Estudio de biomarcadores de daño cardiopulmonar en la dirofilariosis canina por Dirofilaria immitis

ESTUDIO DE BIOMARCADORES DE DAÑO CARDIOPULMONAR EN LA DIROFILARIOSIS CANINA POR DIROFILARIA IMMITIS PROGRAMA DE DOCTORADO EN CLÍNICA E INVESTIGACIÓN TERAPÉUTICA Doctoranda Elena Carretón Gómez Arucas, 1 de Abril de 2013 DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA ANIMAL, PRODUCCIÓN ANIMAL, BROMATOLOGÍA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS TESIS DOCTORAL Doctorado Europeo UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA Departamento de Patología Animal, Producción Animal Bromatología y Tecnología de los Alimentos 35413 – ARUCAS –LAS PALMAS – ESPAÑA TELÉFONOS: (928) 451099 / 451137 – FAX : (928) 451142 – E-mail:[email protected] José Alberto Montoya Alonso, Doctor en veterinaria y Catedrático de Medicina y Cirugía Animal del Departamento de Patología Animal, Producción Animal, Bromatología y Tecnología de los Alimentos de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria y Director del programa de doctorado “CLÍNICA E INVESTIGACIÓN TERAPÉUTICA” INFORMA: Que Dª. Elena Carretón Gómez, Licenciada en Veterinaria, ha realizado, bajo mi dirección y asesoramiento, el presente trabajo de tesis doctoral titulado: “Estudio de biomarcadores de daño cardiopulmonar en la dirofilariosis canina por Dirofilaria immitis”que considero reúne las condiciones y calidad científica necesarias, para su presentación y defensa, para optar al título de Doctora Europea por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. Lo que firmo, a los efectos oportunos, en Arucas (Las Palmas) a dieciocho de marzo de dos mil y trece J. Alberto Montoya Alonso Catedrático de Medicina y Cirugía Animal Fernando Simón Martín, Doctor en Biología y Catedrático de Parasitología del Departamento de Biología Animal, Parasitología, Ecología, Edafología y Química Agrícola de la Universidad de Salamanca, INFORMA: Que Dª. Elena Carretón Gómez, Licenciada en Veterinaria, ha realizado, bajo mi codirección y asesoramiento, la presente Tesis Doctoral titulada: “Estudio de biomarcadores de daño cardiopulmonar en la dirofilariosis canina por Dirofilaria immitis”, que a mi juicio reúne las condiciones y calidad científica necesarias para su presentación y defensa, para optar al título de Doctora Europea por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. Lo que firmo, para que surta los efectos a que haya lugar, en Salamanca a dieciocho de marzo de dos mil y trece, Fdo.: Prof. Fernando Simón Martín Universidad de Salamanca Dipartimento di Scienze Veterinarie e Sanità Pubblica via Celoria, 10 - 20133 Milano, Italy Tel 02 50318070 - Fax 02 50318079 - E-mail: [email protected] 1 Oggetto: Doctoranda Elena Carretón Gómez Tesis Doctoral “Estudio de biomarcadores de daño cardiopulmonar en la dirofilariosis canina por Dirofilaria immitis” Programa de Doctorado en Clínica e Investigación Terapéutica Dichiaro di avere preso visione della tesi in oggetto in tutte le sue parti e di avere steso il seguente giudizio sulla base del lavoro di ricerca svolto dalla dottoranda e sulle mie conoscenze dell’argomento in qualità di esperto della filariosi cardipolmonare del cane. Milano 11 aprile 2013 Claudio Genchi, DMV, Dipl. EVPC Ordinario di Malattie Parassitarie Presidente del Comitato di Direzione della Facoltà di Medicina Veterinaria Università degli Studi di Milano Dipartimento di Scienze Veterinarie e Sanità Pubblica via Celoria, 10 - 20133 Milano, Italy Tel 02 50318070 - Fax 02 50318079 - E-mail: [email protected] 2 La tesi ha una parte di introduzione sulla tassonomia, biologia e ruolo dell’endosimbionte Wolbachia, epidemiologia, patogenesi, clinica e diagnosi della filariosi cardiopolmonare del cane. Inoltre due capitoli sono dedicati alla profilassi e alla terapia della infezione. L’analisi è completa e ben fatta, ricca di spunti critici che dimostrano la profonda conoscenza da parte della dottoranda dell’argomento trattato non solo dal punto di vista bibliografico, ma anche scaturita dall’esperienza diretta che la candidata ha avuto modo di formarsi sui vari aspetti clinico-patologici della malattia nel corso della sua attività di ricerca presso il Departamento de Patología animal, Producción animal, Bromatología y Tecnología de los Alimentos della Facoltà di Medicina Veterinaria de Las Palmas de Gan Canaria. La seconda parte della tesi riguarda nello specifico l’attività di ricerca della dottoranda relativa allo studio di biomarcatori del danno cardiaco in corso di filariosi cardiopolmonare del cane. Anche in questo caso, una parte introduttiva è dedicata alla storia dei biomarcatori cardiaci e la loro applicazione a fine diagnostico sia in ambito di medicina umana, sia di medicina veterinaria. Il lavoro di ricerca della dottoranda riguarda in particolare tre marcatori: le troponine cardiache (T e I), la mioglobina e il dimero-D. Anche in questo caso il significato di questi marcatori è ben illustrato, denota una completa conoscenza dell’argomenti da parte della dottoranda che ne espone con chiarezza il significato prognostico e diagnostico, i limiti e i vantaggi. I risultati riguardanti i marcatori cardiaci sono illustrati in quattro lavori scientifici su Veterinary Parasitology, pubblicazione ad elevato IF e di riferimento per i ricercatori che si interessino dei vari aspetti che riguardano, tra l’altro, la patogenesi e la diagnosi della malattie parassitarie, e una in corso di stampa sullo stesso A Alberto, quien me ha hecho descubrir la magia de la investigación, me ha inspirado y me ha motivado durante estos geniales cuatro años. ¡Gracias jefe! Ilustraciones de la portada cedidas por Carlos Montoya Alonso “Yeah, Mr. White! Yeah,science!” (Jesse Pinkman, Breaking Bad) Esta tesis ha sido parcialmente fi nanciada por la Agencia Canaria de Investigación, Innovación y Sociedad de la Información a través del Programa de Formación de Personal Investigador, y por los proyectos de investigación C20080100093 y SA090/A09. “Back off, man. I am a scientist”. (Dr. Peter Venkman, Ghostbusters) Agradecimientos i ¿Con qué sueñan las fi larias? Cuando me preguntan cómo acabé haciendo una tesis, yo siempre cuento la misma historia. Cuando terminé la carrera dije “no pienso volver a pisar esta facultad en lo que me queda de vida”. Me había costado mucho esfuerzo terminar la carrera, estaba hasta las narices y lo decía en serio. Por hablar, apenas un año después me surgió la oportunidad de pedir una beca. No estaba nada convencida, pero, total, NO ME LA IBAN A DAR. Pues me la dieron. Así que cuando empecé esta aventura yo no sabía dónde me estaba metiendo, ¿una tesis, yo? ¿de qué? ¿¿de fi larias?? Ah, bueno, pero si es con Montoya, entonces sí… Y así empezó; y antes de darme cuenta de lo que ha pasado, ya han terminado estos cuatro años. ¡Así de rápido se me ha pasado el tiempo!. Es una gran verdad eso de que la felicidad consiste en querer lo que uno hace, y durante estos cuatro años he descubierto una profesión que me tiene enamorada, y ningún día me ha costado levantarme de la cama para venir a currar, ni jamás me ha importado trabajar los fi nes de semana. Esos gusanillos blanquecinos, alargados que protestan cuando los obligas a salir del perro, esos bichejos desconocidos me han ido fascinando y conquistando con el paso del tiempo; ¡qué cosa tan asombrosa! Pero todo este panorama que pinto así, tan bonito y feliz, jamás hubiera sido real si no es gracias a la gente que me ha rodeado y acompañado durante todo este tiempo. Cuando vives lejos de tu casa y de tu familia, los amigos y la gente que te rodea se convierten en tu nueva familia, y yo no podría haber sido más afortunada. Por eso, me ha costado mucho ponerme a escribir los agradecimientos de esta tesis: no sé si voy a ser capaz de expresar el profundo y sincero agradecimiento que siento hacia tantísima gente, pero vamos allá. Primero, a El Jefe, así, en mayúsculas, porque gracias a él esta tesis es lo que es, y discúlpenme la poca modestia y la bilbainada: ¡una pedazo de tesis!. Por su fe en mí al Agradecimientos ii empezar este trabajo, cuando yo no sabía ni lo que estaba haciendo, su inmenso cariño, confi anza y amistad, por luchar por mí. ¡¡Gracias boss!! A “la jefa”, a Cande, que ha sido más que una jefa; una amiga, una madre. Qué grandes momentos hemos pasado en las prácticas persiguiendo a las vacas, gracias por la perseverancia en intentar convertirme en una chica guapa; poco a poco lo vamos logrando. A ambos, gracias por cuidarme, por preocuparse por mí, ¡por todo! No hay palabras. Igualmente, muchas gracias a Fernando, co-director de esta tesis, por su cariño, su paciencia, sus palabras de ánimo, su disposición y por hacerme sentir como en casa cuando estuve en Salamanca. Gracias a mis amigos y compañeros veterinarios, aquellos con quienes compartí tantas horas de clase y biblioteca. A Javier y Miriam, ellos no lo saben, pero son los primeros culpables de yo esté ahora aquí. Todo se remonta al examen de Cría y “el mejor correo recibido del año” (qué gran e-mail). Ambos son grandísimas personas, generosas hasta el infi nito, increíblemente humildes y jamás podré agradecerles lo sufi ciente su gran amistad. A Giada, generosa hasta decir basta, siempre preocupada por los demás, y con aventuras locas que sólo le pueden pasar a ella. A María y Fede, los aventureros. Gracias Meri por aconsejarme y escucharme en los momentos difíciles. A Sonia y Gustavo, gracias por vuestro cariño; A Sonia la quiero con locura desde el día que una extraña se le acercó, con toda su jeta, a pedirle los apuntes de bioquímica y dijo que sí; a Gustavo, por esa risa tan contagiosa cuando se ríe de mis chistes malos (y mira que son malos!). A Delia, porque aunque nos veamos poco sigue siendo una inspiración en mi vida, una de mis mejores amigas y no veo el momento de que nos tomemos esas cervezas que tenemos pendientes. Igualmente a Elvira, Olivia, Natacha, Ana, May, Nuria, Alexis “cardiocompi”… seguro que me dejo a alguien y luego me daré de cabezazos cuando tenga el libro impreso (lo tendré que añadir en un post-it): muchas gracias por estar ahí, por las fi estas veterinarias, por recibirme con un abrazo cada vez que nos vemos. A Yeray, Aldara por todo lo que aprendí con vosotros, y a Ofelia, mi amatxu canaria, por escucharme y aconsejarme en esos momentos tan puñeteros que atravesaba cuando trabajabamos juntas. A todos ellos, ¡¡¡muchísimas gracias!!! por vuestra eterna paciencia conmigo, por aguantaros la risa cuando digo “esta semana os llamo”, o “la próxima semana os voy a visitar”. Gracias por perdonarme por el tiempo que no os dedico; no podía haber conocido mejores personas, no podría tener mejores amigos ni podría sentirme más afortunada. La Facultad de Veterinaria se ha convertido en mi casa durante estos años; aquí he pasado más tiempo que en ningún otro sitio con largas e interminables jornadas de trabajo. Que disfrutara de ello, yo que juré por dios que jamás volvería a pasar por aquí, se lo debo a gran parte de la gente que aquí trabaja: Agradecimientos iii A los de la cafetería, que me ha cuidado como una madre: primero Moneiba y Maite, quienes me reñían cuando me alimentaba mal y me obligaban a comer sano (se comía lo que ellas decían, y atrévete a sugerir lo contrario); luego Loli, Nuhacet y Carlos, quienes cocinan de maravilla (sello “amatxu approved”) y da igual lo cansados que estén, que a diario te reciben con una sonrisa y un café cortado bien cargado. A la gente de la conserjería, por su amabilidad y por todos (muchos) los favores que me han hecho; igualmente a Carmelo, que se le echa de menos. A Antonio Mejías, único en la facultad y quien, con sólo mirarte la cara, sabe tu nombre completo, DNI, fecha de nacimiento, teléfono, dirección, grupo sanguíneo y nombre de tus padres. A Mari Carmen y Guillermo, por ayudarme, por informarme, por los favores y por perdonarme los despistes. A Gloria, por su cariño, por recibirme siempre con tanta alegría y por la compañía a la hora de comer cuando casi es la hora de merendar. A Rosi, Fátima y Gloria, por tener siempre mi sitio limpito; Mauro, Araña, Nemesio… en especial las risotadas de Dulce, por acompañarme los fi nes de semana. Sonia, que mimaba el jardín de la facultad y siempre tenía un rato para preguntar qué tal estaba. Del Departamento, a Nuria y Ricardo, por su infi nita paciencia (yo y mis papeles; mis papeles y yo) y por recibirme siempre con una sonrisa; especialmente a Ricardo, por su gran cariño, por llamarme guapa y por preocuparse cuando mi trabajo estuvo en peligro. A los profesores, junto a los que jamás dejé de sentirme una estudiante pero siempre me trataron con todo el respeto y cariño: Eligia, Inma, Mayte, Oscar, Juan Alberto, Carlos, ¡¡muchas gracias!! Ahora voy chuleando de que me codeo con los profes. Las chicas de parasitología (sí, ya sé que algún chico también hay por ahí) por su amistad y buen compañerisno, por echar una mano cuando hizo falta y estar siempre dispuestas a ceder cualquier tipo de material. Por el curro que se pegaron cuando quisieron echarnos. Cuando quiera armar una revolución, ya sé a quién llamar. Su laboratorio siempre me pareció el camarote de los hermanos Marx: nunca faltaba la comida, gente entrando y saliendo contínuamente, y pasándoselo bien. A Adassa, Leire, Davinia, Julia, Irene ¡gracias! En Anatomía, muchas gracias a Diego y a Alberto por echarme una mano y prestarme material e instalaciones cuando lo he necesitado. A toda la gente del Hospital Clínico Veterinario, ¡gracias a todos ellos! A los becarios, a Juanmi y Oliver, a Luigi por esos recibimientos tan efusivos, a Pitti, a Manola, a Paco, a Antonio por ayudarme siempre que lo he necesitado, a Tere por su sonrisa y cariño (¡qué grande!), a Débora porque sólo ella puede contestar una llamada, abrir una fi cha a un cliente, cobrar una consulta, todo a la vez y aún preguntarme “dime ¿qué necesitas?”. iv Mis compañeros de despacho, la pandilla de becarios, sin ellos esto no hubiera sido lo mismo. Noé, cuya compañía echo mucho de menos, con esos altibajos que hemos pasado juntos, esos fi nes de semana hablando y trabajando. Ojalá le vaya bien en esa nueva aventura que le ha llevado tan lejos de su querida isla. A Luca y Jorgi, por aguantarme (porque hay que aguantarme) y por su paciencia y por los buenos ratos. Aquí donde me ven, yo fui una becaria con becaria. Clarita, que fue alumna de colaboración durante un curso, era una superbecaria. Juntas hacíamos un equipo imparable; qué gran investigadora hubiera sido. Auténtica domadora de gatos, y protestona cuando tenía que trabajar en el laboratorio. Ella ya sabe, que siempre que la veo se lo digo: “¡¡Si yo lo hubiera llegado a saber..!!”. Ahora tenemos de becario a Cristian, un tío brillante, listo, despierto y siempre dispuesto a currar. ¡Y encima le gusta la investigación! Afortunado va a ser el equipo con el que acabe trabajando. A Sara y Tara, Tara y Sara, el dúo inseparable. Juntas hacen sinergia y arrasan allá por donde pasan. Fueron ellas solas a un congreso en Murcia y no solo se trajeron un premio, sino que casi se traen el congreso entero. No dejan títere con cabeza y pasé con ellas muy buenos ratos en nuestros viajes a Santa Lucía. Siempre que han podido se han ofrecido a echar una mano y siempre de buen humor. Sea lo que sea que hagan cuando terminen la carrera, sé que van a triunfar. Además, gracias a todos los estudiantes que se ofrecieron voluntarios para acompañarme en los viajes a las perreras y albergues. Liados con las clases, las prácticas, los trabajos, los exámenes, y aún sacaban tiempo e interés para venir conmigo. Y, en general, a todos esos estudiantes de veterinaria, siempre dispuestos a currar, a ayudar, siempre con ganas de aprender. Indulgentes con mis fallos, con ellos descubrí el placer de enseñar lo poquito que sé. ¡Me dicen que yo acabaría diciendo ésto hace unos años, y anda que no me hubiera reído! A todos los voluntarios y la gente que trabaja en los albergues animales, perreras municipales y protectoras, así como compañeros veterinarios que han ayudado de una manera u otra durante el desarrollo de esta tesis: Sin ellos, esta tesis jamás hubiera sido posible. Muchas gracias a Lydia (Adopta un amigo en Gran Canaria), eterna optimista y siempre riendo a carcajadas, incluso cuando la vida la ha estado machacando; nos debemos muchas cervezas mutuamente. A Andrea (Arycan), quién confi ó en mí para tratar sus animales y para dar una conferencia sin apenas conocerme. A Oliver, de la perrera de Mogán, currándoselo en su tiempo libre para convertir una perrera en la envidia de muchos albergues. A Iván, el “Cesar Millán” de Santa Lucía, un mago maximizando re- Agradecimientos v cursos para que los perros estuvieran en las mejores condiciones con cuatro duros (iba a decir “con cuatro perras”, pero quedaba un poco raro). Especialmente quiero agradecer a Rubén y José Miguel, de Santa Brígida, toda su ayuda y amistad durante el tiempo que estuve yendo a la perrera municipal. Grandísimas personas que, sin pedir nada a cambio, y sin necesidad ninguna, siempre estuvieron dispuestos a ayudarme en lo que hiciera falta. Y sobre todo, por el café después de acabar la tarea. Y el mejor regalo, “Cuarentaicinco”, una perrita con fi larias de la que me enamoré (auténtico fl echazo), que José Miguel me cuidó durante meses y que ahora corretea feliz y enamora a la gente allá por donde pasa. Así es ella, el perro nº 45 de mi tesis. ¡Muchísimas gracias a los dos! A la gente del albergue insular; currantes incansables, en una perrera que parece un sumidero donde no paran de entrar perros y más perros abandonados. Muchas gracias por todos los favores, por hacerme un huequito de su tiempo cuando tienen tantísimas tareas, por recibirme con una sonrisa y por las cenas de Navidad. A Tere, Tito, Juani, Mario y, especialmente, a Natacha, por su amistad y su cariño. Y no podía terminar sin dar las gracias a Gusi, esa veterinaria incansable, todoterreno, hiperactiva y tremendamente cariñosa. Sólo ella puede ser capaz de poner fi rmes a los cazadores de la isla para que cuiden a sus perros adecuadamente. También quería agradecer a la gente del Colegio de Veterinarios de Las Palmas, por esos ratos tan buenos, por todo lo que he aprendido con ellos y por su paciencia conmigo. A Fran, Fátima, Tere, Estrella, Javi y Sole: ¡gracias! Sois la envidia de muchos colegios veterinarios. Una de las mejores cosas de este trabajo ha sido conocer gente nueva, “colegas” de profesión lejos de las islas. Chifl ados que también trabajan con esos parásitos espaguéticos y se nota que disfrutan de lo que hacen: en la Facultad de Farmacia de la Universidad de Salamanca está el laboratorio de Parasitología; ahí trabajan Rodrigo, quien sólo abandonaría el laboratorio si fuera para irse de gira con los Celtas Cortos; una persona incansable e imparable, una máquina de investigar y un grandísimo amigo tanto para las risas como en los malos momentos ¡Feliz Navidad, Morchón!. Javi, tronchante con su humor corrosivo, el mejor gusto en Cultura Popular (Chiquito for president y por la beatifi cación de Esteso!), un tío inquieto que no le basta con ser investigador sino que también es músico, actor, y en breve socio co-fundador de la revista “Parasitology Food” (nos vamos a forrar, socio). Isabel “winter is coming”, quién con toda su paciencia me enseñó diferentes técnicas de laboratorio y diferentes bares de Salamanca; disfruté golpeando las placas de ELISA tanto como esas cervezas que nos tomamos juntas, y estoy deseando que volvamos a repetir (ambas actividades). Y fi nalmente y, de nuevo, a Fernando por su paciencia intentando mantener el orden en el laboratorio. Muchas 2 “Research is what I’m doing when I don’t know what I’m doing.” (Wernher von Braun) Introducción 3 La dirofi lariosis cardiopulmonar es una enfermedad de carácter grave producida por el nematodo Dirofi laria immitis que, en su forma adulta, se localiza principalmente en las arterias pulmonares y en el ventrículo derecho de su hospedador, produciendo la dirofi lariosis cardiopulmonar, un proceso también conocido como “enfermedad del gusano del corazón” o “heartworm disease”. La denominación de la enfermedad hace referencia a que, durante muchos años, los veterinarios observaban los parásitos en el corazón derecho durante el examen postmortem; sin embargo, los parásitos generalmente se encuentran en la arteria pulmonar y sólo pasan al ventrículo derecho en las fases más avanzadas de la enfermedad. Su curso es progresivo y potencialmente fatal, agravado por el hecho de que sus primeras fases son asintomáticas y cuando el animal infectado presenta sintomatología, esta suele ser característica de un cuadro avanzado de la enfermedad. En zonas endémicas, los veterinarios incluyen la dirofi lariosis en el diagnóstico diferencial cuando se presenta un animal con sintomatología cardiorrespiratoria. Esta parasitosis tiene distribución mundial, con amplia presencia en zonas templadas, subtropicales y tropicales, donde proliferan los mosquitos que actúan como vectores. Además, en los últimos años se ha constatado su expansión desde zonas endémicas a zonas previamente consideradas libres de la enfermedad. Esto probablemente se deba a una serie de factores, como son el cambio climático, la urbanización de nuevas áreas en las que se crea microclimas adecuados para el mantenimiento de los mosquitos transmisores, así como la formación de nuevas zonas de cultivo. Junto con el aumento del libre transporte y comercio de animales reservorios de la enfermedad y la introducción de nuevas especies de mosquitos potencialmente transmisores, la expansión de la enfermedad parece inevitable, por lo que el papel tanto del veterinario como del propietario en el control de esta enfermedad es sumamente importante. El hombre también puede resultar infectado en las zonas donde la dirofi lariosis es endémica en perros, desarrollando como signo característico un nódulo pulmonar, denominándose dirofi lariosis pulmonar humana. Dichos nódulos son benignos y generalmente asintomáticos. No obstante, su descubrimiento provoca la sospecha de una causa maligna, induciendo al médico a intervenir quirúrgicamente. Introducción 4 El tratamiento de esta enfermedad consiste en eliminar todas las fases parasitarias del organismo del animal. Se trata de un procedimiento largo, agresivo y no exento de riesgo para la salud y la vida del animal, siendo un desafío para el veterinario en las formas más avanzadas de la enfermedad. Afortunadamente, el protocolo de tratamiento adulticida ha ido evolucionando desde hace años y el paso de la tiacetarsamida a la melarsomina ha mejorado exponencialmente el porcentaje de tratamientos llevado a cabo con éxito. Debido a su gravedad y a la amenaza que supone para la vida de la mascota, su amplia distribución y su potencial zoonósico, resulta de gran interés profundizar en el estudio de la patología de esta enfermedad. Los biomarcadores de daño cardiopulmonar llevan desarrollándose en la medicina humana desde los años 50, cuando se comenzó a emplear la determinación de la actividad de la enzima aspartato aminotransferasa (AST) para diagnosticar infarto agudo de miocardio. A partir de entonces, se han conseguido grandes avances que han logrado, mediante el empleo de métodos no invasivos como la medición serológica de biomarcadores, diagnosticar con precisión y rapidez eventos cardiorrespiratorios, que permiten actuar con rapidez y mejorar, por lo tanto, la supervivencia y el pronóstico del paciente. La medicina veterinaria ha acogido con gran entusiasmo el estudio de estas determinaciones serológicas, y durante los últimos 15 años ha habido una avalancha de publicaciones valorando la utilidad de los diversos biomarcadores en diferentes patologías cardiopulmonares en pequeños animales con prometedores resultados, permitiendo confi rmar el diagnóstico en casos dudosos, evaluar la gravedad de la enfermedad y monitorizar la evolución de la misma, entre otras posibilidades. Por lo tanto, la determinación de estos biomarcadores nos ofrece la posibilidad de evaluar una patología que cursa con daño en el sistema cardiopulmonar, como es la dirofi lariosis canina, de forma que permita valorar de forma más adecuada el estado del animal afectado. Así, podrían ofrecer información útil y complementaria al veterinario a la hora de emitir un pronóstico más preciso al propietario, así como a decidir el protocolo terapéutico adecuado a aplicar en cada caso. Además, podrían permitir valorar y monitorizar el curso del tratamiento, de forma que permitirían tomar medidas coadyuvantes si el veterinario lo considerara necesario. Así, nació el objetivo de esta tesis doctoral, que es evaluar y valorar los biomarcadores de daño cardiopulmonar en la dirofi lariosis canina. OBJETIVOS II 6 ”As a scientist, you offer hope. Think about it” (Thomas Zarek, Battlestar Galactica) Objetivos 7 Atendiendo a las consideraciones expuestas en el apartado anterior, se plantearon los siguientes objetivos: 1. Establecer los valores serológicos de los biomarcadores de daño cardiopulmonar, troponinas T e I cardíacas, mioglobina y dímero-D, y comprobar su utilidad en la evaluación del daño provocado por Dirofi laria immitis en el perro. 2. Determinar, mediante técnicas de inmunohistoquímica, la presencia de dímero-D en tejido pulmonar y renal de perros infectados por D. immitis, y correlacionarla con modifi caciones serológicas de este biomarcador. 3. Estudiar las variaciones de dímero-D en perros infectados por D. immitis, durante el tratamiento adulticida con ivermectina, doxiciclina y melarsomina, siguiendo el protocolo terapéutico recomendado por la American Heartworm Society. 4. Evaluar, mediante técnicas de inmunohistoquímica, la pérdida intracelular de troponina I cardíaca y mioglobina en tejido miocárdico de perros infectados por D. immitis, correlacionando los cambios histológicos con las elevaciones serológicas de esos marcadores. 5. Valorar las variaciones de los biomarcadores troponina I cardíaca y mioglobina, en perros infectados por D. immitis durante el tratamiento adulticida con ivermectina, doxiciclina y melarsomina, siguiendo el protocolo terapéutico recomendado por la American Heartworm Society. Objetivos REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA III 10 “The most exciting phrase to hear in science, the one that heralds new discoveries, is not ‘Eureka!’, but ‘That’s funny...” (Isaac Asimov) Revisión Bibliográfi ca 11 1. TAXONOMÍA Dirofi laria immitis es un nematodo fi laroideo de la familia Onchocercidae, y la subfamilia Dirofi lariinae, que comprende los géneros Dirofi laria y Loa (Marquardt et al., 2000). Dentro del género Dirofi laria, se reconocen diversas especies entre las que destacan por su importancia clínica y su amplia distribución D. immitis y D. repens. 2. CICLO BIOLÓGICO Dirofi laria immitis es un parásito fi liforme, de color blanquecino y que presenta dimorfi smo sexual. Los machos tienen un diámetro de 0.7-0.9 mm y una longitud de 12-20 cm; además, presentan el extremo posterior enrollado en forma de espiral. Las hembras poseen un diámetro de 1-1.3 mm y una longitud de 15-30 cm; son ovovivíparas; los huevos larvados eclosionan en el útero, eliminando en sangre periférica a las microfi larias o larvas de primer estadío (290-330 μm de longitud y 7 μm de diámetro) (McCall et al., 2008b). ADULTOSproducen MICROFILARIAS (L1) (L1) Mosquitoingiere MICROFILARIAS (L1) LARVAS(L3)se hacenADULTAS (L1) MICROFILARIAS maduran de L1 a L3 Mosquitos transmitenlas maduran  de  L1  a  L3 LARVAS(L3) Figura 1. Ciclo biológico de Dirofi laria immitis Dirofilariosis cardiopulmonar canina 18 trucción inmunomediada, produciendo un serio distrés respiratorio (Calvert y Losonsky, 1985). Las microfi larias son rápidamente capturadas e inmovilizadas en la microcirculación del pulmón, debido a un exceso de anticuerpos anti-microfi larias (IgG). Éstos adhieren los leucocitos a las microfi larias, causando su secuestro e inmovilización en la microcirculación del pulmón. Las microfi larias muertas son rodeadas por una infl amación eosinofílica granulomatosa, apreciable radiológicamente. Se considera que entre un 10 y un 15% de los perros con dirofi lariosis oculta presenta neumonitis eosinofílica (Calvert et al., 1999). 5.5. Tromboembolismo pulmonar El parásito vivo es resistente a la tromboembolización pero cuando muere, ya sea de forma espontánea o inducida por tratamientos adulticidas, se produce una trombosis masiva. Los vermes muertos son barridos distalmente hacia las arterias más fi nas y, como consecuencia, el fl ujo sanguíneo se deteriora, o incluso se interrumpe hacia los lóbulos caudales, que con frecuencia muestran consolidación, infarto y mínimo funcionamiento a nivel de intercambio gaseoso; esto puede provocar un desequilibrio entre ventilación y perfusión y desencadenarse una hipoxemia (McCall et al, 2008b). Se produce una infl amación granulomatosa de la pared arterial que provoca un crecimiento exagerado de las vellosidades de la íntima vascular y un aumento de la permeabilidad, con la formación de edemas perivasculares. Los fragmentos del parásito son calcifi cados y parcialmente incorporados a la pared de la arteria, que posteriormente cicatrizan con formación de gran cantidad de tejido conectivo fi broso. Los trombos y la rigidez de estas arterias lesionadas, agravan la hipertensión pulmonar (Kittleson, 1998; Atkins, 2005). 5.6. Síndrome de la vena cava El síndrome de la vena cava en perros se produce en animales con una alta carga parasitaria, con el 55-84% de los parásitos en las venas cavas craneal, caudal y aurícula derecha (Rawlings, 1986; Atkins, 1987; Atkins et al., 1988). El parásito en su estado adulto reside principalmente en las arterias pulmonares del hospedador defi nitivo, manteniéndose en estos vasos gracias a la circulación sanguínea. Pero cualquier incidente hemodinámico que tenga como consecuencia una hipoperfusión transitoria o mantenida de la arteria (como hipertensión pulmonar y disminución del gasto cardiaco), les hace caer a través de la válvula pulmonar en el ventrículo derecho (Kittleson, 1998). Así, los parásitos colonizan la aurícula derecha, vena cava caudal o venas hepáticas, produciendo insufi ciencia cardiaca derecha y obstrucción del retorno sanguíneo elevando la presión venosa central (Strickland, 1998). La regurgitación de la tricúspide produce una Revisión Bibliográfi ca 19 disminución del fl ujo de salida por la vasculatura pulmonar hacia el corazón izquierdo. Como resultado, hay una disminución del fl ujo sanguíneo sistémico dando síntomas de mala perfusión y shock cardiocirculatorio. Su pronóstico es generalmente desfavorable. 5.7. Alteraciones renales La glomerulonefritis membranosa es frecuente en perros con dirofi lariosis crónica. Esta glomerulopatía sucede porque se forman y depositan complejos autoinmunes contra antígenos del parásito en la membrana basal del glomérulo (Abramowsky et al., 1981; Grauer et al., 1988; 1989). Esta glomerulonefritis también se ha correlacionado con la presencia de microfi larias en los capilares glomerulares y vasos medulares, lo que provoca la presencia de infi ltrados infl amatorios en glomérulos y un engrosamiento de la membrana basal de los capilares glomerulares (Ludders et al., 1988; Paes-deAlmeida et al., 2003). Además, las microfi larias son una fuente importante de antígenos parasitarios, incluyendo Wolbachia y ésta, liberada desde las microfi larias muertas, produce infl amación y una respuesta inmune específi ca (McCall et al., 2008a; Morchón et al., 2012a). La glomerulonefritis puede dar paso a una nefrosis grave con proteinuria y, en algunos casos, puede llegar a provocar azotemia por insufi ciencia renal. La concentración plasmática de antitrombina III también puede estar reducida, fomentando más aún la formación de trombos (Boudreaux y Dillon, 1991a). Otra alteración inmunopatológica que también puede desencadenarse a nivel renal es una nefritis intersticial, con infi ltrado de células plasmáticas, leucocitos, polimorfonucleares y macrófagos en el intersticio medular y cortical. Figura 9 y 10. Imágenes tomada al microscopio de tejido renal (x40) en las que se aprecia la presencia de microfi larias de D.immitis en glomérulos renales de perros con dirofi lariosis cardiopulmonar. 20 5.8. Otras alteraciones Aunque raras veces, se han descrito complicaciones derivadas de la presencia de fi larias adultas en localizaciones aberrantes tan diversas como el cerebro, la cámara anterior del ojo, la cavidad peritoneal, el corazón izquierdo, arterias sistémicas, quistes y abscesos musculares y subcutáneos, los bronquios y el hígado (Liu et al., 1966; Patton y Garner, 1970; Mandelker y Brutus, 1971; Slonka et al., 1977; Weiner et al., 1980; Carastro et al., 1992; Henry, 1992; Frank et al., 1997; Sevimli et al., 2007). 6. SIGNOS CLÍNICOS Durante los seis a siete meses desde que los parásitos son inoculados no se presenta ningún signo clínico, ya que las larvas mudan y migran sin causar ninguna alteración. La dirofi lariosis clínica tarda en desarrollarse, por lo que la sintomatología se presenta en perros a partir de un año de edad y, generalmente, no se hacen evidentes hasta pasados varios años desde la infección (Kittleson, 1998;McCall et al., 2008b). La tos no productiva y crónica, que se acentúa después del ejercicio, es el síntoma más habitual en perros levemente afectados o con enfermedad cardiopulmonar crónica, junto con disnea o taquipnea, intolerancia al ejercicio, pérdida de peso y síncope. Se pueden auscultar crepitaciones pulmonares difusas y soplo cardiaco sistólico, especialmente en casos de síndrome de la vena cava. Otros signos clínicos pueden ser: hemoptisis, epixtasis, letargia, apatía, hiporexia, ascitis y derrame pleural. 7. DIAGNOSTICO Para el diagnóstico de la enfermedad es necesario realizar test de detección de antígenos y de microfi larias en sangre periférica, mientras que para establecer la gravedad de la enfermedad, son necesarias otras pruebas diagnósticas (Knight, 1995; American Heartworm Society, 2012). 7.1. Detección de antígenos En el mercado hay disponibles kits de tests de detección de antígenos de Dirofi laria immitis por técnicas de ELISA o inmunocromatografía, que detectan proteínas secretadas principalmente por el tejido ovárico de parásitos adultos hembras de Dirofi laria immitis, aunque los tests de última generación también detectan proteínas comunes a parásitos hembras como machos (Grieve et al., 1981; Weil, 1987). Revisión Bibliográfi ca 21 La especifi cidad es muy elevada en todos los tests disponibles y no existen reacciones cruzadas con otras fi larias caninas (D. repens, A. reconditum, A. dracunculoides), por lo que los falsos positivos son muy poco frecuentes y suelen deberse a errores técnicos durante la realización del test (Goodwin, 1988; McCall et al., 2000). La sensibilidad suele ser muy elevada; algunos factores pueden afectar la sensibilidad del test, como la edad del parásito y el tamaño del perro. Parásitos muy jóvenes y parásitos de edad avanzada presentan menor carga antigénica, mientras que la antigenemia que presente un perro de raza grande siempre va a ser menor que la que presente un perro de raza pequeña albergando el mismo número de parásitos. Los falsos negativos pueden suceder en infecciones con carga parasitaria muy ligera, en casos de fi larias juveniles (menores de 6 meses de edad), infección sólo por fi larias macho o fallos técnicos por no seguir las instrucciones correctamente (Tonelli, 1989; Goodwin, 1998; McCall, 1992; Courtney y Zeng, 2001a). Figura 12. Ecocardiografía en corte parasternal derecho donde se observan las fi larias en el ventrículo derecho (VD), y marcada dilatación de la arteria pulmonar (AP). Figura 13. Electrocardiograma de perro con dirofi lariosis, con bloqueo de rama derecha del Haz de His. Figura 11. Radiografía de tórax ventrodorsal de un perro con dirofi lariosis, donde se aprecia dilatación de las cámaras cardíacas derechas mostrando la característica forma de “D” invertida. 22 7.2. Detección de microfi larias La detección de microfi larias en sangre se debe considerar como un método complementario, ya que incluso en áreas hiperendémicas, se calcula que alrededor de un 30% de los perros infectados son amicrofi larémicos; este porcentaje se eleva en poblaciones de perros que han recibido tratamiento preventivo a dosis intermitentes (Rawlings et al., 1982). Por otro lado, existen cuatro especies de fi larias cuyas microfi larias podemos encontrar en sangre periférica, por lo que para poder confi rmar el diagnóstico de dirofi - lariosis cardiopulmonar debemos identifi car correctamente a las microfi larias. Existen varios métodos para detectar microfi larias en sangre periférica (Courtney, 1989; Genchi et al., 2007). La observación directa es un método sencillo, que consiste en examinar la muestra directamente al microscopio con el objetivo de x10 aumentos, o mediante la concentración en tubo de microhematocrito (Altman, 1972; Martini et al., 1996; Coutney y Zeng, 2001b). Mediante el método de fi ltración, se permite concentrar y teñir las microfi larias, facilitando de esta manera su observación e identifi cación (Acevedo et al., 1981). El test de Knott modifi cado es bastante similar al método de fi ltración, y es el método de referencia empleado cuando se quiere cuantifi car el número de microfi larias por mililitro de sangre (Knott, 1939; Jackson y Otto, 1975). El método histoquímico, permite identifi car a la especie a la que pertenece la microfi laria mediante el estudio de la distribución somática de las zonas de actividad de fosfatasa ácida que estas microfi larias presentan. La positividad se observa de color rojizo en diferentes zonas de la microfi laria según sea la especie a la que pertenece (Chalifoux y Hunt, 1971; Peribáñez et al., 2001). 7.3. Radiología El examen radiográfi co de tórax proporciona información insustituible sobre la localización y gravedad de las alteraciones vasculares y del parénquima pulmonar (Losonsky et al., 1983; Venco et al., 2003). Los cambios que se observan son dilatación y mayor tortuosidad de las arterias pulmonares, y terminación de las mismas de forma brusca, por tromboembolismos que interrumpen el fl ujo a segmentos pulmonares (Losonsky et al., 1983). Las alteraciones del parénquima pulmonar pueden presentarse precozmente bajo la forma de respuesta infl amatoria a la presencia del parásito adulto y/o de las microfi larias, o más tardíamente como consecuencia de fenómenos tromboembólicos inducidos por la muerte de los parásitos. Se observan como zonas de densidad aumentada, adyacentes a las arterias afectadas y, según se agrava el cuadro, el aumento Revisión Bibliográfi ca 23 de densidad puede generalizarse y afectar cualquier punto del campo pulmonar. La dilatación cardiaca derecha no es característica en casos leves y es posible que no exista o no sea evidente en casos de gravedad moderada (Losonsky et al., 1983); por lo general, se aprecia mejor en las proyecciones ventrodorsales, observándose una silueta cardiaca en forma de “D” mayúscula invertida. 7.4. Ecocardiografía El examen ecocardiográfi co permite la correcta valoración de las dimensiones de las cámaras cardíacas y de su cinética, de la velocidad, dirección y características del fl ujo en el interior de las cámaras cardíacas y de la parte inicial de los grandes vasos, así como la estimación aproximada del número y localización de las fi larias y la valoración de la gravedad de la hipertensión pulmonar (Badertscher et al., 1988; Moise, 1988; Venco et al., 2003). Para diagnosticar una dirofi lariosis, debe obtenerse una proyección paraesternal derecha de eje corto, que incluya el tracto de salida del ventrículo derecho, la válvula pulmonar, la arteria pulmonar principal y las porciones proximales de las arterias de los lóbulos caudales. La imagen ecocardiográfi ca del parásito adulto está representada por dos líneas paralelas hiperecógenas separadas por una línea hipoecógena (Kittleson, 1998). La observación ecográfi ca de los parásitos es más fácil en infecciones masivas y en perros de pequeña talla, cuando las fi larias adultas han ocupado la arteria pulmonar principal, ramas interlobares izquierda y derecha o dentro del ventrículo derecho. 7.5. Electrocardiografía La electrocardiografía es útil para la detección de arritmias. Éstas son poco frecuentes en perros con dirofi lariosis (2%-4%) (Lombard y Ackerman, 1984), excepto en los casos de síndrome de vena cava o insufi ciencia cardíaca. Con frecuencia se observan ondas Q y S profundas y bloqueos de rama derecha. Figura 14. Filarias adultas en el ventriculo derecho de un perro infestado por D. immitis.Figura 15. Filarias adultas en la arteria pulmonar de un perro con dirofi lariosis. 24 7.6. Pruebas de laboratorio En la mayoría de los perros con dirofi lariosis el hemograma es normal, sin embargo alrededor de un 10% de los perros con dirofi lariosis leve y un 60% con infestaciones graves presentan una moderada anemia normocítica normocrómica (Sharma y Pachauri, 1982; Calvert, 1987; Mass et al., 1992). Los perros con síndrome de la vena cava pueden presentar hemólisis (Buoro y Atwell, 1984). La fórmula leucocitaria suele ser normal en perros asintomáticos (Rawlings, 1986). Es habitual encontrar linfopenia, neutrofi lia o monocitosis. La eosinofi lia está presente en el 85-95% de los perros; la basofi lia junto con eosinofi lia es un elemento sugestivo inespecífi cos de la enfermedad, pero en el 50% de los casos hay eosinofi lia sin basofi lia (Rawlings et al., 1980; Confer et al., 1983). El perfi l de coagulación se altera signifi cativamente en casos de tromboembolización grave, porque hay consumo activo de las plaquetas, fi brinógeno y otros substratos de la coagulación (Rawlings, 1982; Boudreaux y Dillon, 1991a). En los casos más graves, puede haber presente elevación de las transaminasas hepáticas y azotemia renal. La disfunción glomerular provoca proteinuria e isostenuria en el 10% de los casos con signos clínicos. Los perros con síndrome de la vena cava pueden presentar una orina de color marrón por la presencia de bilirrubinuiria y hemoglobinuria. 8. PROFILAXIS 8.1. Lactonas macrocíclicas Se recomienda que los cachorros comiencen la profi laxis cuanto antes, y nunca más tarde de los 2 meses de edad (Atkins, 2011; American Heartworm Society, 2012). Los productos utilizados para prevenir la dirofi lariosis son las lactonas macrocíclicas (moxidectina, ivermectina, selamectina y milbemicina oxima). Existen preparados comerciales de administración mensual vía oral y tópica, y también un preparado inyectable de administración anual (McTier et al., 1992). Estos fármacos interrumpen el desarrollo de las larvas que han sido transmitidas por mosquitos al perro durante los 30-60 días anteriores a su administración. Las lactones macrocíclicas poseen un ratio terapéutico/tóxico excelente y poseen actividad antihelmíntica contra las microfi larias, larvas en estadíos L3 y L4, y en algunos casos Revisión Bibliográfi ca 25 y durante su uso contínuo, actúan sobre fi larias pre-adultas (L5). Aunque esta característica proporciona una cierta seguridad en casos de omisión o retraso del tratamiento mensual, pasados dos meses su efi cacia contra las formas larvarias desciende (McCall et al., 2001a). Además, las fi larias juveniles L5, que pueden encontrarse desde los 50 días post-infección, son aún menos susceptibles a estos productos. Por lo tanto, se recomienda su administración mensual (McCall, 2005). Las lactonas macrocíclicas presentan cierta efi cacia frente a estados parasitarios de 3-8 meses post-infección cuando se administran mensualmente de forma continua (Rawlings, 2002; McCall, 2005). Este llamado “reach back” o efecto retroactivo es diferente para cada una de las lactonas macrocíclicas y han sido probados sólo en condiciones experimentales (McCall et al., 2008b). Clase I Anamnesis y exploración física normales Radiografía torácica, ecocardiografía y analítica normales Pronóstico favorable Clase II Ligera intolerancia al ejercicio y tos leve Radiografía torácica: ligero engrosamiento arteria pulmonar y aumento moderado del ventrículo derecho Ecocardiografía: presencia de fi larias adultas Pronóstico reservado Clase III Intolerancia al ejercicio, tos persistente, disnea, anorexia, caquexia, soplo sistólico Radiografía torácica: aumento arterias pulmonares, dilatación del ventrículo derecho Ecocardiografía: fi larias en arterias pulmonares y ventrículo derecho Pronóstico grave Clase IV (Síndrome de la vena cava) Sintomas anteriores junto con shock, letargia, ascitis, disnea, cianosis. Hemoglobinuria, hemoglobinemia Radiografía torácica: aumento arterias pulmonares, dilatacion del ventrículo derecho y cava caudal Ecocardiografía: fi larias en arterias pulmonares , ventrículo derecho, cava caudal y craneal Pronóstico desfavorable Tabla 2. Clasifi cación clínica de la dirofi lariosis canina 26 8.2. Falta de efi cacia y resistencia parasitaria Las lactonas macrocíclicas como preventivos de la dirofi lariosis poseen una efi - cacia del 100%. Sin embargo, existen informes de falta de efi cacia en varias regiones del mundo. La mayoría de los informes de falta de efi cacia son debidos a problemas de interacción entre el veterinario y el cliente, o entre el cliente y su mascota. Es posible que un perro se infecte por olvido o retraso en la toma de una única dosis de preventivo, muy especialmente en zonas endémicas (Atkins, 2011). Solamente una cepa de fi larias ha demostrado poseer resistencia a las lactonas macrocíclicas (Atkins, 2011; Blagburn et al., 2011; Snyder et al., 2011; Bowman, 2012). La cepa MP3 de D. immitis fue aislada en el año 2006 en un perro de Estados Unidos, que nunca recibió tratamiento preventivo. Desde entonces, esta cepa se mantiene de forma Día Tratamiento Día 0 ● Diagnóstico positivo ● Comenzar la restricción de ejercicio ● Si el perro es sintomático: estabilizar con tratamiento adecuado y administrar prednisona (0.5 mg/Kg BID 1ª semana, 0.5 mg/kg SID 2ª semana, 0.5 mg/kg cada 2 días durante la 3ª y 4ª semanas) Día 1 ● Administrar preventivo de dirofi lariosis ● Si hay presentes elevadas cantidades de microfi larias, pre-tratar con antihistamínicos y glucocorticoides si no está tomando prednisona para reducir el riesgo de anafi laxia ● Animal bajo observación durante un periodo mínimo de 8 horas Día 1-28 ● Doxiciclina 10 mg/kg BID durante 4 semanas Día 30 ● Administrar preventivo de dirofi lariosis Día 60 ● Administrar preventivo de dirofi lariosis ● Primera inyección de melarsomina 2.5 mg/kg IM ● Si es necesario, repetir el protocolo de administración de prednisona ● Restricción absoluta de ejercicio Día 90 ● Administrar preventivo de dirofi lariosis ● Segunda inyección de melarsomina 2.5 mg/kg IM Día 91 ● Tercera inyección de melarsomina 2.5 mg/kg IM ● Si es necesario, repetir el protocolo de administración de prednisona ● Restricción absoluta de ejercicio Día 120 ● Evaluar la presencia de microfi larias ● Si es positivo, administrar 30 días de doxiciclina y repetir la prueba en 30 días Día 271 ● Test de antígenos a los 6 meses tras fi nalizar el tratamiento Tabla 3. Protocolo de tratamiento adulticida (American Heartworm Society, 2012). Revisión Bibliográfi ca 27 experimental en perros de laboratorio. Siempre ha existido polimorfi smo genético en las poblaciones de fi larias y probablemente existan alelos que contribuyan a la creación de resistencias en un gen o múltiples genes, que pueden conducir a un descenso o pérdida de susceptibilidad a las lactonas macrocíclicas (Blagburn et al., 2010; Bourguinat et al., 2010; 2011). Lo que se desconoce es la frecuencia de estos alelos, el número de genes implicados y si estos alelos son dominantes o recesivos a la hora de expresar el fenotipo resistente. Es importante que se entienda que los parásitos no se vuelven resistentes, sino que el empleo de los fármacos preventivos selecciona los parásitos con resistencia genética. Esta resistencia se ha observado en otros parásitos, por ejemplo trichostrongiloides en pequeños rumiantes; sin embargo, las condiciones que favorecen estos procesos de selección (parásito de ciclo directo, tratamientos colectivos, falta de reservorios, elevadas cargas parasitarias y ciclo de vida corto) no se dan en la dirofi lariosis (Bowman, 2012). 9. TRATAMIENTO Se debe evaluar el estado clínico y cardiovascular del paciente mediante la historia clínica, examen físico, test de antígenos y radiografía torácica (Bowman y Atkins, 2009). Aún siendo un método poco refi nado e inexacto para determinar la carga parasitaria, también debe tenerse en cuenta la reacción del test de antígenos, que puede dar información sobre el número de parásitos presentes en base a la reacción antigénica (Atwell et al., 1986; Rawlings et al., 1993). Se debe tener en cuenta que en casos crónicos puede observarse signos de enfermedad vascular muy avanzada en perros con una baja carga parasitaria. Igualmente, perros muy inactivos pueden presentarse asintomáticos y con mínimos cambios radiográfi cos teniendo una elevada carga parasitaria. 9.1. Clasifi cación del estado de gravedad En función de la sintomatología, y por tanto de la gravedad de la enfermedad, la dirofi lariosis se ha clasifi cado en cuatro clases o niveles de gravedad (Di Sacco y Vezzoni, 1992). Los hallazgos que caracterizan a cada grupo están resumidos en la tabla 2. Actualmente se prefi ere una clasifi cación más simple, que clasifi ca los pacientes en dos categorías, basándose en el número de fi larias estimado, el tamaño y edad del perro, la severidad de la enfermedad pulmonar y presencia de enfermedades concomitantes, así como la actividad física y la posibilidad de restricción del ejercicio durante el tratamiento adulticida (McCall et al., 2008b). Así, las categorías en que se clasifi can los perros con dirofi lariosis son: 34 determinar la actividad de la isoenzima CK-MB, un marcador más cardioespecífi co que los anteriores, convirtiéndose en el biomarcador de daño miocárdico más importante de los años ochenta (Jockers-Wretou y Pfl eiderer, 1975). Estos primeros biomarcadores no ofrecían especifi cidad cardíaca, ya que también estaban presentes en musculatura esquelética y otros tejidos. Además, presentaban una baja sensibilidad, con valores basales relativamente altos, que hacían complicada la interpretación de pequeños incrementos en la actividad serológica de estas enzimas, por lo que estos biomarcadores funcionaban incluso peor a la hora de diagnosticar patologías cardíacas no isquémicas. Paralelamente, en 1975, se publicó por primera vez la relación entre mioglobina serológica y la presencia de infarto de miocardio (Kagen et al., 1975; Stone et al., 1975), dando inicio al desarrollo de ensayos para la detección de anticuerpos monoclonales, lo que supuso un gran salto cualitativo en el campo del diagnostico médico. Así, en los años ochenta se realizó un gran avance gracias al desarrollo del inmunoensayo y comenzó una nueva generación de biomarcadores, basados en la detección de anticuerpos, dando un enorme paso en la mejora del diagnóstico del infarto agudo de miocardio. En 1989, Katus et al. desarrollaron un un inmunoensayo para detección de troponina T en pacientes con infarto agudo de miocardio (Katus et al., 1989); posteriormente, en 1995, Missov et al. describieron por primera vez la asociación entre troponina I y fallo cardiaco en 11 pacientes (Missov et al., 1997). Desde entonces hasta la actualidad, se ha incrementado notablemente el número de marcadores y su contribución a la cardiología, ocupando un primer plano en el diagnóstico y seguimiento de las cardiopatías, y actualmente son herramientas que se emplean para identifi car individuos de alto riesgo, diagnosticar estados patológicos rápidamente y de forma precisa, y para determinar planes de tratamiento y pronóstico. Mientras que el término “biomarcador” fue empleado por primera vez en 1989 (Vasan, 2006), en 2001 su defi nición se estandarizó como “una característica que es medida de forma objetiva y evaluada como un indicador de procesos biológicos normales, procesos patogénicos o respuestas farmacológicas a intervenciones terapéuticas” (Biomarkers Defi nitions Working Group, 2001; Ramachandran, 2006). El uso de biomarcadores para detección de enfermedades cardiovasculares en medicina veterinaria supone un gran atractivo y se lleva evaluando ampliamente durante los últimos 15 años (Boswood, 2009). Varios inmunoensayos humanos han mostrado una sensibilidad adecuada para el diagnóstico de enfermedades cardíacas en veterinaria, además del creciente desarrollo de tests comerciales específi cos para pequeños animales. El apoyo en este método diagnostico sería de gran utilidad no solo al veterinario car- Revisión Bibliográfi ca 35 diólogo, sino también para el veterinario de primera opinión, ya que podrían permitir: • Confi rmar o descartar enfermedad cardiaca en casos dudosos (cardiomegalia cuestionable en radiografías torácicas sin posibilidad de ecocardiografía, indicadores ecocardiográfi cos de función cardíaca o miocárdica ligeramente disminuidos, tos o disnea de origen dudoso, etc…). • Confi rmar o descartar enfermedad en estadios precoces, lo que permitiría iniciar tratamientos en el momento adecuado, reduciendo mortalidad y morbilidad asociados a los estadios avanzados de cardiopatías. • Identifi cación de forma precisa de procesos difíciles de identifi car (miocarditis, cardiopatía isquemica e hipertensión pulmonar). • Monitorización durante la administración de fármacos potencialmente cardiotóxicos, o de enfermedades extracardiacas sobre la integridad y función miocárdica (doxorrubicina, torsión / dilatación gástrica). • Monitorización del tratamiento (estado cardíaco) en insufi ciencia cardíaca congestiva • Selección y cribado de ciertas poblaciones de razas en busca de enfermedades miocárdicas asintomáticas tales como la miocardiopatía dilatada (MCD) en Doberman. 2. TROPONINAS CARDÍACAS: TROPONINA T e I Las troponinas cardíacas son marcadores de integridad miocárdica y, debido a la elevada sensibilidad y especifi cidad para daño miocárdico que presentan, son consideradas los biomarcadores de elección para la detección de daño celular cardíaco (Adams Figura 1. Esquema del fi lamento fi no del sarcómero y estructura de la molécula proteíca de actina a la que se asocian las proteínas reguladoras troponina y tropomiosina. 36 et al., 1993; Ohman et al., 1996; O’Brien et al., 1997a; Fredericks et al., 2001). 2.1. Fisiología Las troponinas son proteínas reguladoras que forman parte del aparato contráctil del tejido muscular esquelético y cardíaco. Se encuentran integradas en los fi lamentos fi nos de actina, en la estructura de los miofi lamentos musculares, y son esenciales para la regulación de la contracción del músculo mediada por el calcio. Los miofi lamentos de actina están constituídos por 2 hebras proteicas, que se enrollan para formar una estructura helicoidal doble. La tropomiosina es una molécula con forma de bastón, que corresponde a un dímero de dos cadenas helicoidales idénticas, que se enrollan una respecto de la otra para formar unos fi lamentos que discurren a lo largo de ambos bordes del miofi lamento de actina. Completando esta estructura está la troponina, un complejo de 3 subunidades (troponina C, T e I) que se dispone en forma discontinua a lo largo del miofi lamento; cada una de ellas es diferente funcionalmente e interactúan entre sí (Wells y Sleeper, 2008). La troponina C se une al calcio para iniciar la contracción muscular. La troponina C está presente en dos isoformas: una de las isoformas está presente en las fi bras musculares tipo 2 (contracción rápida) y la otra está presente en fi bras musculares cardíacas y en las fi bras musculares tipo 1 (contracción lenta). La homología que existe entre la isoforma cardíaca y una de las isoformas del músculo esquelético reduce la especifi cidad cardíaca de la troponina C y, por lo tanto, limita su utilidad diagnóstica para enfermedad cardíaca (Schreier et al., 1990). Troponin free in cytoplasm Troponin complex bound to actin filament Actin Cardiomyocyte Necrosing zone of myocardium Multiples of the Upper Reference Limit Days after Onset of Acute MI Cardiac troponin after "classic" acute MI CK-MB after acute MI Cardiac troponin after "microinfarction" Upper reference limit 102345678 1 2 5 10 20 50 Myosin Figura 2. Esquema de la liberación de troponinas cardíacas durante el infarto agudo de miocardio (Antman, 2002). Revisión Bibliográfi ca 37 La troponina T une el complejo troponina a la tropomiosina en las fi bras musculares, manteniendo la unión entre la actina y la miosina. Existes múltiples isoformas de troponina T en músculo esquelético, mientras que en el tejido cardíaco humano existen cuatro isoformas, pero sólo una es característica del corazón adulto. Las otras tres isoformas cardíacas son expresadas en tejido fetal. La troponina I inhibe la actomiosina ATP-asa y previene la interacción estructural de la miosina con los lugares de unión de la actina. La unión de los iones de calcio a la troponina C desplaza la troponina I y provoca un cambio de conformación de la tropomiosina, de modo que no interfi ere con la unión actina-miosina y pueda llevarse a cabo la contracción muscular. Existen tres isoformas para la troponina I: dos de ellas están presentes en musculatura esquelética y la otra está presente sólo en musculatura cardíaca. Liberación de troponina La troponina se distribuye en dos compartimentos dentro de las células. En su mayor parte, se encuentra unida estructuralmente al fi lamento fi no del aparato contráctil, mientras que un pequeño porcentaje permanece libre en el citosol celular. Este porcentaje corresponde aproximadamente al 2-4% de la troponina I y al 6-8% de la troponina T (Katus et al., 1991; Adams et al., 1994). La cinética que muestra su liberación en la circulación sanguínea se correlaciona con la liberación de las troponinas presentes en los dos compartimentos celulares: tras el daño cardíaco agudo, la troponina libre citosólica es liberada, resultando en un incremento temprano de los niveles sanguíneos de troponina; posteriormente, es seguido por una liberación más lenta de las troponinas que se encuentran unidas estructuralmente al aparato contráctil, lo que resulta en una elevación sostenida de sus niveles serológicos (Katus et al., 1991; Adams et al., 1994; Jaffe et al., 1996). En humanos con infarto agudo de miocardio, los niveles de troponinas comienzan a elevarse a las 4-12 horas tras el infarto y alcanzan los valores más elevados a las 12-48 horas. Los niveles permanecen elevados durante 7-10 días en el caso de la troponina I y 10-14 días en caso de la troponina T (Cummins et al., 1987; Goldmann et al., 2001; Babuin y Jaffe, 2005). La elevación sostenida de troponinas durante varios días tras el infarto agudo de miocardio es probablemente debido a una liberación continuada desde los miocitos dañados (Fishbein et al., 2003). Se desconoce el mecanismo exacto de metabolización de las troponinas, aunque se cree que está relacionado con la depuración mediante el sistema reticuloendotelial (Freda et al., 2002), y también existen evidencias de que las troponinas podrían descomponerse en pequeños fragmentos que posteriormente podrían ser excretados renalmente (Diris et al., 2004). 38 2.2. Troponinas cardíacas en medicina humana En humanos, las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de morbilidad y mortalidad en el mundo (Organización Mundial de la Salud, 2012). El principal papel de la medición de troponinas cardíacas en medicina humana está enfocado al diagnóstico de la enfermedad isquémica cardíaca, como el infarto de miocardio. Durante años, los marcadores para el diagnóstico y evaluación del infarto agudo de miocardio incluían la CK total, CK-MB, LDH y AST (Tunstall-Pedoe et al., 1994). Sin embargo, estos biomarcadores tienen poca especifi cidad para daño cardíaco (Tsung y Tsung, 1986; Antman et al., 2000), y aunque la CK-MB sea algo más específi ca que el resto, no lo es tanto como las troponinas (Adams et al., 1993). Además, los niveles de CK-MB regresan a los valores basales tras 48 horas del episodio isquémico, por lo que no es posible emplear este marcador para realizar un diagnóstico tardío de infarto, mientras que los niveles de troponinas permanecen elevados durante aproximadametne 10 días (Rajappa y Sharma, 2005). Debido a ésto, en el año 2000 un comité de expertos de la Sociedad Europea de Cardiología y el Colegio Americano de Cardiología (ESC/ACC) desarrolló una nueva defi nición para el diagnóstico de infarto de miocardio (Antman et al., 2000), que estaba predominantemente basada en la medición de troponinas cardíacas, junto con un biomarcador que se eleve rápidamente, como la mioglobina o la CK-MB, en aquellas situaciones en las que se necesite un diagnóstico temprano (Antman et al., 2000). Estas nuevas medidas supusieron un incremento exponencial en el diagnóstico de infarto de miocardio (Kontos et al., 2003). Las últimas recomendaciones del ESC/ACC establecen las normas para su medición e interpretación en insufi ciencia cardíaca aguda y crónica y, actualmente, junto con el ECG y el historial del paciente, son el método diagnóstico de referencia para el infarto agudo de miocardio (Januzzi et al., 2012; Newby et al., 2012). Figura 3. Cinética de la liberación de troponina tras daño miocárdico (Melanson et al., 2007). Revisión Bibliográfi ca 39 Mientras que la elevación de los valores de troponina indican daño miocárdico, éstas no dan ninguna información acerca del mecanismo que provoca ese daño. Para ayudar al diagnóstico, podrían analizarse muestras seriadas, porque daños agudos, tal como infarto de miocardio, mostrarán una elevación y caída de los valores serológicos típica, mientras que otras enfermedades cardíacas tal como la insufi ciencia cardíaca congestiva, podrían mostrar elevaciones persistentes de troponina con valores relativamente bajos (Collinson y Stubbs, 2003). Las troponinas cardíacas también presentan un papel importante a la hora de establecer un pronóstico. Con infarto de miocardio, insufi ciencia cardíaca crónica o tromboembolismo pulmonar, cualquier nivel de troponina por encima de los valores de referencia está asociado a un mayor riesgo de complicaciones a corto y largo plazo (Antman et al., 1996; Stubbs et al., 1996; Galvani et al., 1997; Hamm et al., 1997; Giannitsis et al., 2000; LaVecchia et al., 2000). De hecho, el tamaño del área infartada podría ser predicho en base a los niveles alcanzados de troponina I o troponina T a las 72 horas (Licka et al., 2002; Metzler et al., 2002; Gallegos et al., 2004). Los niveles de troponinas con frecuencia regresan a valores normales tras el tratamiento con éxito del episodio isquémico agudo, lo que sugiere que los niveles de troponinas pueden utilizarse para monitorizar el curso clínico de la enfermedad (LaVecchia et al., 2000). Diversos autores han discutido acerca de si la troponina es liberada durante el daño cardíaco reversible o si es solamente liberada tras un daño irreversible; hoy en día, se reconoce que la isquemia reversible también produce liberación de troponinas (Feng et al., 1998). Algunos estudios realizados tras ejercicio prolongado e intenso, han mostrado una liberación transitoria de troponinas cardíacas (Rifai et al., 1999; Neumayr et al., 2001), probablemente liberadas desde el compartimento citosólico. Esta hipótesis está apoyada por la observación de dos patrones de liberación de proteínas, llevadas a cabo en pacientes con angina inestable: un patrón temprano transitorio y un patrón persistente (Hamm et al., 1992; Feng et al., 1998; Wu y Ford, 1999). La observación de que la disfunción miocárdica encontrada durante la sepsis es reversible, también respalda la teoría de una liberación de troponinas asociado al daño reversible del miocardio (Parker et al., 1984). Sin embargo, aún no es posible diferenciar qué población de troponinas es liberada, por lo que el debate continúa abierto y se deben realizar más estudios para poder determinar su origen (Müller-Bardorff et al., 2002). 2.3. Troponinas cardíacas en pequeños animales Animados por los grandes benefi cios que el estudio de estas proteínas aportan a la cardiología humana, durante los últimos años se han publicado multitud de trabajos en los que se ha evaluado la utilidad de las troponinas en medicina veterinaria (Wells y 40 Sleeper, 2008); al igual que en medicina humana, en medicina veterinaria las troponinas cardíacas pueden ser liberadas durante la insufi ciencia cardíaca aguda o crónica, siendo los niveles proporcionales a la gravedad de la patología. Se han llevado a cabo estudios de isquemia miocárdica con modelos experimentales en perros para estudiar el comportamiento de las troponinas (Cummins y Cummins, 1987; Remppis et al., 2000; Hori et al., 2012) y se ha visto que las concentraciones de troponina I se correlacionan con el tamaño del infarto (Ricchiuti et al., 1998). Los niveles de troponinas pueden elevarse con muy pequeños focos de necrosis de miocardiocitos; en estos casos, la mayoría de los autores están de acuerdo en que los niveles de troponina I son más sensibles que los niveles de troponina T para detectar el daño cardíaco menor. Varios estudios han observado que la troponina I se elevaba con mayor frecuencia que la troponina T en varias patologías cardíacas en el perro (Hamm et al., 1997; Burguener et al., 2006; Apple et al., 2008; O’Brien, 2008). Esto podría ser debido al menor tamaño de la troponina I (24 KDa frente a los 37 KDa de la troponina T), por lo que ésta se libera con mayor facilidad en los primeros estadíos de daño miocárdico (Linklater et al., 2007). 2.3.1. Ensayos Las troponinas cardíacas se determinan empleando técnicas de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA). La diferencia entre la secuencia de aminoácidos de las troponinas T e I del musculo esquelético y las cardíacas ha permitido la producción de anticuerpos específi cos para la determinación de troponinas cardíacas mediante estas técnicas (Larue et al., 1992; Müller-Bardorff et al., 1997). El primer ensayo de detección de troponinas fue desarrollado a fi nales de los años ochenta. Desde entonces, estos ensayos han evolucionado drásticamente, obteniendo mayores sensibilidades y una mejor precisión. En los últimos años, se han desarrollado ensayos de troponina denominados “de alta sensibilidad”, que son 1000-10000 veces más sensibles que la primera generación de ensayos (Baker et al., 2011; Christ et al., 2011). El tiempo de obtención de los resultados también ha disminuido, pasando a ser de varias horas a los pocos minutos que tarda actualmente. Además, se han desarrollado unos tests de diagnóstico inmediato “in situ” (denominados point-of-care) que pueden ser empleados sin necesidad de enviar la muestra al laboratorio. Determinación de la troponina I Existen múltiples ensayos disponibles, procedentes de una variedad de fabricantes, para determinar la troponina I cardíaca, lo que ha traído consigo cierta confusión a la hora de interpretar los resultados. Los ensayos no están estandarizados, ya que los fa- Revisión Bibliográfi ca 41 bricantes posiblemente diseñen los tests empleando diferentes anticuerpos patentados, que apunten a diversas secuencias de aminoácidos de la molécula de la troponina I (Katrukha et al., 1998; Apple, 1999), por lo que no existe un ensayo único estandarizado para la determinación de troponina I. Estudios comparativos empleando diversos analizadores concluyeron con la recomendación de que, hasta que el método esté estandarizado, se deben establecer rangos de referencia propios para cada analizador, y los valores absolutos obtenidos de diferentes analizadores no pueden ser comparados (Apple, 1999; Panteghini et al., 2004; Panteghini, 2005; Adin et al., 2006). Estudios en perros han mostrado que los niveles de troponina I no cambian signifi cativamente en el suero almacenado a temperatura ambiental durante 5 días, ni en el suero que ha sido sometido hasta 5 ciclos de congelación y descongelación (Schober et al., 2002; Oyama y Solter, 2004). Determinación de la troponina T Actualmente, sólo un fabricante produce un test para la determinación de troponina T (Singh et al., 2010), por lo que con esta proteína no existen problemas de comparación entre ensayos. La primera generación de ensayos de troponina T empleó un anticuerpo que presentaba reacciones cruzadas con la troponina T del músculo esquelético, por lo tanto descendía su especifi cidad para la detección de daño cardíaco (Katus et al., 1992; Dameron et al., 1997). Generaciones posteriores de ensayos de troponina T han reemplazado este anticuerpo por uno más específi co y, por lo tanto, han eliminado los falsos positivos provocados por daño muscular (Müller-Bardorff et al., 2002). Aunque la sensibilidad de los ensayos para la determinación de troponinas ha mejorado a lo largo de los años, todavía existen dudas acerca de su precisión en daño miocárdico de bajo nivel (Apple et al., 2002b). Por otro lado, también se ha informado de falsos positivos debido Figuras 4 y 5. Algunos de los ensayos disponibles para la determinaciòn de troponina I (fi gura 4) y troponina T cardíacas (fi gura 5), validados para su uso en veterinaria. 42 a interferencias por sustancias presentes en la sangre, como factores reumatoides, exceso de fi brina, anticuerpos heterófi los, hemólisis, lipemia, elevada fosfatasa alcalina y formación de complejos inmunes. Empleo en medicina veterinaria Mientras que algunos analizadores han sido específi camente fabricados para su uso en medicina veterinaria, se cree que los ensayos humanos para la determinación de troponinas pueden ser empleados para medir los niveles sanguíneos de las troponinas cardíacas T e I en la mayoría de las especies estudiadas (O’Brien et al., 1997a; 1997b; Schober et al., 1999; Fredericks et al., 2001; Sleeper et al., 2001; Adin et al., 2005; Oyama y Sisson, 2004; Oyama y Solter, 2004; Rishniw et al., 2004a; Sisson, 2004; O’Brien et al., 2006). Recientemente, se han secuenciado los genes para troponina I cardíaca felina y canina, demostrando que la homología entre los genes caninos y felinos, y genes humanos es del 95% y 96%, respectivamente. En la región empleada para la detección en la mayoría de los ensayos, genes caninos y felinos fueron idénticos entre ellos, mientras que los humanos fueron diferentes de éstos solamente por un aminoácido (Rishniw et al., 2004a). Las especies estudiadas incluyen perros, ratones, ratas, cerdos, monos, ovejas, conejos, caballos y vacas. Sin embargo, la medición de troponina I cardíaca parece menos útil en aves y nada útil en peces (O’Brien et al., 1997b). Se han publicado valores normales de troponina T e I cardíaca en medicina veterinaria (Sleeper et al., 2001; DeFrancesco et al., 2002; Herndon et al., 2002; Phillips et al., 2003; Oyama y Sisson, 2004; Tarducci et al., 2004; Spratt et al., 2005; Burguener et al., 2006); aunque cada ensayo debe tener su propios rangos de referencia establecidos, la mayoría de los animales sanos presentan valores de troponina por debajo del umbral de detección de los ensayos actuales. 2.3.2. Troponinas en diferentes patologías Cardiopatías adquiridas Varios estudios en medicina veterinaria han mostrado que los niveles de troponina T e I pueden estar elevados en enfermedades cardíacas primarias (DeFrancesco et al., 2002; Herndon et al., 2002; Oyama y Sisson, 2004; Tarducci et al., 2004; Spratt et al., 2005; O’Brien et al., 2006). Un estudio mostró que, empleando el método de clasifi cación de insufi ciencia cardíaca del International Small Animal Cardiac Health Council (ISACHC, 1995), los perros con insufi ciencia cardíaca clases II y IIIA tenían niveles de troponina I mayores que los perros normales y los perros con insufi ciencia cardíaca clase IA y IB (Spratt et al., 2005). Los perros con niveles de troponina I más elevados pre- Revisión Bibliográfi ca 43 sentaban tiempos de superviviencia más cortos, correlacionando niveles de troponina con la gravedad y el pronóstico de la enfermedad. Además, se encontró una correlación entre el tamaño de las cámaras cardíacas y los valores de troponina I (Oyama y Sisson, 2004). Estudios similares llevados a cabo en perros usando el ensayo de troponina T, han mostrado valores elevados en aproximadamente el 30% de los pacientes con enfermedad cardíaca adquirida, lo que es congruente con otros estudios que muestran que la troponina I es más sensible que la troponina T (DeFrancesco et al., 2002; Tarducci et al., 2004). La miocardiopatía hipertrófi ca (MCH) en gatos puede provocar áreas de isquemia microscópicas e hipertrofi a miocárdica con necrosis celular y liberación de troponinas en la circulación (Maron et al., 1986; Krams et al., 1998). Aunque los gatos con enfermedad leve a moderada podrían tener niveles de troponina I normales, los gatos con MCH moderada a severa tienen niveles de troponina I circulante signifi cativamente mayores que los gatos normales (Herndon et al., 2002; Herndon et al., 2004a), especialmente aquellos gatos que presentan insufi ciencia cardíaca, lo que sugiere que la determinación de troponina I podría ser empleada para diferenciar gatos con causas cardíacas y extracardíacas de distrés respiratorio (Herndon et al., 2002; Herndon et al., 2004b). Varios estudios han evaluado los valores de troponinas en perros con valvulopatía mitral adquirida crónica (VMAC). No sólo presentaban valores elevados de troponina I, sino que además observaron que ésta se elevó más rápidamente en perros que murieron de enfermedad cardíaca, demostrando el valor pronóstico de las troponinas en perros con esta enfermedad (Oyama y Sisson, 2004; Spratt et al., 2005; Linklater et al., 2007; Bakirel y Gunes, 2009; Ljungvall et al., 2010; Hezzell et al., 2012; Trafny et al., 2012). Figura 6. Boxer con cardiomiopatía arritmogénica ventricular derecha, sometiéndose a un registro Holter 24 horas. Figura 7. Radiografía torácica latero-lateral de un perro con VMAC, con cardiomegalia, dilatación de aurícula izquierda y edema pulmonar. 50 sufi ciencia cardíaca congestiva, especialmente si al mismo tiempo hay presente una miocardiopatía primaria. Varios estudios han demostrado elevaciones de troponina I en esta patología (Connolly et al., 2003; 2005). En uno de ellos, evaluaron 23 gatos hipertiroideos, de los cuales 11 presentaban niveles elevados de troponina I (Connolly et al., 2005). Seis meses después del tratamiento con yodo radioactivo, sólo tres gatos tenían todavía concentraciones elevadas de troponina I, lo que sugiere que el daño continuado a los miocardiocitos se había resuelto en la mayoría de los ellos. Otras patologías que han mostrado elevaciones de troponinas por daño miocárdico secundario son golpe de calor (Mellor et al., 2006), rabdomiolisis (Wells et al., 2009), polimiositis (Warman et al., 2008), anemia hemolítica inmonomediada (Gow et al., 2011), anemia, pancreatitis, Cushing y Addison descompesados, cólico severo, linfoma y otras neoplasias (Serra et al., 2010). Perros con piometra mostraron de ligeras a moderadas elevaciones de troponina I sin haber llegado a determinar su origen (Hagman et al., 2007; Pelander et al., 2008). Edad y Raza Aunque hay pocos estudios al respecto, perros de edades avanzadas podrían relacionarse con incrementos de troponina I (Oyama y Sisson, 2004; Ljungvall et al., 2010). Se han observado mayores valores de troponina I en perros Doberman sanos con más de 8 años de edad, posiblemente por cambios en el miocardio relacionados con la edad o por miocardiopatía inicial (Wess et al., 2010). LaVecchio et al. (2009) encontraron valores de troponina I signifi cativamente mayores en galgos deportivos retirados que en perros de otras razas. Sin embargo, otras patologías subyacentes deben tenerse en cuenta y hacen falta más estudios para determinar si existen variaciones de los valores basales de troponinas entre diferentes razas de perros. Fallo renal Diferentes estudios muestran que entre el 7-18% de los humanos con fallo renal presentan valores elevados de troponina I (Freda et al., 2002; De Zoysa, 2004; Abbas et al, 2005) y además estos valores elevados son indicadores pronósticos de mortalidad (Stolear et al., 1999; Apple et al., 2002a). Aunque la causa exacta de estas elevaciones se desconoce, se han propuesto varios mecanismos, incluyendo necrosis miocárdica oculta, hipertrofi a ventricular y aclaramiento renal disminuido (Diris et al., 2004; Jeremias y Gibson, 2005). La troponina T está más comúnmente asociada a elevaciones durante la insufi ciencia renal, con un 82% de los pacientes con elevaciones de troponina T frente Revisión Bibliográfi ca 51 al 7% con valores elevados de troponina I (Apple et al., 2002a; Lamb et al., 2004). Probablemente, el aclaramiento de la troponina T está disminuido por su mayor tamaño (37 KDa frente a los 24 KDa de la troponina I), por lo que su medición es menos útil para detectar daño miocárdico no isquémico en pacientes con insufi ciencia renal (Schober, 2005). Hay varios estudios que muestran elevaciones de troponina I en gatos y perros con azotemia e insufi ciencia renal (Rishniw et al., 2004b; Porciello et al, 2008; Sharkey et al, 2009; Serra et al., 2010). 3. MIOGLOBINA 3.1. Fisiología La mioglobina es una proteína monomérica de peso molecular relativamente bajo (17.8 KDa), que fi ja el oxígeno del músculo estriado, tanto cardíaco como esquelético. Está unida de manera reversible al oxígeno y aumenta su transporte a las mitocondrias, desempeñando un papel importante en el metabolismo aerobio celular (Kamga et al., 2012). La mioglobina está relacionada fi logenéticamente con la hemoglobina (Kendrew et al., 1954; Wittenberg y Wittenberg, 1989), y mientras la hemoglobina se une a cuatro Figura 14. Molécula de mioglobina frente a molécula de hemoglobina (Fuente: Peter E. Childs, Haemoglobin, a molecuar lung, www.ul.ie). Figura 15. Cinética de la liberación de mioglobina frente a la troponina I y CK-MB en el infarto agudo de miocardio. 52 moléculas de oxígeno, la mioglobina se une sólamente a una molécula de oxígeno, y esta unión no es modifi cada por el pH del sarcoplasma. Así, el oxígeno unido a la mioglobina puede emplearse cuando el músculo está deprivado de oxígeno procedente de la circulación sanguínea, necesario para mantener la función mitocondrial (Kamga et al., 2012). La mioglobina está localizada en tejido muscular esquelético y cardíaco, y representa el 2% del contenido proteico citoplasmático en esas células (Varki et al., 1978; Kiessling et al., 1981; Vaidya, 1992); la proteína es idéntica en ambos tipos de tejido muscular (Wu, 1989). Además, no sólo está presente en el músculo estriado, sino que también se ha demostrado su presencia en musculatura lisa en humanos; mediante técnicas inmunohistológicas, se detectó en muy pequeñas concentraciones en el colon, intestino delgado, útero y vejiga, además de arterias y venas (Qiu et al., 1998). El daño celular, debido a una perfusión tisular inadecuada o por trauma, puede conducir a la liberación de mioglobina a la circulación (Varki et al., 1978). Los niveles de mioglobina se elevan a las 2 horas tras el episodio isquémico, alcanzan sus valores máximos entre las 6-9 horas y regresan a la normalidad entre las 24-36 horas (Vaidya, 1992). La vida media de la mioglobina en plasma es de 5-9 minutos en perros y 10-20 minutos en humanos (Klocke et al., 1982; Ellis y Saran, 1989), y se elimina con rapidez por la orina. La elevación tan temprana de los niveles de mioglobina se atribuye al pequeño tamaño de la proteína (Vaidya, 1992; Bhayana y Henderson, 1995). 3.2. Mioglobina en medicina humana En medicina humana, la utilidad de la mioglobina reside en su elevada sensibilidad y valor predictivo negativo en las primeras horas del infarto agudo de miocardio (Brogan et al., 1994; McCord et al., 2001; Singh et al., 2010). Su principal ventaja radica en la rapidez de su elevación en sangre, siendo actualmente la prueba diagnóstica más precoz del infarto agudo de miocardio (Van Blerk et al., 1992; Montague y Kircher, 1995; Laurino et al., 1996; de Winter et al., 2000; Lang et al., 2000; McCord et al., 2003) o contusión cardiaca (Keller y Shatney, 1988; St Louis y Grandhi, 1994; Ferjani et al., 1997; Bertinchant et al., 2000; Collins et al., 2001; Sybrandy et al., 2003). Sin embargo, durante durante las 3-4 primeras horas desde la aparición de los síntomas, un incremento aislado de mioglobina no es lo sufi cientemente sensible para el diagnóstico (Mair, 1997); por lo tanto, elevaciones de mioglobina obligan a la determinación ulterior de otro marcador más cardioespecífi co, como las troponinas cardíacas o CK-MB; estos marcadores son más específi cos pero la elevación de sus valores serológicos comienza más tarde. Por otro lado, la medición de valores Revisión Bibliográfi ca 53 de mioglobina nos proporciona información sobre la posible extensión de la necrosis miocardica, si sus cifras no vuelven a la normalidad en el tiempo estimado normal (24 a 36 horas después del daño miocárdico). Un estudio con 951 pacientes humanos con sospecha de padecer un síndrome coronario agudo, observó que los valores de mioglobina y de troponina I en el momento de la presentación del paciente en el centro de urgencias, eran importantes indicadores, independientes entre sí, del pronóstico a largo plazo, y ambos se asociaron con una mayor mortalidad en un periodo de 5 años (Jaffery et al., 2008). Otro estudio con 3461 pacientes, concluyó que, a pesar de la ausencia de especifi cidad cardíaca, valores elevados de mioglobina estaban fuertemente relacionados con la mortalidad de los pacientes (Kontos et al., 2007). El hecho de que la mortalidad asociada a la mioglobina fuera elevada en pacientes con valores de troponina I negativos, sugiere que la mioglobina podría predecir la mortalidad a través de mecanismos basados en isquemia no miocárdica. Por ejemplo, la hipotensión y la perfusión renal reducida pueden resultar en liberación de mioglobina por la musculatura esquelética (Spangenthal y Ellis, 1995) y podría contribuir a la mortalidad de origen no cardíaco. De acuerdo con esta teoría, un pequeño estudio en 31 pacientes que presentaban sepsis o shock hipovolémico mostraron que las elevaciones de mioglobina (97%) eran más frecuentes que elevaciones de troponina I (74%) (Arlati et al., 2000). La carencia de especifi cidad diagnóstica es debida a que los niveles séricos de mioglobina se pueden elevar en varias patologías con daño a las células musculares esqueléticas, como rabdomiolisis, cirugías, inyección intramuscular, miopatías, tras realizar ejercicio intenso, shock y convulsiones, y por varias toxinas y medicamentos (Brianzoni et al., 1981; Klocke et al., 1982; Baadsgaard y Schmidt, 1984; Vaidya, 1992; Bhayana y Henderson, 1995). Ya que es eliminado a través del riñón, los niveles séricos de mioglobina pueden estar elevados en insufi ciencia renal (Varki et al., 1978; Klocke et al., Figura 17. Extrasístoles ventriculares derechas en el ECG del mismo perro de la imagen anterior. Figura 16. Radiografía abdominal de perro con DVT, donde se aprecia una marcada dilatación gástrica. 54 1982; Vaidya, 1992; Spangenthal y Ellis, 1995). Aunque hay estudios donde observaron que la eliminación de mioglobina no se vio afectada por la tasa de fi ltración glomerular ni por la función renal, lo que sugiere un importante papel de la eliminación extrarrenal (hígado, bazo) (Wakabayashi et al., 1994; Lappalainen et al., 2002). Con la introducción de ensayos de troponina más sensibles y precisos, que pueden detectar necrosis miocárdica más temprano desde la aparición de los síntomas, la medición de mioglobina ya no ofrece ninguna ventaja respecto a estos marcadores más cardioespecífi cos (Eggers et al., 2004; 2005). Sin embargo, como se ha descrito anteriormente, la elevación de mioglobina ha demostrado tener un fuerte valor pronóstico en la aparición de efectos adversos en pacientes de alto riesgo (de Lemos et al., 2002) y de bajo riesgo (Newby et al., 2001) con síndrome coronario agudo. 3.3. Mioglobina en pequeños animales En animales, la determinación de mioglobina no se considera clínicamente útil debido a su baja especifi cad, rápida eliminación y la baja incidencia patología isquémica en comparación con humanos. Probablemente debido a esta causa, existen pocos trabajos publicados en los que se haya determinado los valores de mioglobina sérica en medicina veterinaria. 3.3.1. Ensayos Hasta la fecha, solamente un inmunoensayo electroquimioluminiscente “point-ofcare” empleado en humanos para cuantifi car la mioglobina, ha sido estudiado para medir la mioglobina en pacientes caninos (Burgener et al., 2006; Adamik et al., 2009). 3.3.2. Mioglobina en diferentes patologías Hasta la fecha, dos trabajos han publicado valores de mioglobina en perros con dilatación vólvulo-torsión gástrica (DVT) (Burgener et al., 2006; Adamik et al., 2009), mostrando su valor como indicador pronóstico, ya que asociaban valores elevados de mioglobina con mortalidad debido a complicaciones cardíacas derivadas de la patología. En ambos estudios se observaron valores de mioglobina elevados en el momento del ingreso y tras 48 horas en la mayoría de los pacientes. Sin embargo, Adamik et al. (2009) concluyeron que el valor de mioglobina en el momento del ingreso del perro en el hospital no se podía emplear como único parámetro para predecir la superviviencia del animal. Burgener et al., (2006) estudiaron los valores de mioglobina en perros con trauma- Revisión Bibliográfi ca 55 tismo torácico, obteniendo valores elevados en todos los perros estudiados (n=8) en el momento de su ingreso en el hospital y tras 48 horas. Otro estudio en perros con contusión torácica inducida experimentalmente mostró, mediante técnicas de inmunohistoquímica, pérdidas aisladas de mioglobina celular y presencia en el espacio intercelular a partir de los 5 minutos tras la contusión, y depleción de mioglobina en las fi bras miocárdicas en los perros muertos entre los 60-180 minutos tras el trauma, junto con focos hemorrágicos y/o necróticos, aunque en este estudio no se midieron los valores séricos de mioglobina; además, estos perros también manifestaron taquicardias ventriculares (Guan et al., 2007). Resultados similares se han encontrado en estudios inmunohistoquímicos en isquemia inducida experimentalmente en cerdos, ratas y perros (Block et al., 1983; Nomoto et al., 1987; Fujiwara et al., 1988). En un estudio experimental, se observaron valores serológicos elevados de mioglobina a los 20-40 minutos tras producir oclusión arterial en perros, con una vida media de 38 minutos (Klocke et al., 1982); mientras que otro estudio experimental en 18 perros en los que se indujo hipotensión sistémica, mostró que el análisis de la cinética de la mioglobina plasmática permite una detección temprana de la reperfusión coronaria tras el daño miocárdico incluso en presencia de una importante hipotensión sistémica (Spangenthal y Ellis, 1995). Increased thrombin production due to Fibrinogen Fibrin clot Fibrinolysis Intermediate fragments Complete clot lysis EEED DED DD DD DD EEEDD DD DD EEEDDDDDDD EEEDD DD EDDEDDDDD EEEDDDD DD E DD Surgery Trauma Infection Inflammation Disseminated intravascular coagulation Pregnancy and delivery Thrombosis Fibrinopeptide A Fibrinopeptide B d-Dimer Plasmin Fragment E Figura 18. Esquema global de la fi brinogénesis y fi brinolisis con la formación fi nal de dímero-D (Bockenstead, 2003). Figura 19. Radiografía posteroanterior del pulmón derecho de una mujer con embolismo pulmonar (Fuente: radiographics.rsna.org). 56 4. DÍMERO-D El dímero-D es el principal producto de la degradación de la fi brina por la plasmina y es generado en el paso fi nal de la formación de trombos. Se trata de uno de los parámetros de la hemostasia más estudiados en la última década, debido principalmente al papel que ha desarrollado en los algoritmos diagnósticos no invasivos de trombosis venosa profunda (TVP) y tromboembolismo pulmonar (TEP), dada la tendencia que se está registrando, cada vez mayor, de hacer un diagnóstico no invasivo de estas patologías, que conduce a subrayar todos los intentos encaminados a un diagnóstico más cómodo, rápido y barato. 4.1. Fisiología Durante el proceso de activación de la coagulación, se forma trombina, la cual, además de ser un potente activador plaquetario, cataliza la transformación de fi brinógeno a fi brina y promoviendo su polimerización (Fuster et al., 1988). Por lo tanto, mediante la acción de la trombina se liberan dos pequeños péptidos (fi brinopéptidos A y B), dando lugar a los monómeros solubles de fi brina. La unión en paralelo de los dominios D y E de dos monómeros da lugar a la formación de dímeros de fi brina, que posteriormente se unen entre sí de forma no covalente formando polímeros de fi brina (Walker y Nesheim, 1999; Horan y Francis, 2001). El factor XIII, activado por la trombina, actúa sobre estos polímeros y catalizando la formación de enlaces covalentes entre los dominios D de dímeros adyacentes de fi brina, estabilizando la molécula. La molécula resultante forma el coágulo en sí (Bockenstedt, 2003). Una vez formado dicho coágulo, comienza a actuar el sistema fi brinolítico, por medio de la plasmina, la cual lleva a cabo una escisión aleatoria de las moléculas de fi brina estabilizada a nivel de las uniones no covalentes entre los dominios D y E de los monómeros originales de fi brina (Bockenstedt, 2003), pero respetando las uniones covalentes entre los dominios D de moléculas adyacentes, obteniendo como resultado dímeros-D y fragmentos-E de fi brina (Bauer, 2002). Ambos son parte del producto fi nal de este proceso de degradación de la fi brina estabilizada. Por lo tanto, el dímero-D se genera exclusivamente a partir de la degradación de la fi brina estabilizada, mientras que los productos de degradación del fi brinógeno (PDFs) se originan tanto a partir de la degradación del fi brinógeno como de la fi brina no estabilizada (Aguilar, 2010). Por lo que los resultados de estos ensayos no siempre representan los mismos procesos fi siológicos o patológicos (Stokol, 2003). El dímero-D es una molécula pequeña (182 KDa); la elevación de las concentracio- Revisión Bibliográfi ca 57 nes serológicas se detecta aproximadamente una hora después del inicio de la formación del trombo. Los niveles de dímero-D elevados persisten unos 7 días tras el episodio tromboembólico (Meissner et al., 2000); posee una vida media de 8 horas y su vía de eliminación es principalmente renal, y en menor medida por el sistema mononuclear fagocítico (Adam et al., 2009). 4.2. Dímero-D en medicina humana El dímero-D se usa principalmente para detectar enfermedades tromboembólicas, incluyendo coagulación vascular diseminada (CID), TVP y TEP (Bick y Baker, 1992; Horan y Francis, 2001; Kelly et al., 2002). En el manejo del TEP, la sospecha clínica y la realización de una gammagrafía pulmonar es la estrategia diagnóstica más recomendada (Goldhaber y Morpurgo, 1992; Hyers, 1995; Palla et al., 1995); sin embargo, entre el 40-60% de los casos el resultado no es concluyente (Hull et al., 1985). La angiografía permanece como el patrón de diagnóstico imprescindible en determinados pacientes (Torbicki et al., 2008), pero es costosa e invasiva, y no está exenta de riesgo (Stein et al., 1992); además, no está diponible en muchos centros de urgencias (Jurado-Gámez et al., 2000). Ante la sospecha clínica, una prueba con un elevado valor predictivo negativo tendría un gran interés para descartar esta patología y evitar pruebas innecesarias o, por el contrario, para afi anzar la sospecha clínica (Anderson y Wells, 2000; Mavromatis y Kessler, 2001; Kelly et al., 2002). Muchos autores defi enden el uso de dímero-D dentro de un algoritmo diagnóstico para diferenciar pacientes que necesitan someterse a más pruebas más defi nitivas de tromboembolismo pero invasivas (Mavromatis y Kessler, 2001; Kelly et al., 2002). Así, empleando el dímero-D se reduce el número de pruebas diagnósticas requeridas Fallo multiorgánico Hemorragias Consumo plaquetas y factores coagulación Depósito de fibrina Plasmina PDF y DD Células mononucleares Citocinas proinflamatorias Expresión de factor tisular Alteración de los mecanismos anticoagulantes naturales (AC, C, S) Inhibición de la fibrinólisis (PAI-1) Estímulo Trombosis microvascular manual_dimero.indd 39 18/10/10 9:48 Figura 20. Fisiopatología de la CID y generación de Dímero-D (Páramo, 2010). 58 para confi rmar tromboembolismo y reduce sustancialmente los costes sanitarios (Kelly et al., 2002). Numerosos estudios han concluido que los resultados negativos en los valores de dímero-D serológicos poseen un fuerte valor predictivo negativo para excluir estas patologías, con una sensibilidad entre 95-100% para TEP, aunque este valor varía según el método empleado (Perrier, et al., 1997; Quinn et al., 1999; Anderson y Wells, 2000; Mavromatis y Kessler, 2001; Kelly et al., 2002; Abcarian et al., 2004; Goldhaber y Bounameaux, 2012). Sin embargo, algunos autores advierten contra la sobreinterpretación de resultados negativos en casos con una elevada sospecha clínica de trombosis, ya que la obtención de valores normales de dímero-D no pueden excluir la posibilidad de tromboembolismo en todos los casos (Anderson y Wells, 2000; Abcarian et al., 2004; Breen et al., 2009). De igual manera, para el diagnóstico del TVP, la flebografía con contraste ha sido el procedimiento diagnóstico de elección clásico, pero es una prueba invasiva y compleja desde el punto de vista técnico, que conllevaba una no despreciable morbilidad (Pearson et al., 1995; Cogo et al., 1998), y que sólo confi rma la enfermedad en 10-25% de los pacientes con sospecha clínica (Heijboer et al., 1993; Wells et al., 1997), por lo que en los últimos años se han desarrollado nuevas estrategias diagnósticas basadas las escalas de predicción clínica y valores de dímero-D, reservando las pruebas de imagen para los casos seleccionados. El valor predictivo positivo del dímero-D es muy bajo en la gran mayoría de los trabajos (24-30%) (Ginsberg et al., 1993; Goldhaber et al., 1993). Debido a su baja especifi cidad, un test positivo no puede ser empleado para confi rmar tromboembolismo, aunque algunos autores creen que un valor de dímero-D elevado podría ser sufi ciente evidencia para iniciar tratamiento trombolítico, especialmente en aquellos pacientes con un índice elevado de sospecha (Kelly et al., 2002). Un dímero-D alto obliga a realizar otras técnicas diagnósticas para confi rmar o excluir TEP o TVP. Los niveles de dímero-D elevados persisten unos 7 días tras el episodio tromboembólico (Meissner et al., 2000); a partir de ahí, un resultado negativo no puede excluir la patología. La localización del trombo también infl uye en los valores serológicos de dímero-D, ya que se ha visto que pacientes con TVP de localización distal o TEP subsegmentarios, muestran una mayor probabilidad de presentar resultados falsamente negativos (Aguilar, 2010). Se ha visto que los niveles de dímero-D aumentan con la edad, posiblemente por la elevada prevalencia de comorbilidades (Kelly et al., 2002; Rumley et al., 2006; Douma Revisión Bibliográfi ca 59 et al., 2010; Tita-Nwa et al., 2010; Penaloza et al., 2012), por lo que se considera que la especifi cidad y utilidad clínica de la medición del dímero-D disminuyen al aumentar la edad de los pacientes. Existen numerosos procesos patológicos que no son de naturaleza trombótica que también pueden cursar con una elevación del dímero-D, como traumatismo, cirugías, neoplasias, sepsis, coagulación intravascular diseminada, insufi ciencia cardíaca congestiva, hipertensión pulmonar y eventos coronarios agudos (Jafri et al., 1993; Sbarouni et al., 1994; Anderson y Wells, 2000; Horan y Francis, 2001; Cugno et al., 2004; Warwick et al., 2008; Chalmers et al., 2009; Hargett y Tapson, 2008; Ho, 2011; Kelly et al., 2002). Especialmente interesante es la elevación del dímero-D durante el embarazo, ya que se produce una activación fi siológica del sistema hemostático para preparar a la gestante para el parto, y los niveles de dímero-D sufren un incremento progresivo de lo largo de todo el embarazo (Kline et al., 2005; Jeremiah et al., 2012). 4.3. Dímero-D en pequeños animales En perros, el dímero-D es más comúnmente usado como un test complementario para el diagnóstico de CID (Caldin et al., 1998; 2000; Stokol et al., 2000; Scott-Moncrieff et al., 2001; Griffi n et al., 2003), aunque tiene un potencial para la detección de Figura 22. Tipos de ensayos de determinación de Dìmero-D: todos los ensayos emplean anticuerpos monoclonales que reconocen epítopos específi cos del fragmento Dímero-D (Bates, 2012). Figura 21. Determinación de dímero-D humano en un ensayo validado para su uso en perros. 66 endotelio pulmonar (Lang et al., 1993). Además, la detección de los trombos no siempre es posible, dependiendo de su localización. Algunos estudios han evaluado diferentes ensayos para identifi car procesos tromboembólicos en perros, obteniendo una sensibilidad de 100% y especifi cidad de 70% con un método de algutinación en latex (Nelson y Andrease, 2003) y sensibilidad de 87% y especifi cidad de 26% empleando un método inmunométrico (Dewhurst et al., 2008) ambos con un cutoff de 0.5 μg/ml. El dímero-D tiene el potencial de ser útil para la detección antemortem de TEP en pacientes caninos. Un estudio experimental en perros demostró que tras la inducción de TEP, los niveles de dímero-D estaban incrementados signifi cativamente a los 30 minutos post-embolización, alcanzaron su punto más alto a las 2 horas post-embolización y permanecieron signifi cativamente elevados durante 24 horas (Ben et al., 2007). Los niveles de dímero-D están ciertamente elevados en perros con evidencias clínicas de tromboembolismo (Griffi n et al., 2002; Nelson y Andreasen, 2002; 2003); en el estudio de Nelson y Andreasen (2002), la enfermedad tromboembólica estaba asociada a los valores de dímero-D más elevados comparados con otras condiciones, incluyendo enfermedad hepática y neoplasia. El resultado de éste y otros estudios plantean la posibilidad de que el grado de incremento en el dímero-D dé mayor información diagnóstica, con valores más elevados siendo más indicativos de tromboembolismo, especialmente si se pueden excluir hemorragias internas en la evaluación clínica. Sin embargo, no hay que olvidar que, al igual que en humanos, perros con TEP crónico pueden presentar valores normales de dímero-D (Griffi n et al., 2003). ARTÍCULOS IV 68 “Nothing shocks me, I am a scientist”. (Dr HW Indiana Jones, Indiana Jones and the Temple of Doom) Artículos 69 Carretón, E., Corbera, J.A., Juste, M.C., Morchón, R., Simón, F., Montoya-Alonso, J.A., 2011. Dirofi laria immitis infection in dogs: cardiopulmonary biomarker levels. Vet Parasitol. 176:313-316. Carretón, E., González-Miguel, J., Montoya-Alonso, J.A., Morchón, R., Simón, F., Passeri, B., Cantoni, A.M., Kramer, L., 2013. D-dimer deposits in lungs and kidneys suggest its use as a marker in the clinical workup of dogs with heartworm (Dirofi laria immitis) disease. Vet Parasitol. 191:182-186. Carretón, E., Morchón, R., González-Miguel, J., Simón, F., Juste, M.C., MontoyaAlonso, J.A., 2013. Variation of d-dimer values as assessment of pulmonary thromboembolism during adulticide treatment of heartworm disease in dogs. Vet Parasitol. doi:pii: S0304-4017(13)00030-7. 10.1016/j.vetpar.2013.01.005. Carretón, E., Grandi, G., Morchón, R., Simón, F., Passeri, B., Cantoni, A.M., Kramer, L., Montoya-Alonso, J.A., 2012. Myocardial damage in dogs affected by heartworm disease (Dirofi laria immitis): immunohistochemical study of cardiac myoglobin and troponin I in naturally infected dogs. Vet Parasitol. 189:390-393. Carretón, E., Morchón, R., González-Miguel, J., Juste, M.C., Simón, F., Montoya-Alonso, J.A. Utility of cardiac biomarkers during adulticide treatment of heartworm disease (Dirofi laria immitis) in dogs. Vet Parasitol. (aceptado con revisiones menores 26/03/2013). Artículos 2. 4. 1. 3. 5. 70 Artículos 71 Veterinary Parasitology 176 (2011) 313–316 Contents lists available at ScienceDirect Veterinary Parasitology journal homepage: www.elsevier.com/locate/vetpar Dirofilaria immitis infection in dogs: Cardiopulmonary biomarker levels E. Carretóna,∗, J.A. Corberaa, M.C. Justea, R. Morchónb, F. Simónb, J.A. Montoya-Alonsoa a Internal Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, University of Las Palmas de Gran Canaria, 35413 Arucas (Las Palmas), Spain b Laboratory of Parasitology, Faculty of Pharmacy, University of Salamanca, 37007 Salamanca, Spain article info Keywords: Dirofilaria immitis Cardiac troponin T Cardiac troponin I Myoglobin D-dimer Cardiopulmonary biomarkers abstract Cardiopulmonary biomarkers are biological parameters that can be objectively measured and quantified as indicators of pathogenic processes (heartworm disease) or as indicators of response to therapeutic intervention. To determine levels of cardiopulmonary biomarkers in canine dirofilariasis, measurements of cardiac troponin T, cardiac troponin I, myoglobin, and D-dimer concentrations were performed for dogs with and without evidence of adult heartworm infection. The results showed that levels of cardiac troponin T were undetectable in all dogs studied while levels of cardiac troponin I were higher in dogs infected with Dirofilaria immitis. In healthy dogs, levels of myoglobin and D-dimer were below detection limits of the instrument and were significantly higher in heartworm-infected dogs, notably in microfilaremic dogs. The results suggest the possibility of using troponin I and myoglobin as markers for cardiac damage and the D-dimer as a supportive tool for a diagnosis of pulmonary thromboembolism in dogs with cardiopulmonary dirofilariasis. © 2011 Elsevier B.V. All rights reserved. 1. Introduction Heartworm disease, caused by the filarial nematode Dirofilaria immitis, is increasingly diagnosed in temperate and tropical areas of the world (Genchi et al., 2007). The pathophysiologic response to heartworm infection is mainly due to the presence of adult worms in the pulmonary arteries. Intimal proliferation occurs in arteries occupied by living worms, while embolic fragments trigger thrombosis. Both these effects lead to pulmonary hypertension, which is one of the most important causes of clinical signs in heartworm disease. Thrombosis and thromboembolism may compromise the pulmonary circulation further. Severe pulmonary hypertension, if not treated, may progress to congestive heart failure (McCall et al., 2008). Cardiopulmonary biomarkers are biological parameters that can be objectively measured and quantified as indica- ∗Corresponding author. Tel.: +34 928 457426; fax: +34 928 451114. E-mail address: [email protected] (E. Carretón). tors of pathogenic processes like heartworm disease, or as responses to therapeutic interventions (Singh et al., 2010). The use of these biomarkers is a regular practice in human medicine for detection and prognosis of cardiovascular diseases. In veterinary medicine, these markers allow early detection of cardiopulmonary diseases, confirm doubtful cases and processes, and contribute to the establishment of prognosis and the decision on a specific treatment (Morrow and de Lemos, 2007; Boswood, 2009). Troponin T and troponin I are cardiac-specific isoforms of troponin, a striated muscle-structural protein (O’Brien, 2008), released into the circulation when the cardiac myocytes are damaged by necrosis or ischemia. Because troponin T and troponin I can be measured in plasma, both enzymes are used as an indicator of myocardial damage (Boswood, 2009). Myoglobin is an oxygen-binding protein found in skeletal and heart muscle. Cell injury caused by inadequate tissue perfusion or trauma may lead to the release of myoglobin into blood stream. In human medicine, it is used as an early diagnostic tool for acute myocardial infarction (Collinson et al., 2003). During the process of clot formation, thrombin cleaves fibrinogen to form soluble fibrin monomers that become 0304-4017/$ – see front matter © 2011 Elsevier B.V. All rights reserved. doi:10.1016/j.vetpar.2011.01.015 72 314 E. Carretón et al. / Veterinary Parasitology 176 (2011) 313–316 insoluble when factor XIII cross-links these monomers. Insoluble fibrin is cleaved by plasmin, producing different oligomers, one of them being the D-dimer (Goggs et al., 2009).Thus, increased concentrations of D-dimerin plasma is a marker of fibrinolysis, and consequently, of clot formation. The aim of the present study was to determine the levels of troponin T, troponin I, myoglobin, and D-dimer in dogs with and without adult heartworm infection to determine their application as biomarkers of the damage caused by D. immitis. 2. Materials and methods 2.1. Sample and sampling procedure Cardiac troponin T, cardiac troponin I, myoglobin, and D-dimer were measured in 88 client-owned dogs brought to the Veterinary Medicine Service of Las Palmas de Gran Canaria University. Their clinical status in relation to heartworm disease was assessed using a commercial ELISA test kit to detect circulating antigens (PetChek1 HW PF, IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, Maine, USA) according to manufacturer instructions. Dogs positive for circulating adult heartworm antigen were further evaluated for the presence or absence of microfilariae using a modified Knott test. Dogs were separated into three groups based on adult heartworm antigen status, clinical signs, and the presence or absence of circulating microfilariae. Group 1 comprised 13 clinically healthy dogs 1–10 years old (mean 4.8 years); six dogs were females and seven were males. All were negative for circulating D. immitis antigen, had no circulating microfilariae, and had no obvious signs of heartworm infection. Group 2 consisted of 21 amicrofilaremic dogs 2–14 years of age (mean 4.9 years) that were positive for circulating D. immitis antigens; 10 were females and 11 were males. Group 3 comprised 50 microfilaremic dogs 1–14 years old (mean 5.1 years) that were positive for circulating D. immitis antigen; 27 were females and 23 males. The study <0.1 ng/ml and <74 ng/ml, was approved by the ethical committee of Veterinary Medicine Service of Las Palmas de Gran Canaria University and was carried out in accordance with the current European legislation on animal protection. 2.2. Biomarker tests Blood samples were drawn from the cephalic vein of each animal on sampling days. Measurement of circulating troponin T, myoglobin and D-dimer was performed using heparinized blood, within 4 h of venipuncture, using specific CARDIAC T Quantitative ® , CARDIAC M ® and CARDIAC D-Dimer ® immunoassay system (Cardiac Reader ® system, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) respectively, according to manufacturer instructions. The measuring range was 0.1–2 ng/ml for troponin T, 30–700 ng/ml for myoglobin, and 0.1–4 ␮g/ml for D-dimer. Values below and above these ranges were displayed as negative and high, respectively. Reference ranges of troponin T and myoglobin in healthy dogs on Cardiac Reader were established as <0.1 n g/ ml and <74 n g/ ml, res p ectivel y( Bur g ener et al., 2006). A range of D-dimer concentration on Cardiac Reader in clinically healthy dogs in <0.2 ␮g/ml was established, based on reference ranges reported in a previous study (Bauer and Moritz, 2009). Measurement of circulating troponin I was performed within 4 h using the test Troponina I Easy Reader ® (Gernon Laboratories; Germany) and was processed using Vedalab Easy Reader ® (Veda.Lab diagnostics; Alenc¸ on, France) according to manufacturer instructions. Reference ranges for this assay were established using values of the healthy dogs included in the study; reference ranges vary widely based upon the equipment used making comparison of absolute values obtained from different equipment of little clinical utility (Adin et al., 2006; Wells and Sleeper, 2008). 2.3. Statistical analysis The SPSS statistical package (version 17.0 for Windows) was used for all data analyses. Descriptive analyses of the variables were carried out using the test of proportions for qualitative variables and measurements of central tendency (mean), measures of dispersion (standard deviation; SD) for quantitative variables. The comparisons of absolute means between groups were made using the Student’s t test for normally distributed variables. Bivariate analyses of proportionality of distribution of categorical variables were estimated using the  2 test. A Pvalue <0.05 was determined as indicating significance. 3. Results Levels of cardiac troponin T levels in all dogs (n= 71) were below the detection limit (<0.1 ng/ml) of the instrumentation used (Table 1). In group 1 (healthy dogs without heartworm disease; n= 8), cardiac troponin I levels were between 0.33 and 1.18 ng/ml. Dogs in group 2 (positive for D. immitis antigen and amicrofilaremic; n= 14) had cardiac troponin I values ranging from 0.44 to 3.26 ng/ml (Table 1). Values in group 3 dogs (positive for D. immitis antigen and microfilariae; n = 16) ranged from 0.67 to 1.97 ng/ml. The values for group 1 were significantly lower than those of both groups 2 and 3 (P< 0.05). No statistically significant differences were found between the values for groups 2 and 3 (both of which had dogs that were positive for circulating heartworm antigen). Myoglobin levels were under 30 ng/ml for all dogs tested in group 1 (n= 9). Elevated circulating myoglobin values (>74 ng/ml) were found in 18.8% and 23.9% of the dogs in groups 2 (n= 16) and 3 (n= 46), respectively (Table 1). Statistically significant differences (P< 0.01) were found between the mean myoglobin value for dogs from group 1 versus the mean for the dogs in groups 2 and 3 that had elevated myoglobin values (Table 1). There was also a significant difference (P< 0.01) between mean the myoglobin value in dogs in group 2 (amicrofilaremic) versus the mean for group 3 (microfilaremic). D-dimer values were below the detection limit of the instrument ( <0.1 n g/ ml ) in all do g s tested in g rou p 1 ( n=9 ) . Artículos 73 E. Carretón et al. / Veterinary Parasitology 176 (2011) 313–316 315 Table 1 Mean values for cardiopulmonary biomarkers studied for groups of dogs with and without heartworm infection. Cardiopulmonary markers Group 1 (n= 13) Group 2 (n= 21) Group 3 (n= 54) Cardiac troponin T <0.1 ng/ml (n= 9) <0.1 ng/ml (n= 16) <0.1 ng/ml (n= 46) Cardiac troponin I 0.9 ±0.3 ng/ml (n= 8) 1.23 ±0.8 ng/ml * (n= 14) 1.2 ±0.4 ng/ml * (n= 16) Myoglobin <30 ng/ml (n=9) 93±18 ng/ml a (n= 3) 273 ±24 ng/ml a,† (n= 11) D-dimer <0.1 ␮g/ml (n= 9) 0.39 ±0.1 ␮g/ml b,** (n= 7) 0.63 ±0.2 ␮g/ml b,**,† (n= 22) Data are shown as the mean or the mean ±standard deviation. Group 1: Healthy dogs without heartworm disease; Group 2: D. immitis-Ag+ and amicrofilaremic; Group 3: D. immitis-Ag+ and microfilaremic. a Includes only dogs with elevated values of myoglobin (>74 ng/ml). b Includes only dogs with elevated values of D-dimer (>0.2 ␮g/ml). * Significantly greater than Group 1 (P< 0.05). ** Significantly greater than Group 1 (P< 0.01). † Significantly greater than Group 2 (P< 0.01). Elevated D-dimer levels (>0.2 ␮g/ml) were detected in 44% of the dogs tested in group 2 (n= 16) and 48% of group 3 (n= 46) (Table 1). Statistically significant differences (P< 0.01) were found between mean D-dimer value for group 1 and the mean values for dogs in groups 2 and 3 with elevated levels. Statistically significant differences (P< 0.01) were also found between mean D-dimer value for dogs with elevated levels in group 2 versus that in group 3. 4. Discussion Cardiopulmonary biomarkers are biological parameters that can be measured objectively and be used as indicators of pathogenic processes or as a response to therapeutic interventions (Singh et al., 2010). Several cardiac biomarkers have been used in veterinary medicine for diagnosing and assessing the extent and severity of cardiopulmonary disease (Nelson and Andreasen, 2003; Boswood, 2009). In heartworm disease, primary lesions occur in pulmonary arteries and lung parenchyma, causing pulmonary hypertension that can progress to congestive heart failure (McCall et al., 2008). In the present study, we measured levels of troponin T, troponin I, and myoglobin as indicative of the myocardial damage and D-dimer levels as a marker of thrombolysis in dogs infested with D. immitis. There are several studies that demonstrate the utility of both troponin T (DeFrancesco et al., 2002; Tarducci et al., 2004; Burgener et al., 2006; Linklater et al., 2007; Bakirel and Gunes, 2009), and troponin I (Oyama and Sisson, 2004; Burgener et al., 2006; O’Brien, 2008; Bakirel and Gunes, 2009) in the evaluation of myocardial damage in different pathologies, as the slightest increase in serum levels indicates a pathological change. In the current study, values of troponin T were below limits of detection both in animals with heartworm disease and healthy control subjects. This result is similar to that found in previous studies in dogs positive for circulating heartworm antigen (Sribhen et al., 1999). However, levels of troponin I were slightly higher in the antigen positive animals both with and without circulating microfilariae in comparison with the control group. This may indicate the presence of myocardial damage in dogs positive for heartworm antigen. Several studies suggest that troponin I is a more sensitive and s p ecific marker than tro p onin T for the detection of minor cardiac damage (Hamm et al., 1997; Burgener et al., 2006). This could be due to the difference in size of the troponin I molecule in comparison with that of troponin T, the former being smaller, and therefore, less sever cardiac damage may allow leakage to occur (Linklater et al., 2007). Although levels of troponin I can rise in non-cardiac pathologies, such as renal failure (Porciello et al., 2008; Sharkey et al., 2009), the dogs in our study did not show any evidence of concomitant renal pathology, and we therefore attribute the differences found between the healthy control animals and the dogs with heartworm disease to the presence of D. immitis. In human medicine, myoglobin is used as an early indicator of acute myocardial infarction. The highest serum levels occur several hours before other cardio-specific biomarkers, allowing a more rapid diagnosis and prognosis (Collinson et al., 2003). Myoglobin may come from both cardiac and skeletal muscle. Detection of elevated plasma myoglobin in dogs is not considered clinically useful due to its low specificity, rapid elimination, and the low incidence of ischemic cardiac disease levels in dogs compared with humans. This is why an increase in myoglobin plasma values is not specific for cardiac damage in the dog. In our study, the concentrations of myoglobin in dogs infested with D. immitis were elevated in 23% of the dogs, notably in dogs with microfilaremia. There are several studies that show elevated levels of myoglobin in dogs with cardiac damage in a range of pathologies, such as gastric dilatationvolvulus, blunt chest trauma, and systemic hypotension (Spangenthal and Ellis, 1995; Burgener et al., 2006; Adamik et al., 2009); however, there are no published data on dogs with cardiopulmonary dirofilariasis. Therefore, we cannot confirm whether the origin of these levels of myoglobin is cardiac or skeletal. Further studies would need to be carried out to make this determination. The D-dimer is a fibrin degradation product. High plasma concentrations may indicate the presence of thrombi and their degradation. In 47% of dogs positive for D.immitis antigen, D-dimer were above the normal range, most notably in microfilaremic dogs. Moreover, these dogs had higher average values than amicrofilaremic dogs that were positive for heartworm antigen. Other studies have demonstrated elevated values of D-dimer in dogs with clinical evidence of thromboembolism (Griffin et al., 2003; Nelson and Andreasen, 2003; Stokol, 2003). In our 74 316 E. Carretón et al. / Veterinary Parasitology 176 (2011) 313–316 study, these elevated values may have been due to the thromboembolic complications caused by the D. immitis infection. Pulmonary thromboembolism is a common complication in animals infected with D. immitis, due to the presence of dead worms and fragments of diseased vascular intima (Adcock, 1961; Rawlings, 1986; Knight, 1987; Atwell et al., 1988). The presence of microfilaremia seems to increase D-dimer values, suggesting that the presence of microfilariae could increase the tendency to develop pulmonary thromboembolism. In conclusion, these preliminary data suggest the possibility of using troponin I and myoglobin as markers for cardiac damage and D-dimer as a marker supportive for thromboembolism in dogs with cardiopulmonary dirofilariasis. However, more studies should be carried out to obtain more reliable data on the marking capacity of these molecules. Conflict of interest The authors declare no conflicts of interest. Acknowledgments This research was partially supported by Agencia Canaria de Investigación, Innovación y Sociedad de la Información, Gobierno de Canarias, Spain (co-financed by FEDER funds) (grant C20080100093) and by Junta de Castilla y León, Spain (grant SA090/A09). References Adamik, K.N., Burgener, I.A., Kovacevic, A., Schulze, S.P., Kohn, B., 2009. Myoglobin as a prognostic indicator for outcome in dogs with gastric dilatation-volvulus. J. Vet. Emerg. Crit. Care 19, 247–253. Adcock, J.L., 1961. Pulmonary arterial lesions in canine dirofilariasis. Am. J. Vet. Res. 22, 655–662. 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Kramerc a Internal Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, University of Las Palmas de Gran Canaria, 35413 Arucas, Las Palmas, Spain b Laboratory of Parasitology, Faculty of Pharmacy and Institute of Biomedical Research of Salamanca (IBSAL), University of Salamanca, 37007 Salamanca, Spain c Department of Animal Health, University of Parma, 43100 Parma, Italy a r t i c l e i n f o Article history: Received 19 July 2012 Received in revised form 11 August 2012 Accepted 13 August 2012 Keywords: Dirofilaria immitis Thromboembolism D-dimer Lung Kidney Immunohistochemistry a b s t r a c t It has been reported that dogs with heartworm disease (Dirofilaria immitis) show increased plasma levels of D-dimer, a fibrin degradation product present in the blood after a blood clot is degraded by fibrinolysis. In the present study the authors show that, in dogs with both experimental and natural infections with D. immitis, D-dimer deposits in lungs and kidneys are associated with pulmonary thromboembolism and microfilariemic status, as well as there was a clear association between increased plasma values of D-dimer and positive staining in immunohistochemistry. Results suggest that the monitoring of D-dimer levels in infected dogs could be useful in evaluating the presence of pulmonary thromboembolism in the lungs and that microfilariae may induce microthrombosis in kidneys, thus contributing to renal pathology. © 2012 Elsevier B.V. All rights reserved. 1. Introduction Canine heartworm disease (CHWD) is caused by the filarial nematode Dirofilaria immitis that resides in the pulmonary arteries, and occasionally right heart chambers, of dogs, cats, ferrets and wild canids. Infection is characterized by endothelial proliferation, perivascular inflammation and thrombo-embolism, all leading to chronic pulmonary hypertension and right-side congestive heart disease (Simón et al., 2012). Although the exact incidence of pulmonary thromboembolism in these animals is unknown, it is thought that it is a substantial complication in infected animals and in animals under adulticide treatment. D-dimer is a fibrin degradation product present ∗Corresponding author. Tel.: +34 636024279; fax: +34 928451114. E-mail address: [email protected] (E. Carretón). in the blood after a blood clot is degradated by fibrinolysis. During the process of clot formation, thrombin cleaves fibrinogen to form soluble fibrin monomers that become insoluble when factor XIII cross-links these monomers. Insoluble fibrin is cleaved by plasmin, producing different oligomers, one of them being the D-dimer (Goggs et al., 2009). Thus, increased concentrations of D-dimer in plasma is a marker of fibrinolysis, and consequently, of clot formation. Several studies have documented that increased plasma D-dimer concentrations can be useful in the identification of dogs with thromboembolic disease and disseminated intravascular coagulation, suggesting that early recognition of these conditions in critically ill dogs followed by instigation of antithrombotic therapy may help in the reduction of mortality (Nelson and Andreasen, 2003; Stokol, 2003; Dewhurst et al., 2008). Carretón et al. (2011) recently reported that levels of D-dimer were significantly 0304-4017/$ – see front matter © 2012 Elsevier B.V. All rights reserved. http://dx.doi.org/10.1016/j.vetpar.2012.08.008 82 ARTICLE IN PRESS G Model VETPAR-6673; No. of Pages 6 2E. Carretón et al. / Veterinary Parasitology xxx (2013) xxx– xxx from both adults and microfilariae when they die. The adult worms cause endoarteritis with intimal proliferation and thickening of the wall vessels, and obstruction of the blood flow by narrowing the lumen of the smaller pulmonary arterioles-branches. Furthermore, when the worms die, along with platelet aggregation and fragments of diseased vascular intima, embolic fragments are formed which trigger thrombosis. These events lead to pulmonary hypertension, which is one of the most important causes of clinical signs in heartworm disease. Severe pulmonary hypertension, if not treated, may progress to congestive heart failure (McCall et al., 2008; Simón et al., 2012). Thrombosis and thromboembolism may compromise the pulmonary circulation further; moreover, during the adulticide treatment, pulmonary thromboembolism (PTE) is an inevitable consequence of successful adulticide therapy. Mild thromboembolism may be clinically unapparent but in severe cases life-threatening respiratory distress can occur. d-Dimer is an end product of the degradation of a fibrin-rich thrombus. During the process of clot formation, thrombin cleaves fibrinogen to form soluble fibrin monomers that become insoluble when factor XIII crosslinks these monomers. Insoluble fibrin is cleaved by plasmin, producing different oligomers, one of them being the d-dimer. Thus, increased concentrations of d-dimer in plasma is a marker of fibrinolysis, and consequently, of clot formation. d-Dimers result only from the degradation of cross-linked fibrin (stabilized clot) and, thus, in contrast to other degradation products, are specific for active coagulation and fibrinolysis (Goggs et al., 2009). d-Dimer assays are the focus of much research in human studies of PTE and in veterinary studies of thromboembolic diseases (Nelson and Andreasen, 2003; Stokol, 2003; Torbicki et al., 2008). Several studies have reported that increase in plasma d-dimer concentrations can be useful in the identification of dogs with thromboembolic disease and disseminated intravascular coagulation (Nelson and Andreasen, 2003; Stokol, 2003; Dewhurst et al., 2008). It has recently been reported that a significant number of dogs with naturally acquired HWD show an increase in plasma concentrations of d-dimer (Carretón et al., 2011, 2012). The authors showed that these elevated concentrations of d-dimer would be due to thromboembolic processes, suggesting that d-dimer could be used as a supportive tool for diagnosis and evaluation of PTE in dogs with heartworm disease. The purpose of the present study was to evaluate the variation of d-dimer, as well as platelets, in dogs infected by D. immitis during the adulticide treatment with ivermectin, doxycycline and melarsomine, following the American Heartworm Society’s recommended protocol. 2. Materials and methods 15 client-owned dogs brought to the Veterinary Medicine Service of Las Palmas de Gran Canaria University were included in the study. Ten were male and 5 were female and the age ranged from 2 to 7 years; 10 were mixed-bred dogs and 5 were pure-bred dogs (Dalmatian, Samoyed, Beagle, German Shepherd Dog and Dachshund). All the owners gave their consent to participate in this study. The dogs lived in a hyperendemic area of HWD (Montoya-Alonso et al., 2011). Inclusion in the study was based on a positive result for circulating D. immitis antigens (PetChek ® HW PF, IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, Maine, USA). Dogs were further evaluated for the presence or absence of microfilariae using a modified Knott test. Thoracic radiography and echocardiography exams were carried out in all dogs at the beginning and at the end of the study. The study was approved by the Ethics Committee of the Veterinary Medicine Service of Las Palmas de Gran Canaria University and was carried out in accordance to current European legislation on animal protection. Echocardiographic findings and levels of circulating antigens were evaluated to estimate the worm burden (Venco et al., 2003). According to Venco et al. (2003), when worms were visualized in the pulmonary trunk and/or in the proximal intralobar pulmonary arteries, the worm burden was more likely to be clinically significant, while when no worms were visualized or only a few echoes occupying the right pulmonary artery and extending to the main pulmonary artery, the worm burden was considered low. The dogs received adulticide treatment following the American Heartworm Society recommended management protocol (American Heartworm Society, 2012). Briefly, on day 0 the dog is diagnosed and verified as heartworm positive, monthly heartworm preventative based on ivermectin (6 ␮g/kg) and the administration of doxycycline (10 mg/kg BID) for 4 weeks is initiated. On day 60 the dog is treated with the first intramuscular injection of melarsomine (2.5 mg/kg), followed on day 90 by a second injection, and a third injection on day 91. On day 120 the dog is tested for presence of microfilariae and discharged. Finally, on day 271, 6 months after completion, an antigen test is carried out to confirm the adulticide efficacy. Moderate exercise restriction was recommended from day 0 until day 60 and significant since day 60 until at least one month after the last melarsomine injection. The blood sampling and measurements were done on day 0, day 60 and from then on, on a weekly basis; on day 67, day 75, day 82, day 91, day 98, day 106, day 113 and day 120. Finally, on day 271 the last blood sample and measurements were taken and the test for detection of circulating antigens was carried out (PetChek ® HW PF, IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, Maine, USA). Measurement of circulating d-dimer was performed using heparinized blood, within 4 h of venipuncture, using specific CARDIAC D-Dimer ® immunoassay system (Cardiac Reader system, Roche ® Diagnostics, Mannheim, Germany), according to manufacturer instructions. The measuring range was 0.1–4 ␮g/ml; values below and above these ranges were displayed as negative and high, respectively. A range of d-dimer concentration on Cardiac Reader in clinically healthy dogs in <0.2 ␮g/ml was established, based on reference ranges reported in a previous study (Bauer and Moritz, 2009). Platelet count was performed using blood collected in EDTA-3K tubes, following standardized techniques (canine profile) (Medonic ® CA530, Boule Medical AB, Stockholm, Sweden). Slight or mild thrombocytopenia was considered when the platelet count was 50–142 × 10 3 platelets/␮l (Furlanello et al., 2005) and thrombocytosis Artículos 83 ARTICLE IN PRESS G Model VETPAR-6673; No. of Pages 6 E. Carretón et al. / Veterinary Parasitology xxx (2013) xxx– xxx 3 was considered when the platelet count was >500 × 10 3 platelets/␮l (Neel et al., 2012). 2.1. Statistical analysis For data statistical analysis the IBM ® SPSS ® Statistics (version 19) was used throughout. Descriptive analyses of the variables were carried out using the test of proportions for qualitative variables and measurements of central tendency (mean), measures of dispersion (standard deviation; SD) for quantitative variables. For continuous variables we used the Kolmogorov–Smirnov test to check that the variables were normally distributed. The comparisons of absolute means between groups were made with the T of Student test for normally distributed variables. Bivariate analyses of proportionality of distribution of categorical variables were estimated using the 2 test. A P value < 0.05 was determined as indicating significance. Finally, the correlation between abnormalities in platelet number and d-dimer concentration in the different groups by means of a Spearman rank correlation was evaluated. 3. Results Based on the modified Knott test results on day zero, 7 dogs (47%) showed microfilaremia and 8 (53%) were amicrofilariemic. On day 120, only one dog showed microfilaremia and on day 271, none of them revealed presence of microfilariae. Echocardiographic findings and analysis of the levels of circulating antigens suggest that 9 dogs (60%) can be considered as having a low burden of heartworms (group 1) while 6 can be considered to have a high burden (group 2). On day zero, 40% (6/15) of dogs showed elevated values of d-dimer (>0.2 ␮g/ml). Of these, 42.85% (3/7) were microfilaremic and 37.5% (3/8) were amicrofilaremic. On day zero, the group 1 (low parasite burden) showed elevated levels of d-dimer in 33.3% of dogs (3/9), while in group 2 (high parasite burden) 50% of the dogs (3/6) showed elevated levels of d-dimer. Table 1 Mean values of d-dimer for group 1 (low parasite burden) and group 2 (high parasite burden) during the treatment. Includes only dogs with elevated values of d-dimer (>0.2 ␮g/ml). Data are shown as the mean or the mean ± standard deviation (␮g/ml). The asterisk (*) refers to the first intramuscular injection of melarsomine and the two asterisks (**) refers to second (day 90) and third (day 91) intramuscular injections of melarsomine. Day of treatment Group 1 (low burden) (n = 9) Group 2 (high burden) (n = 6) Day 0 0.32 ± 0.15 (n = 3) 0.29 ± 0.1 (n = 3) Day 60* 0.2 (n = 1) 0.29 (n = 1) Day 67 0.28 (n = 1) 0.5 ± 0.3 (n = 5) Day 75 0.2 (n = 1) 0.4 ± 0.39 (n = 6) Day 82 None 0.25 ± 0.06 (n = 4) Day 91** None 0.38 ± 0.17 (n = 2) Day 98 None 0.39 ± 0.12 (n = 6) Day 106 None 0.47 ± 0.28 (n = 6) Day 113 None 0.47 ± 0.42 (n = 5) Day 120 None 0.58 ± 0.53 (n = 2) Day 271 None None The variations in the percentages of dogs in groups 1 and 2 showing elevated levels of d-dimer during the treatment are described in Fig. 1. There were statistically significant differences between both groups during all the treatment (P < 0.05). The mean values of d-dimer in dogs with elevated levels during the treatment in groups 1 and 2 of dogs are shown in Table 1. On day zero, 40% (6/15) of the studied dogs showed slight or mild thrombocytopenia; of these, 42.8% (3/7) presented microfilaremia and 37.5% (3/8) were amicrofilaremic. Concerning the parasite burden, 33.3% (3/9) of dogs from group 1 and 50% (3/6) of dogs from group 2 showed thrombocytopenia. There were not statistically significant differences in mean values of platelets between groups 1 and 2 during the treatment, except on day 67 (P = 0.04). At the end of the treatment (day 120), all dogs had a platelet count within the reference ranges for healthy dogs. The mean values of platelets in all the studied dogs as well as in dogs of groups 1 and 2 during the treatment are described in Table 2. There were not statistically Fig. 1. Percentages of dogs of groups 1 (low parasite burden) and group 2 (high parasite burden) with elevated levels of d-dimer during the treatment. There are statistically significant differences between both groups during all the treatment (P < 0.05). The asterisk (*) refers to the first intramuscular injection of melarsomine and the two asterisks (**) refers to second (day 90) and third (day 91) intramuscular injections of melarsomine. 84 ARTICLE IN PRESS G Model VETPAR-6673; No. of Pages 6 4E. Carretón et al. / Veterinary Parasitology xxx (2013) xxx– xxx Table 2 Mean values of platelets for all dogs, and groups of dogs with elevated (>0.2 ␮g/ml) and normal (<0.2 ␮g/ml) levels of d-dimer, during the treatment. Data are shown as the mean ± standard deviation (×10 3 platelets/␮l). The black triangle () designates significant (P < 0.05) differences. The asterisk (*) refers to the first intramuscular injection of melarsomine and the two asterisks (**) refers to second (day 90) and third (day 91) intramuscular injections of melarsomine. Day of treatment Total dogs (n = 15) Elevated d-dimer Normal d-dimer Day 0  226.80 ± 149.29 299.16 ± 116.42 (n = 6) 178.55 ± 154.87 (n = 9) Day 60* 297.46 ± 74.07 385.00 ± 63.64 (n = 2) 284.00 ± 67.75 (n = 13) Day 67  259.73 ± 80.47 208.16 ± 28.82 (n = 6) 294.11 ± 86.54 (n = 9) Day 75 201.40 ± 74.36 181.00 ± 56.42 (n = 7) 219.25 ± 86.90 (n = 8) Day 82 217.46 ± 66.11 195.50 ± 38.44 (n = 4) 225.45 ± 73.57 (n = 11) Day 91** 270.66 ± 66.40 266.50 ± 61,52 (n = 2) 271.30 ± 69.46 (n = 13) Day 98 212.33 ± 74.82 193.16 ± 49.95 (n = 6) 225.11 ± 88.20 (n = 9) Day 106 253.93 ± 88.38 223.50 ± 65.51 (n = 6) 274.22 ± 99.14 (n = 9) Day 113 260.73 ± 65.45 239.80 ± 48.48 (n = 5) 271.20 ± 72.49 (n = 10) Day 120 324.73 ± 63.23 368.00 ± 67.88 (n = 2) 318.07 ± 62.61 (n = 13) Day 271 324.93 ± 47.98 None 324.93 ± 47.98 (n = 15) significant differences in mean values of platelets between dogs with elevated and with normal levels of d-dimer during the treatment, except on days 0 and 67 (P < 0.01). No correlation was detected between thrombocytopenia and elevated levels of d-dimer (P = 0.46, r = −0.20). On day 271, all dogs had a negative result in the heartworm antigen test and there was no evidence of heartworms in the echocardiographic examination. There was not any adverse reaction during the treatment and all the dogs completed it. Only two dogs from group 2 showed clinical signs suggesting thromboembolism (cough, dyspnea) at the time of blood sampling on day 75 (d-dimer: 1.2 ␮g/ml) and day 98 (d-dimer: 0.58 ␮g/ml), respectively. 4. Discussion During canine HWD, PTE is present: intimal proliferation occurs in arteries occupied by living worms and embolic worm fragments from dead worms trigger thrombosis, both which may completely obstruct segments of the pulmonary arteries; moreover, as worms die following administration of adulticidal drugs, they decompose and small worm fragments lodge in the distal pulmonary arterioles and capillary beds in the caudal lung lobes blocking blood flow. These worm fragments, along with the elicited inflammation and platelet aggregation, result in thromboembolisms. Significant pulmonary vascular occlusion leads to pulmonary arterial hypertension and increased right ventricular afterload. Severe, acute changes in right ventricle afterload result in debilitation and dysfunction (McCall et al., 2008; Goggs et al., 2009). Clinical signs of PTE are highly variable, inconsistent and non-specific, and many small animals with PTE will have normal thoracic radiographs (Goggs et al., 2009). Therefore, the diagnosis of this disorder is often difficult to obtain and is frequently missed. In most cases, the consequences of misdiagnosis are serious. There are a lack of non-invasive tests that are sensitive and specific for the diagnosis of PTE. d-Dimer is a product of degradation of fibrin, thus high plasma concentrations indicate the presence of thrombi and their degradation. Although numerous laboratory biomarkers of coagulation have been studied, the d-dimer assay is considered the marker of choice for dogs with a suspicion of PTE (Nelson and Andreasen, 2003; Stokol, 2003). Furthermore, negative d-dimer concentrations may exclude PTE in a suspicious patient (Nelson and Andreasen, 2003). In the present study, 40% of dogs showed pathological concentrations of d-dimer before beginning the treatment protocol. Previous studies reported levels of d-dimer significantly higher compared to those of healthy dogs in 47% and 34.8% of HWD-infected dogs (Carretón et al., 2011, 2012). Furthermore, the authors reported that ddimer levels were above the normal range most notably in microfilaremic dogs and suggested that the presence of microfilariae could increase the tendency to develop PTE. Likewise, in the present study microfilaremic dogs showed elevated levels of d-dimer more frequently, which is in accordance with these findings. Recently, an immunohistochemical study reported that the presence of PTE was consistently associated with positive staining for d-dimer (Carretón et al., 2012). Moreover, all dogs with pathological levels of plasma d-dimer were associated with positive staining for d-dimer in pulmonary tissue and some cases affected by thromboembolisms as well, leading to the conclusion that the monitoring of ddimer levels in infected dogs is useful in evaluating the presence of pulmonary thromboembolic episodes in the lungs of dogs with heartworm disease. Furthermore, in that study positive staining for d-dimer associated with aggregates of microfilariae was observed in many cases. The findings of our study agree with those reported by Carretón et al. (2012), since 50% of dogs with high burden of D. immitis showed elevated levels of d-dimer, compared to 33.3% of dogs with low parasite burden, furthermore 42.85% of microfilaremic dogs showed elevated levels of d-dimer, compared to 37.5% of amicrofilaremic dogs. 40% of the studied dogs showed slight or mild thrombocytopenia on day 0. This finding probably represents the dramatic consumptive process of thromboembolism. Previously, thrombocytopenia was reported in dogs infected by D. immitis (Rawlings, 1982; Boudreaux et al., 1989; Anuchai et al., 2007). Thrombocytopenia, as marker of disseminated intravascular coagulation, may increase the index of suspicion for PTE (Feldman et al., 2000). No correlation was detected between elevated levels of d-dimer and thrombocytopenia in the studied dogs. Artículos 85 ARTICLE IN PRESS G Model VETPAR-6673; No. of Pages 6 E. Carretón et al. / Veterinary Parasitology xxx (2013) xxx– xxx 5 Nelson and Andreasen (2003) found similar results, who reported incidence of platelet number abnormalities (thrombocytopenia o thrombocytosis) in 65% of dogs with thromboembolic processes, although they found no correlation between thrombocytopenia and high d-dimer concentrations in dogs with thromboembolic disease. We found that the levels of d-dimer decreased on day 60, as well as the medium levels of platelets increase, being within normal ranges in all dogs. This could be due to the joint action of the ivermectin, doxycycline and (moderate) exercise restriction. It has been reported that the use of a macrociclic lactone prior to adulticide treatment reduce, if not eliminate, circulating microfilariae and reduce female worm mass; the resulting reduction in antigenic mass may be likely to reduce the severity of PTE (Kramer et al., 2011). Furthermore, specific antibiotic therapy given to infected dogs reduces the endosymbiotic bacterial population of Wolbachia within all life stages of D. immitis, which greatly reduces pro-inflammatory reactions to dying worms. The elimination of Wolbachia and reduction of microfilariae may reduce the vascular inflammation and, therefore, reduce thromboembolic processes or its severity. Several studies have shown that dogs that received the combined doxycycline/ivermectin protocol prior to treatment with adulticide, showed less severe arterial lesions (Bazzocchi et al., 2008; Kramer et al., 2008, 2011). Likewise, an immunohistochemical study showed that lung tissues from heartworm-infected dogs treated with ivermectin and doxycycline were rarely positive to d-dimer (Carretón et al., 2012). Therefore, the elimination of worms through adulticide therapy should be carried out according to specific guidelines that are aimed at limiting further pathology associated with dying worms. All dogs with high parasite burden (group 2) showed elevated values of d-dimer on several occasions during the treatment. The highest values were found on day 75 (second week after the first injection of melarsomine) and days 98 and 106 (first and second week after the third injection of melarsomine). This may be due to embolization of the dead worms into the pulmonary vasculature, which justifies the importance of the parasite burden in the development of thromboembolic processes. PTE is an inevitable consequence of successful adulticide therapy and may be severe if infection is heavy and pulmonary arterial disease is extensive. If signs of embolism develop, they are usually evident within 7–10 days, but occasionally as late as 4 weeks after completion of adulticide administration (American Heartworm Society, 2012). On the other hand, only 33.3% of the dogs with low parasite burden showed elevated d-dimer levels at some point during the treatment, and all of them showed undetectable levels of d-dimer from day 82 of treatment (third week after the first injection of melarsomine), which indicates that significant thromboembolic processes only developed during the first two weeks after the first injection of adulticide in this group. There were not significant differences in mean values of platelets between groups 1 and 2 during the treatment, except on day 67 (P = 0.04), when only a very weak significance was observed. Given the lack of non-invasive tests that are sensitive and specific for the diagnosis of PTE, the evaluation of serum d-dimer may be considered a quick and valuable screening test. During the treatment, there was not correlation between thrombocytopenia and high levels of d-dimer. A possible explanation may be that the d-dimer levels seems to keep significantly elevated from 30 min to 24 h postembolism, as described by Ben et al. (2007) after inducing acute PTE in eighteen healthy dogs; on the other hand, Kitoh et al. (1994) observed that, after intravenous injection of heartworm extract in 50 dogs with and without heartworm disease, the platelet count decreased markedly at initial collapse and tended to recover 30 min after heartworm injection. On day 120, 33.3% of the dogs with high parasite burden showed elevated levels of d-dimer, which indicates that one month after the last injection of adulticide, thromboembolic processes are still occurring, therefore the exercise restriction may continue in these dogs. On day 271, all dogs showed undetectable levels of d-dimer; none of them revealed presence of heartworm during echocardiographic examination, as well as all antigen tests being negative, confirming the success of the treatment. All the microfilaremic dogs except one, showed no presence of circulating microfilariae on day 120, and all of them were amicrofilaremic on day 271. Bazzocchi et al. (2008) reported that, after weekly administration of ivermectin (6 ␮g/kg) and doxycycline (10 mg/kg/day) intermittently during 34 weeks in heartworm-infected dogs, there was a significant fall in circulating microfilariae beginning at week 6 of treatment, and all dogs were amicrofilaremic at week 12 (day 84), concluding that this dramatic drop could due to the summation of the effects of both drugs. In our study, the administration of ivermectine was mensual, and the doxycycline was administrated only for 4 weeks, hence this could be the cause of a slower drop of circulating microfilariae. The d-dimer appears to be a supportive test in the monitoring and evaluation of the dog during the adulticide treatment of D. immitis. d-dimer is a non-invasive, useful and quick screening test, and could be used as a supportive tool for assessment and monitoring of PTE in dogs with HWD during the adulticide treatment. Acknowledgements This research was partially supported by Agencia Canaria de Investigación, Innovación y Sociedad de la Información, Gobierno de Canarias, Spain (co-financed by FSE funds). References American Heartworm Society, 2012. Guidelines for the diagnosis, prevention and management of heartworm (Dirofilaria immitis) infection in dogs (2012). Available at: http://www.heartwormsociety.org (accessed 15.11.12). Anuchai, N., Morakot, K., Sonthaya, T., Somporn, T., Siram, S.A., 2007. Retrospective study of the clinical hematology and the serum biochemistry tests made on canine dirofilariasis cases in an animal hospital population in Bangkok, Thailand. Res. Vet. Sci. 82, 364–369. Bauer, N., Moritz, A., 2009. Evaluation of the cardiac reader (R) as a point-of-care instrument for measurement of fibrin d-dimers in dogs. Tierärztl. Prax. 37, 319–325. 86 ARTICLE IN PRESS G Model VETPAR-6673; No. of Pages 6 6E. Carretón et al. / Veterinary Parasitology xxx (2013) xxx– xxx Bazzocchi, C., Mortarino, M., Grandi, G., Kramer, L.H., Genchi, C., Bandi, C., Genchi, M., Sacchi, L., McCall, J.W., 2008. Combined ivermectin and doxycycline treatment has microfilaricidal and adulticidal activity against Dirofilaria immitis in experimentally infected dogs. Int. J. Parasitol. 38, 1401–1410. Ben, S.Q., Ni, S.S., Shen, H.H., Shi, Y.X., Huang, S.B., Xu, J.H., Huang, J.F., 2007. The dynamic changes of LDH isoenzyme 3 and d-dimer following pulmonary thromboembolism in canine. Thromb. Res. 120, 575–583. Boudreaux, M.K., Dillon, A.R., Spano, J.S., 1989. Enhanced platelet reactivity in heartworm-infected dogs. Am. J. Vet. Res. 50, 1544–1547. Carretón, E., Corbera, J.A., Juste, M.C., Morchón, R., Simón, F., MontoyaAlonso, J.A., 2011. Dirofilaria immitis infection in dogs: cardiopulmonary biomarker levels. Vet. Parasitol. 176, 313–316. 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Montoya-Alonso a aInternal Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, University of Las Palmas de Gran Canaria, 35413 Arucas, Las Palmas, Spain bDepartment of Animal Health, University of Parma, 43100 Parma, Italy cLaboratory of Parasitology, Faculty of Pharmacy, University of Salamanca, 37007 Salamanca, Spain a r t i c l e i n f o Article history: Received 19 October 2011 Received in revised form 5 April 2012 Accepted 13 April 2012 Keywords: Dirofilaria immitis Myoglobin Cardiac troponin I Myocardium Immunohistochemistry a b s t r a c t It has recently been reported that dogs affected by canine heartworm disease (Dirofilaria immitis) can show an increase in plasma levels of myoglobin and cardiac troponin I, two markers of muscle/myocardial injury. In order to determine if this increase is due to myocardial damage, the right ventricle of 24 naturally infected dogs was examined by routine histology and immunohistochemistry with anti-myoglobin and anti-cardiac troponin I antibodies. Microscopic lesions included necrosis and myocyte vacuolization, and were associated with loss of staining for one or both proteins. Results confirm that increased levels of myoglobin and cardiac troponin I are indicative of myocardial damage in dogs affected by heartworm disease. © 2012 Elsevier B.V. All rights reserved. 1. Introduction Canine heartworm disease (CHWD) is caused by the filarial nematode Dirofilaria immitis, that resides in the pulmonary arteries, and occasionally right heart chambers, of dogs, cats, ferrets and wild canids (McCall et al., 2008). Infection is characterized by endothelial proliferation, perivascular inflammation and thrombo-embolism, all leading to chronic pulmonary hypertension and right-side congestive heart disease. Myoglobin, an oxygen-binding protein found in cardiac and striated muscle, is used as an early diagnostic tool for myocardial infarction (Collinson et al., 2003). Cardiac troponin I is a striated-muscle structural protein, myocardial-specific isoform, whose release ∗Corresponding author at: Dipt. Salute Animale, Facoltà di Medicina Veterinaria, Università di Parma, via del Taglio 10, 43126 Parma, Italy. Tel.: +39 0521 032715; fax: +39 0521 032770. E-mail address: [email protected] (L. Kramer). into the bloodstream is due to damage to cardiac myocytes (Boswood, 2009). It has recently been reported that a significant number of dogs with naturally acquired CHWD show an increase in plasma concentrations of myoglobin and cardiac troponin I (Carretón et al., 2011). The authors hypothesized that these elevated concentrations are due to damage to the myocardium as a result of pulmonary hypertension and consequent right-side congestive heart disease. In order to confirm the myocardial origin of increased plasma levels of these two proteins, the hearts of 24 naturally infected dogs were examined by routine histology and immunohistochemistry with anti-myoglobin and anti-cardiac troponin I antibodies. 2. Materials and methods 2.1. Animals Dogs from a local dog shelter in Las Palmas, Spain, were used in the study. The study was approved by the Ethics 0304-4017/$ – see front matter © 2012 Elsevier B.V. All rights reserved. http://dx.doi.org/10.1016/j.vetpar.2012.04.013 88 E. Carretón et al. / Veterinary Parasitology 189 (2012) 390– 393 391 Committee of the Veterinary Service of Las Palmas de Gran Canaria University and was carried out in accordance to current European legislation on animal protection. Inclusion in the study was based on a positive result for circulating D. immitis antigens (PetChek1 HW PF, IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, Maine, USA). Levels of plasma myoglobin and cardiac troponin I were measured according to Carretón et al. (2011). Recruited dogs were humanely euthanized. Hearts were examined for the presence of macroscopic lesions. Nematodes were counted and parasite loads were divided into “low” (≤10 worms) and “high” (≥10 worms). The myocardium was sampled in the same position for all dogs, i.e. along the midline of the right ventricle free wall. Samples were fixed in 10% buffered formalin until processing. 2.2. Histology and immunohistochemistry Tissues were embedded in paraffin and processed for histology and immunohistochemistry. Six-micron thick sections were placed on polylysine pre-treated slides. Tissue sections were stained with haematoxylin/eosin for routine histological examination. For immunohistochemistry, sections were incubated with an anti-human/canine myoglobin monoclonal antibody (product # M7773, Sigma–Aldrich, Madrid, SP) and an anti-human troponin I polyclonal antibody (product #PA1-86820, Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Briefly, sections were pre-treated in a microwave oven for three 5 min cycles at 400 W; tissues for myoglobin immunohistochemistry were pre-treated in 0.1 M citrate buffer and tissues for cardiac troponin I immunohistochemistry were treated in 10 mM EDTA buffer. Endogenous peroxidase activity was inhibited by incubation in 2% H 2 O 2 for 10 min. Sections were incubated for 20 min with 10% swine serum and then incubated at room temperature for 60 min with primary antibodies diluted at 1:300 in 10% phosphate buffer solution (PBS). Slides were then treated with a secondary antirabbit, anti-mouse and anti-goat Ig-biotinylated complex, rinsed and incubated with a Streptavidin–HRP complex (LSAB + System-HRP kit, Dako, Denmark). Washes were performed with PBS after each incubation step. Reactivity was revealed with 3,3  -diaminobenzidine in chromogen solution kit (Liquid DAB + ‘Substrate Chromogen System, Dako, Denmark) and stopped with rinses of distilled water. Slides were counterstained with hematoxylin, dehydrated with graded ethanol, cleared in xylene and then coverslipped. Negative controls were carried out by omitting the primary antibody. 3. Results A total of 24 infected dogs were recruited for the study. All had detectable plasma levels of cardiac troponin I, while 13 of them showed levels of cardiac troponin I above the reference ranges for healthy dogs. 10 had detectable levels of myoglobin, being considered pathological in 5 of them according to Carretón et al. (2011). Table 1 summarizes the results of the measured biomarkers. Twelve dogs had low worm burdens, while 12 had more than Table 1 Mean values of cardiac biomarkers in dogs with heartworm infection. Cardiac biomarker Results (mean ± standard deviation) Myoglobin (n = 24) <30 ng/ml (n = 14) a 54 ng/ml ± 2 ng/ml (n = 5) b 180.2 ± 205.2 ng/ml (n = 5) c Cardiac troponin I (n = 24) 0.6 ± 0.3 ng/ml (n = 11) * 1.4 ± 0.2 ng/ml (n = 13) ** a Dogs with indetectable levels of myoglobin. b Dogs with detectable non pathological levels of myoglobin. c Dogs with pathological values of myoglobin. * Dogs with normal values of cardiac troponin I. ** Dogs with elevated values of cardiac troponin I. 10 adult worms in the pulmonary artery and right ventricle. None of the hearts showed macroscopic lesions at necropsy. The main histological feature in myocardial tissue from the right ventricle was focal necrosis. Patches of hypereosinophilic, necrotic myocardium were frequently observed (Fig. 1a, c and e), even though they were not present in all tissue samples from all dogs. Occasionally, neutrophilic inflammatory infiltrates could also be observed. Where necrosis was present, there was a consistent loss of staining for myoglobin (Fig. 1b) and cardiac troponin I (Fig. 1d and f). The loss was usually non-uniform in that some fibres showed complete loss with other fibres having varying degrees of incomplete loss. Some fibres clearly within the necrotic zone stained normally. There was no apparent association between worm burden and the presence of myocardial lesions; there was not a correlation in all the studied cases between the plasma levels of cardiac biomarkers and the presence of myocardial lesions either. 4. Discussion CHWD is primarily a disease of the lungs. However, pulmonary hypertension, if not cured, inevitably leads to right-side congestive heart disease (McCall et al., 2008). The effects of pulmonary hypertension on the myocardium during HWD have not been widely studied in the dog. Wang et al. (2005) described changes in the extracellular matrix (ECM) of the right ventricle in D. immitis-infected dogs and reported that the ECM content of the heart was significantly reduced in and became fragmented and dissociated and suggested that the decreased collagen matrix may be an important factor contributes to the dilatation of the ventricle. No studies on myocardial proteins has been carried out, to the authors’ knowledge. A recent review in humans has reported that myocardial injury due to acute pulmonary embolism is characterized by myocyte lysis and inflammation. Chronic hypertension, on the other hand, features the release of components that may trigger apoptosis of cardiac myocytes and remodelling of the myocardium (Watts et al., 2010). During CHWD, both pulmonary embolism and chronic hypertension are present: intimal proliferation occurs in arteries occupied by living worms and embolic worm fragments from dead worms trigger thrombosis, both of which may completely obstruct segments of the pulmonary Artículos 89 392 E. Carretón et al. / Veterinary Parasitology 189 (2012) 390– 393 Fig. 1. (a–f) Sections of right ventricle from a dog with naturally acquired heartworm disease (HWD). (a) Note oedema and hypereosinophilia of myocytes in zone of necrosis (asterisk) (H&E, 20×); (b) immunostaining for myoglobin in the same area, showing decreased staining of necrotic myocardium (40×); (c) note hypereosinophilia of myocytes in the zone of necrosis (asterisk) (H&E, 10×); (d) immunostaining for myoglobin showing cell to cell variation in staining intensity for myoglobin (20×); (e) note hypereosinophilia of myocytes in the zone of necrosis (asterisk) (H&E, 10×); (f) immunostaining for cardiac troponin T showing loss of staining intensity (10×). arteries, thus giving rise to an increase in pulmonary pressure. The use of markers of myocardial injury is widely used in human medicine (Singh et al., 2010). Even though the presence of cardiac troponins in plasma is highly specific for injury to cardiac myocytes, myoglobin is less specific and can also indicate skeletal muscle damage. Carretón et al. (2011) reported that approximately 40% of dogs with naturally acquired HWD showed plasma levels of circulating cardiac troponin I, while approximately 23% had increased concentrations of circulating myoglobin. Here, we wanted to verify the cardiac origin of these two proteins in order to confirm their use during clinical workup in naturally infected dogs. Interestingly, loss of staining for myoglobin and cardiac troponin I was almost always associated with a necrotic lesion of the myocardium. This has also been reported by Fishbein et al. (2003) in a canine model of myocardial ischemia. In the present study, 20.8% of dogs showed pathological plasma levels of myoglobin, while 54.1% showed values of cardiac troponin I above the reference ranges for healthy dogs (Carretón et al., 2011). The loss of staining for myoglobin and cardiac troponin I in the myocardial tissue was not correlated in all the cases with the 90 E. Carretón et al. / Veterinary Parasitology 189 (2012) 390– 393 393 presence of high plasma levels of cardiac biomarkers. We did not find loss of staining of myoglobin or cardiac troponin I in 37.5% of the cardiac tissues from dogs with detectable and/or pathological values of myoglobin or elevated values of cardiac troponin I. This could be due to the fact that, because only a small fragment of myocardial tissue was processed for immunohistochemistry, the lesions that caused the increase of the biomarkers in plasma were not in the sampled tissue. Although levels of cardiac troponin I and myoglobin can rise in non-cardiac pathologies, such as renal failure or skeletal disorders (Haider and Stimson, 1999; Porciello et al., 2008; Sharkey et al., 2009), the dogs in our study did not show any evidence of any other pathology and, therefore, we attribute these alterations to the presence of D. immitis. On the other hand, we observed several cases (16.6%) of loss of staining of myoglobin and/or cardiac troponin I in which the plasma levels of the cardiac biomarkers were within normal ranges. This could be due to inappropriate blood sampling; sampling was either too early or too late to detect the serum abnormality. Myoglobin increases within 1–3 h in the setting of myocardial necrosis, usually peaks within 6–9 h, and may become normal in <24 h (Sallach et al., 2004) while the cardiac troponin I appear later at 3–6 h after symptom onset and remain increased for 7–10 days (McCord et al., 2003). There was no apparent association between worm burden and the presence of myocardial lesions. This could be limited by the fact that, because only a small fragment of myocardial tissue was processed for immunohistochemistry, the lesions could not be found in the sampled tissue. Besides, the severity of the pulmonary artery changes and the increase in pulmonary artery pressure is thought to be correlated mainly to the immune response that an individual dog has to the worms, more than the number of worms itself. One study found no relationship between worm number and pulmonary vascular resistance in a group of naturally infected dogs (Dillon et al., 1995). The amount of exercise a dog receives is also a factor. One study has shown that dogs that exercise develop more severe disease than do caged dogs (Dillon et al., 1995). Finally, the relative parasite load (number of worms/kg of body weight) might be more significant factor than the absolute parasite load in dogs of small size. The results of the present study would confirm the use of this marker in the initial clinical evaluation and in the follow-up of dogs with CHWD. Acknowledgements The authors wish to thank Paola Gianelli and Chiara Cattabiani for excellent technical assistance. This research was partially supported by Agencia Canaria de Investigación, Innovación y Sociedad de la Información, Gobierno de Canarias, Spain (co-financed by FSE funds). References Boswood, A., 2009. Biomarkers in cardiovascular disease: beyond natriuretic peptides. J. Vet. Cardiol. Suppl. 1, S23–S32. Carretón, E., Corbera, J.A., Juste, M.C., Morchón, R., Simón, F., MontoyaAlonso, J.A., 2011. Dirofilaria immitis infection in dogs: cardiopulmonary biomarker levels. Vet. Parasitol. 176, 313–316. Collinson, P.O., Stubbs, P.J., Kessler, A.C., 2003. Multicentre Evaluation of Routine Immunoassay of Troponin T Study. Multicentre evaluation of the diagnostic value of cardiac troponin T CK-MB mass, and myoglobin for assessing patients with suspected acute coronary syndromes in routine clinical practice. Heart 89, 280–286. Dillon, A.R., Brawner, W.R., Hanrahan, L., 1995. Influence of number of parasites and exercise on the severity of heartworm disease in dogs. In: Soll, M.D., Knight, D.H. 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Montoya-Alonsoa a Internal Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, University of Las Palmas de Gran Canaria, 35413, Arucas, Las Palmas, Spain b Laboratory of Parasitology, Faculty of Pharmacy and Institute of Biomedical Research of Salamanca (IBSAL), University of Salamanca, 37007, Salamanca, Spain. *corresponding author Elena Carretón Internal Medicine, Faculty of Veterinary Medicine University of Las Palmas de Gran Canaria 35413 Arucas, Las Palmas, Spain tel. +34 636024279 e-mail: [email protected] Abstract Heartworm disease (Dirofi laria immitis) is a parasitic disease of dogs and other carnivores, characterized by the presence of adult worms in the pulmonary arteries and right ventricle, leading to pulmonary hypertension which may progress to congestive heart failure. Cardiac biomarkers are biological parameters that can be objectively measured as indicators of pathological processes, or to assess the response to therapeutic interventions. To evaluate the myocardial damage during the adulticide treatment in 15 heartworm-infected dogs with ivermectin, doxycycline and melarsomine, measurements of cardiac troponin I (cTnI), myoglobin, MB isoenzyme of creatine kinase (CK-MB) and aspartate aminotransferase (AST) were carried out on days 0, 60 and afterwards weekly on days 67, 75, 82, 91, 106, 113 and 120. Dogs were divided by low parasite burden (n=9) and high parasite burden (n=6). On day 0, dogs with high worm burden showed increased cTnI concentrations (3.62±4.78 ng/ml) while dogs with low worm burden had concentrations similar to those of healthy dogs (0.78±0.22 ng/ml), CK-MB concentrations were increased only in dogs with high parasite burden as well (54.4±54.2 U/l) and 26.6% (4/15) of the dogs showed pathological concentrations of myoglobin. On day 91, most dogs showed pathological concentrations of myoglobin, CK-MB and AST, probably due to the myositis associated to the intramuscular injection of melarsomine. The rest of the measurements made in the study, the biomarkers concentrations were within normal values, except for cTnI in dogs with high parasite burden, which remained above reference concentrations for healthy dogs during all the study. The evaluation of cardiac biomarkers seems to be a helpful test in the assessment of the myocardium in dogs with heartworm disease during the adulticide treatment. 98 No correlation was found between cTnI and CK-MB concentrations during the treatment. This could be due to the different kinetics of each biomarker. Although the release and peak kinetics of cTnI and CK-MB are similar in myocardial infarction (Apple and Murakami, 2005), CK-MB and cTnI fall to the reference interval within 48–72 hours and 7 to 10 days, respectively. As in humans, in veterinary medicine the diagnostic sensitivity of CK-MB is lower when compared with cTnI, as reported by different authors (Diniz et al. 2007; Bakirel and Gunes, 2009). Furthermore, CK-MB is also expressed in intestines, spleen and lungs; therefore the cardiac specifi city of this biomarker is lower than cTnI (Aktas et al., 1993; Dolci and Panteghini, 2006). Myoglobin may come from both cardiac and skeletal muscle. Detection of elevated plasma myoglobin in dogs is not considered clinically useful due to its low specificity and rapid elimination. This is why an increase in myoglobin plasma values is not specific for cardiac damage in the dog. In veterinary medicine, there are several studies that show elevated levels of myoglobin in dogs with cardiac damage in a range of pathologies, such as gastric dilatation-volvulus, blunt chest trauma, and systemic hypotension (Spangenthal and Ellis, 1995; Burgener et al., 2006; Adamik et al., 2009). In a previous study, 23% of dogs with HWD showed pathological concentrations of myoglobin, especially the microfi laremic dogs. Similar results are found in the present study, in which 26.6% of the dogs showed pathological concentrations of myoglobin, being more frequently observed in those with microfi laremia. The previously cited immunohistochemical study by Carretón et al. (2012) showed that increased levels of myoglobin matched with loss of staining for myoglobin and areas of necrosis in myocardial tissue of dogs with HWD. The myoglobin values were within the normal range in all dogs during the rest of the treatment, except on day 91, when 73.3% of the dogs show pathological concentrations of myoglobin. This may probably be due to the myositis caused by the intramuscular injection of melarsomine administered 24 hours before. The rise of myoglobin by muscular damage caused by the melarsomine may be supported by the pathological elevations of AST observed on day 91 as well. AST is released from necrotic cardiac myocites, but is ubiquitously found in liver, skeletal muscle and other tissues, so it could be released after the myositis caused by the injection of melarsomine (Dolci and Panteghini, 2006). The rest of the treatment remains within normal values, being only slightly increased on day 0 in dogs from group 2. Other authors have reported increased levels of AST in heartworm-infected dogs (Kitoh et al., 1994; Niwetpathomwat et al., 2007; Aslan et al., 2010). Finally, we would like to remark the fact that all measured biomarkers decrease Artículos 99 on day 60, after treatment with doxycycline and ivermectin. This could be due to the elimination of Wolbachia and reduction of microfi lariae, which may reduce the vascular infl ammation and, therefore, reduce the severity of the disease. Data exist to support the potential role of Wolbachia spp in the development of the infl ammatory reaction associated with heartworm disease in dogs and cats (Kramer et al., 2005, 2008). Similar results were found in other studies in dogs with HWD, where reduction of AST levels after treatment with ivermectin were found (Aslan et al., 2010), and reduction of D-dimer concentrations after treatment with doxycycline and ivermectin (Carretón et al., in press). In conclusion, the evaluation of cardiac biomarkers appears to be a supportive test in the monitoring and evaluation of the myocardial integrity during adulticide treatment of HWD. These are preliminary results and further studies should be carried out to obtain more reliable data on the monitoring, assessment of the therapy and prognostic capacity of these molecules. Acknowledgements This research was partially supported by Agencia Canaria de Investigación, Innovación y Sociedad de la Información, Gobierno de Canarias, Spain (co-fi nanced by FSE funds). References Adamik, K.N., Burgener, I.A., Kovacevic, A., Schulze, S.P., Kohn, B., 2009. Myoglobin as a prognostic indicator for outcome in dogs with gastric dilatation-volvulus. J. Vet. Emerg. Crit. Care. 19, 247-53. Adams, J.E., Bodor, G.S., Dávila-Román, V.G., Delmez, J.A., Apple, F.S., Ladenson, J.H., Jaffe, A.S., 1993. Cardiac troponin I. A marker with high specifi city for cardiac injury. Circulation. 88, 101-106. Aktas, M., Auguste, D., Lefebvre, H.P., Toutain, P.L., Braun, J.P., 1993. Creatine kinase in the dog: a review. Vet. Res. Commun. 17, 353-369. American Heartworm Society, 2012. Guidelines for the diagnosis, prevention and management of heartworm (Dirofi laria immitis) infection in dogs (2012). 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Signifi cant differences between dogs with high and low worm burden are designates with a black triangle (▲) (p<0.001) and a black square (■) (p<0.05). High Burden Low Burden High Burden Low Burden High Burden Low Burden cTnI (ng/ml) CK-MB (U/l) AST (U/l) Day 0 3.62±4.78 0.78±0.22▲54.4±54.2 18.1±6.7▲62.3±53.7 27.0±12.7■ Day 60* 1.62±1.11 0.56±0.22▲22.0±21.7 13.9±5.0 22.8±11.5 20.5±9.4 Day 67 1.00±0.23 0.65±0.25 17.9±8.3 14.9±4.3 23.5±9.9 26.5±11.0 Day 75 1.48±0.82 0.73±0.45■19.7±7.7 19.1±6.4 25.6±13.8 28.5±8.4 Day 82 1.22±0.65 0.59±0.35■15.6±6.1 17.2±8.7 31.3±14.8 28.4±7.4 Day 91** 1.89±1.48 0.78±0.76▲84.5±57.1 61.8±40.2■293.3±395.1 191.8±179.8▲ Day 98 1.20±0.63 0.73±0.24 20.0±10.3 16.2±7.1 49.6±13.1 36.6±25.6 Day 106 1.22±0.62 0.70±0.42■16.1±5.1 14.8±4.8 35.8±22.4 31.5±18.6 Day 113 0.98±0.59 0.72±0.28 19.1±4.1 15.3±8.3 21.6±7.8 23.0±8.4 Day 120 0.95±0.35 0.58±0.28 21.9±6.7 18.7±8.5 19.8±9.0 22.4±9.4 Artículos 105 Figure captions Figure 1. Box-and-wisker plot of cardiac troponin I (cTnI) concentrations in healthy dogs, group 1 (low worm burden) and group 2 (high worm burden) on day 120 of the study (end of treatment). The boxplots represent median (solid vertical lines within boxes) and distribution of the cTnI in each group. Signifi cant differences between healthy dogs and dogs from group 2 (p<0.05) were found, but not between healthy dogs and dogs from group 1. CONCLUSIONES CONCLUSIONS V 114 I’m a doctor, I’m not a scientist or a physicist, Mr. Spock...” (Leonard McCoy, Star Trek) Resumen 115 La dirofi lariosis cardiopulmonar canina es una enfermedad parasitaria producida por Dirofi laria immitis. La respuesta fi siopatológica a la enfermedad se debe principalmente a la presencia de los parásitos adultos en las arterias pulmonares y ventrículo derecho; los parásitos vivos en contacto con la arteria producen endoarteritis pulmonar proliferativa y rigidez arterial con disminución de la luz, mientras que los parásitos muertos provocan tromboembolismo pulmonar. Estos procesos conducen al desarrollo de hipertensión pulmonar; ésta, si no se corrige, provocará insufi ciencia cardíaca congestiva derecha. Además, durante el tratamiento adulticida, es inevitable la formación de tromboembolismos pulmonares por la muerte de los parásitos. Los marcadores de daño cardiopulmonar son parámetros biológicos que pueden ser medidos de forma objetiva, como indicadores de procesos patológicos o para evaluar la respuesta a un determinado tratamiento terapéutico. En medicina humana se emplean de forma rutinaria para la detección y el pronóstico de patologías cardiorrespiratorias. En medicina veterinaria, permiten la detección temprana de enfermedades cardiovasculares, confi rmar casos dudosos o difíciles de diagnosticar, y contribuyen al establecimiento del pronóstico y a la hora de escoger un determinado tratamiento, así como evaluar la efi cacia del mismo. El objetivo de esta tesis fue evaluar serológicamente e inmunohistoquímicamente los biomarcadores de daño cardiopulmonar troponina T cardíaca, troponina I cardíaca, mioglobina y dímero-D en el diagnóstico, evaluación y pronóstico de la dirofi lariosis cardiopulmonar canina, así como valorar su utilidad en la monitorización del paciente durante el tratamiento adulticida empleando el protocolo recomendado por la American Heartworm Society. Para ello, se hicieron mediciones iniciales de estos marcadores en suero de 75 perros con dirofi lariosis. Además, se tomaron muestras de tejido pulmonar y renal de 45 perros, y muestras de tejido miocárdico del ventrículo derecho de 24 perros infectados por Dirofi laria immitis, para realizar estudios de inmunohistoquímica. Finalmente, se evaluaron 15 perros (9 con baja carga parasitaria y 6 con elevada carga parasitaria) durante el tatamiento adulticida con ivermectina, doxiciclina y melarsomina, haciendo mediciones semanales de biomarcadores hasta la fi nalización del mismo. Como resultado, se observó que los perros infectados por D.immitis mostraron valores normales de troponina T (<0.1 ng/ml), mientras que los valores de troponina I Resumen 116 estaban ligeramente elevados en perros con dirofi lariosis (1.23±0.8 ng/ml y 1.2±0.4 ng/ml en amicrofi larémicos y fi larémicos, respectivamente) respecto a los perros sanos (0.9±0.3 ng/ml), lo que indica la posible presencia de daño miocárdico menor en perros con dirofi lariosis. Igualmente, 23% de los perros presentaban elevaciones de mioglobina (>74 ng/ml), cuyo origen podría ser esquelético o cardíaco. El 47% de los perros presentaban valores patológicos de dímero-D (>0.2 μg/ml), probablemente debido a complicaciones tromboembólicas derivadas de la muerte natural de las fi larias. En los estudios de inmunohistoquímica, se pudo observar pérdidas intracelulares focales de troponina I y mioglobina en el miocardio de perros con dirofi lariosis en áreas con signos histológicos de infl amación y/o necrosis, junto con elevaciones serológicas de estas proteínas en la mayoría de los casos, confi rmando la presencia de daño miocárdico en esta enfermedad. Por otro lado, se observaron depósitos de dímero-D en tejido pulmonar y glomérulos renales de perros con dirofi lariosis, coincidiendo con valores elevados serológicos del mismo, lo que confi rma la utilidad del dímero-D para evaluar la presencia de fenómenos tromboembólicos en esta patología. Por último, durante el tratamiento adulticida, se observó que los valores de troponina I, mioglobina y dímero-D se normalizaban en casi todos los casos tras el tratamiento previo con ivermectina y doxiciclina (día 60). Una vez iniciado el tratamiento con melarsamina, los valores de dímero-D se elevan coincidiendo con la muerte de los parásitos, especialmente los perros con elevada carga parasitaria, para normalizarse en todos los perros al fi nal del tratamiento. Los valores de troponina I permanecieron en valores normales durante todo el tratamiento en perros con baja carga parasitaria, mientras que en perros con elevada carga parasitaria permanecieron por encima de los valores de referencia para perros sanos durante todo el estudio. Los valores de mioglobina permanecieron normales a partir del día 60, excepto el día 91 (3ª dosis de melarsamina), donde presentaba elevaciones patológicas en la mayoría de los perros, probablemente debido a la miositis provocada por la inyección intramuscular de melarsomina el día anterior. En conclusión, los biomarcadores de daño cardiopulmonar troponina I cardíaca, mioglobina y dímero-D, son herramientas complementarias, no invasivas, rápidas y fáciles de determinar, útiles a la hora de evaluar el estado clínico del perro con dirofi lariosis, establecer un pronóstico y monitorizar el tratamiento adulticida en perros infectados por Dirofi laria immitis. Palabras clave: Dirofi laria immitis, dirofi lariosis canina, biomarcadores cardiopulmonares, troponinas cardíacas, mioglobina, dímero-D Summary 117 Canine cardiopulmonary dirofi lariasis is a parasitic disease caused by D.immitis. The pathophysiological response is mainly due to the presence of adult worms in the pulmonary arteries and right ventricle. The contact between the live worms and the intima of the pulmonary arteries leads to proliferative endoarteritis and thickening of the walls of these vessels causing obliterative endarteritis of small peripheral branches, while the arteries become stiffer; moreover, dead parasites cause pulmonary thromboembolism. These processes lead to pulmonary hypertension, that if not treated progresses to congestive right heart failure. Furthermore, during the adulticide treatment, pulmonary thromboembolism is an inevitable consequence of successful adulticide therapy. Cardiopulmonary biomarkers are biological parameters that can be objectively measured and quantifi ed as indicators of pathogenic processes or as indicators of response to therapeutic intervention. The use of these biomarkers is a regular practice in human medicine for detection and prognosis of cardiovascular diseases. In veterinary medicine, they allow early detection of cardiopulmonary diseases, confi rm doubtful cases and processes, and contribute to the establishment of prognosis and the decision on a specifi c treatment, as well as evaluate its effectiveness. The aim of this thesis was to determine the serum levels and immunohistochemical evaluation of the cardiopulmonary biomarkers cardiac troponin T, cardiac troponin I, myoglobin and D-dimer in the diagnosis, evaluation and prognosis of canine cardiopulmonary dirofi lariasis, as well as assess its utility in the monitoring and evaluation of the dog during the adulticide treatment of D. immitis following the protocol recommended by the American Heartworm Society. For this purpose, initial measurements of circulating biomarkers were performed in serum of heartworm-infected dogs. Moreover, samples of pulmonary and renal tissues of 45 dogs were taken, as well as samples of myocardial tissue from the right ventricle of 24 dogs, infected by D.immitis, to perform immunohistochemical studies. Finally, 15 dogs were evaluated (9 dogs with low parasite burden and 6 with high burden) during the adulticide treatment with ivermectin, doxycycline and melarsomine, carring out weekly measurements of biomarkers until completion of the treatment. As result, heartworm-infected dogs showed normal levels of cardiac troponin T (<0.1 ng/ml), while levels of cardiac troponin I were slightly higher in heartworminfected dogs (1.23±0.8 ng/ml and 1.2±0.4 ng/ml in amicrofi laremic and microfi laremic Summary 118 dogs, respectively) when compared to healthy dogs (0.9±0.3 ng/ml), which may indicate the presence of minor myocardial damage in dogs positive for heartworm antigen. Likewise, elevated circulating myoglobin (>74 ng/ml) was found in 23% of dogs, which may come from both cardiac and skeletal muscle. Elevated D-dimer levels (>0.2 μg/ml) were detected in 47% of heartworm-infected dogs, probably due to the thromboembolic complications caused by the D. immitis infection and natural death of the worms. The immunohistochemical studies showed intracellular loss of staining for myoglobin and cardiac troponin I in the myocardium of dogs infected by D.immitis, together with areas of focal necrosis and/or infl ammatory infi ltrates, and serum biomarkers above the reference ranges for healthy dogs in most cases, which confi rmed myocardial damage in dogs affected by heartworm disease. On the other hand, deposits of D-dimer in pulmonary and renal tissue of heartworm-infected dogs were observed, concurring with elevated serum levels of this marker, which confi rms the utility of D-dimer to evaluate the presence of thromboembolic events in this disease. Finally, during the adulticide treatment, levels of cardiac troponin I, myoglobin and D-dimer decreased, being within normal ranges in almost all dogs after treatment with ivermectine and doxycycline (day 60). Once the treatment with melarsomine started, the levels of D-dimer raised concurring with the death of the adult worms, especially in those dogs with high parasite burden, normalizing afterwards at the end of the treatment. Levels of cardiac troponin I remained within normal ranges during the treatment in dogs with low parasite burden, while dogs with high parasite burden presented levels of troponin I above the reference ranges for healthy dogs during all the study. Myoglobin levels remained within normal ranges from day 60 until the end of the treatment, except on day 91 (3rd dose of melarsomine), when most of the dogs showed pathological elevations, probably due to the myositis caused by the intramuscular injection of melarsomine the day before. In conclusion, the cardiopulmonary biomarkers cardiac troponin I, myoglobin and D-dimer constitute as a supportive tool, non-invasive, useful and quick screening tests, for the assessment of the clinical status, to establish a prognosis and monitoring of dogs with heartworm disease during the adulticide treatment. Key words: Dirofi laria immitis, canine dirofi lariasis, cardiopulmonary biomarkers, cardiac troponins, myoglobin, D-dimer BIBLIOGRAFÍA VII 120 “Contrary to what Asimov says, the most exciting phrase in science, the one that heralds new discoveries, is not ‘Eureka!’ or ‘That’s funny...,’ it’s ‘Your research grant has been approved.” (John Alejandro King) Bibliografía 121 Abbas, N.A., John, R.I., Webb, M.C., Kempson, M.E., Potter, A.N., Price, C.P., Vickery, S., Lamb, E.J., 2005. Cardiac troponins and renal function in nondialysis patients with chronic kidney disease. Clin. Chem. 51, 2059-2066. Abcarian, P.W., Sweet, J.D., Watabe, J.T., Yoon, H.C., 2004. 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