Intervención de los monocitos y de su receptor para la quimiotaxis, CCCR2, en el desarrollo de la aterosclerosis coronaria

3 ! ! ! ! ! TESIS DOCTORAL: INTERVENCIÓN DE LOS MONOCITOS Y DE SU RECEPTOR PARA LA QUIMIOTAXIS, CCR2, EN EL DESARROLLO DE LA ATEROSCLEROSIS CORONARIA.! ! PROGRAMA: AVANCES EN MEDICINA INTERNA. AUTOR: José María Medina Gil TUTORES: Efrén Martínez Quintana. Antonio Tugores Cester. 4 ! ! 5 ! ! ! ! ! TESIS DOCTORAL: INTERVENCIÓN DE LOS MONOCITOS Y DE SU RECEPTOR PARA LA QUIMIOTAXIS, CCR2, EN EL DESARROLLO DE LA ATEROSCLEROSIS CORONARIA.! José María Medina Gil. Efrén Martínez Quintana. Antonio Tugores Cester. 6 ! 7 ! AUTORIZACIÓN DIRECTORES DE TESIS. Efrén Martínez Quintana y Antonio Tugores Cester, CERTIFICAN: Que la presente Tesis Doctoral: “Intervención de los monocitos y de su receptor para la quimiotaxis, CCR2, en el desarrollo de la aterosclerosis coronaria”, presentada por José María Medina Gil, para aspirar al grado de Doctor en Medicina, ha sido realizada bajo nuestra dirección. En Las Palmas de Gran Canaria, a 9 de octubre de 2015. Fdo: Dr. Efrén Martínez Quintana. Fdo: Dr. Antonio Tugores Cester. ! 8 ! 9 ! ! ! ! ! ! Para mi familia, a la que cada día quiero más. Para María, porque consigue que cada momento con ella sea especial. ! 10 ! 11 AGRADECIMIENTOS. Para Efrén por ayudarme en mi formación como médico y por su apoyo para desarrollar esta tesis. Para Antonio, por abrirme el apetito investigador y por enseñarme el valor de procrastinar. Para Paloma, que tanto ha trabajado en esta tesis. Para el Dr. Saavedra y el Dr. Limiñana, por su inestimable ayuda con el análisis estadístico. Para Pablo, Rayco, Hector, Laura y demás compañeros de Cardiología de Hospital Insular, que me siguen enseñando a ser mejor cardiólogo. Para mi maestra Vicky, porque parte de este trabajo también es suyo. ! 18 En oposición a la aterosclerosis primaria descrita anteriormente, el daño agudo de la pared vascular, por ejemplo en relación con una angioplastia, desencadena mecanismos diferentes y significativamente más rápidos. Estos vienen iniciados por una erosión endotelial aguda y adhesión plaquetaria a los componentes de la matriz extracelular, así como la apoptosis masiva de células musculares lisas en la capa media de la pared. La acumulación posterior de células musculares lisas en la capa íntima para restaurar la integridad de la pared arterial consiguientemente lleva a hiperplasia intimal y a la progresiva estenosis del vaso (17) . En un estudio en el que se realizó angioplastia con balón a conejos alimentados con dieta rica en colesterol, se mostró que la infiltración temprana de monocitos en la íntima precedía a la acumulación de células musculares lisas, lo cual sugiere que el reclutamiento precoz de monocitos desencadena una respuesta inflamatoria crónica y más sostenida probablemente por liberación de citoquinas y factores de crecimiento llevando a un flujo continuo de monocitos y acumulación de células musculares lisas durante el crecimiento neointimal (18) . Por consiguiente, la aterosclerosis tanto en forma primaria como la secundaria a una agresión endotelial, es una enfermedad inflamatoria promovida por la interacción de los leucocitos migratorios, principalmente monocitos, con las células del endotelio vascular, las células musculares lisas y los fibroblastos. A nivel molecular, la interacción entre estos tipos celulares están regulados por las citoquinas, las moléculas de adhesión y los quimioatrayentes(3,19,20). ! 19 1.1 Los monocitos. Los monocitos son un grupo heterogéneo de glóbulos blancos que se caracterizan por ser el tipo de leucocito más grande, poseer un núcleo de gran tamaño arriñonado, lobulado o cerebriforme y no poseer vesículas granulares en su interior (es un leucocito agranulocítico al igual que los linfocitos). Se generan en la médula ósea y después de permanecer alrededor de 24 horas en el torrente sanguíneo, lo abandonan y atraviesan el endotelio de los capilares hacia el tejido conectivo inflamado donde se diferencian a macrófagos. Figura 2. Imagen de microscopio óptico de una muestra de sangre periférica con tinción de hematoxilina-eosina en la que se observa un monocito. Extraído de https://es.wikipedia.org/wiki/Monocito Existen dos subtipos principales de monocitos reconocidos en humanos y en ratas, diferenciados en base a la expresión de los receptores de quimioquinas en su superficie, CCR2 y CX3CR1 (receptor de fractalkina). Los monocitos CCR2+ son conocidos como “monocitos clásicos”, los cuales comprenden la mayoría de los monocitos humanos (>92%) y se caracterizan por su respuesta, fundamentalmente, a la proteína quimioatrayente del monocito 1 (CCL2 o MCP1) (10, 21, 22) . ! 20 Los monocitos clásicos provienen de la médula ósea, siendo los niveles circulantes de sus ligandos CCL2 (antes llamado MCP1, monocyte chemotactic protein-1) y CCL7 (antes conocida como MCP3, monocyte chemotactic protein-3) los principales que intervienen en mantener unos niveles homeostáticos de monocitos en circulación (21,23) . Posteriormente, se establecen selectivamente en los sitios con inflamación (a diferencia de los no clásicos que los encontramos en tejidos linfoides y no linfoides bajo condiciones no-inflamatorias). Los monocitos clásicos (CCR2+) son los que se acumulan en las placas ateroscleróticas, necesitando para entrar en la misma de la activación de CCR2 entre otros receptores (10,24) . De hecho, se ha observado que estos monocitos clásicos están aumentados de forma muy importante en ratones hipercolesterolémicos (ApoE -/-) que consumen una dieta con alto contenido en grasa, siendo el principal subtipo que se adhiere al endotelio activado, infiltra las lesiones y se convierte en macrófago (25) . Además, los monocitos clásicos constituyen un factor clave en la inestabilización de la placa de ateroma mediante la inducción de la reacción inflamatoria que finaliza con mayor producción de metaloproteinasas que adelgazan la cápsula fibrótica y aumento del core necrótico (21) habiéndose descrito en humanos que los niveles elevados de monocitos clásicos en sangre predicen el desarrollo de un evento coronario agudo (26). ! 21 1.2 El receptor CCR2 y sus ligandos. Desde 1986, un amplio número de citoquinas han sido estudiadas, clonadas y secuenciadas. Hoy en día se sabe que cumplen funciones importantes en la inflamación, proliferación o apoptosis de diferentes células, en la morfogénesis tisular, hematopoyesis, angiogénesis y en el desarrollo de respuesta inmune específica induciendo el tráfico de células del sistema inmune (27) . Las quimioquinas son una potente familia de citoquinas quimiotácticas que regulan el tráfico de leucocitos hacia la zona de lesión, en este caso, el lugar de la inflamación vascular. Su estructura se caracteriza por presentar dos puentes de cisteína en su extremo N terminal. Estos residuos están bien conservados (ver figura 3), estableciéndose la nomenclatura de las quimioquinas en base a la posición que tengan (CC, CXC, C, CX3C), por lo que la denominación CCL es debida a que poseen dos residuos de cisteína adyacentes (28) . Figura 3. Estructura primaria de CCL2 Y CCL7 humano. Las secuencias de aminoácidos de ambos están alineadas. Los residuos de cisteina conservados están alineados (28) . Figura 4. Estructuras terciaria y secundaria de la quimiocinas. A la izquierda vemos una representación esquemática de la estructura tridimensional de las quimioquinas, donde se muestra la lámina α y β además de los residuos de cisteína en los bucles 30 y 40. Todas las quimioquinas comparten una estructura típica de llave griega (reflajada en la figura de la derecha) que se estabiliza por enlaces de residuos de cisteína bien conservados. Obtenido de Deshmane et al, 2009 (28) . ! 22 CCR2. El receptor de quimioquinas CCR2 (C-C chemokine receptor type 2) es una proteína con 5 dominios transmembrana acoplada a proteína G. La expresión de CCR2 está restringida a relativamente pocas células (monocitos principalmente, células musculares lisas, neutrófilos, linfocitos NK) y su función principal es inducir la atracción de estas células hacia las zonas de lesión (5,28) . El gen que codifica para este receptor se localiza en el cromosoma 3p21.3 y entre sus ligandos se han descrito múltiples proteínas, destacando las proteínas de quimioatracción de monocitos -1 (MCP-1 o CCL2) y 3 (MCP-3 o CCL7). Hay dos isoformas de CCR2, denominadas CCR2A y CCR2B, que sólo difieren en su cola C terminal (29) , a pesar de lo cual, su mecanismo de acción es diferente. Por ejemplo, la quimiotaxis de células CCR2A+ ocurre sin la movilización del calcio intracelular, pero éste sí se induce en las células CCR2B (30) , que es el inductor más potente de la quimiotaxis y el que se expresa mayormente en los monocitos (28) . CCL2 / MCP-1. CCL2, también llamada MCP-1 (monocyte chemotactic protein-1) es una citoquina pequeña (13 kDa) cuyo gen en humanos se localiza en el cromosoma 17 q11.2-12 (5, 31) . Las principales células que lo liberan son los monocitos y sus derivados (macrófagos y células dendríticas) aunque lo producen todas las células que intervienen en la placa de ateroma (células endoteliales, células musculares lisas además de los macrófagos). A diferencia de otras quimiocinas, muestra afinidad exclusivamente a un receptor, CCR2. A nivel de la placa de ateroma, CCL2 interviene a través de diferentes funciones: • Regula de forma local la expresión de moléculas de adhesión, así como de otras citoquinas (IL1, IL6) y metaloproteinasas (32) . • Induce la diapedesis desde la circulación de los monocitos con receptor CCR2 (CCR2+) (29) . ! 23 • Promueve la diferenciación de los monocitos a macrófagos cargados de lípidos, además de contribuir a la proliferación de las células musculares lisas, promoviendo por tanto, el desarrollo del componente celular de la placa de ateroma (5) . • Además, aumenta la expresión de factor tisular en células musculares lisas y linfocitos T colaboradores, lo cual sugiere que CCL2 tiene también una función procoagulante (32) . • Interviene también en la inestabilización de la placa de ateroma habiéndose encontrado concentraciones mayores de CCL2 así como niveles mayores de RNA de CCL2 en los pacientes con placas inestables (33-35) . CCL7 / MCP-3. Por su parte, CCL7 cuyo gen se localiza en la región 17q11.2-q12 (36) , no se une específicamente a CCR2, por lo que podemos encontrar receptores que responden a CCL7 en diferentes células: monocitos (CCR1 y CCR2), eosinófilos (CCR3), linfocitos TH2 (CCR3, CCR4 y CCR8), basófilos (CCR3) y células dendríticas inmaduras (CCR1 y CCR2), lo cual subraya la importancia del papel jugado por CCL7 para regular en tráfico de células y la respuesta inmune. En el caso de CCR2, CCL7 se une a la isoforma CCR2B (37) . En condiciones normales, CCL7 libre se une a los receptores de leucocitos CCR1, 2 y 3, induciendo un aumento del calcio intracelular con lo que promueve la migración del leucocito hacia la zona de inflamación. Sin embargo, en el caso de la placa de ateroma establecida, hay algunas diferencias que afectan a su función, puesto que en el interior de la placa encontramos gelatinasas (MMP-2 y MMP-9) y metaloproteinasa 7 (MMP7) producidas por células del tejido conectivo, que producen la proteolisis de CCL7 (38) escindiéndola de su extremo N terminal que resulta fundamental para que active al receptor CCR2 (39) . El resultante de la degradación de CCL7 continúa uniéndose a CCR2 pero ya no induce flujo de calcio ni promueve la quimiotaxis, y en su lugar, actúa como quimioquina antagonista que modera la reacción inflamatoria. De esta manera, a diferencia de su acción agonista sistémica, ! 24 en el ambiente proinflamatorio de la placa de ateroma, el CCL7 actuaría como antagonista sobre el receptor CCR2 (38) . Figura 5. Respuesta del calcio intracelular a CCL7 fraccionado frente a CCL2 fraccionado. Observamos la pérdida de la movilización del calcio intracelular por CCL7 fraccionado por gelatinasa A (28) y que no se produce en CCL2. Además, se ha observado en estudios in vivo en ratones que al inyectar CCL7 completo frente a CCL7 fraccionado por gelatinasa A, que el CCL7 completo, pero no el fraccionado, induce la infiltración mononuclear inflamatoria con degradación asociada de la matriz celular a las 18 horas (38) . CCL7 CCL2 ! 25 - 1.3 Evidencia sobre la intervención de CCR2 en el desarrollo de la aterosclerosis primaria. La evidencia experimental sobre la contribución de las quimioquinas en la aterosclerosis deriva de dos modelos de roedores con predisposición al desarrollo de aterosclerosis por hiperlipidemia severa causada por deficiencia en el receptor de LDL (LDLr -/-) o en la apolipoproteína E (apoE -/-). Respecto a la evidencia publicada en cuanto a la intervención de CCR2 y sus ligados en la placa de ateroma encontramos que: CCL2 y CCR2 se expresan en las células que conforman la placa de ateroma: células endoteliales, células musculares lisas y macrófagos (40) . CCR2 es crucial en la formación de la lesión aterosclerótica y en la infiltración de los macrófagos (41) . La sobre-expresión de CCL2 en leucocitos de ratones dio como resultado el incremento del tamaño de la placa a través de un aumento del número de macrófagos y de la acumulación de lípidos (42,43) . Los ratones que carecen del receptor para CCL2 (CCR2) presentan defectos en la adhesión leucocitaria y de reclutamiento de monocitos (44) . Los ratones hipercolesterolémicos a los que se les provoca una delección en el gen de CCL2 son resistentes al efecto de una dieta rica en colesterol y tienen de forma marcada menos ateroesclerosis (45,46,47) . De la misma forma, la delección genética del receptor CCR2 en ratones hiperlipidémicos, deficientes en ApoE, y alimentados con dieta rica en grasa también protege frente al desarrollo de lesiones ateroscleróticas alcanzándose una reducción de hasta el 85% en el tamaño de la placa además de producirse una reducción de la infiltración macrofágica (41,47-51), lo cual corrobora la ! 26 - importancia de CCR2 en las células monocíticas desde los estadíos iniciales de desarrollo de la placa aterosclerótica. Todos estos hallazgos se encuentran en relación con la hiperlipidemia, puesto que existe una clara asociación entre la intervención de CCL2-CCR2 y los niveles elevados de lipoproteínas de baja densidad (LDL), encontrándose un aumento de 2,4 veces de la expresión de CCR2 en monocitos aislados de pacientes con niveles altos de LDL (no se ha observado ninguna variación con los niveles de triglicéridos), frente a monocitos de controles normales y que los niveles de LDL actúan también aumentando la producción de CCL2 por las células musculares lisas (52) . Este efecto se ve revertido por niveles elevados de lipoproteínas de alta densidad (HDL) (42) . En el caso de humanos, la evidencia publicada al respecto señala: Se ha observado una alta expresión de CCL2 en las placas ateroscleróticas humanas (53) . A pesar de que poco se sabe del papel que juegan los niveles de CCL2 en las enfermedades cardiacas en la población en general, niveles elevados de CCL2 se han asociado con un incremento del riesgo de desarrollar infarto miocardio, muerte súbita, angioplastia coronaria y reestenosis de los stents (54) . También se ha observado que niveles elevados de CCL2 en plasma se asocian con factores de riesgo clásico en el desarrollo de la aterosclerosis, soportando la hipótesis de que el CCL2 podría modular algunos de estos factores en el desarrollo de la enfermedad (55,56) . Además de haberse encontrado en animales hipercolesterolémicos que la activación de CCL2-CCR2 induce la expresión de citoquinas proinflamatorias y metaloproteinasas acelerando el proceso aterosclerótico (40), en células musculares lisas de arterias humanas se ha encontrado que su activación induce la expresión de factor tisular, reforzando la hipótesis de que CCL2 no solamente ! 27 - contribuye a la inflamación vascular sino a la desestabilización de la placa y trombosis, que resulta en eventos coronarios agudos (40) . Se ha planteado que un polimorfismo frecuente en CCR2 (Val64Ile, sustitución de valina por isoleucina en posición 64) se asocia a menor calcificación coronaria objetivada por TAC coronario sugiriendo la intervención de CCR2 en la aterosclerosis humana(57), si bien no parece haber acuerdo en estudios posteriores (58-60). La evidencia del efecto de este polimorfismo en la función de CCR2 también proviene de estudios en HIV (CCR2 es necesario para la entrada del virus de la inmunodeficiencia humana en los linfocitos). En pacientes que presentan el polimorfismo Val64Ile y están infectados por HIV, presentaron una progresión a SIDA entre 2 y 4 años más tarde que los individuos sin él (61). En CCL2 se han descrito otros polimorfismos como A2518 G y A2076T también con resultados no concluyentes (57,62-64) . ! 34 - • Factores de riesgo cardiovascular. Se registró la edad al ingreso en años, el sexo y los antecedentes familiares de cardiopatía isquémica precoz recogidos en la historia clínica y definidos como familiares de primer grado varones < 55 o mujeres < 65 años (72) . Se determinó el índice de masa corporal según la fórmula de Quetelet (IMC = peso/(talla)2) (73) . Se clasificó al paciente como hipertenso si presentaba cifras de tensión arterial superiores a 140/90 mmHg en reposo o se encontraba bajo tratamiento con fármacos antihipertensivos. El diagnóstico de diabetes se estableció según los criterios de la ADA (American Diabetes Association) de 2014 (glucemia ≥ 126 mg/dl en ayunas, ≥ 200 mg/dl en el test de sobrecarga oral de glucosa, HbA1c ≥ 6.5% o ≥ 200 mg/dl en cualquier momento asociado a sintomatología cardinal de diabetes mellitus) o si tomaban previamente tratamiento antidiabético. En cuanto al tabaquismo se diferenció entre no fumador, fumador, y exfumador si habían pasado dos años desde el abandono del hábito tabáquico. Se clasificó como dislipémico según las cifras lipídicas en función del riesgo cardiovascular de acuerdo a las guías de dislipemia ATP III (74) o si tomaban previamente un tratamiento hipolipemiante. • Descripción del evento coronario. Los diagnósticos clínicos se codificaron como angina estable (AE), angina inestable (AI), infarto sin elevación del ST (IAMSEST) e infarto con elevación del ST (IAMCEST). Consideramos como angina estable aquella en la que los síntomas se desencadenaban solamente con los esfuerzos moderados y con un tiempo de evolución mayor a 2 meses. Se catalogó como angina inestable si el paciente presentaba progresión de los síntomas o si se inició en los últimos 2 meses, con o sin cambios dinámicos de la repolarización, pero sin presentar elevación de marcadores de necrosis miocárdica. El infarto sin elevación del ST (IAMSEST) se definió en los pacientes con síndrome coronario agudo sin objetivarse elevación persistente del ST y que realizaron curva de marcadores de necrosis miocárdica (troponina I). El infarto con elevación persistente del ST (IAMCEST) incluía a pacientes con síndrome coronario agudo y elevación del segmento ST en electrocardiograma durante más de ! 35 - 20 minutos (≥0.1 mV en derivaciones que no fueran V1-V2, en las que el punto de corte es ≥0.2 mV en hombres mayores de 40 años; ≥0.25 mV en hombres menores de 40 años o ≥0.15 mV en mujeres) y desarrollo de curva de marcadores de necrosis miocárdica (75) . La localización del infarto se definió por la alteración la repolarización en forma de ascenso del segmento del ST en el electrocardiograma de 12 derivaciones, siendo anterior si se registró en V1-V4, lateral en V5-V6, I y aVL e inferior en II, III y aVF. Se consideró no localizable en caso de no presentar elevación del segmento ST, de que tuviera QRS ancho por presencia de bloqueo de rama izquierda o por estimulación ventricular por marcapasos. Por su parte, la clasificación de Killip-Kimball establece cuatro estadios en los que se correlaciona la clínica de insuficiencia cardíaca con el pronóstico del paciente (76) . Se clasificó como Killip I si el paciente no presentaba datos de insuficiencia cardíaca, Killip II si presentaba crepitantes bibasales, tercer tono cardíaco o aumento de la presión venosa yugular, Killip III si presentaba crepitantes por encima de campos medios o edema agudo de pulmón y Killip IV si se encontraba en situación shock cardiogénico, presión sistólica <90 mmHg y datos de hipoperfusión periférica. En relación al tratamiento al ingreso, se catalogó como médico si el paciente recibía tratamiento con doble antiagregación y heparina; como fibrinolísis si al tratamiento previo se le sumaba la pauta de un fibrinolítico (tenecteplasa ajustada al peso según ficha técnica), angioplastia primaria si el tratamiento revascularizador del infarto agudo de miocardio era percutáneo (angioplastia con balón y/o implante de stent) y fibrinólisis + angioplastia de rescate si se administró la fibrinólisis y posteriormente el cateterismo urgente por no presentar criterios clínicos y electrocardiográficos de reperfusión. Respecto a las características angiográficas, se registró el tipo de stent implantado (convencional o recubierto), número de vasos afectados o la extensión de la enfermedad coronaria definida por el hemodinamista según las características del angiograma (focal o difusa). ! 36 - La función ventricular izquierda ventricular izquierda se determinó por el método de Simpson biplanar en apical 4 y 2 cámaras (77) en el ecocardiograma transtorácico realizado previo al alta (equipo Phillips® iE33, Koninklijke, Holanda). También se registró la terapia final que se recibió de cara al alta hospitalaria definiéndose como tratamiento sólo farmacológico, percutáneo cuando se realizó revascularización mediante angioplastia/implante de stent o quirúrgico cuando se derivó a cirugía de revascularización coronaria. En cuanto al tratamiento farmacológico al alta se distinguió: ácido acetil salicílico 100 mg/24h, clopidogrel 75 mg/24h, acenocumarol o warfarina según controles del índice de coagulación normalizado recomendado (INR) , betabloqueantes (fundamentalmente bisoprolol 2,510 mg/24h, carvedilol 6,25-25 mg/12h y atenolol 50-100 mg/24h), inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (IECAs) (fundamentalmente ramipril 2.5-10 mg/24h, enalapril 5-20 mg/12h), antagonistas del receptor de la angiotensina tipo 2 (fundamentalmente losartan 12,5-100 mg/24h), estatinas (fundamentalmente atorvastatina 20-80 mg/24h, rosuvastatina 10-20 mg/24h, simvastatina 20-40 mg/24h), calcioantagonistas (amlodipino 5-10 mg/24h, nifedipino 30-60 mg/24h, diltiazem 90240 mg/24h), espironolactona (25 -100 mg/24h), eplerenona (25-50 mg/24h) y nitratos (nitroglicerina en parche transdérmico 5-15 mg c/24h o mononitrato de isosorbida oral (20-40 mg dos veces al día). • Determinación analítica. Se realizó una extracción de muestra sanguínea en ayunas, el día del ingreso del paciente en el servicio de Cardiología, determinándose el hemograma con recuento celular, creatinina, ácido úrico, perfil metabólico (glucosa plasmática, hemoglobina glicosilada, insulina, colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL, triglicéridos y lipoproteína A), transaminasas (GPT, GOT), parámetros de inflamación incluyendo la velocidad de sedimentación glomerular (VSG) y la proteína C reactiva (PCR), homocisteína, fibrinógeno y parámetros de afectación miocárdica (NT-pro BNP y pico máximo de troponina I). ! 37 - Se utilizó un analizador automático (AU 5800 de Beckman Coulter®, California, USA) para la determinación de parámetros bioquímicos (glucosa, colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL, triglicéridos, GPT, GOT y PCR). La insulina plasmática se determinó en un UniCel ® DxI 800 de Beckman Coulter®, California, USA. El NT-proBNP se obtuvo en un analizador Stratus de Dare Behring-Siemens®, Berlin, Alemania. La troponina I fue determinada en un equipo VIDAS® de bioMerieux®, Marcy-l'Étoil, Francia. Para la hemoglobina glicosilada se utilizó un ARXRAY Adams A1c HA-818V de Menarini®, Florencia, Italia. El hemograma se realizó con el autoanalizador UniCel ® DxH 800 de Beckman Coulter®, California, USA. La VSG se determinó en el Test 1TH de RAL®, Barcelona, España. El fibrinógeno se obtuvo en un ACLTOP 500 de Instrumentation Laboratory ®, Massachusetts, USA. • Evolución clínica. Se realizó un seguimiento de todos los pacientes en Junio de 2013 mediante la historia clínica electrónica o por contacto con el paciente o la familia por vía telefónica, quedando registrado además el tiempo de seguimiento. En caso de que el paciente presentara un reingreso, se inscribió también el diagnostico clínico con la misma definición clínica que en el primer episodio (angina estable, angina inestable, infarto sin elevación del ST y con elevación del ST) añadiéndose además la muerte por causa cardiológica, insuficiencia cardíaca, arritmias ventriculares e ictus. En los pacientes a los que se llevó a cabo un cateterismo cardíaco en el reingreso, registramos si la lesión causante del evento era una trombosis, reestenosis de stent previo o una lesión de novo. Si el paciente había fallecido, también se tuvo en cuenta si la muerte fue de origen cardiológico dentro del hospital, si fue de causa cardiológica extrahospitalaria, si fue causada por complicaciones del tratamiento o si fue de origen no cardiológico. ! 38 - 4.2 Análisis estadístico. Las variables se registraron en una base de datos en SPSS Statistics (IBM®, versión 20), distinguiéndose variables categóricas que se codificaron de forma numérica con valores nominales asignados y variables continúas según el valor específico con dos decimales. Las variables categóricas se expresaron como frecuencias y porcentajes y las variables contínuas como medias y desviaciones standard (SD) cuando los datos siguieron una distribución normal o como media y rango intercuartil (percentil 25-75) cuando la distribución se salía de la normal. Se compararon los porcentajes utilizando el test de Chi cuadrado (χ2), las medias con t de Student y las medianas con el test de Wilcoxon para datos independientes. Con la finalidad de identificar los factores que tienen una asociación independiente con la enfermedad coronaria, se utilizó un análisis logístico multivariable en el que se incluyeron las variables que mostraron significación en los dos análisis univariantes. El análisis de varianza (ANOVA) de un factor se utilizó para comparar una variable cuantitativa en más de dos grupos. También se incluyó en el análisis una variable que expresara interacción entre sexo y el alelo TT, lo cual permitió obtener asociación entre enfermedad coronaria y el alelo TT en hombres y mujeres separadamente. Se llevó a cabo una selección de las variables utilizando el método más adecuado y el criterio AIC (78) . Se exploraron los efectos no-lineales de las variables numéricas en la enfermedad coronaria por medio de modelos aditivos. El modelo resultante resume los valores de p y odds ratio ajustados para otros factores de riesgo, que fueron estimados usando intervalos de confianza del 95%. Se estableció que la asociación estadística fuera significativa cuando su valor p fuera inferior a 0,05. ! 39 - 4.3 Análisis genético. Realizamos la extracción de DNA a partir de una muestra de sangre periférica (10 ml de sangre venosa periférica en tubo con EDTA como anticoagulante, conservada a 5ºC) en todos los pacientes recogidos y previa firma de un consentimiento informado para la realización de estudios genéticos, de acuerdo a la declaración de Helsinki. La extracción del DNA a partir de sangre periférica se realizó utilizando una variante del método de precipitación con sales descrito originalmente por Miller y cols (79) , tal y como se presenta en el producto comercial de extracción de DNA de sangre de QIAGEN® (Hilden, Alemania). Para la búsqueda de variantes genéticas en el sistema del receptor CCR2 y los ligandos CCL7 y CCL2 se secuenciaron todos los exones y secuencias flanqueantes en la empresa Secugen® SL (Madrid, España) en un muestreo inicial con 70 pacientes y 30 controles sanos. Para el análisis de los resultados se utilizaron los programas Sequence Scanner V1.0 para Windows (Applied Biosystems®, California, USA) y/o 4Peaks para MacOS X (Nucleobytes Inc., Holanda), identificándose distintas variantes SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), que fueron contrastadas en la base de datos dbSNP alojada en el Nacional Center for Biotechnology Information (NCBI80). En el informe para cada SNP ya encontrada previamente, se pueden encontrar las frecuencias alélicas de las variantes en el proyecto de los 1000 Genomas (81) . Para detectar la variante rs17735770 se comprobó, en primer lugar, si la variante alteraba la secuencia de reconocimiento de alguna enzima de restricción. Para ello, se utilizó el programa WebCutter (82) . Alelo silvestre TTTATGTAA Alelo mutante TTTACGTAA ! 40 - El cambio de T a C genera un sitio de restricción para la enzima SnaBI. Tras la identificación del cambio, se diseñaron olinucleótidos cebadores para amplificar un fragmento que contuviera la variante utilizando el programa Primer3(83) y, posteriormente, se verificó la especificidad de los oligonucleótidos para amplificar exclusivamente, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la zona de interés utilizando el programa BLAST (84) contra el genoma humano de referencia GRCh37. El resultado de este análisis seleccionó a los cebadores CCL7_B1_1F (5´- CCCAGGCTGAACCCTCAAGGTG-3) y CCL7_B1_1R (5´- AGAAGGGAGGAGCATCCCACAGT-3´). Los cebadores anteriormente indicados fueron utilizados para amplificar la zona de interés del gen CCL7 humano en muestras de DNA genómico tal y como se ha descrito previamente (85) . Brevemente, 50 ng de ADN genómico se amplificaron mediante PCR en un termociclador siguiendo las recomendaciones del fabricante de la Taq polimerasa (Promega Biotech®, Madison, WI, EEUU). Tras 35 ciclos de amplificación (95 °C, 1 min; 55 °C, 1min; 72 °C, 1min) se obtuvo un fragmento de 438 pares de bases que, tras la digestión con SnaBI, produciría 2 fragmentos de 155 y 283 pares de bases en el caso de que la variante C estuviera presente, mientras que el alelo más frecuente (T) no se vería afectado. Para la obtención de los resultados del análisis, las reacciones de digestión se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 1,5% en 1xTBE (89 mM Tris borate, 2 mM EDTA, pH 8.2) y el resultado se visualizó con luz ultravioleta (λ = 254 nm) tras la tinción con bromuro de etidio. El resultado de uno de estos análisis se muestra en la figura 6. Figura 6. Detección de la variante rs17735770 mediante la técnica de RFLP (Restriction Fragment Length Polimorphism). Se muestra el resultado de la resolución electroforética de un análisis de presencia de la variante en diferentes muestras. El procedimiento se explica en el texto. La calle de los marcadores (1Kb) muestra las longitudes de los fragmentos, en pares de bases (bp), obtenidos durante la PCR (438 bp) y tras la digestión con SnaBI (283 y 155 bp). El análisis indica que las muestras 3, 5 y 8 contienen un alelo silvestre y otro alelo portador de la variante rs17735770. La fotografía que se muestra es un negativo de la original. ! 41 - 4.4 Análisis bioinformático La comparación de las secuencias de la región 3´UTR en mamíferos se realizó con el programa BLAST (84). Para detectar la presencia de secuencias potencialmente reguladoras en la zona que contiene la variante rs17735770, se sometió al escrutinio de la aplicación TargetScanHuman® v. 5.1 (86) tal y como se presenta en el UCSC Genome Browser (87). Las secuencias reconocidas por miRNAs son identificadas utilizando fragmentos de siete nucleótidos de todas las familias de miRNAs conocidas en mamíferos y buscadas en todos los extremos 3´UTR de todos los transcritos RefSeq y CDS anotados en NCBI. Las regiones 3´ fueron escrutadas para identificar secuencias conservadas (88) y se les asignó un valor (de 0 a 100) de acuerdo a su contexto (89) . Para evaluar si una variante, presente un el mRNA en una zona no codificante, supone un cambio en la estructura del RNA, utilizamos el algoritmo SNPfold (90), que evalua la consecuencia estructural de la sustitución calculando un coeficiente entre tener el tipo silvestre o la sustitución en una posición determinada. Cuanto menor es la correlación, mayor es el cambio estructural predicho. ! 42 - 5. RESULTADOS. 5.1 Descripción de la población estudiada. Recogimos un total de 519 casos ingresados en el Servicio de Cardiología del Complejo Universitario Insular-Materno Infantil de Gran Canaria y 771 controles de población general. Con la finalidad de hacer un análisis descriptivo de la población estudiada buscamos diferencias desde 3 puntos de vista: se compararon los datos en función de la presencia de enfermedad cardiovascular (casos frente a controles), se realizó un análisis descriptivo del tipo de evento y manejo clínico durante el ingreso en los casos y finalmente se compararon los casos en función del sexo (hombres frente a mujeres). Comparando casos frente a controles (datos mostrados en la tabla 1), observamos que no hubo diferencias significativas en cuanto al índice de masa corporal (controles: 28.3 ± 5.1 kg/m2 vs casos 29.5 ± 5.4 kg/m2, p =0.980) pero, como era de esperar, los casos fueron más frecuentemente hombres (72.4% vs. 45.5%, p<0.001), mayores (61.4 ± 12.2 años vs. 48.4 ± 12.1 años p< 0.001), fumadores (41.4% vs 24.4%, p<0.001), hipertensos (65.7% vs. 23.6%, p<0.001), diabéticos (40.3%, vs 27.5%, p<0.001), dislipémicos (50.48% vs. 17.9%, p<0.001), con cardiopatía isquémica previa (28.5% vs. 4.5%, p<0.001) y con niveles más altos de triglicéridos (casos: 131 mg/dl, controles 106 mg/dl, p<0,001). Llamativamente encontramos cifras de colesterol total (controles: 212.1 ± 40.1 mg/dl vs casos: 163.5 ± 44.5 mg/dl, p<0.001) y LDL (132.3 ± 35.9 mg/dl vs. 93.3 ± 34.6 mg/dl, p<0.001) más bajas entre los casos, lo cual lo atribuimos a que en fase aguda de un infarto está descrito un importante descenso de las concentraciones lipídicas observadas en sangre (91) y a que prácticamente a todos los casos (95.1% vs. 16.9%) se les administraba tratamiento con estatinas durante el ingreso independientemente de las cifras de lípidos que tuvieran. ! 43 - Tabla 1. Controles N = 771 Casos N = 519 P! Edad, años 48.4 ± 12.1 61.4 ± 12.2 <0.001! Hombres / Mujeres, % 45.5 / 54.5 72.4 / 27.6 < 0.001! IMC, Kg/m2 28.3±5.1 29.5±5.4 0.980! Tabaquismo, n (%) No fumador Ex-fumador Fumador actual 471 (61.1) 112 (14.5) 188 (24.4) 198 (38.2) 106 (20.4) 215 (41.4) < 0.001! Hipertensión arterial, n (%) 182 (23.6) 341 (65.7) < 0.001! Diabetes mellitus, n (%) 212 (27.5) 209 (40.3) < 0.001! Antecedente de dislipemia, n (%) 138 (17.9) 262 (50.48) < 0.001! Antecedentes personales de Cardiopatía isquémica, n (%) 35 (4.5) 148 (28.5) <0.001! Colesterol total, mg/dL 212.1 ± 40.1 163.5 ± 44.5 < 0.001! Colesterol LDL, mg/dL 132.3 ± 35.9 93.3 ± 34.6 < 0.001! Triglicéridos, mg/dL 106 (76 ; 149) 131 (100 ; 169) < 0.001! Estatinas, n (%) 130 (16.9) 481 (95.1) < 0.001! Leucocitos x 103/mm3 7.25 (6.10 ; 8.55) 8.60 (7.00 ; 10.4) 0.291! Tabla 1. Perfil de riesgo cardiovascular de los pacientes estudiados frente a los controles. Observamos que los casos son mayormente hombres, con más edad y con mayor frecuencia de los factores de riesgo cardiovascular clásicos. Destaca que presentan niveles más bajos de colesterol total y LDL al ingreso, lo cual se expone en la discusión, siendo atribuido a la reducción de los niveles de LDL colesterol en la fase aguda de un evento coronario agudo y a que prácticamente todos los pacientes estaban tratados con estatinas independientemente de las cifras de lípidos. IMC: índice de masa corporal (kg/m2). LDL: low density lipoprotein cholesterol (mg/dl). Los datos son frecuencias (%), medias ± desviación standard y medianas y cuartiles (25-75%) ! 50 Respecto al análisis por sexos (ver detalles en tablas 6, 7 y 8), destaca que las mujeres son mayores (67 (56; 76) años vs. 59 (50; 70) años, p<0.001), más diabéticas (53% vs. 35.3% p = 0.001) e hipertensas (79% vs. 60.6%, p<0.001) mientras que los hombres son más fumadores (50.8% vs. 16.8%, p<0.001) como se puede ser de forma gráfica en la figura 1. No se obtuvieron diferencias en cuanto a los antecedentes familiares, el diagnóstico previo de enfermedad cardiovascular (cardiopatía isquémica o vasculopatía cerebral) ni de dislipemia. El tipo de evento clínico del ingreso, la localización de la isquemia y la clasificación Killip-Kimball en la admisión en urgencias fueron similares en ambos sexos (tabla 7) a pesar de lo cual, las mujeres recibieron más frecuentemente manejo conservador con tratamiento sólo farmacológico al alta respecto a los varones (33.5% vs. 16%, p<0.001, ver figura 2), concordante con la presencia de mayor enfermedad difusa en la coronariografía que presentaba el sexo femenino (32% vs 24%, p=0.09). Además, las mujeres tendían a recibir más tratamiento con stents recubiertos (64.5% vs. 48.6%, p=0.002) de acuerdo también con la mayor tasa de diabetes. No hubo diferencias significativas en cuanto ala fracción de eyección al alta. En cuanto a las diferencias obtenidas en el motivo de reingreso (no significativas) (tabla 8), los varones tienden a reingresar más por todas las causas (angina estable, angina inestable, infarto transmural, insuficiencia cardíaca, arritmia o ictus) excepto por infarto sin elevación del ST, siendo en este grupo más frecuentes las mujeres (8.4% vs 6.4%, p=0.763). No hubo diferencias significativas en cuanto a la presencia de reestenosis o trombosis de stent (reestenosis de stent: 3.5% en varones vs. 2.8% en mujeres y trombosis de stent: 1.6% en varones vs. 2.1% en mujeres, p=0.870) ni en las causas de mortalidad (cardíaca extrahospitalaria en varones 3.9%, en mujeres 6.3% y cardíaca intrahospitalaria en varones 4.5%, en mujeres 5.6%, p=0.567). ! 51 ! Tabla 6. Datos demográficos Hombres (376) Mujeres (143) p! Edad (años) 59 (50; 70) 67 (56; 76) <0.001! IMC (kg/m2) 29.82 ± 3.8 28.78 ± 8.3 Antecedentes familiares, n (%) 35 (9.3) 18 (12.6) 0.270! Antecedentes de cardiopatía isquémica, n (%) 117 (31) 31 (21.6) 0.083! Hipertensión arterial, n (%) 228 (60.6) 113 (79) <0.001! Diabetes mellitus, n (%) 133 (35.3) 76 (53) 0.001! Dislipemia, n (%) 185 (49.2) 77 (52.8) 0.344! Tabaquismo, n (%) 191 (50.8) 24 (16.8) <0.001! Consumo de cocaína, n (%) 8 (2.1) 1 (0.7) 0.345! Cirugía previa de bypass coronario, n (%) 1 (0,2) 0 (0) 0.656! ACV previo, n (%) 32 (8.5) 14 (9.8) 0.747! ! Tabla 6. Datos demográficos y factores de riesgo cardiovascular clasificados por sexos en los casos. Observamos que las mujeres tienen un debut más tardío y que son más frecuentemente diabéticas e hipertensas. La dislipemia está presente en ambos grupos por igual y los hombres son más frecuentemente fumadores. ACV: accidente cerebrovascular.3 Los datos son frecuencias (%), medias ± desviación estándar y mediana con intervalo intercuartílico (25;75). ! ! ! Figura 7. Presencia de factores de riesgo cardiovascular por sexos. ! ! 0! 10! 20! 30! 40! 50! 60! 70! 80! 90! Varones! Mujeres! ! 52 Tabla 7. Datos clínicos Hombres (376) Mujeres (143) p! Tipo de evento, n (%) 0.353! Angina estable 23 (6.1) 4 (2.8) Angina inestable 55 (14.6) 26 (18.2) IAMSEST 153 (40.7) 61 (42.6) IAMCEST 145 (38.5) 52 (36.3) Localización, n (%) 0.148! No localizable 206 (54.7) 79 (55.2) Anterior 64 (17) 34 (23.7) Lateral 9 (2.5) 1 (0.7) Inferior 97 (25.8) 29 (20.3) Killip al ingreso hospitalario, n (%) 0.933! I 321 (85) 120 (84) II 19 (5) 9 (6.3) III 24 (6.4) 10 (7) IV 12 (3.2) 4 (2.8) Tratamiento al ingreso dentro de los pacientes con IAMCEST, n (%) 0.200! Sin terapia de reperfusión urgente 46 (31.5) 21 (40.4) Fibrinolisis 47 (32.2) 12 (23.1) Fibrinolisis + ACTP rescate. 30 (20.5) 6 (11.5) Angioplastia primaria (ACTP) 23 (15.8) 13 (25) Tratamiento al alta, n (%) <0.001! Solamente farmacológico 60 (16) 48 (33.5) Implante de stent coronario 282 (75) 89 (62) Cirugía de revascularización coronaria 34 (9) 6 (4.2) Tabla 7. Perfil del evento de ingreso definido por el diagnóstico, su localización, clase killip-kimball al ingreso y tratamiento recibido en el momento del ingreso y previo al alta, analizados por sexos. No se obtuvieron diferencias significativas en cuanto al diagnóstico al ingreso, localización de la isquemia o insuficiencia cardíaca al ingreso. Destaca que al alta las mujeres recibieron más frecuentemente tratamiento sólo farmacológico y en los hombres fueron tratados con stent o cirugía de bypass más frecuentemente. IAMSEST: Infarto sin elevación del ST. IAMCEST: Infarto con elevación del ST. Clasificación Killip-kimball al ingreso (I: sin datos clínicos de insuficiencia cardíaca, II: crepitantes bibasales, tercer tono cardíaco o aumento de la presión venosa yugular, III: crepitantes por encima de campos medios o edema agudo de pulmón, IV: shock cardiogénico, presión sistólica <90 mmHg y datos de hipoperfusión periférica). ACTP: angioplastia coronaria transluminal percutánea. Los datos son frecuencias n, (%). ! 53 Figura 8. Porcentaje de tratamiento recibido al alta hospitalaria: médico, percutáneo o quirúrgico. Diagrama de columnas agrupadas. Tabla 8. Hombres (376) Mujeres (143) p! Causa del reingreso 0.763! Angina estable, n (%) 13 (3) 3 (2,1) Angina inestable, n (%) 19 (5) 5 (3,5) IAMSEST, n (%) 24 (6,4) 12 (8,4) IAMCEST, n (%) 9 (2,4) 3 (2,1) Insuficiencia cardíaca, n (%) 21 (5,6) 6 (4,2) Arritmias ventriculares, n (%) 2 (0,5) 0 (0) ACV, n (%) 5 (1) 1 (0,7) Lesión objetivada en el reingreso. 0.870! Reestenosis de stent, n (%) 13 (3.5) 4 (2.8) Trombosis de stent, n (%) 6 (1.6) 3 (2.1) Lesión de novo, n (%) 30 (8) 8 (5.6) Otro, n (%) 11 (2.9) 5 (3.5) Mortalidad. Causas. 0.567! Cardíaca extrahospitalaria, n (%) 15 (3.9) 9 (6.3) Cardíaca intrahospitalaria, n (%) 17 (4.5) 8 (5.6) Iatrogenia, n (%) 3 (0.8) 1 (0.7) No cardíaca, n (%) 27 (7.18) 6 (1.6) Tabla 8. Evolución clínica tras el alta hospitalaria, clasificada por sexos. No se obtuvieron diferencias significativas en cuanto a las causas de reingreso y mortalidad en ambos grupos. IAMSEST: Infarto sin elevación del ST. IAMCEST: Infarto con elevación del ST. ACV: accidente cerebrovascular. Los datos son frecuencias (%). 0! 20! 40! 60! 80! Médico! Percutáneo! Quirúrgico! Hombres! Mujeres! ! 54 5.2 El tipo de evento cardiológico influye en la respuesta inflamatoria. Cuando comparamos los parámetros de respuesta inflamatoria (ver tabla 9) en función del evento coronario agudo que se trate (leucocitos totales, recuento de monocitos, PCR y fibrinogeno), observamos se encuentran en niveles similares en la angina estable e inestable, presentando un aumento progresivo en los pacientes con infarto sin elevación del ST y que es máximo en los pacientes con infarto con elevación del ST en los que existe un mayor daño tisular con elevación de troponina correspondiente. En la figura 9 podemos ver de forma gráfica este aumento progresivo del número de monocitos en función del tipo de evento. Tabla 9. Angina IAM Estable N = 27 Inestable N = 81 IAMSEST N = 214 IAMCEST N = 197 P! Hemoglobina, g/dL 13.6 (13.1 ; 14.3) 13.8 (12.5 ; 15.0) 13.1 (12.0 ; 14.4) 13.2 (11.6 ; 14.4) 0.025! Leucocitos x 103/mm3 7.4 (6.1 ; 8.3) 7.8 (5.9 ; 9.9) 8.4 (7.2 ; 10.0) 9.6 (7.4 ; 11.0) < 0.001! Monocitos 0.6 (0.5 , 0.89 0.6 (0.5 , 0.79 0.7 (0.6 ; 0.9) 0.8 (0.6 ; 1.0) < 0.001! Plaquetas x 103/mm3 202 (167 ; 246) 221 (187 ; 256) 225 (186 ; 277) 255 (204 ; 314) < 0.001! Fibrinógeno, gr/L 4.10 (3.54 ; 5.04) 3.82 (3.45 ; 4.22) 3.95 (3.54 ; 4.54) 4.79 (4.15 ; 5.35) < 0.001! PCR, mg/L 0.60 (0.20 ; 2.14) 0.48 (0.20 ; 1.40) 1.39 (0.50 ; 3.61) 2.89 (1.50 ; 7.00) < 0.001! Troponina > 0.1, n (%) 0 11 (13.4) 192 (96.0) 163 (97.0) < 0.001! Tabla 9. Parámetros analíticos y de inflamación según el tipo de evento. Los parámetros de respuesta inflamatoria (leucocitos totales, recuento de monocitos, PCR, y fibrinógeno) se encuentran progresivamente aumentados en infarto con elevación del ST y sin elevación del ST respecto a los pacientes con angina. LDL: Low density lipoprotein (mg/dl), HDL: High density lipoprotein, HDL bajo: < 35 md/dl, Fibrinógeno, medido por método de Clauss (gr/L). Los datos son medias (± SD), medianas (IQR) o frecuencias (%) ! 55 Figura 9. Figura 9. Diagrama de cajas simples del número de monocitos en función del tipo de evento coronario. Podemos ver de forma gráfica el aumento progresivo del número de monocitos en función del tipo de evento. Además, en la tabla 10 comparamos los controles sanos frente a los casos agrupados en pacientes con angina estable o inestable (sin elevación de marcadores de necrosis miocárdica) y a los que habían sufrido un infarto tanto con elevación del ST como sin elevación del ST (agrupados por tanto como pacientes con elevación de marcadores de necrosis miocárdica). Observamos un incremento significativo del recuento total de leucocitos en los pacientes infarto, en los que existía un daño tisular (8.9 (7.3 ; 10.6) leucocitos/ml) frente a los que no (controles: 7.5 (6.1 ; 8.5) leucocitos/ml, y pacientes con angina: 7.5 (5.9 ; 9.4) leucocitos /ml, p<0.001), siendo esta diferencia a expensas del aumento de los monocitos circulantes, mientras que en los pacientes con angina permanecen en valores similares (angina: 0.60 (0.50 ; 0.70) monocitos/ml, controles: 0.55 (0.40 ; 0.70) monocitos/ml, infarto (0.71 (0.60 ; 0.90), p<0.001). No se objetivaron diferencias en los niveles de hemoglobina y plaquetas y sí un incremento progresivo en los niveles de PCR y fibrinógeno en los controles frente a angina y a infarto (PCR en controles: 0.34 (0.32 ; 0.5) mg/dl, en angina: 0.47 (0.2 ; Tipo de evento! Monocitos ! 56 1.52) mg/dl, en IAM 2.15 (0.78 ; 4.42) mg/dl, p<0.001; fibrinógeno en controles: 3.15 (2.76 ; 3.63) gr/L, en angina: 3.90 (3.47 ; 4.35) gr/L, en IAM: 4.29 (3.72 ; 4.95) gr/L, p< 0.001). En la figura 10 realizamos un diagrama de cajas simples con el número de monocitos, observándose de forma gráfica que los monocitos en la angina, es decir, con isquemia pero sin necrosis tisular presentaban niveles similares de monocitos que los controles, aumentándose de forma importante en los pacientes que tenían un infarto con desarrollo de necrosis tisular. Realizamos también un grafico de dispersión en la figura 11 agrupando niveles de PCR y recuento de monocitos en el que se puede ver un claro aumento de estos dos parámetros de forma simultánea en los casos de infarto frente a los que no habían presentado necrosis tisular, lo cual señala la intervención del sistema inflamatorio en este proceso. ! 57 Tabla 10. Tabla 10. Enfermedad cardiovascular, monocitos e inflamación. Observamos un incremento significativo del recuento total de leucocitos en los pacientes infarto frente a los controles y pacientes con angina (sin necrosis tisular), siendo esta diferencia a expensas del aumento progresivo de los monocitos en angina frente a controles e infarto. No se objetivaron diferencias en los niveles de hemoglobina y plaquetas y sí un incremento progresivo en los niveles de PCR y fibrinógeno en los controles frente a angina y a infarto. Angina incluye angina estable e inestable e IAM incluye infarto sin elevación del ST y con elevación del ST. Los datos son medianas (IQR) y frecuencias (%). Para cada variable y grupo se indica el número de sujetos evaluados Controles Angina IAM P ! Leucocitos x 103/mm3 N = 23 7.5 (6.1 ; 8.5) N = 101 7.5 (5.9 ; 9.4) N = 376 8.9 (7.3 ; 10.6) < 0.001 ! Monocitos N = 16 0.55 (0.40 ; 0.70) N = 52 0.60 (0.50 ; 0.70) N = 225 0.71 (0.60 ; 0.90) < 0.001 ! Plaquetas x 103/mm3 N = 23 221 (184 ; 248) N = 103 217 (180 ; 255) N = 380 237 (191 ; 292) 0.011! Hemoglobina, g/dL N = 23 13.3 (12.5 ; 14.6) N = 100 13.8 (12.6 ; 15.0) N = 379 13.1 (11.7 ; 14.4) 0.019! Fibrinógeno N = 750 3.15 (2.76 ; 3.63) N = 46 3.90 (3.47 ; 4.35) N = 183 4.29 (3.72 ; 4.95) < 0.001 ! PCR N = 752 0.34 (0.32 ; 0.50) N = 68 0.47 (0.20 ; 1.52) N = 272 2.15 (0.78 ; 4.42) < 0.001 ! Troponina N = 21 0.01 (0.01 ; 0.01) N = 112 0.01 (0.01 ; 0.01) N = 368 3.24 (0.85 ; 11.1) < 0.001 ! !! ! 58 Figura 10. Figura 10. Diagrama de cajas simples del número de monocitos en controles frente a pacientes con angina o infarto. ! Figura 11. Figura 11. Grafico de dispersión del número de monocitos y valor de la PCR en función del tipo de evento. Tipo de evento! Monocitos Monocitos! PCR ! 59 5.3 Búsqueda de variantes genéticas en los genes CCR2, CCL2 y CCL7. La inflamación en general, y los monocitos/macrófagos en particular, tienen un papel central en el desarrollo de la aterosclerosis. Los receptores de quimiocinas son importantes en la regulación de la función de los monocitos, destacando el papel del receptor de quimiocinas CCR2 en el desarrollo de la aterosclerosis. Por ello, nos planteamos el estudio de variantes genéticas que pudieran afectar tanto a este receptor como a sus principales ligandos (CCL2 y CCL7) y la posibilidad de que representaran un factor de riesgo adicional para el desarrollo de la enfermedad cardiovascular. Con la finalidad de buscar variantes genéticas en estos tres genes, secuenciamos los exones y las secuencias flanqueantes a partir del DNA genómico de 70 casos y 30 controles sanos (71) utilizando el método bidireccional de Sanger (95) . Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 11. Como se puede observar, la mayoría de las variantes se detectaron en el gen CCR2, 16 en total, y tres de las cuales no se habían descrito en las bases de datos públicas con fecha de septiembre de 2015. En la región del exón 1-5’UTR encontramos rs3749461 (A/G, 3:46353822), rs3092964 (G/A, 3:46354094) y rs3918376 (T/C 3:463541249). En el intrón encontramos: rs 140800049 (G/T, 3:46354226) y rs3918361 (G/A, 3:46354295). En el exón 2-ORF encontramos rs3918367 (G/T, 3:46357683), rs1799864 (G/A, 3:46357717) y rs3918386 (A/G, 3:46359752). En el exón 2-3’UTR encontramos rs140253702 (A/G 3:46360115), rs743660 (G/A, 3:46360527) y rs34138562 (T(G, 3:46360562). En la zona downstream sólo encontramos rs11575062 (A/T 3:46360940). Encontramos también otra variante que está documentada en la base de datos de NCBI pero tiene muy poca información asociada ya que se ha encontrado en muy baja frecuencia o se ha secuenciado en muy pocos genomas: rs36225401 (3:46354020) en la región del exón 1-5’UTR. ! 66 5.5 Análisis de casos jóvenes frente a controles jóvenes. Dado que los factores de riesgo cardiovascular tienen más peso en el desarrollo de la enfermedad aterosclerótica en edades avanzadas y que la carga genética es más importantes en los casos más precoces, decidimos seleccionar a los sujetos jóvenes (varones ≤ 58 años, n=429 vs. mujeres ≤ 65 años, n=425) quedando incluidos en este subestudio 854 individuos de los cuales 222 eran casos y 632 controles. Encontramos que los casos eran mayores (controles: 45.0 ± 8.9 vs. casos 50.3 ± 6.8 años, p<0.001), predominantemente hombres (controles: 41,8% vs casos: 74,3%, p<0.001), fumadores (controles 25.6% vs. casos: 60.4% p<0.001), hipertensos (controles: 17.4% vs. casos: 47.3%, p<0.001), con niveles bajos de HDL (controles: 71.9% vs. casos: 20.7%, p<0.001) y elevados de triglicéridos (casos: 140 (113 ; 183) mg/dl vs. controles: 102 (72 ; 148) mg/dl, p<0.001). Destaca, al igual que en el estudio de la población completa, que los casos tenían niveles más bajos de LDL, atribuidos al tratamiento con estatinas a dosis alta independientemente de los niveles de LDL. Además presentaban niveles más elevados de parámetros de reacción inflamatoria como PCR (controles: 0.34 (0.32 ; 0.52) mg/l vs. casos: 1.22 (0.35 ; 2.92) mg/l. p<0.001), leucocitos (controles 7.55 (6.85 ; 8.85) x 103 /mm3 vs. casos: 9.50 (7.4 ; 10.9) x 103 /mm3 , p= 0.018) y fibrinógeno (controles: 3.1 (2.7 ; 3.6) vs. casos: 4.2 (3.5 ; 5.0); p<0.001) como era de esperar. En este caso el cambio del alelo T por C (TT frente a CT/CC) sí alcanzó la significación estadística siendo más frecuente TT en los casos (casos: 95% vs controles: 89.6%) y CT/CC en los controles (controles: 10.4% vs. casos: 5%, p=0.014), como se puede observar de forma gráfica en la figura 12, sugiriendo una función protectora al cambio de la base nitrogenada. ! 67 Tabla 15. (Pie de página a continuación) CONTROLES N = 632 CASOS N = 222 P! Edad, años 45.0 ± 8.9 50.3 ± 6.8 <0,001! Hombres/mujeres, % 41,8 / 58,2 74,3 / 25,7 <0,001! Indice de masa corporal, kg/m2 28 ±5,2 29,8±6,8 0,123! Tabaquismo, n (%) No 389 (61.6) 52 (23.4) <0,01! Fumador 162 (25.6) 134 (60.4) Exfumador 81 (12.8) 36 (16.2) Hipertensión arterial, n (%) 110 (17,4) 105 (47,3) <0,001! Historia de dislipemia, n (%) 88 (13,8) 104 (46.8) <0.001! HbA1c, % 4.9 (4.7 ; 5.3) 5.6 (5.4 ; 6.2) <0.001! Glucemia, mg/dL 89 (82 ; 100) 99 (90 ; 122) <0.001! Insulinemia 7.25 (4.7 ; 11.2) 7.69 (5.54 ; 11.3) <0.181! Diabetes mellitus , n (%) 131 (20.7) 51 (23.0) 0.482! Colesterol total, mg/dL 0.2 (0.1 ; 0.3) 0.2 (0.1 ; 0.2) <0.001! Colesterol LDL, mg/dL 132.6 ± 34.0 102 ± 39.1 <0.001! Triglicéridos, mg/dL 102 (72 ; 148) 140 (113 ; 183) <0.001! HDL bajo, n (%) 130 (20.7) 115 (71.9) <0.001! Estatinas, n (%) 85 (13.4) 207 (94.19) <0.001! PCR (mg/L) 0.34 (0.32 ; 0.52) 1.22 (0.35 ; 2.92) <0.001! Fibrinógeno 3.1 (2.7 ; 3.6) 4.2 (3.5 ; 5.0) <0.001! Leucocitos x 103 /mm3 7.55 (6.85 ; 8.85) 9.50 (7.4 ; 10.9) 0.018! GOT 23.9 (18.0 ; 37.0) 29.6 (22.4 ; 55.0) 0.139! GPT 29.1 (20.2 ; 53.1) 38.5 (25.1 ; 65.5) 0.361! Creatinina 0.80 (0.7 ; 0.9) 1.00 (0.88 ; 1.13) <0.001! CCL7, n (%) TT 566 (89.6) 211 (95) 0,014! CT/CC 66 (10.4) 11 (5) ! 68 Tabla 15. Análisis de pacientes jóvenes (varones ≤ 58 años, n=429 y mujeres ≤ 65 años, n=425). Los casos presentan mayor edad, son predominantemente hombres, fumadores, hipertensos, con niveles bajos de HDL y elevados de triglicéridos (destaca al igual que en el estudio de la población completa que los casos tenían niveles más bajos de LDL atribuidos al false descenso de las concentraciones observado durante la fase aguda del infarto y al tratamiento con estatinas a dosis alta independientemente de los niveles de LDL). Además presentan niveles más elevados de PCR, leucocitos y fibrinógeno. El cambio del alelo T por C (TT frente a CT/CC) es más frecuente TT en los controles de forma significativa. Los datos son frecuencias (%), medias ± desviación standard o medianas (IQR) Figura 12. Alelo T frente a C en casos y controles jóvenes. (varones ≤ 58 años, n=429 y mujeres ≤ 65 años, n=425). Diagrama de barra 100% apilada. 0%! 20%! 40%! 60%! 80%! 100%! TT! CT/CC! Controles! Casos! ! 69 Dada la presencia de múltiples factores de riesgo cardiovascular en la enfermedad aterosclerótica, realizamos una regresión logística multivariable (ver tabla 7) en la que obtuvimos significación estadística en cuanto a la edad, hipertensión arterial, antecedente descrito de dislipemia y tabaquismo activo como fuertes factores de riesgo cardiovascular ya demostrados en múltiples estudios, pero además se alcanzó la significación en la presencia de los alelos TT como factor de riesgo cardiovascular en los varones jóvenes (p:0.02), sin llegar a serlo en el caso de las mujeres. Es de destacar que no hemos observado un efecto lineal en cuanto a la relación de la edad con la presencia de enfermedad aterosclerótica sino que presenta una evolución sigmoidea con un aumento progresivo de la incidencias de la cardiopatía isquémica hasta los 45-50 años con estabilización en meseta hasta los 60-65 años en los que vuelve a aumentar progresivamente. Esta evolución se muestra de forma gráfica en la en la figura 13. Tabla 16. P OR (95% CI)! Edad <0.001 Efecto no lineal (ver figura 13)! Hipertensión arterial <0.001 2.82 (1.79 ; 4.44)! Historia de dislipemia <0.001 3.69 (2.32 ; 5.87)! Fumador activo <0.001 6.92 (4.49 ; 10.7)! Polimorfismo CCL7: alelo TT Hombres 0.020 3.97 (1.24 ; 12.7)! Mujeres 0.897 1.08 (0.33 ; 3.6)! Tabla 16. Regresión logística multivariable. Observamos que comparando múltiples factores continúan siendo significativos los factores de riesgo cardiovascular clásicos ya establecidos (edad, hipertensión, dislipemia, tabaquismo activo), así como la presencia del alelo TT de CCL7 en hombres jóvenes (no fue significativo en mujeres jóvenes, probablemente por el efecto protector del estradiol hasta la menopausia) ! 70 Figura 13. Efecto no lineal de la edad en la probabilidad de enfermedad coronaria.! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 71 5.6 Impacto de la variante rs17735770 en la estructura del mRNA en la zona 3´UTR. El gen de CCL7, tal y como revela un análisis de comparación de secuencias realizado con el programa BLAST® (97) , se encuentra exclusivamente en mamíferos. A pesar de encontrarse en el extremo 3´ UTR del mRNA, una zona no codificante, el entorno inmediato de la variante rs17735770 se encuentra altamente conservado en diferentes especies (Tabla 17). NM_006273.3 476 TCTAAGGAATATGAGCTTTATGTAATAATGTGAATCATGGTTTTT 520 XM_003278361.3 470 TCTAAGGAATATGAGCTTTATATAATAATGTGAATCATGGTTTTT 514 XM_002748371.3 466 TCTAAGGAATATGAGTCTTATGTAATAATGTGAATCATGGTTTTT 510 XM_008695392.1 535 -CTAAGGAATATGAGATTTGTGTAATAATGTGAATCATGGTTTTT 578 XM_004747090.2 457 TCTAAGGAATATGAGATTTGTGTAATAATGTGAATCATAGTTTTT 501 XM_005597581.1 466 TCTAAGGAATGTGAGTTTTGTGGAATAATGTGAATTATAGTTTTT 510 Consenso TCTAAGGAAT*TGAG*TTT*T**AATAATGTGAAT*AT*GTTTTT Tabla 17 . Conservación de la secuencia adyacente a la variante rs17735770 en el extremo 3´UTR del mRNA de CCL7 en diferentes especies de mamífero. Los números indican la posición en el transcrito maduro (mRNA). NM_006273.3: Homo sapiens chemokine (C-C motif) ligand 7 (CCL7) mRNA; XM_003278361.3 : Nomascus leucogenys chemokine (C-C motif) ligand 7 (CCL7) mRNA; XM_002748371.3: Callithrix jacchus chemokine (C-C motif) ligand 7 (CCL7) mRNA; XM_008695392.1: Ursus maritimus chemokine (C-C motif) ligand 7 (CCL7), mRNA; XM_004747090.2: Mustela putorius furo C-C motif chemokine 2 (LOC101686339), mRNA; XM_005597581.1: Equus caballus chemokine (C-C motif) ligand 7 (CCL7), mRNA. El nucleótido T correspondiente al alelo silvestre de la variante se muestra en rojo. El escrutinio de esta zona en el UCSC Genome Browser, una base de datos genómicos de la Universidad de California Santa Cruz (87) predijo, mediante la utilización del software TargetScanHuman v. 5.1 (86), un sitio de unión para los microRNA miR-23a y b, genéricamente expresados como miR-23ab. Como se muestra en la figura 14, este sitio se encuentra entre las coordenadas 17: 32598948 – 32598955 (genoma de referencia GRCh37/hg19) y fué identificado por el programa de escrutinio tal y como se describe en la sección material y métodos. El programa asigna una puntuación centesimal de acuerdo a la fiabilidad de la predicción y al contexto, obteniéndose en este caso una puntuación de 98/100. Figura 14. Análisis genómico de la zona que contiene la variante rs17735770. Captura de pantalla del UCSC Genome Browser, indicando de arriba a abajo la posición en el genoma de referencia hg19, la presencia de genes y transcritos registrados en RefSeq y otras fuentes (dbEST y GenBank), la presencia de sitios hipersensibles a DNasaI en cromatina, la presencia de secuencias de reconocimiento para miRNAs (miR-23ab en este caso), un alineamiento en 5 especies de mamífero con una apreciación del grado de conservación en su margen superior y, finalmente, la posición de la variante rs17735770. Aunque la variante rs17735770 no afecta al sitio de unión de miR-23ab per se, se planteó la posibilidad de que esta variante pudiera afectar la estructura del RNA en esa zona. Por ello, utilizamos un algoritmo para calcular el efecto de la sustitución en la estructura del RNA próximo a la variante. El algoritmo utilizado, SNPfold, evalúa los efectos de una variante en la estructura secundaria de una molecula lineal de RNA, y lo expresa mediante un coeficiente de correlación que muestra el grado de accesibilidad de los nucleótidos en la estructura. Cuanto mayor es la participación del nucleótido en la estructura, menor es su accesibilidad, por lo que su coeficiente de correlación es también menor (90) . El programa SNPfold predijo una estructura secundaria de tipo horquilla (hairpin) que es estabilizada por la presencia de la variante (Figura 15). Este hecho implica que la estructura secundaria en esta zona es más estable en presencia de la variante C que cuando está presente el alelo más frecuente, T. El coeficiente de correlación afecta, mayoritariamente, a los nucleótidos que se encuentran entre la variante y la secuencia de reconocimiento para miR-23ab, incluyendo también al primer nucleótido (en posición 20) de dicha secuencia (Figura 15, E). Figura 15. La variante rs17735770 provoca, según el algoritmo SNPfold, un cambio en la estructura del RNA que afecta al sitio de unión de miR-23ab. (A) Predicción del apareamiento de bases en el alelo silvestre (T). Cuanto más claro es el color, más fuerte es la interaccion. (B) Representación del gráfico anterior. (C) Predicción del apareamiento (D) Gráfico que representa el perfil de accesibilidad (E) Datos representados en D. En rojo se representa la variante rs17735770. Los nucleótidos que se representan en azul son los que, junto con el nucleótido en posición 20, ya en la secuencia de unión del miR-23ab, se encuentran más afectados en cuanto a un descenso muy significativo en la accesibilidad. ! 75 6. DISCUSIÓN. En nuestro estudio, hemos buscado una influencia entre los factores genéticos (en concreto, cambios en la secuencia de ADN que codifica el sistema del receptor de CCR2 y sus ligandos CCL2 y CCL7), los inflamatorios y los factores de riesgo cardiovascular clásico frente al desarrollo y evolución de la cardiopatía isquémica. Encontramos que el cambio de una timina por una citosina en posición 34271923 del cromosoma 17 (SNP rs17735770 de CCL7) se muestra como factor protector frente al desarrollo de cardiopatía isquémica, y preferentemente frente a la inestabilización de la placa de ateroma, en el subgrupo de pacientes jóvenes en los que tienen más importancia los factores genéticos frente a los factores de riesgo cardiovascular clásicos. De cara a analizar las conclusiones, discutimos primeramente los datos de la población estudiada y perfil clínico y analítico de los pacientes incluidos. 6.1 Descripción de la población estudiada. Como era de esperar, los casos no son iguales que los controles. Son más hipertensos, mayores, varones, fumadores, diabéticos, dislipémicos y con cardiopatía isquémica previa, pero sin embargo, presentaron niveles más bajos de colesterol LDL. Atribuimos este hallazgo a que todos los pacientes recibían tratamiento con lípidos que presentaran. Además, en la fase aguda de un evento coronario agudo existe una reducción de las cifras de colesterol que se inicia en las primeras 24-48 horas y alcanza su máxima reducción en torno al 4º-5º día (hasta un 47% de los niveles previos de HDL y LDL) mientras que aumentan los niveles de triglicéridos. Estas alteraciones se normalizan a los dos meses del evento coronario (91) . También es de destacar que observamos un efecto no lineal de la edad en la probabilidad de desarrollo de enfermedad coronaria presentando una meseta en torno a los 50-65 años en la que se estabiliza. Esta característica no se ha ! 82 Figura 16. Propuesta sobre la diferente infiltración de monocitos en la placa de ateroma en el alelo C de de la SNP rs 17735770 de CCL7. En la imagen de la izquierda vemos la infiltración por monocitos en la placa de ateroma con el alelo silvestre. En la imagen de la derecha, con el alelo C de la SNP rs17735770 aumentaría la síntesis de CCL7 que a nivel de la placa de ateroma actua como inhibidor de CCR2 y por tanto produciendo un menor contenido en células inflamatorias. En relación a la presencia de modificaciones genéticas a nivel del CCL7, algunos investigadores han generado variantes que no se unen a los glicosaminoglicanos de la superficie celular, afectando esto a su función a la hora de inducir la migración transendotelial del leucocito (122) . Llamativamente, en nuestro estudio, el cambio de una timina por una citosina en posición 34271923 del cromosoma 17 (exón 3 del gen de CCL7, región 3´ UTR) no codifica para un cambio de aminoácido, pero sí que se traduce en una ! 83 modificación en el RNA mensajero. Aunque no sean codificantes, las regiones 5´y 3´ no traducidas de los mRNA tienen un papel estructural importante, ya que pueden determinar la traducción y la estabilidad de un mRNA. Como muestra la figura 17 las zonas 5´y 3´no traducidas a proteínas (UTR) contienen secuencias que, tras la formación de estructuras secundarias y terciarias específicas, ofrecen sitios de unión para complejos ribonucleoproteicos que pueden regular la traducción del mRNA, ofreciendo por tanto, un mecanismo de regulación post-transcripcional. En el caso de la variante rs17735770, el cambio de T a C produce, de acuerdo al algoritmo empleado por el programa SNPfold, un cambio conformacional que refuerza la estabilidad de una estructura secundaria en forma de bucle. Esta característica adquiere una mayor importancia al coincidir con un lugar de unión para miR-23ab, un tandem de micro RNAs. El modelo predice que la estructura secundaria presente en la variante es más estable y, por tanto, menos accesible para hibridar con otros ácidos nucleicos como los miRNA. Figura 17. Elementos reguladores en las zonas no traducidas de los mRNA. Los extremos 5´y 3´no traducidos de los mRNA contienen elementos estructurales que pueden ser reconocidos por diversos complejos nucleoproteicos. Estos elementos pueden aportar niveles de control a la traducibilidad y la estabilidad del mRNA. Tomado de Di Liegro et al (123) . ! 84 Los microRNAs son pequeñas moléculas de RNA que pueden participar en varios aspectos de regulación post transcripcional a través de su unión, principalmente, a las zonas 3´ no traducidas de los mRNA eucariotas(124-126). Aunque la función más conocida de los miRNAs parece ser el control de la estabilidad del mRNA, alterando su grado de poliadenilación o comprometiendo la integridad del CAP en el extremo 5´, parace ser que también podrían influir en la accesibilidad del mRNA a la maquinaria de traducción y a la eficiencia del proceso de traducción per se. Una visión general sobre los aspectos que puede regular los miRNAs se muestra en la figura 18. Figura 18. Modelos de regulación post-transcripcional mediada por miRNAs. Los miRNA, tras su unión, principalmente en los extremos 3´UTR del mRNA, pueden iniciar, tras el reclutamiento local de maquinaria específica, varios procesos de control en la productividad del mRNA afectado. Por un lado, pueden promover la deadenilación, que conduce a la degradación del mRNA por 3´exonucleasas. Por otro lado, puede afectar a varios procesos implicados en la iniciación, elongación y terminación de la traducción. Tomada de Chekulaeva et al (127) . Así, en base a estas observaciones y conocimientos, es tentativo especular acerca de la implicación de estos hallazgos. Podríamos pensar que miR-23ab modula la expresión de CCL7 favoreciendo su degradación o su accesibilidad a la maquinaria de traducción. Este es un mecanismo ampliamente utilizado en numerosas moléculas de señalización que tienen unidades trascripcionales pequeñas: se transcriben rápido, se traducen, hacen su función y desaparecen (128) . Para que esto sea posible, tiene que haber ! 85 mecanismos que limiten la vida media del mRNA, como los miRNA. Al estabilizar la estructura circundante al sitio de unión del miRNA, podemos plantearnos la posibilidad de que el apareamiento intracatenario es mas fuerte en esa zona, por lo que dificultaría la unión de un miRNA. La presencia de menos moléculas de mRNA ocupadas por miRNAs puede suponer un aumento neto de CCL7 al estabilizar un número mayor de moléculas de mRNA. Como hemos visto en la introducción, el ambiente proinflamatorio de la placa de ateroma, donde se encuentra, entre otras proteasas, la gelatinasa A (MMP2 / EC 3.4.24.24) (38) , que proteoliza el CCL7 generando un nuevo ligando de CCR2 pero que, en este caso, se comporta como antagonista. Esta observación sugiere que la proteólisis de CCL7 por MMP2 es un mecanismo de regulación negativo para controlar la señalización via CCR2 y modular asi la respuesta inflamatoria. Si además, añadimos que la expresión del RNA mensajero del CCL7, como ocurre con el CCL2, está aumentada en las zonas de infarto de miocardio (121,129) obtendríamos no solo un aumento de la vida media sino también un aumento de su expresión, lo que se traduciría en una mayor actividad antagónica sobre el CCR2 en la placa de ateroma. Esto explicaría, en parte, el porqué el CCL7 está transitoriamente aumentado en el tejido cardiaco tras un infarto de miocardio (130) y porqué nuestros pacientes varones más jóvenes con cardiopatía isquémica, portadores de un cambio de una timina (T) por una citosina (C) en el SNP rs17735770 de CCL7 (genotipos CT y CC), presentan de forma significativa una menor incidencia de cardiopatía isquémica. Igualmente, las estatinas, que tienen un efectos antiinflamatorios independientemente de su intervención sobre los niveles de colesterol plasmático (131) pueden favorecer la estabilidad de la placa actuando a través de diferentes mecanismos pleiotrópicos entre los que se encuentra la reducción de la síntesis de quimioquinas (CCL2, CCL7, CCL13, CCL18, CXCL1) a nivel sistémico. Este posible mecanismo fisiopatológico deducido de la evidencia publicada al respecto, podría explicar el papel de la SNP rs17735770 como factor protector en el desarrollo de la enfermedad aterosclerótica que hemos objetivado en nuestro estudio, si bien la ausencia de evidencia experimental ! 86 limita nuestras observaciones, planteándose el estudio funcional de la variante genética para investigaciones futuras. ! 87 7. CONCLUSIONES. o Los monocitos juegan un papel central en el desarrollo de la cardiopatía isquémica y sus complicaciones siendo una de las claves su diapédesis al interior de la placa de ateroma inducida por el receptor CCR2 y sus ligandos. o Se observa un aumento de los parámetros de inflamación en los pacientes con necrosis tisular frente a los pacientes con isquemia y los controles sanos. o La presencia de la SNP rs 17735770 es un factor protector frente al desarrollo de cardiopatía isquémica exclusivamente en varones jóvenes, incluso ajustado por el resto de factores de riesgo cardiovascular clásicos. o En mujeres no encontramos como significativa la intervención de la SNP rs 17735770 probablemente por el efecto protector en esta franja de edad de las concentraciones de estradiol. o No hemos encontrado diferencias significativas en cuanto a la evolución clínica de los pacientes en función de la SNP rs 17735770 aunque los datos sugieren que podría tener una mayor protección frente a la hiperplasia neointimal y la trombosis aguda tras el implante de un stent. o Es llamativo el efecto no lineal de la edad en la probabilidad de desarrollo de enfermedad coronaria que hemos observado en nuestra población con una meseta de estabilización en torno a los 50-65 años y que no se ha descrito en otras poblaciones coetáneas. ! 88 ! 89 8. 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