Identification, Abundance and Rearing of Mysids of Gran Canaria: aplication to laboratory and oceanographic respiratory metabolism studies

D.ª ISABEL PADILLA LEÓN SECRETARIA DE LA FACULTAD DE CIENCIAS DEL MAR DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA, CERTIFICA, Que el Consejo de Doctores de la Facultad de Ciencias del Mar en su sesión de fecha …………………………….. tomó el acuerdo de dar el consentimiento para su tramitación a la tesis doctoral titulada: “Identification, Abundance and Rearing of Mysids from Gran Canaria: Application to Laboratory and Oceanographic Respiratory Metabolism Studies” presentada por la doctoranda D.ª Alicia Herrera Ulibarri y dirigida por los Doctores D.ª María M. Gómez Cabrera y D. Ted Packard. Y para que así conste, y a efectos de los previsto en el Artº 6 del Reglamento para elaboración, defensa, tribunal y evaluación de tesis doctorales de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, firmo la presente en Las Palmas de Gran Canaria, a ………… de …………………. de 2013. Fdo.: D.ª Isabel Padilla León Facultad de Ciencias del Mar Universidad de las Palmas de Gran Canaria Tesis Doctoral Programa de Doctorado en Oceanografía Facultad de Ciencias del Mar Identification, Abundance and Rearing of Mysids from Gran Canaria: Application to Laboratory and Oceanographic Respiratory Metabolism Studies (Identificación, abundancia y cultivo de misidáceos de Gran Canaria: aplicación en estudios de laboratorio y oceanográficos de metabolismo respiratorio) Memoria presentada por D.ª Alicia Herrera Ulibarri para la obtención del Doctorado en Oceanografía en la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria y dirigida por los Doctores D.ª María M. Gómez Cabrera y D. Ted Packard. Universidad de Las Palmas de Gran Canaria En Las Palmas a de de La Doctoranda Fdo: D.ª Alicia Herrera Ulibarri La Directora El Codirector Fdo:Dra. María M. Gómez Cabrera Fdo:Dr.Ted Packard Identification, Abundance and Rearing of Mysids from Gran Canaria: Application to Laboratory and Oceanographic Respiratory Metabolism Studies TESIS DOCTORAL Alicia Herrera Ulibarri Doctorado en Oceanografía Facultad de Ciencias del Mar Universidad de las Palmas de Gran Canaria Septiembre 2013 xii Agradecimientos estarán para apoyarme en todos mis proyectos. A mi padre por enseñarme dos cosas fundamentales: a reírme mucho de todo, especiamente de mí; y a diferenciar cuál es el verdadero éxito. A mi familia de aquí: Lau, Fabio, Gara, Caro, Fede, Maite y Marco. A todo el “equipo”, especialmente a Ico, Igor y Nat por las largas horas compartidas haciendo ETS. A mis compañeros del laboratorio B-201. A las personas que me han brindado sus conocimientos en distintas áreas desinteresadamente: Fran Otero, Lucía Molina, Fernando Tuya, Tony Sánchez, Fernando Espino, Mariluz Fernández, Lutz Postel y Angelo Santana. A la Dra. Carmen Barberá y el Dr. Karl Wittmann por su inestimable ayuda en la identificación taxonómica. A Carlos por el diseño de las portadas y sobretodo por su infinita paciencia en las semanas mas duras de la tesis. Y finalmente a Fofi, por aguantar hasta el final, sin él todo esto no hubiese sido posible. Resumen Los misidáceos son crustáceos peracáridos que tienen una gran relevancia ecológica, sobre todo en zonas costeras donde son muy abundantes. En los últimos tiempos ha aumentado el interés en su estudio debido a su importancia en la cadena trófica ya que son el principal alimento de muchos peces costeros, especialmente juveniles. Son uno de los principales componentes del suprabentos, y recientemente se ha demostrado que intervienen en la remineralización de una gran parte de los detritos y en la regeneración de nitrógeno. A pesar de su importancia, hasta la actualidad no se habían llevado a cabo estudios sobre la abundancia de estos organismos en Gran Canaria. La presente tesis supone un avance en el conocimiento de las especies que habitan la costa de Gran Canaria, particularmente en los “sebadales” o praderas de Cymodocea nodosa. Estos estudios han puesto de manifiesto el importante papel que juegan los misidáceos en estos ecosistemas, así como también la necesidad de preservar su hábitat. El cultivo de dos especies de misidáceos y el análisis de su calidad nutricional demuestran que son un alimento de excelente calidad para ser utilizado como presa viva de peces y cefalópodos. Estos estudios también son un primer paso en la línea de investigación de nuevas especies en el campo de la acuicultura. Los estudios del metabolismo respiratorio de L. lingvura, una de las especies de misidáceos que ha sido cultivada exitosamente en nuestras instalaciones, han permitido importantes descubrimientos en el campo de la ecofisiología del zooplancton. Se ha demostrado que factores como la inanición afectan a la respiración pero no a la actividad del sistema de transporte de electrones (ETS), por lo tanto la relación R/ETS se ve afectada de la misma xiii xiv Resumen forma que la respiración. Asimismo, se ha comprobado que la disponibilidad de alimento a largo plazo afecta a la relación ETS-biomasa. Estos resultados han posibilitado la mejora en la interpretación de los datos obtenidos con la técnica ETS y han sido aplicados en investigaciones oceanográficas de suprabentos y zooplancton en las que se han corroborado los resultados obtenidos con misidáceos de cultivo. Abtract Mysids are peracarida crustaceans with a highly relevant ecological role, especially in coastal areas where they are abundant. Lately mysids have become topical because of their importance in the food chain; they are the main food for many coastal fish, especially in their juvenile stages. In addition, mysids are one of the principal components of suprabenthos, and have recently been shown to remineralize a large portion of detritus and to regenerate inorganic nitrogen salts. Despite their importance, until now there have been few studies on the abundance of mysids in the waters off Gran Canaria. This thesis advances our knowledge of Canary Island mysid species especially those that inhabit the coastal Cymodocea nodosa seagrass meadows of Gran Canaria. It highlights the important role of mysids in these coastal waters, as well as the need to preserve their habitat. The cultivation of two species of mysids and a study of their nutritional quality shows that they are an excellent food to be used as live prey for fish and cephalopods. This part of the thesis is the first step in the research of new zooplankton species for aquaculture. Studies of the respiratory metabolism of L. lingvura, one of the species of mysids that has been grown successfully in our laboratory, have led to significant discoveries in zooplankton ecophysiology. They have shown that factors such as starvation affect the respiration, but not the electron transport system (ETS) activity. Consequently, the relationship, R/ETS, is affected in parallel with the effect on respiration. It was also found that the long-term availability of food affects the ETSbiomass relationship. xv xvi Abstract These results have facilitated the interpretation of ETS measurements and have been applied in zooplankton and suprabenthos oceanographic research corroborating results obtained on cultured mysids. Índice Agradecimientos xi Resumen xiii Abtract xv 1. Introducción General 1 1.1. Antecedentes ............................. 1 1.2. Objetivos ............................... 23 1.2.1. Capítulo2 .......................... 23 1.2.2. Capítulo3 .......................... 23 1.2.3. Capítulo4 .......................... 23 1.2.4. Capítulo5 .......................... 24 1.2.5. Capítulo6 .......................... 24 1.2.6. Capítulo7 .......................... 24 1.3. Principales resultados obtenidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 1.3.1. Capítulo 2: Identificación de misidáceos presentes en la costa de Gran Canaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 1.3.2. Capítulo 3: Abundancia de los misidáceos asociados a praderas de Cymodocea nodosa .............. 30 1.3.3. Capítulo 4: Estudio de las técnicas de cultivo y análisis de la calidad nutricional en misidáceos presentes en la costa de Gran Canaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 1.3.4. Capítulo 5: Efecto de la inanición y la alimentación en el metabolismo respiratorio de Leptomysis lingvura (G.O. Sars, 1866) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 xvii xviii Índice 1.3.5. Capítulo 6: Aplicación de la técnica ETS en crustáceos suprabentónicos de profundidad: respiración, demanda de carbono y relación ETS-biomasa . . . . . . . . . . . 38 1.3.6. Capítulo 7: Aplicación de la técnica ETS en zooplancton: respiración, demanda de carbono y relación ETSbiomasa............................ 40 1.4. Discusión general . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 1.5. Futuras líneas de investigación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 2. Identification of mysids off the coast of Gran Canaria 49 2.1. Introduction.............................. 49 2.2. Material and Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 2.2.1. Sampling method . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 2.2.2. Taxonomic study . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 2.2.3. Genetic study . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 2.3. Results................................. 60 2.3.1. Siriella armata (Milne-Edwards, 1837) . . . . . . . . . 60 2.3.2. Leptomysis sp. aff heterophila sensu Wittmann and Wirtz, 1998.............................. 64 2.3.3. Leptomysis lingvura ssp. sensu Wittmann and Wirtz, 1998............................... 67 2.3.4. Paramysis arenosa (G.O. Sars, 1877) . . . . . . . . . . 71 2.3.5. Anchialina agilis (G.O. Sars, 1877) . . . . . . . . . . . . 75 2.3.6. Gastrosaccus roscoffensis (Bacescu, 1970) . . . . . . . . 79 2.4. Discussion............................... 82 3. Abundance of mysids (Crustacea Mysidacea) associated with Cymodocea nodosa seagrass meadows. 85 3.1. Introduction.............................. 86 3.2. Material and Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 3.2.1. Sampling method . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 3.2.2. Statistical Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 3.3. Results................................. 89 3.3.1. Suprabenthos assemblage . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 3.3.2. Mysids assemblage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 3.4. Discussion............................... 98 Índice xix 4. Rearing techniques and nutritional quality of two mysids from Gran Canaria (Spain) 101 4.1. Introduction.............................. 102 4.2. Material and Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 4.2.1. Survival and production experiments . . . . . . . . . . 103 4.2.2. Nutritional quality experiments . . . . . . . . . . . . . . 104 4.2.3. Statistical analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 4.3. Results................................. 105 4.3.1. Survival and production experiment . . . . . . . . . . . 105 4.3.2. Nutritional quality experiments . . . . . . . . . . . . . . 108 4.4. Discussion............................... 113 5. Effect of starvation and feeding on respiratory metabolism in Leptomysis lingvura (G.O. Sars, 1866) 117 5.1. Introduction.............................. 118 5.2. Materials and Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 5.2.1. Collection and laboratory maintenance . . . . . . . . . 120 5.2.2. Effect of starvation on respiratory metabolism . . . . . 120 5.2.3. Effect of feeding conditions on the respiratory metabolismbiomass relationship . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 5.2.4. ETS activity determination . . . . . . . . . . . . . . . . 121 5.2.5. Statistical analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 5.3. Results................................. 122 5.3.1. Effect of starvation on respiratory metabolism . . . . . 122 5.3.2. Effect of feeding conditions on the respiratory metabolismbiomass relationship . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 5.4. Discussion............................... 133 5.5. Conclusions .............................. 136 6. Application of ETS analysis in the estimation of respiratory metabolism in deep-sea suprabenthic crustaceans 137 6.1. Introduction.............................. 138 6.2. Material and Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 6.2.1. Study area and sampling methods . . . . . . . . . . . . 141 6.2.2. ETS analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143 6.2.3. Statistical analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144 xx Índice 6.3. Results................................. 144 6.3.1. Characterization of sampling area . . . . . . . . . . . . 144 6.3.2. Biomass, ETS activity and specific ETS activity . . . 147 6.3.3. Relationship between ETS activity and protein biomass 151 6.3.4. Carbon Demand . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153 6.4. Discussion............................... 153 6.5. Conclusions .............................. 158 7. Application of ETS analysis in the calculation of carbon demand and the role of zooplankton in the Balearic coastal ecosystem 161 7.1. Introduction.............................. 162 7.2. Material and Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164 7.2.1. Study area and sampling methods . . . . . . . . . . . . 164 7.2.2. Hydrographic data . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165 7.2.3. ETS analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165 7.2.4. Statistical analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166 7.3. Results................................. 166 7.3.1. Hydrographic data . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166 7.3.2. Zooplankton biomass and ETS activity . . . . . . . . . 166 7.4. Discussion............................... 181 Conclusiones generales 185 Bibliografía 189 Índice de figuras 1.1. Hembra de misidáceo con embriones en el marsupio. . . . . . . 3 1.2. Desarrollo embrionario en Leptomysis lingvura. E1-E4 estadío embrionario, N1-N4 estadío nauplioide, P2 estadío postnauplioide. Tomado de Wittmann (1981). . . . . . . . . . . . . . . 4 1.3. Plano del sistema de recirculación de agua de mar para el cultivo de misidáceos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 1.4. Sistema de recirculación de agua de mar para el cultivo de misidáceos. .............................. 11 1.5. Acuarios de misidáceos con un sifón para separar adultos y juveniles................................. 12 1.6. Secuencia genética del extremo 3’ de Paramysis arenosa de 598 pares de bases (bp). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 1.7. Tasa de crecimiento en biomasa proteica en L. lingvura hasta eldía60devida............................ 17 1.8. Tasa de ingestión en L. lingvura en función de la concentración de Artemia .............................. 18 1.9. Ciclo de Krebs, fosforilación oxidativa y sistema de transporte de electrones. Tomado de Packard (1985). . . . . . . . . . . . . 19 1.10. Reducción del INT a formazan. Según Packard (1985). . . . . 21 1.11. Fondo de arena y rocas en el veril de Risco Verde en la costa deGranCanaria............................ 28 1.12. Fondo de arena y praderas de Cymodocea nodosa en la costa deGranCanaria............................ 29 2.1. Map of Gran Canaria showing sampling areas. 1. Veneguera 2. Risco Verde 3. Roque de Arinaga 4. Faro de Arinaga 5. Playa delCabron. .............................. 55 xxi Capítulo 1 Introducción General 1.1. Antecedentes Los misidáceos son pequeños organismos pertenecientes al filum Arthropoda, subfilum Crustacea. Actualmente no se clasifican dentro de un mismo orden, sino que pertenecen a tres órdenes diferentes (Lophogastrida, Mysida, Stygiomysida) según Anderson (2010a) o a dos órdenes (Lophogastrida y Mysida) según la clasificación de crustáceos publicada por Zhang (2011) dentro del superorden Peracarida. Son un grupo altamente adaptativo, la mayoría son marinos, aunque existen unas pocas especies de agua dulce. Habitan distintos ambientes, la columna de agua, justo sobre el sustrato o dentro de él, o en cuevas submarinas (Murano, 1999). Diversos estudios demuestran que los misidáceos son un importante componente de la cadena trófica, especialmente en zonas costeras donde son muy abundantes. Son alimento de peces, cefalópodos y ballenas, sin embargo, durante muchos años se ha subestimado la importancia de este grupo debido principalmente a que las redes tradicionales de plancton o bentos han resultado no ser eficaces para su captura (Mauchline, 1980). La mayoría de los misidáceos costeros realizan una migración vertical, ascendiendo y dispersándose en la columna de agua durante la noche, y descendiendo durante el día (Mauchline, 1980; Murano, 1999). Son rápidos nadadores y se agrupan en “enjambres”, lo que dificulta muchas veces los estudios de abundancia. Se han diseñado diversos métodos específicos para su cap1 2Capítulo 1. Introducción General tura que incluyen redes de mano, patines bentónicos y bombas de succión, dependiendo del hábitat. La variedad de ambientes que han colonizado hace que exploten una gran diversidad de recursos, y por lo tanto, que presenten distintos tipos de apéndices para la alimentación. Por lo general son omnívoros, en el contenido estomacal de especies costeras se han encontrado detritos, restos de diatomeas, tintínidos y cuerpos y apéndices de otros crustáceos (Mauchline, 1980; Murano, 1999). Al igual que otros crustáceos peracáridos, las hembras presentan un marsupio donde se lleva a cabo el desarrollo de los embriones, cuando los misidáceos emergen de este marsupio tienen una forma similar a la de los adultos en miniatura (Figura 1.1). El desarrollo se divide en tres etapas que están marcadas por la puesta y dos mudas. Las etapas del desarrollo marsupial en misidáceos según Mauchline (1980) son: Estadío I: “huevo”, durante este período el embrión podría asemejarse a la estructura de un huevo. Posteriormente aparecen rudimentos de antenas y comienza el desarrollo del abdomen. Estadío II: comienzan a desarrollarse antenas y apéndices torácicos y los ojos comienzan a pigmentarse. Esta etapa finaliza con una muda. Estadío III: la larva presenta ojos pedunculados. No presenta estatolito en la vesícula del estatocisto. Esta etapa termina con una muda en el momento de la eclosión o inmediatamente después de la misma. Wittmann (1981), en un extenso trabajo sobre el desarrollo marsupial en Leptomysis lingvura y otras especies mediterráneas, propone una nueva terminología para las mencionadas tres etapas: estadío embrionario (embryonic stage), estadío nauplioide (nauplioid stage) y estadío postnauplioide (postnauplioid stage), cada uno con subdivisiones que se corresponden a importantes cambios morfológicos (Figure 1.2). El tiempo de desarrollo marsupial en L. lingvura a 16°C es 0-4.6 días para el estadío embrionario, 4.6-11.2 días para el nauplioide y 11-12 días para el postnauplioide. La duración del desarrollo en el marsupio varía según cada especie y depende de la temperatura ambiental (Mauchline, 1980). Por ejemplo en Neomysis intermedia el tiempo de desarrollo en el marsupio varía entre 7 y 1.1. Antecedentes 3 Figura 1.1: Hembra de misidáceo con embriones en el marsupio. 15 días dependiendo de la temperatura del agua (Murano, 1999). Después de la eclosión y la subsiguiente muda los misidáceos se encuentran en la fase juvenil. Uno de los fenómenos más destacables dentro de esta etapa es la formación de los estatolitos dentro de la cámara del estatocisto, completando así su desarrollo. A partir de este momento los juveniles tienen la forma de un adulto en miniatura pero sin los caracteres sexuales secundarios desarrollados. 4Capítulo 1. Introducción General Figura 1.2: Desarrollo embrionario en Leptomysis lingvura. E1-E4 estadío embrionario, N1-N4 estadío nauplioide, P2 estadío postnauplioide. Tomado de Wittmann (1981). 1.1. Antecedentes 5 En Gran Canaria, los estudios realizados hasta el momento donde se hayan identificado misidáceos son: el estudio de Castro (1995), que identifica varias especies de misidáceos a partir de restos encontrados en el contenido estomacal de Scomber japonicus, un primer inventario llevado a cabo por Wittmann and Wirtz (1998) que identifica algunas de las especies costeras, el trabajo de Wittmann et al. (2003) sobre especies epi y batipelágicas, el catálogo de especies planctónicas (Soldevilla et al., 2006) y el primer registro de Gastrosaccus roscoffensis publicado recientemente por Wittmann et al. (2010). Según Wittmann and Wirtz (1998) y Wittmann et al. (2010), las especies costeras de misidáceos citadas para el Archipiélago Canario son 18, de las cuales 9 están citadas para Gran Canaria (marcadas con asterisco): Orden Mysida Haworth, 1825 Familia Mysidae Haworth, 1825 Subfamilia Siriellinae Czerniavsky, 1882 Siriella armata (Milne-Edwards, 1837)∗ Siriella claussi (G.O. Sars, 1877) Siriella gracilipes (Nouvel, 1942) Subfamilia Gastrosaccinae Norman, 1892 Anchialina agilis (G.O. Sars, 1877) Gastrosaccus sanctus (Van Beneden, 1861)∗ Gastrosaccus roscoffensis (Bacescu, 1970)∗ Haplostylus bacescui (Hatzakis, 1977)∗ Haplostylus lobatus (Nouvel, 1951) Subfamilia Erythropinae Hansen, 1910 Erythrops elegans (G.O. Sars, 1863) Subfamilia Leptomysinae Hansen, 1910 Leptomysis sp. A (aff heterophila)∗ Leptomysis lingvura ssp. B. Leptomysis sp. C (aff mediterranea)∗ Paraleptomysis banyulensis (Bacescu, 1966) Mysidopsis sp. A (aff gibbosa) 6Capítulo 1. Introducción General Subfamilia Mysinae Haworth, 1825 Hemimysis sp. A (aff. maderensis)∗ Schistomysis sp. A (aff spiritus)∗ Paramysis arenosa (G.O. Sars, 1977)∗ Subfamilia Heteromysinae Norman, 1892 Heteromysoides cotti (Calman, 1932) Según Castro (1995), en el contenido estomacal de Scomber japonicus colectados en aguas alrededor de Gran Canaria también se citan A. agilis,S. clausii yHemimysis sp. junto con otras 8 especies: Subfamilia Mysinae Haworth, 1825 Paramysis spp. Stilomysis sp. (S. grandis ?) Subfamilia Siriellinae Czerniavsky, 1882 Siriella sp. S. norvegica (G.O. Sars,1869) S. thompsoni (Milne-Edwards, 1837) Subfamilia Gastrosaccinae Norman, 1892 Gastrosaccus normani (G. O. Sars, 1877) Subfamilia Boreomysinae Holt and Tattersall, 1905 Paramblyops sp. Subfamilia Leptomysinae Hansen, 1910 Leptomysis sp. (L. sardica ?) En el trabajo de Castro (1995) se estima que la biomasa que consume anualmente Scomber japonicus es de 242,000 toneladas de misidáceos y 29,000 toneladas de eufáusidos. Esta estimación se basa en los porcentajes de misidáceos y eufausiáceos encontrados en el contenido estomacal de Scomber japonicus, la estimación acústica de abundancia de esta especie en la región y al hecho de que dicha especie consume diariamente un 8% de su peso corporal en crustáceos y un 2.5% en peces (anchoa). Este estudio ha puesto de 1.1. Antecedentes 7 manifiesto la importancia que tienen los misidáceos como alimento de peces de interés comercial en la zona, a pesar de lo cual hasta la actualidad no se han llevado a cabo investigaciones sobre su abundancia en la isla. El presente estudio surge en un principio por la necesidad de contar con un organismo marino representativo de la comunidad planctónica, fácil de obtener del medio y de mantener en cautividad para utilizarlo como animal de experimentación y poder llevar a cabo estudios de metabolismo respiratorio. Los misidáceos son organismos muy abundantes y de fácil captura en la costa de Gran Canaria ya que se encuentran a profundidades entre 5 y 15 metros y en zonas de fácil acceso. Por este motivo se planteó la posibilidad de cultivarlos en el laboratorio, ya no solo como organismos de experimentación en estudios de metabolismo respiratorio, sino también como posible alimento para peces en acuicultura. Los estudios de Woods and Valentino (2003) y Otero-Ferrer (2012) han demostrado que los misidáceos son un excelente alimento para los caballitos de mar, obteniéndose un aumento en las puestas y un mayor crecimiento de las crías. Iglesias et al. (2007) ha obtenido resultados similares en paralarvas de pulpo que habitualmente tienen una supervivencia muy baja, siendo el principal problema en el cultivo de pulpo. Estos estudios han puesto de manifiesto la potencialidad de los misidáceos como alimento vivo, y por lo tanto, la necesidad de investigar con el fin de mejorar el cultivo de estos organismos. Artemia y rotíferos son las dos presas vivas que tradicionalmente se utilizan en el cultivo de larvas de peces, lo que provoca en muchos casos deficiencias nutricionales (Izquierdo, 1996). Para el normal crecimiento y desarrollo de los peces son esenciales tres ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (PUFA): el ácido docosahexanoico (DHA), el ácido eicosapentaenoico (EPA) y el ácido araquidónico (AA) (Sargent et al., 1999, 1997). Estos ácidos grasos juegan un papel fundamental en el mantenimiento de la estructura y función de las membranas celulares y son precursores de un grupo de hormonas altamente activas conocidas como eicosanoides que se producen como respuesta al estrés. La función de los eicosanoides está determinada por la relación DHA:EPA:AA. Por lo tanto, no solo el contenido de estos ácidos grasos es importante sino también la relación entre ellos. Conocer la relación óptima de estos ácidos grasos es difícil en la práctica, ya que difiere en cada especie 14 Capítulo 1. Introducción General File: 14B9KAA023_customer.ab1 Run Ended: 2013/6/29 17:5:23 Signal G:1949 A:2197 C:3300 T:2018 Sample: 14B9KAA023_customer Lane: 45 Base spacing: 14.709749 598 bases in 7241 scans Page 1 of 1 Figura 1.6: Secuencia genética del extremo 3’ de Paramysis arenosa de 598 pares de bases (bp). investigaciones futuras en este campo hemos realizado tanto la identificación taxonómica como la secuenciación genética para poder contar con un registro de estas especies en la base de datos. Uno de los objetivos que se plantean para un futuro a partir de esta tesis, es la recopilación de toda la literatura disponible sobre misidáceos en la región y la publicación de una clave de identificación taxonómica de las especies de misidáceos costeros de Gran Canaria. Asimismo todas las secuenciaras obtenidas serán enviadas para su incorporación en la base de datos en GenBank. Esta clave facilitará futuros estudios ecológicos de esta comunidad en la región y los registros de las secuencias genéticas nos permitirá la identificación en los casos en los que no sea posible mediante el estudio de la morfología. 1.1. Antecedentes 15 El siguiente paso en nuestro trabajo fue el estudio de la abundancia de los misidáceos y las variaciones estacionales de la misma. Siendo éste un objetivo demasiado amplio, finalmente se optó por estudiar las especies presentes en las praderas de Cymodocea nodosa, uno de los ecosistemas donde los misidáceos son más abundantes. Las praderas de C. nodosa son uno de los ecosistemas costeros mas importantes en las Islas Canarias, estas praderas desempeñan importantes funciones como es la regeneración de detritos, servir de hábitat para organismos omnívoros y herbívoros que transfieren carbono a niveles tróficos superiores y ser una importante zona de cría para numerosas especies de peces costeros (Espino et al., 2011a,b). Se seleccionaron las especies más aptas par el cultivo realizando una serie de experimentos de supervivencia en cautividad. Conocer el ciclo de vida y el comportamiento de los misidáceos fue un paso previo indispensable para el estudio del metabolismo. Fueron necesarios dos años hasta lograr las condiciones óptimas de reproducción y crecimiento, siendo imprescindible construir instalaciones apropiadas para ello. Finalmente L. lingvura fue la especie seleccionada debido a la alta supervivencia en cautividad y a su fácil captura durante todo el año. La tasa de crecimiento de L. lingvura se adapta a una función sigmoide (Figura 1.7): Wt=W0+a 1+e −⎛ ⎜ ⎝ t−t0 b ⎞ ⎟ ⎠ (1.1) Siendo Wtla biomasa en el tiempo t, W0la biomasa en el tiempo cero, t el tiempo en días, a=0.0304 y b=4.2 (r2=0.91, P<0.0001). A partir del día 30 se observaron las primeras hembras con embriones en el marsupio, por lo que a partir del día 30 los individuos se consideraron sexualmente maduros (adultos). La curva de crecimiento muestra que durante los primeros 20 días el crecimiento en L. lingvura es lento, en una segunda etapa entre los 20-35 días sufren un crecimiento rápido y a partir del día 35 el crecimiento es lento otra vez. 16 Capítulo 1. Introducción General Por otra parte, se determinó la tasa de ingestión a diferentes concentraciones de presa para calcular la concentración de Artemia necesaria para suministrarle a los cultivos (figura 1.8). L. lingvura mostró una respuesta funcional tipo II. La tasa de ingestion se relaciona con la concentración de Artemia L−1 según la ecuación: I=Imax ⋅C Km +C(1.2) Donde I= tasa de ingestión, I max (tasa de ingestión máxima)= 20 Artemia mysid−1h−1, Km= concentración de (Artemia a 0.5 I max)=1219 Artemia L−1, y C=concentración de Artemia L−1(r2=0.98, P<0.0001). 1.1. Antecedentes 17 Figura 1.7: Tasa de crecimiento en biomasa proteica en L. lingvura hasta el día 60 de vida. 18 Capítulo 1. Introducción General Figura 1.8: Tasa de ingestión en L. lingvura en función de la concentración de Artemia 1.1. Antecedentes 19 Figura 1.9: Ciclo de Krebs, fosforilación oxidativa y sistema de transporte de electrones. Tomado de Packard (1985). Nuestro grupo de investigación se ha especializado en el estudio del metabolismo respiratorio en organismos marinos. Uno de sus integrantes, el Dr. Ted Packard ha desarrollado la técnica basada en la actividad enzimática del sistema de transporte de electrones (ETS) que permite estimar el consumo de oxígeno (Packard, 1971; Packard et al., 1971, 1974). La respiración aerobia puede dividirse en tres etapas, la glucólisis, el ciclo de Krebs y la fosoforilación oxidativa. Durante la glucólisis una molécula de glucosa es descompuesta parcialmente a piruvato con un rendimiento neto de 2 moléculas de piruvato, 2 moléculas de ATP y 2 de NADH; posteriormente en la mitocondria una enzima retira 1 átomo de carbono de cada molécula de piruvato, la coenzima A (CoA) se transforma en acetil coenzima A y este fragmento se transfiere al oxalacetato, que es el compuesto inicial del ciclo de Krebs. Durante el ciclo de Krebs se liberan 6 moléculas de CO2y 2 ATP, 6 NADH y 2 FADH2que pasarán al sistema de transporte de electrones (Figura 1.9. 20 Capítulo 1. Introducción General La etapa final del proceso es la fosforilación oxidativa donde se produce la mayor parte del ATP. En esta etapa la energía libre de la transferencia de electrones desde el NADH y FADH2al O2por medio de los complejos redox unidos a las proteínas está acoplada a la síntesis de ATP por las ATP sintetasas. El sistema de transporte de electrones consta de cuatro complejos de proteínas a través de los cuales los electrones pasan desde los potenciales de reducción estándar mas bajos hacia los mas altos, estos complejos se denominan complejo I (NADH deshidrogenasa), complejo II (Succinato deshidrogenasa), complejo III (Ubiquinona: citocromo c oxidoreductasa y complejo IV (Citocormo oxidasa). El aceptor final de electrones en este proceso es el O2. El método ETS (Packard, 1971) consiste en saturar el ETS mitocondrial con NADH y succinato, y el ETS microsomal con NADPH, utilizando Tetrazolium salt 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloryde (INT) como aceptor artificial de electrones. El INT reducido se transforma en formazan, un compuesto coloreado (Figura 1.10). En este proceso 1 mol de O2consumido, es equivalente a 2 moles de INT reducido, y es medido espectrofotométricamente a 490 nm usando 750 nm como línea base; de esta manera se mide la capacidad de mitocondrias y microsomas de transferir electrones desde sustratos fisiológicos (NADH, NADPH y succinato) a un aceptor final de electrones, reduciendo así los problemas asociados con las incubaciones de zooplancton en un ambiente controlado. Durante años uno de los principales objetivos de nuestro grupo ha sido investigar la bioquímica de estos procesos y experimentar con organismos marinos los procesos fisiológicos que pueden afectar el consumo de oxígeno, con el fin de mejorar esta técnica (Hernández-León and Gómez, 1996; Gómez et al., 1996; Packard and Gómez, 2008; Martínez et al., 2010; Herrera et al., 2011b; Maldonado et al., 2012). El estudio de la respiración ha sido uno de los principales temas de investigación en oceanografía en las últimas décadas debido principalmente a la importancia que pueda tener el océano en el cambio climático actuando como sumidero de CO2(Falkowski and Wilson, 1992). Es por eso que se ha dado tanta importancia a conocer el balance metabólico en los océanos, o lo que es lo mismo conocer la relación entre la producción y el consumo de oxígeno 1.1. Antecedentes 21 Figura 1.10: Reducción del INT a formazan. Según Packard (1985). (Falkowski and Wilson, 1992; Del Giorgio and Duarte, 2002; Del Giorgio and Williams, 2005; Duarte et al., 2013). El debate sobre si el océano es autotrófico o heterótrofico continúa hasta hoy día, fundamentalmente debido a la dificultad que presenta la estimación precisa de la respiración de los distintos organismos. El zooplancton juega un papel fundamental en los flujos de transferencia de carbono, ya que transfiere parte del carbono secuestrado de la atmósfera desde la zona eufótica a zonas más profundas del océano, participando activamente en lo que se conoce como la ‘bomba biológica” (Longhurst and Harrison, 1989). Por este motivo la respiración en el zooplancton ha sido estudiada ampliamente (Conover, 1960; Childress, 1968; Ikeda, 1970; Packard, 1971; Packard et al., 1974; King and Packard, 1975; Bämsted, 1980; Hernández-León and Gómez, 1996; Gómez et al., 1996; Del Giorgio and Williams, 2005; Mayzaud et al., 2005; Hernández-León and Ikeda, 2005; Packard and Gómez, 2013). 22 Capítulo 1. Introducción General Hemos llevado a cabo distintos estudios de laboratorio en L. lingvura que han permitido determinar como afectan factores como la inanición, las condiciones de alimentación y el crecimiento, a la actividad ETS y a la respiración in situ (R). La actividad ETS es utilizada para estimar la respiración potencial (F). Conocer la relación R/Fen distintas condiciones nos permite poder estimar con mas exactitud la respiración in situ en el zooplancton, y de esta forma facilitar las estimaciones globales de consumo de oxígeno. Finalmente, a partir de los estudios realizados en misidáceos, se han podido extrapolar los resultados en investigaciones oceanográficas donde se estudió la respiración en organismos suprabentónicos y zooplantónicos colectados durante la campaña IDEADOS 0710 llevada a cabo en julio del 2010 dentro del proyecto multidisciplinar IDEADOS (http://www.ba.ieo.es/ideados) coordinado entre el Instituto Español de Oceanografía, el Consejo Superior de Investigaciónes Científicas (CSIC) y la Universitat de les Illes Balears (UIB). Esta campaña se realizó al oeste y sur de Mallorca, en las subcuencas Balear y Argelina respectivamente que presentan condiciones oceanográficas muy diferentes. Uno de los objetivos fue calcular la demanda ‘potencial” de carbono del suprabentos y del zooplancton epipelágico en ambas zonas. Otro de los objetivos del estudio llevado a cabo tanto en suprabentos como en zooplancton fue determinar si existían diferencias en las condiciones fisiológicas en las que se encontraban los organismos en cada región. 1.2. Objetivos 23 1.2. Objetivos 1.2.1. Capítulo 2 Identificar las especies de misidáceos que habitan la costa de Gran Canaria entre los 5 y 15 metros. Secuenciar los genes que codifican la subunidad ribosomal pequeña (18S rRNA) en las distintas especies identificadas y registrarlos en la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information) que se encarga de hacer accesibles las bases de datos de secuencias de ADN de GenBank, con el fin de fomentar el conocimiento de la comunidad de misidáceos en Canarias. 1.2.2. Capítulo 3 Estudiar la abundancia de los principales grupos taxonómicos que componen el suprabenthos asociado a Cymodocea nodosa, uno de los ecosistemas más importantes en la costa de Gran Canaria, con especial interés en misidáceos. Determinar si existe variabilidad entre finales de primavera y finales de otoño, ya que durante la primavera las praderas de C. nodosa presentan máxima densidad y biomasa foliar, mientras que en otoño e invierno están en un período de senescencia. 1.2.3. Capítulo 4 Estudiar la supervivencia y la producción en cautividad de dos especies de misidáceos presentes en Gran Canaria: Paramysis nouveli yLeptomysis lingvura. Determinar la composición de ácidos grasos en individuos salvajes e individuos de cultivo alimentados con Artemia enriquecida con DHA Selco y compararla con la de Artemia y rotíferos. 30 Capítulo 1. Introducción General 1.3.2. Capítulo 3: Abundancia de los misidáceos asociados a praderas de Cymodocea nodosa Se seleccionaron 5 praderas de C. nodosa en la costa este y oeste de Gran Canaria (Veneguera, Risco Verde, Roque de Arinaga, Faro de Arinaga y Playa del Cabrón),(Figura 2.1) y se realizaron muestreos durante finales de primavera (mayo) y finales de otoño (noviembre) de 2011, con el objetivo de identificar el suprabentos asociado, con especial interés en las especies de misidáceos y determinar la variabilidad temporal en su abundancia. Las muestras fueron colectadas utilizando una red tipo chinchorro de 6 m de longitud, 4 de ancho y 0.5 de altura, con una abertura de malla de 1 mm. La red fue arrastrada por dos buceadores a 10 cm del sustrato, colectando un volumen de 50 m−3(Figura 2.2). Las muestras fueron fijadas en formol al 4% para su posterior identificación mediante lupa binocular y microscopio hasta el nivel de grupo, y para los misidáceos hasta el nivel de especie siguiendo los trabajos de Tattersall and Tattersall (1951), Wittmann (1986), Barberá-Cebrián et al. (2001) y Wittmann et al. (2010). En el presente estudio, la comunidad suprabentónica asociada a praderas de Cymodocea nodosa estuvo formada en más de un 95% por misidáceos, decápodos y anfípodos. Durante la primavera, los misidáceos fueron los organismos más abundantes, mientras que en otoño fue mayor la abundancia de los decápodos (Tabla 3.1). El diagrama MDS para la comunidad de suprabentos muestra un claro patrón de asociación de muestras por estación (Figura 3.2). Los tres grupos representativos (misidáceos, anfípodos y decápodos) mostraron diferencias significativas en la abundancia consistente entre localidades, siendo en todos los casos mayores en mayo que en noviembre (2-way ANOVA: p<0.05, Tabla 3.2; Figura 3.3). Se determinó la abundancia media (±error estándar) de los misidáceos durante mayo y noviembre (Tabla 3.3). Se identificaron seis especies de la familia Mysidae: Siriella armata (Milne-Edwards, 1837), Gastrosaccus roscoffensis,Paramysis arenosa (G.O. Sars, 1877) Leptomysis sp., Anchialina agilis (G.O. Sars, 1877) y Leptomysis lingvura (G. O. Sars, 1866) (Tabla 3.3). Solo Gastrosaccus roscoffensis estuvo presente en todas las muestras colectadas durante mayo y noviembre (Tabla 3.3, Figura 3.5). Siriella armata yGastro- 1.3. Principales resultados obtenidos 31 saccus roscoffensis mostraron altas abundancias (151.2±113.9 and 42.3±27.5 ind m−3respectivamente) en Veneguera, y Paramysis arenosa también presentó altas abundancias (71.3±52.7 ind −3) en Faro de Arinaga a finales de primavera (Tabla 3.3). El diagrama MDS para la comunidad de misidáceos muestra una separación de las muestras por estación (Figura 3.4). La variabilidad temporal de la abundancia para las especies de misidáceos mostró diferentes patrones. En L. lingvura no se observaron diferencias significativas entre mayo y noviembre (2-way ANOVA: “Time” p=0.715, Tabla 3.4). En P. arenosa,Leptomysis sp. yG. roscoffensis la abundancia total fue mayor en mayo que en noviembre, sin embargo las diferencias varían entre localidades, lo que resulta en una interacción significativa “Ti x Lo” (Figura 3.5, Tabla 3.4). Finalmente, S. armata solo se encontró durante los muestreos de mayo, sin embargo, no se detectaron diferencias significativas entre estaciones, probablemente debido a la alta variabilidad de la abundancia entre las réplicas de cada localidad (Figura 3.5; 2-way ANOVA: “Time” p=0.446, Tabla 3.4). A partir de los resultados obtenidos se pone de manifiesto la importancia de los misidáceos en las praderas de C. nodosa. Estudios previos, como por ejemplo el llevado a cabo por Castro (1995) ya habían evidenciado la importancia de los misidáceos como alimento de peces en Gran Canaria, siendo más abundantes en el contenido estomacal de Scomber japonicus que los eufausiáceos. Es probable que estos peces se alimenten en zonas cercanas a la costa donde los misidáceos son más accesibles. Algunas de las especies identificadas en dicho estudio (Paramysis sp.,Siriella sp.,Anchialina agilis yLeptomysis sp.) fueron colectados en las praderas de Cymodocea en el presente estudio. Estos resultados son un avance en el conocimiento de los misidáceos costeros y su importancia trófica. 32 Capítulo 1. Introducción General 1.3.3. Capítulo 4: Estudio de las técnicas de cultivo y análisis de la calidad nutricional en misidáceos presentes en la costa de Gran Canaria Se estudió la supervivencia y la producción de Leptomysis lingvura yParamysis nouveli, dos de las especies de misidáceos presentes en la costa este de Gran Canaria. Las muestras fueron colectadas en Risco Verde (Figura 2.1). Luego de un período de aclimatación de dos días, 10 machos y 10 hembras de cada especie fueron colocados en tanques de 14 litros en un sistema de recirculación de agua de mar, con triplicados para cada experimento. El pH se mantuvo a 8.2±0.1 y las concentraciones de amonio, nitrato y nitrito por debajo de 0.2, 1 y 0.02 mg L−1respectivamente. El fotoperíodo fue de 14 horas de luz y 10 de oscuridad. Los misidáceos fueron alimentados dos veces al día con 100 nauplios de Artemia por individuo. Adultos y crías fueron contados diariamente. La supervivencia fue expresada como porcentaje del número original de organismos, y la producción relativa fue estimada dividiendo el número de crías por día por el número de hembras vivas. Para el estudio de la calidad nutricional se analizaron proteínas, cenizas y lípidos en porcentaje del peso seco, y se separaron y cuantificaron los ácidos grasos en porcentaje del total de lípidos. Al final del experimento, la supervivencia de L. lingvura fue de 65±8.7% y la de P. nouveli de 16±5.8% (Figura 4.1). Hasta el día 9 no se observaron diferencias significativas en la supervivencia de ambas especies, a partir de este día, la supervivencia de L. lingvura fue significativamente mayor (P<0.05). La producción total de crías fue de 166±2 para L. lingvura y 45±7 para P. nouveli. La longitud estándar de las crías fue de 2.03±0.23 mm y 1.86±0.17 mm en L. lingvura yP. nouveli respectivamente (Figura 4.2). La producción relativa fue significativamente mayor (P<0.05) en L. lingvura (18.2±2 crías) que en P. nouveli (4.6±0.8 crías) al día 21. Las proteínas y lípidos fueron en P. nouveli el 73.38±1.77% y el 15.01±1.12%; y en L. lingvura el 74.19±5.22% y el 14.79±2.66% del peso seco respectivamente (Tabla 4.1). El porcentaje de ácidos grasos se comparó con los porcentajes obtenidos en misidáceos cultivados, misidáceos salvajes, y en Artemia y rotíferos, dos presas utilizadas frecuentemente en acuicultura (Tabla 4.1). 1.3. Principales resultados obtenidos 33 El estudio de los porcentajes de ácidos grasos en individuos salvajes y cultivados de Paramysis nouveli yLeptomysis lingvura respectivamente (Figuras 4.3 y 4.4) mostró que los ácidos grasos más abundantes para ambas especies en cultivo fueron 16:00, 18:1n9, 20:5n3 (EPA), 22:6n3 (DHA), 18:3n3 y18:2n6 (Tabla 4.1; Figuras 4.3 y 4.4). Los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) n-3 y n-6 totales para Paramysis nouveli yLeptomysis lingvura en cultivo representaron un 39.44% y 8.42%; y 42.4% y 8.4% del total respectivamente. El porcentaje de PUFA n-3 fue mayor que el que presentaron Artemia (31.14%) y rotíferos (21.12%) de acuerdo a los resultados presentados por Roo et al. (2009) (Tabla 4.1). Los ácidos grasos poliinsaturados DHA, EPA y ácido araquidónico (AA) son necesarios para el normal crecimiento y desarrollo en peces, y no solamente la cantidad sino también la relación entre éstos. Ambas especies poseen un mayor porcentaje de DHA, EPA y AA que la que poseen rotíferos y Artemia según datos publicados por Roo et al. (2009). La relación DHA:EPA fue 0.85±0.01 y 0.89±0.01, DHA:AA fue 6.26±0.26 y 4.74±0.14; EPA:AA 7.32±0.26 y 5.32±0.20, en P. nouveli yL. lingvura respectivamente (Tabla 4.1), estos porcentajes no muestran diferencias significativas con los que presentan P. nouveli yL. lingvura salvajes (Figuras 4.3 y 4.4). Sargent et al. (1999), sugieren que la composición que presentan las presas en el medio natural podría ser la “óptima” para sus predadores naturales, lo que puede ser un indicio de por qué los misidáceos han resultado ser un alimento de mejor calidad para sepias y caballitos de mar que Artemia o rotíferos (Otero-Ferrer et al., 2007; Woods and Valentino, 2003; Domingues et al., 2001b). 34 Capítulo 1. Introducción General 1.3.4. Capítulo 5: Efecto de la inanición y la alimentación en el metabolismo respiratorio de Leptomysis lingvura (G.O. Sars, 1866) Para determinar el efecto de la inanición en el metabolismo respiratorio se colectaron nuevamente misidáceos de la especie L. lingvura en la costa este de Gran Canaria. Luego de un período de aclimatación de 7 días alimentados con nauplios de 48 hs de Artemia sp. enriquecidos con ácidos grasos (DHA-Selco, INVE, Belgium) se separaron machos de tallas similares en recipientes individuales para evitar el canibalismo y se sometieron a diferentes períodos de inanición: 2, 6, 10, 22, 26, 30, 36, 46, 52 y 74 horas. Finalizado cada período de inanición se separaron 5 individuos para realizarles medidas de respiración in vivo (µl O2por hora) con oxímetro (Strathkelvin 928, 6-Channel oxygen system) en celdas individuales de 50 ml en condiciones de oscuridad. Posteriormente los organismos fueron congelados a -196°C en nitrógeno líquido y conservados a -80°C para el estudio de la actividad ETS según Packard (1971) con modificaciones (Owens and King, 1975; Gómez et al., 1996) y estimación de la biomasa (en mg de proteínas) según el método Lowry modificado por Rutter (Lowry et al., 1951; Rutter, 1967). Para determinar el efecto de las condiciones de alimentación en la relación respiración-biomasa y ETS-biomasa se separaron 100 individuos de distintas tallas y durante una semana se sometieron a diferentes tratamientos de alimentación: Tratamiento A: dos tomas diarias de 150 nauplios de 48 hs de Artemia sp. Tratamiento B: dos tomas diarias de 75 nauplios de 48 hs de Artemia sp. Tratamiento C: dos tomas diarias de 10 nauplios de 48 hs de Artemia sp. Cada tratamiento se llevó a cabo por triplicado. Luego se escogieron 36 individuos al azar de todo el rango de tallas para realizarles medidas de respiración in situ en el oxímetro como se describe anteriormente. Posteriormente fueron fotografiados y medidos; y luego congelados a -196°C y conservados a -80°C para realizar los análisis de la actividad ETS y la estimación de la biomasa. El estudio de la tasa de respiración in situ y la tasa de respiración potencial (F) para cada período de inanición muestra que el estado fisiológico en 1.3. Principales resultados obtenidos 35 que se encuentra L. lingvura influye en la tasa respiratoria, que disminuye a medida que aumenta el período de inanición (Figura 5.1), sin embargo, no ocurre lo mismo con la respiración potencial, representada por la actividad enzimática del sistema de transporte de electrones, que en un período de 74 horas no muestra un descenso de su actividad (Figura 5.2). En el presente estudio, las tasas respiratorias en los individuos recién alimentados son tres veces mayores que las que se observan en los individuos que permanecen en períodos de inanición de 46 horas o superiores, lo que se refleja en cocientes R/Ftambién más altos (Figura 5.3). En los misidáceos que presentan un metabolismo activo y poca reserva de nutrientes, esa falta de sustratos se evidencia en el descenso de la tasa respiratoria en un corto período de tiempo. La variación en los cocientes R/Fes consecuencia directa de lo expuesto anteriormente. Otros autores ya han mencionado la importancia del alimento en la variabilidad del cociente R/Fy sugieren que la respiración es el factor que produce la alta variabilidad de este cociente (Hernández-León and Gómez, 1996). Al inicio del periodo de oscuridad, hacia las 20 horas se observa un aumento de la respiración in situ (Figura 5.1), por lo cual, si tenemos en cuenta dos variables: horas de inanición y hora del día, el modelo que mejor se ajusta está representado por la ecuación: R=44,49 −9,98 log h +1,82 t(1.3) Es probable que los ritmos circadianos internos expliquen este comportamiento, muchos misidáceos hiperbentónicos presentan ritmos endógenos de actividad, por ejemplo en el género Gastrossacus que descansa sobre el sedimento durante el día y asciende nadando durante la noche, este comportamiento persiste incluso bajo condiciones experimentales de oscuridad durante varios días (Mauchline, 1980). Las especies mediterráneas de Leptomysis también presentan este tipo de comportamiento alimentario (Dauby, 1995). Hecq et al. (1984) han realizado estudios sobre la influencia de las condiciones experimentales y ambientales en el consumo de O2en L. lingvura , observando que durante el día la tasa respiratoria varía entre 20 y 24 µg O2h−1mg prot−1, mientras que al anochecer la respiración aumenta proporcionalmente, siendo su máximo al final de la noche (48.2 µg O2h−1mg prot−1). 36 Capítulo 1. Introducción General Respecto a la relación respiración-biomasa y ETS-biomasa con los distintos tratamientos de alimentación, se determinó que la relación entre respiración y biomasa expresada como regresión logarítmica fue para el tratamiento A: log R =2,18 +0,84 log W (1.4) (R2=0.64, n=34), Coeficiente de correlación de Pearson =0.798, p<0.01; para el tratamiento B: log R =2,72 +0,92 log W (1.5) (R2=0.69, n=36), Coeficiente de correlación de Pearson =0.798 =0.829 p< 0.01; y para el tratamiento C: log R =1,87 +0,71 log W (1.6) R2=0.81, n=35), Coeficiente de correlación de Pearson =0.798 =0.902, p< 0.01 (Figuras 5.4, 5.5, 5.6). La actividad ETS representa la tasa de respiración potencial (F), es decir, la velocidad máxima de reacción que presentan las enzimas del sistema de transporte de electrones, la relación entre esta actividad y la biomasa fue para el tratamiento A: log ETS =2,73 +0,72 log W (1.7) (R2=0.84, n=34), Coeficiente de correlación de Pearson=0.916, p<0.01; para B: log ETS =2,85 +0,71 log W (1.8) (R2=0.77, n=36), Coeficiente de correlación de Pearson=0.879, p<0.01; y para C: log ETS =2,44 +0,54 log W (1.9) (R2=0.85, n=35), Coeficiente de correlación de Pearson =0.924, p<0.01 (figuras 5.4, 5.5, 5.6). 1.3. Principales resultados obtenidos 37 La relación entre respiración y biomasa se expresa de acuerdo a la ecuación R=a Mby durante años se ha aceptado que el coeficiente b tiene un valor de 0.75 para todos los organismos, lo que se conoce como “ley de Kleiber” (Hemmingsen, 1960; Kleiber, 1961; Peters, 1983; Calder III, 1983; SchmidtNielsen, 1984). De acuerdo a los resultados obtenidos en el presente estudio, en organismos que se sometieron al tratamiento C (con escasez de alimento) los valores para el coeficiente b fueron significativamente inferiores a 0.75, tanto para la relación R-biomasa como para la relación ETS-biomasa. Respecto a la relación existente entre el metabolismo respiratorio y la biomasa, otros autores (Martínez, 2007; Gómez et al., 2008; Packard and Gómez, 2008; Herrera, 2009) han encontrado correlaciones similares en distintos grupos de zooplancton (Tabla 5.2) y la pendiente b se encuentra en el rango entre 0.5 y 0.9. Este amplio rango en que se sitúa el coeficiente b nos plantea muchos interrogantes respecto a la aplicabilidad de la ley de Kleiber para describir el consumo de oxígeno en un rango pequeño de tallas, corta escala de tiempo o en diferentes estados fisiológicos, tal como plantean Dodds et al. (2001); Lane (2005); Packard and Gómez (2008); Kolokotrones et al. (2010). 38 Capítulo 1. Introducción General 1.3.5. Capítulo 6: Aplicación de la técnica ETS en crustáceos suprabentónicos de profundidad: respiración, demanda de carbono y relación ETS-biomasa El estudio se llevó a cabo durante la campaña oceanográfica IDEADOS en julio de 2010 en dos áreas pesqueras en la costa noroeste y sur de Mallorca (Islas Baleares) a bordo del B/P Punta dés Vent. El área de muestreo al noroeste esta cerca del puerto de Sóller en la subcuenca Balear, mientras que el área sur esta cercana al archipiélago de Cabrera en la subcuenca Argelina (Figura 6.1). Estas subcuencas presentan condiciones oceanográficas muy diferentes (EUROMODEL Group, 1995). Se colectaron muestras de suprabentos a tres profundidades (250 m, 650 m y 850 m) en las dos localidades (Cabrera y Sóller). En cada localidad y profundidad se colectaron tres muestras de suprabentos. Se separaron entre 3-5 individuos de diferentes especies de decápodos (Gennadas elegans (Smith, 1884), Plesionika heterocarpus (A. costa, 1871) y Sergestes arcticus (Kröyer, 1855)), de eufausiáceos (Meganyctiphanes norvegica (M. Sars, 1857) yThysanopoda aequalis (Hansen, 1905)) y de misidáceos (Boreomysis arctica (Kröyer, 1855) y Eucopia unguiculata (Willemoes-Suhm, 1875)) y se congelaron inmediantamente a -196°C para el posterior análisis de ETS y proteínas. El resto de la muestra fue fijada en formaldehído al 4% para su identificación taxonómica hasta el nivel de especie y para el estudio de la abundancia. Se estimó la abundancia en ind 100 m−2de los principales componentes del suprabentos (decápodos, misidáceos y eufausiáceos), (Tabla 6.1). La actividad ETS se estimó según Packard (1971) con modificaciones (Owens and King, 1975; Gómez et al., 1996; Packard and Christensen, 2004) y la biomasa protéica según el método de Lowry (Lowry et al., 1951) con las modificaciones de Rutter (Rutter, 1967). La abundancia no mostró diferencias significativas entre localidades ni entre profundidades. Sin embargo, en ambas localidades, la abundancia de los decápodos fue menor a 250 m, la de los eufausiáceos fue mayor a 250 m y la de los misidáceos mayor a 650 que a 850 m y en ambos casos mayor que a 250 m (Tabla 6.1, p<0.001). 1.3. Principales resultados obtenidos 39 Los valores de ETS por unidad de biomasa expresados como µl O2h−1 mg prot−1no mostraron diferencias significativas entre especies (ANOVA test p>0.05), con valores medios entre 6.54 µl O2h−1mg prot−1para T. aequalis y 9.76 µl O2h−1mg prot−1para M. norvegica (Tabla 6.2). Se estudió la relación log ETS-log biomasa para los organismos suprabentónicos en Cabrera y Sóller respectivamente (Figura 6.4). El coeficiente b de la relación ETS = a Wbfue mayor en Cabrera que en Sóller. La abundancia de decápodos, eufausiáceos y misidáceos representó un 56% del total del suprabentos. A partir de los datos de abundancia y actividad ETS se estimó la demanda media anual de carbono debido a la respiración. El total de los tres grupos principales fue en Cabrera 20.48±10.33, 41.84±23.67 y 10.60±2.28 a 250, 650 y 850 m respectivamente, mientras que en Sóller fue 119.70±79.25, 19.10±8.95 y 13.32±7.06 a 250, 650 y 850 m respectivamente (Tabla 6.4). Estos valores representan un 0.03% de la producción primaria total en Sóller y un 0.015% en Cabrera según los datos de productividad primaria en la región publicados por Bosc et al. (2004). La aplicación del método ETS ha permitido llevar a cabo estimaciones de la actividad respiratoria del suprabentos y la detección de cambios fisiológicos entre ambas áreas, así como estimar la demanda de carbono que presenta esta comunidad en la región. 46 Capítulo 1. Introducción General 1.5. Futuras líneas de investigación La presente tesis ha supuesto un primer paso en muchas áreas de investigación, por lo tanto, aún quedan muchos interrogantes por resolver y mucho por estudiar sobre la taxonomía, la abundancia, el cultivo y el metabolismo respiratorio de los misidáceos. En primer lugar, a partir de este trabajo se ha puesto de manifiesto la necesidad de recopilar todos los datos existentes en la literatura sobre los misidáceos en la región y realizar un catálogo y una clave de las especies costeras de misidáceos de las Islas Canarias. También es necesario continuar con el estudio de la abundancia y de la variabilidad temporal, y de los factores bióticos y antropogénicos que puedan afectarle. Este estudio no se plantea ya solamente en las praderas de C. nodosa, sino también en fondos de arena, rocas y cuevas donde estos organismos son muy abundantes. Otra línea de investigación abierta a partir de esta tesis es la del cultivo. Es necesario contar con instalaciones más amplias que permitan seguir desarrollando las técnicas de cultivo para hacerlos económicamente viables mejorando el rendimiento a pequeña escala. En un futuro se plantea la posibilidad de alimentar cultivos de peces ornamentales, como por ejemplo caballitos de mar, solamente con misidáceos lo que mejoraría considerablemente la supervivencia y producción de este tipo de cultivos. Por otra parte es necesario continuar con el estudio de la composición en proteínas y acidos grasos de estos organismos, ya que nos puede proporcionar importantes pautas para el desarrollo de piensos con una calidad nutricional “óptima” para muchas especies de peces y cefalópodos. En cuanto al metabolismo respiratorio, el gran interrogante que queda planteado a partir de este trabajo es: ¿De que manera las condiciones de alimentación podrían afectar a la relación ETS-biomasa?. Una de nuestras hipótesis planteadas es que la disponibilidad de alimento a largo plazo durante el crecimiento permitiría desarrollar mayor número de mitocondrias en las células de estos organismos y junto con éstas mayor cantidad de complejos enzimáticos responsables de la respiración celular y por lo tanto, responsables últimos del consumo de oxígeno. 1.5. Futuras líneas de investigación 47 Evaluar esta hipótesis a través de la correlación entre la cantidad de mitocondrias, la actividad ETS y la biomasa es nuestro siguiente paso en el estudio del metabolismo respiratorio del zooplancton. Capítulo 2 Identification of mysids off the coast of Gran Canaria Abstract: Samples were taken between May and November 2011 to identify the species of mysids present in the east and west coast of Gran Canaria. From samples collected over sandy bottoms near rocks and Cymodocea nodosa meadows at depths between 5 and 15 m, 6 species were identified: Siriella armata (Milne-Edwards, 1837), Leptomysis sp. aff heterophila sensu Wittmann and Wirtz, 1998, Leptomysis lingvura ssp. B sensu Wittmann and Wirtz, 1998, Paramysis arenosa (G.O. Sars, 1877), Anchialina agilis (G.O. Sars, 1877) and Gastrosaccus roscoffensis (Bacescu, 1970). Two of the mysid species identified (Leptomysis sp. aff heterophila and Leptomysis lingvura ssp.) have never been officially described in the taxonomic literature. L. lingvura had never been observed before in the waters off Gran Canaria. This research describes the first genetic sequencing of the 18S rRNA gene from the mysids, Leptomysis sp. aff heterophila,L. lingvura ssp. and G. roscoffensis. 2.1. Introduction Historically mysids have been classified within the Phylum Arthropoda, Subphylum Crustacea, Class Malacostraca, Superorden Peracarida, Or49 50 Capítulo 2. Identification of mysids off the coast of Gran Canaria der Mysidacea; containing two sub-orders: Mysida and Lophogastrida. Mysid classification, and generally crustacean classification, is constantly being reviewed (Spears et al., 2005; Martin and Davis, 2001; Meland and Willassen, 2007; Anderson, 2010b; Zhang, 2011) and the development of molecular techniques has raised the need for even more revision. Recent phylogenetic analyzes of “Mysidacea” show that there is not a common ancestor for the group. However, there are three, well supported lineages: Lophogastrida, Mysida and Stygiomysida (Meland and Willassen, 2007). So these authors suggest a revision of the taxa based on monophyletic relationships according to which the “mysids” are classified as follows. Order Lophogastrida Boas, 1883 Family Lophogastridae G.O. Sars, 1870 Family Gnathophausiidae Udrescu, 1984 Family Eucopiidae G.O. Sars, 1885 Order Stygiomysida Tchindonova, 1981 Family Lepidomysidae Clarke, 1961 Family Stygiomysidae Caroli, 1937 Order Mysida Boas, 1883 Family Petalophthalmidae Czerniavsky, 1882 Subfamily Rhopalophthalminae Hansen, 1910 Subfamily Boreomysinae Holt and Tattersall, 1905 Subfamily Gastrosaccinae Norman, 1892 Subfamily Siriellinae Czerniasky, 1882 Subfamily Erythropinae Hansen, 1910 Subfamily Mancomysinae Bacescu and IliVe, 1986 Subfamily Heteromysinae Norman, 1892 Subfamily Mysidellinae Norman, 1892 Subfamily Mysinae Haworth, 1825 Subfamily Leptomysinae Hansen, 1910 Family Mysidae Haworth, 1825 Martin and Davis (2001) propose to include in the Superorder Peracarida the two orders of former “mysids” treated as the separate orders Lophogastrida and Mysida. These two new orders in the Peracardia would then stand 2.1. Introduction 51 beside the traditional orders: Thermosbaenacea, Spelaeogriphacea, Mictacea, Amphipoda, Isopoda, Tanaidacea, and Cumacea. More recently, Anderson (2010b) in the database of Superorder Peracarida, includes orders Cumacea, Lophogastrida, Mysida, Stygiomysida and Tanaidacea. The most recent clasification of crustacea published by Zhang (2011) include the two orders of “mysids” Lophogastrida and Mysida, with the other eight orders: Thermosbaenacea, Spelaeogriphacea, Bochusacea, Mictacea, Amphipoda, Isopoda, Tanaidacea, and Cumacea. In the present work we follow the recent Zhang (2011) classification. The number of species of mysids has been increasing in recent decades. Gordon (1957) listed about 520 species divided into 106 genera, (Mauchline and Murano, 1977) listed 765 species distributed in 120 genera, and recently Anderson Anderson (2010b) mentions 1106 species with 58 in the order Lophogastrida and 16 in the order Stygiomysida. The studies that identify mysids in Canary waters are Wittmann and Wirtz (1998) for coastal species and Wittmann et al. (2010); Wittmann et al. (2003) and Soldevilla et al. (2006) for planktonic species. Castro (1995) describes the mysids in the stomach contents of Scomber japonicus (Castro, 1995). There are 18 coastal mysids species cited for the Canary Archipelago: Order Mysida Haworth, 1825 Family Mysidae Haworth, 1825 Subfamily Siriellinae Czerniavsky, 1882 Siriella armata (Milne-Edwards, 1837)∗ Siriella claussi (G.O. Sars, 1877) Siriella gracilipes (Nouvel, 1942) Subfamily Gastrosaccinae Norman, 1892 Anchialina agilis (G.O. Sars, 1877) Gastrosaccus roscoffensis (Bacescu, 1970)∗ Gastrosaccus sanctus (Van Beneden, 1861)∗ Haplostylus bacescui (Hatzakis, 1977)∗ Haplostylus lobatus (Nouvel, 1951) 52 Capítulo 2. Identification of mysids off the coast of Gran Canaria Subfamily Erythropinae Hansen, 1910 Erythrops elegans (G.O. Sars, 1863) Subfamily Leptomysinae Hansen, 1910 Leptomysis sp.A (aff heterophila)∗ Leptomysis lingvura Leptomysis sp.C (aff mediterranea)∗ Paraleptomysis banyulensis (Bacescu, 1966) Mysidopsis sp. A (aff gibbosa) Subfamily Mysinae Haworth, 1825 Hemimysis sp. A (aff. maderensis)∗ Schistomysis sp. Ac (aff spiritus)∗ Paramysis arenosa (G.O. Sars, 1977)∗ Subfamily Heteromysinae Norman, 1892 Heteromysoides cotti (Calman, 1932) Those mysids collected in Gran Canaria are marked with an asterisk (above). Listed below are other 8 mysids species found in the stomach contents of Scomber japonicus sampled off Gran Canaria (Castro, 1995). Subfamily Mysinae Haworth, 1825 Paramysis spp. Stilomysis sp. (S. grandis ?) Subfamily Siriellinae Czerniavsky, 1882 Siriella sp. S. norvegica (G.O. Sars,1869) S. thompsoni (Milne-Edwards, 1837) Subfamily Gastrosaccinae Norman, 1892 Gastrosaccus normani (G. O. Sars, 1877) 2.1. Introduction 53 Subfamily Boreomysinae Holt and Tattersall, 1905 Paramblyops sp. Subfamily Leptomysinae Hansen, 1910 Leptomysis sp. (L. sardica ?) 60 Capítulo 2. Identification of mysids off the coast of Gran Canaria Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit following the recommendations of the manufacturer to ensure the correct amplification of the target genes. The sequencing products were run on an ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystem R ○) and electropherograms were analysed with MEGA v.4 software. BLAST R ○(Basic Local Alignment Search Tool) was carried out to search for homology. The alignment with the sequences registered in the NCBI (National Center of Biotechnology Information) database was used for construction of the matrix of genetic distances and for the graphical representation of phylogenetic tree of each sample. 2.3. Results Six species were identified: Siriella armata (Milne-Edwards, 1837) from samples 1 and 3, Leptomysis sp. aff heterophila sensu Wittmann and Wirtz, 1998 from samples 2 and 6, Leptomysis lingvura ssp. B sensu Wittmann and Wirtz, 1998 from sample 4, Paramysis arenosa (G.O. Sars, 1877) from samples 5, Anchialina agilis (G.O. Sars, 1877) from sample 7 and Gastrosaccus roscoffensis (Bacescu, 1970) from sample 8. 2.3.1. Siriella armata (Milne-Edwards, 1837) Scientific synonyms and common names: Cynthis armata Milne-Edwards, 1837 Cynthia flemingii Goodsir, 1842 Mysis rostrata Guerin-Meneville, 1844 Cynthilia flemengii (Goodsir, 1842) Mysis griffithsiae Bell, 1853 Mysis productus Gosse, 1853 Siriella armata (Milne-Edwards, 1837) Siriella flemingi (Goodsir, 1842) Pseudosiriella frontalis Norman, 1886 Siriella intermedia Gourret, 1888 Cynthilia armata (Milne-Edwards, 1837) Cynthilia frontalis (Norman, 1886) Siriella frontalis (Norman, 1886) 2.3. Results 61 Description: (Abstracted directly from Tattersall and Tattersall (1951)) General form very long and slender. Rostrum very long and acutely pointed, reaching almost to the distal end of the second segment of the antenal peduncule. Carapace small. Antennular peduncle very long and slender. Antennal scale long and narrow with the sides almost parallel and a small distal suture present, outer margin naked and slightly concave terminating in a strong tooth, inner margin slightly convex. Eyes with long cylindrical stalks projecting laterally beyond the sides of the carapace. Telson long and slightly tapering, entire; proximal marginal spines subequal, distally the large prominent spines have small ones between in series of six to ten; apex narrowly rounded, with two large spines, and between them from three to five (usually four) small equal spinules and two small setae. Uropod very long and slender; exopod from six to six and a half times as long as broad, with a distal suture. Outer margin, armed with a continuous row of about thirty spines. Endopod shorter than, and about half as broad as, the exopod. Size: Length 21 mm (Tattersall and Tattersall, 1951). In collected samples average length was 15 mm. Colour: Almost completely transparent, lacking all trace of chromatophores on the posterior part of the thoracic somites. Habitat: Hyperbenthic; shallow waters: 0-30 metres. Rarely taken at a depth of more than 20 metres. World distribution: North-East Atlantic: 33-56°N; Mediterranean; coastal, shelf. Distribution in Gran Canaria: S. armata was recorded by Wittmann and Wirtz (1998) in Muelle de Arinaga, 27.85N/15.40W in Cymodocea meadow at 7 m. In the present study was collected in Cymodocea nodosa meadows in Veneguera, Risco Verde, Roque de Aringa, Faro de Arinaga and Playa del Cabron at depths between 10 and 15 m. 62 Capítulo 2. Identification of mysids off the coast of Gran Canaria Figura 2.5: Siriella armata. a. Adult female b. Antennal scale c. Telson 2.3. Results 63 Muestra 3 Siriella armata 18S rRNA gene Siriella jaltensis 18S rRNA gene. Siriella clausi 18S rRNA gene. 0.0005 Figura 2.6: Phylogenetic tree representation of sample 3. Genetic study: After amplification and subsequent sequencing, sample 3 achieved a sequence of 587 pairs of bases (bp). Using BLAST R ○the alignment with the species of the database provided 100% identity with Siriella armata. The genetic distances between species are shown in the table 2.3, and figure 2.6 shows the corresponding phylogenetic tree representation. Tabla 2.3: Genetic distances between species in sample 3. For more information, GenBank accession numbers are given. Sample 3 Accession GenBank Siriella armata AJ566105.1 0.000 Siriella clausi AJ566107.1 0.005 0.004 Siriella jaltensis AJ566106.1 0.005 0.004 0.004 64 Capítulo 2. Identification of mysids off the coast of Gran Canaria 2.3.2. Leptomysis sp. aff heterophila sensu Wittmann and Wirtz, 1998 Description: (Abstracted directly from Wittmann and Wirtz (1998)) This new species resembles L. mediterranea (G.O. Sars, 1877) by the form of the antennal scale and the large rostrum, however, the terminal joint of the antennal scale shows only 11-16 setae. The species differs from L. buergii (Bacescu, 1966) by having the posterior pore group not integrated into the posterior margin of the carapace. Size: In collected samples, the average length was 12 mm. Colour: Transparent. Habitat: Bentic. Shallow waters. Distribution in Gran Canaria: This new species was sampled for the first time off Gran Canaria over rocks, sand and Cymodocea meadows between 7 and 22 m by Wittmann and Wirtz (1998). For the present work it was sampled in Cymodocea meadows between 10 and 15 m in Veneguera, Risco Verde, Roque de Arinaga and Faro de Arinaga. 2.3. Results 65 Figura 2.7: Leptomysis sp. aff heterophila. a. Adult b. Antenal scale c. Telson 66 Capítulo 2. Identification of mysids off the coast of Gran Canaria Leptomysis mediterranea partial 18S rRNA gen Leptomysis lingvura lingvura 18S rRNA gene. Muestra 6 Leptomysis lingvura adriatica 18S rRNA gene. 0.002 Figura 2.8: Phylogenetic tree representation of sample 6. Genetic study: For sample 6 was obtained a sequence of 640 bp. The alignment with the species of the NCBI database provided 98% identity with Leptomysis lingvura lingvura and Leptomysis mediterranea. Table 2.4 shows the genetic distances and figure 2.8 shows the corresponding phylogenetic tree representation. Tabla 2.4: Genetic distances between species in sample 6. For more information, GenBank accession numbers are given. Sample 6 Accession GenBank Leptomysis mediterranea AM422503.1 0.007 Leptomysis lingvura lingvura AJ566099.1 0.007 0.000 Leptomysis lingvura adriatica AJ566098.1 0.021 0.025 0.025 2.3. Results 67 2.3.3. Leptomysis lingvura ssp. sensu Wittmann and Wirtz, 1998. Scientific synonyms and common names of Leptomysis lingvura: Mysis lingvura G.O. Sars, 1866 Leptomysis sardica G.O. Sars, 1877 Leptomysis pontica Czerniavsky, 1882 Leptomysis marioni Gourret, 1888 Leptomysis linguura Zimmer, 1933 Subspecies: Leptomysis lingvura lingvura Wittmann, 1986 Leptomysis lingvura adriatica G.O. Sars, 1877 Leptomysis lingvura marioni Gourret, 1888 Description of species: (Abstracted directly from Tattersall and Tattersall (1951)) General form more shorter, more compact and robust than L. mediterranea. Rostrum short, triangular, acutely pointed. The form of the rostrum is the most reliable character by which the species may be recognized. Antennal scale shorter than in L. mediterranea, less than twice the length of the antennular peduncle; divided in two segments, distal segment occupies one-fourth to one-third of the total length and has from four to five setae on each margin. Eyes more closely set than in the other species, with characteristic pigments. Uropod shorter and considerably broader than in the other species. Exopod is longer and curved outward, and the endopod has a big statocyst and spines in their inner margin. Telson entire, linguiform, shorter and broader than in the other species, apex broadly rounded, normally armed with two long spines flanking two much smaller median spinules. Description of the new subspecies: (Abstracted directly from Wittmann and Wirtz (1998)) The local population of Madeira and the Canaries correspond to L. lingvura lingvura (G.O. Sars 1866) in most aspects, but are different by showing 8-segmented exopod of fourth male pleopod (as in Leptomysis lingvura adria- 68 Capítulo 2. Identification of mysids off the coast of Gran Canaria tica (Wittmann1986) and Leptomysis lingvura marioni (Gourret, 1888)), in contrast to 10 to 11-segmented one in other Atlantic populations. Size: Length 17 mm (Tattersall and Tattersall, 1951). In the present work the average length for L. lingvura ssp. was 12 mm. Colour: Less transparent than other species, with brown pigmentation. Habitat: Littoral; usually found in swarms near the coast in water of 10 meters in depth. Distribution in Gran Canaria: L. lingvura ssp. was not previously cited for Gran Canaria, but was sampled in El Hierro island (Wittmann and Wirtz, 1998). For the present work it was sampled in swarms resting in sandy bottoms near the rocks in Risco Verde at 5 m; and in Cymodocea meadows between 10 and 15 m in Veneguera, Risco Verde, Roque de Arinaga and Playa del Cabron. 2.3. Results 69 Figura 2.9: Leptomysis lingvura. a. Adult b. Antennal scale c. Telson 76 Capítulo 2. Identification of mysids off the coast of Gran Canaria Distribution in Gran Canaria: A. agilis was previously cited in the stomach content of Scomber japonicus sampled in waters off Gran Canaria (Castro, 1995); and for Tenerife island in Cymodocea meadows at 18 m Wittmann and Wirtz (1998). In the present work it was sampled in Cymodocea meadows between 10 and 15 m in Veneguera, Risco Verde, Roque de Arinaga, Faro de Arinaga and Playa del Cabron. 2.3. Results 77 Figura 2.13: Anchialina agilis a. Adult b. Antennal scale c. Telson 78 Capítulo 2. Identification of mysids off the coast of Gran Canaria Boreomysis tridens partial 18S rRNA gene specimen voucher Natural History Museum Univ. Bergen ZMBM77822. Boreomysis arctica partial 18S rRNA gene specimen voucher Natural History Museum Univ. Bergen ZMBM77819. Boreomysis inermis partial 18S rRNA gene specimen voucher Natural History Museum Univ. Bergen ZMBM77821. Rhopalophthalmus sp. ZMBM77826 partial 18S rRNA gene specimen voucher Natural History Museum Univ. Bergen ZMBM77826. Muestra 7 Anchialina agilis 18S rRNA gene Meterythrops robusta partial 18S rRNA gene specimen voucher Natural History Museum Univ. Bergen ZMBM77834. Heteromysis formosa small subunit ribosomal RNA gene complete sequence. 0.005 Figura 2.14: Phylogenetic tree representation of sample 7. Genetic study: After amplification and subsequent sequencing , sample 7 achieved a sequence of 575 bp. The alignment with the species of the NCBI database provided 100% identity with Anchialina agilis. The genetic distances between species and corresponding phylogenetic tree representation are shown in the table 2.7 and figure 2.14 respectively. Tabla 2.7: Genetic distances between species in sample 7. GenBank accession numbers are given. Sample 7 Accession GenBank Anchialina agilis AM422487.1 0.000 Boreomysis inermis AM422482.1 0.047 0.047 Boreomysis tridens AM422484.1 0.047 0.047 0.009 Boreomysis arctica AM422481.1 0.047 0.047 0.009 0.000 Rhopalophthalmus sp. AM422488.1 0.047 0.047 0.009 0.011 0.011 ~~ l~,-----I -----1 2.3. Results 79 2.3.6. Gastrosaccus roscoffensis (Bacescu, 1970) Description: (Abstracted directly from Tattersall and Tattersall (1951) and Wittmann et al. (2010)) General form slender and transparent, somewhat laterally compressed. Antennal scale short, outer margin without setae and terminating in a strong spine. Small eyes. Telson long, quadrangular, with apical cleft armed with spines, lateral margin also armed with spines. G. roscoffensis differs from other species of Gastrosaccus by the form of the lobes on the caudal side of carapace. Differs from close genus Haplostylus Kissmann, 1880, by less number of spines, usually five, rarely six, on the lateral margin of the telson, and the multi-segmented endopod of the third male pleopod. Size: Length 6.1-11.1 mm in females and 6.5-8.7 in males (Wittmann et al., 2010). Here, length ranged from 4 to 8 mm. Colour: transparent Habitat: Benthic. Littoral shallow waters. World distribution: Atlantic coast of Spain and France. Spanish mediterranean coast. South coast of Portugal and Canary Islands. Distribution in Gran Canaria: Gastrosaccus roscoffensis has recently been cited for the Canary Islands. In Gran Canaria samples were collected between 7 and 15 m depth at night from Pasito Blanco to Faro de Maspalomas (Wittmann et al., 2010). Here, samples were collected in Veneguera, Risco Verde, Roque de Arinaga, Faro de Arinaga and Cabron between 7 and 15 m depth in Cymodocea meadows. 80 Capítulo 2. Identification of mysids off the coast of Gran Canaria Figura 2.15: Gastrosaccus roscoffensis. a. Adult b. Antennal scale c. Telson 2.3. Results 81 Boreomysis arctica partial 18S rRNA gene specimen voucher Natural History Museum Univ. Bergen ZMBM77819. Boreomysis tridens partial 18S rRNA gene specimen voucher Natural History Museum Univ. Bergen ZMBM77822. Taphromysis bowmani partial 18S rRNA gene. Heteromysis sp. JM-2004 18S ribosomal RNA gene partial sequence. Boreomysis inermis partial 18S rRNA gene specimen voucher Natural History Museum Univ. Bergen ZMBM77821. Gastrosaccus psammodytes 18S rRNA gene. Muestra 8 Haplostylus dispar partial 18S rRNA gene specimen voucher Natural History Museum Univ. Bergen ZMBM77825. 0.005 Figura 2.16: Phylogenetic tree representation of sample 8. Genetic study: For sample 8 after amplification and subsequent sequencing achieved a sequence of 310 bp. The alignment with the species of the NCBI database provided a 95% identity with Haplostylus dispar. The genetic distances between species and corresponding phylogenetic tree representation are shown in the table 2.8 and figure 2.16 respectively. Tabla 2.8: Genetic distances between species in sample 8. GenBank accession numbers are given. Sample 8 Accession GenBank Haplostylus dispar AM422487.1 0.033 Boreomysis arctica AM422481.1 0.045 0.048 Boreomysis tridens AM422484.1 0.047 0.050 0.002 Taphromysis bowmani AM422514.1 0.056 0.064 0.030 0.028 Gastrosaccus psammodytes AJ566087.1 0.042 0.040 0.045 0.048 0.056 Boreomysis inermis AM422482.1 0.045 0.048 0.014 0.011 0.040 0.043 82 Capítulo 2. Identification of mysids off the coast of Gran Canaria 2.4. Discussion The study of mysids is recent in the Canary archipelago. Wittmann and Wirtz (1998) published the first inventory of coastal mysids which cited five of the six species identified in this study: Siriella armata,Anchialina agilis,Leptomysis lingvura spp., Leptomysis sp. (aff. heterophila) and Paramysis arenosa. Wittmann et al. (2010) recently published the first record of Gastrosaccus roscoffensis for the Canary Islands, one of the species identified here. This species has small morphological differences with the Roscoff (France) species, consequently the authors, lacking other studies such as genetic analysis, have not considered the possible establishment of a different taxon for the Canary Islands species (Wittmann et al., 2010). Genetic studies of G. roscoffensis have not confirmed the species because to date there are no genes sequenced in the GenBank database for this species. Identification has been carried out based on morphological characteristics described by Wittmann et al. (2010) and has been corroborated by Dr. Karl Wittmann. The 18S rRNA gene sequence of Gastrosaccus roscoffensis will be the first record of this species in GenBank, and will facilitate the comparison with the samples collected in other areas. In Siriella armata,Paramysis arenosa and Anchilina agilis the genetic study provided a 100% identity, confirming the previous taxonomic classification. However, in samples 2, 4 and 6 the genetic study did not permit a determination of the species. It only provided 98% identity with L. mediterranea and L. lingvura lingvura. In these cases the identification was only possible by taxonomic examination of the samples. The morphological characteristics of sample 4 corresponded to those described by Wittmann and Wirtz (1998) for Leptomysis lingvura ssp. B., while the description of Leptomysis sp. aff. heterophila matched the description of samples 2 and 6. These two taxa have not yet been described by the authors, therefore the identification is based on the observations that appear in the work of Wittmann and Wirtz (1998). This was corroborated by one of the authors, Dr. Karl Wittmann. He personally confirmed that the species are the same as the previously mentioned ones in his publication with Wirtz (above). L. lingvura ssp. had never been observed before in waters off Gran Canaria. 2.4. Discussion 83 It is clear that much remains to be investigated in the taxocenosis of mysids in the Canary Islands, as there are species and subspecies described yet. The study and sequencing of the samples collected in this work will foster advances in the knowledge of the community of mysids inhabiting the coast of Gran Canaria. Acknowledgements I would like to thank Tony Sánchez, Fernando Espino and Fernando Tuya for their cooperation during the sampling. I am gratefull to Dr. Karl Wittmann and José María Espinosa for his collaboration in the identification. This work was supported by Project BIOMBA project (CTM2012-32729) granted to M. Gómez, and PhD scholarship from University of Las Palmas de Gran Canaria granted to A. Herrera. 90 Capítulo 3. Abundance of mysids (Crustacea Mysidacea) associated with Cymodocea nodosa seagrass meadows. Figura 3.2: Bidimensional representation of MDS (stress=0.08) showing similarities in suprabenthos assemblage structure at different sampling time. Triangles: May 2011; squares: November 2011. Figura 3.3: Mysid, decapod and amphipod abundance (individuals m−3) in May and November. Sampling areas: 1. Veneguera, 2. Risco Verde, 3. Roque de Arinaga, 4. Faro de Arinaga and 5. Playa del Cabron. Tabla 3.1: Abundance (individuals m−3±SE) of taxonomic groups of suprabenthos collected in Cymodocea nodosa seagrass during late spring (May) and late autumm (November). Mysidacea Decapoda Amphipoda Copepoda Cumacea Isopoda Tanaidacea VENEGUERA May 211.88 ±120.70 3.53 ±0.99 17.16 ±7.17 4.38 ±3.29 0.16 ±0.16 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 November 3.35 ±1.35 0.71 ±0.34 0.97 ±0.16 0.00 ±0.00 0.14 ±0.05 0.00 ±0.00 0.12 ±0.05 RISCO VERDE May 22.99 ±7.60 25.77 ±7.77 22.97 ±6.29 2.99 ±2.99 0.00 ±0.00 0.30 ±0.18 0.00 ±0.00 November 2.36 ±0.88 9.19 ±2.32 2.75 ±0.90 0.02 ±0.02 0.17 ±0.08 0.01 ±0.01 0.02 ±0.00 ROQUE May 13.44 ±2.64 9.56 ±0.73 8.22 ±2.21 0.34 ±0.34 0.00 ±0.00 0.04 ±0.04 0.00 ±0.00 November 0.83 ±0.43 6.115 ±2.32 1.34 ±0.94 0.00 ±0.00 0.20 ±0.13 0.01 ±0.01 0.03 ±0.02 FARO May 74.40 ±52.36 14.56 ±2.76 20.00 ±3.48 0.32 ±0.19 0.42 ±0.25 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 November 1.25 ±0.65 1.225 ±0.42 1.74 ±0.76 0.03 ±0.03 0.22 ±0.14 0.02 ±0.01 0.01 ±0.01 CABRON May 8.24 ±4.62 8.18 ±2.11 7.50 ±1.50 0.76 ±0.15 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 November 1.65 ±0.91 10.195 ±5.73 2.56 ±1.41 0.00 ±0.00 0.34 ±0.23 0.00 ±0.00 0.04 ±0.03 TOTAL May 330.95 ±187.92 61.60 ±14.35 75.85 ±20.65 8.79 ±6.96 0.58 ±0.41 0.34 ±0.22 0.00 ±0.00 November 9.42 ±4.20 27.435 ±11.13 9.34 ±4.18 0.05 ±0.05 1.05 ±0.63 0.04 ±0.03 0.22 ±0.10 91 92 Capítulo 3. Abundance of mysids (Crustacea Mysidacea) associated with Cymodocea nodosa seagrass meadows. Tabla 3.2: Results of 2-way ANOVA testing differences in mysid, amphipod and decapod abundance between times (Ti) and seagrass meadows (Lo). Mysidacea Factor df MS F P Ti=time fixed 1 240.18 10.15 0.006 Lo=location random 4 35.36 2.54 0.049 TixLo 4 23.66 1.70 0.163 Residual 30 13.93 Total 39 Amphipoda Factor df MS F P Ti=time fixed 1 70.30 60.88 0.004 Lo=location random 4 2.70 2.61 0.061 TixLo 4 1.16 1.12 0.371 Residual 30 1.03 Total 39 Decapoda Factor df MS F P Ti=time fixed 1 22.30 9.48 0.034 Lo=location random 4 9.14 6.72 0.002 TixLo 4 2.35 1.73 0.172 Residual 30 1.36 Total 39 3.3. Results 93 3.3.2. Mysids assemblage A total of six species (in order of abundance), from the family Mysidae, were identified: Siriella armata (Milne-Edwards, 1837), Gastrosaccus roscoffensis,Paramysis arenosa (G.O. Sars, 1877) Leptomysis sp., Anchialina agilis (G.O. Sars, 1877), and Leptomysis lingvura (G. O. Sars, 1866) (Table 3.3). Only G. roscoffensis were present at all sampled seagrass of C. nodosa in both sampled periods (Table 3.3; Figure 3.5). S. armata and G. roscoffensis showed higher abundances (151.2±113.9 and 42.3±27.5 ind m−3respectively) in Veneguera, and Leptomysis sp. showed higher abundance (71.3±52.7 ind −3) in Faro de Arinaga during late spring (Table 3.3; Figure 3.5). The MDS bidimensional representation showed a separation of mysid assemblages by seasons (Figure 3.4). Different patterns were observed in temporal variability in mysid abundance. In L. lingvura differences between May and November were not significant (2-way ANOVA: “Time” p=0.715, Table 3.4). In P. arenosa,Leptomysis sp. and G. roscoffensis total abundance was higher in May than November. However, significant differences varied among localities, resulting in significative “Ti x Lo” interaction (Figure 3.5, Table 3.4). Abundance of A. agilis was greater in May than November (Figure 3.5; 2-way ANOVA: “Time” p=0.042, Table 3.4), independently of the location (Table 3.4, 2-way ANOVA: “Ti x Lo” p>0.05). Finally, S. armata were found only during the spring sampling, but no significant differences were detected between seasons, probably they were masked by the high variability between replicates at each locality (Figure 3.5; 2-way ANOVA: “Time” p=0.446, Table 3.4). 94 Capítulo 3. Abundance of mysids (Crustacea Mysidacea) associated with Cymodocea nodosa seagrass meadows. Figura 3.4: Bidimensional representation of MDS (stress=0.17) for mysids species abundance. Triangles: May 2011; squares: November 2011. 3.3. Results 95 Figura 3.5: Abundance (ind m−3) of mysids, in spring (black bars) and autumm (gray bars). Error bars are ±SE of means. 300 T----- - ---- - ------, ~~~ 1 • 8) SlrleU. armat. 1 150 100 .0 / 1/ 250 200 150 100 ,00 1 if' so E ." é. ~ e • ." e , .c < 2 o 300 2.0 200 150 100 50 t. t2 to e e • 2 o d) Leptomyai8 sp. ¡ f) G •• troa8ccu4 fOacoffensis ,¡, <f'S' .,.0 b~ ...... .{># , ,,'" ~~ {,o '" o .i' #' • / ¡ 1 ,¡, ,~ ,0 300 250 200 c) L.ptomy.;. lingvu", § c:::::J NOY 150 100 e- '0 / 3/ / 2 -~ L In o 300 250 200 e) PlInlmyaJ. areno •• 150 100 50 - 2 o L- ~ L-~ ____ ____ ~~ ~ 300 m 200 150 100 50 • 5 • 3 2 g) Aneh'-flna egNls / 1 ... ~ / * L In / Tabla 3.3: Abundance (individuals m−3±SE) of mysids associated with Cymodocea nodosa seagrass meadows . S. armata L. lingvura Leptomysis sp. P. arenosa G. roscoffensis A. agilis VENEGUERA May 151.20 ±113.87 0.10 ±0.06 0.00 ±0.00 11.78 ±10.80 42.34 ±27.48 2.72 ±2.04 November 0.00 ±0.00 0.45 ±0.37 0.05 ±0.05 0.04 ±0.04 2.02 ±1.18 0.35 ±0.18 RISCO VERDE May 0.05 ±0.04 1.10 ±0.97 1.05 ±0.95 0.00 ±0.00 0.64 ±0.35 2.92 ±2.20 November 0.00 ±0.00 0.02 ±0.02 0.28 ±0.16 0.00 ±0.00 1.95 ±0.97 0.08 ±0.05 ROQUE May 0.06 ±0.04 0.46 ±0.30 0.88 ±0.80 0.44 ±0.44 2.70 ±1.08 3.34 ±1.55 November 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.11 ±0.04 0.00 ±0.00 0.49 ±0.37 0.23 ±0.08 FARO May 0.02 ±0.02 0.00 ±0.00 71.34 ±52.72 0.46 ±0.30 1.54 ±0.56 1.31 ±1.10 November 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.06 ±0.02 0.00 ±0.00 1.01 ±0.59 0.16 ±0.10 CABRON May 0.65 ±0.34 0.20 ±0.12 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.40 ±0.30 0.34 ±0.15 November 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.27 ±0.18 0.81 ±0.52 0.00 ±0.00 TOTAL May 151.98 ±114.31 1.86 ±1.45 73.27 ±54.47 12.68 ±11.54 47.62 ±29.76 10.63 ±7.04 November 0.00 ±0.00 0.47 ±0.39 0.49 ±0.27 0.31 ±0.22 6.27 ±3.63 0.82 ±0.41 96 3.3. Results 97 Tabla 3.4: Results of 2-wayANOVA testing differences in mysid species abundances between times (Ti) and seagrass meadows (Lo). S. armata Factor df MS F P Ti=time fixed 1 28.86 1.08 0.446 Lo=location random 4 26.80 2.42 0.091 TixLo 4 26.80 2.42 0.066 Residual 30 11.06 Total 39 L. lingvura Factor df MS F P Ti=time fixed 1 0.10 0.62 0.715 Lo=location random 4 0.09 0.58 1.000 TixLo 4 0.16 1.08 0.588 Residual 30 Total 39 Leptomyis sp. Factor df MS F P Ti=time fixed 1 17.25 1.42 0.171 Lo=location random 4 12.12 2.28 0.081 TixLo 4 12.12 2.28 0.073 Residual 30 5.31 Total 39 P. arenosa Factor df MS F P Ti=time fixed 1 2.82 1.68 0.165 Lo=location random 4 1.69 1.75 0.023 TixLo 4 1.69 1.75 0.022 Residual 30 0.96 Total 39 G. roscoffensis Factor df MS F P Ti=time fixed 1 9.60 1.15 0.338 Lo=location random 4 10.31 4.34 0.002 TixLo 4 8.37 3.52 0.006 Residual 30 2.38 Total 39 A. agilis Factor df MS F P Ti=time fixed 1 5.89 11.51 0.042 Lo=location random 4 0.51 0.76 0.577 TixLo 4 0.51 0.76 0.546 Residual 30 0.67 Total 39 98 Capítulo 3. Abundance of mysids (Crustacea Mysidacea) associated with Cymodocea nodosa seagrass meadows. 3.4. Discussion The suprabenthic community associated with C. nodosa seagrass in Gran Canaria were composed almost entirely of crustaceans of the taxonomic groups Mysidacea, Decapoda and Amphipoda. These taxonomic groups were also dominant in others suprabenthic studies (Mees et al., 1995, 1993; San Vicente and Sorbe, 1999, 2001). Seasonal changes in the total abundance of mysids, decapods and amphipods follow the same pattern that density of ichthyofauna and macrofauna associated with C. nodosa. It is characterized by maxima in spring and summer, and minima in winter (Tuya et al., 2001; Espino et al., 2011b). Mysidacea are a major taxa in suprabenthic communities associated with seagrass meadows in temperate coastal waters (Mauchline, 1980; Yamada et al., 2007). Furthermore, it has been known that mysids are the most important food for small fish because they are easier to catch than other species (Yamada et al., 2010). Here, during late spring mysids were the most abundant organism, with abundances up to 200 ind −3, this highlights the importance of mysids in C. nodosa ecosystems. In the Canary Islands during summer and spring the shoot density and biomass of C. nodosa reaches its maxima (Tuya et al., 2006) and provides a nursery habitat for fishes, many of them with commercial interest (Espino et al., 2011a). This period coincides with the maximum abundance of mysids, which could indicate a trophic relationship between juvenile fish and mysids. The study of Castro (1995) provide evidence of the importance of mysids as fish food in Gran Canaria; they were more abundant in the stomach content of Scomber japonicus than euphausiids. It is probable that chub mackerel feed closer to the shore where swarms of mysids are more accessible. Some of the mysids identified in the stomach content of chub mackerel (Paramysis sp.,Siriella sp.,Anchialina agilis and Leptomysis sp.) were found in Cymodocea meadows in the present study. In recent years there has been an increase in the interest in suprabenthic studies because of their possible importance in trophic chains (Wang and Dauvin, 1994; Ansell et al., 1997; Cartes et al., 2008, 2011; Madurell et al., 2008). Most mysids feed on organic detritus and can be responsible 3.4. Discussion 99 for the remineralization of an important part of refractile detritus (Ansell et al., 1997). Other studies shown the importance of suprabenthic mysids in nitrogen regeneration in the surf zone (Cockcroft et al., 1988). Many mysid species are vertical migrators, living near the surface of the sediment during the day and migrating to the water surface at night (Mauchline, 1980). Here the samples were collected at 10 cm above the bottom only during the day to avoid underestimating mysid abundance. In this study, a total of six mysids species were sampled, a low value, similar to the number captured in seagrasses meadows in the Mediterranean Sea by Barberá-Cebrián et al. (2002) and Sánchez-Jerez and Esplá (1996). S. armata,A. agilis,Leptomysis sp., L. lingvura and P. arenosa have been previously recorded in Cymodocea meadows by Barberá-Cebrián et al. (2002) and Wittmann and Wirtz (1998). The first record of G. roscoffensis in the Canary Archipelago was only recently published by Wittmann et al. (2010). Several mysid species swarm in close spatially arranged groups (Clutter, 1969; Mauchline and Murano, 1977; Wittmann et al., 1977). Wittmann et al. (1977) describes several types of relationships that mysids have with their substrates. These range from substrate specialist to swarm specialist. Within the substrate specialists are A. agilis and S. armata which are inactive, do not react to predators and cling to the leaves of Zoostera. The second group, including L. lingvura, swarm and swim near Cystoceira, rocks and recesses rocks. L. mediterranea forms a third group that swarms in groups above sandy bottoms. The present study based on in situ observations has shown that many mysids, such as S. armata,L. lingvura,Leptomysis sp. and P. arenosa aggregate in swarms. This behavior helps to explain the high variability between replicates at each locality. It is likely that the level of replication was insufficient to determine seasonal changes in abundance in these species. A. agilis was not observed forming swarms as reported by Wittmann et al. (1977) in the northern Adriatic Sea. This was the only species that showed significant differences in abundance between seasons. It peaked in abundance in late spring in all localities. The present work is the first step in understanding the distribution of 102 Capítulo 4. Rearing techniques and nutritional quality of two mysids from Gran Canaria (Spain) wild. Here, we argue that as mysids are prey for many commercially important fish, cephalopods and rays, it is likely that the biochemical composition of mysids in their natural environment is “optimal” for these predators. Therefore, we studied the lipid profile of both species as they naturally occur in their environment. The results indicate that these mysids could be used to develop high quality live fish food. 4.1. Introduction The order Mysidacea comprises 780 species in about 120 genera, all included in the superorder Peracarida (Mauchline, 1980). Mysids are omnivorous. The stomachs of mysids collected near the coast contain detritus, bodies and appendages of small crustaceans, and small amounts of diatom shells (Murano, 1999). Studies on the relationships between fish and mysids indicate that mysids are a keystone food for fish, especially in coastal environments where they are abundant (Murano, 1999; Mauchline, 1980). The stomach contents of chub mackerel (Scomber japonicus) indicate that mysids have a trophic importance even greater than euphausiids in the waters around the island of Gran Canaria (Castro, 1995). This mackerel represents 52% of mid-sized pelagic fish in the region. It daily consumes 8% of its body mass in crustaceans and 2.5% in fish (anchovy). Accordingly, Castro (1995) estimated that annually this mackerel consumes about 242,000 tonnes of mysids and 29,000 tonnes of euphausiids. These data give us an idea of the trophic importance of mysids as food in the region. In aquaculture, mysids have proven to be a high quality food for the juvenile stages of cuttlefish, Sepia officinalis (Domingues et al., 2001b) and adult seahorse, Hippocampus abdominalis (Woods and Valentino, 2003) and H. hippocampus (Otero-Ferrer et al., 2010). In culturing fish larvae, only Artemia and rotifers are used traditionally as food and this poverty of choice can lead to nutritional imbalances (Izquierdo, 1996), and other foods are needed to improve this situation.Three fatty acids are essential for normal development of marine fish: DHA, EPA, AA. 4.2. Material and Methods 103 They fill a fundamental role in developing both the structure and function of integral cell-membranes. Furthermore, they and the EPA:AA ratio, serve as precursors or are otherwise important for the development of a group of highly active hormones known as eicosanoids (Izquierdo, 1996; Sargent et al., 1999; Roo et al., 2009). However, not only is the content of these fatty acids important, but their inter-relationships: DHA: EPA: AA are also important. Knowing the optimal ratios is difficult in practice because it is likely to differ in each species (Sargent et al., 1999). Consequently, we suggest analyzing the prey of each species in its natural environment, as predator and prey are well adapted to the same environment conditions. This paper is a pilot study of the survival and production of L. lingvura and P. nouveli in captivity. Here, we analyze the nutritional quality (lipid and protein profiles) of both species to determine their suitability as live prey in aquaculture. We present the protein and fatty acid profiles of both species in their natural environment in order to determine if the diet used during cultivation changes their natural biochemical composition. Other investigators have cultivated mysids, mainly from the genus Mysidopsis, and used them for laboratory experimentation and for water toxicity testing (Reitsema, 1980; Ward, 1984; Lussier et al., 1988; Domingues et al., 1999a; Verslycke et al., 2004). We intend to use our results to facilitate the development of fish food for cultivating ornamental fish as well as commercially important fish. 4.2. Material and Methods 4.2.1. Survival and production experiments On the east coast of Gran Canaria, in Risco Verde bay (27°51N and 15°23 W), samples were taken weekly from August to October 2008. Sampling took place at depths between 5 and 15 meters in areas near the rocks using SCUBA equipment and a hand net of 500-µm mesh. Species identification was performed with a binocular microscope (Wild M8, Heerbrugg, Switzerland), following the work of Tattersall and Tattersall (1951), Labat (1953), Wittmann (1986), Barberá-Cebrián et al. (2001). To study the survival and production, samples of L. lingvura and P. nou- 104 Capítulo 4. Rearing techniques and nutritional quality of two mysids from Gran Canaria (Spain) veli, two of the most abundant species in our samples, were taken in October 2008. After acclimatization for 2 days, 10 males and 10 females of each species were then placed in small 1L farrowing containers that in turn, were placed in larger 14 L open flow tanks of filtered seawater with a salinity of 37 g L−1(PSU). The seawater, common to the farrowing containers and the 14 L tanks, was maintained at 18.2 ±0.4°C, renewed every 12 hours, and monitored for pH, oxygen, ammonium, nitrate and nitrite. The pH was maintained at 8.2 ±0.1, the O2at 7.1 ±0.1 mg L−1, and NH4+, NO3−, and NO2−, at concentrations below 0.2, 1 and 0.02 mg L−1respectively. The photoperiod was 14h:10h light and dark. Mysids were fed twice daily using 100 Artemia nauplii per mysid. The Artemia (EG type) were enriched with Easy-DHA Selco R ○; INVE aquaculture, Dendermonde, Belgium). Mysids were counted daily. Survival of adults was expressed as a percentage of the original number. Relative production was estimated by dividing the number of hatchlings per day by the number of females alive. Production rates were expressed as young per female. The experiments were carried out in three replicates. To measure the standard length (from the rostrum in between the eye stalks to the end of the last abdominal segment) of young we used a binocular microscope with a reflex digital camera of 10 megapixels (Canon EOS 1000D, Tokyo, Japan) and the software Image J 1.40g (National Institutes of Health, USA) to estimate the length from the megapixels in the photograph. 4.2.2. Nutritional quality experiments Samples for lipid and protein analysis were also collected in Risco Verde between March and April 2009. Samples of P. nouveli and L. lingvura were separated immediately after capture using a binocular microscope and kept frozen at -80°C for further analysis. For culture experiments the mysids were separated by species and after an acclimatization period of 2 days, were maintained for 7 days, fed twice daily using 100 Artemia nauplii per mysid (as above). The culture conditions were identical to those used in the survival and production experiments. At day 7 the organisms were placed on filters, washed with distilled water, and stored at -80°C until analysis was made. 4.3. Results 105 Moisture was determined in the samples by drying them to constant weight in an oven at 110°C (AOAC, 1995). The ash content was determined by incinerating the samples to constant weight in a muffle furnace at 600°C (AOAC, 1995). Protein was calculated from total nitrogen in the samples as determined by the Kjeldhal technique (AOAC, 1995). Crude lipids (% wet mass) were extracted following the method of Folch et al. (1957). Fatty acid methyl esters from total lipids were prepared by transmethylation as described by Christie (1982), separated and quantified by Gas-Liquid chromatography as described by Izquierdo et al. (1990). Proteins, lipids, ash and moisture were expressed as% dry mass. Fatty acids are expressed as% of total. 4.2.3. Statistical analysis Mann-Whitney non-parametric test with significance P<0.05 was used to determine statistical differences in the survival and production of each species and Kruskal Wallis one-way ANOVA with significance P<0.05 was performed for the three replicates. All the biochemical data were expressed as means ±SD. To evaluate the homogeneity of variances between wild and cultured mysids we applied Levene’s test, and to study differences between them we applied the Student t-test with significance level, P<0.05. These statistical analyses were done using SPSS Statistical Software version 14.0 (SPSS Chicago, Illinois, 1999). 4.3. Results 4.3.1. Survival and production experiment At the end of the experiment the average survival for L. lingvura was 65 ± 8.7% (mean ±S.D.) and for P. nouveli 16 ±5.8% (Figure 4.1). The cultures of the two mysids showed no significant differences in survival until day 9, since then values were higher (P<0.05) in L. lingvura (Figure 4.1). The total hatchling production was 166 ±2 and 45 ±7 for L. lingvura and P. nouveli (Figure 4.2) and the hatchling average standard length was 2.03 ±0.23 mm 106 Capítulo 4. Rearing techniques and nutritional quality of two mysids from Gran Canaria (Spain) and 1.86 ±0.17 mm, respectively, showing significant differences between species (P<0.05). The relative production (young female−1) was significantly higher (P<0.05) in L. lingvura (18.2±2) that P. nouveli (4.6±0.8), at day 21. No hatchlings of P. nouveli were found from day 12 of experiment. 4.3. Results 107 Figura 4.1: Survival in percentage of L. lingvura and P. nouveli at day 7, 14 and 21 of the experiment. 0-'------ 7 14 Day 21 108 Capítulo 4. Rearing techniques and nutritional quality of two mysids from Gran Canaria (Spain) 4.3.2. Nutritional quality experiments Lipid and protein analysis was the first step in determining the nutritional quality of the cultured mysids. The proteins and lipids as a percentage of dry mass, for P. nouveli were 73.38 ±1.77% and 15.01 ±1.12% and for L. lingvura, 74.19 ±5.22% and 14.79 ±2.66% (Table 4.1). The most abundant fatty acids in both species were oleic acid 18:1 n-9, palmitic acid 16:0, eicosapentaenoic acid (EPA) 20:5 n-3, docosahexaenoic acid (DHA) 22:6 n-3, αlinoleic acid (ALA) 18:3 n-3 and linolenic acid (LA) 18:2 n-6 (Table 4.1; Figures 4.3 and 4.4). The omega-3 (n-3) and the omega-6 (n-6) polyunsaturated fatty acids (PUFA), in P. nouveli and L. lingvura accounted for 39.45 ±0.73% and 8.43 ±0.22%, and 42.4 ±0.36% and 8.34 ±0.06% of the total lipids, respectively (Table 4.1). The ratio DHA:EPA was 0.85 ±0.02 and 0.89 ±0.01, DHA: arachidonic acid (AA) 6.25 ±0.26 and 4.74 ±0.14 and EPA:AA 7.32 ±0.26 and 5.32 ±0.2%, (Table 4.1). In mysids collected in the wild; lipids, protein and ash as a percentage of dry mass were for P. nouveli: 17.83 ±0.12%; 74.24 ±1.28% and 2.69 ±0.2% respectively; and for L. lingvura: 16.25 ±4.96%; 77.34 ±1.24% and 3.72 ± 0.31%, respectively (Table 4.1). Fatty acids as a percent of total are presented in table 4.1 and represented with the percentages obtained for mysids fed Artemia in culture in figure 4.3 for L. lingvura and figure 4.4 for P. nouveli. 4.3. Results 109 Figura 4.2: Total hatchling production of L. lingvura and P. nouveli at day 21 of the experiment. 180 --- 160 _ L. Iingvura el c:::::J P.nouveli c:: ..c:: 140 o .... ca ..c:: 120 ca .... O 100 .... - o o 80 c:: ~ c:: 60 o :¡:¡ o ::J 40 "C o .... c.. 20 O 21 Day Tabla 4.1: Lipids, proteins and ash composition (% dry mass) and fatty acids (% total fatty acids) of wild and cultured P. nouveli and L. lingvura; and two live prey used frequently in aquaculture (rotifers and Artemia) enriched with Selco R ○reported by Roo et al. (2009). Values (mean±SD). ∗Significant differences between wild and cultivated. Wild Cultured Wild Cultured Enriched Enriched P. nouveli P. nouveli L. lingvura L. lingvura Rotifers Artemia % Lipids (dw) 17.83±0.12 15.01±1.12 16.25±4.96 14.79±2.66 22.05±3.84 26.04±0.41 % Proteins (dw) 74.24±1.28 73.38±1.77 77.34±1.24 74.19±5.22 54.28±4.57 56.39±4.84 % Ash (dw) 2.69±0.2 2.99±0.07 3.72±0.31 3.63±0.21 1.48±0.50 0.75±0.02 16:00 Palmitic acid 22.88±0.34∗16.94±0.62∗21.71±0.07∗15.48±0.23∗13.0±2.48 15.22±3.8 18:00 Stearic acid 4.28±0.14 4.01±0.1 4.48±0.25 3.64±0.05 4.73±1.21 4.42±0.37 18:1n9 Oleic acid 12.85±0.46∗19.11±0.38∗12.53±0.93 17.9±0.24 20.1±1.72 20.36±7.38 18:2n6 Linolenic acid 3.15±1.07 4.79±0.24 2.86±0.63 4.76±0.02 8.14±1.31 3.78±2.61 18:3n3 αlinoleic acid 0.78±0.12∗8.22±0.19∗0.67±0.08∗14.18±0.26∗1.62±0.11 10.81±4.23 20:5n3 EPA Eicosapentaenoic acid 19.39±0.68 14.77±0.2 1 7.89±1.85 12.45±0.15 6.51±0.62 11.10±4.27 22:6n3 DHA Docosahexaenoic acid 16.98±1.22 12.63±0.37 16.62±0.86 11.10±0.20 9.68±0.93 4.47±1.43 20:4n6 AA Arachidonic acid 2.92±0.01∗2.02±0.06∗3.57±0.96 2.34±0.09 1.46±0.73 1.49±0.37 ·PUFA n-3 40.31±0.38 39.45±0.73 38.04±2.95 42.4±0.36 21.12±0.48 31.14±11.43 ·PUFA n-6 7.99±1.18 8.43±0.22 8.53±0.31 8.34±0.06 10.77±2.11 7.03±3.73 DHA/EPA 0.88±0.09 0.85±0.02 0.93±0.05 0.89±0.01 1.49±0.01 0.4±0.34 DHA/AA 5.81±0.44 6.25±0.26 4.8±1.06 4.74±0.14 8.1±4.45 2.99±3.87 EPA/AA 6.64±0.21 7.32±0.26 5.13±0.86 5.32±0.20 5.45±2.99 7.43±11.53 110 4.3. Results 111 Figura 4.3: The most abundant fatty acids as a percentage of total for wild L. lingvura and for the same species cultured fed for 7 days on Artemia nauplii enriched for 48 h with EasyÐDHA Selco R ○, INVE, Belgium. The fatty acids are identifiable by the following key, 16:0 (Palmitic acid), 18:0 (Stearic acid), 18:1 n-9 (Oleic acid), 18:2 n-6 (Linolenic acid), 18:3 n-3 (αlinoleic acid), 20:5 n-3 (EPA), 22:6 n-3 (DHA), and 20:4n-6 (AA). ~ o o t 16 18 18:1 n9 18:2n6 18:3n3 20:4n6 AA 20:5n3 EPA 22:6n3 DHA PUFA n-3 PUFA n-6 DHA/EPA DHA/AA EPA/AA % of total fatty acids '" o '" o .... o DI rr- §=§= !Q!Q ~ ~ QJ QJ ::;" ::lE n == t: a. ;::;: t: Cil '" o 206 Bibliografía Tattersall, W.M., Tattersall, O., 1951. The British Mysidacea. Ray Society, London. pp 460. Thor, P., 2003. Elevated respiration rates of the neritic copepod Acartia tonsa during recovery from starvation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 283, 133–143. Torres, J., Belman, B., Childress, J., 1979. Oxygen consumption rates of midwater fishes as a function of depth of occurence. Deep Sea Research Part A. Oceanographic Research Papers 26, 185–197. Torres, J., Childress, J., 1983. Relationship of oxygen consumption to swimming speed in Euphausia pacifica. Marine Biology 74, 79–86. Tuya, F., Hernandez-Zerpa, H., Espino, F., Haroun, R.J., 2012. Drastic decadal decline of the seagrass Cymodocea nodosa at Gran Canaria (eastern Atlantic): interactions with the green algae Caulerpa prolifera. Aquatic Botany 105, 1–6. Tuya, F., Martín, J., Luque, A., 2006. Seasonal cycle of a Cymodocea nodosa seagrass meadow and of the associated ichthyofauna at Playa Dorada (Lanzarote, Canary Islands, eastern Atlantic). Ciencias Marinas 32, 695– 704. Tuya, F., Perez, J., Medina, L., Luque, A., 2001. Seasonal variation of the macrofauna from three seagrass meadows of Cymodocea nodosa off Gran Canaria (central-eastern Atlantic ocean). Ciencias marinas 27, 223–234. Verslycke, T., Fockedey, N., McKenney Jr, C., Roast, S., Jones, M., Mees, J., Janssen, C., 2004. Mysid crustaceans as potential test organisms for the evaluation of environmental endocrine disruption: a review. Environmental Toxicology and Chemistry 23, 1219–1234. Wang, Z., Dauvin, J.C., 1994. The suprabenthic crustacean fauna of the infralittoral fine sand community from the Bay of Seine (Eastern English Channel): composition, swimming activity and diurnal variation. Cahiers de Biologie Marine 35, 135–155. Ward, S., 1984. A system for laboratory rearing of the mysid, Mysidopsis bahia Molenock. The Progressive Fish-Culturist 46, 170–175. Bibliografía 207 Whitfield, J., 2006. In the beat of a heart: Life, Energy, and the unity of Nature. The National Academies Press. pp. 278. Wittmann, K., 1981. Comparative biology and morphology of marsupial development in Leptomysis and other Mediterranean Myisidacea (Crustacea). Journal of experimental marine biology and ecology 52, 243–270. Wittmann, K., 1986. Saisonale und morphogeographische differenzierung bei Leptomysis lingvura und zwei verwandten spezies (Crustacea, Mysidacea). Annalen des Naturhistorischen Museums in Wien. 87, 265–294. Wittmann, K., Moro, L., Riera, R., 2010. Sobre la distribución de Gastrosaccus roscoffensis (Crustacea: Mysida) en el Atlántico nororiental y primer registro para las Islas Canarias. Revista de la Academia Canaria de Ciencias 22, 91–101. Wittmann, K., Wirtz, P., 1998. A first inventory of the mysid fauna (Crustacea: Mysidacea) in coastal waters of the Madeira and Canary archipelagos. Bol. Mus. Mun. Funchal 5, 511–533. Wittmann, K.J., Hernández, F., Durr, J., Tejera, E., González, J.A., Jimenez, S., 2003. The epi-to bathypelagic Mysidacea (Peracarida) off the Selvagens, Canary, and Cape Verde Islands (NE atlantic), with first description of the male of Longithorax alicei H. Nouvel, 1942. Crustaceana 76, 1257–1280. Wittmann, K.J., et al., 1977. Modification of association and swarming in North Adriatic Mysidacea in relation to habitat and interacting species. Biology of Benthic Organisms 493, 502. Woods, C., Valentino, F., 2003. Frozen mysids as an alternative to live Artemia in culturing seahorses Hippocampus abdominalis. Aquaculture Research 34, 757–763. Yamada, K., Hori, M., Tanaka, Y., Hasegawa, N., Nakaoka, M., 2007. Temporal and spatial macrofaunal community changes along a salinity gradient in seagrass meadows of Akkeshi-ko estuary and Akkeshi Bay, northern Japan. Hydrobiologia 592, 345–358. Yamada, K., Hori, M., Tanaka, Y., Hasegawa, N., Nakaoka, M., 2010. Contribution of different functional groups to the diet of major predatory fishes 208 Bibliografía at a seagrass meadow in northeastern Japan. Estuarine, Coastal and Shelf Science 86, 71–82. Yamada, K., Kumagai, N.H., 2012. Importance of seagrass vegetation for habitat partitioning between closely related species, mobile macrofauna Neomysis (Misidacea). Hydrobiologia 680, 125–133. Zariquiey Alvarez, R., 1968. Crustáceos decápodos ibéricos. Investigación Pesquera 32, 510. Zhang, Z.Q. (Ed.), 2011. Animal biodiversity: An outline of higher-level classification and survey of taxonomic richness. volume 3148, 1-237. Zootaxa.