Valoración de los cambios morfológicos y pronósticos relacionados con la mutación BRAF en el carcinoma papilar de tiroides

-M. S. Martínez Martín- -M. S. Martínez MartínTESIS DOCTORAL “VALORACIÓN DE LOS CAMBIOS MORFOLÓGICOS Y PRONÓSTICOS RELACIONADOS CON LA MUTACIÓN BRAF EN EL CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES” FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD DEPARTAMENTO DE CIENCIAS MÉDICAS Y QUIRÚRGICAS Programa de Doctorado: “Avances en Traumatología, Medicina del Deporte y Cuidado de las Heridas” Área de Conocimiento: Ciencias Médicas TESIS DOCTORAL Presentada por: Dª María Soledad Martínez Martín CODIRIGIDA POR LOS PROFESORES: Dr. Juan José Cabrera Galván Dr. Eduardo Salido Ruíz Las Palmas de Gran Canaria, 16 de octubre de 2015 -Tesis doctoral- -M. S. Martínez MartínINTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 1 1.1 EL GEN BRAF .................................................................................................................................... 1 1.2 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES .................................................................................................. 4 1.2.1 DATOS EPIDEMIOLÓGICOS .............................................................................................................. 4 1.2.2 CLÍNICA Y DIAGNÓSTICO CLÍNICO .................................................................................................. 9 1.2.3 DESCRIPCIÓN MACROSCÓPICA ..................................................................................................... 10 1.2.4 DESCRIPCIÓN MICROSCÓPICA ...................................................................................................... 11 VARIANTES HISTOLOGICAS .................................................................................................................... 15 2.5 HISTOQUÍMICA E INMUNOHISTOQUÍMICA ..................................................................................... 22 1.2.6 FACTORES RELACIONADOS CON EL PRONÓSTICO ........................................................................ 24 1.2.7 EXTENSIÓN Y METÁSTASIS ............................................................................................................ 25 1.3 CARACTERÍSTICAS MOLECULARES DEL CARCINOMA PAPILAR ........................................................ 26 1.3.1 REORDENAMIENTOS ..................................................................................................................... 27 1.4 ASPECTOS MORFOLOGICOS PREDICTIVOS PARA LA MUTACION BRAF EN EL CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES. ........................................................................................................................................ 28 1.5 VALOR DEL PORCENTAJE DE LA MUTACIÓN BRAF EN EL CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES. ........ 35 PLANTEAMIENTO, HIPOTESIS Y OBJETIVOS. ....................................................... 40 OBJETIVOS DE LA TESIS DOCTORAL ...................................................................................................... 43 MATERIAL Y METODOS ........................................................................................... 44 3.1 ESTUDIO GENETICO. ....................................................................................................................... 45 -Tesis doctoral- -M. S. Martínez Martín3.2 DISEÑO ESTADÍSTICO. .................................................................................................................... 50 RESULTADOS ........................................................................................................... 52 4.1 RESULTADOS ESTADISTICOS ......................................................................................................... 177 4.1 Variable Implante tumoral: ............................................................................................................ 178 4.2 Variable Pink-atipia: ....................................................................................................................... 178 4.3 Variable Cambios Nucleares: ......................................................................................................... 178 4.4 Variable Encapsulación: ................................................................................................................. 179 4.5 Variable Fibrosis Tumoral: ............................................................................................................. 179 4.6 Variable Esclerosis-Desmoplasia: ................................................................................................... 179 4.7 Variable Infiltración de los Límites del Tumor: .............................................................................. 179 4.8 Variable Infiltración de Bordes: ...................................................................................................... 179 4.9 Variable Recidiva Tumoral: ............................................................................................................ 180 4.10 Variable Metástasis Ganglionares linfáticas:............................................................................... 180 4.11 Variable Metástasis a Distancia: .................................................................................................. 180 4.12 Variable Pacientes Fallecidos: ...................................................................................................... 180 4.2 RESULTADOS ESTADISTICOS POR TIPO HISTOLOGICO. Tabla de Contingencia. ............................. 181 4.3 RESULTADOS DEL ANALISIS DEL PORCENTAJE DE LA MUTACION BRAF EN ESCALA CONTINUA. ... 183 DISCUSIÓN .............................................................................................................. 198 5.1 DISCUSION RESULTADOS POR ANALISIS MULTIVARIANTE ........................................................... 198 5.1.1. Disposición Subcapsular del CPT. .............................................................................................. 199 5.1.2. Variable Implante tumoral. ........................................................................................................ 200 -Tesis doctoral- -M. S. Martínez Martín5.1.3. Variable “Pink-atipia”. ................................................................................................................ 200 5.1.4. Variable Cambios Nucleares. ..................................................................................................... 202 5.1.5. Variable Encapsulación .............................................................................................................. 203 5.1.6. Variable Fibrosis Tumoral........................................................................................................... 204 5.1.7. Variable Esclerosis. ..................................................................................................................... 205 5.1.8. Estadio Tumoral > I incluyendo Tamaño. ................................................................................... 206 5.1.9. Variable Infiltración de los Límites del Tumor. .......................................................................... 206 5.1.10. Variable Infiltración de Bordes Quirúrgicos. ............................................................................ 207 5.1.11. Variable Recidiva Tumoral. ...................................................................................................... 208 5.1.12 Variable Metástasis Ganglionares linfáticas. ............................................................................ 208 5.1.13. Variable Metástasis a distancia. ............................................................................................... 208 5.1.14 Variable pacientes fallecidos. .................................................................................................... 209 5.2 RESULTADOS ESTADISTICOS POR TIPO HISTOLOGICO. ................................................................. 210 (Ver Tabla de Contingencia). .............................................................................................................. 210 5.2.1. Variante Células Altas. ............................................................................................................... 210 5.2.2. El CPT de Clásico. ........................................................................................................................ 210 5.2.3. CPT variante Folicular. ............................................................................................................... 211 5.2.4. Variante Microcarcinomas. encapsulados y/o esclerosantes. ................................................... 212 5.2.5. Variante CPT Oxifílico. ............................................................................................................... 212 5.2.6. Variante Macrofolicular. ............................................................................................................ 213 5.2. 7. Variante Cribiforme. .................................................................................................................. 213 5.2.8. Variante poco diferenciada. ....................................................................................................... 213 -Tesis doctoral- -M. S. Martínez Martín5.3 DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS DEL ANALISIS DEL PORCENTAJE DE LA MUTACION BRAF EN ESCALA CONTINUA. ........................................................................................................................... 214 5.3.1. Variable Infiltración de los límites del Tumor. ........................................................................... 215 5.3.2. Variable Pink-atipia. ................................................................................................................... 216 5.3.3. Variable Fibrosis. ........................................................................................................................ 218 5.3.4 Variable Esclerosis-Desmoplasia. ................................................................................................ 218 5.3.5. Variable Estadio > I. .................................................................................................................... 219 5.3.6 Variable Bordes quirúrgicos. ....................................................................................................... 220 5.3.7. Variable CPT Encapsulados. ....................................................................................................... 221 5.3.8. Variable Subcapsular .................................................................................................................. 221 5.3.9. Variable Implante tumoral. ........................................................................................................ 222 5.3.10 Variable Recidiva Tumoral........................................................................................................ 223 5.3.11. Variable Metástasis Ganglionares linfáticas. ........................................................................... 223 5.4. DISCUSION RESULTADOS DE LOS CASOS CON MÁS DE UNA LESION. ........................................... 224 CONCLUSIONES ..................................................................................................... 227 BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................ 229 -M. S. Martínez MartínINTRODUCCIÓN -Introducción1 INTRODUCCIÓN 1.1 EL GEN BRAF Las mutaciones activadoras de BRAF están presentes en el 30-70% de los carcinomas papilares de tiroides (PTC), representando la alteración molecular más común. BRAF, como los otros componentes de la familia RAF (ARAF y CRAFT) es una quinasa serina-treonina, en la vía MAPK activada por RAS, y representa la isoforma más importante en las células foliculares. La asociación entre BRAF y carcinoma papilar tiroideo es más intensa cuando los tumores se caracterizan por la arquitectura papilar, independientemente que sea una carcinoma papilar clásico o un subtipo caracterizado por la arquitectura papilar (por ej. variante células altas). De hecho, la activación del oncogén BRAF es poco frecuente en la variante folicular y a veces presenta mutaciones distintas de la V600E. La mutación suele ser más frecuente en el sexo masculino, en pacientes de edad avanzada al diagnóstico, con infiltración extra tiroidea, de ganglios linfáticos o metástasis a distancia, presentación en estadio alto, recurrencia, y supervivencia reducida. Por todo lo expuesto, la mutación BRAF puede ser un factor pronóstico importante en el manejo de los pacientes con PTC. Esto se refleja en el importante valor predictivo en relación a la agresividad del tumor, recurrencia y mortalidad. Existen criterios moleculares documentados que sustentan la importancia de la mutación BRAF en la génesis del PTC y en su valor pronóstico, así como, en la sobreexpresión de proteínas promotoras, genes supresores tumorales y genes relacionados con la captación del -Introducción2 yodo. El valor pronóstico de la mutación BRAF, puede tener gran utilidad en muchas áreas del manejo de los PTC, como indicación quirúrgica más apropiada y el tratamiento con yodo, sobre todo en los pacientes con bajo riesgo, así como, en su seguimiento más adecuado. La posibilidad de usar la mutación BRAF como valor predictivo en la PAAF de Tiroides previa a la cirugía y en el posterior seguimiento, la convierten en una importante herramienta para la toma de decisiones. Aunque la eventualidad del uso de BRAF como indicación específica y estratégica para el manejo del PTC necesita aún ser definida, se espera que el uso pronóstico de este marcador molecular pueda dar una nueva dimensión en el riesgo de recurrencia, teniendo un impacto importante en el manejo práctico de PTC. LA MUTACIÓN BRAF La mutación del gen BRAF representa la proteína quinasa más comúnmente evaluada en la práctica patológica. Se encuentra en melanoma, carcinoma papilar de tiroides (incluyendo en carcinoma papilar de tiroides sobre teratoma ovárico-estruma ovarii), tumores serosos ováricos, carcinoma colorrectal, gliomas, carcinomas hepatobiliares, y leucemia de células peludas. En estos carcinomas se han descrito varias aberraciones genéticas del protooncogen BRAF, como diferentes mutaciones puntuales, y reordenamientos cromosómicos. La mutación más frecuente, BRAF V600E, puede ser detectada por secuenciación de ADN y con inmunohistoquímica de tejido incluido en parafina y fijado en formol. La detección de BRAF V600E tiene un potencial uso clínico tanto como marcador diagnóstico como en el pronóstico. Además una gran cantidad de investigaciones se centran en moléculas que inhiban su actividad. De esta forma, ensayos clínicos usando inhibidores selectivos de BRAF han tenido resultados esperanzadores en pacientes con melanoma metastásico. En otras neoplasias también hay investigaciones a este respecto. El mayor conocimiento de la -Introducción9 bilaterales, y carcinoma papilar de tiroides. Se estudiaron mutaciones genéticas que relacionan todos estos síndromes. (20) La obesidad se ha relacionado con el carcinoma papilar de tiroides en un estudio que relaciona el índice de masa corporal en pacientes con carcinoma, hay un riesgo mayor de desarrollar metástasis loco regionales durante el seguimiento y también más persistencia de enfermedad. (21) Se ha relacionado la postmenopausia con un factor adverso para el pronóstico del carcinoma papilar y está asociado con la expresión de EGFR. Este dato es importante para la estadificación tumoral y en la predicción del comportamiento tumoral. (22) En 2012, Cheng y col. publicaron un caso de coexistencia de carcinoma papilar de tiroides y linfoma primario tipo MALT extra nodal en un paciente de larga evolución de tiroiditis de Hashimoto. (23) En otro de los casos publicados se manifestó como obstrucción de la vía aérea superior que requirió traqueotomía de urgencia y tiroidectomía total como tratamiento de las dos neoplasias. (24) En resumen, en un estudio prospectivo de cohortes realizado en Estados Unidos de 5583 casos de carcinoma de tiroides tratado durante 1996, los potenciales factores de riesgo asociados con carcinoma papilar de tiroides, incluyen bocio (14.9% de los casos), tiroiditis (8.1% de casos), historia de exposición a la radiación (4.8%), y enfermedad de Graves (2.0% de casos). (25) 1.2.2 CLÍNICA Y DIAGNÓSTICO CLÍNICO Casi todos los pacientes tienen enfermedad clínicamente evidente en el cuello cuando se diagnostica por primera vez. En series de estudios se han diagnosticado enfermedad localizada en tiroides en un 67% de casos, en tiroides y ganglios linfáticos en un 13% y sólo en ganglios linfáticos en un 20%.(26) -Introducción10 Clínicamente el carcinoma papilar puede manifestarse como metástasis pero la ausencia de lesión primaria en el tiroides se designa como carcinoma papilar oculto.(27) La ecografía es el método de elección para la detección de ganglios linfáticos regionales en pacientes con carcinoma papilar de tiroides, antes de la cirugía y para control posterior de la evolución, importante en la guía de la punción con aspiración para el diagnóstico. El carcinoma papilar presenta imágenes típicas como microcalcificaciones, cambios quísticos, morfología anormal, y alteraciones vasculares con infiltración metastásica ganglionar, que son útiles, tanto para el diagnóstico con punción con aguja fina, como para el seguimiento posterior. (28) 1.2.3 DESCRIPCIÓN MACROSCÓPICA La típica apariencia macroscópica del carcinoma papilar de tiroides es una tumoración bien definida con bordes irregulares y consistencia firme, con superficie de corte blanquecina, pálida, granular y algunas veces asociada a calcificaciones. Otras presentaciones del carcinoma papilar es un tumor quístico, con crecimiento adjunto de tipo papilar. A veces puede tener un crecimiento de tipo adenoma y es necesario un adecuado estudio microscópico para su diagnóstico. El tamaño del tumor primario varía desde microscópico hasta gran tamaño. Una gran proporción de cánceres tiroideos que miden menos de 1 mm de diámetro son carcinoma de tipo papilar. La mayoría de los casos son sólidos, blanquecinos, firmes, y claramente invasivos, menos un 10% aproximadamente, que están rodeados por una cápsula completa. Hay marcados cambios quísticos en un 10% de los casos. A veces, macroscópicamente son evidentes las papilas, incluso a simple vista. (26) -Introducción11 1.2.4 DESCRIPCIÓN MICROSCÓPICA Microscópicamente el carcinoma papilar clásico contiene numerosas papilas verdaderas, una imagen fácilmente reconocible que, como cualquiera podría deducir, fue la que dio nombre al carcinoma (Fig. 1). (29;30) Las papilas, generalmente son completas, ramificadas, y orientadas aleatoriamente, con un eje central fibrovascular rodeado por un epitelio celular cuboidal simple o estratificado. El estroma papilar puede ser edematoso o hialino, y puede contener infocitos, macrófagos espumosos, hemosiderina, o excepcionalmente tejido adiposo. Esas papilas están asociadas estrechamente con la formación de folículos, aunque la proporción entre estos dos componentes varían ampliamente según los casos. Con la mayor experiencia en el conocimiento de estos tumores, se ha hecho evidente que las células de los carcinomas papilares tienen imágenes nucleares características. Estas características nucleares han tomado tanta relevancia, que actualmente el diagnóstico del carcinoma papilar es más dependiente de su presencia que de la existencia de una arquitectura papilar, que puede ser mínima e incluso ausente (ver variantes histológicas). Fig. 1: imagen microscópica del carcinoma papilar. -Introducción12 Los cambios nucleares consisten:  Núcleos ópticamente claros, en vidrio esmerilado.  Pseudoinclusiones nucleares  Muescas o surcos nucleares  Microfilamentos nucleares Fig.2. Núcleos claros con gran tamaño (H/E 40x) Los núcleos son claros, en vidrio esmerilado, suelen tener un gran tamaño y se superponen (Fig. 2). El nucleolo suele ser discreto y se encuentra empujando la membrana nuclear, que aparece engrosada. Las pseudoinclusiones nucleares representan invaginaciones del citoplasma y aparecen como formaciones acidofílicas y suavemente contorneadas. Al contrario de la imagen en vidrio esmerilado, las pseudoinclusiones son fácilmente evidentes en las muestras de sección congeladas y -Introducción13 en muestras citológicas de aspiración. Inmunohistoquímicamente muestran positividad a -catenina y a veces con colágeno tipo IV.(31;32) Fig. 3 y 4. Pseudoinclusiones nucleares (H/E, 20x y 40x) Los surcos o muescas nucleares tienden a ocurrir en núcleos ovales o fusiformes, suelen estar organizados en el eje mayor nuclear y representan (como las pseudoinclusiones) la expresión morfológica de invaginaciones de excedentes de la membrana nuclear.(33) Por último los pocos casos de microfilamentos nucleares, han sido descritos en los aclaramientos nucleares debido a acúmulos de finas fibrillas filiformes. (34;35) Las mitosis son muy escasas o ausentes. (36) Aproximadamente la mitad de los casos, muestran fibrosis extensa. Los cuerpos de Psammoma se ven aproximadamente en la mitad de los casos. Suelen localizarse en el cuerpo de la papila, en el estroma fibroso o en los focos sólidos de las células tumorales. Su presencia en la glándula tiroides sugiere fuertemente el diagnóstico de carcinoma papilar, mientras su ocurrencia en otras lesiones tiroideas es excepcional. (37) Klinck y Winship (38) encontraron sólo una, en una revisión de 2153 tiroides benignos. Esto representa una característica diagnóstica muy importante no sólo en secciones de parafina, sino también en secciones en congelación, en -Introducción14 preparaciones citológicas y en número bastante de ecografías. (39) Si se presentan en tejido tiroideo normal o en ganglios linfáticos en cuello, indican con alta probabilidad la existencia de un carcinoma papilar en la inmediata vecindad. (38;40) Esas estructuras basofílicas muestran laminaciones concéntricas que se tiñen con mucina, hierro, y calcio, y parecen originarse de necrosis de células individuales, que ocasionalmente pueden ser vistas en el centro y representan el nido de esta formación. (41) Fig. 5. Cuerpos de psammoma (H/E, 20x) Los cuerpos de psammoma (Fig. 5) deben diferenciarse de otras formas de calcificación, y de los focos intraluminales de secreción espesa que se observan en los tumores de células de Hürtle. (29) La infiltración linfocítica del estroma tumoral se observa en una cuarta parte de los casos, no está claro si representa una reacción frente al tumor o bien una expresión de una tiroiditis preexistente. (42) Infiltración vascular sólo se encuentra en un 5% de los casos. (43) -Introducción15 VARIANTES HISTOLOGICAS Han sido descritas las siguientes variantes histológicas: (44)  Variante carcinoma micropapilar.  Variante folicular.  Variante de células altas o columnares.  Variante encapsulada.  Variante esclerosante difusa.  Variante oncocítica (oxifílica).  Variante cribiforme o morular.  Carcinoma papilar con estroma exuberante nodular fascitis-like. CARCINOMA PAPILAR VARIANTE MICROPAPILAR (1) Se define el carcinoma micropapilar como aquel que mide 1 cm o menos de diámetro. (45) Sus características microscópicas y el perfil de pérdida de heterocigosidad mutacional investigados ampliamente no son diferentes del carcinoma papilar de mayor tamaño. (46) RET/PTC es frecuente y las mutaciones del gen BRAF han sido identificados, aunque son menos frecuentes que en los tumores de mayor tamaño. El carcinoma micropapilar es un hallazgo incidental extremadamente común (25% o más, dependiendo de la minuciosidad del examen) en glándulas tiroideas examinadas por otras razones y en estudios autópsicos poblacionales. (47) Al contrario de los -Introducción16 carcinomas papilares clásicos, los micropapilares parecen ser más frecuentes en varones que en mujeres. (48) A pesar de su pequeño tamaño, el tumor a veces es puede ser identificado en material de aspiración con aguja fina.(49) Se asocia con metástasis en ganglios cervicales (reactivas con S100A4). (50) De todos modos, las metástasis a distancia son extremadamente raras y el pronóstico suele ser excelente.(45) La experiencia con los casos relacionados con el accidente de Chernobyl sugieren que su relevancia clínica y su buen pronóstico no puede ser asumida en los carcinomas micropapilares en la infancia, y de hecho se propone que la definición de carcinoma micropapilar se reserve sólo para los tumores en adultos. (51-53) VARIANTE FOLICULAR (2) Carcinoma papilar compuesto totalmente o casi totalmente por folículos (Fig.6). (54) El diagnóstico está basado en la presencia de núcleos tipo carcinoma papilar. Otras características útiles para el diagnóstico son: un patrón de crecimiento infiltrante, Fig. 6. Carcinoma papilar variante folicular (HE 40x) trabeculación fibrosa (particularmente en la periferia tumoral), cuerpos de psammoma, coloide eosinofílico con bordes festoneados, y la presencia de papilas abortivas. El comportamiento de esos tumores, cuando son infiltrantes, es similar al carcinoma papilar convencional, particularmente con respecto a la alta incidencia de metástasis -Introducción17 ganglionares. (55) Las metástasis usualmente exhiben formaciones papilares mejor desarrolladas. La variante folicular del carcinoma papilar puede ser vista como resultado del balance de dos propiedades biológicas de las células tumorales: diferenciación de la actividad secretora (folículos coloideos) y proliferación. Cuando una de estas propiedades predominan sobre las otras, surgen las siguientes variantes: sólida, macrofolicular, difusa (multinodular), y encapsulada. Variante sólida del carcinoma papilar de patrón folicular Esta variante, que es particularmente común en niños, se desarrolla cuando la proliferación predomina sobre la secreción. Se caracteriza por nidos sólidos de forma redondeada, que puede ser visualizado por folículos. Se distingue del carcinoma insular, y otras formas de carcinoma poco diferenciado, porque las imágenes nucleares son similares al del carcinoma papilar. (56) Fig. 7. Variante macrofolicular del carcinoma papilar tipo folicular Variante macrofolicular del carcinoma papilar de patrón folicular Esta pudiera ser vista como la opuesta a la variante sólida, en el sentido en que la actividad secretora es resultado de grandes folículos dilatados, por lo que el tumor asemeja no tanto a una neoplasia folicular, sino a un nódulo hiperplásico. (57) Los requerimientos para inclusión de esta lesión en el grupo del carcinoma papilar, puede -Introducción18 ser incluso más exigentes que los de la variante clásica del carcinoma papilar. Basándonos en estas observaciones y con el propósito de aclarar todas las reacciones que el término carcinoma provoca en los cirujanos y pacientes, el Chernobyl Pathology Group, propuso la siguiente terminología, según las características histológicas propias del carcinoma papilar sean obvias, cuestionables o ausentes. Si los cambios nucleares son evidentes se denominan carcinoma papilar de tiroides, variante folicular, con independencia de la existencia de cápsula. Para lesiones con cambios nucleares cuestionables, se prefiere el término de carcinoma bien diferenciado, NOS, si se observa infiltración de la cápsula. Si la infiltración capsular es cuestionable o ausente, se trataría de un tumor bien diferenciado, con potencial maligno indeterminado. Otros autores han encontrado que la reproductibilidad diagnóstica de este esquema es similar a las de las otras clasificaciones convencionales.(58) Es importante mencionar que RET/PTC y mutaciones de V600 BRAF son raras en la variante folicular encapsulada del carcinoma papilar (aunque otras mutaciones de BRAF como la K601E pueden estar presentes), que las mutaciones RAS son frecuentes, mutaciones PAX8/PPAR pueden ocurrir y que la aneuploidía es frecuente. (59) Esto indica que estos tumores son diferentes de los otros carcinomas papilares y muestran alteraciones que (al menos estadísticamente hablando) son intermedios entre adenomas o carcinomas foliculares y carcinoma papilar. Este hecho, junto a la dificultad en hacer un diagnóstico histológico reproducible, sugieren que al menos algunas variantes foliculares encapsuladas del carcinoma papilar podrían ser actualmente incluidas como carcinomas foliculares (si infiltran) o adenomas foliculares (cuando no son invasivos). (60) -Introducción25 FOCOS ANAPLÁSICOS, ESCAMOSOS, POCO DIFERENCIADOS: estas características tienen marcada influencia negativa en el pronóstico. Afortunadamente, sólo se presentan en un 5% de los casos. GRADO: este parámetro suele relacionarse con los siguientes, sin embargo puede ser subestimado y es necesario una adecuada definición de criterios (necrosis, actividad mitósica, etc.) y estandarizarlos para alcanzar su máximo potencial. (85) DNA ploidía: algunos estudios han mostrado una buena correlación entre aneuploidía y comportamiento agresivo en el carcinoma papilar, pero no está aún claro si el tipo de información que proporciona ya se podría obtener de la clínica o de parámetros morfológicos. (86) CELULAS TUMORALES CIRCULANTES: la presencia de células tumorales circulantes (determinadas con RT-PCR para RNA de tiroglobulina o por identificación de V600E BRAF en sangre periférica) ha sido asociada con enfermedad persistente/recurrente y puede proveer de información útil, aunque no está claro cuál de esos procedimientos jugará un papel práctico en el manejo clínico. (87) BRAF: muchos estudios han mostrado que los casos con mutación BRAF (V600E) tienen un comportamiento más agresivo y peor respuesta a los tratamientos. (88;89) 1.2.7 EXTENSIÓN Y METÁSTASIS La extensión extra-tiroidea en tejidos blandos del cuello se encuentra en una cuarta parte de los casos, con ocasional extensión a las glándulas paratiroides. La infiltración de los ganglios linfáticos cervicales es muy común (particularmente en los pacientes jóvenes), y pueden ser la primera manifestación de la enfermedad. Las metástasis ganglionares tienen tendencia a incluir cambios quísticos. Esas metástasis pueden no ser clínicamente aparentes por su pequeño tamaño y también porque su consistencia puede no ser diferente de un ganglio linfático normal. En un estudio de 67 pacientes -Introducción26 con nódulos clínicamente negativos, 41 (61%) tenían metástasis en el examen microscópico. (90) Las metástasis por vía vascular son menos frecuentes que en otros carcinomas de tiroides, pero también pueden producirse. (81) Aunque el órgano más común al que metastatizan es el pulmón, también pueden producirse en huesos, tejidos blandos, sistema nervioso central, páncreas, mama, y algunos otros órganos. Las mutaciones BRAF se han asociado con la existencia de metástasis en ganglios linfáticos y a distancia. 1.3 CARACTERÍSTICAS MOLECULARES DEL CARCINOMA PAPILAR La principal vía molecular implicada en el carcinoma papilar de tiroides es la vía de activación de la proteína quinasa mitogénica activada (MAPK mitogen-activated protein kinase).(91) Esta vía de señalización regula importantes funciones celulares (por ej. proliferación, diferenciación, y supervivencia) y está alterada en muchos tipos de tumor. En la glándula tiroides la vía de activación MAPK es la consecuencia de tres elementos diferentes: reordenamiento de genes (RET/PTC o bien reordenamientos TRK, menos frecuentes), activación de mutación BRAF, o activación de mutación RAS. (92) El factor oncogénico de las mutaciones RET/PTC, BRAF y RAS en las células foliculares tiroideas han sido demostrados en numerosos estudios in vitro y usando modelos transgénicos de ratones. Como era esperable, como los procesos oncogénicos se producen de manera secuencial, en la misma vía de activación, muchos estudios han demostrado que esas alteraciones son mutuamente excluyentes, pero una de ellas suelen ser detectada en la mayoría de los casos de carcinoma papilar de tiroides (70-80%). De esta forma, el análisis de expresión de cDNA ha -Introducción27 confirmado que esas mutaciones provocan tumores que aunque son similares, sin embargo tienen diferentes perfiles. Las principales alteraciones genéticas implicadas en el carcinoma papilar de tiroides son las siguientes: Carcinoma papilar (tipo convencional): mutación BRAF (30-70%), RET/PTC (20-40%), RAS (0-10%), TRK (0-10%), estabilidad cromosómica (estudios citogenéticos convencionales, medida citométrica de contenido en DNA, hibridación genómica comparativa, pérdida de heterocigosidad). Variante encapsulada folicular del carcinoma papilar: mutación RAS (25-45%), RET/PTC (5-10%), BRAF (5-10%), PAX8/PPPAR (0-30%) e inestabilidad cromosómica (estudios citogenéticos convencionales, medida citométrica de contenido en DNA, hibridación genómica comparativa, pérdida de heterocigosidad). 1.3.1 REORDENAMIENTOS El cáncer de tiroides es uno de las pocas neoplasias epiteliales asociadas con reordenamientos genéticos específicos (RET/PTC, TRK, PAX8/PPPARg), similares a las que ocurren en tumores hematolinfoides y mesenquimales. Los reordenamientos afectan a un 20-40% de los carcinomas papilares y la amplia mayoría de ellos incluyen el gen RET, receptor transmembrana de tirosina quinasa. (93) Estos, se denominan RET/PTC (para papillary thyroid carcinoma) son genes quiméricos generados por fusión del dominio RET tirosina quinasa con otros genes, que distinguen diferentes isoformas. Los reordenamientos suelen ser identificados por reacción inversa de la cadena de transcriptasa-polimerasa (RT-PCR) o por hibridación fluorescente in situ (FISH). También podría ser usada la inmunohistoquímica para su detección pero depende de la viabilidad de los anticuerpos y deben ser confirmadas por otros métodos. -Introducción28 RET/PTC se asocia típicamente con radioterapia terapeútica o bien por exposición accidental, la más evidente es la asociación con el accidente nuclear de Chernobyl en 1986. También frecuentemente se asocia con carcinoma papilar de tiroides en los niños y adultos jóvenes. En general los casos RET/PTC positivos suelen ser carcinomas papilares clásicos o microcarcinomas, suelen ser de bajo grado, aunque es común la presencia de metástasis en ganglios linfáticos, y muestran baja actividad proliferativa y poca tendencia a la desdiferenciación.(94) Esto es particularmente evidente en los casos con el reordenamiento más común RET/PTC1, mientras RET/PTC3 positivos son más agresivos. (95) La prevalencia del reordenamiento RET/PTC en el carcinoma papilar es enormemente variable, no sólo por la variación geográfica sino por los diferentes métodos de detección utilizados. (96) 1.4 ASPECTOS MORFOLOGICOS PREDICTIVOS PARA LA MUTACION BRAF EN EL CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES. Como se ha expuesto en la presente introducción, la mutación BRAF en el PTC se ha descrito con una frecuencia que oscila entre un 28-70%, siendo la anomalía genética más hallada con finalidad pronóstica y predictiva, siendo ahora ampliada a la PAAF tiroidea como diagnóstico. Muchos autores han descrito relaciones entre la mutación BRAF y factores pronósticos del PTC, así por ejemplo en relación a las metástasis ganglionares linfáticas, la extensión extra-tiroidea del tumor, alto estadio, recurrencia y recidiva, aunque otros autores no lo han encontrado. Por otro lado conociendo la mutación BRAF, se puede determinar la extensión quirúrgica, el uso del yodo radioactivo como terapia y el seguimiento del paciente. Se -Introducción29 ha llegado a proponer que una terapia dirigida contra la mutación BRAF puede ser una alternativa al yodo. Los PTC estén mutados o no, presentan unos hallazgos distintivos ya relatados anteriormente. Ahora bien, la mutación se asocia mayormente con la infiltración de los límites del tumor, reacción estromal asociada a la neoplasia que va desde la desmoplasia a la simple fibrosis o esclerosis. Otro signo histológico asociado es el aspecto microscópico del núcleo, con sus características morfológicas completas (irregularidades de la forma y tamaño, cromatina clara, pseudoinclusiones, inclusiones verdaderas y apilamientos nucleares) o incompletas (cuando faltan algunos de ellos). Además de los cambios nucleares, se le da mucho valor al aspecto y tamaño de los citoplasmas. Un tamaño celular mayor con eosinofilia (plumppink o “pink atipia”), célula alta y los cuerpos de psammoma. Dentro de las variables histológicas, el PTC Clásico, el de células altas y la forma Esclerosante subcapsular, son las más asociadas a la mutación, mientras que la variante Folicular no se asocia a la misma. A modo de resumen de lo expuesto, se puede concretar con más detalle las características morfológicas citadas. Así, para definir un PTC clásico se requiere que el tumor muestre un patrón arquitectural papilar en más del 5% de su estructura, pudiendo llegar a ser quístico. La variante Folicular, debe tener un patrón exclusivo folicular o menos de un 5% de áreas papilares. Un dato muy remarcado es la definición del PTC de células altas. Así, más del 50% del tumor debe tener moderada o abundante eosinofilia (Pink atipia) citoplásmica y éste debe ser el doble de alto que de ancho. Además debe poseer cambios nucleares típicos. -Introducción30 La forma Subcapsular esclerosante, se caracteriza por su disposición característica, al menos 20% del tumor está relacionado con la cápsula, fibrosis central estrellada, bordes infiltrados y cambios nucleares clásicos. Las alteraciones de los núcleos son también notorias. Así, se consideran cambios nítidos nucleares bien desarrollados: agrandamiento irregular, apilamientos, inclusiones, membrana nuclear irregular, aclaramiento cromatínico y pseudoinclusiones. Se considera poco pronunciado, cuando las pseudoinclusiones están ausentes y el resto de los hallazgo son muy focales o están ausentes. Un factor interesante es el comportamiento infiltrativo del tumor. El PTC, al ser de crecimiento lento, muestra su agresividad en base a la infiltración de los límites del tumor, entre el mismo o su cápsula si la tuviera y la interfase tisular periférica normal del tumor. Aunque se podrían establecer diferentes grados, como por ejemplo infiltración proximal, mediana o a distancia, se debe diferenciar esta característica de la ocupación de la capsula externa glandular por el crecimiento infiltrante del mismo de forma masiva o por su incremento de tamaño. La reacción estromal del PTC, es una característica similar a la de otros tumores epiteliales. Esta capacidad de respuesta fibroblástica del tumor se puede establecer de la siguiente forma: a) Fibrosis, sería componente colágeno fibroso con un estroma no mixoide. b) Desmoplasia con proliferación fibroblástica y estroma laxo joven o mixoide, indicativa de la actividad del tumor o bien c) Esclerosis, con un colágeno paucicelular, eosinófilo y con bandas densas de colágeno ya re-precipitado. Un detalle a tener en cuenta en el crecimiento del PTC, como ya se ha dicho, es la forma citoplásmica. Es muy frecuente que al tener mayor capacidad de desarrollo aumente el tamaño citoplásmico y se haga más eosinófilo (Plump pink) o Pink atipia, que aunque en sus diversos grados, se puede establecer como positiva o negativa. -Introducción31 Este cambio morfológico, puede estar supeditado a la subjetividad del patólogo que observa. Para su definición, el tamaño celular suele tener un aspecto poligonal con moderada o abundante eosinofilia homogénea, a veces con prolongaciones ovoides o “en tachuela”. El tamaño de su citoplasma es menos de dos veces su altura, no considerándoseles células altas. Estos rasgos se acompañan de cambios nucleares marcados. Es característico que este signo se pueda ver solamente focal o en muchas ocasiones de forma neta en las zonas de infiltración del tumor. Debe diferenciarse de los tipos celulares denominados oncocíticos o eosinofílicos, propios de las variantes denominadas de células de Hürthle. Por último los cuerpos de psammoma pueden estar presentes o ausentes, con sus formas de calcificaciones lamelares concéntricas. Estas alteraciones celulares del PTC descritas, son las que más se asocian con la mutación BRAF. Se han realizado estudios predictivos doble ciego por patólogos distintos, que valoran previamente los criterios morfológicos más asociados a la mutación BRAF, estableciéndose la hipótesis de que dichos cambios pueden establecer la presencia de mutación en un alto porcentaje de casos, en torno a un valor predictivo de un 84%, un 96% de sensibilidad y un 71% de especificidad. Los valores predictivos fueron, positivos de un 78% y negativo de un 94 %. En tal sentido, los signos morfológicos mayormente asociados a la mutación BRAF y el PTC se pueden resumir en los siguientes: referidos a una asociación específica negativa se considera en primer lugar la negatividad para la mutación en el PTC Variante Folicular (p=0.001). La encapsulación del tumor sin límites infiltrativos, que fue de p=0.005. Los hallazgo nucleares incompletos o subtle se valoraron significativamente también p=0.002. -Introducción32 Respecto a la relación positiva, llama la atención la presencia de Infiltración de los límites tumorales p=0.005, la asociación para la Reacción estromal p=0.001, la pinkatipia (Plump pink) p=0.013 y los cuerpos de psammoma, que fue negativa p=0.158. Es interesante señalar los rasgos morfológicos que pueden servir como predictivos para mutación positiva por un patólogo desconocedor de la mutación. Así, los cambios nucleares bien desarrollados fueron 100% sensible predictivos, mientras que la infiltración de los bordes tuvo una especificidad de un 71% y un PPV del 75%. Por el contrario los cambios nucleares incompletos (subtles) tuvieron un valor predictivo negativo (NPV). Los valores predictivos más altos corresponden a la infiltración de los límites del tumor (75%) de mutación positiva, la relación desmoplasia/fibrosis (74%) y los cuerpos de psammoma (65%). Además, cuando los tres rasgos estaban presentes la predicción de la mutación positiva se acerca casi al 100%. El valor predictivo de estos estudios entre ambos patólogos fue de un 83%. (97) Otros tipos de asociaciones como la Pink atipia, y la reacción estromal con la infiltración de los bordes alcanza un predicción del 80%. Los cuerpos de psamoma, sin embargo se relacionan poco por sí solos a la mutación, excepto que se combinen con límites infiltrados, reacción estromal y la pink atipia. Teniendo en cuenta los datos precedentes, la mutación puede predecirse en un 85% de los casos, pudiendo llegar a tener una sensibilidad del 96%. Los tumores más propensos a no ser predictivos son los correspondientes a la variante Folicular de CPT, los que aparezcan bien delimitados, sin límites infiltrados, aunque tengan cambios nucleares bien desarrollados. Sin embargo, algunos casos de mutación negativa pueden poseer algunos de los rasgos morfológicos como núcleos muy -Introducción33 característicos, cuerpos de psamoma, límites infiltrados, reacción estromal o pink atipia. Por todo lo precedente, la mutación BRAF puede predecirse en más de un 80% de los casos de PTC, teniendo en cuenta los parámetros citados, solamente mediante la observación de una simple Hematoxilina y Eosina. Dichos parámetros, se podrían resumir en: Subtipo histológico, cambios nucleares, reacción estromal, pink atipia y presencia de cambios focales atípicos como las células altas. Todos los anteriores, excepto los cuerpos de psammoma, demostraron alta sensibilidad (>80%), pero una especificidad limitada 65-75 %. Ahora bien, si los rasgos nucleares no están totalmente presentes el valor predictivo negativo NPV fue del 100% por ejemplo el CPT Folicular. Uno de los hallazgos que con mayor exactitud predice la mutación fue la infiltración de los bordes o límites del tumor. Para otros autores como Lupi (98), la ausencia de capsula también se asocia a la mutación por medio de análisis multivariante. Por tipos histológicos, la prevalencia no es uniforme, así las células altas, clásico y Warthin-like se asocian frecuentemente, mientras que no ocurre así con la variante folicular. El tipo histológico es un dato importante, por lo tanto. Ahora bien, solo este dato no es suficiente porque algunos Foliculares pueden ser positivos y algunos Clásicos pueden ser negativos, aunque sean los menos frecuentes. En la experiencia de esos autores, la Variante folicular con hallazgos nucleares positivos, bordes infiltrativos y estroma asociado, tenderá a ser positiva, a pesar de ser variante folicular. Ello ha sido reportado por otros como Eloy (99), mientras que un PTC bien circunscrito y con limites no infiltrados, sería no predictivo en más del 94% de los casos, que puede llegar a un casi 100% si los hallazgos nucleares no son nítidos, todo -Introducción34 ello excluye casi virtualmente la mutación. Si el patólogo emplea estos aspectos puede hacer posible la predicción. Es lógico pensar que dicha predicción puede verse afectada por la eficacia de las técnicas moleculares. En la experiencia, el patólogo responsable del diagnóstico selecciona el área para extraer la zona tisular para la extracción del ADN, asegurándose que sea representativa. Un dato a tener en cuenta es valorar previamente dicha zona con IHQ mediante el anticuerpo monoclonal BRAF 600E-proteína mutada, clona VE1. Aunque se propone como sensible, sin embargo la debilidad de la tinción no permite que sea específica claramente. Hay que tener en cuenta el precio del anticuerpo y parece ser que no va a reemplazar a la realización de la mutación. Al final se concluye por los autores citados que la propuesta de un set morfológico muy definido por los criterios establecidos puede predecir en más de un 80% la mutación BRAF. Aunque este test histopatológico no va a reemplazar la práctica del test de la mutación, si va a orientar el tipo de tejido o tumor apropiado para dicha técnica, limitando así los costes. Ello podría ser interesante en los PTC multifocales, para seleccionar la zona más apropiada para extraer el DNA. Convendría, por último, recomendar un estudio de los cambios morfológicos citados en los casos de PTC que no muestren la mutación, así como la variabilidad resultante entre el incremento del porcentaje de la mutación BRAF y su posible asociación con mayor agresividad manifestada por los signos que acabamos de exponer. -Planteamiento, hipótesis y objetivos41 PLANTEAMIENTO, HIPOTESIS Y OBJETIVOS Dado que en el PTC la mutación BRAF está estrechamente asociada con la extensión extra tiroidea, invasión ganglionar linfática cervical, estadio tumoral avanzado, recurrencia e incluso mortalidad y que se han identificado muchas alteraciones moleculares promocionadas o asociadas a la mutación BRAF, tales como sobreexpresión de genes promotores, supresión de genes supresores y anulación de genes relacionados con la yodación tiroidea que dificultan la adecuada captación del mismo, dificultando la terapia posterior con yodo radioactivo, nos proponemos con el presente trabajo, estudiar la mutación BRAF en patología quirúrgica tiroidea con la finalidad de que su estudio y valoración pueda ser útil con alto valor predictivo en el posterior seguimiento del PTC y en un futuro uso de la misma en las PAAF tiroideas. Todo ello puede aportar más exactitud en el manejo y estadiaje de los citados tumores, sobre todo, a la hora de la toma de decisiones preoperatorias y posteriormente con el tratamiento con yodo radioactivo, evitando así las posibles recidivas. Por todo lo expuesto, la mutación BRAF puede ser un factor pronóstico importante en el manejo de los pacientes con PTC. Esto se refleja en su valor predictivo respecto de la agresividad tumoral, recurrencia y mortalidad. Existen criterios moleculares documentados que sustentan la importancia de la mutación BRAF en la tumorogénesis del PTC y en su valor pronóstico, así como, en la sobreexpresión de proteínas promotoras, genes supresores tumorales y genes relacionados con la captación del yodo. El valor pronóstico de la mutación BRAF, puede tener mucha utilidad en diversas áreas de manejo de los PTC, como son la indicación quirúrgica más apropiada y el -Planteamiento, hipótesis y objetivos42 tratamiento con yodo, sobre todo en los pacientes con bajo riesgo, así como, en su seguimiento más adecuado. La posibilidad de usar la mutación BRAF como valor predictivo en la PAAF de Tiroides previa a la cirugía y en el posterior seguimiento, le convierten en una importante herramienta para la toma de decisiones. Aunque la eventualidad del uso de BRAF como indicación específica y estratégica para el manejo del PTC necesita aún ser definida, se espera que el uso pronóstico de este marcador molecular, pueda dar una nueva dimensión en el riesgo de recurrencia, teniendo un impacto importante en el manejo práctico de PTC. Está ya suficientemente probado en la literatura que la mutación BRAF, además de los factores ya descritos, se asocia con unas características morfológicas determinadas. De tal modo es así, que se han hecho estudios que predicen dicha mutación en base a las mismas. Faltaría estudiar cual es la expresión de esos cambios morfológicos en los PTC cuando no existe la mutación. Por último, con métodos de pirosecuenciación se ha establecido relación entre el porcentaje de la mutación BRAF y los factores pronósticos. Por todo lo cual, nos planteamos los siguientes objetivos, en la presente Tesis Doctoral. -Planteamiento, hipótesis y objetivos43 OBJETIVOS DE LA TESIS DOCTORAL 1) Determinar los valores y porcentajes de la mutación BRAF en el PTC. 2) Relacionar dichos valores con los factores pronósticos generales. 3) Valorar estadísticamente dichos factores. 4) Estudiar los cambios histopatológicos del PTC asociados a la mutación. 5) Valoración estadística de los mismos. 6) Comprobar la relación estadística entre dichos cambios y el porcentaje de la mutación. 7) Valorar las características morfológicas de los PTC no mutados y sus diferencias con los positivos. -M.S.Martínez MartínMATERIAL Y MÉTODOS -Material y métodos44 MATERIAL Y METODOS Se han seleccionado un total de 60 casos de Carcinoma Papilar de Tiroides intervenidos quirúrgicamente en los últimos 10 años en el Complejo Hospitalario Insular Materno Infantil de Las Palmas, siguiendo un criterio aleatorio tendente a incluir la mayoría de tipos tumorales, casos con metástasis y recidivas, así como, atendiendo a formas especiales de PTC, como el Oculto o incidental y las formas Quísticas. Se valoraron las características clínicas de los mismos, atendiendo al tipo histológico, tamaño tumoral, extensión intra y extra tiroidea, metástasis ganglionares y a distancia y recidivas. Desde el punto de vista clínico, se valoraron la edad, sexo, patologías asociadas y antecedentes familiares. Una vez evaluada la situación clínica de cada caso, fueron extraídos los bloques de parafina del Archivo Hospitalario, se hicieron controles de H/E, para confirmación del diagnóstico. Posteriormente, de cada caso seleccionado, se realizaron tres cortes de 10u c/u en portas habituales y tras su desparafinado, se llevaron a suero fisiológico. A continuación se marcaron los portas y por microdisección se separaron los tumores del resto del tejido y se llevaron posteriormente a TENS, para la extracción del DNA tumoral. Después de la extracción del DNA según procedimiento habitual, se amplificó el gen BRAF por PCR mediante primers y sondas adecuadas, cuantificando y evaluando en gel de agarosa. El producto de amplificación, con los controles correspondientes, fue sometido a secuenciación mediante sistema de Pirosecuención para detectar la mutación 600E. Por último, seleccionados los casos que presentaron la mutación, se valoró su relación con los factores previamente descritos, como son: tipo tumoral, TNM y -Material y métodos45 recidiva tumoral. Todos los datos se evaluaron y se determinaron con el consiguiente estudio estadístico. La finalidad última es valorar si la mutación BRAF tiene trascendencia en los diferentes parámetros ya considerados 3.1 ESTUDIO GENETICO. Muestras: Para el análisis genético, se usaron muestras de tejido procedente de la tiroidectomía incluido en parafina. Se realizaron 8 cortes de 10µm de la zona más representativa del diagnóstico Extracción de ADN: La extracción del ácido desoxirribonucleico (ADN) se llevó a cabo desde disección en portas no silanizados del tejido previamente cortado y seleccionando las zonas más representativas tumorales. Los cortes de los tejidos se introdujeron en estufa a 58º durante 1 hora, se desparafinaron con xylol y se hidrataron mediante alcoholes decrecientes (Et-OH 100º durante cinco minutos, Et-OH 96º durante cinco minutosEtOH 70º durante cinco minutos, terminando en un baño de agua destilada durante cinco minutos más). Después se delimitó la zona tumoral en microscopio y se marcó con rotulador permanente. Con una punta desechable y estéril se raspó la zona tumoral seleccionada previamente en el microscopio y se recogió, poniéndola en un Eppendorf de 1,5 ml con de TEENS. Para purificar el ADN, se añadió al Eppendorf con el tejido re suspendido en 400ul de TEENS, 40ul de proteinasa K (10mg/ml). Se incubó a 56º en estufa y en movimiento hasta la mañana siguiente. Se dispuso en Eppendorf a 90º en termo bloque durante 1 hora para inactivar la proteinasa K. Después se sometió a centrifugación durante cinco -Material y métodos46 minutos a máximas r.p.m. Tras este paso, se añadió 400ul de phenol-cloroformoisoamílico y se agitó vigorosamente durante 15 minutos. Se centrifugó a máximas r.p.m. durante 15 minutos. Se decantó la fase superior en un Eppendorf nuevo, teniendo cuidado de no absorber la interfase. Se añadió 40ul de Ac NA 3M y también se añadió 1200ul de Et OH 100º. Se mezcló suavemente y se mantuvo a -20º durante 1 hora. La muestra se volvió a centrifugar a máximas r.p.m. durante 15 minutos. Se decantó el sobrenadante y se añadió 500ul de Et OH 70º. Después se centrifugó a máximas rpm. durante 5 minutos. Se decantó el sobrenadante y se secó el pelet a 30º hasta la evaporación del Et-OH. Por último se re suspendió el pelet en 50ul de TE (ajustando el volumen al tamaño del pelet). Amplificación por PCR del gen BRAF: para cada amplificación por PCR, se usó aproximadamente 20ng de ADN celular total. La PCR se realizó usando los primers específicos para el BRAF: BRAF Forward primer F2: TGATTTTGGTCTAGCTACA BRAF Reverse primer RBIO: TCCAGACAACTGTTCAAACTGAT El protocolo de amplificación para el gen BRAF fue el siguiente: Reactivos para 1muestra:  6,5 µl de H2O.  12,5 µl de Hot Start Green Master Mix ( Promega, Ref: M5122 )  0,5 µla 12,5µMPrimer Forward: TGATTTTGGTCTAGCTACA  0,5 µl a 12,5µM Primer Reverse: TCCAGACAACTGTTCAAACTGAT  10 – 20 ng de ADN en 5µl -Material y métodos47 Volumen final: 25µl Comprobación de la amplificación Mediante electroforesis en gel de agarosa al 2,5%. Añadiendo en el gel un marcador de peso molecular (Bench Top PCR Markers, Promega, Ref: G7531) Termociclador Bio Rad. Programa BRAF. El programa de amplificación fue el siguiente: 95º - 2 minutos – X1 Ciclo 94º - 20 segundos – X40 CICLOS 55º - 20 segundos – X40 CICLOS 72º - 20 segundos – X40 CICLOS 4º - 30 minutos Usando el termociclador de BioRad, modelo: MY CYCLER™THERMAL CYCLER. Secuencia del producto amplificado: Pyrosecuenciación BRAF Binding: 1. Reactivos para una muestra: 38µl Binding Bfr 2µl Streptavidin – Agarose 2. Vf: 40µl 3. Alicuotar los 40µl en tubos de 0,2 ml con tapa. 4. Añadir 30µl de H2O ( el volumen es ajustable en función del pPCR ) 5. Añadir 10µl del pPCR -Material y métodos48 6. Colocar los tubos bien cerrados en el agitador, 1400rpm durante 5 minutos. 7. Preparar la estación del pirosecuenciador: Llenar las cubetas con los reactivos correspondientes: H2O, EtOH 70º, Denaturing Buffer y Washing buffer. (Llenar hasta la marca indicada). Preparar la placa de secuenciación: Reactivos por muestra: 25µl Annealing Buffer 0,75µPrimers de secuenciación BRafPys TGATTTTGGTCTAGCTACA Dispensar 25µl en el pocillo correspondiente de la placa de pirosecuenciación. Manifold Colocar el peine de vacío en la cubeta de H2O. Aspirar con el peine de vacío el contenido de los tubos que contienen: (BindingBfr, Streptavidin – Agarose y pPCR). Pasar el peine por las soluciones: EtOH 70º durante 5 segundos. Denaturing Buffer durante 5 segundos. Wasing Buffer durante 10 segundos. Colocar el peine vertical para que el líquido sea aspirado Colocar el peine sobre la placa de pirosecuenciación. Mantenerlo durante 10 segundos moviéndolo suavemente. -Material y métodos49 Tapar la placa de pirosecuenciación y colocarla en el termo bloque a 80º durante 2 minutos (No excederse de los dos minutos) Tras dos minutos, retirar la placa de pirosecuenciación del termo bloque y dejar enfriar a temperatura ambiente al menos 10 minutos. Encender el pirosecuenciador. Abrir el programa PyroMark Q 24 en el ordenador. New Run (signo Play en verde o File – New Run). Instrument Method: PyroMark Method 003. Arrastrar hasta Assay la prueba BrafV600K que está en su carpeta correspondiente. (No confundir con otras opciones) Nombrar los pocillos de acuerdo con el orden que se ha seguido al aspirar las muestras. Save as en un Pendrive. Cargar el cartucho del pirosecuenciador con: 100µl de Enzime. 100µl de cada sustrato A, C, T, G. Las cantidades exactas de cada reactivo pueden consultarse en el ordenador. Para ello, una vez preparada la plantilla de la placa, hay que hacer click en Tools – Pre Run Information. Se abrirá una nueva ventana con los datos. Colocar el Pendrive en el pirosecuenciador Seleccionar Run y elegir el archivo que se acaba de crear. -Resultados55 Fig. 2.1. Carcinoma papilar, zona quística. CASO Nº: 2 Nº DE BIOPSIA: 05 B 14612 NHC: 132293 F/N: 10/10/1948 F/I: 27/12/2005 EDAD: 65 años SEXO: Mujer ANTECEDENTES PERSONALES: Carcinoma de laringe intervenido. TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar clásico con transformación esclerosaste. TAMAÑO TUMORAL: 2’5 x 2 x2 cm. EXTENSIÓN: Infiltra la cápsula, invasión vascular y dos implantes en LTD. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: Metástasis ganglionares. RECIDIVAS: No, en 2011 última revisión normal (paciente de Fuerteventura). TNM: pT2, pN1a, pM0. ESTADIO: III -Resultados56 Fig. 2.2 Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 23%). Descripción: Se trata de un carcinoma papilar clásico con tendencia a célula alta y patrón encapsulado, aparece mutado en un (23%) y llama la atención sus rasgos de agresividad consistentes en la presencia de esclerosis, atipia nuclear y pink atipia, infiltración de límites y de bordes quirúrgicos con metástasis a distancia, siendo su estadio de III. -Resultados57 Fig. 3.1 Carcinoma papilar de células altas. CASO Nº: 3 Nº DE BIOPSIA: 06 B 7574 NHC: 365782 F/N: 25/08/1947 F/I: 29/06/2006 EDAD: 66 años SEXO: Mujer ANTECEDENTES PERSONALES: Alergia a Nolotil, sin otros antecedentes. TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar variante células altas. TAMAÑO TUMORAL: 4 x 2’5 cm en lóbulo tiroideo izquierdo. EXTENSIÓN: Infiltra y rompe la cápsula tiroidea. METÁSTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: En el otro lóbulo (derecho) y cuatro metástasis en ganglios ipsilaterales. RECIDIVAS: Metástasis ganglionares en 2009 (tres metástasis ganglionares en cadena yugular derecha anterior y 7 metástasis ganglionares en compartimento central en abril, dos metástasis más en linfadenectomía derecha y dos más en izquierda en noviembre). 2013: recidiva en otra adenopatía. TNM: pT2, pN1b, pM0. ESTADIO: IVA -Resultados58 Fig. 3.2. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 26%). Descripción: Se trata de un carcinoma papilar de células altas con tendencia a columnar de gran tamaño (4cm), se encuentra encapsulado. Está mutado en un (26%) y presenta rasgos de agresividad consistentes en: esclerosis, núcleos atípicos, pink atipia e infiltración de los límites del tumor y bordes quirúrgicos. Su estadio es IVA. -Resultados59 Fig. 4.1. Carcinoma papilar clásico. CASO Nº: 4 Nº DE BIOPSIA: 12 B 16046 NHC: 3182081 F/N: 27/01/1965 F/I: 13/12/2012 EDAD: 48 SEXO: Mujer ANTECEDENTES PERSONALES: Desnutrición calóricoproteica. Nefrectomía izquierda por tumor ureteral. LNH en la infancia tratado con quimio y radioterapia. Cardiopatía congénita sometida a cirugía de recambio valvular con prótesis biológica en 27/05/2011. Asma bronquial. DMNID. Esplenectomía. Pólipos nasales de tipo alérgico. Bocio multinodular. TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar clásico con zonas de células altas y oxifílico. TAMAÑO TUMORAL: 1’5 x 1’5 cm. EXTENSIÓN: Lobectomía izquierda con bordes libres quirúrgicos. Lobectomía derecha negativa operada en segundo tiempo (19/03/2013). METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: No. RECIDIVAS: No. TNM: pT1b, pN0, pM0. ESTADIO: I -Resultados60 Fig. 4.2. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 3%). Descripción: Se trata de un carcinoma papilar clásico, con cierta tendencia a célula alta y eosinofilia. No aparece mutado (3%), siendo poco agresivo, pequeño tamaño (1,5 x1, 5 cm) y presenta encapsulación. Los núcleos son escasamente atípicos y muestra fibrosis. -Resultados61 Fig. 5.1. Carcinoma papilar clásico. CASO Nº: 5 Nº DE BIOPSIA: 12 B 2226 NHC: 190265 F/N: 25/04/1954 F/I: 06/03/2012 EDAD: 59 años SEXO: Mujer ANTECEDENTES PERSONALES: Bocio multinodular. Adenoma paratiroideo superior derecho. TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar clásico, encapsulado y quístico. TAMAÑO TUMORAL: 1’2 x 1 x 0’9 cm. EXTENSIÓN: Tiroidectomía total, nódulo. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: No. RECIDIVAS: No (2012). TNM: pT1b, pN0, pM0. ESTADIO: I -Resultados62 Fig. 5.2. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 12%). Descripción: Se trata de un carcinoma papilar clásico con áreas quísticas. Aparece mutado en un (12%) y está encapsulado y con disposición subcapsular glandular. Llama la atención la atipia nuclear y la ausencia de pink atipa, respeta los límites del tumor y los bordes quirúrgicos, siendo su estadio de I. -Resultados63 CASO Nº: 6 Nº DE BIOPSIA: 07 B 14583 NHC: 254972 F/N: 03/04/1955 F/I: 19/12/2007 EDAD: 58 años SEXO: Mujer ANTECEDENTES PERSONALES: Bocio multinodular TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar clásico, quístico y encapsulado. TAMAÑO TUMORAL: 2 x 1’5 cm. EXTENSIÓN: Implante microscópico en LTD de 0’3 x 0’2 cm. Cápsula libre de infiltración tumoral. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: No. RECIDIVAS: 2013: no adenopatías laterales de aspecto patológico. TNM: pT1b, pN0, pM0. ESTADIO: I Fig. 6.1. Carcinoma papilar clásico - quístico. -Resultados64 Fig. 6.2. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 4%). Descripción: Se trata de un carcinoma papilar clásico-quístico que no está mutado (4%), encapsulado, con núcleos atípicos, muestra fibrosis mientras que la esclerosis, la infiltración de bordes y límites del tumor está ausente. Su estadio es de I. -Resultados71 Fig. 10.1. Carcinoma papilar, oxifílico tipo Warthin-like. CASO Nº: 10 Nº DE BIOPSIA: 08 B 8026 NHC: 3181116 F/N: 11/07/1968 F/I: 17/07/2008EDAD: 45 años SEXO: Mujer ANTECEDENTES PERSONALES: HTA TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar de tiroides variante oncocítica tipo células de Hürtle con tiroiditis de Hashimoto asociada tipo “Warthin-like”. TAMAÑO TUMORAL: 1’5 x 1 cm. EXTENSIÓN: Contacta con el margen quirúrgico de resección. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: No. RECIDIVAS: No. TNM: pT1b, pN0, pM0. ESTADIO: I (menor de 45 años) -Resultados72 Fig. 10.2. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 9%). Descripción: Se trata de un carcinoma papilar oxifílico en una tiroiditis crónica linfocítica con infiltración linfocítica tumoral tipo Warthin-like, infiltra límites tumorales y bordes quirúrgicos. Su tamaño es pequeño (1,5 x 1cm) y llama la atención cierta atipia citoplásmica con forma en raqueta con tendencia a pink atipia. Su estadio es I y no aparece mutado (9%). -Resultados73 CASO Nº: 11 Nº DE BIOPSIA: 06 B 10979 NHC: 160867 F/N: 27/08/1955 F/I: 02/10/2006 EDAD: 58 años SEXO: Varón. ANTECEDENTES PERSONALES: Gonartrosis. HTA. Edema de Reinke. TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar de tiroides. No encapsulado e infiltrante. TAMAÑO TUMORAL: 2’5 x 2cm. EXTENSIÓN: Contacta e infiltra la cápsula glandular. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: Metástasis ganglionar linfáticas en tres adenopatías en istmo, seis yugulo-tímicas y siete yugulo-carotideas de trece. RECIDIVAS: No, hasta 2012 sin alteraciones. TNM: pT3, pN1b, pM0. ESTADIO: IVA Fig. 11.1. Carcinoma papilar clásico. -Resultados74 Fig. 11.2. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 11%). Descripción: Se trata de un carcinoma papilar clásico de pequeño tamaño (2,5 x 2cm) de disposición subcapsular. Infiltra límites tumorales y bordes quirúrgicos produciendo metástasis a distancia ganglionares. Se encuentra mutado en un (11%) y su estadio es IVA. -Resultados75 Fig. 12.1. Carcinoma papilar variante folicular. CASO Nº: 12 Nº DE BIOPSIA: 08 B 4337 NHC: 443414 F/N: 22/08/1955 F/I: 28/04/2008 EDAD: 58 años SEXO: Mujer ANTECEDENTES PERSONALES: No antecedentes ni personales ni familiares de carcinoma. TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar variante folicular. TAMAÑO TUMORAL: 1 x 1 x 0’6 cm en lóbulo tiroideo izquierdo. EXTENSIÓN: Multicéntrico, varios implantes, con las que contacta e infiltra localmente tejidos blandos periféricos. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: No. RECIDIVAS: No. TNM: pT1a, pN0, pM0. ESTADIO: I -Resultados76 Fig. 12.2. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 3%). Descripción: Se trata de un carcinoma papilar variante folicular, tamaño mayor de 1 (1 x 1cm) y disposición subcapsular. Es infiltrante, los bordes quirúrgicos están afectados. Carece de metástasis ganglionares y a distancia. No aparece mutado (3%). Sin embargo presenta marcada multicentricidad. Su estadio es I. -Resultados77 Fig. 13.1. Carcinoma papilar, células altas. Fig. 13.2. Carcinoma papilar, zona desdiferenciada. Nº CASO: 13 Nº DE BIOPSIA: 08 B 12274 NHC: 212880 F/N: 19/07/1931 F/I: 28/10/2008 EDAD: 82 años SEXO: Mujer ANTECEDENTES PERSONALES: Enfermedad de Bowen en brazo izquierdo, bocio de rápido crecimiento. TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar de tiroides de células altas con desdiferenciación y áreas desmoplásicas. TAMAÑO TUMORAL: Más de 5 cm. EXTENSIÓN: Infiltra parénquima muscular pretiroideo. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: No consta RECIDIVAS: éxitus el 25 de noviembre de 2008. TNM: pT4b, pN0, pM0. ESTADIO: IVB – IVC -Resultados78 Fig. 13.3. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 7%). Fig. 13.4. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 5%). -Resultados79 Descripción: Se trata de un carcinoma papilar de células altas con tendencia a columnares, con abundantes signos de agresividad, con esclerosis, núcleos atípicos, infiltración de los límites del tumor y bordes quirúrgicos y con pink atipia ( Fig 13.1).Su estadio es IVC. Presenta un cambio de desdiferenciación con transformación desmoplásica que alcanza el grado de carcinoma indiferenciado (Fig.13.2). A pesar de todo, tanto la forma diferenciada como la desdiferenciada no presentan mutación (7%) y (5%) respectivamente. -Resultados80 Nº CASO: 14 Nº DE BIOPSIA: 08 13085 NHC: 286982 F/N: 28/08/1971 F/I: 21/11/2008 EDAD: 42 años SEXO: Mujer ANTECEDENTES PERSONALES: Apendicectomizada. TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar de tiroides variante clásica y esclerosante. TAMAÑO TUMORAL: 1’5 x 1’5 cm. EXTENSIÓN: Cápsula tiroidea libre y bordes de resección libres. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: No. RECIDIVAS: No (hasta 2012). TNM: pT1b, pN0, pM0. ESTADIO: I Fig. 14.1. Carcinoma papilar clásico con fibrosis. -Resultados87 CASO Nº: 17 Nº DE BIOPSIA: 10 B 13491 NHC: 287793 F/N: 31/03/1944 F/I: 11/11/2010 EDAD: 69 años SEXO: Mujer ANTECEDENTES PERSONALES: Carcinoma de mama derecha. Cataratas bilaterales. Quistes de ovario. TIPO HISTOLÓGICO: 20. Carcinoma papilar clásico - microcarcinoma, encapsulado, con focos de calcificación. 21. Neoplasia folicular de células de Hürtle. TAMAÑO TUMORAL: 0’8 x 0’8 cm. EXTENSIÓN: Encapsulado. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: No. RECIDIVAS: No (gammagrafía ósea negativa en 2.013) TNM: pT1a, pN0, pM0. ESTADIO: I Fig. 17.1. Carcinoma papilar – microcarcinoma. Fig. 17.2. Zona de carcinoma papilar oxifílico. -Resultados88 Fig. 17.3. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 4%). Fig. 17.4. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 4%). -Resultados89 Descripción: Se trata de un carcinoma papilar de pequeño tamaño (0,8cm), incidental y subcapsular. Aparece encapsulado, los núcleos son atípicos con pink atipia y fibrosis no detectándose la esclerosis, siendo su estadio I (Fig. 17.1). El tumor no aparece mutado (4%). El tumor se acompaña en otro foco glandular de una neoplasia folicular de células de Hürthle, que no aparece mutado (4%) (Fig.17.2). -Resultados90 CASO Nº: 18 Nº DE BIOPSIA: 10 B 16448 NHC: 61794 F/N: 29/05/1970 F/I: 12/01/2011 EDAD: 43 SEXO: Mujer ANTECEDENTES PERSONALES: NMAC. Hipotiroidismo en tratamiento. Síndrome de Turner. TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar clásico en LTD. Lobectomía izquierda: microimplante por carcinoma papilar variante folicular en zona intralobular izquierda. TAMAÑO TUMORAL: 0’8 x 0’8 cm EXTENSIÓN: Encapsulado e infiltrante, contacta con margen quirúrgico. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: Ganglio linfático (+) laterocervical izquierdo en 2013. RECIDIVAS: Ganglionar el 02/07/2013. Gammagrafía ósea negativa 2013. TNM: pT1a, pN1a, pM0. ESTADIO: I (menor de 45 años) Fig. 18.1. Carcinoma papilar clásico con atipia eosinofílica. -Resultados91 Fig. 18.2. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 33%). Descripción: Se trata de un carcinoma papilar clásico, subcapsular y encapsulado, con atipia moderada nuclear y leve esclerosis. Por otra parte presenta fibrosis con pink atipia. (Fig.18.1).Se considera un microcarcinoma por su tamaño, mostrando infiltración de límites de bordes quirúrgicos, con metástasis linfática siendo su estadio I. Con todos estos signos su mutación es del (33%). -Resultados92 CASO Nº: 19 Nº DE BIOPSIA: 10 B 16510 NHC: 3027482 F/N: 03/06/1964 F/I: 13/01/2011 EDAD: 49 años SEXO: Mujer ANTECEDENTES PERSONALES: Sin interés. TIPO HISTOLÓGICO: N. 23: Carcinoma papilar variante clásica, encapsulado, quístico e infiltrante. N. 24: tumor de células de Hürtle, oxifílico, nodular y encapsulado TAMAÑO TUMORAL: N.23: 2’5 x 2’5 cm. N.24: 5 x 3’5 x 3’5 cm. EXTENSIÓN: Encapsulados. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: No. RECIDIVAS: No. Gammagrafía negativa en 2011.TNM: pT2, pN0, pM0. ESTADIO: II Fig. 19.1. Carcinoma papilar clásico quístico. Fig. 19.2. Zona carcinoma papilar oxifílico. -Resultados93 Fig. 19.3. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 33%). Fig. 19.4. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 3%). -Resultados94 Descripción: Se trata de un carcinoma papilar variante clásica con xantomatosis intrapapilar y áreas quísticas. Aparece encapsulado y bien delimitado. Presenta núcleos atípicos, infiltración de bordes y la pink atipia es leve, mostrando cuerpos de psammoma. (Fig. 19.1). Su estadio es II. El tumor tiene una mutación del (33%). El tumor se acompaña de una lesión papilar de células oxifílicas con rasgos nucleares de atipia leve, (Fig.19.2). Siendo una lesión de gran tamaño (5 x 3,5cm), la cual no aparece mutada (3%) -Resultados95 CASO Nº: 20 Nº DE BIOPSIA: 11 B 3564 NHC: 300131 F/N: 02/12/1978 F/I: 01/04/2011 EDAD: 35 años SEXO: Mujer ANTECEDENTES PERSONALES: Sin interés. TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar variante células altas en lóbulo derecho. TAMAÑO TUMORAL: 2 x 1 cm. EXTENSIÓN: Infiltra cápsula glandular, borde quirúrgico libre. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: Metástasis en ganglio de compartimento central derecho. RECIDIVAS: Adenopatías latero-cervicales derechas, con metástasis en un ganglio linfático de seis, en julio de 2013. TNM: pT1b, pN1b, pM0. ESTADIO: I (menor de 45 años). Fig. 20.1. Carcinoma papilar células altas. -Resultados96 Fig. 20.2. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 11%). Descripción: Se trata de un carcinoma papilar de células altas con esclerosis, núcleo atípico, infiltración de límites, pink atipia y ocupación de bordes quirúrgicos. (Fig. 20.1). Presenta además metástasis ganglionar linfática, siendo su estadio I. El tumor está mutado en un (11%). -Resultados103 CASO Nº: 24 Nº DE BIOPSIA: 12 B 17072 NHC: 168168 F/N: 29/04/1958 F/I: 27/12/2012 EDAD: 55 años SEXO: Mujer. ANTECEDENTES PERSONALES: Sin interés. Lobectomía tiroidea izquierda en 1999 por bocio. TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar encapsulado variante folicular de células de Hürtle. TAMAÑO TUMORAL: 1’2 x 1’2 cm. EXTENSIÓN: Encapsulado. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: No. RECIDIVAS: No. TNM: pT1b, pN0, pM0. ESTADIO: I. Fig. 24.1. Carcinoma papilar oxifílico. -Resultados104 Fig. 24.2. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 7%). Descripción: Se trata de una lesión oxifílica con rasgos nucleares de carcinoma papilar. Encapsulado, incidental sin fibrosis ni esclerosis y sin pink, muestra un porcentaje de mutación del 7%, siendo negativo. -Resultados105 CASO Nº: 25 Nº DE BIOPSIA: 12 B 17447 NHC: 535783 F/N: 28/03/1978 F/I: 10/01/2013 EDAD: 35 años SEXO: Mujer ANTECEDENTES PERSONALES: Riesgo cardiovascular moderado, madre con enfermedad de tiroides. Obesidad. Asma bronquial. Procedente de Fuerteventura. TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar tipo clásico, encapsulado en LTI. LTD normal. TAMAÑO TUMORAL: 3 x 2’7 cm. EXTENSIÓN: No extratiroidea. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: No. RECIDIVAS: No (vive sana en 2013) TNM: pT2, pN0, pM0. ESTADIO: I. Fig. 25.1. Carcinoma papilar clásico. -Resultados106 Fig. 25.2. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 30%). Descripción: Se trata de un tumor papilar clásico que aunque tiene un estadio I presenta un tamaño pT2. Presenta pink atipia leve, con atipia nuclear, tendente a columnar. Carece de esclerosis pero muestra fibrosis intersticial. Presenta una mutación del (30%). Lo más característico son los signos de infiltración de la capsula tumoral y glandular. -Resultados107 Fig. 26.1. Carcinoma papilar variante folicular. CASO Nº: 26 Nº DE BIOPSIA: 13 B 156 NHC: 550857 F/N: 14/02/1957 F/I: 24/01/2013 EDAD: 56 años SEXO: Varón. ANTECEDENTES PERSONALES: HTA, síndrome prostático, depresión. Hepatomegalia esteatósica con dos LOES que pueden corresponder a hemangiomas. TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar variante folicular en LTD. TAMAÑO TUMORAL: 1’1 x 1cm. EXTENSIÓN: Bordes quirúrgicos libres. Lobectomía izquierda sin alteraciones. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: No. RECIDIVAS: No. TNM: pT1a, pN0, pM0. ESTADIO: I. -Resultados108 Fig. 26.2. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 4%). Descripción: Se trata de un tumor incidental subcapsular con atipia nuclear leve, aunque muestra seudoinclusiones, irregularidad de los núcleos e inclusiones verdaderas en bastantes células. Lo más llamativo es su disposición subcapsular. No se encuentra mutado. -Resultados109 Fig. 27.1. Carcinoma papilar incidental en bocio coloide. CASO Nº: 27 Nº DE BIOPSIA: 13 B 6971 NHC: 250427 F/N: 27/01/1956 F/I: 10/06/2013 EDAD: 57 años SEXO: Mujer. ANTECEDENTES PERSONALES: HTA, ansiedad, hernia discal y vértigos. TIPO HISTOLÓGICO: Microcarcinoma papilar atípico de tipo incidental u oculto. TAMAÑO TUMORAL: 0’2 x 0’2 cm. EXTENSIÓN: Intraparenquimatoso. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: No. RECIDIVAS: No. TNM: pT1a, pN0, pM0. ESTADIO: I. -Resultados110 Fig. 27.2. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 3%). Descripción: Se trata de una lesión incidental dentro de un bocio coloide. Muestra atipia nuclear moderada. No se encuentra mutado. -Resultados111 Fig. 28.1. Carcinoma papilar variante folicular, zona papilar. CASO Nº: 28 Nº DE BIOPSIA: 13 B 7563 NHC: 176270 F/N: 31/03/1969 F/I: 31/05/2013 EDAD: 44 años SEXO: Mujer ANTECEDENTES PERSONALES: HTA, hiperlipidemia. Bocio multinodular. TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar variante folicular en LTI. En LTD: carcinoma papilar en seis lesiones distintas intraparenquimatosas. TAMAÑO TUMORAL: 1’1 x 1 cm. EXTENSIÓN: Bordes quirúrgicos libres. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: No. RECIDIVAS: No. TNM: pT1a, pN0, pM0. ESTADIO: I. -Resultados112 Fig. 28.2. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 23%). Descripción: Se trata de un carcinoma papilar variante folicular con zonas papilares con menos del 10%. Muestra signos de atipia moderada, no hay esclerosis, pero si fibrosis, llama la atención la presencia de seis implantes tumorales. La agresividad de éste se manifiesta en los múltiples implantes. El resultado de la secuenciación del gen BRAF es del 23%, por lo que lo consideramos mutado. -Resultados119 Fig. 32.1. Carcinoma papilar infiltrante y esclerosante. CASO Nº: 32 Nº DE BIOPSIA: 05 B 11359 NHC: 351909 F/N: 14/04/1968 F/I: 06/10/2005 EDAD: 37 años SEXO: Mujer ANTECEDENTES PERSONALES: Sin interés. TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar infiltrante. TAMAÑO TUMORAL: 3 x 2’5 x 1’5 cm. EXTENSIÓN: Lóbulo tiroideo izquierdo, infiltra cápsula y tejido adiposo conjuntivo y muscular estriado vecino. Infiltración perineural. Foco en lóbulo tiroideo derecho de 0’2 cm que no alcanza cápsula. METÁSTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: En vaciamiento, siete ganglios positivos de 54 aislados en 2005. En 2006 tres ganglios linfáticos positivos a nivel cervicomediastínico y mediastínico. En 2008 de nuevo metástasis ganglionares que se extirparon. RECIDIVAS: Lesiones dudosas en PET-TAC en pulmón derecho e izquierdo en 2007, 2008 y 2010. En 2012 se realiza un nuevo PET-TAC con lesión en segmento anteroapical de LSD sugestivo de metástasis pulmonar y adenopatías hipermetabólicas en mediastino. Se decidió nuevo tratamiento con 131-I. Posttratamiento RCT negativo. Actitud conservadora desde marzo de 2014. TNM: pT3, pN1, pM1. ESTADIO: II. -Resultados120 Fig. 32.2. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 31%). Descripción: Se trata de un carcinoma papilar infiltrante que rebasa la capsula glandular y tejidos blandos cervicales. Muestra invasión ganglionar linfática cervical con recidivas ganglionares mediastínicas dos años después. Siete años después muestra metástasis pulmonares detectadas por PET-TAC. Su TNM es: pT3, pN1b, pM1. Su mala evolución coincide con una mutación de 31%. Tiene esclerosis con desmoplasia, atipia nuclear, infiltración de bordes, recidivas y en estadio es II TNM. Tiene pink atipia. -Resultados121 CASO Nº: 33 Nº DE BIOPSIA: 05 B 13826 NHC: 40796 F/N: 26/11/1959 F/I: 16/12/2005 EDAD: 46 años SEXO: Mujer ANTECEDENTES PERSONALES: Adenocarcinoma parotídeo izquierdo en la infancia, tratado con cirugía y radioterapia externa. Bocio nodular tiroideo. TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar, variante esclerosante, no encapsulado. TAMAÑO TUMORAL: 1’1 x 0’9 x 1’5 cm. EXTENSIÓN: No infiltra ni rebasa cápsula. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: No. RECIDIVAS: En 2006, lobectomía derecha con implante de carcinoma papilar de 0’7 x 0’5 cm que no alcanza borde capsular ganglionar externo. Hasta 2013 controles negativos. TNM: pT1b, pN0, pM0. ESTADIO: I. Fig. 33.1. Carcinoma papilar esclerosante. -Resultados122 Fig. 33.2. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 24%) Descripción: Se trata de un carcinoma papilar subcapsular y esclerosante con atipia nuclear, pink atipia e infiltración. Un año después en la lobectomía contralateral se halló un implante de 0,7 x 0,5 cm. Muestra una mutación del 24%. -Resultados123 Fig. 34.1. Carcinoma papilar macrofolicular. CASO Nº: 34 Nº DE BIOPSIA: 05 B 14094 NHC: 21270 F/N: 05/02/1971 F/I: 26/12/2005 EDAD: 34 años SEXO: Varón ANTECEDENTES PERSONALES: Osteomielitis en la infancia. Escoliosis TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar variante macrofolicular. TAMAÑO TUMORAL: 4’5 x 3’7 x 3 cm. EXTENSIÓN: Infiltra lóbulo derecho, parte de istmo y nódulo retro lobular derecho, de dudoso origen adenopático. Infiltra cápsula glandular en diferentes zonas sin llegar a rebasarla por completo. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: No RECIDIVAS: No TNM: pT3, pN0, pM0. ESTADIO: I (menor de 45 años). -Resultados124 Fig. 34.2. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 3%). Descripción: Se trata de un carcinoma papilar macrofolicular de 4,5 x 3,7 cm. Muestra signos infiltrantes periféricos sin rebasar la capsula glandular. Presenta núcleos atípicos siendo negativa la esclerosis y la pink atipia. No se encuentra mutado -Resultados125 Fig. 35.1. Carcinoma papilar variante folicular. CASO Nº: 35 Nº DE BIOPSIA: 06 B 10536 NHC: 370626 F/N: 15/04/1928 F/I: 18/09/2006 EDAD: 78 años SEXO: Mujer ANTECEDENTES PERSONALES: HTA, riesgo cardiovascular moderado, obesidad, ACV isquémico. TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar variante folicular. TAMAÑO TUMORAL: 6 x 5 x 3 cm. Ocupa la totalidad del lóbulo tiroideo derecho. EXTENSIÓN: Infiltra cápsula, tejido muscular cervical y cartílago laríngeo. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: Adenopatía cervical positiva en 2006, en 2008 cuatro nódulos cervicales derechos positivos para carcinoma papilar. RECIDIVAS: Metástasis pulmonares en 2011. En 2012 se realiza gammagrafía para descartar metástasis óseas, siendo ésta negativa. Vive en 2014. TNM: pT4a, pN1, pM1. ESTADIO: IVC. -Resultados126 Fig. 35.2. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 3%). Descripción: Se trata de carcinoma papilar variante folicular con focos papilares en una extensión menor del 10%. Muestra atipia nuclear evidente y pink atipia focal y leve. Infiltra bordes y tiene fibrosis marcada con escasa desmoplasia. Llaman la atención las figuras de mitosis, así como el tamaño tumoral, la invasión de tejidos blandos y la laringe. Presenta adenopatías positivas ganglionares linfáticas, así como metástasis pulmonares hace cuatro años. Siendo su estadio TNM: IVC. No está mutado. -Resultados127 CASO Nº: 36 Nº DE BIOPSIA: 06 B 10964 NHC: 264487 F/N: 13/05/1930 F/I: 02/10/2006 EDAD: 76 años SEXO: Mujer ANTECEDENTES PERSONALES: Mieloma múltiple en tratamiento con poliquimioterapia. Plaquetopenia. Enfermedad de Crohn. Enfermedad de Parkinson. TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar macrofolicular, quístico y encapsulado. TAMAÑO TUMORAL: 3 x 1’5 cm EXTENSIÓN: Cápsula infiltrada con implantes periféricos que no afectan la cápsula tiroidea glandular. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: No. Exitus en 2007. RECIDIVAS: No. TNM: pT2, pN0, pM0. ESTADIO: II Fig. 36.1. Carcinoma papilar macrofolicular. -Resultados128 Fig. 36.2. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 3%). Descripción: Se trata de un carcinoma papilar variante macrofolicular con atipia nuclear e infiltración de bordes tumorales. No muestra pink atipia y llama la atención del tamaño del tumor siendo este de 3 x 1,5cm. No está mutado. -Resultados135 CASO: 40 Nº DE BIOPSIA: 07 B 10279 NHC: 115554 F/N: 01/04/1940 F/I: 13/09/2007 EDAD: 67 años SEXO: Mujer ANTECEDENTES PERSONALES: LNH en tratamiento. Legrado uterino. TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar de células de Hürthle con zonas de variante folicular. TAMAÑO TUMORAL: 2 x 1’8 cm. EXTENSIÓN: En lóbulo izquierdo, sin infiltrar cápsula. Implante en LTD no infiltrando cápsula. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: No. RECIDIVAS: Sí en 2008, recidiva en lecho tiroideo residual. Nov2013 sigue viva. TNM: pT1b, pN0, pM0. ESTADIO: I. Fig. 40.1. Carcinoma papilar oxifílico. -Resultados136 Fig. 40.2. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 18%). Descripción: Se trata de un carcinoma papilar oxifílico, encapsulado, con un tamaño de 2,8 x 1,8 cm. Se encuentra mutado en un porcentaje del 18%. La atipia nuclear es leve pero si presenta pink atipia. El tumor presenta rasgos de fibrosis y tiene bordes tumorales infiltrados. -Resultados137 CASO Nº: 41 Nº DE BIOPSIA: 07 B 11419 NHC: 423159 F/N: 08/01/1959 F/I: 09/10/2007 EDAD: 48 años SEXO: Hombre ANTECEDENTES PERSONALES: Bocio multinodular. DMNID en tratamiento con ADO. Enfermedad de Graves. TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar variante células altas, con zonas esclerosantes. TAMAÑO TUMORAL: 4 x 3’5 x 3 cm. EXTENSIÓN: En lóbulo derecho, infiltra parénquima tiroideo vecino, cápsula externa y ocupa tejidos blandos periféricos, incluido el músculo estriado. Implante en lóbulo tiroideo izquierdo. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: No. RECIDIVAS: No. TNM: pT3, pN0, pM0. ESTADIO: III. Fig. 41.1. Carcinoma papilar de células altas y esclerosante. -Resultados138 Fig. 41.2. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 42%). Descripción: Se trata de un carcinoma papilar de células altas con esclerosis, atipia nuclear e infiltración de los límites tumorales y bordes quirúrgicos. Tiene un estadio TNM III y un tamaño de 4 x 3,5 cm. Tiene pink atipia y se encuentra mutado en un 42%. -Resultados139 CASO Nº: 42 Nº DE BIOPSIA: 07 B 14584 NHC: 356188 F/N: 31/01/1934 F/I: 21/12/2007 EDAD: 73 años SEXO: Mujer. ANTECEDENTES PERSONALES: HTA, hepatitis sin filiar, tuberculosis pulmonar. TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar de tiroides tipo sólido e infiltrante. TAMAÑO TUMORAL: 2’5 x 2’5 cm. EXTENSIÓN: Lóbulo derecho, e izquierdo, infiltra cápsula, tejidos blandos y músculo esquelético cervical. Tráquea infiltrada. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: No. RECIDIVAS: No. TNM: pT3, pN0, pM0. ESTADIO: III. Fig. 42.1. Carcinoma papilar de células altas. -Resultados140 Fig. 42.2. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 34%). Descripción: Se trata de un carcinoma papilar de células altas con esclerosis y pink atipia. Infiltra límites del tumor y bordes quirúrgicos, así con partes blandas cervicales y musculo esquelético. Su estadio TNM es III. Se encuentra mutado en un 34%. -Resultados141 CASO Nº: 43 Nº DE BIOPSIA: 08 B 9081 NHC: 446184 F/N: 18/03/1968 F/I: 30/07/2008 EDAD: 40años SEXO: Hombre ANTECEDENTES PERSONALES: Sin interés. TIPO HISTOLÓGICO: Carcinoma papilar de tiroides intraquístico. TAMAÑO TUMORAL: 2 cm de diámetro mayor. EXTENSIÓN: Lóbulo izquierdo, infiltración cápsula, márgenes de resección libres. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: Metástasis en adenopatía tirotímica, y en yugular izquierda. En vaciamiento ganglionar metástasis en cuatro de treinta ganglios linfáticos aislados. RECIDIVAS: No. TNM: pT1b pN1b, pM0. ESTADIO: I. Fig. 43.1. Carcinoma papilar clásico. -Resultados142 Fig. 43.2. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 13%). Descripción: Se trata de un carcinoma papilar clásico con leve mutación (13%). Carece de esclerosis, los núcleos son algo atípicos y muestra infiltración de los bordes del tumor. No tiene pink atipia. -Resultados143 CASO Nº: 44 Nº DE BIOPSIA: 08 B 8.226 NHC: 344814 F/N: 28/12/1964 F/I: 24/07/2006 EDAD: 42 años SEXO: Mujer. ANTECEDENTES PERSONALES: mamoplastia reductora. TIPO HISTOLÓGICO: Microcarcinoma papilar encapsulado. TAMAÑO TUMORAL: 0’9 x 0’5 cm. EXTENSIÓN: Lóbulo izquierdo, márgenes de resección libres. METASTASIS GANGLIONARES/A DISTANCIA: No. RECIDIVAS: No. TNM: pT1a, pN0, pM0. ESTADIO: I. Fig. 44.1. Carcinoma micropapilar. -Resultados144 Fig. 44.2. Representación gráfica porcentaje mutación BRAF (T/A: 3%). Descripción: Se trata de un carcinoma micropapilar, encapsulado, sin inflitración de márgenes, con buena evolución sin recidivas ni metástasis a distancia. No presenta mutación con un porcentaje de la misma del 3%.