacable que mediante el empleo de campos de 9 T se han conseguido visualizar incluso micrometástasis de 0,2 mm en ratones.30 La técnica de MRI a alto campo es también una gran herramienta de investigación en humanos, habiéndose empleado en estudios sobre la esclerosis múltiple, para la obtención de imágenes de los ganglios basales y estructuras relacionadas, y para angiografías.25, 31-33 Figura 2. Imágenes de un cerebro obtenidas mediante MRI a distintos campos (1,5, 3 y 7 T).28 Hay que señalar que a pesar de estas ventajas que presenta la MRI a alto campo, aún no está establecido su uso clínico porque deben todavía resolverse aspectos importantes como son la seguridad para el paciente, el desarrollo de nueva instrumentación y la ineficacia de los ACs convencionales al emplearlos a alto campo. En cuanto al primer aspecto, inicialmente, la normativa de la FDA (Food and Drug Administration) limitaba las aplicaciones clínicas a 3T, considerando los posibles efectos secundarios que podían generar ruido y la estimulación nerviosa provocada por los altos campos.28, 31 En 2003, la FDA declaró que la MRI con campos de hasta 8 T no constituía un riesgo significativo para humanos (excluidos los neonatos).34 Ello, fue confirmado posteriormente, en 2009, por la Comisión Internacional sobre Protección contra la Radiación No Ionizante (ICNIRP, en inglés), si bien indicó que estos campos pueden provocar leves efectos secundarios tales como vértigos y/o mareos.35 1,5 T 3 T 7 T CAPÍTULO I: MOTIVACIÓN Y OBJETIVOS 35 Sin embargo, estos efectos secundarios remiten tras la obtención de las imágenes MRI, por lo que no constituyen un riesgo considerable para la salud. Actualmente, se debate si es adecuado emplear campos superiores a 8 T para la obtención de imágenes MRI en humanos.34 Respecto al desarrollo de la nueva instrumentación necesaria para obtener imágenes a alto campo, hay que hacer notar que en los últimos años ha aumentado el número de sistemas de alto campo (7 T) instalados en centros especializados en neuroimagen para investigación en humanos (60 en 2014 y a más de 80 en 2018).33, 36 Además, a partir de 2018, se han instalado varios equipos que funcionan a campos aún más altos (entre 9,4 y 11,7 T),37-39 también para su uso en el ámbito de la investigación. No obstante, para uso clínico, sólo se dispone en la actualidad de un sistema de 7 T, que fue autorizado en 2017 para la obtención de imágenes de piernas, brazos y cabeza.40 Por último, la ineficacia de los ACs convencionales en condiciones de campo alto es debida a diferentes causas según se trate de ACs positivos o negativos. En el caso de los ACs positivos basados en Gd3+, las ecuaciones Solomon-Bloembergen-Morgan predicen que al aumentar la magnitud del campo magnético, aumenta el tiempo de relajación longitudinal del espín de los electrones (T1e) y, como consecuencia, el valor de r1 disminuye (Apéndice I).41- 47 Este comportamiento es aplicable también a otros ACs positivos tales como los basados en Mn2+, lo cual dificulta el desarrollo de ACs positivos para MRI a alto campo. Ello no sucede con los ACs negativos ya que, de acuerdo con la teoría mecánica cuántica de la esfera externa, sus valores de r2 aumentan al aumentar su magnetización, la cual aumenta con la magnitud del campo (Apéndice I). No obstante, hay que tener en cuenta que en el caso de los ACs basados en SPIONs, su magnetización satura a una magnitud de campo inferior a 1 T,1, 52 lo cual no sucede para los ACs basados en cationes Ln3+ paramagnéticos que serían, por tanto, candidatos más interesantes para su uso a altos campos.48, 49 Entre ellos, los basados en Dy3+ son especialmente atractivos, pues este catión presenta el mayor valor de magnetización debido a CAPÍTULO I: MOTIVACIÓN Y OBJETIVOS 36 su mayor momento magnético (10,6 μB)50 entre todos los cationes Ln3+. De hecho, al comienzo de esta tesis doctoral, podían encontrarse en la bibliografía diversas publicaciones sobre este tipo de ACs que incluían, bien complejos de Dy3+ que presentan valores bajos de r2,51,52 o bien NPs inorgánicas constituidas en su mayoría por matrices tipo fluoruro45, 53, 54 que presentan un inconveniente importante relacionado con su solubilidad en medio acuoso,55, 56 que provoca la liberación de iones de fluoruro potencialmente tóxicos.57 Estos antecedentes ponen de manifiesto que la búsqueda de ACs basados en compuestos de Dy3+ estables químicamente en medio acuoso es indispensable para el desarrollo de la técnica MRI a alto campo. Como posibles alternativas, sería razonable abordar NPs basadas en vanadato, molibdato, volframato y fosfato de Dy3+, ya que, si bien no se han tenido en consideración hasta el comienzo de esta tesis, sí se habían desarrollado diversos ACs de Gd3+ basados en estas matrices, que presentan características adecuadas para su uso en MRI a bajo campo.58-60 No obstante, es importante señalar que la estabilidad química de estos compuestos en condiciones fisiológicas no había sido analizada. 1.2.2. Imagen por resonancia magnética en modo dual T1-T2. En muchas ocasiones, incluso empleando ACs T1 o T2, la nitidez de las imágenes MRI registradas no permite alcanzar un diagnóstico preciso. Para aumentar la sensibilidad y exactitud del diagnóstico se ha propuesto el empleo de la técnica conocida como MRI dual T1-T2.6 El registro de imágenes brillantes y oscuras de forma simultánea permite excluir falsos positivos mediante la validación cruzada de ambos tipos de imágenes. Además, la resonancia magnética, en modo dual T1 y T2 puede suministrar información complementaria y esencial para un correcto diagnóstico, lo cual constituye una ventaja adicional de esta técnica. Por ejemplo, en la resonancia magnética cerebral, las imágenes T1 permiten distinguir posibles lesiones, mientras que mediante las imágenes T2 se puede visualizar el líquido cefalorraquídeo en el tejido cerebral.61 CAPÍTULO I: MOTIVACIÓN Y OBJETIVOS 37 A pesar de estas ventajas, la resonancia magnética en modo dual T1-T2 no se ha implementado aun en clínica como método estándar, lo cual puede ser debido, en parte, a que los ACs positivos disponibles tienen poca capacidad para acortar T2 mientras que los negativos, aunque producen un cierto acortamiento de T1, no llegan a mejorar el contraste de la imagen ponderada en T1. Sólo algunos ACs constituidos por SPION,62 tienen la capacidad de acortar tanto T2 como T1 (Fig. 3), pudiendo actuar como agentes duales T1-T2, aunque su capacidad para acortar T1 es significativamente menor.63 Por ello, resulta una actividad prioritaria en este campo, el diseño de nuevos ACs duales T1-T2 (Fig. 4), que sean capaces de acortar ambos tiempos de relajación con eficiencia similar. Figura 3. Imágenes in vivo de MRI a 7 T ponderadas en T1 y T2 de un ratón antes y después de la inyección de NPs de Fe3O4.62 Con este objetivo, en la bibliografía se ha propuesto incorporar en cada partícula, ACs que aporten alto valor de r1 (basados en Gd3+ o, en menor medida, Mn2+) y ACs con alto valor de r2 (basados en SPION, Dy3+, Ho3+o Yb3+).64-68 Para este tipo de diseño, el empleo de cationes Dy3+ como componente T2 es muy conveniente si se usa Gd3+ como agente T1, ya que la similar reactividad de los iones lantánidos simplifica el proceso de síntesis de las NPs compuestas. Hay que resaltar que la mayoría de NPs reportadas en la bibliografía que se basan en combinaciones Dy3+/Gd3+ están basadas en fluoruros, los cuales poseen el inconveniente anteriormente mencionado de su 120 min 140 min Antes de la inyección T1T2T1T2 CAPÍTULO I: MOTIVACIÓN Y OBJETIVOS 38 solubilidad en medio acuoso y, por lo tanto, su potencial toxicidad. Es, por tanto, fundamental desarrollar nuevas NPs de Dy3+/ Gd3+ basadas en otro tipo de matriz. Figura 4. Esquema del funcionamiento de los agentes de contraste duales T1-T2. 1.2.3. Imagen multimodal mediante resonancia magnética y luminiscencia Si bien la técnica de obtención de bioimágenes MRI se usa frecuentemente en clínica, en ocasiones, esta puede resultar insuficiente para un diagnóstico preciso. Por ello, se han llevado a cabo numerosos estudios que proponen usar esta técnica en combinación con otras técnicas de imagen que proporcionen una información complementaria.69 Una de las más interesantes es la imagen luminiscente que consiste en iluminar la muestra con radiación electromagnética (excitación) y registrar la emisión de radiación emitida por la misma con una energía diferente a la de la excitación. Debido a su alta sensibilidad, esta técnica es muy útil para obtener información sobre patologías a nivel celular o subcelular, que complementa a la información anatómica obtenida mediante MRI. Ello hace de esta combinación de técnicas una herramienta de diagnóstico médico muy potente. Para la obtención de bioimágenes luminiscentes de las células órganos o tejidos de interés se utilizan sondas luminiscentes que se incorporan al espécimen a analizar. Tradicionalmente, las sondas más empleadas han sido complejos orgánicos y proteínas,70 que se excitan en el ultravioleta y emiten en la zona del visible (400-700 nm), lo que conlleva poco poder de penetración en especímenes vivos y por tanto limita su uso a estudios in vitro; además, Agente de contraste T1Agente de contraste T2 Agente de contraste dual T1- T2 CAPÍTULO I: MOTIVACIÓN Y OBJETIVOS 39 presentan baja fotoestabilidad y pueden interferir fácilmente con la autoluminiscencia de los tejidos biológicos. Estas limitaciones pueden minimizarse parcialmente mediante el uso de sondas luminiscentes basadas en NPs inorgánicas, consistentes bien en puntos cuánticos de semiconductores con tamaño <10 nm, en NPs de carbono o en nanoclústeres de oro. Sin embargo, estos tres tipos de NPs presentan importantes inconvenientes entre los que cabe destacar su baja selectividad para ensayos biológicos debida a la elevada anchura de sus bandas de emisión.71 Además, los puntos cuánticos (sobre todo, los basados en CdSe) pueden presentar elevada toxicidad.72 Durante las últimas décadas, se viene prestando gran atención a otro tipo de NPs inorgánicas luminiscentes basadas en matrices de diversa composición dopadas con cationes lantánidos. Estos materiales presentan importantes ventajas respecto a los anteriores tales como una menor toxicidad y una mayor estabilidad química y térmica.73 Además, sus bandas de emisión son mucho más estrechas, lo que confiere una alta selectividad a los ensayos. Esta característica es debida a que los orbitales f están muy apantallados por los orbitales 5s y 5p externos y sus niveles de energía apenas se ven afectados por el campo cristalino. Finalmente, mediante la elección de los cationes activos es posible seleccionar el rango espectral en el que tienen lugar la excitación y las emisiones de los mismos. Ello es esencial para el uso de estos materiales como sondas para la obtención de imágenes biomédicas ya que es conveniente que, en el caso de aplicaciones in vivo, la excitación y emisión de las sondas tenga lugar en el infrarrojo cercano (NIR, en inglés), concretamente, en las regiones conocidas como ventanas biológicas I (λ = 650-950 nm), II (λ = 1000-1350 nm) y III (λ = 1500-1800 nm), en las que las radiaciones tienen alto poder de penetración y no dañan los tejidos.70 Entre los iones lantánidos con emisión en el NIR más estudiados se encuentra el Nd3+ que se excita a 808 nm (ventana biológica I) y que emite a 900 nm, 1060 nm y 1340 nm (ventanas biológicas I y II). CAPÍTULO I: MOTIVACIÓN Y OBJETIVOS 40 Todo lo expuesto anteriormente justifica el gran interés que tiene en la actualidad el desarrollo de nuevas sondas multimodales para la obtención de imágenes mediante luminiscencia en las ventanas biológicas y mediante MRI (Fig. 5). Figura 5. (a) Fotografía de un ratón implantado con células HeLa. Las posiciones de las dos regiones tumorales están marcadas en amarillo. Imagen de fluorescencia NIR-II in vivo (b) y de MRI ponderada en T2 (c) de las regiones tumorales tras la inyección directa de un agente de contraste basado en NaYF4:Nd (izquierda) y NaYF4:Nd/NaDyF4 (derecha).74 1.3. Características requeridas para el uso de nanopartículas en la obtención de imágenes biomédicas Los requisitos esenciales que debe cumplir cualquier sonda basada en NPs para su empleo en aplicaciones biomédicas in vivo, son los siguientes (Fig. 6): • Forma y tamaño de partícula. Es común administrar las NPs vía intravenosa para aplicaciones in vivo. En este caso, se admite que el tamaño óptimo para evitar la formación de trombos y que no sean eliminadas antes de cumplir su función se encuentra entre 20 y 100 nm, pues las partículas más pequeñas son rápidamente eliminadas a través del riñón y las más grandes, por el sistema reticuloendotelial, acumulándose en el bazo o el hígado.75 Por otra parte, el comportamiento in vivo de las NPs (internalización por células, biodistribución, farmacocinética, etc) depende en gran medida de su forma y tamaño,76 por lo que la forma debe ser homogénea y la a b c CAPÍTULO I: MOTIVACIÓN Y OBJETIVOS 41 distribución de tamaños estrecha para asegurar la reproducibilidad de dicho comportamiento y simplificar el estudio de dichos procesos. • Dispersabilidad. Para cumplir el requisito de tamaño anteriormente mencionado, las NPs deben presentar una adecuada dispersabilidad en el medio fisiológico, es decir, debe evitarse su agregación, lo cual puede conseguirse mediante un diseño adecuado de las características de su superficie, que generalmente incluye su recubrimiento con polímeros orgánicos. • Biocompatibilidad. Es obvio que para su uso en aplicaciones in vivo, las NPs deben ser biocompatibles, es decir, no deben presentar toxicidad. Debe tenerse en cuenta que dicha toxicidad no sólo depende de la composición química de las partículas sino, además, de otros factores tales como su forma, tamaño, características superficiales (hidrofilicidad y carga superficial) y naturaleza del recubrimiento orgánico.77 Figura 6. Requisitos de las NPs para su uso in vivo. En el caso de los ACs para MRI, es necesario además que los materiales desarrollados presenten propiedades de relajatividad adecuadas, las cuales se ven afectadas de forma significativa por su composición, tamaño, forma y las propiedades de su superficie, como se describe de forma detallada en el Apéndice I. Por otra parte, es obvio que las sondas para la obtención de Biocompatibilidad Forma y tamaño uniformes Estabilidad coloidal alta REQUISITOS DE LAS NPs PARA SU USO IN VIVO CAPÍTULO I: MOTIVACIÓN Y OBJETIVOS 48 sido ampliamente adoptado y sigue siendo popular en los laboratorios académicos como lo demuestran miles de artículos publicados. Otro de los ensayos colorimétricos más ampliamente utilizados en la evaluación de la citotoxicidad de NPs que complementa al ensayo MTT, es el conocido como vivo-muerto. La integridad de la membrana es la característica más utilizada para detectar si las células cultivadas in vitro están vivas o muertas. Las células que han perdido la integridad de la membrana se clasifican como no viables o muertas. El ensayo vivo-muerto emplea colorantes, que no son permeables a las células viables, pero que pueden penetrar en las células muertas a través de membranas dañadas, para así cuantificar la población muerta de células en un cultivo.111 Hay que tener en cuenta que los resultados dependen en gran medida del tipo de célula (tejido de origen) tiempo de incubación, medio de cultivo y suplementación.112 Análisis histológicos. Los análisis histológicos se llevan a cabo mediante tinción, seccionamiento y posterior examen al microscopio (electrónico o óptico) de los tejidos de interés.113 Se analizan tanto las características de los tejidos como las estructuras microscópicas de las células, lo cual aporta información sobre la toxicidad de las NPs. 1.4. Objetivos Los antecedentes expuestos en la sección anterior justifican la pertinencia del objetivo general de la presente tesis doctoral que consiste en el desarrollo de agentes de contraste químicamente estables para MRI monomodal a alto campo, para MRI dual T1-T2 y para imagen bimodal mediante MRI a alto campo e imagen luminiscente en el infrarrojo cercano. Estos objetivos se abordarán a través de los siguientes objetivos específicos: a) Síntesis de nanopartículas hidrofílicas y uniformes basadas en DyVO4, NaDy(MoO4)2, NaDy(WO4)2 y DyPO4. CAPÍTULO I: MOTIVACIÓN Y OBJETIVOS 49 b) Síntesis de nanopartículas basadas en los compuestos de Dy3+ contemplados en el objetivo (a) a las que se les incorporan cationes Gd3+ utilizando diferentes arquitecturas. c) Síntesis de nanopartículas basadas en los compuestos de Dy3+ contemplados en el objetivo (a) a las que se les incorporan cationes Nd3+ empleando distintas arquitecturas. d) Funcionalización con ácido poliacrílico de las NPs sintetizadas según objetivos (a), (b) y (c), que así lo requieran, para que puedan ser dispersadas en condiciones fisiológicas. e) Análisis de la estabilidad química en condiciones fisiológicas de las nanopartículas funcionalizadas. f) Evaluación comparativa in vitro de las relajatividades magnéticas de las nanopartículas funcionalizadas en función de su composición, tamaño, forma y diámetro hidrodinámico. g) Evaluación in vitro de las propiedades luminiscentes de las nanopartículas sintetizadas según el objetivo específico (c). h) Análisis de la biocompatibilidad de las sondas desarrolladas mediante estudios de citotoxicidad in vitro y análisis histológicos. i) Aplicación de las sondas desarrolladas para la obtención de imágenes in vivo en modelo animal. 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Cloos, Cancer Cell Culture: Methods and Protocols, Second Edition, 2011, 731, 237-245. 111. T. Riss, A. Niles, R. Moravec, N. Karassina, J. Vidugiriene, S. Markossian, A. Grossman, K. Brimacombe, M. Arkin, D. Auld, C. Austin, J. Baell, T. D. Y. Chung, N. P. Coussens, J. L. Dahlin, V. Devanarayan, T. L. Foley, M. Glicksman, K. Gorshkov, J. V. Haas, M. D. Hall, S. Hoare, J. Inglese, P. W. Iversen, S. C. Kales, M. Lal-Nag, Z. Li, J. McGee, O. McManus, Y. Saradjian, J. R. Weidner, M. J. Wildey, K. Wilson, M. Xia and X. Xu, in Assay Guidance Manual, ed. E. L. C. a. t. N. C. f. A. T. Sciences, 2004. 112. S. Lorscheidt and A. Lamprecht, Expert Opinion on Drug Delivery, 2016, 13, 1545-1558. 113. H. A. Alturkistani, F. M. Tashkandi and Z. M. Mohammedsaleh, Global Journal of Health Science, 2015, 28, 72-79. CAPÍTULO II PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES CAPÍTULO II: PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES 64 Por todas estas ventajas, en esta tesis se ha considerado el uso preferente de etilenglicol (EG) como disolvente para la síntesis de los distintos tipos de partículas estudiadas. Hay que señalar que, aunque en la bibliografía pueden encontrase métodos de síntesis de una variedad de tipos de NPs12-16 en los que se emplean diversos polioles como disolvente, esta tesis doctoral es pionera en uso de estos compuestos para la obtención de agentes de contraste para MRI a alto campo y MRI dual. 2.1.2. Síntesis de nanopartículas con arquitectura núcleo-corteza Con el fin de obtener las nanoarquitecturas núcleo-corteza se ha empleado el método de precipitación homogénea descrito en la sección anterior para la formación de la fase corteza, pero en presencia de las NPs que constituyen la fase núcleo y que actúan como semillas sobre las cuales se produce la nucleación de la fase corteza y el posterior crecimiento de la misma. En la Fig. 3 se presenta un esquema del proceso de formación de este tipo de partículas. Esencialmente, este supone suprimir la etapa de nucleación homogénea producida como consecuencia de una concentración de especies precursoras de la precipitación superior a la sobresaturación al introducir de forma deliberada las semillas que actúan como núcleos, los cuales crecen por difusión mientras que la disolución permanezca sobresaturada. Cuando la concentración de precursores cae por debajo del umbral de sobresaturación, el proceso de crecimiento finaliza. Este tipo de nucleación se denomina heterogénea. En este procedimiento de síntesis es importante evitar que tenga lugar una nucleación homogénea en el seno de la disolución que originaría la formación adicional de NPs de la fase corteza. Ello puede conseguirse ajustando la cinética de precipitación de forma que no se alcance la 𝐶𝑚𝑖𝑛 𝑛𝑢𝑐𝑙, para lo cual, en esta tesis, se utilizó el mismo procedimiento empírico descrito en la sección anterior, que implica un análisis sistemático de los efectos de los distintos parámetros experimentales sobre el evento de precipitación.17 CAPÍTULO II: PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES 65 Figura 3. Ilustración esquemática del proceso de formación de NPs con arquitectura núcleo-corteza. 2.1.3. Purificación de las nanopartículas sintetizadas En todos los casos, las partículas fueron sometidas a un procedimiento de purificación consistente en la centrifugación y lavado dos veces con etanol y una con agua doblemente destilada del precipitado obtenido. Las NPs purificadas se dispersaron finalmente en agua destilada, exceptuando algunos casos, en lo que se secaron a 50 ºC para posteriores análisis. 2.2. Funcionalización Existen distintos procedimientos de funcionalización de partículas con superficie tanto hidrofóbica como hidrofílica. Aquí, sólo nos referiremos al segundo caso, en el que se enmarcan las NPs objeto de estudio de esta tesis. Atendiendo al procedimiento experimental empleado, estos métodos de funcionalización pueden clasificarse en dos categorías, dependiendo de si el proceso de funcionalización se lleva a cabo durante el propio proceso de síntesis de las NPs o en una etapa posterior. En el primer caso, tenemos los métodos de funcionalización conocidos como one-pot según su denominación en inglés, y en el segundo, los métodos two steps siguiendo también su denominación en inglés, los cuales se ilustran en la Fig. 4. Cs [Precursores] Tiempo Cnucl Cnucl mín máx CAPÍTULO II: PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES 66 Figura 4. Esquema de los métodos de funcionalización: One-pot y two steps. Los métodos de funcionalización también pueden clasificarse según la naturaleza de las interacciones entre las NPs y las moléculas del agente de funcionalización. Así, podemos distinguir aquellos métodos que se basan en interacciones iónicas, covalentes o electrostáticas.18 Entre los primeros se encuentran la mayoría de procesos de funcionalización con grupos carboxilato, ya que las moléculas de estos compuestos pueden adherirse a los cationes presentes en la superficie de las NPs mediante enlace iónico. El procedimiento más empleado para la funcionalización mediante enlace covalente es el conocido método de química de la carbodiimida.19, 20 Como se verá más adelante, este método consiste básicamente, en la reacción entre grupos carboxilo y grupos amino para formar enlaces amida. Por último, el método de funcionalización basado en interacciones electrostáticas más conocido es el denominado “capa a capa” que aquí será mencionado por su denominación en inglés layer-by-layer. Este tipo de funcionalización se basa en adsorber sobre la superficie de las NPs, mediante interacciones electrostáticas, polielectrolitos de carga eléctrica opuesta de forma secuencial y alternada. PolímeroNP Adsorción del polímero Precursores aniónicos y catiónicos Polímero Precipitación y adsorción del polímero ONE-POT TWO STEPS CAPÍTULO II: PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES 67 Los reactivos empleados en los procesos de funcionalización se incluyen en las Tablas 4 y 5 del Apéndice II y los procedimientos experimentales concretos, se detallan a continuación. 2.2.1. Funcionalización con ácido poliacrílico (PAA) Procedimiento one-pot. Para la funcionalización de las NPs con PAA durante su proceso de formación se utilizaron los mismos métodos ya optimizados para la obtención de NPs homogéneas de los distintos sistemas estudiados, pero introduciendo 2 mg·mL-1 (salvo que se indique otra cantidad) de PAA en la disolución de partida del precursor de disprosio para propiciar la adsorción de este polímero (Fig. 5) sobre la superficie de las NPs mediante interacciones iónicas con los cationes Ln superficiales.21 Figura 5: Esquema de la funcionalización con PAA mediante interacciones iónicas. Procedimiento two steps. En aquellos casos en los que el proceso de funcionalización mediante procedimientos one-pot no tuvo éxito, se optó por llevar a cabo la funcionalización de NPs con PAA mediante procedimientos two steps. Para ello, en primer lugar, se ensayó el método de deposición de moléculas de PAA sobre la superficie de las NPs basado en interacciones iónicas. Para los sistemas en que este procedimiento no funcionó, se procedió a usar el procedimiento conocido como layer-by-layer basado en interacciones electrostáticas. Ln Ln O O H H H PAA CAPÍTULO II: PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES 68 a) Funcionalización mediante interacciones iónicas Para funcionalizar las NPs sintetizadas mediante interacciones iónicas con ácido poliacrílico (Fig. 5) en una etapa posterior a su síntesis, se preparó una suspensión de NPs en agua Milli-Q con una concentración de 1 mg·mL-1 y su pH se ajustó a 10 con una disolución de NaOH (1 M). A continuación, se añadió la cantidad deseada de PAA a dicha suspensión y, de nuevo, se ajustó el pH a 10. La suspensión resultante se agitó magnéticamente durante 1 h a temperatura ambiente y, posteriormente, se centrifugó a 14000 rpm durante 20 min para eliminar el sobrenadante. Las NPs resultantes se lavaron dos veces con agua Milli-Q mediante centrifugación en las mismas condiciones y se almacenaron en agua Milli-Q. b) Funcionalización mediante el método layer-by-layer Como se ha mencionado anteriormente, este tipo de funcionalización se basa en adsorber sobre la superficie de las NPs polielectrolitos de carga eléctrica opuesta mediante interacciones electrostáticas de forma secuencial y alternada (Fig. 6). Como polielectrolito de carga positiva se utilizó poli(clorhidrato) de alilamina (PAH)22 y como polielectrolito de carga negativa, se usó PAA. En primer lugar, se procedió a depositar la capa PAH mediante el siguiente procedimiento. Se añadieron 5 mL de una disolución acuosa de NaCl 0,05 M a pH 6,5 que contenía 10 mg·mL-1 de PAH, a 1,5 mL de una dispersión acuosa que contenía 5 mg de las NPs. La mezcla resultante se sonicó en agua helada durante 5 minutos y luego se mantuvo en agitación durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, la dispersión se centrifugó para eliminar el sobrenadante y las NPs se lavaron dos veces con agua Milli-Q. Para la deposición de la segunda capa negativa de PAA, se siguió un procedimiento similar, salvo que el PAH se sustituyó por PAA. Las NPs funcionalizadas resultantes se dispersaron y almacenaron en agua Milli-Q. CAPÍTULO II: PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES 69 Figura 6: Esquema de la funcionalización layer-by-layer con PAH y PAA de una NP. 2.2.2. Funcionalización con polietilenglicol La funcionalización con polietilenglicol mediante unión covalente23, 24 se llevó a cabo utilizando la química de acoplamiento de la carbodiimida, también conocida como química EDC-NHS (Fig. 7), la cual está bien establecida en la química orgánica y, especialmente, en la de bioconjugación.25 Básicamente, el procedimiento consiste en la reacción entre grupos carboxilo y grupos amino para formar enlaces amida.25 Para ello, se usa 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida, (EDC) que activa los grupos carboxilo formando un producto intermedio inestable denominado O-acilisourea. Este producto es estabilizado mediante la adición de N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS), de forma que el nuevo producto intermedio semiestable puede reaccionar eficazmente con grupos amino para formar los enlaces amida.26 Por tanto, se trata de una vía de funcionalización mediante enlaces covalentes.27 Por tanto, este método requiere la presencia de grupos carboxilato en la superficie de las NPs y grupos amino en las cadenas de PEG. Por ello, las NPs de interés fueron previamente funcionalizadas con PAA, y se seleccionó un PEG derivatizado con grupos amino (ɑ-metoxi-ω-amino PEG). El procedimiento experimental se llevó a cabo como se describe a continuación. Para la funcionalización de las NPs con PAA se siguió el mismo procedimiento two steps descrito anteriormente, pero utilizando 10 mg·mL-1 de PAA para aumentar el número de grupos carboxilato en la superficie de las NPs y así facilitar la incorporación de ɑ-metoxi-ω-amino PEG en la superficie de las NPs. Las NPs así funcionalizadas fueron dispersadas en una disolución de tampón borato sódico (6 mg NPs·mL-1). A continuación, se mezcló un volumen PAAPAH CAPÍTULO II: PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES 70 de 0,94 mL de una disolución de EDC en tampón borato (3,2 mg·mL-1) con 0,85 mL de disolución de sulfo-NHS en tampón borato (6 mg·mL-1).28 La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 min. A esta disolución, se añadió un volumen de 161 μL de la suspensión de NPs funcionalizadas con PAA. Los volúmenes mencionados se eligieron para obtener una relación molar: 1 COOH:10 EDC:15 sulfo-NHS (COOH se refiere a los grupos carboxílicos del PAA unidos a las NPs). La suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 h en el agitador rotatorio y se mezcló con 1,56 mL de una disolución de 10 mg·mL-1 de ɑ-metoxi-ω-amino PEG en tampón borato sódico (de acuerdo con la proporción 1 COOH:2 PEG). Por último, tras 45 minutos de agitación a temperatura ambiente en agitador rotatorio, las NPs se separaron por centrifugación a 14500 rpm durante 5 minutos. Las NPs resultantes se lavaron dos veces con la disolución de tampón borato sódico y se suspendieron en 1 mL de esta misma disolución tamponada, dejando la suspensión resultante almacenada a 4 °C. Para su caracterización posterior, estas NPs funcionalizadas con ɑ-metoxi-ω-amino PEG se dispersaron y almacenaron en agua Milli-Q. Figura 7: Reacciones de la química de la carbodiimida para la formación del enlace amida y consecuente anclaje del ɑ-metoxi-ω-amino PEG en la superficie carboxilada de la nanopartícula. O OH O O N NH N H Cl- + H + Cl-O ON O O SO OONH2 O NH EDC O-acilisourea Sulfo-NHS Éster sulfo-NHS amino-reactivo Formación del enlace amida CAPÍTULO II: PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES 71 2.3. Caracterización 2.3.1. Análisis morfológico Microscopía de transmisión electrónica (TEM). La morfología y el tamaño de las partículas sintetizadas se analizó mediante microscopía electrónica de transmisión. Como es bien conocido, esta técnica usa un haz de electrones como fuente de iluminación. Cuando este haz incide sobre la muestra, según sea el tipo de átomo que constituya la muestra y el espesor de la misma, los electrones pueden atravesar la muestra. Estos electrones trasmitidos son empleados para formar las imágenes mediante el uso de lentes. Para la obtención de las micrografías TEM, se depositó una gota de la suspensión acuosa de NPs en una rejilla de cobre recubierta con un polímero transparente que se dejó secar al aire antes de ser introducida en un microscopio de transmisión JEOL 2100Plus de 200 kV con filamento de LaB6. Las curvas de distribución del tamaño de las partículas sintetizadas se obtuvieron midiendo un centenar de partículas en las micrografías TEM utilizando el software libre ImageJ. 2.3.2. Análisis estructural Difracción de rayos X (DRX). Para obtener información sobre las fases cristalinas presentes en las muestras analizadas, se hizo uso de la técnica de difracción de rayos X, la cual permite identificar las fases cristalinas y el tamaño de cristal. El fundamento de esta técnica se basa en las interferencias ópticas que tienen lugar cuando una radiación monocromática atraviesa una rendija con un espesor similar a la longitud de onda de la radiación. En particular, los rayos X tienen longitudes de onda del orden de los Angstroms, al igual que las distancias interatómicas de los componentes de las redes cristalinas. Por lo tanto, al focalizar esta radiación sobre la muestra a analizar, los rayos X se difractan con ángulos que dependen de las distancias interatómicas. CAPÍTULO II: PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES 72 Las condiciones necesarias para que se produzca la difracción vienen determinadas por la conocida ley de Bragg, dada por la Ecuación 1: 𝑛·𝜆=2·𝑑ℎ𝑘𝑙 ·sin𝜃 (Ecuación 1) donde n es un número entero, λ es la longitud de onda de la radiación incidente, dhkl es la distancia entre los planos cristalinos (hkl) y 𝜃 es el ángulo de difracción. Para la obtención de los diagramas de difracción se utilizó un difractómetro modelo X’Pert Panalytical con radiación Kα del cobre (λ=1,5406 Å) que emplea un detector X’Celerator multicanal y un monocromador de grafito. Los difractogramas se registraron entre 10 y 90º (valores de 2 𝜃), con un tiempo de conteo de 200 s en cada paso, y un paso de 0,05 (2 𝜃). El tamaño de cristal (𝐷), también conocido como tamaño de los dominios coherentes de difracción, de las partículas sintetizadas se calculó a partir de la anchura del pico de difracción de mayor intensidad, empleando para ello la ecuación de Scherrer (Ecuación 2):29 𝐷= 𝐾·𝜆 𝐵·cos𝜃𝑏 (Ecuación 2) donde K es el factor de forma, una constante que depende de las condiciones experimentales y cuyo valor es 0,89 para cristales redondeados, λ es la longitud de onda de la línea CuKα, B es la anchura de pico a media altura corregida (𝐵=𝐵𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙 −𝐵𝑖𝑛𝑠𝑡𝑟𝑢𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙, siendo 𝐵𝑖𝑛𝑠𝑡𝑟𝑢𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙 =0,112 en radianes, y θb es el ángulo correspondiente al máximo del pico. 2.3.3. Análisis de composición química Espectrometría de emisión atómica con plasma acoplado inductivamente (ICP-AES). El análisis de la composición química cuantitativa de las muestras se llevó a cabo mediante espectrometría de emisión atómica con plasma acoplado inductivamente.30 Esta técnica permite cuantificar la mayoría de los elementos de la tabla periódica a niveles de traza y ultra traza, pero para ello es CAPÍTULO II: PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES 73 necesario tener a los átomos de la especie a analizar en disolución y llevar a cabo todo el procedimiento en un ambiente inerte para evitar la formación de especies indeseables, tales como óxidos, carburos, etc., los cuales afectarían a la precisión de la medición. Para la digestión de las muestras se empleó ácido clorhídrico y los análisis se llevaron a cabo en un espectrómetro de emisión con fuente de plasma de acoplamiento inductivo iCAP 7200 ICP-OES Duo (ThermoFisher Scientific). Espectroscopía de energías dispersivas de rayos X (EDS). Para analizar la localización de los cationes en las partículas, se llevaron a cabo análisis mediante espectroscopía de energías dispersivas de rayos X (EDS). Esta técnica se basa en el análisis de la energía de los rayos X emitidos por una muestra cuando esta es irradiada con un haz de electrones en un microscopio electrónico. Cuando estos chocan con los átomos que constituyen una muestra, son capaces de arrancar electrones de sus capas más internas, dando lugar así a un hueco y quedando el átomo ionizado. A continuación, un electrón de las capas más externas ocupa dicho hueco y el átomo emite energía (rayos X) para volver al estado fundamental. La energía emitida de los rayos X y la transición desde la que se producen son características de cada elemento. Para adquirir los espectros se empleó un detector de EDS acoplado a un microscopio de transmisión en modo barrido (STEM), FEI TECNAI G2F30 (300kV). Para la obtención de las micrografías STEM y mapas composicionales de las partículas, se depositó una gota de la suspensión acuosa de las mismas en una rejilla de cobre recubierta con un polímero transparente que se dejó secar al aire antes de ser introducida en el microscopio. Espectroscopía infrarroja (FTIR). Para obtener información sobre la presencia de especies adsorbidas o impurezas en la superficie de las partículas se utilizó la técnica de espectroscopía infrarroja que se basa en el estudio de la interacción de la radiación electromagnética, en el rango infrarrojo medio del CAPÍTULO II: PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES 80 2.7. Propiedades luminiscentes Las propiedades luminiscentes de las NPs dopadas con neodimio fueron analizadas a partir de sus espectros de excitación y emisión, de los valores de vida media de luminiscencia y de las imágenes en el infrarrojo cercano de la muestra. 2.7.1. Espectros de excitación y emisión Los espectros de excitación y emisión de fotoluminiscencia se registraron en un instrumento FLS1000 Edinburgh, equipado con tubos fotomultiplicadores que detectan radiación roja e infrarroja, y una lámpara de Xe, utilizando longitudes de onda de emisión y excitación de 877 nm y 806 nm, respectivamente. Los espectros de emisión se corrigieron en función de la respuesta del detector, los espectros de excitación se corrigieron en función de la intensidad de la lámpara y ambos se corrigieron también en función del fondo. Para llevar a cabo las medidas, se prepararon suspensiones coloidales de las NPs en agua utilizando una concentración constante (0,5 mg NPs·mL-1) para todas las muestras, lo cual permitió llevar a cabo un análisis comparativo preciso de las propiedades luminiscentes de las mismas. 2.7.2. Vidas medias Los valores de los tiempos de vida de la luminiscencia se estimaron mediante ajuste de las curvas de decaimiento obtenidas al excitar las muestras con un pulso de luz de alta intensidad y corta duración y registrar a continuación el número de fotones emitidos en función del tiempo. Para las muestras que muestran un único tiempo de vida de luminiscencia, su intensidad decae exponencialmente según la Ecuación 5: 𝐼(𝑡)=𝐼0exp (−𝑡 𝜏) (Ecuación 5) donde I0 es la intensidad de la luminiscencia a tiempo cero y τ es el tiempo de vida media de la luminiscencia, es decir, es el tiempo en el que la intensidad de emisión decae un factor 1/e con respecto a su valor inicial. CAPÍTULO II: PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES 81 Sin embargo, las muestras analizadas en esta tesis están constituidas por NPs de compuestos de elementos lantánidos que no suelen presentar un decaimiento monoexponencial, sino biexponencial que se ajusta mediante Ecuación 6: 𝐼(𝑡)=𝐼01exp(− 𝑡 𝜏1)+𝐼02exp(− 𝑡 𝜏2) (Ecuación 6) donde τ1 y τ2 son los tiempos de vida media de los dos componentes de la luminiscencia con intensidades I01 e I02, respectivamente. El componente de tiempo de vida más largo se considera como el tiempo de decaimiento de los iones lantánidos situados en el interior de las NPs, mientras que el componente más corto se refiere a los iones situados cerca de la superficie de las mismas, cuya luminiscencia estará influenciada por centros de desactivación como pueden ser moléculas de disolvente o moléculas de ligandos adsorbidas superficialmente.37 A partir de los valores de vida media de los distintos componentes es posible calcular el tiempo de vida promedio, dado por la Ecuación 7: 〈𝜏〉=∫𝑡𝐼(𝑡)𝑑𝑡 𝑡𝑓 𝑡0 ∫𝐼(𝑡)𝑑𝑡 𝑡𝑓 𝑡0=𝜏1 2𝐼1+𝜏2 2𝐼2 𝜏1𝐼1+𝜏2𝐼2 (Ecuación 7) El análisis de los tiempos de vida de la luminiscencia se realizó con las muestras en forma de polvo usando en el mismo equipo mencionado anteriormente para el registro de espectros de emisión y excitación. 2.7.3. Imágenes de luminiscencia en el infrarrojo cercano Para obtener imágenes de la luminiscencia infrarroja emitida por la muestra dopada con Nd3+ se utilizó una cámara NIR (WiDy SenS 320 V-ST) equipada con un detector InGaAs (rango de longitud de onda 900 -1700 nm). La muestra, preparada en polvo sobre un portaobjetos, fue excitada a una longitud de onda (λex) de 806 nm, con una fuente láser pulsada sintonizable (Fianium, SC400) que funcionaba a una frecuencia de repetición de 40 kHz. CAPÍTULO II: PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES 82 2.8. Ensayos en modelo animal Para los ensayos in vivo se utilizaron ratones macho Balb/c, proporcionados por Janvier Labs. Los ratones se anestesiaron con isoflurano (0,5-1 % en oxígeno a 1 dm3/min) y se les canuló la vena de la cola para la administración intravenosa de las NPs en una concentración entre 5 y 10 mg Dy/kg animal. A continuación, los ratones se colocaron en el imán, donde se monitorearon las constantes vitales, la respiración y la temperatura corporal durante todo el experimento. En la Fig. 11 se indica esquemáticamente dicho procedimiento. Figura 11: Representación esquemática del procedimiento utilizado para la obtención de imágenes MRI en un ratón. Todos los estudios se realizaron cumpliendo las Directrices Españolas y Europeas para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (R.D. 53/2013 y 2010/62/UE) y aprobados por el Comité Local de Ética Animal y el Máximo Comité de Ética Institucional (Junta de Andalucía, acreditación número 14/09/2021/130). 2.8.1. Imágenes in vivo de resonancia magnética Las imágenes de resonancia magnética se adquirieron en el equipo Bruker Biospec 9,4 T mencionado en la sección 2.5, equipado con una antena de 40 mm de diámetro tipo bird-cage. El esquema de adquisición consistió en imágenes ponderadas en T2 de alta resolución, imágenes paramétricas cuantitativas en T2, inyección intravenosa de las NPs, secuencia dinámica ponderada en T2 y nuevamente imágenes de alta resolución e imágenes T2 CAPÍTULO II: PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES 83 paramétricas.38 Las imágenes ponderadas en T2 de alta resolución se adquirieron utilizando una secuencia turbo-RARE con control respiratorio (TE = 16 ms, TR = 1000 ms, 4 promedios, FOV = 4 cm, tamaño de matriz = 384x384, grosor de corte = 1 mm). Los mapas T2 se adquirieron utilizando una secuencia de eco de espín multieco (TE que van desde 7 ms a 448 ms, TR = 3500 ms, FOV = 4 cm, tamaño de matriz = 128x128, espesor de corte = 1 mm). El comportamiento farmacocinético a corto plazo (primeros 30 minutos) se estudió a partir del análisis semicuantitativo de la secuencia dinámica ponderada en T2. Se adquirieron imágenes T2 cuantitativas a las 0, 1 y 24 h para evaluar la farmacocinética y la biodistribución a largo plazo de las NPs. Después de 24 h tras la inyección de las NPs, los ratones fueron sacrificados y se recolectaron muestras de tejido para la evaluación histológica y la cuantificación del contenido de Dy3+ por ICP. Para obtener los valores de intensidad, se dibujaron regiones de interés (ROI) en la primera imagen de la secuencia de imágenes y se ajustaron según las Ecuaciones 8 y 9: Mz(t)=M0(1−e−TR T1) (Ecuación 8) 𝑀𝑋𝑌(𝑡)=𝑀0𝑒−𝑇𝐸 𝑇2 (Ecuación 9) donde MZ y MXY son las intensidades de señal en el tiempo TR (tiempo de repetición) o TE (tiempo de eco), y M0 es la intensidad de señal en equilibrio. 2.8.2. Imágenes ex vivo de luminiscencia en el infrarrojo cercano Las imágenes ex vivo de fluorescencia en el NIR se registraron en el equipo Bruker Xtreme. El filtro de excitación se fijó en 600 nm y el filtro de emisión en 800 nm, se empleó un campo de visión de 120x120 mm, un binning de 2x2, y un tiempo de exposición de 1 min. CAPÍTULO II: PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES 84 2.9. Ensayos de biocompatibilidad La biocompatibilidad de las NPs preparadas se evaluó mediante ensayos de citotoxicidad in vitro y mediante el análisis histológico ex vivo de diversos órganos del modelo animal utilizado para los estudios in vivo. Los productos químicos requeridos para la realización de estos análisis se encuentran recogidos en la Tabla 6 del Apéndice II. 2.9.1. Citotoxicidad La evaluación de la viabilidad celular de las NPs se realizó empleando la línea celular de fibroblastos de prepucio humano HFF-1 mediante dos métodos: el ensayo colorimétrico MTT y el ensayo conocido como vivomuerto. Ensayo MTT. El ensayo colorimétrico MTT mide la actividad metabólica celular. El fundamento de este ensayo se basa en la capacidad de la enzima succinato deshidrogenasa mitocondrial para reducir el compuesto MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazoil)-(2,5-difeniltetrazólico) que es amarillo, a un compuesto púrpura que se denomina formazán. El ensayo supone incubar un cultivo celular con el reactivo MTT y las NPs cuya toxicidad se desea analizar.39Al cuantificar la cantidad de formazán producido se tiene información sobre el % de células viables en el cultivo, ya que la capacidad de las células para reducir el MTT indica el nivel de integridad de las mitocondrias y puede entonces interpretarse su actividad funcional como una medida de la viabilidad celular en presencia de las NPs analizadas. Para realizar el ensayo MTT, se sembraron células HFF-1 a una densidad de 1x104 células/pocillo en una placa de 96 pocillos a 37 ºC en una atmósfera con 5 % de CO2 en 200 µl de DMEM (Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium) suplementado. Tras incubarlas durante de 24 h, el medio de los pocillos se reemplazó con medio fresco que contenía las NPs a analizar en concentraciones variables de 0,1 µg/ml a 100 µg/ml. Y a uno de los pocillos se le agregó Triton X-100 como control positivo de muerte. Después de 24 h, el CAPÍTULO II: PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES 85 sobrenadante de cada pocillo se reemplazó por 200 µL de medio fresco con MTT (0,5 mg·mL-1). Transcurridas 2 h de incubación a 37 ºC y 5 % de CO2, se retiró el medio y los cristales de formazán formados se solubilizaron con 200 µl de dimetilsulfóxido. Finalmente, las disoluciones de formazán se agitaron vigorosamente para disolver el colorante reaccionado y se midió la absorbancia de cada pocillo en un lector de microplacas (Dynatech MR7000) a 550 nm. Todas las medidas de viabilidad celular se llevaron a cabo por quintuplicado para obtener un valor promedio y evitar errores experimentales. La viabilidad celular relativa (%) y su error relacionado con los pocillos de control que contenían medio de cultivo celular sin nanopartículas se calcularon mediante las Ecuaciones 10 y 11: 𝑉𝑖𝑎𝑏.𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 (𝑉𝐶𝑅)(%)=[𝐴𝑏𝑠]𝑡𝑒𝑠𝑡 [𝐴𝑏𝑠]𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑥 100 (Ecuación 10) 𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 (%)=𝑉𝐶𝑅𝑡𝑒𝑠𝑡 𝑥 √([𝜎]𝑡𝑒𝑠𝑡 [𝐴𝑏𝑠]𝑡𝑒𝑠𝑡)2+( [𝜎]𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 [𝐴𝑏𝑠]𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙)2 (Ecuación 11) Según se especifica en la norma UNE-EN ISO 10993-5:2009 “Evaluación biológica de productos sanitarios. Parte 5: ensayos de citotoxicidad in vitro”, cuando la viabilidad decae más allá del 70 %, las NPs se consideran potencialmente tóxicas para la línea celular utilizada.40 Morfología celular y ensayo vivo-muerto. Las células HFF-1 se sembraron a una densidad de 1x104 células/pocillo en una placa de 96 pocillos a 37 ºC en una atmósfera con 5 % de CO2 en 200 µl de DMEM suplementado. Después de 24 h de cultivo, el medio DMEM de los pocillos se reemplazó con medio fresco que contenía las NPs a analizar en concentraciones variables de 0,1 µg/ml a 100 µg/ml. De manera similar a los ensayos de citotoxicidad, después de 24 h, se agregó Triton X-100 a los pocillos de control positivo. Después de 15 min, todos los pocillos se tiñeron con DAPI (4',6-Diamidino-2-fenilindol) (dilución 1:3000) para marcar los núcleos en todas las células, y TO-PRO-3 (tiazol rojo) (dilución 1:1000) para marcar solo las células muertas. Las imágenes de morfología celular se adquirieron utilizando el equipo Operetta High Content CAPÍTULO II: PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES 86 Imaging System (Perkin Elmer) con una lente de objetivo 20x. Se analizaron 5 réplicas de pocillos para cada condición con 10 campos de imágenes aleatorias capturadas por pocillo. Para cada campo, se capturaron imágenes de fluorescencia para DAPI y TO-PRO-3, además de una imagen de campo claro. Los porcentajes de mortalidad celular se calcularon automáticamente mediante el software Operetta Harmony, mediante el cual se identificaron todos los núcleos (vivos y muertos) a partir de la tinción DAPI y luego se determinó el porcentaje de células muertas por el número de núcleos que también poseían altos niveles de tinción TO-PRO-3.41 2.9.2. Histología Secciones de tejido de riñón, bazo e hígado se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) para evaluar la arquitectura del tejido mediante microscopía óptica (escáner de portaobjetos OLYMPUS VS200 con campo claro, campo oscuro y polarizador).42 Los tejidos se fijaron en formaldehído al 4 % (Panreac, pH 7 tamponado) durante 48 h, cambiando el formaldehído al 4 % transcurridas 24 h. Luego, las muestras se deshidrataron con etanol y se embebieron en parafina (temperatura de 56 ° C durante 2 h con agitación y vacío). Las muestras incluidas en parafina se seccionaron en láminas de 7 μm de espesor. A continuación, se desparafinizaron, rehidrataron y tiñeron con H&E, y finalmente se deshidrataron en concentraciones ascendentes de etanol, se aclararon en xileno y se montaron en un portaobjetos de vidrio comercial. CAPÍTULO II: PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES 87 2.10. Bibliografía 1. V. Privman, D. V. Goia, J. Park and E. Matijevic, Journal of Colloid and Interface Science, 1999, 213, 36-45. 2. V. K. Lamer and R. H. Dinegar, Journal of the American Chemical Society, 1950, 72, 4847-4854. 3. T. Sugimoto, Advances in Colloid and Interface Science, 1987, 28, 65- 108. 4. P. C. Hiemenz and R. Rajagopalan, Principles of colloid and surface chemistry, New York, Third Edition edn., 1997. 5. M. Iosin, V. Canpean and S. Astilean, Journal of Photochemistry and Photobiology a-Chemistry, 2011, 217, 395-401. 6. M. Ocana, R. Rodriguez-Clemente and C. J. Serna, Advanced Materials, 1995, 7, 212-216. 7. T. D. Nguyen, Nanoscale, 2013, 5, 9455-9482. 8. R. Belcher, G. W. Tully and G. 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Garcia-Martin, Acs Applied Nano Materials, 2021, 4, 4199-4207. CAPÍTULO III AGENTES DE CONTRASTE PARA IMAGEN POR RESONANCIA MAGNÉTICA DE ALTO CAMPO CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 96 precipitación que cabría esperar como consecuencia de la variación de las concentraciones de precursores (Sección 2.1.1. del Capítulo II). De estos resultados se deduce que para la obtención de NPs que puedan ser empleadas en biomedicina debe emplearse unas concentraciones de precursores muy restrictivas, en concreto, 0,02 M de Dy3+ y 0,1 M de VO43-. Figura 3. Micrografías TEM de las NPs obtenidas por calentamiento a 120 ºC durante 20 h de disoluciones que contenían 0,02 M de Dy(OAc)3 y 0,02 M de Na3VO4 (a), 0,02 M de Dy(OAc)3 y 0,2 M de Na3VO4 (b), 0,01 M de Dy(OAc)3 y 0,1 M de Na3VO4 (c) y 0,04 M de Dy(OAc)3 y 0,1 M de Na3VO4 (d) en mezclas EG/H2O = 4/1, según se indica en la Tabla 1. Por último, se estudió cómo afectaban la temperatura y el modo de calentamiento a las características morfológicas de las partículas utilizando las condiciones experimentales que dieron lugar a las NPs más pequeñas, homogéneas y dispersas (ilustradas en la Fig. 2a). Se observó que al disminuir la temperatura desde 120 a 80 ºC, se mantuvo la forma aparentemente cúbica DyVO4EG23DyVO4EG22 DyVO4EG24 DyVO4A76 100 nm ba dc CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 97 de las NPs (Fig. 4a), aumentando tanto la longitud media de arista a 84 nm ( = 6 nm) como el valor de Dh a 170 nm (PZ = -37 mV) y, por tanto, su grado de agregación. Al incrementar dicho parámetro a 150 ºC, se obtuvieron NPs más pequeñas (51 nm,  = 14 nm) pero más heterogéneas (Fig. 4b) y agregadas (Dh de 276 nm, PZ = -31 mV). Así pues, la temperatura de síntesis que permite obtener las NPs más adecuadas para aplicaciones biomédicas por su forma, tamaño y grado de dispersión es 120 ºC. En cuanto al efecto de la fuente de calentamiento, se observó que el empleo de un horno asistido por microondas (tiempo de calentamiento = 30 min) en lugar de una estufa convencional, resultó en NPs más alargadas (Fig. 4c) con tamaño 45 nm ( = 1 nm) x 26 nm ( = 3 nm) y un valor de Dh en suspensión acuosa de 209 nm (PZ = -32 mV) que revela la presencia de un cierto grado de agregación. Este resultado indica que la mayor velocidad de calentamiento asociada al empleo del horno microondas no mejora, en este caso, las características morfológicas de las NPs precipitadas. Figura 4. Micrografías TEM de las NPs obtenidas por calentamiento de disoluciones de 0,02 M Dy(OAc)3 y 0,1 M Na3VO4 en mezclas EG/H2O = 4/1 en estufa convencional a T = 80 ºC (a), estufa convencional a T = 150 ºC (b) y horno asistido por microondas a 120 ºC (c), según se indica en la Tabla 1. Del análisis de los efectos de los parámetros de síntesis sobre las características de las partículas obtenidas se concluye que, por su uniformidad, tamaño y valor de Dh, las NPs más adecuadas para su empleo en bioimagen serían las que presentan una forma aparentemente cúbica (Fig. 2a), una longitud DyVO4EG29 DyVO4EG28 DyVO4EG27 100 nm a b c CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 98 media de arista de 67 nm y un valor de Dh de 81 nm, por lo que se eligió esta muestra (denominada en adelante DyV67) para estudios posteriores. La estructura cristalina de dichas NPs se analizó mediante DRX. En la Fig. 5 se presenta el diagrama de difracción obtenido que consiste en un conjunto de reflexiones compatibles con el patrón correspondiente a la fase tetragonal de DyVO4 (PDF: 01-076-2476). La ausencia otras reflexiones adicionales indicó que no estaban presentes otras fases cristalinas y, por tanto, un alto grado de pureza. Utilizando la fórmula de Scherrer aplicada a la reflexión 2θ ≈ 33º, se obtuvo un valor de tamaño de cristalito de 16 nm que es notablemente inferior al tamaño de las NPs (67 nm), indicando que dichas NPs presentaban un carácter policristalino. Ello sugiere que probablemente se formaron por un proceso de agregación ordenada de unidades más pequeñas cuyo mecanismo se discute en la Sección 2.1.1. del Capítulo II. 20 40 60 80 2q (grados) PDF: 01-076-2476 DyV67 Figura 5. Diagrama de difracción de rayos X obtenido para la muestra DyV67, junto con el patrón de difracción correspondiente a la estructura tetragonal de DyVO4 (PDF: 01-076-2476). 3.1.2. Nanopartículas de molibdato de sodio y disprosio Para la síntesis de NPs uniformes de NaDy(MoO4)2, se adaptó un método desarrollado anteriormente para fabricar NPs esféricas de NaY(MoO4)2 basado en reacciones de precipitación homogénea en medio poliol,2 pero usando DyCl3 como precursor de Dy3+. Para ello, se prepararon dos CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 99 disoluciones en viales independientes con agitación magnética, una de ella contenía Na2MoO4 disuelto en una mezcla EG/H2O (1 mL H2O + 1,5 mL EG) y otra, DyCl3 disuelto en 2,5 mL de EG a ≈ 80 °C. Una vez enfriada esta última a temperatura ambiente, se mezclaron ambas disoluciones. Las concentraciones de Dy3+ y MoO42- en la disolución final fueron 0,02 M y 0,2 M, respectivamente. Una vez homogeneizada la mezcla, se envejeció durante 20 horas en una estufa convencional precalentada a 120 ºC. El precipitado obtenido consistió en NPs esféricas (Fig. 6a) con un tamaño medio de 23 nm ( = 4 nm) (Tabla 2) y un valor de Dh de 52 nm (PZ = -31 mV) (Tabla 2) que indicó que estaban dispersas en medio acuoso. Es importante indicar que, en este caso, la variación sistemática de la mayor parte de los parámetros experimentales (Tabla 2) no dio lugar a cambios apreciables en la forma (Fig. 6) de las NPs obtenidas, en comparación con las presentadas en la Fig. 6a, excepto al disminuir la proporción EG/H2O (de 4/1 a 2,5/2,5) que resultó en partículas irregulares (Fig. 6e). Tampoco se observaron cambios significativos en el tamaño de partícula ni mejoras en los valores de Dh. Por ello, se utilizaron para estudios posteriores las NPs de 23 nm (Fig. 6a) que constituyen la muestra, denominada a partir de aquí, DyMo23. CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 100 Tabla 2. Forma, tamaño medio, diámetro hidrodinámico (Dh) y potencial Z (PZ) de las partículas obtenidas usando diferentes condiciones experimentales. Las condiciones que conducen a la muestra óptima se encuentran sombreadas. σ: desviación estándar MW: horno asistido por microondas durante 30 min Fig. 6a 6b 6c 6d 6e 6f 6g 6h PZ (mV) -31 -23 -30 -22 - -36 -32 -32 Dh (nm) 52 143 93 85 - 52 44 1069 Tamaño (σ) (nm) 23 (4) 27 (9) 23 (4) 19 (2) - 19 (8) 17 (3) 21 (2) Forma Esférica Esférica Esférica Esférica Irregular Esférica Esférica Esférica T (ºC) 120 120 120 120 120 120 180 120 Fuente de calor Estufa Estufa Estufa Estufa Estufa Estufa Estufa MW EG/H2O (vol.) 4/1 4/1 4/1 4/1 2,5/2,5 4/1 4/1 4/1 [MoO42-] (M) 0,2 0,1 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 [Dy3+] (M) 0,02 0,02 0,01 0,04 0,02 0,02 0,02 0,02 Precursor de Dy3+ Dy(NO3)3 Dy(NO3)3 Dy(NO3)3 Dy(NO3)3 Dy(NO3)3 Dy(OAc)3 Dy(NO3)3 Dy(NO3)3 CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 101 Figura 6. Micrografías TEM de las NPs obtenidas empleando las condiciones indicadas en la Tabla 2. EG119 EG1 MA4 EG118 200 nm 200 nm a 200 nm 100 nm b c d e f gh CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 102 En la Fig. 7 se muestra el diagrama de DRX de dicha muestra. Aunque no se encontró en la base de datos cristalográfica ninguna referencia para la estructura del NaDy(MoO4)2, las reflexiones observadas son consistentes con la fase tetragonal del NaY(MoO4)2 (PDF: 01-082-2369), por lo que puede admitirse que las NPs obtenidas presentan una estructura tetragonal. Por otra parte, haciendo uso de la fórmula de Scherrer aplicada a la reflexión 2θ ≈ 29º, se obtuvo un valor de tamaño de cristalito de 23 nm, el cual es próximo al tamaño de las NPs, y sugiere, por lo tanto, que las NPs presentaban un carácter monocristalino, lo cual sugiere un modelo de crecimiento por difusión (Sección 2.1.1. del Capítulo II). 20 40 60 80 2q (grados) DyMo23 PDF: 01-082-2369 Figura 7. Diagrama de difracción de rayos X obtenido para la muestra DyMo23, junto con el patrón de difracción correspondiente a la estructura tetragonal de NaY(MoO4)2 (PDF: 01-076-2476). 3.1.3. Nanopartículas de volframato de sodio y disprosio Dada la similitud en composición y estructura del NaDy(MoO4)2 y el NaDy(WO4)2, para la síntesis de NPs uniformes de este último se siguió un procedimiento experimental muy similar al descrito en la sección anterior para la muestra DyMo23 sustituyendo el precursor Na2MoO4 por Na2WO4 e introduciendo ligeras variaciones en las concentraciones de los reactivos que fueron 0,02 M y 0,1 M en Dy3+ y WO42-, respectivamente. En estas condiciones se obtuvieron partículas con morfología poco definida, aunque próxima a la CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 103 esférica (Fig. 8a) y con una distribución estrecha de tamaños, siendo el tamaño medio de 14 nm y el valor de  = 3 nm (Tabla 3). Estas NPs presentaban un valor de Dh en suspensión acuosa (308 nm) muy superior a su tamaño medio (Tabla 3) indicando un alto grado de agregación. Este comportamiento no puede atribuirse a razones electrostáticas dado que el valor de PZ para esta dispersión fue suficientemente elevado (-26 mV) (Tabla 3) para proporcionar estabilización electrostática. Con objeto de obtener NPs uniformes y libres de agregación, se realizaron experimentos adicionales en los que se analizó el efecto de la variación de los parámetros de síntesis (naturaleza y concentración de los precursores, proporción EG/H2O, fuente de calentamiento y temperatura de reacción) sobre las características de las NPs precipitadas. Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 3. En primer lugar, se modificó la fuente de calentamiento empleando un horno asistido por microondas en lugar de una estufa convencional, y manteniendo constantes el resto de condiciones de síntesis. Ello dio lugar a partículas de morfología similar (Fig. 8b) de mayor tamaño medio (37 nm,  = 9 nm). El valor de Dh obtenido para una suspensión acuosa de dichas partículas fue 80 nm (PZ = -32 mV), el cual es sólo ligeramente superior a su tamaño medio indicando la ausencia de procesos de agregación significativos. Por tanto, en este sistema, el uso del horno asistido por microondas permite mejorar el grado de dispersión de las NPs, por lo que se mantuvo este modo de calentamiento en experimentos posteriores. El aumento de la temperatura de reacción, de 120 ºC a 220 ºC manteniendo constantes las condiciones anteriormente seccionadas, dio lugar a NPs con forma aproximadamente esférica (Fig. 8c) y tamaño medio (40 nm,  = 9 nm) similares a las sintetizadas a 120 ºC (37 nm), pero con un valor de Dh menor (68 nm, PZ = -39 mV). Debido a esta mejora en la dispersabilidad, el análisis de los efectos de los demás parámetros experimentales se llevó a cabo manteniendo la temperatura del horno microondas a 220 ºC. CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 104 Tabla 3. Forma, tamaño medio, diámetro hidrodinámico (Dh) y potencial Z (PZ) de las partículas obtenidas usando diferentes condiciones experimentales. Las condiciones que conducen a la muestra óptima se encuentran sombreadas. σ: desviación estándar MW: horno asistido por microondas durante 30 min Fig. 8a 8b 8c 8d 8e 8f 8g 8h PZ (mV) -26 -32 -39 - -39 - -37 -36 Dh (nm) 308 80 68 - 65 - 81 49 Tamaño (σ) (nm) 14 (3) 37 (9) 40 (9) - 39 (8) - 66 (7) 22 (4) Forma Cuasiesférica Cuasiesférica Cuasiesférica Heterogénea Cuasiesférica Irregular Cuasiesférica Cuasiesférica T (ºC) 120 120 220 220 220 220 220 220 Fuente de calor Estufa MW MW MW MW MW MW MW EG/H2O (vol.) 4/1 4/1 4/1 3/2 4/1 4/1 4/1 4/1 [WO42-] (M) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,3 0,1 0,1 [Dy3+] (M) 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,01 0,04 Precursor de Dy3+ Dy(NO3)3 Dy(NO3)3 Dy(NO3)3 Dy(NO3)3 Dy(OAc)3 Dy(NO3)3 Dy(NO3)3 Dy(NO3)3 CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 105 En dichas condiciones, la relación EG/H2O en la mezcla disolvente es un parámetro crítico para la obtención de las NPs perseguidas, ya que la variación de esta magnitud de 4/1 a 3/2, dio lugar a NPs con forma heterogénea (Fig. 8d) probablemente debido a los cambios en la cinética de precipitación y en el comportamiento frente a la agregación originados por la variación de las propiedades (viscosidad y constante dieléctrica) de dicha mezcla. (Sección 2.1.1 del Capítulo II). Sin embargo, un cambio en la naturaleza del precursor de disprosio no tuvo un efecto importante, ya que al emplear Dy(OAc)3 en lugar de Dy(NO3)3, no se observaron cambios significativos en la forma (Fig. 8e), ni en el tamaño medio (39 nm,  = 8 nm) ni en el valor de Dh (65 nm, PZ = -39 mV) de las partículas precipitadas. En cuanto al efecto de las concentraciones de reactivos, se observó que el aumento de la concentración de Na2WO4 de 0,1 a 0,3 M resultó en NPs irregulares (Fig. 8f). Por otra parte, una disminución la concentración de Dy(NO3)3 de 0,02 a 0,01 M condujo a un aumento del tamaño de las NPs (Fig. 8g) de 40 a 66 nm ( = 7 nm), y del valor de Dh de 68 a 81 nm (PZ = -37 mV), mientras que un aumento de dicha magnitud de 0,02 a 0,04 M, dio lugar a una disminución del tamaño de las NPs (Fig. 8h) de 40 a 22 nm ( = 4 nm) y del valor de Dh de 68 a 49 nm (PZ = -36 mV). Por tanto, a través de la variación de la concentración del precursor de Dy3+, es posible modular el tamaño y el valor de Dh de las NPs en un rango adecuado para que estas puedan ser empleadas en el campo de la biomedicina. Por ello, en este caso, se decidió considerar NPs con diferentes tamaños (22 y 66 nm) para evaluar el efecto de este parámetro sobre sus propiedades y, por tanto, sobre su aplicabilidad como AC. Estas muestras se denominarán a partir de aquí DyW22 y DyW66, respectivamente. CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 112 El análisis de estas muestras (DyP37 y DyP57) mediante DRX puso de manifiesto que ambas presentaban un conjunto similar de reflexiones (Fig. 11), todas ellas compatibles con la estructura tetragonal del DyPO4 (PDF: 00-026- 0593). Haciendo uso de la fórmula de Scherrer aplicada a la reflexión con 2θ ≈ 29º, se obtuvieron valores de tamaño de cristalito de 34 nm y 52 nm para las muestras DyP37 y DyP57, respectivamente. En ambos casos, estos valores son muy próximos al tamaño de las NPs, lo cual sugiere que las NPs presentaban un carácter monocristalino que sugiere su formación a través de un proceso de crecimiento difusivo (Sección 2.1.1. del Capítulo II). 10 20 30 40 50 60 2q (grados) DyP57 PDF: 00-026-0593 DyP37 Figura 11. Diagramas de difracción de rayos X obtenidos para DyP37 y DyP57, junto con el patrón de difracción correspondiente a la estructura tetragonal del DyPO4 (PDF: 00-026-0593). 3.2. Dispersabilidad en condiciones fisiológicas y funcionalización 3.2.1. Dispersabilidad de las nanopartículas prístinas La dispersabilidad de las NPs seleccionadas para cada sistema y suspendidas en PBS (pH = 7,4) fue evaluada a partir de medidas de los valores de Dh mediante DLS, obteniéndose en todos los casos valores de dicha CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 113 magnitud superiores a 700 nm (Figura), lo cual indica que todos ellas presentan un alto grado de agregación en medio fisiológico. 02000 4000 6000 DyV67 DyMo23 DyW22 DyW66 DyP57 DyP37 Intensidad (u.a.) Diámetro hidrodinámico (nm) (793 nm) (837 nm) (903 nm) (1080 nm) (1278 nm) (1106 nm) Figura 12. Curvas DLS y diámetro hidrodinámico (Dh) correspondientes a suspensiones en PBS a pH = 7,4 de NPs de distinta composición. Por tanto, ninguno de estos sistemas cumple el requisito de dispersabilidad necesario para su aplicación en técnicas de bioimagen. Por ello, se procedió a su funcionalización con PAA, para lo cual se seleccionó en primer lugar un procedimiento en una sola etapa (one-pot) por su simplicidad y rapidez. En los casos en que este procedimiento no tuvo éxito, se desarrolló un procedimiento más complejo en dos etapas (two steps). 3.2.2. Funcionalización de las nanopartículas con ácido poliacrílico 3.2.2.1. Funcionalización one-pot Este método de funcionalización se llevó a cabo de forma simultánea al proceso de síntesis de las partículas. Específicamente, se emplearon las mismas condiciones experimentales implicadas en la síntesis de las NPs que constituían las diferentes muestras seleccionadas para cada sistema (DyV67, DyMo23, DyW22, DyW66, DyP37 y DyP57) descritas en la sección anterior, pero añadiendo 2 mg·mL-1 de PAA a la disolución del precursor de Dy3+, ya que se ha reportado anteriormente que esta cantidad es suficiente para dotar de dispersabilidad a NPs de naturaleza similar.1, 4 CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 114 Nanopartículas de DyVO4. Las NPs obtenidas para este sistema en presencia de PAA presentaban una forma más esférica (Fig. 13a) que las obtenidas en ausencia de PAA (Fig. 2b) y un tamaño similar (66 nm, σ = 10) (Fig 13b). Figura 13. Micrografía TEM (a) y distribución del tamaño de partícula (b) de las NPs sintetizadas según las condiciones de la muestra DyV67, pero añadiendo 2 mg·mL-1 de PAA. El valor de Dh obtenido para dichas NPs en medio acuoso sólo fue ligeramente superior 106 nm (Fig. 14) a su tamaño medio indicando que la ausencia de una agregación significativa. También se observó que el valor de PZ medido después del proceso de funcionalización era superior (-61 mV a pH≈6) respecto a las NPs no funcionalizadas (PZ = -37 mV, Tabla 1). Este cambio del valor del PZ sugiere la presencia en la superficie de las NPs de moléculas de PAA, cuya ionización daría lugar a un aumento de la carga negativa. 0200 400 600 Intensidad (u.a.) Diámetro hidrodinámico (nm) 106 nm Pot. Z: - 61 mV Figura 14. Curva DLS, diámetro hidrodinámico y potencial Z correspondientes a una suspensión acuosas de las NPs sintetizadas según las condiciones de la muestra DyV67, pero añadiendo 2 mg·mL-1 de PAA. 200 nm 040 80 120 160 200 0 10 20 Frecuencia de NPs (%) Diámetro (nm) 66 nm (=10) ab 100 nm CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 115 Ello fue confirmado mediante espectroscopía FTIR. Así en el espectro de la muestra obtenida en presencia de PAA se detectaron bandas de absorción entre 1400 y 1550 cm-1, que no se observan en el espectro de las partículas obtenidas en ausencia de este polímero (Fig. 15a) y que pueden atribuirse a los modos vibracionales de tensión simétrico y asimétrico característicos de los aniones carboxilato del PAA, respectivamente.5 Mediante un análisis TG fue posible cuantificar la cantidad de PAA incorporado a las NPs. Como se observa en la Fig.15b, la curva TG de la muestra obtenida en ausencia de PAA, sólo mostró una pérdida de peso, que tuvo lugar principalmente en el rango de temperaturas 25-300 °C, la cual se debe a la liberación del agua adsorbida. Sin embargo, en el caso de la muestra obtenida en presencia de PAA, además de detectarse la liberación de agua, se observó, una pérdida de peso (9 %) en el intervalo de 300-800 °C, que puede atribuirse a la descomposición de las especies de PAA. Figura 15. Espectros FTIR (a) y curvas TG (b) para las muestras DyV67 y DyV67@PAA. Una vez funcionalizada dicha muestra (denominada en adelante DyV67@PAA), se procedió a evaluar el efecto del proceso de funcionalización sobre la dispersabilidad de las NPs en medio PBS (pH = 7,4). En estas condiciones, el valor de Dh obtenido mediante DLS (Fig. 16) es muy inferior (94 nm) al correspondiente a las NPs sin funcionalizar (1106 nm, Fig. 12) y similar al tamaño medio de las NPs (67 nm). Ello pone de manifiesto que mediante funcionalización de las NPs con PAA, estas pueden ser bien dispersadas a pH fisiológico. 4000 3000 2000 1000 DyV67@PAA Absorbancia (u.a.) Número de onda (cm-1) COO- DyV67 200 400 600 800 84 88 92 96 100 Peso (%) Temperatura (ºC) DyV67 DyV67@PAA 9 % ab CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 116 110 100 1000 Intensidad (u.a.) Diámetro hidrodinámico (nm) 94 nm Figura 16. Curva DLS y diámetro hidrodinámico para una suspensión de la muestra DyV67@PAA en PBS. Finalmente, el diagrama DRX obtenido para la muestra funcionalizada era similar al correspondiente a la muestra sin funcionalizar (Fig. 5), y, por tanto, también consistente con la estructura tetragonal del DyVO4. Nanopartículas de NaDy(MoO4)2. El proceso de funcionalización one-pot con PAA aplicado a las NPs que constituyen la muestra DyMo23 no tuvo éxito, ya que no se observó precipitación apreciable tras el proceso de síntesis. Aunque la causa de tal inhibición de la precipitación no ha sido establecida, podría estar relacionada con la disminución del pH producida por la adición del ácido poliacrílico que daría lugar a una protonación de los aniones MoO42- disminuyendo así la cantidad de dichos iones disponibles y, por tanto, ralentizando la precipitación. Nanopartículas de NaDy(WO4)2. Al emplear las condiciones de síntesis que dieron lugar a las NPs que constituían la muestra DyW66, pero añadiendo PAA a la disolución inicial, no se detectó una precipitación apreciable, lo cual podría atribuirse a la ralentización de la precipitación mencionada anteriormente para el sistema NaDy(MoO4)2. No obstante, en el caso de las NPs DyW22, sí se observó precipitación indicando que dicha ralentización fue menos efectiva, probablemente debido a la mayor concentración de iones Dy3+ implicada en el proceso de síntesis. Las NPs obtenidas presentaban una forma poco definida (Fig. 17a) y un tamaño CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 117 medio de 17 nm con una desviación estándar (σ = 4 nm) pequeña (Fig. 17b) que indica una distribución de tamaños estrecha. Estas características morfológicas son ligeramente distintas a las de las NPs obtenidas sin usar PAA como aditivo, lo cual parece confirmar la influencia de las moléculas de polímero en la cinética de precipitación y su intervención en los procesos de nucleación y/o crecimiento de las NPs. Figura 17. Micrografía TEM, b) distribución del tamaño de partícula obtenido a partir de micrografías TEM de las NPs sintetizadas según las condiciones de la muestra DyW22, pero añadiendo 2 mg·mL-1 de PAA. El valor de Dh obtenido (60 nm) mediante DLS (Fig. 18) para una suspensión acuosa (pH≈6) de estas NPs (PZ = -31 mV) indica que se encontraban razonablemente dispersas. 0200 400 600 Intensidad (u.a.) Diámetro hidrodinámico (nm) 60 nm Pot. Z: -31 mV Figura 18. Curva DLS y diámetro hidrodinámico para una suspensión de la muestra DyW22, pero añadiendo 2 mg·mL-1 de PAA. Como se muestra en la Fig. 19a, el espectro FTIR de las NPs sintetizadas en presencia de PAA, presenta las bandas características de los grupos carboxilato del PAA, ya descritas anteriormente para el caso de la 040 80 120 0 10 20 Frecuencia de NPs (%) Diámetro (nm) 17 nm (=4) ab 200 nm CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 118 muestra DyV67, las cuales no estaban presentes en el espectro de la muestra sin funcionalizar indicando el éxito del proceso de funcionalización. La comparación de las curvas TG obtenidas para las NPs sin funcionalizar y funcionalizadas (Fig. 19b) permiten cuantificar la cantidad de PAA incorporada en el segundo caso. Así, la curva de la muestra obtenida en ausencia de PAA (DyW22), sólo mostró una pérdida de peso en el intervalo 25- 300 °C como consecuencia de la liberación de agua adsorbida. Sin embargo, en el caso de la muestra funcionalizada con PAA (muestra denominada a partir de aquí DyW22@PAA), se detectó junto con la liberación de agua, una pérdida de peso adicional (4 %) en el intervalo de 300-800 °C, que puede atribuirse a la descomposición de las especies de PAA. Figura 19. Espectros FTIR (a) y curvas TG (b) para las muestras DyW22 y DyW22@PAA. Para comprobar el efecto de la funcionalización de las NPs de NaDy(WO4)2 sobre su dispersabilidad en PBS, se registró la curva DLS de una suspensión de las NPs funcionalizadas en dicho medio (Fig. 20). El valor de Dh obtenido (81 nm) es muy inferior al correspondiente a las NPs sin funcionalizar (903 nm, Fig. 12), lo cual pone de manifiesto el papel esencial de las moléculas de PAA sobre la dispersabilidad de las mismas en PBS. 4000 3000 2000 1000 Absorbancia (u.a.) Número de onda (cm-1) DyW22 DyW22@PAA COO- 200 400 600 800 92 94 96 98 100 Peso (%) Temperatura (ºC) DyW22@PAA DyW22 4 % ab CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 119 110 100 1000 10000 Intensidad (u.a.) Diámetro hidrodinámico (nm) 81 nm Figura 20. Curva DLS y diámetro hidrodinámico para una suspensión de la muestra DyW22@PAA en PBS. Finalmente, hay que mencionar que la muestra funcionalizada presentaba un diagrama DRX similar al de la muestra sin funcionalizar (Fig. 9) consistente con la fase tetragonal del NaDy(WO4)2. Nanopartículas de DyPO4. Empleando las condiciones de síntesis que dieron lugar a las NPs que constituían la muestra DyP37 pero añadiendo PAA a la disolución inicial, se obtuvieron NPs uniformes (Fig.21a). Figura 21. Micrografía TEM (a) y distribución del tamaño de partícula (b) de las NPs sintetizadas según las condiciones de la muestra DyP37, pero añadiendo 2 mg·mL-1 de PAA. Curva DLS y diámetro hidrodinámico para una suspensión de dichas NPs a pH≈6 (c). Espectro FTIR (d) de la muestra presentada en (a). 0750 1500 2250 3000 Intensidad (u.a.) Diámetro hidrodinámico (nm) 245 nm Pot. Z: - 37 mV 050 100 150 0 5 10 15 20 25 Frecuencia de NPs (%) Diámetro (nm) 98 nm (=16) a b c 4000 3000 2000 1000 Absorbancia (u.a.) Número de onda (nm) d 500 nm CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 120 Estas NPs presentaron un tamaño medio de 98 nm (Fig. 21b) que es superior al de las NPs sin funcionalizar y un valor de Dh en suspensión acuosa (pH≈10) de 245 nm (PZ = -37 mV) (Fig.21c), el cual indica que el proceso de funcionalización induce la agregación de las mismas. Hay que señalar que mediante FTIR (Fig. 21d) se observó que la muestra no presentaba las bandas características de los grupos carboxilatos del PAA. El comportamiento de la muestra DyP57 fue similar. Estos resultados ponen de manifiesto que este método de funcionalización no es adecuado para este sistema. 3.2.2.2. Funcionalización two steps. Para los sistemas basados en NaDy(MoO4)2 (muestra DyMo23) y DyPO4 (muestras DyP37 y DyP57), para los cuales no funcionó el procedimiento de funcionalización one-pot se utilizó un método de funcionalización consistente en recubrir las NPs previamente sintetizadas con moléculas de PAA. Nanopartículas de DyPO4. El procedimiento experimental seguido para la deposición de moléculas de PAA sobre la superficie de las NPs correspondientes a las muestras DyP37 y DyP57, mediante interacciones iónicas, se detalla en la Sección 2.2. del Capítulo II. En ambos casos, este tratamiento de funcionalización fue efectivo como puede observarse en las Figs. 22c y d, en las que se presentan los espectros FTIR de las NPs antes y después del recubrimiento con PAA. Así, para ambas muestras, los espectros de las NPs registrados después de la funcionalización mostraban bandas de baja intensidad entre 1400 y 1500 cm-1 que pueden asignarse a las vibraciones de los grupos carboxilato de las moléculas de PAA,6 demostrando el éxito del proceso de funcionalización. Mediante análisis termogravimétrico se cuantificó la cantidad de PAA adsorbida. Así, las curvas TG obtenidas para las muestras DyP37 y DyP57 antes de la funcionalización con PAA (Figs.22e y f, respectivamente) únicamente mostraron una primera pérdida de peso (6 %), correspondiente a la eliminación del agua adsorbida entre 100 y 300 ºC y una segunda, progresiva (1 %), entre 300 y 600 ºC que podría asignarse a la CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 121 descomposición de las moléculas de disolvente (butanol) residuales. Sin embargo, después de la funcionalización, se observó para ambas muestras (denominadas en adelante DyP37@PAA y DyP57@PAA, respectivamente.) una pérdida de peso más pronunciada (≈3 %) en el rango 300-600 ºC que puede asociarse a la descomposición de las moléculas de PAA. El proceso de funcionalización no afectó a las características morfológicas de las NPs (Figs. 22a y b). ni a la dispersabilidad de las mismas en suspensión acuosa (a pH≈7). Así, las muestras DyP37@PAA y DyP57@PAA presentaron valores de Dh de 85 y 105 nm (Figs. 22g y h), respectivamente, que son similares a los obtenidos en dichas condiciones para las muestras sin funcionalizar (106 y 142 nm) y que no son muy superiores a los tamaños de las NPs (37 y 57 nm), indicando la ausencia de agregación en estas condiciones. Este comportamiento estaría de acuerdo con los valores similares de potencial zeta medidos para las muestras antes (-42 y -40 mV, muestras DyP37 y DyP57, respectivamente) y después de la funcionalización (-45 y -52 mV, muestras DyP37@PAA y DyP57@PAA, respectivamente). El recubrimiento con PAA tuvo un efecto importante sobre la dispersabilidad de las NPs suspendidas en PBS, como se observa en las Figs. 22g y h en las que se presentan las curvas DLS obtenidas para las muestras funcionalizadas. Los valores de Dh medios obtenidos a partir de estas medidas (100 y 109 nm, para las muestras DyP37@PAA y DyP57@PAA, respectivamente) eran muy inferiores a los de las muestras sin funcionalizar (>1000 nm, Fig. 12), por lo que puede concluirse que el proceso de funcionalización mejoró notablemente la dispersabilidad de las NPs de DyPO4 en PBS. CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 128 de contraste favorecen r2 y que el área afectada por dichas inhomogeneidades aumenta a medida que aumenta el valor de Dh.9 Tabla 5. Tamaño medio obtenido a partir de micrografias TEM, diámetro hidrodinámico (Dh) en suspensión acuosa y relajatividad transversal (r2) de las NPs correspondientes a los distintos sistemas seleccionados. Finalmente, cabe mencionar que los valores de r2 obtenidos en esta tesis para las dos muestras basadas en fosfato de Dy son más altos que los reportados previamente para NPs basadas en distintos compuestos de Dy, tales como DyF3,10 NaDyF410, 11 o Dy2O312, que mostraron valores de r2 entre 100 y 380 mM-1s-1, por lo que darían lugar a mayor contraste de las imágenes MIR. 3.4. Estabilidad química Los estudios de estabilidad química de las muestras seleccionadas se llevaron a cabo empleando suspensiones de las NPs en medio PBS que fueron tratadas a 37 ºC, para simular el medio fisiológico. En el caso de los sistemas basados en matrices tipo molibdato y volframato (DyMo23@PAH@PAA y DyW22@PAA) se observó mediante TEM, que tras un día de tratamiento aparecieron partículas con forma fibrosa (Figs. 27a y b) que no estaban presentes en las muestras de partida. Además, el análisis mediante ICP de los sobrenadantes obtenidos tras centrifugar las Sistema Muestra Tamaño (nm) Dh (nm) r2 (mM-1s-1) DyVO4 DyV67@PAA 67 81 383 NaDy(WO4)2 DyW22@PAA 17 60 106 NaDy(MoO4)2 DyMo23@PAH@PAA 23 59 290 DyPO4 DyP37@PAA 37 85 432 DyP57@PAA 57 105 516 CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 129 suspensiones reveló la presencia de altas cantidades de Mo y W (39,5 y 20,0 % molar, respectivamente, respecto al contenido inicial de las mismas), indicando que dichas NPs tienden a disolverse en condiciones fisiológicas. Hay que mencionar que la tendencia a la disolución de estas partículas es incluso superior a la reportada para NPs de diversos fluoruros de tierras raras (liberación de F- = 15-25 %), 13 por lo que tampoco serían adecuadas para su uso como ACs. Figura 27. Micrografías TEM obtenidas para las muestras DyMo23@PAH@PAA (a) y DyW22@PAA (b) tras tratarlas durante 1 día en PBS a 37 ºC. Sin embargo, para las NPs basadas en las matrices tipo vanadato y fosfato (muestras DyV67, DyP37 y DyP57) no se observaron variaciones significativas de su morfología (Figs. 28a, b y c) tras 5 semanas de tratamiento. Además, la cantidad de V o P determinada mediante análisis ICP de los sobrenadantes respecto al contenido inicial de las suspensiones era insignificante (0,8 % molar para la muestra DyV67@PAA, 1,7 % molar para la muestra DyP37@PAA y 2,1 % molar para la muestra DyP57@PAA). Estos datos indican que no se produjo una disolución significativa de estas NPs durante el tratamiento y que, por tanto, cumplen el requisito de estabilidad química para ser empleadas en biomedicina. a b 50 nm CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 130 Figura 28. Micrografías TEM obtenidas para las muestras DyV67@PAA (a), DyP37@PAA (b) y DyP57@PAA (c) tras tratarlas durante 5 semanas en PBS a 37 ºC. 3.5. Biocompatibilidad y comportamiento in vivo A la vista de los resultados obtenidos de la evaluación de la relajatividad y estabilidad química, para los estudios de viabilidad celular y del comportamiento in vivo que se presentan a continuación, se seleccionó la muestra DyP57@PAA por presentar el valor óptimo de r2 (516 mM-1s-1) siendo químicamente estable. 3.5.1. Funcionalización con polietilenglicol Previamente a la evaluación de la biocompatibilidad y del comportamiento in vivo de las NPs que constituyen la muestra DyP57@PAA, estas se recubrieron con ɑ-metoxi-ω-amino polietilenglicol (PEG) con el fin de mejorar su tiempo de circulación sistémica y evitar su eliminación por el sistema inmunitario.14 Para ello, fue necesario utilizar una mayor cantidad de PAA (10 mg mL-1) en el proceso de funcionalización que la considerada en los estudios anteriormente descritos, para así aumentar el número de grupos carboxilato en la superficie de las NPs que son necesarios para su reacción mediante la química de la carbodiimida con los grupos amino de ɑ-metoxi-ω- amino polietilenglicol. En la Fig. 29a se presentan los espectros FTIR de las NPs recubiertas con ɑ-metoxi-ω-amino PEG y del ɑ-metoxi-ω-amino PEG puro. En el espectro de las primeras se observan varias bandas correspondientes al ɑ-metoxi-ω- abc 50 nm CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 131 amino PEG (marcadas con asterisco) entre las que no se encuentran las asociadas a vibraciones de tensión de aminas alifáticas que aparecen a 1282 y 1242 cm-1 en el espectro del ɑ-metoxi-ω-amino PEG puro (marcadas en rojo). Ello prueba la formación de enlaces amida entre los grupos carboxilato y las moléculas de ɑ-metoxi-ω-amino PEG y, por tanto, el éxito del proceso de recubrimiento. Ha de destacarse que la banda característica del grupo amida solapa con la del agua en la región 1640-1650 cm-1 por lo que no puede identificarse claramente. Figura 29. a) Espectros FTIR de las NPs DyP57@PAA recubiertas con ɑ-metoxi-ω- amino PEG. También se presenta el espectro FTIR del ɑ-metoxi-ω-amino PEG puro con fines comparativos. b) Diámetro hidrodinámico y curva DLS de una suspensión en PBS de NPs DyP57@PAA@PEG. En la Fig. 29b se presenta la curva DLS de las NPs funcionalizadas con ɑ-metoxi-ω-amino PEG y dispersadas en PBS, de la cual se obtuvo un valor de Dh de 164 nm, el cual indica la ausencia de una agregación importante en dicho medio. A partir de aquí, esta muestra se denominará DyP57@PAA@PEG. 3.5.2. Análisis de la viabilidad celular La evaluación del comportamiento citotóxico de la muestra DyP57@PAA@PEG se llevó a cabo empleando la línea celular de fibroblastos de prepucio humano HFF-1. Dicha evaluación incluyó varios estudios tales como el análisis de la morfología celular mediante microscopia óptica, de la inducción de células necróticas/apoptóticas tardías y de la actividad mitocondrial de las células en presencia de dichas NPs. 4000 3000 2000 1000 Absorbancia (u.a.) Número de onda (cm-1) PEG DyP57@PAA@PEG * * * * 0200 400 600 800 1000 Intensidad (u.a.) Diámetro hidrodinámico (nm) 164 nm a b CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 132 Al fusionar las imágenes de microscopía de campo claro, con las de fluorescencia correspondientes a la tinción DAPI (azul, células vivas) y TOPRO-3 (rojo, células muertas) (Figs. 30a-c), se observó que las células expuestas a una concentración de NPs de hasta 100 µg/mL (referida a Dy3+), no mostraban ningún cambio morfológico apreciable. Figura 30. Ensayos de citotoxicidad para la muestra DyP57@PAA@PEG: Imágenes de microscopía óptica de fibroblastos HFF-1 resultantes de la fusión de imágenes de campo claro (gris), con tinción DAPI (azul) y tinción TO-PRO-3 (rojo): a) control negativo, b) control positivo, c) células expuestas a 100 µg/ml de Dy. La barra de escala corresponde a 50 µm. Número total de células por pocillo (d), porcentaje de células muertas (e) y ensayo MTT (f) de células expuestas a concentraciones crecientes de NPs. a b c 0 1000 2000 3000 Nº total de células 0.1 1 10 50 100 [Dy] (ug/mL) C. Neg. C. Pos. 0 20 40 60 80 100 120 Viabilidad celular (%) 0.1 1 10 50 100 [Dy] (mM) C. Neg. C. Pos. 0 20 40 60 80 100 Células muertas (%) 0.1 [Dy] (mM) 110 50 100 C. Neg. C. Pos. d e f CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 133 La necrosis celular, evaluada mediante el recuento del número total de células en el ensayo vivo-muerto (Fig. 30d), también puede descartarse, ya que no se produjo una disminución estadísticamente significativa (p<0,05) en el número de células para ninguna de las concentraciones de Dy ensayadas (≤100 µg/mL). Tampoco se observaron diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) entre el porcentaje de células muertas cuando se exponen a las diferentes concentraciones de Dy ensayadas (≤100 µg/mL) y el correspondiente al control negativo, indicando la ausencia de apoptosis (Fig. 30e). Por último, no se observó ningún efecto estadísticamente significativo sobre la actividad mitocondrial mediante el ensayo MTT, ya que la supervivencia celular fue superior al 70 % (Fig. 30f) que es el límite por debajo del cual se considera que las NPs son potencialmente citotóxicas (norma UNE- EN ISO 10993-5:2009)15. Estos resultados indican claramente que las NPs de DyPO4 funcionalizadas con PAA y ɑ-metoxi-ω-amino PEG (muestra DyP57@PAA@PEG), no son tóxicas en las condiciones ensayadas y, por tanto, serían aptas para su uso como sondas en aplicaciones de bioimagen. 3.5.3. Evaluación del comportamiento in vivo Dado que según la teoría mecano-cuántica (Apéndice I), la naturaleza y el espesor de la capa de funcionalización puede afectar a la relajatividad transversal, previamente a la evaluación del comportamiento in vivo de la muestra DyP57@PAA@PEG, se procedió a comprobar el efecto del recubrimiento con PEG sobre la efectividad de las mismas como ACs T2 para MRI a alto campo. El valor de r2 obtenido para dicha muestra (Fig. 31a) fue algo inferior (438 mM-1-s-1) al de la muestra sin recubrir con PEG (516 mM-1-s-1). Ello puede explicarse según la teoría mecano-cuántica de la relajatividad, según la cual r2 disminuye al aumentar el grosor de la capa superficial de funcionalización de CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 134 las NPs, como cabría esperar, en este caso, debido a la adición de PEG. No obstante, aunque el valor de r2, las imágenes phantom obtenidas para diferentes suspensiones acuosas con distinta concentración de Dy (Fig. 31b), presentan un oscurecimiento significativo al aumentar la concentración de NPs, lo cual indica que las NPs recubiertas con PEG son adecuadas para su uso como agentes de contraste negativo en MRI a alto campo. Figura 31. Representación de la velocidad de relajación trasversal (1/T2) en función de la concentración de Dy3+(a) e imágenes phantom de MRI a 9,4 T obtenidas para suspensiones acuosas con diferentes concentraciones (mM de Dy3+) de la muestra DyP57@PAA@PEG. Para la evaluación del comportamiento in vivo, se inyectó por vía intravenosa a ratones BALB/c una cierta cantidad de la muestra DyP57@PAA@PEG suspendida en PBS, correspondiente a una concentración de 5 mg Dy/kg animal. Posteriormente se obtuvieron imágenes de resonancia magnética dinámica ponderada en T2 y mapas cuantitativos en T2 a un campo de 9,4 T. Mediante el analisis de las primeras, se obtuvo información sobre la farmacocinética a corto plazo, observándose una rápida captación hepática (hígado) y esplénica (bazo), y una despreciable acumulación en los riñones 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0 25 50 75 100 125 1/T2 (s-1) Concentration (mM) [Dy] (mM) r2=438 mM-1s-1 a Dy [mM]0 0.01 0.03 0.06 0.12 0.25 b CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 135 (Fig. 32). Hay que destacar que la captación hepática fue notablemente mayor y más rápida que la esplénica, lo que concuerda con la farmacocinética de captación descrita para otras NPs recubiertas con PEG en el mismo intervalo de tamaño.16 Este comportamiento puede explicarse por una mayor afinidad endocítica/fagocítica de los nanomateriales por parte de las células de Kupffer en comparación con los macrófagos esplénicos.17 Figura 32. Farmacocinética a corto plazo de las NPs correspondientes a la muestra Dy57@PAA@PEG inyectadas por vía intravenosa (5 mg Dy/kg animal) determinada mediante MRI dinámica ponderada en T2. (a) hígado, (b) bazo y (c) riñón. El músculo (gris) se representa como referencia en todos los casos. La farmacocinética se evaluó a largo plazo (24 h) mediante el análisis de mapas cuantitativos en T2 (Fig. 33a), observándose un drástico incremento de la velocidad de relajación transversal, R2 (1/T2), en el hígado y en el bazo 1 hora después de la inyección de las NPs, con ∆R2 de 24 s-1 y 14 s-1, respectivamente (Fig. 33b). Después de 24 h, seguía retenida una cierta cantidad de NPs, tanto en el hígado como en el bazo, como evidencian sus valores de ∆R2 (6,6 s-1 y 12,3 s-1, respectivamente). Por otra parte, la cuantificación post-mortem del contenido de las NPs que constituyen la muestra DyP57@PAA@PEG en extractos tisulares mediante ICP (Fig. 33c) confirmó los resultados de la resonancia magnética, mostrando altas concentraciones de Dy en el hígado (115 g Dy/ Kg de tejido) y mucho menores en el bazo (29 g Dy/ Kg de tejido), que correspondían a ≈23 % y ≈0,6 % respecto a la dosis inyectada, respectivamente. En cuanto a los riñones, se observó un ligero decaimiento de T2 (∆R2 = 4 s-1) 1 h después de la inyección de NPs, que puede atribuirse al paso de las NPs restantes por el torrente sanguíneo. Como era de esperar, los valores de T2 renales volvieron a la normalidad a las 24 horas, lo Mejora relativa (%) Tiempo (min) Tiempo (min) Tiempo (min) Hígado Músculo Bazo Músculo Riñones Músculo Mejora relativa (%) Mejora relativa (%) CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 136 que concuerda con la ausencia de NPs en el torrente sanguíneo a partir de ese momento. Figura 33. Imágenes representativas de MRI ponderada en T2 a diferentes tiempos tras la inyección intravenosa de las NPs que constituyen la muestra Dy57@PAA@PEG (5 mg Dy/kg animal) (a). Cambios ∆R2 en hígado, bazo, riñón y músculo calculados a partir de imágenes MRI ponderadas en T2 a diferentes tiempos (b). Concentraciones absolutas y relativas (g de Dy/Kg de tejido y % respecto a la dosis inyectada) en hígado y bazo a las 24 h tras la inyección de las NPs. (c). Así pues, la evaluación in vivo de las NPs constituidas por DyPO4 y recubiertas con PAA y PEG demostró que se comportan como un agente de contraste negativo eficiente para MRI a alto campo y que, según los estudios de biodistribución, el principal mecanismo de eliminación de estas NPs del torrente sanguíneo será vía hepatobiliar, tal y como se esperaba debido a su naturaleza nanoparticulada.17 3.5.4. Histología Por último, se llevó a cabo un análisis histológico de los principales órganos para evaluar la toxicidad in vivo de las NPs que constituyen la muestra DyP57@PAA@PEG, ya que como se mencionó en la introducción de esta tesis Bazo Riñones Hígado Hígado Bazo Riñón Músculo ΔR2(s-1) g de Dy/Kg de tejido % Dy respecto a la dosis inyectada CAPÍTULO III: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI A ALTO CAMPO 137 doctoral, es conveniente complementar los resultados obtenidos de los ensayos in vitro, con esta evaluación post-mortem. Tal y como puede observarse en la Fig. 34, los órganos analizados (hígado, riñón, bazo y pulmón) presentaban una arquitectura celular normal, comparable a la de los controles (inyectados con disolución salina), sin cambios histopatológicos observables que indiquen daño tisular.18 Estos resultados junto con los obtenidos de los ensayos citotóxicos, demuestran que las NPs que constituyen la muestra DyP57@PAA@PEG son biocompatibles bajo las condiciones ensayadas y, por lo tanto, pueden usarse como AC para MRI a alto campo. Figura 34. Tinción H&E de secciones de tejido de hígado, riñón, bazo y pulmón inyectadas con disolución salina (control) y con las NPs que constituyen la muestra Dy57@PAA@PEG. 3.6. Conclusiones 1. Empleando métodos de precipitación homogénea en medio alcohólico se han obtenido partículas uniformes con diferentes morfologías de DyVO4, NaDy(WO4)2, NaDy(MoO4)2 y DyPO4 cuyo tamaño pudo ajustarse en el rango nanométrico (< 100 nm). 2. Todas las nanopartículas cristalizaron con estructura tetragonal, siendo todas ellas monocristalinas, a excepción de las basadas en DyVO4, que presentaban un carácter policristalino. 3. Todas las nanopartículas pudieron ser funcionalizadas con ácido poliacrílico mediante procedimientos one-pot (DyVO4 y NaDy(WO4)2) o two steps (DyPO4 y NaDy(MoO4)2). 250 μm CAPÍTULO IV: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI DUAL T1-T2 144 Teniendo en cuenta estas consideraciones se decidió abordar un estudio comparativo de las dos arquitecturas mencionadas anteriormente (Fig. 1) con objeto de obtener agentes de contraste para MRI dual T1-T2 con propiedades magnéticas óptimas. 4.2. Síntesis y caracterización 4.2.1. Nanopartículas de fase única Para sintetizar NPs con iones Gd3+ e iones Dy3+ integrados en una única fase (Fig. 1a), se empleó un método de precipitación homogénea usado previamente para sintetizar NPs de DyVO4 que fue ligeramente modificado. El procedimiento experimental consiste en el envejecimiento a 120 ºC durante 20 h de disoluciones en una mezcla EG/H2O (relación volumétrica: 3,5:1,5) que contenían Dy(NO3)3 (0,02 M), Gd(NO3)3 (0,01 M), PAA (2 mg·mL-1) y Na3VO4 (0,1 M). Las NPs obtenidas presentaron una forma esférica (Fig. 2a) con un diámetro medio de 36 nm (Fig. 2b) y una distribución de tamaños estrecha (σ = 6, Fig. 2b). Figura 2. Micrografía TEM (a) y distribución del tamaño de partícula (b) de las NPs que contienen Dy3+ y Gd3+ coprecipitados en forma de disolución sólida. El diagrama de DRX de estas NPs se ajustó a los patrones de las fases DyVO4 y GdVO4, ambas con estructura tetragonal (Fig. 3), los cuales son casi indistinguibles dada la similitud de radios iónicos de los dos cationes lantánidos (1,03 para el Dy3+ y 1,05 para el Gd3+, en coordinación VIII).5 020 40 60 80 100 0 10 20 30 Frequencia de NPs (%) Diámetro (nm) 36 nm (=6) a b 100 nm CAPÍTULO IV: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI DUAL T1-T2 145 20 40 60 2q (degree) DyVO4 PDF: 96-152-6061 GdVO4 PDF: 96-152-7825 Figura 3. Diagrama de DRX de las NPs que contienen Dy3+ y Gd3+ coprecipitados en forma de disolución sólida. También se incluyen los patrones de las fases DyVO4 (PDF: 01-076-2476) y GdVO4 (PDF: 96-152-7825) tetragonales. Los mapas de composición obtenidos mediante EDS (Fig. 4a-c) para una nanopartícula (Fig. 4d) confirmaron la incorporación de los iones Dy3+ y Gd3+ por coprecipitación en una única fase, ya que en ellos se observó una distribución homogénea tanto de Dy como de Gd en el interior de la NP, que también fue detectada mediante en el perfil de composición mostrado en la Fig. 4e. Figura 4. Mapas composicionales (a, b y c), micrografía STEM (d) y perfil de composición(e) obtenidos mediante EDS tras la coprecipitación de los iones Gd3+ y Dy3+ en NPs de una única fase. 20 nm 010 20 30 40 50 60 Intensidad (u.a.) Posición (nm) Dy Gd e d Dy Gd GdDy a b c CAPÍTULO IV: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI DUAL T1-T2 146 Los análisis mediante ICP indicaron que las NPs contenían un 63,4 % molar de Dy (relación molar Dy3+/(Dy3++Gd3+)) y un 36,5% de Gd (relación molar Gd3+/ (Dy3++Gd3+)) y, por tanto, una relación molar Dy3+/Gd3+ = 1,6. Por último, el espectro FTIR (Fig. 5a) de esta muestra, denominada a partir de aquí, DyGd, presentó bandas entre 1600 y 1400 cm-1 que son características de los aniones carboxilato procedentes del PAA, confirmando la incorporación de este polímero a las NPs durante el proceso de síntesis. La curva TG obtenida para dichas NPs (Fig. 5b) indicó que contenían un 4 % en peso de PAA incorporado, que corresponde a la pérdida de peso detectada en el rango de temperatura comprendido entre 300 y 800 ºC. Figura 5. Espectro FTIR (a) y curva TG (b) obtenidos para la muestra DyGd. 4.2.2. Nanopartículas con arquitectura núcleo-corteza Siguiendo el procedimiento descrito en la Sección 3.2.2.1. del Capítulo III, se sintetizaron NPs de DyVO4 para ser utilizadas como núcleos que serían recubiertos posteriormente con una corteza de GdVO4. Los núcleos de DyVO4 presentaron una forma esférica (Fig. 6a) y un tamaño medio de 50 nm con una distribución de tamaños estrecha, σ = 6 (Fig. 6b). 4000 3000 2000 1000 Absorbancia (u.a.) Número de onda (cm-1) 200 400 600 800 92 96 100 Peso (%) Temperatura (ºC) 4,0 % PAA 1800 1600 1400 1200 COO- a b CAPÍTULO IV: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI DUAL T1-T2 147 Figura 6. Micrografías TEM (a) y distribución del tamaño de partícula (b) de las NPs de DyVO4 utilizadas como núcleos. Micrografías TEM (c) y distribución del tamaño de partícula (d) de las NPs de DyVO4 recubiertas con una corteza de GdVO4. Para la deposición de la corteza de GdVO4 sobre los núcleos de DyVO4, se dispersaron 30 mg de estos últimos en una disolución que contenía Gd(NO3)3 (0,02 M), Na3VO4 (0,1 M) y PAA (4 mg·mL-1) en una mezcla EG/H2O (3,5 mL de EG + 1,5 mL de H2O). Finalmente, esta dispersión fue envejecida en una estufa convencional a 120 ºC durante 20 h. Este proceso de recubrimiento dio lugar a NPs esféricas (Fig. 6c) cuyo tamaño medio fue superior (55 nm, σ = 11, Fig. 6d) al de los núcleos (50 nm, σ = 6, Fig. 6b), lo cual sugiere el éxito del proceso de recubrimiento que fue corroborado mediante análisis EDS. Así, tanto los mapas composicionales obtenidos mediante EDS (Fig. 7a-c) de una única NP (Fig. 7d) como su correspondiente perfil (Fig. 7e), claramente indicaron la presencia de Gd3+ en su parte externa, mientras que los iones Dy3+ se encontraban en su parte central. 020 40 60 80 100 0 10 20 30 Frecuencia de NPs (%) Diámetro (nm) 50 nm (=6) ab c 020 40 60 80 100 0 5 10 15 20 Frecuencia de NPs (%) Diámetro (nm) 55 nm (=11) d 100 nm 100 nm CAPÍTULO IV: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI DUAL T1-T2 148 Figura 7. Mapas composicionales (a, b y c), micrografía STEM (d) y perfil de composición(e) obtenidos mediante EDS tras el recubrimiento de las NPs de DyVO4 con GdVO4. La presencia de la cubierta de GdVO4 no pudo ser detectada mediante DRX, ya que el difractograma obtenido para las NPs con arquitectura núcleocorteza es consistente tanto con la fase DyVO4 tetragonal como con la fase de GdVO4 tetragonal (Fig. 8a), las cuales son difícilmente distinguibles mediante esta técnica, como se ha mencionado anteriormente. La composición cuantitativa de estas NPs núcleo-corteza obtenida mediante análisis ICP reveló que el contenido en Dy y Gd (relaciones molares Dy3+/(Dy3++Gd3+) o Gd3+/(Dy3++Gd3+)) era del 63,7 % y 36,4 %, respectivamente, lo cual indica una relación molar Dy3+/Gd3+ = 1,6, muy similar a la obtenida para la arquitectura de fase única. Ello permite comparar y evaluar las relajatividades magnéticas de ambos tipos de NPs. 020 40 60 80 Intensidad (u.a.) Posición (nm) Dy Gd 20 nm e d Dy Gd GdDy a b c CAPÍTULO IV: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI DUAL T1-T2 149 20 40 60 2q (grados) DyVO4 PDF: 01-076-2476 GdVO4 PDF: 96-152-7825 Figura 8. Diagrama de DRX de las NPs de DyVO4 tras su recubrimiento con GdVO4. También se incluyen los patrones de las fases DyVO4 (PDF: 01-076-2476) y GdVO4 (PDF: 96-152-7825) tetragonales. Finalmente, la presencia de moléculas de PAA sobre la superficie de las NPs fue confirmada mediante espectroscopía FTIR. Así, en el espectro de esta muestra se observaron las bandas características de los grupos carboxilatos del PAA en el rango 1600-1400 cm-1 (Fig. 7b). La cantidad de polímero incorporada fue del 4,6 % en peso, de acuerdo con la pérdida de masa detectada en el rango 300-800 ºC determinada a partir de la curva TG (Fig. 7c). En adelante, esta muestra constituida por NPs de DyVO4 recubiertas por una corteza de GdVO4 se denominará Dy@Gd. Figura 9. Espectro FTIR (a) y curva TG (b) de las NPs de DyVO4 tras su recubrimiento con GdVO4. 200 400 600 800 92 96 100 Peso (%) Temperatura (ºC) 4,6 % PAA a 4000 3000 2000 1000 Absorbancia (u.a.) Número de onda (cm-1) 1800 1600 1400 1200 COO- b CAPÍTULO IV: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI DUAL T1-T2 150 4.3. Relajatividades magnéticas Las relajatividades magnéticas medidas a 9,4 T para las arquitecturas ensayadas se presentan en la Fig. 10. En ella puede observarse en primer lugar que los valores de r1 obtenidos para ambas arquitecturas son muy similares (0,663 mM-1s-1 para la muestra DyGd y 0,707 mM-1s-1 para la muestra Dy@Gd). Por otra parte, el valor de r2 obtenido para la muestra DyGd constituida por las NPs formadas por una única fase es inferior (258,0 mM-1s-1) que para la muestra Dy@Gd constituida por las NPs con arquitectura núcleo-corteza (454,06 mM- 1s-1), lo cual podría atribuirse al mayor tamaño de partícula de esta última (Apéndice I). Hay que resaltar que la efectividad de un AC para MRI dual T1-T2 depende no sólo de los valores de r1 y r2 sino también de la relación r2/r1. Así, esta magnitud debe presentar valores próximos a 1 para los ACs T1,6-8 superiores a 10 para los ACs T29, 10 e intermedias entre 1 y 10 para los ACs T1-T2.6 Para las NPs de este estudio, el valor del cociente r2/r1 es muy superior a 10, tanto para la muestra DyGd (389) como para la muestra Dy@Gd (642), lo cual indica que ninguna de ellas es apropiada para la obtención de imágenes mediante MRI dual T1-T2. Figura 10. Velocidad de relajación longitudinal (a) y transversal (b) frente a la concentración de (Dy3++Gd3+) obtenidas a 9,4 T para las muestras DyGd (azul) y Dy@Gd (rojo). Dado que la mayor parte de los escáneres clínicos usados para humanos funcionan a campos magnéticos ≤ 3 T, se decidió llevar a cabo un estudio de DyGd Dy@Gd 1/T1 (s-1) [Dy3++Gd3+] (mM) y=0,663x0,321 R2=0,969 y=0,707x+0,324 R2=0,971 0 0,5 1 0,5 0,75 1 0 50 100 150 200 250 y=454,06x-4,93 R2=0,995 DyGd Dy@Gd 1/T2 (s-1) [Dy3++Gd3+] (mM) y=258,00x-1,78 R2=0,998 0 10,5 ab CAPÍTULO IV: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI DUAL T1-T2 151 las relajatividades a 1,44 T, para así evaluar la potencialidad de las arquitecturas desarrolladas como ACs para MRI dual T1-T2 en estas condiciones. Figura 11. Velocidad de relajación longitudinal (a) y transversal (b) frente a la concentración de (Dy3++Gd3+) obtenidas a 1,44 T para las muestras DyGd (azul) y Dy@Gd (rojo). En la Fig 11a se puede observar que, en estas condiciones, los valores de r1 aumentaron (0,937 mM-1s-1 para la muestra DyGd y 1,558 mM-1s-1 para la muestra Dy@Gd) y los valores de r2 disminuyeron (5,394 mM-1s-1 para la muestra DyGd y 10,248 mM-1s-1 para la muestra Dy@Gd) respecto a los resultados obtenidos a 9,4 T. Este comportamiento se ajusta al predicho por las ecuaciones de Solomon-Bloembergen-Morgan y por la teoría mecano-cuántica que explican el valor de r1 y r2, respectivamente (Apéndice I). En dicha figura también se observa que los valores de, tanto de r1 como de r2, de la muestra con arquitectura núcleo-corteza (Dy@Gd) eran superiores (1,558 y 10,248 mM-1s-1, respectivamente) a los de la muestra DyGd obtenida por coprecipitación (0,937 y 5,394 mM-1s-1, respectivamente). Para explicar estas diferencias de relajatividad es necesario considerar que, la mayor contribución a r1 viene dada por los iones Gd3+ que presentan un momento angular de espín (7/2) mayor que el Dy3+ (5/2), mientras que la mayor contribución a r2 viene dada por los iones Dy3+, ya que presentan un momento magnético (10,65 μB) mayor que el que poseen los iones Gd3+ (7,29 μB) (Apéndice I). Por tanto, el mayor valor de r2 que presentaron las NPs con arquitectura núcleo-corteza puede deberse al mayor tamaño de sus núcleos (50 0 4 8 12 DyGd Dy@Gd 1/T2 (s-1) [Dy3++Gd3+] (mM) y=5,394x+0,423 R2=0,999 y=10,248x+0,377 R2=0,999 0 10,5 0 1 2 y=1,558x+0,219 R2=0,985 DyGd Dy@Gd 1/T1 (s-1) [Dy3++Gd3+] (mM) y=0,937x+0,324 R2=0,922 0,50 1 ab CAPÍTULO IV: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI DUAL T1-T2 152 nm) en los que se encuentran los iones Dy3+ en comparación al tamaño inferior (36 nm) que presentan las NPs que incorporan Dy3+ y Gd3+ en una única fase, ya que según la teoría mecano-cuántica de la relajatividad, r2 debe aumentar al aumentar el tamaño de partícula (Apéndice I). Por otra parte, el mayor valor de r1 que presentan las NPs con arquitectura núcleo-corteza debe atribuirse, al menos en parte, a la localización de los iones Gd3+ en la corteza, ya que, en estas condiciones, el número de iones Gd3+ en contacto directo con el agua circundante sería mayor, lo cual aumenta el valor de r1 según predicen las ecuaciones de Solomon-Bloembergen-Morgan (Apéndice I). Adicionalmente, hay que tener en cuenta que cuando los iones Dy3+ y Gd3+ están localizados en posiciones próximas de la matriz en la que se incorporan, la nube de electrones de los iones Gd3+, que presenta una polarizabilidad mayor que la de los iones Dy3+, puede distorsionarse por el acoplamiento con la nube de electrones de los iones Dy3+. En consecuencia, el estado isótropo de los iones Gd3+ se vuelve anisótropo, surgiendo la interacción espín-orbital que conduce a una disminución del tiempo de relajación del espín longitudinal de los electrones (ver T1e en Apéndice I) y, por lo tanto, a una disminución de r1.4 Por tanto, la separación de los iones Dy3+ e iones Gd3+ en la arquitectura núcleo-corteza, minimiza las interferencias magnéticas entre ambos tipos de iones (Gd3+, T1 y Dy3+, T2) lo cual también conduce a un mayor valor de r1. Independientemente de su arquitectura, el cociente r2/r1 (≈ 6) de las muestras ensayadas, obtenido a partir de los valores de r1 y r2 arriba comentados, se encuentra comprendido en el rango requerido (1 < r2/r1 < 10) para ser empleadas como agentes de contraste para MRI dual T1-T2. No obstante, la muestra Dy@Gd presentó valores más elevados de relajatividad (tanto longitudinal como transversal), por lo que se concluye que las NPs de DyVO4 recubiertas con una corteza de GdVO4, son más apropiadas para ser empleadas como ACs T1-T2 a 1,44 T. Para evaluar la idoneidad de esta muestra para dicha aplicación se llevaron a cabo los estudios de dispersabilidad, de estabilidad química y de viabilidad celular que se presentan a continuación. Hay CAPÍTULO IV: AGENTES DE CONTRASTE PARA MRI DUAL T1-T2 153 que señalar que, en este caso, no se pudieron llevar a cabo estudios in vivo debido a la falta de disponibilidad de un equipo de MRI a bajo campo (1,44 T) para estudios preclínicos en animales. 4.4. Dispersabilidad La dispersabilidad de las NPs que constituyen la muestra Dy@Gd se evaluó para suspensiones de estas NPs en agua y PBS (pH = 7,4). En la Fig. 12 se presentan las curvas de DLS junto con los valores de Dh obtenidos para estas suspensiones. Como puede observarse, en PBS se obtuvo un valor de Dh similar (106 nm) al de la suspensión en agua (105 nm) siendo ambos valores algo más elevados que el tamaño medio obtenido a partir de las micrografías TEM (55 nm), pero suficientemente pequeños para descartar una agregación significativa. Por consiguiente, puede considerarse que estas NPs que constituyen la muestra Dy@Gd son dispersables tanto en agua como en un simulador de las condiciones fisiológicas, tal como se requiere para las aplicaciones in vivo. Esta dispersabilidad puede atribuirse a la presencia de las moléculas de PAA en la superficie de las NPs como se ha discutido en el Capítulo III para los ACs para MRI a alto campo. 110 100 1000 Agua PBS Intensidad (u.a.) Diámetro hidrodinámico (nm) (105 nm) (106 nm) Figura 12. Curva DLS y valor de Dh obtenido para suspensiones de las NPs que constituyen la muestra Dy@Gd en agua (gris) y PBS (rojo).