Análisis y distribución de disruptores endocrinos en lodos de depuradora y en el sistema suelo-planta

UNIVERSIDAD DE SEVILLA ESCUELA POLITÉCNICA SUPERIOR DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA ANÁLISIS Y DISTRIBUCIÓN DE DISRUPTORES ENDOCRINOS EN LODOS DE DEPURADORA Y EN EL SISTEMA SUELO-PLANTA TESIS DOCTORAL CONCEPCIÓN ABRIL GONZÁLEZ SEVILLA, 2021 ANÁLISIS Y DISTRIBUCIÓN DE DISRUPTORES ENDOCRINOS EN LODOS DE DEPURADORA Y EN EL SISTEMA SUELO-PLANTA El Director El Director Fdo.: Dña. Irene Aparicio Gómez Profesora Titular de Universidad Departamento de Química Analítica Universidad de Sevilla Fdo.: D. Juan Luis Santos Morcillo Profesor Titular de Universidad Departamento de Química Analítica Universidad de Sevilla Trabajo presentado para aspirar al grado de Doctora Fdo.: Concepción Abril González Graduada en Química Universidad de Sevilla Escuela Politécnica Superior Departamento de Química Analítica C/ Virgen de África, 7 41011 Sevilla (España) Dra. Irene Aparicio Gómez, Profesora Titular de Universidad del Departamento de Química Analítica de la Escuela Politécnica Superior, de la Universidad de Sevilla, y Dr. Juan Luis Santos Morcillo, Profesor Titular de Universidad del Departamento de Química Analítica de la Escuela Politécnica Superior, de la Universidad de Sevilla, INFORMAN: Que Dña. Concepción Abril González, graduada en Química en la Universidad de Sevilla, ha realizado en el Departamento de Química Analítica de la Escuela Politécnica Superior de la Universidad de Sevilla, bajo nuestra dirección, el trabajo de investigación Análisis y distribución de disruptores endocrinos en lodos de depuradora y en el sistema sueloplanta, que reúne las condiciones necesarias para ser presentada para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. Fdo.: Dra. Irene Aparicio Gómez Fdo.: Dr. Juan Luis Santos Morcillo AGRADECIMIENTOS En mi vida podría haberme imaginado como se desarrollaría mi Tesis… sufrimientos (muchísimos), llantos, alegrías (elevadas a la máxima potencia), gente maravillosa, compañeros estupendos, gente que viene y va, los jefes, tantísimas muestras, proyectos, fechas de entrega, problemas, complicaciones, estrés, ansiedad, y un largo etcétera de cosas buenas y no tan ueas… Esa itauilidad de llega a la esuela e i suiedo las esaleas pesado e el asas  dei… po favo ue o se haa ido la luz, po favo…. Esa agustia o los atíulos, los rechazos, las revisiones mayores, etc. pero gracias a Dios, todo pasa, y qué alegría poder dei… ¡Po fi, ahoa sí, teié! Ahora es cuando lo ves, una vez que terminas, esa sensación de alivio, de a está, de lo hie, po fi. Es por ello que quiero agradecer, en primer lugar, a mis Directores de Tesis, Dra. Irene Aparicio y Dr. Juan Luis Santos, a quienes no he parado de acribillar con múltiples dudas, correcciones, atíulos… ¡ué sufiieto es pulia peo ue satisfatoio uado lo ves aeptado! Irene, esa perfección, siempre el detalle, precisa, pendiente de cada coma, tan profesional, iuiosa, ese… se piesa ejo o papel  lápiz, Gaias Dietoa¡ Juan Luis, con el que tan buenos ratos hemos pasado tanto en el laboratorio, como fuera o de congresos, a uié heos atoetado o pegutas, o dudas, o poleas… itetaé atee esos patitos ie alieados… Gaias Dieto¡ En segundo lugar, y no menos importante, agradecer al Director del grupo de investigación, Dr. Esteban Alonso, siempre dije que me recordabas mucho a mi padre, tu forma de pensar, de gestionar, de llevar el grupo como lo haces, el soluioado de poleas, ees de esas personas necesarias e imprescindibles para que un grupo (un departamento, un equipo, una failia…) fuione como debiera ser y, aunque no eres ninguno de mis Directores, siempre formaste parte. Gracias ¡ Al Ministerio de Economía y Competitividad, por la financiación recibida a través de los proyectos de referencia CGL2013-44402-R y CTM2017-82778-R que han permitido el desarrollo de esta Tesis Doctoral. A Julia, como mi madre del grupo casi, siempre para todo, esa vitalidad la trasmite allí donde va, es contagiosa, adora lo que hace y eso se nota de lejos, Mil Gracias Flor¡, por los ánimos, por estar siempre, por ayudarme siempre que lo he necesitado, Gracias por todo¡ Nunca dejaré de acordarme de ese día en el laboratorio de instrumental, yo abriendo el congelador con 400 muestras (en mi cabeza bien cuadrado a cuantas me tocaban por día para quitármelo lo antes posible y poder continuar con mi tesis) Juan Luis y Julia mirándome durante un segundo, los dos sin pestañear  pegutae… ¿todo ie Kit?  o aseti o la aeza  soiete y, de epete… poee a lloa oo ua agdalea del agoio ue teía, o las muestras y con la tesis, < si, Jefe, los patitos…> (después todo quedó solucionado). A mi compi de laboratorio, José Luís, con quien al final acabé pasando más horas que con mi madre... ¡en qué buen momento entraste!, siempre apoyándonos, los sufrimientos, cosa de dos, las alegrías, de dos, los problemas, cosa de dos también. Muchísimas gracias por haber estado, has sido fudaetal opañeo de atallas. A Javi, el mejor técnico de laboratorio del mundo mundial, qué bien nos viene tu alegría, tus cánticos, tu cara sonriente, tus rezos, esa disposición para cualquier cosa, gracias, Javi, tampoco hubiese sido lo mismo sin ti. Y no menos importante los compañeros que han pasado por el laboratorio, Cristina, Mariate, Alexandra, Eli, Fran y en especial a Pepe y a Pablo, con quienes compartí más tiempo y de los que guardo tan buenos recuerdos, gracias a todos. Y ahora el turno de mi familia, Auelita, auue a o estés… te oiste asi ás de edia tesis, o ha día ue o e auede de ti, de cuando salía de la escuela e iba directa a verte, día tras día, apenas fallaba. A i failia, al fial sufe los daños olateales, i heaa Saa, ue, auue el deate de uié es ao de las dos aú siga eistiedo… gaias po esta  apoae siepe  aposta por mi desde el primer momento. A Cris, he de decirte que esto si ha sido ua guea…  ¡he ganado la batalla! A Mamá y Papá, por haber hecho posible que haya podido hacer la tesis, por esos días de llantos, de angustia, de ver que se me caía todo encima y no ver el final, porque ha habido de esos, de pensar qué estaba haciendo con mi vida, si no estaba aprovechando el tiempo o si lo podría haber hecho mejor. A Pablo, quién también se ha tragado lo suyo, y ha hecho posible que tuviera más de un respiro, aguantando hasta el último momento. Más de uno me hubiera mandado a paseo desde hae tiepo… Gaias¡ A todos, muchas gracias. DzAmar y sufrir es a la larga, la única forma de vivir con plenitud y dignidaddz GREGORIO MARAÑÓN Abreviaturas Abreviaturas 19 ABREVIATURAS A Ace Acetona Acetone ACN Acetonitrilo Acetonitrile AcOEt Acetato de etilo Ethyl acetate APs Alquilfenoles Alkylphenols AS-C12 Dodecilsulfato sódico Sodium dodecylsulfate AS-C14 Tetradecilsufato sódico Sodium tetradecylsulfate AS-C16 Hexadecilsulfato sódico Sodium hexadecylsulfate AS-C18 Octadecilsulfato sódico Sodium octadecylsulfate ASCs Compuestos alquilsulfatos Alkylsulfate compounds B BPA Bisfenol A Bisphenol A BPs Benzofenonas Benzophenones BP-1 Benzofenona-1 Benzophenone-1 BP-2 Benzofenona-2 Benzophenone-2 BP-3 Benzofenona-3 Benzophenone-3 BP-6 Benzofenona-6 Benzophenone-6 BP-8 Benzofenona-8 Benzophenone-8 4-BP-OH 4-Hidroxibenzofenona 4-Hidroxybenzophenone D DCM Diclorometano Dichloromethane DLLME Microextracción líquido-líquido dispersiva Dispersive liquid-liquid microextraction d-SPE Extracción en fase sólida dispersiva Dispersive solid phase extraction E EC50 Concentración de efectos crónicos 50% Effective cronic concentration 50% EDCs Compuestos disruptores endocrinos Endocrine disrupting compounds ESI Ionización por electrospray Electrospray ionization F FUSLE Extracción con ultrasonidos focalizados Focused ultrasound solidliquid extraction G GC Cromatografía de gases Gas chromatography H HAc Ácido acético Acetic acid L LC Cromatografía líquida Liquid chromatography LC50 Concentración letal media Lethal concentration 50% LLE Extracción líquido-líquido Liquid-liquid extraction LOD Límite de detección Limit of detection LOQ Límite de cuantificación Limit of quantification Abreviaturas 20 M MAE Extracción asistida por microondas Microwave assisted extraction MS/MS Espectrometría de masas en tándem Tandem mass spectrometry MeOH Metanol Methanol MISPE Extracción en fase sólida empleando polímeros impresos molecularmente Moleculary imprinted solidphase extraction MRM Monitorización de reacciones múltiples Multiple reaction monitoring MSPD Dispersión de la matriz en fase sólida Matrix solid-phase dispersion MSPE Extracción en fase sólida magnética Magnetic solid-phase extraction N NPs Nonilfenoles Nonylphenols P PBs Parabenos Parabens PPCPs Fármacos y productos para el cuidado personal Pharmaceutical and personal care products PFBuA Ácido perfluorobutanoico Perfluorobutanoic acid PFCs Compuestos perfluorados Perfluorinated compounds PFHpA Ácido perfluoroheptanoico Perfluoroheptanoic acid PFHxA Ácido perfluorohexanoico Perfluorohexanoic acid PFOA Ácido perfluorooctanoico Perfluorooctanoic acid PFOS Ácido perflurooctanosulfónico Perfluorooctanesulfonic acid PFPeA Ácido perfluoropentanoico Perfluoropentanoic acid PhACs Principios activos farmacológicos Pharmaceutically active compounds PLE Extracción con líquidos presurizados Pressurized liquid extraction PSA Amina primaria y secundaria Primary and secondary amine Q QqQ Analizador de triple cuadrupolo Triple quadrupole QuEChERS Rápida, fácil, barata, efectiva, robusta y segura Quick, easy, cheap, effective, rugged and safe S SALLE Extracción líquido-líquido asistida por sales Salt-assisted liquid-liquid extraction SAs Sulfonamidas Sulfonamides SMCs Almizcles sintéticos Synthetic musk compounds SPE Extracción en fase sólida Solid phase extraction SPME Microextracción en fase sólida Solid phase microextraction T TFC Cromatografía líquida con flujo turbulento Turbulent flow chromatography U UAE Extracción asistida por ultrasonidos Ultrasound assisted extraction Capítulo I Antecedentes En este primer capítulo se analiza, en base a la literatura científica publicada hasta la fecha, la problemática ambiental y sanitaria suscitada por los contaminantes orgánicos en general y por los disruptores endocrinos en particular. Se analiza la presencia de los disruptores endocrinos en los suelos, sus principales vías de contaminación y su posible incorporación a los cultivos. Por último, se realiza un recorrido por las metodologías analíticas descritas para su determinación en lodos de depuradora, suelos agrícolas y vegetales de consumo humano. Capítulo I 23 1. CONTAMINANTES EMERGENTES EN EL MEDIOAMBIENTE Durante décadas, la preocupación por la presencia de sustancias contaminantes en el medioambiente se ha centrado casi exclusivamente en los contaminantes orgánicos persistentes, entre los que se encuentran los contaminantes prioritarios recogidos en el Anexo X de la Directiva Marco del Agua (Directiva 2000/60/CE) y en sus posteriores modificaciones (Directiva 2008/105/CE y Directiva 2013/39/CE) (CE, 2013), y en algunos contaminantes considerados emergentes. Los contaminantes emergentes han sido definidos como aquellos contaminantes previamente desconocidos o no reconocidos como tales cuya presencia en el medio ambiente no es necesariamente nueva pero si la peoupaió po las posiles oseueias de la isa (Petoić et al., . Entre estos se encuentran metales pesados, hidrocarburos aromáticos policíclicos, bifenilos policlorados, pesticidas y principios activos farmacológicos. Sin embargo, los nuevos productos y hábitos de consumo han dado lugar a la presencia en el medioambiente de otras sustancias de las que hasta hace tan solo unos años se desconocía su presencia. Entre estos contaminantes emergentes se encuentran compuestos orgánicos perfluorados, retardantes de llama bromados u organofosforados, parabenos, filtros-UV y otros aditivos empleados en productos de cuidado personal, plastificantes como ftalatos o bisfenoles y surfactantes, entre otros. Estos compuestos, no regulados y de los que se desconoce su impacto en el medioambiente, pueden tener origen industrial, doméstico, agrícola o ganadero. Debido a la continua descarga al medioambiente de estos compuestos, consecuencia de su elevada producción y consumo, no necesitan ser persistentes para ocasionar efectos adversos. Por ello, su estudio se encuentra entre las líneas de investigación prioritarias de los principales organismos dedicados a la protección de la salud pública y medioambiental, tales como la Organización Mundial de la Salud (OMS), la Agencia para la Protección Ambiental de Estados Unidos (USEPA) o la Comisión Europea (CE) (Martín- Pozo et al., 2019; OMS, 2002; Gorito et al., 2017). La principal vía de descarga de estos contaminantes al medioambiente son los vertidos de aguas residuales tratadas procedentes de estaciones depuradoras de aguas residuales (EDARs), a las que han llegado través de los sistemas de alcantarillado. En las Antecedentes 24 EDARs, las aguas residuales son tratadas mediante procesos físicos y biológicos. En esos tratamientos, los contaminantes son parcialmente eliminados mediante procesos de biodegradación o retención en los lodos generados en el proceso de depuración. Estos lodos son habitualmente tratados mediante procesos de estabilización y deshidratación (González et al., 2010; Martín et al., 2012). Tras este tratamiento, estos lodos pueden ser empleados como fertilizantes en suelos agrícolas, especialmente en zonas con suelos degradados como las del área mediterránea. En Europa, se estima que el 39 % de las toneladas, referidas materia seca, que se generan anualmente de lodos tratados son utilizados como enmienda agrícola (Milieu et al., 2008). En algunos países como Francia (70 %), Reino Unido (68 %), Irlanda (63 %) (Milieu et al., 2008), y España (76 %) (MMARM, 2010), la aplicación de estos lodos a los suelos es incluso superior. Todo esto, permite, no solo dar un destino a la gran cantidad de lodos producidos sino, además, darles valor como fertilizantes (González-García et al., 2019). Sin embargo, esta práctica podría hacer que contaminantes presentes en los lodos pudieran incorporarse a cultivos (Ghisi et al., 2019; González-García et al., 2019). La Comisión Europea, estudia una modificación de la Directiva 86/278/CEE, con un tercer borrador publicado en abril de 2000, con intención de restablecer nuevas restricciones y sentar las bases de una nueva Directiva Europea en materia de aplicación de lodos de depuradora al suelo, estableciéndose así un mayor control. Se establecen así unos valores límite más restrictivos para siete metales pesados (cadmio, cobre, cromo, mercurio, níquel, plomo y zinc) y se fijan valores límite para determinados compuestos orgánicos (compuestos orgánicos halogenados, sulfonatos de alquilbenceno lineales, dietilhexilftalato, nonilfenoles, hidrocarburos aromáticos policíclicos, bifenilos policlorados, dibenzodioxinas y dibenzofuranos policlorados). Son muchos los estudios en los que se ha descrito la presencia de contaminantes emergentes en el medioambiente. Estos estudios se centran fundamentalmente en matrices acuosas, como las aguas residuales (Gogoi et al., 2018; Tran et al., 2018) y superficiales (Garrido et al., 2016) y, en menor medida, en matrices sólidas como los lodos de depuradora (Martín-Pozo et al., 2019; Pérez-Lemus et al., 2019; Martín et al., 2012), suelos (Zuloaga et al., 2012; Díaz-Cruz et al., 2009) y vegetales (Concha-Meyer et al., 2019; González-García et al., 2019) (Figura 1). Capítulo I 25 Figura 1. Evolución en el número de publicaciones sobre contaminantes emergentes en matrices acuosas, lodo, suelo y vegetales. (Fuente: Scopus.com, Julio 2020) Entre los contaminantes cuya presencia se encuentra habitualmente descrita en el medioambiente se encuentran los hidrocarburos aromáticos policíclicos (Meng et al., 2019; Capelo et al., 2005), pesticidas (Narenderan et al., 2019; Masiá et al., 2016), compuestos orgánicos perfluorados (Ghisi et al., 2019; Bartolomé et al., 2017; Muñoz et al., 2017; Bizkarguenaga et al., 2016), retardantes de llama (Lu et al., 2013; Rodríguez- Rodríguez et al., 2012; Gatidou et al., 2007) y productos de cuidado personal (López- Serna et al., 2018; Al-Farsi et al., 2017; Cerqueira et al., 2014; Albero et al., 2012a), entre otros. La preocupación por la presencia de tales compuestos en el medioambiente es tal que ha llevado a la Unión Europea a tomar medidas para su control mediante, entre otros, la inclusión de algunos de estos compuestos en las listas de contaminantes prioritarios o la actualización de las normas que regulan la reutilización de las aguas residuales tratadas para riego agrícola y paisajístico y la recarga de aguas subterráneas y acuíferos (CE, 2018). 1.1. Contaminantes emergentes de especial relevancia: Disruptores endocrinos De acuerdo con la OMS, un disruptor endocrino (Endocrine Disrupting Compound, EDC) se define como ua sustaia o ezla eógea ue altea la fuió del sistea endocrino y, en consecuencia, causa efectos adversos para la salud en un organismo itato, o su pogeie, o su polaioes (OMS, 2002), entendiendo por efecto 0 50 100 150 200 250 300 Nº Publicaciones Año Agua Lodo y suelo Vegetales Antecedentes 32 Se trata de un compuesto con propiedades estrogénicas y clasificado como disruptor endocrino por su capacidad de activar o bloquear la actividad de los receptores de estrógenos o progesterona (Beausoleil et al., 2018), afectando así al funcionamiento de la próstata, mama y cerebro (Ma et al., 2019). Este compuesto genera una especial preocupación debido a que los efectos que produce son mucho más nocivos que los de otros compuestos (Mihałoiz et al., . En 2006, la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) completó la primera evaluación de riesgo del BPA fijando inicialmente un valor límite de ingesta diaria de 50 µg kg -1 que posteriormente fue reducido a 4 µg kg -1 (EFSA, 2010). Propiedades físico-químicas El BPA es un compuesto ligeramente hidrofóbico. Puede reaccionar con hipoclorito sódico, empleado como agente blanqueante en la fabricación de papel y en la desinfección de aguas, generando así diversos derivados clorados (Caballero-Casero et al., 2016). En la Tabla 4 se recoge la estructura química del BPA con alguna de las de las propiedades físico-químicas más significativas. Tabla 4. Estructura y principales propiedades fisicoquímicas del BPA objeto de estudio en esta Tesis. Datos obtenidos de la base de datos PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). Abreviatura Estructura química Masa molecular (g/mol) pKa Log Kow CAS BPA 213.1 10.30 3.32 80-05-7 2.4. Benzofenonas Usos y aspectos generales Las benzofenonas se emplean como filtros UV en la formulación de productos cosméticos para la protección solar. El Reglamento Europeo 1223/2009 define los filtros Capítulo I 33 UV oo auellas sustaias ua fialidad elusia o piipal sea potege la piel contra determinadas radiaciones ultravioleta absorbiendo, reflejando o dispersando esta adiaió CE, 2009). Se utilizan, además de en productos cosméticos destinados específicamente a la protección solar, en productos de uso diario como cremas hidratantes, productos para después del afeitado, champús, cremas antiarrugas, maquillaje, etc. (Chisvert et al., 2007). Pueden ser filtros UV inorgánicos, que reflejan y dispersan la radiación, o filtros orgánicos que absorben la radiación UV y la disipan en forma de calor. Como filtros UV orgánicos se emplean benzofenonas, paminobenzoatos, salicilatos, cinamatos, benzotriazoles, benzimidazoles y derivados del alcanfor, entre otros (Chisvert y Salvador, 2018). De todos ellos, las benzofenonas son las más empleadas (Vela-Soria et al., 2014; Jiménez-Díaz et al., 2014). Estudios en animales evidencian que estas sustancias pueden afectar el desarrollo y alterar el eje hipotálamico-pituitario-tiroideo responsable del control de la liberación de hormonas tiroideas al organismo (Krause et al., 2012). Propiedades físico-químicas Las benzofenonas son compuestos químicos formados por dos anillos bencénicos unidos por un grupo carbonílico. Las benzofenonas, salvo la benzofenona-4 y la benzofenona- 5, poseen carácter hidrofóbico lo que favorecerá su retención en sólidos y sedimentos en suspensión en contacto con el agua como puede ser el lodo de depuradora generado en las EDARs. Además, poseen un bajo poder de volatilización (Kim y Choi, 2014). Las benzofenonas seleccionadas en esta Tesis Doctoral son la benzofenona 1 (BP-1), la benzofenona 2 (BP-2), la benzofenona 3 (BP-3), la benzofenona 6 (BP-6), la benzofenona 8 (BP-8) y la 4-hidroxibenzofenona (4-OH-BP). En la Tabla 5 se recogen sus estructuras químicas junto con sus propiedades físico-químicas más significativas. Antecedentes 34 Tabla 5. Estructura y principales propiedades fisicoquímicas de los filtros UV orgánicos objeto de estudio en esta Tesis. Datos obtenidos de la base de datos PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). Abreviatura Estructura química Masa molecular (g/mol) pKa Log Kow CAS BP-1 214.2 7.09 3.48 131-56-6 BP-2 246.2 6.75 3.52 131-55-5 BP-3 228.2 9.70 3.79 131-57-7 BP-6 274.3 6.80 2.21 131-54-4 BP-8 244.5 6.78 3.82 131-53-3 4-OH-BP 198.2 8.10 2.92 1137-42-4 2.5. Triclosán y triclocarbán Usos y aspectos generales El triclosán (TCS) y el triclocarbán (TCB) son compuestos con propiedades antibacterianas y fungicidas. Tienen acción sinérgica con los detergentes a oetaioes ≥ % y acción bactericida contra bacterias Gram-positivas y algo menor frente a bacterias Gram-negativas y hongos (Fang et al., 2010). Los mecanismos de acción de los biocidas han sido poco explorados y difieren de los antibióticos en que Capítulo I 35 pueden actuar sobre múltiples dianas, lo que permite su uso como antisépticos, desinfectantes y conservantes (Chen et al., 2018). A las dosis de uso habituales actúan como bactericida y a dosis menores poseen efecto bacteriostático (Fang et al., 2010). Se emplean en muchos productos hospitalarios, detergentes, jabones, desodorantes, productos de limpieza, productos del cuidado personal como desodorantes, pastas de dientes, enjuagues bucales, etc. (Alshishani et al., 2019). La Directiva 76/768/CEE del Consejo, de 27 de julio de 1976, relativa a la aproximación de las legislaciones de los Estados Miembros en materia de productos cosméticos, permitía su empleo en productos de cuidado personal en concentraciones inferiores al 0.2 y 0.3 % p/p para el triclosán y el triclocarbán, respectivamente. Sin embargo, ambos compuestos generan preocupación por su actividad como disruptores endocrinos. Por este motivo, en enero de 2016, la Comisión Europea publicó la Decisión de Ejecución (UE) 206/110 por la ue o se apuea el triclosán como sustancia activa existente para su uso en biocidas del tipo de producto 1 ioidas paa la higiee huaa (CE, 2016). En septiembre del mismo año, la Agencia Estadounidense Reguladora de Alimentos y Fármacos (Food and Drug Administration (FDA)) dictaminó la retirada del mercado de aquellos productos antisépticos de consumo libre que contuviesen TCS y TCB mientras que seguían siendo permitidos en productos para asistencia sanitaria (FDA, 2016). Entre los efectos causados, se encuentra generar posible resistencia microbiana lo que podría afectar a la flora intestinal provocando efectos adversos como la inflamación y el cáncer de colón (Fang et al., 2010). Propiedades físico-químicas Son compuestos aromáticos clorados que se presentan en forma de polvo cristalino blanco ligeramente aromático y soluble en disolventes orgánicos. Tienden a descomponerse por acción de la luz, el ozono, el cloro y por algunos microorganismos (Fang et al., 2010). El TCS posee carácter lipofílico, por lo que queda fácilmente retenido en lodos de depuradora y en sedimentos (Alshisani et al., 2019). Los agentes antimicrobianos seleccionados como objeto de estudio en esta Tesis Doctoral fueron TCS y TCB por su elevada toxicidad a altas dosis y su extendido uso como agentes Antecedentes 36 antimicrobianos (FDA, 2016). En la Tabla 6 se muestran las estructuras químicas de los compuestos seleccionados junto con algunas de sus propiedades físico-químicas más significativas. Tabla 6. Estructura y principales propiedades fisicoquímicas de los agentes antimicrobianos objeto de estudio en esta Tesis. Datos obtenidos de la base de datos PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). Abreviatura Estructura química Masa molecular (g/mol) pKa Log Kow CAS TCB 315.6 11.42 4.93 202-924-1 TCS 289.5 7.68 4.98 3380-34-5 2.6. Parabenos Usos y aspectos generales Los parabenos son compuestos con una gran estabilidad química y térmica (Błędzka et al., 2014). A bajas concentraciones (entre 0.05 y 0.20 % p/p), son conservantes efectivos frente al crecimiento de hongos, como mohos y levaduras, de bacterias Gram positivas, y en menor grado, de bacterias Gram negativas como Salmonella, Escherichia Coli y alguna pseudomona, razón por la cual, se empezaron a emplear como conservantes en fármacos en los 1920s (Błędzka et al., 2014). Actualmente, debido a sus propiedades antimicrobianas, son empleados como conservantes principalmente en productos de cuidado personal, como cosméticos, cremas, geles, lociones, champús, productos capilares, pasta dentífrica, espumas de afeitar, toallitas limpiadoras, etc. Se estima que un 80% de los productos de cuidados personal contienen parabenos (Błędzka et al., 2014). También se emplean como conservantes en fármacos y alimentos (Jamal et al., 2019; Kolatorova et al., 2018). Su uso industrial, tanto en cosmética como en la industria alimentaria, está regulado a nivel europeo a través del Reglamento 1223/2009 sobre los Capítulo I 37 productos cosméticos (CE, 2009) y la Directiva 95/2/CE relativa a aditivos alimentarios distintos de los colorantes y edulcorantes (CE, 1995). Sin embargo, no hay legislación hasta la fecha que regule su vertido o presencia en el medioambiente. Los parabenos se consideran compuestos disruptores endocrinos (Jamal et al., 2019; Nowak et al., 2018), y su uso está controlado en la Unión Europea, Estados Unidos y Canadá (Kolatorova et al., 2018). El nivel máximo permitido para estos compuestos en cosmética varía según se apliquen de manera aislada (0.4 %) o combinada (0.8 %) (Kolatorova et al., 2018; Bledzka et al., 2014). Se les considera responsables de múltiples alteraciones en el sistema endocrino (Nowak et al., 2018). Propiedades físico-químicas Los parabenos son sólidos cristalinos, incoloros e inodoros, poco volátiles y lipofílicos derivados del ácido p-hidroxibenzoico. Su extendido uso como conservante radica en su amplio espectro de actividad frente a hongos, mohos y bacterias, su gran estabilidad química en un amplio intervalo de temperatura y pH comprendido entre 4.5 y 7.5, su actividad microbiana se incrementa con la longitud de la cadena carbonada pero a la vez su solubilidad en agua se ve disminuida, no poseen olor ni sabor ni alteran la consistencia o coloración de los productos a los que son añadidos (Błędzka et al., 2014). Los parabenos seleccionados en esta Tesis Doctoral son metilparabeno (MeP), etilparabeno (EtP), propilparabeno (PrP) y bencilparabeno (BzP). En la Tabla 7 se recogen sus estructuras químicas y algunas de las propiedades físico-químicas más significativas. Antecedentes 38 Tabla 7. Estructura y principales propiedades fisicoquímicas de los parabenos objeto de estudio en esta Tesis. Datos obtenidos de la base de datos PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). Abreviatura Estructura química Masa molecular (g/mol) pKa Log Kow CAS MeP 152.2 8.47 1.91 99-76-3 EtP 166.2 8.50 2.34 120-47-8 PrP 180.2 8.47 2.94 94-13-3 BzP 228.2 8.20 3.59 94-18-8 3. PRESENCIA DE LOS EDCs OBJETO DE ESTUDIO EN EL MEDIOAMBIENTE Los estudios publicados hasta la fecha sobre los EDCs objeto de estudio en el medioambiente abarcan tanto (i) el desarrollo de metodologías analíticas para su determinación principalmente en matrices acuosas (Alshishani et al., 2019; Chisvert et al., 2018; Cerqueira et al., 2014; Onghena et al., 2012) y, en mucho menor medida en matrices sólidas como lodos (Martín-Pozo et al., 2019; Azzouz y Ballesteros, 2016; Zuloaga et al., 2012), suelos (Camino-Sánchez et al., 2016; Albero et al., 2012b) y sedimentos (Gorga et al., 2014; Casas-Ferreira et al., 2011) (ii) su distribución en diferentes compartimentos ambientales, fundamentalmente matrices líquidas (Gogoi et al., 2018; Tran et al., 2018; Montes-Grajales et al., 2017; Garrido et al., 2016; Pan et al., 2016; Li et al., 2015; Camacho-Muñoz et al., 2014) (iii) la evaluación del impacto ambiental generado por estos compuestos (Acir et al., 2018; Garrido et al., 2016; Molins- Delgado et al., 2016; Langford et al., 2015; Li et al., 2015; Martín et al., 2012; González Capítulo I 39 et al., 2010). La mayoría de dichos estudios se han centrado en su presencia en matrices ambientales líquidas como aguas residuales (Alshishani et al., 2019; Montes-Grajales et al., 2017; Molins-Delgado et al., 2016), aguas superficiales (Zacs y Bartkevics, 2016; Houtman, 2010), aguas subterráneas (Li et al., 2015), e incluso aguas potables (Marta- Sánchez et al., 2018; Pan et al., 2016; Cerqueira et al., 2014; Petoić et al., 2003). Las concentraciones descritas se encuentran en el rango de ng L-1 hasta µg L-1 en función del compuesto y tipo de muestra. 3.1. Presencia y riesgos medioambientales de los EDCs seleccionados en lodos de depuradora El número de estudios publicados sobre la presencia de estos compuestos en matrices ambientales sólidas es muy reducido. En España, Azzouz et al. (2016) analizaron lodos de depuradoras de Andalucía encontrando concentraciones de TCS y BPA comprendidas entre 145-150 y 128-164 ng kg-1, respectivamente. Autores como Chen et al. (2019), evaluaron la frecuencia de aparición y las concentraciones de TCS y TCB en muestras de lodo procedentes de EDARs, recogidas en 21 provincias de la región de China, donde encontraron concentraciones comprendidas entre <4 y 4870 ng g-1 para el TCS, con una frecuencia de aparición del 99 %, y concentraciones de entre <3 y 43300 ng g-1 para el TCB, con una frecuencia de aparición del 95 %. Yu y Wu, 2012 evaluaron la concentración de BPA y TCS en muestras de lodo procedente de 4 EDARs del Sur de California, encontrando valores de concentración de 66.4- 217 ng g-1 para el BPA y 271.9-1965 ng g-1 para el TCS, correspondiendo las concentraciones más bajas, y las más altas, a lodos de la misma EDAR. Estos trabajos se han desarrollado fundamentalmente sobre el lodo obtenido tras el proceso de estabilización. Sin embargo, muy pocos estudios han evaluado el comportamiento de estos compuestos en los diferentes tipos de lodos generados por las diferentes tecnologías de estabilización. Es por ello, que son pocos los compuestos en los que se ha realizado un seguimiento comparando su aparición y destino, como los surfactantes (Camacho-Muñoz et al., 2014; González et al., 2010), compuestos perfluorados (Ulrich et al., 2016), plastificantes como el BPA (Guerra et al., 2015), parabenos (Albero et al., 2012a), filtros UV (Liu et al., 2012) y agentes Antecedentes 40 antimicrobianos como el TCS y TCB (Tohidi y Cai., 2017). Los estudios realizados sobre impacto ambiental en lodos son igualmente escasos. González et al. (2010), evaluaron el riesgo ecotoxicológico en lodos de depuradora generados en EDARS andaluzas y posteriormente en los suelos enmendados con dichos lodos. Para compuestos como el NP, NP1EO y NP2EO obtuvieron un coeficiente de riesgo superior a 1 para el 99 %, 92 % y 36%, respectivamente, de las muestras analizadas. El coeficiente de riesgo referido a suelo tratado con lodo fue superior a 1 para NP, NP1EO y NP2EO en el 86 %, 6% y 2%, respectivamente, de las muestras. Por otra parte, Verlicchi et al. (2015) realizó una evaluación del impacto ambiental que generan ciertos productos de cuidado personal, como el TCS y el TCB entre otros, en suelo tras haber aplicado lodo digerido procedente de estaciones depuradoras, obteniendo un coeficiente de riesgo >1 para ambos compuestos. 3.2. Presencia y riesgos medioambientales de los EDCs seleccionados en suelos Son muy pocos los estudios que se han realizado sobre la presencia de los EDCs seleccionados en suelos. Por ejemplo, se ha descrito la presencia de filtros-UV, BP-1, BP- 3, BP-6, BP-8 y 4-OH-BP, entre otros, en suelos enmendados con lodos de depuradora y suelos procedentes de zonas industriales pertenecientes a la región de Madrid (España) (Sánchez-Brunete et al., 2011). Encontraron concentraciones inferiores a 0.10 ng g-1 para BP-1, BP-3, BP-8 y 4-OH-BP y 0.6±0.4 ng g-1 para BP-6 en los suelos enmendados con lodo de depuradora y de 5.7 ng g-1 para BP-1 e inferiores a 0.10 ng g-1 para BP-3, BP-6, BP-8 y 4-OH-BP en los suelos procedentes de la zona industrial (Sánchez-Brunete et al., 2011). Otros compuestos, como el BPA, el TCS y el TCB, se han medido en suelos regados con aguas residuales y regados con aguas subterráneas desde los años 1960s ubicados ambos la región de Hebei (China) (Chen et al., 2011). Encontraron concentraciones comprendidas entre <3.40 y 4.30 ng g-1 para el BPA, <1.58 ng g-1 para el TCS y <0.39 ng g-1 para el TCB en los suelos regados con aguas superficiales, y concentraciones inferiores a 3.40 ng g-1 para el BPA, entre <1.58-1.80 ng g-1 para el TCS y entre <0.39-105 ng g-1 para el TCB en los suelos regados con aguas residuales. Sánchez-Brunete et al. (2009), analizaron muestras de suelo, procedentes tanto de zona agrícola como Capítulo I 41 industrial, de la región de España, obteniendo rangos de concentración para el BPA de entre 0.7-4.6 ng g−1 en suelo agrícola y 1.1-44.5 ng g−1 en suelo procedente de la zona industrial. Otros autores como Gao et al. (2019) determinaron la concentración de compuestos perfluorados (PFBuA, PFPeA, PFHxA, PFHpA y PFOA, entre otros) en 32 muestras de suelo compostado procedente de la región de Hubei (China). Las concentraciones encontradas estuvieron comprendidas entre 0.27-313 ng g-1, 0.09-129 ng g-1, 0.32-21.9 ng g-1, <0.05-61.2 ng g-1 y <0.01-39.5 ng g-1 para PFBuA, PFHxA, PFOA, PFPeA y PFHpA, respectivamente. La frecuencia de aparición fue del 93.8 % para PFPeA y PFHpA y del 100 % para PFBuA, PFHxA y PFOA. Así mismo, se realizó una evaluación de riesgo de exposición al PFOS a través del suelo, las aguas subterráneas y el agua de grifo, concluyéndose que podrían existir riesgos potenciales por su bioacumulación en la cadena alimentaria (Zhang et al., 2017). Mungray y Kumar (2008) evaluaron el impacto ambiental que generan los surfactantes aniónicos en tres tipos de suelos, suelo procedente de zona industrial, suelo agrícola y suelo de pastizal, a los que se les había aplicado lodos digeridos aeróbicamente, anaeróbicamente y digeridos aeróbicamente con posterior secado natural. Obtuvieron coeficientes de riesgo inferiores a 1 en todos los casos, excepto cuando se aplicó lodo digerido anaeróbicamente. Los coeficientes de riesgo más altos correspondieron al suelo procedente de la zona industrial siendo superiores a 1 para estos surfactantes aniónicos. Chen et al. (2014), evaluaron el impacto ambiental en suelos enmendados con biosólidos de la región de China. Obtuvieron coeficientes de riesgo superiores a 1 tanto para el TCS como para el TCB. 3.3. Presencia de los EDCs seleccionados en vegetales de consumo humano Hasta la fecha existen pocos estudios que evalúen la presencia de los EDCs objeto de estudio en vegetales. Las principales vías por los que estos compuestos podrían estar presentes en cultivos son el riego agrícola con agua residual tratada o el empleo de lodo compostado como fertilizante. Estos contaminantes, en función de sus propiedades fisicoquímicas (log Kow y pKa) y de las características del suelo y de la planta, pueden llegar a bioacumularse en distintas partes de las plantas. Los EDCs son asimilados por las raíces y transportados junto con el resto de nutrientes, pudiendo llegar a acumularse en Antecedentes 48 2010). García-Valcárcel et al. (2012) describió la aplicación de la extracción en fase sólida dispersiva, con un sorbente de Florisil®, para la limpieza de extractos en la determinación de PFCs en suelos. Chen et al. (2010), en la determinación de TCS, TCB y BPA, hicieron pasar el extracto obtenido por una columna de gel de sílice para eliminar los interferentes del mismo. Vakondios et al. (2016) emplearon la microextracción en fase sólida, mediante fibra de sílice recubierta de un polímero extractante y posterior desorción en el cromatógrafo de gases, en la determinación de BPA y TCS. Luque-Muñoz et al. (2017) describieron el uso de la extracción líquido-líquido asistida por sales en la determinación de parabenos y benzofenonas. Capítulo I 49 Tabla 8. Resumen de condiciones descritas en la bibliografía para la determinación de los EDCs seleccionados en suelo agrícola y lodo de depuradora mediante la extracción asistida por ultrasonidos. Referencia Higgins et al., 2005 Li et al., 2010 García- Valcárcel et al., 2012 Pan et al., 2016 Ulrich et al., 2016 Recuperación (%) 79-87 57-115 (lodo) 73-112 (suelo) 70-105 78.2-114 - LOQ (ng g-1) - 0.10-0.50 0.10-0.23 0.07-0.10 0.01-10 LOD (ng g-1) 0.90-2.20 0.03-0.30 0.03-0.05 0.02-0.03 - Determinación cromatográfica LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS Limpieza SPE (C18) SPE (WAX) d-SPE (Florisil) SPE (WAX) SPE Condiciones de extracción MeOH:HAc (1%,) 10 mL, (90:10, v/v) 60°C, 15 min 2 extracciones MeOH:HAc (1%,) 10 mL, (90:10, v/v) 60°C, 15 min 2 extracciones ACN:HAc (1%,) 2 mL, (50:50, v/v) 60°C, 15 min 2 extracciones MeOH:HAc (1%,) 10 mL, (90:10, v/v) 60°C, 15 min 2 extracciones MeOH, 5 mL, 60 min, 40°C 1 extracción Masa (g) 1 1 2 1 1 Matriz Lodo Lodo y suelo Suelo Lodo Lodo Compuestos PFHxA, PFOA, PFOS y otros PFBuA, PFPeA, PFHxA, PFHpA, PFOA, PFOS y otros PFPeA, PFOA, PFOS y otros PFBuA, PFPeA, PFHxA, PFHpA, PFOA, PFOS y otros PFHxA, PFHpA, PFOA, PFOS y otros Antecedentes 50 Tabla 8. Continuación. Referencia Zacs y Bartkevics, 2016 Gatidou et al., 2007 Nie et al., 2009 Vakondios et al., 2016 Samaras et al., 2011 Recuperación (%) 95 (PFOS) 98 (PFOA) 70.6 (TCS) 87.2 (BPA) 101.8 (BPA) - 67 (BPA) 74 (TCS) LOQ (ng g-1) 0.005 (PFOS) 0.04 (PFOA) 0.49(TCS) 1.84(BPA) 1.3(BPA) 2.19- 12.10 108 (BPA) 49 (TCS) LOD (ng g-1) - 0.15(TCS) 0.56(BPA) - 4-50 15 (BPA) 25 (TCS) Determinación cromatográfica LC-Orbitrap-MS GC-MS/MS GC-MS/MS GC-MS/MS GC-MS/MS Limpieza SPE (WAX) SPE (C18) SPE (HLB) SPME SPE (C18) Condiciones de extracción MeOH 5 mL NaOH (0.2M) 1 mL (5:1, v/v), 15 min 2 extracciones MeOH 5 mL H2O 3 mL 30 min, 50 °C 1 extracción MeOH:Ace (1:1, v/v) 5 mL, 10 min, 3 extracciones MeOH 6 mL, 10 min 1 extracción MeOH:H2O (2:1, v/v) 4 mL, 30 min, 50°C 1 extracción Masa (g) 0.5 - 1 1 0.4 Matriz Lodo Lodo Lodo Lodo Lodo Compuestos PFOA y PFOS BPA, TCS y otros BPA y otros BPA, TCS y otros BPA, TCS y otros Capítulo I 51 Tabla 8. Continuación. Referencia Sánchez- Brunete et al., 2009 Chen et al., 2010 Luque- Muñoz et al., 2017 Subedi et al., 2017 Núñez et al., 2008 Recuperación (%) 102 95-111 93-109 77-122 83-110 LOQ (ng g-1) 0.12 0.39-3.40 4-13 0.5-50 0.11-0.31 LOD (ng g-1) 0.03 0.12-1.02 1-4 - 0.04-0.09 Determinación cromatográfica GC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS Limpieza - Columna de gel de sílice SALLE SPE (HLB) - Condiciones de extracción AcOEt 5 mL 15 min 2extracciones (SAESC) AcOEt:Ácido fórmico (50:1, v/v) 10 mL 15 min 1 extracción ACN: AcOEt (1:1, v/v), (10% HAc) 5 mL, 10 min, 2 extracciones MeOH:H2O (5:3, v/v) 6 mL, 30 min 1 extracción ACN, 7 mL, 15 min, 2 extracciones (SAESC) Masa (g) 5 5 0.8 0.1 10 Matriz Suelo Suelo Lodo Lodo Lodo Compuestos BPA y otros BPA, TCS y TCB MeP, EtP, PrP, BP- 1, BP-3, BP-6, BP-8, 4-OH-BP, y otros TCB, TCS, 1 BP y otros MeP, EtP, PrP, BzP y otros Antecedentes 52 Tabla 8. Continuación. Referencia Camino- Sánchez et al., 2016 Yu y Wu, 2012 Dórival- García et al., 2012 Ace: Acetona; ACN: Acetonitrilo; AcOEt: Acetato de etilo; d-SPE: Extracción en fase sólida dispersiva; GC-MS/MS: Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas en tándem; HAc: Ácido acético; LC-MS/MS: Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem; LC-Orbitrap-MS: Cromatografía líquida Orbitrap acoplada a espectrometría de masas; MeOH: Metanol; SALLE: Extracción líquido-líquido asistida por sales; SPE: Extracción en fase sólida; SPME: Microextracción en fase sólida; SAESC: Extracción asistida con ultrasonidos en pequeñas columnas Recuperación (%) 83-107 80 (BPA) 86 (TCS) 99.4 LOQ (ng g-1) 0.1-1 4.7 (BPA) 7.2 (TCS) 13 LOD (ng g-1) 0.03-0.4 1.4 (BPA) 2.1 (TCS) 4 Determinación cromatográfica LC-MS/MS GC-MS/MS LC-MS/MS Limpieza - SPE (HLB) - Condiciones de extracción MeOH 15 mL, 25 min, 1 extracción MeOH (1% Ácido fórmico), 4 mL, 20 min 2 extracciones AcOEt 10 mL, 20 min 1 extracción Masa (g) 0.5 1 1 Matriz Suelo y lodo Lodo Lodo Compuestos MeP, EtP, PrP, BzP, BP-1, BP-2, BP-3, BP-6, BP-8, 4-OH- BP, TCS y TCB BPA, TCS y otros BPA y otros Capítulo I 53 4.1.2. Extracción con líquidos presurizados En la extracción con líquidos presurizados se emplean disolventes a elevada presión y temperatura lo que favorece la extracción de los contaminantes. La muestra se introduce en una celda de extracción, normalmente mezclada con tierra de diatomeas u otro material inerte como arena, óxido de aluminio, etc. para dispersar la muestra y evitar que se formen agregados. Se trata de una tecnología totalmente automatizada. El disolvente extractante se hace pasar a través de la celda a elevada presión y temperatura aumentando así la solubilidad y, por tanto, la transferencia de los analitos al extractante. El aumento de la temperatura de extracción promueve la solubilidad del analito, disminuye la viscosidad y la tensión superficial de los disolventes y ayuda a que estos penetren con mayor facilidad en la matriz sólida, favoreciendo la cinética de la extracción sin degradar los analitos (Zuloaga et al., 2012). En la Tabla 9 se muestran las características operacionales y analíticas de los métodos descritos en la literatura para la determinación de los EDCs objeto de estudio en suelos y lodos de depuradora mediante extracción con líquidos presurizados. La mayoría de estos métodos se han descrito para la determinación de productos de cuidado personal como, parabenos (Malvar et al., 2020; Albero et al., 2012b), parabenos, TCS, TCB y BPA (Gorga et al., 2014), benzofenonas (Langford et al., 2015; Gago-Ferrero et al., 2011; Negreira et al., 2011), BPA (Dórival-García et al., 2012; Martínez-Moral y Tena, 2011; Meesters y Schroder, 2002) y, en menor medida, para la determinación de PFCs (Llorca et al., 2011). En cuanto al disolvente empleado para la extracción de los contaminantes seleccionados, el MeOH se ha descrito para la extracción de PFCs (Llorca et al., 2011) y MeOH con 0.5% v/v de ácido fórmico para extraer parabenos como el MeP y el PrP (Malvar et al., 2020). Otras mezclas empleadas han sido H2O:MeOH:Ace (1:2:1, v/v/v) para extraer parabenos, TCB, TCB y BPA (Gorga et al., 2014); AcOEt:MeOH (90:10, v/v) para extraer parabenos (Albero et al., 2012b); AcOEt:ácido fórmico (9:1, v/v) (Meesters y Schroder, 2002), AcOEt (Dórival-García et al., 2012) y DCM (Martínez-Moral y Tena, 2011) para extraer BPA. Se han descrito también mezclas DCM:Hex en distintas proporciones como DCM:Hex (1:2, v/v) para extraer las benzofenonas BP-1, BP-3 y 4-OH-BP (Gago-Ferrero et al., 2011) y DCM:Hex (20:80, v/v) (Negreira et al., 2011) y DCM:Hex (50:50, v/v) para extraer BP-3. Antecedentes 54 Otras variables a tener en cuanta en esta técnica de extracción son el tiempo de extracción, la temperatura, la presión y el número de ciclos. En el caso de la temperatura de extracción, el rango descrito en la literatura para los compuestos seleccionados es de 50-170 °C. Las temperaturas más bajas se emplearon para extraer parabenos (Malvar et al., 2020; Gorga et al., 2014) y las temperaturas más elevadas para extraer BPA (Dórival- García et al., 2012; Martínez-Moral y Tena, 2011; Meesters y Schroder, 2002). La presión de extracción se fijó en un rango de entre 69-140 bares. El tiempo de extracción más habitual fue de 5 min salvo en el método descrito por Gorga et al. (2014) que emplearon 25 min para extraer parabenos, TCS, TCB y BPA. Se suelen emplear entre 1 y 3 ciclos de extracción siendo lo más habitual 2 ciclos de 5 min (Malvar et al., 2020; Gago-Ferrero et al., 2011). Al igual que en otros métodos de extracción, es necesario una limpieza de los extractos obtenidos antes de su determinación cromatográfica. Dicha etapa de limpieza se realiza habitualmente mediante extracción en fase sólida con sorbentes C18 (Gago- Ferrero et al., 2011) o PSA (Negreira et al., 2011) en la determinación de benzofenonas; Oasis WAX en la determinación de PFCs (Llorca et al., 2011); Oasis HLB en la determinación de parabenos, TCS, TCB y BPA (Gorga et al., 2014) y columnas de permeación en gel en la determinación de BP-3 (Langford et al., 2015). Una variante en el proceso de limpieza y/o preconcentración del extracto es la extracción con líquidos presurizados selectiva. En ella se añade a la celda de extracción, además de la muestra y el sólido dispersante, un sorbente capaz de retener las posibles interferencias, permitiendo así realizar la extracción y limpieza del extracto de manera simultánea en la propia celda de extracción. Se ha descrito el empleo de la mezcla de sorbentes C18 y PSA (Malvar et al., 2020) en la determinación de parabenos, y de Florisil en la determinación de BPA (Martínez-Moral y Tena, 2011). Capítulo I 55 Tabla 9. Resumen de condiciones descritas en la bibliografía para la determinación de los EDCs seleccionados en suelo agrícola y lodo de depuradora mediante la extracción con líquidos presurizados. Referencia Llorca et al., 2011 Meesters y Schroder, 2002 Martínez- Moral y Tena 2011 Dórival- García et al., 2012 Gorga et al., 2014 Recuperación (%) 65-98 100 100 99.5 64-98 LOQ (ng g-1) 0.84- 2.77 - 35.7 18 0.44- 6.20 LOD (ng g-1) 0.022- 0.83 0.0001 10.7 5 0.13- 1.90 Determinación cromatográfica LC-QLiT-MS/MS GC-MS/MS GC-MS/MS LC-MS/MS TFC-LC-MS/MS Limpieza SPE (WAX) SPE SPLE (Florisil) - SPE (HLB) Condiciones de extracción MeOH 22 mL, 1 min 70°C, 100 bar, 2 ciclos AcOEt:fórmico (9:1, v/v), 170 °C, 140 bar DCM 11 mL, 1 min, 130 °C, 1 ciclo AcOEt, 15 mL 8 min, 100°C, 69 bar 3 ciclos H2O:MeOH: Ace (1:2:1, v/v/v), 20 mL, 25 min, 50 °C, 104 bar, 1 ciclo Masa (g) 0.5 2 0.5 1 1 Matriz Lodo Lodo Lodo Lodos Lodo Compuestos PFBuA, PFPeA, PFHxA, PFHpA, PFOA, PFOS y otros BPA y otros BPA y otros BPA y otros MeP, EtP, PrP, BzP, TCB, TCS, BPA y otros Antecedentes 56 Tabla 9. Continuación. Referencia Gago- Ferrero et al., 2011 Negreira et al., 2011 Langford et al., 2015 Malvar et al., 2020 Recuperación (%) 30-95 106 72 46 (MeP) 67 (PrP) Suelo 73 (MeP) 77(PrP) Lodo LOQ (ng g-1) 3.3-200 61 10 1.89 (MeP) 3.29 (PrP) Suelo 7.94 LOD (ng g-1) 1-60 - - 0.57 (MeP) 0.99 (PrP) Suelo 2.38 Determinación cromatográfica LC-MS/MS GC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS Limpieza SPE (C18) SPE (PSA) - SPLE (0.4 g PSA y 0.8 g C18) Condiciones de extracción DCM:Hex (1:2,v/v) 25 mL, 5 min, 100 °C, 100 bar, 2 ciclos Hex:DCM (80:20, v/v) 5 min, 75 °C, 104 bar, 1 ciclo Hex:DCM (50:50, v/v), 5 min, 100°C, 3 ciclos MeOH (0.5 % Ác.Fórmico) 5 min, 50 °C, 104 bar, 2 ciclos Masa (g) 1 0.5 1 2 Matriz Lodo Lodo Lodo Suelo y lodo Compuestos BP-1, BP-3, 4-OH- BP y otros BP-3 y otros BP-3 y otros MeP, PrP y otros Capítulo I 57 Tabla 9. Continuación. Referencia Albero et al., 2012b Ace: Acetona; AcOEt: Acetato de etilo; DCM: Diclorometano; GC-MS/MS: Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas en tándem; Hex: Hexano; LCMS/MS: Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem; LC-QLiT-MS/MS: Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas con analizador híbrido de triple cuadrupolo y trampa de iones lineal; MeOH: Metanol; SPE: Extracción en fase sólida; SPLE: Extracción selectiva con líquidos presurizados; TFC-LC-MS/MS: Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas con analizador de tiempo de vuelo. Recuperación (%) 99-119 LOQ (ng g-1) 3.20-5.10 LOD (ng g-1) 1.00-1.70 Determinación cromatográfica GC-MS/MS Limpieza Condiciones de extracción AcOEt:MeOH (90:10, v/v), 10 min, 80°C, 120 bar 2 ciclos Masa (g) 1 Matriz Suelo Compuestos MeP, EtP, PrP, BzP y otros Antecedentes 64 introduce en el interior del recipiente que contiene la muestra junto con el disolvente extractante. La potencia extractiva de la sonda de ultrasonidos suele ser unas 100 veces superior a la que se alcanza mediante baños de ultrasonidos. Esto hace que se reduzcan los tiempos de extracción respecto de entre 10-60 min en baño de ultrasonidos a 10s-5 min con sonda de ultrasonidos (Albero et al., 2019). La extracción con ultrasonidos focalizados es además una técnica sencilla que requiere una cantidad de muestra inferior a la empleada en extracción en baño de ultrasonidos (0.25-0.5 g) y también un menor consumo de disolventes (entre 7-10 mL). En la Tabla 11 se muestran las características operacionales y analíticas de los métodos descritos en la literatura para la determinación de los EDCs objeto de estudio en distintos tipos de vegetales empleando las técnicas de extracción asistida por ultrasonidos. La mayoría de los métodos de extracción en baño de ultrasonidos se han desarrollado para la determinación de PFCs (Navarro et al., 2017; Xiang et al., 2017; Felizeter et al., 2014) y, en menor medida, para la determinación de TCS y TCB (Cabrera- Peralta y Peña-Álvarez, 2018; Carter et al., 2014; Wu et al., 2012) y BPA (Lu et al., 2013). El disolvente más empleado para la extracción de los contaminantes seleccionados es el metil terc-butil éter (MTBE), empleado para extraer PFCs en lechuga, calabaza, zanahoria y cereales (Xiang et al., 2017), tomate, calabacín y col (Felizeter et al., 2014). Wu et al. (2012), para la extracción de TCS y TCB de muestras de apio, tomate, zanahoria, brócoli, espinaca y pimiento realizan una primera extracción con MTBE y una segunda con acetonitrilo. Otro disolvente empleado es el acetonitrilo. Se ha empleado para la determinación de PFCs en espinacas, tomate y maíz (Navarro et al., 2017) y, en mezclas ACN:H2O (70:30, v/v), para extraer TCS de rábano y calabacín (Carter et al., 2014). Aunque en menor medida, se ha descrito también el uso de la acetona, para la extracción de BPA en lechuga (Lu et al., 2013), y el MeOH, para determinar TCS en lechuga (Cabrera-Peralta y Peña-Álvarez, 2018). Otras de las variables a tener en cuanta en esta técnica de extracción son el tiempo de extracción y el número de extracciones realizadas. El tiempo de extracción suele establecerse entre 5 y 20 min y suelen realizarse una o dos extracciones. No obstante, las condiciones más habituales son 2 extracciones de 10 min cada una de ellas (Xiang et al., 2017; Felizeter et al., 2014). Capítulo I 65 La extracción mediante sonda de ultrasonidos se ha empleado fundamentalmente para la determinación de PFCs (Bizkarguenaga et al., 2015; Zabaleta et al., 2014), y en menor medida, para la determinación de TCS (Mijangos et al., 2015) y BPA (Martín et al., 2019). Se ha descrito el uso de mezclas de disolventes como ACN:H2O (90:10, v/v), para extraer PFCs de zanahorias (Bizkarguenaga et al., 2015) y de lechuga, zanahoria y pimienta (Zabaleta et al., 2014); Ace:Hex (70:30, v/v) y para extraer BPA y TCS en muestras de lechuga y zanahoria (Mijangos et al., 2015). La acetona ha sido también empleada para extraer BPA de zanahorias (Martín et al., 2019). Una vez llevada a cabo la extracción por ultrasonidos, y con el fin de eliminar interferencias y/o preconcentrar el extracto, se aplica la extracción en fase sólida mediante cartuchos rellenos de un material polimérico absorbente. Se ha descrito el uso de cartuchos Oasis WAX (Waters), para la determinación de PFCs (Xiang et al., 2017; Felizeter et al., 2014; Zabaleta et al., 2014), y de cartuchos Oasis HLB para la determinación de TCS y TCB (Carter et al., 2014; Wu et al., 2012). Otros autores describen el empleo de la extracción en fase sólida dispersiva, con PSA para determinar BPA (Martín et al., 2019) y C18 para determinar BPA y TCS (Mijangos et al., 2015). Cabrera-Peralta y Peña-Álvarez (2018) aplican una microextracción en fase sólida con inmersión directa de fibra de PDMS-DVB en la determinación de TCS. Antecedentes 66 Tabla 11. Resumen de condiciones descritas en la bibliografía para la determinación de los EDCs seleccionados en matrices vegetales mediante extracción asistida por ultrasonidos y con ultrasonidos focalizados. Referencia Felizeter et al., 2014 Navarro et al., 2017 Xiang et al., 2017 Lu et al., 2013 Cabrera- Peralta y Peña- Álvarez, 2018 Recuperación (%) 48-97 48-104 115 (PFHxA) 71 (PFOS) 96 89 LOQ (ng g-1) - - - 0.1 5 LOD (ng g-1) - 0.01-0.90 0.020 (PFHxA) 0.150 (PFOS) 0.03 1 Determinación cromatográfica LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS GC-MS/MS GC-MS/MS Limpieza SPE (WAX) SPE SPE (WAX) - SPME (PDMSDVB) Condiciones de extracción MTBE 5 mL 10 min 2 extracciones ACN MTBE 5 mL 10 min 2 extracciones Ace 100 mL 15 min 1 extracción MeOH 5 mL, 5 min 1 extracción Masa (g) 10 - 0.5 5 0.1 Matriz Tomate, calabacín y col Espinacas, tomate y maíz Lechuga, calabaza, zanahoria y cereales Lechuga Lechuga Compuestos PFBuA, PFPeA, PFHxA, PFHpA, PFOA, PFOS y otros PFBuA, PFPeA, PFHxA, PFHpA, PFOA, PFOS y otros PFHxA, y PFOS BPA y otros TCS y otros Capítulo I 67 Tabla 11. Continuación. Referencia Wu et al., 2012 Carter et al., 2014 Zabaleta et al., 2014 Bizkarguena ga et al., 2015 Recuperación (%) 120 (TCB) 103 (TCS) - 80-120 79-132 LOQ (ng g-1) - 7 (TCS) - - LOD (ng g-1) 0.04 (TCB) 3 (TCS) - 0.3-12.4 0.11-1.83 Determinación cromatográfica LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS Limpieza SPE (HLB) SPE (HLB) SPE (WAX) PES (1-MP) Par iónico Condiciones de extracción 1°extracción MTBE 20 mL, 20 min 2°extracción ACN 20 mL, 20 min ACN:H2O (70:30, v/v) 5 mL, 15 min 2 extracciones ACN:H2O (9:1, v/v) 7 mL ,2.5 min Time on 0.8 s (10 %) ACN:H2O (9:1, v/v) 7 mL ,2.5 min Time on 0.8 s (10 %) Masa (g) 0.2 1 0.5 0.5 Matriz Apio, tomate, zanahoria, brócoli, espinaca y pimiento Rábano y calabacín Zanahoria , lechuga y pimienta Zanahoria Compuestos TCS, TCB y otros TCS y otros PFBuA, PFPeA, PFHxA, PFHpA, PFOA y otros PFBuA, PFPeA, PFHxA, PFHpA, PFOA y otros 4 Antecedentes 68 Tabla 11. Continuación. Referencia Mijangos et al., 2015 Martín et al., 2019 Ace: Acetona; ACN: Acetonitrilo; d-SPE: Extracción en fase sólida dispersiva; GC-MS/MS: Cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas en tándem; Hex: Hexano; LC-MS/MS: Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem; MeOH: Metanol; MTBE: Metil terc-butil éter; SPE: Extracción en fase sólida; SPME: Microextracción en fase sólida; PES: Poliéter sulfona. Recuperación (%) 89 (TCS) 133 (BPA) zanahoria 95 (TCS) 122 (BPA) lechuga 97 LOQ (ng g-1) - 0.05 LOD (ng g-1) 1.8 (TCS) 2 (BPA) zanahoria 3.3 (TCS) 4.3 (BPA) lechuga 0.02 Determinación cromatográfica LC-MS/MS GC-MS/MS Limpieza d-SPE (EnviCar- C18) d-SPE (PSA) Condiciones de extracción Ace:Hex (70:30, v/v) 10 mL, 5 min, Time on 0.8 s (33 %) Ace 10 mL, 5 min, Time on 0.8 s (80 %) Masa (g) 0.25 y 0.5 0.25 Matriz Lechuga y zanahoria Zanahoria Compuestos BPA, TCS y otros BPA y otros Capítulo I 69 4.2.2. Extracción con líquidos presurizados La extracción con líquidos presurizados es otra de las técnicas de extracción más utilizadas para la determinación de algunas de las familias de los EDCs seleccionados en muestras de vegetales y frutas. La extracción con líquidos presurizados utiliza disolventes convencionales a elevadas temperaturas que oscilan entre 80-180 °C y presiones de entre 100-140 bares para mejorar el proceso de extracción de los contaminantes. En la Tabla 12 se muestran las características operacionales y analíticas de los métodos descritos en la literatura para la determinación de los EDCs objeto de estudio en vegetales mediante extracción con líquidos presurizados. Los métodos han sido desarrollados fundamentalmente para determinar agentes antimicrobianos, TCS y TCB (Aryal y Reinhold, 2011; Herklotz et al., 2010; Wu et al., 2010). Otros incluyen también BPA (Calderón-Preciado et al., 2009; Carabias-Martínez et al., 2006). Se ha descrito el uso de MeOH, para extraer BPA de cereales (Carabias-Martínez et al., 2006); acetonitrilo, para extraer TCS y TCB de judías (Wu et al., 2010); acetona, para extraer TCS y TCB de calabaza y calabacín; y mezclas de disolventes como Ace:Hex (1:1, v/v) para extraer TCS y BPA de lechuga (Calderón-Preciado et al., 2009) y ACN:H2O (55:85, v/v) para extraer TCS en muestras de col y zanahoria (Herklotz et al., 2010). Otras de las variables a tener en cuenta en esta técnica de extracción son el tiempo de extracción, la temperatura, la presión y el número de ciclos. La temperatura de extracción suele fijarse entre 80 y 130 °C aunque para la extracción de BPA, suelen emplearse temperaturas superiores a 100 °C (Carabias-Martínez et al., 2006; Calderón- Preciado et al., 2009). La presión suele estar comprendida entre 104-111 bares. Suelen aplicarse 1 o dos ciclos de extracción. Posteriormente, se realiza una etapa de limpieza del extracto habitualmente mediante extracción en fase sólida. Se ha descrito el uso de cartuchos Oasis HLB (Waters) en la determinación de BPA en cereales (Carabias- Martínez et al., 2006) y en la determinación de TCS y TCB C8 en judías (Wu et al., 2010). Calderón-Preciado et al. (2009) propusieron una limpieza del extracto, en la determinación de TCS y BPA en lechuga, mediante dispersión de la matriz en fase sólida. Antecedentes 70 Tabla 12. Resumen de condiciones descritas en la bibliografía para la determinación de los EDCs seleccionados en matrices vegetales mediante extracción con líquidos presurizados. Referencia Carabias- Martínez et al., 2006 Calderón- Preciado et al., 2009 Wu et al., 2010 Aryal y Reinhold, 2011 Recuperación (%) 81 74 (TCS) 76 (BPA) 30-123 - LOQ (ng g-1) - 7.66 (TCS) 15.3(BP A) - - LOD (ng g-1) 43 6.66 (TCS) 13.6(BPA) 0.10-4.89 - Determinación cromatográfica LC-MS/MS GC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS Limpieza SPE (HLB) MSPDPLE SPE (C8) - Condiciones de extracción MeOH 10 min, 120°C, 111 bar, 1ciclo Ace:Hex (1:1, v/v) 13,5 min, 104°C, 2 ciclos ACN 5 min, 80 °C, 104 bar 2 ciclos Ace 5 min, 100°C 104 bar 1 ciclo Masa (g) 2.5 0.5 0.5 5 Matriz Cereales Lechuga Judías Calabaza, calabacín Compuestos BPA y otros TCS, BPA y otros TCS, TCB y otros TCS y TCB Capítulo I 71 Tabla 12. Continuación. Referencia Herklotz et al., 2010 Ace: Acetona; ACN: Acetonitrilo; GC-MS/MS: Cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas en tándem; Hex: Hexano; LC-MS/MS: Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem; MeOH: Metanol; MSPD: Microextracción en fase sólida dispersiva; SPE: Extracción en fase sólida. Recuperación (%) 71(zanahoria) 46 (col) LOQ (ng g-1) LOD (ng g-1) 8.12 (zanahori a) 3.13 (col) Determinación cromatográfica LC-MS/MS Limpieza - Condiciones de extracción ACN:H2O (55:85, v/v) 130 °C, 5 min 104 bar 1 ciclo Masa (g) 8 Matriz Col y zanahoria Compuestos TCS y otros Antecedentes 72 4.2.3. Método QuEChERS El método QuEChERS es un método sencillo consistente en una extracción sólido-líquido seguida de limpieza del extracto mediante extracción en fase sólida dispersiva (Perestrelo et al., 2019). Suele aplicarse a muestras con cierto contenido en agua. Inicialmente, el método QuEChERS se empleó en la determinación de pesticidas en frutas y vegetales (Mao et al., 2020; Concha-Meyer et al., 2019; Narenderan et al., 2019). En los últimos años, esta técnica ha ido extendiéndose a otros tipos de compuestos, como los principios activos farmacológicos (Chuang et al., 2015) y micotoxinas (Dong et al., 2019). El disolvente más empleado es el acetonitrilo al que se le añaden sales como NaCl y MgSO4 para aumentar la fuerza iónica y favorecer la transferencia entre la fase acuosa y el acetonitrilo. En la Tabla 13 se muestran las características operacionales y analíticas de los métodos descritos en la literatura para la determinación de los EDCs objeto de estudio en vegetales y fruta. La mayoría de ellos se han desarrollado para la determinación de PFCs, en vegetales (Zhou et al., 2019) y frutas (Sznajder-Katarzynska et al., 2018) y, en menor medida, TCB, BPA y PFCs (Pérez-Ortega et al., 2017), BPA (Cunha y Fernandes, 2013) y BP-1 (Ramos et al., 2020). El acetonitrilo puro, o acidificando con ácido fórmico o ácido acético, ha sido empleado para la extracción de PFCs en muestras de pepino, lechuga, tomate, berenjena y puerro (Zhou et al., 2019) y en muestras de plátano, manzana, naranja, patatas, zanahorias, col y tomates (Sznajder-Katarzynska et al., 2018); BPA en diversos vegetales y frutas (Cunha y Fernandes, (2013)) y PFCs, TCB y BPA en tomate y naranja (Pérez-Ortega et al. (2017). Ramos et al. (2020), propone el empleo de H2O:AcOEt (4:10, v/v) para extraer BP-1 en muestras de tomate. Para la etapa de limpieza, algunos autores proponen la combinación de distintos tipos de sorbentes como PSA y MgSO4 para muestras de tomate y naranja (Pérez-Ortega et al., 2017; Ramos et al. (2020)) o EnviCarb y MgSO4 para muestras de plátano, manzana, naranja, patatas, zanahoria, col y tomates (Sznajder-Katarzynska et al. (2018)). En otros casos se propone una limpieza adicional, tras aplicación del método QuEChERS, mediante microextracción líquido-líquido dispersiva con C2Cl4 (Cunha y Fernandes (2013)). Capítulo I 73 Tabla 13. Resumen de condiciones descritas en la bibliografía para la determinación de los EDCs seleccionados en matrices vegetales mediante QuEChERS. Referencia Zhou et al., 2019 Sznajder- Katarzynska et al., 2018 Pérez- Ortega et al., 2017 Cunha y Fernandes, 2013 Recuperación (%) 55-118 89-97 - 92 LOQ (ng g-1) - 0.006- 0.024 0.3-150 LOD (ng g-1) 0.003- 0.034 0.002- 0.009 - 0.1 Determinación cromatográfica LC-MS/MS UHPLC-MS/MS UHPLCQTOFMS GC-MS Limpieza SPE (PSA + MWCNT) / (C18 +GCB) SALLE- d-SPE (150 mg EnviCarb+ 900 mg MgSO4) d-SPE (250 mg PSA +750 mg MgSO4) DLLME (C2Cl4) Condiciones de extracción ACN 15 mL Ác.fórmico 150uL, 6 g MgSO4 1.5 g NaCl ACN 10 mL Ác.fórmico 150uL, 2.5 min 4g MgSO4 1g NaCl ACN 10 mL HAc 100 uL 4g MgSO4 1g Acetato de sodio ACN 10 mL 4g MgSO4 1g NaCl Masa (g) 15 5 10 10 Matriz Pepino, Lechuga, tomate, berenjena, puerro Plátano, manzana, naranja, patatas, zanahorias, col y tomates Tomate y naranja Vegetales y fruta Compuestos PFBuA, PFPeA, PFHxA, PFHpA, PFOA, PFOS y otros PFBuA, PFPeA, PFHxA, PFHpA, PFOA, PFOS y otros PFBuA, PFPeA, PFHpA, PFOA, PFOS, BPA, TCB BPA Antecedentes 80 methodology. 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Capítulo II Objetivos y plan de trabajo Capítulo III 113 Capítulo III 115 Resumen Artículo 1: En este primer artículo se propuso una metodología analítica para la determinación de seis compuestos perfluorados (cinco ácidos perfluorocarboxílicos (ácido perfluorobutanoico, ácido perfluoropentanoico, ácido perfluorohexanoico, ácido perfluoroheptanoico y ácido perfluorooctanoico) y el ácido perfluorooctanosulfónico), dos plastificantes (bisfenol A y di(2-etilhexil)ftalato, tres tensioactivos no iónicos (nonilfenol y los nonilfenoles mono- y dietoxilados), ocho tensioactivos aniónicos (cuatro alquilsulfatos (dodecil-, tetradecil-, hexadecil- y octadecilsulfato) y cuatro sulfonatos de alquilbenceno lineales (sulfonatos de decil-, undecil-, dodecil- y tridecilbenceno)), cuatro conservantes (metil-, etil-, propil- y bencilparabeno), dos antimicrobianos (triclosán y triclocarban), seis filtros solares (benzofenonas 1, 2, 3, 6 y 8 y 4-hidroxibenzofenona) y cuatro hormonas (estrona, 17β-estradiol, estriol, 17α- etinilestradiol). Los 35 disruptores endocrinos objeto de estudio engloban compuestos químicos de uso industrial y doméstico, productos de cuidado personal y hormonas. La metodología desarrollada consistió en una extracción sólido-líquido mediante ultrasonidos y limpieza del extracto mediante extracción en fase sólida dispersiva. Se seleccionaron ambas metodologías por su sencillez, bajo coste y buenos resultados en la determinación de contaminantes orgánicos en muestras sólidas. Se optimizó el tipo y volumen de disolvente, número de extracciones y tipo y cantidad de sorbente a emplear para la limpieza del extracto. Se optimizó así mismo el método para su determinación cromatográfica tanto en cuanto a las condiciones de separación como a las de determinación mediante espectrometría de masas de triple cuadrupolo. La metodología optimizada se validó en términos de linealidad, límites de detección y cuantificación, precisión y exactitud. Se obtuvieron límites de detección en el rango comprendido entre 0.025-12.5 ng g-1, referidos a materia seca. La precisión del método, expresada en términos de desviación estándar relativa, fue inferior al 19%. La exactitud, expresada en términos de recuperaciones relativas, se encontró en el rango entre 81 y 126 %. La cuantificación se realizó mediante calibrado en matriz. Metodologías desarrolladas para la determinación de disruptores endocrinos en vegetales 116 El método desarrollado se aplicó a la determinación de los contaminantes en lechugas, espinacas, acelgas, zanahorias, nabos y patatas adquiridos en un mercado local. Los compuestos más frecuentemente encontrados fueron el ácido perfluorobutanoico, los sulfonatos de alquilbenceno lineales y el triclosán. Se encontraron diferencias entre vegetales de raíz y de hoja. Por ejemplo, algunos compuestos como los sulfonatos de alquilbenceno lineales y la benzofenona-3, fueron detectados en ambos tipos de vegetales mientras que otros solo se encontraron en vegetales de hoja (benzofenona-2) o de raíz (ácido perfluoropentanoico, nonilfenol, nonilfenol monoetoxilado, alquilsulfatos y di(2-etilhexil)ftalato). El método desarrollado constituyó el primer método analítico publicado para la determinación multiresiduo de diferentes grupos de disruptores endocrinos en vegetales. Capítulo III 117 Capítulo III 141 ARTÍCULO 2 Título: Dispersive liquid-liquid microextraction as a new clean-up procedure for the determination of parabens, perfluorinated compounds, UV-filters, biocides, surfactants, and plasticizers in root vegetables Autores: Concepción Abril, Julia Martín, José Luis Malvar, Juan Luis Santos, Irene Aparicio, Esteban Alonso Afiliación: Departamento de Química Analítica, Escuela Politécnica Superior, Universidad de Sevilla, Sevilla, España. Revista: Analytical and Bioanalytical Chemistry Editorial: Springer Heidelberg Año de publicación: 2018 ISSN: 1618-2642 (Impreso) 1618-2650 (Online) doi: 10.1007/s00216-018-1165-9 Factor de impacto (2018): 3.637 Factor de impacto (5 años): 3.286 Categoría: Analytical Chemistry Posición de la revista en la categoría: 18/84 Cuartil: Q1 Categoría: Biochemical Research Methods Posición de la revista en la categoría: 18/77 Cuartil: Q1 Capítulo III 143 Resumen Artículo 2: En este artículo se propuso una metodología analítica para la determinación de 31 disruptores endocrinos en vegetales de raíz comestible. No se incluyeron las hormonas del primer artículo para centrarlo en disruptores endocrinos presentes en compuestos químicos de uso industrial y/o doméstico (6 compuestos perfluorados (5 ácidos perfluorocarboxílicos (ácido perfluorobutanoico, ácido perfluoropentanoico, ácido perfluorohexanoico, ácido perfluoroheptanoico y ácido perfluorooctanoico) y el ácido perfluorooctanosulfónico)), 2 plastificantes (bisfenol A y di(2-etilhexil)ftalato, 8 tensioactivos aniónicos (4 alquilsulfatos (dodecil-, tetradecil-, hexadecil- y octadecilsulfato) y 4 sulfonatos de alquilbenceno lineales (sulfonatos de decil-, undecil- , dodecil- y tridecilbenceno)), 3 tensioactivos no iónicos (nonilfenol y los nonilfenoles mono- y dietoxilados)) y compuestos presentes en productos de cuidado personal (4 conservantes (metil-, etil-, propil- y bencilparabeno), 6 filtros solares (benzofenonas 1, 2, 3, 6 y 8 y 4-hidroxibenzofenona) y 2 agentes antimicrobianos (triclosán y triclocarbán)). La metodología desarrollada se basó en una extracción asistida por ultrasonidos y una limpieza del extracto mediante microextracción líquido-líquido dispersiva (DLLME). Se seleccionó DLLME como técnica de limpieza por ser una técnica muy rápida, sencilla, de bajo coste y que requiere únicamente de pocos microlitros de disolvente orgánico. Se evaluó la influencia del tipo de disolvente de extracción y tiempo de extracción en la etapa de extracción por ultrasonidos. Se optimizó así mismo el tipo de disolvente de extracción, volúmenes de disolvente extractante y dispersivo, pH y fuerza iónica de la fase acuosa a emplear en la etapa de limpieza del extracto por DLLME. Debido al gran número de variables, niveles a evaluar y analitos se aplicaron diseños experimentales Box-Behnken para poder evaluar, con un reducido número de experimentos, las condiciones experimentales más adecuadas para la extracción y limpieza de extractos. La determinación analítica se realizó mediante cromatografía líquida con detector de espectrometría de masas de triple cuadrupolo. Metodologías desarrolladas para la determinación de disruptores endocrinos en vegetales 144 El método desarrollado se validó en términos de linealidad, límites de detección y cuantificación, recuperación absoluta, precisión y exactitud. Estos tres últimos parámetros se evaluaron a tres niveles de concentración. Se obtuvieron límites de cuantificación en el rango comprendido entre 0.1-25 ng g-1, referidos a materia seca (m.s.), siendo para 26 de los 31 compuestos inferiores a 5 ng g-1 m.s. La precisión del método, expresada en términos de desviación estándar relativa, fue inferior al 18 %. La exactitud, expresada en términos de recuperaciones relativas, fue superior al 82 %. La cuantificación se realizó mediante el método de calibrado en matriz. El método desarrollado se aplicó a muestras de zanahorias, patatas y nabos procedentes de un mercado local. Se analizaron cuatro muestras de cada tipo. El triclocarbán, los tensioactivos aniónicos y el nonilfenol-dietoxilado fueron detectados en todas las muestras analizadas, correspondiendo las concentraciones más elevadas a los tensioactivos aniónicos. El método desarrollado constituyó el primer método analítico para la determinación multiresiduo de contaminantes en vegetales empleando DLLME como técnica de limpieza. Capítulo IV  Resue Artíulo : E este atíulo se popuso ua etodología aalítia paa la deteiaió de  disuptoes edoios: otaiates idustiales ete los ue se ilue seis opuestos pefluoados io áidos pefluooaoílios áido pefluooutaoio, áido pefluopetaoio, áido pefluoheaoio, áido pefluoheptaoio  áido pefluoootaoio  el áido pefluoootaosulfóio, u plastifiate isfeol A, uato tesioativos aióios uato aluilsulfatos dodeil-, tetadeil-, headeil-  otadeilsulfato  opuestos pesetes e podutos de uidado pesoal, ete ellos uato osevates etil-, etil-, popil-  eilpaaeo, dos atiioiaos tilosá  tiloaá  seis filtos solaes ezofeoas , , ,     -hidoiezofeoa. No se ilueo los tesioativos sulfoatos de aluileeo lieales  oilfeoles i el plastifiate di- etilheilftalato, iluidos e las etodologías e platas, po se opuestos apliaete estudiados e lodos de depuadoa  suelos. La etodología desaollada osistió e ua etaió sólido-líuido ediate ultasoidos, lipieza del etato ediate etaió e fase sólida dispesiva  deteiaió aalítia ediate oatogafía líuida o deteto de espetoetía de asas de tiple uadupolo. Se optiizó el tipo  volue de disolvete, úeo de etaioes  tiepo de etaió a eplea e la etapa de etaió,  el tipo  atidad de soete epleado e la etapa de lipieza del etato. Se optiizao así iso las odiioes paa la sepaaió  deteiaió oatogáfia. Los paáetos aalítios evaluados fueo liealidad, eupeaioes asolutas, líites de deteió  uatifiaió, peisió  eatitud. Se epleao paa ello uestas dopadas de suelo, lodo digeido  lodo opostado. Se otuvieo líites de deteió e el ago opedido ete .-. g g-, efeidos a ateia sea. La peisió del étodo, epesada e téios de desviaió estáda elativa, fue ifeio al %. Se Metodología para la determinación de disruptores endocrinos en suelos y lodos de depuradora  otuvieo valoes de eatitud, epesada e téios de eupeaioes elativas, e el ago ete -%. La uatifiaió se ealizó ediate aliado e atiz. La apliailidad del étodo se veifió ediate su apliaió a la deteiaió de los opuestos ojeto de estudio e uestas de suelo, lodo digeido aaeóiaete  lodo opostado. Los opuestos ás feueteete eotados,  a aoes iveles de oetaió, fueo los tesioativos aióios, e oeto el dodeilsulfato sódio, ue fue detetado e todas las uestas aalizadas. El étodo popuesto ostituó la piea etodología desaollada paa la deteiaió de los opuestos ojeto de estudio e lodo digeido, opostado  suelo. Capítulo IV  Journal of Chromatography A, 1576 (2018) 34–41 Contents lists available at ScienceDirect Journal of Chromatography A jo ur nal ho me pag e: www.elsevier.com/locate/chroma Determination of perfluorinated compounds, bisphenol A, anionic surfactants and personal care products in digested sludge, compost and soil by liquid-chromatography-tandem mass spectrometry Concepción Abril, Juan Luis Santos, José Luis Malvar, Julia Martín, Irene Aparicio∗, Esteban Alonso Department of Analytical Chemistry, Escuela Politécnica Superior, University of Seville, C/Virgen de África, 7, E–41011 Seville, Spain a r t i c l e i n f o Article history: Received 16 May 2018 Received in revised form 17 July 2018 Accepted 15 September 2018 Available online 17 September 2018 Keywords: Emerging concern pollutants Digested sludge Compost Soil Dispersive solid-phase extraction Liquid chromatography-tandem mass spectrometry a b s t r a c t A method for the determination of 23 emerging concern pollutants in digested sludge, compost and soil has been developed. Target pollutants include six perfluorinated compounds (5 perfluorocarboxylic acids and perfluorooctanesulfonic acid), the plasticizer bisphenol A, four anionic surfactants (sodium alkylsulfates), four preservatives (parabens), two antimicrobial agents (triclosan and triclocarban) and six UV-filters (benzophenones). Sample treatment was based on ultrasound-assisted extraction with 3 mL of methanol:acetic acid (95:5, v/v) and clean-up by dispersive solid-phase extraction (d-SPE) with C18. Analytical determination was carried out by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Extraction solvent, sonication time, number of extraction cycles and type and amount of d-SPE sorbent were optimized. Due to the physical-chemical properties of target compounds, and the high number of sample treatment variables involved, a Box-Behnken design was applied to method optimization. The method was validated by means of spiked samples. Method detection limits were in the range from 0.01 to 6.2 ng g−1dry matter. Accuracy and precision were evaluated at three spike levels in each type of sample matrix. Accuracy, expressed as relative recovery, was in the range from 70% to 120% for most of the compounds and spike levels. Precision, expressed as relative standard deviation, was equal or below 21%. To the best of our knowledge, the proposed method constitute the first analytical method for multiclass determination of emerging pollutants in digested sludge, compost and soils. © 2018 Elsevier B.V. All rights reserved. 1. Introduction Perfluorinated compounds, surfactants, plasticizers, preservatives, biocides and UV-filters are pollutants of emerging concern that have been identified in ground water and surface water [1]. They are present in everyday products, such as household chemicals and personal care products, therefore, they can end up in the aquatic media and, in river sediments, through wastewater discharges from wastewater treatments plants (WWTP). In Europe, a directive draft entitled Working Document on Sludge [2], recommends the application of treated sewage sludge, it is, digested sludge or compost from urban WWPTs, on land whenever possible because of its nutrient and organic matter content. To prevent from harmful effects on soil and vegetation, the current European Sewage Sludge Directive, Directive 86/278/EEC on agricultural use of sewage sludge, sets limit values for seven heavy metals, but no ∗ Corresponding author. E-mail address: [email protected] (I. Aparicio). limits for organic pollutants have been fixed yet. Therefore, emerging pollutants present in wastewater could end up in soils fertilized with sewage sludge or irrigated with reclaimed wastewater [3]. Because of that, in the last years, an increasing concern has arisen about health and environmental risks due to emerging pollutants when sewage sludge is applied onto agricultural soils [3,4]. To the date, the analytical determination of emerging pollutants in environmental samples has mainly been carried out in liquid samples such as wastewater, surface water and ground water [5] Nevertheless, their determination in solid matrices, such as sludge and soil, has been scarcely investigated probably due to matrix complexity. Moreover, analytical methods reported for the determination of such compounds in solid matrices have been developed mainly for the determination of pharmaceutical compounds and, in the last years, also for the determination of personal care products [3,6]. Ultrasound-assisted extraction (UAE) [7–12] and pressurized liquid extraction (PLE) [9,13–16] are the extraction techniques most commonly applied to the determination of the household chemicals and personal care products in sewage sludge and soils. Other extraction techniques applied, in a lower https://doi.org/10.1016/j.chroma.2018.09.028 0021-9673/© 2018 Elsevier B.V. All rights reserved. Presencia y distribución de disruptores endocrinos en lodos de depuradora Capítulo V En este capítulo se hace un estudio de la presencia y comportamiento de los disruptores endocrinos en diferentes tecnologías de estabilización de lodos de depuradora. Así mismo, se hace una evaluación de los riesgos medioambientales que dichos contaminantes presentan tanto en el lodo de depuradora como en suelos enmendados con lodos de depuradora. Los resultados de estos estudios dieron lugar al siguiente artículo científico: 4. C. Abril, J.L. Santos, J. Martín, I. Aparicio, E. Alonso. 2020. Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments. Science of the Total Environment 711, 135048. Capítulo V 197 ARTÍCULO 4 Título: Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments Autores: Concepción Abril, Juan Luis Santos*, Julia Martín, Irene Aparicio, Esteban Alonso Afiliación: Departamento de Química Analítica, Escuela Politécnica Superior, Universidad de Sevilla, Sevilla, España. Revista: Science of the Total Environment Editorial: Elsevier Science BV Año de publicación: 2020 ISSN: 0048-9697 (Impreso) 1879-1026 (Online) doi: 10.1016/j.scitotenv.2019.135048 Factor de impacto (2019): 6.551 Factor de impacto (5 años): 6.419 Categoría: Environmental Sciences Posición de la revista en la categoría: 22/265 Cuartil: Q1 Capítulo V 199 Resumen Artículo 4: En este artículo, se recoge la aplicación de la metodología desarrollada a la determinación de disruptores endocrinos en lodos de depuradora. Se analizaron lodos primarios, lodos secundarios y lodos digeridos anaeróbicamente procedentes de cuatro plantas basadas en digestión anaerobia; lodo compostado procedente de una planta de compostaje de lodos digeridos anaeróbicamente; lodos mixtos y digeridos aeróbicamente procedentes de dos plantas de tratamiento aerobio; y lodo procedente de tres lagunas de digestión anaerobia. Las concentraciones más elevadas encontradas correspondieron a los alquilsulfatos. Dichos compuestos fueron además lo que se encontraron a mayores concentraciones en todos los tipos de lodos analizados. Se observaron diferentes pautas de comportamiento para los contaminantes objeto de estudio motivadas por sus diferentes propiedades físico-químicas, en especial valores de log Kow y pKa, además de las propiedades del lodo que condicionaron la retención de los contaminantes por interacciones hidrofóbicas y/o electrostáticas y su biodisponibilidad. Aquellos más retenidos en lodo, y por tanto menos biodisponibles, demostraron ser más difícilmente eliminables mediante digestión. La digestión anaerobia resultó más efectiva para la eliminación de la mayoría de los contaminantes con excepción de los compuestos perfluorados y el bisfenol A cuyas concentraciones si se vieron reducidas tras el compostado de los lodos digeridos anaeróbicamente. En el proceso de digestión aerobia se observaron pautas de comportamiento diferentes para compuestos de la misma familia como los alquilsulfatos, mientras que la concentración de los alquilsulfatos de cadena corta disminuyó tras el proceso de digestión, la concentración de los de cadena más larga se vio incrementada. Se realizó una evaluación de los riesgos ecotoxicológicos en dos posibles escenarios: los riesgos ecotoxicológicos en el lodo generado en cada tipo de tratamiento de estabilización y los riesgos generados en suelos tratados con dichos lodos. Todos los disruptores endocrinos objeto de estudio, salvo uno de los agentes antimicrobianos, el triclocarbán, y el tensioactivo octadecilsulfato, revelaron presentar riesgos Capítulo VI 229 Resumen Artículo 5: En este artículo, se evaluó la asimilación y translocación de los disruptores endocrinos en rábanos (Raphanus sativus) sembrados en un suelo típico mediterráneo enmendado con lodo compostado. Los estudios se hicieron en condiciones climáticas controladas. El lodo fue dopado con los compuestos objeto de estudio: seis compuestos orgánicos perfluorados (PFCs), cuatro alquilsulfatos (ASCs), bisfenol A (BPA), cuatro conservantes, dos biocidas y cinco filtros UV. Tras 14 semanas de crecimiento, se recolectaron los rábanos y se analizó raíz, piel e interior del bulbo, tallos y hojas. Así mismo se analizó el suelo y el suelo adherido a la raíz. Para la mayoría de compuestos, las concentraciones medidas en el suelo al final del estudio fueron inferiores a las medidas al inicio de los ensayos. Además, este comportamiento fue similar para cada una de las familias de compuestos estudiadas; excepto en el caso del PFOS, cuya concentración se vio reducida en un 69 %, frente a la reducción de entre el 77 y el 95 % del resto de compuestos. La degradación de los ASCs fue superior a medida que aumentaba longitud de su cadena alquílica. La degradación de los compuestos producida en el suelo adherido a la raíz fue más elevada, y presentó un comportamiento diferente entre unas familias de compuestos y otras. Los compuestos más recalcitrantes fueron los PFCs, los surfactantes aniónicos y el biocida triclocarban (TCB).Los PFCs y el AS-C12 fueron detectados en todas las partes de la planta analizadas, además de presentar un alto factor de bioconcentración (BCF). En el caso de los ASCs, los BCFs disminuyeron a medida que aumentaba la longitud de la cadena alquílica del compuesto. Los compuestos no iónicos, a excepción del TCB, se acumularon principalmente en el bulbo del rábano, aunque a concentraciones bajas, debido posiblemente a su metabolización en la planta. Dinámica de disruptores endocrinos en el sistema suelo-planta bajo condiciones controladas 230 Los resultados obtenidos en este estudio ponen de manifiesto por primera vez la asimilación y translocación por plantas de disruptores endocrinos de diferentes familias presentes en el suelo. Además, pone de manifiesto que las propiedades físico-químicas de los contaminantes afectan no solo a su asimilación y translocación sino también a su metabolización en la planta. Capítulo VI 231 Conclusiones Conclusiones 253 CONCLUSIONES La revisión del estado del arte sobre disruptores endocrinos en el medioambiente y en particular en el sistema suelo-planta ha puesto de manifiesto la llegada continua e inevitable de estos contaminantes, procedentes de fuentes domésticas e industriales, a los suelos agrícolas, como consecuencia de la aplicación de lodos de depuradora al suelo o del riego con aguas residuales tratadas. Además, ha evidenciado la falta de metodologías analíticas validadas y fiables que permitan la monitorización de disruptores endocrinos en lodos de depuradora, suelos y vegetales de consumo humano y, como consecuencia de ello, el desconocimiento de la distribución de estos contaminantes en las diferentes tecnologías de estabilización de lodos empleadas habitualmente en el tratamiento de este tipo de residuos, y en el sistema sueloplanta. Se ha desarrollado una metodología analítica que permite la determinación fiable de 35 disruptores endocrinos, incluyendo compuestos orgánicos perfluorados, surfactantes, conservantes, biocidas, plastificantes, filtros ultravioleta y hormonas, en vegetales de consumo humano. El método se basó en extracción en fase sólida, limpieza del extracto empleando extracción en fase sólida dispersiva y determinación mediante cromatografía líquida con detector de espectrometría de masas de triple cuadrupolo. Para todos los compuestos la exactitud, expresada en unidades de recuperación, fue superior al 81 %, los límites de detección y cuantificación se situaron entre 0.025 y 0.050 ng g-1 ms y 0.083 y 0.167 ng g-1 ms, respectivamente. La aplicabilidad del método se comprobó mediante el análisis de vegetales del consumo humano, de hoja o raíz comestible (lechuga, espinaca, acelgas, zanahoria, nabos y patatas). Se desarrolló un nuevo método, basado en el tratamiento de las muestras mediante extracción asistida por ultrasonidos y limpieza de los extractos mediante microextracción líquida dispersiva, para la extracción de los disruptores endocrinos seleccionados en vegetales de raíz. Este método mejoró, en términos de rapidez, economía y sencillez, los métodos analíticos desarrollados hasta la fecha para el análisis de disruptores endocrinos en este tipo de muestras. La exactitud del método fue superior al 82 %, su precisión inferior al 18 %, y los límites de cuantificación inferiores a 5 ng g-1 para la mayoría de compuestos. Para 23 de los disruptores endocrinos inicialmente seleccionados, y por su especial relevancia en lodos y suelos, se desarrolló y validó un método multiresiduo, basado en la extracción de los Conclusiones 254 contaminantes empleando extracción asistida por ultrasonidos, limpieza de los extractos mediante extracción en fase sólida dispersiva y determinación empleando cromatografía líquida con detector de espectrometría de masas de triple cuadrupolo. Los disruptores endocrinos seleccionados fueron seis compuestos orgánicos perfluorados, cuatro surfactantes, cuatro conservantes, dos biocidas, un plastificante y seis filtros UV. Los parámetros de validación del método, como la exactitud, situada entre el 70 y el 120 %; la precisión, inferior al 21 %; y límites de detección, inferiores a 6.2 ng g-1 ms, hacen que sea un método adecuado para el análisis rutinario de estos disruptores endocrinos en lodos y suelos y útil para el seguimiento de la distribución de estos compuestos en los procesos de estabilización de lodos, en los suelos tratados con estos lodos y en la evaluación de riesgos asociada a su presencia en suelos. La monitorización de disruptores endocrinos en los procesos de estabilización de lodos permitió conocer la distribución de estos contaminantes en las tecnologías más habitualmente aplicadas al tratamiento de lodos de depuradora. Las mayores concentraciones se encontraron en el caso de los surfactantes. Se observó un comportamiento diferenciado en función del tipo de contaminante y tratamiento aplicado al lodo. La evaluación de riesgos mostró la posible influencia de estos contaminantes sobre los microorganismos responsables del proceso de digestión del lodo, mientras que tales riesgos se ven reducidos una vez que estos lodos son aplicados al suelo. Los estudios del comportamiento de los disruptores endocrinos en el sistema suelo-planta pusieron de manifiesto una degradación de los contaminantes en el suelo. Esta degradación fue similar para todos los compuestos. Sin embargo, en el suelo adherido a la raíz se observó una mayor degradación y un comportamiento diferente de los distintos grupos de disruptores endocrinos. Los más recalcitrantes fueron los compuestos perfluorados, tensioactivos aniónicos y triclocarbán. En el estudio de bioacumulación y translocación en la planta se observó una gran diferencia de un grupo de compuestos a otros. Los compuestos con un mayor factor de bioacumulación y translocación fueron los compuestos perfluorados. Estos compuestos fueron encontrados en todos los tejidos medidos en la planta. Los plastificantes, conservantes, triclosán y filtros-UV fueron detectados a muy bajas concentraciones, o incluso no fueron detectados en ninguno de los tejidos analizados. Este hecho, no observado para el triclocarbán, puso de manifiesto una posible metabolización de los contaminantes fenólicos una vez asimilados por la planta tal y como habían descrito otros autores.