Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis

Departamento de Ciencias Médicas y Quirúrgicas Tesis Doctoral Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Carlos Thams Baudot Directores de Tesis Dr. Ulf Thams Lorey Dr. Jorge Freixinet Gilart Las Palmas de Gran Canaria, Noviembre 2015 Departamento de Ciencias Médicas y Quirúrgicas Programa de Doctorado: Avances en traumatología, medicina del deporte. Cuidados de heridas (Interdepartamental) Tesis Doctoral Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Carlos Thams Baudot Doctorando Directores de Tesis Dr. Ulf Thams Lorey Dr. Jorge Freixinet Gilart Las Palmas de Gran Canaria, Noviembre 2015 2.2.1. Aislamiento de condrocitos 92 2.2.2. Conservación y descongelado de los condrocitos 93 2.2.3. Cultivo en monocapa 93 2.2.4. La cosecha y el procesado de las células 94 2.2.5. Contaje celular 95 2.2.6. Elaboración de los agregados tridimensionales de condrocitos 96 2.3 Histología e inmunohistoquímica 97 2.3.1.Descalcificación 98 2.3.2. Cortes de las muestras de tejido porcino 98 2.3.3.Fijacióneinclusiónenparafinadelasmuestras 100 2.3.4.Cortesultrafinosdelasmuestras 100 2.3.5.Desparafinadoyrehidratación 101 2.3.6. Tinción de hematoxilina eosina 101 2.3.7. Tinción Masson-Goldner 102 2.3.8. Tinción Safranina-O-Fast Green 102 2.3.9. Preparación de las muestras en formol 103 2.3.9.1. Pretratamiento con tripsina 103 2.3.9.2. Pretratamiento con hialuronidasa y pronasa 104 2.3.9.3. Pretratamiento con pronasa 104 2.3.9.4. Pretratamiento con el tampón de citrato 104 2.3.10. Tinciones inmunohistoquímicas 105 2.3.11. Control negativo 106 2.3.12. Evaluación de las tinciones 107 2.3.13. Establecimiento de determinados anticuerpos primarios 107 2.3.14. Supresión de la tinción positivas en los controles negativos positivos 108 2.4 Diseño del análisis estadístico 109 3. Resultados 110 3.1 Evaluación del cultivo celular 110 3.1.1. Estudios morfológicos de los cultivos monocapa 110 3.1.1.1. Valoración morfológica de los condrocitos del cerdo 111 3.1.1.2. Valoración morfológica de los condrocitos humanos 111 3.1.2. Valoración morfológica de los trasplantes tridimensionales 112 3.1.2.1. Análisis de los trasplantes de condrocitos porcinos 112 3.1.2.2. Análisis de los trasplantes de condrocitos humanos 112 3.2 Evaluación macroscópica de los cóndilos femorales porcinos tratados y de los no tratados con colagenasa 114 3.3 Análisis histológico de los cóndilos sanos y los tratados con colagenasa 119 3.3.1. Valoración de la tinción con hematoxilina-eosina 119 3.3.2. Valoración de la tinción de Safranina-O-FastGreen 120 3.3.3. Valoración de la tinción tricrómica de Masson-Goldner 122 3.4 Análisis inmunohistoquímico de los cóndilos sanos y los tratados con colagenasa 124 3.4.1. Valoración inmunohistoquímica de los componentes de la matriz extracelular 124 3.4.1.1. Expresión de colágeno tipo II 124 3.4.1.2. Expresión de colágeno tipo I 126 3.4.1.3. Expresión de colágeno tipo III 128 3.4.1.4. Expresión de agrecano 128 3.4.1.5. Expresión de S-100 129 3.4.2. Valoración inmunohistoquímico de la expresión de factores de crecimiento 130 3.4.2.1. IGF-1 130 3.4.2.2. TGF-ß 131 3.4.3. Estudio inmunohistoquímico de la expresión de citoquinas degenarativas o catabólicas 133 3.4.3.1. Interleuquina-1ß 133 3.4.3.2. Factor de Necrosis Tumoral α 134 3.4.4. Estudio inmunohistoquímico de la expresión de enzimas 134 3.4.4.1. ADAMTS-5 (Agrecanasa-2) 134 3.4.4.2. MMP-13 (Colagenasa-3) 135 3.4.5. Estudio inmunihistoquímico de la expresión del marcador de apoptosis caspasa-3 136 3.5 Resumen de resultados 137 3.5.1. Análisis estadístico de los resultados 139 4. Discusión 140 4.1 Comparativa entre la producción de trasplantes de condrocitos porcinos y humanos 140 4.1.1. Comparación de los cultivos monocapa 140 4.1.2. Cultivo tridimensional de los condrocitos de cerdo 141 4.1.3. Comparación de los cultivos tridimensionales 141 4.2 Comparación macroscópica e histológica del cartílago sano y el tratado con colagenasa 142 4.3 Comparación de los componentes de la matriz extracelular en el cartílago sano y artrósico 146 4.4 Comparación de la expresión de citoquinas entre articulaciones sanas y artrósicas 148 4.4.1. Las enzimas catabólicas IL-1β y TNF-α 148 4.4.2. IGF-1 y TGF-β, dos citoquinas anabólicas 149 4.5 Las enzimas MMP-13 y ADAMTS-5 y su papel en el desarrollo de la artrosis 152 4.6 Apoptosis en el desarrollo de la artosis 154 4.7 La idoneidad de la inyección intraarticular de colagenasa en la rodilla del minipig como modelo de artrosis 156 4.8 Perspectiva 157 Bibliografía 159 Índice de abreviaturas ºC Grado centígrado 3D Tridimensionales fig. Figura ROM Rango de movilidad (del inglés Range of motion) ABVD Actividades básicas de la vida diaria ICRS International Cartilage Repair Society LCA Ligamento cruzado anterior TAC Tomografía axial computerizada RMN Resonancia nuclear magnética ADAMTS A disentigrin and metalloprotease with thrombospondin type 1 motifs AP Fosfatasa alcalina BSA Bovine serum albumin (albúmina de suero bovino) cm Centímetro cm² Centímetro cuadrado TC Tomografía computerizada EDTA Tetraacetato de etilendiamina et al. Et altera MEC Matriz extracelular FGF Fibroblast growth factor (factor de crecimiento fibroblástico) FI Fossa intercodilaris gr Gramo h Hora H-E Hematoxilina-Eosina AH Ácido hialurónico 23 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis 1. Introducción 1.1 La articulación Una articulación se define como zona de contacto entre dos elementos del esqueleto próximos entre sí. A la articulación le corresponden las superficies de contacto entre los correspondientes elementos del esqueleto (superficies articulares), así como estructuras de partes blandas (tejidos) que se encuentran entre ambas superficies articulares (1,2). Existen principalmente dos tipos de articulaciones, las sinartrosis y las diartrosis. En las primeras falta el espacio articular, donde en su lugar existe tejido conjuntivo o cartílago como tejido conectivo. Por otro lado se encuentran las diartrosis (clasificadas según su función) o también articulaciones sinoviales (clasificadas según su estructura). 1.1.1 Estructura de las diartrosis, especialmente la rodilla Las articulaciones sinoviales del tipo diartrosis se componen de los siguientes elementos: 1) Superficies articulares lisas, separadas por una cavidad articular y móviles unas sobre otras. 2) una cápsula articular y ligamentos. 3) un tejido sinovial responsable de producir líquido sinovial que sirve de alimento y lubricante articular. Superficiesarticulares - Las superficies articulares están siempre revestidas por cartílago llamado articular o de revestimiento. Este cartílago presenta una superficie libre, lisa y pulida, cuyo espesor será proporcional a la presión soportada por unidad de superficie. Es sólido, flexible, elástico y liso, facilitando los deslizamientos, protegiendo la superficie ósea y evitando el desgaste del hueso. 24 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Frecuentemente, como es el caso de la rodilla, las superficies articulares no se adaptan entre sí con exactitud. Para lograr la concordancia existen unas láminas fibrocartilaginosas interarticulares llamadas meniscos. En la rodilla tienen forma de medialuna cuyas periferias se adhieren directamente a la cápsula articular. Cápsula articular y ligamentos - Son las encargadas de mantener en contacto las superficies articulares. El manguito fibroso que se inserta en la vecindad de las superficies articulares se denomina cápsula articular. Su laxitud será directamente proporcional a la amplitud de movimiento y a la movilidad en sí de cada articulación. Existen una serie de refuerzos situados en donde la cápsula debe presentar una mayor resistencia denominados ligamentos. Sin embargo, existen ligamentos que no son refuerzos de la cápsula, sino que se relacionan con tendones, tejido muscular y aponeurosis en su origen embriológico, quedando como ligamentos intrínsecos en la articulación definida, como por ejemplo los ligamentos cruzados en la rodilla. La rodilla En el caso concreto de la rodilla la cápsula articular tiene dos capas, compuestas por fuera por la membrana fibrosa y por dentro por la membrana sinovial. La membrana fibrosa se compone de tejido conectivo fuerte unido al hueso a través de fibras de colágeno. La membrana sinovial se divide en íntima y subíntima. La primera está compuesta de uno a cuatro estratos de sinoviocitos fibroblásticos y macrofágicos. Los macrófagos se encargan de fagocitar bacterias y restos celulares así como de la producción de ácido hialurónico. Los sinoviocitos fibroblásticos sintetizan diversas proteínas. También encontramos células nerviosas aferentes en la cápsula articular. El espacio articular está relleno de líquido sinovial, que suele ser claro, de color ámbar y viscosa gracias a su alto contenido en ácido hialurónico. Este líquido lubrica las superficies articulares rebajando enormemente la fricción entre ellas. También participa en la amortiguación y en aportar nutrientes al cartílago. El líquido sinovial presenta fosfolípidos, proteoglicanos (por ejemplo lubricina) y proteínas, que provienen de la sangre. 25 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis La rodilla articula el fémur en proximal y con la tibia y el peroné hacia distal. El peroné no articula con el fémur, sino únicamente con la tibia en su lado lateral por debajo de la meseta tibial. El fémur termina distalmente en dos rodetes ligeramente convexos cubiertos de cartílago articular: los cóndilos femorales, uno interno y otro externo. Formando parte del aparato extensor de la rodilla encontramos el hueso sesamoideo más grande del cuerpo humano, la rótula, que articula en su cara posterior con el fémur a nivel del surco intercondíleo. En su parte proximal se inserta el tendón cuadricipital del músculo cuádriceps femoral, y distalmente el tendón rotuliano que a su vez se inserta en la espina tibial anterior, formando parte de esta forma del potente aparato extensor de la rodilla. Las superficies articulares de los cóndilos femorales y de la tibia no son del todo congruentes, pero existen dos meniscos en forma de semiluna que se ocupan de aportar estabilidad y amortiguación, consiguiendo de esta forma una articulación estable y armónica. Cuando la rodilla está flexionada, son las superficies posteriores, más planas, de los cóndilos femorales las que articulan sobre la tibia. Fig. 1: Vista frontal de una rodilla derecha en bipedestación 32 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Los glucosaminoglicanos que se asocian con proteoglicanos son cinco: keratán, hiparán sulfato, dermatán sulfato, condroitín sulfato y hialuronato. El más importante de éstos es el ácido hialurónico no sulfatado, ya que posee una secuencia de 25.000 ácidos, lo que le confiere una carga negativa. Por esto atrae a diversos cationes, sobre todo al sodio, y esto hace que tenga gran actividad osmótica. Esta propiedad hace que atraiga agua, convirtiendo cada molécula en un ovillo muy hidratado y laxamente plegado, ocupando un volumen importante en el espacio intercelular. Los glicosaminoglicanos sulfatados se encuentran en el espesor de la red de colágeno y su principal contribución es la de revertir la deformación del cartílago. El agrecano es el proteoglicano más importante y se trata de una proteína grande a la que se unen más de 100 cadenas de condroitín sulfato y 20 de keratán sulfato, y a través de su cordón proteico se puede unir al ácido hialurónico. Cuando se unen varios a una molécula de hialuronato pueden formar un agregado masivo. Esta construcción es la responsable de la dureza y la resistencia de la matriz cartilaginosa. Cuando es presionada, pierde agua y cuando la presión cede lo vuelve a atraer, recuperando la forma. Esta característica hace que el cartílago actúe como un amortiguador para el hueso subyacente. La fuerza aplicada será distribuida de forma ordenada y repartida gracias a la configuración espacial de las fibras de colágeno. Se trata de una distribución en forma de arcos que se pueden dividir en cuatro zonas que sin embargo no se pueden diferenciar directamente unas de otras. Las fibras de colágeno más superficiales están colocadas de forma tangencial, en la zona 1. Aquí, la concentración de colágeno es alta y la de proteoglicanos es menor, al contrario que en las zonas 2 y 3. La zona 2 tan sólo es la transición a la zona 3, en la que las fibras de colágeno adoptan una distribución radial o perpendicular hacia la superficie. Aquí es donde se encuentra la mayor concentración de proteoglicanos, aunque las fibras de colágeno son de mayor grosor. La zona más profunda es la llamada zona 4 o mineralizada, que contacta con el hueso subcondral y es donde se anclan las fibras de colágeno y donde encontraremos cristales de hidroxiapatatita en la matriz extracelular. (2, 21, 25, 80). 33 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis 1.2 Artrosis También conocida como osteoartritis o enfermedad degenerativa de las articulaciones, es la afectación degenerativa de las superficies sinoviales. Es la patología articular más frecuente y supone un alto gasto sanitario a nivel mundial. Afecta con mayor frecuencia a las rodillas, caderas, manos, pies y columna vertebral, pero potencialmente puede aparecer en cualquier articulación sinovial. La artrosis de las rodillas se denomina gonartrosis, en las caderas coxartrosis y en la base del pulgar rizartrosis. Éstas son las tres presentaciones más comunes de la enfermedad, junto con la lumboartrosis. Suponen un 30% de todos los ingresos hospitalarios a nivel mundial. Se estima que más del 10% de la población mundial padece esta patología (Neogi, 50). Se estima que alrededor del 40% de los varones y el 47% de las mujeres desarrollarán alguna forma de artrosis a lo largo de su vida, siendo mayor la incidencia en pacientes obesos, como publicó Zhang en 2013 (20). Los costes de esta enfermedad son particularmente elevados, puesto que generan un gasto médico asistencial importante, y una disminución de productividad de la población que la padece con su correspondiente pérdida de calidad de vida. La Sociedad Española de Reumatología (SER), en asociación con la Sociedad Española de Médicos de Atención Primaria (Semergen), publicó en el año 2012 que el coste anual de la artrosis de rodilla y de cadera en España es de 4.738 millones de euros, de los cuales el 46 por ciento corresponde a gastos asistenciales, el 22 por ciento a bajas laborales, el 13 por ciento a ingresos hospitalarios, el 7 por ciento a pruebas diagnósticas y el 5 por ciento a fármacos. Sólo el tratamiento de la artrosis en España consume más del 0,5% del producto interior bruto (P.I.B.) (19). En el año 2002, la Sociedad Alemana de Cirugía Ortopédica cifró el coste anual aproximado de la artrosis en torno a los 7.200 millones de euros para el año 2002 (17). Es una enfermedad característica de pacientes mayores, porque tarda mucho tiempo en desarrollarse y en ser sintomática. La incidencia pasa del 2% en torno a los 45 años al 68% a partir de los 65 años de edad (15, 20). 34 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis El gran coste económico de esta patología hace que desde hace varios años se estén diseñando diversas estrategias de prevención y educación de la población. Sabemos que hay diferentes factores de riesgo, y que algunos como la edad o el sexo no pueden ser tratados de forma preventiva. Por esto, es sobre todo el problema del sobrepeso el que se ha convertido en diana de importantes esfuerzos por parte de organizaciones de la salud y varios gobiernos, aunque aún falta mucho para poder ver resultados positivos de estas campañas. La población en el llamado primer mundo continúa con una tendencia al alza en ganancia ponderal, y por ejemplo en países como Estados Unidos de América la obesidad se ha convertido en un problema prioritario para el gobierno. 1.2.1.Definicióndeartrosis El concepto de osteoartrosis ha recibido numerosas definiciones a lo largo de la historia, por lo que en 1994 se estableció una definición oficial por parte del grupo “New Horizons in Osteoarthritis” (15). En ésta, se hace especial hincapié en que la artrosis no se compone de una única enfermedad. Según esta definición, la artrosis es un conjunto de diferentes enfermedades que se solapan, posiblemente con diferentes etiologías pero con una aparición biológica, morfológica y clínica similares. Se ven afectados diferentes tejidos, todos aquellos que forman parte de una articulación, y no se limita al cartílago. Ocurren varios hechos diferentes pero relacionados entre sí, que finalmente acaban en la degradación del cartílago y del hueso subyacente, y estos hechos pueden ser desencadenados por diversos factores como la genética, los traumatismos, metabólicos y del desarrollo, entre otros. En 2012, el grupo de trabajo de Goldring et al. (16), escribió que la artrosis, más que un proceso de desgaste y rotura, se debe entender como una remodelación anormal de los tejidos articulares conducida por una serie de mediadores inflamatorios dentro y fuera de la articulación afectada. Para desarrollar este concepto propone conocer a la articulación como un conjunto de estructuras con sus características fisiológicas e histoquímicas particulares que forman un órgano, por lo que el título de su trabajo es precisamente ese: “The Joint as an Organ”, “La articulación como un órgano”. 35 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Se entiende que la artrosis se comporta como una enfermedad degenerativa no inflamatoria, un proceso bioquímico que tiene más de intento reparador que de degenerativo, y que se caracteriza por degeneración del cartílago articular, hipertrofia del hueso en sus márgenes y cambios en la membrana sinovial. En cambio, en la artritis el daño empieza en la membrana sinovial y secundariamente se afecta el cartílago. Clínicamente se manifestará con dolor articular, sensibilidad exacerbada, rigidez articular, crepitación y diferentes grados de inflamación. Estos síntomas no son constantes pero sí duraderos, y a veces son tan intensos que los pacientes se ven incapaces de caminar con normalidad. Este hecho puede tener efectos negativos sobre la productividad laboral y sobre el estado de ánimo de los pacientes, pudiendo ser el desencadenante de cuadros relacionados con la distimia o la depresión. Los pacientes buscan remedios para mitigar sobre todo el dolor. El uso prolongado de analgésicos y antiinflamatorios no está exento de riesgos y complicaciones, como trastornos metabólicos, hepatopatías, nefrotoxicidad y afectaciones del aparato digestivo. La inmovilidad por el dolor de la artrosis también es responsable de problemas como el sobrepeso y la obesidad, el incremento de la incidencia de enfermedades como la diabetes y la hipertensión arterial. Con todo esto, podríamos definir la artrosis como un síndrome clínico-radiológico y de laboratorio consistente en: 1. Pérdida progresiva del cartílago artricular por destrucción enzimática, que provoca una reducción del espacio interarticular y presencia de metabolitos y enzimas en la sangre, en el líquido articular y en la orina. 2. Remodelación de las epífisis y metáfisis óseas con formación de nuevo hueso, osteofitos, esclerosis subcondral y quistes subcondrales. 3. Sinovitis secundaria que puede provocar una fibrosis capsular. 36 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis 1.2.2. Diagnóstico de la artrosis El diagnóstico de artrosis no es un proceso complejo, y se fundamenta en tres pilares: A. Anamnesis o historia clínica B. Exploración física C. Pruebas radiológicas, estudios de imagen • Radiografía simple • TAC • Resonancia magnética D. Artroscopia A.B. Historia Clínica y exámen físico: Los médicos casi siempre diagnostican la artrosis basándose en esas tres cosas: Primero, en la historia del paciente obtenida mediante una correcta anamnesis, segundo por la exploración física y tercero por pruebas complementarias de imagen, tales como la radiografía simple, los escáneres, las resonancias magnéticas y a veces la visión directa obtenida por artroscopia (23, 30). De la anamnesis y de la exploración física podremos valorar los síntomas más frecuentes en la artrosis, como lo son el dolor, la rigidez, la crepitación de la articulación y los cambios en el estado de ánimo del paciente, como la preocupación e incluso depresión (58). Es importante diferenciar a los pacientes que presentan una lesión aislada o múltiples lesiones focales de aquellos que presentan cambios degenerativos artrósicos difusos. Los pacientes con lesiones focales conservan habitualmente un rango de movilidad (ROM - range of motion) normal, dolor y tumefacción en un punto concreto del cóndilo medial o lateral, dependiendo de la localización de la lesión. A veces se acompañan de derrames articulares relacionados con determinadas actividades, como por ejemplo un exceso de carga por 37 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis causas laborales o deportivas. Suele tratarse de paciente jóvenes con un estilo de vida activo y que pese a la lesión son capaces de realizar sus Actividades Básicas de la Vida Diaria (ABVD) sin limitaciones, pero que referirán síntomas relacionados con actividades deportivas o posturas concretas como ponerse de cuclillas o arrodillarse. Con frecuencia este tipo de pacientes presentan lesiones asociadas o alteraciones de la alineación ósea, por lo que merece la pena estudiar y documentarlos bien de cara a la decisión terapéutica más adecuada para cada caso. Son el grupo de pacientes que más se benefician de las técnicas de tratamiento modernas y que tratan de preservar toda la articulación. Aquellos pacientes con cambios degenerativos difusos se ven más limitados para su vida diaria, presentando dolor constante y limitación del rango de movilidad. Pueden sufrir derrames articulares sin necesidad de un desencadenante mecánico y el manejo sintomático es mucho más complejo que en pacientes con lesiones focales. Suelen ser pacientes mayores y con frecuencia presentan otras enfermedades concomitantes, a veces tan graves que desaconsejan el tratamiento a priori indicado para su artrosis. Al ser lesiones difusas que afectan a la totalidad de la articulación suponen un reto terapéutico, muchas veces demasiado difícil de superar, siendo subsidiarios a tratamientos más agresivos como la artroplastia total. Ésta consiste en la destrucción de la totalidad de la superficie articular con su cartílago y la sustitución por una prótesis. C. Estudios de imagen: Los hallazgos radiológicos son fundamentales a la hora de corroborar la sospecha clínica, así como para clasificar el grado de artrosis y de esa forma poder tomar decisiones terapéuticas. Las radiografías simples son una prueba no inocua pues conlleva radiación, pero es rápida, no es compleja de realizar y es relativamente barata. En articulaciones de carga, como lo es la rodilla, se recomienda hacer las radiografías cargando el peso sobre las extremidadades afectadas para ver cómo se comporta la articulación. Es sumamente útil para estadíos moderados o severos de artrosis, y es obligatoria para valorar la alineación de la extremidad, 38 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis lesiones asociadas o previas y para planificar el tratamiento. Al ser la prueba diagnóstica más extendida en el mundo para esta enfermedad, casi todas las clasificaciones de artrosis se basan en estudios de radiografía simple. La Tomografía Axial Tomputerizada (TAC) también es una prueba que utiliza radiación X, pero haciendo mútliples cortes en diferentes planos que permiten obtener una imagen clara, nítida y muy detallada de tejido óseo. Hoy en día se están haciendo reconstrucciones tridimensionales, y esto resulta muy útil para valorar por ejemplo superficies articulares. No obstante, tan sólo refleja tejido de alta densidad como el hueso y no permite valorar el cartílago ni otras partes blandas como los meniscos y ligamentos. En la práctica clínica habitual se utiliza muy poco para diagnosticar artrosis, aunque sí es útil para valorar secuelas de fracturas previas que afectan a una articulación. Figs. 7 y 8: Radiografías en proyección anteroposterior y lateral de una rodilla derecha sometida a artoplastia con protesis de rodilla. 39 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis La Resonancia Magnética Nuclear (RNM) no utiliza radiaciones ionizantes, por lo que resulta inocua. Mediante un aparato de imágenes de resonancia magnética (MRI son sus siglas en inglés) se obtiene una imagen basada en las propiedades físicas de los átomos de los tejidos. Consiste en crear un campo magnético intenso y homogéneo una vez colocado el sujeto del estudio en un cilindro diseñado para ello. Los protones de los núcleos celulares van a sufrir un proceso llamado excitación celular al recibir unas pulsaciones de ondas de radiofrecuencia. A continuación se suspenden las radiofrecuencias y los protones pasan a la fase de relajación. Este cambio de excitación a relajación hace que desde el interior del paciente se generen unas concretas ondas de radio que la máquina recoge y transforma en píxeles para crear una imagen. Dependiendo del tipo de tejido, estas imágenes cambian el tipo de onda y su frecuencia, lo que se conoce como densidad protónica. De esta forma se pueden crear mapas de imágenes de los tejidos sin utilizar radiaciones ionizantes. Esta técnica permite visualizar los tejidos blandos de las articulaciones y se emplea sobre todo para valorar lesiones asociadas de ligamentos o meniscos, puesto que tiende a subestimar la extensión real de lesiones del cartílago. Pero empleando la técnica adecuada puede ser extremadamente útil para evaluar el cartílago y sus lesiones (Delgado, 25). Una de estas técnicas de RMN novedosas es la inyección de sustancias de contraste. Concretamente, para evaluar el cartílago articular se emplea el gadolinio: delayed Gadolinium-Enhanced MRI of Cartilage (dGEMRIC). El gadolinio es un metal iónico que tiene cargas negativas y se inyecta por vía intravenosa, y que se une a las moléculas de glucosaminglicanos. Esto permite evaluar la concentración de proteoglicanos en el cartílago articular. Tiene gran utilidad en evaluar artrosis incipientes o leves, comúnmente en aquellas secundarias a una inestabilidad por lesión ligamentosa o meniscal (Young, 26). También permite medir la rigidez por compresión después de un tratamiento de reparación de cartílago (Kurkijarvi, 27). El Mapa T2 es otra técnica de resonancia magnética útil en el estudio de lesiones articulares, puesto que puede ser utilizado para medir el contenido de colágeno en el cartílago basándose en la densidad de agua del cartílago. Ha probado ser una técnica útil para determinar no sólo la degradación histológica del cartílago, sino también para establecer un mapa de la lesión de cara a optimizar una posible intervención quirúrgica (Maier, 28). 40 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis D. Artroscopia: Desde que en 1920 Eugen Bircher utilizó la artroscopia de rodilla como método diagnóstico, el uso de ésta como tal se ha considerado una de sus principales indicaciones. En los años 60 y 70 se popularizó su uso, sobre todo en los Estados Unidos de América, como herramienta diagnóstica fiable que superaba a cualquier técnica de imagen puesto que permitía evaluar tanto el cartílago como las partes blandas de la rodilla de forma directa. Al inconveniente de ser una técnica quirúrgica y por eso una técnica invasiva no exenta de riesgos y complicaciones, se le contrarresta el hecho de que resulta una eficaz herramienta de diagnóstico y terapéutica al mismo tiempo. Antes de que aparecieran las modernas técnicas de implantes de condrocitos o los injertos condrales, la artroscopia se hacía con el objetivo de evaluar la articulación y realizar un desbridamiento en ese mismo momento, y en caso de encontrar un defecto focal del cartílago realizar las microfracturas que serán descritas más adelante. Tan sólo en los Estados Unidos de América se realizan al año aproximadamente unas 200.000 intervenciones quirúrgicas relacionadas con el tratamiento de lesiones del cartílago, según un estudio del año 1997 (30). Esta patología se estimaba que podía afectar a casi un millón de pacientes tan sólo en ese país. De todas esas intervenciones, la mayoría eran artroscopias diagnósticas y desbridamientos simples. En las dos últimas décadas se han desarrollado novedosas técnicas artroscópicas que además permiten la evaluación, diagnóstico y tratamiento en otras articulaciones como la muñeca, el hombro, codos, tobillos y caderas. 41 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis 1.2.3.ClasificacióndelaArtrosis Clásicamente se ha dividido la artrosis en dos grandes grupos, primaria o idiopática y secundaria. Esta clasificación es siempre relativa pero resulta fácil de entender y facilita la comprensión de la patología por parte del personal médico y de los pacientes. A. Primaria o idiopática: Es la clásica forma en la que aparece sin factores desencadenantes conocidos, la típica presentación de la enfermedad que se muestra en la población más anciana. Puede ser localizada o generalizada. a. Localizada • Manos: Rizartrosis del pulgar, nódulos de Heberden y de Bouchard, artrosis erosiva interfalángica. • Columna vertebral: espondiloartrosis, interapofisaria, ligamentosa (hiperostosis anquilosante vertebral, disco-vertebral). • Cadera: Coxartrosis: excéntrica (superior), concéntrica (medial) o difusa (coxa senilis). • Rodilla: gonartrosis: uni-, bio tricomaprtimental. • Pies: Hallux rigidus, hallux valgus, artrosis talonavicular o subastragalina • Otras localizaciones: hombros, acromioclavicular, codos, etc.. b. Generalizada Afecta a 3 o más de las siguientes: • Pequeñas articulaciones periféricas y del raquis. • Grandes articulaciones y raquis • Mixta 48 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis - Fracturas del cartílago: Pueden ser consecuencia de las primeras, es decir, de las lesiones contusas, o bien secundarias a un traumatismo más intenso o repetido. Suponen la disrupción normal de la superficie articular del cartílago, que provocará una respuesta consistente en la proliferación de condrocitos y síntesis proteica de matriz. Estos esfuerzos no consiguen reparar la lesión, puesto que los condrocitos no son capaces de migrar hasta ella. - Fracturas osteocondrales: Esta lesión abarca el espesor completo del cartílago, llegando al hueso subcondral y afectando a éste. Esto provoca una hemorragia y a continuación un coágulo de fibrina que activará la respuesta inflamatoria. Si la lesión es extensa se reparte sobre la mayor parte de la superficie articular y termina alterando la naturaleza bioquímica del líquido sinovial. Las plaquetas liberan diversos factores de crecimiento, citoquinas y mediadores vasoactivos. La lesión ósea también provoca una rección destinada a la reparación, aportando más factores de crecimiento favoreciendo la neoangiogénesis y la invasión de fibroblastos y de células indiferenciadas procedentes de la médula ósea, que se diferenciarían en condrocitos y osteocitos funcionales. Los fibroblastos se encargan de los primeros pasos de la reparación, fabricando un fibrocartílago en el que predomina el colágeno tipo I en vez del de tipo II más propio del cartílago sano. Los cambios en la estructura molecular de este fibrocatílago que pueden ocurrir con el tiempo no mejoran este aspecto, por lo que el tejido resultante no consigue tener la misma calidad que el cartílago normal. 49 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Cambios asociados a la artrosis como enfermedad: Estas lesiones del cartílago van a aparecer en la artrosis, y lo que se entiende hoy en día como artrosis va a ser la respuesta biológica a estas lesiones. Predominantemente aparecerán en zonas de carga o sobreuso en diferentes articulaciones. La destrucción del cartílago articular comienza con una pérdida de los proteoglicanos de la matriz extracelular, mediada en parte por factores mecánicos y en parte por mediadores de la inflamación como la interleuquina 1 (IL-1) y el factor de necrosis tumoral beta (TNF-ß) entre otros. Cuando las condiciones fisiológicas normales del cartílago se alteran, la capacidad de los condrocitos para reparar el daño se ve sobrepasada, no consiguiendo evitar la degradación que desemboca en la artrosis (6, 7). Figura 10: Dibujo esquemático que compara una rodilla sana en la mitad lateral con una rodilla que sufre los cambios propios de la artrosis en la mitad medial. Imagen reproducida y traducida con permiso de la editorial propietaria del copyright, a partir del trabajo de Uth y Trifonov (107). 50 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis La agresión al cartílago desencadena la respuesta de incremento de síntesis por parte de los condrocitos. En la artrosis los condrocitos son activados, causando proliferación celular, formaciones de agrupaciones y un aumento en la producción de enzimas formadoras de matriz y enzimas degradantes de matriz extracelular. La disrupción del estado de reposo de los condrocitos se puede ver como una respuesta a la lesión, llevando a la remodelación de la matriz, maduración celular hipertrofiada pero incompetente y calcificación del cartílago. Uno de los primeros cambios que se aprecian a nivel del cartílago son edemas, que resultan de un aumento de la hidratación resultante del incremento de la síntesis de proteoglicanos. Citoquinas en la homeostasis del cartílago y su papel en la artrosis: Las citoquinas son proteínas solubles que se producen sobre todo en células del sistema inmune, aunque también pueden ser producidas en grandes cantidades por otras células, como las presentes en el tejido lipídico. Su efecto se dirige a diferentes tipos de dianas y se puede solapar con el efecto de otras citoquinas. Así, se puede desencadenar un mismo efecto por diferentes citoquinas, fenómeno llamado redundancia, o bien una sola citoquina puede provocar diferentes efectos, llamadas pleiotrópicas. Su mecanismo de acción puede ser: - Autocrino: liberación y recepción de la citoquina por parte de la misma célula. - Paracrino: una citoquina actúa sobre una célula vecina. - Endocrina: la citoquina es transportada por el torrente sanguíneo y actúa sobre una célula situada a distancia. Para recibir a una citoquina y que ésta pueda provocar algún tipo de efecto, las células poseen unos receptores que pueden estar localizados en la membrana o ser intracelulares (6, 8). 51 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Para ordenar el efecto de las principales citoquinas a nivel articular, van den Berg (5) propuso dividirlas en tres grupos principales: 1. Citoquinas líticas, como la interleuquina 1 (IL-1) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), que oprimen la síntesis de componentes de la matriz extracelular y estimulan a los condrocitos a liberar enzimas destructivas. 2. Citoquinas reguladoras, como la interleuquina 4 (IL-4) y la IL-6, que pueden atenuar la producción de enzimas destructivas. 3. Factores de crecimiento. Las principales enzimas que degradan la matriz que se pueden encontrar en una articulación artrósica son las agrecanasas (ADAMTS-4 y 5) y colagenasas, que pertenecen a la familia de las metaloproteinasas de la matriz (MMPs). En estadíos precoces de artrosis la degradación matricial corre a cargo de MMP-13 y de ADAMTS-5 (A Disintegrin And Metaloproteinase Motifs-5), estimuladas por la IL-1, y que degradan concretamente el agrecano. Seguidamente aumenta la colagenasa, en concreto la MMP-13, que es altamente eficaz para degradar el colágeno tipo II. Una vez que la red de colágeno se degrada, se alcanza una fase que ya no es reversible (9). La actividad de estas enzimas se controla por un regulador llamado TIMP-6 (6-Tiosina Monofosfato), que es un inhibidor tisular natural de las metaloproteinasas. Existen proenzimas que controlan la actividad de las enzimas, y necesitan ser activadas por plasmina y la cosecreción de TIMP-6, que forman complejos que inactivan la proteinasa. Esta actividad requiere de un balance controlado por los condrocitos, que a su vez dependen del ambiente químico y mecánico. Son influidos por hormonas locales y citoquinas o por hormonas sistémicas de estirpe estrogénica. Existen tres factores que han demostrado ser estimuladores de la producción de metaloproteinasas y proteínas séricas por parte de los condrocitos, y por tanto fomentar la degradación de la matriz. Se trata del Factor de Necrosis Tumoral (TNF), la citoquina Interleuquina-1 (IL-1) y el factor de crecimiento beta TGF-β (Transforming Growth Factor beta), que van a causar la pérdida de matriz por proteólisis. Los resultados de ésta aumentan la presencia de fibronectina y otros péptidos, que a su vez elevan los niveles de citoquinas, en especial de la IL-1, y 52 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis también en menor medida la IL-6. Los efectos de la IL-1 sobre el cartílago consisten en la activación de la liberación por parte de los condrocitos, así como de las células sinoviales, de metabolitos del ácido araquidónico, que son factores inflamatorios. Se sabe que la IL-1 se segrega en grandes cantidades en la grasa corporal, y que es por tanto una vía inflamatoria articular añadida que se puede dar en obesos, aparte de la sobrecarga mecánica. Otro efecto producido por la IL-1 y el TNFα es el aumento de monóxido de nitrógeno (NO). Se trata de una molécula muy reactiva poseedora de radicales libres, que pueden provocar daño tisular incapacitando a los condrocitos y favoreciendo la apoptosis celular. En el cartílago de pacientes con artrosis establecida, los niveles de monóxido nitroso se encuentran elevados. Con respecto al TGF-β, los condrocitos del cartílago sano muestran una sensibilidad muy escasa hacia este factor. Pero en el cartílago artrósico los condrocitos verán cambiado su fenotipo haciéndose sensibles al TGF-β. Este factor estimula por un lado la proliferación celular y por otro la síntesis de prostaglandinas. Hay que añadir que no son sólo los condrocitos los que reaccionan al estímulo del TGF-β una vez sensibilizados, sino que también lo hacen los osteoblastos. Se ha demostrado que la exposición repetida de articulaciones en ratones al TGF-β desencadena la aparición de osteofitos, que son un signo típico en la artrosis avanzada (16, 34). No obstante, la respuesta inflamatoria de este proceso degenerativo artrósico es mucho menos virulenta que la que se puede encontrar en otras patologías, como en las artritis sépticas o por depósito de cristales. También es un proceso muy prolongado en el tiempo. Una vez que la colagenasa comienza a descomponer el colágeno tipo II, los proteoglicanos acaparan una mayor cantidad de agua. Este incremento de hasta el 3% de hidratación del cartílago se puede apreciar en las fases tempranas de la artrosis, antes de que se puedan ver macroscópicamente las roturas y fibrilaciones condrales. A medida que la artrosis avanza, los condrocitos mueren. Por consiguiente dejan de sintetizar matriz extracelular. El colágeno pierde su estructura tridimensional y comienza a desintegrarse. Finalmente todos los componentes de la matriz disminuyen y también lo hace el contenido de agua del cartílago, repercutiendo negativamente en la respuesta a la carga mecánica y deslizamiento articular. 53 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis La superficie lisa y compacta del cartílago se pierde y aparecen las grietas, se vuelve áspera y rugosa. Esto conlleva a crepitación durante el movimiento, e incluso puede provocar que se desprendan fragmentos mayores de cartílago por el mal deslizamiento de las superficies articulares. Todo esto conduce a la exposición del hueso subcondral y a la afectación de la cápsula articular, los meniscos, la membrana sinovial, los tendondes y los ligamentos estabilizadores. Esta inestabilidad resultante supone un gran problema para el funcionamiento de la extremidad, debido a la incongruencia articular. El hueso también sufre los cambios degenerativos de la artrosis. El hueso tiende a adaptarse a las cargas mecánicas, aumentando su dureza y densidad en las áreas de mayor carga, y esto ocurre sin necesidad de lesiones en el cartílago y en condiciones normales se entiende como un fenómeno fisiológico no patológico. Pero en una articulación artrósica, los cambios inmunohistoquímicos en la misma, así como los cambios de carga mecánica y los secundarios a la inestabilidad, condicionan unos cambios adaptativos en el hueso subcondral y adyacente a las articulaciones. Estos cambios secundarios a la artrosis aparecen en la artrosis primaria cuando el la lesión condral se encuentra en fase avanzada, es decir, en fases tardías. En cambio, en las lesiones del cartílago secundarias, ya sea por fracturas u otras lesiones asociadas, estos cambios pueden apreciarse de forma precoz. La respuesta ósea va a producir los conocidos signos que se pueden apreciar en las imágenes radiológicas: esclerosis, pinzamiento, osteofitosis y quistes subcondrales. Como ya hemos visto, las clasificaciones más utilizadas de artrosis se basan en los hallazgos de los cambios óseos en las radiografías simples. Un mecanismo adicional para la adaptación del esqueleto se produce en los márgenes de la articulación y en inserciones tendinosas y ligamentosas, donde se añade hueso nuevo por osificación endocondral, recapitulando los mecanismos celulares de crecimiento esquelético y el desarrollo (56 Yorimitsu). Este proceso da lugar a la formación de osteofitos. La producción local de factores de crecimiento, incluyendo el factor β de transformación y la proteína morfogenética ósea-2 han sido implicados en este proceso. Aunque sigue ha- 54 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis biendo controversia respecto a su papel funcional, los osteofitos pueden servir para estabilizar la articulación en lugar de contribuir a la progresión de la artrosis (35). Por ejemplo, en la artrosis de la articulación trapeciometacarpiana de la mano, uno de los problemas y posible causa de la aparición de dicha degeneración articular es la tendencia a la subluxación por problemas de inestabilidad. El cuerpo humano reacciona aumentando la producción osteofitaria a veces cubriendo casi la totalidad de la articulación. En cambio, en pacientes con una rizartrosis en la que la inestabilidad no juega un papel tan importante, se apreciarán importantes cambios degenerativos, como la esclerosis y pinzamiento pero en cambio tendrán muchos menos osteofitos. En cuanto a los ligamentos y meniscos en la rodilla artrósica, éstos también sufren cambios degenerativos. Ambos están formados por una densa y resistente red de colágeno y una matriz extracelular, y por lo tanto también son vulnerables a los efectos proteolíticos de las enzimas que degradan el cartílago, puesto que éstas se distribuyen por todo el líquido sinovial. Los cambios patológicos en los meniscos, tanto en el envejecimiento y la artrosis tienen similitudes con los cambios observados en el cartílago articular, incluyendo la interrupción de la matriz, fibrilación, agrupaciones de células, la calcificación y la muerte celular. Existe una correlación significativa entre los cambios morfológicos graves de artrosis en el cartílago de la rodilla y los de los meniscos de las mismas articulaciones (Griffiths, 48). Se ha observado un aumento en la penetración vascular acompañado por un aumento de la densidad de los nervios sensoriales en los meniscos, que puede referirse a la capacidad de los meniscos como una fuente de dolor en la rodilla (36, 43, 44). Se ha observado que la inervación que acompaña a la angiogénesis que se da en fases avanzadas de la artrosis es responsable de una parte importante del dolor que sufren los pacientes. La sinovitis también se considera una de las principales causas de dolor, puesto que el tejido sinovial se hipervasculariza y en consecuencia se “carga” de terminaciones nerviosas que acompañan a los vasos sanguíneos, y los estímulos propios de la inflamación tisular como la IL-1, IL-6 y el TNF exacerbarán la respuesta sensitiva (46). 55 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Figura 11: Resumen esquemático de los principales factores involucrados en el proceso osteoartrítico en el tejido sinovial ( color naranja) , el hueso (ocre) y en el cartílago (azul). Reproducido y traducido con autorización de copyright, a partir del trabajo de Loesser, Goldring et al. (16). 56 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis 1.4 Tratamiento de la Artrosis Se trata de una de las patologías con mayor impacto en la sociedad actual, con una elevada incidencia y unos costes sociosanitarios inmensos. Como se ha comentado anteriormente (página 19), el coste derivado de forma directa de la artrosis equivale a más del 0’5% del producto interior bruto de España. Resulta muy difícil calcular el coste de lo que se deja de producir por pacientes impedidos por la enfermedad, en situación de baja o incapacitados por la misma. En la rodilla, la artrosis establecida se puede dividir clínicamente y radiológicamente en diferentes estadíos. Con el fin de poder determinar la mejor opción terapéutica para cada paciente es conveniente saber qué tipo de afectación articular es la que hay que tratar, si es tratable, y conocer las necesidades, las expectativas y las limitaciones de cada paciente. Existen lesiones del cartílago focales, que sí pueden ser tratadas con diferentes opciones quirúrgicas como veremos a continuación. Cuando se trata de una artrosis ya establecida, en la que el daño tisular al cartílago no es recuperable, hay que valorar si afecta a la totalidad de la articulación o sólo a una parte. En el caso de las rodillas, la artrosis puede ser unicompartimental si afecta a un solo compartimento. Se entiende por compartimento una división artificial de la rodilla, que ayuda a planificar el tratamiento definitivo. Las rodillas clásicamente se dividen en tres compartimentos: interno, externo y femoropatelar (65). El grado de afectación de un compartimento u otro depende de la estabilidad articular, de la morfología y alineación de las extremidades inferiores del paciente, de su complexión física, de su actividad física a lo largo de la vida y en el momento actual, así como de lesiones concomitantes o secuelas de lesiones antiguas. El compartimento interno es el que con mayor frecuencia presenta los primeros síntomas de la artrosis, y donde se aprecia el mayor número de lesiones de menisco. La artrosis precoz se ve más en pacientes que previamente han sufrido una lesión del menisco medial, habiéndose tratado o no con artroscopia. En el trabajo de Karlsson (33) en 2015 también se describe que en pacientes obesos se afecta con mayor frecuencia el compartimento medial de la rodilla en las fases iniciales de la gonartrosis. Cuando se afecta el compartimento anterior o 57 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis femoropatelar, el pronóstico en cuanto a remisión de la clínica dolorosa es peor, puesto que afecta negativamente al aparato extensor de la rodilla, y por ende a la recuperación funcional de la misma. El tratamiento de la artrosis de rodilla se basa en tres pilares fundamentales (a, b, y c) y uno en vías de desarrollo (d): a. Tratamiento preventivo b. Tratamiento médico c. Tratamiento quirúrgico d. Tratamiento genético y células madre 64 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis La artroplastia de rodilla con prótesis es un proceso no exento de complicaciones, puesto que es una cirugía agresiva, y se suele realizar en pacientes entre los 65 y 80 años de edad. Muchos de estos paciente padecen de enfermedades concomitantes que pueden aumentar el riesgo de complicaciones. Es importante elegir bien el momento de realizar la artroplastia, explorar bien al paciente y desanconsejar el procedimiento en caso de descubrir factores de riesgo que la contraindiquen. Algunas de las complicaciones pueden ser muy graves, como la anemización, la infección y las alteraciones tromboembólicas. Por esto es muy importante informar al paciente de su enfermedad, de su curso natural y de los procedimientos que hay para tratarla. No se deben menospreciar los riesgos y el paciente tiene la obligación de conocerlos. También es importante que el paciente tenga una buena predisposición de cara al proceso postoperatorio, que resulta clave para obtener un buen resultado final. Al tratarse de material no biológico que va a sufrir unas cargas y fuerzas derivadas del movimiento, las prótesis de rodilla también pueden sufrir fenómenos de desgaste o aflojamiento de algunos de sus componentes. No es infrecuente que tras un tiempo variable sea necesario realizar una segunda intervención quirúrgica, una cirugía de recambio de prótesis. Fig. 12: Componente femoral e inserto de polietileno, dos de los componentes de una prótesis de rodilla. 65 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Fig. 13: Exposición de la rodilla mediante un acceso anterior longitudinal para proceder a la artroplastia mediante prótesis. Fig. 14: Introducción de guía intramedular para realizar los cortes femorales. Apréciese el desgaste condral del cóndilo medial y la osteofitosis junto al índice del cirujano. 66 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Fig. 15: Cóndilos femorales después de su resección. Se puede ver el cartílago del cóndilo medial (a la derecha) dañado. Fig. 16: Platillo tibial después de ser resecado. En este caso el lado medial está a la izquierda, presentando un importante desgaste. 67 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Fig. 17: Rodilla izquierda con los cortes femoral y tibial, previo a la inserción de los componentes de la prótesis. Fig. 18: Antes de realizar el cierre de la herida quirúrgica, se aprecia la articulación con los componentes definitivos implantados. 68 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Técnicas actuales para el tratamiento de lesiones focales: A. Microfracturas: Esta técnica hace perforaciones subcondrales controladas en el foco de una lesión o defecto del cartílago articular, haciendo que elementos de la médula ósea como células mesenquimales y factores de crecimiento se puedan acumular en el defecto condral. Estas perforaciones dan lugar a la formación de un coágulo que durante los siguientes 6 a 12 meses se irá remodelando hasta formar un tejido de reparación fibrocartilaginoso. Por desgracia, éste se compone mayoritariamente por colágeno tipo I y se asemeja más a fibrocartílago que a cartílago hialino (compuesto sobre todo por colágeno tipo II). No tiene las mismas características de resistencia y elasticidad que el cartílago sano y resulta más friable y frágil, resistiendo peor a cargas compresivas o al rozamiento. No obstante, se trata de una técnica con muy poca morbilidad y más barata que cualquier otra técnica invasiva. Si se realiza correctamente tiene potencial para la mejoría sintomática. Además, está ampliamente documentada y existen numerosos estudios que presentan buenos resultados. Así por ejemplo Gobbi et al presentaron una serie de 109 casos tratados con esta técnica con resultados de mejoría objetiva y subjetiva tras un seguimiento medio de 72 meses (59). Las microfracturas alcanzan los mejores resultados en pacientes con lesiones focales aisladas de menos de 200 mm2 de superficie, con un índice de masa corporal (IMC: el peso en kilos dividido entre la altura en metros al cuadrado) menor de 30 y una edad menor de 40 años (Mithoefer, 60, 61). La técnica de microfractura se emplea con frecuencia como técnica de referencia para comparar otras técnicas de reparación del cartílago. Por ejemplo, Knutsen et al. (62) realizó un estudio en el 2004 sobre la efectividad del trasplante autólogo de condrocitos comparándolo con la técnica de microfractura, no encontrando diferencias significativas entre ambas técnicas. 69 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Existen numerosos estudios, como he mencionado, que hablan de las bondades y la reproducibilidad de las microfracturas, pero hay que mencionar que también tiene sus contraindicaciones como son la falta de compromiso o de posibilidad de un paciente a someterse al periodo de recuperación postoperatorio, que normalmente consiste en unas 6 semanas de descarga completa, pero realizando ejercicios de movilidad pasiva. B. Implantes de condrocitos autólogos Los implantes de condrocitos autólogos son un procedimiento que se ha desarrollado durante los últimos veinte años, tras la publicación inicial de Brittberg en 1994, y continúa en pleno auge. Consiste en la obtención de una pequeña cantidad (entre 100 y 300 mg) de tejido cartilaginoso sano de una zona articular exenta de carga, casi siempre durante un procedimiento de artroscopia inicial evaluadora. De este tejido recogido se obtendrán los condrocitos mediante un proceso de degradación enzimática, para a continuación someterlos al aislamiento, purificación y expansión antes de reimplantarlos en el foco de una lesión sintomática (Brittberg 63, Libera 115). La idea es que al utilizar condrocitos del propio paciente se consiga regenerar una superficie cartilaginosa sana y de buena calidad, con colágeno tipo II en más del 90%. La realidad no ha conseguido tal porcentaje de ese colágeno idóneo, variando en diferentes estudios desde 35% hasta 55%, pero sí que han demostrado superar cualitativamente cualquier resultado histológico de todas las demás técnicas, logrando un tejido biomecánicamente más eficaz que por ejemplo el fibrocartílago regenerado en lesiones similares reparados con microfracturas o condroplastias. Los resultados de éxito obtenidos en zonas de baja presión o baja fricción se acercan al 89%, según Peterson (64), pero en zonas como la femoropatelar la tasa de buenos resultados no consigue superar el 62%. Un problema importante que ha acompañado a esta técnica durante años es que resultaba difícil hacer que esos condrocitos implantados en la lesión se integraran adecuadamente en ella. Faltaba una especie de pegamento que les diera estructura 70 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis tridimensional y a la vez los mantuviera justo en el lugar deseado, evitando que se distribuyeran por toda la articulación como ocurría con los primeros intentos. Esta dificultad fue la que motivó el desarrollo de la segunda generación de injertos de condrocitos autólogos (“ACI” sus siglas en inglés de “Autologous Chondrocyte Implantation”), llamados “MACI” puesto que incluyen una matriz extracelular. Estos biomateriales están constituidos por colágeno tipo I, ácido hialurónico y colágeno tipo I/III, todos ellos formando un andamio membranoso para otorgar al grupo de condrocitos implantados una estructura tridimensional que los ordenara y además mantuviera en el lugar deseado (66). Algún estudio prospectivo ha documentado que los resultados clínicos son similares a la técnica de la primera generación sin matriz extracelular (67). C. Injertos osteocondrales Esta técnica consiste en realizar un injerto de tejido osteocondral, ya sea autólogo o heterólogo. A día de hoy sigue siendo la única técnica que consigue la reconstrucción con cartílago hialino puro. Los injertos autólogos, que obtienen el tejido casi siempre de la misma articulación a tratar pero de una zona donde su obtención no sea lesiva, se utilizan sobre todo para el tratamiento de lesiones pequeñas, de menos de 2 cm2. Los aloinjertos se definen como injertos de tejido similar de la misma especie animal, pero de un individuo diferente al receptor. Normalmente se obtienen de donantes cadáver y por tanto suelen ser de mayor tamaño. Técnicamente son más complejos y los requisitos médico-legales hacen que no se pueda hacer en cualquier centro asistencial. Mientras que los injertos autólogos tienen como principal limitación la lesión de la zona donante y su pequeño tamaño, los injertos aloinjertos tienen el riesgo de respuesta injerto contra huésped así como la potencial transmisión de enfermedades. Por esto, solamente pueden ser implantados una vez que se haya comprobado la esterilidad y ausencia de enfermedades transmisibles del injerto donante, y esto puede retrasar el proceso desde que se obtiene el tejido hasta que se pueda dar el visto bueno a implantarlo. 71 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis No se trata de una técnica que se realice con el fin de salvar una vida, por lo que normalmente estos injertos obtenidos de un cadáver que reúna las condiciones necesarias por edad, antecedentes y causa de muerte serán congelados. Se calcula que la viabilidad máxima de los condrocitos se logra mantener en injertos implantados como máximo a los 28 días de su obtención (68). Normalmente se obtiene en forma de semiesfera o cono con abundante hueso subcondral, que es el que se va a fijar al hueso receptor. Mosaicoplastia: Ésta es la técnica más extendida que utiliza los injertos condrales autólogos. Consiste en obtener múltiples pequeños injertos con un sacabocados de ambos lados de la zona proximal de los cóndilos femorales, evitando lesionar la superficie que articula con la rótula. Estos injertos con forma circular se colocarán uno a uno en la lesión a tratar en zona de carga, que previamente se habrá preparado hasta presentar hueso subcondral sano. Al colocar varios trozos de injerto se crea una especie de mosaico. A veces éste se cubre con una pieza de periostio a modo de red para evitar que se desplacen los injertos. Los resultados utilizando la técnica de mosaicoplastia descritos por autores como Hangody son favorables, sobre todo para lesiones aisladas en el fémur. Igual que con los condrocitos autólogos, los resultados menos buenos se describen en la zona femoropatelar (Hangody, 69, 70). La mosaicoplastia está bien extendida como tratamiento en lesiones focales del cartílago articular, con predominio de una población joven, sana y en relación con la práctica deportiva. Su uso también se ha extendido a otras localizaciones como el astrágalo, la cabeza femoral en la cadera y en el codo. Estas técnicas tradicionalmente se han reservado para paciente jóvenes, en su mayoría deportistas, con lesiones aisladas. La primera serie larga de resultados a medio-largo plazo con la técnica de aloinjertos fue la que presentó McDermott en 1985 (71), pero tan sólo el 56% de los pacientes obtuvieron resultados buenos o excelentes. Desde entonces, con la extensión y popularización del uso de esta técnica se han publicado diversos trabajos en los que la tendencia general mejora los resultados, pero a pesar de ello tampoco es una opción perfecta puesto que a largo plazo sigue teniendo fracasos y complicaciones (55). 72 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis 1.4.4 Expectativas, terapia genética y células madre La artrosis sigue siendo una patología muy prevalente en el mundo entero, y con la mayor longevidad de la población mundial su incidencia ha aumentado y la tendencia es que siga aumentando. Aunque no se trate de una dolencia con una gran mortalidad, sí que tiene una elevada morbilidad afectando a la calidad de vida de quien la padece. Cada vez se conoce mejor la enfermedad, y se están destinando numerosos recursos tanto en el ámbito público como en el privado a la investigación. Hoy en día existen diferentes técnicas que se pueden utilizar para tratar lesiones focales del cartílago articular con buenos resultados, como los implantes de condrocitos autólogos, los autoy los aloinjertos así como las microfracturas. No obstante, como se ha visto, y aunque con casi todas estas técnicas se alcanzan unos resultados satisfactorios, ninguna es perfecta y tampoco consigue la curación completa de la lesión. Tampoco son técnicas útiles para el tratamiento de la artrosis primaria que afecta a áreas extensas de las articulaciones, incluso a varias articulaciones, más propia de la población mayor. Hay grandes esperanzas en el tratamiento con células madre y en general con la ingeniería tisular, así como en la ingeniería genética experimental. Células madre mesenquimales Todas las técnicas empleadas en la actualidad para el tratamiento de lesiones del cartílago tienen sus puntos fuertes y sus puntos débiles. Ninguna ha demostrado la regeneración completa del tejido dañado. Los implantes de condrocitos autólogos a priori deberían dar lugar a un tejido cartilaginoso sano, pero la mayor parte de las veces sólo es capaz de generar cartílago de inferior calidad, debido sobre todo a la difícil movilización, diferenciación y proliferación de los condrocitos. Por esto se ha propuesto utilizar células madre mesenquimales multipotentes. Estas células son capaces de diferenciarse al linaje condral, y presentan las siguientes ventajas con respecto a los condrocitos: 73 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis - Se pueden obtener de una gran variedad de tejidos, evitando de esta forma causar más iatrogenia a un tejido ya dañado. - Son células abundantes desde el momento de su obtención. - Al contrario que los condrocitos, estas sí son fáciles de expandir in vitro. Las células madre multipotentes se diferenciarán en condrocitos en respuesta a estímulos condrogénicos específicos. Se ha logrado cultivarlos en cantidades grandes (72, 73). Finalmente, otra de las características más ilusionantes de cara al futuro es que estas células también exhiben potencial regenerativo y trófico, lo que podría hacerlas muy útiles para el tratamiento de patologías degenerativas del cartílago, incluso podrían prevenir la degeneración del cartílago en pacientes con artrosis. Las células madre se diferencian en totipotentes, pluripotentes, multipotentes y unipotentes. Las células madre totipotentes tienen la capacidad de crecer y dar forma a un organismo vivo completo. Las pluripotentes son capaces de formar diferentes linajes celulares a partir de los tres linajes embrionarios: ectodermo, endodermo y mesodermo, pero no son capaces de formar un organismo completo. Por unipotentes se entienden aquellas células madre que sólo darán lugar a un tipo de célula; también se llaman células progenitoras. Las células madre multipotentes sólo podrán formar células de su mismo linaje. Entre éstas destacan las hematopoyéticas y las mesenquimales. De éstas últimas se podrán formar, entre otros, osteocitos y condrocitos. Lo interesante es que dependiendo de en qué momento evolutivo de la célula mesenquimal se logre diferenciar su formación, podría dirigirse hacia una u otra célula. Por ejemplo, se podrían diferenciar células hacia condrocitos y otras hacia osteocitos, y crear de esta forma un grupo celular mixto que implantar. Esto serviría para poder tratar lesiones osteocondrales de forma combinada, facilitando la mejor integración de las células implantadas en el lugar del defecto porque los nuevos condrocitos serían potencialmente capaces de fijar el implante al hueso subcondral. 80 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Lo que caracteriza a estos modelos es un desgaste generalizado e intensivo del tejido cartilaginoso, siendo además modelos bastante constantes en el tiempo y que se pueden desencadenar de forma relativamente precoz. En cambio, los modelos de enfermedad espontáneos se desarrollan de forma muy lenta y dependen de desencadenantes no diversos y a veces desconocidos. A pesar de esto, son modelos que tienen utilidad para el estudio de la artrosis en humanos por su similitud en la enfermedad, y pueden aportar valiosa información para establecer estrategias para desarrollar diferentes estudios farmacológicos. No obstante, al ser tan lentos están sujetos a variaciones en el grado de incidencia o gravedad de la enfermedad, limitando de esta forma mucho su utilidad real. Para los modelos mencionados, tanto inducidos como espontáneos, existen dos grupos de animales: pequeños y grandes. Entre los pequeños se utilizan sobre todo ratones y ratas, conejillos de indias y conejos. Los animales grandes suelen ser sobre todo perros, ovejas, primates y caballos (80, 82, 87, 88, 89). Los modelos animales están limitados por diferencias específicas de especies en cuanto a metabolismo, anatomía y diferentes formas de reaccionar frente a determinadas sustancias. En los modelos de animales pequeños el lapso de tiempo para el estudio del efecto de la sustancias aplicadas suele ser muy corto, desde pocas semanas a como mucho uno o dos meses. Los animales grandes son por esto preferibles, pero necesitan de mayor cantidad de medicación y su mantenimiento es más complejo, encareciendo notablemente el estudio. A pesar de estas limitaciones, los estudios con animales son muy valiosos e imprescindibles antes de poder comenzar con estudios en humanos. 81 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis 1.5.2. El modelo “Pond-Nuki” y el modelo “Moskowitz” Estos dos modelos animales son los más empleados para simular artrosis. El modelo “Pond-Nuki” fue desarrollado por los autores Pond y Nuki en 1973 (86). Provocaban una inestabilidad articular mediante la rotura del ligamento cruzado anterior de la rodilla en perros. De esta forma aparecían a nivel del cóndilo femoral medial erosiones, fibrilaciones y roturas del cartílago articular, comprobado mediante análisis histológicos. Posteriormente demostraron la proliferación de condrocitos y la aparición de osteofitos. Ese mismo año Moskowitz et al. (88) presentaron el modelo “Moskowitz” que a diferencia del modelo anterior, realiza una meniscectomía del menisco medial en la rodilla del perro. Esto también desestabiliza la articulación y además altera las fuerzas biomecánicas en la rodilla durante la marcha, desencadenando finalmente un cuadro de artrosis precoz similar a la de los seres humanos que han sufrido esta lesión. Moskowitz demostró que en el plazo de entre 4 y 8 semanas se instauraba la degradación del cartílago. El resto del proceso artrósico es similar a los demás modelos. 1.5.3. El modelo animal de este trabajo Para este trabajo se escogió un modelo animal experimental estructural de artrosis, en el que se pretendía desarrollar una degeneración artrósica de la matriz extracelular del cartílago en la rodilla. El animal elegido fue el cerdo. Estudios recientes han determinado la validez del cerdo como modelo animal válido y reproducible para el estudio de enfermedades articulares: Kiapour et al demostraron en 2015 que el uso de minipigs era válido para valorar factores predisponentes, fisiopatológicos y relacionados con el sexo del sujeto en lesiones del ligamento cruzado anterior (90). Al lesionar este ligamento de forma iatrogénica demostraron la aparición de cambios degenerativos artrósicos en las rodillas de los cerdos con correlación con lo que ocurre en el ser humano. 82 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis En un trabajo de 2011, Verma et al. (91) repasan en la literatura la utilización de minipigs en diferentes trabajo científicos. Explican que de los numerosos modelos animales disponibles para los estudios proteómicos o sobre medicina molecular, sólo un pequeño número ha sido utilizado con éxito en la comprensión de la biología humana. El mayor número de estudios ha utilizado a roedores de forma satisfactoria, pero existen dudas acerca de su idoneidad a la hora de imitar la biología humana. Por otro lado, los cerdos presentan mayor similitud con nuestra especie humana en cuanto a tamaño, forma y fisiología, y se ha utilizado como modelo de mamífero importante para muchos estudios diferentes, obteniendo resultados extrapolables al entendimiento de la patología humana, como por ejemplo en estudios sobre los xenotrasplantes, las enfermedades cardiovasculares, la hemodinámica, la nutrición, las funciones metabólicas generales, trastornos digestivos, enfermedades respiratorias, diabetes, enfermedades renales y de la vejiga, la toxicidad específica de órganos, dermatología y en secuelas neurológicas. Además de esto, se ha descubierto que el genoma porcino y el humano comparten una parte muy grande (92). Esto se une a la mencionada similitud en cuanto a tamaño y forma, haciendo del cerdo un modelo ideal para el estudio de patología musculoesquelética. Por este motivo, los cerdos también se han utilizado con éxito para trabajos acerca de remodelación ósea, plasma rico en plaquetas y osteointegración de diversos implantes como publicaron, entre otros, los grupos de Fürst, Watzek y Sanroman (93, 95). Wancket realiza un metanálisis en 2015 (96) de los distintos modelos animales utilizados para el estudio de implantes óseos y destaca las ventajas del cerdo como modelo animal por su biocompatibilidad, por ser lo suficientemente grande para hacer estudios trasladables a patología humana y por su facilidad de manejo. Esto mismo se desprende de otros trabajos que utilizan el mismo tipo de minipig y manejo del mismo que el presente trabajo (Thams et al. 97, 98). Además, en comparación con otros animales, se considera que los cerdos son menos susceptibles a sufrir complicaciones médicas después de una intervención quirúrgica, aunque esto no está demostrado (94). 83 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Los cerdos empleados en nuestro estudio: Tras evaluar las diferentes alternativas y su disponibilidad, se decidió utilizar para este estudio a cerdos de la variante Minipig. Se emplearon 10 cerdos domésticos (Sus scrofa domesticus) de la raza Minipig, resultante del cruce entre el cerdo barrigón vietnamita y el minipig de Minnesota. Su edad media era de 5 años y su peso medio era de 148 kilogramos. Fueron alimentados con una dieta rica en calorías y se les proporcionó acceso a agua en todo momento. Durante el estudio permanecieron en recintos de entre 4 y 10 m2 aproximadamente, al principio en parejas y una vez tratados de forma individual. Fig. 19: El primer minipig del estudio, justo después de haber sido anestesiado y antes de proceder a la artrotomía de rodilla. 84 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Fig. 20: Los animales en su recinto. Para la degradación de la matriz extracelular del cartílago se eligió la enzima colagenasa, que se obtiene de la bacteria Chlostridium histolyticum, tipo II, y distribuido por Merck (Darmstadt, Alemania). La enzima colagenasa es una metaloproteinasa de matriz que contiene zinc y degrada el colágeno a base de romper sus enlaces proteicos. Puede actuar contra diferentes tipos de colágeno: tipo I, II, III, IV y V. La colagenasa procedente de la bacteria gram positiva Clostridium Histolyticum se compone de una combinación fija de dos enzimas sinérgicas pero de diferente clase. Su codificación depende de dos genes diferentes: colG para la clase I (AUX-I) y colH para la clase II (AUX-II). La clase I hidroliza los terminales carboxi y amoni del colágeno, mientras que la clase II hidroliza el interior del colágeno, actuando de esta forma ambas enzimas de forma eficaz y sinérgica (163). La colagenasa de Clostridium Histolyticum (CCH) tiene a día de hoy diversos usos terapéuticos. El más popular actualmente es su empleo para el tratamiento no quirúrgico de la enfermedad de Dupuytren en las manos, disolviendo el cordón fibroso que impide la correcta extensión de los dedos. También se utiliza en el tratamiento de la enfermedad de Peyronie en el pene y la enfermedad de 85 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Ledderhose en la planta del pie. Además de esto, se ha empleado con éxito para el desbridamiento enzimático y limpieza de heridas complicadas (164). Su uso en el ser humano no está exento de complicaciones, aunque hasta ahora sólo se han descrito complicaciones a nivel local. El problema es que al tratarse de proteínas biológicas no endógenas van a dar lugar a la producción de anticuerpos, y se están investigando posibles reacciones cruzadas con otras metaloproteinasas endógenas humanas. Basándonos en los estudios de Kikuchi et al. (89), en los que provocaban artrosis en rodillas de conejos mediante la inoculación intraarticular de colagenasa, hicimos un cálculo de la concentración de colagenasa a 40 miligramos por mililitro de suero salino (cloruro sódico) con una actividad enzimática de 269 unidades internacionales por miligramo (Unit/mg). Los animales fueron anestesiados en un ambiente estéril, concretamente un quirófano de cirugía veterinaria, y en ese momento se administró 1 mililitro de solución de colagenasa en la rodilla derecha. Después de un tiempo promedio de 4 meses, los animales fueron sacrificados para su estudio histológico. Fig. 21: Otro individuo en el antequirófano tras ser anestesiado 86 1. Introducción Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis 1.6. Objetivos El objetivo original de este estudio era provocar y probar cambios artrósicos en las rodillas de minipigs a través de inyecciones intraarticulares de colagenasa. Para ello se optó por utilizar un modelo de investigación con animal grande y cambios estructurales inducidos por la mencionada enzima colagenasa. Después de un tiempo de reposo de 4 meses, los animales fueron sacrificados y sus articulaciones examinadas macroscópica-, inmunohistoquímicae histológicamente. El hecho de haber desencadenado artrosis en las articulaciones tratadas se demostró mediante tinciones histológicas e inmunohistoquímicas, analizando: - los componentes de la matriz extracelular y los marcadores condrogénicos como el colágeno 1, 2 y 3, agrecano y S-100 - factores de crecimiento como el Factor de crecimiento insulino-like-1, Transforming Growth Factor-β - Citoquinas degenerativas como la interleuquina-1 y el factor de necrosis tumoral-α - Enzimas degradantes como la agrecanasa-2 (ADAMTS-5) y la colagenasa-3 (MMP-13) - La apoptosis celular demostrando la presencia de caspasa-3. Por otra parte se investigó la posibilidad de desarrollar transplantes tridimensionales de condrocitos procedentes del cartílago de la rodilla sana de los cerdos. Para ello se realizó una biopsia de tejido condral con el fin de aislar condrocitos, multiplicarlos en monolayer y poder obtener finalmente implantes tridimensionales de condrocitos porcinos. Las células del cartílago obtenido fueron analizadas y se determinó su vitalidad y su capacidad de multiplicación, comparándolas con condrocitos humanos. Se crearon los preparados tridimensionales de condrocitos y sus características fueron comparadas con las de los humanos. El objetivo final es poder responder a la pregunta de si se pudo desencadenar la artrosis y si los resultados obtenidos son comparables con otros estudios animales así como con la situación de esta patología en seres humanos. 87 2. Material y métodos Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis 2. Material y métodos 2.1 Manejo de los animales Se emplearon 10 cerdos del tipo “Minipig”, fruto del cruce del cerdo barrigón vietnamita y el minipig de Minnesota. Estos animales fueron alimentados con una dieta rica en calorías y con abundante agua, que tenían a su alcance en todo momento. Antes de ser intervenidos permanecieron en grupos de tres en unos establos de entre 8 y 10 metros cuadrados, techados. Después del proceso invasivo pasaban a recintos individuales, algunos de 4 a 5 metros cuadrados y otros en los que habían estado previamente. En el plazo de aproximadamente un mes los cerdos fueron anestesiados mediante relajación e intubación endotraqueal en un quirófano para el procedimiento quirúrgico, que consitía en primer lugar en una artrotomía abierta de la rodilla derecha del animal. Se decidió que todas las rodillas tratadas fueran las derechas, para posteriormente evitar errores de etiquetado o almacenaje. Primero se procedía a la obtención de una biopsia tisular de cartílago de una zona exenta de carga articular, para inmediatamente proceder al procesado de la muestra para el aislamiento y posterior cultivo tisular de condrocitos. A continuación, en el mismo acto quirúrgico se inyectó una dosis de colagenasa diluida en la rodilla, procediendo al cierre por planos de la herida quirúrgica. La colagenasa empleada procede de de la bacteria Clostridium Histolyticum, tipo 2 (Merck, Darmstadt, Alemania). Los animales recibieron profilaxis antibiótica de 2 gramos de Augmentine (Ratiopharm, Ratiopharm España) intravenoso. El manejo postquirúrgico fue estandarizado siguiendo el protocolo habitual de la clínica para animales de este tamaño sometidos a una intervención quirúrgica. Se alimentó de forma habitual y con abundante agua a los cerdos. Se realizaban controles de su estado general diarios. Las heridas quirúrgicas se revisaron con la misma regularidad. Finalmente, tras un periodo de 4 meses, los animales fueron sacrificados para su posterior estudio. 88 2. Material y métodos Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Este estudio fue autorizado por el comité de ética del Hospital Gómez Ulla de Madrid, España, y fue supervisado por el Profesor Dr. Fidel San Román, Catedrático de Cirugía de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid, España. Fig. 22: El equipo quirúrgico al inicio del trabajo. 89 2. Material y métodos Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Fig.23: Preparando el campo quirúrgico, rodilla derecha del cerdo número 3. Fig.24: Preparando el sistemia de isquemia previa a la artrotomía. 96 2. Material y métodos Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis 2.2.6 Elaboración de los agregados tridimensionales de condrocitos Como se ha comentado, para facilitar la implantación y el manejo físico de los condrocitos cultivados, éstos deberán poder ser transformados en esferas tridimensionales, que realmente acabarán formando una estructura implantable en la lesión. Una vez conseguido un cultivo celular satisfactorio y habiendo logrado la confluencia tras el cuarto subcultivo, se procedió a elaborar los agregados tridimensionales. Para ello se sembraron 2 x 105 de células meniscales, procedentes de biopsia de cóndilo sano previo al tratamiento con colagenasa, por cada well en una placa de 96 wells, que previamente había sido revestida con agarosa al 2%. La agarosa es un producto natural que forma una matriz inerte y no tóxica, que permite formar geles ideales para el cultivo celular. Se trata de un polisacárido de galactosas alfa y beta y se obtiene de algas. De esta forma, las células sembradas se agregan formando unas estructuras tridimensionales esféricas. Los cambios de medio de cultivo se hacían de la misma forma que en los pasos previos: para los condrocitos humanos medio de cultivo con 10% de suero humano procedente de pool, y para los condrocitos porcino medio de cultivo con 10% de suero autólogo. Una vez cada semana se realizaba una fotografía de los agregados, y dos veces por semana se realizaban comprobaciones morfológicas. Al mismo tiempo se determinaba el tamaño de cuatro esferas, escogidas aleatoriamente. Para ello se empleó un microscopio de contraste de fases, que permite observar células sin colorear y es especialmente útil para ver células vivas. Se mide el tamaño en unidades oculares micrométricas (UOM), que con el uso del objetivo de 5 aumentos corresponden 50 UOM = 990 μm; de aquí se obtiene el factor F = 19,8 (990 μm/ 50 UOM). Para determinar el tamaño de los agregados celulares se multiplican los UOM medidos con el factor F. 97 2. Material y métodos Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis 2.3 Histología e inmunohistoquímica Una vez realizada la intervención quirúrgica sobre la rodilla derecha de los cerdos, que consistía en la realización de una biopsia condral de una zona exenta de carga, así como la inoculación de la enzima colagenasa, éstos fueron sacrificados transcurridos 4 meses. Hasta ese momento, los animales permanecieron en recintos techados e individuales. Fueron alimentados e hidratados en abundancia, las heridas quirúrgicas fueron supervisadas y curadas varias veces a la semana. No requirieron retirada del material de sutura puesto que las heridas fueron cerradas con hilo reabsorbible tipo vicryl rapidR. El sacrificio del animal se realizó siguiendo las normativas de la CE (Directiva del Consejo 93/119/CE) (Comisión de las Comunidades Europeas 1993) y las regulaciones nacionales sobre métodos de sacrificio, así como los estándares éticos previstos por el comité deontológico del Hospital Gómez Ulla de Madrid, España. Los animales fueron sedados en su recinto habitual por sus cuidadores. Posteriormente fueron transportados al quirófano, donde recibirían el eutanásico de uso veterinario T-61 (Merck) por vía intravenosa. Cuando se confirmó la muerte del animal se procedió a realizar los cortes necesarios para obtener las dos rodillas del cerdo. Esto se realizó en el ambiente estéril de quirófano, para minimizar el riesgo de contaminación de las muestras. Las muestras fueron lavadas con PBS, guardadas en contenedores estériles y debidamente etiquetadas. Se transportaron en medio refrigerado de forma urgente al laboratorio donde se completaría el procesado de las muestras. Una vez transportadas hasta el laboratorio donde se sometería al análisis histológico, las muestras fueron sacadas de su embalaje y tratadas con las más estrictas medidas de asepsia. En primer lugar, las muestras fueron sometidas a un proceso de descalcificación, corte, fijación, tinción y finalmente al estudio microscópico. 98 2. Material y métodos Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Fig. 29: Detalle de una rodilla tratada con colagenasa en el proceso de limpieza de la pieza tras el sacrificio del animal. Se puede apreciar macroscópicamente la alteración de la superficie cartilaginosa de la zona de carga de la articulación. 2.3.1Descalcificación Para descalcificar las muestras se empleó una solución titriplex, que provoca la formación de quelatos hidrosolubles de calcio, que resultan fáciles de lavar sin dañar el tejido. Es un proceso lento, que dura entre 10 y 20 semanas, dependiendo del tamaño y del estado de la muestra. La solución de titriplex se cambiaba tres veces a la semana, y las muestras se incubaban a 37º en un baño de agua. 2.3.2 Cortes de las muestras de tejido porcino Las muestras de tejido procedente de los cerdos, correspondiendo a dos rodillas por cada animal, ascendían a 20 rodillas, cada una con dos cóndilos femorales, que era la parte de la articulación que se decidió estudiar. La mitad de las 99 2. Material y métodos Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis muestras correspondían a cóndilos tratados con colagenasa y la otra mitad a las muestras control, que en este estudio decidimos llamar cóndilos control. Los cóndilos tratados con colagenasa serán llamados de esa forma o como cóndilos artrósicos a lo largo de este trabajo. Las muestras de tejido eran demasiado grandes para su estudio histológico, por lo que fueron sometidos a cortes que dividían cada cóndilo femoral en varios segmentos. El número de piezas obtenidas por cada cóndilo variaba en función del tamaño de cada animal. Así, por ejemplo, del animal nº1 se obtuvieron 6 trozos de cóndilos tratados con colagenasa, mientras que en el animal nº2 se obtuvieron 8 trozos. Fig. 30: Detalle de una muestra una vez cortada para su estudio y procesado. Se aprecia la superficie articular cartilaginosa y el hueso subcondral. 100 2. Material y métodos Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis 2.3.3Fijacióneinclusiónenparafinadelasmuestras Después de someter las muestras al corte y descalcificación, había que fijarlas. Esto significa: detener los procesos que se desarrollan en el interior de las células para prevenir y detener la autolisis, la putrefacción y descomposición. Para lograr esto se empleó formalina para el entrecruzamiento de las proteínas. Para fijar las muestras se usó Histofix (Roth, Karlsruhe, Alemania). Cada muestra se dejó fijando durante la noche. A continuación se realizó la deshidratación de las muestras, mediante una serie de etanoles de gradiente ascendente: primero con etanol de 70%, dos veces durante 45 minutos a 50º C). Después se repitió con un etanol de 80% (dos veces 45 minutos a 50º), luego con etanol de 96% dos veces durante 60 minutos a 50º. Finalmente sometió a este proceso con etanol absoluto una vez durante 2 horas a 50º y otra vez durante toda la noche a temperatura ambiente. El siguiente paso consistía en incubar cada muestra durante una hora con xileno para después incluir las muestras en parafina durante toda la noche. El xileno, también llamado xilol o dimetilbenceno, es un disolvente cuyo uso en la histología consiste en tornar transparentes las muestras para facilitar su observación a la luz del microscopio. Se suele utilizar en los últimos pasos del preparado de las muestras. La parafina desplaza el xileno, por lo que por la mañana se cambió la parafina una vez más antes de la inclusión final. En cuanto la inclusión final estaba hecha, las muestras fueron almacenadas inmediatamente a -20º C. 2.3.4Cortesultrafinosdelasmuestras El almacenaje de las pruebas a -70º permitió realizar unos cortes óptimos con un grosor de 4 μm. Para ello se utilizó un micrótomo rotacional (Modelo 2065 Supercut de Leica, Solms, Alemania). Las piezas cortadas fueron depositadas en un recipiente con agua a 40º C para que se estiraran. Luego fueron colo- 101 2. Material y métodos Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis cadas en portaobjetos de microscopio y se dejaron durante 2 días a temperatura ambiente para que pudieran secarse. 2.3.5Desparafinadoyrehidratación Para que los cortes pudieran ser examinados histológicae inmunohistoquímicamente, debían ser previamente desparafinados y después rehidratados. Primero se bañaron los cortes en xileno dos veces durante 5 minutos para retirar la parafina. La rehidratación se hizo aplicando una serie de gradación descendente de etanoles, justo lo contrario del proceso de deshidratación. Comenzando con 3 minutos de etanol absoluto, bajando con etanol 96%, 80%, 50% hasta finalmente bañar las muestras en agua destilada, también durante 3 minutos. 2.3.6 Tinción de hematoxilina y eosina La tinción con hematoxilina y eosina es una de las más populares para el estudio histológico. La hematoxilina es catiónica y básica, por lo que tiñe estructuras celulares que sean ácidas o basófilas. La eosina hace lo contrario gracias a su naturaleza ácida. La hematoxilina tiñe en color azul y púrpura, y las estructuras por las que tiene afinidad son ácidas, como los núcleos celulares. La eosina prefiere medios básico o alcalinos, proporcionando un color rosáceo, como por ejemplo el citoplasma. Al concluir el proceso de desparafinado y rehidratado, los cortes fueron bañados durante 4 minutos en un baño de hematoxilina, luego lavados con agua destilada por tres veces y dejados en remojo para adquirir el característico tono azulado. Después se se incubaron durante 20 minutos en eosina, tras lo cual fueron nuevamente lavados con agua destilada y sometidos a un nuevo proceso de deshidratación con una escala ascendente de etanoles, como ya hemos visto previamente. 102 2. Material y métodos Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Los cortes con xileno fueron incorporados en bálsamo del Canadá y cubiertos con una hoja de vidrio sobre el portaobjetos. 2.3.7 Tinción de Masson-Goldner También llamada tinción tricrómica de Masson, está pensada para teñir tejido conectivo y se compone de tres colorantes diferentes, que se aplican uno tras otro sobre el tejido, permitiendo que cada uno aporte una coloración determinada para cada tipo de tejido diferente. El proceso de tinción de las muestras consistió en el desparafinado con xileno y la rehidratación con la escala descendente de etanoles. Después, los cortes fueron sumergidos por 15 minutos en la tinción de hematoxilina férrica de Weigert, para a continuación lavarlos con agua destilada. Después fueron sometidos a la tinción con los tres soluciones que componen la tinción tricrómica de Masson. Al finalizar, se procedió a la deshidratación de los cortes y a su fijación con bálsamo del Canadá para preparar los portaobjetos de cara a su visualización microscópica. 2.3.8 Tinción Safranina-OFast Green Esta tinción es la combinación de los colorantes Safranina-O, Fast Green y hematoxilina férrica de Weigert. La Safranina-O (también llamada rojo básico 2) tiñe de rojo oscuro los núcleos celulares de determinadas bacterias, pero en estudios histológicos como el nuestro tiene una utilidad añadida: al ser básica, este colorante se une a estequimétricamente a los mucopolisacáridos (glucosaminoglicanos), que son ácidos. Concretamente, cada molécula de colorante se une a un grupo de glucosaminoglicanos con carga negativa. De esta forma se pueden extraer datos cuantitativos de la cantidad de glucosaminoglicanos. 103 2. Material y métodos Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis El hueso se tiñe de verde con el colorante Fast Green o Verde Rápido FCF, que se une a las moléculas de colágeno presentes en el hueso. Este colorante también se usa ampliamente en la industria alimentaria como colorante, en repostería y para elaborar gominolas; en Europa se denomina con el código E-143. La hematoxilina férrica de Weigert es utilizado en este caso para cromar los núcleos celulares, por su resistencia y estabilidad frente a los ácidos. La safranina-O es hidrosoluble, por lo que tras las tinciones los cortes sólo podían ser aclarados brevemente con agua antes de proceder a la deshidratación con etanoles y xileno y fijarlos con bálsamo del Canadá sobre un portaobjetos. 2.3.9 Preparación de las muestras en formol Los cortes histológicos parafinados fijados en formol primero se desparafinaban y rehidrataban. El formol hace que en los tejidos se forme un entrecruzamiento de las proteinas, enmascarando los antígenos presentes. Para que pudiera ocurrir una reacción antígeno-anticuerpo, había que realizar un desenmascaramiento de los antígenos mediante enzimas proteolíticas o tratamiento con microondas. 2.3.9.1 Pretratamiento con tripsina Este fue el método empleado con la mayor parte de los preparados inmunohistoquímicos. Con esta enzima se descubren los anticuerpos dirigidos contra el TGFβ , agrecano, S-100, ADAMTS-5, MMP-13, colágeno tipo 1 y tipo 3, y el IGF-1. Después del desparafinado y rehidratado de los cortes, las muestras sobre el portaobjetos fueron rodeadas con un rotulador hidrófobo (tinta grasa), evitando que se mezclen o se pierdan líquidos entre las dos muestras sobre el portaobjetos. En este método se utilizaba una tableta de tripsina, cuya masa era de 1 mg. La pas- 104 2. Material y métodos Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis tilla se disolvió en 1 ml de agua destilada y precalentada a 37º, para a continuación regular el ph hasta 7’8. Los portaobjetos se colocaron sobre una placa caliente a 37º y se aplicó la solución de tripsina, dejando que incubaran durante 15 minutos. Luego se retiraba la solución de tripsina y se lavaron los cortes en tampón Tris para regular el ph. 2.3.9.2 Pretratamiento con hialuronidasa y pronasa Este método se utilizó con anticuerpos anti-colágeno tipo 2. El método es parecido al descrito anteriormente en el pretratamiento con tripsina. En este caso se aplica primero la hialuronidasa disuelta en PBS a ph de 5’5 y después la pronasa a ph neutro de 7’4, incubando los portaobjetos durante 30 minutos en cámara húmeda a temperatura ambiente. 2.3.9.3 Pretratamiento con Pronasa Este proceso encontró utilidad para los anticuerpos anti interleuquina-1. Tras el desparafinado y rehidratado, tal como se ha explicado con anterioridad, se rodearon las muestras sobre el portaobjetos con un círculo graso con un rotulador de tinta hidrófoba. Se disolvieron 0,05 mg de pronasa en tampón Tris, que luego se aplicaron sobre los cortes. Se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente en un espacio húmedo. Después se retiró la solución y se sometieron a lavado con tampón Tris. 2.3.9.4 Pretratamiento con tampón de citrato Este era el método empleado para determinar la caspasa 3, para el estudio de la apoptosis de los condrocitos. 105 2. Material y métodos Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Para confeccionar el preparado de tampón citrato se utilizó una combinación de dos soluciones, una de ácido cítrico y otra de citrato sódico. Una vez conseguido el tampón de citrato, fue calentado a 37ºC. A continuación se pasó a un recipiente adecuado (cápsula de cristal) para microondas en el que ya estaban los portaobjetos con las muestras. Dicha cápsula fue introducida en el microondas y se calentó hasta la ebullición. Se retiró la cápsula y se dejó enfriar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después se lavaron los portaobjetos nuevamente con tampón Tris y en este caso fue entonces cuando se aplicó el círculo con rotulador graso hidrófobo. 2.3.10 Tinciones inmunohistoquímicas La unión antígeno-anticuerpo se puede detectar generalmente con ayuda de un anticuerpo secundario marcado, una inmunoglobulina procedente de una especie animal diferente a la del anticuerpo primario. Puede reconocer específicamente el tipo de inmunoglobulina al que pertenece el anticuerpo primario. Esos anticuerpos secundarios pueden estar marcados con biotina, que es una enzima, o con un fluorocromo. En nuestro trabajo se empleó el método LSAB (Labelled-Streptavidin-Biotin-Method), que se basa en la afinidad entre la estreptoavidina y la biotina, que se une covalentemente al anticuerpo secundario. La glicoptroteina Avidina posee 4 nexos para la vitamina biotina. Por cada anticuerpo se unen 150 moléculas de biotina. De esta forma, al anticuerpo primario ligado a su antígeno se une el anticuerpo secundario biotinilizado. A éste último se une el complejo estreptoavidina-biotina marcado con un trazador enzimático, en este caso con fosfatasa alcalina, puesto que ésta es capaz de actuar sobre un gran número de cromógenos que pueden aportar una mayor variedad de colores. Este método LSAB es muy sensible. Tras el desparafinado y la rehidratación, se sometió a los cortes histológicos a su correspondiente preparación para el procesado con el método LSAB. Una vez preparados, los cortes fueron lavados con tampón Tris. Todos los pasos siguientes se realizaron en una cámara húmeda para evitar que los cortes pudieran secarse. 112 3. Resultados Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis 3.1.2 Valoración morfológica de los trasplantes tridimensionales 3.1.2.1 Valoración de los trasplantes de condrocitos porcinos Al concluir el cultivo celular en monocapa, se realizó la cosecha y contaje de los condrocitos porcinos. Se obtuvieron suficientes células para confeccionar 312 esferas tridimensionales de condrocitos porcinos. Al comienzo del cultivo tridimensional, se formaban grandes agregados redondos de condrocitos porcinos. En el centro tendían a ser translúcidos y más compactos en los bordes. Rodeando al agregado se podía ver un ribete que se supone que contenía restos de células muertas, detritus y algunas células sueltas que no consiguieron adherirse a las del agregado. Pasados 4 días, el tamaño de esta esfera era de 1351,5 μm x 1238 μm. Transcurridas dos semanas, se podían observar otros agregados celulares más pequeños y compactos, tanto en el centro como en los bordes. Sus límites eran lisos. A su vez, el ribete celular que rodeaba el gran agregado principal era cada vez más denso, y poco a poco se apreciaba como en su interior se formaban nuevos pequeños agregados celulares esferoidales. El tamaño del agregado central pasadas 4 semanas era de 663 μm x 619 μm, es decir, que era más pequeño, perdiendo cantidad de células en pos del aumento de densidad y tamaño del ribete celular que lo rodeaba, y donde se formaban los pequeños agregados redondos lisos y compactos. 3.1.2.2 Valoración de los trasplantes 3D de condrocitos humanos. Los trasplantes 3D de condrocitos humanos se fabricaban del mismo modo que sus homólogos porcinos, pero a diferencia de éstos, los agregados celulares que se formaban al principio eran compactos en los bordes y en el centro, no sólo en los bordes. No se formó el ribete celular ni las miniesferas celulares que sí se observaron con los condrocitos porcinos. A los 4 días de cultivo las esferas tenían un tamaño medio de 886 μm x 871 μm. Dos semanas después los agregados eran más pequeños, redondos y presentaban bordes li- 113 3. Resultados Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis sos y una apariencia más compacta. En algunas pero no en todas las esferas se podía observar la formación de hilos de proteína. Además, se apreció que en varios pozos había células en monocapa. También se observó cómo se formaban miniesferas, y cuando había un ribete celular en torno a un agregado, éste solía ser muy fino. El tamaño medio de los agregados en ese momento era de 604 μm x 589 μm. 114 3. Resultados Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis 3.2 Evaluación macroscópica de los cóndilos femorales porcinos tratados y de los no tratados con colagenasa Antes de someter los cóndilos al proceso de descalcificación, éstos fueron fotografiados y valorados macroscópicamente. Los cóndilos control, es decir, aquellos que no fueron intervenidos ni sometidos al tratamiento con colagenasa, presentaban una superficie lisa, blanca y brillante, sin apreciar rugosidades ni soluciones de continuidad en el cartílago. Estas características son típicas de cartílago articular sano. Fig. 31: Rodilla izquierda de un individuo del estudio, no tratada con colagenasa. Presenta una superficie articular blanquecina, lisa, brillante y dura, propia de cartílago sano. 115 3. Resultados Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis En cambio, los cóndilos femorales de las rodillas sometidas al tratamiento con colagenasa presentaban diferentes apariencias a nivel del cartílago articular. Por un lado había regiones de cartílago blancas y brillantes, y por otro había partes de la superficie que tenían un color amarillento o ambarino y mate, sin brillo. Además, en todos los cóndilos tratados con colagenasa se apreciaban defectos de diverso tamaño y profundidad en el cartílago. En algunos de éstos se llegaba a ver claramente el hueso expuesto. También se comprobó la consistencia del cartílago en todos los cóndilos mediante una aguja de carga. La conclusión era que el cartílago sano era más duro en toda su superficie mientras que el tratado con colagenasa era más blando y friable. Fig. 32: Rodilla derecha, sometida al efecto de la colagenasa. En sólo 4 meses han aparecido cambios degenerativos macroscópicos importantes, quedando menos de un tercio de superficie cartilaginosa con aspecto normal en esta rodilla. 116 3. Resultados Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Fig. 33: Representación macroscópica de una rodilla derecha tratada con colagenasa. Fig. 34: Cóndilos femorales con lesiones del cartílago, color amarillento y pérdida de brillo tras tratamiento con colagenasa. Se puede ver con claridad el hueso subcondral expuesto en zona de carga. 117 3. Resultados Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis En el manejo habitual de las lesiones artrósicas en rodillas de seres humanos, el diagnóstico se basa en tres pilares fundamentales: la clínica, las imágenes radiológicas y los hallazgos macroscópicos. De hecho, una de las formas de diagnosticar y clasificar que más consenso ha provocado en los últimos años es la visualización directa mediante la artroscopia de rodilla. Basándose en los hallazgos macroscópicos de la evaluación artroscópica de la rodilla existe la escala ICRS (International Cartilage Repair Society): Tabla 5: Escala de ICRS (International Cartilage Repair Society) Fig. 35: Cóndilos tratados con colagenasa; hueso expuesto en las zonas de mayor carga articular. Cartílago mate y friable. 118 3. Resultados Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Aplicando esta escala a los hallazgos macroscópicos de las muestras de los cóndilos tratados con colagenasa de los cerdos, el 100% de las mismas tenían lesiones del cartílago. Así, las 10 rodillas tratadas con colagenasa tenían algún grado de lesión del cartílago articular. 3 rodillas correspondían al grado 3 de la escala, mientras que las otras 7 rodillas presentaban lesiones con perdida completa del grosor del cartílago, con zonas en las que quedaba expuesto el hueso subcondral, correspondiendo al grado 4 de la escala ICRS. Utilizando la clasificación de Outerbridge, que también clasifica los grados de artrosis en función de los hallazgos macroscópicos, los resultados obtenidos son los mismos que con la escala ICRS con 3 rodillas en grado 3 y las demás con grado 4. Tabla 6: Clasificación de Outerbridge 119 3. Resultados Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis 3.3 Análisis histológico de los cóndilos sanos y los tratados con colagenasa 3.3.1 Evaluación de la tinción de hematoxilina-eosina La tinción de hematoxilina-eosina es considerada como la técnica de tinción de uso más frecuente en el estudio de células y tejidos a través del microscopio fotónico. Es muy útil para obtener una visión general de las muestras de tejido. Los núcleos celulares se tiñen de lila gracias a la hematoxilina mientras que la eosina tiñe de rosa o rojizo la matriz extracelular. Cóndilos control: El corte a través del cóndilo sano del cerdo muestra una capa de cartílago sano de grosor uniforme y firme. Su superficie es lisa y no muestra roturas o zonas deshilachadas. Los condrocitos son escasos y están ordenados, es decir: en la superficie se agrupan de forma radial o paralela a la superficie, mientras que a medida que alcanza mayor profundidad, se agrupan en forma tangencial, formando las características estructuras en forma de columna. Cóndilos tratados con colagenasa: Todos los cortes transversales de todos los cóndilos tratados con colagenasa mostraban significativos cambios en altura y grosor del cartílago, incluso su completa ausencia en algunas áreas. El grosor de la capa cartilaginosa en estos cóndilos variaba en función de la geografía condílea: así, en las zonas que limitan con la cápsula articular, el cartílago tenía mayor grosor, mientras que en las zonas más cercanas a las zonas de carga eran notablemente más finas. En general, en las zonas de los intercóndilos, lejos de la cápsula articular pero en una zona exenta de carga mecánica, el grosor del cartílago era normal, aunque presentando pequeñas lesiones en forma de soluciones de continuidad y fibrilaciones a nivel de su superficie. El número de condrocitos era mayor que en el cartílago normal, y tan sólo mantenían su organización espacial típica en las zonas más profundas 120 3. Resultados Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis cercanas al hueso. En las regiones donde la capa de cartílago era más delgada, la matriz extracelular era muy escasa, contrastando con la exagerada cantidad de células. También se apreciaba esclerosis, es decir, aumento de la densidad del hueso subcondral en dirección de la cápsula articular. En las zonas cercanas a los bordes articulares, allí donde el cartílago era de mayor grosor, había presencia de agrupaciones proliferatvas de condrocitos, a veces con más de 10 células juntas. Estas agrupaciones proliferativas de células se observaron en todas las muestras, teniendo de media entre 5 y 7 células. Su presencia y concentración era mayor cerca de zonas de rotura del cartílago, y además era directamente proporcional al tamaño de la lesión. Aparte de esto, también en esta zona se apreciaba la presencia de roturas de pequeño tamaño pero que podían afectar al grosor total del cartílago, así como rugosidades en la superficie. En el hueso subcondral, el hueso esponjoso presentaba mayor concentración de matriz o médula ósea. En algunos cóndilos el hueso subcondral presentaba quistes rellenos de esta médula. También se contabilizaron roturas de hueso, es decir, fracturas en zonas relacionadas con esos quistes subcondrales. En las regiones de mayor carga, la densidad del hueso era mayor, tanto a nivel de superficie subcondral como en la esponjosa adyacente. 3.3.2 Evaluación de la tinción Safranina - O - Fast Green El valor de esta tinción reside en su capacidad para valorar cuantitativamente la presencia de proteglicanos en el cartílago hialino, que forman una parte importante del cartílago hialino. Cóndilos control: La zona tangencial, la más superficial, del cartílago de los cóndilos no sometidos al efecto de la colagenasa no mostraban ninguna tinción con Safranina-O. En cambio, en la zona de transición y en la zona radial la matriz extracelular mostraba una fuerte tinción positiva, debido a la alta concen- 121 3. Resultados Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis tración de proteoglicanos. A medida que se va profundizando, la matriz volvía a teñirse muy poco o nada, siendo tan sólo las columnas de condrocitos las que permanecían teñidas con fuerza. Cerca de la cápsula articular las tinciones se debilitaban. Cóndilos tratados con colagenasa: Las zonas cercanas a la cápsula articular, donde en estos cóndilos lesionados el espesor del cartílago era mayor, no se objetivó tinción con Safranina-O en las capas superficiales, pero sí en las demás capas más profundas. La intensidad de la tinción era muy variable, desde débil hasta muy fuerte, pero no parecía seguir ningún patrón específico, salvo que la intensidad era más fuerte en cercanía de grupos de condrocitos. En las zonas del cóndilo donde el cartílago tenía menor espesor, era negativa a la tinción con Safranina-O. Allí donde el cartílago de estos condílos presentaba un grosor más cercano a la normalidad, es decir, en la zona intercondílea, se apreciaba una fuerte intensidad de tinción en las capas profundas, que disminuía hacia la superficie del cartílago. Fig. 36: Tinción típica con Safranina-O en un corte de cartílago sano. 128 3. Resultados Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis 3.4.1.3 Expresión de colágeno tipo III La principal función de este tipo de colágeno es la de sostén en tejidos expansibles, y se localiza en paredes de vasos sanguíneos, en la glía y otros tejidos fibroconectivos, pero no se encuentra en el hueso ni en el cartílago. Por esto, los cóndilos control no mostraron ninguna reacción al anticuerpo anti-colágeno tipo III. Los cóndilos sometidos a tratamiento con colagenasa tampoco mostraron ninguna reacción. 3.4.1.4 Expresión de agrecano Dentro del cartílago hialino, el agrecano es el proteoglicano más grande, y participa en la organización tridimensional y en la estabilidad de las redes de colágeno. Cóndilos control: En los cortes tangenciales, es en las capas medias en las que se aprecia una positividad para agrecano débil a media (1+/2+). En las regiones mineralizadas del cartílago, se aprecia expresión débil para agrecano en las cápsulas de los condrocitos. Cóndilos tratados con colagenasa: A diferencia de los cóndilos con cartílago sano, en estos cóndilos se apreció una reacción con el anticuerpo anti-agrecano disminiuda. Así, las zonas de cartílago engrosado y las de cartílago muy adelgazado no mostraban ningún trazo de agrecano. El cartílago de zonas exentas de carga con un grosor similar al normal sí tenían expresión positiva para agrecano, de forma muy similar al presentado por el cartílago sano de los cóndilos control. Otra diferencia que se pudo apreciar es que los grupos de proliferación celular en las regiones profundas del cartílago se teñían con más fuerza (2+). 129 3. Resultados Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis 3.4.1.5 Expresión de S-100 La proteina S-100 se sintetiza exclusivamente en condrocitos, aunque su función se desconoce. Cóndilos control: Todas las células del cartílago de las articulaciones no sometidas a tratamiento con colagenasa mostraban una fuerte expresión positiva, de distribución homogénea, para la proteina S-100. Las células del tejido óseo son negativas para S-100. Cóndilos tratados con colagenasa: En las zonas de cartílago engrosado, las células que se encontraban en la superficie mostraron expresión negativa para S-100. En las zonas medias del espesor la expresión para S-100 era débil (1+), mientras que en la profundidad era fuerte (3+). En algunos cortes se apreció una tinción de fuerza media (2+) para S-100 en la matriz extracelular, pero negativa para las células de esta región del corte. Todos los cortes mostraron positividad para la expresión de S-100, pero a diferencia de los cóndilos sanos, eran negativos para la expresión de S-100 en las zonas superficiales allí donde el cartílago tenía mayor espesor, cerca de las cápsulas articulares. En las regiones adelgazadas cercanas a roturas o fisuras del cartílago la expresión era positiva pero débil en las zonas centrales del espesor y fuertes en la zona más profunda cercana al hueso. En resumen, dado que la proteína S-100 expresa presencia de condrocitos, y éstos están presentes tanto en rodillas sanas como en articulaciones artrósicas, lo que es realmente significativo es el cambio en el patrón de distribución en función de la disposición patológica de los condrocitos en las rodillas sometidas al efecto de la colagenasa. 130 3. Resultados Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis 3.4.2 Valoración inmunohistoquímica de la expresión de factores de crecimiento 3.4.2.1 IGF-1 Se trata de una citoquina anabólica, conocida como Factor de Crecimiento Insulino-like 1 (IGF 1), y cuya función en el contexto de la fisiología y patogenia del cartílago hialino consiste en mantener funcionando la síntesis de prostaglandinas y en estimular la proliferación de condrocitos. Cóndilos control: La mayor parte de las células del cartílago sano muestran una expresión de fuerza media positiva para la IGF-1, siendo negativa en la matriz extracelular. En el hueso se aprecia positividad de fuerza media (2+) en las cavidades del hueso esponjoso, aunque en las zonas de hueso cortical no había expresión para IGF-1. Cóndilos tratados con colagenasa: Los cortes transversales de los cóndilos sometidos al efecto de la colagensa mostraron bastantes diferencias de coloración cuando fueron teñidas para mostrar su expresión para la IGF-1. Así, en las zonas de cartílago más engrosado, cercanas a la cápsula articular, había menos células que expresaban positivamente para IGF-1 en comparación con el cartílago de los cóndilos sanos. Además, lo hacían con una fuerza débil (1+). En las zonas adelgazadas del cartílago, donde estaba sometido a mayor carga, se apreciaba una expresión positiva con fuerza media (2+) en la matriz extracelular. Por lo demás se podía apreciar una tinción fuerte (3+) en la superficie así como en la parte que contacta con el hueso subcondral. En la parte intercondílea, donde el cartílago estaba sometido a menor presión mecánica, la tinción para IGF-1 tenía un comportamiento parecido al del cartílago sano, es decir, sin tinción en la matriz extracelular y medianamente positiva para las células allí presentes. La zona en la que se pudo observar la mayor intensidad de tinción (4+) para la IGF-1 fue en los quistes subcondrales rellenos de matriz a nivel del hue- 131 3. Resultados Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis so subcondral, aunque esto sólo se observó en 4 de los cóndilos tratados con colagenasa; en el resto la reacción con el anticuerpo anti-IGF-1 en estos quistes era media o fuerte (2+ / 3+). 3.4.2.2 TGF-ß El Factor de Crecimiento Transformante beta (TGF-ß ) es una proteína que actúa como citoquina anabólica, teniendo un importante papel estimulador de la síntesis de diversos componentes de la matriz extracelular. También participa en el control del crecimiento celular de la proliferación celular y de la apoptosis. En nuestra serie de cortes inmunohistoquímicos, los resultados fueron: Cóndilos control: La expresión para TGF-ß en las zonas más superficiales del cartílago sano era de fuerza baja a media (1+/2+) en la matriz extracelular y de fuerza media (2+) para las células. A medida que se examinan las zonas más profundas, la matriz pierde toda la expresión para este factor y tan sólo es expresado por las células con intensidad baja a media (1+/2+). En el hueso subcondral no se apreció ninguna expresión para el TGF-ß. Cóndilos tratados con colagenasa: El resultado de esta prueba en las zonas cercanas a la cápsula articular, donde el cartílago se tenía el mayor grosor, mostraba una expresión débil para TGF-ß en la matriz extracelular en todo su grosor, y las células tenían una expresión negativa, al contrario que en el cartílago sano. Allí donde el cartílago presentaba menor grado de lesión macroscópica, manteniendo color y grosor similar al cartílago sano, la expresión era parecida a la encontrada en los cóndilos no sometidos al tratamiento con colagenasa, aunque con una intensidad menor. En cambio, en las zonas muy adelgazadas del cartílago la matriz extracelular expresaba para el TGF-ß con fuerza alta (3+). Este hallazgo era constante en todos los cortes: si el cartílago estaba adelgazado, mayor era la expresión para TGF-ß. En las zonas en las que el cartílago presentaba roturas y grietas de 132 3. Resultados Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis diversa envergadura, la expresión era débil cuando la altura o grosor del cartílago no estaba disminuida, y mayor cuando el cartílago era más fino. En torno a los núcleos de proliferación celular cercanos a estas roturas, la expresión era de fuerza media o alta (2+/3+), mientras que la matriz extracelular era negativa. En las zonas de mayor profundidad la expresión para TGF-ß era fuerte para las células y débil para la matriz extracelular. Otro hallazgo constante era que la matriz extracelular próxima a lesiones del hueso subcondral y a los quistes subcondrales rellenos de matriz presentaba una expresión de fuerza media (2+) para TGF-ß. 133 3. Resultados Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis 3.4.3 Valoración inmunohistoquímica para la expresión de citoquinas degenerativas o catabólicas 3.4.3.1 Interleuquina - 1ß La Interleucina o interleuquina 1 es una citocina producida por diferentes tipos de células, pero sobre todo por los macrófagos. Se trata de uno de los principales mediadores de la respuesta inflamatoria. Se libera en grandes cantidades ante situaciones de estrés, agresiones al tejido o ante procesos infecciosos. Sus efectos pueden ocasionar respuesta febril, neutrofilia y aumenta la producción de proteínas de fase aguda. Está involucrada en el dolor. La Interleuquina -1ß es el subtipo que se libera al torrente sanguíneo, y en función del receptor actuará sobre un tipo u otro de tejido. A nivel articular estimula a los condrocitos a producir metaloproteinasas y monóxido de carbono. Las metaloproteinasas actúan como enzimas proteolíticas y descomponen el colágeno. Cóndilos control: En ningún cóndilo sano se detectó reacción con el anticuerpo para Interleuquina -1ß. Cóndilos tratados con colagenasa: En las zonas de cartílago engrosado no se objetivó reacción contra la Interleuquina -1ß. Pero en las zonas más adelgazadas de cartílago, la matriz extracelular mostraba una expresión débil. En zonas de cartílago macroscópicamente normal pero de rodillas sometidas al tratamiento con colagenasa se podía ver una expresión débilmente positiva en zonas de superficie y en las zonas más profundas. En zonas próximas a lesiones del cartílago como grietas o lesiones óseas sí había expresión débil para la Interleuquina -1ß. En ningún corte se apreció una expresión fuerte. 134 3. Resultados Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis 3.4.3.2 Factor de Necrosis Tumoral alfa: TNFα El TNF-α es una hormona glucopeptídica proteica perteneciente al grupo de las citocinas que se liberan por células del sistema inmune y que actúan en procesos de inflamación y destrucción articular, entre otros efectos. Tiene una estrecha relación con la interleucina-1ß. Se libera durante procesos infecciosos, inflamatorios autoinmunes y sus receptores son diana para tratamientos de enfermedades como la artritis reumatoide, espondilitis anquilosante o la psoriasis. A nivel articular estimula a los condrocitos a sintetizar metaloproteinasas. Cóndilos control: En todos los cortes de los cóndilos sanos se objetivaron un total de 4 células positivas para expresión de TNFα. Cóndilos tratados con colagenasa: De todos los cortes condíleos tratados con colagenasa sólo se apreció expresión positiva para el TNFα en la mitad de las muestras, es decir, en 5 rodillas. En todos los casos, la expresión positiva se vió en células que se encontraban en la parte más profunda del cartílago en zonas próximas a lesiones o cambios estructurales del hueso subcondral. En dos casos también se vió expresión débilmente positiva en la superficie del cartílago, y en ambos casos justo sobre lesiones óseas. 3.4.4 Valoración inmunohistoquímica de la expresión de enzimas 3.4.4.1 ADAMTS-5 (Agrecanasa-2) Esta molécula es una metaloproteinasa, y se encarga de descomponer el agrecano que es un componente principal de la matriz extracelular del cartílago. Su mayor concentración se encuentra en casos de artritis inflamatoria. 135 3. Resultados Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Cóndilos control: En toda la capa más superficial del cartílago sano, casi todas las células mostraban una expresión para ADAMTS-5 fuerte (2+). La matriz extracelular mostraba en estas zonas una expresión débil a fuerza media (1+/2+) pero distribuida en forma de manchas separadas entre sí, sin orden aparente. En las zonas profundas, mineralizadas y en el hueso no se apreció reacción alguna para el ADAMTS-5. Cóndilos tratados con colagenasa: Los resultados fueron muy variables, pero los hallazgos más constantes fueron que en la zona de cartílago engrosado la expresión para ADAMTS-5 era de intensidad media y fuerte en las zonas profundas y medias, mientras que era negativo en la superficie. El patrón de manchas a nivel de la matriz extracelular era constante en todos los cortes analizados. En las zonas de cartílago adelgazado la expresión para ADAMTS-5 era de intensidad débil y media a fuerte (1+/2+/3+) en la matriz extracelular y en las células, repitiéndose este hallazgo en zonas cercanas a grietas del cartílago. En zonas profundas, próximas o no a lesiones óseas, la matriz extracelular no mostraba ninguna expresión, pero sí lo hacían las células, sobre todo las que estaban agrupadas en nidos celulares. 3.4.4.2 MMP-13 (Coleganasa-3) Esta enzima pertenece al grupo de las metaloproteinasas, y tiene un potente efecto de degradación del componente extracelular. Se relaciona con diversos tipos de carcinomas y metástasis. Cóndilos control: Aproximadamente la mitad de los condrocitos sanos mostraron una expresión de fuerza media (2+) para el MMP-13, mientras que la matriz extracelular era completamente negativa. A nivel de los bordes de las cavidades del hueso subcondral también se halló positividad de fuerza media para la expresión de MMP-13. 136 3. Resultados Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Cóndilos tratados con colagenasa: La principal diferencia con respecto a los cóndilos sanos es que en todos los cóndilos sometidos al efecto de la colagenasa, la matriz extracelular mostraba expresión positiva para el MMP-13. La intensidad de esta expresión variaba en función de la zona y tipo de cartílago dañado. Así, en las zonas donde el cartílago estaba más engrosado se objetivó una expresión de fuerza media en la matriz extracelular, y además casi el 80% de las células presentaban positividad para el MMP-13. En zonas de cartílago muy adelgazado, la matriz extracelular y las células eran positivas con intensidad fuerte (+3). También en los bordes y en el interior de las cavidades del hueso subcondral se apreció una fuerte tinción positiva para MMP-13. En general, la intensidad de la expresión para MMP-13 era mayor cuanto más cerca del hueso subcondral. Este hallazgo era constante para todos los cóndilos analizados. 3.4.5 Valoración inmunohistoquímica de la expresión del marcador de Apoptosis Caspasa-3 La caspasa-3 es una enzima que participa en la transmisión de señales de la apoptosis, por lo que juega un papel muy importante en la muerte celular programada. Cóndilos control: Ningún cóndilo sano mostró reacción alguna contra el anticuerpo anti-caspasa-3, es decir, que la expresión fue negativa. Cóndilos tratados con colagenasa: Tan sólo los cóndilos de cuatro de los diez cerdos mostraron una expresión negativa para la caspasa-3. Los 6 individuos que sí mostraron una expresión positiva lo hicieron únicamente en áreas de intensa degradación del cartílago donde éste estaba más adelgazado, y siempre en las capas más superficiales, y con una intensidad baja a media. 137 3. Resultados Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis 3.5 Resumen de Resultados: Tal como se desarrolla en la discusión de los resultados, los hallazgos observados en los cortes de las rodillas sometidas al efecto de la colagenasa son correlativos con patrones propios de articulaciones artrósicas, como se ha demostrado en diversos modelos animales a lo largo de los últimos 20 años. Tabla 6: Tabla 7: 144 4. Discusión Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis - 2: clonación - 3: hipocelularidad • Intensidad de la tinción de fondo: - 0: normal - 1: ligera reducción - 2: reducción moderada - 3: reducción extensa - 4: no se aplica tinción La pérdida de proteoglicanos, en especial del agrecano, provoca una pérdida de solidez del cartílago hialino. Esto hace que el cartílago sea vulnerable a las cargas mecánicas, y éstas pueden llevar a la degeneración del cartílago. Dado que en el cartílago artrósico se pueden ver tanto cambios degenerativos como intentos de reparación, no es extraño que en algunas zonas del cartílago tratado con colagenasa en las rodillas de los cerdos de este trabajo, en especial en zonas cercanas a los clúster de proliferación celular, se pueda encontrar una tinción más intensa para la Safranina-O. Aunque la síntesis de proteoglicanos aumenta, no se logra su inclusión en la matriz extracelular de una forma eficaz (40). Los proteoglicanos fijan el agua, y como en la situación descrita existe un aumento de la cantidad de proteoglicanos que no se han unido de forma eficaz a la matriz extracelular, se provoca un edema del cartílago. El cartílago sano carece de vasos sanguíneos. En consonancia con ello, el cartílago de las rodillas no tratadas con colagenasa era avascular. Por el contrario, en el cartílago de las rodillas que sufrieron el efecto de la colagenasa sí se objetivó la angiogénesis como un hallazgo constante. La neoangiogénesis se ve estimulada por factores de crecimiento como el VEGF (Factor de Crecimien- 145 4. Discusión Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis to Vascular Endotelial) o el FGF-1 (126). En un estudio del 2006 se demostró que en articulaciones artrósicas se pueden hallar cantidades elevadas de VEGF (125). Otros factores que promueven la angiogénesis son citoquinas que median en la respuesta inflamatoria, como el TNF-α. La inervación ligada al proceso de vascularización es la responsable del desencadenamiento del dolor en la artrosis. Además puede dar lugar a la destrucción de la perfusión tisular, osificación anormal y una respuesta exagerada a estímulos normales y/o patológicos. Se considera ésta una explicación al fuerte dolor descrito por pacientes cuando reciben un traumatismo banal sobre una articulación artrósica (126). Walsh publicó en 2004 un artículo sobre la angiogénesis en la osteoartrosis. Describió que precisamente esa inervación que acompaña a la angiogénesis fomenta la formación de hueso, en especial la formación de osteofitos (127). En 5 de los diez cerdos estudiados en nuestro trabajo se hallaron vasos sanguíneos en la zona de engrosamiento del hueso subcondral de las rodillas tratadas con colagenasa. Según el trabajo publicado por Mankin, la formación de vasos sanguíneos en el cartílago también es signo de artrosis avanzada (119). En resumen, según el criterio propuesto por Mankin, que a día de hoy se sigue considerando como válido y estandarizado para determinar la severidad de la artrosis desde un punto de vista hitológico e histoquímico, se ha desarrollado artrosis severa en grado III a IV en todas las rodillas tratadas con colagenasa de los cerdos del presente estudio. 146 4. Discusión Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis 4.3 Comparación de los componentes de la matriz extracelular en el cartílago sano y artrósico El colágeno tipo II y el agrecano son los principales componentes del cartílago hialino y por sus cualidades son responsables de sus características. La matriz extracelular también se encarga de proteger a los condrocitos de posibles daños mecánicos y de mantener la forma fenotípica de las células sanas. En la superficie del cartílago sano se da una concentración muy alta de colágeno y una muy baja de proteoglicanos, como describen Buckwalter y Mankin (29). Esta proporción entre los dos componentes varía en función de la profundidad del cartílago. En la zona profunda o radial la concentración de colágeno es muy baja, mientras que la de proteoglicanos alcanza su apogeo. Además, los condrocitos son protegidos adicionalmente por una especie de cesto formado por fibrillas de colágeno. Las rodillas no tratadas con colagenasa de los cerdos de nuestro estudio mostraban esta disposición de la matriz extracelular y sus componentes colágeno II y agrecano. La pérdida de agrecano se puede reconocer en las fases precoces de la artrosis y esto disminuye la rigidez del cartílago, haciéndolo más friable (130, 131). También ha sido descrita la pérdida de colágeno tipo II en las articulaciones artrósicas (130, 132, 133). Este hecho lleva a la pérdida irreversible de las características elásticas y de la integridad estructural del cartílago. En las rodillas tratadas con colagenasa de nuestros cerdos se ha podido determinar la reducción de la concentración e incluso la ausencia total de colágeno tipo II y de agrecano. Éstos son indicios típicos de artrosis. Los cambios en las cualidades del cartílago conducen a un incremento de la sensibilidad hacia la carga mecánica de la articulación. Esto a su vez lleva a una pérdida de función articular y con frecuencia se asocia a dolor. Según Pfander et al. (135), el cartílago articular sano en conejos estaría cubierto por una fina capa de colágeno tipo I. También esto se correlaciona positivamente con los hallazgos histológicos de las rodillas no tratadas con colagenasa de los cerdos de nuestro estudio. En el mismo trabajo de Pfander, 147 4. Discusión Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis así como en otros (96, 103), se describe que en las rodillas de conejos que presentaban artrosis el cartílago dañado presentaba un aumento de la síntesis de colágeno tipo I, hecho éste que también se observó en el cartílago de las rodillas tratadas con colagenasa de los cerdos de nuestro estudio. En las articulaciones sometidas al efecto de la colagenasa del presente estudio se ha podido observar que en varias zonas de diverso grado de degeneración cartilaginosa, algunas células no marcaban positivamente para el marcador S-100, específico para los condrocitos (ver 3.4.1.5). Coincidía que en estas zonas también se halló el mayor incremento de síntesis de colágeno tipo I. En el cartílago artrósico puede llegarse a producir un cambio en el fenotipo de los condrocitos (136). Por este motivo se pueden encontrar tres tipos de condrocitos en la artrosis avanzada: condrocitos sanos, degenerados y condorcitos denominados “fibroblasto-like” por adquirir un fenotipo más parecido al de un fibroblasto que a un condrocito. Estos condrocitos similares a fibroblastos participan en la regeneración tisular, pero lo hacen sintetizando fibrocartílago cuyo componente principal es el colágeno tipo I, es decir, tejido cicatricial. Aparte de este fenómeno, la angiogénesis permite que al cartílago dañado accedan fibroblastos que también sintentizan fibrocartílago (38). Aigner et al (134) publicaron en 1993 que en estadíos tardíos de la artrosis en humanos en la zona tangencial y en la zona de transición superior del espesor del cartíalgo, se podía dar la síntesis de colágeno tipo III. En nuestro estudio no se evidenció la síntesis de colágeno tipo III en ninguna muestra analizada, ni en las sanas ni en las sometidas al efecto de la colagenasa. Existen varios trabajos más recientes que o no mencionan el colágeno tipo III o bien lo mencionan como un ausente en los hallazgos del cartílago hialino, tanto sano como degenerado con proceso artrósico (16, 95, 144, 156). Por tanto, podemos considerar que la ausencia de expresión para colágeno tipo III en las rodillas sanas y en las rodillas sometidas al efecto de la colagenasa son hallazgos consecuentes con la norma, y por lo tanto extrapolables. 148 4. Discusión Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis 4.4 Comparación de la expresión de citoquinas entre articulaciones sanas y artrósicas La producción y los cambios en la cascada de las citoquinas son considerados dos aspectos clave en la patogenia de la artrosis. (4, 5, 16, 46). El mecanismo de acción y los efectos de las citoquinas es muy complejo y todavía no se comprende en su totalidad. Las citoquinas tienen efectos unas sobre otras, tienen efectos superpuestos y crean una red funcional. Son capaces de tener efecto sobre condrocitos incluso con concentraciones tan bajas como a niveles de nano o pico. A través del aumento en la producción de citoquinas destructivas o catabólicas se llega a la disminución de la síntesis de componentes de la matriz extracelular y al aumento de la producción de metaloproteinasas, otras citoquinas y monóxido de carbono (144). 4.4.1 Las enzimas catabólicas IL-1β y TNF-α La IL-1β es una de las citoquinas catabólicas más potentes y se considera clave en la artrosis. Es producida fundamentalmente por la membrana sinovial y por condrocitos. La otra citoquina catabólica que tiene un papel importante en el desarrollo de la artrosis es el TNF-α. Kobayashi et al (137) demostraron que en el cartílago artrósico de conejillos de indias había un aumento de células con positividad para IL-1β en los estudios histoquímicos. Esto también es lo que ocurre habitualmente en el cartílago humano, además del aumento de TNF-α, como publicaron Goldring (147) y Pritchard (148). Estos estudios además mostraron un incremento del número de receptores para estas dos citoquinas en las paredes celulares de condrocitos y células sinoviales en articulaciones con lesiones artrósicas. En nuestro estudio con cerdos no ha habido un llamativo incremento en la reacción positiva a IL-1β y TNF-α, pero sí se trataba de un número de condrocitos significativamente mayor que en las muestras de las rodillas sanas. Este hallazgo se correlaciona con 149 4. Discusión Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis los que presentó en su trabajo acerca de la inoculación intraarticular de colagenasa en las rodillas de conejos, Kikuchi en 1998 (89). En este trabajo se apreciaron importantes cambios inflamatorios a nivel de las rodillas de conejos en la primera semana después de haber sido inoculada una dosis intraarticular de colagenasa. Sin embargo, esta reacción inflamatoria disminuía con el tiempo y en la sexta semana tras la inyección era muy débil. Correlativamente, en nuestro trabajo con cerdos, en el momento del análisis inmunohistoquímico unos cuatro meses tras la inoculación de la colagenasa, también se determinaron unos niveles bajos de los mediadores de la inflamación IL-1β y TNFα. Sin embargo, la detección de proteínas por tinción inmunohistoquímica presupone que las citoquinas IL-1β y TNFα con los determinantes antigénicos esenciales son capaces de sobrevivir indemnes al proceso de fijación, descalcificación, deshidratación e incorporación y que además demuestran ser suficientemente consistentes en la parafinización. Aparte de este hecho, los anticuerpos utilizados estaban dirigidos contra la IL-1β y TNFα humanas, sesgo que también podría haber conducido a una disminuida tinción para estas citoquinas. Por este motivo se recomienda que para futuros estudios se analicen el tejido y el líquido sinovial, puesto que éstos son los que contienen mayor número de mediadores de la inflamación. 4.4.2 IGF-1 y TGF-β, dos citoquinas anabólicas Para la IGF-1 se ha podido determinar que promueve la síntesis de los principales componentes de la matriz extracelular del cartílago hialino, entre ellos el agrecano y el colágeno tipo II (148). La citoquina IGF-1 posee un efecto autocrino y paracrino sobre los condrocitos (149). Existen numerosos trabajos en los que se ha podido ver cómo la concentración de IGF-1 aumenta en las zonas más degradadas del cartílago artrósico, y que en las zonas sanas o levemente dañadas disminuye o mantiene una concentración estable. El incremento del nivel de IGF-1 es una muestra del intento de reparación del tejido, efecto que sin embargo no es eficaz puesto que tam- 150 4. Discusión Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis bién aumenta la concentración de ligandos o proteinas de unión de IGFs en las articulaciones artrósicas (151, 152). Además, Pelletier y su equipo demostraron que los osteoblastos del hueso subcondral humano presentaban un incremento en la liberación de IGF-1 (154), y este hecho es considerado como una consecuencia de las señales anómalas de la IGF-1 durante el proceso artrósico. En nuestro estudio con cerdos se han objetivado en los niveles de IGF-1 cambios propios de la artrosis, con incrementos de su concentración en las zonas del cartílago más dañadas en las rodillas tratadas con colagenasa, así como niveles normales o muy bajos en las rodillas sanas. También vimos un incremento de IGF-1 en el hueso subcondral en las rodillas artrósicas. Una hipótesis es que como consecuencia del aumento de carga en las zonas dañadas de las articulaciones artrósicas se produce el incremento del nivel de IGF-1 en contexto del intento de reparación tisular, tal como propone Goldring (16, 155). Esto puede producir un aumento en la síntesis de determinados componentes matriciales que podrían explicar la presencia de matriz extracelular en las cavidades del hueso subcondral cuando aparece la artrosis. La citoquina TGF-β estimula la síntesis de proteoglicanos y la proliferación de condrocitos. Blaney Davidson et al. demostraron en 2006 que la inyección de TGF-β intrarticular en ratones como modelos de artrosis provoca un aumento de la síntesis de proteoglicanos (156). Un dato importante es que la producción local de TGF-β provoca la formación de osteofitos (157). En el trabajo aquí expuesto se ha podido determinar una disminución del TGF-β, y por lo demás destacta una reacción débil para TGF-β únicamente en las zonas artrósicas donde el hueso subcondral presentaba mayor esclerosis y en las zonas dañadas cercanas al borde articular. Este comportamiento puede conducir a una producción de proteoglicanos disminuída en el cartílago. La presencia de TGF-β en el hueso subcondral de las articulaciones sometidas al tratamiento con colagenasa podrían llegar a poducir osteofitos, y se considera responsable de la esclerosis del hueso subcondral en aquellas muestras histológicas que lo presentaban, en total en 5 cerdos de los 10 empleados, es decir, en el 50% de los casos. 151 4. Discusión Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis Estos hallazgos hacen hincapié en el hecho de que la expresión alterada de las citoquinas anabólicas no se limita al cartílago, sino que también influye en el hueso subcondral. La importancia de este hecho radica en que, como ya se comentó en la introducción, en la práctica habitual de la medicina el diagnóstico de la artrosis se basa en la correlación de la clínica y de los hallazgos radiológicos. Y estos últimos dependen directamente de los efectos sobre el hueso subcondral y la formación de osteofitos. 152 4. Discusión Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis 4.5 Las enzimas MMP-13 y ADAMTS-5 y su papel en el desarrollo de la artrosis Es sabido que la degradación de la matriz extracelular del cartílago en el proceso de la artrosis guarda relación con el aumento importante de la síntesis de las enzimas metaloproteinasas de la matriz (MMPs) y sus subtipos (Pelletier, 139, 141). Entre éstas se encuentran las enzimas colagenasas. En la tarea de degradar la matriz demostraron las 2 colagenasas, MMP-1 y MMP-13, ser las más eficaces, y con probabilidad las enzimas primarias en digerir el colágeno tipo II. La MMP-13 posee una mayor especificidad contra el colágeno tipo II y a la vez divide pequeños proteoglicanos ricos el leucina (SLRP), que asumen funciones reguladoras en la organización de la matriz extracelular (138). La degradación del agrecano en el cartílago artrósico también ha sido estudiado en los últimos años y esto ha conducido a identificar las enzimas proteolíticas que degradan el agrecano de forma específica. De esta forma se considera que las metaloproteinasas colagenasa-3 (MMP-13), agrecanasa-1 (ADAMTS-4) y la agrecanasa-2 (ADAMTS-5) son los principales responsables de este fenómeno, según publicaron Chambers et al. (140). Kobayashi et al. (137) publicó un trabajo en el que demostraban cómo en el cartílago sano de conejillos de indias tan sólo los condrocitos dispuestos en la zona tangencial del cartílago mostraban una tinción positiva para MMP-13. Por el contrario, en las rodillas artrósicas, que en ese trabajo se produjo mediante una meniscectomía abierta, la positividad de tinción para MMP-13 se distribuía por todo el cartílago en un número mucho mayor de células. También en el cartílago humano se ha podido observar un incremento en la síntesis de MMP-13 en la totalidad del grosor del cartílago cuando hay artrosis, según Pelletier et al. (141). En este último trabajo no obstante se vió que las muestras de control no teñían MMP-13. Contrariamente a esto, el cartílago de los cóndilos control de los minipigs de nuestro estudio sí mostraba algunas células en zonas profundas y bastantes células en la zona tangencial del espesor del cartílago que expresaban positividad para MMP-13. El incremento en el nivel de MMP-13 puede tener como consecuencia un aumento de la degradación del colágeno tipo II, y esto puede dañar la consistencia del cartílago y hacerlo más sensible a las cargas mecánicas. 153 4. Discusión Modelo de investigación animal para el estudio de la osteoartrosis En el anteriormente mencionado trabajo de Pelletier (141), se describe que el nivel de la proteína ADAMTS-5 en el cartílago artrósico en humanos es significativamente mayor que en los controles de cartílago sano, en los que tan sólo presentaba una ligera tinción de fondo. Sin embargo, en nuestro trabajo se aprecia expresión de ADAMTS-5 tanto en el cartílago sano como en el artrósico. Aún así hay que mencionar que los fenómenos de tinción podían ser muy diferentes entre sí en localizaciones determinadas del cartílago tratado con colagenasa, habiendo unas zonas con tinciones muy fuertes (3+ incluso 4+) y otras con tinciones débiles. El cartílago de 5 rodillas sanas mostraba positividad para ADAMTS-5 en todo su grosor, pero no en las otras 5. Esta forma de expresión para ADAMTS-5 en cartílago sano y artrósico se ha visto en otros trabajos como el de Bluteau et al. (142) y el de Malfait et al. (143).