Variantes genéticas de la proteina D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincital (VRS)

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD DEPARTAMENTO DE CIENCIAS CLÍNICAS SVETLANA PAVLOVIC NESIC VARIANTES GENÉTICAS DE LA PROTEINA D DEL SURFACTANTE PULMONAR (SP-D): PAPEL EN LA SUSCEPTIBILIDAD Y GRAVEDAD DE LA INFECCIÓN POR VIRUS RESPIRATORIO SINCITIAL (VRS) Tesis doctoral presentada por Dña. Svetlana Pavlovic Nesic Dirigida por los doctores D. Luis Peña Quintana y D. José Carlos Rodríguez Gallego Dedicado a mi hija y mi marido Conocer es usar y generar Gracias Mili por tu apoyo, por animarme en todo lo que hago, por tu compresión, paciencia, cariño, gracias por estar siempre conmigo. Gracias Nina, por comprender que tu mamá en los últimos meses tenía un trabajo muy importante que terminar. Gracias por tus besos en los momentos difíciles, gracias por darme ánimo. Gracias por la ayuda que me has dado. Eres una hija maravillosa. Quisiera aprovechar estas líneas para expresar mi más sincero agradecimiento a todos aquellos que han hecho posible que esta tesis sea una realidad. He tenido la suerte de contar con el apoyo, la ayuda y cariño de muchas personas que han sido fundamentales durante todo este tiempo y que de alguna manera forman parte de este trabajo. Gracias, especialmente a mis directores de tesis, a los doctores D. Luis Peña Quintana y, D. José Carlos Rodríguez-Gallego, por su constante apoyo, dedicación y ayuda, por animarme en los momentos difíciles y sobre todo por confiar en mí. Por ofrecerme su apoyo en todo momento, por escuchar y resolver mis dudas y por corregir y mejorar minuciosamente este trabajo. Gracias a Estefanía Herrera Ramos, gracias por tu disponibilidad, tus consejos y por el trabajo realizado. Agradecimiento especial para mi compañera y amiga María Rosario García Luzardo, Sara, gracias por todo. Gracias al Dr. Antonio Aguilar por su apoyo en la recogida de datos. Quisiera agredecer al Profesor Dr.D. Pedro Saavedra Santana por su tiempo y predisposición. Por su aportación con la estadíastica en este proyecto. También me gustaría agradecer a María Trujillo García y a Rosa Rodríguez Rodríguez, por llevar todos estos “tubos” al laboratorio y siempre con una sonrisa. Gracias a Inma, Virginia y Héctor por el apoyo y el trabajo. Gracias a todos mis compañeros, es un placer trabajar cada día en un equipo de excelentes profesionales, siempre dispuestos a ayudar. Gracias a mis padres y mi hermano por confiar en mí. Gracias mami, Divna-Nina, todo lo que soy te debo a ti, has sido mi mejor ejemplo y apoyo en todos estos años, en los momentos complicados pienso en tus consejos y tu cariño y todo se hace más fácil. Muchas gracias a todos, por entender mi profesión y por estar conmigo. ÍNDICE ÍNDICE ÍNDICE ÍNDICE DE FIGURAS ÍNDICE DE TABLAS ABREVIATURAS RESEÑA HISTÓRICA INTRODUCCIÓN ..................................................................................................5 1.1 BASE TEÓRICA .........................................................................................5 1.2 VIRUS RESPIRATORIO SINCITIAL ..........................................................6 1.2.1. Características del Virus ..................................................................6 1.2.2. Epidemiología ...................................................................................9 1.3 BRONQUIOLITIS AGUDA .........................................................................10 1.3.1. Definición ..........................................................................................10 1.3.2. Incidencia y Clínica ...........................................................................11 1.3.3. Diagnóstico .......................................................................................13 1.3.4. Pruebas complementarias ...............................................................14 1.3.5. Tratamiento .......................................................................................15 1.3.5.1. Fármacos .....................................................................................18 1.3.5.1.1. Broncodilatadores adrenérgicos ..........................................18 1.3.5.1.2. Corticoides ..........................................................................19 ABREVIATURAS ABREVIATURAS INGLÉS ESPAÑOL CD cluster differentiation diferenciación cluster CR complement receptor receptor del complemento CRD carbohidrate recognition domain dominio de reconocimiento de carbohidratos CTLA4 cytotoxic Tlymphocyte antigen antígeno 4 del linfocito T citotóxico DPPC EDTA ELISA gp-340 GWAS HDN HWE ILC LAIR1 LD LPS LRP1 MAF MBL MD2 MFAP4 MPO PAMPs PC PCR PE PI pRDS PRR dipalmitoyl phosphatidylcholine ethylenediaminetetra acetic acid enzime linked immunosorbant assay glycoprotein 340 genome wide association studies human neutrophil defensins Hardy – Weinberg equilibrium innate lymphoid cell leukocyte – associated Ig-like receptor 1 linkage disequilibrium lipopolysaccharide low density lipoprotein related protein 1 minor alelle frequency mannose-binding myeloid differentiation factor 2 microfibrilassociated protein 4 myeloperxidase pattogen-associated molecular pathern phosphatidylcholine polymerase chain reacction phosphatidylglycerol phosphatidylinositol prematurely borninfants with respiratory distress síndrome pattern-recognition receptor dipalmitoilfosfatidilcolina ácido etildiaminotetraacético inmunoensayo de absorción ligado a enzimas glicoproteína 340 estudios de asociación de genoma completo defensinas producidos por neutrófilos humanos equilibrio de Hardy – Weinberg células linfoides innatas receptor 1 de tipo inmunoglobulina asociado al leucocito desequilibrio de ligamento lipopolisacárido proteína 1 relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad frecuencia del alelo menos frecuente lectina de unión a manosa factor 2 de diferenciación mieloide proteína 4 asociada a microfibrilla mieloperoxidasa patrones moleculares asociados a patógenos fosfatidilcolina reacción en cadena de la polimerasa fosfatidilglicerol fosfatidilinositol síndrome de dificultad respiratoria en el recién nacido prematuro receptores reconocedores de patrones PS rhSPD SIRPα phosphatidyserine recombinant human SP-D signal inhibitory regulatory protein alfa fosfatidilserina SP-D humana recombinante Proteína de señal reguladora alfa SNP SP SPR210 SSP-PCR TLR single nucleotide polymorphism surfactant protein specific 210-kDa SP-A receptor sequence-specific primers PCR Toll like receptors polimorfismos de un solo nucleótido proteína surfactante receptor de 210kda específico para SPA PCR con primers de secuencia específica receptores de membrana tipo Toll CI Confidence interval Intervalo de confianza Español A ADN Arg ARN Asn Asp BA C CEIC Cys CHUIMI Derp EPOC G HA HUMIC Ig ILe IRA Met N NA OR pb adenina ácido desoxirribonucleico arginina ácido ribonucleico asparagina ácido aspártico bronquiolitis aguda citosina comité ético de investigación clínica cisteína Complejo Hospitalario Universitario Insular Materno Infantil Dermatophagoides pteronyssinus enfermedad pulmonar obstructiva crónica guanina hemaglutinina Hospital Universitario Materno Infantil de Canarias inmunoglobulina isoleucina insuficiencia respiratoria aguda metionina tamaño muestral neuranimidasa odds ratio pares de bases SDRA T Thr Val VRS Síndrome de distres respiratorio agudo Timina Treonina Valina Virus respiratorio sincitial Reseña Histórica La Bronquiolitis Aguda (BA) es una enfermedad respiratoria de inicio agudo, con dificultad predominante respiratoria, y signos acompañantes de infección vírica (coriza, otitis, fiebre). El Virus Respiratorio Sincitial (VRS) es el principal agente infeccioso de la BA. Los brotes de la enfermedad se producen en invierno o en primavera. El VRS fue descubierto en 1956, cuando Morritis y cols., aislaron un nuevo virus de chimpancé en un grupo de primates que estaban enfermos con resfriado. En ese momento no se sabía que este virus podría causar infecciones respiratorias en seres humanos (Morris y cols., 1956). Posteriormente, Chanock y Finberg, detectaron un aumento en los niveles de anticuerpos neutralizantes específicos frente al virus causante del coriza del chimpancé en niños con patología de vías respiratorias (Chanock y Finberg., 1957). De ésta forma se vio que el nombre del agente infeccioso del coriza del chimpancé no era adecuado para este virus y desde entonces se ha denoominado Virus Respiratorio Sincitial (VRS) por sus manifestaciones clínicas y de laboratorio (Chanock y cols., 1961). En la década de los 60 del siglo pasado se descubrió una sustancia pulmonar necesaria e imprescindible para la función respiratoria normal en los recién nacidos (RN), el surfactante pulmonar, que evita el colapso alveolar, siendo además un componente esencial de la inmunidad innata (Gluck, 1971). En los años 80 del siglo pasado se describió el síndrome de distrés respiratorio (pRDS) en recién nacidos prematuros (Hallman y cols., 1977). INTRODUCCIÓN Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 5 1. INTRODUCCIÓN 1.1. BASE TEÓRICA Tradicionalmente se ha considerado que la susceptibilidad y la gravedad de las enfermedades respiratorias dependen de los factores externos, pero cada vez es más evidente que están influenciados por la variación de nuestro material genético. La Bronquiolitis aguda (BA) es una afectación de las vías respiratorias bajas en niños menores de dos años de edad producida por una infección por virus, entre los que juega un papel importante el virus respiratorio sincitial (VRS). Se ha demostrado que variaciones en genes codificantes de componentes del sistema inmunológico pueden aumentar la susceptibilidad a padecer diversas enfermedades como infecciones, neoplasias o enfermedades autoinmunes. El papel del sistema inmunológico en la defensa frente a la infección se puede explicar mediante el estudio de enfermedades mendelianas monogénicas como las inmunodeficiencias primarias o congénitas. La herencia mendeliana simple se caracteriza por individuos que presentan mutaciones poco frecuentes en un único gen o fragmento cromosómico, que cursan con manifestaciones clínicas de la enfermedad (manifestación fenotípica) y tienen una alta penetrancia. Pero en ocasiones no se encuentra una única mutación causal en el ácido desoxirribonucleico (ADN), sino que distintas variantes pueden actuar a través de un modelo de herencia complejo de baja penetrancia. Una gran diversidad de variantes genéticas se presentan en la naturaleza y están relacionadas con la adaptación y la biodiversidad. Además, un elemento común para la evolución y la estabilidad de las especies son las variaciones genéticas polimórficas. En concreto, los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), resultado de la presencia de una base nucleótida que Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 12 enfermedades neuromusculares debilitantes, metabolopatías, cardiopatías con repercusión hemodinámica, neonatos y lactantes menores de 2 meses. La mortalidad global es baja en niños previamente sanos, pero aumenta considerablemente en los pacientes con las patologías de base mencionadas (Garcia y cols., 2007). La eliminación del virus a través de las secreciones nasofaríngeas se prolonga de 6 a 21días desde el inicio de los síntomas e incluso más de 6 semanas en el paciente inmunodeprimido. No existen portadores sanos de VRS, en niños mayores y adultos ocasiona cuadros pseudogripales. La inmunidad generada es relativamente corta. Pueden haber reinfecciones, que pueden producirse en semanas posteriores a la recuperación, aunque por lo general suelen darse en epidemias posteriores, siendo la tasa de reinfección por epidemia de hasta un 20%. Los anticuerpos maternos transmitidos a través de la placenta tienen algún efecto protector en el neonato, lo que explica que las infecciones graves sean infrecuentes en las primeras 4-6 semanas de vida. Tras una bronquiolitis por VRS es frecuente la recidiva de episodios de sibilantes, hasta en un 30-80% de los lactantes que padecieron una bronquiolitis importante. La prevalencia de estas recidivas va disminuyendo hacia los 3-5 años de edad. No es fácil sin embargo, determinar “a priori” qué lactantes presentará recurrencias. El periodo de incubación dura de 4 a 5 días, luego el virus se replica en nasofaringe y se disemina a las vías respiratorias inferiores. Los síntomas de vías altas suelen ser tos, rinorrea, estornudos con o sin fiebre, que duran de uno a tres días; después de estos aparecen los síntomas de vías respiratorias bajas como tos más intensa, dificultad respiratoria progresiva con aparición de sibilantes, taquipnea, tiraje y dificultad más o menos intensa para la alimentación. En los casos más severos progresan la tos y la dificultad respiratoria se hace más importante, apareciendo rechazo de la alimentación, postración, Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 13 taquipnea y en algunos casos cianosis y crisis de apnea. Es el primer episodio de sibilancias tal y como se indica en la definición. Las pausas de apnea pueden ser un síntoma inicial de bronquiolitis, especialmente en lactantes pequeños y prematuros y constituyen un factor de riesgo importante para desarrollar un cuadro grave. El VRS puede producir pausas de apnea en lactantes pequeños incluso sin signos de bronquiolitis. En el primer mes de vida la clínica puede ser atípica, con febrícula, irritabilidad, rechazo de la alimentación y apnea central, confundiéndose muchas veces con sepsis. En ocasiones puede acompañarse de complicaciones infecciosas del aparato respiratorio como otitis media (30-50%) y neumonía (15%) (Eriksson y cols., 2002). Dada la evolución clínica de la bronquiolitis, conviene recomendar la reevaluación clínica en un plazo de 72 horas en los lactantes menores de 12 meses. En la exploración podemos encontrarnos un tórax hiperinsuflado, taquipnea, tiraje subcostal, intercostal, supraesternal, aleteo nasal e incluso sibilancias audibles sin fonendoscopio. A la auscultación pulmonar el hallazgo más común son la espiración alargada, hipoventilación, roncus y los sibilantes de predominio espiratorio; los crepitantes finos inspiratorios y los subcrepitantes no son infrecuentes, de hecho pueden ser el principal hallazgo auscultatorio en los lactantes más pequeños. 1.3.3. Diagnóstico Es fundamentalmente clínico, debiéndose cumplir los siguientes requisitos, siguiendo los criterios de McConnochie: edad menor de 24 meses, primer episodio y cuadro clínico mencionado previamente (McConnochie, 1993). Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 14 1.3.4. Pruebas complementarias  La saturación de oxígeno es un signo para la predicción de hipoxemia y la valoración clínica (Tabla 1). La pulsioximetría tanscutánea es un método sencillo, incruento y tiene una buena correlación con la PaO2 sanguínea. Se recomienda su determinación en todos los pacientes con bronquiolitis (Schroeder y cols., 2004)  La radiografía de tórax en la mayoría de pacientes no muestra alteraciones significativas, salvo el atrapamiento aéreo esperado. Puede observarse hiperinsuflación pulmonar, infiltrados peribronquiales o atelectasias laminares. En algunos estudios recientes se ha señalado que la presencia de fiebre igual o superior a 38ºC y la saturación menor al 94% se asocian significativamente a la existencia de infiltrados o atelectasias (Garcia Garcia y cols., 2004).  Hemograma, PCR, en casos con clínica moderada y/o grave (Purcell y cols., 2004).  Identificación de virus (cultivo en lavado nasofaríngeo): Los test rápidos para detectar anticuerpos de VRS con inmunofluorescencia directa tienen una sensibilidad entre 80-90%, su principal utilidad es en casos de diagnóstico incierto (ej.; distress en cardiópata, “bronquiolitis incipientes” en pacientes de riesgo…) o para establecer medidas de aislamiento. Los estudios microbiológicos sólo tienen utilidad epidemiológica y no son precisos para efectuar el diagnóstico que “es clínico” ni para orientar la terapia ni modificar el manejo del paciente (Reis y cols., 2008). Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 15 Tabla 1: Sistema de puntuación clínica de Wood-Downes modificado. PUNTUACIÓN 0 1 2 Sat 02 ≥ 95% respirando aire ambiente 92-95% respirando aire ambiente ≤ 92% respirando aire ambiente Frecuencia respiratoria < 50 rpm 50-60 rpm > 60 rpm Sibilancias espiratorias Cortas Toda la espiración Inspiración y espiración o audibles sin fonendoscopio o hipoventilación Musculatura accesoria Ninguna o ligera intercostal Intercostal moderada y supraesternal Intensas, Aleteo nasal, bamboleo del tórax Interpretación de la escala: Afectación leve: 0-3 puntos. Afectación moderada: 4-5 puntos. Afectación grave: 6 ó más puntos; rpm: Frecuencia respiratoria por minuto; 1.3.5. Tratamiento La BA por VRS es una enfermedad autolimitada, y con frecuencia de gravedad leve/moderada, por lo que la mayoría de los niños pueden tratarse en su domicilio con medidas generales, sabiendo que la fase crítica son las primeras 4872 horas. No existe un tratamiento de soporte específico en el manejo de BA. Se consideran recomendaciones en la opinión de experto y en la buena práctica clínica las siguientes: - Los pacientes con dificultad respiratoria grave y/o cianosis y/o SatO2 < 92 deben recibir oxigenoterapia. - Se recomienda aspirar secreciones de las vías respiratorias altas antes de las tomas, antes de valorar la gravedad y antes de cada tratamiento inhalatorio. - Se debe valorar el estado de hidratación y la capacidad de tomar líquidos. Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 16 - Se recomienda fraccionar y/o espaciar la toma si se objetiva dificultad para la ingesta. - La alimentación por sonda nasogástrica (SNG) puede ser una opción en los niños con riesgo de deshidratación y desnutrición. - En los niños más grave o en los que no toleran por vía oral se recomienda canalizar una vía e hidratar por vía intravenosa. - Se debe evitar la exposición al tabaco. - No se recomienda el uso rutinario de salbutamol o adrenalina inhalada o nebulizada, sólo es útil en los casos que tengan una buena respuesta terapéutica y siempre valorando la relación riesgobeneficio. - Los corticoides inhalados no son útiles en el tratamiento de la BA. La evidencia actual indica que los glucocorticoides sistémicos o inhalados no aportan un efecto clínicamente relevante en la reducción de los ingresos hospitalarios o la duración de la hospitalización. - La ribavirina nebulizada tampoco debe utilizarse sistemáticamente. El efecto de la ribavirina tiene un escaso impacto clínico. Podría considerarse restringido su uso a pacientes con infecciones respiratorias por VRS grave de alto riesgo. - El suero salino hipertónico parece ser eficaz y útil en el manejo de la BA del paciente hospitalizado, por no tener una relación favorable con la mejoría clínica en los primeros tres días y una potencial disminución de las tasas de hospitalización. Sin embargo, los últimos estudios de Havard Ove Skjerven y cols. 2015, no han encontrado ningún beneficio en los pacientes ingresados con BA por VRS cuando recibieron tratamiento con suero salino hipertónico nebulizado, frente a medidas de soporte. Tampoco descendió la duración de la hospitalización. - Se ha propuesto la ventilación no invasiva o presión positiva continua de las vías respiratorias (CPAP) o doble nivel de presión positiva de las vías respiratorias (BiPAP), como una alternativa o paso intermedio, antes de la Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 17 ventilación invasiva, de forma particular en aquellos pacientes con crisis de apnea frecuentes. - Se debe considerar el uso selectivo de heliox en BA moderada–grave administrándolo con mascarilla reservorio-oxigeno y de forma continua con una concentración 70/30 en los casos de BA grave. Se recomienda utilizar el heliox combinado con CPAP. - No se recomienda el uso general de las metilxantinas en la BA., Se podrían considerar como de uso alternativo en la BA con apnea en neonatos y/o en lactantes con antecedentes de prematuridad. - Ni el óxido nítrico, ni la DNAasa recombinante humana nebulizada, ni el interferón intramuscular, ni la furosemida nebulizada, ni la inmunogobulina intravenosa, ni el bromuro de ipratropio, ni la fisioterapia respiratoria se han demostrado eficaces en el tratamiento de la BA. Tampoco los antibióticos, considerándose inapropiado su uso. - El surfactante es recomendable en los casos de BA grave, pero no existen estudios de coste para valorar la relación coste-beneficio para este tipo de tratamiento. Las proteínas de surfactante asociada SP-A y SP-D son moléculas de reconocimiento de patrones con estructura colectina. La detección de alteraciones cualitativas y cuantitativas en el surfactante de lactantes con BA grave, constituye la base racional para la suplementación terapéutica de surfactante exógeno. El surfactante es una agente tensioactivo compuesto por proteínas y fosfolípidos que se produce en los neumocitos tipo 2, bien conocido en patología respiratoria neonatal para mejorar la estabilización alveolar al disminuir la tensión superficial. De sus cuatros componentes proteicos (A, B, C y D), dos de ellos (A y D) tienen capacidad de unirse a marcadores reconocidos en la superficie de bacterias y virus, como en el caso de BA por VRS. En este sentido no está claro si el uso del surfactante en BA por otros virus pudiera ser diferente (Willson y coll., 2005). La administración de surfactante en lactantes con BA grave que precisan ventilación mecánica parece una alternativa eficaz y segura. Las evidencias existentes, aunque limitadas, surgieren un efecto beneficioso clínico y gasométrico, así como una mejoría de la función pulmonar en las primeras 60 horas de su aplicación. Hay Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 18 que considerar si estos estudios son suficientes para su utilización en el tratamiento de la BA por VRS (Luchetti y coll., 2002). De una forma más específica se exponen los diferentes fármacos. 1.3.5.1. Fármacos 1.3.5.1.1. Broncodilatadores adrenérgicos Los broncodilatadores adrenérgicos como la adrenalina y el salbutamol, son los fármacos más estudiados y usados. Los estudios comparativos publicados con Adrenalina versus Salbutamol tampoco parecen demostrar una clara ventaja de uno sobre el otro; aunque en algún ensayo clínico se ha documentado la superioridad de la adrenalina sobre los beta-2. Se le atribuye al efecto alfa añadido, la mejoría de los scores clínicos en pacientes ingresados y, especialmente en los de urgencias, el menor tiempo de estancia hasta el alta y el menor número de ingresos en planta, aunque no modifican el tiempo de hospitalización (King y cols., 2004). Se necesitan más estudios para saber la dosis óptima de Adrenalina, pero en la mayoría de los protocolos se recomiendan dosis de 3 mg independientemente del peso o edad. Se presupone que la dosis debe ser similar independientemente del peso, porque la cantidad de fármaco que llega al pulmón depende del volumen Tidal. Los efectos adversos de ambos fármacos son por lo general clínicamente poco preocupantes; en general palidez, taquicardia, hipertensión arterial y vómitos, entre otros. En algunas series se han detectado en mayor proporción con el Salbutamol, en comparación con la Adrenalina. Culley, 2002 ha demostrado que la Adrenalina es segura en comparación con placebo y Salbutamol, sin evidenciarse efectos secundarios de gravedad. Hasta un 10% de los pacientes pueden sufrir una hipoxemia paradójica tras la administración de broncodilatadores, que hace necesaria la administración de oxigenoterapia transitoriamente (Karadag y cols., 2007). Los ensayos realizados con broncodilatadores orales no han demostrado eficacia. Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 19 1.3.5.1.2. Corticoides Se ha referido algún beneficio en su uso. Kuyucu S y cols., 2004 refieren que administrar en la fase inicial de la enfermedad una dosis de Dexametasona IM (0,6 mg/Kg) añadida a broncodilatadores nebulizados (L-adrenalina o Salbutamol) da lugar a una mejoría de los scores clínicos, frecuencia respiratoria (FR) y saturación en la fase tardía (5º día) de las bronquiolitis leve/moderada versus a broncodilatadores solos, sin diferencias significativas de estas variables antes del 5º día ni a los 2 meses. En cuanto a los corticoides inhalados la mayoría de trabajos, como el de Csonkay cols., 2003, encuentran alguna evidencia sobre su eficacia incluyendo tanto bronquiolitis como episodios de sibilancias recurrentes. Los que incluyen exclusivamente pacientes con bronquiolitis han demostrado ausencia de beneficios a corto y largo plazo, e incluso más efectos adversos (ej. reingresos) entre los pacientes que usaron esteroides inhalados. Wong JYW y cols. 2000 han observado un cierto descenso en las recidivas en bronquiolitis por Rinovirus. Hasta el momento actual, no se ha podido demostrar que la Budesonida nebulizada disminuya los síntomas en bronquiolitis aguda o prevenga sibilancias posteriores. 1.3.5.1.3. Anticuerpos IgG monoclonales frente a VRS (Palivizumab) La inmunoprofilaxis pasiva más utilizada frente a la BA es el Palivizumab (anticuerpos antiglucoproteína F monoclonales murinos humanizados frente al VRS). Reduce un 55% el riesgo de hospitalización en pacientes pediátricos de alto riesgo. En el subgrupo de prematuros se redujo la incidencia de hospitalización en un 78% y en el de enfermedad pulmonar crónica (EPC) un 39%. Parece ser útil para prevenir ingresos hospitalarios y en UMI, pero no para evitar la ventilación mecánica (Wang, 2006). Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 20 Son eficaces en la prevención en los grupos de riesgo, pero su uso en la enfermedad ya establecida no ha sido concluyente. Se ha demostrado su efecto antiviral en la enfermedad aguda al reducir el número de cultivos positivos, pero no hay significación clínica ni estadística en días de ingreso, mejoría de scores o necesidad de ventilación mecánica (Rodriguez, Gruber, 1997). En el metaanálisis realizado por Fuller, Del Mar, 2008 ninguno de los estudios incluidos demostró beneficio estadísticamente significativo del tratamiento con IgIV. No se han encontrado diferencias significativas en la duración de la hospitalización entre los tratados o no con Palivizumab. La profilaxis pasiva se administra una vez al mes a dosis de 15 mg/kg. Se usa en períodos epidémicos. Su inconveniente es el altísimo coste. 1.3.5.1.4. Montelukast Diversos estudios fisiopatológicos (Bisgard, 2003) sugieren que la vía de los leucotrienos está muy activada en la patogénesis de la bronquiolitis. De ahí que cuando surgieron los fármacos inhibidores de los leucotrienos, como montelukast, aprobados para el tratamiento del asma y las sibilancias recurrentes de los lactantes y preescolares era razonable que por la aparente analogía entre la BA y el asma y por su asociación epidemiológica, se pensara que éstos fármacos podrían constituir una alternativa definitiva en el manejo terapéutico de la BA, tanto de su sintomatología aguda como de las recurrencias postbronquiolitis. Sin embargo, los estudios diseñados a tal efecto hasta el momento actual no han podido demostrar que Montelukast sea eficaz para acelerar la curación de la BA en fase aguda ni para prevenir los síntomas postbronquiolitis durante la convalecencia. De estos estudios (Amirav y cols., 2008) se pueden extraer varias enseñanzas provechosas, la primera es que la BA y el asma (y sibilancias recurrentes del lactante y preescolar) son enfermedades completamente distintas y que el tratamiento eficaz de la BA es muy probable que no venga del tratamiento del asma (Bisgard y cols., 2008), (Martínez – Gimeno, 2009). Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 21 1.3.6. Recidivas Las recidivas tras bronquiolitis por Rinovirus oscilan en torno a un 63% frente a 20% para VRS. Tras una bronquiolitis grave por VRS es frecuente la recidiva de episodios de sibilantes, hasta en un 30-80%. La prevalencia de estas recidivas va disminuyendo hacia los 3-5 años de edad. No es fácil sin embargo, determinar “a priori” qué lactantes presenta recurrencias. Sin otros factores predisponentes, las recidivas cesan hacia los 11 años. Los pacientes con menos de 6 meses en pico epidémico tienen mayor riesgo de recidivas. Existe 5 veces más riesgo de asma si tienen 122 días en el momento de la bronquiolitis (Martínez – Gimeno, 2009). 1.3.7. Indicaciones de profilaxis La principal medida de prevención son las medidas higiénicas, tanto en los hogares y guarderías, como en centros sanitarios. Estas recomendaciones incluyen: lavado frecuente de manos, evitar tabaquismo pasivo, evitar el contagio a través de hermanos en edad escolar y la asistencia a guardería. Profilaxis activas-vacunas: aún no disponibles. En agosto de 2015 se ha publicado que el adenovirus de chimpancé PanAd3RSV y el virus vaccinia modificado Ankara, MVA-RSV, son vectores virales de replicación defectuosa que codifican la proteína de fusión F del VRS, de la nucleocápside (N) y de la matriz (M2-1), proteínas que sirven para la inducción humoral y la respuesta celular. Se ha realizado un estudio en adultos sanos, a los que se administró la vacuna, por vía intramuscular o intranasal, demostrándose su seguridad e inmunogenicidad. Además son muy bien toleradas y sin eventos adversos, excepto reacción local (Green Christopher y cols., 2015). Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 28 Una colectina muy importante es la lectina de unión a la manosa (MBL), un PRR (Pattern Recognition Receptors) importante del sistema inmunológico innnato que se une a bacterias, virus, hongos y protozoos. La MBL reconoce predominantemente hidratos de carbono en la superficie de microorganismos; pero también fosfolípidos, ácidos nucleicos y proteínas no glicosiladas. Son producidas junto con moléculas surfactantes por el hígado y secretadas al suero como reactantes de fase aguda. Se unen a los carbohidratos de las bacterias Gram positivas y negativas, hongos, virus y parásitos. 1.4.3. Inmunidad frente al Virus Respiratorio Sincitial Jacoby DB y cols. (1997) demostraron que existía susceptibilidad genética para la bronquiolitis por VRS según variantes de la IL 8. Un polimorfismo de un solo nucleótido en el gen de la IL8, relacionado con los niveles de producción del mismo, se ha asociado con la severidad de la enfermedad en niños con bronquiolitis por VRS (Heinzmann, 2004). Durante la bronquiolitis por VRS se liberan interleuquinas y cis-leucotrienos (cis-LT). La respuesta inmunitaria de las vías respiratorias a las infecciones virales incluye la liberación de una serie de interleuquinas proinflamatorias, la afluencia de macrófagos, linfocitos y eosinófilos (Gern, Busse, 2000), y la liberación de mediadores como los cis-LT, que se encuentran en mayores cantidades en la secreción de las vías respiratorias durante la infección por VRS (Garafalo y cols., 1992), (Volovitz y cols., 1988). La inmunidad por células T juega un papel clave en la eliminación de virus de los pulmones infectados. Dado que el desarrollo de la inmunidad adquirida por células T requiere de varios días, la activación de los mecanismos de inmunidad innata es esencial para que se contenga la infección vírica y para la posterior generación de una inmunidad específica. Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 29 El primer elemento celular de la respuesta innata a VRS son los macrófagos alveolares (MA). Experimentos in vitro, tanto en ratones como en humanos, han señalado que los MA se activan tras ser incubados con VRS, generando citoquinas proinflamatorias como TNFα, IL6 e interferones α y β (Panuska, 1990), (FrankeUllmann y cols., 1995). Las infecciones por virus de ARN, así como por el virus respiratorio sincitial y el virus de la gripe, son las mayores causas de inflamación de vías respiratorias. Los TLRs expresados en los compartimientos intracelulares (TLR3; 7; 8; 9) reconocen ácidos nucleicos de estos virus y de esta forma detectan la infección intracelular. En la BA el papel de la predisposición genética se sustenta en la fuerte asociación de la susceptibilidad a presentar formas más graves de infección con historia familiar de asma y en diferencias en la susceptibilidad según los distintos grupos étnicos, raciales o de sexo. Un trabajo realizado en Dinamarca por Jansen y cols., estudíaron 12346 pares de gemelos en un periodo de 10 años, relacionados con la hospitalización causada por VRS. La concordancia fue de 0,66 en los gemelos monocigóticos frente a 0,53 de los dicigóticos y se estimó una contribución genética del 16 a 20% en la gravedad de la enfermedad (Janssen y cols., 2007). La infección por los virus respiratorios generalmente se restringe a las células superficiales del epitelio respiratorio, a las células de los bronquiolos y de los neumocitos tipo 1, y en su curación participa la inmunidad innata y la adquirida. Las células epiteliales detectan virus VRS a través de receptores tipo Toll (TLR). Los TLR, mediante una cascada de señalización inducen la inmunidad innata con la expresión de una respuesta inflamatoria liberando distintas citocinas y quimocinas. El funcionamiento inadecuado o excesivo de estos mediadores inmunitarios de las vías respiratorias es regulado por distintos genes y puede aumentar la respuesta inflamatoria y causar daño en el tracto respiratorio. Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 30 El CX3C, fractalkina, es una proteína presente en los leucocitos que interacciona con el receptor CX3CR cuando se liga a la proteína G del VRS mediando reacciones inmunológicas posteriores. El polimorfismo T280M del receptor CX3CR se ha asociado a bronquiolitis grave por VRS (Amanatidou y cols., 2006). La gravedad se relaciona con un mayor inóculo del virus. La carga viral influye en la gravedad de la enfermedad (DeVincenzo y cols., 2005). Determinadas secuencias de la proteína G del virus pueden influir en el equilibrio Th/Th2 incrementando la respuesta Th2. La susceptibilidad de la enfermedad está influenciada por un número de factores genéticos y no genéticos. La mayoría pueden tener un nivel diferente de impacto en las diferentes etapas de la vida. Los componentes genéticos que determinan la susceptibilidad en la enfermedad pulmonar aguda y crónica han sido estudiados en diferentes contextos biológicos y se están correlacionando con los factores ambientales y/o contaminantes, las enfermedades bacterianas y víricas o las condiciones como el nacimiento prematuro o la necesidad de ventilación mecánica (Villar y cols., 2008). Se cree que la variabilidad en la presentación clínica de la BA por VRS tiene una base poligénica. Los datos epidemiológicos y clínicos no apoyan un modelo de herencia mendeliana de las enfermedades más comunes. En principio, los SNPs no alteran el fenotipo de un individuo, pero en determinadas condiciones ambientales pueden afectar a la función genética determinando la susceptibilidad a presentar una enfermedad como la bronquiolitis (Amanatidou y cols., 2009). Los genes que se estudian están implicados en el control directo del patógeno y pueden alterar la adhesión del virus, su fusión o replicación, o modificar la respuesta inmunológica posterior. Probablemente estos dos aspectos sobre el sistema inmunológico y la inflamación se combinan de distintas maneras en cada individuo según la edad y la genética propia. Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 31 En estudios sobre predisposición genética, se han encontrado polimorfismos en los genes relacionados con determinadas citocinas y quimiocinas incluyendo IL4 y su receptor, IL-8, IL-9, IL10, IL-13 (Puthothu y cols., 2006), y CCR5 (Hoebee y cols., 2003). También se han relacionado formas graves de la enfermedad con polimorfismos de genes implicados en la interacción célula-virus y señales intercelulares como CX3CR1, SP-A, SP-D (proteínas del surfactante implicados en la opsonización del virus) (TalG y cols., 2004) y TLR-4 (Haynes y cols., 2001). Así mismo se han relacionado determinados haplotipos genéticos de IL-13 con mayor gravedad de la enfermedad (Puthothu y cols. 2006). El complejo del receptor TLR4/CD14+ activado por la proteína F del VRS, tiene un importante papel en la respuesta innata al virus. Así, determinados polimorfismos en dicho receptor como el cambio en el aminoácido D259G (Puthothu y cols.,2006) o los alelos (299) Gly y (399) lle se asocian con menor señal del factor nuclear NF-kB, menor producción de IFN, IL-8, IL-10, IL-12p35, IL18 y ausencia de factor de necrosis tisular TNFa (Tulic y cols., 2007). Estudios experimentales en roedores carentes de TLR4 o con dichos polimorfismos han demostrado que la enfermedad se prolonga más en el tiempo y es más grave (KurtJones y cols., 2000). La variación genética en los genes implicados en la adaptación pulmonar puede contribuir, bajo ciertas condiciones, a las diferencias en la susceptibilidad de la enfermedad o a la severidad de la misma entre las personas. Estudios de la genética de los componentes del surfactante pulmonar y en particular de las proteínas del surfactante, han revelado la correlación con la enfermedad pulmonar en RN, niños y adultos (Flores y cols., 2003). Las variaciones genéticas y mutaciones de las proteínas del surfactante se han correlacionado con la susceptibilidad de la enfermedad o patogénesis (Flores y cols., 2009). Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 32 1.4.4. Proteínas asociadas al surfactante SP-A y SP-D El surfactante pulmonar (Figura 3), es un complejo de lipoproteínas, sintetizado por las células epiteliales tipo II en el pulmón. Su función es reducir la tensión superficial en la interfase aire-líquido alveolar y así evitar el colapso alveolar. Juega además un papel importante en la inmunidad innata siendo esencial para la vida, para la salud respiratoria y para la función pulmonar normal durante toda la vida (Flores y Kala, 1998). El surfactante pulmonar mantiene la integridad alveolar y juega un papel importante en la defensa pulmonar y en el control de la inflamación. Su principal función es reducir la tensión superficial en la interfase aire-liquido del interior del alveolo y prevenir el colapso alveolar. Está compuesto aproximadamente por 90-92% de lípidos y 8-10% de proteínas (Postle y cols., 2001; Weaver, 2010). La fracción lipídica está compuesta principalmente por fosfolípidos, la mayoría de los cuales es fosfatidilcolina (PC) y dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) un particular componente clave en la reducción de la tensión superficial. El segundo más abundante es fosfatidilglicerol (PS) y otros fosfolípidos, así como lípidos no fosforilado como el colesterol y los triglicéridos (Flores y Phelps, 1997). Es probable que cada uno de los componentes sea importante en la formación y absorción de la película, así como de su comportamiento en la superficie alveolar. Han sido identificadas cuatro proteínas asociadas al surfactante (SP: A, B, C y D) (White R y cols., 1985). El componente proteico del surfactante pulmonar consiste en proteínas de suero y proteínas del surfactante que originalmente se pensó que era específico solo para el pulmón. Sin embargo, el surfactante se puede encontrar en tejidos extra pulmonares, especialmente las proteínas hidrofílicas (SP-A y SP-D) (Brauer y cols., 2009). Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 33 Las cuatro proteínas del surfactante (SP-A, SP-B, SP-C y SP-D) se dividen en dos grupos por sus propiedades de hidrofobicidad. Las hidrofóbicas, proteína surfactante (SP-B) B y C (SP-C), están implicadas principalmente en la prevención del colapso alveolar en las vías respiratorias bajas, reduciendo la tensión superficial. SP-C posee apenas la capacidad de enlazar LPS y juega un importante papel en la inmunidad innata (Glasser y cols., 2001, Augusto y cols., 2003). SP-A y SP-D son proteínas hidrofílicas que pertenecen a la familia de lectinas tipo C (colectinas), siendo su principal misión la defensa de huésped, (Crouch, 2001, Hawgood y Poulain, 2001). Se ha demostrado que SP-D juega un papel importante en la estructura de la forma extracelular del surfactante, mielina tubular, y otras funciones relacionadas con el surfactante (Wang y cols., 2010), asi como en la homeostasis del surfactante (Hawgood y Poulain, 2000; Ikegami y cols., 2000; Botas y cols., 1998). Los miembros de la familia colectinas se caracterizan por un dominio Nterminal del colágeno y un dominio de reconocimiento del carbohidrato C-terminal (CRD) que permite el enlace a varios tipos de macromoléculas, incluyendo carbohidratos, fosfolípidos y proteínas, así como a un número de agentes patógenos y alérgenos (Crouch y Wright, 2001). La SP-D se encuentra en grandes estructuras oligoméricas que se unen a virus, bacterias y hongos. Esta unión es dependiente del calcio (Loros, Wang y Lin, 2005), (Kishore y cols. 2006), (Holmskov y cols. 2003). SP-A es una proteína de 248 aminoácidos (aa) (35kDa), asociada en una subunidad estructural trímerica (105kDa), y seis de estos trímeros se unen en una estructura oligomérica, generalmente hexámeros (630kDa) que contiene un total de dieciocho monómeros SP-A1 y SP-A2 (Wang y cols., 2007, Mikerov y cols., 2008). Los oligómeros de SP-D son estructuras tetraméricas cruciformes de 540kDa compuestas por cuatro subunidades de 130kDa y cuyos monómeros poseen 375aa (Kishore y cols., 2006). Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 34 La SP-A y la SP-D son componentes importantes del sistema inmune innato. Estas moléculas potencian la defensa frente a bacterias, virus, hongos y otros patógenos, por mecanismos como agregación, aglutinación o inhibición de la opsonización (Kishore y cols., 2005). Se han descrito diversos receptores de membrana que reconocen a las colectinas, por ejemplo, la SP-A interactúa con CD35 (CR1) (Tenneret y cols., 1989), C1qR (CD93), CD14 (Sano y cols., 2000), CD91/calreticulina. Algunos receptores de la SP-A se han identificado en las células alveolares tipo II, pero no en la superficie celular de los macrófagos alveolares, indicando su papel potencial como agente tensoactivo. La mayoría de las moléculas de receptor que interactúan con la SP-A también interactúan con la SP-D y proteína de señal reguladora alfa (SIRPalfa, CD91/calreticulina, gp-340, TLR-2, TLR-4 y CD14), para promover la fagocitosis, la eliminación de células apoptóticas y por otra parte modula la producción de citoquinas o actúa como quimiocinas, estimulando la migración del macrófago alveolar. Las colectinas facilitan la destrucción de diversas bacterias, virus y hongos, tras la interacción directa con el patógeno, o la activación de las células inmunes (Wu y cols., 2003, Schaeffer y cols., 2004). La SP-A y la SP-D no sólo regulan la función de las células inmunes innatas, como las células dendríticas y otras células presentadoras de antígeno, sino que también regulan las funciones de las células T, proporcionando un enlace entre el sistema inmune innato y el adquirido, con el fin de aliviar la infección y la inflamación y promover la restauración la homeostasis del tejido (Pastva y cols., 2007). Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 35 Las proteínas asociadas al surfactante A y D juegan además un papel muy importante en la regulación de la respuesta inflamatoria (Gardai y cols., 2003), (Wright, 2005), y promueven el aclaramiento de células apoptóticas del pulmón (Vandivier y cols., 2002). Por otra parte, se encargan de mantener el pulmón en estado quiescente en ausencia de infección. VRS: virus respiratorio sincitial; SP-D: proteína surfactante D; PBMCs: células mononucleares de sangre periféricas. SARS: Sindrome respiratorio agudo grave. Figura 4: Funciones múltiples de las proteínas asociadas al surfactante SP-D Virus Se une a la proteína G de VRS Inhibe la infección por VRS Reconoce a SARS de coronavirus. Inhibe la unión de hemaglutinina y la actividad de neuraminidasa de virus de la gripe. Hipersensibilidad e inflamación. Mejora la apoptosis de eosinófilos y la captación en los pacientes con asma. Reduce la poliferación de PBMCs en los pacientes sensibles a ácaros. Agregación y captación de gránulos de polen. Suprime la inflamación inducida por el alérgeno y disminución de la sensibilización. Disminuye la infiltración de eosinófilos y la producción de citoquinas proinflamatorias. Eliminación de células apoptóticas Mejora la apoptosis celular. Inhibición de hongos Mediante el aumento de la permeabilidad de membrana. Embarazo SP-D, se ha detectado en recién nacidos, en sangre umbilical y en sangre capilar. Se han detectado niveles bajos de SP-D en corionamnionitis Bacteria Inhibición del crecimiento Facilita la agregación y opsonisación Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 36 Figura 5: Funciones múltiples de las proteínas asociadas al surfactante SP-A Virus Interacción con HSV1 a través de sus oligosacáridos unidos a dominio N que conducen a la fagocitosis por AMs - unión a la subunidad F2 de la proteína F del VRS para neutralizar su infectividad Se une a gp120 y realiza inhibición de la infección de las células CD4 Mejora la eliminación de adenovirus e inhibe la inflamación. Hongos Unión con Cryptococcus neoformans Facilita la patogénesis por Aspergilus Fumigatus. Bacteria -Inhibición del crecimiento de Pseudomona aeruginosa mediante el aumento de permeabilidad de la membrana. -Union de polisacáridos capsulares de Kiebsiella. -Unión y atenuación de Mycobacterium pneumonia a través de fosfatodiglicerol. -Facilita la captación de patógenos por las células huésped. -Agregación y opsonización de Hemophilus Influenza a través de la proteína de membrana externa P2. ----Aumento de la captación mediada por C1q de Stafilococo Aureus -Aumento de absorción mediada por el receptor de manosa de Mycoobacteria. Hipersensibilidad y inflamación Unión a los granos de polen. Aumento de los niveles de SPA en pacientes asmáticos. Embarazo y desarrollo Inhibición de citoquinas pro inflamatorias Impide la activación prematura de la cascada de prostaglandina Inducción de la estimulación directa de IL1b y NF-kB por los macrófagos en el líquido amniótico. Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 37 Figura 6: Molécula SP-A N-terminal Región colágeno Cuell o CRD Receptor CD14 Unión A Receptor SPR210 calreticulina/CD91 Unión A Oligómero SP-A Dominio N -terminal Dominio Colágeno Dominio helicoidal CRD Trimer (x3) · Actividad antiviral: residuos de ácido siálico de SP-A controlan la actividad de opsoninas atando a las glicoproteínas F y G de VRS · Actividad antibacteriana: S aureus, P aeruginosa, E coli, M tuberculosis, H. Influenze ·Actividad antifungica: Pneumocytstis, C albicans, A fumigatus · Tabla 5: Información disponible que se encuentra asociada significativamente a variantes genéticas, (SNP) y haplotipos de SP-A1, SP-A2 y SP-D en la edad pediátrica y adulta. ________________________________________________________________________________________________ Enfermedad Gen Población SNP o haplotipo Nucleótido (aminoácido) Susceptibilidad Casos Controles Referencia RA SP-D China rs721917 C (Thr) riesgo 216 84 Deng y cols., 2009 Asma SP-D Alemana no asociación 322 270 Krueger y cols.,2006 Asma SP-D Afroamericana rs721917 T (Met) riesgo 162 97 Brandt y cols.,2008 CV SP-D Noruega rs721917 C/C (Thr/Thr) riesgo 130 100 Berg y cols.,2009 EPOC SP-D Caucásica rs2245121 A riesgo 389 472 Foreman y cols.,2010 EPOC SP-D Caucásica rs911887 G riesgo 389 472 Foreman y cols.,2010 EPOC SP-D Caucásica rs6413520 C (Ser) riesgo 389 472 Foreman y cols.,2010 EPOC SP-D Caucásica rs721917 C (Thr) riesgo 389 472 Foreman y cols.,2010 EPOC SP-D Caucásica rs7078012 C riesgo 389 472 Foreman y cols.,2010 VRS SP-D Mixto rs2243639 A (Thr) posible (riesgo) 148 n/a Thomas y cols.,2009 VRS SP-D Mixto rs721917rs2243639 T(Met)G(Ala) protector 148 n/a Thomas y cols.,2009 VRS SPA1 SPA2 SP-D Mixto 6A2-1A0rs2243639 G (Ala) protector 148 n/a Thomas y cols.,2009 VRS SP-A2 Filandesa 1A3 riesgo 86 95 Lofgren y cols.,2002 VRS SP-A2 Filandesa 1A protector 86 95 Lofgren y cols.,2002 VRS SP-A1 Filandesa 6A protector 86 95 Lofgren y cols.,2002 VRS SPA1 SPA2 Filandesa 6A/1A protector 86 95 Lofgren y cols.,2002 VRS SP-A1 Filandesa rs1059047 C (Ala) protector 86 95 Lofgren y cols.,2002 VRS SP-A2 Filandesa rs17886395 C (Pro) protector 86 95 Lofgren y cols.,2002 VRS SP-A2 Filandesa rs1965708 A (Lys) riesgo 86 95 Lofgren y cols.,2002 VRS SP-A2 Filandesa 1A1/1A1 riesgo 86 95 Lofgren y cols.,2002 VRS SP-A2 Filandesa 1A0/1A3 riesgo 86 95 Lofgren y cols.,2002 VRS SP-A1/SP-A2 Filandesa 6A2/1A3 riesgo 86 95 Lofgren y cols.,2002 VRS SP-D Filandesa rs721917 T (Met) riesgo 84 93 Lahti y cols.,2002 TBC SP-D Mexicana rs721917 C (Thr) riesgo 178 101 Floros y cols.,2000 UC SP-D Japonesa rs911887 G riesgo 296 394 Tanaka y cols.,2009 UC SP-D Japonesa rs2243639rs911887 A (Thr)-G riesgo 296 394 Tanaka y cols.,2009 Influenza A SP-A Española rs1965708 A riesgo 93 1736 Herrera Ramos y cols.,2014 Pneumonia SP-A SP-D Española A1/6A (2) riesgo 682 769 García-Laorden et al,2011 RA: Rinitis alérgica; CV: cardiovascular; FQ: Fibrosis Quística; EPOC: Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica; VRS: Virus Respiratorio Sincitial; TBC: tuberculosis; UC: colitis ulcerosa. Escriba Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 46 Algunas variantes alélicas en SFTPD se han asociado con la susceptibilidad a infecciones respiratorias por varios microorganismos y a otras enfermedades pulmonares como el asma y la EPOC. Las asociaciones de las variantes de SFTPD con enfermedades se resumen en la Tabla 5. Diversas enfermedades respiratorias en edad pediátrica como en adultos se han asociado con variantes de SP-A1, SP-A2 y SP-D, tanto con SNPs como con haplotipos. Dado el papel de SP-A y SP-D en la defensa y en el control de la inflamación pulmonar, no resulta sorprendente que la SP-A y SP-D (como las proteínas hidrofóbicas del surfactante), estén involucradas en el desarrollo de la protección a varias enfermedades pulmonares. Se han encontrado varios polimorfismos de SP-A y SP-D que se asocian con el riesgo de tuberculosis (Malik y cols., 2006, Madan y cols., 2002), incluyendo variantes haplotipicas de SFTPA, SP-A1 6A4 (Floros y cols., 2000), y SP-A2 1A3 (Malik y cols., 2006), y 1A5 (Malik y cols., 2006). Los SNPs rs1136451 y rs4253527, SP-A2 rs17886395 y rs1965708 (Malik y cols., 2006), rs721917 de SFTPD (Floros y cols., 2000) y G459A (Vaid y cols., 2006) se han asociado con Tuberculosis. También se han asociado polimorfismos en los genes de la SP-A y SP-D, con el desarrollo de las enfermedades alérgicas como la rinitis o el asma (Krueger y cols., 2006, Deng y cols., 2009, Deng y cols., 2010, Pettigrewet, 2007). La variante Met11Thr SP-D y otra variante se han asociado con la función y concentración de SP-D (Leth-Larsen y cols., 2005). Dos grupos independientes analizaron las asociaciones de polimorfismos SPA con susceptibilidad a la otitis media, una de las infecciones más comunes de la niñez temprana (Pettigrew y cols., 2006), causada por bacterias patógenas (Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis (Dudley y cols., 2001), y Staphylococcus aureus o secundaria a la infección del Virus Respiratorio Sincitial (VRS (Andrade y cols., 1998). SP-A y SP-D se expresan en la Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 47 trompa de Eustaquio, y alteraciones en la expresión o la regulación de estas moléculas también pueden ser un factor de riesgo importante para la otitis media (Lim y cols., 2000). Este grupo finlandés identificó los haplotipos 6A2/1A0, SPA1/SP-A2 como factor de riesgo de la otitis aguda, 6A4/1A5 como riesgo para la infección aguda y recurrente y el genotipo de 6A2/6A2 SP-A1 para otitis recurrente. El genotipo C/C (Thr/Thr), en el SNP con rs721917 se relaciona con los niveles más bajos de SP-D en el suero, las estructuras oligoméricas más pequeñas, una menor afinidad a los patógenos y la susceptibilidad a la enfermedad pulmonar (Leth-Larsen y cols., 2005). Sin embargo, aunque la SP-D juega un papel importante en la homeostasis lipídica y la eliminación de las células muertas del huésped, estos autores concluyen que las variantes de SP-D están débilmente asociadas con el proceso aterogénico. Son de especial interés las asociaciones genéticas de las variantes en SP-A1, SP-A2 Y SP-D (SNPs/ y haplotipos) con la enfermedad del recién nacido, así como su relación con otros factores (por ejemplo, prematuridad, uso de tratamiento pre y post parto, como corticoides prenatales, ventilación mecánica, etc.), debido a su potencialidad para predecir susceptibilidades y para ayudar en las decisiones sobre el uso del tratamiento apropiado. Los polimorfismos en genes de la SP-A y SP-D están asociados con dos enfermedades neonatales, el síndrome de dificultad respiratoria (SDR) y la displasia broncopulmonar (DBP) que reflejan, respectivamente, la lesión pulmonar aguda y crónica. La deficiencia de surfactante puede tener importancia en los recién nacidos prematuros con SDR, habiéndose detectado en estos pacientes una cantidad insuficiente de proteínas del surfactante, particularmente SP-A, así como la ausencia de la mielina tubular, una forma estructural extracelular del surfactante pulmonar (Mello y cols., 1989, Pryhuber y cols.,1991). Hil Gendorff y cols. Refieren que para SP-D, un SNP no codificante de SFTPD (rs1923537) era protector frente al SDR (Gendorff y cols., 2009), mientras que Thomas y cols. identificaron varios haplotipos de SP-A1, SP-A2 y SP-D que también se asocian con la protección SP-A2/SP-D: 1A1-Thr160 (rs2243639), 1A1Met11 (rs721917)-Thr160 (rs2243639), SP-A1-A2/SP/SP-D: 6A4-1A2-Tr160 Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 48 (rs2243639) y 6A3-1A1-Met11 (rs721917)-Thr160 (rs2243639) y 6A4-1A2-Met11 (rs721917)-Thr160 (rs2243639), (Thomas y cols., 2007). 1.4.4.2. Variantes en SFTPD y Bronquiolitis Aguda por VRS Polimorfismos en los genes de la SP-A y SP-D se han relacionado con la susceptibilidad a la infección por VRS (Lahti y cols., 2002, Lofgren y cols., 2002, Thomas y cols., 2009). En la Tabla 5 se resume la información disponible asociada a variantes genéticas (SNP) y haplotipos de SP-A1, SP-A2 y SP-D en la edad pediátrica y su relación con diferentes enfermedades. Los factores genéticos pueden jugar un papel importante en las diferencias relacionadas con el huésped en la susceptibilidad a la infección grave por VRS. En una población finlandesa se asoció el riesgo de infección por el VRS con las variantes 1A3, 1A1/1A1 y 1A1/1A3 de SP-A y 6A2/1A3 de SP-A1 Y SP-A2 (Lofgren y cols., 2002). También se han asociado con el riesgo contar con una asparagina en el aa9 (rs1059046), lisina en aa223 (rs1965708) de SP-A2 (Lofgren y cols., 2002), así como el rs721917 de SP-D (Lahti y cols., 2002). En contraste, alanina en aa9 SP-A1 (rs1059047), y prolina en SP-A2 aa91 (rs17886395), ha sido referidos como protectores (Lofgren y cols., 2002). Otras asociaciones protectoras incluyen la SP-A1 6A (Lofgren y cols., 2002), la variante 1A de SP-A2 (Thomas y cols., 2009), así como genotipo 1A0/1A0, (El Saleeby y cols., 2010) y haplotipos de SP-A, SP-A1/SP-A2 6A2/1A3 (Lofgren y cols., 2002), haplotipos de SP-D Met11 (rs721917) / Ala160 (rs2243639) (Thomas y cols., 2009) y haplotipos de SP-A1-A2/SP/SP-D 6A2/1A0/Ala160 (rs2243639) (Thomas y cols., 2009). De otra parte, SP-A tiene la capacidad de enlazar las glicoproteínas virón VRS y aumentar su absorción por las células inmunes (Ghildyai y cols., 2002, Hickling y cols., 2000). Se ha encontrado que la SP-D se une a la glicoproteína de la fusión de VRS y disminuye la infectividad de VRS (Hickling y cols., 2000). HIPÓTESIS Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 51 2. HIPÓTESIS Puesto que algunos polimorfismos genéticos pueden afectar a la expresión, estructura o función inmunomoduladora de la proteína D del surfactante, se sugiere que: 1. Polimorfismos genéticos de un solo nucleótido del gen SFTPD, y/o combinaciones de estos en haplotipos, influyen en la susceptibilidad a padecer bronquiolitis aguda por virus respiratorio sincitial tipo A y tipo B. 2. Polimorfismos genéticos de un solo nucleótido del gen SFTPD, y/o combinaciones de estos en haplotipos, influyen en la gravedad de la bronquiolitis aguda por virus respiratorio sincitial. OBJETIVOS Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 60 La gravedad de la bronquiolitis fue estratificada en base a la Escala de WoodDownes-Lecks (Tabla 1). Inicialmente se reclutaron 201 pacientes con bronquiolitis aguda por VRS. De estos 8 fueron excluidos por no ser españoles de raza caucásica y uno por tener un hermano gemelo incluido en el estudio. Finalmente, se incluyeron 192 pacientes con infección por VRS; en 68 fue debida a VRS-A (60 con información genética) y en 124 a VRS-B (119 con información genética) (Figura 11). Figura 11: Diagrama de flujo 4.1.2 Grupo II (controles) El grupo control consistió en 330 pacientes menores de dos años de edad, españoles de raza caucásica, atendidos en el Hospital Universitario Materno-Infantil de Gran Canaria. Los individuos del grupo control fueron seleccionados entre los pacientes que acudieron a realizarse una extracción analítica como valoración preoperatoria para una cirugía menor y que no habían presentado patologías respiratorias documentadas previas ni procesos inflamatorios en un periodo mínimo Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 61 de 3 meses, precedentes a su inclusión en este estudio (Tabla 6). Hay que recordar que no era necesario comprobar la presencia de infección por VRS porque no hay portadores sanos. Ninguno de los niños del grupo control fue diagnosticado de BA por VRS durante el proceso de recogida de datos. Inicialmente se reclutaron 346 lactantes. De estos, 11 fueron excluidos por no ser españoles de raza caucásica y 5 por tener un hermano gemelo incluido en el estudio. Al final, la muestra se completó con 330 individuos (Tabla 6). Tabla 6: Población de estudio 4.2 PROCEDIMIENTOS CLÍNICOS Y RECOGIDA DE DATOS Los pacientes con BA se clasificaron según la gravedad, utilizando el score de Wood – Downes – Lecks (Tabla 1). En los pacientos con infección debida a VRS-A (n=68), 33 tenian un score grave y los 35 pacientes restantes leve o moderado. En los pacientes con infección por VRS – B (n=124), 47 sufrieron BA grave y 77 leve o moderado (Figura 11). Se recogieron datos de edad, sexo, peso al nacer, lactancia materna, antecedentes familiares de asma, alergia alimentaria, atopia y rinitis alérgica, datos clínicos como frecuencia cardiaca y respiratoria, saturación de oxigeno (satO2), así como datos de pruebas complementarias como Proteína C Reactiva y hemograma. Controles Casos Total Muestra inicial 346 201 547 Españoles raza caucásica 330 192 522 Otras nacionalidades 11 8 19 Gemelos 5 1 6 Excluidos 16 9 25 Muestra total final 330 192 522 Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 62 4.3. PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO 4.3.1 Hemograma A todos los pacientes incluidos en el estudio se les extrajo sangre para realizar un hemograma. El hemograma permite evaluar los tres tipos principales de células sanguíneas: hematíes, leucocitos y plaquetas. El recuento anormal de leucocitos puede ser un indicador de infección y/o inflamación. Las plaquetas, que desempeñan un papel importante en la coagulación y control de las hemorragias, también se consideran reactantes de fase aguda de la infección. El hemograma se realizó de forma automatizada. La muestra se obtuvo por punción venosa, en tubos adecuados con anticoagulante específico etileno – diamino – tetraacetato (EDTA) y fueron procesadas en contador hematológico (Beckman Coulter, LH750), siendo un proceso automático con control de calidad y bioseguridad. Hemograma: Seria roja Hemoglobina (Hb) : niveles normales: 13,5 – 17,5 g/dl (varones) 12 - 16 g/dl (mujeres) Hematiés: niveles normales: 4500 000 – 5 900 000/ml(varones). 4 000 0005 200 000/ml, (mujeres). Volumen corpuscular medio: (VCM): niveles normales: 88-100 fl ( por hematíe). Hemoglobina corpuscular media (HCM): niveles normales, entre 27 y 33 pg (picogramos)/hematíe, Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 63 Serie Blanca Leucocitos: niveles normales: 4500 – 13500/ ml Neutrófilos: 2000 -7500/µl; (40,0 – 59,0%), Linfocitos: 1300 – 4000/µl; (24,0 - 45,0%), Monocitos: 300 - 1000/µl; (3,4-10,0%), Eosinófilos: 0 – 500 /µl; (0,005,0%), Basófilos: 0 – 150 /µl; (0,0 – 1,5%),l Serie plaquetar Plaquetas: niveles normales: 150000 – 450000/µl 4.3.2 Proteína C reactiva (PCR) La proteína C reactiva (PCR) es un miembro de proteínas conocidas como pentraxinas. La PCR es una proteína plasmática circulante que actúa como opsonina, principalmente de bacterias; aumenta de forma muy significativa sus niveles en respuesta a la inflamación (es una proteína-reactante de fase aguda). A los pacientes estudiados también se les extrajo sangre para la determinación de los niveles de PCR. La muestra fue procesada para la determinación cuantitativa de PCR en suero con los sistemas C-reactive Protein-hs, BioSystems. S.A. Los valores normales en edad pediátrica se consideran de 0,0-1,00 mg/dl. (Ridker, Libby, 2007). 4.3.3 Detección de Virus Respiratorio Sincitial (VRS) En los pacientes del grupo casos se realizó una toma de muestras mediante lavado nasofaringeo a temperatura ambiente y se envió al laboratorio de microbiología donde se procesó la muestra. Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 64 4.3.3.1 Técnicas para la detección de virus respiratorio sincitial: Se emplearon una de las 2 técnicas que reseñamos a continuación: A. Técnica de Inmunocromatografía (RSV Respi-Strip, Coris Bioconcept Laboratorios MATERLAB). Se coge un tubo estéril, se añaden 8 gotas del tampón de extracción, se añade 250 µl (ó 6 gotas) de la muestra con la pipeta de plástico estéril, se agita en el vortex para homogeneizar la solución. Se sumerge la varilla sensibilizada (tira de inmunocromatografía) en el tubo de ensayo con la muestra y el reactivo de extracción, se deja la tira en el tubo durante el tiempo de incubación (15 minutos). En aquellas muestras con resultado “Inválido” ó “negativo”, en período estacional (Nv-Fb), se realizó la inmunofluorescencia directa para VRS (IMF DFA). B. Técnica de Inmunofluorescencia directa para VRS (Respiratory Syncitial Virus DFA (Light Diagnostics, Millipore™) Procedimiento: Se agita la muestra para homogenizarla. Con una pipeta estéril se dispensa una gota en un pocillo del portaobjetos, se deja secar a temperatura ambiental o con calor. Los portaobjetos se fijan con acetona fría durante 10 minutos. Se añade 25 µl del reactivo Respiratory Syncitial Virus DFA, Light Diagnostics, Millipore™. Se incuba 30 minutos en cámara húmeda a 37ºC. Se lava durante 2-3 minutos con PBS, y luego se lava durante 5 minutos con agua bidestilada, para eliminar los restos de sales del PBS. Se deja secar completamente y a continuación se procede al montaje (Mounting fluid) con un cubreobjetos. Se observa al microscopio de fluorescencia. Se considera positivo si la Fluorescencia es verde brillante. Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 65 En aquellos que fueron positivos, se procedió con una técnica de microarray (CLART®-PneumoVir-Genomica (reactivo de amplificación y visualización)) que detectaba VRS (A y B). 4.4 DETERMINACIONES GENÉTICAS Una vez procesadas y analizadas genéticamente las muestras, a través del estudio del desequilibrio de ligamento genético, se propusieron establecer las frecuencias y el modo de herencia de las variantes seleccionadas de los genes de SFTPD en la población de pacientes menores de 2 años en Gran Canaria. Se pretende estudiar la influencia de estas variantes como factores de riesgo o de protección en los pacientes con bronquiolitis aguda por VRS. Se estudiaron, asimismo, determinaciones de 9 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). 4.4.1. Estudios de asociación genética La variabilidad en la presentación clínica tiene una base poligénica. Los datos epidemiológicos y clínicos no apoyan un modelo de herencia mendeliana en las enfermedades más comunes. Los mapas de ligamento genético se utilizan para representar la segregación de los SNPs. En la Figura 12 se representan los valores de D1 obtenidos para la población control cuando se consideraron los 9 SNPs del gen SFTPD. En la Figura 13 se presentan los valores del coeficiente de correlación (r2) para medir el grado de desequilibrio de ligamento (LD) entre los SNPs. A todos los pacientes incluidos en el estudio se les extrajo sangre en un tubo con EDTA, para posteriormente extraer el DNA. Las muestras y los consentimientos informados de los pacientes se recibieron en el Servicio de Inmunología de Hospital Universitario de Gran Canaria “Dr Negrin” (HUGCDN) a través de mensajería desde el HUMIC. Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 66 En términos generales, planteamos revelar la posible relación de la variabilidad genética de las proteínas asociadas al surfactante SP-D con la susceptibilidad a padecer bronquiolitis por VRS y con la predisposición a una mayor gravedad clínica de los pacientes afectos. Figura 12: Desequilibrio de ligamento (D1) de SFTPD Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 67 Figura 13: Desequilibrio de ligamento (r2) en SFTPD 4.4.2 Extracción de DNA La extracción de DNA, así como el tipaje del gen SFTPD de todas las muestras, se realizó en la Unidad de Inmulogía del Hospital Universitario de Gran Canaria “Dr. Negrín”. De cada individuo a estudio se obtuvo una muestra de 5 ml de sangre venosa anticoagulada en un tubo con EDTA, que se procesó según el siguiente protocolo estándar de extracción por fenol-cloroformo (modificado de Blin y Stafford, 1976) (Tesis Doctoral, Maria Isabel Garcia–Laorden, ULPGC.2009). Para el aislamiento y lavado de las células blancas, a la sangre total de cada individuo se le añadió tampón de lisis de células rojas hasta un volumen de 50 ml y se centrifugó a 600 xg durante 10 minutos. A continuación, se decantó el sobrenadante y se repitió el lavado dos veces más. Las células blancas se lisaron resuspendiendo el precipitado resultante en 4 ml de solución de lisis e incubando en agitación a 42ºC hasta el día siguiente. Tras este paso, se añadieron 4 ml de fenol/cloroformo/isoamílico y se puso en agitación Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 68 10 minutos a temperatura ambiente, centrifugándose a continuación 10 minutos a 1.700 xg. La fase superior (acuosa) resultante se pasó a otro tubo y se repitió el proceso, desechándose la fase inferior (orgánica). Para el siguiente paso, se añadieron 4 ml de cloroformo-isoamílico a la fase superior y se puso en agitación a temperatura ambiente durante 7 minutos, tras lo cual se centrifugó 5 minutos a 1.200 xg. De nuevo se rescató la fase superior acuosa y se repitió el proceso. Se añadieron 300 ml de NaCl 3M y 4 ml de isopropanol, mezclando suavemente por inversión hasta la aparición del precipitado. Dicho precipitado se extrajo a otro tubo y se lavó durante 30 minutos en etanol al 70% frío, tras lo cual se dejó secar a temperatura ambiente hasta el día siguiente. Una vez seco, se añadieron 500 ml de tris-EDTA (TE) 1/0,1 y se puso a rotar en un agitador orbital en días sucesivos hasta su resuspensión. Para proceder a la realización de las determinaciones genéticas, la concentración de trabajo considerada óptima fue de 100 ng/ul con una ratio absorbancia 260/280 en un rango de 1.7 a 2.2 (valor de ratio establecido para asegurar que es DNA). La calidad de las muestras se determinó con el espectrofotómetro NanoDropND-1000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, Estados Unidos). 4.4.3. Selección de polimorfismos La información necesaria para realizar la selección de las variantes genéticas fue obtenida con acceso de internet, principalmente NCBI, Ensemble, UCSC genome, Genecard, plataformas que integran la información de muchas bases de datos, incluyendo los datos del proyecto del genoma humano (HapMap Project). http://www.hapmap.org; http://www.ncbi.nlm.nih.gov.SNP;http://www.rcsb.org/pdb/; http://www.genome.ucsc.edu. Estos mapas presentan las relaciones (desequilibrio de ligamento entre polimorfismos), lo que permite estudiarlos en conjunto, a través de haplotipos. Nos proporciona una información valiosa a la hora de seleccionar los SNPs respetando los siguientes criterios: un coeficiente de correlación (r2) de desequilibrio de ligamiento mayor de 0,8 y una frecuencia del alelo menos frecuente (MAF) del 5%. Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 69 Se escogieron SNPs que tuvieran una frecuencia en la población general lo suficientemente alta como para que su frecuencia pueda ser detectada en los análisis y que proporcionara la máxima información acerca de la variabilidad del gen SFTPD. Como población de referencia del proyecto Hapmap se escogió la población CEU (población europea) y los SNPs fueron seleccionado tras procesar los datos mediante el software Haploview 4.2 (Barrett y cols., 2005), http://broad.mit.edu/haploview/haploview. Algunos SNPs seleccionados conllevan cambios conformacionales o estructurales que son susceptibles de afectar a la función biológica de la proteína codificada; no obstante, también se incluyeron SNPs intrónicos, sinónimos y en regiones no codificantes que podrían afectar a la expresión y la regulación de la proteína SP-D. Además se completó la selección de los SNPs con la inclusión de un SNP asociado en la literatura con los niveles séricos de la proteína (Foreman y cols., 2011) (Tesis doctoral, Estefanía Herrera Ramos, ULPGC, 2015). 4.4.4. Técnicas de análisis molecular de los polimorfismos de SFTPD Para los análisis genéticos se han utilizado técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real. Para visualizar los resultados se utilizan sondas que contienen marcadores fluorescentes, lo que permite la detección de las variantes en los SNPs en cada ciclo mediante un ordenador que está conectado al termociclador. La identificación de los distintos polimorfismos se ha realizado mediante discriminación alélica a través de sondas de hidrólisis TaqMan (Life technologies, Carslbad, Estados Unidos) con fluorocromos que emiten a una longitud de onda específica (VIC a 550 nm y/o FAM a 520). Se trata de cadenas cortas de nucleótidos marcadas con un fluorocromo para cada alelo. Cuando se unen al DNA se rompen liberando la fluorescencia a una longitud de onda determinada. El análisis se realizó siguiendo las instrucciones protocolizadas por el fabricante Taqman genotyping assays (Life Technologies, Carisbad, Estados Unidos). Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 76 Con respecto a la estacionalidad, en nuestro medio las epidemias ocurrieron entre los meses de noviembre y febrero, con un pico entre diciembre y enero. Se observaron casos esporádicos hasta mayo. En la figura 15 se representan los datos de la estacionalidad en las dos epidemias anteriormente valoradas. 0 10 20 30 40 50 60 noviembre diciembre enero febrero 5.1.2 Edad Todos los pacientes seleccionados para este estudio eran menores de 24 meses de edad. Se incluyeron 68 pacientes afectos de bronquiolitis aguda por VRS-A, 124 por VRS-B y 330 controles. La edad media de los pacientes con VRS-A fue de 6,3± 2,21 meses, la de los pacientes VRS-B de 5,99± 2,11 meses y la de controles fue de 9,87± 3,17 meses (Tabla 8). EPIDEMIA 2006/2007 EPIDEMIA 2007/2008 Figura 15. Estacionalidad de la Bronquiolitis aguda (2006-2008) Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 77 Los controles cuentan con mayor edad (p=0,0238) que los pacientes con infección por VRS, sin embargo esto se podría explicar porque este grupo de pacientes acudían programados para una intervención quirúrgica. En la edad pediátrica se demoran las intervenciones hasta que el paciente gane suficiente peso y tenga la edad necesaria para poder soportar dicho procedimiento, siempre que la patología que motiva la cirugía no sea urgente y la clínica lo permita. 5.1.3 Sexo La distribución por sexos para los grupos de casos y controles se muestra en la Tabla 8. Se observa que la prevalencia de varones es mayor en el grupo control que en el grupo de pacientes, aunque no se hallaron asociaciones significativas entre la susceptibilidad a esta infección y el género (p=0,107). Tabla 8: Distribución de la población estudiada por edad, sexo y peso al nacimiento en los pacientes y controles con bronquiolitis aguda por VRS VRS-A VRS-B Casos VRS Controles p n = 68 n = 124 n = 192 n = 330 Edad (meses) 6,30 ± 2,,21 5,99 ± 2,11 6,10 ± 2,15 9,98 ± 2,17 0,0238 Peso al nacer 3277,28 ±528,96 3150,12± 581,81 3195,44±565,42 3213,58±491,44 0,04334 Sexo Varones 41 (60,3%) 74 (59,7%) 115 (59,89%) 229 (69,4%) 0,107 Mujeres 27 (39,7%) 50 (40,3%) 77 (40,11%) 101 (30,6%) Los datos son medias ± SD, medianas (IQR) y frecuencias (%); La p representa-casos con bronquiolitis aguda por VRS frente a controles. En el caso del género se presenta el tamaño muestral y entre paréntesis el porcentaje. Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 78 5.2 PESO AL NACIMIENTO Y EDAD GESTACIONAL El peso al nacimiento fue significativamente menor en los pacientes con bronquiolitis aguda por VRS, que en los controles (p= 0,04334; OR 2,209; IC-95%, 1,008-4,841) (tabla 8). Comparando el peso al nacimiento y la edad gestacional (bajo peso para su edad < 2500 gr y EG > 37 semanas), no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos. Dentro del grupo de casos sólo 25 (13%) fueron recién nacidos a término pequeños para la edad gestacional (EG > 37 semanas y peso < 2,500 gr) y 15 (7,81%) nacieron pretérmino (edad gestacional < 37 semanas). En el grupo control, 26 (7,9%) fueron recién nacidos a término pequeños para la edad gestacional y 8 pacientes (2,42%) nacieron antes de las 37 semanas de edad gestacional. 5.3 LACTANCIA MATERNA Hemos encontrado diferencias respecto a la alimentación con lactancia materna entre ambos grupos. Dentro del grupo de casos 107 (55,4%) habían recibido lactancia materna menos de un mes o no la habían recibido y 85 (44,0%) superior a un mes. En el grupo control, 220 (66,7%) se alimentaron con lactancia materna más allá del primer mes y el resto (33,3%), inferior a un mes o nunca la habían recibido. Estas diferencias eran estadísticamente significativas (p=0,04864; OR 0,5262; IC95% 0,2758-1,004). Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 79 5.4 ANTECEDENTES FAMILIARES (AF) Los antecedentes familiares, como asma, atopia, rinitis alérgica o alergia alimentaria se muestran en la Tabla 9. Dentro de grupo casos, 49 (25,4%) tenían como antecedentes rinitis alérgica. En el grupo control solo 20 (6,1%), presentaban estos antecedentes. Las diferencias fueron estadísticamente significativas (p=0,0030; OR 2,4; IC-95% 1,331-4,329). Tabla 9: Antecedentes familiares y asociación con el desarrollo de bronquiolitis aguda por VRS AF Casos (n=192) SI NO Controles (n=330) SI NO p Asma 95 (49,2%) 97 (50,3%) 101 (30,6%) 229 (69,4%) < 0,001 Atopia 73 (37,8%) 119 (61,7%) 77 (23,3%) 253 (76,7%) 0,022 Rinitis alérgica 49 (25,4%) 143 (74,6%) 20 (6,1%) 310 (93,9%) 0,0030 Alergia alimentaria 5 (2,6%) 187 (97,4%) 3 (0,9%) 327 (99,1%) 0,147 AF: Antecedente familiares; VRS: Virus Respiratorio Sincitial; La p representa-casos con bronquiolitis aguda por VRS frente a controles. En el caso de AF se presenta el tamaño muestral y entre paréntesis el porcentaje. También se encontraron diferencias estadísticamente significativas con los antecedentes familiares de asma y atopia y no con la alergia alimentaria, tal como se muestra en la Tabla 9. Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 80 5.5 SINTOMATOLOGÍA Los pacientes con bronquiolitis aguda por VRS fueron clasificados en tres grupos según la gravedad de la sintomatología, mediante la aplicación de la escala de WoodDownes-Lecks. 5.5.1 Clasificación según gravedad VALORACIÓN DE GRAVEDAD – SÍNDROME DISTRÉS RESPIRATORIO Según el Score de Wood– Downes – Lecks los pacientes fueron clasificados en 3 grupos: 1. Bronquiolitis aguda leve-SDRA (1): 31pacientes (con información génetica 30). 2. Bronquiolitis aguda moderada-SDRA (2): 81 pacientes (con información genética 76). 3. Bronquiolitis aguda grave-SDRA (3): 80 pacientes (con información genética 73). 5.6 EXPLORACIONES COMPLEMENTARIAS Las pruebas complementarias realizadas como reactantes de fase aguda (PCR) y los valores de leucocitos y plaquetas se representan en la Tabla 10. Dentro de grupo casos el valor absoluto de leucocitos fue de 12,99 x 103 comparado con los valores de 10,07x103 en el grupo control (p < 0,001). El valor absoluto de neutrófilos en el grupo casos (3,1x103) y en el grupo control (3,6x103) (p=0,189) no fueron estadísticamente significativos. El valor absoluto de linfocitos fue superior en el grupo casos (5,6x103), que en el grupo control (5 x103), siendo estadísticamente significativo (p <0,001). El valor absoluto de plaquetas fue superior en grupo casos (363 x103), que en el grupo control (310 x 103) con significación estadística (p <0,001). Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 81 No hubo diferencias estadísticamente significativas en los valores de PCR en el grupo casos (0,66 mg/l), comparado con el grupo control (0,70 mg/l) (p= 0,236). Con repecto a la Rx de tórax, que se realizó en todos los pacientes del grupo con BA, en 188 pacientes (97,9 %) fue normal y solo en 4 pacientes (2,1%) presentaba hallazgos patológicos. Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 82 Tabla 10: Resultados analíticos en pacientes con bronquiolitis aguda por VRS y en individuos controles Los datos son medias ± SD, medianas (IQR).La p de significación es el resultado de la comparación estadística de casos (VRS) frente a controles. 5.7 SIGNOS VITALES – CONSTANTES VALORADAS En la Tabla 11 se representan los datos de signos vitales tomados en los dos grupos de pacientes para determinar la gravedad clínica-dificultad respiratoria (SDRA). Se encontraron diferencias estadísticamente significativas al comparar pacientes con bronquiolitis aguda por VRS con individuos controles, para la saturación de oxígeno (p=0,0035; OR 2,603; IC-95% 1,087-6,237), frecuencia respiratoria (p=0,0012; OR 1,435; IC-95% 1,049-1,963) y frecuencia cardiaca (p=0,0023, OR 1,895, IC-95% 1,256-2,857) como puede apreciarse en la Tabla 11. Controles (n=330) Casos (n=192) p PCR, mg/l 0,70 (0,45 ; 1,08) 0,66 (0,23 ; 1,56) 0,236 Leucocitos (x103)/µl 10,07 (9 ; 12) 12,99 (10 ; 14,7) < 0,001 Linfocitos (x103)/µl 5 (4 ; 6) 5,6 (4,5 ; 6,5) < 0,001 Neutrófilos (x103)/µ 3,6 (3 ; 4,4) 3,1 (2,4 ; 4,2) 0,189 Plaquetas (x103) 310 (230 ; 360) 363 (287 ; 461) < 0,001 Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 83 En los pacientes con infección por VRS, la gravedad es mayor para los afectos por VRS-A. Tabla 11: Signos vitales en pacientes con bronquiolitis aguda por VRS (VRSA/VRSB) y en individuos controles VRS-A (n=68) VRS-B (n=124) VRS (n=192) Controles (n=330) p T (ºC) 37,6 ± 0,6 37,7± 0,7 37,6 ± 0,7 36,7 ± 0,5 0,156 SatO2 (%) 92 ± 2 93 ± 2 92 ± 2 98 ± 1 0,0035 FR por minuto 44 ± 7 43 ± 8 43 ± 7 31 ± 4 0,0012 FC latidos/minuto 138 ± 22 136 ± 21 137 ± 21 98 ± 14 0,0023 Los datos son medias ± SD, medianas (IQR); La p se refiere a casos VRS y a controles; TºC: temperatura corporal; SatO2: saturación de oxigeno; FR: frecuencia respiratoria; FC: frecuencia cardiaca 5.8 TRATAMIENTO 5.8.1 Aerosolterapia con salbutamol En el grupo de casos, 190 pacientes (98,4%) recibieron tratamiento con salbutamol nebulizado, mientras que al grupo de controles, obviamente no se administró esta terapia. Dos pacientes no recibieron tratamiento con salbutamol, por la clínica leve de la BA. 5.8.2 Corticoides En el grupo de casos, recibieron tratamiento con corticoides sistémicos 48 pacientes (24,9%), respecto, obviamente, a ninguno dentro del grupo control. Los pacientes con BA no recibieron ningún otro tipo de tratamiento, salvo las medidas de soporte. Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 84 5.9. ASOCIACIONES GENÉTICAS 5.9.1 ASOCIACIONES DE LAS VARIANTES EN SFTPD CON LA SUSCEPTIBILIDAD DE LA BRONQUIOLITIS AGUDA POR VRS Tabla 12: Frecuencias genotípicas en la población control y equilibrio de HardyWeinberg Como paso previo e indispensable en todo estudio de asociación genética se realizó un análisis del equilibrio de Hardy-Weinberg para las variantes a estudio en el grupo control. El análisis del equilibrio de Hardy-Weinber, corregido para comparaciones múltiples (al igual que el resto de comparaciones genéticas), mostró que todos los SNP estudiados se encuentran en equilibrio de Hardy Weinberg. Variantes Genotipos Población control HWE SFTPD n = 296 p rs3088308 (S270T) TT/TA/AA 245(82,8)/47(15,9))/4(1,4) 0,4665 rs2243639 (T180A) CC/CT/TT 36(12,2)/137(46,3)123(41,6) 0,9464 rs10887199 (intr.) CC/CT/TT 9(3,0)/81(27,4)/206(69,6) 0,8784 rs17886286 (intr.) CC/GC/GG 243(82,1)/49(16,6)/4(1,4) 0,5551 rs7078012 (intr.) CC/CT/TT 190(64,2)/85(28,7)/21(7,1) 0,0193 rs6413520 (S45S) AA/AG/GG 259(87,5)/37(12,5)/0(0,0) 0,2514 rs721917 (M31T) CC/CT/TT 44(14,9)/145(49,0)/107(36,1) 0,7652 rs723192 (intr.) CC/CT/TT 216(73,0)/74(25,0)/6(2,0) 1 rs1885551 (prom) AA/AG/GG 211(71,3)/75(25,3)/10(3,4) 0,3939 Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 85 5.9.1.1 Estudio de asociación de los polimorfismos (SNPs) de SFTPD con la susceptibilidad a Bronquiolitis Aguda por VRS En el estudio se calculó la frecuencia alélica de cada uno de los nueve SNPs estudiados de SFTPD y se comparó su distribución entre los pacientes con infección por VRS y los individuos control. Este estudio se realizó también para analizar la asociación con BA por VRS-A y VRS-B por separado. La distribución de las frecuencias entre los pacientes con infección por VRS y los individuos control es diferente para los SNP rs7078012 y rs6413520. Sin embargo, la asociación de rs7078012 es marginal y no se mantiene tras corrección para mútiples comparaciones (Tabla 13).El alelo menos frecuente del SNP rs6413520 (rs6413520-G) se asoció con el doble de riesgo (OR 1,994) de padecer BA por VRS, siendo la única asociación que se mantiene significativa tras comparación para múltiples comparaciones. Diversos SNP se han asociado con susceptibilidad a BA por VRS-A, rs10887199, rs7078012, rs6413520, rs721917 y rs1885551 (Tabla 14). Sin embargo, tras corrección para múltiples comparaciones, la única asociación que se mantiene significativa es la de rs6413520: El alelo menos frecuene, rs6413520-G, confiere un riesgo de 2,48 (IC 95% 1,343-4,564, p=0,0028) de sufrir BA por VRS-A. Al analizar la asociación de BA por VRS-B, la única asociación observada es con rs6413520 (p=0,035; OR 1,76, IC 95% 1,035-2,995), aunque esta asociación no se mantiene estadísticamente significativa tras corrección para múltiples comparaciones (Tabla 15). En las Tablas que se muestran a continuación (Tablas 13,14 y 15) se presentan las frecuencias alélicas en pacientes (VRS, VRS-A y VRS-B respectivamente) y controles. Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 92 Tabla 18: SNPs y marcadores clínicos de la Bronquiolitis Aguda por infección de VRS (grupo casos) Los datos son números absolutos y frecuencias de los alelos de casos de BA por VRS, en el correspondiente SNPs. SNPs Casos (n=179) SatO2 (%) FR FC N Media SD N Media SD N Media SD rs3088308 (S290T) AA 149 93 2 149 43 7 149 136 20 AT 30 92 2 30 44 8 30 136 23 TT 0 0 0 rs2243639 (T180A) CC 29 92 2 29 43 6 29 135 18 CT 81 92 2 81 43 7 81 137 21 TT 69 92 2 69 44 8 69 136 22 rs10887199 (Intr) CC 1 90 1 46 1 144 CT 42 92 2 42 43 8 42 135 23 TT 136 92 2 136 43 7 136 137 20 rs17886286 (Intr) CC 151 92 2 151 43 7 151 137 20 GC 27 92 2 27 43 8 27 134 24 GG 1 90 1 46 1 144 rs7078012 (Intr) CC 110 93 2 110 43 7 110 135 21 CT 41 92 2 41 46 7 41 136 22 TT 28 92 2 28 40 7 28 144 19 rs6413520 (S45S) AA 137 92 2 137 43 8 137 136 22 AG 42 92 2 42 44 6 42 139 18 GG 0 rs721917 (M31T) CC 16 92 1 16 44 7 16 137 21 CT 87 92 2 87 43 8 87 134 22 TT 76 92 2 76 43 7 76 139 19 rs723192 (Intr) CC 135 92 2 135 44 7 135 137 20 CT 43 90 2 43 43 9 43 133 24 TT 1 1 46 1 144 rs1885551 (Prom) AA 136 93 2 136 43 7 136 137 20 AG 43 92 2 43 44 8 43 135 23 GG 0 0 0 Tabla 19: SNPs y marcadores analíticos de la Bronquiolitis Aguda por infección de VRS (grupo casos) SNPs Casos (n=179) Leucocitos/mm3 Neutrófilos (%) Linfocitos (%) Plaquetas/mm3 PCR (mg/dl) N Media SD N Media SD N Media SD N Media SD N Media SD rs3088308 (S290T) TT 149 12849 3799 149 34,29 15,48 149 54,62 15,58 149 377953 115008 149 1,078 1,395 TA 30 13606 4139 30 38,33 14,62 30 49,87 13,37 30 383833 119428 30 1,188 1,139 AA 0 . . 0 . . 0 . . 0 . . 0 . rs2243639 (T180A) CC 29 13179 3551 29 33,76 16,43 29 55,93 17,62 29 358966 100690 29 1,181 1,691 CT 81 13064 3935 81 35,25 16,33 81 53,58 15,94 81 392580 118437 81 0,907 1,145 TT 69 12787 3931 69 35,14 13,90 69 53,22 13,56 69 371319 117283 69 1,287 1,413 rs10887199 (Intr) CC 1 8800 . 1 40,00 . 1 56,00 . 1 272000 . 1 0,500 . CT 42 13750 4662 42 39,05 14,63 42 50,86 14,30 42 396476 132533 42 1,127 1,263 TT 136 12768 3557 136 33,67 15,48 136 54,72 15,59 136 374309 109701 136 1,092 1,388 rs17886286 (Intr) CC 151 12840 3776 151 34,44 15,71 151 54,38 15,75 151 378861 114583 151 1,077 1,387 GC 27 13892 4234 27 37,74 13,56 27 50,59 12,64 27 383333 122590 27 1,229 1,183 GG 1 8800 . 1 40,00 . 1 56,00 1 272000 . 1 0,500 . rs7078012 (Intr) CC 110 13316 3862 110 35,01 15,31 110 53,35 15,63 110 380591 119159 110 1,150 1,551 CT 41 12282 3642 41 34,00 15,88 41 54,39 14,86 41 375805 105440 41 1,042 0,962 TT 28 12654 4109 28 36,21 15,35 28 54,82 15,10 28 377036 118461 28 0,966 0,961 Se han observado asociaciones significativas del rs 7078012 con la frecuencia cardiaca (p=0,04) y el número de linfocitos (p=0,027) de los SNP rs723192, rs188551 y rs10887199 con el número de neutrófilos mononucleares (p=0,02, p=0,04 y p=0,46 respectivamente); y de rs3088303 y rs17886286 con la saturación de oxigeno (SatO2). Sin embargo, todas estas asociaciones son marginales y no se puede excluir que al menos alguna de ellas sea fruto del elevado número de comparaciones realizadas. rs6413520 (S45S) AA 137 12812 3709 137 35,19 15,33 137 53,09 14,91 137 379569 113290 137 1,182 1,405 AG 42 13510 4306 42 34,24 15,67 42 56,19 16,48 42 376881 123599 42 0,813 1,134 GG 0 0 0 0 0 rs721917 (M31T) CC 16 12981 2706 16 33,88 12,54 16 52,13 11,35 16 401625 135165 16 1,625 1,479 CT 87 12915 4167 87 35,91 14,71 87 52,84 14,47 87 386092 124196 87 1,139 1,431 TT 76 13045 3730 76 34,12 16,72 76 55,30 16,91 76 365974 99736 76 0,938 1,216 rs723192 (Intr) CC 135 12699 3432 135 33,38 15,36 135 55,14 15,54 135 374919 109393 135 1,093 1,391 CT 43 13944 4880 43 39,84 14,69 43 49,63 14,08 43 394047 133192 43 1,122 1,258 TT 1 8800 . 1 40,00 1 56,00 . 1 272000 . 1 0,500 . rs1885551 (Prom) AA 136 12666 3440 136 33,67 15,48 136 54,74 15,58 136 376757 110552 136 1,096 1,387 AG 43 13955 4867 43 39,07 14,46 43 50,93 14,18 43 385837 130881 43 1,099 1,2258 GG 0 . . 0 . . 0 . . 0 . . 0 . . DISCUSIÓN Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 97 6. DISCUSIÓN Este estudio ha pretendido evaluar la epidemiología de la BA, así como la asociación de variantes genéticas del gen SFTPD, en la población menor de dos años de edad en la isla de Gran Canaria. El virus respiratorio sincitial es un importante patógeno del tracto respiratorio en la primera infancia. Los factores ambientales, el género y el nivel socioeconómico, juegan un papel importante en el riesgo de contraer una infección por VRS, pero las diferencias relacionadas con el huésped y en su susceptibilidad sugieren que existen factores genéticos que contribuyen también en el riesgo de padecer esta enfermedad (Malhotra y Krilov, 2000). Como ha sido ampliamente referido (Terletskaia-Ladwing y cols., 2005) las infecciones por VRS cursan a nivel mundial de forma estacional, ya que tienen lugar en los meses de octubre y noviembre, con picos asistenciales máximos durante diciembre y enero, disminuyendo en los meses de primavera y esporádicamente se pueden encontrar casos aislados durante el resto del año. La excepción son las zonas ecuatoriales donde se observan durante todo el año (Stensballe y cols., 2003). Los datos de nuestro estudio coloboran estos datos, ya que las infecciones por VRS en la isla de Gran Canaria también se presentan entre los meses de noviembre y febrero, con pico máximo en diciembre y enero. Referir, asimismo, que la mayoría de los lactantes quedan expuestos a este virus en al menos una ocasión (Carroll y cols., 2008). En cuanto a la frecuencia de consulta a urgencias, durante la epidemia 20062007 fue del 3,2% y en la de 2007-2008, del 3,4%. Mansbach y cols., refieren frecuencia de consultas por BA en Atención Primaria del 4-20% y en urgencias del 2,6% (Mansbach y cols., 2005), similar a las referidas en nuestra serie de un Servicio de Urgencias hospitalario. En la epidemia de 2006-2007 la tasa de ingresos hospitalarios por BA fue del 0,96% y en la de 2007-2008, del 1,5%. Nuestros datos son similares a los estudios publicados. Para la población menor de dos años de edad la frecuencia de ingresos Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 98 por BA se situa entre 1-3,5% siendo por VRS entre el 0,8-2,5% (Shay y cols., 1999, Nielsen y cols., 2003). El VRS es el agente etiológico predominante en la BA, siendo el responsable del 56% de los casos ingresados por debajo de los dos años de edad (intervalo 27%- 73%), pudiendo llegar a ser fatales (Vicent, 2003). Los datos de nuestro estudio son similares a los de Vicent, ya que ingresaron por BA por VRS el 57% (durante la epidemia de 2006-2007 y el 66% durante la epidemia de 2007-2008. Parece existir una alternancia anual en las epidemias de ingresos por infección por VRS, siendo unas de comienzo precoz e intenso, con otras de comienzo tardío y leve (Tarletskaia-Ladwing y cols., 2005). En el presente estudio la edad de la población afectada fue de 6,3 ± 2,21 meses para los pacientes con infección por VRS-A y 5,99 ± 2,11 meses para los afectados por VRS-B (p=0,02383). La edad media del grupo control fue superior a la de los casos por tratarse de pacientes que acudían programados para una intervención quirúrgica, ya que en la edad pedíatrica se demoran las intervenciones hasta que el paciente gane suficiente peso y tenga la edad necesaria para poder soportar dicho procedimiento, siempre que la patología que motiva la cirugía no sea urgente y la clínica lo permita. Los principales factores de riesgo para padecer BA y que ésta sea de mayor gravedad son: Prematuridad, Displasia brocopulmonar (DBP), EPC y las Cardiopatías Congénitas (CC) (fundamentalmente las complejas hemodinámicamente inestables o con hiperaflujo pulmonar) (Liese y cols., 2003, Rietveld y cols., 2006). De hecho, en poblaciones de riesgo la frecuencia de ingresos por IRA por VRS es mayor que para la población general, por ejemplo, en los prematuros menores de 32 semanas de edad gestacional oscila entre 4,4-18%; en lactantes con DBP entre 7,3%-42% y en niños con CC entre 1,6-9,8% (Bonillo y cols., 2000, Pedersen y cols., 2003). Existen otros factores de riesgo como tener hermanos mayores, asistir a la guardería, el género masculino, la exposición al tabaco (fundamentalmente durante Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 99 la gestación), el haber recibido lactancia materna durante menos de 1-2 meses y el pertenecer a niveles socioeconómicos inferiores (Cilla y cols., 2006). Con respecto a estas premisas, en nuestros pacientes los varones se afectaron algo más que las mujeres, pero estas diferencias no eran significativas (p=0,107). Con respecto al peso al nacimiento fue significativamente menor en los pacientes con bronquiolitis aguda por VRS, que en los controles (p= 0,04334; OR 2,209; IC-95%, 1,008-4,841). Sin embargo, comparando el peso al nacimiento y la edad gestacional (bajo peso para su edad < 2500 gr y EG > 37 semanas), no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos. También corroboramos, como Eriksson y cols., 2002, que la alimentación con lactancia materna durante menos de un mes es un factor de riesgo para sufrir BA, ya que más de la mitad (55,4%) de los pacientes habían recibido menos de un mes lactancia materna o no la habían recibido (p=0,04864, OR 0,5262, IC 95% 0,27581,004). Con respecto a los antecedentes familiares (como atopia, asma, rinitis alérgica) corroboramos, como Rossi y cols. 2007, que juegan un importante rol en el desarrollo de infección por VRS. Para rinitis alérgica el resultado fue p=0,003022; OR 2,4; IC 95%: 1,331-4,329. No encontramos asociación con la alergia alimentaria. En nuestra población, y como era de esperar, los parámetros clínicos que definen la gravedad de la enfermedad, como la frecuencia respiratoria, la frecuencia cardiaca o la saturación de oxigeno, se han asociado significativamente con la gravedad clínica de la BA por VRS. De hecho, la hipoxia (Sat O2 < 92-94%) es el mejor predictor clínico de la gravedad, requieriendo oxigenoterapia u otros tratamientos y medida de soporte. Clinicamente la hipoxia se correlaciona con la frecuencia respiratoria, pero no con las sibilancias o el tiraje. La identificación de factores de riesgo o marcadores clínicos de gravedad puede resultar útil en la toma de decisiones médicas, fundamentalmente para la indicación o no de realización de pruebas diagnósticas o la instauración de Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 100 procedimientos terapéuticos. En los últimos años ha surgido un especial interés por identificar factores de riesgo de BA grave. A pesar de la elevada incidencia y los múltiples estudios realizados, ningún tratamiento ha demostrado claramente su eficacia en la bronquiolitis. Sólo la oxigenoterapia se considera eficaz y necesaria en los casos con hipoxia (American Academy of Pediatrics, 2006). En referencia al tratamiento instaurado en nuestros pacientes, el 98,4% recibieron salbutamol nebulizado. Solo en dos pacientes no fue prescrito, probablemente por la clínica leve de la BA. Sigue existiendo controversia acerca de la eficacia real del salbutamol inhalado y cuándo usarlo. No hay suficiente evidencia para recomendar su uso sistemático, ya que no se ha podido demostrar su eficacia y no están exentos de efectos adversos. Los últimos metaanálisis publicados por Zhang y cols., 2005, sostienen que el beneficio obtenido es parcial y transitorio, por lo que debe sopesarse su uso valorando los riesgos y beneficios. Wainwright y cols., 2003, refieren que mejoran la oximetría y las puntuaciones de las escalas de trabajo respiratorio de forma aguda (aunque menos efecto en otros parámetros como duración de la hospitalización o tasa de ingresos). En otros estudios no han demostrado tener más eficacia que el placebo. En la experiencia clínica es cierto que algunos pacientes mejoran tras su administración; por lo tanto, es correcto usar una dosis de prueba, valorando la relación riesgobeneficio, pero si tras la reevaluación el paciente no mejora, no hay motivo para mantener el tratamiento. No está bien establecida la cadencia de administración de las inhalaciones en los lactantes en los que se encuentra mejoría tras su administración, concluyendo la mayoría de los estudios que se debe ser a demanda. Por otra parte, parece ser que el Salbutamol es más eficaz en niños mayores de 6 meses o con historia de atopia o asma familiar y la Adrenalina en los menores de 3-5 meses (Langley y cols., 2005). Por otra parte, recibieron tratamiento con corticoides sistémicos 48 pacientes (24,9%). En el momento actual se mantiene la recomendación de no aconsejar su utilización (tanto sistémica como inhalada) para los pacientes ambulatorios, e individualizarla en pacientes ingresados administrándolos sólo en casos muy seleccionados, que es lo que ha sucedido en nuestros pacientes. No fue prescrita ninguna otra medicación en nuestra serie. Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 101 En el presente trabajo se observó una asociación del SNP rs6413520 de SFTPD con la predisposición a sufrir BA por VRS: (p=0,003, OR 1,994, IC 95% 1,255-3,168). Además, el SNP rs7078012 se asoció marginalmente con la predisposición a BA por VRS (p=0,047). Cuando se realizó la asociación con BA por VRS-A y VRS-B por separado, el SNP que mostró una mayor asociación con BA por VRS-A fue también rs6413520 (0,028; OR 2,476, IC 95% 1,34-4,56). Otros SNP como rs10887199 (p=0,01), rs7078012 (p=0,026), rs 721917 (p=0,023) y rs1885551 (p=0,03) también se asociaron con BA por VRS-A pero en menor grado. Sin embargo, a pesar de que el tamaño muestral del grupo de pacientes con BA por VRS-B era el doble que el de VRS-A, el SNP rs6413520 se asoció en menor grado con BA por VRS-B (p=0,035; OR 1,761, IC 95% 1,035-2,995) y no se observaron asociaciones con los otros SNP analizados. De las asociaciones observadas con la predisposición a BA con VRS, VRS-A o VRS-B, únicamente la asociación de rs6413520 con predisposición a BA por VRS y VRS-A se mantuvo significativa tras corrección para comparaciones múltiples. Como resumen del estudio de asociación, nuestros resultados indican que el alelo menos frecuente de rs6413520 (alelo G) predispone a BA por VRS y VRS-A y podría asociarse en menor grado con BA por VRS-B. La asociación de rs6413520-G con predisposición a BA por VRS y VRS-A es además independiente la edad, la lactancia materna (menor de un mes o no lactancia frente a mayor de un mes) y de la presencia de antecedentes familiares de alergia como variables independientes, tal como se mostró en el análisis de regresión logística en el que se incluyeron estas variables. Los estudios previos de análisis de asociación de variantes de SFTPD con BA por VRS han sido contradictorios (Thomas y cols., 2009; Lathi y cols., 2009, Ampuero y cols., 2011). En dos estudios previos, el SNP rs721917 se asoció con la susceptibilidad a bronquiolitis por VRS (Lathi y cols., 2009, Ampuero y cols., 2011). En el estudio de Lathi y cols., se estudiaron 84 pacientes menores de un año de edad hospitalizados para tratamiento de bronquiolitis aguda por VRS y 93 niños control. En su estudio se observó una débil asociación (p=0,033) del alelo del rs721917 codificante para Metionina en el residuo 11 (Met11) con la susceptibilidad a BA por VRS. Por otra parte, Ampuero y cols., estudiaron 118 pacientes pediátricos menores de 6 meses de edad con infección por VRS (59 con BA grave, 34 moderada Variantes genéticas de la proteína D del surfactante pulmonar (SP-D): papel en la susceptibilidad y gravedad de la infección por virus respiratorio sincitial (VRS) 109 7. CONCLUSIONES En base a lo previamente expuesto, se llega a las siguientes conclusiones: 1. El bajo peso al nacimiento, lactancia materna inferior a un mes y los antecedentes familiares de atopia, rinitis alérgica y asma son factores de predisposición a bronquiolitis aguda por VRS, confirmando resultados publicados anteriormente. 2. El polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) rs6413520 del gen SFTPD se asocia con la susceptibilidad a bronquiolitis aguda por VRS, especialmente la causada por la infección por VRS-A. 3. Aunque se ha observado una discreta asociación estadística del SNP rs721917 con la susceptibilidad a bronquiolitis aguda por VRSA, pero no VRS-B ni VRS total, esta asociación no se mantiene tras corrección para múltiples comparaciones. Los datos obtenidos no apoyan un papel del rs721917 en la susceptibilidad a bronquiolitis aguda por VRS, como se había propuesto en estudios previos. 4. El haplotipo TCTCCGTCA de las variantes a estudio del gen SFTPD se asocian con la susceptibilidad a VRS, tanto VRS-A como VRS-B. 5. Pudiera existir una asociación del alelo rs6413520-G con una mayor predisposición a la bronquiolitis aguda por VRS moderada o grave, aunque los datos no permiten establecer conclusiones definitivas. 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