Evolución cicatricial de úlceras cutáneas experimentales inducida por productos clínicos de limpieza de heridas

UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD  Programa de Doctorado Interdepartamental (Departamentos de Ciencias Médicas y Quirúrgicas, Educación Física y Enfermería) Dpto. Coordinador: Ciencias Médicas y Quirúrgicas  TESIS DOCTORAL “Evolución cicatricial de úlceras cutáneas experimentales inducida por productos clínicos de limpieza de heridas”  Doctorando: Rodrigo Chacón Ferrera 2012 AGRADECIMIENTOS A mi director Dr. Dº Juan Fernando Jiménez Díaz, por su guía constante y sus valiosas aportaciones en el desarrollo de este trabajo. A mis codirectores, la Dra. Dª Mª Pino Quintana Montesdeoca, el Dr. Dº Carmelo Monzón Moreno y la Dra. Dª Guillermina Bautista Harris, por sus orientaciones, sus valiosas y oportunas críticas, su preocupación y ayuda en especial en el análisis estadístico, microbiológico e histológico. Mi reconocimiento a quienes han colaborado en este trabajo, gracias Natalia y Martín técnicos del estabulario, Fabiola y Juan Francisco técnicos de morfología y Pedro técnico de ilustración, por la ayuda en el cuidado de los animales, la preparación y fotografía de muestras histológicas y maquetación del texto. A quienes siempre me apoyaron y estimularon para alcanzar metas superiores en el plano profesional y personal, mis padres: Francisco (in memoriam) y Mª Teresa. De manera especial, agradezco la ayuda, comprensión, paciencia y ánimos de mi familia. Magüi, Claudio, Rodrigo y Victor. Sin todos ellos no hubiera llegado a buen puerto esta tesis. A todos muchas gracias. TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA ÍNDICE 1.-Introducción /13 1.1.- Concepto de heridas /18 1.2.- Recuerdo anatómico y funcional de la piel /21 1.3.- Recuerdo histórico del cuidado /36 1.4.- Fisiopatología de la cicatrización /41 1.5.- Tipología de las heridas /61 1.6.- Clínica de las heridas /64 1.7.- Limpieza de heridas /66 1.8.- Contaminación de las heridas /72 1.9.- Complicaciones en la resolución de heridas /77 2.- Justificación y objetivos /87 2.1.- Justificación /89 2.2.- Objetivos /95 3.- Material y métodos /97 3.1.- Condiciones de trabajo /100 3.2.- Ulcerometría Planimétrica /102 3.3.- Histología /106 3.4.- Microbiología /107 4.- Resultados /117 5.- Discusión/185 6.- Conclusiones/203 7.- Bibliografía/209 TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 18 Así pues, nuestro trabajo se centra en plantear esta investigación con la finalidad de valorar si los diferentes productos utilizados en la clínica de forma habitual en la limpieza de heridas, tienen efectos distintos en el favorecimiento del cierre de las mismas. Los diferentes productos objeto de esta investigación serán: Agua destilada, Agua oxigenada, Suero fisiológico y Suero glucosado. 1.1.-Concepto de heridas Herida es una lesión física caracterizada por un desgarramiento de la piel y que por lo general es el resultado de un accidente o traumatismo más que de una enfermedad, como por ejemplo las heridas por armas de fuego o las heridas punzantes 1. Con frecuencia, los traumatismos producen como resultado una herida corporal es decir una ruptura o pérdida de continuidad en la piel, de las mucosas, de TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 19 los huesos o de algún órgano corporal 2. Como consecuencia de la agresión de este tejido existe riesgo de infección y posibilidad de lesiones en órganos o tejidos adyacentes: músculos, nervios, vasos sanguíneos, etc. Las heridas pueden ser graves en función de una o varias de estas situaciones. Las heridas corporales pueden ser intencionadas o no intencionadas, los traumatismos intencionales se producen en el transcurso de un tratamiento como por ejemplo las intervenciones quirúrgicas, las punciones venosas, etc. Por el contrario las heridas no intencionadas son accidentales, por ejemplo tras una fractura los tejidos se traumatizan 3. Cuando los traumatismos son cerrados, se denominan contusiones y no hay afectación de la piel; cuando son abiertos se denominan heridas. Por tanto podemos definir también heridas como la presencia de una solución de continuidad en la piel y mucosas producidas por un agente físico, químico o TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 20 mecánico 4. Las heridas incluyen cortaduras, arañazos y picaduras en la piel. Suelen ocurrir como resultado de un accidente o una lesión, pero las incisiones quirúrgicas, las suturas y los puntos también causan heridas. Las heridas menores no suelen ser serias, pero hasta las cortaduras y los arañazos pueden necesitar atención para evitar infecciones y acelerar la curación 5. Autores como Fonder et. al. 6 , proponen algunas actuaciones que hay que tener con ellas, que se resumen en las siguientes: Aplique presión con una gasa limpia para detener la hemorragia Limpie la herida con agua Use un ungüento antibiótico para prevenir las infecciones Cubra la herida con una venda si está en un área que puede ensuciarse Vigile la hinchazón (edema) y enrojecimiento Aplique un refuerzo contra el tétanos si le corresponde TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 21 Haciendo especial hincapié en el lavado de manos, como fase previa a la cura de cualquier herida. Cuando la herida se extiende a tejidos internos y órganos, y como resultado de la lesión en estas estructuras, el daño adquiere mayor gravedad y dependerá de los tejidos y estructuras afectados, por lo que no siendo objeto de este trabajo, nos extenderemos a precisar los mismos. Todo lo expuesto, parece indicarnos que la resolución de las heridas, requiere de una serie de intervenciones de cierta complejidad. 1.2.-Recuerdo anatómico y funcional de la piel Hace más de cien años, Virchow 7 describió la piel como una cubierta protectora de otras vísceras internas más delicadas y de función más sofisticada, en aquella época, se creía que la piel era fundamentalmente una barrera pasiva contra la pérdida de líquidos y las agresiones mecánicas. TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 22 La investigación científica, ha demostrado que la piel es un órgano complejo, en el que las interacciones celulares controlan muchas respuestas importantes frente al medio ambiente; ahora sabemos que está formada por diversos tipos de estructuras celulares independientes que actúan en conjunto por un mismo objetivo protector 8. La piel es el órgano más extenso del cuerpo, al que recubre en su totalidad, teniendo múltiples funciones como son 9: 1. Barrera protectora 2. Absorbe y elimina líquidos 3. Regula la temperatura 4. Impide la pérdida y la entrada de agua 5. Absorbe y filtra radiaciones 6. Metabolismo de la Vitamina D 7. Tiene funciones sensitivas y cosméticas TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 23 8. Impide la entrada de microorganismos Teniendo en cuenta estas importantes funciones, podemos afirmar que la piel es esencial para la supervivencia de una persona, forma una barrera que impide que substancias y microorganismos nocivos penetren en el cuerpo, protege a los tejidos corporales contra lesiones, controla también la pérdida de líquidos fundamentales para la vida como la sangre y el agua, nos ayuda a regular la temperatura corporal a través de la transpiración y nos protege de los rayos ultravioleta nocivos del sol. Sin las terminaciones nerviosas en nuestra piel no podríamos sentir calor, frío u otras sensaciones. Cada pulgada cuadrada de piel contiene miles de células y cientos de glándulas sebáceas, glándulas sudoríparas, terminaciones nerviosas, vasos sanguíneos y folículos pilosos. Las características (es decir, el grosor, el color, la textura) de la piel no son uniformes en todo el cuerpo. Por ejemplo, la cabeza presenta más folículos pilosos y por tanto glándulas sebáceas que cualquier otra parte, mientras que la planta de los pies y la palma de las TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 24 manos no tienen. Además, la piel de la planta de los pies y de la palma de las manos es más gruesa. Además de actuar como escudo protector contra el calor, la luz, lesiones e infecciones, la piel también almacena agua y grasa 9. La piel, es un órgano delgado, relativamente plano, clasificado como una membrana, la membrana cutánea. A efectos de descripción, tomaremos la siguiente distribución. La piel está compuesta por las siguientes capas, cada una de ellas desempeña distintas funciones 10: a. Epidermis. b. Dermis. c. Capa de grasa subcutánea. a. Epidermis Según Junqueira 11, la epidermis es la capa externa y delgada de la piel, presenta un epitelio escamoso TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 25 estratificado queratinizado externo que se autorregenera. Las capas de la epidermis se ven mejor en la piel gruesa, por ejemplo, la de la planta del pie. Las células producidas por mitosis en la capa basal germinal adyacente a la dermis sufren cambios madurativos relacionados con la producción de queratina, la capa externa queratinizada sufre una descamación continua y es sustituida gracias al movimiento y maduración progresivos de las células procedentes de la capa germinal; por tanto, todas las células de esta estirpe se denominan queratinocitos. La frecuencia de las mitosis de la capa germinal suele ser equivalente a la velocidad a la que se desprende la queratina de la superficie más externa; en el hombre, el proceso de maduración desde la célula basal hasta el momento de la descamación dura de 25 a 50 días, siendo mas rápido en las zonas expuestas a las fuerzas de fricción más intensas. Las fases de este proceso dinámico se reflejan en cuatro capas con morfología distinta 12: TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 26 a.1. Capa córnea Esta capa corresponde a los restos aplanados y fusionados de las células y consiste en queratinocitos completamente maduros que contienen proteínas fibrosas (queratinas). Las queratinas son un complejo de proteínas existiendo dos formas, la queratina blanda que constituye la mayor parte de queratina que cubre la superficie cutánea y la queratina dura que forma el pelo y las uñas. a.2. Estrato granuloso Esta capa, que se encuentra debajo del estrato córneo, se caracteriza por gránulos intracelulares que contribuyen al proceso de queratinización y contiene queratinocitos activos (células escamosas), que maduran y forman el estrato córneo. a.3. Estrato espinoso O de Malphigi, llamado así por el aspecto “espinoso” de las células, está formado por múltiples hileras de queratinocitos, de TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 27 citoplasma eosinófilo, aplanados y unidos entre si por puentes intercelulares, estos puentes intercelulares son desmosomas y es debido a su presencia por lo que se llaman así, estas células se encuentran en proceso de crecimiento e inician la síntesis de queratina. a.4. Capa basal Es la capa germinal. La actividad mitótica en esta capa proporciona un suministro constante de nuevos queratinocitos que sustituyen a los perdidos por el desgaste y la descamación normales. Es la capa más profunda de la epidermis y está constituida por una sola capa de células cuboidales que se disponen por encima de la unión dermo-epidérmica, estas células basales se dividen continuamente, formando nuevos queratinocitos que reemplazan a los antiguos que se desprenden de la superficie cutánea 13. El queratinocito, es la célula con mayor presencia en la epidermis (representa el 80% de las células TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 34 afecte a toda la estructura de la piel 16. La palabra latina fascia significa etimológicamente banda, siendo empleada por primera vez por Celso, enciclopedista romano del siglo I d.C.. Posteriormente, es Galeno el primero que las considera en relación con la piel; es decir, lo que hoy consideramos como tejido celular subcutáneo. Fue mas tarde Vesalio, en el siglo XVI, el primero que, en su sistemática de disección, relaciona el concepto fascia con la membrana próxima a determinados músculos. Winslow es el primero que comienza a sistematizar esta relación con todos los músculos, como vaina de envoltura de los mismos, lo que posteriormente será corroborado por otros autores 17. Las fascias son vainas, hojas u otros agregados de tejido conectivo fibroso, no tendinoso, disecable. Según su mecanismo de formación se pueden diferenciar tres tipos: fascias de condensación, fusión y migración. Las fascias musculares, son por tanto membranas que rodean a las células del músculo esquelético, que son TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 35 las encargadas de realizar los movimientos voluntarios, estas células pueden ser gigantes y poseen una constitución sincitial, es decir gran número de núcleos en un citoplasma común. Dado el sincronismo del núcleo y del citoplasma y las características de ser plurinuclear, la reproducción resultaría un proceso complejo y difícil para una célula muscular que posee un citoplasma altamente ordenado en actina y miosina, por lo que prácticamente podemos decir que la célula muscular no se reproduce de forma clásica 11. La célula muscular esquelética se desarrolla por fusión de mioblastos ya que éstos si pueden dividirse mitóticamente, pero en la consecución de esta fusión, muchos genes diferentes se activan de forma coordinada y en los adultos, estos mioblastos permanecen en estado quiescente en forma de células satélites. Cuando un músculo se lesiona, estas células satélites adquieren el papel de células madre, que se activan, proliferan y se fusionan para sustituir las células musculares que se han perdido, estando modulada esta activación por la estimulación de la placa motriz. TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 36 1.3.-Recuerdo histórico del cuidado Podemos decir que el cuidado de las heridas es tan antiguo como la humanidad, según restos encontrados en el valle de Dussel (Alemania), en el Neandertal, ya se utilizaron hierbas para tratar las heridas por quemaduras 18. Otros autores como Harvey 19 refieren que desde 3000 años a.C., las heridas hemorrágicas eran tratadas cauterizando las mismas, el uso de torniquete es descrito en 400 a.C., la sutura es documentada desde el siglo 3 a.C.. Algo más reciente, en la cultura egipcia, encontramos descripciones de métodos para el manejo de heridas, en forma de emplastos, con utilización de mezclas de sustancias como la mirra, la goma, el aceite caliente y las resinas de árboles, como se describe en el papiro de Ebers, además, son pioneros en mencionar los principios básicos del manejo de las heridas: lavar, cubrir e inmovilizar 19. Con más o menos relevancia, todas las culturas van TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 37 desarrollando las formas de curación y cuidados de heridas, siguiendo el principio de tratamiento que ya enunciaron los egipcios 20. En época más reciente y coincidiendo fundamentalmente con las campañas de conquista de territorio, la generalización de las guerras, y la aparición de la pólvora, las heridas se hicieron más graves y se produce un gran desarrollo en su tratamiento. El barbero-cirujano francés Ambroise Paré, en 1585 orientó el tratamiento de las heridas (generalmente por armas de guerra) 20 proponiendo el desbridamiento, la aproximación de los bordes y las curas con vendajes limpios y cambios frecuentes, rechazando el uso de aceite caliente o hierros encendidos para cauterizar las lesiones. Se le considera un revolucionario respecto a la cirugía, escribió un tratado sobre "Tratamiento de las heridas por arma de fuego". Paré era un ardiente defensor del poder de curación de la naturaleza, siendo autor de la frase "yo lo vendé, Dios lo curó" 18. En esta época de conflictos bélicos, se hizo necesaria la intervención de la empresa para garantizar la curación TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 38 de los soldados, que habían sufrido algún tipo de herida, con el propósito de reintegrarlos lo más rápido posible a su regimiento, en esa época, se inicia la producción en masa de vendajes para los heridos. En la Guerra de Crimea el gobierno inglés produce vendajes de esta forma y en este periodo, destaca sobremanera el personaje de Florence Nightingale, enfermera encargada del cuidado de los heridos de guerra, quien impulsó la atención esmerada de los heridos y el desarrollo de curaciones de las heridas, teniendo como principal objetivo de su cuidado la higiene. En el mismo siglo, con el descubrimiento de los “gérmenes” por Louis Pasteur, probando que la infección no aparecía espontáneamente, y con base en los estudios de Joseph Lister, se introdujo el uso de vendajes impregnados en antisépticos como el ácido carbólico 21. Posteriormente y ya en el siglo XX, se produce una revolución de la terapéutica con la aparición de la penicilina 18. TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 39 Otro personaje como Hipócrates, respecto al tratamiento de las heridas, acuñó el lema de “ayudar a la Naturaleza”. Considerando que el cuerpo está compuesto por cuatro cualidades básicas: calor, frío, sequedad y humedad y que tanto el exceso como el defecto de los mismos causan enfermedad. Por otro lado el lema “es la naturaleza, y no los medicamentos lo que cura las heridas”, se constituyó como el Método Magatiano y se instauró como base del tratamiento de heridas durante los siglos XVII y XVIII, apoyándose en dos principios: 22 (a) A menor cambio de apósitos, menor posibilidad de lesionar nuevos tejidos. (b) La necesidad de utilizar tratamientos locales sencillos para el cuidado de las heridas. Si indagamos en la historia de los tratamientos en heridas, observamos vestigios apoyando la cura húmeda: Esta misma autora Bellón 22, refiere que desde que se demostraran los beneficios de la cura húmeda, ha sido TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 40 numerosa la evidencia a través de los estudios realizados, apoyando este tipo de cura. Y desde 1994 existe una sociedad científica en nuestro país que trabaja en pro de facilitar las mejores evidencias en el abordaje de los pacientes portadores de heridas,23 denominado Grupo Nacional de Estudio y Asesoramiento en Úlceras Por Presión (GNEAUPP), de forma similar a experiencias en otros países (EPUAP a nivel europeo, NPUAP en Estados Unidos de América, y Canadá). En la actualidad, en relación a la cura húmeda o la cura tradicional, tenemos soporte científico más que suficiente como para elegir la primera, 22,23,25 ya desde 1962, en el que se publican los trabajos de George Winters, 24,25 quién introduce el concepto de “cura en ambiente húmedo”, pues a partir de ese momento, se revoluciona el manejo de las heridas, pues demostró a partir de estudios con animales, que la cicatrización en ambiente húmedo era mucho mejor y más rápida que en ambiente seco. TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 41 En la historia del cuidado de las heridas, este descubrimiento representa un hito y modifica desde ese momento el tratamiento de las lesiones, considerándose a partir de entonces la curación en ambiente húmedo como relevante en contraposición a la curación tradicional que se producía hasta entonces. 23 Esta situación relatada, permanece hasta la actualidad, propiciando este hecho el desarrollo de una gran gama de vendajes o apósitos que mantienen la humedad en la herida y evitan su desecación 24, 25. Por lo que Bellón apostilla: Cura húmeda y cura tradicional, es como “el Bien y el Mal”. ¡Yo me quedo con la evidencia: La cura húmeda!. Aunque para ello tenga que cambiar mis costumbres 22. 1.4.-Fisiopatología de la cicatrización En la piel cutánea, a la hora de producirse la cicatrización de una herida, los fibroblastos de la dermis se reproducen con rapidez y empiezan a formar TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 42 una masa de nuevas fibras de tejido conjuntivo. Si esta masa no es sustituida por tejido normal, queda una cicatriz 26 - 28. Cuando se produce una herida, la reparación de los tejidos se va a realizar en dos procesos distintos: La regeneración, o sustitución de las células lesionadas por otras de la misma clase, a veces sin que queden huellas residuales de la lesión anterior, o a través de la sustitución por tejido conjuntivo, llamada fibroplasia o fibrosis, que deja una cicatriz permanente. Tanto la regeneración como la fibroplasia dependen básicamente de los mismos mecanismos que intervienen en la migración, proliferación y diferenciación celular, así como las interacciones célula-matriz 28. Estas últimas son especialmente importantes. Para que la regeneración del tejido epitelial de la piel y las vísceras sea ordenada es necesario que exista membrana basal (MB). Esta matriz extracelular (MEC) TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 43 especializada funciona como una trama o andamiaje extracelular que ayuda a lograr una reconstrucción exacta de las estructuras preexistentes. Gracias a la integridad de la MB se obtiene la especificidad y la polaridad celular, además de influir en la migración y el crecimiento celular. En los tejidos del adulto, la masa de una población celular está determinada por la velocidad con que se producen la proliferación, la diferenciación y la muerte celular por apoptosis 29. Sea cual sea el tipo de herida, el tipo de reparación de tejidos y de la extensión que abarque la pérdida de tejido, la cicatrización y curación de la misma discurre en varias fases que se desarrollan y solapan en el tiempo, a saber: 1. Fase inflamatoria y/o exudativa, con hemostasia y limpieza de la herida 2. Fase proliferativa o etapa de granulación, con recontrucción de los tejidos 3. Fase de remodelación, con contracción y maduración de la herida TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 50 (FCE), factor de crecimiento trombocítico (FCT), así como también los factores de crecimiento tumoral - α y – β (FCT - α y – β). Estos factores de crecimiento son polipéptidos que influyen de diversas maneras sobre las células que intervienen en la curación de la herida: atraen células y fomentan la circulación en el sector de la herida (quimio-taxis), estimulan la proliferación y diferenciación celular. Posteriormente y cuando se ha producido el desbridamiento del sitio lesionado, el macrófago activado puede ser dañino para las células sanas. Así, para proteger al tejido normal se suprime la actividad de los macrófagos. Se cree que el factor FCTβ participa en esta supresión, porque se ha informado que desactiva la producción de superóxido de los macrófagos 35 - 39. Además, el factor FCT-beta puede regular y controlar la actividad de otros factores de crecimiento como el FbCF 27. TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 51 Los linfocitos y sus productos como las interleukinas e interferones también interactúan con los macrófagos durante la fase inflamatoria, lo que vincula la reacción inmunitaria con la cicatrización de las heridas 40. De esta forma, el macrófago amplifica, orquesta y sostiene el proceso de cicatrización de la herida 33. 2. La fase proliferativa o de granulación En esta fase de la curación de la herida predomina la rápida proliferación celular con el fin de alcanzar la reconstitución vascular y de volver a rellenar la zona defectuosa mediante el tejido granular 41. Esta fase comienza aproximadamente a partir del cuarto día desde que se produjo la herida, las condiciones necesarias ya han sido comentadas en la fase anterior, los fibroblastos ilesos de los tejidos colindantes pueden migrar al coágulo y a la retícula de fibrina que han sido formados mediante la coagulación sanguínea y utilizarla como matriz provisoria, las citocinas, y los factores de crecimiento estimulan y regulan la migración y proliferación de las células encargadas de la reconstitución de tejidos y vasos. TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 52 Reconstitución vascular y vascularización La curación de la herida no puede progresar sin nuevos vasos, ya que éstos deben garantizar un aporte adecuado de sangre, oxígeno y sustancias nutritivas 41, 42. La reconstitución vascular se inicia desde los vasos intactos que se encuentran en el borde de la herida. Gracias a la estimulación de los factores de crecimiento, las células de la capa epitelial, que revisten las paredes vasculares (endotelio), están capacitadas para degradar su membrana basal, para movilizarse y proceder a migrar a la zona lesionada y al coágulo sanguíneo colindante. A través de sucesivas divisiones celulares en este lugar se origina una figura canaliculada, la cual se vuelve a dividir en su final adquiriendo una forma de botón. Estos botones vasculares individuales crecen uno encima de otro y se unen formando asas vasculares, que a su vez se seguirán ramificando, hasta que se topen con un vaso aún mayor en el que pueden finalmente desembocar 42. Sin embargo, recientemente se han descubierto en la sangre células germinales endoteliales, las cuales TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 53 ponen en entredicho la doctrina vigente hasta el momento. Una herida bien irrigada se encuentra extremadamente vascularizada. Incluso la permeabilidad de los nuevos capilares que se han formado es mucho más alta que la de los capilares normales, con lo cual se responde al aumento del metabolismo de la herida. Sin embargo los nuevos capilares tienen una menor capacidad de resistencia ante las sobrecargas producidas de forma mecánica, es por ello que se debe proteger la zona de la herida contra posibles traumatismos. Con la posterior maduración del tejido granular que se transforma en tejido cicatricial también se vuelven a reducir nuevamente los vasos 43. Junto con la reconstitución vascular, a partir del cuarto día de producirse la herida comienza a rellenarse la zona defectuosa mediante nuevo tejido. Se desarrolla el denominado tejido granular, cuya formación es iniciada preponderantemente por los fibroblastos. Éstos producen por una parte colágeno extracelular, que madura fuera de las células hasta transformarse en una fibra y le otorga su resistencia al TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 54 tejido, y por otra parte también proteoglicanos que constituyen la substancia básica de tipo gelatinoso del espacio extracelular 44. Los fibroblastos fusiformes no son transportados en exclusiva hasta la herida mediante la circulación sanguínea, sino que proceden también de los tejidos locales lesionados y son atraídos por quimiotaxis. De forma simultánea los fibroblastos utilizan la retícula de fibrina que se formó durante la coagulación sanguínea como matriz para la formación de colágenos. La estrecha relación que existe entre los fibroblastos y la retícula de fibrina condujo en el pasado a la hipótesis, de que la fibrina se transformaba en colágeno. Lo cierto, sin embargo, es que con la progresiva constitución del colágeno se va degradando la retícula de fibrina, los vasos cerrados son nuevamente recanalizados. Este proceso, que es controlado por la enzima plasmina, se denomina fibrinólisis 44. El alcance de este proceso de granulación se corresponde de forma directa con la importancia de la coagulación sanguínea y la dimensión del incidente inflamatorio, incluido el desbridamiento endógeno TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 55 llevado a cabo con la ayuda de la fagocitosis. La reepitelización de la herida comienza a las pocas horas de producida la lesión, migrando las células epiteliales desde los bordes de la herida, con ulterior desplazamiento a partir de folículos pilosos y elementos procedentes de las glándulas sebáceas pero se intensifica durante esta mitosis rápida conforme emigran células a lo largo del nuevo puente de fibrina dispuesto. La migración epitelial continúa hasta que las células contactan entre sí, lo que produce inhibición por contacto e indica el fin de la expansión epitelial y el comienzo de la queratinización, transformándose dichas células epiteliales a su fenotipo no migratorio 45. El tejido granular que participa de forma esencial en este proceso de reparación, puede ser descrito como una primitiva y transitoria unidad hística que cierra la herida y hace las veces de base para la sucesiva epitelización. Tras haber cumplido con su cometido se va transformando paso a paso en tejido cicatricial. La denominación de tejido de granulación, como TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 56 apunta Romanelli 41 fue introducida por Billroth en el año 1865 y tal definición obedece a que durante el desarrollo del tejido pueden visualizarse en la superficie pequeños gránulos rosados y vítreotransparentes. A cada uno de estos pequeños gránulos corresponde un arbolillo vascular con cuantiosos y finos nudos capilares, como los que se originan durante la reconstitución vascular. Sobre los nudos se asienta el nuevo tejido. Al producirse una óptima granulación los gránulos se van agrandando con el paso del tiempo y aumentan también su número, de tal modo que finalmente se forma una superficie húmeda, brillante y de color rojo asalmonado. Este tipo de granulación es síntoma de una curación bien encaminada. En los casos de procesos de curación alterados o estancados, cuando la granulación se encuentra recubierta con costras pegajosas, presenta un aspecto pálido, fofo y poco consistente o tiene una coloración azulada 28. TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 57 3. Fase de remodelación o de contracción En esta fase de la reparación de las heridas, que ocurre aproximadamente entre el 6º y el 10º día, se produce el comienzo de la maduración de las fibras de colágeno. La herida se contrae, cada vez más, se reduce la presencia vascular y de agua en el tejido granular, por lo que aumenta su consistencia y se transforma finalmente en el tejido cicatricial, disminuyendo por otra parte el número de fibroblastos y macrófagos. Este proceso incluye la reconstitución de las células epidermales a través de la mitosis y la migración celular, principalmente desde los bordes de la herida 33. Durante esta última fase, la contracción de la herida 46 conduce, por medio de las substancias tisulares no destruidas, a que la zona de “reparación incompleta” se mantenga lo más reducida posible y las heridas cierren de forma espontánea 47. Los fibroblastos del tejido granular tienen una intervención mucho más decisiva en la contracción, ya que una vez finalizan sus actividades de secreción se TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 58 transforman tanto en fibrocitos como en miofibroblastos. Los miofibroblastos se asemejan a las células musculares lisas y, al igual que éstos, contienen actomiosina, una proteína muscular que hace posible las contracciones 32, 48 - 50. Hay autores como Van Winkle 51 que apuntan que la locomoción de fibroblastos se basa en la premisa de que el movimiento de fibroblastos individuales a través de la herida produce redisposición local de la matriz de tejido conectivo vecino. Lo más probable es que in vivo tengan lugar varios fenómenos y se combinen para causar la contracción de la herida necesaria para una cicatrización normal 32, 51. En la epitelización de la herida con pérdida de la epidermis, las células basales empiezan su diferenciación y migración, inicialmente formando una sola capa, el resto de capas se producen por mitosis. Esto se debe sobre todo a los factores de crecimiento epidérmico liberados por los macrófagos y plaquetas que inician éste proceso, pero dicho proceso es limitado y la muerte tisular lo retarda, es un proceso que puede demorar desde 3-5 días hasta meses o años. TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 59 Al comienzo se forma la primera capa y el resto se van produciendo por mitosis 11. Ya en una fase tardía, caracterizada por la síntesis proteica con formación de colágeno y matriz, encontramos que los fibroblastos han sido activados para producir factores de crecimiento. La producción de colágeno es iniciada por activación del factor de crecimiento estimulante de fibroblastos, dependiendo este hecho de varios factores, entre ellos la presencia de: hierro, Vitaminas C y A, Zinc, Cobre y O2. 12 La síntesis se realiza en el fibroblasto y la molécula luego de adquirir su estructura terciaria es liberada en forma de procolágeno. La producción de colágeno es máxima a las primeras dos semanas y alcanza el máximo de su depósito en 34 semanas. La matriz intersticial es producida por los fibroblastos y otras células. Los proteoglicanos (principal componente de la matriz) son compuestos de glucosaminoglicanos y proteínas. Esto hace que se produzca una matriz más rígida en los estadios iniciales de la cicatriz, con la maduración de la misma disminuye su concentración con la consiguiente pérdida de rigidez. TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 66 intensidad de la sensación dolorosa, siendo las heridas contusas más dolorosas que las incisas. Y por último, el umbral de dolor del paciente condiciona la percepción del dolor 54. Según la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor (IASP), “el dolor es una desagradable experiencia sensorial y emocional, asociada a un daño tisular real o potencial, que se describe en términos de dicho daño” 55. 1.7.- Limpieza de heridas Una fase del cuidado de las heridas que es algo consustancial en todas ellas es la limpieza de las mismas, por la aportación de hidratación colaborando en la curación por cura húmeda y minorando la colonización bacteriana por mecanismo de arrastre mecánico, por lo que tiene gran importancia. Torra y Bou 56, señala que el hecho de limpiar correctamente una herida va a tener una relación directa con la optimización de las condiciones necesarias para que esta cicatrice correctamente y que TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 67 disminuya el peligro de infección, ya que con la limpieza, se retiran microorganismos y material necrótico presentes en el lecho de la lesión. Una forma de valorar la evolución positiva de la herida, se establece midiendo su contorno, lo que nos da una medida del correcto funcionamiento de los procesos de cicatrización, que se traduce por un cierre continuado y en los plazos previstos 57. Varias instituciones valoran como fundamental la limpieza de las heridas como base de la evolución de las mismas, así la Agency for Health Care Policy and Research (AHCPR) 58, edita una Guía para el Tratamiento de heridas crónicas, en la que establece sobre la limpieza de las ulceras una serie de recomendaciones, adaptables y extensibles al resto de lesiones cutáneas, orientadas a reducir el trauma físico y químico que pueden representar las acciones de limpieza. A continuación se enumeran dichas recomendaciones. - Limpiar las heridas al principio del tratamiento y durante cada cambio de apósito. TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 68 - Utilizar la mínima fuerza mecanica al limpiar las heridas con gasas o esponjas. - No limpiar las heridas con productos limpiadores o agentes antisépticos, como por ejemplo: povidona yodada, yodoforos, soluciones de hipoclorito sódico, peroxido de hidrogeno y ácido acético. - Utilizar solución salina isotónica para limpiar las heridas. - Administrar el producto limpiador a una presión suficiente que no cause trauma en el lecho de la herida pero facilite el arrastre mecánico de los restos necróticos. Es tal vez la mas desconocida de estas recomendaciones, la que hace referencia a la no utilización de productos antisépticos, principalmente la povidona yodada, hipoclorito sódico, peroxido de hidrógeno y ácido acético, todos ellos de reconocida toxicidad y agresividad con los granulocitos, monocitos, fibroblastos y el tejido de granulación fundamentales todos ellos en el proceso de reparación de las heridas 59 - 66. TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 69 Por su parte el Grupo Nacional para el Estudio y Asesoramiento en Ulceras por Presión (GNEAUPP) 67 hace algunas recomendaciones para la limpieza en las úlceras cutáneas, entre otras las siguientes: - Limpie las lesiones inicialmente y en cada cura. - Utilice como norma suero salino fisiológico. - Use la mínima fuerza mecánica para la limpieza de la úlcera así como para su secado posterior. Use una presión de lavado efectivo para facilitar el arrastre de los detritus, bacterias y restos de curas anteriores pero, sin capacidad para producir traumatismos en el tejido sano. - La presión de lavado más eficaz es la proporcionada por la gravedad o por ejemplo la que realizamos a través de una jeringa de 35 ml. con una aguja o catéter de 0,9 mm. que proyecta el suero fisiológico sobre la herida a una presión de 2 kg/cm². Las presiones de lavado de la úlcera efectivas y seguras oscilan entre 1 y 4 kg/cm². - No limpie la herida con antisépticos locales (povidona iodada, clorhexidina, agua oxigenada, ácido TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 70 acético, solución de hipoclorito,...) o limpiadores cutáneos. Todos son productos químicos citotóxicos para el nuevo tejido y en algunos casos su uso continuado puede provocar problemas sistémicos por su absorción en el organismo 67. Ambas instituciones 59,67, hacen especial hincapié en la utilización de líquidos, en este caso el suero fisiológico, para la limpieza de las heridas, aportando por un lado hidratación a la misma, en la línea de cura en ambiente húmedo propugnada, colaborando en la curación por cura húmeda y por otro minorando la colonización bacteriana por mecanismo de arrastre mecánico 25. En este sentido, podemos decir que la limpieza apropiada de la herida puede remover bacterias, detritos celulares, restos de otras curaciones y reducir el exceso de exudado 68. Por otra parte, algunos autores se han preguntado si otros líquidos se comportan de la misma manera en la limpieza de las heridas. En el estudio de Fernández et al., 69 los autores pretendían comparar los efectos del agua con el suero salino y otras soluciones de limpieza TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 71 en el índice de curación y nivel de infección de las heridas agudas. Y entre los resultados destacan que la utilización de agua, agua destilada, agua hervida o suero fisiológico repercute positivamente en las heridas en tanto que disminuye la carga bacteriana que en ellas existe, elimina restos y cuerpos extraños, favoreciendo que el proceso de cicatrización pueda realizarse sin interferencias. Por otra parte, al comparar los distintos tipos de soluciones utilizadas, refieren que no existen diferencias significativas a favor de un producto u otro para la limpieza de las heridas, excepto desde el punto de vista económico, por lo que los resultados de los ensayos clínicos revisados en este estudio, no parecen que sean concluyentes en determinar qué producto es más efectivo, si el agua o el suero fisiológico, y cual de ellos tiene mayor influencia en la ausencia de complicaciones e infecciones 69, 70, resultados que refieren también otros autores 71, 72. Ni siquiera el uso de determinados antisépticos parece ser más eficaz que la limpieza con agua, en algunas lesiones, como las episiotomías. TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 72 Por lo que concluyen, que hay adecuada evidencia para recomendar la limpieza de las heridas agudas con agua del grifo, agua hervida, agua destilada o suero salino. Refiriendo que no existen datos que permitan recomendar como más eficaz en su utilización a ninguno de ellos sobre los otros, excepto por criterios económicos 70. Este aumento de costo, lo refieren otros autores al comparar los diferentes tratamientos que pueden implementarse en la curación de heridas, con lo que remarcan la importancia de elegir el producto idóneo y de menor valor al abordar el tratamiento 73 - 81. 1.8.- Contaminación de las heridas Todas las heridas crónicas contienen bacterias pero no es dicha presencia el único factor que interfiere en la cicatrización, sino el número de ellas y la interacción que tengan con el huésped. Existe un delicado equilibrio entre la resistencia del huésped y las distintas bacterias que determina la posibilidad de cicatrización de una herida 82 - 84. TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 73 Según Dow et al, 85 hay diversos estados por los que transita una herida en relación con la presencia de gérmenes, comenzando por: -Esterilidad: Estado ocasional en el que se puede encontrar una herida tras trauma térmico o durante la cirugía. Es la ausencia absoluta de gérmenes. O por el contrario valorando la presencia de bacterias en el lecho de una herida pudiendo de este modo manifestarse en cuatro categorías: 83,85,86 -Contaminación: Presencia de microorganismos (aunque no se multiplican). La gran mayoría de las heridas están contaminadas. En este caso, las defensas del huesped son capaces de eliminar los intentos de replicación y no hay signos clínicos, la mayoría de las heridas están en este estado -Colonización: Se produce multiplicación activa de microorganismos sin generar síntomas clínicos, no causan daño celular en el huésped por lo que no hay reacción del paciente (huésped), sino que funcionan como comensales sin alterar el proceso de cicatrización TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 74 -Colonización crítica: También denominada Infección local, es una fase de transición o de infección encubierta. Durante esta fase se presentan tenues síntomas de infección local, pudiendo aparecer también algunos signos y síntomas como son: retraso en la cicatrización, dolor, incremento del exudado seroso, cambios en el color del lecho y tejido de granulación friable. -Infección sistémica: Tiene lugar cuando se rompe el equilibrio entre la resistencia del huésped y las bacterias presentes en la herida, instaurándose una fase de invasión bacteriana y deterioro tisular provocado por la interacción de un agente infeccioso y un huésped susceptible, en el que resulta crucial la virulencia del germen. En este caso se evidencian signos y síntomas de infección, como son eritema, calor, edema, dolor, olor y supuración. Pudiendo cursar con fiebre, leucocitosis y/o neutrofilia 85. Entre los factores del huesped que favorecen la infección se encuentran entre otros: trastornos vasculares, diabetes, inmunodepresión, edema, TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 75 nutrición inadecuada, corticoides e inmunosupresores, radioterapia y abuso de alcohol 86. En el estudio de Cooper 87 valorando úlceras venosas de la pierna que no avanzaban hacia la curación, realiza un análisis de la flora colonizada dentro de la herida para evaluar el estado microbiológico, descubriendo una media de 5,8 unidades formadoras de colonias por úlcera, opinando que esa colonización influye de manera decisiva en el retardo cicatricial de las heridas, reflejando también que las complejas interacciones entre los pacientes y las especies microbianas que viven en las heridas aún no están completamente caracterizados. En estos casos está indicada la toma de muestra con hisopo, para evaluar a través del cultivo bacteriológico la presencia de bacterias en el lecho de la herida, que va a permitir diferenciar entre colonización e infección de la herida, haciendo un recuento del número de bacterias por gramo de tejido. TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 82 menor capacidad fibroblástica 90. Igualmente suelen padecer mayor acumulación de afecciones que interfieren el proceso curativo, como la diabetes, la arteriosclerosis, la hipoproteinemia y la hipovitaminosis C, que reducen la microcirculación, el oxigeno circulante y facilitan la infección que hace fracasar la reparación. En relación a la desnutrición e hipoproteinemia, un estado de desnutrición grave, la hipoproteinemia e hipoalbuminemia en los pacientes, retrasa el proceso reparativo de la herida, alargándose la fase de acumulación de materiales. Enfermedades asociadas. La obesidad, la desnutrición, la edad avanzada (más de 60 años), la isquemia, la vasculopatía periférica, el cáncer, la insuficiencia orgánica, la sepsis e incluso las limitaciones de la movilidad afectan a la cicatrización. La diabetes mellitus altera la cicatrización de las heridas en alrededor de un 10% de los pacientes 102, debido a que altera la función de los leucocitos y reduce la proliferación de fibroblastos y el depósito de colágena. TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 83 Por tanto, un elemento fundamental del tratamiento de las heridas consiste en corregir en la medida de lo posible las enfermedades subyacentes y concomitantes. Si la enfermedad subyacente no puede corregirse o es difícil de controlar 103, es posible que la cicatrización de la herida se demore. Administración de fármacos (hormonas). Cualquier fármaco que interfiera las vías que conducen a la reacción inflamatoria que termina en la producción de colágeno, puede afectar a la curación de la herida. Entre otras 104, cabe citar la administración de antiinflamatorios (esteroides o no), los anticoagulantes y las sustancias citotóxicas empleadas en el tratamiento de pacientes neoplásicos. Inhiben la inflamación, neoangiogénesis y producción de colágeno. La respuesta inmunoinflamatoria, repercute de manera negativa en la cicatrización y aumenta el riesgo de infección de la herida 105. TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 84 El proceso inflamatorio es una parte esencial de la cicatrización de la herida aguda, y se sabe que su alteración constituye una de las causas principales de la cronificación de las heridas 99, 106, 107. Estados carenciales de vitaminas A, C, E y K. En pacientes con hipovitaminosis C la probabilidad de que se produzca una dehiscencia en una herida, por fallo en la síntesis de colágeno, es 8 veces mayor que en un individuo normal, la vitamina A estimula la epitelización, la vitamina E se ha recomendado como estabilizadora de las cicatrices, la vitamina K es necesaria en la síntesis de factores de coagulación 108 - 111. Esencial también resulta la vascularización: La correcta oxigenación y perfusión tisular son necesarias para el mantenimiento de la integridad y el éxito en la reparación tisular 41. En síntesis, una gran variedad de factores, tanto intrínsecos como extrínsecos, pueden influir en la cicatrización de las heridas. Algunas de estas influencias ambientales pueden ser objeto de TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Introducción / 85 manipulación para lograr una cicatrización más rápida. En este sentido, todos los factores que influencian de una u otra manera, muchas veces no pueden ser eliminados, pero dada la repercusión que tienen en el normal desarrollo del proceso cicatricial de reparación de heridas, deben ser controlados para reducir la posibilidad de interferencia con el mismo 30. Justificación y Objetivos 22 TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Justificación y objetivos / 89 2.-JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 2.1. Justificación Con la finalidad de determinar la implicación de los productos de limpieza de heridas en la evolución de las lesiones cutáneas, nos planteamos la presente tesis doctoral. Teniendo en cuenta que los cuidados que se brindan a los pacientes portadores de heridas cutáneas, abarcan un amplio abanico de posibilidades que van desde la limpieza de la misma, con la utilización de diferentes productos clínicos, la utilización de otros productos como cremas, pomadas, etc., que combinadas con la utilización y el manejo de TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Justificación y objetivos / 90 diferentes apósitos, van a facilitar entre otras cosas los procesos de cicatrización precisos para la reparación de la forma más adecuada de los defectos de cobertura cutánea que presentan dichos pacientes 112, 113. Según Soldevilla 113, para un correcto tratamiento de las lesiones cutáneas, es preciso el riguroso cumplimiento de las medidas de limpieza, desbridamiento, desinfección, junto a la selección del apósito apropiado. Por otra parte, según refiere Alexandre 52, de todos los procesos que se instauran en el tratamiento para la resolución de las heridas, la limpieza y el lavado son fundamentales, ni una técnica adecuada de sutura ni la utilización de profilaxis antibiótica, puede sustituir a la limpieza y el lavado meticuloso. Sin embargo, la utilización de productos para esta limpieza y lavado, presenta un espectro de posibilidades de utilización no bien definido en los protocolos clínicos 114 - 116. La limpieza de las heridas, pretende reducir por el TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Justificación y objetivos / 91 proceso de arrastre mecanico su contenido de restos o detritus, pero por otra parte, también disminuir la colonización bacteriana, amén de aportar hidratación e iones en función de la fórmula utilizada. Debido a esta utilización, no bién protocolizada y muchas veces de forma rutinaria de los procedimientos de limpieza en todos los procesos de curas de heridas 117, es preciso revisar las directrices generales sobre la limpieza de heridas que incluyen como recomendaciones las principales asociaciones profesionales. Así encontramos que el Grupo Nacional para el Estudio y Asesoramiento en Ulceras por Presión (GNEAUPP), hace las siguientes recomendaciones de limpieza en las úlceras cutáneas: 67,118 “Limpie las lesiones inicialmente y en cada cura. Utilice como norma suero salino fisiológico”. Por otra parte, una revisión sistemática sobre la eficacia de las soluciones para limpieza de las heridas, 119,120 concluyó que el agua potable del grifo era una solución eficaz para la limpieza de heridas lacerantes o postoperatorias en adultos, si bien apuntan que esta TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Material y metodología / 99 3.-MATERIAL Y METODOLOGÍA Se realiza un estudio experimental para comprobar la influencia cicatricial de diversos productos de limpieza de heridas en el animal de laboratorio. Se pretende evaluar la relación existente entre diferentes productos de limpieza de heridas utilizados en la clínica con la influencia sobre la evolución cicatricial de los mismos, planteando tres fases, a saber: a) Ulcerometría planimétrica; con medición diaria de la superficie de las heridas TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Material y metodología / 100 b) Histológica; con valoración microscópica de las piezas cutáneas c) Microbiológica; evolución de la población de bacterias mesófilas, expresado en número de unidades formadoras de colonias (UFC) en las muestras tomadas. 3.1. Condiciones de trabajo Para este estudio experimental, se ha utilizado como animal de laboratorio la rata blanca, cepa Sprague Dawley adulta. Los animales fueron mantenidos en condiciones estándar de laboratorio con un ciclo luz - oscuridad 12:12, con comida y bebida ad libitum durante todo el experimento. La temperatura ambiental se mantiene entre 20-22C. Se procedió a anestesiarlos individualmente en cámara de metacrilato transparente, con atmósfera de éter y, a TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Material y metodología / 101 continuación, previa extracción del pelo con tijera, se les practica una herida cutánea de piel total en la región del dorso, con un punch quirúrgico desechable de 8 mm. de diámetro lo que nos proporciona una herida estándar con una superficie ( π x r2 ) de 50.26 mm2. Tras la realización de las heridas cutáneas eran colocadas en jaulas individuales para evitar que se lamieran entre ellas y con altura suficiente para impedir el roce de la herida con las mismas. Se realiza cada día la limpieza de las heridas, utilizando para cada grupo un producto de limpieza diferente. Para hacer este lavado, se han valorado las guías de práctica clínica aportadas por el GNEAUPP 67, 68, cuando recomienda un sistema de lavado apoyado en la presión de arrastre para eliminar detritus o bacterias, pero teniendo en cuenta que, en este caso, no nos interesa eliminar la flora bacteriana por métodos de arrastre, sino valorar la variación de esa flora en función de los diferentes productos utilizados, TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Material y metodología / 102 nos decantamos por un sistema de pulverización del producto para que el lavado, no sea una variable que afecte a la minoración de la flora. Así, cada producto, se introduce en un recipiente con un sistema de pulverización que se aplica a cada grupo de animales, presionando cuatro veces en cada ocasión para igualar la cantidad de producto depositado en la superficie de la herida en cada ocasión. Se aplica cada uno de ellos a un grupo distinto de animales, a los que hay que añadir el grupo control, al que no se le aplica ningún producto, por tanto tenemos cuatro productos y un grupo al que no se le realiza limpieza, contabilizando en total 5 grupos y cuatro productos, siendo los siguientes: 1.- Grupo Control 2.- Grupo Agua Destilada 3.- Grupo Suero Fisiológico 4.- Grupo Suero Glucosado 5.- Grupo Agua Oxigenada TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Material y metodología / 103 3.2. Ulcerometría Planimétrica Se trata de valorar el cierre de las heridas producidas, mediante medición de las superficies de las mismas cada día, hasta que se produce la reparación y cierre cutáneo. Para esta fase, se establecieron 5 grupos en el que se incluyen a 10 animales, distribuidos en 5 hembras y 5 machos, en cada uno de ellos resultando un total de 50 animales. A cada animal se le realiza una medición del contorno de la herida cada día. Teniendo en cuenta que los días necesarios para el cierre de las heridas es de unos 20 y a cada animal se le realiza una medición diaria, resultan un total aproximado de 1.000 mediciones. Para proceder a la medición de las mismas, después de revisar la bibliografía buscando un método sencillo y fiable, encontramos algunos que cumplen estos parámetros. TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Material y metodología / 104 Por un lado Chang 127, realiza un estudio con las áreas de 40 heridas para valorar dos métodos de medición, uno de ellos fotográfico, con cálculo del área de la herida a través de un software y por otra parte utilizando un método de reborde de la imagen de la herida en una película transparente de 2 capas (método Visitrak), con el que calcula el área de la herida, trasladando la imagen del contorno a través de un software (ImageJ®) de ordenador. Concluyendo que no hay diferencias estadísticamente significativas en la medición del área de la herida entre los dos métodos. Otros autores, como en el estudio de Jiménez et al 71, establecen una comparación entre la medición externa del alto y ancho de la herida a la que aplican un factor de corrección para hallar la superficie y la utilización de un ulcerómetro® 57 que consta de 2 capas, una película transparente de acetato y un papel milimetrado, que permite al posicionarlo sobre la herida rebordear su contorno y medir su superficie, retirando el papel al terminar de reflejar el contorno de la herida, quedando la imagen rebordeada en el acetato, lo que permite su medición posterior, TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Material y metodología / 105 quedando el contorno de la imagen para valorar su evolución, no entrando este material en contacto directamente con la herida al hacer las mediciones, y en este caso al igual que en el estudio anterior, no encontrando diferencias significativas entre uno y otro método. Por lo que nos decantamos para realizar la medición de la evolución del contorno de las úlceras cutáneas, por la utilización del modelo de utilidad patentado “ulcerómetro® de Jiménez y Chacón” 57, que nos permite obtener una imagen de la superficie de la herida, que permanece en el soporte de acetato para su posterior medición de las variaciones diarias de la extensión de las lesiones ulcerativas quedando además una prueba gráfica de la evolución de la misma. Para estudiar si se producían diferencias significativas respecto al cierre evolutivo de la superficie de las úlceras cutáneas, durante el tiempo de evolución cicatricial de las lesiones entre los diez grupos de animales, teniendo en cuenta el sexo y los cuatro tratamientos considerados más el grupo control, se TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Material y metodología / 106 utilizó el modelo de medidas repetidas con efectos mixtos, considerando los dos factores de variación (tipo de tratamiento asignado y sexo del animal) como variables independientes y como variable respuesta o dependiente, la superficie de las úlceras cutáneas. Dada las características de los datos fue necesario procesar el análisis estadístico de los mismos con el software libre R (versión R-2.11.1). En este caso se pretende contrastar si cada uno de los factores (tratamiento, sexo) afectaba a la variable respuesta (superficie de las úlceras cutáneas) por separado y si la interacción entre ambos modifica dicho efecto. Se tomó como nivel de significación  ≤ 0.05 128, 129. 3.3. Histología En este caso, se pretende evaluar la “calidad” de la cicatrización de la herida, mediante la valoración de la pieza histológica teniendo en cuenta en este caso, no el tamaño de cierre de superficie de la úlcera, sino los elementos celulares que entran a formar parte de la cicatrización de la misma TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Material y metodología / 107 Para esta parte del estudio, se obtuvieron piezas de piel total, con margen de seguridad, de las lesiones cutáneas producidas previamente, a las 72 horas, una semana y dos semanas del inicio del experimento. Se utilizaron 20 animales, dos animales por cada grupo, uno de cada sexo para realizar las tres tomas de muestra referenciadas, en la última a las dos semanas, se toman de los dos últimos animales (de cada grupo) utilizados para la planimetría. Por lo tanto, si a estos primeros 20 les añadimos estos otros 10, resultan un total de 30 animales, a los cuales se realiza la toma de muestras para Histología. Las piezas se fijaron en formaldehído al 10% y fueron incluidas en un bloque de parafina. Para su valoración microscópica, fueron cortadas con microtomo en muestras micrométricas de 5µ, para la coloración se utiliza la tinción de hematoxilina-eosina. El estudio histológico fue realizado sistemáticamente en todos los grupos de acuerdo con los hallazgos referidos a la herida como: aproximación de los TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Material y metodología / 114 requisitos exigidos a trabajos de investigación con animales de laboratorio (normativa europea, española y canaria). De la Comunidad Europea, la Directiva 2010/63/UE 132 , publicada el 20 de octubre de 2010, relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos. Con ella queda derogada la que, desde el año 1986 y hasta ahora, ha servido de base normativa en este área (Directiva 86/609/CEE). Del Estado español, la Ley 32/2007 133, de 7 de noviembre, para el cuidado de los animales, en su explotación, transporte, experimentación y sacrificio. Y de la Comunidad Autónoma Canaria, se ha tenido en cuenta el Decreto 117/1995 134, de 11 de mayo, por el que se aprueba el Reglamento de la Ley 8/1991, de 30 de abril, de Protección de los Animales y se desarrollan otros aspectos relacionados con los mismos (BOC 062; 19-05-1995). Por otra parte, se ha solicitado y obtenido el permiso para la realización del experimento del Comité de Ética de Experimentación Animal de la Universidad de Las TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Material y metodología / 115 Palmas de Gran Canaria, que se creó con los objetivos de protección del bienestar de los animales de experimentación, el respeto de los principios y compromisos bioéticos asumidos por la comunidad científica y para obtener resultados experimentales fiables y de alta calidad. Comité a quién se realizó la petición, describiendo los puntos principales del experimento y obteniendo respuesta positiva en oficio firmado por su presidente. Así mismo, al final de cada tipo de análisis efectuado (planimétrico, microbiológico e histológico) y dada la inocuidad de los productos clínicos aplicados, se han mantenido a los animales vivos en el estabulario, siendo el personal técnico del mismo el que le ha asignado su destino correspondiente en la cadena biológica. Resultados 44 TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 119 4.-RESULTADOS: ANÁLISIS ESTADÍSTICO 4.1. Ulcerometría Planimétrica. Se presentan los datos relativos al cierre evolutivo de la superficie de las úlceras cutáneas, durante el tiempo de evolución cicatricial de las lesiones, entre los diez grupos de animales, teniendo en cuenta el sexo y los cuatro tratamientos considerados, así como el grupo que sirvió de control en el presente estudio. Como se comentó en la parte metodológica, dada la agrupación de los datos, se realiza el análisis estadístico de los mismos con el software libre R (versión R-2.11.1). Contrastando cada uno de los factores (tratamiento, sexo) con su afectación a la TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 120 variable respuesta (superficie de las úlceras cutáneas) por separado y si la interacción entre ambos modifica dicho efecto. Se toma como nivel de significación  ≤ 0.05. Resultados Estadísticos De los 50 animales iniciales, tres se quedan fuera de esta parte del estudio, ya que el animal numerado con el nº 47 falleció el cuarto día de observación, así como los animales nº 28 y nº 32 por tener unas superficies iniciales muy superiores al resto, sin embargo si se utilizan para las otras dos tomas de muestra de que consta este estudio, a saber Microbiología e Histología. Resultando un total de n = 47 x 20 = 940 mediciones. En la Figura 1 se muestran en gráfico las nubes de puntos, de la superficie de la úlcera frente al número de días transcurridos hasta el cierre total de la herida, de cada una de los 47 animales considerados en esta parte del estudio, superpuesta en cada nube de puntos aparece una línea de ajuste obtenida mediante regresión polinómico local. TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 121 Figura 1 A la vista del resultado obtenido proponemos un modelo matemático de la dinámica de cicatrización de la herida, es decir, una expresión matemática que permita describir el cambio de tamaño de la herida, o superficie de la misma, con respecto al tiempo. Teniendo en cuenta el trabajo desarrollado por Cukjati et al, 129 que describe varios modelos matemáticos de posibles funciones que se pueden ajustar al cierre de TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 122 heridas, planteamos el siguiente modelo con tres parámetros que describimos a continuación: Consideramos de este modo un modelo global no lineal para la superficie de la úlcera cutánea que queda por cerrar (S(d)) que depende del número de días (d) transcurridos hasta el cierre total de la herida, siendo los parámetros S0 = “Superficie inicial de la herida”, d75 = “día en que la superficie de la herida ha cerrado un 75% de la superficie inicial”, en cuanto al parámetro  sabemos que la función dada tiene como valor el de la pendiente en el día en el que la superficie de la herida se ha cerrado un 75% de la superficie inicial: 75 30 '( 75) · 4· 16 75 d Se Sd d           lo que nos lleva a considerar  como un elemento que permite valorar la velocidad de cierre de la herida en d75. 75 (75) 175 375 ( ) 0· ( ; 75, , 0) 1 3 d dd dd e d Sd S f dd S e            TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 123 La ventaja de utilizar un modelo no lineal generalmente es porque se usa un menor número de parámetros respecto a un modelo polinómico lo que permite obtener una descripción de los datos más parsimoniosa es decir con menos dispersión. Asimismo, los modelos no lineales también proporcionan predicciones más fiables para la variable respuesta fuera del rango observado de los datos de lo que lo harían los modelos polinomiales. En la Tabla 1 se muestra la salida de resultados obtenida con el software R mediante el procedimiento de mínimos cuadrados no lineal (nls: nonlinear least squares) en la que figuran los valores estimados de los parámetros, que resultan altamente significativos (pvalue = 2e-16 < 0.001), para el modelo considerado: S(d) =f(d;d75,  ,S0)+  con   N(0,  ) () TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 130 lineal (nlme: nonlinear mixed-effects). En ésta Figuran los valores estimados de los parámetros, que resultan significativos en los tres casos (p-value < 0.001). Modelo 1. Modelo de efectos mixtos, sin efectos fijos Parameter Estimate Std. Error DF t-value pvalue S0 45.24426 1.05288 891 42.9717 0.000 d50 6.45821 018123 891 35.6354 0.000  -0.38959 0.02424 891 -16.0694 0.000 ˆ1.8387   Tabla 2 Siendo las desviaciones típicas estimadas ˆ6.7305 S  ,ˆ1.2068 d  ,ˆ0.1409    y la desviación típica del residuo del modelo 1 ˆ1.8387   (inferior a la desv. típica obtenida con el procedimiento nls de la Tabla 1). En la Figura 5 se representa para cada animal la nube de puntos de la superficie de la úlcera cutánea a lo largo de los 20 días de observación con la línea de TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 131 ajuste obtenida mediante regresión polinómico local (en color rojo), junto con la estimación del modelo de efectos mixtos no lineal, sin efectos fijos (en color azul). Figura 5 Modelo 2. Modelo mixto con efectos fijos debido a los factores sexo y tipo de tratamiento En este caso planteamos el modelo mixto con efecto fijo debido a los factores tipo de tratamiento administrado TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 132 y sexo del animal y la interacción entre los mismos, quedando así la expresión de los parámetros: 75 * 75 dtsxtsxd d       , con  d  N(0,  d) *tsxtsx           , con    N(0,   ) siendo t =1,2,..., 5; sx =1,2. En la Figura 6 se muestran las trayectorias de la superficie de cicatrización de la úlcera cutánea de cada animal diferenciada por sexo: Figura 6 TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 133 Asimismo, en la Figura 7 puede observarse la evolución de la superficie de cicatrización de la úlcera cutánea de cada animal según el tipo de tratamiento administrado. Figura 7 Utilizando el procedimiento ANOVA, se contrasta el modelo 1 de efectos mixtos sin efectos fijos (Tabla 2) frente al modelo 2 teniendo en cuenta el efecto fijo debido al sexo, tipo de tratamiento y la interacción TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 134 entre ambos. La salida de resultados, se concreta en la Tabla 3, donde se comprueba que únicamente el factor tipo de tratamiento afecta significativamente al parámetro d75. Concluimos, por tanto, que la variación de la superficie de cicatrización de la úlcera cutánea a lo largo del tiempo hasta el cierre total depende únicamente del tratamiento asignado al animal. Modelo 2. ANOVA con 2 factores: Sexo y Tipo de Tratamiento Num DF Den DF F-value p-value Resultado S0. (Intercept) 1 873 2320.2850 <0.0001 Signif. d75. (Intercept) 1 873 1928.9740 <0.0001 Signif. d75. tratamiento 4 873 5.9924 0.0001 < 0.05 Signif. d75.sexo 1 873 0.3676 0.5445 > 0.05 NS d75.trat:sex o 4 873 0.9067 0.4594 > 0.05 NS . (Intercept) 1 873 323.4041 <0.0001 Signif. . tratamiento 4 873 2.2888 0.0582 > 0.05 NS .sexo 1 873 2.1307 0.1447 > 0.05 NS TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 135 Tabla 3 En la Figura 8 se representan las trayectorias de la superficie de cicatrización de la úlcera cutánea de cada animal por sexo y para cada uno de los 4 tipos de tratamiento y el grupo control. Figura 8 Asimismo, en la Tabla 4 se muestran los resultados obtenidos con el procedimiento ANOVA que nos permiten decir que el modelo 2 (Modelo mixto con efectos fijos debido al sexo y tipo de tratamiento) . tratamiento: sexo 4 873 0.6532 0.6247 > 0.05 NS TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 136 resulta significativamente mejor que el modelo 1 (Modelo mixto sin efectos fijos) (p-valor =0.024 < 0.05). Model 1 2 df 7 25 AIC 4204.961 4209.277 BIG 4238.882 4238.882 logLik -2095.481 -2079.639 Test 1 vs 2 Test 31.635 Test 0.024 Tabla 4 Modelo 3: Modelo mixto con efectos fijos debido sólo al tipo de tratamiento, considerando  independiente de ambos factores Teniendo en cuenta los resultados obtenidos (Tabla 3) que permiten concluir que la variable respuesta no depende del sexo del animal, en este caso realizamos la estimación de los parámetros mediante el modelo 3 considerando: TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 137 75 75 dtd d    , con  d  N(0,  d) t       , con    N(0,   ) siendo t =1,2,..., 5; sx =1,2. Utilizando el procedimiento ANOVA obtenemos los resultados de la Tabla 5 que nos permiten decir que el modelo 3 (Modelo mixto con efectos fijos debido al tratamiento) respecto al modelo 2 (Modelo mixto con efectos fijos debido al tratamiento y sexo) no difiere significativamente (p-valor = 0.5742 > 0.05), es decir, ambos resultan equivalentes, de modo que a partir de ahora consideramos el modelo 3. Model 2 3 df 25 15 AIC 4209.277 4197.838 BIG 4238.882 4197.838 logLik -2079.639 -2983.919 Test 2 vs 3 Test 8.56091 Test 0.5742 Tabla 5 TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 138 En la Tabla 6 se muestran los resultados del procedimiento ANOVA que demuestra, además, que el modelo 3 (Modelo mixto con efectos fijos debido al tratamiento) resulta significativamente (p-valor =0.0032 < 0.05) mejor que el modelo 1 (Modelo mixto sin efectos fijos). Modelo 3 1 df 15 7 AIC 4197.838 4204.961 BIG 4197.838 4238.882 logLik -2983.919 -2095.481 Test 3 vs1 Test 23.1226 Test 0.0032 Tabla 6 En la Tabla 7 se presentan los resultados del procedimiento ANOVA para el modelo 3 resultando significativos los valores estimados, y en particular, el efecto del tipo de tratamiento sobre el parámetro d75. TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 139 Tabla 7 Siendo las desviaciones típicas estimadas ˆ6.7871 S   , ˆ0.9912 d  , ˆ0.1273    y la desviación típica del residuo del modelo 3 ˆ1.8381   (similar a la desv. típica obtenida para el modelo 1). En la Figura 9 se muestra la evolución de la superficie de la úlcera cutánea, S(d), para cada tipo de tratamiento. Modelo 3. ANOVA con el factor tipo de tratamiento Parámetros Num DF Den DF F-value p-value Resul -tado S0 1 883 2264.4930 <0.0001 Signif. d75. (Intercept) 1 883 1807.7818 <0.0001 Signif. d75.trat 4 883 5.5932 0.0002 < 0.05 Signif. theta. (Intercept) 1 883 298.3450 <0.0001 Signif. .trat 4 883 1.9908 0.0939 NS ˆ1.8381   TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 146 Contraste de Levene sobre la igualdad de las varianzas errora F Gl1 Gl2 Significación B_Inicio B_3 días B_7 días B_10 días B_14 días 1,662 1,164 3,657 3,204 8,093 9 9 9 9 9 39 39 39 39 39 ,132 ,345 ,002 ,005 ,000 Contrasta la hipótesis nula de que la varianza error de la variable dependiente es igual a lo largo de todos los grupos. a. Diseño: Intersección+Sexo+Tratamiento+Sexo* Tratamiento Diseño intra sujetos: Tiempo Tabla 10 Las Figuras 10 y 11 corresponden a los “diagramas de caja y bigotes” que permiten apreciar la dispersión de los niveles de flora microbiana (al inicio, a los 3, 7 10 y 14 días) entre sexos y entre tipos de tratamiento TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 147 Sexo del animal HembraMacho 8 6 4 2 0 1 19 1 35 34 36 38 48 B_14 días B_10 días B_7días B_3 días B_Inicio Figura 10 Tipo de tratamiento Agua OxigenadaSuero GlucosadoSuero FisiológicoAgua DestiladaGrupo Control 8 6 4 2 0 Hembra Hembra Hembra Hembra Macho Hembra Hembra Hembra Macho B_14 días B_10 días B_7días B_3 días B_Inicio Figura 11 TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 148 Los resultados de la prueba de Mauchly, que permite contrastar la hipótesis nula de que la matriz de covarianza error de la variable dependiente transformada es proporcional a una matriz identidad, ha resultado significativa (p-valor < 0.05), de modo que los datos no satisfacen el supuesto de esfericidad. En este caso, consideramos la alternativa del análisis multivariado (Tabla 11). Contrastes multivariados c ,677 18,821a4,000 36,000 ,000 ,323 18,821a4,000 36,000 ,000 2,091 18,821a4,000 36,000 ,000 2,091 18,821a4,000 36,000 ,000 ,366 ,981 16,000 156,000 ,480 ,669 ,973 16,000 110,619 ,491 ,444 ,957 16,000 138,000 ,507 ,258 2,515b4,000 39,000 ,057 ,021 ,189a4,000 36,000 ,942 ,979 ,189a4,000 36,000 ,942 ,021 ,189a4,000 36,000 ,942 ,021 ,189a4,000 36,000 ,942 ,500 1,394 16,000 156,000 ,151 ,530 1,598 16,000 110,619 ,081 ,831 1,792 16,000 138,000 ,038 ,759 7,403b4,000 39,000 ,000 Traza de Pillai Lambda de Wilks Traza de Hotelling Raíz mayor de Roy Traza de Pillai Lambda de Wilks Traza de Hotelling Raíz mayor de Roy Traza de Pillai Lambda de Wilks Traza de Hotelling Raíz mayor de Roy Traza de Pillai Lambda de Wilks Traza de Hotelling Raíz mayor de Roy Efecto Tiempo Tiempo * Tratamiento Tiempo * Sexo Tiempo * Tratamiento * Sexo Valor FGl de la hipótesis Gl del error Significación Estadístico exacto a. El estadístico es un límite superior para la F el cual ofrece un límite inferior para el nivel de significación. b. Diseño: Intersección+Tratamiento+Sexo+Tratamiento * Sexo Diseño intra sujetos: Tiempo c. Tabla 11 TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 149 En la que observamos que la evolución del número de gérmenes a lo largo del tiempo no depende significativamente del tipo de tratamiento aplicado, ni del sexo del animal. Sin embargo, llama la atención el resultado obtenido con respecto a la asociación entre la evolución de la flora microbiana y la interacción sexo*tratamiento. Se muestran, a continuación, las gráficas de la evolución a lo largo del tiempo de la variable Flora Microbiana y la transformada Log10(1 + flora Microbiana), según el tipo de tratamiento: reflejadas en las Figuras 12 y 13 Figura 12 Tiempo 14Días10Días7Días3DíasINI Medias marginales estimadas (FB) 10000000 8000000 6000000 4000000 2000000 0 Agua Oxigenada Suero Glucosado Suero Fisiológico Agua Destilada Grupo Control Tipo de tratamiento TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 150 Tiempo 14Días10Días7Días3DíasINI Medias marginales estimadas (Log(1+FB)) 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 Agua Oxigenada Suero Glucosado Suero Fisiológico Agua Destilada Grupo Control Tipo de tratamiento Figura 13 Para cada sexo: reflejadas en las Figuras 14, 15, 16 y 17 Tiempo 14Días10Días7Días3DíasINI Medias marginales estimadas(FB) 12000000 10000000 8000000 6000000 4000000 2000000 0 Agua Oxigenada Suero Glucosado Suero Fisiológico Agua Destilada Grupo Control Tipo de tratamiento Sexo del animal = Macho Figura 14 TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 151 Tiempo 14Días10Días7Días3DíasINI Medias marginales estimadas(Log(1+FB)) 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 Agua Oxigenada Suero Glucosado Suero Fisiológico Agua Destilada Grupo Control Tipo de tratamiento Sexo del animal = Macho Figura 15 Figura 16 Tiempo 14Días10Días7Días3DíasINI Medias marginales estimadas (FB) 10000000 8000000 6000000 4000000 2000000 0 Agua Oxigenada Suero Glucosado Suero Fisiológico Agua Destilada Grupo Control Tipo de tratamiento Sexo del animal= Hembra TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 152 Tiempo 14Días10Días7Días3DíasINI Medias marginales estimadas(Log(1+FB)) 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 Agua Oxigenada Suero Glucosado Suero Fisiológico Agua Destilada Grupo Control Tipo de tratamiento Sexo del animal = Hembra Figura 17 A continuación se muestran las gráficas de la evolución (Figura 18) a lo largo del tiempo de la variable Flora Microbiana y la transformada Log10(1 + flora Microbiana) para cada uno de los 49 animales observados. TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 153 Figura 18 Se presentan seguidamente, las gráficas de la evolución de la flora microbiana de cada animal según sexo y tipo de tratamiento (Figuras 19 y 20). TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 154 Se superpone en color negro y con trazos discontinuos las medias de cada producto a lo largo de los distintos días de observación. Machos Figura 19 TESIS DOCTORAL: RODRIGO CHACÓN FERRERA Resultados / 155 Hembras Figura 20 Se puede apreciar la variabilidad de la flora encontrada en cada animal, diferenciado por grupo de tratamiento y por sexo.