Respuesta inmune inespecífica de la dorada ("Sparus aurata") frente a "Photobacterium damselae" subsp. piscicida

BIBLIOTECA UNIVERSITARIA LAS PAL^'¡AS DE G. CANARIA N ° Doeumento nP'^^Sé N»Copia ¿9^Uó^ ''mtjiyíÚAsí UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA FACULTAD DE VETERINARIA DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA ANIMAL, PRODUCCIÓN ANIMAL, BROMATOLOGÍA y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS TESIS DOCTORAL RESPUESTA INMUNE INESPECÍFICA DE LA DORADA \Spanis aurata) FRENTE A PhotobacteHum damsetae subsp. pisdcida Félix Acosta Arbelo Las Palmas de Gran Canaria, 2002 UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA FACULTAD DE VETERINARIA DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA ANIMAL, PRODUCCIÓN ANIMAL, BROMATOLOGÍA y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Tesis Doctoral presentada por D. Félix Antonio Acosta Arbelo Dirigida por el Dr. D. Fernando Real Valcárcel El Director Fernando Real Valcárcel Félix Acosta Arbelo Las Palmas de Gran Canaria, 2002 FERNANDO REAL VALCÁRCEL, PROFESOR TITULAR DE UNIVERSIDAD EN EL DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA ANIMAL, PRODUCCIÓN ANIMAL, BROMATOLOGÍA y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS DE LA FACULTAD DE VETERINARIA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA. INFORMA: Que D. Félix Antonio Acosta Arbelo, Licenciado en Veterinaria, ha realizado bajo mi dirección y asesoramiento el presente trabajo titulado "RESPUESTA INMUNE INESPECÍFICA DE LA DORADA {Sparus aurata) FRENTE A Photobacterium damselae subsp, pisdddcC*, el cual considero reúne las condiciones y calidad científica para optar al grado de Doctor en Veterinaria. Las Palmas de Gran Canaria, 2002 Pdo. Fernando Real Valcárcel A mifamilici, y en especial a Patri, mi amor lindo ÍNDICE ÍNDICE DE TABLAS, FIGURAS Y ESQUEMAS I ABREVIATURAS IX I.-INTRODUCCIÓN 1 II.- REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 7 n.1.- ESTUDIO DE LA PA8TERELOSIS 7 11.1.1.- Importancia de la enfermedad en acuicultura continental y marina 7 II. 1.2.-Etiología 9 II. 1.3.- Epidemiología 15 n.1.4.- Patogenia 18 II. 1.5.- Clínica 21 II. 1.6.- Lesiones 23 II.1.6.1.- Lesiones macroscópicas 23 II.1.6.2.- Lesiones microscópicas 25 II. 1.7.- Diagnóstico 30 II.1.8.- Control de la enfermedad 34 II. 1.8.1.- Quimioterapia 34 II. 1.8.2.- Inmunoprofilaxis 35 n.2.- MECANISMOS DE DEFENSA FRENTE A LA INFECCIÓN DÉLOS TELEÓSTEOS 39 II.2.1.- Sistema inmune 39 II.2.1.1.- Órganos linfoides primarios 40 II.2.1.2.- Órganos Unfoides secundarios 41 II.2.2.- Sistema inmune celular 42 II.2.2.1.-Macrófagos 42 n.2.2.2.-Granulocitos 45 II.2.2.3.- Células citotóxicas no específicas 46 II.2.3.- Mecanismos para destruir microorganismos fagocitados 47 II.2.3.1.- Mecanismos oxígeno dependientes 48 III.- MATERIAL Y MÉTODOS 55 ni.l.- ANIMALES SOMETIDOS A ESTUDIO... 55 in.2.- ORIGEN Y CONSERVACIÓN DE LAS CEPAS DE Photobttcteriutn deunselae stibespede pisdcida UTILIZADAS 56 IZr.3.- MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS 57 27.4.- MATERIAL Y MÉTODOS UTILIZADOS EN CADA E2[PERIENCIA 58 III.4.1.- EXPERIENCIA I.- Actividad bactericida del óxido nítrico y los peroxinitritos sobre Photobacterium damseíae subespecie piscicidn. 58 III.4.2.- EXPERIENCIA II.- Peces infectados experimentalmente con Fhotobacterium damseíae subsp. piscicid£L 68 III.4.2.1.- Experiencia preliminar 68 III.4.2.2.- Infección experimental 69 III.4.2.3.- Inoculación de Photobacterium damseíae subsp. pisdcida 71 III.4.2.4.- Determinación de la concentración de nitritos en el suero sanguíneo 72 III.4.2.5.- Determinación de L-citruHna 76 III.4.2.6.- Aislamiento de macrófagos 78 III.4.2.7.-Extracción del ARN 79 III.4.2.8.- Síntesis de ADN complementario (ADNc) 81 III.4.2.9.- Detección de la óxido nítrico sintasa inducible mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 81 III.4.3.-EXPERIENCIA III.- Inmunización frente a Photobacterium damselae subsp. pisddda e infección posterior" 86 III.4.3.1.- Elaboración de la vacuna 87 III.4.3.2.- Protocolo de inmunización 88 III.4.3.3.- Determinación de la concentración de nitratos y L-citrulina en cultivos de macrófagos in vitro 89 III.4.3.4.- Estudio de la "explosión respiratoria" 91 III.4.3.5.- Producción de los factores activadores de los macrófagos (MAF) 92 III.4.3.6.- Determinación de la "explosión respiratoria" 92 xas.- TRATABSIENTO ESTADÍSTICO 97 IV.-RESULTADOS 99 IV. 1.- COMPROBACIÓN DE LA PRESENCIA DE CÁPSULA EN Photobacterium damselae subsp. pisddda 99 IV.2.- EXPERIENCIA L 99 IV.2.1.- Actividad bactericida del óxido nítrico y los peroxinitritos sobre Photobacterium dcunseUie subsp. pisddda 99 IV.2.1.1.-Toxicidad del óxido nítrico 99 IV.2.1.2.- Toxicidad de los peroxinitritos 102 IV.3.- EXPERIENCIA JT. 106 IV.3.1.- Experiencia preliminar 106 IV.3.2.- Respuesta de la dorada {SpcuTis aurate^ frente a la infección experimental con Photobacterium. damselae subsp. pisddda 107 rv.3.2.1.- Determinación de nitritos en el suero sanguíneo 107 IV.3.2.2.- Determinación de L-citrulina en el suero sanguíneo 110 IV. 3.2.3. - Detección de la óxido nítrico sintasa inducible... 113 IV.4.- EXPERIENCIA m. 113 IV.4.1.- Respuesta inmune de la dorada {Spcuvs €Uirata\ tras la vacuna-ción con bacterina de Fhotobuu^terium damselae subsp. pistícida. Comparación de los resultados con los peces infectados experimentalmente 113 IV.4.1.1.- Determinación de nitritos en el suero sanguíneo 113 IV.4.1.2.- Determinación de L-citixilina en el suero sanguíneo 116 rv.4.1.3.- Detección de la óxido nítrico sintasa inducible... 118 IV.4.2.- Producción de nitritos y L-citrulina por los macrófagos obtenidos de peces inmunizados 119 IV.4.2.1.- Determinación de nitritos 119 rv.4.2.2.- Determinación de L-citruüna 123 IV.4.3.- Estudio de la ''explosión respiratoria" 126 VI.- TABLAS Y FIGURAS 127 VIL-DISCUSIÓN 161 Vn.l.- EXPERIENCIA LACTIVIDAD BACTERICIDA DEL ÓXIDO NÍTRICO Y LOS PEROXINITRITOS SOBRE Photob€icterium damselae subsp. pisdcida. 164 Vn.2.- EXPERIENCIA ILRESPUESTA INMUNE DE LAS DORADAS INFECTADAS EXPERIMBNTALMENTE CON Photobojcterium damselae subsp. pisdcida. 168 VII.2.1.- Respuesta de la dorada frente a la infección experimental con Photobacterium damselae subsp. pisdcida 172 VII. 2.2.- Respuesta inmune de la dorada tras la vacunación con bacterina de Photobticterium damselae subsp. pisddda y posterior infección 174 VIIL-CONCLUSIONES 181 IX.-RESUMEN 185 X.-SUMMARY 189 índice de Tablas, Figuras y Esquemas Figura 5.- Efecto del óxido nítrico en la supervivencia de Photo-bacterium damselae subsp. piscicida. 130 Figura 6.- Concentraciones de nitritos obtenidas en función de la concentración de SNAP añadida, y valores medios de supervivencia 131 Figura 7.- Efecto de la N-acetil penicüamina sobre la supervivencia de Photobacterium damselae subsp. piscicida. 132 Figura 8.- Efecto del SIN-1 en la supervivencia de Photobacterium damselae subsp. piscicida 133 Figura 9.- Comparación del efecto del óxido nítrico frente a los peroxinitritos en la supervivencia de Photobacterium damselae subsp. piscicida. 135 Figura 10.- Concentración de nitritos en suero sanguíneo de las doradas infectadas experimentalmente 137 Figura 11.- Concentración de L-citrulina en suero sanguíneo de las doradas infectadas experimentalmente 139 Figura 12." Resultado de la PCR para detectar iNOS en la experiencia preliminar 141 Figura 13.- Concentración de nitritos en suero sanguíneo de las doradas infectadas experimentalmente con Photobacterium damselae subsp. piscicida. 142 Figura 14.- Concentración de nitritos en suero sanguíneo de las doradas infectadas experimentalmente con Photobacterium damselae subsp. piscicida y tratadas con L-NAME 144 V Índice de Tablas, Figuras y Esquemas Figura 15.- Concentración de L-citrulina en suero sanguíneo de las doradas infectadas experimentalmente con Photobacterium damselae subsp. piscicida 146 Figura 16.- Concentración de L-citrulina en suero sanguíneo de las doradas infectadas experimentalmente con PhotobacteñuTn damselae subsp. piscicida y tratadas con L-NAME 148 Figura 17.- Resultado de la PCR para detectar iNOS en la infección experimental 150 Figura 18.- Niveles de nitritos detectados en el suero de las doradas inmunizadas en comparación con los peces que fueron sólo infectados y con peces no infectados 151 Figura 19.- Niveles de L-citruüna detectados en el suero de las doradas inmunizadas en comparación con los peces que fueron sólo infectados y con peces no infectados 153 Figrura 20.- Concentración de nitritos producidos por los macrófagos de doradas inmunizadas, después de la infección con Photobacterium damselae subsp. piscicida 155 Figura 21.- Concentración de L-citruHna producida por los macrófagos de doradas inmunizadas, después de la infección con Photobacterium. damselae subsp. piscicida. 157 VI índice de Tablas, Figuras y Esquemas Figura 22.- Concentración de radicales superóxido (OQ) producida por los macrófagos de doradas inmunizadas, infectadas con Photobacterium damselae subsp. piscicida. 159 ESQUEMAS Esquema de las reacciones químicas producidas in vitro por los donadores e inhibidores de óxido nítrico y peroxinitritos usados en el experimento 60 Acción del óxido nítrico y los peroxinitritos 65 Estudio comparado del efecto del óxido nítrico frente a los peroxinitritos 66 Experiencia preliminar 84 Infección experimental con Photobacterium damselae subsp. piscicida. 85 Experiencia de irmiunización e infección posterior 95 Estudio de la "Explosión respiratoria" y determinación de óxido nítrico y L-citruHna 96 BSQUBBIA 1.- ESQUEMA 2.- ESQUEBSA 3.- ESQUEBIA 4.- ESQUEBIA 5.- ESQUEBIA 6.- ESQUEBIA 7.- Irt VII ABREVIATURAS Abreviaturas ADNc: Ácido desoxirribonucleico complementario ARN: Ácido ribonucleico ATCC: Colección Americana de Cultivos Tipo BHIB: Caldo Infusión Cerebro Corazón BHIA: Infusión Cerebro Corazón Agar CAT: Catalasa DEPC: Dietil pirocarbamato DLso: Dosis letal cincuenta EXi^Ps: Productos extracelulares EPC: Célula epitelial de carpa FES: Suero fetal bovino fg: Fentogramo g: Fuerza de gravedad Go: Glucosa oxidasa gr: Gramo HBSS: Solución balanceada de Hank hrs: Horas iNOS: Óxido nítrico sintasa inducible Kb: Kilobases 1: Litro L-NAME: No-nitro-l-arginina metil ester LPS: Lipopolisacáridos MAF: Factores activadores de los macrófagos mg: Miligramo min: Minuto mi: Mililitro j>\ IX Abreviaturas MTT: 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl-2-5-bromuro de difeniltetrazolium NADPH: Nicotinamida adenin dinucleótido fosfato NaCl: Cloruro sódico ng: Nanogramo nm: Nanómetro nmol: Nanomoles O2": Anión superóxido ON: Óxido nítrico P/S: Penicilina/estreptomicina pb: Pares de bases PBS: Tampón fosfato salino PCR: Reacción en cadena de la polimerasa pg: Picogramo rpm: Revoluciones por minuto SIN-1: 3-Morfolinosydnonimina, HCl SNAP: N-(P-D-Glucopyranosil)-N^-acetil-S-nitroso-D,L-penicilamina SOD: Superóxido dismutasa TNF-a: Factor de necrosis tumoral humano a u.f.c: Unidades formadoras de colonias UI: Unidades internacionales X: Xantina Xo: Xantina oxidasa [i: Miera Hg: Microgramo JAI: Microlitro |j,in: Micrómetro X '^ INTRObUCdON A^^Vr^ _A>i Introducción Photobacterium damselae subsp. piscicida, anteriormente conocida como Pasteurella piscicida, es el agente causal de la pasterelosis en los peces, una enfermedad descrita por primera vez en 1953 en poblaciones naturales de perca blanca [Morone amerícanus) y lubina estriada {Morone saxatilis) en la bahía de Chesapeake de EEUU (SNIEZKO y cois., 1964). En 1969, este patógeno demostró su importancia económica en la acuicultura del Japón, provocando grandes pérdidas en esta industria piscícola (KUSUDA y YAMAOKA, 1972). Aunque hasta hace algunos años Europa se consideraba libre de esta enfermedad, a comienzos de la década de los noventa empiezan a detectarse brotes epidémicos en diferentes países europeos, entre los que cabe citar, Francia (BAUDIN LAURENCIN y cois., 1991), Italia (CESCHIA y cois., 1991), España (TORANZO y cois., 1991, BALEBONA y cois., 1992; REAL y cois., 1997), Grecia (BAKOPOULOS y cois., 1995), Portugal (BAPTISTA y cois., 1996), Turquía (CANDAN y cois., 1996), Noruega (SPEILBERG y cois., 1991), Escocia (JONES y COX, 1999) y Malta (BAKOPOULOS y cois., 1997). En la actualidad la expansión de la pasterelosis ha llegado a convertirse en un problema de primer orden en la acuicultura mundial. En el Archipiélago Canario es una de las enfermedades de mayor prevalencia y repercusión económica para la acuicultura, con una tendencia de presentación estacional, en épocas estivales. En los últimos años se ha intentado aclarar el mecanismo de acción patógena de esta bacteria, y aunque poco conocido hasta el Introducción momento, si ha sido descrito que la presencia en determinadas condiciones de un polisacárido capsular enesta bacteria (BONEÍT y cois., 1994), hace mucho más virulento a este patógeno (MAGARIÑOS y cois., 1996b; LÓPEZ-DORIGA y cois., 2000). La respuesta inmune inespecífica de los peces frente a determinados patógenos es todavía un terreno poco explorado. El óxido nítrico (ON) es un radical libre que se forma biológicamente a partir de la arginina por la acción de una familia de enzimas óxido nítrico sintasa. Esta familia de enzimas presenta tres isoformas, de las que dos son enzimas que se expresan de forma constitutiva, y que inicialmente se caracterizaron en neuronas (nNOS) y células endoteliales de mamíferos (eNOS), (MAYER y HEMMENS, 1997; KNOWLES y MONCADA, 1994; NATHAN y XIE, 1994). En cambio, una tercera isoforma, la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), que se regula a nivel transduccional y transcripcional , es una isoforma no constitutiva que se asocia a la defensa celular inespecífica, actuando allí donde es requerida por la respuesta inmune celular (XIE y NATHAN, 1994; SCHMIDT y WALTER, 1994). En los peces, inicialmente, la actividad de la óxido nítrico sintasa se describió asociada a las formas constitutivas de la enzima (eNOS y nNOS) (SCHOOR y PLUMB, 1994; SODESTROM y cois., 1995; WONG y cois., 1998). Introducción Los cultivos primarios de macrófagos y las líneas celulares dé macrófagos producen óxido nítrico cuando son estimulados con lipopolisacáridos bacterianos (NEUMMAN y cois., 1995; WANG y cois., 1995). El óxido nítrico (NO) y los radicales superóxido (O2") que se forman durante la "explosión respiratoria", pueden reaccionar para formar peroxinitritos (ONOO), una de las especies de moléculas reactivas de nitrógeno, considerados también como un potente radical libre (ISCHIOROPOULOS y cois., 1992). El óxido nítrico y los peroxinitritos son capaces de atacar diferentes tipos de enzimas como la citocromo oxidasa (STHUER y NATHAN, 1989), ribonucleótido reductasa (LEPOIVRE y cois., 1991), citocromo p450 (WINK y cois., 1993), aldolasa (KHAL y cois., 1978), y también enzimas que contienen un centro hierrosulfurado como diferentes tipos de óxido reductasas (HYMAN y ARP, 1991) y la acotinasa (DRAPIER y HIBBS, 1988). Este conjunto de enzimas esenciales inactivadas por el ON y los ONOO" comprometen las funciones fisiológicas que controlan, y por tanto genera un escenario de incompatibilidad con la vida, tanto para bacterias, virus, parásitos como células tumorales. La forma inducible de la óxido nítrico sintasa así como el aumento de las tasas de ON séricas han sido demostradas Revisión bibliográfica En Salmón Atlántico (Salmo salar), JONES y COX (1999) en su descripción de la enfermedad, reflejan una mortalidad muy baja, siendo esta desde abril a octubre, de un 6% total. II.1.2.-Etiologia Photobacterium damselae subsp. piscicida, anteriormente denominada Pasteurella piscicida, es un bacilo gram negativo inmóvil con una tinción bipolar (AUSTIN y AUSTIN, 1999), y no produce esporas. El tamaño de las células varía con las condiciones de cultivo. KOIKE y cois. (1975) describen tamaños desde 0.6-1.2 X 0.8-2.6 ^m. Son polimórficas y pueden ser observadas desde formas de micrococos hasta largos bacilos dependiendo de las condiciones de cultivo. Para su cultivo se han usado diferentes medios como son el Agar Infusión Cerebro Corazón (BHIA), Agar Triptona-Neopeptona, Agar LevaduraPeptona, Agar leche y Agar Sangre, todos conteniendo entre un 1.5 y un 2% de NaCl (EGUSA, 1992). Observándose en estos medios colonias redondas, incoloras, semi-transparentes en forma de "gotas de rocío" y de consistencia pegajosa. En Agar Nutritivo también se cultiva pero su crecimiento no es tan bueno, siendo también inadecuado en otros medios líquidos como el Caldo Nutritivo y el Agua de Peptona. Aunque mal, algunas cepas seleccionadas pueden crecer en Agar MacConkey. No crece en Agar Salmonella-Shigella. Photobacterium damselae subsp. piscicida presenta un metabolismo anaerobio facultativo (AUSTIN y AUSTIN, 1999). Revisión bibliográfica El estudio de los caracteres tintoriales de esta bacteria fue muy controvertido hasta hace unos años al definir una de sus características más básicas, como la de si es o no una bacteria gram-negativa. KIMURA y KITAO (1971) afirmaron que el cultivo inicialmente es positivo y luego se vuelve negativo. SIMIDU y EGUSA (1972) describen que la bacteria retiene el cristal violeta cuando realizamos la tinción, pero que la decoloración no es igual de efectiva que en otros gram negativos. KUBOTA y cois. (1972) afirman que la bacteria exhibe una reacción gram positiva cuando la tinción es llevada a cabo sobre muestras de tejido. KUSUDA y YAMAOKA (1972) así como KOIKE y cois. (1975) afirman que la bacteria es gram-negativa. Descripciones posteriores como las de YASUNAGA (1983, 1984), TUNG y cois. (1985), UEKl y cois. (1990), TORANZO y cois. (1991), BALEBONA y cois. (1992), CANDAN y cois. (1996), BAPTISTA y cois. (1996), REAL y cois. (1997), KAWAKAMI y cois. (1999) y JONES y COX (1999) la describen siempre como una bacteria gram negativa. Las propiedades bioquímicas de Photobacterium damselae subsp. piscicida han sido descritas por numerosos autores. SNIEZKO y cois. (1963), JANSSEN y SURGALLA (1968), KIMURA y KITAO (1971), SIMIDU y EGUSA (1972), KUSUDA y YAMAOKA (1972) describieron las caracteristicas bioquímicas de Photobacterium damselae subsp. piscicida coincidiendo todos ellos de forma general en el comportamiento bioquímico de esta bacteria, exhibiendo unas caracteristicas típicas como son el ser 10 Revisión bibliográfica inmóvil, oxidasa y catalasa positiva, tener un metabolismo fermentativo, ser sensible a la acción del agente vibriostático O/129 (AUSTIN y AUSTIN, 1999), no producir gas a partir de la glucosa y ser halófila (JANSEN y SURGALLA,1968; MAGARIÑOS y cois., 1992a). Las características bioquímicas de los diferentes aislados de Photobacterium damselae subespecie piscicida a. lo largo del tiempo se muestran en la Tabla 1 (JANSEN y SURGALLA, 1968; YASUNAGA y cois., 1983, 1984; TORANZO y cois., 1991). Esta bacteria se diferencia desde un punto de vista bioquímico del resto de bacterias pertenecientes al Género Pasteurella por no crecer a 37°C, por ser halófila y por no reducir los nitratos (MAGARIÑOS y cois., 1992a). x..-^ 11 Revisión bibliográfica Tabla 1.- Características bioquímicas de Photobacteriutn damselae aubespecie piscicida. Gram Tinción bipolar Movilidad Crecimiento en: Agar Nutritivo Agar Marino Caldo Nutritivo Agua de Peptona Agar BHI+ 2% NaCl AgarSS Agar Sangre + 2% NaCl Agar McConkey Crecimiento a: 5°C lO-C is-c 25°C 30°C ay-c Crecimiento en: 0% de NaCl 0.5% de NaCl 3% de NaCl 5% de NaCl Citocromo oxidasa Catalasa Rojo de metilo Voges Proskauer Producción de : Indol Nitrato Amonio Citrato Sulfídrico O/F (Glucosa) Gas de glucosa Arginina dehidrolasa Lisina decarboxilasa Omitina decarboxilasa Triptófano desaminasa P-Galactosidasa Ureasa Resitencia a: Agente Vibriostático O/129 Novobioctna - - - + + + + + - + - - - + + + - - + + - + + + + - - - - - F - + - - - - - - - D-Tartrato Gelatinasa Caseinasa Lipasa (Tween 80) Fosfolipasa Amilasa Hemolisis de eritrocitos: Oveja Salmón Rodaballo Trucha Producción de ácido a partir de: Glucosa Mañosa Galactosa Fructosa Maltosa Sucrosa Ramnosa Arabinosa Amigdalina Melibiosa Manitol Inositol Sorbitol Glicerol Xilosa Lactosa Trealosa Rafinosa Celibiosa Dextrina Inulina Glicógeno Adonitol Inositol Dulcitol Eritritol Salicina EscuUna + Reacción positiva; - Reacción negativa; F Metabolismo fermentativo Una serie de caracteristicas bioquímicas que diferencian sin lugar a dudas a esta bacteria de otros patógenos comunes en acuicultura como son Vibrio anguillarum y Aeromonas salmordcida 12 Revisión bibliográfica subsp. salmonicida, así como de otras Pasteurellas sp. son descritas por MAGARIÑOS y cois. (1992a). Dichas diferencias se muestran en la Tabla 2. Tabla 2.- Principales diferencias bioquimicas entre Photobacterium damselae subespecie piscicida, otras pasterelas clínicas, V, Anguillarum y Aerotnonas salmonicida subespecie salmonocida. Especies Movilidad Producción de Gas de glucosa: Arginina dehidrolasa Indol Reducción de nitrato Gelatinasa Crecimiento a 37°C Requerimiento de NaCl Sensibilidad : O/129 Novobiocina Ph. Damselae subsp. piscicida - + - - - - + S S P. Multocida - - + + - + - S s p. Heiemolítica - - - + - + - S V A. Salmonicida subsp. salmonicida - + - + + - - R R V. anguillarum + + + + + V + s s + Reacción positiva; - Reacción negativa; V Reacción variable MAGARIÑOS y cois. (1992a) han encontrado que todos los aislados del continente europeo, Japón y EEUU son bioquímicamente y antigénicamente similares, teniendo también patrones electroforéticos en sus lipopolisacáridos similares, así como unos perfiles similares en las proteínas de membrana. 13 Revisión bibliográfica SAKAI y cois. (1993) encontraron que seis de sus aislados presentaban una superficie hidrofóbica y que eran capaces de aglutinar eritrocitos de oveja. Al obtener los perfiles de ácidos grasos de diferentes aislados de Photobacterium damselae subespecie piscicida, ROMALDE y cois. (1995c) describen la similitud existente entre estos perfiles. GAUTHIER y cois. (1995) basándose en el estudio del ARN ribosómico y relacionándolo con el ADN completo y con las características bioquímicas, reasigna a Pasteurella piscicida en una subespecie de Photobacterium damselae, aunque THYSSEN y cois. (1998) basándose en estudios morfológicos y bioquímicos concluyen que Photobacterium. damselae subespecie piscicida está relacionado con especies del Género Photobacterium pero es fácilmente distinguible de Photobacterium. damselae subespecie damselae, y que no se encuentra ninguna evidencia para encuadrarla como una subespecie de Photobacterium. damselae. La caracterización de cepas de esta bacteria utilizando la "Amplified fragment length polimorphism" (AFLP) realizada por THYSSEN y cois. (2000), demuestra que existe una homología entre Photobacterium damselae subespecie piscicida y Photobacterium, damselae subespecie damselae de un 77%, lo cual ratifica la idea de una proximidad taxonómica. A pesar de todo esto 14 Revisión bibliográfica la denominación de "pasterelosis" se mantiene más por motivos de tipo histórico que por taxonómicos (DALY, 1999). II. 1.3.- Epidemiología Photobacteñum damselae subespecie piscicida ha sido aislada de peces enfermos en EEUU de América (SNIEZKO y cois., 1963; JANSSEN y SURGALLA, 1968; LEWIS y cois., 1970; HAWKE y cois., 1987), Japón (KIMURA y KITAO, 1971; KUSUDA y YAMAOKA, 1972; ONISHI y cois., 1982; YASUNAGA y cois., 1983, 1984; NAKAI y cois., 1992; KAWAKAMI y cois., 1999), Taiwan (TUNO y cois., 1985), España (TORANZO y cois., 1991; BALEBONA y cois., 1992; REAL y cois., 1997), Francia (BAUDIN LAURENCIN y cois., 1991), Grecia (BAKOPOULOS y cois., 1995), Turquía (CANDAN y cois., 1996), Italia (CESCHIA y cois., 1991), Portugal (BAPTISTA y cois., 1996), Malta (BAKOPOULOS y cois., 1997a), Noruega (SPEILBERG y cois., 1991), y Escocia (JONES y COX, 1999). Además, este patógeno primario ha sido aislado de numerosas fuentes, afectando tanto a especies salvajes como de piscifactoría. Las diferentes especies afectadas se detallan en la Tabla 3 (obtenida del trabajo de DALY, 1999 y completada por nosotros). 15 Revisión bibliográfica Tabla 3.-- Aislamientos de Photobacterium damsetae subespecie piscicida Especie Pais Referencia Perca blanca Lacha tirana MugU común MugU común Medregal del Japón Ayu Black sea bream Red sea bream Oval file fish Largescale blackfish Jurel Snakehead fish Lubina Lubina Lubina estriada Pejerrey Bocinegro Dorada Dorada Lubina Salmón Atlántico Salmón Atlántico Roccus americanus Brevoortia tyrannus Mugü cephahis MugU cephalus Serióla quinqueradiata Pecoglossiis cUtivelis Mylio macrocephahis Acanthopagrus schlegeli Navodan mxxiestus Girella punctata Pseudocaranx dentex Channa maculata Dicentrarchus labrax Dicentrarchus labrax Moróme saxatilis Atherina boyeri Pagnis Sparus aurata Sparus aurata Dicentrarchus labrax Salmo salar Salmo salar EEUU EEUU Francia Japón Japón Japón Japón Japón Japón Japón Taiwan España Francia EEUU de América Italia Italia España Portugal Turquía Noruega Escocia Sniezko y cois., 1964 Janssen y Surgalla 1968 Lewis y cois., 1970 B. Laurencin y cois., 1991 Kimuar y Kitao 1971 Kusuda y Miura 1972 Onishiy cois., 1982 Yasunagay cois., 1983,1984 Yasunagay cois., 1983,1984 Kawakami y cois., 1999 Nakaiy cois., 1992 Tungy cois., 1985 Balebona y cois. 1992 B. Laurencin y cois., 1991 Sniezko y cois., 1964 Hawkeycols., 1987 Ceschiay cois., 1991 Ceschiay cois., 1991 Toranzoy cois., 1991 Real y cois., 1997 Batista y cois., 1996 Canean y cois., 1996 Speilbergy cois., 1991 Jones y Cox 1999 La fuente de infección ha sido motivo de discusión durante mucho tiempo, siendo el agua de mar uno de los puntos más discutidos. Así, JANSSEN y SURGALLA (1968) observaron que la 16 Revisión bibliográfica bacteria moría en 3 días al ponerla en agua estéril con un 1.7% de NaCl, lo cual llevó a pensar que la temperatura y la salinidad son factores restrictivos que hacían que Photobacterium damselae subespecie piscicida no pudiera vivir mucho tiempo fuera del hospedador. TORANZO y cois. (1982) afirman de acuerdo con JANSSEN y SURGALLA (1968) que Photobacterium damselae subespecie piscicida sólo es capaz de sobrevivir en agua de mar no más de 3-5 días, sugiriendo que la forma de transmisión es por contacto directo pez a pez. MAGARIÑOS y cois. (1994a) describen a este agente causal con capacidad suficiente para sobrevivir en agua de mar, estando en ella en un estado viable pero no cultivable, y manteniendo la capacidad patógena sobre el rodaballo [Psettodes belcheri). Utilizando la técnica de ribotipado, MAGARIÑOS y cois. (1997b) estudian 29 cepas de esta bacteria con orígenes y hospedadores diferentes, con el fin de establecer si la técnica es útil para estudios epidemiológicos y para la clasificación taxonómica. El estudio reveló la aparición de dos ribotipos bien diferenciados, uno perteneciente a cepas europeas y otro a cepas japonesas. De esto se concluye que la utilización del ribotipado es una técnica útil tanto en estudios epidemiológicos como taxonómicos. K^?^ Revisión bibliográfica ROMALDE y cois. (1999) sugieren la posibilidad de una manera de infección hasta el momento no descrita como es la vía vertical, detectando la presencia de Photobacterium damselae subespecie piscicida en gónadas, huevos, fluido ovárico y seminal. En un estudio de distintas cepas de esta especie mediante la técnica de "Random amplified polymorphic DNA" (RAPD) para estudiar la posición taxonómica de diferentes cepas europeas y japonesas, MAGARIÑOS y cois. (2000) observaron que las cepas japonesas y europeas pertenecen a dos taxones diferentes, a pesar de compartir similares hospedadores, por lo cual esta técnica se presenta como una de las de elección a la hora de realizar estudios epidemiológicos en patógenos de peces. II. 1 A.- Patogenia Una vía de infección no clara es el agua. Para comprobar el interés que tiene en los mecanismos de transmisión MAGARIÑOS y cois., (1994a) realizaron un estudio en el que hicieron infecciones por baño en doradas y rodaballos, obteniendo que las doradas eran susceptibles de infectarse con una DL50 de 10^-10^ células/ml, mientras que el rodaballo se mostraba resistente y no se infectaba por esta vía. El mecanismo de acción patógena de Photobacterium damselae subespecie piscicida no está demasiado claro, aunque el hecho provocar lesiones granulomatosas durante la infección 18 Revisión bibliográfica histológicos encontrados en los peces, observándose en el bazo una necrosis aguda multifocal del tejido linfoide caracterizada por la pérdida de células, necrosis por coagulación, cariorrexis y por la presencia de muchas bacterias. En el hígado, encontraron una moderada necrosis aguda multifocal de los hepatocitos con una prominente cariorrexis. También observaron muchas bacterias en los sinusoides y dentro de los vasos hepáticos. Grandes áreas, del hígado mostraron zonas de hiperplasia de las células reticuloepiteliales de revestimiento de los sinusoides hepáticos. En el páncreas observaron también una necrosis aguda multifocal, acompañada con la pérdida o reducción del tamaño de los granulos de zimógeno. Sin embargo, no se detectó infiltrado inflamatorio en ninguno de los tejidos afectados. En el estudio en España del primer brote de esta enfermedad en dorada, TORANZO y cois. (1991) encontraron alteraciones histológicas, tanto en peces infectados de forma natural como experimentalmente, una necrosis aguda con infiltrado de eritrocitos y la presencia de muchas bacterias en capilares y espacios intersticiales en bazo y riñon. En el hígado se observó la presencia de una necrosis multifocal moderada de los hepatocitos, así como la presencia de bacterias en los sinusoides y espacios hepáticos. Las lesiones crónicas (granulomas) sólo fueron encontradas en peces con infección natural, después de que estos fueron tratados y habían superado el brote de la enfermedad. En 25 Revisión bibliográfica los peces de la infección experimental no se encontró ningún animal con granulomas. NOYA y cois. (1993) inocularon cepas vivas y los ECPs de Photobacteñum damselae subespecie piscicida en doradas para estudiar los cambios histológicos que estos provocaban en los peces. Observando los diferentes órganos describieron las siguientes lesiones: en la sangre de ambos grupos de peces el número de leucocitos, principalmente neutrófilos y eosinófilos, aumentó considerablemente. También se apreciaron abundantes leucocitos inmaduros y eritrocitos degenerados. Algunos de los peces inoculados con bacterias mostraron septicemia, observándose que neutrófilos y monocitos contenían a menudo bacterias fagocitadas, y que un porcentaje elevado de estas células sufria necrosis. En la cavidad peritoneal observaron neutrófilos, macrófagos y abundantes eosinófilos. Estos macrófagos y neutrófilos presentaban gran cantidad de bacterias fagocitadas. Los peces inoculados con ECPs y procesados en las primeras horas después de la inyección no manifestaron lesiones importantes. A partir de las 24 hrs aumentó el número de macrófagos en la pulpa roja, en los sinusoides y rodeando los elipsoides. Estos macrófagos estaban hipertrofiados y contenían abundantes eritrocitos fagocitados. En los peces inoculados con bacterias también se incrementó el número de macrófagos, los cuales contenían principalmente bacterias. Estos macrófagos se 26 Revisión bibliográfica localizaban fundamentalmente en áreas perielipsoidales. Con el tiempo se formaban colonias de diferentes tamaños, aunque sin llegar a constituir granulomas. Asimismo, se apreció un ligero aumento de leucocitos inmaduros. El riñon, tanto de las doradas inyectadas con ECPs como las inoculadas con bacterias, mostró dilatación de los sinusoides, en los cuales aparecían numerosos macrófagos, melanomacrófagos y leucocitos inmaduros. También se produjo un aumento de macrófagos en el tejido hematopoyético y un incremento de células en mitosis, lo cual estaba unido a una disminución de las formas más maduras de leucocitos y eritrocitos. En las doradas inoculadas con los ECPs estos macrófagos contenían abundantes eritrocitos fagocitados, mientras que en los inoculados con bacterias presentaban gran cantidad de bacterias. A partir del tercer o cuarto día aparecían colonias de diferente tamaño dispersas por todo el tejido hematopoyético. En ninguno de los peces estudiados se detectaron alteraciones en la nefrona. Las branquias de ambos grupos de peces mostraron infiltración de neutrófilos y macrófagos con restos celulares fagocitados, en los espacios interlaminares de las laminillas primarias y secundarias. Esta infiltración se hace más patente con el tiempo, y en los peces más afectados, incluso las células epiteliales de las laminillas se encuentran degeneradas, presentando granos de distinto tamaño en su citoplasma. Í^C>^ 27 Revisión bibliográfica En el hígado, no se han detectado lesiones en los peces inoculados con los ECPs. En los peces inoculados con bacterias, éstas forman colonias e invaden el parénquima hepático. Rodeando a estas colonias no se han apreciado alteraciones importantes. Por otra parte, el hígado de los peces que no fue invadido no parece sufrir ningún tipo de alteración. En el corazón se produjo un incremento en el número y tamaño de los granulos de las células endoteliales de la cavidad ventricular. Algunas de estas células muestran vacuolas. También se ha detectado una ligera pericarditis en algunos de los peces inoculados con bacterias, la cual va asociada a una colonización bacteriana del epicardio. En ningún caso las fibras musculares resultaron afectadas. El intestino es el menos afectado, y sólo se ha observado infiltración celular en la lámina propia de algunos de los peces inoculados. En la musculatura se ha comprobado que los ECPs no producen lesiones y que las bacterias tampoco parecen multiplicarse ni constituir colonias. Solamente se han podido observar lesiones en las zonas donde se realizaron las inyecciones con bacterias. En estas zonas las fibras musculares aparecen a menudo degeneradas, apreciándose una intensa infiltración leucocitaria. En ningún caso se llegaron a formar granulomas. 28 Revisión bibliográfica Además, en todos los órganos donde se formaron colonias bacterianas, se observó una ausencia total de alteraciones alrededor de las mismas. Por otra parte, se ha podido constatar que hay una clara relación entre el efecto patológico y el tiempo que tarda el pez en morir. En la descripción de la enfermedad en Salmón Atlántico (Salmo salar), JONES y COX. (1999) observaron como lesiones microscópicas, la presencia de diferentes áreas de necrosis coagulativa en bazo, hígado y riñon. II. 1.7.- Diagnóstico Photobacteñum damselae subsp. piscicida puede crecer en diferentes medios de cultivo suplementados con NaCl a una concentración final del 2-3%. La identificación de esta bacteria se puede realizar por pruebas bioquímicas clásicas (SMIBERT y KRIEG, 1981; WEST y COLSWELL, 1984) y por características morfológicas. La Tabla 1 muestra las propiedades bioquímicas de esta bacteria (JANSEN y SURGALLA, 1968; YASUNAGA y cois., 1983, 1984 y TORANZO y cois., 1991). KENT y cois. (1982) describieron el uso del sistema miniaturizado API 20E como una herramienta útil en el diagnóstico de la enfermedad, dando la bacteria resultados positivos a Arginina dehidrolasa. Glucosa, Galactosa, Mañosa y Fructosa, y negativo al resto de pruebas de la galería. SANTOS y cois. (1993) evalúan la fCT' 29 Revisión bibliográfica Utilidad del sistema miniaturizado API 20E para identificar a esta bacteria obteniendo como resultado que ninguna de las cepas usadas pudo ser identificada como Photobacterium damselae subespecie piscicida, debido a que el perfil de esta bacteria no se encuentra incluido en la base de datos de este sistema. KITAO y KIMURA (1974); KAWAHARA y cois. (1986) describen como técnica de diagnóstico para esta enfermedad, el uso de anticuerpos fluorescentes para detectar la bacteria en tejidos de peces infectados. La técnica de hibridación del ADN fue utilizada por ZHAO y AOKI (1989) para evaluar la presencia de Photobacterium daniselae subespecie piscicida a partir de colonias bacterianas crecidas en medios de cultivo, pero la sensibilidad de esta técnica no fue descrita. También usaron la misma técnica para detectar directamente la bacteria sobre tejido (bazo y riñon), siendo capaces de detectar 3.9 ng de ADN, o 10^ células de este agente patógeno. ZHAO y AOKI (1992) describieron el uso de la técnica de PCR para el diagnóstico de la infección por Photobacterium damselae subespecie piscicida utilizando unos cebadores elaborados a partir de la secuencia génica de un plásmido específico de esta bacteria y con un peso molecular de 5.1 Kb. 30 Revisión bibliográfica Un estudio comparativo realizado por ROMALDE y cois. (1995a) entre la técnica de aglutinación tradicional y unos sistemas para aglutinación en látex fabricados por Bionor®, muestra que en ambos casos se detectaron todas las cepas usadas de esta especie, no existiendo reacciones cruzadas con otros patógenos importantes en acuicultura como son Vibrio anguillarum y Aeromonas salm.onid.da, ni con otras bacterias pertenecientes a la Familia Pasteurellaceae. Sí hubo diferencias notables en cuanto a la sensibilidad, donde los sistemas con látex sólo detectaron a partir de 10^° bacterias por mi. La técnica de aglutinación en placa fue capaz de detectar a partir de 10'^ bacterias por mi. ROMALDE y cois. (1995b) evaluaron el sistema Aquararid-Pp de Bionor® para la detección de Photobacterium damselae subespecie piscicida observando que es una buena herramienta de diagnóstico al detectar todas las cepas del estudio, y que su especificidad también era buena al no tener reacciones cruzadas con otros patógenos importantes en acuicultura como son Vibrio anguillarum y Aeromonas salmonicida, ni con otras bacterias pertenecientes a la Familia Pasteurellaceae. La sensibilidad de la prueba permitió detectar 10^ bacterias por 0.5 gr de tejido. Un método para detectar a este agente infeccioso en el agua lo describieron REALI y cois. (1997). Para ello tomaron una muestra de agua y la filtraron por un filtro de nitrocelulosa de 0.45 l^m de poro y pusieron este filtro sobre un medio de cultivo (Agar 31 Revisión bibliográfica Marino con un 1% de manitol y 0.5 % de rojo fenol), siendo este método capaz de detectar la bacteria con 8 días de antelación a la aparición de un brote de enfermedad, lo cual permitió instaurar un tratamiento precoz frente a este patógeno. BAKOPOULOS y cois. (1997b) desarrollaron un ELISA para detectar la presencia de esta bacteria. Para ello probaron cepas de diferentes origenes tanto en cultivos in vitro como a partir de tejidos infectados. Estos autores obtuvieron que en cultivos in vitro y en tejidos infectados podían detectar valores desde 10^ células/mi, lo cual indicaba que el método ELISA podía ser una herramienta rápida, fácil y específica para detectar a Photobacterium damselae subespecie piscicida en brotes de enfermedad. La sensibilidad y especificidad del "Magnetic Beads-EIA" de BIONOR® AQUAEIA kit para el diagnostico de pasterelosis fue demostrada por ROMALDE y cois. (1999). Detectando todas las cepas de Photobacterium damselae subespecie piscicida probadas hasta una dosis de 10^ u.f.c./ml y dando resultados negativos para las cepas probadas de Photobacterium damselae subespecie damselae y Ph histaminum hasta dosis de lO^-lO^o u.f.c./ml. El resultado fue positivo en gónadas, huevos, fluido ovárico y seminal, lo cual abre una puerta a la posibilidad de la transmisión vertical de la pasterelosis. 32 Re visión bibliográfica Para realizar el diagnóstico de la enfermedad, OSORIO y cois. (1999) diseñaron una serie de cebadores, a partir de una región conservada del ARN 16S de la bacteria, desarrollando una iVesíed-PCR la cual era capaz de detectar de forma específica sólo a Photobactemim damselae subespecie piscicida, discriminándola perfectamente de otros patógenos en acuicultura. Esta técnica presenta una sensibilidad que permite detectar entre 1-10 fg de ADN (20-200 células). OSORIO y cois. (2000) para realizar el diagnóstico diferencial de la infección por Photobacterium damselae subespecie piscicida frente a Photobacterium damselae subespecie damselae utilizaron dos juegos de cebadores, uno a partir de una región conservada del ARN 16S de la bacteria y otro para el gen de la ureasa, desarrollando un método PCR, el cual fue capaz de detectar de forma específica sólo a Photobacterium damselae subsp. piscicida discriminándolo perfectamente de Photobacterium damselae subespecie damselae, ya que esta última especie muestra dos bandas, una correspondiente al ARN 16S y otra al gen de la ureasa, en cambio Photobacterium. damselae subespecie piscicida sólo muestra la banda del ARN 16S, lo cual revela que esta es una buena técnica para el diagnóstico de la enfermedad. 33 Revisión bibliográfica II. 1.8.-Control de la enfermedad II. 1.8.1.- Quimioterapia La susceptibilidad antibiótica de 60 cepas japonesas de Photobacterium damselae subespecie piscicida a 14 agentes quimioterápicos fue descrita por AOKI y KITAO (1985). Todas las cepas fueron sensibles a la ampicilina, 21 resistentes a furazolidona, y cinco a cloranfenicol, tetraciclina, kanamicina y sulfamonometoxin, siendo detectado en estas cinco el plásmido R. TAKASHIMA y cois. (1985) describieron las resistencias antibióticas de cepas de Photobacterium damselae subespecie piscicida de diferentes distritos del Japón. De 281 cepas probadas, 262 presentaban resistencia a la combinación de antibióticos formada por ampicilina, ácido nalidíxico, furazolidona, cloranfenicol, tetraciclina, kanamicina y sulfamonometoxin, siendo detectado el plásmido R en 168 cepas, contradiciendo los resultados previos de AOKI y KITAO (1985). La efectividad del fluorfenicol en el tratamiento de la enfermedad provocada de forma experimental, así como la ineficacia de otros agentes como ácido oxolínico, ampicilina y nifurstirenato sódico fue descrita por YASUNAGA y YASUMOTO (1988). 34 Revisión bibliográfica 1983; CHYLMONCZYK, 1992). Una de las características del timo de los mamíferos es la presencia de corpúsculos de Hassall, los cuales también han sido descritos en diversas ocasiones (GOOD y cois., 1966) en estudios de microscopía en lampreas y elasmobranquios (ZAPATA y cois., 1996a), pero no en teleósteos. Estudios realizados por ZAPATA y COOPER (1990), CHYLMONCZYK (1992) y MANNING (1994) describen que el timo de los teleósteos además de ser parecido morfológicamente, presenta una función similar al de los vertebrados superiores, siendo una fuente de células T inmunocompetentes. II. 2.1.2. - Órganos linfoides secundarios • Bazo Se encuentra situado junto a la curvatura mayor del estómago. Éste presenta un color rojo oscuro y forma ovoide. Su cápsula es fibrosa y desprovista de músculo. Ésta, a diferencia de los mamíferos no emite trabéculas a través del parénquima del órgano (ELLIS y cois., 1989). Los peces que presentan un gran desarrollo del tejido linfoide en el riñon, no tienen un gran desarrollo del tejido linfoide del bazo (ZAPATA y cois., 1996b). La función del bazo en la respuesta inmune ha sido relacionada fundamentalmente con la respuesta inmune secundaria (ELLIS y SOUSA, 1974; TATNER 1985). 41 Revisión bibliográfica • Tejido línfoíde asociado al intestino Este tejido se distribuye en acúmulos difusos a lo largo de la lámina propia y el epitelio del intestino de los teleósteos (DOGGET y HARRIS, 1991). Histológicamente, hay poca variación entre especies, caracterizándose por ser un tejido linfoide no encapsulado, compuesto por macrófagos, linfocitos, células plasmáticas y diferentes tipos de granulocitos (TEMKIM y McMlLLAN, 1986; ROMBOUTy cois., 1993). II.2.2.- Sistema inmune celular En este sistema defensivo estáin involucradas una gran variedad de células como son monocitos/macrófagos, granulocitos, y células citotóxicas no específicas. n.2.2.1.- Macrófagos Los macrófagos son células fagocíticas móviles que podemos encontrar en diferentes localizaciones como: la sangre (donde se les denomina monocitos y son considerados los precursores de los macrófagos tisulares), órganos linfoides (en especial del riñon anterior) y cavidad peritoneal. El estudio del sistema inmune, y en particular de los macrófagos exige ser capaz de obtenerlos de la forma más pura posible. Para enriquecer las preparaciones de macrófagos se utiliza la centrifugación en un gradiente de densidad, lo cual permite separar de forma efectiva los macrófagos de linfocitos y blastocitos, 42 Revisión bibliográfica debido a su estructura más grande y granular (SECOMBES, 1990). Sin embargo, este método hace difícil la separación de los macrófagos de los granulocitos, por lo que se puede realizar una extracción enriquecida en macrófagos obteniéndolos a partir de la cavidad peritoneal usando agentes flogísticos capaces de inducir una respuesta inflamatoria (SECOMBES, 1996). En dicha respuesta, los granulocitos aparecerán en los primeros días postinyección debido a su alta movilidad, mientras que los macrófagos aumentarán su presencia más tarde, momento que será el idóneo para recoger las células. Para obtener cultivos aún más puros, se recurre a explotar características propias de los macrófagos como son . las de adherirse a substratos y poder vivir durante semanas en cultivo. La adherencia a superficies de cristal o plástico es un método rápido para aumentar la pureza de una extracción de macrófagos, técnica que además es rápida, pues puede ser realizada en 2-3 horas. Inmediatamente después del, periodo de adherencia se retiran las células no adherentes, obteniéndose cultivos de macrófagos con una pureza superior al 95% (SECOMBES, 1996). Los macrófagos pueden ser identificados por diversas vías, al ser mononucleados, positivos a la esterasa no específica y fosfatasa acida y negativo a la peroxidasa (SECOMBES, 1996). 43 Revisión bibliográfica Funcionalmente, estas células pueden actuar como células accesorias para la respuesta de los linfocitos, desarrollando también su capacidad fagocítica, o pueden producir radicales libres de oxígeno y nitrógeno, pudiendo destruir patógenos como bacterias, virus y parásitos. Estas funciones pueden variar y tener unas más desarrolladas que otras en función del origen de los macrófagos (SECOMBES, 1990). Algunos autores destacan la actividad antimicrobiana de los macrófagos por la producción de óxido nítrico (ON), así lo han demostrado diferentes trabajos, en los cuales macrófagos de ratón fueron estimulados con citoquinas y respondieron incrementando la producción de ON (MURRAY y TEITELBAUM, 1992; SCHNEEMANN y cois., 1993; SCHOEDON y cois., 1995; EVANS y cois., 1996). En macrófagos de rumiantes, también se ha demostrado la producción mayor de ON cuando se les estimuló con citoquinas o LPS (ALDER y cois., 1996). En peces, algunos autores han logrado obtener respuestas de cultivos primarios de macrófagos y de líneas celulares de macrófagos en forma de producción de óxido nítrico cuando las estimularon con lipopolisacáridos bacterianos (NEUMMAN y cois., 1995; WANG y cois., 1995). Otros autores observaron diferentes respuestas en función de la cantidad de arginina en la dieta de los peces, y en los medios de cultivo donde se cultivaron los macrófagos (BUENTELLO y GATLIN, 1999). En un estudio 44 Revisión bibliográfica realizado con macrófagos de rodaballo [Scophtkalmus maximus), TAFALLA y NOVOA, (2000) describieron los requerimientos que estas células tenían para una correcta activación y producción de ON, demostrando que añadiendo a los macrófagos el factor de necrosis tumoral humano a (TNF-a), éstos producían mucho más ON. Otros autores han utilizado los macrófagos para el estudio de la actividad que estos experimentan cuando entran en contacto con un agente extraño (bacteria, virus, parásito, etc.). Así, HARDIE y cois. (1996) trataron macrófagos con factores activadores de los macrófagos (MAF), los cuales fueron enfrentados con el patógeno de peces Renibacterium salrnoninarurn, observando un aumento en la "explosión respiratoria" (producción de O2") y en la capacidad de inhibición del crecimiento de la bacteria. En 1995, SKARMETA y cois, utilizaron macrófagos de trucha arcoiris, dorada y lubina para estudiar el efecto bactericida de la "explosión respiratoria" sobre Photobacterium damselae subsp. piscicida, observando que los macrófagos de las tres especies tenían efecto bactericida sobre la bacteria. II.2.2.2.- Granulocitos En los teleósteos se han encontrado tres tipos de granulocitos que son neutrófilos, eosinófilos y basófilos (ELLIS, 1977; ROWLEY y cois., 1988; HIÑE, 1992; AINSWORTH, 1992). ^ 45 Revisión bibliográfica Los neutrófilos y eosinófilos son los más comunes, estando presentes en la mayoría de las especies al contrario que los basófilos. (SECOMBES, 1996). Estas células muestran una morfología y propiedades histoquímicas similares a los de mamíferos. Se encuentran en sangre, bazo, riñon, lesiones inflamatorias (ELLIS, 1989) y peritoneo (SECOMBES 1996). Los granulocitos son muy móviles, especialmente los neutrófilos. Su actividad fagocítica fue cuestionada por algunos autores (ELLIS, 1981), pero hoy en día no existen dudas de esta capacidad por parte de los granulocitos (SECOMBES, 1996). Estas células producen moléculas reactivas de oxígeno, pero aún así su capacidad bactericida es pobre en relación con los macrófagos (SECOMBES, 1996). Existen unos granulocitos menos móviles que encontramos en las agallas e intestino, los cuales presentan actividad frente a bacterias y helmintos patógenos (SECOMBES, 1996). II.2.2.3.- Células citotóxicas no especificas En peces, estas células son consideradas como las equivalentes a las células "Natural Killef de los mamíferos, y pueden ser obtenidas de sangre, órganos linfoides e intestino. 45 Revisión bibliográfica Presentan una morfología similar a las de los monocitos (EVANS y cois., 1984) y tienen capacidad para lisar un gran número de líneas celulares tumorales de mamíferos (SECOMBES, 1996) y líneas celulares de peces cuando se infectan con virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa (MOODY y cois., 1985), así como frente a protozoos (EVANS y JASO-FRIEDMANN, 1992). 11.2.3.- Mecanismos para destruir microorganismos fagocitados Los fagocitos son capaces de destruir patógenos usando diversos métodos que podemos clasificar en dos categorías, los mecanismos dependientes del oxígeno y los no dependientes del oxígeno. II.2.3.1.- Mecanismos Oxigeno Dependientes Cuando una célula fagocítica ingiere una partícula, se produce un aumento en el oxígeno captado que es independiente de la respiración mitocondrial. A este fenómeno se le denomina "Explosión Respiratoria". La explosión respiratoria de las células fagocíticas (macrófagos y neutrófilos) presenta una clara actividad antimicrobiana (DINAUER y cois., 1993; NEUMAN y cois., 2001). Mediante la "explosión respiratoria", las células fagocíticas producen diferentes radicales de oxígeno y nitrógeno que son tóxicos para las bacterias, virus, parásitos y células tumorales. Entre estos radicales destacan como moléculas oxígeno reactivas los aniones superóxido (Oa), peróxido de hidrógeno (H2O2) y radicales hidroxilo (OH), y como moléculas nitrógeno reactivas Revisión bibliográfica encontramos el óxido nítrico (ON) y los peroxinitritos (ONOO) (ELLIS, 1999). Estos productos producidos por las células fagocíticas se dividen en dos clases: • Moléculas Oxígeno Reactivas (MOR) Estas moléculas son producidas por las células fagocíticas durante la "explosión respiratoria", al contactar con bacterias o durante la fagocitosis (SECOMBES, 1996; LAMAS y ELLIS, 1994). La producción de radicales libres de oxígeno durante la "explosión respiratoria" de las células fagocíticas de los peces ha sido minuciosamente estudiada desde hace tiempo (SECOMBES y FLETCHER, 1992). En la "explosión respiratoria" la primera reacción que se produce es la reducción de un electrón de la molécula de oxígeno produciendo O2", reacción que es catalizada por la enzima NADPH oxidasa, la cual se encuentra en la membrana plasmática de las células fagocíticas (SEGAL y ABO, 1993; XIA y ZWEIER, 1997). Se ha demostrado la existencia de NADPH oxidasa en fagocitos de trucha y la producción de Oa" por un mecanismo glucosa dependiente, hecho que habría que comprobar en otras especies de peces (SECOMBES y FLETCHER, 1992). 48 Revisión bibliográfica Existen estudios que indican que los aniones superóxido producidos por los macrófagos no son particularmente tóxicos para las bacterias patógenas en general, aunque Photobacteñum damselae subespecie piscidda se muestra sensible a la acción del O2" (SKARMETA y cois., 1995), pero sí lo son todas en general al peróxido de hidrógeno y sus derivados (SHARP y SECOMBES, 1993; HARDIE y cois., 1996), moléculas que también se producen durante esta reacción. HARDIE y cois. (1996) realizaron experimentos de activación de macrófagos de trucha arcoiris con MAF, describiendo el aumento de producción de MOR (O^-, H2O2) en los macrófagos tratados, y la inactivación de un mayor número de células de Renibacteñum salmoninarum por parte de dichos macrófagos. Tanto los macrófagos como los neutrófilos pueden generar MOR, aunque existen diferencias entre ambos tipos celulares. En salmón atlántico (Salmo salar) se ha descrito como después de una estimulación con esteres de forbol existe una mayor producción de O2" por parte de los neutrófilos que de los macrófagos (LAMAS y ELLIS, 1994), aunque el pez gato (Ictalurus punctatus) parece ser un pobre productor de MOR (DEXIANG y AINSWORTH, 1991). • Moléculas Nitrógeno Reactivas (MNR) Dentro de este grupo se encuentran diferentes moléculas como el óxido nítrico (NO), peroxinitritos (OONO), nitratos (NO3), 49 Revisión bibliográfica dióxido de nitrógeno (NO2) y nitritos (NOa), (NATHAN y SHILOH, 2000). H2N NH; NH / H2N N-OH NH \ A 0=0 HgO NADPH NADP* O V A Or 0=0 H2O 0.5 NADPH 0.5NADP' m n / \ + •N=0 Figura 1.- Formación de óxido nítrico y L-citnilina a partir de arginina Una de las moléculas más significativas de las MNR es el óxido nítrico (ON), el cual fue estudiado en primer lugar en el sistema nervioso donde actúa como mensajero intra y extracelular (GARTHWAITE, 1991; BREDT y SYNDER, 1992). El ON se sintetiza a partir de la Arginina por la acción de una oxidasa de función mixta (Óxido Nítrico Sintasa, NOS), la cual hidroxila su carbono terminal para dar ON y L-citrulina (Figura 1). En los mamíferos, se describe una óxido nítrico sintasa constitutiva (NOS), que se divide en dos tipos, la primera se 50 Material y métodos III.3.- MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS Para el cultivo de las diferentes cepas y su utilización en el laboratorio se usaron varios medios de cultivo, que fueron el Agar Infusión Cerebro Corazón (BHIA) (Cultimed), Caldo Infusión Cerebro Corazón (BHIB) (Cultimed) y Agar Sangre (Cultimed) suplementados con un 1% de NaCl (Panreac), los cuales se prepararon según las instrucciones del fabricainte. Para enriquecer el medio se empleó sangre desfibrinada de oveja (Oxoid) en una proporción del 5%. Para capsular las cepas se utilizó BHIA suplementado con un 1% de NaCl (Panreac) y un 1% de glucosa (Panreac). Este medio nunca ha sido descrito para la formación de la cápsula de Photobacterium damselae subsp. piscicida, pero desde hace algunos años existen descripciones donde el enriquecimiento con glucosa del medio de cultivo facilita su desarrollo (BONETy cois., 1994). Para la comprobar la formación de esta estructura en las cepas, éstas se sembraron en dos medios: Agar sangre con un 1% de NaCl y en BHIA con un 1% de NaCl y un 1% de glucosa. A las 48 horas, se sumergió el cultivo en glutaraldehido, y lo enviamos al Servicio de Microscopía Electrónica y Apoyo a la Investigación de la Universidad de Córdoba, donde se realizó un estudio mediante Microscopía Electrónica de Transmisión. 57 Material y métodos Los medios inoculados fueron incubados durante 48 horas a 25°C. Las cepas aisladas en cultivo puro, fueron resuspendidas en Caldo Triptona Soja (Cultimed) con un 15% de glicerol y fueron congeladas a -80°C para su conservación. III.4.- MATERIAL Y MÉTODOS UTILIZADOS EN CADA EXPERIENCIA Desarrollo del objetivo 1.- CONOCER EL EFECTO DEL ÓXIDO NÍTRICO SOBRE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE Photobacterium damselae subsp. piscicida. III.4.1.- EXPERIENCIA I.- Actividad bactericida del óxido nítrico y los peroxinitritos sobre Photobacterium damselae subespecie piscicida. Esta experiencia en una primera fase consistió en enfrentar a la bacteria capsulada y sin capsular a una serie de diluciones de donadores de óxido nítrico (ON) N-{p-D-Glucopyranosil)-N2-acetil-Snitroso-D,L-penicilamina (SNAP), y de peroxinitritos (ONOO) 3Morfolinosydnonimina, HCl (SIN-1), con el fin de medir la supervivencia de Photobacterium damselae subsp. piscicida frente a estos productos. Con la finalidad de establecer si el efecto producido sobre la supervivencia es debido o no a las moléculas nitrógeno reactivas se 58 Material y métodos emplearon dos enzimas, que son la superóxido dismutasa (SOD) (Sigma-Aldrich S.A.), la cual elimina los radicales superóxido haciendo que no se formen peroxinitritos, y la catalasa (CAT) (Sigma-Aldrich S.A.), la cual reacciona con el peróxido de hidrógeno eliminándolo en forma de agua y oxigeno comprobando de esta forma que el daño sobre la bacteria no es producido por el H2O2 sino por los peroxinitritos, las cuales se adicionarán a los tubos en los que incorporamos SIN-1. En una segunda fase tomamos la dosis mayor de SNAP utilizada en la fase anterior y la añadimos a la misma dosis de bacterias con y sin cápsula, y posteriormente incorporamos donadores de radicales superóxido para averiguar quién es más tóxico, el óxido nítrico o los peroxinitritos. Las diferentes reacciones químicas que se producen por la acción de los donadores y de los inhibidores se resumen en el Esquema 1. 59 Material y métodos SNAP X/Xo G/Go SIN-1 ON ^ O. HoOo^ SOD •2'-^2 CAT ONoa ON ONOa Hp O2 EflSQUEMA 1.- Esquema de las reacciones químicas producidas in vitro por los donadores e inhibidores usados en el experimento. Para evaluar el efecto del óxido nítrico y los peroxinitritos, medimos la supervivencia utilizando el método del 3-[4-5Dimetiltiazol-2 y e]-2-5bromuro de difeniltetrazolium (MTT) (SECOMBES, 1990). El desarrollo de estas fases se resume en el Esquema 2. Para el desarrollo de la primera fase se sometieron a varias cepas de Photobacteríum damselae subsp. piscicida, con y sin cápsula, a la acción del óxido nítrico y peroxinitritos, haciendo reaccionar los cultivos en fase líquida de estas bacterias con diferentes diluciones (O, 10, 30, 100, 300, y 1000 i^M) de donadores de estos productos, como son el SNAP (N-(p-D-Glucopyranosil)-N260 Material y métodos acetil-S-nitroso-D,L-penicilamina) (Calbiochem) para óxido nítrico, y SIN-1 (3-Morfolinosydnonimina, HCl) (Calbiochem) para el NO y los O2". Estos reactivos al ser mezclados en el medio de cultivo liberan estos productos (CAMPOS-PÉREZ y cois., 2000a). Las cepas de Photobacterium damselae subespecie piscicida usadas en esta experiencia fueron la C2, 94/99, Dl-21 y la ATCC 17911, cuyas fuentes y orígenes se muestran en la Tabla 4. Todas ellas fueron cultivadas en BHIA con un 1% de NaCl para las cepas sin cápsula y en BHIA con un 1% de NaCl y un 1% de glucosa para las cepas con cápsula. A partir de estos cultivos puros se tomaron bacterias con un hisopo estéril para resuspenderlas en BHI líquido con un 1% de NaCl, obteniendo una concentración de bacterias de 108 unidades formadoras de colonias por mililitro (u.f.c./ml). Esto se hizo ajustando una suspensión del cultivo a una densidad óptica de 0.68 medida a 590nm en un espectrofotómetro (Boheringer-Mangein, Spectra shell), y com.pro bando posteriormente, mediante diluciones seriadas y cultivo de una alícuota de las mismas, el con taje directo de colonias en las placas. Como control de la técnica se usó la N-acetil penicilamina (compuesto parental del SNAP), para establecer si esta presenta efecto tóxico pos sí sola sobre la bacteria. La N-acetil penicilamina fue diluida a una concentración de ImM. Entonces se tomaron 4 eppendorfs con 1 mi cada uno de BHIB conteniendo cada uno 10^ unidades formadoras de colonias. 61 Material y métodos Los donadores de ON, SNAP (N-(p-D-Glucopyranosil)-N2acetil-S-nitroso-D,L-penicilamina) (Calbiochem) y de O2' y ON, SIN1 (3-Morfolinosydnonimina, HCl) (Calbiochem) se diluyeron en BHIB haciendo diluciones seriadas de O, 10, 30, 100, 300 y 1000 ViM (BRUNELLl y col., 1995; FIERRO y col., 1996). Del cultivo líquido en fase logarítmica se pasó 1 mi a 24 eppendorfs, 6 para el SNAP y 18 para el SIN-1, quedando entonces cada uno con 10^ u.f.c./ml. Centrifugamos a 3000 rpm durante 10 minutos, para a continuación retirar el sobrenadante. Al precipitado obtenido, se le añadió 500 \x\ por separado de las 6 diferentes diluciones preparadas en ese momento, de SNAP (5 eppendorfs) y de SlN-1, este último fue hecho por triplicado (3 grupos de 6 eppendorfs). Triplicar el SIN-1, fue para añadir a cada grupo de 6 eppendorfs: • SIN-1 solo • SIN-1 + Superóxido dismutasa (SOD, 500 U/ml) • SIN-1 + Superóxido dismutasa (SOD, 500 U/ml) + Catalasa (500 iig/ml). Para minimizar el error de lectura de las pruebas de cada concentración obtenida se tomaron por cuadruplicado 100 pl y se 62 Material y métodos pasaron a placas de ELISA de 96 pocilios. Estas placas se incubaron a 25°C y se tomaron muestras a las 24 horas de cada una de las diluciones probadas. Después de la incubación se preparó el 3-[4-5-Dimetiltiazol-2 y e]-2-5bromuro de difeniltetrazolium (MTT) a una concentración de 5 mg/10 mi en agua destilada y a continuación se añadió 100 ]i\ a cada pocilio (SECOMBES, 1990). Las placas fueron leídas 15 minutos después en un espectrofo tome tro (Boheringer-Mangein, Spectra shell) a 600 nm. El cálculo de bacterias supervivientes se realizó según la formula: Densidad óptica de pocilios tratados XlOO Densidad óptica de pocilios no tratados En la segunda fase se ha intentado comprobar los resultados obtenidos en la primera fase por una vía diferente que corroborase o no los datos obtenidos. En concreto las cepas fueron sometidas a la acción de donadores de radicales superóxido (xantina (X), xantina oxidasa (Xo), glucosa (G) y glucosa oxidasa (Go) (todas obtenidas en Sigma-Aldrich S.A.) y utilizadas a una concentración de 100 pg/ml. La combinación de radicales superóxido, que estos productos liberan, con el óxido nítrico que libera el SNAP produjo la formación de peroxinitritos. Para ello tomamos la dosis mayor de SNAP probada en la fase anterior (1000 ^M) y fue enfrentada a una 63 Material y métodos dosis única (100 lag/ml) de estos donadores. Posteriormente, se realizaron muéstreos seriados durante 24 horas (O, 5, 9, 12, 18 y 24 horas). Después de añadir el MTT a la concentración descrita anteriormente se tomaron muestras de cada pocilio para medir mediante espectrofotómetro en las mismas condiciones que la fase anterior. Esta fase se resume en el Esquema 3. 54 Material y métodos SNAP o, 10, 30, 100, 300, 1000|xM SIN-1 O, 10, 30, 100, 300, lOOOnM Producción de Óxido nítrico Producción de peroxinitritos SIN-1 o, 10, 30, 100, 300, ICOO^M + SOD+CAT Inhibición de la producción de peroxinitritos Photobacterium damselae subsp. piscicida, Vibrio alginolyticus y Vibrio harveyi Medir supervivencia E^SQUEMA 2.- Acción del óxido nítrico y los peroxinitritos 65 Material y métodos SNAP 1000 ^M SNAP (1000 nM) + X/Xo (lOOnM/ml) SNAP (1000 HM) + G/Gc(100fiM/ml) Producción de óxido nítrico Producción de peroxinitritos Photobacteñum dams^ae subsp. piscicida Medir svtpétvivencia. ,'*'í>t,"2tr' rss^Rs^'^'í'',*; w •'""' ;„T."2r r'-^';?-"?*.'r»s^,JiííE:? sr,' ESQUEMA 3.-Estudio comparado del efecto del óxido nítrico frente a los peroxinitritos 66 Material y métodos Posteriormente fueron incubadas a 27°C durante una hora. Como la NADPH interfiere en la medición de nitritos, se debe inducir su oxidación, para lo cual fueron añadidos 1.5 }il de una solución de L-Lactic deshidrogenasa Tipo 1 (Sigma-Aldrich S.A.) (25 mg/ml) y 10 -[ú de una solución 100 mM de piruvato sódico (Sigma-Aldrich S.A.), e incubados a 37°C durante 1 hora. Al final de estas reacciones, el nitrato es reducido totalmente a nitritos y es en este momento cuando realizamos la medición. Para ello se añadió 100 ]ú de reactivo de Griess por pocilio, el cual va a convertir a los nitritos en compuestos Azo que son medibles en el espectrofo tome tro a una longitud de onda de 540 nm. El fundamento del método espectrofo tomé trico mostrando la reacción de nitritos con sulfanilamida en solución acida de naftiletilendiamina se describe en la Figura 2. Reactivo de Griess: - Componente 1 • Sulfanilamida Igr • 100 mi de una solución de H3PO4 al 5% - Componente 2 • Naftil-etilenediamina 0.1 gr • 100 mi de H2O destilada Mezclando volúmenes iguales de ambos componentes. 73 Material y métodos Figura 2-. Esquema general de la reacción espectrofotométrica mostrando la reacción de nitritos con sulfanilamida en solución acida de naftiletilendiamina NO, Nitrato Nitrato Reductasa NO, Nitrito SOjNHj Sulfanilamida {Componente 1 del Reactivo de Griess] ---X^NH, .-^NH: SOjNHj N-(1-Naftil)etilenediainina [Componente 2 del Reactivo de griess] SOjNHj Compueto Azo ^mai = 540 nm 74 Material v métodos La absorbancia fue medida a 540 nm, en un lector de placas (Boheringer-Mangein, Spectra shell). La curva estándar fue elaborada a partir de diluciones seriadas de nitrato sódico. Para ello preparamos una solución madre (SM) a una concentración ImM de nitrato sódico en medio mínimo esencial (DMEM, Gibco BRL) haciendo alícuotas de 500 1^1 que se mantienen congeladas a -20°C. La elaboración de las diluciones seriadas se hizo según se muestra en la Tabla 5, y ello permitió establecer con exactitud la medida de los nitritos en el suero, extrapolando la absorbancia medida con respecto a la curva patrón. Tabla 5.- Diluciones de la curva patrón CONCENTRACIÓN 100 (xM 80 nM 60 nM 40 nM 20 nM 10 nM 5nM 2.5 vM ÜLANCÜ (Medio) VOLUMEN A PASAR !50 lal de SM 1600 ni 1200 ni 800 ni 400 ni 400 |il 400 jxl 400 ni de nitrato sódico VOLUMEN DE MEDIO 2250 ni 400 ni 400 ni 400 ni 400 ni 400 ni 400 ni 400 ni 800 ni 75 Material y métodos III.4.2.5.- Determinación de L-citrulina La L-citrulina es un coproducto de la biosíntesis del óxido nítrico, y para su determinación fue utilizado el método colorimétrico (BOYDE y RAHMATULLAH, 1980). Se tomaron 400 pl de suero del pez, al que fue añadido ureasa tipo III (Sigma-Aldrich S.A.) a una concentración final de 45 Ul/ml, incubándolo a 37 °C durante 30 minutos. La mezcla fue desproteinizada añadiendo una solución fría al 5% de ácido tricloroacético (Sigma-Aldrich S.A.). Posteriormente, centrifugamos a 5000 rpm durante 15 min, y recogimos el sobrenadante (aprox. 400 vil). Estos 400 \x\ fueron mezclamos con 3 mi de solución cromogénica que tiene la siguiente composición: Consta de 1 parte de Solución I y 2 partes de Solución II 0.5% diacetiImonoxime/0.01% tiosemicarbacide en Solución I: agua destilada 0.025% FeCls en una solución al 25% de ácido Solución II: sulfúrico y 20% de ácido fosfórico en agua destilada 76 Material y métodos Esta mezcla se llevó a 96°C durante 5 minutos y luego fue enfriada a temperatura ambiente. Posteriormente se midió la absorbancia a 570 nm en un espectrofotómetro (BoheringerMangein, Spectra shell). Para hacer la curva patrón utilizamos L-citrulina (SigmaAldrich S.A.) de la cual se hicieron diluciones conocidas (2.5-100 ]aM). Comenzamos preparando una solución madre al 1 mM de Lcitrulina e hicimos alícuotas de 2000 i^l que mantuvimos congeladas a -20°C. La elaboración de las diluciones seriadas se hizo según se muestra el la Tabla 6. Tabla 6.- Diluciones de la curva patrón de L-citrulina CONCENTRACIÓN VOLUMEN A PASAR VOLUMEN DE MEDIO 100 nM —-, ] 80 nM —T 60 ^M —£ 40 HM T 20 nM - 10 HM T 5nM J 2.5 nM ^ ÜLANCÜ (Medio) OOQil de SM 6400^1 4800 lal 3200 ni 2400 ni 2400 ni 2400 ni 2400 ni 9000 ni 1600 ni 1600 ni 1600 ni 1600 ni 1600 ni 1600 ni 1600 ni 200Ó ni ^T'^f^^ 77 Material y métodos III.4.2.6.- Aislamiento de macrófagos Los macrófagos se aislaron de la porción anterior del riñon de las doradas del estudio, inmediatamente después de su sacrificio, según el protocolo descrito por SECOMBES (1990). El riñon proximal fiae extraído y macerado haciéndolo pasar por una membrana de nylon de 100 ]i de poro (Eppendorf), resuspendiéndolo en medio Leibovitz L-15 (Sigma-Aldrich S.A.) suplementado con un 2% de suero fetal bovino (FBS) (Biochrom KG), 100 ng de penicilina por mi, 100 pg de estreptomicina por mi (P/S) (Biochrom KG) y 10 unidades de heparina por mi (Sigma-Aldrich S.A.). Esta suspensión fue colocada sobre un gradiente discontinuo de percoll (51/34%) (Sigma-Aldrich S.A.) y la centrifugamos a 1400 g durante 35 minutos. La banda de células que aparece en la interfase del percoll fue recogida según aparece en la Figura 3, y lavadas dos veces con medio L-15. Posteriormente, realizamos un contaje en un hemocitómetro, y la concentración fue ajustada a 1x10'^ células/mi con L-15 suplementado con un 0.1% de suero fetal bovino (FBS) y P/S, repartiendo 100 pl de esta suspensión de células en cada pocilio de las placas de 96 pocilios (Corning). Se Incubó 3 horas a 18°C y entonces el medio fue retirado para eliminar las células no adheridas al pocilio. Las tres placas preparadas fueron lavadas dos veces con solución balanceada de Hank (Sigma-Aldrich S.A.) mediante inversión sobre papel de filtro, eliminando la solución de los pocilios y llenando de nuevo con la misma solución, para 78 Material y métodos posteriormente realizar la extracción del ARN de los macrófagos según se describe en el apartado 111.4.2.7. PercoU 34% Capa de enriquecimiento de macrófagos Percoll 51% Figura 3.- Esquema del gradiente de percoll para la obtención enriquecida de macrófagos. III.4.2.7.- Extracción del ARN El ARN total fue extraído a partir del hígado, agallas, intestino, bazo, sistema nervioso, riñon y de los macrófagos aislados del riñon anterior de los peces sacrificados. Para la extracción se tomó una muestra de cada tejido de unos 25 mg, la cual fue congelada en nitrógeno líquido. Posteriormente, la muestra fue macerada, y resuspenddida en 0,5 79 Material y métodos mi de Trizol, siguiendo las recomendaciones del fabricante (Biotech) y manteniéndola mientras tanto en hielo, añadiéndole 500 ]al de cloroformo (Panreac). La suspensión fue mezclada con agitación fuerte durante 15 segundos en vortex, y centrifugada a 12000 rpm durante 20 min a 4°C. La fase acuosa se recogió en eppendorfs, añadiéndole el mismo volumen de Isopropanol (SigmaAldrich S.A.) frío, e incubándola toda la noche a -20 °C. Se centrifugó a 12000 rpm durante 20 min a 4°C, eliminando el sobrenadante. Al precipitado se le añadió 500 pl de etanol (Panreac) 70% frío, y centrifugamos a 12000 rpm durante 10 minutos a 4°C. Este paso se repite dos veces. El sobrenadante es retirado, y dejamos secar el precipitado por completo para posteriormente añadir de 20 a 40 vil de agua destilada tratada con dietil pirocarbamato (DEPC) (Sigma-Aldrich S.A.). Posteriormente, para diluirlo bien, el precipitado se calentó a 55°C en un baño durante unos 10 min. Para evaluar la calidad del ARN extraído, se midió la absorbancia a 260 y 280 nm de longitud de onda. La relación entre ambas medidas (lectura 260/lectura 280) nos debe dar valores entre 1.6 y 2 si el ARN obtenido es de buena calidad. Para cuantificar la cantidad de ARN de la extracción se tomó la lectura medida a 260 nm y la multiplicamos por 4, obteniendo de esta forma el número de pg/ul. 80 Material y métodos III.4.2.8.- Síntesis de ADN complementario (ADNc) Para elaborar ADNc a partir de ARN es necesaria la participación de una enzima transcriptasa inversa, la cual puede construir una cadena de ácidos nucleicos complementaria a la cadena molde. Para ello es necesario la presencia de una cadena iniciadora que híbrida en el extremo 3' de la cadena molde. La razón de recurrir a esta transformación es por la fragilidad del ARN en comparación con el ADNc, el cual se mantiene viable mucho más tiempo y se conserva de manera más fácil que el ARN. Para la transcripción inversa del ARN a ADNc se tomó 1 pg de ARN y se añadió 1 \x\ de la cadena iniciadora (oligo (DT) 12-18) (Amersham-Pharmacia), 2 \x\ de tampón, 4 \ú. de CbMg, 1 \x\ de la mezcla de dinucleótidos-fosfato (20 mM) (Amersham-Pharmacia), 0.6 |il de inhibidor de la ribonucleasa (RNAsin) (Promega), 0.3 pl de la enzima transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV transcriptasa inversa) (Promega) y 2.1 pl de agua DEPC. Posteriormente, se incubó durante 75 min a 42°C, para luego ponerlo 10 min a 94 °C y finalmente 5 min en un baño helado a 4°C. El ADNc se conservó a 4°C. III.4.2.9.- Detección de la óxido nítrico sintasa inducible mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Para la detección de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) en dorada por RT-PCR fue utilizada la técnica de iVesíed-PCR. Para la primera fase de la técnica se utilizaron los cebadores NOS-M (5'- ^-^ 81 Material y métodos GTTGGTACATGGGCACTGA-3') y NOS-N (5'-GTAATGTCCAGGAAGTAGGTG-Sl. Los cebadores NOS-P (5'-CTTCAACTCCAGGTTGCTCTG-3') y NOS-Q (5'-TCACTCGGAAGGTGTCAGAAC-3') fueron usados en la segunda fase de la reacción. Todos los cebadores se usaron a una concentración de 20 pg/ml y fueron elaborados por Genset S.A. (París, Francia). Los cebadores se han diseñado siguiendo las directrices de trabajos previos (CAMPOS-PÉREZ y col., 2000b) que detectaron la presencia de la enzima en trucha arcoiris. La amplificación fue realizada en un volumen de 25 \x\ conteniendo 2.5 lal de tampón, 2 vil de la mezcla de dinucleótidosfosfato, 1 pl de CbMg (Promega), 0.125 pl de Taq polimerasa (Promega), 1 pl de ADNc y el resto hasta 25 pl de agua ultrapura estéril, por cada reacción. Como control de la técnica fue utilizado igualmente un juego de cebadores diseñado para la detección de la P-Actina (proteína constitutiva de los tejidos). Debido a que el gen que expresa esta proteína está muy conservado en casi todas las especies, su fórmula es idéntica a las previamente utilizadas (CAMPOS-PÉREZ, 2000b). Los cebadores son el BAC-1 (5'-ATCGTGGGCGCCCCAGGCACC-3') y BAC-2 (5'-CTCCTTAATGT-CACGCACGATTTC-3'). El protocolo en cuanto al número de ciclos, tiempo de acción y temperatura utilizados en cada fase, se describe en la Tabla 7. 82 Material y métodos • El grupo control se inoculó con 100 ]ú de tampón fosfato salino estéril. • Un último grupo (testigo) se inoculó con 100 [ú de tampón fosfato salino estéril. Los peces se mantuvieron durante cuatro semanas para permitir una inmunización activa, tras las cuales fueron inoculados (salvo el grupo testigo), y muestreados de idéntica forma que los peces de la experiencia II. in.4.3.3.- Determinación de la concentración de nitratos y Lcitnilina en cultivos de macrófagos in vitro En este apartado se pretendió establecer la relación existente entre la producción de nitritos y L-citrulina entre macrófagos de peces sin inmunizar y peces inmunizados de diferentes formas, así como de macrófagos no tratados y tratados con factores de activación de los macrófagos (MAF). Para el desarrollo de este apartado fueron utilizadas doradas procedentes del experimento de inmunización (Experiencia III). Para ello, una vez transcurrido el mes de inmunización se tomaron 5 peces de cada uno, es decir, 5 peces control, 5 peces inmunizados con la bacterina más Adyuvante de Freund Incompleto, 5 peces testigos y 5 peces sólo inmunizados con la bacterina. 89 Material y métodos A estos peces les fue extraído el riñon anterior, y de él extrajimos los macrófagos según el protocolo descrito en el apartado 1II.4.2.6. Los macrófagos obtenidos a partir de los peces de la experiencia de inmunización se dividieron en dos grupos: • uno tratado con los MAF (ver III.4.3.5) • otro no tratado. Para realizar dicho tratamiento, los macrófagos se pusieron en contacto con los MAF durante 48 horas siguiendo el mismo protocolo descrito en el punto III.4.3.6. Posteriormente se lavó dos veces con L-15, y finalmente fue añadido a cada pocilio de los macrófagos tratados y no tratados, 100 \i\ de una suspensión de Photobacterium damselae subsp. piscicida (SxlO^ bacterias en 100 [ú de L-15 con 5% de suero fetal bovino). Las placas fueron centrifugadas a 150 g durante 5 minutos a 4°C para provocar un mejor contacto de la monocapa de macrófagos con las bacterias. Posteriormente las placas fueron incubadas a 18°C durante 3 días. La medición de nitritos y L-citrulina fue llevada a cabo según el protocolo descrito en los apartados III. 4.2.4 y III. 4.2.5, respectivamente. El desarrollo de este punto se resume en el Esquema 6. 90 Material y métodos III.4.3.4.- Estudio de la '^explosión respiratoria** En este apartado se pretendió establecer la relación existente entre la producción de radicales superóxido entre macrófagos de peces sin inmunizar e inmunizados de diferentes formas . Para el desarrollo de este apartado se utilizaron doradas del experimento de inmunización. Para ello, una vez transcurrido el mes de inmunización, se tomaron 5 peces de cada grupo, es decir, 5 peces control, 5 peces inmunizados con la bacterina más Adyuvante de Freund Incompleto y 5 peces sólo inmunizados con la bacterina. A estos peces les fue extraído el riñon anterior y de él extrajimos los macrófagos según el protocolo descrito en el apartado III.4.2.6. Los macrófagos de cada grupo, a su vez, se dividieron en dos lotes, uno tratados con factores activadores de los macrófagos (MAF) y otro sin tratar. Posteriormente, esos lotes de macrófagos fueron inoculados con las dosis de bacterias de 2x10^ a 4x10^ bacterias en 100 f^l, para estimular la "explosión respiratoria", y calcular la producción de radicales superóxido en los diferentes grupos. El desarrollo de este punto se resume en el Esquema 7. 91 Material y métodos III.4.3.5.- Producción de los factores activadores de los macrófagos (MAF) Los MAF fueron producidos utilizando el método descrito por GRAHAM y SECOMBES (1988) con la modificación de no incluir antibióticos para evitar interferencias en los ensayos con bacterias posteriores (HARDIE y cois., 1996). Los macrófagos fueron obtenidos según lo descrito en el apartado 111.4.2.6 a partir de riñon anterior de 3 doradas procedentes de un grupo de animales que no se había utilizado hasta el momento para ninguna experiencia previa y en el cual se hicieron las comprobaciones previas pertinentes descritas en el apartado III. 1. Los macrófagos fueron estimulados durante 3 horas con 100 \i\ de una solución compuesta por: 10 |j.g de concavalina A 5 i^g de acetato de forbol myristato 1 mi de agua destilada Transcurrido este tiempo las placas fueron lavadas con medio L-15, y finalmente, a las células se les añadió 100 \i\ de medio L-15 con un 10% de suero fetal bovino para incubarlas a 18°C durante 48 horas. Posteriormente, se recogió el sobrenadante donde se encuentran estos factores "MAF". III.4.3.6.- Determinación de la **explosión respiratoria** Los macrófagos obtenidos a partir de los peces de la experiencia de inmunización se dividieron en dos grupos: 92 Material v métodos • Uno tratado con los MAF • Otro no tratado. Para realizar dicho tratamiento, los macrófagos se pusieron en contacto con 100 ni de MAF durante 48 horas. Posteriormente se lavó dos veces con L-15 y, finalmente se añadió a cada pocilio de los macrófagos tratados y no tratados 100 ^il de diferentes diluciones de Photobacterium damselae subsp. piscicida (2x10^, 2.5x106, 3x106, 3.5x106 y 4x106 bacterias en 100 [ú de L-15 con 5% de suero fetal bovino). Las placas fueron centrifugadas a 4°C durante 5 minutos a 150 g para provocar un mejor contacto de la monocapa de macrófagos con las bacterias. Posteriormente, se incubaron las placas a 18°C durante 3 días. Las placas fueron lavadas cuidadosamente dos veces con solución balanceada de Hank (HBSS) sin rojo fenol. Para estimular la "explosión respiratoria", cada pocilio recibió 100 ^l de una solución de: 2 mg Ferricitocromo C (Sigma-Aldrich S.A.) 1 [ig de acetato forbol miristato (Sigma-Aldrich S.A.) 1 mi de HBSS sin rojo fenol Como control de la técnica se tomaron 5 pocilios de cada grupo y se les añadió superóxido dismutasa (SOD) a una concentración de 300 Ul/ml. Como blanco fueron utilizados pocilios con HBSS sin rojo fenol y SOD. Material y métodos La densidad óptica de cada pocilio fue medida en un espectrofotómetro (Boheringer-Mangein, Spectra shell) a una longitud de onda de 550 nm. Las densidades ópticas obtenidas fueron convertidas en nmol. de O^- según describió PICK (1986), multiplicando por el factor de corrección 15.87. 94 Material v métodos Doradas ( Sparus aurata ) 01 Tampón fosfato salino IL Bacterina Photobacterium damselae subsp. piscicida 94/99 capsulada Control Testigo SIN ADYUVANTE CON ADYUVANTE Inoculamos la cepa capsulada 3x10 ' bacterias/pez al mes de vacunar Obtención de suero 0,6,12,18,24,36,48 horas y 6,13,20,27, y 34 días Determinación de nitritos y L-citrulina Obtención de macrófagos y tejidos Alas 24 horas 0,6,12,18,24,36,48 horas y 6,13,20,27 y 34 días Explosión respiratoria Detección de iNOS por PCR ESQUEMA 6.- Experiencia de inmunización e infección posterior ^^^ 95 Material y métodos Doradas sin inmunizar Doradas inmunizadas CONTROL CON ADYUVANTE DE FREUND SIN ADYUVANTE DE FREUND Extracción de macrófagos al mes de inoculación Tratados con MAF No tratados con MAF Inoculación con Ph. damselae subsp. piscicida Medir la producción de radicales superóxido Medir la producción de NO y L-citrulina ,-vt? "rr'ri •3:*W3i&?e5*i,'?5ntr».» •^iír<'fiv s^.'Sf?* •' ESQUEMA 7.- Estudio de la "explosión respiratoria" y determinación de NO y L-citrulina. 96 Material y métodos III.5.- Tratamiento estadístico Para el análisis de los resultados, se utilizó un modelo de análisis lineal de un solo factor, a fin de determinar, por separado, la variación atribuible a los efectos de la presencia o ausencia de cápsula, tipo de inmunización, utilizando la producción de óxido nítrico como variable: Yí/ = // + Ti + £^ donde Yy es el valor individual del animal, JJ. es la media de la población, Ti es el efecto del factor i-ésimo bajo consideración presencia o ausencia de cápsula, tipo de inmunización sy es el error asociado al registro ij-ésimo. El software utilizado para el tratamiento estadístico de los datos fue el programa SPSS (Versión 8.0). Las diferencias estadísticas se reflejaran como significativas cuando el intervalo de confianza sea p<0.05 y muy significativas cuando sea p<0.01. En las tablas expresamos la existencia de diferencias significativas o muy significativas de un valor con respecto a su correspondiente control mediante la impresión de uno o dos asteriscos sobre el valor, respectivamente. 97 RESULTADOS -í>. •><:;?». JíCC-^-JíC:-A Resultados la supervivencia fue mucho más marcada con todos los donadores añadidos a los pocilios de las cepas no capsuladas. Comparando el nivel de significación obtenido entre cepas capsuladas y no capsuladas, las diferencias fueron significativas (p<0.05) a las Oyó horas entre todos los casos, excepto para el tiempo de 6 horas de SNAP solo, y muy significativas (p<0.01) para el resto de mediciones en los tres casos. Cuando se comparan los resultados obtenidos con los controles, se observó que en el caso de las cepas capsuladas, hasta las 6 y 9 horas no hubo diferencias significativas, y sólo entre 12 y 24 estas diferencias fueron significativas (p<0.05) para el SNAP. Para el SNAP+X/Xo y el SNAP+G/Go las diferencias fueron significativas (p<0.05) a las 6 y 9 horas, y muy significativas (p<0.01) de 12 a 24 horas (Tabla 13). Si comparamos los diferentes resultados obtenidos hasta las 6 horas con los controles en el caso de las cepas no capsuladas, no encontramos diferencias significativas (p<0.05). Desde las 9 a las 18 horas fueron significativas (p<0.05), y a las 24 horas fueron muy significativas (p<0.01) para el SNAP. Para el SNAP+X/Xo las diferencias fueron significativas (p<0.05) a las 6 horas y muy significativas (p<0.01) hasta el final. Para el SNAP+G/Go las diferencias fueron significativas (p<0.05) a las 6 y 9, y muy significativas (p<0.01) de 12 a 24 (Tabla 14). 105 Resultados Al comparar las curvas de supervivencia obtenidas que refleja cada producto entre sí, y a ellos mismos con los controles, tanto para el óxido nítrico como para los peroxinitritos fueron similares a las que obtuvimos en la experiencia anterior en la que usamos SNAP y SlN-1 como donadores de ON y ONOOre spectivamente. IV.3.- EXPERIENCIA II IV.3.1.- Experiencia preliminar Las doradas de 150-300 gr y las de 400-600 gr infectadas no mostraron variaciones significativas con relación a sus respectivos controles, no observándose en ninguno de los dos casos más de 0.5 Vimoles de óxido nítrico (Figura 10 y Tabla 15) ni de L-citrulina (Figura 11 y Tabla 16). En el caso del grupo de peces de 35-70 gr se observó un aumento progresivo del óxido nítrico con un pico a las 24 horas, donde se midió una media de 16.69 pmoles para luego comenzar a descender (Figura 10 y Tabla 15). La L-citrulina mantuvo un comportamiento similar al de los nitritos con un valor máximo a las 24 horas de 16 jimoles (Figura 11 y Tabla 16). Estas diferencias fueron significativas (p<0.05) para ambos valores a las 6 horas postinoculación y muy significativas (p<0.01) para el resto de las mediciones con respecto a sus controles (Tablas 15 y 16). 106 Resultados A partir de agallas, hígado, bazo, intestino, riñon, macrófagos, y sistema nervioso, extraídos a los peces de las diferentes tallas mencionadas, se hizo la técnica de PCR y en ninguno de los grupos de peces inoculados se detectó la banda de 791 pares de bases que nuestros cebadores debían amplificar. El control positivo de la técnica detectó la banda de P-actina (541 pares de bases) en todos los tejidos de los peces (Figura 12), a su vez, el control negativo también dio el resultado esperado. IV.3.2.- Respuesta de la dorada frente a la infección experimental con Photobacteríum damselae subsp. piscicida. IV.3.2.1.- Determinación de nitritos en el suero sanguíneo Los resultados obtenidos en esta experiencia se describen en las Figuras de la 13 a la 15, en las cuales no aparecen todos los valores de los tiempos muestreados, pues a partir de las 480 horas (20 días) los resultados obtenidos fueron similares a los del día 20 postinfección. Sin embargo, en las Tablas, sí se muestran todos los valores obtenidos hasta el final de la experiencia. Los peces inoculados, tanto con las cepas acapsuladas como con las capsuladas, mostraron un incremento en la concentración de nitritos en el suero sanguíneo a partir de las 6 horas postinoculación alcanzándose valores de 3 y 4.97 ^moles, respectivamente, niveles que siguieron aumentando hasta las 24 horas donde se registraron picos de óxido nítrico en torno a los 26 Inmoles para los peces inoculados con las cepas capsuladas, y 107 Resultados entre 15.88 y 17.16 |imoles para los inoculados con las cepas acapsuladas (Figura 13, Tablas 17 y 18). A partir de las 24 horas comenzó un descenso en las concentraciones séricas de nitritos, los cuales alcanzaron sus valores mínimos alrededor de las 480 horas (20 días) postinfección, para mantenerse en niveles en torno a 1 larnol para los inoculados con las cepas capsuladas y de 0.33 jimoles para los inoculados con las cepas acapsuladas hasta el final de la experiencia (Figura 13 y Tablas 17 y 18). Por otro lado, puede apreciarse en la Figura 13 que con las dos cepas utilizadas en esta experiencia se han obtenido unos valores y una cinética muy similar. Los resultados obtenidos con los peces infectados con la bacteria capsulada y los inoculados con la cepa acapsulada mostraron diferencias significativas (p<0.05) a las 6 y 12 horas postinoculación, para pasar estas diferencias a ser muy significativas (p<0.01) a las 24 y 48 horas, volviéndose significativas (p<0.05) a las 72 y 144 horas. En el resto de los tiempos observados no se encontraron diferencias significativas. Los peces controles inoculados con PBS estéril mostraron niveles básales de nitritos durante todas las mediciones realizadas que como promedio estuvieron en torno a los 0.15 jamóles (Figura 13, Tablas 17 y 18). 108 Resultados Al comparar las concentraciones de nitritos de los peces controles y los inoculados con las cepas capsuladas, encontramos diferencias muy significativas (p<0.01) desde las 6 horas hasta las 144 horas (6 días), mientras a las 312 horas existían sólo diferencias significativas (p<0.05). En el resto de observaciones las diferencias no fueron significativas (Tablas 17 y 18). Cuando comparamos los valores de las concentraciones de nitritos de los animales inoculados con las cepas no capsuladas frente a las de los controles, también hemos encontrado diferencias muy significativas (p<0.01), pero en este caso desde las 12 horas hasta las 72 horas, mientras a las 6 y 144 horas las diferencias fueron solamente significativas (p<0.05). En el resto de las observaciones los resultados no mostraron significación estadística (Tablas 17 y 18). Antes de la infección experimental, el grupo de peces tratados con el inhibidor de la producción de óxido nítrico -LNAME-, mostró niveles de nitritos básales, los cuales se elevaron a las 6 horas de la inoculación en torno a 1 |imol para la infección con la cepa capsulada y de 0.7 pmoles para la infección con la cepa acapsulada, para mantenerse posteriormente durante toda la experiencia en estos niveles (Figura 14, Tabla 19). A pesar de que cada grupo mantuvo durante la experiencia distintos valores en las concentraciones de nitritos en el suero, en 109 Resultados ninguno de los casos, cuando comparamos los resultados de las cepas capsuladas con las acapsuladas, ni entre estas y sus controles, se observaron diferencias significativas (p< 0.05). Al comparar las concentraciones de nitritos en el suero sanguíneo de los peces tratados y no tratados con L-NAME, las diferencias obtenidas fueron las mismas en el caso de las cepas capsuladas y acapsuladas. Existiendo diferencias muy significativas (p<0.01) desde las 6 horas hasta las 144 horas (6 días), mientras que a las 312 horas mostraron diferencias sólo significativas (p<0.05), en el resto de las observaciones las diferencias no tuvieron significación estadística. IV.3.2.2.- Determinación de L-citrulina en el suero sanguíneo Este producto se detectó durante el desarrollo de esta experiencia en ambos grupos de peces infectados, tanto en los peces infectados con cepas acapsuladas, como en los infectados con cepas capsuladas, ofreciendo una cinética de producción similar a la estudiada con los nitritos en el punto anterior, aumentando paulatinamente hasta las 24 horas, donde se observaron valores cercanos a 26 pmoles de media para los peces infectados con cepas capsuladas, y de 16 jimoles de media para los peces infectados con cepas acapsuladas (Figura 15, Tablas 20 y 21). También en este caso los valores obtenidos con las dos cepas probadas fueron muy similares (Figura 15, Tablas 20 y 21). no Resultados Las diferencias obtenidas en las concentraciones de Lcitrulina en el suero sanguíneo entre los peces infectados con bacteria capsulada y los inoculados con la cepa acapsulada fueron significativas (p<0.05) a las 6 y 12 horas postinoculación, pasando posteriormente estas diferencias a ser muy significativas (p<0.01) a las 24 y 48 horas, volviéndose significativas (p<0.05) a las 72 y 144 horas. En el resto de las mediciones realizadas no se encontraron diferencias significativas. Durante todas las mediciones realizadas, los peces controles presentaron niveles básales de este producto, en torno a 0.15 ]amoles de media con las dos cepas utilizadas. Al comparar las concentraciones de L-citrulina en el suero sanguíneo de los peces del grupo control y los inoculados con las cepas capsuladas, se encontraron diferencias muy significativas (p<0.01) desde las 6 horas hasta las 144 horas (6 días), las cuales se volvieron sólo significativas (p<0.05) a las 312 horas (13 días). En el resto de observaciones las diferencias no fueron significativas (Tablas 20 y 21). Cuando se comparó las concentraciones de L-citrulina para los peces inoculados con las cepas no capsuladas frente a los del grupo control, encontramos diferencias muy significativas (p<0.01) desde las 12 horas hasta las 72 horas (3 días), mientras que entre las 6 y 312 horas estas diferencias sólo fueron significativas 111 Resultados (p<0.05). En el resto de las observaciones medidas no encontramos significación estadística (Tablas 20 y 21). El suero analizado de los peces tratados con L-NAME mostró también el mismo patrón de comportamiento que el obtenido en las mediciones de nitritos, siendo los valores obtenidos en torno a 1 pmol para la infección con la cepa capsulada y de 0.7 ]amoles para los de la infección con la cepa acapsulada (Figura 16, Tabla 22). Cuando comparamos los resultados de las cepas capsuladas con las acapsuladas, ni entre estas y sus correspondientes controles, no detectamos en ningún momento de la experiencia, diferencias significativas (p< 0.05). Sin embargo, al comparar las medidas de las concentraciones de L-citrulina en el suero sanguíneo de los peces tratados y no tratados con L-NAME, las diferencias obtenidas fueron las mismas para el caso de las cepas capsuladas y acapsuladas, encontrando diferencias muy significativas (p<0.01) desde las 6 horas hasta las 144 horas (6 días), que se volvieron sólo significativas (p<0.05) a las 312 horas. En el resto de las observaciones realizadas las diferencias no fueron significativas. 112 Resultados IV.3.2.3.- Detección de la óxido nítrico sintasa inducible En ninguno de los tejidos analizados (agallas, riñon, hígado y sistema nervioso) se encontró la banda de 791 pares de bases que nuestros cebadores debían amplificar (Figura 17). El control positivo de la técnica obtuvo el resultado esperado, observándose la banda de 541 pares de bases de la p-actina. El control negativo también mostró el resultado esperado (Figura 17). IV.4.- EXPERIENCIA III IV. 4.1.- Respuesta inmune de la dorada tras la vacunación con bacterina de Photobtzcterium damselae subsp. piscicida. Comparación de los resultados con los peces infectados experimentalmente. IV.4.1.1.- Determinación de nitritos en el suero sanguíneo Los peces vacunados con la bacterina sin ad5ruvante mostraron un aumento en dicha concentración con un pico máximo a las 24 horas postinfección, mostrando un valor medio de 26.5 limóles de nitritos para posteriormente ir descendiendo de una forma lenta hasta alcanzar un valor medio de 2.6 pmoles a las 816 horas (34 días), a partir del cual se mantuvo constante hasta el final de la experiencia (Figura 18, Tabla 23). 113 Resultados Los peces vacunados con la bacterina, junto con Adyuvante de Freund Incompleto, también mostraron un incremento de la concentración de nitritos con un pico máximo a las 24 horas y un valor medio de 34.5 inmoles, para posteriormente descender de una forma lenta hasta alcanzar un valor medio de 3.7 pmoles a las 816 horas (34 días) postinfecciónción, a partir del cual se mantuvo constante (Figura 18, Tabla 23). Los peces controles infectados mostraron un comportamiento similar a los de la inoculación experimental de la Experiencia II, incrementando la concentración de nitritos a partir de la inoculación, y mostrando igualmente, el valor máximo a las 24 horas con una concentración media de 23.5 pnioles, y un descenso posterior más acusado, llegando a valores de 1.02 vimoles a las 312 horas (13 días) los cuales se estabilizaron hasta el final de la experiencia (Figura 18, Tabla 23). Los peces testigos se mantuvieron durante toda la experiencia en niveles básales de la concentración de nitritos, siendo similares a los obtenidos con los controles de la Experiencia II. Las diferencias obtenidas entre los peces inmunizados con adyuvante y los inmunizados sin adyuvante, no mostraron diferencias significativas a las 6 horas postinoculación, para pasar a ser significativas (p<0.05) a las 12 horas, volviéndose muy 114 Resultados básales de la concentración de nitritos, siendo estos similares a los obtenidos con los controles de la Experiencia II y III. Las diferencias obtenidas en las concentraciones de nitritos entre los macrófagos aislados de peces inmunizados con ad5aivante y de los inmunizados sin adyuvante, tratados con MAF, mostraron durante toda la experiencia diferencias muy significativas (p<0.01). De igual forma sucedió cuando comparamos los datos de los macrófagos aislados de peces inmunizados con adyuvante frente a los controles. No obstante, cuando se comparó el grupo de macrófagos obtenido de peces inmunizados sin adyuvante con los controles, no hubo diferencias significativas (p<0.05) hasta los valores obtenidos a las 9 horas. Las diferencias fueron significativas a las 12 horas, y muy significativas (p<0.01) a partir de las 18 horas hasta el final de la experiencia. Las diferencias encontradas entre los peces testigo (no vacunados ni infectados) frente a los tres grupos experimentales en el caso de los macrófagos tratados fueron muy significativas (p<0.01) durante todas las mediciones realizadas para los macrófagos de peces inmunizados con adyuvante, para los de los peces inmunizados sin adyuvante las diferencias fueron muy significativas (p<0.01) desde las 12 horas hasta el final de la experiencia, y significativas a las 9 horas, mientras que a las 6 horas no existieron diferencias significativas (p<0.05) (Tabla 25). 121 Resultados En cuanto al grupo de macrófagos que no fueron tratados con MAF, las diferencias obtenidas en las concentraciones de nitritos entre los macrófagos aislados de peces inmunizados con adyuvante y de los inmunizados sin adyuvante, de la misma forma que en el caso anterior, mostraron diferencias muy significativas (p<0.01) durante toda la experiencia. Lo mismo sucedió al comparar los datos de los macrófagos aislados de peces inmunizados con adyuvante frente a los controles. También de una manera casi similar cuando comparamos el grupo de macrófagos obtenido de peces inmunizados sin adyuvante con el control, no hubo diferencias significativas (p<0.05) hasta las 9 horas, las diferencias fueron significativas a las 12 horas, y muy significativas (p<0.01) a partir de las 18, 24 y 48 horas, para acabar siendo de nuevo significativas (p<0.05) a las 72 horas. Las diferencias encontradas entre los peces testigo (no vacunados ni infectados) frente a los tres grupos experimentales en el caso de los macrófagos no tratados, fueron para el grupo de los peces inmunizados sin adyuvante, no significativas (p<0.05) a las 6 horas, para pasar a ser muy significativas (p<0.01) desde las 9 horas hasta el final de la experiencia. Para los macrófagos de peces inmunizados con adyuvante las diferencias fueron muy significativas (p<0.01) durante todas las mediciones realizadas (Tabla 26). 122 Resultados Al comparar las concentraciones de nitritos de los grupos tratados con MAF frente a los no tratados, no encontramos diferencias significativas (p<0.05) entre los macrófagos de los peces inmunizados sin adjnavante, ni entre los controles. Las únicas diferencias se produjeron, únicamente en los peces inmunizados con adyuvante, a las 24 y 48 horas, a un nivel significativo (p<0.05). IV.4.2.2.- Determinación de L-citnilina Al igual que sucedió en los peces infectados experimentalmente en las Experiencias II y III, la producción de Lcitrulina siguió una cinética similar a las concentraciones obtenidas en el suero sanguíneo de los peces de esas experiencias, aumentando la concentración de la misma a partir de la inoculación de los pocilios, obteniendo el pico de producción a las 24 horas y disminuyendo a partir de ese momento. Hay que señalar que la curva fue prácticamente una copia de la que hemos descrito en el punto anterior para las concentraciones de nitritos producida por los macrófagos. De esta manera, para el grupo de los macrófagos tratados con MAF, se observó que los niveles de L-citrulina comenzaron a elevarse a las pocas horas de inocular los pocilios, mostrando ya a las 6 horas niveles de 2.8 emoles para los macrófagos de peces inmunizados con adyuvante y de 0.44 y 0.1 pmoles para los 123 Resultados macrófagos de peces inmunizados sin adyuvante y los controles, respectivamente. La curva continuó ascendiendo también en este caso, hasta alcanzar su valor máximo a las 24 horas, siendo los valores encontrados de 12.53 Rimóles para los macrófagos de peces inmunizados con adyuvante y de 4.74 y 1.72 pmoles para los macrófagos de peces inmunizados sin ad3aivante y los controles, respectivamente (Figura 21, Tabla 27). Posteriormente, las concentraciones de L-citrulina disminuyeron para alcanzar al final de la experiencia (72 horas) valores cercanos a los 7.17 Rimóles para los macrófagos de peces inmunizados con adyuvante, y de 2.66 y 0.64 emoles para los macrófagos de peces inmunizados sin adyuvante y los controles, respectivamente (Figura 21, Tabla 27). Para el grupo de macrófagos no tratados con MAF la producción de L-citrulina fue prácticamente idéntica a la obtenida en el punto anterior con los nitritos. A las 6 horas se detectaron niveles de 1.60 [amóles para los macrófagos de peces inmunizados con adyuvante, y de 0.40 y 0.05 Rimóles para los macrófagos de peces inmunizados sin adyuvante y los controles, respectivamente (Figura 21, Tabla 28). La curva siguió mostrando una pendiente positiva hasta alcanzar el valor máximo a las 24 horas, midiendo entonces 11.06 |j.moles para los macrófagos de los peces inmunizados con adyuvante y de 3.41 y 1.10 jamóles para los macrófagos de los peces inmunizados sin adyuvante y los controles, respectivamente. Entonces dichas concentraciones comenzaron a disminuir hasta situarse al final de la experiencia 124 Resultados (72 horas) en valores de 7.33 emoles para los macrófagos de peces inmunizados con adyuvante, y de 2.26 y 0.32 pmoles para los macrófagos de peces inmunizados sin adyuvante y los controles, respectivamente (Figura 21, Tabla 28). El nivel de significación estadística obtenido para la Lcitrulina con los macrófagos tratados con MAF, y en lo referente a la comparación de los peces inmunizados con ad5aavante, sin adyuvante, y los primeros con los testigos, fue exactamente el mismo que el que obtuvimos con la medición de los nitritos en el punto anterior. Al comparar el grupo de macrófagos obtenido de peces inmunizados sin adyuvante con el control, no hubo diferencias significativas (p<0.05) hasta las 12 horas, a las 18, 48 y 72 horas las diferencias fueron significativas, y muy significativas (p<0.01) a las 24 horas. Para el grupo de macrófagos no tratados con MAF, las diferencias obtenidas en las concentraciones de L-citrulina entre los macrófagos aislados de peces inmunizados con adjmvante y de los inmunizados sin adyuvante, al igual que al comparar las determinaciones de los peces inmunizados con ad3mvante frente a sus testigos, se detectaron diferencias muy significativas (p<0.01) durante toda la experiencia, exactamente igual que sucedió con la determinación de nitritos en el punto anterior. Cuando comparamos el grupo de macrófagos obtenido de peces inmunizados sin adyuvante con el control, encontramos que no 125 Resultados había diferencias significativas (p<0.05) hasta las 12 horas, e igualmente en el resto de las determinaciones. Al comparar los grupos tratados con MAF frente a los no tratados con relación a las concentraciones obtenidas de Lcitrulina, los resultados fueron exactamente los mismos que en la valoración de los nitritos, salvo al comparar los datos de los peces inmunizados con adyuvante, donde observamos la ausencia de diferencias significativas (p<0.05) en todas las mediciones de la experiencia salvo a las 24 horas, donde las diferencias fueron significativas (p<0.05) (Tablas 27 y 28). IV.4.3.- Estudio de la ''explosión respiratoria" Como se aprecia en la Figura 22, Tablas 29, 30 y 31, los macrófagos procedentes de los peces inmunizados con adyuvante mostraron con todas las concentraciones de bacterias utilizadas en la experiencia, una producción de radicales superóxido superiores en todo momento (desde 7.07 hasta 3.30 nmoles) que los procedentes de peces que fueron inmunizados sin ad5aivante (desde 3.23 hasta 0.97 nmoles) y que los controles (desde 1.55 hasta 0.13 nmoles) para los grupos de macrófagos que fueron tratados con MAF. Sin embargo, como puede apreciarse en la Figura 22, los macrófagos no tratados previamente con MAF reaccionaron de una forma similar, dibujando una curva muy próxima al grupo tratado con MAF. 126 Resultados Se observó un fuerte aumento en la concentración de radicales superóxido obtenidos en los peces inmunizados, siendo los valores obtenidos en el caso de los peces inmunizados con adjoivante siempre superiores, desde 4 a 12 veces, con relación a los controles y, de 2 a 7 veces con respecto a los peces inmunizados sin adyuvante (Figura 22, Tablas 29, 30 y 31). Tanto en los peces inmunizados con y sin Adyuvante Incompleto de Freund, no existieron diferencias significativas estadísticamente entre los grupos tratados con MAF y los no tratados, aunque sí una leve tendencia a tener una mayor respuesta en el caso de los tratados con MAF (Figura 22, Tablas 29, 30 y 31). El estudio de la "explosión respiratoria" de los macrófagos de dorada expuestos a la acción de Photobacterium damselae subsp. piscicida reveló la existencia de diferencias muy significativas (p<0.01) entre los controles y los macrófagos de peces inmunizados con adyuvante en todas las concentraciones de bacterias probadas, y diferencias significativas (p<0.05) cuando comparamos los controles con los macrófagos de peces inmunizados sin adyuvante, así como al comparar los resultados de los macrófagos de peces inmunizados con adyuvante con los de los macrófagos de peces inmunizados sin adyuvante. 127 TABLAS y FI&URAS '^ Vyr^"?^ Víí" "^-?s \fr -^ '^~^- '^ Tablas y Figuras Figura 4.- Recuadro A; Photobacterium damselae subsp. pisciáda: nótese la ausencia de cápsula (cultivada en Agar Sangre con un 1% de NaCl). Recuadro B; Photobacterium damselae subsp. piscicida: se aprecia el desarrollo de la cápsula rodeando a la bacteria (cultivada en BHIA con un 1% de NaCl y un 1% de glucosa). (X46000). 129 Tablas y Figuras iin^ 1 lU 100co ü ^„ = 90- <¡> > 1 80a. 3 2 70- •O S5 601 C - C: CONTROL 10 30 100 300 SNAP(^M) NO CAPSUUDA 1000 — CAPSULADA Figura 5.- Efecto del óxido nítrico en la supervivencia de Photobacteríum damselae subespecie piscicida Tabla 8.- Efecto del óxido nítrico en la supervivencia de Photobacterium damselae subespecie piscicida. Cepa/ SNAP ([xmoles) Capsulada No capsulada % DE SUPERVIVENCIA 10 96,23 92,70* 30 94,46* 79,55** 100 92,06* 72,06** 300 90,1* 68,91" 1000 85,74** 62,00" Control 100 100 130