Actividad antihelmíntica y anticcodiósica de extractos procedentes de la planta endémica canaria "Ruta pinnata"

UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA FACULTAD DE VETERINARIA Instituto Universitario de Sanidad Animal y Seguridad Alimentaria Programa de Doctorado: “SANIDAD ANIMAL” Título de la Tesis ACTIVIDAD ANTIHELMÍNTICA Y ANTICCODIÓSICA DE EXTRACTOS PROCEDENTES DE LA PLANTA ENDÉMICA CANARIA RUTA PINNATA Tesis Doctoral presentada por Dña. Adassa María López González Dirigida por el Dr. Antonio Ruiz Reyes, Dra. María del Carmen Muñoz Ojeda y Dr. José Manuel Molina Caballero El Director, El Director, Antonio Ruiz Reyes M.C. Muñoz Ojeda El Director, La Doctoranda, J.M. Molina Caballero Adassa M. López González Arucas, noviembre 2015 Dña. María del Carmen Muñoz Ojeda, Dra. en Veterinaria y Profesora Titular del Área de Parasitología y Cirugía Animal, D. José Manuel Molina Caballero, Dr. en Veterinaria y Catedrático de Parasitología y Enfermedades Parasitarias y D. Antonio Ruiz Reyes, Dr. en Veterinaria y Profesor Titural del Área de Parasitología del Departamento de Patología Animal, Producción Animal, Bromatología, Ciencia y Tecnología de los Alimentos de la Facultad de Veterina de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria INFORMAN: Que la tesis doctoral que lleva por título “Actividad antihelmíntica y anticcocidiósica de extractos procedentes de la planta endémica canaria Ruta pinnata” ha sido realizada por la licenciada en Veterinaria Dña. Adassa María López González en el Departamento de Patología Animal, Producción Animal, Bromatología, Ciencia y Tecnología de los Alimentos de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria bajo nuestra dirección y asesoramiento, y consideramos que cumple la normativa vigente para optar al Grado de Doctor en Veterinaria por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. En Arucas (Las Palmas) a 20 de noviembre de 2015 Fdo. Mª Carmen Muñoz Ojeda Fdo. José Manuel Molina Caballero Fdo. Antonio Ruiz Reyes 35413-ARUCAS-LAS PALMAS-ESPAÑA TELÉFONOS: (928) 451099/451137 – FAX: (928) 451142 – E-mail: secretari[email protected].es ÍNDICE i 1. Agradecimientos ............................................................................................. 1 2. Introducción y Objetivos ................................................................................ 5 3. Revisión Bibliográfica ..................................................................................... 9 3.1. Haemonchosis ............................................................................................... 9 3.1.1. Introducción .................................................................................................... 9 3.1.2. Etiología .......................................................................................................... 9 3.1.2.1. Taxonomía ........................................................................................... 9 3.1.2.2. Morfología ......................................................................................... 11 3.1.2.3. Ciclo biológico .................................................................................. 12 3.1.2.4. Epidemiología .................................................................................... 14 3.1.2.5. Patogénesis ....................................................................................... 15 3.1.2.6. Respuesta inmune frente a nematodos gastrointestinales .............. 16 3.1.2.7. Signos clínicos .................................................................................... 18 3.1.2.8. Lesiones ............................................................................................. 19 3.1.3. Diagnóstico ................................................................................................... 20 3.1.3.1. Datos clínicos y epidemiológicos ...................................................... 20 3.1.3.2. Análisis de laboratorio ...................................................................... 20 3.1.3.3. Necropsia ........................................................................................... 21 3.1.3.4. Diagnóstico serológico ...................................................................... 21 3.1.3.5. Otros métodos .................................................................................. 21 3.1.4. Tratamiento, profilaxis y control .................................................................. 22 3.1.4.1. Antihelmínticos sintéticos ................................................................. 22 3.1.4.2. Manejo del pasto .............................................................................. 22 3.1.4.3. Suplementos nutricionales ................................................................ 22 ÍNDICE ii 3.2. Coccidiosis .................................................................................................... 24 3.2.1. Introducción ................................................................................................... 24 3.2.2. Etiología .......................................................................................................... 24 3.2.2.1. Taxonomía ......................................................................................... 24 3.2.2.2. Morfología ......................................................................................... 25 3.2.2.3. Ciclo biológico .................................................................................... 26 3.2.2.4. Epidemiología .................................................................................... 27 3.2.2.5. Patogénesis ........................................................................................ 28 3.2.2.6. Respuesta inmune frente a coccidios ................................................ 29 3.2.2.7. Signos clínicos .................................................................................... 32 3.2.2.8. Lesiones ............................................................................................. 33 3.2.3. Diagnóstico ..................................................................................................... 34 3.2.4. Tratamiento, profilaxis y control .................................................................... 35 3.2.4.1. Anticoccidiósicos sintéticos ............................................................... 35 3.2.4.2. Medidas higiénicas y de manejo de los animales.............................. 36 3.2.4.3. Suplementos nutricionales ................................................................ 37 3.3. Nuevas alternativas de control terapéutico ................................................... 37 3.3.1. Control biológico ............................................................................................ 40 3.3.2. Inmunoprofilaxis ............................................................................................ 40 3.3.3. Selección de razas resistentes ........................................................................ 41 3.3.4. Fitoterapia parasitaria .................................................................................... 42 3.3.4.1. Plantas con actividad frente a nematodos ........................................ 43 3.3.4.1.1. Ensayos in vitro .................................................................. 43 3.2.4.1.2. Ensayos in vivo ................................................................... 46 ÍNDICE iii 3.3.4.2. Plantas con actividad frente a coccidios ........................................... 47 3.3.4.2.1. Ensayos in vitro ................................................................. 47 3.3.4.2.2. Ensayos in vivo .................................................................. 48 3.4. Plantas medicinales en las Islas Canarias ...................................................... 49 4. Material y Métodos ...................................................................................... 51 4.1. Material vegetal .......................................................................................... 51 4.1.1. Obtención del material vegetal ..................................................................... 51 4.1.1.1. Preparación de los extractos ............................................................. 51 4.1.1.1.1 Obtención de los extractos naturales ............................... 51 4.1.1.1.2.Obtención de cultivos in vitro de Ruta pinnata ................ 52 4.1.1.2. Dilución de los extractos ................................................................... 53 4.2. Animales ..................................................................................................... 55 4.2.1. Animales donantes de Haemonchus contortus ............................................. 55 4.2.2. Animales donantes de Eimeria ninakohlyakimovae ...................................... 55 4.3. Parásitos ...................................................................................................... 56 4.3.1. Recolección, purificación y concentración de huevos de H.contortus .......... 56 4.3.2. Obtención, concentración y purificación de larvas 3 de H.contortus ........... 56 4.3.3. Recogida y purificación de vermes de H.contortus ....................................... 57 4.3.4. Obtención de ooquistes de E. ninakohlyakimovae ....................................... 58 4.3.5. Purificación y concentración de ooquistes no esporulados .......................... 59 4.3.6. Obtención de esporozoítos de E. ninakohlyakimovae .................................. 60 4.3.7. Células hospedadoras .................................................................................... 61 4.4. Ensayos in vitro con nematodos ................................................................... 62 4.4.1. Ensayos de eclosión de huevos (EEH) ............................................................ 62 ÍNDICE iv 4.4.2. Ensayos de desarrollo larvario (EDL) .............................................................. 63 4.4.3. Ensayos de páralisis larvaria (EPL) ................................................................. 63 4.4.4. Ensayos de viablidad de adultos (EVA) .......................................................... 65 4.5. Ensayos in vitro con coccidios ....................................................................... 66 4.5.1. Ensayos de inhibición de la esporulación (EIE) .............................................. 66 4.5.2. Ensayos de viabilidad de esporozoítos (EVE) ................................................. 68 4.5.3. Ensayos de inhibición de la invasión celular (EIIC) ......................................... 69 4.5.3. Ensayos in vitro de citotoxicidad .................................................................... 70 4.6. Ensayos in vivo con nematodos y coccidios ................................................... 70 4.6.1. Reactivación de las cepas ............................................................................... 70 4.6.2. Material vegetal ............................................................................................. 71 4.6.3. Viabilidad y efecto de las larvas 3 utilizadas en el ensayo in vivo ................. 71 4.6.4. Diseño experimental ...................................................................................... 72 4.6.5. Inoculaciones.................................................................................................. 73 4.6.5.1. Inoculación de las larvas 3 de H. contortus ....................................... 73 4.6.5.2. Inoculación de los ooquistes de E. ninakohlyakimovae .................... 73 4.6.6. Toma de muestras y procesado ..................................................................... 74 4.6.7. Tratamientos .................................................................................................. 75 4.7. Procesamiento de los datos y análisis estadístico .......................................... 75 4.7.1. Análisis de los datos obtenidos en los ensayos in vitro ................................. 75 4.7.2. Análisis de los datos obtenidos en los ensayos in vivo .................................. 76 5. Resultados ....................................................................................................... 79 5.1. Evaluación de la actividad antiparasitaria mediante ensayos in vitro ............. 79 5.1.1. Estudio de la actividad antihelmíntica ........................................................... 79 Introducción y Objetivos INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 5 2.1. INTRODUCCIÓN Entre las múltiples afecciones parasitarias que pueden afectar a los animales domésticos de abasto, las patologías originadas por los helmintos y coccidios se extienden por todo el mundo considerándose de las parasitosis más generalizadas y que inciden con más severidad en las explotaciones ganaderas, registrándose altas tasas de morbilidad y ocasionando cuantiosas pérdidas económicas. Entre las distintas nematodosis gastrointestinales que afectan al ganado ovino y caprino destacan las producidas por la familia Trichostrongylidae, siendo Haemonchus contortus una de las especies más patógenas. En su fase adulta, este nematodo se localiza en el abomaso, donde se alimenta de sangre, por lo que los animales afectados pueden presentar anemia severa, además de otros signos, entre ellos diversas alteraciones gastrointestinales, edema y pérdida de peso. Por otro lado, la coccidiosis en rumiantes es la denominación que se atribuye a las infecciones producidas por las diferentes especies del género Eimeria. Una de las especies más patógenas que afectan al ganado caprino es Eimeria ninakohlyakimovae. Este coccidio afecta principalmente a cabritos comprendidos entre las 2 semanas y 4 meses de edad, con una prevalencia de hasta un 30 % en las granjas de la Isla de Gran Canaria. Los signos clínicos que acompañan a la infección por E. ninakohlyakimovae se ven agravados debido a la replicación masiva en las células endoteliales hospedadoras, lo cual da lugar a la destrucción generalizada de la mucosa intestinal. Este hecho se manifiesta en el animal con graves cuadros diarreicos, en ocasiones hemorrágicos, frecuentemente acompañado de mucus e incluso de restos de la mucosa intestinal. Otros signos que acompañan la parasitación por esta especie de Eimeria incluyen debilidad, anorexia, pérdida de peso y retraso en el crecimiento de los animales infectados. Para el tratamiento y control de las enfermedades parasitarias se utilizan comúnmente agentes químicos, combinados con prácticas de pastoreo que limiten el contacto entre el parásito y el hospedador, así como mejora en el manejo y limpieza de la explotación, siendo los beneficios de la utilización de estos métodos incuestionables. Sin embargo, diversas circunstancias como el elevado coste invertido en los tratamientos antiparasitarios, el aumento del interés de los consumidores por métodos de producción orgánicos y sostenibles, la publicación de nuevas leyes que restringen cada vez más el uso de aditivos y fármacos en producción animal, así como la creciente aparición de resistencias están teniendo un fuerte impacto sobre la productividad. Este último aspecto se considera de especial interés, ya que la pérdida de eficacia de los productos comerciales disponibles, especialmente cuando estos productos se han utilizado como la única acción terapéutica de control, podría derivar en una situación preocupante. Ante esta situación, se ha promovido el desarrollo de nuevas técnicas de control y tratamiento frente a las parasitosis, por ejemplo, el control inmunológico, la selección de razas resistentes, el control biológico o la fitoterapia. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 6 La posibilidad de encontrar principios activos y/o extractos naturales a partir de plantas que sean útiles en producción animal constituye una alternativa muy prometedora, más si cabe, teniendo en cuenta que los hallazgos que se realicen de forma general en la medicina veterinaria en este ámbito, podrían ser también de interés en el marco de la conservación de la biodiversidad vegetal. De hecho, la importancia de este tipo de trabajos recae, no exclusivamente en la posibilidad de demostrar el efecto terapéutico de las plantas, la determinación y análisis de los compuestos a los que se adscriben sus propiedades, o la elucidación de los mecanismos intrínsecos de actuación, sino también en la posibilidad de subrayar el interés y potencialidad que supone rescatar el conocimiento popular en etnobotánica, conservar la diversidad florística de una región y mantener un desarrollo agroecológico sostenible en nuestro entorno. Se han descrito numerosas plantas que poseen actividad antiparasitaria, no sólo frente a nematodos o protozoos, sino también frente a otros grupos parasitarios como trematodos, cestodos y artrópodos. En medicina veterinaria, H. contortus ha sido uno de los parásitos donde más se ha investigado el efecto antihelmíntico de productos naturales de origen vegetal en diferentes partes del mundo. Sin embargo, los estudios de fitoterapia enfocados al control de la coccidiosis caprina y, en general, de rumiantes, son escasos. Las Islas Canarias son un reducto de biodiversidad donde tradicionalmente se han usado plantas, sobre todo endemismos, para el tratamiento de diversas enfermedades, entre ellas las plantas pertenecientes a la familia de las rutáceas. A esta familia de plantas se le atribuyen propiedades dermatológicas, pero también se han usado como agentes espasmolíticos, antirreumáticos, analgésicos o como alternativa al tratamiento de la alopecia en humanos, entre otras. Se desconoce mucho sobre el uso de las rutáceas en medicina veterinaria, y, aunque se ha descrito su utilización como parte de la alimentación del ganado, principalmente cuando presentan parasitaciones digestivas, no existen evidencias científicas que demuestren su efecto antiparasitario. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 7 2.2. OBJETIVOS 2.2.1. OBJETIVO GENERAL  Evaluar la actividad antihelmíntica y anticoccidiósica frente al nematodo de pequeños rumiantes Haemonchus contortus y al coccidio caprino Eimeria ninakohlyakimovae de extractos procedentes de diversas plantas de la flora canaria, en particular de la especie endémica Ruta pinnata. 2.2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Valorar y comparar la actividad antihelmíntica y anticoccidiósica mediante ensayos in vitro de extractos metanólicos elaborados a partir de la parte aérea sin fructificar de tres plantas pertenecientes a la flora canaria: Ruta pinnata, Psoralea bituminosa y Ruta graveolens.  Evaluar y comparar la actividad antihelmíntica y anticoccidiósica mediante ensayos in vitro de extractos metanólicos y sus fracciones, elaborados a partir de frutos en distintos estados de maduración de Ruta pinnata.  Profundizar en la evaluación de la actividad antihelmíntica y anticoccidiósica utilizando ensayos in vitro del extracto metanólico de frutos maduros de Ruta pinnata.  Estudiar la actividad antihelmíntica y anticoccidiósica empleando ensayos in vitro de compuestos metanólicos, y sus fracciones, elaborados a partir de cultivos in vitro de material vegetal de Ruta pinnata.  Evaluar la citotoxicidad in vitro de Ruta pinnata en cultivos celulares de células epiteliales de colon bovino (BCECs) y células VERO (African Green monkey kidney cells).  Investigar la actividad antiparasitaria de dos extractos (natural y procedente de cultivos in vitro) de Ruta pinnata mediante ensayos in vivo. Revisión Bibliográfica REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 9 3.1. HAEMONCHOSIS 3.1.1. INTRODUCCIÓN La haemonchosis producida por Haemonchus contortus en los pequeños rumiantes se incluye dentro un conjunto de enfermedades parasitarias que se conocen comúnmente como nematodosis gastrointestinales. Suelen ser infecciones mixtas, es decir, producidas por diversas familias y géneros, destacando las siguientes: Trichostrongylidae (Haemonchus, Ostertagia, Teladorsagia, Trichostrongylus, Marshallagia, Cooperia); Molineidae (Nematodirus); Ancylostomatidae (Bunostomun) y Strongylidae (Chabertia y Oesophagostomun) (Meana y Rojo, 2000). Dependiendo de la especie, estos vermes se localizan en distintas tramos del aparato digestivo: abomaso, intestino delgado e intestino grueso. Todas estas especies son parásitos vermiformes de sección redondeada, de color blanquecino o rojizo (si desarrollan hematofagia), con unas medidas que oscilan entre un par de milímetros y tres o cuatro centímetros. La cutícula puede ser lisa o estriada, más o menos ornamentada y, a veces, puede presentar expansiones cuticulares en el extremo anterior. A nivel del extremo posterior de los machos, las expansiones de la cutícula forman una estructura conocida como bolsa copuladora, donde se localizan diversas estructuras quitinosas que intervienen en la cópula. Las hembras producen huevos que son ovoides, de cáscara fina, y que salen al medio con las heces en fase de blástula. Continúan su desarrollo en el medio bajo condiciones ambientales apropiadas hasta que eclosiona la larva (L1) de su interior, la cual, bajo las mismas condiciones, experimentará dos mudas (L2 y L3) para alcanzar finalmente el estado de L3, que será infectante. 3.1.2. ETIOLOGÍA 3.1.2.1. Taxonomía Dentro del amplio conjunto de especies responsables de “gastroenteritis parasitarias” en pequeños rumiantes, uno de los encuadres taxonómicos reconocidos actualmente para Haemonchus contortus (H. contortus) sería el siguiente (Rudolphi, 1808; Wilford Olsen/Cordero del Campillo, 1977; Leiper, 1912; Coob, 1898): REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 10 PHYLUM: Nematoda CLASE: Nematoda SUBCLASE: Rhabditia ORDEN: Strongylida SUBORDEN: Strongylina FAMILIA: Trichostrongylidae GÉNERO: Haemonchus Aparte de H. contortus (Rudolphi, 1803), descrito como parásito del cuajar de ovejas, cabras y, en menor medida, de bovinos y otros numerosos rumiantes en casi todas las zonas del mundo, se han identificado otras especies diferentes dentro del género. Gibbsons (1979) reconoce la existencia de un total de nueve especies pertenecientes al género Haemonchus. Por otro lado, autores como Das y Whitlock (1960), en base a diferencias morfológicas, propusieron la existencia de dos nuevas subespecies y una nueva variedad de H. contortus, denominadas H. contortus contortus (Australia), H. contortus cayugensis (EEUU) y H. contortus var. utkalensis (India). Posteriormente se identificaron otras subespecies, como H. contortus bangalorensis (India), H. contortus hispanicus (España) y H. contortus kentuckiensis (EEUU). Según Daskalov (1972), el hospedador sería el principal responsable de la aparición de las diferentes subespecies de este parásito, sin dejar al margen la influencia de los factores geográficos y ecológicos. Actualmente, también se reconoce como especie dentro del género a H. placei (Place, 1983; Ransom, 1911). La propuesta inicial de estos autores fue contrastada por Roberts et al. (1954) tras diversos estudios realizados con rumiantes parasitados por Haemonchus spp., a partir de los cuales concluyen que bovinos y ovinos están parasitados por dos especies distintas de este género, H. placei y H. contortus, respectivamente. Dentro de este mismo género se ha incluido también a la especie Haemonchus similis (Travassos, 1914), encontrada en bóvidos y cérvidos en Florida, Luisiana y Texas, además de en rumiantes de Europa y Brasil. En ciertas regiones de África, donde los rumiantes comparten los mismos pastos durante todo el año, es común encontrar infecciones mixtas por H. placei, H. contortus y H. similis. En este caso, la última especie citada es la predominante en bovinos de razas autóctonas (Achi et al., 2003). Finalmente, se ha descrito la presencia de H. longistipes (Pailliet y Henry, 1909), en camellos y dromedarios, así como otras especies en rumiantes silvestres del África austral, entre ellas, H. bedfordi (Le Roux, 1929), H. dinniki (Sachs, Gibbons y Leveno, 1973), H. krugeri (Ortlepp, 1964), H. lawewnci (Sandground, 1933), H. mitchelli (Le Roux, 1929), H. vegliai (Le Roux, 1929), H. okapiae (van den Berghe, 1937) y H. horaki (Lichtenfels et al., 2001). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 11 3.1.2.2. Morfología H. contortus se encuentra englobado en la superfamilia Trichostrongyloidea, considerándose la especie de mayor longitud entre los nematodos gastrointestinales con bursa (Anderson, 1992). Los trichostrongylidos constituyen un grupo de nematodos, por lo general, pequeños, frecuentes patógenos de los rumiantes en pastoreo, que tienen la apariencia de un pelo, y que suelen alojarse (salvo Dyctiocaulus, que se localiza en vías respiratorias) en el tracto digestivo de mamíferos y aves (Anderson, 1992; Urquhart et al., 2001). Existen, sin embargo, otros géneros que parasitan la cavidad nasal (género Nasistrongylus), conductos biliares (género Hepatojarakus) y glándula mamaria (género Mammanidula) de sus hospedadores (Anderson, 1992). Los miembros de esta superfamilia no presentan estructuras muy llamativas y su cápsula bucal es muy reducida. Sin embargo, en los machos destaca la presencia de bolsas copuladoras desarrolladas con dos espículas, cuyas características morfológicas se utilizan para su diferenciación (Urquhart et al., 2001). Haemonchus spp. (Cobb, 1898), uno de los géneros parásitos del cuajar de diversos rumiantes con mayor potencial patógeno, tiene una longitud que oscila entre los 10-30 mm, siendo las hembras mayores que los machos. Poseen una pequeña cápsula bucal con un fino diente o lanceta, así como papilas cervicales prominentes. La bolsa copuladora del macho es grande, en especial los lóbulos laterales, siendo el lóbulo dorsal pequeño y asimétrico. La vulva se sitúa en el tercio posterior y puede contar con una protuberancia, solapa o proceso lingüiforme. H. contortus (Rudolphi, 1803) se localiza en el cuajar de ovejas y cabras en casi todas las zonas del mundo. Se conoce vulgarmente como gusano rojo del cuajar de los rumiantes y es una de las especies más patógenas. Los machos miden de 10 a 22 mm de longitud, y las hembras de 18 a 34 mm (Soulsby, 1988). El macho de esta especie presenta un color rojizo uniforme, mientras que en la hembra, los ovarios blancos enrollados en espiral alrededor del intestino rojo le dan un aspecto rayado característico. Presenta unas crestas cuticulares en la superficie que van desde el extremo anterior hasta más allá de la mitad del cuerpo (Lichtenfels y Pilitt, 2000), si bien se han observado ciertas diferencias en este sentido, según el grado de adaptación al hospedador (ovino o caprino) (Wahab y Suhalia, 2007). Disponen de una pequeña cavidad bucal que contiene una lanceta dorsal con la que erosionan la mucosa gástrica (Meana y Rojo, 2000). Los huevos liberados por las hembras tienen forma ovoide, son de cáscara fina y presentan un tamaño que oscila entre 67-85 x 41-48 µm. Salen al exterior con las heces en forma de blástula con 16-32 blastómeros (Soulsby, 1988; Anderson, 1992). La primera fase larvaria (L1) mide 340-350 µm de longitud y presenta un bulbo esofágico, una cola puntiaguda prominente y una cavidad bucal tubular. El segundo estadio larvario (L2) es algo mayor y también posee bulbo esofágico. Tras la segunda muda, se desarrollan las larvas de tercer estado (L3), que miden alrededor de 754-756 µm de longitud y que están recubiertas por una vaina, la cual no es sino la cutícula de la L2. La cola de este estado larvario es de tamaño medio y su extremo anterior REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 12 estrecho y redondeado, características que se utilizan para diferenciar las larvas de Haemonchus de las L3 de otros géneros dentro de la superfamilia (MAFF, 1989). El cuarto estado larvario (L4) tiene una longitud de 750-850 µm y presenta una cápsula bucal provisional que le permite ingerir sangre. Antes de evolucionar a estado adulto, pasa por una fase denominada L5 o preadulto, que ya posee caracteres sexuales diferenciados. 3.1.2.3. Ciclo Biológico Fase exógena H. contortus tiene un ciclo biológico directo típico de la superfamilia Trichostrongyloidea (Soulsby, 1988; Urquhart et al., 2001). Los animales parasitados eliminan huevos que salen al medio junto con las heces del hospedador y allí evolucionan hasta el estado de L3 (envainada), que es la forma infectante. La infección se produce de forma pasiva por la ingestión de las L3, cuyo posterior desarrollo hasta el estado adulto se produce en la localización final, el abomaso, sin llegar a producir ningún tipo de migración orgánica (Fig. 1) (Urquhart et al., 2001). Los adultos se localizan en abomaso y depositan los huevos en la luz gástrica Los huevos son eliminados al medio en forma de mórula Los huevos eclosionan y las larvas evolucionan hasta alcanzar el estado L3 o forma infectante El ganado se infecta al ingerir las L3 del pasto contaminado Los adultos se localizan en abomaso y depositan los huevos en la luz gástrica Los huevos son eliminados al medio en forma de mórula Los huevos eclosionan y las larvas evolucionan hasta alcanzar el estado L3 o forma infectante El ganado se infecta al ingerir las L3 del pasto contaminado Figura 1. Ciclo biológico de Haemonchus contortus. Las hembras son ovíparas y son capaces de eliminar entre 5.000 y 10.000 huevos/día (Meana y Rojo, 2000). Los huevos se desarrollan a medida que discurren por el intestino del hospedador y posteriormente en el medio, siendo aquellos que alcanzan el estado de pre-eclosión más resistentes a condiciones adversas como la congelación o la desecación (Soulsby, 1988). Según algunos autores, la masa fecal REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 13 serviría de protección frente a condiciones ambientales desfavorables (Zajac, 2006) y la humedad favorecería la eclosión de los huevos (O’Connor et al., 2006). Se considera que la temperatura óptima para el desarrollo exógeno del parásito oscila entre 20 y 30 °C. No obstante, es importante tener en cuenta que, incluso dentro de condiciones medioambientales aceptables, cada especie parásita puede desarrollar adaptaciones locales. Dentro del rango de temperatura señalado se suceden las dos primeras mudas (Zajac, 2006), pero el tiempo en alcanzar el estado de L3 también depende de la temperatura; así, en veranos calurosos, el desarrollo de las larvas puede tardar 3 o 4 días, mientras que, si los huevos son depositados en primaveras frías, el desarrollo puede verse retrasado varios meses (Zajac, 2006). Esta fase larvaria se caracteriza por contar con una vaina que le proporciona gran resistencia frente a distintos factores ambientales, pero evita que las larvas se alimenten, por lo que mueren una vez que las L3 consumen sus reservas nutritivas acumuladas durante las fases previas. Por este motivo, las larvas que eclosionan en periodos con temperaturas más bajas cuentan con menos movilidad y tienden a sobrevivir durante más tiempo (Zajac, 2006). Los huevos no se desarrollan por debajo de los 4 °C, y pueden no continuar su desarrollo cuando se eleva la temperatura. Las larvas 3 suelen sobrevivir a temperaturas bajas, pero a temperaturas altas pueden morir, así como en heces en descomposición. La humedad fecal normal es adecuada para la L1 y la L2, pero no para la L3, que necesita de mayor humedad (O´Connor et al., 2007). Este factor, junto con la lluvia, son muy importantes para que el tercer estadio abandone el material fecal y se produzca la migración hacia el pasto, por lo que, en periodos secos, un mayor porcentaje de larvas quedará retenida en el estiércol (Zajac, 2006). También otros factores como la intensidad de la luz, el viento o el transporte en invertebrados pueden favorecer la migración de las L3 hacia la hierba. Fase endógena A los 30 minutos de su ingestión, aproximadamente, las larvas infectantes (L3) se desprenden de la vaina por efecto de distintos estímulos del hospedador. Estos estímulos hacen que la larva segregue un fluido de muda que actúa sobre la cutícula provocando su ruptura, con lo que la larva, ayudada por sus movimientos, puede salir. La pérdida de la vaina se produce en el rumen y, a continuación, las fases larvarias del parásito migran al cuajar penetrando entre las glándulas epiteliales gástricas (Meana y Rojo, 2000). Una vez en la mucosa, las larvas mudan otra vez y se transforman en L4 en el interior de las glándulas. Estas larvas son capaces de ingerir sangre y causar pequeñas hemorragias a partir de los 3 días postinfección. Después de la última muda se transforman en L5 o preadultos, que maduran sexualmente y pasan a adultos (Anderson, 1992). Los adultos machos y hembras se mueven libremente por la superficie de la mucosa, y en ella se produce la fecundación. Las hembras son capaces de poner huevos a partir de los 15 días postinfección, sin embargo, en algunos casos, el REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 20 descrito la presencia de eosinófilos en la mucosa abomasal y en tejidos adyacentes a la infección (González et al., 2011). 3.1.3. DIAGNÓSTICO Debe realizarse en base a los datos clínicos, al historial epidemiológico, así como a distintos análisis de laboratorio. 3.1.3.1. Datos clínicos y epidemiológicos Es difícil debido a que las manifestaciones más frecuentes (adelgazamiento, anemia, etc.) pueden aparecer en otros procesos, parasitarios o no. Aun así, estos signos pueden orientar y aportan información valiosa si los relacionamos con los datos epidemiológicos. Se puede sospechar de infecciones intensas por nematodos cuando en una explotación ganadera se aprecian signos relacionados con trastornos gastrointestinales, animales en mal estado, anoréxicos e incluso muertes esporádicas. La anemia que provoca H. contortus, sobre todo en animales jóvenes, puede ser un síntoma clave para el diagnóstico, aunque siempre requiere de confirmación laboratorial (Soulsby, 1988). Durante los últimos años se está poniendo en práctica en zonas endémicas la utilización de métodos basados en el grado de palidez de las mucosas (FAMACHA) para estimar el grado de infección por H. contortus. La utilización de este método podría contribuir a identificar aquellos animales con cargas parasitarias más elevadas, con lo que se podría racionalizar el uso de antihelmínticos en términos económicos, a la vez que dificultar la aparición de resistencias debido al excesivo uso de estos productos (van Wyk y Bath, 2002). 3.1.3.2. Análisis de laboratorio El análisis de laboratorio es imprescindible para establecer un diagnóstico asertivo. Sin embargo, este diagnóstico debe ir acompañado de datos clínicos y epidemiológicos, puesto que ninguna prueba laboratorial de uso común tiene por sí sola un valor determinante. Tradicionalmente, la confirmación de la infección por H. contortus se realiza mediante estudios coprológicos. El procedimiento más comúnmente usado para detectar huevos fecales de H. contortus es la técnica de concentración por flotación, que se basa en la capacidad de los huevos del parásito para flotar en soluciones concentradas de azúcar, cloruro sódico, sulfato de zinc, sulfato magnésico o nitrito de sodio. La morfología de los huevos de H. contortus es similar a la de otros géneros de la misma familia Trichostrongylidae (Ostertagia spp., Trichostrongylus spp., etc.) por lo que un diagnóstico certero debe ir precedido de cultivos fecales y observación de las características morfológicas de las L3 (Meana y Rojo, 2000). En ocasiones, es necesario REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 21 realizar un análisis cuantitativo de las muestras fecales, como indicador de la carga parasitaria. Para ello se han descrito varios procedimientos, como la técnica de la doble centrifugación, el método de Stoll modificado y la técnica de McMaster, siendo esta última la más usada (MAFF, 1989; Ballweber, 2006). 3.1.3.3. Necropsia Este método de diagnóstico incluye el estudio tanto de las lesiones generales (anemia, ascitis, adelgazamiento, caquexia) como de las locales (gastritis), incluyendo la visualización de los vermes adultos en el cuajar. Es una forma de diagnóstico sencilla, pero también tiene sus inconvenientes; por ejemplo, cuando no se encuentran vermes en el abomaso de los animales como consecuencia de un fenómeno de autocura o cuando, en la fase terminal de la enfermedad, la mayor parte de los parásitos han desparecido del abomaso (Urquhart et al., 2001). En otros casos, la muerte puede sobrevenir en ausencia de un número abundante de vermes en la luz del abomaso debido a la acción patógena ejercida por los vermes inmaduros (Miller y Horohov, 2006). 3.1.3.4. Diagnóstico serológico Otros métodos que se han considerado en el diagnóstico de la haemonchosis y otras parasitosis gastrointestinales han sido distintos métodos serológicos, entre los que cabría destacar algunos test inmunoenzimáticos (ELISA), tanto para detectar reacciones serológicas frente a antígenos somáticos como frente a productos de excreción/secreción de H. contortus (Prasad et al., 2008), bien en forma de antígenos circulantes (en muestras de suero, orina o leche) (Petit et al., 1981) o, incluso, como coproantígenos (Derbala y el-Rahman, 2001). Entre los inconvenientes observados en su utilización se han señalado la dificultad para detectar infecciones primarias (Gill, 1991), o la aparición de reacciones cruzadas con otros tricostrongílidos (Cuquerella et al., 1994). Para evitar las reacciones cruzadas (especialmente frente a Teladorsagia circumcincta), se han llevado a cabo distintos estudios en los que se ha analizado la respuesta serológica frente antígenos específicos de vermes adultos o larvas 4 de H. contortus, tanto en ganado ovino (Schallig et al., 1994; Gómez-Muñoz et al., 2000) como en caprino (Molina et al., 1999). 3.1.3.5. Otros métodos Algunos autores han conseguido diferenciar la presencia de huevos fecales de H. contortus de diversos trichostrongílidos mediante la utilización de algunas lectinas como marcadores. Así, la aglutinina de cacahuete se ha observado que se une de forma específica a la superficie de los huevos de H. contortus (Palmer y McCombe 1996). También se han demostrado de utilidad la determinación de sangre oculta en las heces (Colditz y Le Jambre, 2008) y la PCR en tiempo real (Siedek et al., 2006). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 22 3.1.4. TRATAMIENTO, PROFILAXIS Y CONTROL 3.1.4.1. Antihelmínticos sintéticos Actualmente, el control y la profilaxis de las trichostrongiloidosis incluyen un conjunto de acciones que combinan los tratamientos antihelmínticos estratégicos con prácticas de pastoreo que limiten los riesgos de infección. Estas medidas deberían diseñarse de forma específica de acuerdo con los sistemas de explotación y las condiciones climáticas (Meana y Rojo, 2000). Entre los fármacos que se emplean actualmente destacan los pertenecientes a los siguientes grupos farmacológicos: benzimidazoles y probenzimidazoles (como el febendazol y el albendazol), imidazotiazoles (como el tetramisol y el levamisol) y lactonas macrocíclicas (como la ivermectina, la doramectina o la eprinomectina), todos ellos ampliamente empleados (Schoenian, 2005). Sin embargo, la utilización reiterada y de forma inadecuada de estos fármacos ha favorecido el desarrollo de cepas de nematodos gastrointestinales resistentes frente a estos fármacos en todo el mundo (Wolstenholme et al., 2004), lo que está empezando a complicar su control. Como se ha comentado anteriormente, es necesario tomar medidas complementarias y/o alternativas al uso de antihelmínticos; a continuación se describen brevemente algunos de los métodos más comúnmente utilizados. 3.1.4.2. Manejo del pasto Se considera de gran importancia la adaptación del tipo de manejo del pasto a las condiciones climáticas de la zona o región, puesto que cada parásito se adapta a las condiciones locales. El objetivo principal de la mayoría de los actuales regímenes de pastoreo consiste en aumentar al máximo la utilización de los pastos disponibles para el ganado de pastoreo, a la vez que disminuir la cantidad de larvas infectantes (L3) en el pasto para, en definitiva, limitar el contacto entre hospedadores y parásitos (Stear et al., 2007). Otra posibilidad podría ser la disminución de la densidad del rebaño, puesto que un menor número de hospedadores permitiría una menor eliminación de huevos en el pasto y con ello disminuiría la posibilidad del contagio para otros animales (Soulsby, 1988; Stromberg, 1997). 3.1.4.3. Suplementos nutricionales La alimentación suplementaria se considera también un método de control frente a nematodos, aunque la adopción más generalizada de esta solución no es sencilla debido, principalmente, al coste del mismo (Stear et al., 2007). Un ejemplo de este tipo de actuación sería el suplemento de proteínas en la dieta antes y durante la infección (Nnadi et al., 2007). Este procedimiento podría ayudar a prevenir o reducir los signos clínicos en infecciones por H. contortus, además de favorecer el desarrollo de una respuesta inmune efectiva frente al parásito (Wallace et al., 1999; Strain y Stear, 2001). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 23 Así mismo, algunos estudios han demostrado que la dieta suplementada con urea en corderos infectados con H. contortus es capaz de elevar los niveles de albúmina plasmáticos y el hematocrito, así como producir un aumento en la ganancia media diaria de peso y de apetito de los animales (Wallace et al., 1998). Además del efecto positivo de las dietas con suplementos proteicos, se ha observado que ciertos oligoelementos como el hierro, el zinc, el cobre o el molibdeno podrían actuar reforzando la resistencia del hospedador a las infecciones por nematodos, por lo que su empleo podría incluirse también entre las estrategias de control de las nematodosis gastrointestinales (Koski y Scott, 2003). Otros autores han demostrado que añadir selenio a la alimentación de los animales podría mejorar la respuesta inmune frente a diferentes patógenos, incluyendo las infecciones por H. contortus en ovejas (Hooper et al., 2014). A parte de los métodos anteriormente citados, existen nuevas alternativas al tratamiento y control de las parasitosis, como el control inmunológico, la selección de razas resistentes, el control biológico o la fitoterapia. Estos serán descritos con más detalle en los siguientes apartados. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 24 3.2. COCCIDIOSIS 3.2.1. INTRODUCCIÓN Las parasitosis producidas por las diferentes especies del género Eimeria en los pequeños rumiantes constituyen un grupo de enfermedades denominadas comúnmente coccidiosis. Los coccidios se transmiten por contaminación orofecal y se reproducen mediante secuencias de fases sexuales y asexuales de multiplicación y desarrollo, principalmente en las células epiteliales del canal alimentario; como resultado se produce una enteritis que puede variar de catarral a hemorrágica y que suele acompañarse de diversos grados de diarrea, pérdida de peso, anorexia, mal estado general y, en ocasiones, muerte (Bowman, 2004). 3.2.2. ETIOLOGÍA 3.2.2.1. Taxonomía La clasificación taxonómica de las especies responsables de las coccidiosis parasitarias en rumiantes más aceptada actualmente es la siguiente (Schneider, 1975; Soulsby, 1982; Levine, 1988; Urquhart et al., 1996): PHYLUM: Aplicomplexa CLASE: Sporozoea SUBCLASE: Coccidia ORDEN: Eucoccidia SUBORDEN: Eimeriina FAMILIA: Eimeridae GÉNERO: Eimeria Hasta la fecha se han descrito un total de 18 especies de Eimeria en los caprinos (Soe y Pomroy, 1992; Smith y Sherman, 2009), de las cuales nueve se reconocen como las más frecuentes y de mayor trascendencia patológica, considerándose Eimeria arloingi (Marotel, 1905), Eimeria ninakohlyakimovae (Yakimoff y Rastegaieff, 1930) y E. christenseni (Lima, 1961) como las más patógenas, debido a su capacidad de replicación masiva durante la primera merogonia en las células endoteliales hospedadoras, y a la destrucción generalizada de la mucosa intestinal afectada (Soe y Pomroy, 1992; Ruiz et al., 2006; Taylor et al., 2007). Otras especies de Eimeria que se encuentran presentes en el ganado caprino son E. alijevi (Kasim et al., 1991; Musaev, 1970), E. hirci (Lima, 1980), E. caprina (Lima, 1999), E. caprovina (Lima, 1980) y E. jolchijevi (Lima, 1980). Todas estas últimas especies se desarrollan en las células epiteliales del intestino delgado y grueso y, por lo general, se consideran REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 25 menos patógenas que las anteriores, aunque se han descrito casos de coccidiosis subclínicas atribuidos a algunas de ellas (Taylor et al., 2007). 3.2.2.2. Morfología Las especies del género Eimeria, al igual que ocurre en otros coccidios, presenta en su desarrollo biológico un tipo morfológico denominado zoíto, que es una célula móvil, con forma de plátano, redondeada por un extremo y puntiaguda por el otro. Según el momento del ciclo biológico de los coccidios, los zoítos reciben diferentes denominaciones, entre ellas esporozoítos (formas infectantes que se encuentran en los ooquistes esporulados) y merozoítos (formas resultantes de la multiplicación asexual del parásito dentro del hospedador) (Jolley y Bardsley, 2006). Todos ellos tienen en común la presencia de un complejo apical que está formado por elementos estructurales y secretores que son cruciales en el proceso activo de invasión de la célula hospedadora, en el proceso de formación de la vacuola parasitaria y en la división celular dentro de la células hospedadoras infectadas (Morrissette y Silbley, 2002; Striepen et al., 2007; Katris et al., 2014). Entre los componentes estructurales del complejo apical se encuentra un anillo-polar, un conoide, microtúbulos subpeliculares, roptrias, micronemas y gránulos densos, algunos de los cuales juegan un papel también en la organización de los microtúbulos de la célula hospedadora durante el crecimiento intracelular y la replicación de parásito (Chobotar y Scholtyseck, 1982; Urquhart et al., 1996). Los elementos estructurales del complejo apical proporcionan la orientación del parásito, y son el punto focal para la externalización de sus orgánulos secretores (Katris et al., 2014). Por otra parte, después del contacto del complejo apical con la membrana de la célula hospedadora, la invasión celular se logra debido a que el parásito activa la motilidad y/o desplazamiento regulado por elementos de actina y miosina (Striepen et al., 2007). Todas las especies de la Familia Eimeridae forman ooquistes que son eliminados al medio por las heces como formas de resistencia. La morfología de los ooquistes es clave para la diferenciación entre las distintas especies, pudiendo variar entre redondeada, ovoide o elipsoide. Otros características morfológicas, tales como la presencia o no del micrópilo (estrechamiento de la pared de algunos ooquistes en uno de sus extremos), o la cápsula micropilar (estructura en forma de casquete que puede estar recubriendo el micrópilo), así como el color de la pared o el tiempo de esporulación de los ooquistes también se emplean en la diferenciación entre especies (Eckert et al., 1995). El ooquiste de E. ninakohlyakimovae tiene forma subesférica o ligeramente elipsoide y su tamaño oscila entre los 20-28 x 15-22 µm. No tiene casquete polar y el micrópilo falta frecuentemente. En esta especie, la esporulación ocurre entre 24-48 horas a temperatura ambiente, una vez que los ooquistes han sido eliminados por las heces (Soe y Pomroy, 1992; Koudela y Bokóva, 1998). Los ooquistes presentan cuerpo de Stiedae, y en el interior del quiste esporulado, resultado del proceso de esporulación, pueden apreciarse cuerpos residuales y gránulos polares (Ruiz et al., 2013). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 26 Durante el desarrollo endógeno de E. ninakohlyakimovae, se producen dos generaciones de esquizontes, dando lugar la primera de ellas a la formación de esquizontes de gran tamaño o macroesquizontes, los cuales presentan un tamaño aproximado de 166µm x 124 µm y pueden contener hasta 100.000 merozoítos de primera generación. Los esquizontes de segunda generación de esta especie son mucho más pequeños que los primeros, siendo su dimensión de 17 µm x 12 µm aproximadamente (Vieira et al., 1997). 3.2.2.3. Ciclo biológico La forma general del ciclo de vida de los coccidios está bien representada por el género Eimeria, cuyas especies, incluyendo E. ninakohlyakimovae, son parásitos gastrointestinales de un amplio grupo de hospedadores, en este caso el ganado caprino. Este ciclo vital incluye tanto fases de multiplicación sexual como asexual (Fig. 2). Esquizogonia (merogonia, ciclo asexual) Cuando el ooquiste esporulado es ingerido por un hospedador adecuado, se produce la exquistación en la luz intestinal, liberándose los 8 esporozoítos que contiene en su interior. Los esporozoítos migran hasta infectar células intestinales específicas, células endoteliales de los capilares linfáticos centrales de las vellosidades del íleon distal y yeyuno en el caso de E. ninakohlyakimovae (Vieira et al., 1997). Tras la infección, el esporozoíto adquiere una forma redondeada y ligeramente de mayor tamaño conocida como trofozoíto. En la misma célula, el trofozoíto crece y se convierte en un esquizonte (o meronte) de primera generación, resultado de un proceso de reproducción asexual. En E. ninakohlyakimovae, estos esquizontes se desarrollan aproximadamente a los 10-12 días post-infección (Vieira et al., 1997). El esquizonte formado generará merozoítos de primera generación que hacen estallar la célula para invadir otras y transformarse en esquizontes de segunda generación, aunque en algunas especies la merogonia puede repetirse, incluso, en más ocasiones. Estas repeticiones de ciclo asexual del parásito son mucho más rápidas que la primera merogonia y suelen tener lugar en el epitelio del íleon, ciego y colon en torno al día 13 post-infección (Mehlhorn, 2004; Uquhart el al., 1996). Los atributos más destacados de la esquizogonia son: el crecimiento exponencial del número de merozoítos obtenidos a partir de un único esporozoíto, la destrucción de las células hospedadoras, proporcional al grado de infección, y la detención automática del proceso asexual después de un número determinado de repeticiones. Gametogonia (ciclo sexual) Los merozoítos producidos en última esquizogonia entran en nuevas células epiteliales para desarrollar gametocitos machos (microgameto) y hembras REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 27 (macrogameto). La fusión de ambos da lugar a un cigoto diploide que, inmediatamente, sufre una meiosis para volver a establecer formas haploides, el denominado esporogonio u ooquiste no esporulado, que será eliminado al medio en las heces de los animales infectados, completándose así el ciclo de vida endógeno del parásito (Striepen et al., 2007). La formación de los gamontes de E. ninakohlyakimovae tiene lugar en las células epiteliales de las criptas del ciego y colon, siendo común observar células infectadas por más de un gameto. El mayor porcentaje de microgametos se localiza en el ciego, mientras que los macrogametos se sitúan en las células del colon de los animales infectados. Los primeros ooquistes comienzan a formarse a partir del día 13 postinfección, comenzado la liberación en heces en torno a los días 14-15 post-infección (Viera et al., 1997; Ruiz et al., 2013). Esporogonia Al cabo 24-48 horas, si el ooquiste dispone de humedad y temperatura adecuadas, y del oxígeno suficiente, la única célula (esporonte) que hay en su interior se divide en cuatro esporoblastos. Cada uno de los esporoblastos terminará desarrollando un esporocisto que contiene dos esporozoítos en su interior, transformándose así en un ooquiste esporulado infectante y completándose de este modo el ciclo biológico (Uquhart el al., 1996; Bowman, 2004). Figura 2. Ciclo biológico de Eimeria ninakohlyakimovae 3.2.2.4. Epidemiología E. ninakohlyakimovae es un parásito de distribución mundial que afecta fundamentalmente a los caprinos (Soe y Pomroy, 1992; Jalila et al., 1998; Koudela y Bokóva, 1998; Ruiz et al., 2006), aunque referencias bibliográficas menos recientes también citan como hospedadores a ovejas, carneros de las Montañas rocosas, muflón, ciervo rojo y corzos (Soulsby, 1988). Esta especie tiene una alta prevalencia en Gran Canaria, tal y como se describe en un estudio realizado por Ruiz et al. (2006). En dicho estudio se encontró E. ninakohlyakimovae en el 30 % de los animales muestreados, con un mismo porcentaje en animales adultos y jóvenes. En este mismo REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 28 trabajo se observaron porcentajes variables de otras especies de Eimeria, entre ellas E. arloingi, E. alijevi (las más frecuentes además de E. ninakohlyakimovae), E. caprina y E. caprovina, entre otras. También se ha encontrado a E. ninakohlyakimovae en países como La Republica Checa, en esta ocasión con una frecuencia del 56 % (Koudela y Bokóva, 1998), Sri Lanka o Malasia (Faizal et al., 2001; Jalila et al., 1998). Otros autores han descrito la presencia de este parásito en diferentes porcentajes en varias regiones del mundo. Así se encontraron infectadas el 31 % de las cabras en Kazakstán y un porcentaje menor en Alemania y USA (Soulsby, 1988). Finalmente, en Zimbabwe, junto a E. alijevi, se encontró parasitando al 99 % de los animales muestreados en un estudio realizado por Chhabra et al. (1991). Hay muchos factores que influyen en la distribución y presencia de E. ninakohlyakimovae y el resto de especie de Eimeria, en general, destacando entre ellos el tipo o sistema de explotación. En el pastoreo extensivo, la diseminación de los animales y la dilución enorme de los ooquistes en amplias superficies motivan que la posibilidad de contaminaciones intensas sea muy baja. En cambio, la estabulación, con superpoblación, sea para proteger del clima frío, sea para separar los cabritos para el mercado, es un factor de riesgo (Harper y Penzhorn, 1999). Otro factor a tener en cuenta es el clima y las condiciones ambientales de temperatura y humedad. Aunque la escasa humedad limita la presencia del parásito, se ha observado que los ooquistes son capaces de sobrevivir en zonas áridas o semiáridas (Ruiz et al., 2006). Otro factor que determina la presencia del parásito es la edad del animal. Al igual que otras especies de Eimeria, E. ninakohlyakimovae afecta con mayor prevalencia a animales jóvenes, especialmente a cabritos de entre 3-4 semanas y 4 meses de edad, los cuales pueden eliminar hasta un millón de ooquistes por gramo de heces en infecciones intensas (Ruiz et al., 2006). Por el contrario, en animales mayores de 4 años los recuentos de ooquistes por gramo de heces son mucho menores (de la Fuente et al., 1992). En animales adultos, al igual que en los jóvenes, son frecuentes las infecciones mixtas (Koudela y Bokóva, 1998). Algunos autores han relacionado el desarrollo de la coccidiosis con la higiene de la explotación, observándose recuentos de ooquistes por gramo de heces menores en explotaciones con buena o moderada higiene, y mayores en granjas con poca higiene (Hidalgo y Cordero del Campillo, 2000). En general, la incidencia estacional de la coccidiosis está determinada por la disponibilidad de los animales jóvenes para el desarrollo del parásito, por la supervivencia de los ooquistes de una estación a la próxima, y por la eliminación de ooquistes durante el periodo de postparto (Soulsby, 1988). 3.2.2.5. Patogénesis Las cabras son muy sensibles a las infecciones por Eimeria, por lo que la coccidiosis se considera un problema serio en los sistemas de producción caprina en todo el mundo. La principal acción patógena de E. ninakohlyakimovae es la destrucción de las células epiteliales del intestino como resultado de las fases de reproducción REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 29 endógena, tanto asexual como sexual. El parásito invade las células del intestino delgado, ciego y colon produciendo descamación del epitelio y atrofia de las vellosidades. Como consecuencia se produce un síndrome de malabsorción y pérdida de fluidos, que se asocian con deshidratación y diversos grados de diarrea. La diarrea también está asociada con una reducción de la fosfatasa alcalina y un incremento del hematocrito y la hemoglobina (Dai et al., 2006). 3.2.2.6. Respuesta inmune frente a coccidios Al igual que en las nematodosis gastrointestinales, la respuesta inmunitaria en la coccidios se divide en respuesta innata y adquirida. La respuesta innata del hospedador frente a las infecciones por Eimeria en rumiantes es relativamente desconocida. Las barreras físicas (p.e. la mucosa), las células epiteliales, las células endoteliales y los leucocitos, componen las líneas de defensa de especificidad creciente que forman parte del sistema inmunitario innato. Entre estos componentes, se ha observado que el endotelio puede jugar un papel importante en la respuesta inmune innata frente a infecciones por algunas especies de Eimeria en las que las células endoteliales actúan como células hospedadoras, entre ellas: E. bovis (bovinos), E. ninakohlyakimovae, E. arloingi y E. christenseni (caprinos) y E. bakubensis (ovinos). Ante la infección y posterior desarrollo del parásito, las células endoteliales pueden responder modulando la transcripción génica de moléculas inmunorreguladoras de la respuesta inmune, incluyendo citoquinas, quimiotinas y moléculas de adhesión. Este hecho se ha demostrado en infecciones in vitro de BUVEC (bovine umbilical vein endotelial cells) con esporozoítos de E. bovis, las cuales muestran un aumento de la transcripción de genes que modifican moléculas proinflamatorias e inmunorreguladoras (Taubert et al., 2006). Una respuesta similar se ha observado también en infecciones in vitro de CUVEC (caprine umbilical vein endotelial cells) con esporozoítos de E. ninakohlyakimovae, encontrándose incrementadas en este caso las moléculas inmunorreguladoras E-selectina, TNF-α, CCL2 y GM-CSF (Pérez et al., 2015a). Como se comentó anteriormente, no sólo las barreras físicas actúan en la respuesta inmune innata, sino que también lo hacen los leucocitos inmunocompetentes innatos, entre ellos los polimorfonucleares neutrófilos (PMN), los monocitos, los macrófagos, las células dendríticas, las células asesinas naturales (NK), los eosinófilos, los monocitos y los leucocitos globulares. Los PMN juegan un papel muy importante en la inmunidad innata ya que, aparte de ser los leucocitos más abundantes (comprenden entre el 50 y el 80 % del total de glóbulos blancos), constituyen la primera línea de defensa frente a los agentes patógenos, siendo los primeros leucocitos en ser reclutados hacia el sitio de la infección (Hahn et al., 2013). En las especies de Eimeria que afectan a mamíferos superiores, especialmente durante el proceso de invasión celular, los esporozoítos están expuestos a esas células, lo cual podría constituir una importante oportunidad del sistema inmune innato temprano para eliminar o reducir el nivel de infección (Abi Abdallah y Denkers, 2012). Así, se ha REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 36 consecutivos a dosis de 50 mg/Kg conseguía reducir totalmente el recuento de ooquistes en heces durante 21 días. El diclazuril, derivado del acetonitrilo benceno comúnmente utilizado frente a coccidios en ovejas y ganado vacuno, así como en las coccidiosis aviares, también ha demostrado tener un efecto frente a la coccidiosis caprina (Ruiz et al., 2012). En dicho trabajo se confirmó que el fármaco no sólo reducía el número de ooquistes en heces sino que mejoraba la tasa de crecimiento de los animales. Del mismo modo, el tortrazuril, un compuesto que proviene del mismo derivado que el diclazuril, también se ha observado que presenta una alta eficacia en el tratamiento de la coccidiosis caprina, produciendo la eliminación total de los ooquistes en heces hasta 28 días después de tratamiento con una única administración (20 mg/Kg) (Iqbal et al., 2013). Por último, el decoquinato también ha mostrado tener una elevada actividad como anticoccidiósico, considerándose un compuesto altamente efectivo y seguro para los caprinos (Foreyt et al., 1986; Morand-Fehr et al., 2002). 3.2.4.2. Medidas higiénicas y de manejo de los animales En la profilaxis y el control de la coccidiosis en rumiantes es de gran importancia la limpieza y desinfección de los establos y camas. Se recomienda que todos los corrales se mantengan limpios y secos, y que los comederos y beberos se construyan de forma que no haya contaminaciones por heces. La cama se ha de cambiar con frecuencia para evitar una acumulación excesiva de ooquistes esporulados (Soulsby, 1988). Por último, cuando a los animales de cría se les suministren alimentos concentrados en el pasto, las áreas de alimentación se cambiarán regularmente. Todo esto contribuirá a disminuir la carga parasitaria presente en el ambiente, reduciéndose así la posibilidad de nuevas infecciones o reinfecciones de los animales. Además, contribuyen al buen control de la enfermedad el manejo correcto de los animales en los diferentes estados de producción. Así, en épocas de partos, donde es común el hacinamiento de madres e hijos, habría que extremar las medidas higiénicas del corral. Por otro lado, en regímenes de lactancia artificial se ha de tener en cuenta que la contaminación fecal no sólo puede afectar a las camas, sino también a los utensilios o, incluso, al propio alimento (Hidalgo y Cordero del Campillo, 2000). Otro período de riesgo donde aumenta la posibilidad de infección y la aparición de coccidiosis clínica es el momento del destete, probablemente debido al cambio de alimentación y al estrés que sufren los cabritos (Ruiz et al., 2006). También se considera crítico el momento en el que los cabritos pasan al cebadero, ya que, nuevamente, el hacinamiento de los animales y la falta de higiene pueden incrementar la tasa de infección (Kanyari et al., 1993). Al igual que en otras infecciones parasitarias, como las producidas por nematodos gastrointestinales, la rotación de pastos es esencial para prevenir la enfermedad. Generalmente, los ganaderos tienen la costumbre de colocar a los animales en la misma zona de pastoreo año tras año, aumentando así las posibilidades de contaminación. En el caso de que no fuera posible hacer este tipo de rotación, mantener las zonas de pastos drenadas y libres de deyecciones se ha observado que REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 37 disminuye las infecciones por coccidios (Gregory et al., 1989; Daugschies y Najdrowski, 2005; Chartier, 2011). Existen numerosos productos que pueden ser empleados para la limpieza y desinfección en la producción avícola y que son capaces de inhibir el ciclo exógeno de diferentes especies de Eimeria en aves, como el hidróxido de amonio y el fenol (Samaha et al., 2013). Los mismos productos serían susceptibles de ser utilizados también en los sistemas de producción en bovinos, ovinos y caprinos. 3.2.4.3. Suplementos nutricionales Al igual que otros aspectos, el uso de suplementos nutricionales como profilaxis a la infección por coccidios se ha estudiado ampliamente en aves pero no en rumiantes. De este modo, se ha demostrado que el uso de probióticos puede ser una alternativa a los profilácticos usados frecuentemente en la producción avícola frente a coccidios. Así, se ha observado que los probióticos añadidos en el agua y comida aumentan la viabilidad de los pollos infectados por coccidios disminuyendo las lesiones y el número de ooquistes eliminados en las heces (Ritzi et al., 2014). También ha dado buenos resultados la suplementación del agua de bebida con levadura de cerveza, posiblemente por estimular la respuesta inmune de los animales, y con ello disminuir la gravedad de la sintomatología de las infecciones por diferentes especies del género Eimeria (Shanmugasundaram et al., 2013). 3.3. NUEVAS ALTERNATIVAS DE CONTROL TERAPÉUTICO Como se comentó en apartados anteriores, el control de las enfermedades parasitarias está basado principalmente en el uso de antiparasitarios químicos. Sin embargo, el aumento de la aparición de resistencias a los antiparasitarios, tanto antihelmínticos como anticoccidiósicos, ha estimulado la búsqueda de nuevas alternativas de control y terapia. La resistencia frente a antihelmínticos se he descrito en la mayoría de los grupos farmacológicos, incluyendo benzimidazoles, lactonas macrocíclicas, etc. Tal y como se recoge en una revisión realizada por Kaplan (2004), las primeras evidencias que se tienen sobre resistencias a antihelmínticos datan de finales de los años 50 y comienzos de los 60, cuando se describe la aparición de cepas de H. contortus resistentes a la feniotazina y al tiabendazol. A partir de ese momento, el fenómeno de resistencia antihelmíntica se extiende a otros nematodos y a otros fármacos, entre ellos la mayoría de los benzimidazoles. A partir de aquí, se introducen nuevos productos antiparasitarios para el tratamiento y prevención de las nematodosis gastrointestinales en ganadería pero, debido a su uso inadecuado, sólo 10 años después empiezan a aparecer resistencias frente a todos ellos. De este modo, diferentes evidencias de resistencia antihelmíntica frente a avermectinas o milbemicinas se han publicado en diferentes partes del mundo donde es importante la producción ganadera (Kaplan, 2004). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 38 Recientemente, se ha confirmado la existencia de cepas de H. contortus resistentes al levamisol, albendazol y la ivermectina en granjas de caprinos de Uganda y Sudáfrica, en porcentajes cercanos al 60 % en el caso de la ivermectina (Nebuyenka et al., 2014, Tsotetsi et al., 2013). Además de a estos productos, en Brasil se han descrito la aparición de resistencia frente al closantel, demostrable no sólo en base a los recuentos de huevos en heces, sino también al evaluar el efecto del fármaco in vitro sobre los vermes adultos de H. contortus y la evolución de las larvas 3 del parásito (Almeida et al., 2010). Igualmente, unos altos niveles de resistencia frente a levamisol, moxidectina y closantel (42, 50 y 67 %, respectivamente) se han descrito en varias granjas de ovinos en el sur de Queensland (Australia) (Lyndal et al., 2014). En Europa, también se han realizado estudios de resistencias a antihelmínticos en el ganado caprino y ovino. En Francia, por ejemplo, se ha demostrado un incremento del nivel de resistencia de nematodos gastrointestinales frente al albenzadol en los últimos 15 años, particularmente en cabras en producción; además, se sabe de la existencia de casos de resistencia a la ivermectina y al levamisol (Hoste et al., 2002). Del mismo modo, un estudio realizado por Dolinská et al. (2014) en granjas de ovinos en Eslovaquia ha confirmado el aumento de la resistencia frente a benzimidazoles y lactonas macrocíclicas como la ivermectina. La resistencia a este último fármaco y al febendazol también se ha detectado en altos porcentajes en Dinamarca, resultado del uso frecuente e inadecuado de ambos compuestos en las granjas de ganado caprino del país (Holm et al., 2014). El fenómeno de las resistencias a los antihelmínticos en el ganado ovino se ha estudiado desde su aparición, no siendo así en el caso del ganado caprino. Entre las causas de la frecuente aparición de resistencias en la cabra, no sólo frente a antihelmínticos sino a otros antiparasitarios, se ha descrito la alta frecuencia de los tratamientos antihelmínticos llevados a cabo en esta especie, posiblemente debido a su baja capacidad para desarrollar una fuerte respuesta inmune a las infecciones por nematodos. Además, debido a la restringida disponibilidad de antihelmínticos cuyo uso está permitido en el periodo de producción lechera, su empleo reiterado ha sido, probablemente, excesivo. A las causas de que los caprinos presenten mayor probabilidad de promover fenómenos de resistencia antiparasitaria ha de sumarse la administración de dosis inadecuadas, ya que la totalidad de los productos han sido diseñados para el tratamiento del ganado ovino y es reconocido que el metabolismo en los caprinos es más elevado y, por tanto, menor la biodisponibilidad de los fármacos a iguales dosis. Ante esta circunstancia, muchos veterinarios optan por administración de dosis terapéuticas dobles en los caprinos en relación con los ovinos, pero los ganaderos no siempre son conscientes de esta información, así como de las pautas correctas de dosificación, incluyendo el pesaje de los animales (Hoste et al., 2002). Como ya se ha comentado, la existencia de resistencia antiparasitaria también afecta a los anticoccidiósicos. En rumiantes hay indicios de resistencia antioccidiósica, pero hasta el momento no existen publicaciones que lo confirmen. Sin embargo, este fenómeno ha sido ampliamente estudiado en aves de corral, existiendo una gran variedad de estudios que analizan y evalúan el incremento de resistencias a los productos anticoccidiósicos comúnmente utilizados frente a la coccidiosis aviar. Una REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 39 revisión realizada por Chapman et al. (2010) describe la evolución de la disminución de la sensibilidad a la monensina, antibiótico utilizado frecuentemente como anticoccidiósico, desde que fue usado por primera vez en Estado Unidos en 1971. Este compuesto fue introducido en las granjas de producción de pollos del país porque, ya entonces, se había observado resistencia a los productos que se utilizaban hasta esa fecha, como las sulfaquinolonas. A partir de entonces, debido a la novedad y al uso indiscriminado de este producto comienzan a presentarse los primeros casos de cepas de Eimeria spp. resistentes a la monesina. Otro medicamento usado a menudo en las granjas de producción avícola es el diclazuril (McDougald et al., 1990). Ya en 1994 se publicó el primer estudio donde se demuestra que diferentes aislados de Eimeria spp. presentaban resistencia parcial o total al diclazuril, el cual sólo fue efectivo en aquellas granjas donde nunca se había utilizado el fármaco, confirmándose así que una de las principales causas de la aparición de resistencias están relacionadas con el uso continuo de los productos (Kawazoe et al., 1994). La evolución de la resistencia en varios compuestos como la monesina, el diclazuril, la halofunginona o la salinomicina también fue estudiada por Peek et al. (2003) en diferentes aislados de Eimeria spp. aviares en tres años diferentes (1996, 1999 y 2001). En este período de tiempo se evaluó la eficacia de los tratamientos observándose que, con diferentes grados, la resistencia anticoccidiósica aumentaba en todos los productos a lo largo de los años. Al igual que en el caso de los antihelmínticos, la resistencia a los anticoccidiósicos está distribuida a nivel mundial, siendo importante, sobre todo, en aquellos países donde la producción de pollos es elevada. En un estudio realizado en Irán, donde los tres productos utilizados comúnmente frente a los coccidios aviares son la salinomicina, el amprolium y el diclazuril, se observó que ninguna de las especies de Eimeria aisladas era totalmente sensible a los tres compuestos, confirmándose así la presencia de resistencia. En este estudio se establecen tres índices que se consideran necesarios para cualquier evaluación de resistencia a anticoccidiósicos: (1) el índice global, que se calcula a partir de la ganancia de peso, la conversión del alimento y el número de ooquistes eliminados en heces y lesiones; (2) la óptima actividad anticoccidiósica, que se establece observando el crecimiento y el ratio de supervivencia de los animales; y (3) el test de sensibilidad anticoccidiósica, con el cual se evalúa la reducción de las lesiones provocadas por la infección por coccidios (Arabkhazaeli et al., 2013). Sin lugar a dudas, los antiparasitarios comerciales han sido una herramienta importante para el control de las enfermedades parasitarias, incluidas las infecciones por nematodos y coccidios. Sin embargo, la creciente aparición de resistencias antes señalada, la creciente preocupación entre algunos consumidores por la presencia de residuos químicos sintéticos en carne y leche, y el mayor interés por el consumo de animales de producción ecológica, han contribuido a la búsqueda de nuevas alternativas de control para dichas enfermedades, como son: el control biológico, la inmunoprofilaxis, la selección de razas resistentes y la fitoterapia. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 40 3.3.1. CONTROL BIOLÓGICO La utilización de microorganismos se considera una prometedora opción para el control biológico de las infecciones parasitarias en rumiantes. Se basa en la neutralización de las formas infectantes de los parásitos mediante hongos, bacterias e incluso virus. En los últimos años, se ha demostrado que la presencia de hongos en las heces de los animales de producción puede reducir el número de larvas infectantes en el pasto, por lo que se ha propuesto como una medida de control de las nematodosis. Por ejemplo, Duddingtonia flagrans ha demostrado tener la capacidad de disminuir la intensidad y severidad de las infecciones por Haemonchus contortus en ovinos sin producir un efecto negativo sobre nematodos no parásitos que habitan en el suelo (Knox et al., 2002; Casillas et al., 2008). Del mismo modo, en cultivos de larvas de nematodos pertenecientes a la familia Trichostrongylidae se observó que, después de 7 días de incubación con diferentes tipos de hongos que habían sido aislados previamente de las heces de los animales infectados (Cladosporium spp., Trichodermas spp. y Fusarium eqüizetli), hubo una disminución significativa en el desarrollo y la viabilidad de las larvas (Zarrin et al., 2015). Además, mediante la utilización de hongos, también es posible favorecer la descomposición o el enterramiento del material fecal y, con ello, aumenta la tasa de degradación de las de las larvas debido a una mayor exposición a las inclemencias del tiempo; por otro lado, la descomposición fecal impediría el movimiento de las larvas hacia el pasto al no existir el medio de llegar hasta el mismo (Vlassoff et al., 2001; Williams y Warren 2004). 3.3.2. INMUNOPROFILAXIS Dentro de las nuevas estrategias de control de las enfermedades parasitarias también se encuentra el uso de vacunas, pudiendo ser su aplicación una fuerte competencia con los fármacos antihelmínticos (Dalton y Mulcahy, 2001). Frente Haemonchus contortus se ha podido inducir una respuesta inmunoprotectora frente al parásito utilizando tanto antígenos naturales de L3 como antígenos de origen somático y de E/S procedentes de vermes adultos (Jacobs et al., 1999, Domínguez-Torano et al., 2000). Así mismo, se ha descrito un importante número de antígenos ocultos que confieren inmuprotección frente a este nematodo, como el polímero contortina (Munn et al., 1987), la proteína H11 (Andrews, 1997) o el complejo P1 (Smith et al., 1993), entre otros. También se han investigado las propiedades inmunoprotectoras de un grupo de enzimas proteolíticas que, igualmente, has sido aisladas, bien de los productos de excreciónsecreción (Karanu et al., 1993; Molina et al., 1994; Rhoads y Fetterer, 1995), o bien de homogeneizado somáticos de vermes adultos de H. contortus (Cox et al., 1990; Pratt et al., 1992; Molina et al., 1994). Entre las enzimas proteolíticas extraídas de este nematodo gástrico, las proteinasas tipo cisteína han demostrado tener un importante efecto protector frente a las infecciones experimentales, tanto en cabras como en ovejas (Molina et al., 2012). En los trabajos llevados a cabo por REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 41 Knox et al. (1999), a partir de homogeneizados de vermes adultos de H. contortus, se aislaron fracciones con actividad cisteína proteinasa capaces de inducir un elevado grado de protección frente al parásito en ovinos inmunizados con el producto obtenido. Los resultados del estudio realizado por Martín et al. (2015) en infecciones experimentales de H. contortus en ovejas y cabras mostraron que este tipo de proteínas producía, inmuprotección frente a la enfermedad en asociación con niveles altos de IgG en suero. Recientemente, Dicker et al. (2014) demostraron que la inmunización con este tipo de proteinasas reducían los recuentos de huevos en heces y la carga parasitaria en valores cercanos al 90 %. Mucho menor es el número de estudios sobre la imunoprofilaxis frente a coccidios en rumiantes. En este aspecto, cabría mencionar el ensayo realizado por Ruiz et al. (2014) en caprinos, cuyo objetivo fue comprobar si animales inoculados oralmente con ooquistes esporulados de Eimeria ninakohlyakimovae atenuados mediante irradiación X adquirían inmunidad frente a una reinfección. Los resultados del estudio demostraron que la inmunización reducía significativamente el número de ooquistes eliminados en las heces de los animales vacunados, así como la sintomatología y lesiones de los mismos. Las publicaciones sobre imunoprofilaxis frente a coccidios son más numerosas en relación a las coccidiosis aviares. Para la prevención de la enfermedad en aves existen una gran variedad de vacunas comercializadas, que incluyen vacunas vivas (McDonald y Shirley, 2009), vacunas vivas atenuadas, como Paracox® y Livacox® (Jeffers, 1975; Shirley and Millard, 1986; Bedrnik, 1989), o aquellas que están basadas en el uso de cepas menos virulentas del parásito, como NobilisCox ATM®. Aunque aún sin comercializar, otras vacunas han utilizado ADN recombinante de especies de Eimeria aviares como método de protección (Ding et al., 2005; Ma et al., 2011). Más recientemente, la inmunización oral, en perlas de gel y spray, con dosis bajas de ooquistes del género Eimeria se ha comprobado que aumenta la resistencia a la infección por coccidios de pollos criados en suelo, los cuales no mostraron una reducción de la ganancia de peso ni de la conversión del alimento, dos indicadores de la presencia de coccidiosis en aves (Jenkins et al., 2013). Además de la inmunización oral con ooquistes, la inoculación subcutánea con proteínas extraídas de ooquistes y esporozoítos de Eimeria tenella ha tenido resultados significativos, destacando la inmunización con esporozoítos, con la que se obtuvo un nivel de protección del 99 % (Al-Idreesi et al., 2013). 3.3.3. SELECCIÓN DE RAZAS RESISTENTES La selección genética de razas resistentes se considera otra de las nuevas alternativas de control de las parasitosis, siendo muchos los métodos que se han utilizado para seleccionar a los animales para la mejora de las razas. Recientemente, aparte de los parámetros de producción y reproducción habituales, también se han considerado diferentes parámetros de resistencia a patógenos. Así, los recuentos de huevos en heces se han utilizado como indicador de la resistencia natural de los caprinos a los nematodos gastrointestinales, por lo que los animales con menores REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 42 recuentos podrían seleccionarse para la mejora genética de la raza (Gunia et al., 2013). Otro método sería el estudio genético para la identificación de secuencias que estén relacionadas con la respuesta inmune frente a nematodos gastrointestinales o, incluso, que estén asociadas directamente a la resistencia en razas que han demostrado ser menos susceptibles a las infecciones por nematodos en áreas donde la prevalencia de las mismas en alta (McRae et al., 2014, Benavides et al., 2015). Los estudios de la selección de razas resistentes es mucho menor en relación a la coccidiodiosis, existiendo únicamente publicaciones en las que se establecen frecuencias y repetibilidad de la eliminación de ooquistes en corderos para establecer un punto de partida para una posible selección genética basada en los recuentos de ooquistes de Eimeria spp. en ovejas Rhön (Gauly et al., 2001). 3.3.4. FITOTERAPIA PARASITARIA El empleo de las plantas medicinales se ha demostrado útil en el control de la mayoría de los grupos de parásitos, incluyendo protozoos, trematodos, cestodos, nematodos y artrópodos. A modo de ejemplo, se ha observado que determinadas plantas, como Jacaranda glaba, presentan actividad frente al protozoo Plasmodium falciparum, causante de la malaria (Gachet et al., 2010). Además, estudios in vitro realizados con tres plantas usadas en la medicina tradicional de Arabia Saudí (Argemore octroteuca, Capparis spinosa y Heliotropium curassavicum) demostraron actividad frente a diferentes protozoos, como P. falciparum, Leishmania infantum, Tripanosoma brucei y T. cruzi (AbdelSattar et al., 2010). Frente a estos mismos parásitos, Bradacs et al. (2010) realizaron un estudio con 18 plantas de uso tradicional en el Archipiélago de Vanuatu y muchas de ellas demostraron tener gran actividad antiparasitaria, si bien en algún caso esta actividad estuvo acompañada de una elevada citotoxicidad. Los estudios de fitoterapia aplicada al control de la leishmaniosis se han realizado frente a las diferentes especies de Leishmania, incluyendo L. amazonensis, L. infantum o L. donovani y han incluido un importante número de plantas. En este sentido, se ha observado que Lyngbya majuscula (Balunas et al., 2010), flavonoides de Lychnopora markgranii (Salvador et al., 2009) y Enanthia chlorantha (Nkewengoua et al., 2009) presentan una alta actividad frente a este protozoo. Sin embargo, otros extractos vegetales ensayados no mostraron el mismo efecto, como los procedentes de Tinospora sinesis (Maurya et al., 2009) o algunos elaborados a partir de las plantas Erodium malacoides, Hyparrhenia hirta, Trymeleaea hirsuta y Pulicaria crispa (El-On et al., 2009). Así mismo, se han llevado a cabo ensayos para evaluar la actividad de ciertas plantas frente a cestodos. Un ejemplo lo constituye el estudio realizado por Sadjjadi et al. (2008), quienes demostraron que el extracto de cloroformo procedente de Allium sativum tenía actividad frente a los protoescólex de los quistes hidatídicos de Echinococcus granulosus. Aparte, en un ensayo in vivo usando ratones infectados de forma natural con Hymenolepis nana, se observó que Nigella sativa producía una REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 43 reducción de la carga parasitaria en el intestino de los ratones y, por lo tanto, una disminución en la eliminación de huevos con las heces (Ayaz et al., 2007). Finalmente, la planta Commiphora molmol ha demostrado tener una gran efectividad para disminuir la carga parasitaria de los adultos de Moniezia expansa en ovejas infectadas de forma natural (Haridy et al., 2004). Por otro lado, en varias especies vegetales de Dryopteris (Magalhães et al., 2010) y en Curcuma longa (Shoheib et al., 2008) se ha demostrado actividad frente al trematodo Schistosoma mansoni; en el primer caso, el efecto se observó frente a los parásitos adultos (provocaban un reducción de la carga parasitaria, alteraba el desarrollo del verme y disminuía la puesta de huevos) y, en el segundo caso, la actividad se demostró frente a las cercarías del parásito. También se han estudiado plantas con efectos sobre Fasciola gigántica, entre ellas Allium sativum y Piper longum (Singh et al., 2009b), el extracto etanólico procedente del tallo de Meryta denhawiii Seem (Shehab et al., 2009) y el extracto acuoso de Artocarpus lakoocha (Sobhon et al., 2009). El efecto de las tres plantas se estudió in vitro frente a los vermes adultos de Fasciola y se observó que todos ellos causaban daños a nivel del tegumento y reducción de la movilidad y la viabilidad de los vermes. Finalmente, la actividad antiparasitaria de plantas también se ha probado frente a artrópodos, fundamentalmente frente a diferentes dípteros que actúan como transmisores de otras enfermedades. Así, Cymbopogon citratus y Croton macrostachyus causaron la muerte de las larvas de Anopheles arabiensis Patton en un alto porcentaje después de 24 horas de exposición (Kanrunamoorthi et al., 2010). De la misma forma, Solanum xanthocarpum demostró un importante efecto larvicida frente a larvas de varias especies de mosquitos de la familia Culicidae, aunque con diferencias según la especie evaluada (Bansal et al., 2009). También existen plantas con efectos repelente frente a Aedes albopictus, como el aceite esencial de Piper aduncum (Misni et al., 2009). Ejemplos adicionales de estudios de fitoterapia realizados frente a otros artrópodos incluyen los llevados a cabo con Erythrina indica lectin, que presenta actividad ovicida y larvicida frente la mosca de la fruta (Singh et al., 2009a), y los realizados con aceite esencial de eucalipto, que demostraron un importante efecto pediculicida (Toloza et al., 2010). 3.3.4.1. Plantas con actividad frente a nematodos 3.3.4.1.1. Ensayos in vitro Este tipo de ensayos permite la realización de test a bajo costo, con un número alto de replicaciones y utilizando pocos materiales. Además, una de sus grandes ventajas es la posibilidad de automatización de los procesos. Entre las desventajas asociadas a este método pueden citarse la imposibilidad de reproducir idénticamente las condiciones naturales, por ejemplo, la temperatura corporal de los animales o el estado de los tejidos (si se estuviese trabajando con células). Aun así, es este tipo de ensayos el más utilizado en la actualidad, debido, sobre todo, al avance de su REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 44 perfeccionamiento de las técnicas laboratoriales y a las limitaciones del uso de animales para experimentación (Hartung et al., 2009). Algunos de los ejemplos de ensayos in vitro más utilizados para el estudio de la actividad antihelmíntica de extractos vegetales son: el ensayo de eclosión de huevos, el ensayo de desarrollo larvario, los ensayos de parálisis larvaria o los de viabilidad de los adultos. Para realizar el ensayo de eclosión de huevos es necesario recoger heces de los animales infectados y, a continuación, purificarlos, concentrarlos y realizar un recuento en una cámara de McMaster. Tras haber conseguido suficiente cantidad, los huevos se dispensan en placas de cultivo, normalmente de 24 pocillos, y sobre ellos se añaden los extractos que se quieran estudiar a diferentes concentraciones. Después de un periodo de incubación determinado en una estufa a 28 °C se realiza el recuento de larvas (tanto vivas como muertas) y huevos no eclosionados (Alawa et al., 2003). Varios autores han demostrado que distintas plantas son capaces de inhibir en altos porcentajes la eclosión de los huevos. Por ejemplo, el extracto acuoso elaborado a partir de hojas de Annona muricata redujo en un 84,91 % la eclosión de los huevos de H. contortus a una dilución del 50 %; esta actividad fue cercana al 50 % incluso a concentraciones del 6,25 % (Ferreira et al., 2013). Otras plantas de la familia Annnonaceace fueron estudiadas por varios autores (Souza et al., 2008), demostrándose la actividad ovicida del extracto de acetato de etilo de Annosa squamosa frente a diferentes nematodos gastrointestinales. Con anterioridad, en un estudio realizado por Alawa et al. (2003), se demostró que Annona senegalensis presentaba una alta actividad antihelmíntica, disminuyendo la eclosión de los huevos de H. contortus en un 88,5 %, no llegándose a este mismo resultado con Vermonia amydalina. También se comprobó actividad ovicida frente a H. contortus utilizando extractos de Chenopodium album y Caesalpinia crista (Jabbar et al., 2007), así como con de extractos de Ziziphus nummularia y Acacia nilotica (Bachaya et al., 2009), Hedera helix (Equale et al., 2007a), Coriandrum sativum (Equale et al., 2007b), Maesa lanceolata y Plectranthus punctatus (Tadesse et al., 2009), Melia azedarach (Maciel et al., 2006) y Cucurbita moschata (Marie-Magdeleine et al., 2009), Thymus capitatus (Boubaker et al., 2013) y Artemisia annua (Cala et al., 2014). Otro método in vitro muy comúnmente utilizado para evaluar la actividad antihelmíntica de extractos vegetales ha sido el ensayo de desarrollo larvario. Este ensayo se realiza generalmente en placas de 24 pocillos, donde se añaden los huevos, medio de crecimiento y antifúngicos para evitar el crecimiento de hongos. Las placas se incuban a temperatura ambiente y, después de 48 horas, se administran las distintas diluciones del extracto. Tras una semana, se observarán con Lugol los distintos estados larvarios que se han desarrollado, realizándose la diferenciación entre larvas que se encuentran como L3 y las que se encuentran como L1 y L2 (Assis et al., 2003). También ciertos estudios se han llevado a cabo para comprobar la capacidad de algunas plantas para inhibir el desarrollo de las larvas de diferentes nematodos. Así, se REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 45 ha encontrado efectividad en los extractos de Ziziphus nummularia y Acacia nilotica (Bachaya et al., 2009). También se ha demostrado actividad larvicida en los extractos acuosos e hidro-alcohólicos procedentes de las hojas y frutos de Maesa lanceolata y Plectranthus punctatus, donde se llegó a observar el 100 % de inhibición del desarrollo larvario a una concentración de 50 mg/ml cuando se utilizó el extracto hidro-alcohólico del fruto de Maesa lanceolata (Tadesse et al., 2009). Igualmente, se encontró actividad larvicida en la planta Melia azedarach (Maciel et al., 2006), así como en los extractos de Spigelia anthelmia Linn, los cuales produjeron una inhibición del desarrollo larvario hasta del 80 % (Assis et al., 2003). Recientemente, estudios realizados por Cala et al. (2012; 2014) han demostrado que diferentes extractos procedentes de Melia azedarach, Trichilia claussenii y Artemisia annua inhiben el desarrollo larvario en porcentajes cercanos al 100 %. Esta actividad no sólo fue observada en larvas de H. contortus sino en otros nematodos gastrointestinales como Trychostrongylus sp. u Oesophagostomun sp. Cuando se quiere medir la parálisis larvaria de las L3 in vitro provocada por el antihelmíntico en evaluación se depositan las larvas del parásito en una placa de cultivo con las diferentes concentraciones del extracto. Estas placas se incuban durante 24 horas y, transcurrido este tiempo, se clasifican las larvas como normales, si se mueven, o como paralizadas, si no se observa movimiento después de 5 segundos (Várady et al., 1999). Algunas plantas o sus derivados han llegado a inhibir la movilidad de las larvas de H. contortus en porcentajes muy elevados, por ejemplo los flavonoides obtenidos a partir de Struthida argentea, cuya actividad en uno de ellos fue del 90 % a una concentración de 3,1 µg/ml (Ayers et al., 2008). También con los extractos de Clisasmpelos capensis se obtuvo una actividad del 90 % (Ayers et al., 2007), siendo este resultado parecido al obtenido al evaluar la actividad larvicida del extracto acuso de Annona muricata (Ferreira et al., 2013). Por último, también es posible evaluar la actividad antihelmíntica de un extracto vegetal mediante el análisis de la viabilidad de los adultos. Para este ensayo se han de recolectar los adultos del abomaso de los animales sacrificados. Los ensayos se realizan tras lavar los vermes y suspenderlos en tampón fosfato salino (PBS). Las incubaciones se llevan a cabo en placas de Petri donde se añaden los extractos a las concentraciones que se vayan a evaluar. Después de incubar los vermes, se observa su movilidad a los intervalos de tiempo seleccionados (Jabbar et al., 2007). El efecto adulticida frente a H. contortus se ha demostrado en ensayos de diferentes plantas como Ziziphus nummularia y Acacia nilotica (Bachaya et al., 2009). También se demostró efectividad frente a adultos en los extractos procedentes de Hedera helix, donde se encontraron diferencias, incluso, entre sexos, siendo mayor el efecto frente a los machos que frente a las hembras del parásito (Equale et al., 2007a). Otras plantas, como Coriandrum sativum (Equale et al., 2007b), Swertia chirata (Iqbal et al., 2006a) y Cucurbita moschata (Marie-Magdeleine et al., 2009), también han demostrado tener efecto adulticida, llegando a ser la actividad de esta última de hasta el 59,2 % después de 24 horas de incubación. MATERIAL Y MÉTODOS 51 4.1. MATERIAL VEGETAL 4.1.1. OBTENCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL La planta fundamental seleccionada para los ensayos fue Ruta pinnata, una especie endémica de Canarias perteneciente a la familia Rutaceae. La selección del material vegetal se realizó en base al saber popular en etnoveterinaria de “yerberos” (personas, generalmente de avanzada edad, que conocen y aplican remedios medicinales utilizando plantas). También se tomaron en consideración algunas referencias bibliográficas que atribuían propiedades medicinales a las Rutáceas (Guarrera, 1999; Pollio et al., 2008). A partir de esta información, se evaluó la actividad antiparasitaria de dos especies de la familia Rutaceae (Ruta graveolens y Ruta pinnata). En el screening preliminar también se incluyó a Psoralea bituminosa, con el fin de comparar los resultados con una planta de una familia diferente, empleada como forrajera por los ganaderos y a la que se han adscrito también ciertas propiedades antiparasitarias. A partir del material vegetal recogido de las diferentes plantas se prepararon diferentes extractos utilizando distintas partes de la planta y distintos disolventes. 4.1.1.1 Preparación de extractos 4.1.1.1.1. Obtención de extractos naturales Las muestras de la plantas fueron recolectadas manualmente en el Jardín Botánico de Gran Canaria y en la Isla de Tenerife, y fueron enviadas al Instituto Universitario de Bioorgánica Antonio Padrón (Universidad de La Laguna, Tenerife), donde se realizó la preparación de los extractos vegetales. Las muestras se secaron en umbría a temperatura ambiente durante aproximadamente un mes, asegurando su óptima aireación para evitar infecciones con hongos y/o bacterias y evitando posibles fermentaciones. Una vez seco, el material vegetal se homogeneizó, por diferentes métodos, para obtener una muestra uniforme. Para la extracción de los extractos bioactivos presentes en las plantas de las especies R. pinnata, R. graveolens y P. bituminosa, se emplearon muestras de la parte aérea de las mismas, tomando plantas maduras en distintos estadios de fructificación. Una vez que las muestras estuvieron secas y homogeneizadas, se procedió a la extracción metanólica de los compuestos activos. La metodología utilizada para esta extracción fue similar a la usada por otros autores para la obtención de extractos de Pancratium canariensis (Cedrón et al., 2009) y Pricamnia antidesma (Solis et al., 1995). Para la extracción de los compuestos orgánicos de las plantas de forma individual, aproximadamente 750 g del material vegetal se empaquetaron en bolsas de papel de filtro y se introdujeron en una columna de un equipo Soxhlet con 5,5 litros de disolvente; la extracción se realizó en caliente hasta el agotamiento. Para la extracción acuosa, la biomasa homogeneizada se hirvió en agua destilada y luego se filtró para MATERIAL Y MÉTODOS 52 eliminar los restos vegetales. Al finalizar la extracción, los extractos bioactivos obtenidos se secaron al vacío utilizando un rota-vapor sobre un baño de agua. También se realizó la extracción de los extractos bioactivos presentes en frutos con distintos grados de maduración de las plantas R. pinnata y R. graveolens. Para ello, se tomaron aproximadamente 70 g de frutos y se homogeneizaron tras congelarlos en nitrógeno líquido, con el fin de disgregarlos y así realizar una extracción más efectiva. El homogeneizado se empaquetó en sobres de papel que se introdujeron en una columna de un equipo Soxthel y la extracción se realizó hasta el agotamiento usando un volumen de disolvente orgánico de 1,5 litros, de forma similar a como se indicó para los extractos de la parte aérea de la planta entera. En primer lugar, se realizó una extracción usando metanol como disolvente. Una vez seco, dicho extractos mostraba un aspecto aceitoso (sobrenadante) además de una parte semisólida (pellet); ambas partes se separaron por decantación y con asistencia de una ligera centrifugación. La parte semisólida se disolvió en agua, obteniéndose así un extracto acuoso de los mismos. Además, parte de esta disolución fue sometida a una extracción líquidolíquido empleando los siguientes disolventes: hexano, cloroformo y acetato de etilo. 4.1.1.1.2. Obtención de cultivos in vitro de Ruta pinnata Debido a la poca disponibilidad de biomasa vegetal de R. pinnata, y por tratarse de una especie protegida, se evaluó la posibilidad de obtener material vegetal mediante cultivos in vitro de la planta. Los cultivos se iniciaron tomando fragmentos de tejidos de plántulas crecidas bajo condiciones de asepsia en frascos traslúcidos en medio sólido Murashige-Skoog, 3 % de sacarosa. Los fragmentos se cultivaron en diferentes medios nutritivos para estimular el crecimiento de las células, agregados celulares, tejidos, brotes, etc. empleando el medios MS, bien solidificado con agar al 0,8 % o medio líquido, contendiendo además 3 % de sacarosa y suplementado con reguladores de crecimiento, tales como auxina (NAA, 2-4-D) y distintas citoquininas (BAP) a diferentes concentraciones. El pH fue ajustado antes de autoclavar a 1 atmosfera de presión, 115 °C durante 15 min. Todos los fragmentos se cultivaron e incubaron en una cámara de cultivo a 25 °C y 16 horas de luz blanca. Los fragmentos cultivados en medio nutritivo líquido se incubaron en un agitador a 95 rpm. A partir del material vegetal obtenido in vitro, los agregados que mostraron cierto grado de diferenciación celular, color verde y en ocasiones yemas o brotes, así como callos, se cultivaron en 3 medios nutritivos que se diferenciaron en el contenido de reguladores del crecimiento que contenían, el medio MSe ( 6 mg/L NAA + 1 mg/L BAP), el MS3 (0,5 mg/L + 1 mg/L BAP) y el MS6 (2 mg/L NAA + 4 mg/L 2,4-D + 1 mg/L BAP). Se dispensaron aproximadamente 2 g de agregado vegetal en matraces de 500 ml con 100 ml de medio nutritivo. Todos ellos se incubaron en agitación (95 rpm) bajo las condiciones de cultivo mencionadas anteriormente. A partir del material vegetal obtenido in vitro de los medios MSe, MS6 o MS3 se realizó una extracción con metanol y a continuación una segunda extracción con diferentes disolventes: hexano, acetato de etilo, cloroformo y agua. En los ensayos de MATERIAL Y MÉTODOS 53 actividad antiparasitaria frente a nematodos y coccidios se utilizaron tanto los extractos metanólicos como sus fracciones. 4.1.1.2. Dilución de extractos Para la realización de los ensayos in vitro, los extractos obtenidos fueron diluidos a diferentes concentraciones en dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma-Aldrich) a concentraciones que no afectasen la viabilidad de los parásitos. La concentración final máxima de DMSO que se utilizó para disolver los distintos extractos fue del 6 %. Extracto y disolvente se mezclaron hasta que la disolución fue homogénea a la concentración final de trabajo elegida para cada ensayo y cada extracto. A partir de la solución inicial se obtuvieron las siguientes diluciones, como se comentará en él apartado correspondiente. Todos los compuestos utilizados en los ensayos de presente estudio se muestran en la Tabla 1. MATERIAL Y MÉTODOS 54 PROCEDENCIA DEL EXTRACTO DISOLVENTE UTILIZADO EN LA EXTRACCIÓN ABREVIATURA/ NOMENCLATURA USADA EN EL TRABAJO Parte aérea de planta de Ruta pinnata Metanol MeOH Rp Parte aérea de planta de Ruta graveolens Metanol MeOH Rg Parte aérea de planta de Psoralea bituminosa Metanol MeOH Pb Frutos maduros de Ruta pinnata Metanol MeOH FrM Rp Frutos maduros de Ruta pinnata Metanol CM-481 Frutos maduros de Ruta pinnata (extracto metanólico) Hexano MeOH + Hx FrM Rp Frutos maduros de Ruta pinnata (extracto metanólico) Cloroformo MeOH + Cl FrM Rp Frutos maduros de Ruta pinnata (extracto metanólico) Acetato de etilo MeOH + Ac FrM Rp Frutos maduros de Ruta pinnata Agua Aq FrM Rp Frutos verdes de Ruta pinnata (Extracto metanólico) Hexano MeOH + Hx FrV Rp Frutos verdes de Ruta pinnata (Extracto metanólico) Acetato de etilo MeOH + Hx FrV Rp Frutos verdes de Ruta pinnata Agua Aq FrV Rp Cultivo in vitro de Ruta pinnata en medio MS6 Metanol CM-472 Cultivo in vitro de Ruta pinnata en medio MSe Metanol MeOH CM-134 Cultivo in vitro de Ruta pinnata en medio MS6 + MS3 Metanol MeOH CM-135 Extracto in vitro de Ruta pinnata en medio MS6 Metanol MeOH CM-463.1 Extracto in vitro CM-463.1 Hexano MeOH CM-466.1 + Hx Extracto in vitro CM-463.1 Cloroformo MeOH CM-467.1 + Cl Extracto in vitro CM-463.1 Acetato de etilo MeOH CM-468.1 + Ac Extracto in vitro CM-463.1 Agua MeOH CM-469.1 + Aq Tabla 1.Relación de extractos, naturales e in vitro, disolventes utilizados y abreviatura/ nomenclatura, utilizados en los ensayos para la evaluación de la actividad antiparasitaria. MATERIAL Y MÉTODOS 55 4.2. ANIMALES 4.2.1. ANIMALES DONANTES DE HAEMONCHUS CONTORTUS Se utilizaron ovejas de raza Canaria de unos 6 meses de edad como donantes de vermes adultos, huevos y larvas infectantes de Haemonchus contortus (H. contortus). Los animales se mantuvieron en un ambiente libre de nematodos en las instalaciones de la Granja Agrícola Experimental del Cabildo de Gran Canaria, situada en el municipio de Arucas en las proximidades de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. Dichas instalaciones fueron previamente limpiadas y desinfectadas. Antes de la inoculación de los animales, se analizó el estado parasitario de los mismos. Para ello se tomaron heces directamente de recto y se analizaron mediante la técnica de concentración por flotación en solución saturada de cloruro sódico. Se observaron huevos de Strongyloides papilosus, por lo que se desparasitaron con Levamisol (Cyver) a una dosis de 1 ml/10 k.p.v. Después de dos semanas se comprobó que los animales estaban libres de nematodos y en este momento se llevó a cabo la infección. Todos los animales se inocularon vía intra-ruminal con 7000 L3 infectantes de una cepa de H. contortus adaptada al caprino, que fue cedida por del Dr. Ignacio Ferré (Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid). A partir de la segunda semana de infección se realizó un chequeo coprológico diario de los animales para determinar el comienzo de la eliminación de los huevos, para lo cual se utilizó el método de concentración por flotación en solución saturada de cloruro sódico. Una vez constatada la presencia de huevos, se empezó a recoger heces diariamente para la obtención de larvas de tercer estado y huevos. 4.2.2. ANIMALES DONANTES DE EIMERIA NINAKOHLYAKIMOVAE Se utilizaron cabritos lactantes de raza Majorera como donantes de ooquistes del coccidio Eimeria ninakohlyakimovae (E. ninakohlyakimovae). Los animales, que cuando llegaron al animalario tenían 1 o 2 días de edad, se sumergieron parcialmente en agua tibia con lejía comercial diluida para eliminar todos los restos de heces adheridos a las pezuñas y región perianal, así como el polvo de entre el pelo, todo ello con el fin de evitar posibles contaminaciones a posteriori con especies de Eimeria exógenas, diferentes a la cepa de E. ninakohlyakimovae. A continuación se secaron y se distribuyeron en jaulas esterilizadas por calor que se alojaron en el animalario ubicado en las instalaciones de la Facultad de Veterinaria de La Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. Los boxes utilizados fueron previamente limpiados y desinfectados con lejía. Antes de la inoculación de los animales se les desparasitó con diclazuril (Vecoxan, Janssen-Cilag®) y halofunginona (Halocur, Intervet ®) para minimizar el riesgo de contagio no deseado con Eimeria y Cryptosporidium, respectivamente. El tratamiento con diclazuril se realizó el día de la recepción de los animales y a la semana siguiente, y la halofuginona se administró MATERIAL Y MÉTODOS 56 durante los primeros siete días. Los cabritos se inocularon a las cuatro semanas de edad. El día anterior a la inoculación se comprobó que los animales estaban libres de parásitos, para lo cual se tomaron muestras de heces directamente del recto y se analizaron mediante la técnica de concentración por flotación en solución saturada de cloruro sódico. Todos los animales se inocularon vía oral con 200000 ooquistes esporulados de E. ninakohlyakimovae, previamente conservados a 4 °C en dicromato potásico al 2 % (Panreac) durante no más de seis meses. A partir de los 12-13 días se realizó un chequeo coprológico diario de los animales para determinar el comienzo de la eliminación de ooquistes, para lo cual se utilizó el método de concentración por flotación en solución saturada de cloruro sódico. Una vez constatada la presencia de ooquistes, se empezó a recoger heces diariamente durante una semana. 4.3. PARÁSITOS 4.3.1. RECOLECCIÓN, PURIFICACIÓN Y CONCENTRACIÓN DE HUEVOS DE H. CONTORTUS Para la obtención de huevos, se recogieron heces de los animales infectados en pequeños cubos y se disgregaron con solución saturada de NaCl con densidad 1,19 g/l. La mezcla se filtró posteriormente por mallas de poro decreciente para eliminar el detritus y obtener una solución de huevos relativamente limpia. Utilizando esta solución, se realizó una flotación en recipientes de plástico de aproximadamente 20 x 20 x 15 durante no más de 20 min para que la solución de sal no afectara a la viabilidad de los huevos. Transcurrido este tiempo, se retiró el cristal que cubría el recipiente y se lavó la cara en contacto con el líquido con abundante agua destilada. Para eliminar todos los restos de sal, la solución de huevos obtenida se lavó 3 veces con agua destilada mediante sedimentación lenta en tubos de Falcon de 50 ml durante 30 min. La determinación del número de huevos en el concentrado resultante se determinó mediante la técnica de McMaster modificada (Sloss et al., 1994). 4.3.2. OBTENCIÓN, CONCENTRACIÓN Y PURIFICACIÓN DE LARVAS 3 DE H.CONTORTUS Con el objeto de crear condiciones favorables para el desarrollo larvario, las heces recogidas de los animales inoculados se mezclaron en un recipiente con turba estéril en relación 1/3 aproximadamente (una parte de turba y tres de heces) y se humedecieron con agua hasta conseguir una mezcla homogénea con una grado de humedad alto, aunque procurando que no hubiese exceso de líquido. Para evitar la contaminación vehiculada por artrópodos y facilitar al mismo tiempo la aireación, los cultivos se cubrieron con una tela tipo tul sellada con un elástico. Las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente durante alrededor de 12 días. Durante ese tiempo, y con una frecuencia de 48 horas, el material fecal se volteó para facilitar la aireación MATERIAL Y MÉTODOS 57 de las capas más profundas del cultivo y minimizar el crecimiento de hongos, añadiendo agua, en caso necesario, para mantener el grado de humedad óptimo. Las larvas infectantes (L3) se obtuvieron mediante el método de Baermann. El material cultivado se colocó sobre una rejilla en un embudo en el que se añadió agua destilada hasta cubrir la parte inferior del material fecal. Transcurridas 24 horas a temperatura ambiente, el líquido del embudo se recogió en una copa de decantación para proceder a la concentración y purificado de las larvas. Con esta finalidad, el líquido recogido del embudo se mantuvo a 4 °C durante aproximadamente 24 horas para que las larvas sedimentaran en el fondo. Transcurrido este tiempo, se eliminó el sobrenadante y el sedimento se transfirió y se dejó secar en un papel de filtro durante 24 horas a temperatura ambiente. Una vez seco el papel de filtro se depositó en una copa de decantación con agua limpia y se mantuvo en esta posición durante 24 horas a la misma temperatura; de esta forma se conseguía que las larvas migraran hacia el agua desprendiéndose del papel y que el detritus quedara adherido al filtro. Una vez limpias, las larvas se concentraron mediante decantación y frío de la forma descrita anteriormente y el sedimento con larvas limpias y concentradas se conservó en frascos de cultivo de fondo plano a 4 °C hasta su uso. Para favorecer la viabilidad y vitalidad de las larvas el agua se renovó cada 2-3 días (Fleck y Moody, 1988; MAFF, 1989; Colville, 1991). La determinación de la concentración de larvas se realizó en base a la media obtenida en los recuentos de alícuotas de 20 µl extraídas del volumen total del líquido, previamente mantenido a temperatura ambiente 24 horas para favorecer la activación larvaria. En el recuento solamente se consideraron las larvas que mostraban movilidad (MAFF, 1989). 4.3.3. RECOGIDA Y PURIFIACIÓN DE VERMES DE H. CONTORTUS La técnica utilizada para la recogida de adultos de H. contortus se basa en la capacidad de los vermes para migrar activamente desde una película semisólida de agar hacia una solución de PBS mantenida a 38 °C. El material empleado en la técnica y la metodología seguida se describen a continuación. Se cortaron paños de teflón de manera que su tamaño se ajustase al fondo de bandejas de plástico de aproximadamente 40 x 20 cm (un total de 10-12 bandejas por abomaso). Se dejó largo el extremo que ha de conectar con la barra soporte para que se pudiese fijar bien a ella mediante pinzas. La longitud real del paño tenía que ser inferior a la del tanque de incubación que contenía el PBS a 38 °C, para que los vermes pudieran migrar al fondo. Una vez fijados los paños a los soportes de madera con pinzas, el conjunto se dispuso en las bandejas ajustando el paño completamente al fondo para evitar que se formaran pliegues; para ello se sumergió previamente el paño en agua tibia, se escurrió y se amoldó luego al fondo de la bandeja. Se preparó suficiente PBS 0,01 M para llenar el tanque y se mantuvo a 38 °C (unos 5 litros por tanque y dos tanques por abomaso). La temperatura de la estufa donde se colocaron las urnas se mantuvo a 42 °C para que, al abrir y cerrar, no disminuyese la temperatura por debajo de los 38 °C. Además de estos materiales, para cada abomaso se MATERIAL Y MÉTODOS 58 prepararon 14 g de agar (Sigma-Aldrich), 700 de agua destilada próximos a ebullición y 700 ml de agua a 38 °C. Antes del sacrificio de los animales, fue necesario mantenerlos en ayuno entre 24-35 horas con el fin de minimizar la presencia de contenido gástrico. Tras el sacrificio se ligó fuertemente el abomaso por ambos extremos con una cuerda, se identificó convenientemente, se introdujo en una bolsa de plástico y a continuación se pasó a una nevera-termo que contenía agua a unos 40 °C para que se mantuviese en lo posible a temperatura corporal hasta su llegada al laboratorio, que se realizó de la manera más rápida posible. Una vez los abomasos llegaron al laboratorio, se añadieron los 14 g de agar a los 700 ml de agua destilada próximos a ebullición y se siguió calentando y agitando hasta que mezcla hirvió al menos tres veces consecutivas. Se enfrió entonces la mezcla en hielo, agitando con frecuencia y comprobando la temperatura hasta que la mezcla alcanzó los 43 °C. Cuando la temperatura del agar líquido estuvo próxima a esta temperatura, se colocó el abomaso en una bandeja y se abrió por la curvatura mayor. A continuación, se lavó la mucosa del abomaso con agua a 38 °C (hasta 700 ml) tratando de recoger el mayor número de vermes posibles. El lavado se mezcló con el agar líquido, dispensando rápidamente la mezcla resultante en las bandejas de manera que formase una fina capa que cubriese todo el paño. Cuando el agar se solidificó, los paños se colocaron rápidamente en el tanque con PBS, manteniendo el conjunto en la estufa una hora y media como mínimo con el objeto de que los vermes se desprendiesen del agar y pasasen al PBS. Durante este tiempo se prepararon placas de Petri, así como lancetas, y se mantuvo una placa caliente a 38 °C. Transcurrida una hora y media, se retiraron los paños de la estufa, comprobando que estuviesen libres de vermes. Tras desechar el PBS sobrenadante del tanque, el sedimento con vermes se recogió en un vaso de precipitado, desde donde se fueron transfiriendo pequeñas cantidades de PBS y vermes a placas de Petri de plástico que se mantenían a 38 °C sobre la placa caliente. A continuación se recogieron los adultos con lancetas y se conservaron en medio RPMI (Sigma-Aldrich) a 37 °C hasta la realización de los ensayos. 4.3.4. OBTENCIÓN DE OOQUISTES DE E. NINAKOHLYAKIMOVAE Para la obtención de ooquistes se recogieron heces de los animales infectados en bolsas que se conservaron a 4 °C. A continuación, las heces se lavaron con agua y se filtraron sobre un embudo con mallas de poro decreciente con el fin de disminuir la cantidad de detritus. La solución resultante se dispensó en envases de plástico sin tapa con solución concentrada de azúcar con densidad 1,5 g/l en una relación 1:1 v/v de forma que se formara un menisco sobre ellos. Los recipientes se cubrieron con cristales con el fin de que los ooquistes, al flotar, quedaran adheridos a la cara inferior de los mismos. Cada dos horas, se procedía al lavado de los cristales recogiendo así los ooquistes y, a continuación, se agitaba suavemente la mezcla, se rellenaba con solución de azúcar si era preciso y se colocaba de nuevo el cristal. Cada lote de flotaciones se mantuvo durante 3 días seguidos; mientras tanto, los ooquistes recogidos se guardaron a 4 °C. MATERIAL Y MÉTODOS 59 Para los ensayos de esporulación de ooquistes se utilizaron ooquistes no esporulados. En tal caso, una vez recogidos mediante el método de flotación descrito anteriormente, los ooquistes se purificaron y concentraron inmediatamente por medio de un gradiente de Percoll, técnica que se explicará en los apartados siguientes. El resto de ooquistes se diluyó en dicromato potásico al 2 % en matraces Erlenmeyer en los que se sumergía un dispositivo electrónico para la aireación del líquido con el fin de favorecer la esporulación. Después de una semana a temperatura ambiente, los ooquistes ya esporulados se lavaron y concentraron por centrifugación y, finalmente, se dispensaron en botellas de cultivo con filtro en una solución de dicromato potásico 2 % (Panreac). Las botellas se conservaron en refrigeración a 4 °C hasta que se llevó a cabo el aislamiento de esporozoítos. 4.3.5. PURIFICACIÓN Y CONCENTRACIÓN DE OOQUISTES NO ESPORULADOS Los ooquistes que se recogieron de las flotaciones en solución de azúcar se purificaron utilizando gradientes de Percoll con el fin de separar el detritus de los ooquistes. Volúmenes de 20 ml de solución de ooquistes se dispensaron en tubos de 50 ml que se terminaron de llenar con agua destilada. Esta mezcla se centrifugó a 1500 x g durante 5 min a 4 °C, se eliminó el sobrenadante y el sedimento se mezcló otra vez con agua para realizar un nuevo lavado, así hasta 5 veces. Después del último lavado, el sedimento resultante se llevó hasta 20 ml con agua destilada y se mezcló con 60 ml de hipoclorito sódico al 5 % (Panreac) en un envase de cristal sellado con film y en oscuridad. A continuación, la mezcla se agitó durante 20 min en oscuridad a 4 °C y la solución resultante se transfirió a tubos de 50 ml (40 ml y 40 ml), realizándose seguidamente una centrifugación a 250 x g durante 5 min. Tras esta centrifugación lenta, se recogió el sobrenadante en un nuevo tubo de 50 ml se procedió a realizar un total de 5 lavados con agua destilada centrifugando a 1500 x g durante 5 min. Tras la última centrifugación, se dejó el sedimento a la cantidad justa que se requiere para dispensarla en los gradiente de Percoll, normalmente 1,5 ml de solución de ooquistes. Se utilizaron dos gradientes continuos de Percoll, del 60 y 50 % (PercollTMGE Healthcare), preparados según se muestra en la siguiente tabla. La realización del gradiente propiamente dicho se realizó mediante centrifugación de la correspondiente mezcla a 27000 x g durante 20 min en una ultracentrífuga (Beckman Coulter OptimaTM L-100 Xp Ultracentrifuge). MATERIAL Y MÉTODOS 60 SOLUCIÓN REACTIVOS CANTIDAD (ml) SOLUCIÓN 1 Percoll 9 NaCl 1,5M 1 SOLUCIÓN 2 NaCl 1,5M 10 dH 2 O 90 SOLUCIÓN DE PERCOLL 50% Solución 1 5 Solución 2 5 SOLUCIÓN DE PERCOLL 60% Solución 1 6 Solución 2 4 Tabla 2. Reactivos y soluciones utilizados en los gradientes de Percoll. De forma rutinaria, se preparaban 7 ml de cada gradiente. Una vez preparados los gradientes se dispensaban cuidadosamente 1,5 ml de la solución de ooquistes sobre los tubos que contenían el gradiente del 50 % y se centrifugaba a 400 x g durante 20 min a 4 °C, con desaceleración 0 y aceleración 0. Después de esta centrifugación se obtenían unas bandas que separaban parcialmente los ooquistes del detritus. Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio se recogía la banda de ooquistes y se transfería a un tubo de 50 ml. Estos ooquistes se concentraban para, a continuación, añadirlos sobre el gradiente del 60 %, repitiéndose el mismo proceso descrito anteriormente. Una vez terminada la correspondiente centrifugación, se recogieron de igual forma los ooquistes limpios, se concentraron y se contaron utilizando una cámara de Newbauer. 4.3.6. OBTENCIÓN DE ESPOROZOÍTOS DE E. NINAKOHLYAKIMOVAE Para la obtención de esporozoítos se utilizaron ooquistes esporulados, los cuales se purificaron y concentraron mediante la técnica de separación con gradientes de Percoll descrita anteriormente. Una vez obtenidos los ooquistes limpios, se dispensaron de 2 a 3 ml en una botella de cultivo sin filtro junto a 20-25 ml de L-cisteína, preparada según se indica en la Tabla 3, esta solución fue esterilizada por medio de filtros de 0,22 µm antes de ser utilizada. Antes de cerrar la botella se añadió CO2 durante 30 segundos y se cerró rápidamente. La mezcla de ooquistes se incubó durante la noche (aproximadamente 16 horas) a 37 °C y una atmósfera del 5 % de CO2. MATERIAL Y MÉTODOS 67 estudiados. Transcurrido el tiempo de incubación seleccionado, se realizaron tres lavados con dH2O mediante centrifugaciones a 420 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Tras el último lavado se dispensaron 400 µl de solución de ooquistes en una placa de 24 pocillos, sobre los que se le añadieron 600 µl de una solución denominada “premezcla”, preparada con dicromato potásico al 10 % y dH2O. Como control positivo se utilizó formaldehido al 10 % (Panreac) y como control negativo DMSO. Los ooquistes dispensados en la placa se incubaron a temperatura ambiente hasta la lectura de los resultados. Los ooquistes se observaron a las 24 y 48 horas, realizándose la diferenciación entre ooquistes esporulados de los no esporulados cuando en los pocillos correspondientes al control negativo (DMSO) se observaba un 80 % de ooquistes esporulados (48 horas en el presente estudio). Extractos (mg/ml) Control positivo Formaldehido 10% (%) Control negativo DMSO (%) 12,5 5 1,5 6,25 2,5 0,75 3,125 1,25 0,375 0,625 0,31 0,075 0,0625 0,03 0,0075 Tabla 15. Concentraciones finales utilizadas en los ensayos de EIS para los extractos metanólicos de planta entera de R. pinnata, P. bituminosa y R. graveolens, frutos maduros de R. pinnata y R. graveolens y la fracción acuosa del extracto metanólico de frutos maduros de R. pinnata. También se representan en la tabla las concentraciones del control positivo (formaldehido 10 %) y control negativo (DMSO). Productos (mg/ml) Control positivo Formaldehido (10%) Control negativo DMSO (%) 25 5 3 12,5 2,5 1,5 6,25 1,25 0,75 3,125 0,31 0,1875 0,625 0,03 0,02534 0,0625 0,003 0,00253 Tabla 16. Concentraciones finales utilizadas en los ensayos de EIE para los productos elaborados a partir de cultivos in vitro de R. pinnata (CM-134, CM-135 y CM-140).También se representan en la tabla las concentraciones del control positivo (formaldehido 10 %) y control negativo (DMSO). MATERIAL Y MÉTODOS 68 Extracto/Productos (mg/ml) Control positivo Formaldehido (10%) Control negativo DMSO (%) 3 5 3 1,5 2,5 1,5 0,75 1,25 0,75 0,1875 0,31 0,1875 0,02345 0,03 0,02534 Tabla 17. Concentraciones finales utilizadas en el estudio dosis-dependiente de la actividad anticoccidiósica en los ensayos de EIE para el extracto metanólico de frutos maduros de R. pinnata y el compuesto CM-475.3, elaborado a partir de un cultivo in vitro de R. pinnata. También se recogen en la tabla las concentraciones utilizadas del control positivo (formaldehido 10 %) y control negativo (DMSO). 4.5.2. ENSAYOS DE VIABILIDAD DE ESPOROZOÍTOS (EVE) Este ensayo permite comprobar si los extractos naturales tienen una actividad antioccidiósica mediada por la alteración de la viabilidad de los esporozoítos de Eimeria ninakohlyakimovae, para lo cual se empleó una modificación del método utilizado por Khalafalla et al. (2011). Para realizar este ensayo se dispensaron en placas de 96 pocillos 100µl de una solución de medio RPMI con 5000 esporozoítos, obtenidos por el método de purificación y desenquistamiento antes mencionado. Sobre la solución de ooquistes se añadieron las diferentes concentraciones de los extractos, además de los controles negativos, diluidos en todos los casos en medio RPMI. Como control positivo se empleó una solución de esporozoítos calentada a 60 °C durante 30 min, asegurando así la muerte de los mismos. Transcurridas 3 horas de incubación a temperatura ambiente se procedió a la lectura de los resultados. Para valorar la viabilidad de los esporozoítos se realizó una tinción con Sytox Orange (Invitrogen), un colorante de ácidos nucleicos capaz de atravesar la membrana nuclear dañada de los esporozoítos no viables. Para la realización de la tinción se retiraron 100 µl de solución de cada pocillo y se añadieron 100 µl de Sytox Orange. A continuación, la mezcla resultante se homogenizó e incubó durante 15 min a temperatura ambiente en oscuridad. Finalmente, las muestras se observaron en un microscopio de fluorescencia (Eclipse 80¡®, Olympus). Cada concentración se evaluó por triplicado y se realizaron dos ensayos similares en días diferentes. MATERIAL Y MÉTODOS 69 Extracto (mg/ml) Control negativo DMSO (%) 10 0,6 5 0,3 2,5 0,15 1,25 0,03 0,625 0,006 0,5 0,0075 0,025 0,0015 Tabla 18. Concentraciones finales utilizadas en el ensayo EVE para el extracto metanólico de frutos maduros de R. pinnata. También se muestran en la tabla las concentraciones utilizadas del control negativo (DMSO). 4.5.3. ENSAYO DE INHIBICIÓN DE LA INVASIÓN CELULAR (EIIC) Utilizando este ensayo se pretende estudiar si los extractos naturales disminuyen la capacidad de invasión celular de los esporozoítos. Con tal fin, un total de 50000 esporozoítos, obtenidos con el método comentado anteriormente, se incubaron en tubos Eppendorf con 1 ml de las diferentes concentraciones del extracto, los controles negativo (DMSO) y positivo (sulfadoxina/ trimetoprim, 200/40; VeterínDiftrim ®, Intervet) durante 3 horas a 37 °C y una atmósfera del 5 % de CO2. A continuación, se realizaron tres lavados con RPMI que contenía un 5 % de penicilina/estreptomicina centrifugando a 2000 × g 5 min. Una vez lavados, los esporozoítos tratados con las diferentes concentraciones del extracto se añadieron sobre BCEC confluentes cultivadas en placas de 12 pocillos y se incubaron a 37 °C y 5 % CO2 durante 24 horas. Tras este periodo de incubación, se realizaron fotografías de 15 campos aleatorios por condición en un microscopio electrónico (Leica DFC 290) con una cámara adaptada. La tasa de invasión celular se obtuvo calculando la relación entre células totales y células infectadas por esporozoítos. Cada condición se realizó por triplicado y se realizaron un total de 3 ensayos idénticos en días distintos (Burt et al., 2013). Extracto (mg/ml) Control positivo Sulfadoxina/trimetoprim (µg/ml) Control negativo DMSO (%) 5 10/2 0,3 2,5 0,1/0,02 1,5 0,5 0,001/0,0002 0,03 0,1 10-6/2x10-7 0,003 0,01 10-9/2x10-10 0,0003 Tabla 19. Concentraciones finales utilizadas en el ensayo EIIC para el extracto metanólico de frutos maduros de R. pinnata. También se representan en la tabla las concentraciones del control positivo (Sulfadoxina/trimeroprim) y del control negativo (DMSO). MATERIAL Y MÉTODOS 70 4.5.4. ENSAYOS IN VITRO DE CITOTOXIDIDAD El estudio de citotoxicidad in vitro del extracto metanólico de R. pinnata se realizó en dos cultivos celulares diferentes. Se utilizaron cultivos in vitro de BCEC, que se hicieron crecer según la metodología explicada en el ensayo de inhibición de invasión celular, y células VERO (African Green monkey kidney cells). Estas últimas células fueron inicialmente obtenidas de la European Collection of Cell Cultures (ECAACC 84113001) y se cultivaron en medio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich) suplementado con L-glutamine 2 nM, 500 U/ml de penicilina, 50 µg/ml de estreptomicina y un 10 % de suero fetal bovino (Linus) (Ruiz et al., 2010). Ambos tipos celulares se cultivaron en placas de 24 pocillos (Nunc) hasta que estuvieron confluentes y, en ese momento, se añadieron 150 µl de cada dilución del extracto o control negativo (DMSO), según se indica en la Tabla 20, más 250 µl de Sytox Orange. Como control negativo se utilizaron diluciones seriadas de DMSO. A continuación, se realizó una incubación durante toda la noche (aproximadamente 16 horas) y la lectura se llevó a cabo en un escáner de fluorescencia (Ascent Fluoroskan, Labsystems) (Agustine et al., 1997). Extracto (mg/ml) Control negativo DMSO (%) 3,125 3 0,625 1,5 0,125 0,75 0,0125 0,325 Tabla 20. Concentraciones finales utilizadas en el ensayo in vitro de citotoxicidad para el extracto metanólico de frutos maduros de R. pinnata. También se muestran en la tabla las concentraciones utilizadas del control negativo (DMSO). 4.6. ENSAYO IN VIVO CON NEMATODOS Y COCCIDIOS El ensayo in vivo permitiría confirmar los resultados obtenidos en los ensayos in vitro sobre la actividad antihelmíntica y anticoccidiósica de los extractos analizados. Debido al coste económico que supone este tipo de análisis cuando se realizan en experimentos controlados, solamente se ensayaron dos extractos, uno de fruto maduro y otro de cultivos vegetales in vitro, en ambos casos de la planta Ruta pinnata. En el curso de inoculaciones experimentales de caprinos con Haemonchus contortus y Eimeria ninakohlyakimovae, se evaluó conjuntamente la actividad antihelmíntica y anticoccidiósica de ambos extractos. 4.6.1. REACTIVACIÓN DE LAS CEPAS Antes de proceder a la inoculación de los animales, las cepas de H. contortus y E. ninakohlyakimovae se reactivaron mediante pase en animales donantes; con ello se pretendía asegurar que los parásitos eran totalmente viables. MATERIAL Y MÉTODOS 71 Para la renovación de la cepa de H. contortus se inocularon 3 ovejas de raza Canaria con 7000 L3 del parásito. A partir del día 21 postinfección se empezaron a recoger heces para aislar, purificar y concentrar las larvas L3 por el método Baermann, ya comentado anteriormente. Los ooquistes de E. ninakohlyakimovae fueron aislados de 7 cabritos de raza Majorera, que se inocularon con 200.000 ooquistes esporulados. Estos cabritos se mantuvieron en condiciones estériles en el animalario del Hospital Dr. Negrín de Las Palmas de Gran Canaria. A los 14 días postinfección se recogieron las heces de los animales y la obtención de ooquistes llevó a cabo mediante la misma técnica explicada anteriormente para la realización de los ensayos in vitro. 4.6.2. MATERIAL VEGETAL Los extractos utilizados en el ensayo in vivo fueron el extracto CM-481 (extracto metanólico de frutos maduros de Ruta pinnata recolectados en el Campus de Ciencias Biológicas de la Universidad de La Laguna en Tenerife durante los meses de agosto y septiembre del 2011) y el CM-472 (muestras de extracto metanólico de material de cultivo in vitro de Ruta pinnata en medio MS6). Cada extracto se homogeneizó con una batidora y se diluyó en DMSO 6 % hasta su completa disolución, conservándose la mezcla en una cámara fría a 4 ºC hasta su utilización. Se administraron 30 g de extracto metanólico de frutos maduros de R. pinnata y 27 g del extracto CM-472, lo que corresponde a aproximadamente 2 g/kg p.v., ya que los animales al comienzo del experimento pesaban en torno a 15 kg. 4.6.3. VIABILIDAD Y EFECTO DE LAS LARVAS 3 UTILIZADOS EN EL ENSAYO IN VIVO Previamente a la realización del ensayo in vivo se realizó un ensayo de parálisis larvaria (EPL) para comprobar que los extractos poseían actividad antihelmíntica y chequear la viabilidad de las L3 antes de la inoculación. El ensayo EPL se realizó siguiendo la misma metodología comentada anteriormente. Los dos extractos se probaron en diferentes concentraciones; se utilizó levamisol como control positivo y DMSO como control negativo (Tabla 21). MATERIAL Y MÉTODOS 72 Extracto/Producto (mg/ml) Control negativo DMSO (%) Control positivo Levamisol (µg/ml) 6,25 3 0,125 3,125 1,5 0,0625 1,5625 0,75 0,03125 0,3125 0,1875 0,00625 0,0625 0,0375 0,00125 0,00625 0,00375 0,000125 0,000625 0,000375 0,0000125 Tabla 21. Concentraciones finales utilizadas en los ensayos EPL para comprobar la eficacia de los extractos in vitro antes de la realización del ensayo in vivo para el extracto metanólico de frutos maduros de R pinnata (CM 481) y el compuesto CM-472 (producto elaborado a partir de un cultivo in vitro de R. pinnata). También se muestran en la tabla las concentraciones utilizadas del control positivo (levamisol) y del control negativo (DMSO). 4.6.4. DISEÑO EXPERIMENTAL En el experimento se empleó un total de 18 caprinos de raza Majorera de entre 6-7 meses de edad pertenecientes a una granja situada en el Guriete, en el municipio de Santa Lucía de Tirajana, en la Isla de Gran Canaria. El experimento se realizó en dicha granja, para lo cual los animales se separaron del resto del rebaño y se dividieron en 5 grupos distintos: A, B, C, D y E: Grupo A: animales inoculados y tratados con el extracto CM-481 (N=4) Grupo B: animales inoculados y tratados con el extracto in vitro CM-472 (N=4) Grupo C: animales inoculados y tratados con Ivermectina (SP Veterinaria) y Diclazuril (Vecoxan, Janssen-Cilag®) (N=4) Grupo D: animales inoculados y no tratados (N=4) Grupo E: animales no inoculados (N=2) En la Tabla 22 se recoge de forma gráfica todas las actuaciones llevadas a cabo a lo largo durante la experiencia en los diferentes grupos de animales: inoculación con Haemonchus contortus (IH), inoculación con E. ninakohlyakimovae (IE), tratamiento con los diferentes extractos o productos comerciales, según el grupo que corresponda (T), y toma de muestras de heces (F). MATERIAL Y MÉTODOS 73 Tabla 22. Esquema del protocolo experimentación. 4.6.5. INOCULACIONES 4.6.5.1 Inoculación de las larvas 3 de H. contortus Las larvas 3 utilizadas para la inoculación de los animales fueron obtenidas por el método Baermann, posteriormente purificadas y conservadas a 4 °C. El día antes a la inoculación, las larvas se dejaron a temperatura ambiente para favorecer su reactivación. Los animales se inocularon con 7000 L3 vía intraruminal (Fig. 3), considerándose este día como el día 0 de la experiencia. 4.6.5.2. Inoculación de los ooquistes de E. ninakohlyakimovae Los animales se inocularon con 200.000 ooquistes vía oral con una sonda gástrica el día 14 del experimento (dos semanas después de la infección con H. contortus) con el fin de hacer coincidir los picos de eliminación en heces de huevos y ooquistes. Días postinfección 0 14 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 Grupo A IH IE F F F F T F F F F F F F Grupo B IH IE F F F F T F F F F F F F Grupo C IH IE F F F F T F F F F F F F Grupo D IH IE F F F F F F F F F F F Grupo E F F F F F F F F F F F MATERIAL Y MÉTODOS 74 Figura 3. Inoculación intraruminal de L3 de H. contortus en caprinos 4.6.6. TOMA DE MUESTRAS Y PROCESADO Se tomaron muestras individuales de heces de todos los animales el día 14 del experimento, coincidiendo con el día de la inoculación con E. ninakohlyakimovae. Aunque, como se indicó, los animales fueron desparasitados 21 días antes del comienzo de la experiencia con ivermectina y diclazuril, la contaminación de los corrales motivó que todos los caprinos estuvieran infectados con ooquistes de diferentes especies. Con las heces recogidas se hicieron mezclas para cada grupo y se recogieron los ooquistes mediante flotación con solución saturada de sal. Con tal fin, los ooquistes adheridos al portaobjetos se retiraron con agua destilada y se recogieron en un vaso de precipitado. Se realizaron 3 flotaciones por lote para obtener la mayor cantidad de ooquistes posible. Después del último lavado se mezcló el volumen total recogido y se añadió dicromato potásico a una concentración final del 2 %. Las diferentes mezclas se dispensaron en botellas de cultivo celular con filtro y se dejaron incubar a temperatura ambiente durante una semana. Tras este tiempo, la mayoría de los ooquistes recogidos había esporulado. A partir de ese momento se procedió a la diferenciación de las especies de Eimeria presentes en cada uno de los lotes de animales, para lo cual se siguieron los criterios descritos en la bibliografía (MAFF, 1986; Alyousif et al., 1992; Soe et al., 1992). A partir del día 28 y hasta el día 38 del experimento se tomaron muestras de heces diariamente de todos los animales, incluidos los controles. Los recuentos, tanto de huevos como de ooquistes, se realizaron mediante el método de McMaster modificado (MAFF, 1989). Las heces que no se emplearon para la cuantificación de ooquistes y huevos se procesaron siguiendo la metodología explicada anteriormente para la diferenciación de especies de Eimeria. Las muestras se tomaron de forma individual directamente del recto de los animales, momento en el que se aprovechó MATERIAL Y MÉTODOS 75 para observar y anotar la presencia o no de diarrea y las características de la misma, en su caso. También se anotaron otros síntomas, tales como: adelgazamiento, anorexia, mal pelaje, decaimiento, postración, anemia, etc. 4.6.7. TRATAMIENTOS El día 31 del experimento se procedió al tratamiento de los animales. A los animales pertenecientes a los grupos A y B se les administró vía oral con una sonda (Fig. 4) los extractos correspondientes. Los animales del grupo C se trataron con las dosis pertinentes de ivermectina (1 ml/ 50 Kg p.v.) y diclazuril (1 ml/ 10 Kg p.v.), vía intramuscular y oral, respectivamente. Al final de la experiencia (día 38 de la experiencia) todos los animales fueron desparasitados con estos mismos productos. Además, tras esta desparasitación, se realizaron chequeos coprológicos periódicos (días 15 y 30 después de terminado el estudio) para asegurar que todos los animales utilizados en la experiencia no presentaran parásitos en las heces. Figura 4. Administración vía oral de los extractos 4.7 PROCESAMIENTO DE LOS DATOS Y ANALISIS ESTADISTICO 4.7.1 ANÁLISIS DE LOS DATOS OBTENIDOS EN LOS ENSAYOS IN VITRO Para el análisis estadístico de los datos se agruparon todas las repeticiones para cada uno de los correspondientes ensayos y se estimaron las diferencias mediante el test no paramétrico Chi-cuadrado. El efecto de las diferentes concentraciones de extracto se comparó con los correspondientes controles DMSO y se consideraron significativas las diferencias para P < 0,05. En todos los análisis se utilizó el programa estadístico Sigmastat 3.1 bajo entorno Windows. MATERIAL Y MÉTODOS 76 La dosis letal 50 (DL50) de cada extracto utilizado en los diferentes ensayos se obtuvo realizando un estudio de dispersión enfrentando los resultados obtenidos por cada extracto a las concentraciones utilizadas. Con la ecuación de la gráfica que más se ajustó a cada ensayo (R2> 0,8) se hizo el cálculo de la DL50. El tipo de dispersión y el dato al que hace referencia la DL50 en cada ensayo se explica con detalle en la Tabla 23. ENSAYO TIPO DE DISPERSIÓN SIGNIFICADO DOSIS LETAL 50 (DL50) Ensayo de Eclosión de Huevos (EEH) Lineal Dosis de extracto necesaria para inhibir el desarrollo embrionario en el 50 % de los huevos Ensayo de Desarrollo Larvario (EDL) Logarítmica Dosis de extracto necesaria para inhibir el desarrollo larvario del 50 % de las larvas Ensayo de Parálisis Larvaria Logarítmica Dosis de extracto necesaria para inhibir la movilidad del 50 % de las larvas Ensayo de Viabilidad de Adultos Logarítmica Dosis de extracto necesaria para causar la muerte del 50 % de los vermes Ensayo de Inhibición de Esporulación de Ooquistes Exponencial Dosis de extracto necesaria para inhibir la esporulación del 50 % de los ooquistes Ensayo de Viabilidad de Esporozoítos Logarítmica Dosis de extracto necesaria para causar la muerte del 50 % de los esporozoítos Ensayo de Inhibición de la Invasión Celular Logarítmica Dosis de extracto necesaria para inhibir la invasión celular en un 50 % Tabla 23. Tipo de dispersión que siguieron los resultados de cada ensayo en relación a las concentraciones y significado de la dosis letal 50 (DL50) en cada caso. 4.7.2 ANÁLISIS DE LOS DATOS OBTENIDOS EN LOS ENSAYOS IN VIVO El análisis de los datos obtenidos en el ensayo in vivo se realizó de diferente forma según se tratara de recuentos de huevos de nematodos y recuentos de ooquistes por gramo de heces. Para el análisis de los recuentos de huevos por gramos de heces se realizaron las medias de todos los grupos por separado. Las medias obtenidas en los grupos tratados con extractos se representaron gráficamente y se compararon diariamente con los respectivos controles positivos (grupo D, animales infectados y no tratados). RESULTADOS 83 Figura 6. Estudio de la actividad antihelmíntica del extracto metanólico de planta entera de P. bituminosa. Ensayo de eclosión de huevos (A), ensayo de desarrollo larvario (B), ensayo de parálisis larvaria (C) y ensayo de viabilidad de adultos (D). En todos los ensayos se usó DMSO a diferentes concentraciones como control negativo. Significación estadística: P < 0,001 (***) y P < 0,01 (**); y P < 0,05 (*) para la actividad larvicida y adulticida; P < 0,001 (a), P < 0,01 (b) y P < 0,05 (c) para la actividad ovicida obtenida en el ensayo de eclosión de huevos. Al analizar el efecto adulticida se observó que el extracto de R. graveolens produjo la muerte de los vermes de forma significativa (P < 0,01) a todas las concentraciones ensayadas. A 25 mg/ml la mortalidad de los adultos fue de un 100 %, este porcentaje fue disminuyendo ligeramente en las siguientes concentraciones hasta el 85 % (0,25 mg/ml) (Fig. 7D). A *** B *** *** *** *** *** ** C D *** *** *** *** RESULTADOS 84 Figura 7. Estudio de la actividad antihelmíntica del extracto metanólico de planta entera de R. graveolens. Ensayo de eclosión de huevos (A), ensayo de desarrollo larvario (B), ensayo de parálisis larvaria (C) y ensayo de viabilidad de adultos (D). En todos los ensayos se usó DMSO a diferentes concentraciones como control negativo. Significación estadística: P < 0,001 (***) y P < 0,01 (**); y P < 0,05 (*) para la actividad larvicida y adulticida; P < 0,001 (a), P < 0,01 (b) y P < 0,05 (c) para la actividad ovicida obtenida en el ensayo de eclosión de huevos. 5.1.1.2. Actividad antihelmíntica de frutos Los resultados comentados en el apartado anterior muestran que, al valorar en conjunto los efectos ovicida, larvicida y adulticida, Ruta pinnata tuvo mayor actividad antihelmíntica que las otras dos ensayadas. Por este motivo, se decidió profundizar más en el estudio de la actividad antihelmíntica de esta planta, considerándose importante evaluar el efecto larvicida de sus frutos en distintos estados de maduración, dado que en otras especies con actividad antihelmíntica, es precisamente en los frutos donde se concentra una mayor cantidad de productos activos. Para ello se realizó el test de parálisis larvaria utilizando extractos elaborados a partir de frutos maduros y verdes. Como se redactó de forma más amplia en el apartado de materiales A a a * * *** *** *** *** *** ** ** ** B C *** *** *** *** D RESULTADOS 85 y métodos, en primer lugar se realizó una extracción con metanol (MeOH) y, a continuación, se llevó a cabo una segunda extracción con diferentes disolventes. 5.1.1.2.1. Estudio comparativo mediante EPL en frutos de R. pinnata con diferente grado de maduración utilizando distintos disolventes En la Figura 8 se muestran los resultados del ensayo de parálisis larvaria después de 24 horas de incubación del extracto metanólico crudo de frutos maduros (MeOH FrM Rp). Se observó que el efecto sobre las L3 de H. contortus del extracto era elevado, disminuyendo la movilidad de las larvas en un 100 % desde concentraciones de 12,5 mg/ml hasta 3,125 mg/ml. A continuación, la actividad disminuyó, manteniéndose en torno al 50 % entre concentraciones de 0,625 y 0,0625 mg/ml. Aunque el porcentaje de larvas inmóviles fue menor al 40 % en las menores concentraciones utilizadas en el ensayo, se siguieron mostrando diferencias significativas con el control negativo incluso a 0,015 mg/ml, donde la actividad observada fue 32,84 %. En base a estos resultados, la dosis eficaz inhibitoria 50 se estableció en 0,1 mg/ml. Esta actividad fue similar a la presentada por el control positivo (resultados no mostrados) en las distintas concentraciones utilizadas. Figura 8. Ensayo de parálisis larvaria. Actividad antihelmíntica del extracto metanólico elaborado con frutos maduros de Ruta pinnata (MeOH FrM Rp). Como control negativo se usó DMSO y como control positivo levamisol a diferentes concentraciones. Significación estadística P < 0,001 (***). La actividad antihelmíntica de las fracciones obtenidas a partir del extracto metanólico crudo y del extracto acuoso de los frutos maduros fue muy variable (Fig. 9). El extracto acuoso (Aq FrM Rp) (Fig. 9A) presentó una alta actividad larvicida a 25 mg/ml, concentración a la que el 90 % de larvas 3 eran inmóviles. A partir de esta concentración la actividad del extracto fue decreciendo en forma dosis dependiente hasta una concentración de 0,0125 mg/ml, donde el porcentaje de larvas inmóviles fue del 47,28 %. En todos los casos se encontraron diferencias significativas (P < 0,001). La *** *** *** *** *** *** *** RESULTADOS 86 fracción hexánica (MeOH+Hx FrM Rp) también mostró un efecto antihelmíntico estadísticamente significativo (P < 0,001) hasta una concentración de 0,625 mg/ml, siendo el porcentaje de larvas inmóviles del 100 %. Únicamente, no hubo diferencias con respecto al control negativo en la menor concentración utilizada en el ensayo (0,0625 mg/ml) (Fig. 9B). Cuando se utilizó la fracción de acetato de etilo (MeOH+Ac FrM Rp) el mayor porcentaje de larvas inmóviles que se observó fue del 72,66 % a una concentración de 25 mg/ml; a partir de esta concentración la actividad disminuyó de una forma dosis dependiente hasta alcanzar el 47 % a concentración de 0,0625 mg/ml. En todas las concentraciones se mostraron diferencias con el control negativo (P < 0,001) (Fig. 9C). Al contrario que las fracciones hexánicas y de acetato de etilo, la fracción elaborada con cloroformo (MeOH+Cl FrM Rp) no mostró un efecto larvicida elevado. En la Figura 9D se observa que dicho extracto sólo mostró una importante actividad a 25 mg/ml, concentración a la que el porcentaje de larvas inmóviles fue superior al 70 % (P < 0,001). En el resto de concentraciones utilizadas este porcentaje no superó el 40 %, aunque se encontraron diferencias significativas (P < 0,01) con respecto al control negativo a concentraciones de 6,25 mg/ml y 3,125 mg/ml. La actividad larvicida de los extractos elaborados a partir de frutos verdes de Ruta pinnata fue muy variada y se observaron grandes diferencias entre ellos (Fig. 10). En el extracto acuoso (Aq FrV Rp) el porcentaje de larvas inmóviles fue menor al 40 % en todas las concentraciones ensayadas, aunque se observaron diferencias significativas (P < 0,01 y P < 0,05) con el control negativo en algunas de ellas. La DL50 calculada para este extracto fue 0,04 mg/ml, siendo cuatro veces mayor al obtenido con el mismo tipo de extracto elaborado con frutos maduros. Por otro lado, las fracciones hexánica y de acetato de etilo, obtenidas del extracto metanólico de frutos verdes de Ruta pinnata, mostraron una actividad antihelmíntica similar a las mismas fracciones de frutos maduros. El extracto hexánico (MeOH+Hx FrV Rp) mostró una actividad cercana al 100 % a 25 mg/ml, a continuación disminuyó ligeramente manteniéndose el porcentaje de larvas inmóviles superior al 90 % hasta la concentración de 3,125 mg/ml. En las siguientes concentraciones (0,625 mg/ml y 0,0625 mg/ml) el efecto volvió a disminuir, pero las diferencias siguieron siendo significativas con respecto al control negativo (P < 0,001) (Fig. 10B). RESULTADOS 87 Figura 9. Ensayo de parálisis larvaria. Comparación de la actividad antihelmíntica del extracto acuoso (Aq FrM Rp) (A) y fracciones del extracto metanólico; fracción hexánica (MeOH+Hx FrM Rp) (B), fracción de acetato de etilo (MeOH+Ac FrM Rp) (C) y cloroformo (MeOH+Cl FrM Rp) (D) elaborado con frutos maduros de Ruta pinnata. Como control negativo se usó DMSO y como control positivo levamisol a diferentes concentraciones. Significación estadística P < 0,001 (***) y P < 0,01 (**). Al igual que el extracto anterior, la fracción de acetato de etilo de los frutos verdes (MeOH+Ac FrV Rp) mostró una actividad larvicida elevada. El porcentaje de larvas inmóviles fue superior al 85 % incluso a concentraciones de 0,625 mg/ml (P < 0,001). Solamente a concentración de 0,0625 mg/ml de extracto no se encontraron diferencias significativas con respecto al correspondiente control negativo (Fig. 10C). A *** *** *** *** *** *** *** *** *** B C *** *** *** *** *** D *** ** ** RESULTADOS 88 Figura 10. Ensayo de parálisis larvaria. Comparación de la actividad antihelmíntica del extracto acuoso (Aq FrV Rp) (A) y fracciones del extracto metanólico; fracción hexánica (MeOH+Hx FrV Rp) (B) y fracción de acetato de etilo (MeOH+Ac FrV Rp) (C) elaborado con frutos verdes de Ruta pinnata. Como control negativo se usó DMSO y como control positivo levamisol a diferentes concentraciones. Significación estadística P < 0,001 (***), P < 0,01 (**) y P < 0,05 (*). 5.1.1.2.2. Actividad ovicida, larvicida y adulticida de frutos maduros de R. pinnata mediante EEH, EDL y EVA. Como se comentó en el apartado anterior, el extracto metanólico elaborado a partir de frutos maduros de Ruta pinnata presentó una actividad larvicida significativa, incluso a concentraciones de 0,01 mg/ml. Por este motivo se realizó una evaluación de la actividad más amplia, realizándose ensayos de eclosión de huevos, ensayos de desarrollo larvario y ensayos de movilidad de adultos con dicho extracto. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 11. En el ensayo de eclosión de huevos, el extracto presentó una actividad ovicida del 100 % a concentraciones de 5 y 1,25 mg/ml, inhibiendo por completo el desarrollo de los huevos. Utilizando la siguiente concentración (0,31 mg/ml), la actividad ** ** * ** A B *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** C RESULTADOS 89 disminuyó al 55 %, siendo en este caso prácticamente igual el número de huevos no larvados que el de huevos larvados; además, a esta concentración, todas las larvas que lograron eclosionar se encontraban inmóviles. El porcentaje de huevos no embrionados continuó disminuyendo en las siguientes concentraciones, hasta ser menor del 10 % a las dos últimas concentraciones ensayadas. Paralelamente, el número de larvas L1 aumentó considerablemente, tanto las inmóviles como las móviles, siendo la mayoría inmóviles a 0,08 mg/ml, mientras que a concentración de 0,02 mg/ml la mayor parte de las larvas eran móviles (Fig. 11A). A estas concentraciones, el patrón observado en los correspondientes controles negativos de DMSO demostraba un predominio de L1 móviles (datos no mostrados), por lo que se encontraron diferencias significativas en ambos casos (P < 0,001 y P < 0,01, respectivamente), además, el efecto ovicida fue igual (100 %) al control positivo (datos no mostrados) utilizado en el ensayo en las mayores concentraciones de extracto (5 y 1,25 mg/ml). RESULTADOS 90 Figura 11. Estudio de la actividad antihelmíntica del extracto metanólico de frutos maduros de R. pinnata (MeOH FrM Rp). Ensayo de eclosión de huevos (A), ensayo de desarrollo larvario (B) y ensayo de viabilidad de adultos (C). En todos los ensayos se usó DMSO a diferentes concentraciones como control negativo. Significación estadística: P < 0,001 (***), P < 0,01 (**) y P < 0,05 (*) para la actividad larvicida y adulticida; P < 0,001 (a), P < 0,01 (b) y P < 0,05 (c) para la actividad ovicida obtenida en el ensayo de eclosión de huevos. La actividad larvicida del extracto metanólico de los frutos maduros de Ruta pinnata no sólo fue destacable inhibiendo la movilidad de las L3 (tal y como se describió en el apartado anterior), sino que, además, inhibió en altos porcentajes el desarrollo larvario. En la Figura 11B se observa que el extracto ensayado bloqueó totalmente el desarrollo larvario, incluso a concentraciones de 0,31 mg/ml. El efecto larvicida continuó siendo destacado y significativo (P < 0,001) a 0,02 mg/ml, concentración a la que el porcentaje de L3 fue menor del 20 %. La actividad antihelmíntica del extracto no sólo fue elevada frente a huevos y larvas sino que también lo fue frente a los adultos. Así, en todas las concentraciones utilizadas en el ensayo de viabilidad de adultos se obtuvo un actividad cercana al 100 %, incluso a concentraciones de 0,25 mg/ml, siendo las diferencias estadísticamente significativas con respecto a los controles negativos de DMSO (P < 0,001) (Fig. 11C). A a a a* *** ** *** *** *** *** *** B *** *** *** *** C RESULTADOS 91 5.1.1.3. Actividad antihelmíntica de cultivos in vitro de Ruta pinnata En el presente trabajo no sólo se evaluó la actividad antihelmíntica de extractos naturales elaborados a partir de las plantas ya mencionadas sino que, además, se utilizaron compuestos obtenidos a partir de cultivos in vitro de material vegetal de Ruta pinnata, cuya producción en condiciones de laboratorio podría ser de interés dado que se trata de una especie protegida. Como se comentó en el apartado de material y métodos, en primer lugar se realizó una extracción con metanol de los diferentes cultivos y, a partir de éstos, una segunda extracción con diferentes disolventes: hexano, acetato de etilo, cloroformo y agua. Todos ellos se analizaron mediante ensayos de parálisis larvaria (EPL). 5.1.1.3.1. Estudio comparativo mediante EPL de extractos metanólicos obtenidos de cultivos in vitro de material vegetal de Ruta pinnata en diferentes medios En la Figura 12 se muestran los resultados obtenidos en los ensayos de parálisis larvaria realizados con tres compuestos metanólicos cultivados in vitro en diferentes tipos de medio Murashige-Skoog (MS): el compuesto CM-134 fue cultivado en medio MSe, el compuesto CM-135 en medio MS6 más MS3 y, por último, el compuesto CM463.1 se cultivó en medio MS6. El compuesto CM-134 (Fig. 12A) mostró una actividad larvicida dosis dependiente: A una concentración de 12,5 mg/ml y después de 24 horas de incubación con el extracto, el porcentaje de larvas inmóviles fue del 85 %. A partir de esta concentración la actividad disminuyó progresivamente hasta el 30 %, siendo la DL50 igual a 0,26 mg/ml. La actividad del compuesto CM-134 mostró diferencias significativas (P < 0,001) con respecto al control negativo en todas las concentraciones ensayadas, a excepción de 0,0625 mg/ml, concentración en la ya no existieron diferencias respecto a la dilución correspondiente de DMSO. El compuesto CM-135 mostró una actividad similar al CM-134. Aunque con una DL50 mayor (0,81 mg/ml), su actividad siguió también un patrón dosis dependiente que comenzó en el 80 % (12,5 mg/ml) y decreció gradualmente hasta el 30 % a una concentración de 0,0625 mg/ml, mostrando diferencias significativas con el control negativo en todas las concentraciones analizadas (Fig. 12B). Sin embargo, el compuesto CM-463.1 no mostró una actividad tan marcada a las mismas concentraciones, ya que su efecto larvicida no superó el 30 % en ninguna de ellas, manteniéndose los resultados en valores no mucho más elevados que los de los correspondientes controles negativos; aun así, existieron diferencias (P < 0,05) entre ambos a concentraciones mayores de 0,12 mg/ml (Fig. 12C). RESULTADOS 92 Figura 12. Ensayo de parálisis larvaria. Comparación de la actividad antihelmíntica de extractos metanólicos obtenidos a partir de cultivos in vitro de material vegetal de R. pinnata en diferentes medios; compuesto CM-134 (medio MSe) (A), compuesto CM-135 (medios MS6 y MS3) (B) y compuesto CM-463.1 (medio MS6). Como control negativo se usó DMSO y como control positivo levamisol a diferentes concentraciones. Significación estadística P < 0,001 (***), P < 0,01 (**) y P < 0,05 (*). 5.1.1.3.2. Estudio comparativo mediante EPL de extractos elaborados a partir de cultivos in vitro de R. pinnata utilizando distintos disolventes Además de estudiar la actividad larvicida de extractos metanólicos elaborados a partir de diferentes cultivos in vitro de Ruta pinnata, se realizaron ensayos de parálisis larvaria con distintas fracciones del compuesto CM-463.1, preparado inicialmente mediante extracción metanólica. Mediante la segunda extracción se obtuvieron las siguientes fracciones: fracción hexánica (CM-466.1), fracción de cloroformo (CM467.1), fracción de acetato de etilo (CM-468.1) y fracción acuosa (CM-469.1). Los cuatro extractos mostraron actividad larvicida similar siendo significativa en tres de ellos, a diferencia de lo descrito anteriormente para compuesto CM-463.1 a A *** *** *** *** B *** *** *** *** * C ** * * * RESULTADOS 99 Figura 17. Ensayo de inhibición de la esporulación de ooquistes. Se evaluó el efecto anticoccidiósico de extracto acuoso de frutos maduros de R. pinnata (Aq FrM Rp) 24 horas después del lavado. Como control positivo se usó formaldehído 10% y como control negativo DMSO a diferentes concentraciones. Significación estadística P < 0,01 (**). 5.1.2.1.3. Evaluación de la actividad anticoccidiósica de compuestos elaborados a partir de cultivos in vitro de Ruta pinnata Todos los extractos de cultivos in vitro de material vegetal de Ruta pinnata procedentes de los tres ensayados no mostraron una actividad anticoccidiósica relevante, siendo los resultados obtenidos prácticamente iguales al control negativo utilizado, excepto para la mayor concentración de extracto utilizada (25 mg/ml). A esta concentración, los extractos CM-134 y CM-135 mostraron un porcentaje de ooquistes esporulados en torno al 70 %, significativamente menor que el encontrado en los correspondientes controles negativos (P < 0,001 y P < 0,01, respectivamente) (Fig. 18A y Fig. 18B). También se observaron diferencias significativas al comparar el extracto CM-140 con los controles negativos a concentraciones de 25 mg/ml (65 % de esporulación, P < 0,001) y 12,5 mg/ml (83 % esporulación, P < 0,05). Sin embargo, a partir de esta concentración el porcentaje de esporulación aumentó progresivamente hasta ser prácticamente igual al del control negativo (Fig. 18C). La dosis eficaz 50 (dosis a la cual el 50 % de los ooquistes están esporulados) para los tres extractos in vitro fueron muy elevadas en comparación con obtenidas para los extractos naturales: 78,81 mg/ml, 60,83 mg/ml y 48,90 mg/ml para los extractos CM-134, CM-135 y CM-140, respectivamente. ** ** ** ** RESULTADOS 100 Figura 18. Ensayo de inhibición de la esporulación de ooquistes. Se evaluó la actividad anticoccidiósica de compuestos elaborados a partir de cultivos in vitro de R. pinnata a diferentes concentraciones después de 24 horas de incubación. CM-134, extracto metanólico elaborado a partir de un cultivo in vitro en medio nutritivo MSe (A); CM-135, extracto metanólico de un cultivo in vitro de células de Ruta pinnata en medios nutritivos MS6 y MS3 (B) y CM-140; extracto metanólico elaborado a partir de un cultivo in vitro de material vegetal de Ruta pinnata (C). Como control positivo se usó formaldehído al 10% y como control negativo DMSO a diferentes concentraciones. Significación estadística P < 0,001(***), P < 0,01 (**) y P < 0,05 (*). 5.1.2.1.4. Estudio dosis-dependiente de la actividad anticoccidiósica en diferentes periodos de incubación La capacidad del extracto metanólico de frutos maduros de Ruta pinnata (MeOH FrM Rp) y del compuesto CM-475.3 (fracción de acetato de etilo obtenido a de un compuesto metanólico elaborado a partir de un cultivo in vitro de material vegetal de Ruta pinnata) para inhibir la esporulación de ooquistes de E. ninakohlyakimovae se evaluó, en un estudio dosis-dependiente, a distintos periodos de incubación: 30 minutos, 4 y 24 horas. A B C *** ** *** * RESULTADOS 101 En la Figura 19 se observa cómo el extracto metanólico aumentó su actividad a medida que aumentó el periodo de incubación desde 30 minutos hasta 24 horas. Tras 30 minutos de incubación (Fig. 19A), el número de ooquistes esporulados fue similar al del control negativo en todas las concentraciones utilizadas, excepto a 3 mg/ml, concentración a la que se encontraron diferencias significativas (P < 0,01). Cuando el periodo de incubación se incrementó hasta 4 horas, las diferencias con respecto al control negativo se observaron a 3 y 1,5 mg/ml, concentraciones a las que el porcentaje de ooquistes esporulados fue cercano al 50 %. Sin embargo, a partir de 0,75 mg/ml, los porcentajes de esporulación fueron similares a los encontrados para las correspondientes concentraciones de DMSO (Fig. 19B). Después de 24 horas de incubación (Fig. 19C), la actividad del extracto metanólico de frutos maduros de Ruta pinnata aumentó considerablemente, alcanzándose porcentajes de ooquistes no esporulados en torno al 80 % a una concentración de 3 mg/ml (P < 0,001). Un mismo grado de significación se encontró, incluso, a 0,75 mg/ml, concentración a la que el número de ooquistes esporulados no superó el 40 %. Esta actividad fue comparable a la del formaldehído al 10% utilizado como control positivo (datos no mostrados). A concentraciones menores no se observaron diferencias con respecto al control negativo utilizado. La diferencia de actividad en función del tiempo de exposición de los ooquistes a los extractos también ser observó al calcular la dosis eficaz. A los 30 minutos de incubación no fue posible hacer el cálculo de la DL50 debido a las características de la curva obtenida; después de 4 horas de exposición al extracto la dosis necesaria para provocar la inhibición del 50 % de los ooquistes fue de 3,644 mg/ml, disminuyendo hasta 0,88 mg/ml cuando el tiempo de incubación se extendió hasta las 24 horas. RESULTADOS 102 Figura 19. Ensayo de inhibición de la esporulación de ooquistes. Se evaluó el efecto dosis dependiente de la actividad anticoccidiósica del extracto metanólico de frutos maduros de R. pinnata (MeOH FrM Rp) a diferentes concentraciones tras 30 minutos (A), 4 horas (B) y 24 horas de incubación (C). Como control positivo se usó formaldehído al 10% y como control negativo DMSO a diferentes concentraciones. Significación estadística P < 0,001(***) y P < 0,01 (**). Los resultados obtenidos con el compuesto CM-475.3 se representan en la Figura 20. Dicho extracto no mostró actividad anticoccidiósica significativa prácticamente en ninguna de las concentraciones ensayadas y, por tanto, no se encontraron diferencias de efecto inhibitorio de la esporulación entre los distintos periodos de incubación. Únicamente se produjo un ligero descenso del número de ooquistes esporulados después de 24 horas de incubación a 3 mg/ml, concentración a la que el porcentaje de ooquistes esporulados fue del 70 % en comparación con el 85% encontrado en el correspondiente control negativo; sin embargo, esta disminución no fue significativa. A B C ** *** ** *** *** *** RESULTADOS 103 Figura 20. Ensayo de inhibición de la esporulación de ooquistes. Se evaluó efecto dosis dependiente de la actividad anticoccidiósica del compuesto CM-475.3 (fracción de acetato de etilo del extracto metanólico del cultivo inicial CM-475) a diferentes concentraciones tras 30 minutos (A), 4 horas (B) y 24 horas de incubación (C). Como control positivo se usó formaldehído al 10% y como control negativo DMSO a diferentes concentraciones. 5.1.2.2. Ensayo de viabilidad de esporozoítos Este ensayo permitió evaluar el efecto de los extractos naturales sobre la forma infectante de E. ninakohlyakimovae y así frenar el comienzo del ciclo endógeno. Para tal fin se evaluó la actividad anticoccidiósica del extracto metanólico de frutos maduros de R. pinnata (MeOH FrM Rp). El efecto sobre los esporozoítos de E. ninakohlyakimovae fue dosis dependiente (DL50: 0,48 mg/ml), tal y como muestra la Figura 21. Después de 3 horas de incubación y a concentraciones de 10 y 5 mg/ml se produjo el 100 % de mortalidad de los esporozoítos, el mismo efecto que produjo la acción del calor (control positivo). A partir de estas concentraciones, la actividad anticoccidiósica del extracto disminuyó progresivamente hasta llegar al 20 % de mortalidad a 0,025 mg/ml, concentración a la cual no se observó ninguna diferencia A B C RESULTADOS 104 significativa respecto al control negativo. La actividad de dicho extracto sí fue significativa (P < 0,001) desde 10 mg/ml hasta 0,5 mg/ml, destacando que a 0,625 mg/ml la mortalidad de los esporozoítos fue cercana al 50 % y que incluso a concentraciones de 0,1 mg/ml se mostraron diferencias significativas (P < 0,01) respecto al control negativo utilizado. Figura 21. Ensayo de viabilidad de esporozoítos. Se evaluó el efecto anticoccidiósico del extracto metanólico de frutos maduros de R. pinnata (MeOH FrM Rp) a diferentes concentraciones tras 3 horas de incubación. Como control negativo se empleó DMSO. Significación estadística P < 0,001 (***) y P < 0,01 (**). 5.1.2.3. Ensayo de inhibición de la invasión celular Con este ensayo se pretendió evaluar si los extractos eran capaces de inhibir la capacidad de los esporozoítos de invadir células cultivadas mediantes sistemas in vitro. Como en el ensayo anterior, con tal fin se utilizó un extracto metanólico de frutos maduros de R. pinnata (MeOH FrM Rp). En la Figura 22 se representan el porcentaje de células invadidas después de 24 horas de incubación con esporozoítos tratados durante 3 horas con diferentes concentraciones de dicho extracto metanólico, DMSO (control negativo) y sulfadoxina/trimetropin (control positivo). *** *** *** *** *** *** ** RESULTADOS 105 Figura 22. Ensayo de inhibición de la invasión celular. Se evaluó el efecto anticoccidiósico del extracto metanólico de frutos maduros de R. pinnata a diferentes concentraciones tras 3 horas de incubación. Como control negativo se empleó DMSO y como control positivo sufaldoxina/trimetropin a diferentes concentraciones. Significación estadística P < 0,001 (***) y P < 0,05 (*). El porcentaje de células invadidas fue significativamente menor (P < 0,001) en los cultivos incubados con esporozoítos tratados, no llegando a superar el 1 % a una concentración de extracto de 5 mg/ml (C1) (Fig. 23A). El efecto sobre la capacidad de invasión de los esporozoítos fue destacado hasta 0,5 mg/ml (C3), concentración a la que el porcentaje de células invadidas fue menor del 3 %. A 0,1 mg/ml el número de células invadidas por esporozoítos aumentó hasta valores próximos al 15 %; aun así, las diferencias fueron significativas (P < 0,05) (Fig. 23B). Únicamente a 0,01 mg/ml, la menor concentración empleada, no se encontraron diferencias respecto al correspondiente control negativo. La incubación de los esporozoítos, con distintas concentraciones de sulfadoxina/trimetropin durante el mismo periodo de tiempo sólo redujo de forma ligera la capacidad de invasión de los mismos; únicamente a la mayor concentración utilizada (10/2 µg/ml) se observó niveles de invasión similares al extracto y significativamente menores que los del control negativo. Tras esta concentración, el porcentaje de células invadidas aumentó hasta mostrar valores prácticamente iguales a los observados para el DMSO (Fig. 22). *** *** *** * RESULTADOS 106 Figura 23. Ensayo de inhibición de la invasión celular por esporozoítos de Eimeria ninakohlyakimovae. Cultivo in vitro de células epiteliales de colon bovino (BCEC). Imagen tomada a 40x después de 24 horas de incubación con esporozoítos tratados con 5mg/ml el extracto metanólico de frutos maduros de R. pinnata (A) y esporozoítos sin tratar (control negativo) (B). Se han señalado mediante flechas los esporozoítos que se encuentran en el interior de las células. 5.2. EVALUACIÓN DE LA CITOTOXICIDAD DE LOS EXTRACTOS Se realizaron ensayos de citotoxicidad en cultivos celulares in vitro tanto en BCECs como en células VERO utilizando el extracto metanólico de frutos maduros de R. pinnata con el fin de descartar que la planta pudiera ocasionar daños en el organismo vivo. Los resultados obtenidos en el ensayo de citotoxicidad mostraron que el extracto utilizado no producía muerte celular significativa en ninguno de los cultivos celulares. A la mayor concentración utilizada de extracto (3 mg/ml) se observó una A B RESULTADOS 107 intensidad de fluorescencia de 3,34 AU en los cultivos de BCEC (Fig. 24A), siendo este valor mayor al DMSO. Sin embargo, a las siguientes concentraciones los valores de intensidad de fluorescencia fueron similares a los correspondientes controles. En el caso de las VERO no existieron diferencias entre el extracto y el control negativo en ninguna de las concentraciones utilizadas, oscilando los valores de intensidad de fluorescencia entre 3,95 y 3,41 AU (Fig. 24B). Figura 24. Ensayo de citotoxicidad. Se evaluó el efecto citotóxico del extracto metanólico de frutos maduros de R. pinnata a diferentes concentraciones en cultivos in vitro de BCEC (A) y células VERO (B). Como control negativo se empleó DMSO a diferentes concentraciones. 5.3. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIPARASITARIA MEDIANTE ENSAYOS IN VIVO Para completar el análisis de la actividad antiparasitaria de R. pinnata, se realizó un ensayo in vivo con caprinos de 6 meses de edad inoculados experimentalmente con H. contortus y E. ninakohlyakimovae y que, posteriormente, se trataron con dos tipos de extractos: extracto metanólico de frutos maduros de Ruta pinnata (CM-480) y extracto procedente de un cultivo in vitro de la planta (CM-472). Con el objeto de evaluar la actividad antiparasitaria in vivo de ambos extractos se monitorizó la sintomatología que presentaron los diferentes grupos de animales, el número de huevos por gramo de heces (HPG), el número de ooquistes por gramo de heces (OPG) y la identificación de las diferentes especies de Eimeria presentes en las muestras de heces. 5.3.1. SINTOMATOLOGÍA Para la evaluación de la sintomatología se observaron tanto el estado general del animal (estado corporal, mucosas…) como la consistencia de las heces (Tabla 24). A B RESULTADOS 108 Los animales del grupo E (animales no inoculados) fueron tomados como controles de la experiencia. Éstos no mostraron ningún síntoma o cambio en el estado de las heces durante el ensayo. Como se observa la Figura 24, los animales pertenecientes al grupo D (inoculados y no tratados) mostraron una clínica severa durante toda la experiencia. En la mayoría de ellos se produjo una disminución del peso corporal y algunos presentaban, incluso, edema submandibular. Además, las mucosas, tanto la bucal como la conjuntival, presentaban una coloración blanquecina, debido a la anemia provocada por la acción hematófaga de H. contortus. Todos animales presentaron un cuadro diarreico con heces líquidas verde amarillentas que, en ocasiones, tenían un tinte sanguinolento o estaban acompañadas de restos de la mucosa intestinal. Figura 24. Estado general de los animales pertenecientes al grupo D (animales inoculados y no tratados). En la primera fase de la experiencia, los animales del grupo C (inoculados y tratados con antiparasitarios comerciales) presentaron cuadros diarreicos graves y un gran deterioro de la condición corporal, llegando a morir algunos animales. Después del tratamiento con ivermectina y diclazuril remitieron todos los síntomas, los animales comenzaron a recuperarse y desaparecieron las diarreas pocos días después. En general, los animales del grupo A (animales inoculados y tratados con el extracto metanólico de frutos maduros de Ruta pinnata) presentaron una clínica entre moderada y grave, con diarreas al comienzo de la experiencia que desaparecieron después del tratamiento. Una situación clínica similar se observó en los animales pertenecientes al grupo B (animales inoculados y tratados con el extracto CM-472). Las diarreas con tinte sanguinolento se intercalaron con la presencia de hemorrágicas con heces pastosas durante la primera fase del experimento y al final del experimento la mayoría de los animales recuperaron su estado corporal y los síntomas desaparecieron por completo. Los signos clínicos mostrados en los grupos A y B fueron los propios de una infección por nematodos y coccidios, no observándose en ninguno de los animales síntomas compatibles con intoxicación debida a la administración de los extractos. RESULTADOS 115 La especies encontradas en el Grupo C fueron en su mayoría E. arloingi y E. christenseni en porcentajes que rondaron el 60 % y el 40 %, respectivamente, durante toda la experiencia. Estos porcentajes variaron únicamente entre los días 14 y 16 p.i., coincidiendo con el pico de eliminación de ooquistes de E. ninakohlyakimovae. Los valores máximos de OPG para esta especie se registraron el día 15 p.i., llegando a ser su porcentaje relativo superior al 90 %. A partir de este día la población de coccidios volvió a restablecerse hasta el día 22 postinfección, donde el recuento fue 0 debido a la administración del diclazuril (Fig. 29B). Figura 29. Recuento de ooquistes por gramo de heces (A) y especiación (B) correspondientes al grupo C (animales inoculados y tratados con diclazuril). B A RESULTADOS 116 En la Figura 30 se muestran los resultados obtenidos de la evaluación de la actividad anticoccidiósica in vivo del grupo A, constituido por animales que fueron inoculados con Eimeria ninakohlyakimovae y tratados el día 17 p.i. con el extracto metanólico de frutos maduros de Ruta pinnata. El recuento de ooquistes aumentó de 2208 a 259333 del día 14 al 15 p.i., a continuación descendió ligeramente hasta el día 17Pi, día del tratamiento con el extracto natural. Después de la administración del extracto los recuentos de OPG siguieron disminuyendo y se mantuvieron en torno a 8000 ooquistes por gramo de heces hasta el final de la experiencia (Fig. 30A). Los resultados de la especiación demostró que en los animales pertenecientes a este grupo la especie mayoritaria se correspondía con E. arloingi. Como en otros grupos infectados, la alta presentación de dicha especie disminuyó entre los días 15 y 17 postinfección coincidiendo con el pico de eliminación de ooquistes de Eimeria ninakohlyakimovae. El resto de especies encontradas no superaron el 30 %, entre ellas E. christenseni y E. alijevi. RESULTADOS 117 Figura 30. Recuento de ooquistes por gramo de heces (A) y especiación (B) correspondientes al grupo A (animales inoculados y tratados con el extracto metanólico de frutos maduros de Ruta pinnata. El número de ooquistes se mantuvo relativamente constante durante todo el experimento en el grupo B (animales inoculados y tratados con el extracto CM-472). En la Figura 31A se observa que los recuentos se mantuvieron en 60000 ooquistes por gramo de heces, incluso después del tratamiento con el extracto. Los porcentajes de especies reconocidas en el Grupo B fueron similares a los del Grupo A. La especie predominante fue, durante todo el periodo de experimentación, E. arloingi. Sólo se observaron menores porcentajes para esta especie en los días donde se produjo el pico de eliminación de ooquistes de E. ninakohlyakimovae llegando a ser dicho pico superior al 90 % el día 15 p.i. En el resto de especies diferenciadas la frecuencia de presentación osciló entre 25 % (E. crhistenseni) y 6 % (E. alijevi y E. caprina) (Fig. 31B). A B RESULTADOS 118 Figura 31. Recuento de ooquistes por gramo de heces (A) y especiación (B) correspondientes al grupo B (animales inoculados y tratados con el compuesto metanólico in vitro CM-472). A B Discusión DISCUSIÓN 119 En el presente trabajo se han realizado ensayos in vitro e in vivo para determinar la actividad antihelmíntica y anticoccidiósica de un gran número de extractos elaborados a partir de plantas pertenecientes a la flora canaria como Ruta pinnata, Psoralea bituminosa y Ruta graveolens. A partir de los resultados obtenidos, también se analizaron estos efectos de extractos procedentes de cultivos in vitro de material vegetal de Ruta pinnata en distintos medios nutritivos. Constituye el primer trabajo en el cual se han utilizado derivados de las rutáceas propias de la flora canaria para evaluar sus posibles propiedades antiparasitarias frente a nematodos y coccidios que afectan al ganado caprino. Otros autores también han llevado a cabo estudios comparativos con diferentes familias en los cuales se demuestra que ciertas especies pertenecientes a la familia Rutaceae, como Ruta graveolens, poseen propiedades antiparasitarias que son frecuentemente utilizadas en la medicina tradicional en el centro de Italia (Guarrera, 1999). Los datos obtenidos de los diferentes ensayos in vitro, realizados tanto con el nematodo de pequeños rumiantes Haemonchus contortus como con el coccidio Eimeria ninakohlyakimovae, demuestran que varios de los extractos utilizados muestran una marcada actividad antiparasitaria, destacando el extracto metanólico elaborado a partir de frutos maduros de Ruta pinnata. Dicho extracto presenta una alta actividad, no sólo frente a todos los estados parasitarios de H. contortus, sino también frente a diferentes fases del ciclo biológico del coccidio investigado en este estudio. La utilización de este mismo extracto, en los ensayos in vivo derivó en una disminución de los recuentos fecales de huevos del nematodo en los animales tratados, pero su efecto no fue tan patente al analizar la actividad anticoccidiósica. Otros extractos utilizados en el estudio también mostraron una elevada actividad antiparasitaria, aunque no tan marcada como el anterior. Así, en los extractos metanólicos elaborados a partir de plantas enteras de R. graveolens y P. bituminosa se observó que presentaban diferentes niveles de actividad antihelmíntica, aunque, en general su efecto, no fue tan marcado como el que mostró el extracto homólogo de Ruta pinnata. De igual forma, la actividad anticoccidiósica frente a E. ninakohlyakimovae fue mayor en R. pinnata que en las otras dos plantas. Los resultados obtenidos con los extractos elaborados con distintos disolventes, así como los elaborados a partir de frutos de Ruta pinnata con distinto grado de maduración, fueron variables, destacando la actividad antihelmíntica mostrada por la fracción hexánica de extractos metanólicos. El efecto antihelmíntico de los extractos también varió en función del tipo de cultivo in vitro de material vegetal de Ruta pinnata empleado. Por ejemplo, los compuestos CM-134 y CM-135 mostraron una importante actividad antihelmíntica, dosis dependiente, tanto frente a larvas como adultos de H. contortus, mientras que las fracciones analizadas del compuesto CM463.1 sólo mostraron una alta actividad frente a las formas larvarias de este nematodo. A diferencia de lo observado en los ensayos realizados con nematodos, la actividad anticoccidiósica de los extractos obtenidos a partir de cultivos in vitro de R. pinnata no fue tan significativa. Con ninguno de ellos se obtuvo un resultado similar al encontrado en los extractos naturales utilizados en los ensayos in vitro con el coccidio ensayado. DISCUSIÓN 120 Todos estos resultados se discutirán con más detalle a continuación. En primer lugar se analizarán por separado los resultados de los ensayos realizados in vitro con nematodos y coccidios y, a continuación, los correspondientes a la experiencia in vivo. 6.1 ENSAYOS IN VITRO 6.1.1. ACTIVIDAD ANTIHELMÍNTICA La actividad antihelmíntica de los diferentes extractos fue evaluada mediante ensayos in vitro donde se utilizaron distintos estadios del nematodo de pequeños rumiantes Haemonchus contortus. Los resultados de los diferentes ensayos (ensayo de eclosión de huevos, desarrollo larvario, parálisis larvaria y viabilidad de adultos) demuestran que los extractos metanólicos de las partes aéreas de las tres plantas seleccionadas poseen, en general, de moderada a alta actividad antihelmíntica. El hecho de que muchos de los extractos analizados tuvieran efecto, tanto frente huevos, como frente a larvas y adultos del parásito, se considera de gran transcendencia ya que su empleo con fines profilácticos o terapéuticos podría interferir en las diferentes fases del ciclo biológico del parásito. Ruta pinnata mostró una actividad ovicida elevada a concentraciones de 5 mg/ml, con una inhibición de la eclosión de los huevos del 95 %, disminuyendo la actividad de forma dosis dependiente a concentraciones menores. Estos resultados fueron similares a los obtenidos en el ensayo homólogo realizado con el extracto metanólico de Ruta graveolens, en el que se observó que el porcentaje de huevos no larvados estaba próximo al 90 % a una concentración de 1,25 mg/ml; de igual forma, el efecto del extracto disminuyó de forma dosis dependiente. Por el contrario, no se observó actividad ovicida al emplear el extracto homólogo elaborado con partes aéreas de Psoralea bituminosa, no superándose más allá del 10 % el porcentaje de huevos no embrionados con ninguna de las concentraciones utilizadas. Numerosos estudios también han valorado la actividad ovicida de diferentes compuestos vegetales frente a los huevos de H. contortus, con resultados similares a los encontrados en el presente trabajo. Así, un ensayo realizado por Macedo et al. (2012) con extractos elaborados a partir de diferentes plantas pertenecientes a la flora brasileña y utilizadas comúnmente en la medicina tradicional de país mostró, que Mentha villosa y Tagetes minuta poseen efecto ovicida frente a los huevos de H. contortus, inhibiendo su eclosión en un 97,6 y un 96,8 % respectivamente a una concentración de 2,5 mg/ml. Por otro lado, en un estudio donde se analizaron diferentes plantas usadas frecuentemente como terapia natural en Sudáfrica, tres de ellas (Heteromorpha trifoliata, Leucosidea serícea y Maesa lanceolata) presentaron una importante actividad ovicida (Adamu et al., 2013). También se ha observado que los extractos elaborados a partir de Mentha piperita, Lippia sdoides y Piper tuberculatum mostraban una actividad ovicida similar al albendazol, fármaco empleado como control positivo del ensayo; por el contrario, los autores no pudieron demostrar ningún efecto antihelmíntico cuando utilizaron la planta Carapa guianensis (Carvalho et al., 2012). DISCUSIÓN 121 Dentro del orden Strongylida, al cual pertenece H. contortus, lo habitual es que en el ciclo exógeno de H. contortus los huevos no embrionados liberados con las heces del hospedador desarrollen en el medio una larva de primer estado en su interior (L1), la cual, tras la eclosión, evoluciona posteriormente a los estados de L2 y L3, siendo esta última larva el elemento infectante (Urquhart et al., 2001). La capacidad de los extractos para detener la evolución de los huevos se considera, por tanto, de gran interés, ya que permitiría cortar el ciclo exógeno del parásito y con ello reducir las posibilidades de contagio de otros animales a partir de las larvas 3 del pasto. Puesto que, tal y como se ha comentado anteriormente, el ciclo evolutivo de H. contortus incluye diferentes estados larvarios, aparte del estudio de la actividad ovicida de los extractos, se llevó a cabo una evaluación del efecto larvicida de los mismos. Para ello se realizaron dos tipos de análisis: el ensayo de desarrollo larvario y el ensayo de movilidad larvaria, el primero de ellos para evaluar la actividad sobre los estados larvarios L1 y L2 y el segundo para valorar el efecto de los extractos sobre las L3 infectantes. El efecto sobre la evolución de las larvas de H. contortus de R. pinnata fue del 100 % cuando se utilizó la mayor concentración; esta actividad fue disminuyendo a medida que lo hicieron las concentraciones. Aunque la inhibición del desarrollo larvario obtenida no pueda, a priori, considerarse elevada, la DL50 (0,075 mg/ml) del extracto metanólico de R. pinnata fue menor que la encontrada en otros estudios realizados con diferentes plantas, como Heteromorpha trifolia (DL50 0,64 mg/ml) (Adamu et al., 2013). El efecto sobre el desarrollo larvario se observó en todas las concentraciones cuando el ensayo se realizó con el extracto metanólico de R. graveolens, llegando a ser estadísticamente significativo hasta 0,02 mg/ml, concentración a la que el número de L3 viables fue menor al 20 %. El efecto larvicida de esta otra rutácea fue, por tanto, destacado. El resultado obtenido en esta prueba con P. bituminosa demostró que la planta era capaz de inhibir el desarrollo larvario en un 100% hasta una concentración de 0,08 mg/ml y cercano al 90 % a 0,02 mg/ml. En base a estos resultados, se podría considerar que el extracto metanólico de P. bituminosa posee mayor actividad larvicida que las especies de Ruta. Sin embargo, durante la realización del ensayo con esta planta se produjo un crecimiento bacteriano en todas las placas utilizadas, por lo que no se podría afirmar que la alta actividad antihelmíntica encontrada fuese debida al extracto en sí. Se desconoce el porqué de este sobrecrecimiento bacteriano, ya que todos los extractos utilizados fueron elaborados de la misma forma. No obstante, puesto que P. bituminosa es comúnmente utilizada como forraje para el ganado debido a su alto valor nutritivo, no sería descartable que los extractos de la planta pudieran haber constituido un estimulante del crecimiento de las bacterias ya existentes en el filtrado de huevos. A parte del efecto ovicida y larvicida, es importante reseñar la actividad que presentaron los extractos de plantas enteras como adulticida, considerándose el efecto más destacado, ya que, a bajas concentraciones, todos ellos produjeron altos porcentajes de mortalidad de los vermes. Así, los porcentajes de disminución de la viabilidad de los adultos fueron superiores al 50 % a una concentración de 0,25 mg/ml DISCUSIÓN 122 después de 24 horas de incubación con P. bituminosa y R. graveolens, siendo menor la actividad adulticida de R. pinnata, la cual mostró un efecto vermicida superior al 80 % a una concentración de 5 mg/ml. Aparentemente, según los resultados obtenidos en los ensayos de viabilidad de adultos, se podría considerar que los extractos metanólicos de R. graveolens y P. bituminosa presentaron mayor actividad adulticida que el mismo extracto de R. pinnata. Sin embargo, estos resultados han de interpretarse con precaución ya que en los ensayos realizados con las dos primeras plantas se obtuvieron valores de mortalidad elevados (superiores al 30 %) en todas las concentraciones utilizadas en el control negativo (DMSO), por lo que parte de los porcentajes de la mortalidad mostrada por los extractos de R. graveolens y P. bituminosa podría haber sido debida a la muerte natural de los vermes y no al efecto del extracto en sí. Al igual que en el presente estudio, también se ha demostrado actividad adulticida frente a H. contortus utilizando otras plantas. Por ejemplo, los extractos acuoso y etanólico de Artemisia absithium, produjeron la muerte de los vermes en un elevado porcentaje, 73,6 y 94,7 % respectivamente (Tariq et al., 2009). De igual forma, los extractos de Swertia chirata (Iqbal et al., 2006), así como los de Chenopodium album y Caesalpinia crista, también se ha demostrado que presentan una importante actividad vermicida, siendo capaces de provocar la muerte de los adultos en altos porcentajes (Jabbar et al., 2007). Comparando los resultados obtenidos en estos estudios con la actividad adulticida presentada por el extracto de R. pinnata a iguales concentraciones (25 mg/ml, por ejemplo), la actividad de la ruta fue considerablemente mayor; en concreto, a dicha concentración se obtuvo una mortalidad de adultos del 100 %. Tampoco los extractos de otras plantas mostraron una actividad adulticida tan alta frente a los vermes adultos de H. contortus como Ruta pinnata. Así, los extractos metanólico y dihiclorometano elaborados con semillas de Curcubita moschata, a la cual se le atribuye un potente efecto tenicida, mostraron un efecto adulticida que no llegó a superar el 59,2 % tras 24 horas de incubación a la mayor concentración utilizada (Marie-Magdeleine et al., 2009). Incluso menor (46 %) fue el porcentaje de mortalidad de adultos inducido por el extracto de diclorometano de hojas de Musa parasidiaca (Marie-Magdeleine et al., 2014). Analizando los resultados de los ensayos comentados anteriormente, se puede observar que existen diferencias en la actividad de los extractos en función del estado parasitario utilizado. De acuerdo con esto, los resultados publicados por Carvalho et al. (2012), donde se evaluó la actividad antihelmíntica de diferentes plantas frente a H. contortus, demostraron que los extractos de Hura crepitans inhibían completamente el desarrollo de las L1 hasta L3, mientras que el efecto ovicida no superó el 16,84 % a concentraciones similares. De igual forma, en el presente trabajo, los extractos de P. bituminosa y R. graveolens no presentaron una actividad larvicida destacada frente a las L3, según demostraron los resultados del ensayo de movilidad larvaria, y su actividad ovicida fue baja y moderada, respectivamente, sin embargo, ambas plantas sí inhibieron en un elevado porcentaje el desarrollo larvario. Por el contrario, el extracto metanólico de R. pinnata presentó porcentajes de parálisis larvaria superiores al 50 % con concentraciones de 0,625 mg/ml, siendo esta actividad significativa hasta 0,0625 mg/ml, mientras el efecto sobre el desarrollo larvario no fue tan destacado. DISCUSIÓN 123 Finalmente, los extractos metanólicos y acuosos de tallo de Musa paradisiaca empleados por Marie-Magdeleine et al. (2014), los cuales no tuvieron ningún efecto sobre la eclosión de los huevos y una actividad adulticida moderada, sí mostraron una actividad larvicida destacada, con porcentajes de inhibición del desarrollo larvario prácticamente iguales a los mostrados por el control positivo. En su conjunto, la evaluación de los resultados de la actividad antihelmínticas de las tres plantas demuestran que los extractos de la planta entera de R. pinnata podrían considerarse como los de mayor actividad, pues no sólo presentan una alta actividad ovicida y larvicida importante (en particular en lo referente a las L3 infectantes) sino que, además, disminuyen la viabilidad de los vermes adultos de H. contortus. Por tanto, la planta podría emplearse tanto para reducir la carga infectante en el medio como para abortar infecciones. Una importante actividad larvicida también se ha demostrado en compuestos procedentes de otras plantas, como los flavonoides procedentes de Struthida argéntea, cuya actividad larvicida llegó a ser de un 90 % a muy bajas concentraciones (Ayers et al., 2008). Igualmente, otros autores han demostrado un importante efecto frente a larvas de H. contortus de plantas como Curcubia moschata, capaz de paralizar a las L3 hasta en un 90 % (Marie-Magdeleine et al., 2009) o Spigelia athelmia Linn, con actividad larvicida del 80 % (Assis et al., 2003). Por último, en un estudio reciente donde se utilizó el ensayo de migración larvaria para evaluar el efecto del aceite esencial de Artemisia lacea frente a las L3 de H. contortus, se observó una actividad antihelmíntica significativa, con disminuciones de la movilidad larvaria de hasta el 77 % (Zhu et al., 2013). En base a la mayor actividad antihelmíntica frente a H. contortus encontrada en el extracto metanólico elaborado a partir de R. pinnata en el primer screening realizado con las tres plantas, se diseñó un estudio más profundo para analizar las propiedades antiparasitarias de este endemismo canario. Para ello, se realizaron diferentes ensayos in vitro con distintas partes de la planta, concretamente con frutos, tanto maduros como verdes, utilizando, además, distintos disolventes para la elaboración de extractos. En dichos ensayos se empleó el test de movilidad larvaria para la evaluación de la actividad larvicida frente a las L3 de H. contortus. A partir de los frutos maduros de R. pinnata se elaboraron un extracto acuoso y uno metanólico, a partir de los cuales ser realizó una segunda extracción con diferentes disolventes, obteniéndose de esta forma un total de cuatro fracciones. Mediante el mismo procedimiento se elaboraron los extractos de frutos verdes, aunque no se utilizó el extracto metanólico crudo en los ensayos por falta de disponibilidad. De todos los extractos ensayados, destacó la actividad larvicida del extracto metanólico de frutos maduros, observándose que fue capaz de inhibir la movilidad larvaria significativamente, incluso a una concentración de 0,015 mg/ml. Este resultado fue similar al obtenido con el extracto acuoso, que también mostró diferencias significativas con el control negativo a la menor concentración utilizada (0,0125 mg/ml). A diferencia de estos, la actividad larvicida mostrada por el extracto acuoso elaborado a partir de frutos verdes fue mucho menor, no superando nunca el porcentaje de parálisis larvaria el 40 % en ninguna de las concentraciones utilizadas. Los resultados muestran, claramente, que el estado de maduración de los frutos de R. DISCUSIÓN 130 minutos hasta las 24 horas, los resultados obtenidos no fueron significativos con respecto al control negativo en ninguna de las concentraciones y periodos de tiempo utilizados, lo que contrasta con la actividad anticoccidiósica antes señalada para el extracto natural. Como ya se ha comentado, tiempos superiores a 24 h de exposición serían poco prácticos en condiciones reales en ganadería (Senger, 1959) por lo que el compuesto CM-475.3 no podría considerarse como un buen candidato como antiséptico frente a los ooquistes de E. ninakohlyakimovae. Los ooquistes son considerados el elemento de resistencia de los coccidios y, de hecho, son capaces de tolerar gran variedad de adversidades tanto físicas como las provocadas por agentes químicos. McDonnel y Russel (1999) han clasificado a los ooquistes como el elemento etiológico más resistente a los desinfectantes, después de los priones. Por esta razón, son necesarias concentraciones moderadas y altas de químicos abrasivos para inhibir su esporulación. La capacidad de los extractos de inhibir el ciclo exógeno del parasito podría ser una alternativa bio-orgánica para la desinfección temprana de construcciones y material, especialmente bajo condiciones de explotación intensiva de rumiantes, como ya fue sugerido para la producción de pollos por Williams (1997). Por todo ello, no se debería infravalorar el efecto anticoccidiósico encontrado en el presente estudio en los extractos naturales de plantas analizados, pero también en los obtenidos a partir de material vegetal cultivado in vitro. En base al conjunto de resultados obtenidos en el presente trabajo al valorar la actividad anticoccidiósica, la relevancia científica de las propiedades anticoccidiósicas de los extractos radica, no sólo en su uso como desinfectantes sino, además, como alternativa a los anticoccidiósicos y coccidiostáticos convencionales, ya que muchos de ellos presentaron un efecto importante sobre el primer estado infectante de parásito, los esporozoítos. Tanto el ensayo de viabilidad de esporozoítos como el de inhibición de la invasión celular con el extracto metanólico de frutos maduros de R. pinnata sirvieron para demostrar que este extracto no sólo afecta a la viabilidad de los esporozoítos sino también a su capacidad para invadir las células hospedadoras, en la que se desarrollarían posteriormente los esquizontes de primera generación. En Eimeria ninakohlyakimovae, dichos esquizontes pueden llegar a tener un tamaño superior a 300 µm y tras su rotura originan una gran destrucción de la mucosa del intestino delgado de los animales infectados (Dai et al., 2006, Ruiz et al., 2013). Otros autores también han descrito un efecto inhibitorio de extractos naturales frente a esporozoítos de coccidios de aves. Así, se ha observado que el carvacol, la curcumina o los extractos de Echinacea purpurea inhiben la invasión de las células denominadas Madin-Darby bovine Kidney (MDKB) por los esporozoítos de Eimeria tenella después de 24 horas de incubación (Burt et al., 2013). Los resultados del presente trabajo también son comparables a los publicados por Khalafalla et al. (2011), quienes, después de 3, 8, 18 y 24 horas de incubación, demostraron que la curcumina afectaba a la morfología y a la viabilidad de los esporozoítos, así como su capacidad de invasión. Estudios en otros coccidios, como Toxoplasma gondii, muestran que Artemisia annua inhibe en porcentajes superiores al 75 % la invasión celular in vitro por los taquizoítos de dicho parásito (Carrijo de Oliveira et al., 2009). DISCUSIÓN 131 La molécula o moléculas responsables de la actividad sobre los diferentes estadios del coccidio de pequeños rumiantes E. ninakohlyakimovae es aún desconocida. Por otro lado, el mecanismo de acción de los compuestos que se encuentran en los extractos utilizados en el estudio no tiene por qué ser igual en todos los casos, pudiendo variar de si actúan inhibiendo la esporulación, comprometiendo la viabilidad de los esporozoítos o inhibiendo su capacidad para invadir células. Además, al comparar los resultados obtenidos en los diferentes tipos de ensayos realizados con el extracto metanólico de frutos maduros de Ruta pinnata (ensayo de inhibición de la esporulación, ensayo de viabilidad de esporozoítos y ensayo de inhibición de la invasión celular), se puede observar que, a igual concentración, los niveles de actividad anticoccidiósica no son los mismos, según demuestran las DL50 de cada ensayo. De esta forma, 0,839 mg/ml fue la dosis necesaria para inhibir en un 50 % la esporulación de los ooquistes, 0,4884 mg/ml la dosis eficaz para obtener un 50 % de mortalidad de esporozoítos y 1,15x10-6 mg/ml DL50 para inhibir su capacidad de invasión celular. Estos datos corroboran que los esporozoítos libres son más susceptibles que los ooquistes al extracto a la misma concentración y con un periodo de incubación mucho menor, 3 horas y no 24, como en el caso de los ooquistes. La explicación más probable a este fenómeno podría ser la protección que confiere la pared del ooquiste frente a las condiciones adversas del medio. De hecho, gracias a su pared quística los ooquistes de E. bovis pueden resistir hasta 4 años y medio en un ambiente húmedo a 4 °C (Hermosilla et al., comunicación personal). Esta puede ser la explicación a los resultados observados con los extractos de Onobrychis viciifolia, los cuales no inhibieron la esporulación de los ooquistes en los ensayos in vitro pero si mostraron actividad anticoccidiósica in vivo al usar la planta como forraje en ovejas infectadas naturalmente por varias especies de Eimeria spp. (Saratsis et al., 2012). 6.2. ENSAYOS IN VIVO La nematodosis causada por H. contortus y la coccidiosis se citan entre las parasitosis más frecuentes que afectan a los pequeños rumiantes, siendo, además, de las más graves, debido a su patogenicidad. La acción patógena de los parásitos se traduce en cuantiosas pérdidas en la producción debido a la sintomatología y a la clínica que presentan los animales infectados, a lo cual habría que sumar el coste de los antihelmínticos y anticoccidiósicos usados comúnmente en la ganadería. Todo ello, junto con la creciente aparición de resistencias a estos productos, ha estimulado la búsqueda alternativas como la fitoterapia, siempre en combinación con adecuadas medidas de manejo. Por esta razón, aparte de mediante ensayos in vitro, la actividad de determinados extractos frente a H. contortus y E. ninakohlyakimovae también se evaluó mediante un ensayo in vivo. Con ello se pretendía comprobar si el efecto observado in vitro se mantenía en el organismo vivo. Se decidió utilizar un extracto metanólico de frutos de R. pinnata (CM-481), ya que dicho extracto fue el que mayor actividad antiparasitaria mostró en los ensayos in vitro. También se empleó un extracto metanólico elaborado a partir de un cultivo in DISCUSIÓN 132 vitro de material vegetal de esta misma planta (CM-472), obtenido siguiendo un procedimiento de elaboración similar a los otros compuestos de origen in vitro utilizados en el estudio, cuya actividad larvicida se discutió anteriormente. En este ensayo se evaluó el estado corporal de los animales, la presencia y características de la diarrea, así como existencia de anemia mediante la observación de las mucosas. Además, se realizaron recuentos de huevos y ooquistes en heces antes y después de tratamiento para, indirectamente, determinar si existía una disminución o no de la carga parasitaria. Todos los animales que fueron inoculados mostraron una clínica grave, siendo signos comunes la presencia de mucosas pálidas, cuadros diarreicos hemorrágicos, acompañado en ocasiones de restos de mucosa intestinal, decaimiento, anorexia, postración, caquexia e incluso muerte de algunos de los animales. Estos signos remitieron en los animales pertenecientes al grupo C después del tratamiento con los antiparasitarios comerciales (ivermectina y diclazuril). La clínica de los animales del grupo A y B (grupos tratados con los extractos CM-481 y CM-472, respectivamente) también mejoró tras el tratamiento, aunque la recuperación de los animales no fue tan rápida como la de aquellos que fueron tratados con ivermectina y diclazuril. En concordancia con estos resultados, diversos autores han demostrado que la alimentación del ganado caprino con pellets de Sericea lespedeza disminuye la pérdida de peso de animales infectados por nematodos gastrointestinales, a la vez que reduce la aparición de palidez de las mucosas, lo que sugiere que dicha planta tiene efecto sobre los adultos de H. contortus. Este hecho se demostró tras el sacrificio de los animales, ya que aquellos que habían sido tratados con el extracto presentaban un menor número de vermes en el abomaso que los que no habían recibido los pellets en la dieta (Terril et al., 2007). También en concordancia con los resultados del presente trabajo, se ha observado que el tratamiento con extractos elaborados con Elephantorrhiza elephantina en cabras parasitadas por H. contortus contribuyó a una notable disminución de los síntomas de la enfermedad, y a mantener una buena condición corporal durante toda la experiencia en los animales tratados (Maphosa et al., 2012). Los animales utilizados en el experimento in vivo de este estudio que fueron tratados con los extractos CM-481 y CM-472 no presentaron una mejoría de los síntomas tan notoria como la descrita por estos otros autores. Esto no tiene por qué significar que el efecto antiparasitario fuese leve o inexistente, ya que los animales de esta experiencia fueron inoculados con dos parásitos diferentes, H. contortus y E. ninakohlyakimovae, y por tanto los síntomas pudieron verse agravados por esta razón. Además, en los ensayos de Terril et al. (2007) y Maphosa et al. (2012), las infecciones fueron naturales, a priori, una situación no tan extrema como la evaluada en este trabajo. Para determinar si los tratamientos con los extractos CM-481 y CM-472 presentaban efecto in vivo sobre H. contortus se realizaron recuentos fecales de los animales pertenecientes a los diferentes grupos del ensayo. Los recuentos de los animales de los grupos A y B (tratados con los extractos CM-481 y CM-472, respectivamente) siguieron una tendencia similar. El número de huevos aumentó hasta el día del tratamiento y comenzó a disminuir después del mismo, manteniéndose DISCUSIÓN 133 los recuentos en valores cercanos a 2000 HPG a partir de entonces. La reducción de los recuentos fecales de huevos fue más clara si se compararon los recuentos acumulados de los días antes y después del tratamiento. En tal circunstancia, los valores de HPG del grupo A mostraron diferencias significativas (P < 0,01) antes y después del tratamiento, siendo estas diferencias no tan manifiestas en el grupo de animales tratado con el extracto in vitro. Resultados similares a los descritos en este trabajo se han observado en otros estudios, como el realizado con el extracto acuoso de Ananas comosus, el cual presenta una alta actividad antihelmíntica in vitro frente a huevos y larvas, pero en los ensayos in vivo la actividad de dicho extracto no fue significativa (Ferreira et al., 2013). Sin embargo, Elephantorrhiza elephantina produjo una reducción en el recuento de huevos en cabras infectadas por nematodos gastrointestinales del 98 % en el día 56 postinfección afectando principalmente a los adultos de H. contortus, como se ha comentado anteriormente (Maphosa et al., 2012). Este mismo autor describió en 2011 el efecto in vivo sobre nematodos gastrointestinales y coccidios en cabras de tres plantas usadas comúnmente en la medicina tradicional de Sudáfrica, Aloe ferox, Elephantorrihiza elephantina y Leonis leonours, las cuales redujeron hasta el 60% los recuentos de huevos y ooquistes de los animales tratados (Maphosa et al., 2011). Al evaluar la posible actividad anticoccidiósica de los extractos mediante la determinación de los recuentos fecales de ooquistes, al existir una infección natural por coccidiosis en los animales de la granja donde se realizó la experiencia, fue necesario tener en cuenta el número de ooquistes que presentaban los animales al comienzo del estudio, valor que fue de aproximadamente 4500 ooquistes por gramo de heces (OPG) durante todo el ensayo, tal y como se observó en los animales que formaban el grupo E (animales no inoculados ni tratados). Los demás grupos se inocularon con 200.000 ooquistes esporulados de E. ninakohlyakimovae por lo que, en todos ellos, se observó un pico de eliminación de ooquistes en torno a los días 16-17 postinfección. Después de este pico, los valores de OPG variaron en función de los grupos y tratamientos administrados. Así, en el grupo D (animales inoculados y no tratados), tras el pico de eliminación de ooquistes los recuentos disminuyeron progresivamente hasta 5000 OPG, recuentos similares a los mostrados por el grupo E. Esta tendencia fue similar en los grupos tratados con los extractos, tanto el natural como el de origen in vitro. Sin embargo, en los animales que fueron tratados con diclazuril el número de ooquistes en heces disminuyó hasta 0 en el día 5 después del tratamiento. En base a estos resultados, los extractos utilizados en la experiencia in vivo no mostraron un efecto marcado frente a los coccidios, ya que no se consiguió que los animales tratados con estos compuestos dejaran de eliminar ooquistes en las heces. No obstante, se ha demostrado que algunas plantas sí presentan actividad anticoccidiósica. Por ejemplo, el suplemento de la dieta con Sericea lespedeza en ovejas infectadas naturalmente con diferentes especies de Eimeria produjo una reducción significativa en el recuento de ooquistes en heces (Maphosa et al., 2012, Burke et al., 2013). Otras plantas como Melia azedarach y Psitacia lentiscus también redujeron el número de ooquistes en heces de rumiantes infectados por coccidios (Madibela et al., 2008; Markovics et al., 2012). También en aves, diferentes plantas han demostrado ser eficaces in vivo frente a la coccidiosis. Así, la administración de extractos elaborados a partir de Eclipta alba, Musa paradisiaca y Argeratum DISCUSIÓN 134 conyzoides en la dieta de pollos inoculados con E. tenella han sido capaces de reducir el número de ooquistes por gramos de heces, así como el deterioro físico de los animales y las lesiones microscópicas típicas de la infección por coccidiosis (Nweze et al., 2009; Anosa et al., 2011; Michels et al., 2011). En general, los extractos CM-481 y CM-472 mostraron cierta actividad antihelmíntica pero no frente a coccidios in vivo, a pesar de que ambos presentan un efecto elevado frente a H. contortus y E. ninakohlyakimovae in vitro. Este hecho puede estar relacionado con la farmacocinética y farmacodinámica de dichos compuestos en la cabra, cuya naturaleza se desconoce, así como al tiempo de absorción y de duración en el organismo. Además, puede ser que la administración oral del tratamiento no sea la más idónea e incluso que la dosis utilizada en el ensayo no sea la adecuada. En el estudio realizado por Maphosa et al. (2012), tampoco se observó una diminución marcada en los recuento de huevos de los animales muestreados hasta el día 56 después de tratamiento. Por el contrario, en otros ensayos realizados con plantas se ha demostrado una notable actividad frente a la coccidiosis caprina, entre los que se incluyen los realizados con Melia azedarach y Pistacia lentiscus; en dichos estudios se administraron los extractos por largos periodos de tiempo, 3 semanas y un mes, respectivamente, observándose únicamente disminución de los recuentos de ooquistes después de dos semanas de tratamiento (Madibela et al., 2008; Markovics et al., 2012), siendo en este caso necesaria la administración de varias dosis para obtener un efecto significativo. En el presente trabajo se utilizó una única dosis y se realizaron recuentos hasta una semana después del tratamiento, por lo que, según lo expuesto en los trabajos anteriores, cabría pensar que la actividad anticoccidiósica de los extractos podría haber sido mayor si se hubiese incrementado la dosis de extracto o si se hubieran realizado más de una administración. Otro aspecto a tener en cuenta a la hora de evaluar la actividad antiparasitaria de los compuestos, es el complejo sistema digestivo que presentan los rumiantes. Hay autores que han señalado la importancia del paso de los extractos naturales por el rumen, sugiriendo que en este órgano puede destruirse los compuestos activos de la planta debido a la acción de la flora ruminal o bien por el efecto del pH del rumen. Además, la digestión en el rumen podría provocar una disolución de los extractos por lo que llegarían con menor disponibilidad o actividad al abomaso (Pervez et al., 1994). En este tipo de estudios in vivo, ha de tenerse en cuenta no sólo la posible actividad antiparasitaria del extracto sino además su posible toxicidad. Con tal fin se evaluó la citotoxicidad del extracto metanólico de frutos maduros de R. pinnata en cultivos celulares in vitro en BCEC y células VERO. En ambos caso no se observó muerte celular, o fue leve a las concentraciones más elevadas de extracto, en comparación con los correspondientes controles negativos. Del mismo modo, ensayos de citotoxicidad realizados con carvacol, compuesto que se encuentra en varias plantas como el orégano, mostraron que dicho compuesto no interfería en el crecimiento celular de células MDBK (Madin-Darby bovine kidney) por lo que se consideró que no presentaba toxicidad a las concentraciones utilizadas en el estudio (Burt et al., 2013). Ante la posibilidad de que los extractos utilizados pudieran causar daños en el organismo de los animales, además de los resultados de los ensayos de citotoxicidad in DISCUSIÓN 135 vitro, previamente a la realización del experimento in vivo con extractos elaborados a partir de Ruta pinnata, se tuvieron en consideración distintas referencias bibliográficas que describen el uso de las rutáceas, en la medicina tradicional. Aparte, este tipo de plantas también se ha demostrado que forman parte de la alimentación de animales. Por ejemplo, restos de los frutos de Ruta pinnata se han encontrado en las heces de los lagartos gigantes (Gallotia galloti) de la isla de Tenerife, por lo que podría concluirse que la planta no posee efectos citotóxicos, al menos en esta especie animal (Rodríguez et al., 2008). Por otro lado, Ruta pinnata también es comúnmente utilizada en la isla de La Palma, donde es abundante, como alimento para el ganado cuando los animales presentan parasitaciones digestivas (Ruiz et al., comunicación personal), siendo este hecho un indicio de su falta de toxicidad en rumiantes. Existen, además, ensayos recientes donde se han utilizado diferentes extractos elaborados a partir plantas de la familia de las rutáceas para evaluar la efecto frente a coccidiosis en pollos in vivo, en los cuales se ha demostrado, no sólo su actividad anticoccidiósica sino la ausencia de toxicidad de las mismas (Jabbar et al., 2014). Además, como se comentó en los resultados, los animales que fueron tratados con los extractos, tanto el natural como el elaborado in vitro, no presentaron síntomas compatibles con intoxicación durante la experiencia in vivo. En general, el uso medicinal de las rutáceas está bastante extendido por todo el mundo, especialmente en el área mediterránea. Por ejemplo, en Italia, el botánico Paolo María Guarrera refiere más de 100 usos de plantas pertenecientes al género Ruta: Ruta angustifolia Pers., Ruta chalepensis L., Ruta corsica DC., y Ruta graveolens L. (Guarrera, 2006). De hecho, las rutáceas se encuentran entre las plantas más usadas de forma general en la medicina tradicional contemporánea italiana, en la botánica y en la vida cotidiana. El uso intensivo de estas plantas no es especifico de Italia, también está documentado en otras regiones del Mediterráneo y otros continentes. Otra especie, Ruta genus, ya se usaba abundantemente en la práctica médica de antaño en el Mediterráneo, según quedó documentado en el llamado Corpus Hippocraticum. Esta colección de 62 tratados fue escrita entre el quinto centenario de la a. C. y el segundo centenario de la d. C., y son atribuidos a los tiempos de Hipócrates (Pollio et al., 2008). Las preparaciones con las distintas especies de Ruta han sido administradas para infecciones de ojos y para diferentes tipos de dolores, e incluso como antídoto de venenos y mordeduras de animales venenosos. En la etnofarmacología tradicional mediterránea, las rutas se han considerado el remedio idóneo para las enfermedades femeninas y secundariamente como un efectivo remedio para las afecciones pulmonares. A estas plantas también se le atribuyen propiedades antirreumáticas y antihelmínticas. Esta última propiedad no sólo ha sido descrita en Italia sino también en países como Argelia, Bulgaria, Chipre, etc., según se recoge en la revisión realizada por Pollio et al. (2008). La actividad antihelmíntica y antiparasitaria de las rutáceas, y en particular de Ruta graveolens, fue descrita con detalle en un estudio realizado en el Norte de Italia por Guarrera (1999). La planta se ha utilizado en combinación con azufre para tratar la sarna en perros y, tras cocción y mezcla con aceite de oliva, para eliminar moscas en granjas porcinas. La cocción de la planta también se ha empleado como brebaje para el DISCUSIÓN 136 ganado en el tratamiento de las helmintiasis, incluso como vermífugo para niños acompañada de ajo o aceite de oliva, o administrada en tortas hechas de harina y agua de ruda. Finalmente, estudios realizados en British Columbia (Canadá) también han demostrado el empleo de R. graveolens en la práctica etnoveterinaria, concretamente en el tratamiento de endoparásitos en cerdos, gatos y perros, como Giardia y Toxoplasma, información recogida a partir de distintas fuentes, como naturalistas, herbolarios, tiendas de animales, farmacéuticos y veterinarios (Lans et al., 2007). Como ya se ha comentado, los mecanismos responsables de la actividad de los extractos naturales utilizados en el presente trabajo frente a H. contortus y E. ninakohlyakimovae, sobre todo a los procedentes de Ruta pinnata, no han sido estudiados. Es posible que la actividad antiparasitaria de los extractos se deba a las propiedades bioactivas de las plantas y que éstas sean debidas a un alto contenido en metabolitos secundarios, como ya se ha demostrado en otras plantas. El alto contenido en taninos, ácido hidroxibenzoico, ácido hidroxicinamico y diferentes flavonoides pueden encontrarse en Onobrychis viciifolia, una planta en la que se ha observado actividad antiparasitaria en ovejas frente a coccidios (Regos et al., 2009, Saratsis et al., 2012). Estos compuestos poseen no sólo actividad anticoccidiósica sino también antihelmíntica frente a nematodos gastrointestinales de pequeños rumiantes, tal y como han citado autores como Hoste et al. (2006, 2008) y Valderrábanos et al. (2010). Además, la actividad de un extracto no tiene por qué ser debida a un único compuesto, sino que podría serlo a varios, los cuales podrían ejercer su acción de forma independiente o trabajar conjunta o sinérgicamente. Si ocurre esto último, el extracto crudo siempre será más activo que cualquiera de los productos que pudieran ser fraccionados y separados a partir de él. Algunos estudios hacen referencia a la actividad sinérgica de diferentes extractos procedentes de una misma planta, como es el caso de las pertenecientes al género Aspidosperma. Así, en un trabajo realizado con alcaloides procedentes de estas plantas se observó que muchos de ellos actuaban conjuntamente y mostraban una alta actividad frente a Plasmodium. Además, estos extractos eran capaces de aumentar la actividad de la clororquina, producto que se utiliza como tratamiento de la malaria (Mitaine-Offer, 2002). También se han encontrado plantas cuyos extractos han mostrado una elevada actividad, en este caso antitumoral, cuando se han utilizado conjuntamente, siendo dicha actividad mayor que la que presentaba cada planta por separado. Un ejemplo lo constituyen las plantas Rhizoma corydalis y Rhizoma cucurmae, ambas plantas típicas de la medicina tradicional china (Gao et al., 2009). En su conjunto, los resultados del presente estudio demuestran que los extractos elaborados a partir de la planta endémica Ruta pinnata presentan una marcada actividad antiparasitaria in vitro frente a nematodos y coccidios que afectan al ganado caprino, en particular, H. contortus y E. ninakohlyakimovae. Esta actividad se constató en diferentes estados evolutivos de ambos parásitos. En concreto, frente a H. contotus se observó una actividad tanto ovicida, larvicida como adulticida; mientras que frente a la especie de Eimeria objeto de estudio se demostró efecto sobre ooquistes y esporozoítos. Puesto que algunos de estos estados se desarrollan en el ciclo exógeno de ambos parásitos y se consideran como formas de resistencia (L3 y ooquistes), los extractos podrían emplearse como antisépticos, además de como DISCUSIÓN 137 antiparasitarios endógenos. Por otro lado, el efecto antiparasitario de los extractos preparados a partir de cultivos in vitro de la planta, aunque no tan notorios como los obtenidos con los extractos naturales, abre la posibilidad de utilizar esta metodología para la obtención de material vegetal con actividad farmacológica a partir de plantas que, como R. pinnata, presentan una disponibilidad baja en estado natural por diversas razones. Al contrastar todos estos resultados in vitro con los obtenidos durante la experiencia in vivo se comprobó que la actividad de los extractos en este último caso no fue tan manifiesta, lo cual podría ser debido a diferentes circunstancias, tal y como se discutió anteriormente. El diseño de nuevos estudios in vivo utilizando distintas dosis, pautas de tratamiento, formulación, etc., y otros en los que se analice en profundidad la farmacocinética y biodisponibilidad de los extractos en el animal podría contribuir sin duda a optimizar el resultado. Con la misma finalidad, también podrían implementarse los métodos de producción de los cultivos in vitro de la planta. Como futuros trabajos relacionados con el presente estudio, también habrían de considerarse el fraccionamiento y la identificación de los compuestos activos responsables de la actividad anticoccidiósica y antihelmíntica, su posible síntesis química y producción. Por último, habría que remarcar que los resultados obtenidos para las especies parásitas del caprino H. contortus y E. ninakohlyakimovae podrían ser extrapolables a otros parásitos pertenecientes a los phyllum Nematoda y Aplicomplexa, respectivamente, tanto de animales como del hombre (por ejemplo, Toxoplasma gondii). Conclusiones CONCLUSIONES 139  Los extractos metanólicos elaborados a partir de la parte aérea sin fructificar de Ruta pinnata, Psoralea bituminosa y Ruta graveolens muestran una actividad antihelmíntica in vitro de moderada a alta frente Haemonchus contortus, y una actividad de ligera a moderada frente al coccidio E. ninakohlyakimovae, variable según el tipo de extracto. De forma general, los extractos de R. pinnata fueron los que presentaron una actividad antiparasitaria más destacada.  La parte de la planta y el estado de maduración de los frutos de Ruta pinnata utilizados para la elaboración de los extractos influyen en el nivel de actividad antiparasitaria. Así, los extractos elaborados a partir de frutos presentaron mayor actividad antihelmíntica y anticoccidiósica que los elaborados a partir de la planta entera, y los frutos maduros mayor efecto frente a nematodos que los obtenidos de frutos verdes.  La extracción con distintos disolventes a partir del extracto metanólico crudo permite obtener nuevos extractos con diferente actividad antiparasitaria, pero siempre igual o menor que la obtenida con el extracto original crudo. En general, los extractos elaborados con disolventes orgánicos presentaron mayor actividad larvicida que los acuosos, siendo las fracciones hexánica y de acetato de etilo los que mayor actividad mostraron.  De todos los extractos naturales analizados, el extracto metanólico de frutos maduros de Ruta pinnata es el que presenta mayor actividad antihelmíntica y anticoccidiósica frente al conjunto de estados parasitarios utilizados en los ensayos in vitro.  Los compuestos elaborados a partir de material vegetal de Ruta pinnata cultivado in vitro poseen una moderada actividad frente a las L3 y los vermes adultos de Haemonchus contortus, por lo que el cultivo in vitro de material vegetal de plantas con actividad antihelmíntica podría considerarse como una alternativa para la obtención de productos antiparasitarios en el caso de endemismos, plantas en peligro de extinción o cuyo acceso o disponibilidad sea escaso.  Los compuestos obtenidos de cultivos in vitro de material vegetal de Ruta pinnata no muestran actividad anticoccidiósica, por lo que la metodología utilizada para la elaboración de estos productos vegetales no permitiría la obtención de compuestos activos frente a Eimeria spp.  Los ensayos in vitro de citotoxicidad de R. pinnata, junto con las evidencias del uso de la planta en animales como alimento habitual o con fines fitoterápicos en la sabiduría tradicional, indicarían que la toxicidad de la planta sería baja o nula. De acuerdo con esto, en la experiencia in vivo no se observó ningún signo clínico asociado a intoxicación en ninguno de los animales tratados.  Debido a diversos factores que no ha sido posible aclarar en el presente estudio, entre ellos la dosis y pauta de tratamiento empleados, la vías de administración y la formulación del producto, la administración de extractos de