Efecto citotóxico de la melatonina en células de leucemia humana Molt-3

JUAN PERDOMO DIAZ Las Palmas de Gran Canaria 2013 Departamento de Patología Animal, Producción Animal, Ciencia y Tecnología de los Alimentos y Departamento de Ciencias Clínicas TESIS DOCTORAL EFECTO CITOTÓXICO DE LA MELATONINA EN CÉLULAS DE LEUCEMIA HUMANA MOLT -3 La melatonina es una indolamina sintetizada principalmente en la glándula pineal que presenta un amplio repertorio de actividades biológicas. Su naturaleza lipofílica posibilita que atraviese fácilmente las membranas biológicas, alcanzando su máxima concentración en el torrente circulatorio durante el periodo nocturno. Aunque durante mucho tiempo se consideró que la glándula pineal era el único órgano encargado de su síntesis, actualmente se sabe que otros tejidos como la retina, las células del sistema inmune, la médula ósea y la piel también expresan la maquinaria biosintética y son responsables de la producción a nivel local. Entre las propiedades fisiológicas de la melatoninadestaca su papel en la regulación del ritmo circadiano, la modulación del sistema inmune y como agente antioxidante. Un creciente número de estudios en los últimos años sugiere que además, puede inhibir la proliferación de las células tumorales e inducir apoptosis, un tipo de muerte celular que ocurre de forma natural en los organismos como mecanismo para la eliminación de células defectuosassin provocar una respuesta inflamatoria. El objetivo inicial de la presente tesis doctoral ha sido evaluar el efecto de la melatonina sobre la viabilidad de las células leucémicas humanas, utilizando como modelo experimental la línea tumoral de origen linfoblástica Molt-3. Los resultados del presente estudio claramente han puesto de manifiestoque presenta propiedades antiproliferativas. La reducción del número de células vivas y el incremento paralelo de células no viables sugieren un efecto citotóxico más que citostático, además de incrementar el porcentaje de células con contenido de ADN hipodiploide y provocar cambios ultraestructurales característicosde la muerte celular por apoptósis. EFECTO CITOTÓXICO DE LA MELATONINA EN CÉLULAS DE LEUCEMIA HUMANA MOLT -3 No es necesario apagar la luz del otro para que brille la nuestra. Gandhi A la memoria de mamá Yeya y papá Nono. A la memoria de Gregorio y Benita. A toda mi familia. Este trabajo ha sido financiado por: - Agencia Canaria de Investigación, Innovación y Sociedad de la Información del Gobierno de Canarias. PI 2007/045. - Ministerio de Ciencia e Innovación / Fondo para el Desarrollo Regional Europeo. SAF201021380. - Instituto Canario de Investigación del Cáncer. ICIC-G.I. Nº 08/2012 Ilustración de la portada: microfotografías de dos células Molt-3, normal (izquierda) y en apoptosis (derecha). Ilustración de la contraportada: estructura química de la melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina). Indice Indice 1 Agradecimientos 5 Abreviaturas 9 Figuras 15 Introducción 19 Melatonina: naturaleza química y biosíntesis 21 Amplio espectro de acción biológica de la melatonina 23 Acción antiapoptótica y protección celular 27 Mecanismos de acción de la melatonina en su acción anticancerígena 30 Objetivos 45 Material y métodos 47 Resultados 59 Discusión 81 Conclusiones 89 Bibliografía 93 Anexos 111 3 Agradecimientos Figuras Figura 1. Estructura química de la melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina). P21 Figura 2. Ruta de la biosíntesis de la melatonina a partir del aminoácido triptófano. P22 Figura 3. Diferentes receptores de muerte. Activación de caspasa 8/10 por los receptores de muerte. P33 Figura 4. Vía intrínseca o mitocondrial. P35 Figura 5. Regulación de la apoptosis por la familia Bcl-2. P37 Figura 6. Miembros antiapoptóticos de la familia Bcl-2. P38 Figura 7. Miembros proapoptóticos de la familia Bcl-2. P39 Figura 8. Viabilidad de las células Molt-3 mediante el ensayo de MTT tras el tratamiento con diferentes concentraciones de melatonina durante 72 horas. P61 Figura 9. Efecto de la melatonina sobre el número de células Molt-3. P62 Figura 10. Microfotografías de contraste de fase de células control y células tratadas con melatonina 1 mM durante 48horas. P64 Figura11. Determinación de los subtipos de receptores de membrana para melatonina expresados en células Molt-3. P65 Figura 12. Evaluación del papel de los receptores de membrana en el efecto antiproliferativo de la melatonina en células Molt-3. P66 Figura 13. Efecto de la melatonina sobre el ciclo celular en células Molt-3. P67 Figura 14. Efecto de la melatonina sobre la externalización de fosfatidilserina en células Molt-3. P68 Figura 15. Evaluación del efecto de la melatonina a nivel ultraestructural en células Molt-3. P68 Figura 16. Efecto de la melatonina sobre la actividad caspasa en células Molt-3. P69 Figura 17. Análisis de la expresión de las caspasas en células Molt-3 tratadas con melatonina. P70 Figura 18. Efecto de la melatonina sobre la expresión de algunos miembros de la familia de Bcl-2 y sobre la liberación del citocromo c al citosol. P71 Figura 19. Efecto de la melatonina sobre el potencial de membrana mitocondrial (∆ψm) en células Molt-3. P72 Figura 20. Efecto de los inhibidores de caspasas sobre la muerte celular por apoptosis inducida por melatonina. P73 Figura 21. Estudio del efecto del inhibidor general de caspasas z-VAD-fmk sobre la viabilidad de células Molt-3 tratadas con melatonina (1 mM). P74 Figura 22. Estudio del efecto del inhibidor general de caspasas z-VAD-fmk sobre la apoptosis inducida por melatonina en células Molt-3. P75 Figura 23. Efecto de la melatonina sobre la generación de ROS en células Molt-3. P76 Figura 24. Efecto de los inhibidores de la cadena transportadora de electrones mitocondrial y del inhibidor de la NADPH oxidasa sobre la generación de ROS en respuesta a melatonina. P77 Figura 25. Efecto de los antioxidantes sobre los niveles de especies reactivas del oxígeno la reducción de la proliferación de células Molt-3 y la apoptosis inducida por melatonina. P78 17 Introducción Melatonina: naturaleza química y biosíntesis La melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina), es una indolamina cuya estructura química fue puesta de manifiesto en 1960 por Aaron Lerner y sus colaboradores (1), quienes demostraron que se trataba del factor de despigmentación descrito por vez primera en 1917 por McCord y Allen, en la piel de los peces y anfibios. Precisamente esta primera función descrita para la melatonina sirvió para dar nombre a la misma. Así, de acuerdo con la definición dada por Lerner y sus colaboradores, se trata de una molécula que actúa como un antagonista de la hormona estimulante de los melanocitos-α (α-MSH) en peces y anfibios. Sin embargo, teniendo en cuenta que la alteración en la coloración de la piel no era aplicable a los mamíferos, cuyos melanocitos no contienen melanosomas móviles controlados fisiológicamente, esta propiedad era del interés solamente de unos pocos especialistas, con lo que no se profundizó en su estudio hasta algunos años más tarde. Figura 1. Estructura química de la melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina). El interés en esta molécula aumentó a partir de las años 80 a raíz de las investigaciones de Redman (2) y Armstrong (3), donde se pone de manifiesto que la melatonina regula y reinicia los ritmos circadianos en mamíferos, estando involucrada en la percepción de la duración del día en especies animales que responden a cambios fotoperiódicos, una variable ambiental que condiciona el ritmo estacional de la reproducción, el metabolismo y el comportamiento. (4-8). Los efectos que esta molécula ejerce directamente en regiones del sistema nervioso central (SNC) con una elevada densidad de receptores como el núcleo supraquiasmático (SCN) o el pars tuberalis (PT), las cuales controlan el ritmo circadiano y estacional, hace que sea considerada por muchos investigadores como su principal función fisiológica. Sin embargo, su acción no está restringida a zonas con una elevada densidad de receptores de la misma. En la década de los 90 se describe que la melatonina no sólo se encuentra en los vertebrados, sino que está presente en invertebrados, bacterias, algas, eucariotas unicelulares y plantas, indicando que esta molécula ha ido adquiriendo funciones adicionales en el curso de la evolución. (9-12). 21 Llevó algún tiempo hasta que pudo establecerse por completo la ruta biosintética de la melatonina, consistiendo ésta en un proceso en el que intervienen hasta cinco enzimas y que comienza con la hidroxilación del aminoácido aromático L-triptófano transformándose en 5-hidroxitriptófano por la enzima triptófano hidroxilasa (TPH), la cual necesita la 6-tetrahidrobiopterina (6-BH4) como un cofactor esencial (13), (14). El 5-hidroxitriptófano es transformado posteriormente en serotonina (5hidroxitriptamina) por la enzima aminoácido aromático decarboxilasa (AAD) (15), siendo ésta convertida en N-acetil-serotonina por la enzima arilalquil N-acetiltransferasa (AANAT) (16). El paso final en la síntesis de la melatonina es la transformación de la N-acetilserotonina por la enzima hidroxindol-O-metiltransferasa (HIOMT), aunque la correcta designación de esta última enzima es serotonin-N-acetiltransferasa (ASMT) (17). En todo este proceso se considera que la AANAT y la HIOMT son los pasos limitantes en la síntesis de melatonina, aunque algunos investigadores consideran que la HIOMT no es un paso limitante en dicha síntesis (18-20). También se ha documentado que la serotonina puede ser acetilada a N-acetilserotonina por una enzima alternativa, probablemente la arilamina N-acetiltransferasa (NAT1) (19, 20). Figura 2. Ruta de la biosíntesis de la melatonina a partir del triptófano 22 5-hidroxitriptófano Serotonina N-acetilserotonina Melatonina Triptófano hidroxilasa (TPH) Aminoácido aromático decarboxilasa (AAD) Arilalquil N-acetiltransferasa (AANAT) Triptófano Hidroxindol-O-metiltransferasa (HIOMT) del H2O2 como es la catalasa (126). En la detoxificación del radical .OH, se cree que la melatonina actúa mediante la donación de un electrón, convirtiéndose ella misma en otro radical (catión indolil), del cual podrían haber varias isoformas (127). De esta manera el catión indolil podría a su vez secuestrar O.- (precursor del radical .OH) y por lo tanto reducir el número de radicales .OH (114), por lo que cada molécula de melatonina aparentemente tiene la capacidad de detoxificar dos radicales. Otro proceso en el que tiene una particular importancia el papel de la melatonina es en la peroxidación lipídica. Dicho fenómeno es altamente devastador teniendo en cuenta que se trata de un proceso el cual una vez iniciado se retroalimenta debido a la acción de radical peroxil (LOO.). En dicho proceso se produce la “mutilación” oxidativa de los lípidos, perturbando por lo tanto la estabilidad de la membrana plasmática. Como se ha descrito anteriormente, la melatonina es capaz de secuestrar varias especies reactivas de oxígeno, las cuales son iniciadoras de este proceso de peroxidación lipídica. No obstante, también se ha puesto de manifiesto la capacidad de la melatonina para neutralizar al propio radical LOO. (129) comparándose su efectividad con la de la vitamina E. La melatonina inhibe la actividad de la forma inducible de la enzima oxido nítrico sintasa (iNOS) a concentraciones fisiológicas, por lo que disminuye la formación de NO. y por lo tanto también la unión de este con el O2.- así como la formación del anión peroxinitrito (ONOO.). Se piensa que la supresión de la actividad de la iNOS por la melatonina se debe a su unión a la calmodulina, la cual es necesaria para la activación de dicha enzima. Algunos autores han manifestado también que la melatonina es capaz de unirse directamente al anión ONOO-. El anión ONOOno sólo inicia la reacción de peroxidación lipídica, sino que también reduce la respiración mitocondrial, disminuye los niveles de glutatión celular y causa daños en el ADN. Según estos autores, la melatonina es tan eficaz como agente secuestrante del anión ONOOcomo el GSH y la cisteina. Estos estudios realizados in vitro fueron corroborados por estudios in vivo (130-133). Por otra parte y aunque parezca paradójico, se ha visto en diferentes líneas celulares, tanto normales como tumorales, que la melatonina es capaz de producir especies reactivas de oxígeno (ROS) de una forma rápida y transitoria, sin que esto provocase un aumento en el stress oxidativo. Según algunos autores, la producción de ROS es independiente de receptores de membrana MT1 y MT2, aunque sí depende de la unión de la melatonina con la proteína intracelular calmodulina dado que fue inhibido por clorpromazine. Alguno de estos autores atribuyen la producción de ROS a la 29 reacción de Fenton. En células normales en las que se ha observado un aumento de ROS, no se vio afectada su viabilidad ni su capacidad de proliferación. (135). Mecanismos de acción de la melatonina en su acción anticancerígena En el año 1977 se celebra el primer congreso internacional en el que se trata la relación entre la glándula pineal y el cáncer, el cual sirvió para sistematizar todo el conocimiento al respecto. A partir de entonces son muchos los trabajos que ponen de manifiesto las propiedades oncostáticas de la melatonina en una amplia variedad de tumores, especialmente en aquellos que son dependientes de hormona. Los efectos de la melatonina se han estudiado en numerosos tipos de tumores incluyendo cáncer de próstata, sarcomas, cáncer colorrectal, hepatocarcinomas, melanomas, tumores neuronales, cáncer de laringe, piel, ovario, mama, cérvix, endometrio, pulmón, linfomas y leucemias. La mayoría de esos estudios han sido realizados in vitro, usando líneas celulares derivadas de tumores humanos, aunque también hay estudios con modelos de tumores en ratones (136). El estrés oxidativo, definido como una perturbación en el equilibrio entre la producción de especies reactivas de oxígeno y su inactivación por los sistemas antioxidantes, está involucrado en la etiología de muchas enfermedades, incluyendo las neoplasias (137). El daño oxidativo del ADN constituye la base de los efectos carcinogénicos de las especies reactivas de oxígeno. Teniendo en cuenta que el estrés oxidativo puede participar en las tres etapas de la carcinogénesis (iniciación, progresión y metástasis) (138), los antioxidantes pueden proteger contra el cancer en los tres estadios de su desarrollo. La acción anticancerígena de la melatonina está relacionada en parte con sus propiedades antioxidativas y secuestradoras de radicales libres. Esto ha sido demostrado en diferentes modelos experimentales de carcinogénesis inducidos por agentes causantes de daño oxidativo en los cuales la melatonina ejerce efectos protectores (139). La carcinogénesis hormonal merece una especial consideración debido a la relevancia de esos tumores de entre el amplio espectro de dicha enfermedad. El 17β-estradiol (E2), una hormona natural, está clasificada como un carcinógeno por la Agencia Internacional para la Investigación del Cancer (IARC). Los efectos carcinogénicos de E2 dependen en parte, de la estimulación de las células en proliferación en diferentes tejidos por dicho esteroide, incrementando así la probabilidad de replicación del ADN mutado como resultado de diferentes causas. Muchos de los efectos carcinogénicos de los estrógenos sin embargo, están relacionados con el estrés oxidativo dependiente de alguno de sus metabolitos. 30 Los estrógenos son metabolizados por la enzima citocromo P450 a productos hidroxilados tales como el 2y el 4-α-hidroxiestradiol. Ambos son oxidados a semiquinonas, que en presencia de oxígeno molecular, son oxidadas a quinonas con la formación de radicales anión superóxido y radicales hidroxilo, los cuales son los responsables de la carcinogenicidad de esos esteroides (140). Usando como modelo el riñón de hamster para inducir carcinogénesis por E2, Karbownik y sus colaboradores (140) demostraron que la melatonina previene el aumento en la oxidación de las bases guanina causada por el E2, y por lo tanto evita el daño en el ADN y la potencial supresión del cancer mediado por estrógenos. Otro aspecto interesante en las propiedades antioxidantes de la melatonina en el campo de la terapia contra el cancer es su utilidad como un adyuvante en tratamientos de quimio y radioterapia. Muchas drogas quimioterapeuticas usadas para combatir las células cancerígenas, además de la radioterapia, inducen la formación de ROS que en muchos casos son fuente de indeseables efectos secundarios. Esta es la base para el uso de antioxidantes como suplemento para reducir la toxicidad de la quimioterapia (141). Un reciente análisis, incluyendo 33 estudios realizados entre 1996 y 2007, y que comprendía una población de 2446 casos, documentó que la melatonina disminuyó la neurotoxicidad, la mielosupresión, la astenia, la caquexia y la diarrea en tratamientos quimioterapéuticos para diferentes tipos de tumores (141). El crecimiento tumoral debe considerarse como el resultado de un equilibrio entre la proliferación celular y la muerte celular. Consecuentemente, la modulación del ciclo celular y la inducción de la apoptosis pueden considerarse como dos mecanismos para el control del crecimiento tumoral. La melatonina aumenta la duración del ciclo celular en células de cáncer de mama MCF-7, células mieloides humanas HL-60, y células de hepatocarcinoma HespG2, expandiendo la fase G1 y retrasando la entrada de las células en la fase S, o manteniendo las mismas en la fase G2/M. La prolongación de la fase G1 reduce la proliferación celular y permite el rescate celular en la fase G0, llevándola a la diferenciación; además una prolongada fase G1 permite la reparación del ADN dañado. La prolongación de la fase G1 podría ser explicada, al menos en parte, por el aumento en la expresión de las proteínas p53 y p21 descrita en diferentes líneas celulares. El retraso en la entrada en la fase S puede explicar la disminución en la síntesis de ADN descrito en las células MCF-7 tratadas con melatonina. Un estudio más reciente indica que la inhibición transcripcional de la ciclina D1 como un evento molecular clave para la actividad antiproliferativa de la melatonina y proporciona una evidencia indirecta de su efecto sobre el promotor de la ciclina D1 es mediado por las proteinas c-jun y ATF-2. Esos hallazgos establecen por primera vez, una conexión molecular entre la melatonina y sus efectos sobre el ciclo celular, proporcionando al mismo tiempo una razón para su uso como adyuvante quimioterapéutico. Los numerosos mecanismos que regulan la diferenciación celular durante el desarrollo normal también estan involucrados en la tumorogénesis. La relación entre la progresión tumoral y su estado de diferenciación son bien conocidos. Los tumores bien diferenciados están generalmente menos avanzados y llevan un mejor pronóstico que los poco diferenciados que son generalmente más agresivos y llevan un peor pronóstico. La melatonina induce la diferenciación celular en diferentes líneas de células normales y tumorales, incluyendo células de neuroblastoma , células MCF-7 células de cáncer de próstata , células troncales mesenquimales humanas adultas y células troncales neuronales (136). El incremento en la duración del ciclo celular, por la expansión de la fase G0-G1 y retraso en la entrada en la fase S, es un medio por el cual la melatonina permite a las células tumorales alcanzar una mayor diferenciación. Ese efecto citodiferenciador ha sido considerado como un posible mecanismo por el cual la melatonina incrementa el tiempo de supervivencia y mejora la calidad de vida de los pacientes afectados por glioblastomas y tratados con radioterapia (136). Mientras algunas condiciones causan que las células que entran en la fase G0 se diferencien, otras, tales como la existencia de una significativa cantidad de ADN dañado, disparan la apoptosis, llevando a las células a una pérdida progresiva de funciones y de estructuras celulares y por lo tanto a la muerte celular. La melatonina, ha demostrado proteger a las células normales de la apoptosis, e inducir apoptosis en varias células cancerosas, incluyendo células mieloides humanas HL-60, células de linfomas B humanas, células de tumores mamarios humanos MCF-7, células de cáncer colorectal humano HT29, células de tumor secretoras de prolactina de pituitaria de rata, células de cáncer de próstata LNCaP, y células de hepatocarcinoma humano HepG2 (136). Los organismos pluricelulares dependen de la apoptosis para un desarrollo apropiado y un mantenimiento de sus tejidos. El fenómeno apoptótico permite la eliminación de las células que no están en su sitio, que no se necesitan o que están dañadas de manera irreparable (142). Se puede definir la apoptosis como un conjunto de reacciones bioquímicas que tienen lugar en la célula, que concluyen con la muerte de la célula de una forma ordenada, sin producir ningún tipo de alteración en el resto del tejido. La apoptosis es un proceso de autodestrucción celular controlada, que permite al organismo su correcta morfogénesis y la eliminación de las células que amenacen su supervivencia, además de ser necesaria para evitar la sobreproducción celular. Este proceso es de vital importancia, tanto durante el desarrollo embrionario como en la vida adulta, y puede observarse su aparición en algunas reacciones del sistema inmune, o cuando las células son dañadas por alguna enfermedad o por la acción de algún agente nocivo. 31 Existe una gran variedad de estímulos y condiciones, fisiológicas o patológicas, que pueden llevar a que se desencadenen los mecanismos apoptóticos: ligandos que actúan sobre receptores específicos (TRAIL o TNF), carencia de factores de crecimiento, la radiación ultravioleta, la hipoxia, toxinas, fármacos, la presencia de radicales libres, una infección vírica o bacteriana, o el desprendimiento de la célula del tejido del que forma parte. Pero no todas las células mueren irremediablemente en respuesta a estos estímulos. Los corticoesteroides inducen apoptosis en algunas células como los timocitos, mientras que otras células no se ven afectadas. La sensibilidad de la célula a un estímulo dependerá del equilibrio entre la expresión de proteínas pro y antiapoptóticas, de la intensidad del estímulo y del momento del ciclo celular en el que esta se encuentre. El papel crítico que desempeña la apoptosis en la regulación de la homeostasis tisular tiene importantes implicaciones en la salud. Excesivos niveles de apoptosis contribuyen al desarrollo de múltiples patologías, como el SIDA, trastornos neurodegenerativos como el Alzheimer y la enfermedad de Huntington, isquemia cardíaca y daño renal, mientras que la deficiencia en la apoptosis es clave en el desarrollo de enfermedades autoinmunes y del cáncer. Esto hace que todos los estudios que contribuyan al conocimiento y manipulación de la apoptosis tengan una gran importancia. Durante la apoptosis, la célula va a sufrir una serie de cambios bioquímicos que afectan en último término a la morfología celular. Se produce una hidrólisis de determinadas proteínas, teniendo una especial relevancia el papel de las caspasas y una fragmentación del material genético. También se produce la externalización de la fosfatidilserina hacia la cara externa de la membrana citoplasmática, actuando como molécula señalizadora que permite el reconocimiento por los fagocitos del sistema inmune y la eliminación de la célula cancerígena. Aumentan los niveles del calcio iónico en estado libre dentro de la célula, a lo que se une una deshidratación de la misma. Al comienzo de la apoptosis se puede observar una contracción celular y la condensación y fragmentación de la cromatina del núcleo. Las células comienzan a menguar, el citoplasma por lo tanto se hace más denso y los orgánulos están más aglutinados dentro de la célula. En la membrana plasmática empiezan a formarse evaginaciones, se fragmenta el núcleo y se forman los llamados cuerpos apoptóticos, los cuales son fragmentos de la membrana que retienen citoplasma junto con orgánulos densamente empaquetados con o sin fragmentos nucleares. Estos cuerpos apoptóticos son rápidamente fagocitados por macrófagos o por células vecinas debido a la exposición de margadores de fagocitosis en la superficie celular como la fosfatidilserina, evitando la exposición del material intracelular al sistema inmune que podría desencadenar una respuesta inflamatoria. 32 Existen dos vías de señalización distintas aunque interrelacionadas que controlan la activación de la apoptosis: la vía extrínseca o vía de los receptores de muerte celular y la vía intrínseca o vía mitocontrial. La activación de la vía extrínsica se inicia mediante la unión de unos ligandos específicos a sus receptores, provocando la agregación del receptor y el reclutamiento de proteínas adaptadoras, que mediante la interacción proteína-proteína transmiten la señal de muerte hasta las moléculas efectoras.Los receptores de muerte pertenecen a la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNF), cuyos miembros tienen en común un dominio extracelular rico en cisteína y un dominio intracelular que permite al receptor acoplarse con el resto de la maquinaria apoptótica. Los receptores de muerte mejor caracterizados y sus correspondientes ligandos son: TNFR1/TNF-l, FasR/FasL, DR3/Apo3L, DR4/TRAIL y DR5/TRAIL. Una vez que se unen las subunidades FasR y FasL se produce la trimerización del complejo ligando-receptor, reclutando otras moléculas adaptadoras asociadas al dominio de muerte como FADD (proteína con dominio de muerte asociado a Fas) o RIP (proteína de interacción con el receptor). Estas últimas, asu vez promueven el reclutamiento de las procaspasas iniciadoras-8 y -10, formándose así el complejo inductor de muerte DISC. Figura 3. Diferentes receptores de muerte. Activación de caspasa 8/10 por los receptores de muerte. 33 En la vía extrínsica existen dos mecanismos de señalización intracelular, que dependen del tipo celular: Tipo I: la activación de la caspasa-8 es suficiente para activar las caspasas efectoras (-3, -6 y -7) y llevar a la célula a su muerte por apoptósis. Este tipo de inducción no precisa de la mitocondria y por tanto no está inhibida por factores antiapoptóticos como Bcl-2 o Bcl-XL, ya que no requiere la amplificación de la señal mediante factores pro-apoptóticos mitocondriales. Tipo II: la activación de la caspasa-8 no es suficiente para activar eficientemente otras caspasas y se hace necesaria la amplificacicón de la señal. En estas células la caspasa-8 provoca la activación proteolítica de BID, que se trasloca a la mitocondria e interacciona con moléculas pro-apoptóticas de la familia Bcl-2 como son Bax y Bak, induciendo la liberación de citocromo c y otros factores pro-apoptóticos al citosol. Aquí el citocromo c se une al dominio C-terminal de la proteína Apaf-1 (factor de activación de la apoptosis) y esta unión produce un cambio conformacional en Apaf-1 que lo hace más flexible, y facilitando de esta manera la unión del ATP a sus dominios de unión a nucleótidos. Se forma de esta manera el apoptosoma, que consiste en un complejo formado por siete moléculas de Apaf-1 interaccionando por los extremos N-terminal, a las que se une dATP, citocromo c, y finalmente la caspasa-9 en su zona central por la interación de diminios CARD (dominios de reclutamiento de caspasas), provocando un cambio conformacional a una forma activa, capaz de activar a las caspasas ejecutoras -3, -6 y -7. El receptor de TNF-l (TNFR1) es una proteína de aproximadamente 55 kDa que se expresa en la mayoría de las líneas celulares. Comparte con CD95 los tres subdominios ricos en cisteína situados en la región extracelular, pero a diferencia de la pareja formada por CD95/CD95L, el par TNFR1/TNF-l es capaz de transmitir a la célula dos tipos de señales muy distintas entre sí. Tras la unión de TNF-l a su receptor, el dominio intracelular es reconocido por una molécula que lleva un dominio de muerte asociado, TRADD, la cual puede unirse a FADD, RIP o a TRAF-2 (TNF-Rasociado al factor 2). FADD se une a la caspasa-8/-10 activándola mediante autoproteolisis e induciendo apoptosis. TRAF2 recluta proteínas inhibidoras de la apoptosis como cIAP-1 y cIAP-2, aunque también puede activar MAPKs. Si TRADD se une a la proteína RIP se induce la transcripción de los factores NF-kB y AP-1 promoviendo la inducción de genes de carácter proinflamatorio e inmunomodulador, oponiéndose a la acción proapoptótica del TNF. La unión del ligando al receptor puede dar lugar a dos tipos de complejos: i) Complejo I, formado por TRADD unido a RIP y a TRAF-2 que dará lugar a la señalización de NF-kB. ii) Complejo II, formado por TRADD unido a FADD que induce la autoproteolísis de caspasa -8/-10 promoviendo la apoptosis. 34 Los niveles de c-FLIP van a determinar la activación de una vía u otra. En el caso de TNFR1, la unión de su ligando sólo induce apoptosis en algunas líneas celulares cuando la síntesis de proteínas ha sido bloqueada. De ahí se deduce la existencia de algún factor que bloquea las señales apoptóticas derivadas de TNFR1, por lo que se podría sugerir que la expresión de este factor estará probablemente controlada a través de NF-kB y JNK/AP-1 (78). Además TNFR1, como se verá más adelante, puede activar dos tipos de esfingomielinasas (Smasas) (79) que a su vez podrían activar una serie de MAP-quinasas que activan la ruta de las caspasas. La vía intrínseca puede ser activada por una gran variedad de estímulos, como compuestos citotóxicos, radiación, estrés celular o la ausencia de factores de crecimiento (80), que actúan directamente sobre la mitocondria o a través de moléculas mediadoras. Además, la mitocondria, puede ser esencial en la amplificación de la señal apoptótica de la vía extrínseca. Esta vía es controlada por el equilibrio entre los miembros proy anti-apotóticos de la familia de proteínas Bcl2. Figura 4. Vía intrínseca o mitocondrial. Los miembros proapoptóticos pueden inducir la permeabilización de la membrana mitocondial externa y liberar moléculas solubles al citosol como: • Citocromo c, el cual estimula la formación del apoptosoma, seguida de la activación de la caspasa-9 e hidrólisis de las caspasas efectoras -3, -6 y -7 (81). 35 • Smac/DIABLO, el cual se une a las proteínas inhibidoras de la apoptosis (IAPs), impidiendo su unión a las caspasas (82). • Endonucleasa G, que es la principal nucleasa responsible de la degradación del ADN, la cual se transloca al núcleo tras su liberación de la mitocondria, y junto con exonucleasas y la ADNasa I producen el típico patrón en escalera vistos en electroforésis en gel de agarosa (83). • Htr/Omi, una serín-proteasa que funciona también como inhibidor de IAPs, mediante la inactivación por corte (84). Como resultado se produce la ruptura de la cadena de transporte de electrones mitocondrial, la liberación de iones superóxido (85,86) y la hiperpolarización de la membrana mitocondrial interna (que puede terminar con la dilatación de la matriz y la rotura de la membrana). Además, se abren los poros mitocondriales permitiendo la entrada de agua y solutos a la matriz, produciéndose un choque osmótico y la liberación del factor inductor de la apoptosis (AIF), que se transloca al núcleo y provoca la condensación y fragmentación del ADN en trozos de alto peso molecular. A nivel de la membrana celular, AIF activa a la flipasa e inhibe a la translocasa haciendo que la fosfatidilserina que en células normales se encuentran en la cara interna de la membrana se exponga ahora al exterior (87). La actividad de AIF es inhibida por la sobreexpresión de Bcl-2, pero no por los inhibidores de caspasas, es decir, su efecto es independiente de las caspasas (88). También se induce la activación de Bax que puede formar un canal en la membrana mitocondrial. Además de estas dos vías, existen señales apoptóticas que tienen su origen en el núcleo celular. La más importante es la protenína supresora de tumores p53, que se activa en el contexto de un daño celular irreparable en respuesta a diferentes tipos de estrés. Esta proteína nuclear puede inducir la expresión de numerosos factores proapoptóticos (ej. Puma, noxa, Bax, Apaf-1, Fas y DR5) (89). Proteínas reguladoras de la apoptosis: Proteínas de la familia Bcl-2 El primer miembro y que da nombre a la familia, Bcl-2, fué clonado a partir del punto de corte en la translocación cromosomal t(14:18), presente en el 85% de los linfomas foliculares de células B humanas, y se caracteriza por inhibir la muerte celular por apoptosis (80). Posteriormente, fué identificada toda una familia de proteinas relacionadas por su homología de secuencia y su participacióno en el control de la apoptosis. Los factores Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1, Bcl-B y Bfl-1 comparten con Bcl-2 una actividad anti apoptótica y una homología estructural en cuatro regiones 36 α-hélice homólogas a Bcl-2, BH1, BH2 y BH3. Finalmente, Bid, Bim, Bad, Bik, Puma, Noxa, Bmf, Hrk, Bk1, BNIP3 y Skipe, sólo poseen el dominio BH3 necesario y suficiente para promover la apoptosis (90). Los miembros de la familia Bcl-2 interactúan de forma dinámica para regular la apoptosis, mediante homo/hetero dimerización o mediante fosforilación y desfosforilación. Los miembros que sólo poseen el dominio BH3, necesitan heterodimerizar para ejercer su acción, uniéndose a las proteinas anti apoptóticas. Además, los miembros pro apoptóticos como Bax pueden heterodimerizar con los factores anti-apoptóticos como Bcl-2 o Bcl-xl y bloquear su actividad anti-apoptótica. Cuando Bcl2 está en exceso, las células están protegidas de la muerte celular, y cuando Bax está en exceso, la célula está avocada a entrar en apoptosis. Por tanto, la relación de los niveles de expresión entre los miembros proy anti apoptóticos de la familia Bcl-2 determina el destino celular (80). Figura 5. Regulación de la apoptosis por la familia Bcl-2. Estas proteinas, poseen localizaciones subcelulares diferentes. Los miembros anti-apoptóticos suelen aparecer como proteinas integrales en las membranas del núcleo, del retículo endoplásmico y fundamentalmente de la mitocondria, estabilizando la membrana mitocondrial y evitando la liberación de citocromo c. En cambio los miembros pro-apotóticos se encuentran en el citosol o asociados al citoesqueleto. En respuesta a un estímulo de muerte estos sufren un cambio conformacional que les permite integrarse en la membrana mitocondrial externa donde interactúan 37 Objetivos En base a lo anteriormente expuesto y dado que los estudios sobre las propiedades antitumorales de la melatonina en células sanguíneas es bastante limitado, nos planteamos como objetivo general estudiar el efecto antitumoral de la melatonina en células Molt-3, una línea celular de naturaleza linfoide que ha demostrado ser un buen modelo celular para este tipo de estudios. Más concretamente, los objetivos específicos planteados son: 1. Evaluar el efecto de la melatonina sobre la proliferación y la viabilidad celular. 2. Determinar si la melatonina induce activación de las vías apoptóticas. 3. Valorar el papel que desempeñan las caspasas. 4. Explorar si la melatonina induce generación de especies reactivas y determinar el papel de estas últimas. Material y métodos Productos y material fungible El medio de cultivo RPMI 1640, el suero bovino fetal (FBS), la tripsina, el HEPES (N-[2hidroxietil] piperazino N´-[2-etanosulfanílico]), la L-glutamina, el azul de tripán, el bicarbonato sódico y los antibióticos (estreptomicina, gentamicina y penicilina G), fueron adquiridos a Sigma Chemical Co. (St. Louise, MO, USA). Las botellas de cultivo de 75 cm2 y las placas de 48 y 96 pocillos estériles, así como el resto del material estéril utilizado fueron de Becton-Dickinson.El yoduro de propidio, la RNasa A y la proteinasa K, fueron adquiridos a Sigma Chemical Co. La agarosa se obtuvo de BioRad (Madrid, España) y el bromuro de etidio de Sigma/Aldrich (España). La anexina V se obtuvo de BD Pharmigen TM (Anexin V-FITC Apoptosis Detection Kit). Las sondas fluorescentes H2-DCF-DA (diacetato 2´,7´-dicloro-dihidro-fluoresceína) y JC-1 (yoduro de 5,5´6,6´-tetracloro-1,1´3,3´-tetraetil-benzimidazol-carbocianina) se obtuvieron de Molecular Probes (Invitrogen Corporation Carlsbad, CA). Los inhibidores de caspasas: z-VAD-fmk (benziloxicarbonil-Val-Ala-Asp (OME)-fluoro metil cetona), z-DEVD-fmk (benziloxicarbonil-AspGlu-Val-Asp-(OME) fluorometil cetona, z-LEHD-fmk (benziloxicarbonil-Leu-Glu-His-Asp-(OME) fluorometil cetona, z-IETD-fmk (benziloxicarbonil-Val-Asp-Val-Ala-Asp-(OME) fluorometil cetona, fueron obtenidos de Sigma, mientras que los inhibidores z-YVAD-fmk (benziloxicarbonilTyr-Val-Ala-Asp-(OME) fluorometil cetona y z-VEID-fmk (benziloxicarbonil-Val-Glu-Ile-Asp- (OME) fluorometil cetona, fueron obtenidos de Calbiochem.Trolox, N-acetil-L-cisteína (NAC), Antimicina A, Rotenone, catalasa (CAT) y superóxido dismutasa (SOD), ditiotreitol (DTT), y el resto de inhibidores fueron obtenidos de Sigma Chemical Co.Los sustratos colorimétricos DEVDpNA, ZETD-pNA y LEHD-pNA utilizados para determinar la actividad caspasa fueron obtenidos de Sigma Chemical Co.La acrilamida (bis N,N´-metilen-bis-acrilamida), persulfato amónico, TEMED (N,N,N,N,-tetrametil-etilendiamina), SDS (dodecil sulfato sódico) y los marcadores de pesos moleculares se obtuvieron de Bio-Rad. El azul de bromofenol, el BSA (albúmina de suero bovino) y el β-mercaptoetanol fueron de Sigma. Las membranas (PVDF) y el sustrato de revelado por quimioluminiscencia se obtuvo de Millipore (Billerica, MA, USA). Las placas para autorradiografía se adquirieron de Kodak.Los anticuerpos anti PARP, caspasa-3, caspasa-6, caspasa7, caspasa-8, caspasa-9, caspasa-2, citocromo c, Bcl-2, Bax, Bid y β-actina se obtuvieron de Beckton Dickinson. El agua desionizada y bidestilada se obtuvo con un equipo Milli-Q (Water Purification System, Millipore Ibérica, Madrid, España). El dimetilsulfóxido (DMSO), EDTA, EGTA, NaCl, glicerol, tris base, MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio), la sacarosa, tween 20, hidróxido de sodio y ácido clorhídrico se adquirieron de Sigma Chemical Co. 49 El resto de reactivos utilizados se obtuvieron de Sigma Chemical Co. Cultivo celular Para este trabajo el modelo experimental elegido fue la línea celular de leucemia humana Molt-3, las cuales se obtuvieron de la colección europea de cultivos celulares (European Collection of Cell Cultures, ECACC) y se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con un 10% (v/v) de suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor y antibiótico (100 unidades/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina) en una atmósfera humidificada (37ºC y 5% CO2) y a una densidad no superior a 0,5 x 106 células/ml [150,151]. A las células se les cambió el medio de cultivo tres veces por semana con una tasa de duplicación de 24 horas aproximadamente. Las células se contaron en un hematocitómetro y la viabilidad siempre fue superior al 95% utilizando el método de exclusión de azul de tripán. Evaluación de la proliferación y viabilidad celular Las células se cultivaron en placas de 96 pocillos por triplicado, a una densidad de 104 células por pocillo en 0,2 ml de medio de cultivo y en presencia de diferentes concentraciones de melatonina durante los tiempos indicados en cada experimento. Una vez transcurrido el tiempo de experimentación, las placas se centrifugaron (500 g, 10 min) a temperatura ambiente y se les eliminó el medio de cultivo mediante aspiración. A cada pocillo se le añadió 100 µl de MTT (0,5 mg/ml en medio de cultivo con antibiótico pero sin suero) y las placas se incubaron durante 4 horas a 37ºC. Una vez transcurrido dicho tiempo, se paró la reacción añadiendo 100 µl de SDS (20%) con HCl 0,02N e incubando la mezcla hasta la mañana siguiente. La cuantificación de la conversión del MTT (color amarillo) en su forma reducida (color púrpura) debido a la actividad de la enzima deshidrogenasa mitocondrial se determinó en un lector de microplacas (modelo 680 de Bio-Rad) a una longitud de onda de 570 nm, usando como blancos tres pocillos en los que no se cultivaron células y a los que se les añadió el medio con MTT. Esta técnica consiste en un ensayo de la reducción metabólica del bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio (MTT) debido a la actividad de la enzima deshidrogenasa mitocondrial [152]. Los datos se analizaron con el programa informático Prism 4.0 (GraphPad). Además, el número de células se determinó por el método de exclusión de azul-tripan (152). 50 Análisis del ciclo celular por citometría de flujo Esta técnica cuantitativa está basada en la fluorescencia emitida por diferentes fluorocromos capaces de unirse al ADN (ioduro de propido en este caso). Se puede detectar el porcentaje de células en cada fase del ciclo celular en función de su contenido en ADN. Las células en la fase G1 forman el primer pico, en la fase S las células están sintetizando ADN y en la fase G2/M las células presentan doble contenido en ADN que una célula normal y aparecerán como un segundo pico. Las células que contienen ADN hipodiploide (menor contenido en ADN que el contenido diploide de las células normales) son consideradas como células apoptóticas, y se localizan a la izquierda del pico G1 constituyendo la fracción SubG1 [150]. Una vez finalizados los correspondientes tratamientos, las células se lavaron con PBS frío y se fijaron durante al menos una hora en etanol al 70% a -20ºC. A continuación se lavaron dos veces con PBS, se centrifugaron a 500 g durante 10 minutos y se incubaron con 1 ml de una mezcla de 100 µg/ml de Rnasa A y 50 µg/ml de ioduro de propidio en PBS durante 1 hora a 37ºC en oscuridad. Una vez transcurrido el periodo de incubación, las muestras se analizaron en un citómetro de flujo Coulter Epics XL-MCL (Beckman Coulter), siendo estimuladas con una longitud de onda de 488 nm y detectándose la fluorescencia emitida por el complejo propidio-ADN a una longitud de onda de 617 nm mediante el detector FL3 (620 +/- 15nm) que incorpora el aparato. Se evaluaron 104 células en cada muestra.Los resultados se analizaron con el software EXPO 32 ADC SoftwareTM (Beckman Coulter) [153]. Determinación de la externalización de fosfatidilserina La fosfatidilserina es un fosfolípido que normalmente se encuentra en la cara interna de la membrana plasmática y se transloca a la cara externa en los estadíos tempranos del proceso de apoptosis. La proteina anexina V tiene afinidad por la fosfatidilserina en presencia de Ca2+ y permite detectar las células apoptóticas por citometría de flujo, previa incubación de las células con anexina V unida a un fluorocromo (FITC). De esta manera distinguimos: a) células viables, las cuales no unen anexina V al tener la membrana citosplasmática intacta y por este mismo motivo no permiten la entrada de ioduro de propidio (anexina V negativas / ioduro de propidio negativas); b) células en un estado de apoptosis temprana que permiten la unión de anexina V al tener parte de la fofatidilserina translocada al espacio extracelular, pero sin embargo no permiten la entrada de ioduro de propidio puesto que la membrana citoplásmica no llega a ser permeable aún a dicho 51 compuesto (anexina V positivas / ioduro de propidio negativas); c) células en apoptosis tardía, las cuales unen anexina V e incorporan ioduro de propidio (anexina V positivas / ioduro de propidio positivas); d) células necróticas que unen anexina V e incorporan ioduro de propidio o solamente incorporan ioduro de propidio. Cuando las células en cultivo sufren apoptosis, al no ser fagocitadas alcanzan un estadio de necrosis secundaria al proceso apoptótico, por lo cual puede aumentar el número de células que dan positivo con ioduro de propidio. Las células (1 x 106 por muestra) una vez tratadas se lavaron con PBS frío y se resuspendieron en tampón 10 mM HEPES/NaOH (pH 7.4), conteniendo 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2. Se transfirió 100 µl de la suspensión (105 células) a un tubo de cultivo de 5 ml, y se le añadió 5 µl de anexina V-FITC y 5 µl de ioduro de propidio. Se mezclaron suavemente las células y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente (25ºC) en oscuridad. Posteriormente se añadió 400 ul del tampón anterior a cada tubo y se analizó cada muestra por citometría de flujo. Microscopía electrónica de transmisión (MET) Para el procesado de muestras por microscopía electrónica de transmisión, las células se centrifugaron, se resuspendieron y se fijaron en glutaraldehído al 2,5% en tampón fosfato (0.1 M, pH 7,2) durante 24 horas. La postfijación se realizó en tetróxido de osmio (OsO4) al 1% en tampón fosfato. Las células se deshidrataron utilizando concentraciones crecientes de etanol. El pellet se incluyó en una resina EMBed 812 que polimerizó a 70 ºC. Los cortes para el procesado de las muestras se realizaron con un ultramicrotomo Reichert Ultracut seica. Los cortes semifinos fueron teñidos con azul de touloidina, mientras que los ultrafinos fueron contrastados con acetato de uranilo y plomo. Las fotografías fueron tomadas en un microscopio electrónico de transmisión Zeiss EM 910 (Carl ZEISS, Germany) equipado con cámara digital Proscan Slow-scan CCD-Camera for TAM (Fa. Proscan Elektronische Systeme GmbH, Germany) y software Soft Imaging System (Germany) en el Servicio de Microscopía Electrónica de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. 52 Determinación de la actividad caspasa Una vez las células fueron tratadas, se centrifugaron a 1.000 g durante 10 minutos a 4 ºC, se lavaron con PBS y se incubaron en hielo. A continuación se resuspendieron en tampón de lisis [50 mM HEPES (pH 7,4), 1 mM de dithiothreitol, 0.1 mM EDTA, 0.1% CHAPS] y se dejaron 5 minutos en hielo. A continuación se centrifugaron durante 10 minutos a 16.000 g y 4 ºC y posteriormente se determinó la concentración de proteínas en los sobrenadantes mediante el método de Bradford. Las muestras se almacenaron a -20 ºC hasta que fueron usadas para el estudio de la actividad enzimática de las caspasas. Cantidades equivalente de proteínas (~ 20 µg) fueron utilizadas. El incremento de la absorbancia a 405 nm después de la incubación a 37 ºC durante 1 hora fue indicativo de la actividad enzimática de las caspasas. Los sustratos colorimétricos utilizados en el ensayo para las actividades caspasa-3, caspasa-9 y caspasa-8 fueron DEVD-pNA, ZETD-pNA y LEHD-pNA respectivamente. Inmunodetección de proteínas (western blot) Después de los correspondientes tratamientos las células (1-10 x 106) fueron recolectadas, centrifugadas (500 g, 10 minutos, 4 ºC) y lavadas dos veces con PBS. En función de los objetivos experimentales las muestras se procesaron de diferente forma. Obtención de lisados celulares: el precipitado celular se resuspendió en 100 µl de tampón de lisis [Tris-HCl (pH 7,4), 2 mM EDTA, 137 mM NaCl, 10% glicerol, 1% Tritón X-100, 2 mM de pirofosfato de sodio, 20 mM de glicerofosfato de sodio, 10 mM de fluoruro sódico, 2 mM de ortovanadato sódico, 1 mM PMSF, 5 µg/ml leupeptina, 5 µg/ml pepstatina A, 5 µg/ml aprotinina] y se incubó durante 15 minutos a 4ºC. Los lisados se sonicaron (cuatro ciclos de 5 segundos) y se centrifugaron a 11.000 g durante 10 minutos a 4 ºC. El sobrenadante se guardó a -20 ºC hasta su utilización [150,152]. Obtención de fracciones subcelulares: el precipitado celular se resuspendió en 100 µl de tampón de homogeneización [20 mM HEPES-KOH (pH 7,5), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 250 mM sacarosa] con inhibidores de proteasas (0.1 mM PMSF, 10 µg/ml leupeptina, 10 µg/ml aprotinina, 10 µg/ml pepstatina A), y se incubó durante 15 minutos a 4ºC. Las células se lisaron usando una aguja de 21 G y el extracto resultante se centrifugó a 1.000 g durante 10 minutos a 4ºC. El precipidato (fracción nuclear) se resuspendió en 100 µl de tampón de homogeneización y se sonicó 3 veces durante 10 segundos a 4ºC. El sobrenadante resultante se centrifugó a 22.000 g durante 10 minutos a 4ºC. El precipitado (fracción mitocondrial) se 53 Para determinar el efecto de la melatonina sobre el crecimiento de las células linfoides humanas Molt-3, las células se incubaron durante 72 horas en presencia de concentraciones crecientes de melatonina y se evaluó la capacidad de reducir el MTT. Como se muestra en la figura 9, un claro descenso en la reducción de MTT fue observado en presencia de concentraciones crecientes (0.011mM) de melatonina. De esta manera, la menor actividad mitocondrial, aproximadamente 25-30% sobre los valores de control, se observó en el grupo incubado con 1 mM de la indolamina. No se detectó un efecto de la melatonina sobre la capacidad de las células para reducir el MTT a concentraciones que están próximas a los niveles fisiológicos en sangre (en el rango nanomolar) en comparación con los controles. Por lo tanto, los experimentos posteriores fueron realizados con la concentración de melatonina que mostró mayor efecto sobre la supresión en el crecimiento celular. Figura 8. Efecto de la melatonina sobre la reducción del MTT en células Molt-3. Las células fueron tratadas con las concentraciones indicadas de melatonina durante 72 horas y la capacidad de las mismas para reducir el sustrato cromogénico MTT se determinó como se describe en material y métodos. * P<0,05; diferencia significativa respecto al grupo control. Como un descenso en la reducción del MTT puede indicar inhibición en la proliferación celular, incremento en la muerte celular o ambos procesos, también se evaluó el efecto de la melatonina sobre el número de células con el método de exclusión del azul de tripan. Como se muestra en la figura 9, el tratamiento con la indolamina disminuyó el número de células viables, efecto que fue más evidente con tiempos de incubación prolongados (48 – 72 horas). Teniendo en cuenta esos resultados, el ensayo de reducción de MTT se consideró un método apropiado para estudiar la inhibición de la proliferación celular en respuesta a la melatonina en este tipo de células. 61 Figura 9. Efecto de la melatonina sobre el número de células Molt-3. Las Molt-3 se incubaron en ausencia (control) o presencia de 1 mM de melatonina durante los tiempos indicados. El número de células viables se determinó mediante el método de exclusión del azul de tripán. # P<0,05; diferencia significativa respecto al grupo tratado con melatonina. La melatonina ejerce propiedades antiproliferativas en diferentes tipos de células cancerosas mediante efectos tanto citotóxicos como citostáticos. La inducción de la muerte celular por apoptosis y la inducción de diferenciación celular han sido observados en diversos modelos celulares. Usando el colorante vital azul de tripan, hemos observado evidencias de citotoxicidad en las células Molt-3 ya que el porcentaje de células muertas (con color azul) fue mayor en el grupo tratado con melatonina en comparación con el grupo control (20% frente a 4%) en el intervalo de tiempo de 24-72 horas. Consistente con los resultados anteriores, al observar al microscopio de contraste de fase las células tratadas con melatonina a las 72 horas, fueron apreciados evidentes signos de daño celular. Una observación más detallada de las microfotografías revelaron un número significativamente menor de células en el grupo tratado con melatonina que en el grupo control (fig. 10), confirmando la acción antiproliferativa de la indolamina. 63 Figura 10. Las células Molt-3 se incubaron en ausencia (control) o presencia de 1 mM de melatonina durante 72 horas y se analizaron por microscopía de contraste de fase. Globalmente, estos resultados sugieren que la reducción en el número de células Molt-3 se debe a una acción citotóxica de la melatonina más que a un posible efecto citostático. La melatonina se une a los subtipos de receptores de membrana acoplados a proteína G sensibles a la toxina pertúsica MT1 y MT2, y su activación se ha demostrado que está involucrada en las propiedades antiproliferativas de esta indolamina en células de cáncer de colon humano (143), en cáncer de mama (144), en cáncer de próstata (145) y en melanoma (146). Por lo tanto, para comprobar si los receptores de membrana de melatonina se expresan en las células Molt-3, se empleó la técnica de RT-PCR usando parejas de oligonucleótidos específicos para los receptores MT1 y MT2 humanos y se analizaron las muestras mediante electroforésis en gel de agarosa. Como se muestra en la figura 11, los productos de PCR con los tamaños esperados para ambos receptores (632 pb para MT1 y 229 pb para MT2) fueron detectados. 64 [5´-TCAACCGCTACTGCTACATC-3´] 5´-TCATCAGTGGAGACGGTTTC-3´] [5´-TCATCGGCTCTGTCTTCAATA-3´] [5´-ACTGGGTGCTGGCGGTCTGGA-3´] Figura 11. Determinación de los subtipos de receptores de membrana para melatonina expresados en células Molt-3. Se extrajo el RNA y utilizando oligonucleótidos específicos para los receptores MT1 y MT2, alícuotas de cDNA se sometieron a RT-PCR. Las muestras se analizaron por electroforesis en gel de agarosa y tinción del DNA amplificado con bromuro de etidio. Para examinar si el efecto inhibitorio de la melatonina sobre el crecimiento celular estaba mediado por los receptores MT1/MT2, las células se preincubaron en presencia de la toxina pertúsica (PTX, 50 ng/ml), un inhibidor de la subfamilia Gi de las proteínas G acopladas a receptor, o en presencia de dos antagonistas de receptores de melatonina, el luzindol (10 µM) y el 4P-PDOT (0.1 µM). Los resultados demuestran que ni la toxina pertúsica (Fig. 12A) ni los antagonistas de los receptores (Fig. 12B) fueron capaces de prevenir el efecto inhibitorio de la melatonina sobre la proliferación celular. Estos resultados sugieren que la disminución en la proliferación celular es independiente de los receptores de membrana acoplados a la proteína G. 65 (A) (B) Figura 12. Evaluación del papel de los receptores de membrana en el efecto antiproliferativo de la melatonina en células Molt-3. (A) Las células fueron preincubadas en ausencia o presencia de PTX (50 ng/ml) durante 16 horas, y posteriormente se incubaron en presencia de melatonina (1 mM) durante 48 horas. La capacidad de las células de reducir el MTT como indicador de la actividad metabólica se determinó como se indica en material y métodos. (B) Las células se preincubaron en ausencia o presencia de luzindol (10 µM) o 4P-PDOT (0,1 µM) durante 48 horas. El número de células viables se determinó siguiendo el método de azul de tripan. En los siguientes experimentos, evaluamos si la inhibición en el crecimiento mediada por la melatonina estaba asociada con la inducción de apoptosis. Para ello, las células Molt-3 fueron tratadas con 1 mM de melatonina durante diferentes tiempos (24, 48 y 72 horas) y se analizó el contenido en ADN hipodiploide, la externalización de fosfatidilserina y los cambios morfológicos ultraestructurales. Como se ve en la figura 13A, un claro incremento en el número de células hipodiploides (pico sub-G1) fue observado en el grupo tratado con melatonina mediante citometría de flujo. El porcentaje de células hipodiploides aumentó tres veces en el grupo tratado con melatonina en comparación con el grupo control (15% frente a 5%) a las 24 horas mientras que el incremento fue de unas seis veces (30% frente a 5%) en los tratamientos más prolongados (fig. 13B). 66 (A) (B) Figura 13. Efecto de la melatonina sobre el ciclo celular en células Molt-3. Las células se incubaron en ausencia (control) o presencia de melatonina (1 mM) durante 48 horas (A) o durante los tiempos indicados (B) y se analizan por citometría de flujo tal y como se detalla en material y métodos. La externalización de la fosfatidilserina es un evento bioquímico temprano durante la activación de la apoptosis y el que aparezca este fosfolípido en la superficie celular prepara a las células que están muriéndose para ser digeridas y eliminadas por los fagocitos. Para determinar si la melatonina induce externalización de la fosfatidilserina, las células Molt-3 fueron incubadas en presencia de la indolamina durante 24 o 48 horas y analizadas posteriormente por citometría de flujo. La determinación del número de células positivas para anexina V (fig. 14), mostró que el porcentaje de células apoptóticas incrementó tres veces (10% en el grupo tratado con melatonina frente a 3.2% en el grupo control) y unas cinco veces (15.4% frente a 3.2%) después de un tratamiento durante 24 y 48 horas respectivamente. De esta manera, también se observó un incremento de unas 3 veces en el porcentaje de células positivas para anexina V e ioduro de propidio (células necróticas primarias o apoptóticas tardías / células necróticas secundarias) en el grupo tratado con melatonina (fig. 14). Además, también se visualizaron cambios ultraestructurales en las células mediante microscopía electrónica de transmisión como son la fragmentación nuclear y la condensación de la cromatina en respuesta al tratamiento con melatonina (fig. 15). Globalmente, estos resultados demuestran que la melatonina promueve mediante apoptosis la muerte de las células Molt-3. 67 Figura 14. Efecto de la melatonina sobre la externalización de fosfatidilserina en células Molt-3. Las células se incubaron en ausencia (control) o presencia de melatonina (1 mM) durante los tiempos señalados, se lavaron con PBS y se analizaron por citometría de flujo en presencia de yoduro de propidio y anexina V-FITC, tal y como se describe en material y métodos. Figura 15. Las células Molt-3 se cultivaron en ausencia (control) o presencia de melatonina (1 mM) durante 48 horas y se analizaron por microscopía electrónica. Uno de los más prominentes marcadores moleculares de apoptosis lo constituye la activación masiva de las caspasas, una clase específica de cisteín-proteasas que juegan un papel clave en la inducción de la apoptosis, tanto en células normales como en células tumorales, y que pueden ser activadas a través de dos rutas diferentes. La caspasa-8 es la principal iniciadora de la apoptosis en la vía extrinsica mientras que la caspasa-9 juega un papel similar en la ruta intrínseca (también conocida como vía mitocondrial). Ambas caspasas activan a la caspasa-3, la principal proteasa ejecutora, la cual a continuación hidroliza a una variedad de substratos y tambien puede activar a otras caspasas, desencadenando la apoptosis. Para determinar el papel de las caspasas en la citotoxicidad inducida por melatonina, las células se incubaron con 1 mM de la indolamina durante diferentes periodos de tiempo y los lisados celulares se ensayaron en presencia de los sustratos para 68 caspasa-3 (DEVD-pNA), caspasa-9 ( LEHD-pNA) y caspasa-8 (IETD-pNA). Como se observa en la figura 16, la actividad de las caspasas -3 y -9 aumentó a las 6 horas en las células tratadas con melatonina, en comparación con sus respectivos controles, y la máxima actividad se alcanzó a las 12 horas de tratamiento para ambas (4,6 veces para la caspasa-3 y 2,4 veces para la caspasa-9). Se observó un ligero aumento de la actividad de la caspasa-8 (1,4 veces) a las 12 horas en las células tratadas con melatonina, similar al aumento observado cuando las células fueron tratadas durante tiempos más prolongados (24 ó 48 horas; 1,6 veces). Figura 16. Efecto de la melatonina sobre la actividad caspasa en células Molt-3. Las células se incubaron en ausencia (control) o presencia de melatonina (1 mM) durante los tiempos indicados. Se obtuvieron las fracciones citosólicas y se evaluó la actividad caspasa de las mismas utilizando sustratos colorimétricos para caspasa-8 (IETD-pNA), caspasa-9 (LEHD-pNA) y caspasa-3 (DEVD-pNA). Las muestras se analizaron a 405 nm en un lector de microplacas. * P<0,05; diferencia significativa respecto al grupo control. El efecto de la melatonina sobre la activación de las caspasas también se evaluó mediante inmunoblot. En este estudio se incluyeron además caspasa-2, caspasa-6 y caspasa-7. La especificidad de la actividad proteasa de caspasa-2, caspasa-3 y caspasa-7 se solapan en gran medida, con una secuencia concenso de hidrólisis DEVD↓G; de esta manera, el péptido substrato DEVD-pNA puede ser hidrolizado tanto por la caspasa-3 como por la caspasa-7 y probablemente por la caspasa-2. Además de la caspasa-3 y la caspasa-7, la caspasa-6 también puede desempeñar un papel como caspasa ejecutora como se ha descrito en algunos modelos celulares. Como se ve en la figura 17, un descenso en los niveles de pro-caspasa-3, pro-caspasa-7 y pro-caspasa-6 (indicativo de su activación) se observó a las 3 horas de tratamiento con melatonina, mientras que la reducción de la pro-caspasa-2 (y el subsiguiente incremento en el fragmento de 30 kDa) requirió un mayor periodo de incubación (48 horas). De acuerdo con los resultados anteriores, el incremento en la 69 actividad de la caspasa-3 también está asociado con cambios bioquímicos tempranos ya que la hidrólisis e inactivación de su substrato específico poli(ADP)ribosa-polimerasa (PARP), una enzima nuclear de 116 kDa normalmente involucrada en la reparación y estabilidad del ADN y otros eventos celulares, ya fue detectada a las 3 horas de tratamiento. La activación de la caspasa-3 y la digestión en paralelo de PARP para dar un fragmento de 85 kDa fue dependiente del tiempo de tratamiento con melatonina. Sin embargo, no se observaron cambios en la expresión de la procaspasa-8 por inmunoblot a ninguno de los tiempos evaluados, lo cual está en consonancia con los resultados de la figura 16. En cambio, la activación de la caspasa-9 también fue detectada de manera temprana (3 horas), como se pone de manifiesto por la aparición del fragmento proteolítico de 35 kDa. En conjunto, estos resultados sugieren un papel principal de la vía intrínseca en la activación de la apoptosis inducida por melatonina en las células Molt-3. Figura 17. Análisis de la expresión de las caspasas en células Molt-3 tratadas con melatonina. Las células se incubaron en ausencia (control) o presencia de melatonina (1 mM) durante los tiempos indicados en la figura, se sonicaron y cantidades equivalentes de proteínas se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS. Las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF y la presencia de las caspasas se determinó por inmunodetección. La β-actina se determinó para confirmar que se cargó la misma cantidad de proteínas en cada canal. La liberación del citocromo c mitocondrial al citosol es un evento central en la señalización de la apoptosis. Para determinar si en la activación de la caspasa-9 está involucrado el citocromo c, las 70 estos datos sugieren que la cadena de transporte de electrones mitocondrial y la NADPH oxidasa son las principales fuentes de producción de ROS en las células Molt-3 tratadas con melatonina. Figura 24. Efecto de los inhibidores de la cadena transportadora de electrones mitocondrial y del inhibidor de la NADPH oxidasa sobre la generación de ROS en respuesta a melatonina. Las células fueron preincubadas con rotenona (2 µM), antimicina A (2 µg/ml), apocinina (300 µM) o difenil iodinio (10 µM) durante dos horas y a continuación se incubaron con melatonina (1mM) durante dos horas, analizándose a continuación la producción de ROS tal y como se describe en material y métodos. * P< 0,05; diferencia significativa respecto al control. # P<0,05; diferencia significativa respecto al tratamiento con melatonina. Para clarificar si ROS juega un papel importante en la muerte celular, las células Molt-3 fueron preincubadas durante 1 hora con diversos antioxidantes como el glutatión (GSH, 5 mM), la Nacetil-L-cisteina (NAC, 10 mM) o el análogo hidrosoluble de la vitamina E trolox (300 µM) y tratados a continuación con melatonina durante 48 horas. Como se muestra en la figura 25, los antioxidantes disminuyeron la formación intracelular de ROS inducida por melatonina, sin embargo, todos ellos fueron incapaces de revertir la inhibición de la proliferación celular (fig. 26A) o la muerte celular por apoptosis (fig. 26B) provocada por la indolamina. Al contrario de otros estudios en los que se ha demostrado que las especies reactivas de oxígeno están involucradas como mediadores en la citotoxicidad inducida por melatonina (148,149), nuestros resultados sugieren que la melatonina reduce la proliferación celular e induce apoptosis en las células Molt-3 a través de un mecanismo que es independiente de la generación de ROS. 77 (A) (B) (C) Figura 25. Los antioxidantes reducen los niveles de especies reactivas del oxígeno inducido por melatonina en células Molt-3. (A) Las células fueron preincubadas con L-glutation (GSH, 5 mM), N-acetil-L-cisteina (NAC, 10 mM) o trolox (300 µM) durante dos horas y a continuación tratadas con melatonina durante dos horas. La generación de ROS se determinó por citometría de flujo tal y como se describe en material y métodos.* P< 0,05; diferencia significativa respecto al control. # P<0,05; diferencia significativa respecto al tratamiento con melatonina. (B) Las células fueron preincubadas con L-glutation (GSH, 5 mM), N-acetil-L-cisteina (NAC, 10 mM) o trolox (300 µM) durante dos horas y a continuación tratadas con melatonina durante 48 horas. El número de células viables fue evaluado por el método de exclusión del azul de tripán, tal y como se describe en material y métodos. (C) Las células fueron preincubadas con Lglutation (GSH, 5 mM), N-acetil-L-cisteina (NAC, 10 mM) o Trolox (300 µM) durante dos horas y a continuación tratadas con melatonina durante 48 horas. El porcentaje de células hipodiploides se obtuvo mediante citometría de flujo tras ser teñidas con ioduro de propidio, tal y como se describe en material y métodos. * P< 0,05; diferencia significativa respecto al control. 78 Discusión La melatonina posee un amplio espectro de actividades biológicas, entre las que se encuentran las propiedades antitumorales. El objetivo del presente estudio fue investigar el efecto de la melatonina sobre las células de leucemia humana Molt-3, una línea celular linfoide maligna que es especialmente sensible a la acción citotóxica de compuestos naturales y que mantiene funcionales tanto la ruta apoptótica intrínseca como la extrínseca (150). En este trabajo se demuestra que el tratamiento con melatonina reduce la proliferación celular de las células Molt-3. Como la mayoría de los estudios realizados en células cancerígenas, los efectos antiproliferativos de la melatonina se observaron con concentraciones elevadas (>10 µM) en comparación con las encontradas en la circulación sanguínea durante la noche (~ 0,1 nM). Sin embargo, existen evidencias de que la concentración intracelular de melatonina puede ser varios órdenes de magnitud superior a la existente en la circulación sanguínea (151). La melatonina posee receptores de membrana (MT1 y MT2) acoplados a las proteínas G sensibles a la toxina pertúsica, los cuales se expresan tanto juntos como por separado (152) y que han demostrado estar involucrados en la inhibición de la proliferación en de las células cancerosas (153-157). Los experimentos de RT-PCR demostraron la existencia de transcritos para ambos subtipos de receptores, aunque los niveles del receptor MT1 fueron significativamente superiores que los de MT2; además, el tratamiento con melatonina aumentó la expresión de los mismos, lo cual sugiere un acoplamiento funcional del complejo melatonina-receptor. Mientras las concentraciones de melatonina próximas a la Kd para los receptores de melatonina (en el rango nanomolar) no tuvieron un efecto significativo sobre la proliferación de las células Molt-3, se realizaron experimentos para clarificar la posible participación de los receptores de membrana en el efecto antiproliferativo de las altas concentraciones de melatonina en esta línea celular. Tales experimentos incluyeron el cotratamiento con la indolamina y la toxina pertúsica además de dos antagonistas bien caracterizados de los receptores de membrana, el luzindol y el 4-P-PDOT. Los resultados sugieren que la unión a sus receptores de membrana no está implicada en la inhibición de la proliferación en células Molt-3, al contrario de lo descrito en otras líneas celulares humanas de próstata (158), de colon (159) o de células linfoides (160-162). Numerosos estudios avalan que la melatonina reduce la proliferación de las células cancerosas a través de mecanismos que inducen la diferenciación (163) o la muerte celular por apoptosis (164). En el presente estudio se muestra que la melatonina despliega propiedades antiproliferativas en la línea celular de leucemia humana Molt-3, efecto que está asociado con alteraciones en la progresión del ciclo celular. Una significativa acumulación en el número de células en la fase G1, a expensas 83 de la fase S y la G2-M, fue observada a las 12 horas de tratamiento con melatonina, seguido de un incremento en el número de células hipodiploides en comparación con las células control. Los efectos proapoptóticos de la melatonina sobre las células Molt-3 fueron confirmados posteriormente mediante análisis por citometría de flujo de células marcadas doblemente con anexina V-FITC y con ioduro de propidio, y también por microscopia electrónica de transmisión. Esta forma de muerte celular puede ocurrir con o sin la activación de las caspasas, una familia de cisteína proteasas que juegan un papel crítico en la apoptosis o en la activación proteolítica de citoqiomas en los mamíferos. Así, la utilización de esos mecanismos es dependiente del tipo de estímulo y del tipo celular. Se conocen dos vías apoptóticas bien caracterizadas en las células de mamíferos, denominadas como la ruta de los receptores de muerte (extrinseca, mediada por caspasa-8) y la ruta mitocondrial (intrínseca, mediada por caspasa-9). Ambas son consideradas como las responsables de si la mayoría, si no de todos los procesos apoptóticos dependientes de caspasas. Un ligero incremento en la actividad de la caspasa-8 se detectó a las 12 hotas en las células Molt-3 tratadas con melatonina. Sin embargo, la hidrólisis de la procaspasa-8 fue difícilmente apreciable por inmunoblot y la generación de tBid (Bid truncado) a partir de Bid (21 kDa), un substrato bien caracterizado de la caspasa-8, no fue observado. Estos resultados sugieren que la vía extrinseca no está involucrada en la iniciación del proceso apoptótico. En contraste, la melatonina indujo una temprana activación (36 horas) de las caspasas -3, -7, -6 y -9. La caspasa-3 es considerada como la principal caspasa ejecutora la cual reconoce e hidroliza un gran número de proteinas con diversas funciones. La hidrólisis de PARP, una proteína nuclear involucrada en la reparación del ADN, si es considerada como un marcador de la muerte celular por apoptosis y un substrato de la caspasa-3, también fue observada tempranamente. Esto indica procesamiento de la caspasa-3 y activación posterior de la misma; así, la activación de la caspasa-3 parece que involucra a la vía apoptótica intrínseca ya que el procesamiento de la procaspasa-9 y el incremento en la actividad de la caspasa-9 también fue un evento temprano. Los resultados claramente demuestran que la melatonina estimula el procesamiento proteolítico de otras caspasas ejecutoras como las caspasas -7 y -6 para dar lugar a sus formas activas. Estudios previos han demostrado que esas caspasas participan en la activación posterior de la caspasa-9, pero no son tan esenciales como la caspasa-3 (165). La activación de la caspasa-9 es un evento citosólico que normalmente requiere la presencia de citocromo c, una proteína que normalmente reside en el espacio intermembrana de la mitocondria. Por lo tanto, la mitocondria juega un papel principal en la 84 muerte celular cuando sus membranas se vuelven permeables. La permeabilización de la mambrana externa mitocondrial está controlada por diferentes miembros de la familia Bcl-2, lo cual constituye un punto de control celular crítico en la vía intrínseca de la apoptosis (166). Los resultados en el presente estudio sugieren que la melatonina induce la permeabilización de la membrana externa mitocondrial, puesto de manifiesto por una redistribución del citocromo c en el citosol, apreciado desde las 3 horas de tratamiento. Para dilucidar los mecanismos moleculares involucrados en la liberación de citocromo c de la mitocondria, los niveles de los factores antiapoptóticas (Bcl-2 y BclXL) y proapoptóticos (Bax) fueron analizados por inmunoblot en las células Molt-3. Interasantemente, la melatonina incrementóla expresión de Bax mientras que los niveles de Bcl-2 y BclXL no sufrieron cambios. Así, el ratio de las moléculas anti y proapotóticas constituye un regulador que establece el límite de susceptibilidad a la apoptosis para la vía intrínseca, la cual utiliza la mitocondria para amplificar la señal de muerte (167). Aunque la activación de Bax durante la apoptosis normalmente no requiere un incremento en la expresión de la proteína, se ha demostrado que varios agentes quimioterapéuticos elevan sus niveles mediante regulación transcripcional. Por ejemplo, todos los agentes quimioterapéuticos del grupo de las antraciclinas ejercensu efecto contra el cancer a través del aumento de Bax (168). El incremento en la expresión de Bax en respuesta a la melatonina ha sido previamente demostrado en células de carcinoma pancreático humano (169), en células de leucemia HL-60 (170) y en células de hepatocarcinoma HepG2 (171), y aumenta la utilidad de la melatonina para promover la permeabilización mitocondrial en céluas cancerosas donde Bcl-2 está sobreexpresado, confiriendoles resistencia a la quimioterapia (172). No obstante, está por dilucidar si el efecto de la melatonina sobre los niveles de Bax implica regulación transcripcional, un incremento en la vida media de la proteína o ambos factores. Es interesante señalar que la melatonina también indujo la hidrólisis de Bax para generar un fragmento de 18 kDa, del cual se sabe que muestra una capacidad mayor que la proteína completa para promover la permeabilidad de la membrana mitocondrial (173). En este trabajo también se muestran evidencias de que la liberación de citocromo c en las células Molt-3 no está asociada con una disipación del potencial de membrana mitocondrial. A este respecto, estudios previos han demostrado que no son necesarios cambios en el ∆Ψm sobre la permeabilización de la membrana externa mitocondrial para una completa liberación de citocromo c (174). Este efecto tardío ocurre como consecuencia de la activación de Bax y/o Bak y la formación de poros en la membrana externa (175). Al contrario, en algunos experimentos realizados se ha observado un ligero incremento en la fluorescencia de JC-1 en las células tratadas con melatonina, 85 efecto que ha sido interpretado por algunos autores como un incremento en el ∆Ψm o en el volumen mitocondrial (176). Para precisar el papel de las caspasas activadas por melatonina en las células Molt-3, se usaron inhibidores de caspasas tanto específicos como de amplio espectro. Los resultados indican que la muerte celular por apoptosis inducida por la melatonina depende de la activación de las caspasas ya que la apoptosis fue inhibida por el inhibidor general de caspasas z-VAD-fmk. En contraposición, los inhibidores específicos para caspasa-3/7, caspasa-8 o caspasa-9 fueron incapaces de bloquear la muerte celular, lo cual sugiere un incremento compensatorio en la activación de otras caspasas cuando la actividad de una caspasa particular es suprimida (177). Por ejemplo, z-DEVD-fmk es un inhibidor más potente para la caspasa-3 que para la caspasa-7 (178), por lo tanto en ausencia de actividad de caspasa-3 tanto la caspasa-7 como la caspasa-6 podrían incrementar su contribución (como caspasas ejecutoras) en la apoptosis inducida por melatonina. La mejor protección proporcionada por z-VAD-fmk frente a z-LEHD-fmk probablemente está causada por su mejor accesibilidad a la caspasa-9 (179). En este contexto, la caspasa-2 exhibe características tanto de una caspasa iniciadora como de una ejecutora (180) y la melatonina indujo el procesamiento del zimógeno a las 48 horas. Sin embargo, será necesario realizar más estudios para determinar si la hidrólisis de la caspasa-2 está asociada con un incremento de la actividad y también si está involucrada en la inducción de apoptosis por la melatonina. En este contexto, es interesante notar que la activación de las caspasas se observó desde las 3 horas y que la máxima actividad de la caspasa-3 se alcanzó a las 12 horas de tratamiento, pero se necesitó periodos de tratamiento mayores (48-72 horas) para alcanzar el mayor porcentaje de células apoptóticas. Nuestros resultados también demuestran que la melatonian tiene la capacidad para activar una muerte celular independiente de caspasas. El pretratamiento de las células Molt-3 con el inhibidor general de caspasas z-VAD-fmk bloqueó la apoptosis inducida por melatonina, pero no atenuó la reducción en el número de células viables estimulada por la melatonina. De esta manera, estudios de citometría de flujo revelaron un incremento significativo en la población de células positivas para anexina V y para ioduro de propidio después del tratamiento con melatonina mas z-VAD-fmk, lo cual sugiere que la melatonina podría inducir una muerte celular regulada por necrosis (181). Existen evidencias de que la muerte celular independiente de caspasas podría estar iniciada por una cascada apoptótica (182,183), aunque los mediadores apoptóticos normalmente inhiben la ruta de muerte celular independiente de caspasas. Como la muerte celular por apoptósis no siempre constituye un objetivo terapéuticamente deseable (184), los compuestos que inducen una modalidad 86 Bibliografía 1 Lerner, A.B., Case, J.D., Takahashi, Y., 1960. 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Reiter 4 and José Quintana 1,3 1Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Fisiología, Genética e Inmunología, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria; 2Departamento de Ciencias Clínicas, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Spain; 3Instituto Canario de Investigación del Cáncer (ICIC, Canary Islands, Spain); 4Department of Cellular and Structural Biology, The University of Texas Health Science at San Antonio, San Antonio, TX, USA Running title: melatonin-induced cell growth inhibition on Molt-3 cells Key words: melatonin, cell proliferation, ROS, caspases, Molt-3, antioxidants Corresponding author: Dr José Quintana Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Fisiología, Genética e Inmunología Facultad de Ciencias de la Salud Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Plaza Dr Pasteur s/n 35016 Las Palmas de Gran Canaria Spain E-mail: [email protected] Melatonin decreases cell proliferation and induces apoptotic cell death in human leukemia molt-3 cells J. Perdomo, J. Cabrera, J. Francisco Loro, F. Estévez, J. Quintana 6th European Congress of Pharmacology. EPHAR 2012. July, 17-20. Granada/ Spain