Influencia de la dieta de los cabritos sobre el sistema inmune de los mismos

UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA FACULTAD DE VETERINARIA INFLUENCIA DE LA DIE SISTEMA INMUNE DE LO Antonio José Morales de la Nuez Las Palmas de Gran Canaria, UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA FACULTAD DE VETERINARIA TESIS DOCTORAL INFLUENCIA DE LA DIE TA DE LOS CABRITOS S OBRE EL SISTEMA INMUNE DE LO S MISMOS Antonio José Morales de la Nuez Las Palmas de Gran Canaria, Abril 2013 UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA OBRE EL Anexo II UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA Departamento: Instituto Universitari o de Sanidad Animal y Se guridad Alimentaria Programa de Doctorado: Sanidad Animal Título de la Tesis “INFLUENCIA DE LA DIETA DE LOS CABRITOS SOBRE EL SISTEMA INMUNE DE LOS MISMOS” Tesis Doctoral presentada por Don Antonio José Morales de la Nuez Dirigida por la Dra. Noemí Castro Navarro Las Palmas de Gran Canaria, a 1 de marzo de 2013 Noemí Castro Navarro El Doctorando, La Directora, Antonio José Morales de la Nuez NOEMÍ CASTRO NAVARRO, PROFESORA TITULAR DE UNIVERSIDAD EN EL DEPARTAM ENTO DE PATOLOGÍA ANIMAL, PRODUCCIÓN ANIMAL, BROMATOLOGÍA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS DE LA FACULTAD DE VETERINARIA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA INFORMA: Que Antonio José Morale s de la Nuez, Li cenciado en Veterinaria, ha realizado bajo mi dirección y as esoramiento el presente trabajo titulado “INFLUENCIA DE LA DIETA DE LOS CABRITOS SOBRE EL SISTEMA INMUNE DE LOS MISMOS” considerando que reúne las condiciones y calidad científica para optar al grado de Doctor en Veterinaria. Las Palmas de Gran Canaria, abril 2013 Fdo. Noemí Castro Navarro Poca gente es capaz de prever hacia donde les lleva el camino hasta que llegan a su fin. Few people are able to anticipate where it leads the way to reaching its end. John Ronald Reuel Tolkien    Agradecimientos Agradecimientos    Decir gracias puede resultar fácil y verdaderamente podría hacer un listado de gente y agradecerles a todos. Sin embargo, no cr eo que eso sea suficiente para ilustrar que, verdaderamente, una Tesis Doctoral no es trabajo de uno, al contrario, sin la colaboración de m uchísimas personas este trabajo no habría sido posible; desde la familia a los más cercanos compañeros de laboratorio y los directores “of course”. Este trabajo me ha permitido conocer muchísimas personas que ahora forman parte de m i historia y la historia de esta Tesis. Todas y cada una de ellas han aportado m ás o menos a este trabajo, a mi formación como futuro investigador y a mi propia persona. Por todo lo anteriormente expuesto. ¡MUCHAS GRACIAS! Índice Introducción 8 La protección frente a enfermedades infecciosas durante las primeras semanas de vida del cabrito es dependiente de la absorción de las inmunoglobulinas contenidas en el calostro (Nandakumar y Rajagopalaraja, 1983; Vihan, 1988). Por el contrario, la supervivencia de los cabritos alimentados con leche de vaca y sin ningún aporte de calostro es factible siempre que se apliquen tratamientos antiinfecciosos (Rowan et al. , 1994). 1.2.2.- Viabilidad Las inmunoglobulinas vehiculadas en el calostro son fundamentales para la supervivencia de la cría (Tizard, 1992). Así, son muchos los autores que han descrito que, la disminución de la mortalidad de cabritos, corderos y terneros depende de una correcta adquisición de inmunidad pasiva por medio del calostro (Halliday, 1971; McGuirre et al. , 1976; Sawyer et al. , 1977; Gay, 1983; Nandakumar y Rajagopalaraja, 1983; Morand-Fehr, 1984; Nocek et al. , 1984; Morand-Fehr, 1989; Argüello et al. , 2004b; Öztabak y Özpinar, 2006; Fratrić et al. , 2007). Han sido varios los autores que han detectado diferencias en las concentraciones sanguíneas de IgG entre los animales que mueren y los que sobreviven en los primeros meses de vida. Así, Dos Santos et al. (1994), encontraron que los valores de IgG del suero sanguíneo de los cabritos que murieron durante su experiencia eran inferiores a los de los animales que sobrevivieron (25,6 y 33,11 mg/ml de IgG, muertos y vivos respectivamente). Este hecho, también fue observado por Argüello et al. (2004b), trabajando con cabritos de la raza Majorera, donde la concentración de IgG a las 24 horas fue de 15,18 y 5,19 mg/ml de IgG (animales vivos y muertos respectivamente). Asimismo, O’Brien y Sherman (1993), utilizando como método de evaluación el test de turbidez, observaron en la sangre de cabritos de raza Alpina Francesa, diferencias significativas en la concentración de inmunoglobulinas en el primer mes de vida entre los animales vivos y los muertos, siendo las concentraciones de 7,5 mg/ml en los muertos y 14,39 mg/ml en los vivos. Por otro lado Al-Jawad y Lees (1985), trabajando con corderos, detectaron que la concentración de inmunoglobulinas en suero sanguíneo a las Introducción 9 36 horas de vida fue de 5,6 mg/ml aproximadamente; concluyendo por tanto, que el hallazgo de concentraciones bajas de inmunoglobulinas en suero sanguíneo, no es un factor determinante en la supervivencia de los corderos. Molina et al. (1994) y Goyena et al. (1997) afirmaron que la falta de una concentración adecuada de inmunoglobulinas es la principal causa de la aparición de enfermedades como la criptosporidiosis en cabritos. 1.2.3.- Transferencia de inmunidad celular La población celular presente en el calostro en la especie caprina ha sido poco estudiada hasta el momento. No obstante, Gonzalo et al. (1988), en un estudio realizado sobre los componentes celulares del calostro ovino y su transición a leche, detectaron que los linfocitos y los macrófagos se encuentran en mayor cantidad en el calostro. Asimismo, estos mismos autores, observaron que la cantidad de linfocitos del calostro casi doblaba su presencia respecto a la leche. Este hecho lo asociaron a una posible transferencia de inmunidad celular hacia el neonato, lo que ha sido también observado por otros autores (Parmely y Beer, 1977; Lee y Outteridge, 1981; Outteridge y Lee, 1981). La ingestión de leucocitos maternos a través del calostro estimula el desarrollo del sistema inmune del neonato mediante el desarrollo de células con capacidad de presentación de antígenos (Reber et al. , 2005). En corderos y terneros recién nacidos, los linfocitos procedentes del calostro son capaces de penetrar la pared intestinal en las primeras horas de vida alcanzando unos niveles máximos en sangre 24 horas después de la toma de calostro (Doménech, 2007). Tuboly et al. (1995) realizaron un estudio sobre la absorción intestinal de linfocitos vehiculados en el calostro suministrado a corderos, y observaron que éstos son absorbidos por la circulación linfática y además se encuentran inmunológicamente activos, con capacidad para presentar antígenos y con memoria. Introducción 10 1.2.4.- Elevación de la temperatura corporal El calostro desempeña un papel importante como fuente de energía incrementando la temperatura corporal de los neonatos. Así, Vermorel et al. (1983), describieron que la temperatura corporal de terneros mantenidos a 10ºC aumentaba un 18 y 9% en la primera y segunda hora tras la administración del calostro. Tras observar que una de las principales causas de mortalidad durante las primeras horas de vida en los corderos es la hipotermia, Eales et al. (1982) propusieron un adecuado encalostrado como medida preventiva para evitar el descenso de temperatura de estos animales. En este mismo sentido, Hamadeh et al. (2000) afirmaron que la ingesta temprana de calostro es primordial para la inducción de la termogénesis en corderos neonatos. En el caso de los cabritos, Mellado et al. (1998), observaron que son animales muy susceptibles al estrés por frío durante los primeros cinco días de vida, sufriendo un descenso de la temperatura rectal (Dos Santos et al. , 1994). El suministro adecuado de calostro aporta la energía necesaria consiguiendo elevar la temperatura rectal del cabrito (Morand-Fehr, 1989; Dos Santos et al. , 1994). Muller y McCutcheon (1991), en una experiencia en la que compararon la resistencia al frío de cabritos y corderos, observaron que la ingesta temprana de calostro era esencial (fundamentalmente en cabritos) como aporte energético ya que, el bajo peso al nacimiento de los cabritos, la inhabilidad de estos animales para mantener la temperatura corporal elevada (tras un estrés por frío) y su menor capacidad para la producción de calor, sugiere que los cabritos tienen una mayor dificultad para resistir condiciones ambientales desfavorables que los corderos. Asimismo, Sanz et al. (1995) apuntaron que los cabritos tienen unas necesidades energéticas muy superiores a las de los corderos. 1.2.5.- Establecimiento del vínculo materno-filial Los patrones de comportamiento que desarrollan los cabritos en sus primeros minutos de vida están encaminados fundamentalmente al establecimiento del vínculo materno-filial, durante el periodo sensible de la Introducción 11 madre, y a realizar lo antes posible el primer amamantamiento (Ramírez et al. , 1998). El citado vínculo se instaura después del parto y tiene lugar en un periodo muy específico y breve de tiempo (Ramírez et al. , 1996a). Collias (1956) y Klopfer et al. (1964) describieron que los primeros diez minutos tras el nacimiento son básicos para el establecimiento de esta relación en ganado caprino, y que a diferencia de otras especies, una hora de separación puede ser suficiente para que se rompa el vínculo. Este hecho, también ha sido observado en cabras multíparas de raza Murciano-Granadina (Ramírez et al. , 1996b). En corderos, el consumo de calostro produce una mayor actividad y vigorosidad sobre los mismos, viéndose favorecido el reconocimiento materno (Nowak et al. , 1990). Por el contrario, García y Goddard (1998) encontraron que el aporte de una dosis extra de calostro comercial no mejoraba el establecimiento del vínculo materno-filial. Según sus consideraciones, la existencia de un reflejo de saciedad por repleción estomacal reduce las posibilidades de que se produzcan mejoras en la citada relación entre la madre y la cría. 1.2.6.- Expulsión de los meconios Por último, pero no por ello menos importante, es necesario mencionar el papel del calostro como estimulador del peristaltismo intestinal en el cabrito. Son varios autores (García de Jalón et al. , 1990; Barza et al. , 1993) los que describen que, esta función es de vital importancia para favorecer la expulsión del meconio evitando así la colonización bacteriana de la mucosa intestinal. 2.- Inmunoglobulinas Las Ig son glucoproteínas con un alto peso molecular. Son producidas por las células del retículo endotelial (células plasmáticas y linfocitos B) y son responsables de la inmunidad humoral, que es aquella que no está mediada por células. Como principales funciones biológicas de las inmunoglobulinas figuran la activación de la vía clásica del sistema de complemento y la formación de los complejos antígeno-anticuerpo. Introducción 12 2.1.- Clasificación de las inmunoglobulinas Las inmunoglobulinas se pueden clasificar de diversas formas según sea su movilidad electroforética, su peso molecular y su estructura antigénica. Actualmente la clasificación más utilizada es la basada en los distintos antígenos de las cadenas pesadas de las Ig o isotipos. De este modo, se diferencian varios isotipos, la inmunoglobulina G, la inmunoglobulina M, la inmunoglobulina A, la inmunoglobulina D y la inmunoglobulina E (IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente), siendo estas dos últimas las de menor importancia. En todos los mamíferos, podemos encontrar IgG, IgM, IgA e IgE, en cambio, la IgD se encuentra restringida a algunas especies de mamíferos y peces. 2.1.1.- Inmunoglobulina G (IgG) La IgG es el principal isotipo de inmunoglobulina y el que se encuentra en mayor concentración en el suero sanguíneo, desempeñando el papel más importante en cuanto a los mecanismos de defensa mediados por anticuerpos se refiere (Tizard, 1992). Esta inmunoglobulina presenta un peso molecular de 180 kDa y junto con la IgD, constituye el grupo de las inmunoglobulinas con menor peso molecular. Esta característica, facilita la salida de las mismas del torrente circulatorio con el fin de alcanzar rápidamente los espacios tisulares y las superficies corporales. La IgG contiene cuatro cadenas polipeptídicas enlazadas y unidas mediante puentes disulfuro. Dos de ellas, son idénticas y con un gran peso molecular, y se les denomina cadenas pesadas. Las otras dos cadenas, se denominan cadenas ligeras. La IgG se puede subdividir en dos subisotipos (IgG 1 e IgG 2 ) diferenciables mediante el uso de métodos electroforéticos (Meckenzie, 1970; Butler et al. , 1971; Kehoe, 1971). La IgG 1 presenta un tipo de transporte selectivo, mientras que la IgG 2 lo realiza por medio de la difusión pasiva (Lascelles et al. , 1980). Los subisotipos que se localizan en el calostro, presentan un origen sanguíneo, siendo mayoritariamente IgG 1 . Así, Castro et Introducción 13 al. (2006) encontraron que la concentración de IgG sanguínea, en cabras de raza Majorera, descendía un 38,7% durante los dos últimos meses de gestación. En los rumiantes, la IgG es la que aparece en mayor concentración en sangre y en el calostro, pudiendo llegar a representar entre el 80 y 90% del total de las inmunoglobulinas (Klaus et al. , 1969; Neubauer y Schöne, 1979; Lacetera et al. , 1996). Asimismo en ganado ovino, Smith et al. (1975) observaron que la presencia de IgG es mayoritaria en suero sanguíneo (88,64%) y calostro (91,65%). En ganado bovino la IgG 1 supone el 50% de las inmunoglobulinas del suero sanguíneo, siendo la más predominante en leche (Tizard, 1992). En un estudio realizado por Ciupercescu (1977) en ganado ovino, se describe que la IgG 2 representa escasamente el 1% de las inmunoglobulinas presentes en la sangre en las primeras etapas de la vida. En el suero sanguíneo y calostro de cabra, Pahud y Mach (1970) observaron concentraciones de IgG de 22,0 y 58,0 mg/ml respectivamente. Valores similares de IgG en el calostro fueron encontrados por Micusan y Borduas (1977) y Rudovsky et al. (2008). Trabajando con cabras de raza Majorera, Argüello (2000) observó concentraciones de IgG calostral de 36,1 mg/ml. Valores similares fueron descritos también por Castro et al. (2006) en el calostro de animales de la misma raza. Por otra parte, Micusan y Borduas (1977) describieron que la concentración de la IgG 1 en el calostro de cabra representa el 95-98% del total de las inmunoglobulinas. Asimismo, Lascelles et al. (1980) encontraron que la concentración de IgG 1 en el calostro de vaca y oveja era de 48,24 y 94,10 mg/ml, respectivamente; mientras la concentración de IgG 2 en el calostro de estas mismas especies era de 3,98 y 2,50 mg/ml. 2.1.2.- Inmunoglobulina M (IgM) Se trata de la segunda inmunoglobulina en importancia en el torrente sanguíneo, ya que tras la IgG, es la que más concentrada está en el suero sanguíneo de la mayoría de los mamíferos. Se encuentra constituida por la unión de 5 monómeros estabilizados mediante puentes disulfuro. Contiene Introducción 14 además un pequeño péptido rico en cisteína, llamado cadena J, la cual al igual que los monómeros se encuentra unida mediante puentes disulfuro. Son las inmunoglobulinas de mayor tamaño (900 kDa), por lo que quedan retenidas en el torrente sanguíneo y no participan en la defensa extravascular. Sin embargo, pueden difundir a través de los epitelios gracias a la cadena J, ya que puede unirse a los receptores presentes en la superficie de las células. En el calostro, a diferencia de la IgG, la IgM se produce a nivel local (Lascelles et al. , 1980). En el ganado ovino, este tipo de inmunoglobulinas representa el 9,5% del total de Ig en el suero sanguíneo (Smith et al. , 1975). En ganado caprino, Pahud y Mach (1970) encontraron que las concentraciones de IgM eran de 3,8 y 0,16 mg/ml en calostro y suero sanguíneo respectivamente. Valores similares han sido encontrados por Rudovsky et al. (2008), trabajando con calostro de la misma especie (3,19 mg/ml). 2.1.3.- Inmunoglobulina A (IgA) La IgA es también denominada inmunoglobulina de secreción debido a que se encuentra casi exclusivamente en secreciones del organismo, tales como el calostro, la leche, la saliva, las lágrimas o simplemente, quedan fijas en la superficie epitelial de las mucosas. Tiene un peso molecular de 360 kDa y se encuentra constituida por un dímero que tiene incorporada, al igual que la IgM, la cadena J. Trabajando con calostro y suero sanguíneo de cabras Pahud y Mach (1970) estimaron que la concentración de IgA en cada uno de estos fluidos era de 1,70 mg/ml en calostro y 0,32 mg/ml en suero sanguíneo. Rudovsky et al. (2008) cuantificaron la concentración de IgA en el calostro caprino en 2,00 mg/ml, lo cual supone que su concentración es de sólo el 3,7% del total de las Ig. 2.1.4.- Otras Inmunoglobulinas Se trata de inmunoglobulinas de menor importancia debido a que se sintetizan en muy pequeñas cantidades. Actúan fundamentalmente como Introducción 15 anticuerpos ligados a membranas (Tizard, 1992). La IgE es producida y secretada por las células plasmáticas del tejido conjuntivo de la dermis. La IgD, si bien, no ha sido detectada en todos los mamíferos, se ha identificado en bovinos, ovinos, cerdos, primates, roedores y perros (Gutiérrez, 2007). 3.- Actividad de la Chitotriosidasa La Chitotriosidasa (ChT) es una enzima secretada en el último estadío de diferenciación de los macrófagos. Su actividad aparece muy elevada en el suero plasmático de pacientes que padecen enfermedades como la malaria, la enfermedad de Gaucher tipo 1 o en alteraciones hematológicas (Hollak et al. , 1994; Barone et al. , 1999; Barone et al. , 2003). Nuevos estudios realizados por varios autores, indican que la ChT toma un papel importante durante la respuesta inmune (Di Rosa et al. , 2005; Malaguarnera et al. , 2005) y en los procesos inflamatorios (Di Rosa et al. , 2006; Malaguarnera et al. , 2006). La ChT es capaz de hidrolizar la quitina de la pared celular de hongos y nematodos. Musumeci et al. (2005) realizaron un estudio en el cual, compararon la actividad de la ChT en el calostro y suero sanguíneo de mujeres africanas y caucásicas. Los resultados mostraron que en el calostro la actividad de la citada enzima fue significativamente mayor en las mujeres africanas que en las mujeres caucásicas (1230 nmol/ml/hora y 293 nmol/ml/hora, mujeres africanas y caucásicas respectivamente). En este trabajo, no se encontró una correlación entre la actividad de la ChT del calostro y el suero sanguíneo en ninguno de los dos grupos de mujeres, lo cual llevó a estos autores a sugerir que la actividad de la ChT es debida a una secreción local por la activación de los macrófagos. En un estudio similar realizado por Argüello et al. (2008) con cabras de raza Majorera, encontraron que la actividad de la ChT en el suero sanguíneo de las cabras se mantuvo en el rango (2368 a 3350 nmol/ml/h) no estando afectado los días prey post-parto. Sin embargo, en el calostro de estos animales la actividad de esta enzima fue de 3912 nmol/ml/hora en el momento del parto y de 465 nmol/ml/hora el día 4 después del parto. En otro estudio con la misma raza caprina Moreno-Indias et al. (2012) observaron Introducción 16 valores de hasta 9431 nmol/ml/hora, en la fracción ordeñable, justo después del parto, llegando a 3553 nmol/ml/hora a a las 10 horas del parto. La actividad de la ChT descritas en estos trabajos en ganado caprino son mayores que las descritas en la especie humana debido probablemente a que las cabras están más en contacto con parásitos y hongos. En cuanto a la actividad de la ChT en los cabritos, Argüello et al . (2008) observaron valores de 2664 nmol/ml/hora al nacimiento y de 9231 nmol/ml/hora a los 49 días de vida, concluyendo que la actividad de la ChT en el suero sanguíneo incrementa con la edad, siendo al nacimiento significativamente menor, que en los días 28, 35, 42 y 49 días de vida. Esto puede ser explicado por la progresiva activación de los macrófagos con la edad de los animales. Moreno-Indias et al. (2012) no encontraron esta misma evolución en el tiempo, no observando diferencia en los primeros 35 días de vida de los animales. Rodriguez et al. (2009) analizaron la ChT los 5 primeros días de vida, en cabritos alimentados con distintas concentraciones de calostro liofilizado y no encontraron diferencias. Esto refuerza la idea de Argüello et al. (2008) de que la ChT no es absorbida a nivel intestinal y puede jugar un rol importante en la defensa local en el lumen. Sin embargo, Wold y Adlerberth (2000) sugieren que la ChT debe ser destruida o inactivada antes de llegar al intestino, al igual que ocurre con otras proteínas de la leche materna. Por otro lado, Malaguarnera (2006) afirma que la ChT juega un papel importante en el control de los patógenos humanos que contienen quitina. La ChT inhibe el crecimiento de Cryptococcus neoformans y previene de la infección de Candida albicans Malaguarnera (2006). 4.- Lactancia Artificial La lactancia artificial de cabritos ha sido un tema de investigación en la Unidad de Producción Animal de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Universidad desde 1991. La separación cuanto más precoz posible de madre-hijo, anula o disminuye en gran medida el vínculo materno-filial que se establece en las primeras horas postparto (Ramírez et al ., 1996a), con lo cual se favorece la Introducción 17 aceptación a las tetinas de amamantamiento y conducta de succión. Este sistema de manejo implica tener que suministrar fuera del entorno materno el calostro, bien fresco procedente de su propia madre o bien previamente refrigerado o congelado para su conservación. Esta última práctica resulta de especial interés en aquellas zonas donde la presencia de patologías tales como Artritis Encefalitis Caprina (CAE), Paratuberculosis, Micoplasmosis etc., están presentes, ya que una vía de transmisión directa es a través del calostro (Guerrault, 1990). 5.- Transferencia de inmunidad pasiva a los cabritos Como se ha citado anteriormente, Brambell (1970) y Wooding (1992) describieron que el tipo de placenta presente en los ungulados, no permite el paso de inmunoglobulinas desde la madre hacia el feto. Son varios los autores que han afirmado que los cabritos en el momento del nacimiento son agammaglobulinémicos (Constant et al. , 1994; Argüello et al., 2004b; Castro, 2005); si bien, para otros existen al nacimiento pequeñas concentraciones de IgG en el suero sanguíneo (Guerrault, 1990; Rabbani et al. , 1990; Sherman et al. , 1990, Rodríguez et al ., 2009). Coincidiendo con estos últimos, Logan et al. (1972) encontraron niveles de IgG e IgM en el suero sanguíneo de terneros recién nacidos que no habían sido encalostrados previamente. Por ello, el consumo de calostro es indispensable para la obtención de una protección inmunológica adecuada, la cual es fundamental para la supervivencia de los neonatos. En ganado caprino, se ha evaluado cuál es la concentración sérica de anticuerpos tras la ingestión de calostro necesaria para evitar el síndrome de fallo de la transferencia de la inmunidad pasiva, estimándose entre 8 y 12 mg/ml (Morand-Fehr, 1984; O'Brien y Sherman, 1993). Diversos autores sugieren que en las primeras etapas de la vida de los rumiantes, el transporte de inmunoglobulinas no es un proceso selectivo (Pierce, 1961; Brandon y Lascelles, 1971, Argüello et al ., 2008), aunque existen varios factores que se localizan en el calostro los cuales ayudan a que la absorción sea óptima. Uno de estos factores es el inhibidor de la tripsina (Laskowski y Laskowski, 1951) el cual, impide la acción de la mencionada Introducción 24 con sus madres y los separados al nacer. Argüello et al. (2004b) observaron niveles de IgG en sangre menores en cabritos alimentados de manera artificial restringida, en comparación con los cabritos encalostrados con sus madres. Sin embargo, estos autores consiguen unos buenos niveles de inmunización mediante el encalostrado artificial. 5.4.3.- Tamaño de la camada y peso al nacimiento En cuanto al tipo de parto, Chen et al. (1999a) trabajando con cabritos, describieron que las concentraciones de inmunoglobulinas en el suero sanguíneo a las 24 horas de vida en animales procedentes de partos simples eran menores que en los que procedían de partos múltiples (14,3 y 35,0 mg/ml, parto simple y doble respectivamente). Sin embargo, Argüello et al. (2006) trabajando con cabritos de raza Majorera, no encontraron una mayor concentración de IgG en el suero de cabritos procedentes de partos simples o múltiples (20,2 y 18,4 mg/ml a las 24 horas de vida, respectivamente). En corderos, Ciupercescu (1977) y Bekele et al. (1992) afirmaron que el tamaño de la camada no afectaba a la tasas de inmunoglobulinas siempre que la cantidad de calostro no fuera limitante. Respecto al peso al nacimiento, Bekele et al. (1992) no hallaron diferencias en la concentración de inmunoglobulinas en suero sanguíneo a las 48 horas de vida, entre corderos nacidos con un peso de entre 1 y 1,5 Kg (36,3 mg/ml) y animales cuyo peso al nacimiento superaba los 3 Kg (40,8 mg/ml). Castro et al. (2009) en cabritos de raza Majorera, encontraron diferencias significativas en la concentración sérica de IgG entre los distintos pesos al nacimiento; los cabritos con pesos inferiores a 2,8kg mostraron un menor valor de IgG en sangre que los cabritos de peso superior. 5.4.4.- Sexo Chen et al. (1999a) no detectaron diferencias significativas entre ambos sexos de cabritos de raza Nubia en referencia a su concentración sérica de inmunoglobulinas. Resultados similares fueron obtenidos por Ciupercescu (1977) con corderos machos y hembras, donde no observaron diferencias debidas al sexo. Sin embargo, O’Brien y Sherman (1993) detectaron que los Introducción 25 machos presentaban una mayor concentración de inmunoglobulinas con respecto a las hembras (135,2 mg/ml y 91,4 mg/ml respectivamente). 6.- Cantidad y calidad del calostro consumido Chen et al. (1999a) encontraron diferencias en la concentración en sangre de γ-globulinas en cabritos de raza Nubia alimentados con un calostro con alta y baja concentración proteica (200 y 100 mg/ml, respectivamente). Estos mismos autores obtuvieron una concentración de inmunoglobulinas superior en el suero sanguíneo de cabritos a las 24 horas de vida, alimentados con un calostro rico en inmunoglobulinas (40,1 mg/ml), que en los animales alimentados con un bajo nivel de las mismas (21,0 mg/ml de IgG). Castro et al. (2005) reportaron resultados similares administrando a los cabritos de raza Majorera calostros con tres concentraciones de inmunoglobulinas diferentes (alta, media y baja), tras lo cual, observaron que los cabritos que habían recibido el calostro más concentrado presentaban en sangre valores superiores de IgG que aquellos que consumieron los de concentraciones media y baja. Argüello et al. (2004b) encontraron una alta correlación positiva (r=0,79) entre la cantidad de IgG consumida y la encontrada en el suero sanguíneo de cabritos de raza Majorera, principalmente en las primeras 72 horas de vida. Asimismo Stott et al. (1983), compararon la administración de 1L vs 2L de calostro, describiendo que la cantidad de calostro en terneros presentó una correlación positiva con la cantidad de inmunoglobulinas absorbidas. Respecto a la cantidad de calostro, Orsel et al. (2000) encontraron que los cabritos que ingerían 100 mL, tenían una menor concentración de inmunoglobulinas en sangre que los que consumían entre 150 y 200 mL. Estos autores utilizaron una única dosis de calostro, por lo que el intestino de los cabritos neonatos no veía colmada su capacidad de absorción con la cantidad de 100 mL y por esto, al consumir mayor cantidad, se observan mayores valores de IgG en plasma. En cabritos de raza Majorera, Argüello et al. (2004b) no encontraron diferencias significativas en los niveles de IgG en el suero sanguíneo, aportando calostro ad libitum o calostro de forma restringida (10% del peso nacimiento/día). Introducción 26 Castro et al. (2005), trabajando con la misma raza, realizaron un estudio en el que se valoró la administración de calostro con una concentración alta y baja de inmunoglobulinas (1684 mg de IgG/ kg de peso vivo y 842 mg de IgG/kg de peso vivo, respectivamente), frente al número de días de encalostrado (1 o 2 días), asegurándose que los animales recibían la misma cantidad de IgG en todo el periodo de encalostrado. Los resultados mostraron que los cabritos encalostrados con una alta concentración de IgG durante 1 día (2 tomas) presentaban valores superiores de la citada inmunoglobulina en sangre, en comparación con los cabritos alimentados con una baja concentración de inmunoglobulinas en 2 días (4 tomas). Continuando en la misma línea, Rodríguez et al . (2009), utilizando calostro atomizado, alimentaron cabritos con concentraciones crecientes de IgG (20, 40, 60 y 80 mg/mL) y volúmenes decrecientes (100, 50, 33, 25 mL/kg de peso al nacimiento) los resultados finales de dicho experimento mostraron que los cabritos que ingirieron menos cantidad pero más concentrada obtuvieron una mayor concentración del IgG en sangre así como una mejor eficacia aparente de absorción. Stott y Fellah (1983), trabajando con terneros, describieron que los animales que consumían un litro de calostro con una concentración de 60 mg/ml, contenían un mayor nivel de inmunoglobulinas en sangre que aquellos que consumían dos litros con una concentración de inmunoglobulinas de 30 mg/ml. Por otro lado, McEwan et al. (1970b) o Stott y Fellah (1983) describen una relación lineal entre las inmunoglobulinas consumidas y la concentración de las mismas en el suero de terneros. Por el contrario, en corderos Al-Jawad y Lees (1985) administrando diferentes fuentes de inmunoglobulinas con varias concentraciones, no hallaron diferencias en cuanto a la absorción de Ig en los corderos. Similares resultados fueron obtenidos por Sawyer et al. (1977), quienes describieron que, la cantidad de calostro suministrado no es un factor limitante en la absorción intestinal, pero sí podrían serlo los factores que afectan a la absorción intestinal. Michanek et al. (1990) realizaron un estudio con terneros de raza Holstein, a los cuales se les administró leche previa a la ingesta de calostro. Los resultados mostraron que la ingesta de leche no afectó a la absorción Introducción 27 intestinal de IgG de los animales. Castro et al. (2007) alimentaron cabritos de raza Majorera con suero de calostro y suero de calostro con adición de lactorreemplazante y no encontraron diferencias en los niveles plasmáticos de IgG entre estos dos grupos entre sí ni con el grupo control alimentado con calostro completo. La adición de cierto tipo de sustancias al calostro, puede aumentar los niveles de absorción de las inmunoglobulinas. Así, Fractrić et al. (2007) en un estudio realizado con terneros, detectaron que existía un mayor nivel de absorción de inmunoglobulinas al administrar un componente a base de minerales (clinoptilotite) junto con el calostro. Asimismo, Kamada et al. (2007), comprobaron que la adición de selenio al calostro proporcionaba un aumento de la absorción intestinal de inmunoglobulinas en los terneros de un 20%. 7.- Higienización del calostro Por todo lo anteriormente expuesto, el encalostrado de los rumiantes recién nacidos es indispensable para un correcto desarrollo de estos animales. Sin embargo, el calostro es un vehículo potencial de transmisión de enfermedades infecciosas. Los patógenos transmitidos con el calostro pueden estar presentes en el calostro de las madres infectadas, llegar al mismo a través de la succión directa de la glándula mamaria o debido a una contaminación posterior al ordeño del mismo. Entre estos patógenos se incluyen bacterias como Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis, Salmonella spp., Listeria monocytogenes, y Escherichia coli (Steele et al., 1997), virus como la artritis-encefalitis caprina (Guerrault, 1990) o el virus de la leucosis bovina (Perrin y Polack, 1988). Así, se hace necesaria la higienización del calostro antes de suministrárselo a los animales recién nacidos. Haciéndose esta necesidad mayor cuando se intenta controlar este tipo de enfermedades, que pueden ser transmitidas por vía calostral. La higienización del calostro se puede realizar siguiendo alguno de los siguientes métodos: Introducción 28 7.1.- Métodos térmicos Tradicionalmente los tratamientos térmicos han sido el método de elección empleado para evitar la trasmisión de enfermedades vía calostral. Stabel (2001) observó una destrucción total de Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis en calostro bovino después de un tratamiento de 65,5ºC durante 30 min. Godden et al. (2006) no encontraron M yco plasma bovis , L. monocytogenes, E. coli O157:H7 ni Salmonella enteritidis viables (inoculados en el calostro ) después de un tratamiento de 60ºC durante 30 min y M. avium ssp . Paratuberculosis fue inactivado con 60ºC durante 60 min. Meylan et al. (1996) observaron una reducción en los niveles de M. avium ssp. paratuberculosis en el calostro bovino después de la pasteurización a 62ºC durante 30 min. Argüello et al. (2003) consiguieron una reducción del 99,99% de aerobios mesófilos utilizando 56ºC durante 60 min, no detectando crecimiento bacteriano cuando trataron el calostro con 57ºC durante 10 minutos y posteriormente los mantuvieron 60 minutos en un termo precalentado con agua hirviendo. Utilizando 56ºC durante 60min y 63ºC durante 30 min, Trujillo et al. (2007) observaron una reducción de los aerobios mesófilos del 95,2% y del 97,4%, respectivamente. La pasteurización ha desempeñado un papel fundamental en la prevención de la transmisión de la artritis encefalitis caprina. Varios autores lo han confirmado; Adams et al. (1983) demostraron la inactivación del Virus de la artritis encefalitis caprina (siglas en ingles CAEV) después de un tratamiento térmico a 56ºC durante 60 min, mientras que Moore et al. (1996) inactivaron con éxito el virus de la inmunodeficiencia bovina con un tratamiento a 47ºC durante 30 min. Las inmunoglobulinas son moléculas termolábiles. Según Li-Chan et al. (1995) y Chen et al. (2000) las Ig sufren una severa desnaturalización con temperaturas superiores a 75ºC. Meylan et al. (1996) and Tyler et al. (2000) analizaron los efectos de los tratamientos térmicos sobre la IgG del calostro bovino observando ambos una ligera reducción de la concentración de IgG cuando el calostro es sometido a 63ºC durante 30 min. Sin embargo, Steinbach et al. (1981) no encontraron diferencias en los niveles de IgG después de 55ºC durante 30 min. Steinbach et al. (1981) no encuentran Introducción 29 diferencias en la transferencia de inmunidad pasiva en terneros alimentados con calostro tratado a 55ºC durante 30 min en comparación con los alimentados con calostro sin tratar. McMartin et al. (2006) trataron térmicamente calostro bovino utilizando temperaturas de 59, 60, 61, 62, y 63ºC y sugieren que el calostro puede ser calentado hasta los 60ºC durante 120 min sin cambios en la viscosidad o la concentración de IgG, pero el tratamiento a 63ºC mostró en una pérdida del 34% de las IgG. Por otro lado, tratamientos térmicos efectuados con calostro bovino e IgG en PBS con un pH similar mostraron que las IgG en el calostro presentaron una mayor actividad (Domínguez et al. , 2001). Esto sugiere un efecto protector de otros componentes del calostro, previniendo la agregación de la IgG durante los tratamientos térmicos. En calostro caprino, Argüello et al. (2003) observaron una reducción del 36,9% de la concentración de IgG con un tratamiento de 56ºC durante 60 min, sin embargo Trujillo et al. (2007) observaron una reducción del 14% con el mismo tratamiento, mientras que con 63ºC durante 30 min obtuvieron un 15% de reducción. Las diferencias en la educción de inmunoglobulinas podrían explicarse debido a que Trujillo et al. (2007) utilizaron un baño María con oscilador mientras que Argüello et al. (2003) usaron un baño María estático, ya que la agitación puede ayudar a homogeneizar la muestra de calostro y por lo tanto las capas más cercanas a la pared del recipiente no se sobre exponen a la temperatura. Utilizando las bases de datos disponibles no existen estudios acerca del efecto sobre la microbiología y las moléculas inmunes del calostro con tratamientos térmicos con temperaturas superiores a 76ºC. Godden et al. (2003) describieron que los terneros alimentaros con 2 litros de calostro en su primera comida tuvieron menos inmunoglobulinas cuando el calostro estaba pasteurizado con respecto al no tratado térmicamente, sin embargo esta diferencia desapareció cuando los terneros recibieron 4 litros de calostro en su primera toma. Sin embargo, ElizondoSalazar y Heinrichs (2009) describen que los terneros alimentados con calostro tratado térmicamente (60ºC durante 30 min) presentaron una Introducción 30 concentración de IgG superior a los alimentados con calostro crudo. Estos mismos autores también observan que no hay diferencias entre animales alimentados con calostro con diferentes niveles de contaminación bacteriana. En cabritos alimentados con calostro térmicamente tratado (56ºC durante 30 min) se observó que los niveles de IgG, en los animales que fueron alimentados con este calostro, fueron más bajos que los animales alimentados con calostro sin tratar durante todo el periodo experimental. 7.2.- Métodos químicos 7.2.1.- Sodium Dodecilo Sulfato (SDS) El SDS es un ingrediente común en productos cosméticos y de higiene personal (pasta de dientes, champús, lavavajillas, lociones, etc.) y además es usado habitualmente en laboratorios como agente desnaturalizante en geles de electroforesis y otras técnicas de solubilización de proteínas. Es fácilmente biodegradable y es considerado por el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente como “de ninguna preocupación con respecto a la salud humana”. La degradación del SDS y otros alquilos sulfatos ha sido descrita en Pseudomonas , perros, ratas y seres humanos (Denner et al ., 1969; Thomas et al. , 1989). Hartmann et al. (2006) propusieron un nuevo método de prevención de la transmisión madre-hijo del VIH, tratando la leche con una dosis relativamente baja de alquilos sulfatos con actividad microbicida como el SDS. El mecanismo de acción de estos compuestos es la ruptura de la disrupción del virión debida al poder surfactante (detergente) y la capacidad de desnaturalizar proteínas (Hartmann et al ., 2006). Morales-delaNuez et al. (2010) han observado que los cabritos alimentados con calostro tratado con SDS mostraron niveles de transferencia de inmunidad pasiva similares a los cabritos del grupo control. De mismo modo, estos autores observaron que los animales no mostraron ninguna variación respecto a sus parámetros bioquímicos en comparación a los animales no tratados. Introducción 31 7.2.2.- Glicerol El glicerol es un producto secundario de la industria del biodiesel. Durante mucho tiempo ha sido usado como crio-protector del semen (Kim et al. , 1971; Futino et al. , 2010). También es usado como co-solvente en la industria cosmética y farmacéutica para mejorar la actividad antimicrobiana de otros productos (Darwish y Bloomfield, 1997). Otros autores (Schlievert et al. 1992; Oh y Marshall, 1993; Ruzin y Novick, 2000) han demostrado la actividad antimicrobiana del glicerol mono laurato. En las bases de datos disponibles no existen estudios que utilicen este producto para el control microbiológico en productos lácteos o calostro. 7.2.3.- Propilenglicol El propilenglicol, también conocido como E-1520, ha sido usado en el tratamiento de la cetosis desde hace muchos años (Johnson, 1954; Maplesden, 1954) y es usado todavía (Bahaa et al. , 1997; McClanahan et al. , 1998). Sin embargo en las últimas décadas se ha incrementado el interés de los ganaderos productores de leche, veterinarios y asesores por su uso como complemento alimenticio (Nielsen y Ingvartsen, 2004). También es bien conocido su uso en la industria farmacéutica y cosmética como co-solvente (Darwish y Bloomfield, 1997) y su reconocida actividad antibacteriana y antifúngica (Kinnunen y Koskela, 1991). En las bases de datos disponibles no existen estudios que utilicen este producto para el control microbiológico en productos lácteos o calostro. 7.3.- Métodos físicos 7.3.1.- Altas presiones Las altas presiones se están perfilando en una interesante alternativa dentro de los tratamientos no térmicos en el sector alimentario como método para la modificación de la estructura y propiedades funcionales de las macromoléculas de los alimentos, sin afectar a las propiedades (valores nutricionales, flavor, color, etc. Trujillo et al. , 2007). Smelt (1998) observó una efectiva inactivación de patógenos alimentarios y microorganismos Introducción 32 alterantes utilizando altas presiones con el propósito de aumentar la vida útil de los alimentos. Las altas presiones han sido propuestas como una tecnología alternativa a los procesos que utilizan el calor en la industria láctea (Trujillo et al. , 2002) incluyendo higienización de leche para fabricar yogur y queso fresco o curado, higienización de queso fresco directamente y como acelerador de la maduración del queso. Trujillo et al. (2007) utilizaron esta tecnología para higienizar calostro caprino observando que 400 y 500 MPa producen una higienización del calostro tan efectiva como los tratamientos térmicos de 56ºC durante 60 min y 63ºC durante 30 min. Sin embargo, en este mismo trabajo también se detalla que 500 Mpa producen un descenso significativo de la concentración de IgG en el calostro tratado. Indyk et al. (2008) afirmaron que el tratamiento de soluciones de IgG bovina con altas presiones puede ser considerado seguro. Viazis et al. (2007) analizaron el efecto de las altas presiones sobre la IgA y la actividad de las lisozimas de la leche humana, consiguiendo mejores resultados en comparación con una pasteurización baja (62,5°C durante 30 min). Felipe et al. (1997) observaron que un tratamiento de 500 MPa durante 10 minutos no producía una reducción de la actividad de la fosfatasa alcalina en leche de cabra, mientras 72ºC durante 15 segundos producía la total inactivación de ésta. Sin embargo estos mismos autores describieron una severa desnaturalización de proteínas del suero así como la formación de agregados sobre los 400 MPa. 7.3.2.- Ultravioleta La radiación ultravioleta (UV) es una pequeña parte del espectro electromagnético (Diffey, 2002). Esta radiación comprende desde los 100 a los 400 nm y se divide en tres partes: UV-A (320-400 nm), UV-B (280-320 nm) y UV-C (200-280 nm) (Guerrero-Beltrán y Barbosa-Cánovas, 2004). Esta última, UV-C, está considerada microbiocida de bacterias, virus, protozoos, levaduras, mohos y algas (Bintsis et al. , 2000). La longitud de onda de 254 nm se ha utilizado para desinfectar superficies, agua y alimentos líquidos como zumos de frutas (Guerrero-Beltrán y Barbosa-Cánovas, 2004). Introducción 33 Uno de los inconvenientes de esta técnica es su reducida capacidad de penetración dependiendo del medio a tratar; por ejemplo, Bintsis et al. (2000), describieron que los microorganismos suspendidos en el aire son más sensibles que en el agua y éstos a su vez más sensibles que los presentes en zumos. Del mismo modo Keyser et al . (2008) observaron que los zumos de fruta más transparentes, como el de manzana, necesitaron una dosis menor de radiación UV que los zumos más turbios como el de naranja. Por otro lado, no existen trabajos que utilicen la radiación UV para higienizar calostro, aunque sí se ha testado en leche. Matak (2004) encontró una reducción eficaz de E.coli utilizando UV. 7.3.3.- Pulsos eléctricos Hay varios estudios en leche que indican que los pulsos eléctricos son una alternativa válida a los tratamientos térmicos como la pasteurización en leche de vaca (Fernández-Molina et al ., 2005) y en leche de soja (Li et al ., 2003). Sin embargo otros autores concluyen que los pulsos eléctricos no son una buena elección para el tratamiento de leche, debido a unos pobres resultados sobre la microbiología y los efectos indeseables sobre los componentes proteicos (Floury et al ., 2005). Con respecto al efecto de los pulsos eléctrico sobre la estabilidad de la IgG, Li et al. (2003) describieron que el tratamiento de pulsos eléctricos, sobre leche de soja enriquecida con IgG bovina, no produjo una reducción de la actividad de dicha inmunoglobulina. Li et al. (2005) describen, en Buffer de borato (pH 6.84), que utilizando 41.10 kV/cm-91µs la concentración de inmunoglobulinas no se vio afectada con respecto a la muestra no sometida a pulsos eléctricos. 7.3.4.- Ultrasonidos Los ultrasonidos causan una cavitación en soluciones acuosas, lo cual es un método efectivo para producir daño en la pared celular de los microorganismos (Elliott y Winder, 1995). Cuando colapsa una burbuja, se genera una fuerza de corte en el ambiente que rompe las uniones químicas de la pared y las membranas (Dubbs, 1996). Dependiendo de la fuerza y la Bibliografía 41 Bibliografía Adams, D.S., Klevjer-Anderson, P., Carlson, J.L., McGuire, T.C., Gorham, J.R., 1983. Transmission and control of caprine arthritis-encephalitis virus. America Journal of Veterinary Research, 44: 1670-1675. Al-Ani, F.K., Vestweber, J.G.E. 1984. Caprine arthritis-encephalitis syndrome (CAE): A review. Veterinary research conmunications, 8: 243-253. Al-Jawad, A.B., Lees, J.L. 1985. 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Schweizer archive fur tierheilkunde, 125: 281-299. 63 Artículo 1 Effects of newborn characteristics and length of colostrum feeding period on passive immune transfer in goat kids 64 Artículo 1. Effects of newborn characteristics and length of colostrum feeding period on passive immune transfer in goat kids 65 Artículo 2. Effects of a reputed immunostimulant on the innate immune system of goat kids 72 Artículo 2. Effects of a reputed immunostimulant on the innate immune system of goat kids 73 Artículo 2. Effects of a reputed immunostimulant on the innate immune system of goat kids 74 Artículo 3 Sodium dodecyl sulfate reduces bacterial contamination in goat colostrum without negative effects on immune passive transfer or the health of goat kids. Artículo 3. Sodium dodecyl sulfate reduces bacterial contamination in goat colostrum without negative effects on immune passive transfer or the health of goat kids 77 Artículo 3. Sodium dodecyl sulfate reduces bacterial contamination in goat colostrum without negative effects on immune passive transfer or the health of goat kids 78 Artículo 3. Sodium dodecyl sulfate reduces bacterial contamination in goat colostrum without negative effects on immune passive transfer or the health of goat kids 79 Artículo 3. Sodium dodecyl sulfate reduces bacterial contamination in goat colostrum without negative effects on immune passive transfer or the health of goat kids 80 Artículo 3. Sodium dodecyl sulfate reduces bacterial contamination in goat colostrum without negative effects on immune passive transfer or the health of goat kids 81 Manuscrito 4. Use of Glycerol and Propylene glycol as additives for goat colostrum pasteurization 88 Key words: colostrums sanitation, goat kid, passive immune transfer, dairy 57 goat. 58 59 Manuscrito 4. Use of Glycerol and Propylene glycol as additives for goat colostrum pasteurization 89 INTRODUCTION 60 Colostrum is a nutrient-rich fluid produced by female mammals 61 immediately after partum. Due to its high content in Immunoglobulin (Ig), 62 mainly IgG, colostrum provides the major antimicrobial protection and 63 confers passive immunity preventing diseases caused by microbial infections 64 in the newborn (Foley and Otterby, 1978). Colostrum can either be fresh 65 (obtained directly from the mother) or preserved (refrigerated, frozen or 66 lyophilized) and treated (high-pressure, substances addition, pasteurization). 67 The sanitation systems are of particular interest in areas where diseases such 68 as CAEV are present; due to colostrum is one of the direct means of 69 transmission (Guerrault, 1990). Thus, it is generally recommended that 70 ruminant newborns are fed with fresh high-quality colostrum as soon as 71 possible after birth. However, a potential method of transmission of infectious 72 diseases to dairy animals is through feeding infected colostrum. Pathogens that 73 may be transmitted via colostrum, either by direct suckling of the mammary 74 gland or postharvest contamination, include bacteria such as Mycobacterium 75 avium ssp. paratuberculosis , Salmonella spp., Listeria monocytogenes , and 76 Escherichia coli (Steele et al., 1997), or viruses such as caprine arthritis-77 encephalitis (Guerrault, 1990) and bovine leukosis (Perrin and Polack, 1988). 78 An effective method to prevent transmission of infectious diseases via 79 colostrum to newborns is pasteurization. Colostrum pasteurization for the 80 destruction of pathogenic microorganisms and the reduction of endogenous 81 milk microbiota has been traditionally conducted by heat treatment. Adams et 82 Manuscrito 4. Use of Glycerol and Propylene glycol as additives for goat colostrum pasteurization 90 al. (1983) demonstrated the inactivation of caprine arthritis-encephalitis virus 83 in colostrum by applying a heat treatment of 56°C for 60 min. 84 Igs are thermolabile compounds of colostrum, severe heat denaturation 85 has been observed on IgG (the most studied), after treatment above 75°C (Li-86 Chan et al., 1995; Chen et al., 2000). Meylan et al. (1996) and Tyler et al. 87 (2000) using cattle, observed that pasteurization produce a reduction on IgG in 88 colostrum. In the same way, a reduced concentration of IgG in pasteurized 89 colostrum had a corresponding effect on the transfer of passive immunity in 90 calves (Lakritz et al., 2000). In contrast to these findings, Steinbach et al. 91 (1981) did not observe differences in IgG concentration in colostrum 92 pasteurized at 55◦C for 30 min with the unpasteurized colostrum. McMartin et 93 al. (2006) heated bovine colostrum at 59, 60, 61, 62, and 63°C and suggested 94 that colostrums could be heated to 60°C for up to 120 min without changes in 95 the viscosity or IgG concentration, but heating colostrum to 63°C resulted in 96 an estimated 34% decrease in IgG concentration and 33% increase in 97 viscosity. With regard to the goat colostrum sanitation, Argüello et al. (2003) 98 and Trujillo et al. (2007) working with 56ºC during 60 minutes, reported a 99 reduction on the IgG level of 37% and 14%, respectively. On the other hand, 100 heating experiments performed with IgG in bovine colostrum have shown 101 higher IgG activity retention those obtained with IgG in PBS buffer at similar 102 pH (Domínguez et al., 2001). This difference suggests a protective effect of 103 other milk components such as proteins, fats, and salts that cause a delay in 104 denaturation and prevent aggregation of IgG during heat treatment. 105 Manuscrito 4. Use of Glycerol and Propylene glycol as additives for goat colostrum pasteurization 91 In human milk, Chantry et al. (2009) observed a decrease on IgA and 106 IgM concentration after flash-heat treatment, but this loss needs more studies 107 to determine the clinical significance. Mainer et al. (1997) described that the 108 degree of immunoglobulin denaturation increased with the time and the 109 temperature of the treatment in bovine milk (62, 65, 69 and 72ºC for IgM; 65, 110 69, 72 and 77ºC for IgA; 69, 72, 77 and 81ºC for IgG). For all temperatures 111 denaturation time was longer for IgG than for IgA, and both were longer than 112 for IgM. 113 Chitotriosidase (ChT) is a functional chitinase which is only expressed 114 at the late stage of monocyte differentiation and it is present in different 115 species (Barone et al., 1999). It is possible that this enzyme plays a role in 116 defending against parasitic and fungal infections (Renkema et al., 1998). 117 Rodriguez et al. (2009) reported that plasma ChT activity in goat kids was 118 1181, 1183, 1312, 1278, 1337, and 1488 nmol/mL/hour, at birth and 1, 2, 3, 4, 119 and 5 d postpartum, respectively, with no differences between different 120 concentrations of IgG using spray dry colostrum, which reinforce the previous 121 hypothesis of Argüello et al., (2008), who proposed that ChT is not absorbed 122 when goat kids were fed with colostrum at first days of life, this suggested 123 that ChT in colostrum may offer protection against pathogens in digestive 124 system. In human milk, Musumeci et al. (2005) reported 1230 and 293 125 nmol/mL/hour in African and Caucasian women, respectively of ChT. In goat 126 milk, Argüello et al (2008) described 3912 nmol/mL/hour at partum, while 127 Moreno-Indias et al. (2012) observed 9431 nmol/ml/hour, just after partum 128 arriving to 3553 nmol/ml/hour at 10 hours after partum. 129 Manuscrito 4. Use of Glycerol and Propylene glycol as additives for goat colostrum pasteurization 92 Goat milk and colostrum differ from humans and bovine in composition 130 (Caseins, whey protein, fat, and salts), so research is necessary to verify the 131 operating pasteurization conditions required and other alternative methods to 132 sanitize colostrum and retains IgG, IgA, IgM and Chitotriosidase activity in 133 goat colostrum. 134 With regard to colostrum preservation methods, the most commonly 135 cited forms are freezing (Morand-Fehr, 1989, Holloway et al., 2001, Argüello 136 et al., 2003), refrigeration (Valenta, 1982, Argüello et al., 2003), lyophilizing 137 (Klobasa et al., 1998, Castro et al., 2005), addition of acidifying substances 138 (Muller and Syhre, 1975) or substances with a buffering capacity (Jenny et 139 al., 1984). Chemical preservation methods are recommended for storage at 140 room temperature in cases where freezing facilities are not available (Foley 141 and Otterby, 1978). Recently Morales-delaNuez et al. (2011) used sodium 142 dodecil sulfate (SDS) as sanitize agent in goat colostrum. These authors 143 observe that SDS did not produce reduction on IgG colostrum concentration 144 and 1% of SDS reduce the bacterial total count like low heat treatment. 145 Glycerol (Gly) is a secondary product of the biodiesel industry. For a 146 long time, Gly has been used as semen cryoprotectant (Kim et al., 1971, 147 Futino et al., 2010). Also, as co-solvent in pharmaceutical or cosmetic 148 industry to improve antibacterial activity of other products (Darwish and 149 Bloomfield, 1997) and others researchers (Schlievert et al. 1992, Oh and 150 Marshall, 1993, Ruzin and Novick, 2000) demonstrated the antimicrobial 151 activity of glycerol monolaurate. 152 Manuscrito 4. Use of Glycerol and Propylene glycol as additives for goat colostrum pasteurization 93 Propylene glycol (Pro), also known as E-1520, has been used in the 153 treatment of ketosis since the 1950s (Johnson, 1954; Maplesden, 1954) and it 154 is still used (Bahaa et al., 1997; McClanahan et al., 1998). However, in recent 155 years, the interest in using Pro as a feed additive has increased among dairy 156 farmers, veterinarians and advisers (Nielsen and Ingvartsen, 2004), as co-157 solvent in pharmaceutical or cosmetic industry (Darwish and Bloomfield, 158 1997) and as antimicrobial and antifungal agent (Kinnunen and Koskela, 159 1991). 160 No references have been found about the use of additives in 161 pasteurization to improve this sanitation process. The aim of this study was to 162 evaluate the use of Glycerol and Propylene Glycol at different concentrations 163 as additive during goat colostrum pasteurization. 164 165 MATERIAL AND METHOD 166 Colostrum quality 167 Eleven goats of Majorera breed were milked, using a bucket milker, 168 immediately after partum. After removed the whole available colostrum, it 169 was aliquoted (50 ml) and subsequently frozen at −20°C until treatment. 170 Sampled colostrums were aliquoted into nine different groups 171 according to treatments with different additives (Table 1). After each addition, 172 colostrum samples were heated in a water bath until reach 56ºC; after that, 173 samples remained for 1 hour into the water bath at 56ºC. Subsequently, 174 samples were transferred to ice water for fast cooling and storage at 4°C until 175 microbiological analyses were performed later on. 176 Manuscrito 4. Use of Glycerol and Propylene glycol as additives for goat colostrum pasteurization 94 Colostrum microbial population was quantified according to standard 177 procedures on Plate Count Agar (Trujillo et al., 2007). Colostrum IgG, IgA 178 and IgM concentration were quantified using ELISA kits (Bethyl 179 Laboratories, Montgomery. TX). Chitotriosidase activity was analyzed follow 180 the Argüello et al. (2008) methodology. 181 Free Fatty Acids (FFA) were measured according to Shipe et al. 182 (1980). Briefly 0.1ml aliquot of 0.7 N HCl was added to 0.5 ml colostrum in a 183 test tube, the mixture was shaken on a Vortex, after that 2 ml of the copper 184 reagent and 6 ml of solvent were added and the sample was shaken for 30 min 185 in a rotary shaker (Heidolph, Rotamax 120) at 240 rpm and later centrifuged 186 for 10 min at 1940 x g (Hettich Rotina 38R). Then 3.5 ml of the solvent layer 187 was transferred to an acid washed tube containing 0.1 ml of the color reagent. 188 Color was measured after mixing at 440 nm within 1 h. 189 Passive immune transfer on goat kid 190 18 goat kids were used. At birth, animals were dried and their umbilical 191 cords disinfected; animals were then weighed and assigned to 1 of 4 192 experimental groups. Kids were bottle-fed colostrum three times (2, 14 and 26 193 h postpartum). Each animal received 50 ml colostrum per kg of BW in each 194 feed times. Treatments were (Table 2); (CG) pasteurized Colostrum with 14% 195 PBS, (Gly) pasteurized colostrum with 14% glycerol addition, (Pro) 196 pasteurized colostrum with 14% propylene glycol addition and (G+P) 197 pasteurized colostrum with 7% of glycerol and 7% propylene glycol addition. 198 At the end of the colostrum period animals were fed ab libitum with milk 199 replacer (Bacilactol Cabritos, Saprogal, La Coruna, Spain; 95.5% DM, 23.6% 200 Manuscrito 4. Use of Glycerol and Propylene glycol as additives for goat colostrum pasteurization 95 CP, and 22.7% ether extract). Blood sample were collected at birth and every 201 12 hours until day 5 of life. Samples were collected before feed. Blood 202 samples were centrifuged and the obtained plasma was aliquoted and store at -203 20ºC. Plasma IgG, IgM, IgA concentration was measure using an ELISA 204 commercial kit. Chitriosidase activity was determined as Argüello et al. 205 (2008). 206 Statistic analysis 207 The SAS software package (version 9.00, SAS Inst. Inc., Cary, NC) 208 was used for statistical analyses. The MIXED procedure (ANOVA for 209 repeated measures) was used to compare between groups. Means were 210 compared with the Tukey test (Ott and Longnecker, 2001). 211 212 RESULTS AND DISCUSSION 213 214 Microbiology reduction in colostrum 215 The microbiology percentage reduction of pasteurization with addition 216 of different percentages of Gly and Pro in reference to traditional 217 pasteurization without additives is showed in Figure 1. For both additives, the 218 addition of 2% of Gly and Pro increased the microbial reduction by 40% more 219 than the control group, just as the concentration of 6% reduced by 60% more 220 than the control sample. No significant differences were observed between 221 concentrations of 10% (Gly: 74%, Pro: 77%) to 14% (Gly: 81%, Pro: 84%). 222 These percentages of Gly or Pro showed higher microbial reduction than CG 223 and 2% and 6% of Gly or Pro. No significant differences were observed 224 Manuscrito 4. Use of Glycerol and Propylene glycol as additives for goat colostrum pasteurization 96 between the same addition percentage of Gly and Pro. 225 Gly can be attached to the free form fatty acids mono-, diand tri-226 glycerides, Propylene glycol likewise may do the same to develop monoand 227 di-glycerides. Kelsey et al. (2006), tested the effects of different fatty acids 228 and mono-glycerides in Staphylococcus aureus , and they found that glycerol 229 mono laurate had a negative effect on growth and protein secretion of 230 staphylococcus. In our study, an initial possibility was that Gly and Pro joined 231 FFA and created monoor di-glycerides, although when the FFA level 232 (Figure 2) was analyzed, no differences were found, for this reason this 233 hypothesis could not be valid. 234 Another possibility may be that Gly and Pro have antimicrobial activity 235 by themselves. Isopropyl alcohol is one of the most used alcohols for 236 disinfection. Alcohols act denaturing proteins and dissolving lipids, changing 237 the lipid membrane (Tortora et al., 2007). Isopropyl alcohol is very similar to 238 Gly and Pro, being only different in the alcohol group number, for this reason, 239 Gly and Pro might have less activity than the Isopropyl alcohol but the same 240 action mechanism to disinfect. Furthermore this action could be improved 241 when the Gly and Pro addition was combined with the pasteurization. Further 242 studies on these action mechanisms are necessary. Moreover, studies about 243 the effect of these additives (with and without pasteurization) on the different 244 microbial populations will be necessary too. 245 Morales-delaNuez et al. (2011) using SDS to sanitize goat colostrum, 246 observed that 1% of SDS addition in colostrum reduced the microbial 247 population in the same level that pasteurization (56ºC-1h), however the 248 Manuscrito 4. Use of Glycerol and Propylene glycol as additives for goat colostrum pasteurization 97 addition of 0.1% of SDS did not reduce significantly the bacterial population 249 with regard to untreated colostrum. 250 251 Immune parameters in colostrum 252 The effects of Gly or Pro additions on the immune parameters (IgG, 253 IgM, IgA and ChT activity) of pasteurized colostrum can be observed in the 254 Table 3. The IgG level ranged from 22.2 to 25.3 mg/ml, no significant 255 differences were found between treatments. IgG colostrum concentration was 256 similar to those described by Argüello et al. (2003) and Trujillo et al. (2007) 257 in the same breed and sampling time. In the entire data base searched were 258 not found any references about chemical addition to improve pasteurization. 259 Argüello et al. (2003) observed a 36.92% of IgG reduction with the 56ºC-1h 260 pasteurization but Trujillo et al. (2007) described only by 14% of reduction 261 using the same method, just as Fernandez et al. (2006) found a 29.2% of 262 reduction in colostrum of Murciano-Granadina goats using the same 263 pasteurization method. With regard to chemical addition to sanitize 264 colostrum, a few references had been found, Washburn et al. (2004) used 265 phenothiazine to inactivate bovine viral diarrhea virus in goat colostrum, but 266 they did not analyze the microbial population or immunity parameters. 267 Morales-delaNuez et al. (2011) did not observe differences on IgG 268 concentrations between colostrum untreated and colostrum treated with SDS 269 addition (0.1% and 1% of SDS). 270 The IgA concentration (Table 3) ranged from 0.37 to 0.49 mg/ml, no 271 significant differences were found between regular pasteurization and Gly 272 Manuscrito 4. Use of Glycerol and Propylene glycol as additives for goat colostrum pasteurization 104 Lucci. 2010. 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Percentage of microbial reduction* in glycerol (Gly) or propylene 546 Glycol (Pro) additions at different concentration in pasteurized goat 547 colostrums with respect to the control group. 548 549 *The reduction percentage of control group (pasteurization without additives) 550 is 0%. 551 552 553 554 555 556 557 558 559 560 561 Manuscrito 4. Use of Glycerol and Propylene glycol as additives for goat colostrum pasteurization 111 Figure 2. Free Fatty Acids level in pasteurized goat colostrums without (CG) 562 and with glycerol (Gly) or propylene glycol (Pro) additions at different 563 concentrations. 564 565 Manuscrito 4. Use of Glycerol and Propylene glycol as additives for goat colostrum pasteurization. 112 Table 1. Colostrum addition of glycerol (Gly) and propylene glycol (Pro) in colostrum quality trial. Colostrum PBS Glycerol Propylene Glycol CG 86% 14% - - Gly 2% 86% 12% 2% - Gly 6% 86% 8% 6% - Gly 10% 86% 4% 1% - Gly 14% 86% - 14% - Pro 2% 86% 12% - 2% Pro 6% 86% 8% - 6% Pro 10% 86% 4% - 1% Pro 14% 86% - - 14% PBS=phosphate buffer saline. CG=Pasteurized colostrum with 14% of PBS. Table 2. Colostrum addition of glycerol (Gly) and propylene glycol (Pro), in passive immune transfer trial. Colostrum PBS Glycerol Propylene Glycol CG 86% 14% - - Gly 86% - 14% - Pro 86% - - 14% G+P 86% - 7% 7% PBS=phosphate buffer saline. CG=Pasteurized colostrum with 14% of PBS. Gly= Pasteurized colostrum with 14% glycerol. Pro= Pasteurized colostrum with 14% propylene glycol. G+P= Pasteurized colostrum with 7% glycerol and 7% propylene glycol. Manuscrito 4. Use of Glycerol and Propylene glycol as additives for goat colostrum pasteurization. 113 Manuscrito 5. Use of Formic Acid and Sodium Dodecyl Sulfate to inactivate Caprine Arthritis Encephalitis Virus (CAEV) in goat colostrum. 120 acid to a pH 4 and treatment of colostrum with 1% SDS was effective in 59 inactivation of greater than 99% of CAEV. Additionally, fresh colostrum 60 demonstrated significant inherent ability to inactivate CAEV. In conclusion, 61 these methods are viable alternatives to heat sanitation of goat colostrum with 62 regard to CAEV. However, in vivo studies are necessary to determine the 63 viability of these methods in the field in the prevention of neonatal 64 transmission of CAEV via colostrum. 65 Key words : CAEV, Goat, Colostrum, Goat kid, Sodium dodecyl sulfate, 66 Formic Acid. 67 68 Manuscrito 5. Use of Formic Acid and Sodium Dodecyl Sulfate to inactivate Caprine Arthritis Encephalitis Virus (CAEV) in goat colostrum. 121 INTRODUCTION 69 The distribution of Caprine Arthritis–Encephalitis virus (CAEV) is 70 worldwide. CAEV is a macrophage/monocyte tropic enveloped retrovirus 71 recently classified in the Small ruminant retrovirus (SRLV) group and causes 72 lifelong, persistent infection in goats (Crawford et al., 1980). All breeds and 73 ages of goats are susceptible to infection (Al–Ani and Vestweber, 1984). In 74 most of the industrialized countries, CAEV is considered one of the most 75 devastating diseases of goats and it represents an economic problem for goat 76 farming (Turin et al., 2005). In the United States of America, CAEV is a 77 major economic problem in dairy goats and the prevalence of serum 78 antibodies against CAEV in dairy goat herds ranges from 38 to 81% 79 (Concha–Bermejillo, A. de la, 2003) 80 CAEV produces disease in goats characterized by chronic proliferative 81 synovitis and arthritis and mastitis in adults and less commonly acute afebrile 82 leukoencephalomyelitis in goats less than 6 months of age (Al–Ani and 83 Vestweber, 1984; Hoesing and Trujillo, 2006). The incubation period of 84 CAEV is highly variable and protracted; most goats become infected at birth 85 through the ingestion of infected colostrum, and develop disease months or 86 more commonly, years later. The natural course of CAEV infection alternates 87 periods of reduced viral expression with periodic increases circulation of 88 productively infected monocytes, particularly under the hormonal influence of 89 parturition (Milhau et al., 2005). Traditionally CAEV was believed to only 90 replicate in cells of the monocyte/macrophage lineage, however, recently it 91 has been reported to infect and replicate in endothelial and epithelial cells in 92 Manuscrito 5. Use of Formic Acid and Sodium Dodecyl Sulfate to inactivate Caprine Arthritis Encephalitis Virus (CAEV) in goat colostrum. 122 vitro (Lerondelle et al., 1999; Le Jan et al., 2000). Other lentiviruses, 93 including CAEV, can infect non–leukocytic cells in vivo (Sanna et al., 1999; 94 Chi et al., 2000; Carrozza et al., 2003), including microglial cells, astrocytes 95 and oligodendrocytes, types I and II pneumocytes, mammary fibroblasts, 96 epithelial and endothelial cells. More recent confirmation of the expanded cell 97 types permissive to CAEV help to explain the pathogenicity of this virus in 98 multiple organ systems in the goat. 99 The mammary gland is a well–recognized target organ for small 100 ruminant lentivirus (SRLV) induced disease with the occurrence of 101 sometimes dramatic pathological lesions accompanied by virus isolation from 102 the mammary gland. (Cutlip et al., 1985; Kennedy–Stoskopf et al., 1985). 103 CAEV contributes to mastitis (‘hard udder’) (Robinson and Ellis, 1986; Van 104 der Molen and Houwers, 1987) and viral load in the mammary gland may be 105 affected by stage of lactation. For example, the induction of lactation is 106 correlated with high virus expression (Lerondelle et al., 1989), contributing to 107 viral transmission through colostrum. 108 The primary route of CAEV transmission is from dam to kid is through 109 the ingestion of virus infected colostrum (McGuire et al., 1990). CAEV can 110 be detected in high concentrations in colostrum and milk. Adams et al. (1983) 111 showed that CAEV could be isolated from cell–free milk and from milk cells 112 (in 7/23 and 5/8 infected goats, respectively) and they reported that CAEV 113 can survive concentration (centrifugation by 155,000xg during 16 hours) and 114 freezing. An early transmission study demonstrated that transmission can 115 occur via ingestion of infected colostrum (Cork et al., 1974). In this study 116 Manuscrito 5. Use of Formic Acid and Sodium Dodecyl Sulfate to inactivate Caprine Arthritis Encephalitis Virus (CAEV) in goat colostrum. 123 25% of goat kids removed from their dams post-parturition and fed 117 colostrum/milk from their infected dams or infected dams from the herd, 118 showed clinical signs consistent with CAEV induced disease within 2–4 119 months of birth. 120 Traditionally, prevention CAEV transmission includes heat treatment 121 of colostrum or the feeding of cow colostrum along with the segregation and 122 culling of seropositive animals (Rowe et al., 1992; Turin et al., 2005; Reina et 123 al., 2009). Heat treatment can play a crucial role in preventing colostrum 124 transmission of the CAEV. Adams et al. (1983) demonstrated the inactivation 125 of CAEV in goat colostrum after 60 minutes of heat treatment at 56ºC. Rowe 126 et al. (1991, 1992) demonstrated that goat kids that received unpasteurized 127 milk were 3.3 times more likely to seroconvert by Agar Gel Immune–128 Diffusion (AGID) than goat kids fed with heat treated milk. Ellis et al. (1983), 129 working with 24 newborn goat kids separated from their dam, colostrum–130 deprived and fed cow’s milk, found that only one kid seroconverted by AGID 131 by day 370. Finally, Péretz et al. (1994) observed infection rates drop from 132 49.5 to 25% in two years in female kid goats feed cow colostrum or goat 133 colostrum heated to 56 ºC for 1 hour compared to an infection rate of 45% in 134 goats given untreated colostrum. 135 Several research groups, including ours, have investigated the effects of 136 heat treatment on IgG concentration of cattle colostrum; Meylan et al. (1996) 137 and Tyler et al. (2000) found that heat treatment (63ºC during 30 minutes and 138 76ºC vs 63ºC, respectively) reduced IgG levels and that this reduction of 139 measurable IgG was significant enough to affect passive transfer of immunity 140 Manuscrito 5. Use of Formic Acid and Sodium Dodecyl Sulfate to inactivate Caprine Arthritis Encephalitis Virus (CAEV) in goat colostrum. 124 to calves (Lakritz et al., 2000). In goat colostrum, Argüello et al. (2003); 141 Trujillo et al. (2007) and Morales–delaNuez et al. (2011), demonstrated that 142 heat treatment (56ºC for 60 minutes), resulted in a 37%, 14% and 29% 143 reduction in the IgG levels, respectively. 144 Aside from detrimental effects on immunoglobulin components in 145 colostrum, heat treatment of colostrum can prove to be technically 146 challenging and time consuming in order to provide thorough heating and 147 effective viral inactivation. Moreover, heat treatment requires the need of 148 special equipment including electricity and proper mixing, which in many 149 cases is not available in the field. Alternate preventative methods such as 150 feeding cow colostrum to dairy goats can be accompanied by detrimental 151 results, including a risk of contracting Johne’s disease ( Mycobacterium avium 152 subsp. paratuberculosis ) from cattle (Trujillo, personal communication and 153 Patel et al., 2012) and the lack of passive transfer immunity to caprine 154 pathogens, thus compromising kid goat immunity. 155 Given the disadvantages of heat treatment of colostrum and the feeding 156 of replacement products despite documented efficacy in the reduction of 157 transmission of CAEV, alternative methods to sanitize ruminant colostrum 158 and milk products have been proposed. These include acidification of 159 colostrum (Muller and Syhre, 1975; Rindsig and Janecke, 1975; Otterby et al., 160 1976); high pressure treatment (Trujillo et al., 2007) and the addition of 161 Sodium Dodecyl Sulfate (Morales–delaNuez et al., 2011). 162 Rindsig and Janecke (1975) found that bovine colostrum treated with 163 1–1.5% of Propionic acid reduced bacterial counts. West et al. (2010) 164 Manuscrito 5. Use of Formic Acid and Sodium Dodecyl Sulfate to inactivate Caprine Arthritis Encephalitis Virus (CAEV) in goat colostrum. 125 demonstrated no effect of Formic acid acidification on the passive transfer 165 and absorption of immunoglobulins following treatment of bovine colostrum 166 in calves. At 12 and 24 hours of age, immunoglobulin levels, and total serum 167 protein were identical in calves fed formic acid acidified colostrum and those 168 fed non–acidified colostrum. Polzin et al. (1976) analyzed the nutritional 169 changes of naturally fermented and acidified colostrum (Propionic, Acetic and 170 Formic acid) and they found no difference in gamma–globulin concentration 171 of bovine colostrum. 172 Formic acid acidification of cow milk and colostrum has been 173 documented to provide antimicrobial effects in the prevention of fermentation 174 during free choice feeding with little to no detrimental effects on calf health 175 (Polzin et al., 1976; Todd et al., 2010; Vickers et al., 2011; Collings et al., 176 2011). Several authors refer to the use of Formic acid as a method of cold 177 pasteurization of colostrum which is effective at lowering aerobic bacteria 178 counts in colostrum and does not interfere with IgG levels or absorption in 179 calves (Vickers et al., 2011). Moreover, Formic acid acidification combining 180 with free choice feeding of calves is an accepted method in Canada 181 (Anderson, 2008). 182 Hartmann et al. (2006) provide in vitro proof of concept that Human 183 Immunodeficiency virus type 1 (HIV–1), a human retrovirus, can be 184 inactivated in human breast milk with inexpensive microbicides including 185 SDS and that important human milk constituents, such as; fat, energy or 186 proteins, are conserved. Morales–delaNuez (2011), using 1% SDS to treat 187 goat colostrum, observed similar effects to heat treatment (56ºC for 1 hour) of 188 Manuscrito 5. Use of Formic Acid and Sodium Dodecyl Sulfate to inactivate Caprine Arthritis Encephalitis Virus (CAEV) in goat colostrum. 126 colostrum on bacterial growth. Goats can be fed free choice SDS treated 189 colostrum without detrimental effects on immune passive transfer of 190 immunity or nutritional components (Morales-delaNuez et al., 2011). 191 Based on data in calves and goats with regard to the ingestion of SDS 192 and Formic acid treated colostrum and/or milk and in the demonstrated 193 antimicrobial activity of SDS and acidification, we decided to evaluate the 194 efficacy of SDS and Formic acid in inactivation of CAEV. The objective of 195 this study was to evaluate the in vitro efficacy of Formic acid and SDS in the 196 inactivation of CAEV in goat colostrum . 197 MATERIAL AND METHODS 198 Cell Culture 199 Goat synovial membrane (GSM) cells were obtained from the 200 explanted carpal synovial membrane of a CAEV free goat kid using methods 201 previously described (Narayan et al., 1980). The resultant primary cell line 202 was expanded by cultivation in Dulbecco's modified Eagle's medium 203 (DMEM) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (FBS) and stored in 204 liquid nitrogen as low passaged stocks. GSM cells are highly permissive to 205 CAEV infection and demonstrate evidence of infection through the formation 206 of syncytial cells 8-14 days post infection 207 208 Colostrum treatment 209 Manuscrito 5. Use of Formic Acid and Sodium Dodecyl Sulfate to inactivate Caprine Arthritis Encephalitis Virus (CAEV) in goat colostrum. 127 Archived colostrum from a CAEV free goat from a CAEV free 210 research herd from Washington State was available for use in this study 211 (stored at -80 ºC long term). 212 Raw, fresh goat colostrum was collected from CAEV seronegative 213 goats during the first milking post-parturition. Goats were from two dairy goat 214 farms in Iowa, United States and the seronegative status was confirmed by 215 repeated testing with the SRLV CI-ELISA (VMRD, Pullman WA, USA) over 216 3 years. Skim colostrum was prepared by removal of the cell pellet and fat 217 plug following centrifugation (5000xG for 15 minutes at room temperature). 218 Skim colostrum was stored at -80ºC until use (stored at less than 6 months). 219 For this study, three different skim colostrum samples were used (designated 220 as colostrum 1, 2 and 3); one colostrum sample was obtained from a single 221 goat, Washington archived sample (colostrum 1), the second sample 222 (colostrum 2) comprised pooled colostrum from multiple goats from Iowa, 223 and third sample (colostrum 3) comprised a pool of colostrum from a second 224 group of Iowa goats. Pool 2 and 3 contained colostrum originating from both 225 farms and consisted of raw skim colostrum. 226 For experimental trials, CAEV free colostrum samples were spiked 227 with 3 different strains of CAE virus for determination of Formic acid 228 acidification efficacy and 2 different strains of CAE virus to evaluate SDS 229 efficacy. Figures 1 and 2 show the experimental design for Formic acid and 230 SDS treatments. Control groups included colostrum spiked with CAEV but 231 not treated with Formic acid or SDS. Virus titration controls included DMEM 232 media spiked with CAE virus strains an not treated. 233 Manuscrito 5. Use of Formic Acid and Sodium Dodecyl Sulfate to inactivate Caprine Arthritis Encephalitis Virus (CAEV) in goat colostrum. 128 CAE virus strains used in this study are infectious and pathogenic in 234 goats causing typical CAE arthritis and mastitis. One CAEV strain, CO–90 is 235 an infectious clone derived by transfection of GSM cells with CAEV–CO 236 proviral DNA (Pyper et al., 1986; Saltarelli et al., 1990). The provirus 237 sequence used to derive this infectious clone originated from the brain of a 238 goat with encephalitis. CAEV-63 is the prototypic CAEV strain isolated from 239 a goat with arthritis (Crawford et al., 1980). CAEV 1g5 was isolated from a 240 California goat by co-culture of peripheral blood mononuclear cells with goat 241 synovial membrane (GSM) cells (Trujillo et al., 2004a, 2004b). All CAEV 242 virus stocks are stored at -80ºC in Dulbecco's Modified Eagle Medium 243 (DMEM) as high titer stocks. CAEV stocks were thawed at 4ºC and utilized 244 to spike colostrum pools at a known virus titer. 245 All experiments were performed in a certified BSL2 laboratory at Iowa 246 State University under the approval of the Institutional Biosafety Committee, 247 Office for Responsible Research, Iowa State University, Ames Iowa, USA. 248 249 Formic acid inactivation 250 Eight aliquots of virus spiked colostrum (3 samples x 8 aliquots x 3 251 virus strains) were made in a biosafety cabinet. Two of these aliquots were 252 acidified to pH 3 (pH 3 group) using a solution of 10% of Formic acid (Fisher 253 Scientific, USA), one aliquate was acidified for 15 minutes and the other one 254 for 30 minutes. Four aliquots were acidified to a pH 4, and 4.5 for 15 or 30 255 minutes. Two aliquots served as non acidified (CNA group). Following the 256 acidification time the pH was returned to neutral using NaOH 1N prior to 257 Manuscrito 5. Use of Formic Acid and Sodium Dodecyl Sulfate to inactivate Caprine Arthritis Encephalitis Virus (CAEV) in goat colostrum. 129 determination of the virus endpoint titer on GSM cells (described below). 258 Experiments were initially performed using the three virus strain spiked into 259 DME media experiments utilizing the same dilution then performed in 260 colostrum, in order to obtain the control virus titer (positive) 261 SDS inactivation 262 Three aliquots of colostrum samples were spiked with two strains of 263 CAEV (CAEV-CO and 1g5) (3 samples x 3 aliquot x 2 virus). One aliquot 264 was treated with 10% (v/v) of a 10% SDS solution; final concentration of 1% 265 SDS. The second aliquot was treated with 10% (v/v) of SDS solution (1%); 266 final concentration of 0.1% SDS. The last aliquot was treated with 10% 267 distilled water (No SDS control). Experiments were initially performed using 268 the two virus strains spiked into DMEM utilizing the same dilution as those in 269 which colostrum treatments, in order to obtain the control virus titers 270 (positive) without colostrum. Prior to determination of the virus endpoint titer 271 on GSM cells (described below) of treatment groups, residual SDS, toxic to 272 GSM cells at a concentration greater that 0.01%, needed to be removed. The 273 samples were diluted (1:15 inDMEM), and centrifuged (3000xg, 30 minutes) 274 in a Centriprep Ultracel 10,000 MW cut off (Milipore, Ireland). These steps 275 were performed four times for 1% SDS treated samples and three times for 276 0.1% SDS treated samples, for concentration of residual virus and removal of 277 SDS through centrifugation dialysis. 278 279 Titration and TCID 50 calculation 280 Manuscrito 5. Use of Formic Acid and Sodium Dodecyl Sulfate to inactivate Caprine Arthritis Encephalitis Virus (CAEV) in goat colostrum. 136 and viral quasi–species compartmentalization of lentiviruses resulting in 424 variable biological activities and susceptibility to host antiviral defenses is 425 well documented in HIV-1 research. Pisoni et al. (2007) observed that the 426 viral genotypes present in colostrum are different from those found in blood. 427 Studies of HIV–1–infected patients have demonstrated an apparent 428 compartmentalization of viral envelope quasi–species among different host 429 tissues (Gupta et al., 2000; Becquart et al., 2002; Zhang et al., 2002). 430 Becquart et al. (2002) have demonstrated a compartmentalization of HIV–1 431 between breast milk and peripheral blood of infected mothers and, within the 432 breast milk, between free virus and provirus. Additionally, in a macaque–SIV 433 model of virus transmission by breast–feeding, the authors found evidence 434 that the viral genotypes selectively transmitted to infants by breast–feeding 435 represent variants that may be particularly adapted for expression in milk 436 (Rychert et al., 2006). So perhaps along with less laboratory adaptation, tissue 437 compartment specific virus isolates might be an partial explanation for the 438 differential antiviral effect of colostrum pools on various CAEV strain 439 utilized in this study. However, in this study virus titration were performed on 440 GSM and not in mammary cells so one might suspect this to be a minor 441 contributor. 442 443 CONCLUSION 444 In conclusion, formic acid acidification until pH 4 is able to inactivate 445 CAEV in colostrum and SDS has effect in the CAEV infectivity too. So, these 446 Manuscrito 5. Use of Formic Acid and Sodium Dodecyl Sulfate to inactivate Caprine Arthritis Encephalitis Virus (CAEV) in goat colostrum. 137 two chemical products provide an option to use in CAEV inactivation in goat 447 colostrum. 448 Further research would be necessary in order to elucidate the effect of 449 formic acid and SDS on CAEV infectivity and transmission of the virus by 450 the colostrum to the goat kids and these experiments are planned. To clarify 451 the effects of bioactive component of colostrum on different virus strain 452 collected from different body goat compartment or different cell culture 453 collection, for example mammary gland cell culture. Also, it would be 454 worthwhile to investigate/identify the inherent antiviral component in goat 455 colostrum. 456 457 ACKNOWLEDGMENTS 458 We gratefully acknowledge the technician Adam Herrick, the PhD student 459 Khushboo Hemnani, and the veterinary student Alejandro Larios by their help 460 in this research. Funding for this study was provided by Center for Advanced 461 Host Defense Immunobiotics and Translational Comparative Medicine 462 (CAHDIT). 463 464 Manuscrito 5. Use of Formic Acid and Sodium Dodecyl Sulfate to inactivate Caprine Arthritis Encephalitis Virus (CAEV) in goat colostrum. 138 REFERENCES 465 Adams, D.S., P. Klevjer–Anderson, J.L. Carlson, T.C. McGuire and J.R. 466 Gorham. 1983. Transmission and control of caprine arthritis–467 encephalitis virus. Am J. Vet. Res. 44, 1670–1675. 468 Al–Ani, F. K. and J.G.E. Vestweber. 1984. Caprine arthritis–encephalitis 469 syndrome (CAE): A review. Vet Res conmun. 8: 243–253. 470 Anderson, N. 2008. Setting Up the System Using Formic Acid, Facts Sheet. 471 http://www.omafra.gov.on.ca/english/livestock/dairy/facts/formicacid.p472 df 473 Argüello, A., N. Castro, J. Capote, R. Ginés, F. Acosta and J.L. López. 2003. 474 Effect of refrigeration, freezing–thawing and pasteurization on IgG 475 goat colostrum preservation. Small Ruminant. 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