Evaluación de potenciales compuestos antileucémicos naturales y semisintéticos

UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA Y DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR, FISIOLOGÍA, GENÉTICA E INMUNOLOGÍA Programa de Doctorado: Obtención, Preparación y Evaluación Biológica de Fármacos de Origen Marino y Terrestre (Programa Interdepartamental) Título EVALUACIÓN DE POTENCIALES COMPUESTOS ANTILEUCÉMICOS NATURALES Y SEMISINTÉTICOS La Doctoranda El Director El Director Olga Burmistrova Dr. Francisco Estévez Rosas Dr. José Quintana Aguiar Las Palmas de Gran Canaria, a 4 de abril de 2013 Departamento de Bioquímica, Biología Molecular, Fisiología, Genética e Inmunología Francisco Estévez Rosas, Catedrático y José Quintana Aguiar, Profesor Titular, ambos del Departamento de Bioquímica, Biología Molecular, Fisiología Genética e Inmunología, como directores del trabajo presentado en esta memoria: CERTIFICAN: Que la memoria titulada “Evaluación de potenciales compuestos antileucémicos naturales y semisintéticos” ha sido realizada por la Licenciada en Química Olga Burmistrova, bajo nuestra dirección en las dependencias de este Departamento durante los años 2007-2013. AUTORIZAN: La defensa de la presente Memoria, dado que reúne los requisitos de calidad necesarios para constituir la Tesis Doctoral, que la citada Licenciada presenta para aspirar al grado de Doctor por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria en el Programa de los Departamentos de Química y Bioquímica y Biología Molecular, Fisiología, Genética e Inmunología titulado Obtención, Preparación y Evaluación Biológica de Fármacos de Origen Marino y Terrestre. Las Palmas de Gran Canaria, abril de 2013 Fdo. Francisco Estévez Rosas Fdo. José Quintana Aguiar AGRADECIMIENTOS En primer lugar, me gustaría dar las gracias a mis directores de tesis, Dr. Francisco Estévez Rosas y Dr. José Quintana Aguiar, por su ayuda y dedicación en el trabajo diario, por estar dispuestos siempre para aclarar mis dudas y por tolerar mi horario de trabajar un poco especial. Muchas gracias a mis compañeros del laboratorio Sara, Gledy, Fernando, Mayte, Mercedes y Elisa, por haberme acompañado durante estos años, por su ayuda, por los pequeños y grandes favores. Gracias a mis amigos de Gran Canaria, en especial a Nayra Guerra, por hacerme sentir como en casa. Nayra, gracias por el apoyo, por compartir conmigo los momentos buenos y malos, nuestras aventuras y nuestras tristezas. Y sobre todo gracias a mi familia, sin ellos no hubiera sido posible. Por apoyarme siempre, psicologicamente y materialmente, por tener tanta paciencia conmigo. Este trabajo está dedicado a ellos. Дорогие мои родители и братишка, спасибо вам за поддержку, моральную и материальную. Без вас все это было бы невозможно. Я, наконецто, пришла к финишу, спасибо за ваше терпение. Эта кандидатская целиком посвящается вам. Надеюсь, вы мной гордитесь. Quiero hacer extensivo mi agradecimiento a la Fundación Canaria Universitaria de Las Palmas por la concesión de una beca de investigación para la realización de una parte del trabajo que aquí se presenta. ÍNDICE Índice ÍNDICE ABREVIATURAS 9 1. INTRODUCCIÓN 13 1.1. Tratamiento del cáncer. 13 1.2. Flavonoides. 14 1.3. Abietanos diterpénicos. 15 1.4. Inhibición de la proliferación celular. Inducción de la parada del ciclo celular. 16 1.5. Apoptosis. 19 1.5.1. Caspasas. 21 1.5.2. Vía extrínseca. Receptores de la muerte. 23 1.5.3. Vía intrínseca o vía mitocondrial. Proteínas de la familia Bcl-2. 25 1.5.4. Estrés oxidativo y apoptosis. 29 1.5.5.Lisosomas y Retículo Endoplasmático (ER) en apoptosis. 29 1.6. Vía de señalización de las proteín-quinasas activadas por mitógenos (MAPKs). 31 2 OBJETIVOS 39 3 MATERIAL Y MÉTODOS 43 3.1. Agentes farmacológicos. 43 3.2. Productos y material. 44 3.3. Modelo experimental. 47 3.3.1. Cultivo de células leucémicas humanas HL-60 y Molt-3, y células de linfoma histiocítico humano U937. 48 3.3.2. Cultivo de células de melanoma humanas SK-MEL-1. 47 3.3.3. Cultivo de células MCF-7. 48 48 3.3.4. Cultivo de células HL-60 transfectadas con el gen humano Bcl-xL y con el vector control, y de células U937 que 3 Abreviaturas 10 MTT Bromuro de 3-[4,5-Dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio Mu-Phe-HPh-fmk Inhibidor de catepsina B/L NAC N-acetil-L-cisteína NF-κB Factor nuclear κB p21 Inhibidor de quinasa dependiente de ciclinas p38 Proteína quinasa activada por mitógenos p38 p53 Proteína supresora de tumores PARP Poli(ADPribosa)polimerasa-1 PBMC Células mononucleares humanas de sangre periférica PBS Tampón fosfato salino PD98059 Inhibidor de MEK1 PHA Fitohemaglutinina PMSF Fluoruro de metilsulfonilfenilo Raf MAP3K Ras Proteína G pequeña RING Dominio interacción proteína-proteína RIP Proteína de interacción con el receptor ROS Especies reactivas de oxígeno SB203580 Inhibidor de p38 SDS Dodecil sulfato sódico Ser Serina Smac/DIABLO Segundo activador de caspasas derivado de mitocondria SOD Superóxido dismutasa SP600125 Inhibidor de JNK TBST 20 mM Tris-HCl pH7,5, 137 mM NaCl, 0,1% Tween-20 TEMED N,N,N,N-tetrametil-etilendiamina Thr Treonina TNF Factor de necrosis tumoral TNFR1 Receptor 1 de TNF TRADD Dominio de muerte asociado a TNFR TRAF2 Factor asociado al receptor de TNF TRAIL Ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF U0126 Inhibidor de MEK1 y MEK2 XIAP Proteína inhibidora de la apoptosis z-DEVD-fmk Inhibidor de caspasa-3/-7 z-IETD-fmk Inhibidor de caspasa-8 z-LEVD-fmk Inhibidor de caspasa-4 z-LEHD-fmk Inhibidor de caspasa-9 z-VAD-fmk Inhibidor general de caspasas INTRODUCCIÓN Introducción 1.1. Tratamiento del cáncer A pesar del progreso en el diagnóstico y el tratamiento del cáncer, esta enfermedad sigue siendo la principal causa de muerte: en el año 2008 murieron 7,6 millones de personas por esta causa (13% de todos los fallecimientos). Esta enfermedad es en realidad una patología compleja ya que no existe un solo tipo de cáncer sino muchos tipos de cánceres, es decir, abarca un grupo heterogéneo de más de 200 tipos de tumores malignos. Cada tipo de cáncer posee unas características particulares, pudiendo considerarse enfermedades independientes, con una etiología, una evolución y un tratamiento específico. El cáncer se caracteriza por la multiplicación incontrolada de las propias células corporales (resistiendo a las señales exógenas de inhibición del crecimiento, proliferando sin control) y la diseminación dentro del organismo (invasión y metástasis), que es capaz de comprometer la funcionalidad del cuerpo y llegar a producir la muerte. Se produce como consecuencia de la acumulación de múltiples alteraciones o errores en el sistema que la célula usa para regular la proliferación. Así la célula adquiere la capacidad de propagarse de forma indefinida (capacidad de las células para generar sus propias señales mitógenas), en donde se encuentran o bien en zonas diferentes de su localización normal como consecuencia de una pérdida de control de su proliferación, su diferenciación o de la respuesta a las señales que determinan su eliminación controlada por apoptosis [1]. Los productos naturales han sido un recurso importante y exitoso de la investigación de nuevos fármacos antitumorales. La importancia de los compuestos naturales es evidente: desde 1940 hasta 2010 aproximadamente el 50% de las 175 13 Introducción moléculas pequeñas con actividad antitumoral son compuestos naturales o sus derivados directos [2]. 1.2. Flavonoides. Los flavonoides son un grupo de compuestos polifenólicos, metabolitos secundarios de las plantas. Estos compuestos comparten la estructura de fenilbenzoγ-pirona (C6-C3-C6) y se pueden clasificar en flavonas, flavonoles, isoflavonas, flavanonas, flavanoles y antocianidinas [3] (Figura 1). Son omnipresentes en las plantas y desempeñan muchas funciones como la pigmentación floral, la protección frente a la luz UV y ante herbívoros y la fijación de nitrógeno. Los flavonoides son bastante abundantes en la dieta humana y presentan una toxicidad relativamente baja comparada con otros compuestos activos de plantas, por ejemplo los alcaloides, un grupo de compuestos con un nitrógeno heterocíclico procedente del metabolismo de aminoácidos, que poseen acción fisiológica intensa en los animales aún a bajas dosis, incluyendo efectos psicoactivos (cocaína, morfina, nicotina etc). Isoflavona Flavona Flavonol Flavanona Flavanol Antocianidina Figura 1. Estructuras de tipos de flavonoides. 14 Introducción Los flavonoides presentan un gran espectro de propiedades biológicas en humanos, entre las que se incluyen propiedades antiinflamatorias, analgésicas, antimicrobianas, antioxidantes, antitrombóticas, protectoras gástricas y hepáticas, cardiotónicas y anticancerígenas. Numerosos estudios epidemiológicos han demostrado que existe una correlación entre el consumo de flavonoides y la disminución del riesgo de cáncer [4]. Estudios experimentales y clínicos indican que los flavonoides poseen efectos importantes en la prevención y tratamiento del cáncer, siendo capaces de interferir en las cuatro etapas de la carcinogénesis: iniciación, promoción, progresión e invasión. Basado en los estudios in vivo e in vitro muchos mecanismos pueden estar implicados en su acción: inactivación de carcinógenos, antiproliferación, inducción de la parada del ciclo celular, inhibición de la angiogénesis, actividad antioxidante y modulación de la resistencia a fármacos. Estos resultados han estimulado el desarrollo de los flavonoides en los ensayos clínicos humanos. 1.3. Abietanos diterpénicos. Los abietanos son un grupo de diterpenos, productos secundarios de algunas plantas (Figura 2), característicos del género Salvia. Los abietanos diterpénicos presentan gran variedad de actividades biológicas, como antioxidantes, antifúngicas, antibacterianas y antiulcerosas [5,6,7,8]. Numerosos estudios indican que este grupo de compuestos también posee propiedades citotóxicas en gran variedad de líneas celulares de cáncer [9,10,11]. 15 Introducción Figura 2. Estructura general de abietanos diterpénicos. La taxodona, así como su derivado oxidado taxodiona, se encuentran en Taxodium distichum, Rosmarinus officinalis y en varias especies del género Salvia. Estos compuestos aislados inicialmente de Taxodium distichum (ciprés calvo), así como sus actividades antitumorales, fueron descubiertos en 1968 [12]. Más recientemente, se estudió la actividad citotóxica de la taxodiona aislada de Salvia hypargeia en determinadas líneas celulares [13]. Aunque existen indicios de que los abietanos diterpénicos poseen propiedades citotóxicas, su mecanismo de acción y su potencial antitumoral no han sido explorados. 1.4. Inhibición de la proliferación celular. Inducción de la parada del ciclo celular. El ciclo celular de una célula eucariota consta de cuatro fases (Figura 3) [14]: - En la fase G1 la célula está creciendo y preparándose para la síntesis de ADN. - En la fase S se produce la duplicación de ADN. - En la fase G2 la célula se prepara para la mitosis. - Y finalmente, en la fase M (mitosis) las células se separan en dos células hijas. 16 Introducción Las células en fase G1 antes de empezar la preparación para la replicación del ADN pueden entrar en fase de descanso G0 (células quiescentes). Figura 3. Regulación del ciclo celular. El paso a través del punto de restricción de G1 es controlado por complejos de CDK4 y CDK6 con ciclinas del tipo D. Más adelante en G1 es controlado por complejos CDK2/ciclina E, que se requieren para el paso de G1 a S. Los complejos CDK2/ciclina A se requieren para la progresión de la fase S y los complejos CDK1/ciclina B dirigen el paso de G2 a M. La transición de una fase del ciclo celular a la otra está regulada por diferentes proteínas celulares, entre ellas las más importantes son las quinasas dependientes de ciclinas (CDK). Las CDKs son una familia de Ser/Thr proteínas quinasas activadas en determinados puntos específicos del ciclo celular. Los niveles de CDK se mantienen estables durante el ciclo celular, a diferencia de sus proteínas activadoras, las ciclinas. Los niveles de ciclinas aumentan y disminuyen durante el ciclo celular para activar periódicamente sus CDKs correspondientes. Además de la unión con las ciclinas, la actividad de CDK también está regulada por fosforilación en Thr y Tyr por el complejo CDK7-ciclina H, también denominado CAK. Estas 17 Introducción fosforilaciones inducen cambios conformacionales y aumentan la afinidad hacia las ciclinas. Las CDKs activas y unidas a ciclinas pueden ser desactivadas por inhibidores de CDK (CKI). La localización intracelular de las proteínas reguladoras del ciclo celular también contribuye a la progresión correcta del ciclo. Existen puntos de control adicionales en cada fase, llamados checkpoints. Como respuesta al daño al ADN, los puntos de control (checkpoints) detienen el ciclo para poder reparar el ADN. Los checkpoints del daño al ADN están antes de que la célula entre en la fase S (checkpoint G1/S) o después de la replicación del ADN (checkpoint G2/M) y probablemente en las fases S y M. En el checkpoint G1/S la detención del ciclo celular depende del factor de transcripción p53. Normalmente los niveles celulares de p53 son bajos, pero el daño al ADN induce la actividad de p53. Este factor de transcripción induce diferentes genes, como por ejemplo p21 y Bax. La proteína p21 es una CKI, que una vez inducida inhibe CDK y detiene el ciclo celular evitando la replicación del ADN dañado. En el cáncer el control de la división celular está alterado y esto conlleva a una proliferación incontrolada. En células de cáncer se han detectado mutaciones en genes de CDK, en enzimas activadoras de CDK, en CKI, en sustratos de CDK y en proteínas checkpoints [15]. Existen varias estrategias teraupéuticas de modulación de la actividad de CDK, como la modulación de los reguladores de la actividad de CDK (estrategia indirecta) o la inhibición de la actividad catalítica de las CDKs (estrategia directa). Las estrategias indirectas incluyen la expresión elevada de CKI, la síntesis de péptidos que imitan los efectos de los CKI, la reducción de los niveles de ciclinas, la modulación del estado de fosforilación de CDK y de sus enzimas reguladoras. Todos los inhibidores de CDK identificados hasta ahora actúan como inhibidores 18 Introducción competitivos de la unión de ATP con CDK. Se han descubierto más de 50 inhibidores específicos de CDK, entre ellos el flavonoide flavopiridol y sus derivados oxoflavopiridol y thiflavopiridol [14]. Los microtúbulos son polímeros dinámicos que desempeñan un papel crucial en muchas funciones celulares como la proliferación y la división celular, la movilidad, la fagocitosis, el transporte y la localización intracelular de orgánulos [16]. Su implicación en la mitosis los convierte en una diana muy atractiva para el desarrollo de fármacos antitumorales. Los agentes anti-microtubulares incluyen a los agentes polimerizantes (paclitaxel y docetaxel) y a los despolimerizantes (vincristina, vinorelbina y estramustina fosfato). Estos agentes inhiben la dinámica de los microtúbulos causando la rotura del huso mitótico, parando el ciclo celular en la fase M e iniciando la apoptosis. 1.5. Apoptosis Además de la parada del ciclo celular y los mecanismos de reparación, las células dañadas pueden inducir una respuesta apoptótica, o la muerte celular programada. El término apoptosis fue utilizado por la primera vez en la publicación de Kerr, Wyllie y Currie en 1972 para describir una forma de la muerte celular distinta morfológicamente [17], aunque algunos componentes del concepto de la apoptosis se describieron anteriormente. La apoptosis desempeña un papel esencial en la supervivencia de los organismos multicelulares y su desarrollo. La desregulación de este proceso puede causar enfermedades neurodegenerativas y autoinmunes y muchos tipos de cáncer. Durante la apoptosis, la célula sufre una serie de cambios morfológicos. Se observa una contracción celular: las células son de tamaño reducido, el citoplasma 19 Introducción inhiben la actividad anti-apoptótica de las proteínas IAPs (Proteínas inhibidores de apoptosis). Figura 5. La vía intrínseca de la apoptosis. Muchas señales de muerte inducen daño mitocondrial, resultando en la liberación de proteínas proapoptóticas del espacio intermembrana. Los miembros de la familia Bcl-2 regulan la integridad de la mitocondria y pueden controlar la liberación de citocromo c y desencadenar la muerte celular. 26 Introducción El segundo grupo de proteínas pro-apoptóticas liberadas de la mitocondria incluyen a la AIF (factor inductor de apoptosis), la endonucleasa G y CAD (Endonucleasa activada por caspasas, proteína responsable de la formación de la “escalera de ADN”). Sin embargo, es un evento tardío de la apoptosis y una vez liberadas estas proteínas inducen la fragmentación de ADN y la condensación de la cromatina [34]. La liberación de estas proteínas de la mitocondria está controlado por proteínas de la familia Bcl-2. La proteína que da el nombre a esta familia, Bcl-2 (B cell lymphoma-2) es un protoncogén responsable de un linfoma folicular de células B [35]. La familia Bcl-2 puede ser dividida en tres grupos basándose en su estructura y su papel en la apoptosis [36]: - proteínas anti-apoptóticas como Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, A1/Bfl-1, NR-13, Boo/Diva/Bcl-2-L-10, Bcl-B. Estas proteínas se caracterizan por la presencia de los 4 dominios de Bcl-2 (BH: BH1, BH2, BH3 y BH4) y poseen una cola hidrofóbica C-terminal que localiza a estas proteínas en la superficie exterior de la membrana mitocondrial y el resto de la proteína está orientada al citosol. - proteínas pro-apoptóticas como Bax, Bak, Bok/Mtd y Bcl-Xs, que contienen tres dominios BH1, BH2 y BH3 y la cola hidrofóbica C-terminal. - proteínas que solo contienen un dominio BH3, que incluyen Bid, Bad, Noxa, Puma, Bmf, BimL/Bod, Bik/Nbk, Blk, Hrk/DP5, Bnip3 and Bnip3 L. Estas proteínas inducen apoptosis activando las proteínas pro-apoptóticas como Bax o inhibiendo las proteínas anti-apoptóticas como Bcl-2. Las proteínas de estas tres clases son capaces de formar homo-oligodímeros y heterodímeros entre sí mismos y desempeñan distintos papeles en el control del 27 Introducción potencial de la membrana mitocondrial. Bax y Bak son esenciales para la liberación de citocromo c [37]. En las células sanas Bax está localizado en el citosol como un monómero. Durante la apoptosis Bax se transloca a la mitocondria [38], donde sufre homooligomerización. Por el contrario, Bak reside en la mitocondria constantemente y durante la apoptosis se oligomeriza [39]. Los miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2 previenen la liberación de citocromo c formando heterodímeros con Bax/Bak y desactivándolos. Existen tres modelos para explicar cómo las proteínas de la familia Bcl-2 controlan la liberación de citocromo c, aunque ninguna de ellas ha sido confirmada. Las proteínas de la familia Bcl-2 no tienen homología en secuencia de aminoácidos significativa con ninguna otra proteína, aunque la estructura tridimensional de Bcl-xL se asemeja a la estructura de los dominios formadores de poros de ciertas toxinas bacterianas que actúan como canales de iones o de proteínas. Si la función está relacionada con la estructura, la predicción sería que las proteínas de la familia Bcl-2 pueden funcionar como canales [40]. Sin embargo, no se sabe si estos canales pueden ser los suficientemente grandes para que puedan pasar las proteínas. Otra posibilidad es que las proteínas de la familia Bcl-2 recluten otras proteínas de la membrana externa mitocondrial, por ejemplo VDAC (Canal Aniónico Dependiente de Voltaje) para formar poros grandes [41]. Este modelo asume que VDAC sufre cambios conformacionales significativos al unirse con los miembros de la familia Bcl-2. Es posible que las proteínas de la familia Bcl-2 controlen la homeostasis de la mitocondria (por ejemplo gracias a su actividad como canal de iones mencionada más arriba) o indirectamente, a través de la modulación de otras proteínas mitocondriales, como por ejemplo VDAC, ya que puede formar un poro de transición permeable mitocondrial (PTP). PTP es un canal grande, su apertura 28 Introducción determina la pérdida rápida del potencial mitocondrial, el hinchamiento del orgánulo y la liberación del citocromo c [36]. 1.5.4. Estrés oxidativo y apoptosis. El tratamiento oxidativo directo así como la producción intracelular no regulada de especies reactivas de oxígeno (ROS) son igual de peligrosos para la célula. Existen varias defensas celulares que pueden ser divididas en no enzimáticas y enzimáticas [42]. Las defensas no enzimáticas incluyen agentes hidrosolubles como el glutatión (GSH), el ascorbato, el ácido úrico, las proteínas plasmáticas, y los agentes liposolubles como el α-tocoferol, el β-caroteno, la bilirrubina y el ubiquinol, que son más útiles para combatir la peroxidación de lípidos. De todos estos agentes el tripéptido GSH (γ-Glu-Cys-Gly) es el más rápido y más abundante, y regula el estado redox de muchas otras moléculas celulares. Se ha demostrado que durante la apoptosis disminuyen los niveles de GSH y se incrementan los niveles de ROS [43]. La capacidad de antioxidantes como la catalasa y la N-acetilcisteína (NAC), precursor de GSH, de bloquear la apoptosis inducida por diferentes agentes, indica el papel central del estrés oxidativo en el proceso de apoptosis [44]. La redistribución del glutatión celular puede ser otro evento crítico durante la apoptosis. Se ha demostrado que la expresión elevada de la proteína anti-apoptótica Bcl-2 induce un cambio del estado redox de la célula hacia el estado más reducido: aumentan los niveles de GSH, de superóxido dismutasa (SOD) y de catalasa [45]. 1.5.5. Lisosomas y Retículo Endoplasmático (ER) en apoptosis. El lisosoma es un orgánulo rico en hidrolasas acídicas y está involucrado en la degradación del material fagocitado y en la digestión de proteínas en general [46]. 29 Introducción Las proteasas de la familia de la catepsina son las hidrolasas lisosomales mejor caracterizadas. La mayoría de las catepsinas son cisteín-proteasas (catepsina B, C, H, F, K, L, O, S, V, W y X/Z), dos son aspartil proteasas (catepsina D y E) y una es una serín-proteasa (catepsina G). Estas enzimas son activas y estables a pH bajo, mientras que a pH normal son muy activas pero no tan estables. La rotura de los lisosomas, que provoca la liberación de las catepsinas al citosol, es dañino para la célula. El citosol contiene cistatinas, que son inhibidores endógenos de cisteín-catepsinas. El grado de permeabilidad lisosomal puede determinar la cantidad de catepsinas liberadas al citosol: la rotura completa de todos los lisosomas induce necrosis, mientras que la rotura parcial (suficiente para superar la protección de cistatinas) puede iniciar la apoptosis. Algunas catepsinas pueden inducir la activación de Bid por hidrólisis iniciando de esta manera la vía intrínseca de la apoptosis [47]. Determinados estudios han puesto de manifiesto que los lisosomas de las células tumorales son más grandes y más susceptibles a la rotura. Además, la probabilidad de una rotura lisosomal en las células tumorales es más alta debido a que la digestión de proteínas está aumentada en las células que proliferan rápidamente. Las proteínas destinadas a la secreción o a la membrana plasmática se translocan al retículo endoplasmático (ER), donde se modifican y se pliegan correctamente. La acumulación de las proteínas mal plegadas en el ER provoca estrés de ER y si éste es excesivo induce la apoptosis. IRE1 es una proteína quinasa transmembranal localizada en el ER y su función es la transmisión de las señales del estrés de ER. Una vez activada IRE1 recluta TRAF2 a la membrana del ER lo que desencadena la activación de la cascada de JNK (ver Vía de señalización de las 30 Introducción proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs) [48]. La liberación de Ca2+ del ER induce la activación de las calpaínas activadas por Ca2+, que pueden activar proteínas apoptóticas como Bid [49], Bax [50] y caspasa-7 [51]. La caspasa-4 localizada en la membrana de ER es procesada y activada cuando las células se tratan con los agentes inductores del estrés del ER [52]. 1.6. Vía de señalización de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs). Las redes de señalización permiten a las células percibir los cambios en el medio extracelular y organizar una respuesta apropiada. Las cascadas de MAPK son uno de los sistemas de señalización más estudiados y se ha demostrado su participación en la diferenciación, el movimiento, la división y la muerte celulares. Hasta ahora, se han caracterizado seis grupos de MAPKs en mamíferos: proteínas quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK1/2), proteínas quinasas de Jun NH2 terminal (JNK1/2/3), proteínas quinasas p38 (p38 α/β/γ/δ), ERK7/8, ERK3/4 y ERK5. Los grupos más estudiados son las proteínas quinasas ERK1/2, JNKs y p38 [53]. Normalmente estas cascadas están organizadas en tres pasos de fosforilación secuencial (Figura 6): MAPK, activador de MAPK (MEK, MKK o MAPKK) y activador de MEK (MEKK, MAPKKK o MAP3K). Las MAP3Ks son Ser/Thr quinasas activadas vía fosforilación y/o interacción con proteínas G pequeñas de la familia Ras/Rho como respuesta a los estímulos extracelulares. La activación de MAP3K causa la fosforilación de MAPKK. MAPKK es una proteína quinasa de especificidad dual y puede fosforilar MAPK en treonina y tirosina del motivo conservado Thr-Xaa-Tyr y de esta manera activarlas. 31 Introducción Figura 6. Las cascadas de MAPKs. La activación de ERK está mediada por cascadas de proteínas quinasas paralelas a las responsables de la activación de JNK y p38. Las cascadas de proteínas quinasas que conducen a la activación de JNK y p38 son activadas preferentemente por las citoquinas y el estrés celular y conducen, en general, a la inflamación o a la muerte celular. Una vez activadas, las MAPKs fosforilan sus sustratos en serina o treonina solo si el siguiente aminoácido es prolina. Además, para aumentar la eficiencia y la especificidad de la vía, las MAPKs requieren la presencia de unos dominios en los sustratos que son específicos para cada grupo de MAPKs. Los sustratos de las MAPKs pueden ser factores de transcripción, proteínas del citoesqueleto u otras proteínas quinasas, proteínas quinasas activadas por MAPKs o MKs. Las MKs contribuyen a la especificidad, diversidad y amplificación adicionales de las cascadas MAPK. Algunos efectos de los MAPKs no requieren su actividad quinasa y pueden 32 Introducción funcionar por interacción directa proteína-proteína, como por ejemplo la degradación de c-jun por JNK y la activación de la topoisomerasa IIα por ERK [54]. Ya que los niveles de MAPKs no cambian durante la estimulación, la desfosforilación por fosfatasas parece desempeñar un papel principal en la regulación de la actividad de MAPK [53]. Este proceso puede ser mediado por Ser/Thr fosfatasas, Tyr fosfatasas o fosfatasas con especificidad dual. Estas fosfatasas tienen un motivo de interacción con quinasas (KIM) en el lado N-terminal del dominio fosfatasa [55]. Se han propuesto varios mecanismos que participan en la determinación de la especificidad de las MAPKs para explicar su capacidad de transmitir señales diferentes e incluso opuestas: i) la duración y la fuerza de la señal, ii) la interacción con proteínas adaptadoras (JIP en la cascada JNK y KSR y MP1 para ERK), iii) la localización subcelular, iv) la presencia de varias isoformas en cada nivel de la cascada, v) la conexión con otras cascadas de MAPKs y otras rutas de señalización, y vi) otras modificaciones post-transcripcionales diferentes a la fosforilación. La proteína quinasa ERK fue la primera MAPK identificada y es la mejor estudiada. Se conocen dos isoformas ERK1 y ERK2 que son 83% idénticas y se expresan en todos los tejidos. La señalización a través de esta cascada comienza por la activación de los receptores de la superficie celular, como los receptores tirosinaquinasas (RTKs) y los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs), la transducción de la señal a través de proteínas G pequeñas (por ejemplo Ras), que transmite la señal reclutando a la membrana plasmática MAP3K (como Raf quinasas), donde se activan. Otras MAPK3Ks involucradas en la cascada de ERK son c-Mos, TPL2 y MEK1/2/3 que actúan principalmente durante la meiosis, la proliferación y la 33 Introducción respuesta al estrés, respectivamente. Las MAP3K activadas se unen con proteínas quinasas de especificidad dual MEK 1 y 2 y las fosforilan. MEK1/2 fosforila posteriormente a ERK1/2 en el motivo conservado Thr-Glu-Tyr. Se conocen más de 150 sustratos de ERK1/2 que incluyen proteínas citosólicas, membranales, nucleares y proteínas del citoesqueleto, así como MKs. La ruta ERK está desregulada en aproximadamente la tercera parte de los cánceres humanos. Muchos componentes de esta ruta están relacionados con la proliferación. ERK1/2 controla tanto la proliferación como la progresión del ciclo celular. Aunque la ruta de ERK está implicada en supervivencia celular, su activación también puede estar implicada en la apoptosis inducida por especies reactivas de oxígeno (ROS) [56]. Varios estudios han demostrado una reducción de la expresión de Bax y p53 por inhibición de ERK [57]. ERK fosforila p53 en Ser15 aumentando su efecto apoptótico [58] y también fosforila al miembro pro-apoptótico de la familia Bcl-2, Bad, impidiendo de esta manera su translocación a la mitocondria [59]. Las JNKs se identificaron inicialmente como proteínas quinasas activadas por estrés (SAPKs) en el hígado de las ratas tratadas con cicloheximida, pero después cambiaron de nombre para resaltar su papel en la fosforilación y la activación del factor de transcripción c-jun [53]. Las JNKs se activan en respuesta a citoquinas, irradiación UV, deficiencia de factores de crecimiento, agentes que dañan el ADN y en menor medida por estimulación de algunos GPCRs, por el suero y por los factores de crecimiento. Las JNKs de mamíferos están codificadas por tres genes distintos (JNK1, JNK2 y JNK3) y la maduración alternativa de estos genes genera diez productos diferentes de 46-55 kDa. Como en el caso de ERK la activación de JNK requiere la fosforilación en el motivo conservado de Thr-Pro-Tyr. Se han 34 Introducción 35 identificado gran cantidad de sustratos de JNKs, principalmente factores de transcripción y receptores hormonales nucleares. Muchas proteínas mitocondriales, como por ejemplo las proteínas de la familia Bcl-2 (Bcl-2, Bcl-xL, Bad, Bim y Bax), también son sustratos de JNK, así como las proteínas del citoesqueleto paxilina, MAP-2, -1B y Tau. Hasta el momento, no ha sido identificada ninguna MK activada por JNK. Se ha demostrado que JNK está involucrada en la degradación del inhibidor de caspasa-8 cFLIPL. Aunque el papel de JNK en apoptosis está bien establecido, esta quinasa también contribuye a la supervivencia. Estos efectos opuestos están determinados por la duración o la magnitud de la activación y en parte por la activación de otras rutas. La activación prolongada de JNK induce la apoptosis, mientras que la activación transitoria está implicada en la supervivencia celular [60]. Por lo general, los mismos estímulos que activan la ruta de JNK también activan la de p38. Existen al menos cuatro isoformas de p38: α, β, γ y δ. Entre ellas la p38α es la más estudiada. La proteína quinasa p38 activa fosforila varias dianas celulares, tanto factores de transcripción (causando cambios en la expresión de genes), como MKs. También se ha demostrado que p38 fosforila y reduce los niveles de la proteína anti-apoptótica Bcl-xL y aumenta los niveles de p53 [61], favoreciendo de esta manera la apoptosis. Material y Métodos 3.1. Agentes farmacológicos. Los estudios correspondientes al aislamiento, elucidación estructural y derivatizaciones de los productos naturales fueron llevados a cabo en el Instituto Universitario de Bio-Orgánica “Antonio González”, La Laguna, Tenerife, bajo la dirección del Dr. Jesús M. González Díaz. Kaempferol 3-O-β-(2”-acetil)- glucopiranósido (2”-acetilastragalina) fue aislado de Delphinium staphisagria. El derivado heptaacetilado de la astragalina (AHA) se obtuvo tratando 2”- acetilastragalina con anhidrido acético en piridina durante 12 h [62]. La identificación de las estructuras se realizó por espectroscopía de resonancia magnética nuclear (1H-NMR y 13C-NMR) y espectrometría de masas de alta resolución (HR-MS) y la pureza de todos los compuestos fue del 99% determinada por HPLC. Los abietanos diterpénicos ensayados son diterpenoides naturales aislados de Salvia sp. o derivados semisintéticos obtenidos de los compuestos naturales. Todos los compuestos han sido descritos anteriormente y se obtuvieron en el laboratorio de Química Orgánica de la Universidad de Lisboa bajo la dirección de la Dra M. Fátima Simões. Los abietanos diterpenoides: taxodona (1), taxodiona (2) y royleanona (3) se aislaron de Salvia phlomoides [63], 7α-etoxiroyleanona (4) and inuroyleanol (5) se aislaron de Salvia lavandulaefolia [64] y coleona U (6) se aisló de Plecranthus grandidentatus [65]. Los abietanos diterpénicos reorganizados 2-oxocandesalvona A (7) y teuvincenona A (8) se aislaron de S. palaestina [66] y Teucrium polium subsp. vincentinum [67], respectivamente. Los derivados sintéticos 11,12-di-O-acetil-14desoxicoleona U (9) y 6,11,12-tri-O-acetil-14-desoxicoleona U (10) se prepararon a partir de 14-desoxicoleona U como está descrito anteriormente [63]. 43 Material y Métodos La 7α-acetoxi-6β-hydroxiroyleanona (11) se obtuvo de P. grandidentatus [68] y los derivados sintéticos 7α-acetoxi-6β-benzoiloxi-12-O-benzoilroyleanona (12), 7α-acetoxi-6β-(4-cloro)benzoiloxi-12-O-(4-cloro)benzoilroyleanona (13), 7αacetoxi-6β-hidroxi-12-O-(4-metoxi)benzoilroyleanona (14), 7α-acetoxi-6β-hidroxi12-O-(4-cloro)benzoilroyleanona (15), 7α-acetoxi-6β-hidroxi-12-O-(4nitro)benzoilroyleanona (16), 7α-acetoxi-6β-(4-nitro)benzoiloxiroyleanona (17), 6β,7α-diacetoxi-12-O-acetilroyleanona (18), 7α-acetoxi-6β-propioniloxi-12-Opropionilroyleanona (19), 6β,7α-diacetoxiroyleanona (20), 7α-acetoxi-6βpropioniloxiroyleanona (21) y 7α-acetoxi-6β-butiriloxiroyleanona (22) se prepararon de (11) como está descrito en [69]. Los derivados sintéticos (11R*,13E)-11-acetoxihalima-5,13-dien-15-ol (23), (11R*,13E)-15-propioniloxihalima-5,13-dien-11-ol (24), (11R*,13E)-15butiriloxihalima-5,13-dien-11-ol (25), (11R*,13E)-15-benzoiloxihalima-5,13-dien11-ol (26), (11R*,13E)-15-(4-metoxi)benzoiloxihalima-5,13-dien-11-ol (27), (11R*,13E)-halima-5,13-dien-11,15-diol (28) y el ester metílico del ácido (11R*,13E)-11-acetoxihalima-5,13-dien-15-oico (29) se obtuvieron a partir del ácido (11R*,13E)-11-acetoxihalima-5,13-dien-15-oico (30), un 5-halimano diterpénico aislado de P. ornatus [70]. 3.2. Productos y material. Los medios de cultivo RPMI 1640, DMEM, el suero bovino fetal (FBS), el HEPES (N-[2-hidroxietil] piperazino N'-[2-etanosulfónico]), la L-glutamina, el azul de tripán, el bicarbonato sódico y los antibióticos (estreptomicina, gentamicina y penicilina G) fueron de Sigma Chemical Co. (San Luis, EE UU). Las botellas de 44 Material y Métodos cultivo de 75 cm2 y las placas de 48 y 96 pocillos estériles, así como el resto del material estéril utilizado fueron de Becton-Dickinson. El yoduro de propidio, la RNasa A, la proteinasa K, el paraformaldehído, la bisbenzimida (Hoechst nº 33258) y el fenol fueron suministradas por Sigma Chemical Co. El cloroformo y alcohol isoamílico se obtuvieron de BDH (Poole, Inglaterra). La agarosa se obtuvo de Bio-Rad (Madrid, España) y el bromuro de etidio de Sigma/Aldrich (España). Se utilizó un microscopio de fluorescencia LSM 5 PASCAL de ZEISS. La anexina V se obtuvo de BD PharmigenTM (Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit). Los fluorocromos H2-DCF-DA (diacetato 2´,7´-dicloro-dihidrofluoresceína) y JC-1 (yoduro de 5,5', 6,6’–tetracloro-1,1', 3,3’-tetraetilbencimidazolo-carbocianina) se obtuvieron de Molecular Probes (Invitrogen Corporation Carlsbad, CA). Los inhibidores de caspasas: z-VAD-fmk (benciloxicarbonil-Val-Ala-Asp (OMe)-fluoro metil cetona), Q-VD-OPh (ácido (3S)-5-(2,6Difluorofenoxi)-3-[[(2S)-3-metil-1-oxo-2-[(2-quinolinilcarbonil)amino]butil]amino]- 4-oxo-pentanoico), z-DEVD-fmk (benciloxicarbonil-Asp-Glu-Val-Asp-(OMe) fluorometil cetona), z-LEHD-fmk (benciloxicarbonil-Leu-Glu-His-Asp (OMe) fluorometil cetona), z-IETD-fmk (benciloxicarbonil-Ile-Glu-Thr-Asp(OMe) fluorometil cetona), z-LEVD-fmk (benciloxicarbonil-Leu-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)-fluorometil cetona), el inhibidor de catepsina B/L, Mu-Phe-HPh-fmk (N-metoxisuccinil-Phe-homoPhefluorometil cetona), los inhibidores de MAPKs (SP600125, PD98059, SB203580, U0126) y los inhibidores de PTP, ciclosporina A y ácido bongkrékico, fueron 45 Material y Métodos obtenidos de Sigma Chemical Co. Los antioxidantes Trolox, N-acetil-L-cisteína (NAC) y Tocoferol (vitamina E) fueron obtenidos de Sigma Chemical Co. Los sustratos específicos utilizados para determinar la actividad caspasa -3/-7 DEVD-pNA (N-acetil-Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilina), caspasa-8 IETD-pNA (Nacetil-Ile-Glu-Thr-Asp-p-nitroanilina) y caspasa-9 LEHD-pNA (N-acetilLeu-GluHis-Asp-p-nitroanilina) fueron obtenidos de Sigma, y la paranitroanilina (pNA) fue obtenida de Calbiochem. La acrilamida (bis N,N'-metilen-bis-acrilamida), persulfato amónico, TEMED (N,N,N,N,-tetrametil-etilendiamina), SDS (dodecil sulfato sódico) y los marcadores de pesos moleculares se obtuvieron de Bio-Rad. El azul de bromofenol, el BSA (albúmina de suero bovino) y el β-mercaptoetanol fueron de Sigma. Las membranas (PVDF) y el sustrato de revelado por quimioluminiscencia se obtuvieron de Millipore (Billerica, MA, EE UU). Las placas para autorradiografía se adquirieron de Kodak. Los productos utilizados en la obtención del lisado celular, fueron: aprotinina (inhibidor de serínproteasas que inhibe tripsina, quimiotripsina y plasmina), leupeptina (inhibidor de cisteín y serínproteasas. Inhibe plasmina, tripsina, papaína y catepsina B), pepstatina A (inhibidor potente de proteasas ácidas), PMSF (inhibe cisteín, serínproteasas y acetilcolinesterasa), ditiotreitol (DTT: agente reductor estereoselectivo para puentes disulfuro en complejos moleculares), ortovanadato sódico (inhibidor de fosfatasas alcalinas) y el detergente tritón X-100 fueron obtenidos de Sigma Chemical Co. De Stressgen se obtuvieron los anticuerpos de las caspasas -3, -7, -8, -9, citocromo c y PARP. De Cell Signaling Technology se obtuvieron los anticuerpos de 46 Material y Métodos las caspasas -3, -7, -8, -9, fosfo-p38MAPK (Thr180/Tyr182), p38MAPK, fosfo-JNK (Thr183/Tyr185), JNK/SAPK, fosfo-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) y ERK1/2. De Medical and Biological Laboratories Co se obtuvieron los anticuerpos de las caspasas4, -6, y -7. De BD Biosciences se obtuvieron los anticuerpos de las caspasa-4, -6, -8, Bid, Bax, Bcl-xL, citocromo c, Smac/DIABLO y AIF. El anticuerpo de Bcl-2 se obtuvo de Santa Cruz Biotechnology y el anticuerpo de β-actina, de Sigma/Aldrich. Los anticuerpos secundarios se obtuvieron de Amersham Biosciences. El agua desionizada y bidestilada se obtuvo con un equipo Mili-Q (Water Purification System, Millipore Ibérica, Madrid, Spain). El dimetilsulfóxido (DMSO), EDTA, EGTA, NaCl, glicerol, trizma base, trizma-HCl, azida sódica, bromuro de 3- [4,5dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio (MTT), la sacarosa, tween 20, hidróxido de sodio, ácido clorhídrico y otros compuestos utilizados en la preparación de reactivos y tampones se adquirieron de Sigma Chemical Co. o de BDH (Carlo Erba, E Merck y Fluka). 3.3. Modelo experimental. Las células se contaron en un hematocitómetro y la viabilidad siempre fue superior al 95% utilizando el método de exclusión de azul de tripán. 3.3.1. Cultivo de células leucémicas humanas HL-60 y Molt-3, y células de linfoma histiocítico humano U937. Las células HL-60, Molt-3 y U937 se obtuvieron de la colección alemana o americana de cultivos celulares (DSMZ y ATCC) y se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor y antibióticos (100 unidades/ml de penicilina y 100 μg/ml estreptomicina) en una atmósfera humidificada (37 ºC y 5% CO2) y a una densidad no superior a 0,5 x 106 47 Material y Métodos células/ml [71,72]. A las células se les cambió el medio de cultivo tres veces por semana y se dividieron aproximadamente cada 24 horas. 3.3.2. Cultivo de células de melanoma humanas SK-MEL-1. Las células de melanoma humano SK-MEL-1 se obtuvieron de la colección alemana de cultivos celulares (DMSZ), se cultivaron en medio RPMI 1640 en las mismas condiciones que las anteriores. Aunque las células crecen lentamente producen sin embargo una rápida acidificación del medio por lo que el medio de cultivo se cambió tres veces por semana [71,72]. 3.3.3. Cultivo de células MCF-7. Las células de cáncer de mama humano MCF-7 se obtuvieron de la ATCC y se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor, 2 mM L-glutamina y antibióticos (100 unidades/ml de penicilina y 100 μg/ml estreptomicina) 3.3.4. Cultivo de células HL-60 transfectadas con el gen humano Bcl-xL y con el vector control, y de células U937 que expresan niveles elevados del gen humano Bcl-2. Las células HL-60 fueron transfectadas con el plásmido pSFFV-neo (HL60/neo) o con el plásmido pSFFV-Bcl-xL (HL-60/Bcl-xL) que fueron establecidos por el Dr. Kapil N Bhalla (Medical College of Georgia Cancer Center, GA, EEUU) y fueron obtenidas por donación de la Dra. Angelika Vollmar (Departamento de Farmacia, Universidad de Munich, Alemania). Las células HL-60/Bcl-xL y HL60/neo fueron cultivadas igual que en el caso de las células HL-60, añadiendo 0,1 mM de aminoácidos no esenciales y 1 mM de piruvato de sodio (Invitrogen) al medio de cultivo. Además añadimos gentamicina (1 mg/ml) al medio de cultivo cada 48 Material y Métodos quinto pase, y las células con gentamicina no fueron empleadas para los experimentos. Las células U937/Bcl-2 fueron proporcionadas por la Dra. Jacqueline Bréard (INSERM U749, Faculté de Pharmacie Paris-Sud, Châtenay-Malabry, Francia). Las células se cultivaron en RPMI 1640 con glutamax y 25 mM de HEPES, 1% MEM piruvato de sodio, complementado con un 10% de suero bovino fetal inactivado por calor, 100 unidades /ml de penicilina y 100 μg/ml estreptomicina, en una atmósfera humidificada a 37 ºC y 5% CO2. A las células se les cambió el medio de cultivo tres veces por semana y se duplicaron cada 24 horas [71,72]. 3.3.5. Células mononucleares de sangre periférica de origen humano. Las células mononucleares de sangre periférica de origen humano (PBMC) fueron aisladas de sangre obtenida de voluntarios sanos, recogidas en tubos heparinizados para evitar la coagulación y se aislaron mediante centrifugación con Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences). Una parte de las PBMCs obtenidas se estimularon con fitohemaglutinina (PHA, 2 μg / ml) durante 48 h antes del tratamiento experimental. 3.3.6. Tratamiento con los compuestos. Los productos se prepararon a una concentración de 10-100 mM en dimetilsulfóxido (DMSO) y las alícuotas se mantuvieron a –20ºC. Las diluciones necesarias se hicieron en medio de cultivo justo antes del experimento y el porcentaje de DMSO no excedió del 0,3%, concentración no tóxica para las células. La misma proporción de DMSO fue añadida a las células control. 49 Material y Métodos 3.4. Métodos: 3.4.1. Evaluación de la citotoxicidad in vitro y estudios de la proliferación celular: MTT. Se realizó, mediante el ensayo de la reducción metabólica del bromuro de 3- [4,5dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio (MTT) por la actividad deshidrogenasa mitocondrial [73]. Las células se cultivaron en placas de 96 pocitos, por triplicado, a una densidad de 1x104 células/pocito en 0,2 ml de medio de cultivo y en presencia de diferentes concentraciones de los flavonoides y/o diterpenoides durante 72 h. Las placas se centrifugaron (500 g, 10 min) a temperatura ambiente y el medio se eliminó por aspiración. A cada pocito se le añadió 100 μl de MTT (0,5 mg/ml en medio de cultivo con antibiótico pero sin suero) y las placas se incubaron durante 4 h a 37oC. La reacción se paró añadiendo 100 μl de SDS (20%) con HCl 0,02 N e incubando la mezcla hasta la mañana siguiente. La cuantificación de la conversión del MTT (amarillo) en su forma reducida (púrpura) por la deshidrogenasa mitocondrial se determinó a 570 nm en un lector de microplacas (modelo 680 Bio-Rad) utilizando como blancos pocitos sin células a los que se les añadió medio. Los datos se analizaron con el programa informático Prism 2.0 (GraphPad) y se determinó la concentración de producto que inhibe el crecimiento celular a la mitad (IC50) [74]. 3.4.2. Tinción con el fluorocromo bisbenzimida. Método cuantitativo, basado en la capacidad del fluorocromo para unirse al ADN, permitiendo visualizar la existencia de cambios morfológicos del núcleo como son la condensación de la cromatina y su compactación a lo largo de la periferia del núcleo y la segmentación del núcleo. Una vez finalizados los tratamientos, las células 50 Material y Métodos (~5x105) se lavaron con PBS (10 mM fosfato sódico, 150 mM NaCl, pH 7,4) y se fijaron con 70 μl de paraformaldehído (3% en PBS) durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación se centrifugaron (12.000 g, 1 minuto), se eliminó el paraformaldehído y las células se tiñeron con 20 μl de una disolución que contenía 20 μg/mL de bisbenzimida (Hoechst 33258) en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad. Una alícuota (10 μl) se fijó en un porta y se analizó la morfología nuclear de 500 células con un microscopio de fluorescencia (Zeiss-Axiovert). Se consideraron células apoptóticas aquellas cuyos núcleos presentaron condensación de la cromatina, su compactación a lo largo de la periferia y/o la fragmentación nuclear en tres o más cuerpos apoptóticos [71]. 3.4.3. Fragmentación del ADN. Método cualitativo, basado en la detección de la fragmentación internucleosómica del ADN y visualización como una escalera discontinua de bandas multiméricas de 185-200 pares de bases, características del proceso apoptótico. Las células (5 x 105 células/ml) después de ser tratadas se recolectaron por centrifugación (12.000 g, 1 minuto) y se lavaron dos veces con PBS frío. Las células se resuspendieron con 30 μl de tampón de lisis [50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 0,5% SDS] y se incubaron sucesivamente con 1 μg/μl de RNasa A (1 hora a 37 ºC) y con 1 μg/ μl de Proteinasa K (1 h a 50 ºC). Se añadió a cada muestra 2 μl de azul bromofenol (0,25%) y el ADN se extrajo con 100 μl de una mezcla fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (24:24:1). Las muestras se centrifugaron (12.000 g, 1 min.) a temperatura ambiente y la fase acuosa (azul) se lavó nuevamente con 100 μl de cloroformo. A las muestras se les añadió 5 μl de tampón de carga (10 mM EDTA, pH 8,0, conteniendo 1% (p/v) de agarosa de bajo punto de fusión y 40% de 51 Material y Métodos 58 3.4.10. Análisis de la despolarización de la membrana mitocondrial (ΔΨm). Las células HL-60 (1 x 106 células) se incubaron a 37 ºC en la oscuridad, con la sonda JC-1 (10 μg/ml) durante los últimos 30 minutos antes de finalizar el ensayo y se analizaron mediante citometría de flujo utilizando el canal FL1 (527 nm) para detectar la fluorescencia verde de los monómeros de la sonda y el canal FL2 (590 nm) para la fluorescencia roja de los agregados. La cuantificación de la despolarización mitocondrial (ΔΨm) se obtuvo a partir de la representación gráfica de los datos recogidos por el detector FL1 frente a los recogidos por el detector FL2. La división de las gráficas en cuadrantes permite estimar el porcentaje de células con potencial de membrana intacto (cuadrantes superiores) de aquellas que sufren despolarización mitocondrial (cuadrantes inferiores). El ionóforo de protones m-clorofenil hidrazona de carbonil cianuro (CCCP) se utilizó como control positivo de la disipación del potencial de membrana. La despolarización de la membrana mitocondrial inducida por CCCP (10 μM) se ve reflejada por un incremento del número de células que emiten mayor fluorescencia verde y menos roja respecto a las células control y que se sitúan en el cuadrante inferior derecho. Para el análisis se usó un citómetro Coulter Epics XL-MCL (Beckman Coulter). 3.5. Métodos estadísticos. En todos los casos las determinaciones para cada grupo experimental se realizaron por triplicado o cuadruplicado, y los valores representados se corresponden a datos de tres experimentos como mínimo (Media ± S.E.M). La comparación entre los distintos tratamientos se realizó por el método de la t de Student o análisis de la varianza, considerando significativos los valores de P < 0,05. CAPÍTULO I Evaluación de la actividad antiproliferativa del heptaacetato de astragalina (AHA) Capítulo I RESULTADOS 4.1. Los derivados semisintéticos de la quercetina y kaempferol inhiben el crecimiento y la viabilidad de la línea celular de leucemia humana HL-60. En esta Tesis hemos evaluado la potencial actividad antitumoral de nueve derivados semisintéticos de glicósidos de la quercetina y el kaempferol (Tabla 1). Los datos de los estudios antiproliferativos (Tabla 2) indican que el derivado semisintético compuesto 6 (heptaacetato de astragalina, AHA) presenta el valor más bajo de IC50 (Figura 7 A, B). Por el contrario, 2”-acetilastragalina (Compuesto 1, NA-AHA) que se encuentra en naturaleza no es efectiva como un agente antiproliferativo, ya que presenta un valor de IC50 superior a 100 μM en las células de leucemia (Tabla 2 y Figura 7 B). Como experimento control usamos células mononucleares de sangre periférica (PBMC) quiescentes y PBMC cultivados en presencia de un agente inductor de la proliferación (PHA, fitohemaglutinina, 2 μg/ml ). Los resultados indican que AHA no es citotóxico hasta una concentración de 30 μM durante 24 h en los linfocitos quiescentes y hasta 10 μM en los linfocitos proliferantes (Figura 7 C). 61 Capítulo I Compuesto R1 R 2 R 3 R 4 R 5 1 Glc 2”-Ac H H H H 2 Glc-Ac Ac Glc-Ac H Ac 3 Glc-Ac Ac Glc-Ac OAc Ac 4 Glc-Ac Ac Rha-Ac OAc Ac 5 Glc-Ac Ac H H Ac 6 Glc-Ac Ac Ac H Ac 7 Glc-Ac Ac Ac OAc Ac 8 Glc H RhaAc H H 9 Glc 2”Ac H Rha OH H Tabla 1. Estructura de los flavonoides evaluados. Glc = Glucosa, Rha = Ramnosa, Ac = Acetato. Compuesto IC50 (μM) Compuesto IC50 (μM) 1 >100 6 8,9±2,4 2 >100 7 10,3±2,7 3 >100 8 39,3 ±12,6 4 20,8±7,0 9 >100 5 23,3±1,5 Tabla 2. Efectos de los derivados de la fenilbenzo-γ-pirona sobre el crecimiento de células HL-60. Las células se cultivaron durante 72 horas y el valor de la IC50 (μM) se determinó mediante el ensayo colorimétrico MTT como se describe en la sección de Material y Métodos. Los datos representan la media ± S.E.M. de 3-5 experimentos independientes con tres determinaciones cada uno. 62 Capítulo I AHA (μM) 0 25 50 75 100 03 10 0 10 Viabilidad celular (%) 30 AHA NA-AHA Viabilidad celular (%) AHA (μM) 3100 0 50 100 25 75 PBMC/PHA PBMC * 30 AB C Figura 7. (A) Estructura química de AHA. (B) Efecto de AHA sobre la viabilidad celular de HL-60 determinado por el método de MTT. Se muestran los valores de un experimento representativo en el que cada punto representa la media de tres determinaciones. (C) Efecto de AHA sobre la proliferación de células mononucleares humanas de sangre periférica. Se cultivaron células quiscentes PBMC y células PBMC activadas con fitohemaglutinina (PHA) en presencia de las concentraciones indicadas de AHA durante 24 h. Los valores representan la media ± SE de tres determinaciones. *P < 0,05 significativamente diferente del control. 63 Capítulo I 4.2. AHA induce apoptosis en células de leucemia mieloide humana. Para evaluar si la apoptosis está implicada en el efecto citotóxico de AHA en las células de leucemia mieloide humana HL-60, utilizamos una serie de métodos complementarios. Hemos estudiado si AHA induce cambios morfológicos característicos de la muerte celular apoptótica mediante microscopía de fluorescencia utilizando el fluorocromo trihidrocloruro de bisbencimida. Las células expuestas a AHA presentan condensación y fragmentación de la cromatina detectables ya después de 6 h de tratamiento (Figura 8 A). El análisis de ADN por electroforesis en gel de agarosa, muestra un patrón de fragmentación típico (hidrólisis de cromatina internucleosómica) en las células tratadas con AHA, confirmando el efecto sobre la inducción de la apoptosis (Figura 8 B). Además, AHA induce la externalización de fosfatidilserina desde la cara interna de la membrana plasmática determinada por citometría de flujo después de la tinción con Anexina V-FITC (Figura 8 C). Para estudiar el efecto de AHA sobre el ciclo celular las células se incubaron con AHA y se analizaron por citometría de flujo después de la tinción con yoduro de propidio (Figura 8 D). El tratamiento causó una detención de ~ 56% de células en fase G0 – G1 (comparado con ~ 46% en las células controles) que fue acompañada con una disminución de la cantidad de células en las fases S y G2 – M. El porcentaje de las células controles en fase S y G2 – M fue de ~23% y 31%, respectivamente, y disminuyó después del tratamiento con AHA durante 24 h en ~18% y 24%, respectivamente. La cuantificación de las células hipodiploides (Figura 8 E) muestra que el porcentaje de las células apoptóticas aumentó 15%, 31% y 39% en respuesta al tratamiento de AHA después de 6, 12 y 24 h, respectivamente. 64 Capítulo I A 0h 6h 12h 24h 0h0h 6h6h 12h12h 24h24h B Contenido de ADN 12h Número de células Control 10 1 10 2 10 3 AHA Figura 8. Efecto de AHA sobre la inducción de la apoptosis en células HL-60. (A) Microfotografías de campos representativos de células teñidas con bisbenzimida para evaluar la condensación de la cromatina nuclear después del tratamiento con 30 μM AHA. (B) Evaluación de la fragmentación del ADN. Las células se trataron con 30 μM AHA durante 24 h. Eto = etopósido 3μM. (C) Análisis por citometría de flujo de células HL-60 teñidas con anexina V y yoduro de propidio después del tratamiento con 30 μM de AHA durante 24 h. (D) Las células fueron tratadas con 30 μM de AHA durante 24 h, teñidas con yoduro de propidio y analizadas por citometría de flujo. La apoptosis fue cuantificada (E) como porcentaje de las células en la región sub-G1. Los valores representan medias ± SE de tres experimentos independientes cada uno hecho por triplicado. *P<0,05 significativamente diferente del control. Control AHA Ioduro de propidio → C Control A nexina V → AHA D * 0 6 12 24 0 10 20 30 40 50 E Eto Células hipodiploides (%) * * Tiempo (h) 65 Capítulo I 4.3. AHA induce la muerte celular mediada por la activación de caspasas. Para determinar si las caspasas están implicadas en la respuesta de las células HL-60 a AHA, las células se trataron con diferentes concentraciones del flavonoide y se analizaron mediante transferencia Western (Figura 9 A). Los resultados indican que AHA estimula la hidrólisis de las pro-caspasas-3, -6, -7 y -9, pero no se detectó el procesamiento proteolítico de la pro-caspasa-8. De acuerdo con este resultado se detectó, también, la hidrólisis del sustrato de caspasa-3, PARP [poli(ADPribosa)polimerasa], proteína implicada en la reparación de ADN y que da lugar a un fragmento de 85 kDa. También evaluamos si AHA induce el procesamiento y la activación de la caspasa-4, que está involucrada en el estrés del retículo endoplasmático, y detectamos una reducción significativa de la pro-caspasa-4 después de 24 h de tratamiento. Ya que el procesamiento de caspasas no siempre está relacionado con su activación, evaluamos la actividad enzimática utilizando DEVD-pNA y LEHD-pNA, sustratos específicos de las caspasas-3/-7 y -9, respectivamente. Como se muestra (Figura 9 B), la caspasa -3/-7 se activa significativamente en los extractos de células tratadas con AHA, mientras caspasa-9 presenta menor activación, lo que es consistente con su papel como caspasa iniciadora. Para confirmar que las caspasas están involucradas en la apoptosis inducida por AHA, se examinaron los efectos de dos inhibidores generales de caspasas. El inhibidor z-VAD-fmk redujo significativamente el número de células hipodiploides (Figura 9 C) y el inhibidor Q-VD-OPh bloqueó la fragmentación de ADN (Figura 9 D), lo que indica que la muerte celular es dependiente de caspasas. Para indentificar qué caspasas son importantes, se estudiaron los efectos de inhibidores de caspasas 66 Capítulo I específicos z-LEHD-fmk (inhibidor de caspasa-9), z-DEVD-fmk (inhibidor de caspasa-3/-7) y z-LEVD-fmk (inhibidor de caspasa-4). El pretratamiento de las células con z-LEVD-fmk redujo significativamente el porcentaje de células hipodiploides, mientras z-LEHD-fmk y z-DEVD-fmk no tuvieron efecto (Figura 9 E). Ya que z-VAD-fmk no bloqueó completamente la muerte celular inducida por AHA, es posible que exista un mecanismo alternativo. En este sentido, existen evidencias de que las catepsinas lisosomales pueden estar implicadas en las etapas tempranas de la muerte celular programada dependiente e independiente de caspasas. Hemos demostrado (Figura 9 E) que el inhibidor de catepsina B/L, Mu-Phe-HPhfmk, redujo el porcentaje de células hipodiploides, lo que indica que esta cisteínproteasa puede estar involucrada en la muerte celular inducida por AHA. 34 kDa β-actina Pro-caspasa 6 01030 AHA (μM) PARP 116 kDa 85 kDa 36 kDa 18-20 kDa Pro-caspasa 3 35 kDa Pro-caspasa 7 17 kDa Fragmento Fragmento Fragmento Pro-caspasa 9 47 kDa Pro-caspasa 8 55 kDa 42 kDa 43 kDa Pro-caspasa 4 A 67 Capítulo I 0 10 20 30 40 50 Células hipodiploides (%) * 60 Control AHA AHA + NAC # Control AHA 64 48 32 16 0 Número de células 10 3 10 2 10 1 10 0 DCF-fluorescencia 0 1 2 3 4 5 Células viables (x10 5 ) 6 Control AHA AHA + NAC * # # Preincubado con AHA después NAC NAC AHA incubado con NAC antes de addicion a las células AB C Figura 12. Importancia de la generación de ROS en la muerte celular inducida por AHA. (A) Las células se incubaron con AHA y se determinó la fuorescencia de H2DCF oxidado por citometría de flujo. (B) Inhibición de la apoptosis por NAC en las células tratadas con AHA. Las células se incubaron con NAC durante 1 h, después con AHA durante 24 h y se analizaron por citometría de flujo. *P<0,05 significativamente diferente del control. (C) Efecto de NAC (10 mM) sobre la muerte celular inducida por AHA. NAC se añadió 2 h antes (AHA+NAC), 2 h después de AHA (30 μM) y simultáneamente con AHA después de la incubación previa de ambos durante 2 h. La viabilidad se determinó por el método de exclusión del azul de tripán utilizando el contador TC10 de Bio-Rad.*P<0,05 significativamente diferente del control. #P<0,05 significativamente diferente del tratamiento AHA+NAC. Los resultados similares se obtuvieron usando el método de MTT. 74 Capítulo I DISCUSIÓN Aproximadamente el 63% de los fármacos anticancerígenos introducidos en los últimos 25 años son productos naturales o sus derivados [2]. Los flavonoides son compuestos polifenólicos que presentan un amplio espectro de actividades biológicas incluyendo aquellas que podrían ser capaces de influir en procesos que desencadenan el desarrollo del cáncer. Por tanto, pueden tener efectos beneficiosos para la salud y considerarse posibles protectores o agentes terapéuticos contra el cáncer. Las propiedades antitumorales de estos compuestos están mediadas por diferentes tipos de parada del ciclo celular y la inducción de apoptosis, una forma activa de muerte celular que desempeña un papel esencial en el desarrollo y la supervivencia y es una respuesta importante a la mayoría de los agentes quimioterápicos [3]. En este estudio se evaluó la sensibilidad de las células HL-60 a nueve compuestos semisintéticos derivados de la fenilbenzo-γ-pirona. Las células HL-60 cosntituyen un modelo útil para estudiar la inhibición del crecimiento de células leucémicas desencadenada por agentes químicos, físicos y fisiológicos. Los estudios anti-proliferativos indican que AHA posee propiedades citotóxicas en células HL-60, mientras las PBMC quiescentes y proliferantes son resistentes. El compuesto induce la apoptosis pero este efecto fue bloqueado por los inhibidores z-VAD-fmk y Q-VDOPh, lo que indica que el mecanismo de la muerte celular es dependiente de caspasas. El estrés del retículo endoplasmático está implicado, ya que AHA induce el procesamiento de caspasa-4 y la apoptosis se bloqueó parcialmente con el inhibidor específico de caspasa-4. Los estudios cinéticos indican que las actividades de las caspasas-3 y -9 aumentaron en respuesta al tratamiento con AHA. Sin embargo, el hecho de que z75 Capítulo I DEVD-fmk no tuviese ningún efecto indica que la muerte celular puede ocurrir en ausencia de la actividad de caspasa-3. Una posibilidad es que otras caspasas ejecutoras, como caspasa-7 o caspasa-6, contribuyan a la apoptosis inducida por AHA. Esta posibilidad está apoyada con el hecho de que z-DEVD-fmk es un inhibidor más potente de caspasa-3 que de caspasa-7 [78]. El hecho de que z-VADfmk no bloqueara completamente la muerte celular inducida por AHA supone la existencia de otras rutas adicionales. Varios estímulos pueden inducir la ruta lisosomal, la cual está caracterizada por la rotura parcial de la membrana lisosomal y la liberación de catepsinas al citosol [79]. Por tanto, es posible que las cisteínproteasas catepsinas B/L pudiesen estar involucradas en el mecanismo de la muerte celular inducida por AHA. Este flavonoide induce la liberación temprana de citocromo c, el procesamiento de Bcl-2, la disminución del nivel de Bcl-xL y el aumento de la cantidad de Bax. Se ha demostrado que la hidrólisis de Bcl-2 por caspasa-3 con la formación de un fragmento de 22 kDa provoca la liberación de citocromo c de la mitocondria [80]. Además, la expresión de niveles elevados de Bcl-xL disminuye el efecto citotóxico de AHA, lo que indica que la mitocondria juega un papel importante en la muerte celular inducida por AHA. AHA induce la activación de JNK/SAPK y la fosforilación bifásica de ERK1/2. La inhibición de estas rutas de señalización potenció la muerte celular apoptótica inducida por AHA, lo que sugiere que estas MAPKs pueden estar implicadas como señales de supervivencia. Aunque el mecanismo por el que AHA induce la fosforilación bifásica de ERK1/2 es desconocido, una posible explicación podría ser la implicación de algunas treonina/tirosina fosfatasas de MAPK (MKPs) 76 Capítulo I con especificidad dual, cuya transcripción se activa por ERK1/2 [81]. Otra posibilidad es que la generación de ROS activada por AHA pueda inhibir las MKPs [82] y de esta manera explicar el segundo pico de la activación de ERK1/2. El aumento de apoptosis en HL-60 cuando se bloquea la ruta de ERK1/2 parece que contradice al hecho de que la muerte celular inducida en PBMC por AHA aumenta en PBMC activadas con PHA. Una posibilidad es que AHA pueda disminuir los niveles intracelulares de glutatión, que, como ha sido demostrado [83], puede disminuir la actividad proliferativa de los linfocitos. Ya que AHA induce la generación de ROS, la respuesta predominante podría ser la disminución del nivel intracelular de glutatión reducido. Además, las ROS podrían reducir los niveles de NADPH (dinucleótido de nicotinamida y adenina reducido) y de esta manera interferir indirectamente en la función de la glutatión reductasa [44]. Además las ROS están implicadas en el efecto antiproliferativo de AHA ya que la preincubación con el antioxidante NAC (N-acetil-L-cisteína) bloquea la generación de ROS y la apoptosis inducida por este flavonoide en las células HL-60. En resumen, nuestros resultados muestran que la muerte celular inducida por AHA en células HL-60 implica a las caspasas y a las catepsinas B/L, está asociada con la liberación de citocromo c y se inhibe por la expresión de niveles elevados de la proteína anti-apoptótica Bcl-xL. Además, AHA activa la ruta de MAPKs y la muerte celular es dependiente de la generación de ROS. 77 CAPÍTULO II Evaluación de actividad antiproliferativa de los abietanos diterpénicos Capítulo II 6.1. Los abietanos diterpénicos inhiben la viabilidad celular de líneas celulares tumorales de origen humano. En esta Tesis hemos examinado los efectos de 30 compuestos naturales y derivados semisintéticos (Figuras 13, 14, 15) sobre la proliferación de cinco líneas celulares tumorales humanas y descubrimos que algunos de ellos presentan propiedades citotóxicas (Tabla 3). Se usaron diferentes líneas celulares para determinar la potencial especificidad de sus efectos citotóxicos. Las células de leucemia fueron elegidas porque son propensas a la apoptosis, las células SK-MEL-1 porque el melanoma es la forma más agresiva del cáncer de piel, y las células MCF-7 porque son resistentes a la apoptosis. Las líneas celulares HL-60, U937 y Molt-3 fueron más sensibles, mientras que las MCF-7 y SK-MEL-1 fueron más resistentes. La taxodona (1) y la taxodiona (2) presentaron valores similares de IC50 (~1-4 μM) en las líneas celulares de leucemia HL-60, U937 y Molt-3, mientras que las líneas SK-MEL-1 y MCF-7 presentaron valores de IC50 de ~10 μM (excepto taxodiona 2 en MCF-7 que presentó una IC50 > 30 μM). La royleanona (3) y la 7αetoxi-royleanona (4) mostraron valores de IC50 > 30 μM en todas las líneas celulares ensayadas. El inuroyleanol (5) mostró propiedades citotóxicas en U937 (IC50 = 11,1 μM) y fue menos potente en HL-60, mientras que el resto de las líneas ensayadas fueron resistentes a este compuesto. La coleona U (6) fue citotóxica en ambas líneas celulares HL-60 y U937, con valores de IC50 de 4,1±1,8 μM y 4,3±1,3 μM, respectivamente. La 2-oxocandesalvona A (7) no presentó citotoxicidad en ninguna línea celular. La teuvincenona (8) solo presentó citotoxicidad en células de leucemia. Los derivados sintéticos 11,12-di-O-acetil-14-desoxicoleona U (9) y 6,11,12-tri-O81 Capítulo II acetil-14-desoxicoleona U (10) presentaron una toxicidad similar en todas las líneas celulares, excepto en MCF-7 con un valor de IC50 >30 μM, pero el derivado triacetilado (10) presentó valores de IC50 ligeramente más bajos que el derivado diacetilado (9). Esto podría explicarse por la diferencia de hidrofobicidad: el derivado triacetilado (10) podría atravesar las membranas biológicas con más facilidad que el derivado diacetilado (9) y de esta manera alcanzar un concentración intracelular más alta. Aunque la 7α-acetoxi-6β-hidroxiroyleanona (11) no presenta potentes propiedades citotóxicas en células de leucemia y de melanoma humanas, este compuesto presenta una actividad antiproliferativa interesante en la línea celular de cáncer de mama MCF-7 (IC50 = 6,8 ± 1,3 μM). De esta manera el compuesto 11 afecta la proliferación celular de una forma específica. Ya que el compuesto 11 tiene dos grupos hidroxilo, se obtuvieron sus derivados con varios radicales (12-22) (Figura 14) y se estudiaron sus efectos en las diferentes líneas celulares. En general, los derivados con grupos funcionales monoester y diester fueron más activos contra las células de leucemia que el compuesto 11, con la única excepción del compuesto 13, que fue menos potente que el compuesto 11 en las células Molt-3, SK-MEL-1 y MCF-7. Entre los derivados con un grupo benzoilo en el anillo de quinona no hubo diferencia en la actividad entre los compuestos con un sustituyente donante de electrones (-OCH3, compuesto 14) y aceptor de electrones (-Cl, compuesto 15) en la posición para del anillo bencénico. Sin embargo, la introducción de un sustituyente aceptor de electrones, el grupo nitro, en el compuesto 16 redujo la actividad citotóxica. El derivado p-nitrobenzoilo (17) fue al menos 6-10 veces más activo que el compuesto 11, excepto en las células MCF-7. El derivado diacetilo (18) fue más citotóxico que el derivado monoacetilado (20) en todas las células ensayadas. 82 Capítulo II OMe HO H OH O OH O H O OEt H OH HO OH O OH OH O H O H H 12 34 5 678 910 Figura 13 . Estructuras químicas de los abietanos ensayados. 83 Capítulo II Para estudiar el efecto de los abietanos diterpénicos seleccionados sobre el ciclo celular, las células incubadas con los compuestos se tiñeron con yoduro de propidio y se analizaron por citometría de flujo (Figura 18). La evaluación del número de células hipodiploides (fase sub-G1) después de 24 h de tratamiento con los compuestos 1, 12, 14, y 15 (3 μM) mostró que el porcentaje de células apoptóticas aumentó aproximadamente 20%, 48%, 35% y 40%, respectivamente. Un número significativo de células apoptóticas fue detectado ya después de 12 horas de tratamiento. Cuando se excluyó del análisis la fracción de células en fase sub-G1, no hubo cambios en la distribución de células en las distintas fases del ciclo entre células HL-60 normales y tratadas. 112 1415 0 20 40 60 80 Compuesto Células hipodiploides (%) * * * * №de células Contenido ADN Control 1121415 10 1 10 2 10 3 10 1 10 2 10 3 10 1 10 2 10 3 10 1 10 2 10 3 10 1 10 2 10 3 Control A B Figura 18. Efecto de los compuestos 1, 12, 14 y 15 sobre el ciclo celular. (A) Evaluación de la cantidad de células hipodiploides (fase sub-G1) después de 24 h de tratamiento con 3 μM de los compuestos seleccionados. Los valores representan medias ± SE de tres experimentos independientes cada uno hecho en triplicado. *P<0,05 significativamente diferente del control. (B) Distribución del ciclo celular en las células tratadas con 3 μM de los compuestos 1, 12, 14 y 15 durante 24 h. 90 Capítulo II 6.3. Papel de las caspasas en la muerte celular inducida por los abietanos 1, 12, 14 y 15. Para determinar si las caspasas están involucradas en la respuesta de las células al tratamiento con los compuestos abietánicos, hemos examinado si estos compuestos inducen el procesamiento proteolítico de las caspasas. Para ello, las células se trataron durante 24 h con 3 μM de los compuestos 1, 12, 14 y 15 y los lisados celulares se analizaron por transferencia Western (Figura 19 A). Los compuestos inducen el procesamiento de la pro-caspasa-9 (en el caso del compuesto 1 no se detectó el fragmento 35-37 kDa), la pro-caspasa-8 (el compuesto 15 fue el más potente) y la pro-caspasa-3. Los compuestos 14 y 15 no inducen la hidrólisis de las pro-caspasas-6 y -7, mientras que los compuestos 1 y 12 inducen el procesamiento más potente de la caspasa-7 que de la caspasa-6. También hemos evaluado si estos compuestos activan la caspasa-4, que está implicada en el estrés del retículo endoplasmático, y hemos observado una disminución de la pro-caspasa-4 (compuesto 1) y la formación del fragmento 18-20 kDa (compuestos 12, 14 y 15). Todos los compuestos ensayados inducen la hidrólisis de PARP (poli(ADPribosa)polimerasa), sustrato de la caspasa-3. Como el procesamiento de caspasas no siempre está relacionado con su activación, hemos evaluado la actividad enzimática de las caspasas-3/7, -8 y -9 en los lisados de las células tratadas con los abietanos seleccionados utilizando los sustratos específicos DEVD-pNA, IETD-pNA y LEHD-pNA (Figura 19 B). Como muestran los resultados, los compuestos 1, 12 y 14 inducen la activación de las caspasas-3/7, - 8 y -9. En las células tratadas con el compuesto 15 se observa el aumento de la actividad de la caspasa-3/7 pero no de las caspasas-8 y -9. 91 Capítulo II A C Figura 19. Implicación de las caspasas en la apoptosis inducida por los compuestos 1, 12, 14 y 15. (A) El procesamiento proteolítico de caspasas y PARP. Las células se trataron con 3 μM de los compuestos indicados durante 24 h y los lisados celulares se analizaron por transferencia Western. (B) Activación de caspasas inducida por los compuestos seleccionados. Los resultados se expresan en incrementos de actividad comparada con el control. Efecto del inhibidor general de caspasas z-VAD-fmk (C) y los inhibidores específicos de caspasa-8 y -9 (D) sobre la apoptosis inducida por los abietanos. *P<0,05 significativamente diferente del control. #P<0,05 significativamente diferente del tratamiento con los abietanos. Control 1 12 14 15 0 2 4 6 Caspasa 3/7 Caspasa 8 Caspasa 9 A ctividad caspasa (u.a) * * * * * * * * * Pro-caspasa 7 Pro-caspasa 8 55 kDa Pro-caspasa 9 47 kDa 35 kDa Pro-caspasa 6 34 kDa Pro-caspasa 4 43 kDa Pro-caspasa 3 Fragmento 36 kDa 18-20 kDa β-actina PARP Fragmento 116 kDa 85 kDa 42 kDa 1 12 14 15 112 14 15 0 20 40 60 80 100 - z-IETD-fmk z-LEHD-fmk Células hipodiploides (%) * * * * # # * * * 80 Células hipodipoloides (%) 60 * * 40 * # 20 # # # 0 z-VAD z-VAD z-VAD z-VAD Control - - - - 112 14 15 D Control Control B 92 Capítulo II Para demostrar si la activación de las caspasas es necesaria para la apoptosis inducida por los compuestos 1, 12, 14 y 15, las células se trataron con un inhibidor general de caspasas z-VAD-fmk y se analizaron por citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 19 C, este inhibidor reduce significativamente (compuesto 1) o casi completamente (compuesto 12, 14, y 15) la cantidad de células hipodiploides, lo que indica que estos compuestos inducen una muerte celular dependiente de caspasas. Para identificar qué caspasas están involucradas en el mecanismo de la muerte celular inducida por los abietanos, hemos examinado los efectos de los inhibidores específicos de caspasa-9 (z-LEHD-fmk) y caspasa-8 (z-IETD-fmk) (Figura 19 D). Estos inhibidores no tuvieron efecto sobre la muerte celular inducida por los compuestos 1 y 12. El pretratamiento de las células con z-IETD-fmk redujo significativamente la cantidad de células hipodiploides inducidas por los compuestos 14 y 15, mientras z-LEHD-fmk no tuvo efecto. 6.4. Papel de la mitocondria en la apoptosis inducida por los compuestos 1, 12, 14 y 15. Para determinar si el tratamiento con los abietanos induce la liberación de proteínas mitocondriales, las fracciones citosólicas de los extractos celulares se analizaron por transferencia Western (Figura 20 A). Como se observa los compuestos seleccionados inducen la liberación al citosol de proteínas proapoptóticas citocromo c, Smac/DIABLO y AIF. Además, los abietanos 1 y 15 inducen la disminución de Bcl-2 y ligeramente de Bax citosólico. La taxodona (1) 93 Capítulo II también reduce los niveles de Bid, lo que está de acuerdo con la activación de la caspasa-8. A 15 kDa Citocromo c 22 kDa Smac/DIABLO AIF 67 kDa Bcl-2 26 kDa Bax 22 kDa 22 kDa Bid β-actina 42 kDa 15 114 12 Control Control 1 12 14 15 B Figura 20. El papel de la mitocondria en la apoptosis inducida por los compuestos 1, 12, 14 y 15. (A) Efecto de los abietanos diterpénicos sobre la liberación de citocromo c, Smac/DIABLO y AIF y su efecto sobre los niveles de las proteínas de la familia Bcl-2: Bcl-2, Bax y Bid. Las células se trataron con 3 μM de los compuestos indicados durante 24 h y los lisados celulares se analizaron por transferencia Western. (B) Efecto de los compuestos seleccionados sobre el potencial de la membrana mitocondrial (ΔΨm). Las células teñidas con JC-1 se analizaron por citometría de flujo. 6,4% 12,7% 9,7% 2,4% 7,2% 12 h FL2-H (→) 1,7% 1,2% 4,1% 1,3% 8,1% 4,1% 6,1% 1,8% 1,7% 2,3% 13,5% 19,9% 26,2% 3,9% 16,0% 37,9% 16% 2,7% 2,8% 0,7% 81,3% 14,2% 38,8% 10,2% 65,8% FL1-H ( → ) 94 Capítulo II Para determinar si la disipación del potencial de la membrana mitocondrial (ΔΨm) es necesaria para la liberación de las proteínas mitocondriales, las células se tiñeron con JC-1 y se analizaron por citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 20 B, ΔΨm disminuyó solo después de 24 horas de tratamiento, lo que indica que la disipación de ΔΨm no es un evento temprano en la apoptosis inducida por los compuestos seleccionados. 6.5. Los abietanos diterpénicos seleccionados activan las proteínas quinasas activadas por mitógenos MAPKs. La vía de las MAPKs actúa como mediadora de una serie de señales que promueven o inhiben la proliferación de las células leucémicas. Para determinar si la fosforilación de las MAPKs desempeña un papel importante en la apoptosis inducida por los diterpenos, hemos examinado el efecto de los inhibidores específicos de MAPKs sobre la muerte celular inducida por estos compuestos. El pretratamiento de las células con PD98059 y U0126, inhibidores de las quinasas extracelulares activadas por mitógenos 1/2 (MEK1/2), y con SP600125, inhibidor de JNK/SAPK, no hizo efecto sobre la apoptosis inducida por taxodona (1) (Figura 21 A). Sin embargo, la inhibición de p38MAPK con el inhibidor específico SB203580 aumentó el porcentaje de células apoptóticas inducida por este compuesto de 15,3±3,8% a 54,3±7,6%. Ningún inhibidor tuvo efecto sobre la muerte celular inducida por el compuesto 12, lo que sugiere que la activación de estas MAPKs no es necesaria para la apoptosis inducida por este compuesto. 95 Capítulo II 114 A Células hipodiploides (%) Control 14 14 + PD 14 + U0 14 + SP 14 + SB 0 20 40 60 Células hipodiploides (%) * ## # # * # Control 1 1+ PD 1+ U0 1+ SP 1+ SB 0 20 40 60 B β-actina P-ERK1/2 ERK1/2 P-JNK P-p38 p38 0246 Tiempo (h) 12461 Control 15 15 + PD 15 + U0 15 + SP 15 + SB 0 20 40 60 * ## # Células hipodiploides (%) Control 12 12 + PD 12 + U0 12 + SP 12 + SB 0 20 40 60 80 * Células hipodiploides (%) Figura 21. (A) Efecto de los inhibidores de las MAPKs sobre la apoptosis inducida por los compuestos 1, 12, 14 y 15. Las células se preincubaron con PD98059 (PD, 10 μM), U0126 (U0, 10 μM), SP600125 (SP, 10 μM) y SB203580 (SB, 2 μM) durante 1 h y después con 3 μM de los abietanos diterpénicos durante 24 h. *P<0,05 significativamente diferente del control. #P<0,05 significativamente diferente del tratamiento con los compuestos. (B) Fosforilación de las MAPKs inducida por los compuestos 1 y 14. Las células se trataron con 3 μM de los compuestos durante los tiempos indicados y los lisados celulares se analizaron por transferencia Western. 96 Capítulo II Los inhibidores de MEK 1/2 así como SP600125 aumentaron la muerte celular inducida por los compuestos 14 y 15. El inhibidor de p38MAPK bloqueó casi completamente la apoptosis inducida por el compuesto 14, mientras que este inhibidor no tuvo ningún efecto significativo sobre las células tratadas con el compuesto 15. Estos resultados sugieren que la activación de p38MAPK es necesaria para la apoptosis inducida por el compuesto 14. Para explorar el papel de las MAPKs en la muerte celular inducida por estos compuestos hemos analizado el efecto de los compuestos 1 y 14 sobre la fosforilación de las MAPKs mediante transferencia Western (Figura 21 B). La fosforilación de ERK 1/2 y p38MAPK en las células tratadas con taxodona 1 se detectó después de 1 h de tratamiento, mientras que la fosforilación de JNK/SAPK se detectó después de 4 h. Por el contrario, no se observó fosforilación de MAPKs en las células tratadas con el compuesto 14, pero se detectó la disminución de la fosforilación de fosfo-p38MAPK y también una leve disminución de la cantidad de p38MAPK total. 6.6. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) no son necesarias para la muerte celular inducida por los abietanos diterpénicos. Hemos investigado si la generación de ROS está involucrada en la apoptosis inducida por los compuestos seleccionados. Para ello las células se tiñeron con H2DCF-DA (diacetato de 2’,7’-diclorodihidro-fluoresceína) y se analizaron por citometría de flujo. La generación de ROS fue detectada después de 30 min, 1 h y 4 h de tratamiento con los abietanos diterpénicos 15, 12 y 1, respectivamente (Figura 22 A). No hubo generación de ROS en las células tratadas con el compuesto 14. 97 Capítulo II Figura 22. (A). Generación de ROS por los abietanos seleccionados. Las células se incubaron con los compuestos 1, 12, 14 y 15 durante los tiempos indicados y se determinó la fuorescencia de H2-DCF oxidado por citometría de flujo. (B) Efecto de NAC (10 mM) sobre la muerte celular inducida por los compuestos 1, 12, 15. NAC se añadió simultáneamente con los compuestos después de la incubación previa de NAC con cada compuesto durante 2 h. Las células tratadas se tiñeron con yoduro de propidio y se analizaron por citometría de flujo. Fluorescencia DCF (u.a.) A B 3 1 12 14 15 Control 2 1 15 min 30 min 1 h 2 h 4 h 0 Tiempo 40 Células hipodiploides (%) 30 20 10 Control 0 (14+NAC) 1 (1+NAC) 11 (11+NAC) 14 98 Capítulo II Para determinar si la generación de ROS está involucrada en la apoptosis inducida por los compuestos 1, 12 y 15 hemos examinado el efecto de N-acetil-Lcisteína (NAC, 10 mM), α-tocoferol (vitamina E, 25 μM) y trolox (2 mM). NAC fue el único antioxidante que bloqueó la muerte celular inducida por los compuestos 1, 12 y 15. Sin embargo, el papel protector de NAC parece ser una consecuencia de la reacción directa con los abietanos ya que no se detectó la muerte celular cuando los compuestos se preincubaron con NAC durante 2 h y después se añadieron a las células (Figura 22 B) 99 CONCLUSIONES 1. Hemos evaluado la actividad antitumoral de nueve derivados semisintéticos de glicósidos de la quercetina y el kaempferol en la línea celular HL-60. 2. De los compuestos analizados el heptacetato de astragalina (AHA) es el más citotóxico. AHA posee propiedades citotóxicas en células HL-60, mientras que las PBMC quiescentes y proliferantes son resistentes. 3. AHA induce la apoptosis por un mecanismo dependiente de caspasas. Sin embargo, el hecho de que inhibidor general de caspasas z-VAD-fmk no bloqueara completamente la muerte celular inducida por AHA supone la existencia de otras rutas adicionales. 4. El estrés del retículo endoplasmático está implicado, ya que AHA induce el procesamiento de caspasa-4 y la apoptosis se bloqueó parcialmente con el inhibidor específico de caspasa-4. 5. La apoptosis inducida por AHA está asociada con la liberación de citocromo c a través de un mecanismo que es independiente de la despolarización de la membrana mitocondrial, y se inhibe mediante la expresión de niveles elevados de Bcl-2 y Bcl-xL. 6. AHA induce la activación de JNK/SAPK y la fosforilación bifásica de ERK1/2. Las MAPKs parecen actuar como señales de supervivencia, ya que la inhibición de estas rutas de señalización potencian la muerte celular apoptótica inducida por AHA. 7. La muerte celular inducida por AHA es dependiente de la generación de las especies reactivas de oxígeno (ROS). 8. Hemos examinado los efectos de 30 diterpenoides sobre la proliferación de cinco líneas celulares tumorales humanas y descubrimos que algunos de ellos presentan propiedades citotóxicas. 9. La taxodona (1) y su derivados 12, 14 y 15 poseen propiedades citotóxicas en todas las líneas celulares analizadas. Además los linfocitos normales (PBMC) fueron más resistentes a los compuestos 1, 12, 14 y 15 que las células HL-60. 108 10. El efecto antiproliferativo de los diterpenoides 1, 12, 14 y 15 es dependiente de caspasas y asociado a la liberación de proteínas mitocondriales y la disipación del potencial de membrana mitocondrial. 11. Los abietanos diterpénicos seleccionados son citotóxicos en las células de leucemia humana que expresan niveles elevados de Bcl-2 y Bcl-xL y por lo tanto son capaces de inactivar la protección conferida por estas proteínas. 12. La activación de JNK y ERK1/2 no es necesaria para la muerte celular inducida por taxodona, pero la inhibición de la ruta p38MAPK sensibiliza a las células HL-60. En cambio, p38MAPK parece estar implicada en la apoptosis inducida por el compuesto 14, mientras que ERK1/2 y JNK/SAPK están involucradas en la supervivencia celular. BIBLIOGRAFÍA Bibliografía BIBLIOGRAFÍA [1] Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell 2000; 100:57-70 [2] Newman DJ, Cragg GM. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. J Nat Prod 2012; 75:311-35 [3] Havsteen BH. The biochemistry and medical significance of the flavonoids. Pharmacol Ther 2002; 96:67-202 [4] Ren W, Qiao Z, Wang H, Zhu L, Zhang L. Flavonoids: promising anticancer agents. 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