Epidemiología clínica y molecular de la tripanosomosis animal por Trypanosoma evansi en Canarias

UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA Departamento de Patología Animal, Producción Animal Bromatología y Tecnología de los Alimentos t +34 928 451 099 +34 928 451 137 f +34 928 451 142 e-mail [email protected] www.ulpgc.es Edificio de Veterinaria Campus U. De Montaña Cardones 35413 Arucas – Las Palmas Anexo I D. MIGUEL BATISTA ARTEAGA, SECRETARIO DEL DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA ANIMAL, PRODUCCIÓN ANIMAL, BROMATOLOGÍA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA, CERTIFICA, Que el Consejo de Doctores del Departamento toma el acuerdo de dar el consentimiento para su tramitación a la tesis doctoral titulada ”Epidemiología clínica y molecular de la tripanosomosis animal por Trypanosoma evansi en Canarias” presentada por el doctorando D. Noé F. Rodríguez González y dirigida por los Dres. D. Carlos J. Gutiérrez Cabrera, D.ª María Teresa Tejedor Junco y D.ª Margarita González Martín. Y para que así conste, y a efectos de los previsto en el artº 5 del Reglamento para la Elaboración, Tribunal, Defensa y Evaluación de Tesis Doctorales de la Universidad de las Palmas de Gran Canaria, firmo la presente en Arucas, a 23 de noviembre de dos mil once. PROGRAMA DE DOCTORADO EN CLÍNICA E INVESTIGACIÓN TERAPÉUTICA DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA ANIMAL, PRODUCCIÓN ANIMAL, BROMATOLOGÍA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS TESIS DOCTORAL “Epidemiología clínica y molecular de la tripanosomosis animal por Trypanosoma evansi en Canarias” Doctorando Noé F. Rodríguez González Directores Carlos J. Gutiérrez Cabrera Mª Teresa Tejedor Junco Margarita González Martín Las Palmas de Gran Canaria, a 9 de noviembre 2011 Carlos J. Gutiérrez Cabrera, Profesor Titular del Área de conocimiento de Medicina y Cirugía Animal del Departamento de Patología Animal, Producción Animal y Tecnología de los Alimentos de la Universidad de las Palmas de Gran Canaria, y Mª Teresa Tejedor Junco y Margarita González Martín, Profesoras Titulares del Área de conocimiento de Microbiología del Departamento de Ciencias Clínicas de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. INFORMAN: Que D. Noé F. Rodríguez González, Licenciado en Veterinaria por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, ha realizado bajo nuestra dirección y asesoramiento el presente trabajo de tesis doctoral titulado: “Epidemiología clínica y molecular de la tripanosomosis animal por Trypanosoma evansi en Canarias” El cual reúne las condiciones exigidas por la legislación vigente para su presentación con el fin de optar al grado de Doctor en Veterinaria. Y para que así conste a los efectos oportunos, firmamos en Arucas (Las Palmas) a 9 de noviembre de 2011. Fdo. Dr. Carlos J. Gutiérrez Cabrera Fdo. Dra. Mª Teresa Tejedor Junco Fdo. Dra. Margarita González Martín “Ninguna fuerza abatirá tus sueños, porque ellos se nutren con su propia luz. Se alimentan de su propia pasión. Renacen cada día para ser” Atahualpa Yupanqui A mi abuelo Pedro. A mis padres. A mi hermana. Al resto de mi familia y a esos familiares con los que no comparto sangre, pero sí el músculo que la bombea, mis amigos. A todos ellos, porque conocen el sacrificio que ha supuesto este camino, por ser el aliento para seguir luchando y porque me permiten definirme como la persona que soy, no más que una amalgama de vivencias compartidas. Abreviaturas de uso común: ADN ADNk Ag-ELISA BCM CATT/T. evansi ELISA IFI IgGELISA MHCT OIE OMS pb PCR RoTat 1.2 VCM VSG Acido desoxirribonucleico Acido desoxirribonucleico kinetoplástido Enzimainmunoensayo para detección de antígenos Método de la capa leucocitaria Test de aglutinación sobre tarjeta para Trypanosoma evansi. Enzimainmunoensayo Inmunofluorescencia indirecta Enzimainmunoensayo para detección de inmunoglobulinas G. Método de concentración del microhematocrito o técnica de Woo Organización Internacional de Epizootias Organización Mundial de la Salud Pares de bases Reacción en cadena de la polimerasa Rode Trypanozoon antigen type 1.2 Volumen corpuscular medio Glicoproteínas variables de superficie Índice I Página I. INTRODUCCIÓN Y JUSTIFICACIÓN 1 II. OBJETIVOS 11 III. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 15 1. HISTORIA Y EVOLUCIÓN DE Trypanosoma evansi 17 1.1. Historia del término Trypanosoma evansi: sinonimias 17 1.2. Historia del término “surra”: sinonimias 18 1.3. Evolución de Trypanosoma evansi 19 1.4. Distribución geográfica de Trypanosoma evansi 20 1.5. Reseñas históricas de los camellos (Camelus dromedarius) en Canarias. 22 1.6. Situación actual de la surra desde la óptica del comercio internacional de animales 24 1.7. Situación actual de Trypanosoma evansi desde la óptica de la salud pública: potencial zoonótico 25 2. TAXONOMÍA DE Trypanosoma evansi 27 2.1. Sistemática tradicional de Trypanosoma spp. 27 2.2. Sistemática actual de Trypanosoma spp. 27 2.3. Clasificación de los tripanosomas de importancia veterinaria y médica que afectan a mamíferos 29 3. MORFOLOGÍA DE Trypanosoma evansi 31 3.1. Generalidades 31 3.2. Flagelo 31 3.3. Periplasto y envoltura de glicoproteínas 32 3.4. Citoesqueleto 33 3.5. Citoplasma 33 4. CICLO DE Trypanosoma evansi 36 Índice II 4.1. Formas de transmisión de Trypanosoma evansi 36 4.1.1. Transmisión por picadura de vectores mecánicos 36 4.1.2. Transmisión por mordedura por Desmodus rotundus 37 4.1.3. Transmisión vía oral 37 4.1.4. Transmisión iatrogénica 38 4.1.5. Transmisión vertical 38 4.1.5.1. Transmisión transplacentaria 38 4.1.5.2. Transmisión lactógena 39 4.2. Insectos vectores principales de Trypanosoma evansi. Situación en Canarias 39 4.2.1. Géneros Tabanus y Atylotus 39 4.2.2. Género Stomoxys 42 4.2.3. Género Haematobia (Lyperosia) 44 4.3. Papel de otros insectos en la epidemiología de Trypanosoma evansi 45 4.3.1. Género Hippobosca 45 4.3.2. Otros insectos 46 4.4. Animales hospedadores potenciales de Trypanosoma evansi 46 5. PATOLOGÍA DE LA INFESTACIÓN POR Trypanosoma evansi 51 5.1. Manifestaciones clínicas 51 5.1.1. Generalidades 51 5.1.2. Manifestaciones clínicas en camélidos 52 5.1.3. Manifestaciones clínicas en equinos 53 5.1.4. Manifestaciones clínicas en especies rumiantes ganaderas 54 5.1.5. Manifestaciones clínicas en carnívoros domésticos 56 Índice III 5.1.6. Manifestaciones clínicas en otras especies animales 56 5.1.7. Confusiones clínicas con otros tripanosomas patógenos distintos de T. evansi 59 5.1.7.1. Trypanosoma lewisi 59 5.1.7.2. Trypanosoma theileri 59 5.1.7.3. Trypanosoma vivax 60 5.1.7.4. Trypanosoma equiperdum 60 5.1.7.5. Trypanosoma spp. con estrictas especificidades geográficas 60 5.2. Hallazgos laboratoriales 61 5.2.1. Hematología 61 5.2.1.1. Hematología. Alteraciones de la serie roja 61 5.2.1.1.1. Camélidos 61 5.2.1.1.2. Equinos 62 5.2.1.1.3. Carnívoros domésticos 63 5.2.1.1.4. Especies rumiantes ganaderas 64 5.2.1.2. Hematología: Alteraciones de la serie blanca 64 5.2.1.2.1. Camélidos 65 5.2.1.2.2. Equinos 65 5.2.1.2.3. Carnívoros domésticos 65 5.2.1.2.4. Especies rumiantes ganaderas 66 5.2.2. Alteraciones bioquímicas 67 5.2.2.1. Proteínas séricas totales: Albumina y globulinas 67 5.2.2.2. Enzimas 68 5.2.2.3. Bilirrubina, índice ictérico 69 I. INTRODUCCIÓN Y JUSTIFICACIÓN Introducción y justificación 3 Trypanosoma evansi es el tripanosoma animal patógeno de más amplia distribución mundial y afecta a especies ganaderas en Asia, África y América Central y del Sur (Luckins y Dwinger, 2004), produciendo una enfermedad denominada surra. Hace más de veinticinco años se describieron en Europa dos casos de infestación por T. evansi en una capibara y un perro tras ser importados desde Sudamérica y Nepal respectivamente (Kageruka y Mortelmans, 1971; Hellebrekers y Slappendel, 1982), sin haberse notificado información posterior. La primera descripción en Europa de tripanosomosis producida por este protozoo en ganado fue realizada por nuestro equipo de investigación en el año 1997 en Gran Canaria, en un dromedario (Camelus dromedarius) procedente del noroeste africano, realizándose el diagnóstico tres años después de haber sido importado. Tras el diagnóstico, el animal fue tratado en estado agónico con Naganol –Bayer® Lab.-, produciéndose remisión de la parasitemia a las 24 horas, pero sin observarse recuperación total, produciéndose la muerte un mes después (Gutiérrez et al., 1998). La primera referencia histórica sobre el dromedario en las Islas, conocido como camello, data del año 1405, procedente del continente africano acompañando las primeras expediciones de los moriscos apresados por Juan de Bethencourt primero y luego por Diego García de Herrera a lo largo del siglo XV en la cercana costa africana, durante la conquista de las Islas por los castellanos (Fabelo, 2008). Desde entonces, las islas han importado animales desde África hasta el momento de la adopción de la nueva normativa en materia de sanidad animal, tras la inclusión de España en la UE. La primera descripción de tripanosomosis en dromedario en el vecino país de Marruecos la realizó Bouin a principios del siglo pasado (citado por Atarhouch et al., 2003). Tras el diagnóstico del primer caso de T. evansi en un dromedario en la isla de Gran Canaria, nuestro equipo realizó estudios de prevalencia en la ganadería camellar de las Islas. La seroprevalencia fue de un 9% mediante IgG-ELISA, oscilando desde un 7,5% en la isla de Tenerife hasta un 10% en la isla de Gran Canaria (Molina et al., 2000). Utilizando CATT/ T. evansi (Card Direct Agglutination Test; Institute of Tropical Medicine, Antwerp, Belgium), la seroprevalencia fue de un 4,8%, oscilando desde 7,1% en la isla de Lanzarote hasta 0% en la isla de Tenerife (Gutiérrez et al., 2000). Estos Introducción y justificación 4 valores de seroprevalencia se situaron por debajo de los observados en Marruecos y Mauritania (Dia et al., 1997a, Atarhouch et al., 2003). Los dromedarios de las Islas Canarias que fueron diagnosticados fueron aislados y tratados con tripanocidas específicos para T. evansi (Naganol® y Cymelarsan®), pero se observó la reaparición de T. evansi en el año 2002, asociada a un foco de abortos y alta mortalidad neonatal. Hasta ese momento no se habían realizado campañas terapéuticas masivas, pero se establece su recomendación en la población de dromedarios como medida preventiva o terapéutica, de cara a controlar o lograr una eventual erradicación de la enfermedad (Gutiérrez et al., 2005). A pesar de no existir un censo oficial para Camelus spp. en Canarias, se ha estimado en aproximadamente 2000 cabezas (Gutiérrez et al., 2005). Actualmente, Gran Canaria es la única isla afectada por esta enfermedad. No ha sido posible controlarla en un área limitada con aproximadamente 200 dromedarios, a pesar de haberse ejercido medidas sanitarias similares a otras zonas del Archipiélago, donde actualmente se consideran libres de la enfermedad. Se han propuesto al respecto dos hipótesis que expliquen estas observaciones: por un lado la pérdida de eficacia del tratamiento con Cymelarsan® y subsecuente reaparición de la enfermedad, o la presencia de reservorios de la enfermedad en las áreas afectadas y subsecuente reinfestación (Gutiérrez et al., 2010). El foco principal de atención de esta tesis doctoral se centra en evaluar esta última posibilidad y complementar el conocimiento de la epidemiología de la enfermedad en Canarias. Por tanto, de forma complementaria al tratamiento masivo en la zona afectada, se establece la necesidad de identificar posibles reservorios de la enfermedad mediante el chequeo en otras especies animales (Gutiérrez et al., 2005). En primer lugar, el número de animales rumiantes en Canarias, y fundamentalmente de caprino y ovino, es considerablemente mayor que el de camélidos. El caprino es la especie ganadera económicamente más importante de las islas en producción lechera, y la segunda más importante en producción cárnica, detrás del sector avícola. Destaca el mayor peso del censo de pequeños rumiantes en las islas orientales, con más de dos terceras partes del número total de ambas especies concentrados en la provincia de Las Palmas (Estadística Agraria de Canarias, 2009), dentro de la cual se encuentra la isla de Gran Canaria. Aunque la explotación de estas especies tiende cada vez más hacia un Introducción y justificación 5 modelo productivo intensivo, aún existe pastoreo en algunas zonas. Así, de forma tradicional los pequeños rumiantes en Canarias se han desarrollado próximos a los hábitats de los dromedarios, así como también ocurre en algunos otros lugares del mundo, donde podrían ser reservorios potenciales del protozoo (Gutiérrez et al., 2010). En el este de África se ha descrito la posibilidad de que cabras y ovejas puedan ser hospedadores de T. evansi, cuando son criados en rebaños con dromedarios, y se ha demostrado tras la inoculación experimental que las cabras pueden padecer un cuadro severo (Ngeranwa et al., 1993). Nuestro grupo de investigación ha demostrado la susceptibilidad del caprino a la cepa canaria de T. evansi, cursando la enfermedad generalmente de forma subclínica con baja parasitemia (Gutiérrez et al., 2004). En contraste, en Mauritania y tras estudios de campo se considera limitado el papel que pueden desempeñar los pequeños rumiantes en la epidemiología de la tripanosomosis por T. evansi en camellos, a pesar de haberse demostrado susceptibilidad de forma experimental a la cepa local, produciendo una clínica de abortos y pérdida de peso en ovino, y un curso generalmente subclínico en caprino (Jacquiet et al. ,1993). Con estos antecedentes nuestro grupo se propuso realizar varios estudios como parte de esta tesis. Por un lado uno basado en la valoración de dos técnicas diagnósticas directas sobre un modelo experimental caprino inoculando la cepa canaria de T. evansi. Por otro lado, y tomando como base el anterior estudio, se realizó un trabajo de campo sobre las especies ganaderas rumiantes en la isla de Gran Canaria para conocer si pueden actuar como reservorios de la enfermedad y, en segundo lugar, si desempeñan algún papel en la epidemiología de la enfermedad objeto de estudio. En segundo lugar, y dado que conforme al grupo ad hoc de la OIE sobre tripanosomas no transmitidos por tse-tsé (NTTAT), dentro del grupo de especies altamente susceptibles a la surra además de los camellos, están incluidos perros y equinos (OIE, 2009), valoramos incluir en nuestro estudio a equinos residentes en la zona afectada de Gran Canaria. Con respecto a los perros y de acuerdo a Hoare (1972), éstos están protegidos por el pelaje de los ataques de los vectores de T. evansi y se produce la contaminación por vía oral tras la ingesta de cadáveres de ungulados afectados por surra. A pesar de que Introducción y justificación 6 Desquesnes (2004) describe este tipo de contaminación como el principal modo de infestación en carnívoros en América, esta posibilidad es remota en Canarias y por tanto no la hemos incluido como objeto de estudio en la presente Tesis; en primer lugar, debido a la imposibilidad de acceso de carnívoros a cadáveres de los camellos infestados y, por otra parte, por la creciente implicación de los propietarios en el cuidado de los perros como mascotas, lo cual lleva implícito una atención veterinaria cada vez mayor. A esto hay que añadir que Canarias es una región endémica de Dirofilaria immitis, una infestación también principalmente de carácter hemático que afecta sobre todo a perros y en la que es habitual el diagnóstico a través de la técnica de gota gruesa, técnica sencilla y económica. Esta técnica diagnóstica es útil también para el diagnóstico de T. evansi, figurando en el capítulo 2.1.17 del Manual de las Pruebas de Diagnóstico y de las Vacunas para los Animales Terrestres 2010 (OIE, 2011). Hasta el momento ningún clínico veterinario ha notificado infestación por Trypanosoma spp. en carnívoros en Canarias. Con estos antecedentes nuestro grupo de investigación no ha considerado prioritario incluir en esta tesis a los carnívoros, aunque en función de las conclusiones que se puedan extraer de la misma, podría ampliarse el trabajo sobre estas especies en el futuro. En el caso de los equinos no es habitual realizar controles rutinarios de sangre en busca de hemoparásitos, al menos en zonas fuera de los trópicos, exceptuando situaciones en las que se evidencien signos clínicos sospechosos que sugieran este tipo de patologías. En el caso de Gran Canaria, además, estos animales tienen libre movimiento por toda la isla, siendo habituales las excursiones a caballo tanto como actividad turística como privada, lo que podría comportar situaciones de riesgo epidemiológico. Por esta razón, dentro de esta tesis doctoral se ha marcado como otro objetivo la vigilancia de T. evansi en équidos, con remisión de muestras de sangre por parte de veterinarios clínicos ambulantes así como visitas a cuadras por parte de nuestro equipo. Además y ya habiendo comentado las posibilidades de transmisión en carnívoros a través de la vía oral, así como se comentará a continuación en roedores, y teniendo en cuenta los modos de transmisión descritos para T. evansi, consideramos que la forma más probable de contagio de la surra en Canarias sería a través de insectos vectores. Dípteros pertenecientes a los géneros Tabanus, Stomoxys, Atylotus y Lyperosia Introducción y justificación 7 (sinónimo de Haematobia) transmiten la surra de forma mecánica a través de la picadura (Brun et al., 1998), siendo hasta el momento desconocidas las especies responsables de la transmisión en esta región. Otros modos de transmisión como los representados por picaduras de vampiros se circunscriben a Sudamérica (Desquesnes, 2004), existiendo únicamente en Canarias nueve especies de quirópteros silvestres (Martín González y García, 2004) con hábitos insectívoros y frugívoros pero no hematófagos, por lo que se ha descartado esta posibilidad. Se ha prestado especial atención a la posibilidad de transmisión iatrogénica en la población de camellos afectados a través de agujas compartidas y prácticas colectivas como vacunación e identificación, por lo cual se ha informado al respecto y se ha recomendado la profilaxis en este sentido para evitar este tipo de contagio. Con estos antecedentes, y de acuerdo también a la aparición de enfermedades emergentes y adaptación de vectores a nuevos hábitats, en gran parte como consecuencia del cambio climático y corrientes migratorias, de cara a la sanidad animal y salud pública la vigilancia epidemiológica en áreas subtropicales como Canarias se muestra esencial. Por esta razón se ha enmarcado dentro de esta tesis un trabajo para documentar la presencia de insectos vectores que pudieran estar implicados en la transmisión de la surra en Canarias, y se intenta correlacionar esta información con la vigilancia en équidos, lo que servirá como complemento a los trabajos anteriores y a la descripción de la epidemiología de la enfermedad en las islas. Por último y en tercer lugar, debido a la susceptibilidad de los roedores a T. evansi, dentro de esta tesis se ha enmarcado un estudio sobre el papel que desempeñan estos micromamíferos silvestres en la epidemiología de esta enfermedad. Como ejemplos, las capibaras (Hydrochaeris hydrochaeris), que son los roedores de mayor tamaño del mundo y habitan de forma salvaje en Sudamérica, actúan como reservorios de T. evansi, sin mostrar signos clínicos manifiestos (Franke et al., 1994); por otro lado, se ha citado la posibilidad de infestación por T. evansi en pequeños roedores por vía oral (Raina et al., 1985; da Silva et al., 2007). Por estas razones y dado que las ratas y ratones son animales considerados como plagas, siendo habitual su presencia en explotaciones ganaderas y siendo difícil su control, la posibilidad de contacto directo de esta fauna Introducción y justificación 8 silvestre con la doméstica es elevada, lo cual podría suponer un riesgo epidemiológico potencial, hasta el momento no evaluado para esta enfermedad en Canarias. El estudio de la surra en Canarias toma además importancia por los siguientes motivos: • En Canarias, el dromedario ha sido la única especie en la que se ha descrito la enfermedad hasta el momento, y es además en esta región donde se mantiene la única ganadería camellar tradicional de Europa, con más de seis siglos de existencia. La importancia de este animal ha sido tal, que recientemente la Comisión Nacional de Coordinación para la Conservación, Mejora y Fomento de Razas Ganaderas acordó el reconocimiento de la raza Camello Canario y su inclusión en el Catálogo Oficial de Razas de Ganado de España (Notas de prensa de la Consejería de Agricultura, Ganadería, Pesca y Medio Ambiente del Gobierno de Canarias. 31/3/2011). Actualmente la cría de esta especie en las islas tiene como fin la explotación dentro del sector turístico, que es el principal motor de la economía canaria. • Por otro lado y también a nivel local, es patente la importancia de los pequeños rumiantes en Canarias. Por esta razón, el estudio de esta enfermedad en estas especies, se muestra también esencial, de cara a la repercusión que podría tener la aparición de nuevas enfermedades en el ganado sobre las economías familiares dependientes del sector primario. El ganado vacuno no presenta un censo elevado en Canarias; sin embargo, dado que figura como especie altamente susceptible para la OIE (2011), ha sido también evaluado en la presente tesis. • A nivel estatal e internacional, recientemente han aparecido focos puntuales de surra en Europa continental, en zonas donde los camellos son considerados exóticos. Estos focos han estado asociados a la importación de dromedarios desde Canarias. Afortunadamente, fueron controlados y la enfermedad no alcanzó la categoría de endémica (Desquesnes et al., 2008; Tamarit et al., 2010). Desde una óptica de garantías en la seguridad sanitaria del comercio de animales y sus productos, tanto entre autonomías como a nivel internacional, se muestra esencial el estudio de esta enfermedad en Canarias. Introducción y justificación 9 • Desde la perspectiva en salud pública, el tema toma importancia a raíz de las posibilidades de zoonosis por T. evansi. A este respecto, y aunque se presenta de forma infrecuente, se han realizado recientes descripciones de infestaciones y exposición al protozoo en la especie humana (Joshi et al., 2005, Shegokar et al., 2006; Vanhollebeke et al., 2006). La observación de distintos grados de resistencia natural al suero humano en algunos stocks de T. evansi, hace necesaria una mayor atención a su probable potencial zoonótico (Lai et al., 2010). Revisión bibliográfica 17 1. Historia y evolución de Trypanosoma evansi 1.1. Historia del término Trypanosoma evansi: sinonimias Los tripanosomas son protozoos pertenecientes al género Trypanosoma. Los primeros organismos pertenecientes a este género fueron descubiertos en Berna en el año 1841, en sangre de trucha (Salmo fario) por Valentine. El término Trypanosoma fue acuñado en 1843 por Gruby, un médico húngaro que trabajó en París. Este científico empleó dicho término, derivado fonéticamente de la combinación de dos palabras griegas (τρυπάνο: taladro o barrena y σώμα: cuerpo), para denominar a organismos con un movimiento parecido al de las anguilas que encontró en sangre de ranas, y a los que llamó Trypanosoma rotatorium (Tobey, 1906; Itard, 1989). Trypanosoma evansi fue el primer tripanosoma descrito e identificado como agente causal de tripanosomosis en mamíferos (Mahmoud y Gray, 1980). Este microorganismo, agente causal de la surra, fue denominado como T. evansi en honor al veterinario militar Griffith Evans, que descubrió este flagelado tras sus trabajos en camellos y équidos infestados en el distrito Dara Ismail Khan, Punjab en la India, en 1880 (Evans, citado por Indrakamhang, 1998; Cordero del Campillo, 2001). Cinco años más tarde, Steel encontró los mismos organismos parasitando mulas procedentes de la Unión de Myanmar (antiguamente denominada Birmania), siendo referidos estos protozoos por Balbiani, como “tripanosomas”, en el año 1888 (Stephen, 1986). La enfermedad debida a T. evansi (= T. ninaekohlyakimovi, Hoare, 1972) fue más tarde también descrita por Yakimoff (1921, 1923) en camellos rusos en Turkestan. Yakimoff (1923) estableció que la tripanosomosis en camellos rusos fue detectada primero por Feinschmidt en 1912, en Astrakhan y Saratov (Yakimoff, citado por Mahmoud y Gray, 1980). A lo largo de los años, se han observado enfermedades similares causadas por tripanosomas indistinguibles de T. evansi, en otras partes del mundo y en diversos Revisión bibliográfica 18 mamíferos como hospedadores (Hoare, 1972). Desde su primera descripción han sido utilizados varios sinónimos: T. equinum (Voges, 1901), T. evansi var. mborii (Laveran, 1903), T. soudanense (Laveran, 1907), T. soudanense var. berberum (Sergent et al., 1912), T. marocanum (Sergent et al., 1915), T. aegyptum (Nattan-Larrier y Noyer, 1932) (autores citados por Stevens y Brisse, 2004). Se han utilizado treinta y tres nombres diferentes, pero actualmente se acepta que el único nombre válido para el parásito causante de la surra es el de T. evansi (Hoare, 1972). El Comité Internacional de la Organización Mundial de la Salud (OMS) había recomendado el nombre de T. brucei evansi en el año 1978, basándose en que T. evansi derivó de T. brucei, y en que esta evolución se produjo por pérdida del ADN kinetoplástido (ADNk). Sin embargo, basándose en la Nomenclatura Zoológica Internacional, los participantes de la “10ª Reunión Internacional sobre Trypanosoma evansi” señalaron que la denominación T. brucei evansi no era adecuada, porque para este organismo el término “evansi” fue acuñado antes de la denominación “brucei”. Por dicha razón el grupo ad hoc sobre tripanosomosis animales no trasmitidas por tse-tse (NTTAT) de la Organización Internacional de Epizootías (OIE), mientras tanto, prefiere referirse a la nomenclatura que fue presentada a la Comisión Internacional de Nomenclatura Zoológica en 1989, y a partir de entonces re-denominada y confirmada en las 10ª y 11ª reuniones internacionales sobre Trypanosma evansi: Trypanosoma (Trypanozoon) evansi (Desquesnes, 2004). Lai et al., (2008) niegan el estatus de especie tanto para T. evansi como para T. equiperdum, considerándolas como subespecies de T. brucei, y sugiriendo por tanto los nombres de T. brucei evansi y T. brucei equiperdum respectivamente. 1.2. Historia del término “surra”: sinonimias El término “surra”, denominación aceptada internacionalmente, hace alusión a una observación clínica de la enfermedad, procede del hindú y significa “corrupto” (Cordero del Campillo y Martínez Fernández, 1999), pero existen otras denominaciones en otros lugares del mundo. Así en Sudamérica y Centroamérica esta enfermedad recibe los nombres de “Murrina”, “Derrengadera”, “Mal de Caderas” y “Tristeza”. En el norte de Revisión bibliográfica 19 África se le conoce como “El Debab”, una palabra árabe que significa enfermedad de la mosca; “Guifar” o “Dioufar” en Chad; “Tahaga” en Mali; “Doukane” en Etiopía; “Tabourit” en Mauritania (Itard, 1989; Dia et al., 1997a, b, c). En Rusia es conocida con el término de “Su-auru” (Hoare, 1972). 1.3. Evolución de Trypanosoma evansi De todas las especies de tripanosoma, T. evansi tiene la distribución mundial más amplia y comparte el rango de hospedadores mamíferos con T. brucei. Así, el origen de T. evansi y T. equiperdum ha sido objeto de debate y de acuerdo a Hoare (1972): “…si animales infestados con T. b. brucei hubieran sido introducidos desde un área enzoótica de Nagana hacia una nueva localización libre de moscas tse-tse, donde el tripanosoma fue transmitido subsecuentemente por vectores mecánicos, especialmente tábanos…la pérdida de contacto con Glossina podría haber llevado a la transformación de T. b. brucei hacia una estirpe monomórfica indistinguible de las especies ahora conocidas como T. evansi…” De este modo, la transmisión de T. brucei por moscas tse-tse (Glossina spp.) ocurre exclusivamente en África en un área de aproximadamente 10 millones de km2, extendiéndose a ambos lados del ecuador, desde la latitud 15º N a 20º S. T. evansi es probablemente un T. brucei que perdió la capacidad para la transmisión cíclica al ser introducido por animales domésticos, principalmente camellos, en áreas libres de moscas tse-tse (Itard, 1989). A la hipótesis de Hoare (1972) referente a la aparición de T. evansi por evolución a partir de T. brucei, Lun y Dresser (1995) aportaron que se pudo haber debido a la pérdida del maxicírculo del ADNk durante la replicación de un mutante de T. brucei, lo cual estaría correlacionado con la amplia distribución y rango de hospedadores de T. evansi. Como resultado de ello y de la ausencia de cambios morfológicos de T. evansi en el vector, la transmisión mecánica no depende de un vector estricto. Aquellos tripanosomas de la sección Salivaria que exhiben alteraciones naturales del ADNk (incluye a T. equiperdum y T. evansi), han perdido la capacidad de diferenciarse Revisión bibliográfica 20 dentro del insecto vector y son transmitidos por picaduras de moscas o por vía venérea (Brun et al., 1998). Sin embargo, en contraposición a la idea del origen de T. evansi a partir de T. brucei, Brun et al. (1998) plantearon la hipótesis de que T. evansi pudiera haber surgido desde una forma sanguínea del T. equiperdum. A su vez, Lun et al. (2004) sugirieron que T. equiperdum evolucionó a partir de una cepa ancestral de T. brucei adaptada a équidos, que durante esta fase de adaptación perdió parte del maxicírculo de su ADNk. Filogenéticamente, T. evansi está muy próximo a T. brucei, y presenta una gran homogeneidad genética. Esta homogeneidad se observa en todo el subgénero Trypanozoon, en el que se incluyen las especies T. brucei y T. evansi, observándose particularmente homogeneidad genética entre las cepas de T. evansi (Ventura et al., 2002; De Oliveira et al., 2008; Lai et al., 2008). Lai et al. (2008) se oponen a la hipótesis de la aparición puntual y única de T. evansi a partir de T. brucei, y sugieren que la aparición de mutantes akinetoplástidos y diskinetoplástidos ocurre espontáneamente y frecuentemente en T. brucei. 1.4. Distribución geográfica de Trypanosoma evansi Originalmente, la distribución de T. evansi coincidía con la del camello (Soulsby, 1987). Actualmente T. evansi es el tripanosoma animal patógeno de mayor distribución mundial y afecta al ganado en Asia, África y América Central y del Sur (Luckins y Dwinger, 2004). En Latinoamérica existen cuatro especies de tripanosomas con interés médico-veterinario e importancia económica: T. cruzi, T. equiperdum, T. evansi y T. vivax. Solamente T. cruzi, perteneciente a la sección Stercoraria, es una especie indígena de América y responsable de la Enfermedad de Chagas, siendo las otras tres especies, pertenecientes a la sección Salivaria, importadas por el hombre junto con sus principales hospedadores domésticos. La introducción de T. evansi en territorio americano, tuvo lugar en el siglo XVI en Colombia por caballos árabes que pertenecían a las caballerías de los conquistadores españoles (Desquesnes, 2004). Revisión bibliográfica 21 En Europa continental se decribieron dos casos de infestación por T. evansi tras la importación de una capibara de Sudamérica y un perro procedente de Nepal (Kageruka and Mortelmans, 1971; Hellebrekers and Slappendel, 1982). La primera descripción en ganado de la enfermedad por T. evansi en Europa tuvo lugar en 1997 en territorio español, concretamente en un dromedario de las Islas Canarias. En esa época la población de camélidos en las islas rondaba los 1400 ejemplares, siendo en su mayoría importados de países próximos del noroeste africano, como Marruecos y Mauritania. La enfermedad fue diagnosticada en un dromedario que residía en una explotación ganadero-turística del sur de Gran Canaria. Su propietario, al observar emaciación, alopecia y atrofia muscular y de la joroba en el animal posteriormente diagnosticado, solicitó atención por veterinarios. El dromedario, un macho entero de 9 años de edad había sido importado hacía 3 años del noroeste africano. El animal pudo haber sido contagiado en origen, ya que los animales con formas crónicas de la enfermedad pueden sobrevivir 3 o 4 años. Tras el diagnóstico, el animal fue tratado en estado agónico con Naganol –Bayer® Lab.-, produciéndose remisión de la parasitemia a las 24 horas, pero sin observarse recuperación total y con muerte al mes de tratamiento (Gutiérrez et al., 1998). Tras esta primera descripción en Canarias se realizaron estudios en la ganadería camellar de las islas, y la seroprevalencia observada fue de un 9% mediante IgGELISA (Molina et al., 2000), y de un 4,8% utilizando CATT/ T. evansi (Gutiérrez et al., 2000). Sin embargo, la seroprevalencia observada en Canarias es más baja que las observadas en dromedarios de los países vecinos de Marruecos y Mauritania. Así, la prevalencia de la enfermedad en Marruecos mostró un valor de 14,1% utilizando CATT/T. evansi, y 18,2 % a través de IgG-ELISA. (Atarhouch et al., 2003). En Mauritania la seroprevalencia fue de 16,5%, 24,3% y 14,1 % a través de CATT/ T. evansi, IFI y Ag-ELISA respectivamente. (Dia et al., 1997a). En territorio continental europeo se detectó un foco de surra en el año 2006, en dromedarios del departamento de Aveyron (Francia). El foco apareció en una granja tras la importación de cinco dromedarios desde las Islas Canarias durante el mismo año. La granja ya poseía ocho dromedarios importados de Canarias en el año 1995, de los cuales tres resultaron positivos, junto a dos de los que habían sido importados recientemente. No se observó T. evansi en ningún otro animal de la granja, ni de granjas vecinas, pero Revisión bibliográfica 22 algunas de las ovejas de estas granjas mostraron positividad a través de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y serología (Desquesnes et al., 2008). Posteriormente, en el verano de 2008 se detectó otro foco de surra en Alicante (España), en una granja que había importado dromedarios desde las Islas Canarias hacía un año y medio. Este brote afectó a dromedarios, caballos y burros (Tamarit et al., 2010). 1.5. Reseñas históricas de los camellos (Camelus dromedarius) en Canarias La primera referencia histórica del camello (Camelus dromedarius) en las islas data del año 1405 procedente del continente africano, acompañando las primeras expediciones de los moriscos apresados por Juan de Bethencourt primero y luego por Diego García de Herrera, a lo largo del siglo XV en la cercana costa africana, durante la conquista de las islas por los castellanos (Fabelo, 2008). Así en la obra francesa “Le Canarien”, donde se refleja la crónica de la conquista de Canarias relatada por dos de sus protagonistas, Gadifir de La Salle y Jean de Béthencourt, y al margen de interpretaciones históricas, aparecen de forma clara en alguno de sus capítulos las primeras referencias. Así, en cuanto al camello se cita textualmente: “…muy cerca del puerto de Bojador; y allí bajó Monseñor de Béthencourt con sus hombres y entraron por lo menos ocho leguas en el país y prendieron hombres y mujeres que llevaron consigo, y más de tres mil camellos, [ ] y después volvieron a Gran Canaria, como Monseñor de Béthencourt lo había ordenado, pero el temporal los cogió en el camino, de manera que de las tres barcazas una llegó a Erbania (refiriéndose a Fuerteventura) y la segunda a la isla de La Palma y allí se quedaron, hasta que llegó la tercera barcaza, en que venia Monseñor de Béthencourt, haciendo la guerra a los del país” En “Historia de las siete islas de Canaria” (Arias de Marín de Cubas, 1986) se cita: “Salieron de Ervania o Fuerteventura dia 6 de Octubre del mismo año de 405, guiando las tres Galeras al Puerto grande frontero de Telde y Argones que es Gando, y Revisión bibliográfica 23 dandoles un recio norte desgarran a tierra de Africa junto a el cabo Boxador, entraronla por mas de diez leguas onde estubieron ocho dias, apresaron muchos arabes con familias y mas de quatro mil camellos;…” Las Islas Canarias constituyen una región ultraperiférica que pertenece políticamente a la Unión Europea y presenta unas características climáticas muy diferentes a las de la Europa continental, debido a su proximidad a la costa africana, distando 95 km del Sáhara Occidental. Las condiciones climáticas constantes, con temperaturas suaves durante todo el año, han convertido a las islas en un atractivo turístico a nivel mundial, permitiendo a este sector situarse como eje económico principal del archipiélago a partir de los años sesenta del pasado siglo. El desarrollo del turismo tuvo una influencia clara sobre el dromedario, conocido en las islas como camello, provocando un cambio radical en el modo de su explotación. Antaño fue una especie ganadera explotada en labores agrícolas y construcciones para aumentar la superficie cultivable, modelando incluso el paisaje, como el caso de La Geria en la de isla de Lanzarote, ahora conocida mundialmente, para después en esos mismos paisajes llevar a cabo con la llegada de turistas, labores de transporte recreativo, lo que supuso un nuevo enfoque a la rentabilidad de este animal como especie ganadera. Este nuevo modelo de explotación del dromedario se exportó a las vecinas islas de Fuerteventura, Gran Canaria y Tenerife, que junto a Lanzarote son las cuatro islas donde habitan dromedarios (Gutiérrez et al., 2000). Después de la entrada de España en la Unión Europea, y tras asumir una nueva legislación comunitaria en materia de sanidad animal, las importaciones de camellos africanos a las Islas Canarias fueron reduciéndose poco a poco hasta desaparecer por completo. No obstante, entre los animales que se encuentran en la actualidad en las distintas explotaciones, aún es fácil distinguir algunos ejemplares con marcas de fuego en el cuello que revelan el origen de los mismos y la tribu a la que pertenecían (Fabelo, 2008). En un análisis genético utilizando 13 microsatélites en la población canaria de dromedarios, se observó la mayor proximidad genética con dromedarios del Norte de África (Tinduf, Argelia) y un cierto grado de subdivisión, con importantes diferencias Revisión bibliográfica 24 genéticas entre los criadores. Esto, unido al escaso censo de este animal justificaría la puesta en funcionamiento de un programa de conservación genética que permitiera el manejo eficiente de la diversidad genética actual en la única población tradicional de esta especie en Europa (Schulz et al., 2010). A este respecto, la Comisión Nacional de Coordinación para la Conservación, Mejora y Fomento de Razas Ganaderas, acordó en reunión celebrada el 24 de marzo de 2011 en Madrid, el reconocimiento de la raza Camello Canario y su inclusión en el Catálogo Oficial de Razas de Ganado de España (Notas de prensa de la Consejería de Agricultura, Ganadería, Pesca y Medio Ambiente del Gobierno de Canarias. 31/3/2011). 1.6. Situación actual de la surra desde la óptica del comercio internacional de animales En la antigua clasificación de las enfermedades de declaración obligatoria de la Organización Internacional de Epizootías (OIE) mantenida hasta 2005, la surra tenía el estatus de enfermedad dentro de la lista B de équidos. Actualmente se encuentra como enfermedad de varias especies en la lista de la OIE , incluida en el capítulo 2.1.17 del Manual de las Pruebas de Diagnóstico y de las Vacunas para los Animales Terrestres 2010. En el mismo manual se cita como expertos y laboratorios de referencia para la enfermedad al Dr. Filip Claes del Institute of Tropical Medicine Antwerp en Bélgica, y al Prof. Noboru Inoue del National Research Center for Protozoan Diseases, en Japón. No obstante, hasta el momento en dicho manual no figura todavía asignado ningún test diagnóstico para T. evansi ni con categoría de “prescrito” ni “alternativo” para el movimiento internacional de animales y productos de origen animal (OIE, 2011). Así, de acuerdo a Desquesnes et al. (2008), la enfermedad producida por T. evansi está listada para las organizaciones internacionales sólo como surra en caballos, pero no en camellos. En el Código Sanitario para los Animales Terrestres 2010, cuyo objetivo es garantizar la seguridad sanitaria del comercio internacional de animales terrestres y productos de animales terrestres, aparece la durina como enfermedad listada propia de los équidos, cuyo agente causal es T. equiperdum. Sin embargo, en dicho código no figura la enfermedad producida por T. evansi en las enfermedades comunes a varias Revisión bibliográfica 25 especies, ni siquiera en las recomendaciones aplicables a las enfermedades de équidos (OIE, 2011). 1.7. Situación actual de Trypanosoma evansi desde la óptica de la salud pública: potencial zoonótico La tripanosomosis por T. evansi se ha convertido en una enfermedad emergente potencial tras su reciente descripción en la especie humana. La enfermedad fue observada en 2004 en un granjero hindú de 40 años del distrito de Chandrapur en el estado de Maharashtra. El paciente presentó una clínica de fiebre intermitente asociada a escalofríos y sudoración y que evolucionó hacia déficit sensorial, desorientación, agitación y comportamiento violento (Joshi et al., 2005). De acuerdo a Vanhollebeke et al. (2006), la susceptibilidad de este paciente a esta protozoosis se atribuyó a una deficiencia de apolipoproteína L-1 (Apo-L1), una molécula que se encuentra de forma normal en el suero humano y que representa un factor tripanolítico natural. Tras esta primera descripción de T. evansi en la especie humana, se realizó un estudio de seroprevalencia en el mismo pueblo en el que se localizó el paciente afectado. Se observaron resultados positivos al CATT/ T. evansi, a alta dilución del suero, en un 3,32% de los habitantes, sin confirmarse parasitemia en ningún caso, lo que indica una frecuente exposición de la población humana a T. evansi en esta área (Shegokar et al., 2006). En algunas subespecies de T. brucei se ha citado la presencia del gen de resistencia asociada al suero (SRA), que confiere resistencia al suero del hospedador, lo que ha proporcionado información importante en la gama de huéspedes que pueden afectarse por este tripanosoma y los mecanismos de resistencia que se presentan (Pays et al., 2006). A este respecto, un fragmento homólogo a SRA llamado SRAbc se encuentra en todos los stocks de T. brucei evansi (Lai et al, 2009). En estudios realizados en algunos stocks de T. evansi, obtenidos de distintos hospedadores animales y variada procedencia geográfica, se ha observado distinto nivel de sensibilidad a los efectos del suero humano. Ciertos stocks muestran una resistencia Revisión bibliográfica 32 parte libre del flagelo mide entre 3 y 5 micrómetros, y no está presente en las formas rechonchas (Desquesnes, 2004). El flagelo presenta el patrón clásico de organización de 9 pares de microtúbulos periféricos y un par central, y además en tripanosomátidos, como diferencia del resto de protozoos parásitos, está asociado al axonema un complejo de filamentos denominado estructura paraflagelar (de Souza, 2008). 3.3. Periplasto y envoltura de glicoproteínas El cuerpo del parásito está delimitado por una pared llamada periplasto, la cual comprende una membrana plasmática de 8-10 nm de espesor y, bajo ésta, una capa de microtúbulos peliculares (Itard, 1989). La membrana plasmática que envuelve se invagina formando el bolsillo flagelar, continuando a lo largo del flagelo (de Souza y da Cunha-e-Silva, 2003). El cuerpo puede estar envuelto a su vez por una capa de glicoproteínas secretadas por la célula, que actúa como antígeno de superficie en las formas sanguíneas de los tripanosomas de mamíferos. Esta capa puede transformarse, lo cual le permite al parásito evadir la acción de los anticuerpos generados por los hospedadores mamíferos (Itard, 1989). Esta capa, denominada con las siglas VSG (glicoproteínas variables de superficie), presenta en T. evansi un peso molecular de 66-67 kDa (Ghorui y Srivastava, 1999). Estas VSG determinan los tipos antigénicos variables de los tripanosomas individuales, denominados VAT. La especie T. evansi presenta un repertorio limitado de VSG, teniendo un carácter predominante la glicoproteína RoTat 1.2 (Verloo et al., 2001). Esto puede explicar la alta sensibilidad mostrada por test diagnósticos para detectar anticuerpos frente a T. evansi, realizados en distintos lugares del mundo y en distintos hospedadores, basados en el antígeno RoTat 1.2 (Diall et al., 1994; Dia et al., 1997b; Verloo et al. 1998; Davison et al., 1999; Gutiérrez et al., 2000; Verloo et al., 2000). Sin embargo, en estudios realizados en Kenia fue imposible detectar diversos casos de T. evansi a través de test basados en la VGS RoTat 1.2 (Ngaira et al., 2003; Njiru et al., 2004). Se concluyó que algunas cepas T. evansi en Kenia carecen del gen que codifica RoTat 1.2 y de su VSG asociada, observándose a su vez algunas poblaciones de T. Revisión bibliográfica 33 evansi que presentaban el gen, pero carecían de la citada VSG (Ngaira et al., 2004). Estas cepas aisladas en Kenia que carecen de VSG RoTat 1.2 se denominan T. evansi non-RoTat 1.2 y poseen una VSG llamada JN 2118Hu (Ngaira et al., 2005). No obstante el término non-RoTat 1.2 en referencia a las cepas VSG JN 2118Hu debe ser aplicado con cautela, teniendo en cuenta que la existencia de otros T. evansi que estén desprovistos de ambas glicoproteínas de superficie no ha sido descartada (Njiru et al., 2010). 3.4. Citoesqueleto Bajo el periplasto se encuentra el citoesqueleto del protozoo, conformado por microtúbulos, presentes en todas la células eucariotas, pero especialmente abundantes en la familia Trypanosomatidae (Rasooly y Balaban, 2004). Los microtúbulos individuales están compuestos de heterodímeros de tubulina, habiendo sido identificadas en T. brucei 6 tubulinas hasta el momento: alpha, beta, gamma, delta, epsilon y zeta (Gull, 2001). La unión de los microtúbulos individuales entre sí y con la membrana plasmática, a través de puentes cruzados, se produce por la presencia de las proteínas asociadas a microtúbulos (MAPs) (Kohl y Gull, 1998). La beta-tubulina es un importante miembro de la familia de tubulinas en las especies de la familia Trypanosomatidae, y además de estar presente debajo de la membrana plasmática, forma parte del flagelo, estructura paraflagelar y el huso mitótico. La secuencia de aminoácidos de la beta-tubulina en T. evansi presenta una homología del 100 % y del 99.8% con las de T. equiperdum y T. brucei respectivamente (Li et al., 2007). 3.5. Citoplasma El citoplasma contiene distribuidos al azar los ribosomas y el retículo endoplásmico, estando este último orgánulo unido a los microtúbulos del citoesqueleto. El complejo de Golgi se encuentra cerca de la bolsa flagelar (de Souza y da Cunha-e-Silva, 2003). Revisión bibliográfica 34 El núcleo de los tripanosomas pueden estar situado en diferentes partes del cuerpo, pero en las formas sanguíneas aparece cerca del centro o en la mitad anterior (Hoare, 1972). El orden Kinetoplastida comprende un grupo de protozoos definidos por la presencia de un orgánulo característico, el kinetoplasto (Vickerman, 1976). Este orgánulo corresponde a una condensación de ADN extranuclear, y en tripanosomátidos se encuentra dentro de la única mitocondria ramificada, que se localiza frente al cuerpo basal que da lugar al flagelo (De Souza y da Cunha-e-Silva, 2003). En T. evansi el diámetro del kinetoplasto es de 0,7 micrómetros (Hoare, 1972). El kinetoplasto de los tripanosomas está conformado por miles de moléculas circulares de doble cadena llamadas maxicírculos y minicírculos. La red del ADNk consiste en 50100 maxicírculos y 5000-10000 minicírculos. Los maxicírculos corresponden al equivalente del ADN mitocondrial de otros eucariotas, y en ellos está codificada la información para la producción del ARN mitocondrial. En los minicírculos está codificado ARN mensajero que interviene en la definición de la producción final del ARN mitocondrial, a través de un proceso post-trancripcional en el cual se produce inserción y/o extracción de nucleótidos de uridina y es catabolizado por complejos multiprotéicos (Stuart, 2005). Se pueden producir alteraciones en el ADNk, de forma natural o inducidas en laboratorio (Schnaufer et al., 2002). A tenor de las alteraciones que puede sufrir el kinetoplasto surgen los términos akinetoplástido y diskinetoplástido, haciendo referencia a la pérdida total o reducción en el tamaño del ADNk respectivamente, que pueden sufrir los tripanosomas. No obstante, se deben denominar diskinetoplástidos a todos aquellos stocks en los que no se ha realizado análisis del estado del kinetoplasto, debido a que tripanosomas aparentemente akinetoplástidos, pueden poseer un ADNk no condensado, no detectable por Giemsa (Ventura et al., 2000). Existen tres especies incluidas dentro de la categoría de tripanosomas diskinetoplástidos/akinetoplástidos: T. evansi, T. equinum y T. equiperdum (Hoare, 1972). Clásicamente T. equinum fue considerada como una especie separada, y en la actualidad es considerada una forma de T. evansi (Ventura et al., 2000). Revisión bibliográfica 35 T. evansi carece de maxicírculos en su ADNk y la secuencia de los minicírculos es muy similar entre cepas aisladas en diferentes partes del mundo (Borst et al., 1987; Songa et al., 1990; Lun et al., 1992). Mientras que en T. evansi hay ausencia de maxicírculos, en T. equiperdum sí existen; según Lun et al. (2004), estos maxicírculos en T. equiperdum son incompletos, con respecto a los de T. brucei, especie a partir de la cual estos autores sugieren que se originó T. equiperdum. Existen cepas de T. evansi akinetoplástidas de forma natural, habiendo sido descritas cepas desprovistas de ADNk tanto de animales domésticos como salvajes (Ventura et al., 2000). Aparte del kinetoplasto, en tripanosomátidos existen otros orgánulos característicos. En primer lugar se presenta el denominado glicosoma, que es un orgánulo por lo general redondo, y que contiene una matriz más densa que la del citoplasma. La mayoría de las enzimas de la vía glucolítica se localizan en este orgánulo. Dado que en algunas especies el glicosoma contiene catalasa y enzimas que intervienen en la beta-oxidación de los lípidos, se correspondería a un peroxisoma (De Souza y da Cunha-e-Silva, 2003). Otro orgánulo característico es el acidocalcisoma, que consiste en varias vesículas distintivas, que suelen mostrar un vacío interior y un material electrodenso en su periferia. Este orgánulo está involucrado en la regulación de la concentración citoplasmática de calcio, con la participación de varias ATPasas (De Souza y da Cunhae-Silva, 2003). Figura 5. Morfología de Trypanosoma evansi. Revisión bibliográfica 36 4. CICLO DE Trypanosoma evansi T. evansi presenta un ciclo de vida monoxeno, y su contagio se realiza de forma mecánica, sin que este protozoo sufra evolución en el tiempo que transcurre en la transmisión, entre un hospedador infestado y un nuevo hospedador. Esta diferencia con respecto a otros tripanosomas que sí presentan evolución durante la transmisión entre hospedadores, ha sido explicada en T. evansi por la pérdida de los maxicírculos del kinetoplasto (Borst et al., 1987). La multiplicación de T. evansi en sus hospedadores mamíferos se produce por fisión binaria longitudinal, y tiene lugar en sangre, linfa o líquido cefalorraquídeo (Fowler, 2010). 4.1. Formas de transmisión de Trypanosoma evansi Se le ha atribuido un rol importante a especies concretas de artrópodos hematófagos en la transmisión mecánica de la surra, aunque también se han descrito otros modos de transmisión, sin la intervención de los mismos. 4.1.1. Transmisión por picadura de vectores mecánicos En la transmisión de T. evansi generalmente intervienen un grupo determinado de insectos, que se comportan como vectores a tenor de sus hábitos hematófagos. Tras alimentarse de la sangre de animales parasitémicos, pueden transportar en sus piezas bucales tripanosomas que pueden presentar capacidad infestiva. El potencial transmisor de estos vectores depende del tiempo que transcurre hasta la siguiente alimentación sobre otro animal libre de la protozoosis y a su vez de la especie de vector involucrada. Las especies de insectos que transmiten la surra de forma mecánica, a través de la picadura, pertenecen a los géneros Tabanus, Stomoxys, Atylotus y Lyperosia (sinónimo de Haematobia) (Brun et al., 1998). Estas especies se describirán de forma más detallada en el apartado 4.2. Revisión bibliográfica 37 4.1.2. Transmisión por mordedura por Desmodus rotundus En Sudamérica juegan un papel importante en la epidemiología de la enfermedad los murciélagos vampiros (Desmodus rotundus), que por sus hábitos hematófagos se convierten simultáneamente en hospedadores, reservorios y vectores mecánicos de T. evansi. Así, estos quirópteros adquieren la infestación a través de la ruta orodigestiva, o incluso de forma percutánea por mordedura entre congéneres (Hoare, 1965; 1972). Debido a que actúan tanto como vectores y como reservorio, existiendo multiplicación del parásito en dicho vector, existe justificación para considerar a los murciélagos vampiros como vectores biológicos (Desquesnes, 2004). En Canarias habitan nueve especies de quirópteros, distribuidos de forma distinta por todas las islas (Martín González y García, 2004), y no existe la especie hematófaga Desmodus rotundus, circunscrita únicamente a Latinoamérica. 4.1.3. Transmisión vía oral La transmisión vía oral, por alimentación de carne o sangre infestada ha sido demostrada en perros, gatos y ratones (Ray et al., 1972; Raina et al., 1985; Bazzoli et al., 2002). En otros estudios se consiguió transmisión vía oral en ratas (Rattus norvegicus) pero no en ratones (Mus musculus) (da Silva et al., 2007). De acuerdo con Hoare (1972), los perros domésticos y salvajes están protegidos de los ataques de los vectores hematófagos por la cobertura de pelo, lo que sugiere que el contagio tiene lugar por comer cadáveres de ungulados infestados. Desquenses (2004) cita este modo de transmisión como la principal ruta de adquisición de T. evansi en carnívoros en América, particularmente en perros. Además, se cita también la posible importancia que puede tener esta vía de transmisión en otras especies salvajes de Sudamérica, como son las capibaras (Hydrochoerus hydrochaeris) y los coatís (Nasua nasua), los cuales tienen un comportamiento gregario y agresivo entre congéneres, pudiéndose mantener la infestación en el grupo, por peleas Revisión bibliográfica 38 entre individuos (Herrera et al., 2004). De la misma forma, tal como se citó en el apartado anterior, la especie de murciélago Desmodus rotundus adquiere la infestación a través de la ruta orodigestiva, o incluso de forma percutánea por mordedura entre congéneres (Hoare, 1965; 1972). 4.1.4. Transmisión iatrogénica La transmisión iatrogénica, la cual no ha recibido la atención adecuada, es otra ruta probable de contagio desde hospedadores subclínicos hacia hospedadores sanos, ya que se ha descrito la transmisión mecánica por agujas hipodérmicas contaminadas como vía posible para adquirir T. evansi (Ngeranwa y Kilalo, 1994; Fowler, 2010). Prácticas colectivas como programas de vacunación, así como identificación a través de crotal en pabellones auriculares o tatuaje, sin las adecuadas medidas higiénicas, podrían ser medios de transmisión del protozoo (Ngeranwa y Kilalo, 1994; Reid, 2002). 4.1.5. Transmisión vertical 4.1.5.1. Transmisión transplacentaria Se han asociados abortos y mortalidad neonatal a brotes de T. evansi, pero se desconocen los mecanismos responsables de estos desórdenes reproductivos (Gutiérrez et al., 2005). No obstante, no parece tener importancia la transmisión congénita de T. evansi, a la vista de la poca información sobre el tema en la literatura científica. A este respecto, tomando fuentes bibliográficas no indexadas, ha sido citada la transmisión transplacentaria de T. evansi, al detectarse el protozoo en sangre de un feto de asno abortado (Pathak y Kapoor, 1999); y de forma experimental, también se observaron tripanosomas en fetos de ratas y ratones, pero no se observó en feto de chinchilla, procedentes de madres inoculadas (Latif et al., 1986). En otro estudio no se observaron al microscopio T. evansi en la sangre de fetos de ratón cuyas madres habían sido Revisión bibliográfica 39 infestadas previamente, pero sí se demostró en posterior subinoculación, lo cual confirmó la transmisión transplacentaria (Sarmah, 1998). 4.1.5.1. Transmisión lactógena Otro tipo de transmisión vertical que también está poco documentada para T. evansi, es el contagio a lactantes. De forma experimental, en animales de laboratorio, no se han podido obtener resultados que permitan incluirla como probable vía de contagio (Latif et al., 1986). 4.2. Insectos vectores principales de Trypanosoma evansi. Situación en Canarias 4.2.1. Géneros Tabanus y Atylotus Los dípteros de la familia Tabanidae, en la cual se incluyen los géneros Tabanus y Atylotus, son bien conocidos por el hostigamiento que producen con sus picaduras al hombre y a muchos animales domésticos y salvajes. De esta forma, dentro de los insectos citados como posibles vectores de la surra, los que se consideran más importantes pertenecen al género Tabanus (Luckins, 1988; Luckins y Dwinger, 2004). Las picaduras se producen como consecuencia de los hábitos hematófagos que tienen las hembras de la mayoría de las especies. Las hembras adultas pueden vivir de uno a dos meses, y necesitan la toma de sangre para la maduración de los huevos, teniendo lugar hasta cuatro tomas en intervalos de una semana o más, dependiendo de si es posible encontrar un hospedador (Portillo, 1984; Desquesnes, 2004). Los estímulos que dirigen a los tábanos a sus hospedadores son de tipo olfatorio, en particular el dióxido de carbono, y visual, teniendo una marcada preferencia por grandes animales, convirtiéndose la especie equina en un tipo de hospedador muy atractivo para este insecto (Desquesnes, 2004). Un mecanismo como es la contaminación de las piezas bucales con sangre, que contiene las formas sanguíneas del parásito, es suficiente para asegurar la consiguiente potencial Revisión bibliográfica 40 transmisión mecánica de T. evansi, viéndose facilitado ello en los tábanos, porque presentan unas piezas bucales ásperas, que destacan en tamaño con respecto a los demás vectores potenciales, y unas labelas esponjosas (Foil, 1989; Sumba et al., 1998). Los tábanos atacan de forma vigorosa produciendo una reacción defensiva en su hospedador que espanta al insecto y lo obliga a atacar a un nuevo hospedador para completar su alimentación (Luckins y Dwinger, 2004). La alimentación interrumpida de sangre es el factor más importante, responsable del rol de los tabánidos como eficientes vectores mecánicos, aumentando la probabilidad de esta eficiencia con el aumento de interrupciones en la alimentación. Ello depende tanto del comportamiento hematófago inherente a cada especie de tábano, como de la interacción tábano-hospedador, definida en este segundo caso en mayor medida por el comportamiento del hospedador frente a los ataques. Así, se observan especies de tabánidos que completan su alimentación en un solo hospedador, haciéndolos menos eficientes como transmisores, frente a otras especies que necesitan más de un hospedador, lo que los convierte en vectores potenciales más eficaces. Los comportamientos defensivos de la especie hospedadora potencial, como pueden ser el movimiento de la cola, pataleo, sacudir la cabeza, espasmos dérmicos, entre otros, o la indiferencia frente al ataque del insecto, son factores que también definen el nivel de éxito de la transmisión, así como el perfil de vulnerabilidad que presenta la especie hospedadora (Muzari et al., 2010). Otro factor que condiciona el éxito de la transmisión por estos insectos es la distancia entre hospedadores potenciales. Así, el porcentaje de los tábanos que se mueven entre animales susceptibles, está inversamente relacionado a la distancia que los separa. Cuando se produce la alimentación de los tábanos sobre varios hospedadores, ocurre entre los animales del mismo rebaño, habiéndose observado este fenómeno con distancias de separación de hasta 25 metros. A pesar de que se han observado tábanos que recorren incluso kilómetros, el vuelo a largas distancias después de una alimentación interrumpida, no constituye la norma en el comportamiento hematófago del insecto en busca de nuevos hospedadores, por lo menos en un periodo de pocas horas (Barros y Foil, 2007). La actividad de los tábanos es diurna, pero sin embargo el ritmo circadiano de los tábanos muestra tendencias distintas según el continente. Así, en África los tábanos Revisión bibliográfica 41 muestran mayor actividad después del mediodía y durante la tarde, cuando el tiempo es claro y sin viento, mientras que en Sudamérica la tendencia es durante la mañana y la puesta de sol (Dia et al. 1997c; Desquesnes, 2004). También se observan diferencias en la presencia de picos de abundancia de tábanos según los periodos de lluvias y sequía en distintas localizaciones y continentes, y se relacionan con variaciones temporales en la seroprevalencia de T. evansi en las zonas estudiadas (Dia et al., 1997c; Barros, 2001; Abdesalam et al., 2002). Así, en África se observaron picos de abundancia de tábanos al final de la estación lluviosa y comienzo de la estación seca (Dia et al., 1997c; Abdesalam et al., 2002). En contraste, en Sudamérica, según la localización, se observó mayor abundancia de tábanos tanto durante la estación lluviosa (Barros, 2001), como durante la estación seca (Desquesnes, 2004). La última revisión llevada a cabo en España de la familia Tabanidae, registra 97 especies (Portillo, 1984; Portillo y Báez, 2002). En países africanos situados en latitudes próximas a las Islas Canarias, se ha descrito la presencia de tábanos en áreas prevalentes de surra en dromedarios, destacando Atylotus agrestis como la especie más abundante (Dia et al., 1997c; Abdesalam et al., 2002). No obstante, en Canarias se ha citado poca abundancia de tabánidos, recogiéndose desde el punto de vista histórico que ya en 1866, Viera y Clavijo, en su “Diccionario de Historia Natural” decía: “por fortuna, no se conoce (el tábano) en nuestras islas”. En Canarias fueron descritas la especie endémica Atylotus canarius (Enderlein, 1929), y la especie Tabanus fortunatus (Frey, 1936), resultando esta última sinónima de la especie europea Tabanus cordiger (Meigen, 1820) (Báez y Portillo, 1981; Portillo y Báez, 2002; Báez y García 2004). Estas especies fueron descritas en las islas de Tenerife, Fuerteventura y Lanzarote, no encontrándose información de su existencia en las restantes islas del archipiélago (Báez y García, 2004). La mayoría de especies de climas templados tienen una única generación al año y los adultos viven durante 2-4 semanas (Wall y Shearer, 2010). Las condiciones óptimas de Revisión bibliográfica 48 En África y en Latinoamérica se considera a T. evansi como un patógeno leve o insignificante para el ganado vacuno, siendo diferente la situación que acontece en Asia, donde presenta importancia médica y económica en esta especie y se ha confirmado la enfermedad empleando diversos métodos diagnósticos (Desquesnes et al., 2009a; Pruvot et al., 2010). No obstante, de acuerdo a Mekata et al. (2009), la situación epidemiológica de la tripanosomosis bovina en Latinoamérica puede presentar diferencias de acuerdo a las variaciones regionales en la distribución de los protozoos, habiéndose observado una mayor diversidad de los genes que codifican receptores de transferrina en las cepas sudamericanas que en las asiáticas, lo cual podría determinar diferencias en la habilidad de las distintas cepas para adaptarse a diferentes hospedadores. Reid et al. (1999) contrastaron el comportamiento de la parasitemia en el cerdo con la que mostró el ganado vacuno frisón en estudios de otros autores, y observaron durante los primeros meses tras una infestación un patrón similar en ambas especies, con más días mostrando aparasitemia que días con parasitemia. Como reservorios para T. evansi podrían intervenir especies cinegéticas (NTTAT, 2009). A este respecto, de acuerdo a Reid et al. (1999), en Indonesia se citó como reservorio de la enfermedad a una especie de cérvido, que destaca en este sentido sobre los cerdos salvajes. Los cerdos salvajes, mostraron una alta tolerancia al protozoo sin apreciarse sintomatología, observándose parasitemias bajas y oleadas parasitémicas con intervalos entre picos de hasta veinte días. Este patrón menos marcado que la especie de cérvido también estudiada, hace de esta forma al cerdo comparativamente una especie menos efectiva como reservorio en Indonesia. En una zona endémica de tripanosomosis por T. evansi de Brasil, a principios de la década pasada se realizaron dos estudios de campo que incluyeron también suidos salvajes: en el primero de ellos no se detectó parasitemia (Herrera et al., 2004) y en el segundo a pesar de que sólo se detectó parasitemia por PCR, se les atribuye un importante rol en el mantenimiento de T. evansi (Herrera et al., 2008). Continuando con especies cinegéticas, pero en este caso de caza menor, no se han encontrado referencias acerca de infestaciones naturales en conejos silvestres por este Revisión bibliográfica 49 mismo protozoo, por lo que el significado de esta especie en la epidemiología de esta enfermedad es desconocido. Reglero et al. (2007), describieron una infestación por Trypanosoma spp. en conejos salvajes al sur de la Península Ibérica, pero no fue identificada la especie, sugiriéndose que fuera Trypanosoma nabiasi, la especie aceptada que infesta a conejo salvaje y doméstico y se transmite a través de la ingestión de pulgas o de heces de este insecto. De acuerdo a Uche et al. (1992), los conejos son resistentes a la infestación por T. evansi. En una infestación experimental se sugirió que los conejos son refractarios al parásito, al observarse que T. evansi desparece del torrente sanguíneo después del día ochenta y dos tras inoculación, restableciéndose también los parámetros hematológicos que se mantenían alterados durante la etapa de presencia de parasitemia (da Silva et al., 2008a). En otra infestación experimental en conejos se observó que la parasitemia desapareció a los noventas días post-inoculación, observándose variaciones irregulares de parasitemia (da Silva et al., 2009a). Los pequeños rumiantes se han asociado a menudo a los hábitats de los dromedarios, así como también ocurre en algunos otros lugares del mundo, donde podrían ser reservorios del protozoo (Gutiérrez et al., 2010). En el este de África se ha citado la probabilidad de que cabras y ovejas puedan ser hospedadores probables de T. evansi, cuando se crian en rebaños con dromedarios, y se ha demostrado, tras la inoculación experimental, que las cabras pueden cursar con un cuadro severo (Ngeranwa et al., 1993). No obstante, en el noroeste africano, concretamente en el sur de Mauritania, tras estudios de campo se ha descartado el rol que pueden desempeñar los pequeños rumiantes en la epidemiología de la tripanosomosis por T. evansi en camellos, a pesar de haberse demostrado susceptibilidad de forma experimental a la cepa del lugar, mostrándose una clínica de abortos y pérdida de peso en ovino, y un curso generalmente subclínico en caprino (Jacquiet et al., 1993). Por otro lado, pueden ser considerados como importantes reservorios de la enfermedad en Latinoamérica la capibara (Hydrochoerus sp.), el coati (Nasua sp.) y el murciélago vampiro (Desmodus sp.) (NTTAT, 2009). Revisión bibliográfica 50 Exceptuando a la capibara, que es también un roedor, pero sólo presente de modo salvaje en Sudamérica, no existe demasiada información disponible en la bibliografía acerca del rol que desempeñan los roedores silvestres en la epidemiología de infestaciones naturales por T. evansi. No obstante, los roedores presentan susceptibilidad a T. evansi y además son usados a menudo como modelo para diagnóstico a través de inoculación (OIE, 2011). Además, se ha confirmado la posibilidad de la infestación por T. evansi en roedores a través de la vía oral (Raina et al., 1985; da Silva et al., 2007). Revisión bibliográfica 51 5. PATOLOGÍA DE LA INFESTACIÓN POR Trypanosoma evansi 5.1. Manifestaciones clínicas 5.1.1. Generalidades Los signos clínicos típicos de surra descritos son fiebre intermitente, anemia, emaciación, edema, conjuntivitis y epífora, linfadenomegalia, esplenomegalia, daño en la función motora y abortos (Taylor y Authié, 2004). El edema se puede observar en la región intermandibular, las extremidades, el abdomen (Desquesnes, 2004) e incluso en algunas especies se ha descrito en tejidos de la cara, párpados y orejas (Da Silva et al., 2009a; 2010a). Otro amplio grupo de signos clínicos han sido atribuidos a la infestación por T. evansi, incluyendo sialorrea, diarrea, ictericia, descarga nasal mucopurulenta, disnea, alopecia, urticaria, infertilidad, disminución en la producción lechera en vacuno, debilidad, incoordinación y parálisis (Luckins y Dwinger, 2004). Cuando los parásitos acceden al sistema nervioso central y al humor acuoso, se pueden observar síntomas neurológicos y hemorragia ocular (Desquesnes, 2004). Los signos neurológicos podrían ser observados en los estadios tardíos de la enfermedad (Taylor y Authié, 2004). En casos de tripanosomosis cerebral los animales muestran signos de torneo, excitación, comportamiento agresivo, ataxia, paresia de miembros pelvianos, decúbito lateral, convulsión y finalmente muerte (Luckins y Dwinger, 2004). La enfermedad puede presentarse de forma aguda en animales jóvenes y hembras preñadas, los cuales mueren en pocas semanas, pero en zonas endémicas la presentación común de la enfermedad es la forma crónica que cursa durante años y conduce a caquexia y muerte del animal (Taylor y Authié, 2004). Factores tales como el estrés por transporte, situaciones climáticas adversas, deficiencias nutricionales, cambios fisiológicos y enfermedades concurrentes, puede dan lugar a tripanosomosis clínica en animales con infestaciones latentes (Luckins y Dwinger, 2004). Revisión bibliográfica 52 5.1.2. Manifestaciones clínicas en camélidos La surra en camellos es una enfermedad crónica debilitante, que presenta un impresionante desarrollo de síntomas clínicos aparentes alrededor del mes de la infestación. Se presentan episodios agudos de fiebre, asociada con apatía, falta de apetito y epífora, coincidiendo con los picos de parasitemia elevada. Poco a poco, el animal pierde condición, la joroba se encoge y aparece debilidad progresiva. Se pueden producir edemas. Las hembras preñadas a menudo abortan. La enfermedad por lo general suele ser mortal, a veces con bastante rapidez en un par de semanas o más a menudo unos pocos meses después de su comienzo; no obstante la evolución es mucho más a menudo crónica, y puede durar hasta dos o tres años. En los casos crónicos suele ser muy difícil encontrar los parásitos en la sangre por medios directos (Uilenberg, 1998). Figura 7. (A) Dromedario afectado por surra de forma crónica: nótese el adelgazamiento, atrofia de la joroba y edema en prepucio y extremidades pelvianas. (B) Edema prepucial en dromedario macho afectado por T. evansi. (C) Prepucio normal en dromedario macho. Revisión bibliográfica 53 Los casos agudos a menudo muestran signos de fiebre recurrente acompañada de anemia progresiva y pobre condición corporal, pudiéndose desarrollar también edema y parálisis. Los casos subagudos acontecen con fiebre, edema, emaciación y alta mortalidad. El edema varía desde placas en el cuello y flancos a edema en hocico, pared torácica, prepucio y escroto y en las piernas hasta las rodillas y los corvejones (Wernery y Kaaden, 2002). La surra crónica en camellos se caracteriza por anemia, edema y emaciación, e intermitentes episodios de fiebre, entre los cuales el parásito podría estar ausente en los vasos sanguíneos periféricos (Fowler, 2010). Se pueden producir nacimientos prematuros, abortos y disminuir la producción de leche. Algunos camellos pueden recuperarse espontáneamente (Wernery y Kaaden, 2002). En camellos, la infestación por T. evansi se complica a veces por infecciones pulmonares (Taylor y Authié, 2004), así como en esta misma especie, este protozoo ha sido implicado como factor predisponente en brotes causados por Clostridium perfringens (Luckins y Dwinger, 2004). En la forma crónica de la enfermedad, dependiendo de los cuidados proporcionados al animal, la supervivencia podría ser hasta de tres o cuatro años (Fowler, 2010). 5.1.3. Manifestaciones clínicas en equinos Los caballos son considerados como una especie altamente sensible a la enfermedad (OIE, 2010). Los asnos, sin embargo, suelen padecer infestaciones crónicas o asintomáticas y podrían actuar como reservorios de la enfermedad (Taylor y Authié, 2004). En los caballos se han descrito muchos signos clínicos comunes a otras especies animales, como palidez de mucosas, ictericia, linfadenomegalia superficial, edema (submandibular, prepucial, y abdominal ventral), hemorragia o derrame conjuntival y abortos (Marques et al., 2000; Rodrigues et al., 2005). Se ha observado que caballos que se recuperaron de la enfermedad continuaron con una mala condición corporal (Rodrigues et al., 2005). En caballos afectados por la forma crónica de la surra se ha Revisión bibliográfica 54 descrito emaciación progresiva, a pesar de que los animales presentaron apetito voraz (Rodrigues et al., 2005), y en algunos casos se observó apetito reducido (Marques et al., 2000). Los términos “mal de caderas” y “derrengadera”, utilizados en Sudamérica para definir la enfermedad producida por T. evansi, hacen alusión a la sintomatología neurológica y debilidad que presentan los caballos en los cuartos traseros, y que se manifiestan a través de ataxia, ceguera, torneo, hiperexcitabilidad, decúbito lateral, déficits propioceptivos (mostrado por andar vacilante y pasos descoordinados e inestables), caída y desvío de la cabeza y “posición de perro sentado” (Marques et al., 2000; Rodrigues et al., 2005). Se observó que la “posición de perro sentado” la adoptaron los animales cuando fueron sometidos a un esfuerzo físico, siendo incapaces de soportar peso en los cuartos traseros, y después de algunos minutos, y a pesar de la gran dificultad, los animales pudieron levantarse y permanecer en estación (Marques et al., 2000). 5.1.4. Manifestaciones clínicas en especies rumiantes ganaderas El ganado vacuno se comporta a menudo como portador asintomático en Sudamérica, mientras que desarrolla formas crónicas de la enfermedad en Asia (Taylor y Authié, 2004). En novillas frisonas infestadas con una cepa indonesia de T. evansi se observó aumento de la temperatura corporal, anemia y disminución en la ganancia de peso, observándose en algunos casos una capacidad de ingesta reducida (Payne et al., 1992). El ganado bovino raramente se ve afectado de forma grave, pero el parásito puede tener una influencia negativa en la fertilidad y las razas lecheras no pueden alcanzar su potencial de producción (Uilenberg, 1998). Las formas agudas de la enfermedad pueden ocurrir en búfalo y en ganado bovino en las zonas donde se presenta la enfermedad por primera vez. Incluso en las zonas endémicas, T. evansi puede causar anemia y pérdida de la condición corporal de búfalos, y aunque la infestación no suele ser fatal, la enfermedad puede tener una gran importancia económica. Los animales de tiro son particularmente propensos a los efectos de la infestación (Uilenberg, 1998). Revisión bibliográfica 55 Aunque las infestaciones experimentales pueden causar la enfermedad en los pequeños rumiantes, a nivel de campo las ovejas y las cabras no se ven afectadas frecuentemente de forma grave (Uilenberg, 1998). La enfermedad ha sido descrita en pequeños rumiantes de forma subclínica, moderada y severa, describiéndose parasitemia errática, pérdida de peso y una caída significativa del hematocrito (Gutiérrez et al., 2006a). En ovejas, los síntomas de la enfermedad que se han descrito incluyen anemia, palidez de mucosas, epífora, pérdida de apetito, emaciación, inapetencia y aspecto áspero de la lana junto a pirexia fluctuante que en la mayoría de los casos coincidió con los picos de parasitemia. Se describieron dos formas distintas de la enfermedad: por un lado se observó una forma aguda, con una supervivencia dentro de los primeros 14 días tras la infetación; por otro lado se mostró la forma crónica, con una supervivencia de casi dos meses (Audu et al., 1999a). Cabras inoculadas de forma experimental con T. evansi procedente de un camello, mostraron un curso de la enfermedad subclínico, con unos pocos episodios de fiebre en las primeras semanas y artritis a los seis meses post-inoculación (Gutiérrez et al., 2004a). Además se observó ulceración corneal en un caso, que tras tratamiento con droga tripanocida remitió totalmente, y otro caso de retinocoroiditis que persistió sin evolución (Morales et al., 2006). A pesar de que no existen signos patognomónicos, signos clínicos como progresiva pérdida de peso, membranas mucosas pálidas, pelo áspero, temperatura corporal fluctuante y anemia, junto a otros signos menos frecuentes como tos, aumento testicular y diarrea, podrían indicar infestación por T. evansi en cabras en zonas endémicas de surra, pero el diagnóstico definitivo no se puede confirmar sin detección de tripanosomas en sangre (Dargantes et al., 2005a). En búfalos infestados por T. evansi se observaron membranas mucosas anémicas, depresión, debilidad, intolerancia al ejercicio, pérdida de apetito y emaciación (Damayanti et al., 1994). Revisión bibliográfica 56 5.1.5. Manifestaciones clínicas en carnívoros domésticos Tanto en Sudamérica como en Asia existen descripciones de la enfermedad en perros, que presentan la forma aguda con signos clínicos oculares, vasculares y neurológicos (Taylor y Authié, 2004). Varios autores han descrito signos clínicos comunes en perros que incluyen anemia de moderada a severa, fiebre, emaciación progresiva e inapetencia, y además se observaron algunos casos de conjuntivitis, linfadenomegalia palpable, edema en las extremidades y un inicio gradual de paresia en los cuartos traseros (Silva et al., 1995; Aquino et al., 1999; Franciscato et al., 2007). Da Silva et al. (2010a) observaron de forma común apatía, debilidad, hiporexia, edema palpebral y caquexia en gatos infestados de forma experimental por T. evansi; en menor grado aparecieron además otros signos como vómitos, palidez de mucosas, diarrea, deshidratación superior al 6% y áreas alopécicas en la cara. En menos del 50 % se observó anorexia, mucosas congestivas, conjuntivitis, opacidad corneal, respiración abdominal, edema de los tejidos de la cara, piel seca, rigidez, mortalidad y ya por último en menor proporción, por debajo del 30% se registraron arritmias, edema de extremidades, abscesos y enfisema subcutáneo. 5.1.6. Manifestaciones clínicas en otras especies animales En suidos y cérvidos salvajes inoculados experimentalmente con T. evansi no se observó indicios de la enfermedad ni disminución notable del apetito. Tras una parasitemia estable al inicio, en ambas especies se produjo un patrón fluctuante de parasitemia con repetidos picos, siendo el inicio de este patrón más temprano en los cerdos salvajes (Reid et al., 1999). En coatis (Nasua nasua) infestados experimentalmente con T. evansi se observó de forma común emaciación progresiva y aumento de ganglios linfáticos, y en algunos casos fueron descritos depresión, letargia y moderada fotofobia. No se detectó fiebre, no existiendo correlación entre la temperatura y la parasitemia (Herrera et al., 2001). Revisión bibliográfica 57 En conejos infestados por T. evansi se observó anorexia, apatía, mucosas pálidas y edema en pabellones auriculares y párpados, con disminución en la ganancia de peso, aunque no se produjeron muertes como consecuencia de la parasitosis (da Silva et al., 2009a). En otro estudio en esta especie Barman et al. (2010) observaron un registro regular de la temperatura, que presentó aumentos a los días 14 y 31 post-inoculación; además se produjo conjuntivitis purulenta, inflamación y edema en nariz, párpados y escroto, con descarga nasal y en pene, que progresó a ulceración e incluso a desprendimiento; se observó eczema en algunos casos, presentándose de forma generalizada emaciación y caquexia que aumentaba con el progreso de la enfermedad junto con edemas en varias zonas corporales, así como asfixia pasado un mes, y en algún caso opacidad corneal unilateral; además dichos autores registraron muerte de los animales infestados a los 43-86 días tras la inoculación. En ratones infestados experimentalmente por T. evansi se observó palidez corneal que aumentó con el avance de la parasitemia, reducción del apetito pero invariable y no en todos los animales, apatía y pelo áspero que progresó a pelo erizado, descarga ocular, nasal y de pene en algunos casos a los 3 días post-inoculación; la mayoría de los animales estiraban su cuerpo todo lo posible. En el estadío final los ratones se movía desorientados, paraban y volvían a moverse, por último saltaban y morían en decúbito lateral o dorsal, dentro de las 80-96 horas tras la inoculación (Barman et al., 2010). En capibara, Hydrochaeris hydrochaeris, el mayor roedor del mundo que habita en Sudamérica y que actúa de reservorio de T. evansi, no se observaron signos clínicos en una infestación experimental con dicho protozoo (Franke et al., 1994). En conejillo de indias los signos clínicos se observaron entre las 3-4 semanas postinoculación y se produjeron dos picos de temperatura corporal en el primer mes; se observó emaciación, palidez conjuntival, y estornudos y asfixia después del día 25 postinoculación, con muerte registrada entre los días 38-61 post-inoculación (Barman et al., 2010). Se han descrito tripanosomosis en félidos salvajes en la India. En gato de la jungla o de los pantanos (Felis chaus) infestado por T. evansi se observó opacidad corneal bilateral, con descaraga serosa y fotofobia (Dakshinkar et al., 2002). En un tigre afectado por T. evansi se observó anorexia, estreñimiento y letargia, taquipnea y jadeo, taquicardia, Revisión bibliográfica 64 5.2.1.1.4. Especies rumiantes ganaderas En la mayoría de unos terneros de raza frisona infestados de forma experimental con T. evansi se produjo una rápida caída del valor del hematocrito después de la aparición de los parásitos, y permaneció hasta el final del periodo de observación en valores inferiores a los obtenidos previamente a la inoculación (Payne et al., 1992). En terneros de búfalos de agua (Bubalus bubalis) infestados por T. evansi se observó disminución en la concentración de hemoglobina, hematocrito y recuento de eritrocitos, observándose unos valores aumentados del volumen corpuscular medio (VCM) y disminución de concentración de hemoglobina corpuscular media (MCHC), describiéndose por tanto una anemia macrocítica e hipocrómica (Hilali et al., 2006). En cabras inoculadas experimentalmente se observó anemia normocítica y normocrómica, con carácter no regenerativo por disminución de la hematopoyesis en la fase tardía de la enfermedad, sobre todo en cabras que recibieron mayor dosis infestante (Dargantes et al., 2005a). Sin embargo, en cabras infestadas experimentalmente con la cepa de T. evansi presente en Canarias, se observó recuperación de los valores del hematocrito a los 8 meses post-inoculación (Gutiérrez et al., 2004a) dentro de rangos normales para esta especie (Byers y Kramer, 2010), aun habiendo recibido una dosis infestante aún mayor a la descrita por Dargantes et al. (2005a). En ovejas infestadas por T. evansi se observó una leve anemia caracterizada por una disminución en el recuento de eritrocitos y del hematocrito, citándose dos casos de autocuración donde se observó un incremento de estos parámetros que precedieron a la cura (Onah et al., 1996). 5.2.1.2. Hematología: Alteraciones de la serie blanca Las alteraciones en la serie blanca como consecuencia de la surra pueden ser enormemente variadas entre especies, e incluso dentro de la misma especie. Dentro de los leucocitos, generalmente son los linfocitos las células que presentan más variaciones en su recuento. Revisión bibliográfica 65 5.2.1.2.1. Camélidos Se asocia un incremento de linfocitos, eosinófilos y monocitos a la infestación por T. evansi en camellos (Wernery y Kaden, 2002). En camellos parasitémicos se observó una leucocitosis de tipo linfocítica y monocítica, aunque también se registró un aumento de eosinófilos sin significación estadística (Juste, 2000; Gutiérrez et al., 2005). 5.2.1.2.2. Equinos Marques et al. (2000) describieron una infestación natural en caballos sin cambios significativos en la serie blanca, aunque algunos animales mostraron leucocitosis en algunos momentos durante el proceso. Silva et al. (1995) sin embargo, observaron una leve leucopenia con relativa linfocitosis y monocitosis, y disminución en el recuento de neutrófilos como alteraciones leucocitarias en caballos afectados también de forma natural. Por otro lado, Rodrigues et al. (2005) observaron leucocitosis, atribuida a linfocitosis, en la mitad de un grupo de caballos afectados de forma experimental por T. evansi. En una yegua infestada por T. evansi se observó una leucocitosis asociada a una marcada linfocitosis, y además un elevado número de células en el examen del líquido cefalorraquídeo, predominando los linfocitos y células plasmáticas (Berlin et al., 2009). 5.2.1.2.3. Carnívoros domésticos En un perro infestado de forma natural por T. evansi se observó leucopenia debido a linfopenia y eosinopenia en el momento de la valoración veterinaria tras historia de pérdida de peso desde hacía aproximadamente un año, debilidad, progresiva pérdida de apetito y anemia; un segundo hemograma realizado posteriormente aunque no se precisa cuanto tiempo después, reveló neutropenia y linfocitosis, con el recuento total de glóbulos blancos dentro de los límites fisiológicos (Franciscato et al., 2007). En perros infestados experimentalmente se manifestó leucopenia como consecuencia de una significativa neutropenia entre la semana dos y cinco post-infestación, restableciéndose los valores dentro de los rangos fisiológicos una vez pasado ese Revisión bibliográfica 66 periodo y hasta el final del estudio, si bien los valores fueron inferiores a los del grupo control. Además, y aunque los linfocitos presentaron una tendencia a la baja también entre la semana dos y cinco en los perros infestados, el recuento de estas células se mantuvo dentro de los límites fisiológicos (Aquino et al., 2002). 5.2.1.2.4. Especies rumiantes ganaderas En cabras inoculadas experimentalmente con T. evansi se observó un progresivo aumento en el recuento de leucocitos, los cuales se mantuvieron en valores altos durante seis/siete semanas, evolucionando a una leucopenia en la etapa tardía de la enfermedad. Esta evolución fue atribuida a la inmunosupresión y a su correlación directa con la dosis infestante (Dargantes et al., 2005a). En ovejas infestadas por T. evansi se observó una disminución transitoria en el contaje de leucocitos, seguido por un incremento significativo el día 22 tras la inoculación, observándose en paralelo un aumento constante de la proporción media y número de linfocitos y neutrófilos. Tras la infestación se observó una disminución de eosinófilos por debajo de los niveles previos a la inoculación que se mantuvo durante todo el curso de la infestación. Los monocitos mostraron inicialmente un incremento, pero sobre el día 12 post-inoculación se observó un retorno a los niveles previos a la inoculación (Onah et al., 1996). En ovejas que presentaron autocuración, se observó al inicio de la infestación una disminución mayor de leucocitos en los quince primeros días, pero después el recuento permaneció ligeramente por debajo de los niveles previos a la inoculación hasta el día 43, cuando retornó a los niveles anteriores. Independientemente de esto, hubo un patrón trifásico de linfocitosis, que fue paralelo con fases de neutropenia. La proporción media de eosinófilos disminuyó y permaneció en niveles previos a la inoculación, incluso después de la autocuración. La proporción media de monocitos mostró una disminución inicial y de forma general permaneció por debajo de los valores previos a la infestación, excepto en el día 43 (Onah et al., 1996). Revisión bibliográfica 67 En terneros de búfalos de agua (Bubalus bubalis) infestados por T. evansi se observó incremento en el recuento de leucocitos con linfocitosis y monocitosis, no detectándose variaciones significativas en el recuento de neutrófilos y eosinófilos (Hilali et al., 2006). 5.2.2. Alteraciones bioquímicas La infestación por T. evansi produce algunas alteraciones bioquímicas sanguíneas como consecuencia de alteraciones orgánicas derivadas de la patogenicidad del protozoo. A continuación se presenta una revisión sobre las alteraciones en los distintos parámetros bioquímicos de mayor interés en las distintas especies animales. 5.2.2.1. Proteínas séricas totales: Albúmina y globulinas En camellos infestados de forma natural por T. evansi se observó un aumento significativo de las proteínas totales, con un ratio A/G (albúmina/globulinas) disminuido con respecto a animales no infestados (Juste, 2000). En cabras infestadas experimentalmente con T. evansi se observaron fluctuaciones en la concentración de proteínas totales a lo largo del estudio, con aumentos significativos después de la inoculación (Gutiérrez et al., 2004a). De forma similar en perros y gatos inoculados de forma experimental con T. evansi se observó que los niveles de proteínas totales también aumentaron significativamente con respecto al grupo control, detectándose un aumento significativo de las globulinas y una disminución también significativa en la concentración de albúmina (Aquino et al., 2002; Costa et al., 2010). En contraste con lo anterior, en caballos infestados de forma experimental no se detectaron cambios estadísticamente significativos en los niveles de proteínas totales (Marques et al., 2000). De forma semejante, en una yegua infestada de forma natural se observó hipoproteinemia; sin embargo y como en otras especies animales, se describió Revisión bibliográfica 68 hipoalbuminemia como hallazgo bioquímico (Berlin et al., 2009). En esta especie también se ha descrito hiperproteinemia de grado variable (Rodrigues et al., 2005). Franciscato et al. (2007) describieron en un perro infestado de forma natural niveles normales de α-globulinas y un aumento de ß-globulinas e hipergammaglobulinemia con características de gammapatía policlonal. En gatos infestados se observaron incrementos en la fracción α-2 globulina, ß-globulinas (aunque dentro del rango fisiológico) y de γglobulinas (Costa et al., 2010). En camellos infestados por T. evansi el incremento de proteínas se debió a un aumento de las globulinas, fundamentalmente debido a γglobulinas (Juste, 2000). 5.2.2.2. Enzimas De acuerdo a Enwenzor y Sackey (2005), en la patogenia de la infestación por T. evansi en camellos ocurren dos sucesos relacionados con las enzimas séricas: 1. en primer lugar aparece un marcado incremento de la enzima succinato deshidrogenasa (SDH) coincidente con la aparición de tripanosomas en el torrente sanguíneo. Se desconocen los mecanismos bioquímicos de este incremento. 2. en segundo lugar y también en el tiempo ocurre un marcado incremento de aspartato aminotransferasa (AST) y aumento moderado de alanina aminotransferasa (ALT). En algunos estudios de la enfermedad natural en dromedarios no se detectaron alteraciones significativas de las enzimas amilasa, ALT, AST, gamma glutamil transpeptidasa (GGT), lactato deshidrogensa (LDH) y lipasa, por lo que no se sugirieron alteraciones hepáticas (Juste, 2000; Gutiérrez et al., 2005). En estos camellos se observaron incrementos significativos de creatin-cinasa, directamente relacionados con lesión muscular progresiva por caquexia y decúbito en las fases finales de la enfermedad (Juste, 2000). Revisión bibliográfica 69 En gatos infestados de forma experimental, los parámetros hepáticos no se encontraban alterados, ya que los valores de ALT y GGT no presentaron diferencia entre infestados y grupo control (da Silva et al., 2009c). En perros infestados de forma experimental se observó un marcado incremento en los niveles de AST por encima de los valores normales, así como un moderado incremento de ALT pero dentro de los límites de referencia, de forma que se atribuyó el conjunto de estas alteraciones a daño cardíaco y no a daño hepático (Aquino et al., 2002). 5.2.2.3. Bilirrubina, índice ictérico En dromedarios que presentaban parasitemia por T. evansi se encontraron valores de bilirrubina significativamente elevados, lo que se atribuyó a fenómenos hemolíticos (Juste, 2000). Sin embargo, en perros también infestados pero experimentalmente, la bilirrubina se mantuvo dentro del rango normal (Aquino et al., 2002). En caballos se observó que los incrementos en el índice ictérico coincidían con periodos de alta parasitemia, lo que sugiere que la ictericia aparece como consecuencia de una acción hemolítica de los parásitos (Marques et al., 2000). 5.2.2.4. Urea y Creatinina En un estudio con gatos experimentalmente infestados, los valores de urea y creatinina no presentaron diferencias comparados con el grupo control (da Silva et al., 2009c). En dromedarios infestados naturalmente se observó daño renal, por aumento de creatinina y urea en animales parasitémicos (Juste, 2000), mientras que en otros casos, sólo se observó un aumento de la urea en sangre que no estuvo acompañado de elevación de creatinina y fue atribuido, por tanto, a un incremento en el catabolismo de las proteínas corporales (Gutiérrez et al., 2005). Revisión bibliográfica 70 5.2.2.5. Macro y microminerales Con respecto a los macro y microminerales, se ha observado hipercalcemia en una yegua infestada por T. evansi como hallazgo bioquímico anormal (Berlin et al., 2009). En camellos afectados no se observaron alteraciones en los niveles de calcio, fósforo, sodio, potasio y cloro. Se observó disminución en la concentración de hierro con respecto a los no infestados (Juste, 2000: Gutiérrez et al., 2005), lo que podría deberse a una disminución de proteínas transportadoras de hierro (Gutiérrez et al., 2006b). En gatos infestados por T. evansi se observaron niveles disminuidos de hierro y de zinc, y aumentos en el nivel de cobre, no estando directamente relacionadas estas alteraciones con los picos de parasitemia (da Silva et al., 2009c). 5.2.2.6. Glucosa Se observan disminuciones significativas en la glucemia en dromedarios infestados respecto a los no infestados (Gutiérrez et al., 2005). En un estudio experimental en caninos, los niveles de glucemia fluctuaron pero se mantuvieron dentro de los rangos normales y no se mostró ninguna tendencia particular entre infestados y grupo control (Aquino et al., 2002). El primer camello diagnosticado en Canarias por T. evansi presentó una hipoglucemia extrema (Gutiérrez et al., 1998). 5.2.2.7. Parámetros lipídicos Los valores de colesterol y triglicéridos no mostraban variaciones entre dromedarios parasitémicos y controles (Juste, 2000). Revisión bibliográfica 71 5.3. Anatomía patológica 5.3.1. Hallazgos macroscópicos En las tripanosomosis se ha descrito una lesión dérmica denominada chancro caracterizada por un endurecimiento nodular, presentándose esta lesión como una zona de induración con abultamiento, con vesiculación central, descamación dérmica en los bordes e hiperpigmentación, todo ello acompañado de edema (Navarrete y Acosta, 1999). En la necropsia de cabras afectadas por T. evansi se observaron cadáveres pálidos y anémicos, linfadenomegalia y presencia de líquido serohemorrágico en cavidades torácica y peritoneal (Dargantes et al., 2005b), coincidiendo estos hallazgos con los observados en camellos enfermos de forma crónica, en los cuales además se han descrito petequias de forma difusa en las meninges del cerebelo y tronco cerebral (Wernery y Kaden, 2002). En caprinos infestados se observó un corazón de aspecto pálido y flácido con derrame pericárdico serohemorrágico (Dargantes et al., 2005b); en algunos ovinos se apreciaron hemorragias petequiales en mucosa abomasal, enteritis catarral y aumento en el tamaño de las glándulas adrenales (Audu et al., 1999b). En ambas especies de pequeños rumiantes hubo hallazgos post-mortem coincidentes como esplenomegalia, hepatomegalia y linfadenomegalia, describiéndose en ovinos congestión e inflamación del parénquima pulmonar, y en caprinos lóbulos pulmonares craneales más oscuros y firmes de lo normal (Audu et al., 1999b; Dargantes et al., 2005b). En camellos afectados de forma aguda y subaguda se observan petequias en membranas serosas y en parénquima hepático y renal, apareciendo en casos subagudos hemorragias severas en la cauda equina (Wernery y Kaden, 2002). En caballos se ha descrito esplenomegalia, linfadenomegalia e hiperplasia de folículos linfoides en bazo y ganglios linfáticos (Rodrigues et al., 2005, 2009), coincidiendo estos hallazgos de necropsia con los encontrados también en algunas otras especies. Se han descrito además otras lesiones como edema subcutáneo, atrofia serosa de ganglios Revisión bibliográfica 72 linfáticos periféricos, inflamación renal con presencia de múltiples focos miliares rojos en la corteza, fluido claro en cavidad torácica y pericárdica, e hipertrofia de ventrículo izquierdo con atrofia serosa de la grasa pericárdica (Berlin et al., 2009). En équidos también se ha observado una atrofia muscular bastante marcada en los cuartos traseros (Rodrigues et al., 2005, 2009). En gatos infestados experimentalmente se describió una evidente pérdida del volumen muscular en los miembros pelvianos, y además se encontró un grado variable de ictericia en tejido subcutáneo, serosas e íntima de las arterias, junto a mucosas pálidas, esplenomegalia, linfadenomegalia, y en algunos casos, edema subcutáneo en cabeza y párpados, opacidad corneal y ascitis (da Silva et al., 2010b). En un caballo afectado de forma subaguda se observó edema cerebral, con fibrina recubriendo las meninges también edematosas, y presencia de petequias en el aspecto ventral del tronco cerebral (Berlin et al., 2009). En el cerebro de caballos infestados de forma crónica por T. evansi también se observó en algunos casos a nivel meníngeo hemorragias subpiales, apareciendo además en esta especie una inflamación asimétrica de los hemisferios cerebrales, con aplanamiento de las circunvoluciones. La sustancia blanca de los lóbulos parietal, temporal y frontal presentaba de forma zonal una coloración amarillenta y consistencia gelatinosa y friable a causa de un severo edema y malacia, presentándose en otro caso lesiones similares en el núcleo basal, tálamo y mesencéfalo (Rodrígues et al., 2009). En cadáveres de perros afectados por la enfermedad se observaron hallazgos característicos y comunes con otras especies, como emaciación, palidez de mucosas, linfadenomegalia edematosa y esplenomegalia, mostrando en un corte del bazo una prominente evidencia del tejido linfoide. Además algunos animales presentaron corazones con áreas pálidas en ambos aurículas y ventrículos derechos, mostrando estos últimos áreas hemorrágicas, y en un caso se apreció acumulación de líquido seroso en saco pericárdico (Aquino et al., 2002). Revisión bibliográfica 73 5.3.2. Hallazgos microscópicos 5.3.2.1. Piel A nivel de la piel se ha observado en caprinos afectados una reacción leve de linfocitos y macrófagos, y edema en la dermis que se extiende a nivel subcutáneo. En éstas lesiones pudieron observarse tripanosomas (Dargantes et al., 2005b). 5.3.2.2. Sistema nervioso En caprino la actividad de los tripanosomas y la reacción celular en el sistema nervioso central fue principalmente a nivel meníngeo, y de tipo leve comparada con otras especies (Dargantes et al., 2005b). En camellos las lesiones histológicas a nivel del sistema nervioso tienen un mayor carácter patognomónico, describiéndose meningitis no supurativas y meningoencefalitis focales de carácter leve a moderado en la mayoría de los animales afectados de forma aguda y subaguda (Wernery y Kaden, 2002). Se describen una infiltración perivascular amplia de leucocitos en la sustancia gris, presencia de “estructuras corpusculares” PAS positivas y eosinofílicas en las meninges e infiltrados en cauda equina, las cuales corresponden a células plasmáticas que contienen “cuerpos de Russel o Mott”. Estos hallazgos son también característicos en la tripanosomosis humana africana y otras encefalitis, habiendo sido descritas también estas estructuras en caballos como “células morulares” (Wernery y Kaden, 2002). Rodrigues et al. (2005) describieron en caballos lesiones histológicas tanto en la sustancia blanca como en la sustancia gris, mientras que Silva et al. (2010b), no observaron alteraciones microscópicas en el cerebro y médula espinal de gatos experimentalmente infestados con T. evansi. En dos perros se observaron lesiones histológicas en el sistema nervioso que correspondieron a una meningoencefalitis no supurativa, con un marcado patrón infiltrativo de carácter mononuclear a nivel de sustancia blanca y gris de la corteza y pedúnculo cerebral, alrededor de vasos sanguíneos y en las meninges de la corteza cerebral, especialmente en el surco y alrededor de las vesículas meníngeas; además Revisión bibliográfica 80 el resultado de una intensa infiltración de células polimorfonucleares, pueden promover la inducción de la inmunidad (Luckins y Dwinger, 2004). Las formas tripomastigotes de T. evansi cuando son inoculadas intradérmicamente en los hospedadores mamíferos, inducen la formación de una lesión cutánea edematosa, conocida como chancro (Luckins y Dwinger, 2004). Este surge como resultado de la propia respuesta celular, haciendo su aparición las células mononucleares, lo que produce una vasodilatación que hace posible la penetración de los parásitos en el torrente circulatorio sanguíneo para su distribución por el organismo (Navarrete y Acosta, 1999). 5.4.3. Parasitemia y fiebre intermitentes. Consecuencias Después de un periodo de incubación, los tripanosomas invaden la sangre y pueden aparecer de forma periódica o persistir a lo largo de la infestación, pero en ambos casos la parasitemia fluctúa con la temperatura del hospedador (Hoare, 1972). Asimismo, el grado de parasitemia paralela a la temperatura implica que el número de tripanosomas en la circulación, y posiblemente también en los tejidos, esté relacionado con la concentración de citoquinas pirógenas (Dargantes et al., 2005a). La merma de la condición corporal se ha asociado a la respuesta febril del organismo frente a T. evansi, más que a una disminución de la ingesta. Así, la fiebre podría contribuir a la pérdida de peso y emaciación (Aquino et al., 1999) o a la disminución de la ganancia de peso observada en animales en crecimiento afectados por la enfermedad, debido a que se producen aumentos de alrededor del 15% en la tasa metabólica por cada grado centígrado de temperatura corporal que se incrementa (Payne et al., 1992). La desaparición de la oleada parasitémica se produce por una reacción con los anticuerpos específicos formados, dando lugar a la ruptura de los tripanosomas y consiguiente liberación de antígenos somáticos. La aparición de la fiebre en agujas (intervalos entre 2 y 10 días), paralela a la oleada parasitémica tiene su origen en la capacidad evolutiva de los tripanosomas de cambiar su composición antigénica Revisión bibliográfica 81 superficial, lo que les permite de nuevo y repetidamente llegar a sangre e iniciar el proceso (Navarrete y Acosta, 1999). Se ha sugerido que la velocidad de producción de anticuerpos contra cada variación antigénica, la cual determina los intervalos entre sucesivos picos de parasitemia, está directamente relacionada con la cantidad de tripomastigotes que producen la infestación (Dargantes et al., 2005a). 5.4.4. Período de prepatencia Interpretando el período de prepatencia como la etapa de la infestación parasitaria comprendida desde el momento de la inoculación del parásito hasta la presencia de éste en sangre, debemos mencionar que la valoración de este intervalo guarda relación con la técnica diagnóstica empleada, así como con el número y virulencia de los tripanosomas inoculados (Holland et al., 2001). Se muestran diferencias en el periodo de prepatencia entre diversos estudios en distintas e incluso las mismas especies y vías de contagio. Así, se ha observado un periodo de prepatencia de 24-48 horas en gatos tras inoculación intravenosa, con un pico de parasitemia a los 5 días (da Silva et al., 2010a); aplicando la misma vía de contagio, en caprinos y ovinos algunos autores han observado un periodo de prepatencia entre 2 y 6 días (Audu et al., 1999a; Dargantes et al., 2005a). En conejos, el periodo de prepatencia observado a través de frotis sanguíneos en una infestación experimental intraperitoneal por T. evansi fue de 11 días (da Silva et al., 2008b). No obstante, en otro estudio en conejos infestados también intraperitonealmente, los parásitos fueron detectados en sangre entre 15 y 18 días post inoculación, lo cual se comprobó a través de inoculación de la sangre en ratones, en los cuales se detectó a su vez a los 8 días post inoculación (Barman et al., 2010). Por otro lado, en una infestación experimental en ratones donde no se cita la vía de contagio, se pudo detectar T. evansi a las 12 horas mediante PCR, pero no es hasta las 24-72 horas cuando se puede detectar mediante métodos diagnósticos parasitológicos directos (Fernández et al., 2009). Revisión bibliográfica 82 En perros se ha observado un periodo de prepatencia de alrededor de dos semanas, en infestación tanto por vía endovenosa como por vía oral (Raina et al., 1985; Aquino et al., 1999; Bazolli et al., 2002); sin embargo, en roedores infestados por vía oral se mostraron diferencias, con periodos de prepatencia de entre dos y diez días en ratones (Raina et al., 1985), y con una media de tres semanas en ratas (da Silva et al., 2007). En cerdos inoculados de forma experimental se observó T. evansi en sangre desde la primera semana en adelante, sin observarse signos clínicos de la infestación (Holland et al., 2003). El periodo de incubación de T. evansi en camellos varía desde alrededor de 7 días en el norte de África a 2-3 semanas en Asia (Barotte, 1925 y Yakimoff 1931, citado por Hoare, 1972). En un dromedario inoculado de forma experimental con un stock de T. evansi de Mauritania, se observó un periodo de prepatencia de 6 días (Dia et al., 1997d). Según recoge Hoare (1972), Galuzo y Novinskaja (1960) inocularon en terneros cepas de T. evansi de equino y camello de Kazajistán y los mantuvieron durante 2 años. En este experimento describieron que la infestación persistió oculta en los bovinos durante 4 meses. Sin embargo, en una infestación experimental en terneros frisones, se observó un periodo de prepatencia de 48 horas, con niveles de parasitemia altos durante las primeras 4 ó 5 semanas tras la infestación, con una frecuencia de aparición de picos de parasitemia de 7 días, observándose una disminución de la probabilidad de detección del parásito con el paso del tiempo (Payne et al., 1992). En caballos inoculados de forma experimental con T. evansi por vía intravenosa, se constató un periodo de prepatencia de 4 días, en concordancia con observaciones anteriores citadas por otros autores en infestaciones naturales y experimentales (Marques et al., 2000). 5.4.5. Patogenia de la anemia. Consecuencias La patogénesis de la anemia en la tripanosomosis por T. evansi todavía no ha sido definida de forma clara, y se han propuesto varios mecanismos que podrían incluso estar combinados entre sí. Revisión bibliográfica 83 Así se ha sugerido que la acción mecánica ejercida por la motilidad de los parásitos podría provocar la rotura de los eritrocitos (da Silva et al., 2010c). Por otro lado y de una forma general se han propuesto alteraciones hematopoyéticas como mecanismo productor de la anemia, y de una forma más concreta se ha relacionado con bajo nivel sérico de hierro y/o reducción de la actividad de la enzima acetilcolinesterasa en sangre, lo que produce alteraciones en la producción y maduración de los glóbulos rojos (da Silva et al., 2009c; 2010c, d). Otro de los mecanismos sugeridos como desencadenante de la anemia ha sido el estrés oxidativo, que produce alteraciones de la membrana eritrocítica aumentando su fragilidad. La parasitemia por T. evansi se ha relacionado no sólo con una mayor producción de radicales libres (óxido nítrico), aumento de la peroxidación lipídica e incremento de metahemoglobina, sino además también con una ineficiente capacidad de las barreras antioxidantes que tiene el organismo, que se manifiesta por la inhibición de la actividad antioxidante de la enzima superóxido dismutasa en eritrocitos y disminución sérica de glutatión, albúmina e ión ascorbato (vitamina C) (Saleh et al., 2009; da Silva et al., 2009d, 2010c) Por último, se ha mencionado como causa de anemia la destrucción de los hematíes por el sistema retículo-endotelial. A este respecto, por un lado se ha sugerido un mecanismo inmunomediado, con la participación de inmunoglobulinas específicas contra T. evansi, dando lugar a la formación de inmunocomplejos con el antígeno y el complemento sobre la superficie de los eritrocitos, permitiendo así el secuestro y destrucción de los hematíes por el sistema retículo-endotelial (Audu et al., 1999a). Por otro lado se ha propuesto la implicación de la producción de neuraminidasa o sialidasa por parte de T. evansi, lo que puede causar daños a las células y las hace más propensas a la hemólisis por parte del sistema retículo-endotelial (Shehu et al., 2006). Se ha demostrado que en animales infestados por T. evansi puede ocurrir eritrofagocitosis en el torrente sanguíneo (Silva et al., 1995). En relación con la destrucción de hematíes, en la infestación por T. evansi aparece un aumento del índice ictérico coincidente con periodos de alta parasitemia, relacionándose la ictericia con la acción hemolítica de los parásitos (Marques et al., 2000). Revisión bibliográfica 84 La severa anemia y destrucción de eritrocitos por el sistema retículo-endotelial, puede explicar la respuesta inicial de la médula ósea en la cual se produce una activa leucopoyesis y eritropoyesis. Sin embargo, en las fases finales se puede producir una regresión de la actividad de la médula ósea por un origen inmunogénico, pero que podría ser en parte debida a la citotoxicidad de los propios tripanosomas (Dargantes et al., 2005b). Baral et al. (2007) describieron que la anemia no es el principal determinante en el tiempo de supervivencia del hospedador, y señalan que la anemia parece estar relacionada al factor de necrosis tumoral (TNF), a través de la señal mediada por TNFR2 durante la última etapa de desarrollo de la misma. La anemia persistente conduce a una disminución de la llegada de oxígeno a los tejidos, apareciendo en estas condiciones signos de disfunción en algunos órganos, lo que produce un aumento del gasto cardíaco y afecta sobre todo al sistema nervioso, con desarrollo de anoxia cerebral. Esto puede contribuir a producir depresión del estado mental en el animal afectado (Enwezor y Sackey, 2005). 5.4.6. Patogenia del edema Otro de los fenómenos que se presenta en la tripanosomosis por T. evansi es el edema, debido al aumento de la permeabilidad endotelial de los vasos sanguíneos por las reacciones inflamatorias continuas, así como a la formación de inmunocomplejos que ocasionan un incremento en la liberación de cininas plasmáticas (Barman et al., 2010). Además, se ha sugerido que el edema puede ser atribuido a variaciones en la presión osmótica debidas a la reducción del nivel de proteínas, concretamente hipoalbuminemia como consecuencia del aumento de la permeabilidad vascular, y por lo tanto extravasación de albúmina al intersticio (Silva et al., 2010e). Se ha sugerido además en rumiantes que la disminución de la concentración plasmática de proteínas puede ser debida a destrucción de proteínas o pérdida de urea y hemodilución (Audu et al., 1999a). Revisión bibliográfica 85 De acuerdo a Costa et al. (2010), se han propuesto otros mecanismos para explicar la hipoalbuminemia observada en algunas especies. En primer lugar, puede ser debida a un mecanismo compensatorio para mantener la osmolaridad, teniendo en cuenta que la hipoalbuminemia es seguida por el desarrollo de hiperglobulinemia; otra de las posibles causas podría ser la insuficiencia hepática; y por último se ha propuesto la implicación de las citoquinas, concretamente la interleucina 1 (IL-1), que modula la producción de proteínas por los hepatocitos y disminuye la producción de albúmina y transferrina. Otro mecanismo propuesto, que podría interpretar el edema observado en diferentes zonas corporales, se ha centrado en una rápida sucesión de variaciones antigénicas de los tripomastigotes, lo que conllevaría una estimulación no específica de la proliferación de células B, hecho que incrementaría el nivel de macroglobulinas. Estas macroglobulinas podrían incrementar a su vez la viscosidad plasmática, lo que conduciría a estasis vascular sanguínea, permitiendo a continuación que escape al espacio extravascular la porción plasmática de la sangre (Barman et al., 2010). 5.4.7. Invasión del sistema nervioso central y alteraciones neurológicas Como continuación de la etapa temprana hemolinfática en la tripanosomosis por T. evansi, seguidamente los tripomastigotes invaden el sistema nervioso central al traspasar la barrera hematoencefálica. El mecanismo por el cual los tripomastigotes traspasan esta barrera es desconocido, pero se cree que ocurre de forma primaria por una acción directa del parásito que interrumpe la continuidad de la estructura, o bien secundariamente por liberación de mediadores químicos incluyendo citoquinas y proteasas (Silva et al. 2011; Berlin et al., 2009, Rodrigues et al., 2009). Se ha sugerido que la ruta por la cual se abren las uniones celulares (zonula ocludens) del epéndimo tiene lugar en los plexos coroideos, donde se forma el líquido cefalorraquídeo (Lemos et al., 2008) En el sistema nervioso central se produce una infiltración perivascular de linfocitos y células plasmáticas, causando una meningoencefalitis no supurativa con necrosis, edema, hemorragia, pleiocitosis con linfocitosis predominante, y además presencia de Revisión bibliográfica 86 tripomastigotes en el líquido cefalorraquídeo (Berlin et al., 2009, Rodrigues et al., 2009). La sintomatología neurológica presente en la tripanosomosis por T. evansi ha sido relacionada por da Silva et al. (2010d, 2011) con alteraciones del neurotrasmisor acetilcolina, mediante mecanismos hipotéticos distintos: • Por un lado, en el sistema nervioso central se han descrito tanto disminuciones como incrementos en la actividad de la enzima acetilcolinesterasa, y a su vez y respectivamente se sugirió una relación de la sintomatología neurológica por una disminuida o excesiva hidrólisis del neurotransmisor, teniendo en cuenta que esta enzima es la encargada de la catálisis de acetilcolina. • Otra hipótesis en la que se ha relacionado a la disminución de acetilcolina en las estructuras cerebrales es la presencia de unos 1200 receptores nicotínicos de acetilcolina que presenta cada tripomastigote de T. evansi, pudiendo así reducir la cantidad de este neurotransmisor en el espacio sináptico. • Por último, otra de las hipótesis sugeridas para explicar el aumento de la acetilcolinesterasa ha sido la presencia de esta enzima en el parásito, no asociándose entonces a una respuesta colinérgica en sí por parte del hospedador. Además del papel de la colinesterasa, las alteraciones locomotoras como incoordinación o parálisis de miembros posteriores se han relacionado también con lesiones en nervios, más que como consecuencia de la atrofia muscular (Silva et al., 2011). 5.4.8. Respuesta inmunitaria. Inmunodepresión En la respuesta inmunitaria frente a T. evansi se observan dos factores asociados a los mecanismos de defensa a través de la respuesta de tipo celular, representada por la fagocitosis del parásito, y la respuesta de tipo humoral, representada por la tripanolisis (Quiroz, 1986). Revisión bibliográfica 87 Se ha sugerido que la citopatología mostrada en la enfermedad aparece como respuesta al sistema inmunitario (Dargantes et al., 2005b). Como ejemplo y sin necesidad de una acción directa de los tripomastigotes sobre el riñón, se puede producir glomerulonefritis que puede responder a un proceso inmunomediado secundario a la infestación, por depósito de inmunocomplejos (Berlin et al., 2009), incluso pudiendo estas lesiones del glomérulo contribuir a la muerte del animal (Dargantes et al., 2005b). 5.4.8.1. Respuesta inmunitaria celular Durante la infestación por T. evansi se produce una reacción celular generalizada esencialmente de linfocitos y macrófagos (presumiblemente con células dendríticas), tanto en el sistema linfático como en el resto de órganos. La respuesta inmunitaria frente a la infestación aparece intensamente a través de linfocitos B y T, dando como resultado deposición de hemosiderina en distintos órganos por la respuesta simultánea de los macrófagos (Dargantes et al., 2005b). De acuerdo a Onah et al. (1999), la composición de linfocitos en la sangre periférica de ovejas infestadas por T. evansi se ve alterada. En ese estudio se observó un comportamiento distinto en las subpoblaciones celulares de linfocitos en unas ovejas que curaron sin necesidad de tratamiento, frente a ovejas infestadas que no curaron hasta que se aplicó terapia, por lo que estos cambios se relacionaron con la habilidad para controlar la enfermedad. Los cambios celulares en los animales que remitieron sin quimioterapia tuvieron las siguientes características: • Se produjo una disminución, por debajo de los niveles previos a la infestación, de la subpoblación CD8+ durante el curso de la infestación, mientras que la subpoblación CD4+ aumentó o se mantuvo la mayor parte del tiempo, con respecto a los niveles preinfestivos. Esto se observó como un ratio CD4:CD8 incrementado con respecto al grupo de ovejas que hubo que tratar en las cuales este ratio disminuyó. • A pesar de que hubo un aumento en los linfocitos B circulantes en todos los animales infestados, este incremento fue significativamente más bajo en los Revisión bibliográfica 88 animales que remitieron sin terapia, presentando en éstos un comportamiento bifásico en el cual la segunda fase coincidió con incrementos de linfocitos T CD5+ y CD4+, y a su vez con el periodo de control de los parásitos y de la curación. También se ha observado la coexpresión de antígenos de superficie CD4+ y CD8+ en linfocitos T, asociados a infestaciones por T. evansi, sin conocerse el fenómeno que lo produce. La posterior depleción observada en el número de todos las subpoblaciones de linfocitos, podría explicarse a través de apoptosis o muerte celular programada asociada a coexpresión de estos dos antígenos de superficie (Onah et al., 1998a). Conforme avanza la enfermedad se produce un agotamiento del sistema inmunológico que deriva en inmunosupresión por inducción de la liberación de interferón gamma (IFNγ) y factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) por subpoblaciones de linfocitos T (Dargantes et al., 2005b). Se ha sugerido la implicación de IFNγ, dependiente de la producción de NO, en la supresión de esplenocitos en la tripanosomosis por T. evansi (Baral et al., 2007). Además, la inmunosupresión que se presenta en infestaciones por T. evansi produce una incapacidad de los animales hospedadores para responder adecuadamente a la presencia de antígenos heterólogos, pudiendo producir interferencias en el desarrollo de una protección efectiva frente a otras enfermedades distintas a la producida por T. evansi (Onah et al., 1998b; Holland et al., 2003). Se ha observado que T. evansi induce en el hospedador un incremento de linfocitos B CD5+, es decir con antígeno de superficie CD5, y estas células representan a la mayoría de los linfocitos B circulantes durante el curso de la infestación (Onah et al., 1998a, b). La molécula CD5, aunque originalmente se encuentra en linfocitos T, la expresan los linfocitos denominados como B1a, los cuales siguen un proceso de diferenciación distinto de los linfocitos convencionales; sólo son producidos durante la etapa fetal y se encargan de producir IgM, llamados anticuerpos “naturales” o de “baja afinidad”, con un papel importante frente a antígenos independientes de linfocitos T (Arjona Saz, 2007; Abbas y Litchman, 2003). Revisión bibliográfica 89 A nivel local, se ha demostrado por ejemplo en el sistema nervioso central el papel que desempeña la microglia para actuar como células presentadoras de antígeno, produciendo una amplificación local de la respuesta inmunológica por reestimulación de linfocitos T. También se evidenció que el número de células presentadoras de antígeno y el nivel de expresión de moléculas de histocompatibilidad clase II en las diferentes poblaciones del sistema nervioso central podrían influir en el resultado de la respuesta inmunológica (Lemos et al., 2008). 5.4.8.2. Respuesta inmunitaria humoral 5.4.8.2.1. Anticuerpos En lo relativo a la defensa humoral, el rol que se le ha atribuido a los anticuerpos en el control de la enfermedad es controvertido. Así, se ha atribuido un papel esencial a las IgM, en vez de a las IgG, las cuales contribuyen significativamente durante las etapas iniciales de la infestación al control de la parasitemia y supervivencia del hospedador, indicándose que los “anticuerpos de baja afinidad” son los principales responsables de la protección frente a T. evansi (Baral et al., 2007). En oposición, observaciones realizadas por otros autores no relacionan el nivel de anticuerpos con la habilidad de los mismos para controlar la parasitemia (Payne et al., 1992; Aquino et al., 1999). Onah et al. (1999) sugirieron que la habilidad para eliminar los parásitos depende de los anticuerpos aunque no de forma exclusiva, siendo importante para ello no sólo la IgM sino también la IgG1. Así, utilizando ovejas como modelo experimental, observaron en todos los animales infestados por T. evansi una respuesta específica de IgM e IgG1. No obstante, se observó que en un grupo que curó sin necesidad de tratamiento, los niveles de inmunoglobulinas IgM e IgG1 fueron superiores y paradójicamente presentaron menor proporción de linfocitos B que el grupo de animales tratados. Además esta respuesta se muestra inicialmente con niveles altos de IgM y a continuación es reemplazada por altos niveles de IgG1, no ocurriendo este reemplazo en los animales tratados hasta la aplicación del quimioterápico. Revisión bibliográfica 96 6.1.2. Métodos de concentración En la mayoría de los hospedadores, T. evansi puede inducir una clínica leve o un estado subclínico de portador con baja parasitemia, en los cuales resulta difícil poner de manifiesto los parásitos. En estas circunstancias, los métodos de concentración son necesarios ya que incrementan la sensibilidad al examen microscópico (OIE, 2010). Como técnicas de concentración descritas para el diagnóstico de T. evansi figuran la técnica de centrifugación del microhematocrito (conocida también como técnica de Woo o MHCT, mHCT o HCT), la técnica de la capa de leucocitos en campo oscuro o contraste de fases (conocida también como técnica de Murray o BCM, -Buffy Coat Method-), y por último la técnica del mini-intercambio aniónico y centrifugación (OIE, 2010). Tanto la técnica de Woo, como la técnica de Murray permiten estimar la anemia a través de la medida de volumen que ocupan los eritrocitos sedimentados por la centrifugación en los capilares. Esto puede ser utilizado en estudios de rebaños en riesgo, de forma que el valor del hematocrito puede ser un indicador para seleccionar un subconjunto de muestras y realizar análisis complementarios, como la PCR (OIE, 2010). 6.1.2.1. Técnica de Woo o de concentración del microhematocrito (MHCT, mHCT o HCT) El método de concentración del hematocrito (MHCT, mHCT o HCT) también llamado técnica de Woo, consiste en la centrifugación de un volumen de 70 microlitros de sangre en tubos capilares durante 5 minutos a 3000g (alrededor de 12000 rpm en una centrífuga de hematocrito), para luego examinar el capilar al microscopio bajo el objetivo 10x, colocándolo directamente sobre un porta, pudiéndose observar los tripanosomas en movimiento en la interfase entre el plasma y la capa leucocitaria, también denominada esta última fase como capa “buffy coat” (Woo, 1970; OIE, 2010). Esta técnica de diagnóstico rápido y poco costosa muestra además si el animal está anémico (Desquesnes, 2004). No obstante, se recomienda realizar la técnica de Woo Revisión bibliográfica 97 dentro de las tres horas posteriores a la toma de la sangre; es mejor mantener las muestras a 4º C y preservadas de forma cuidadosa de la exposición directa a la luz solar ya que hace que los parásitos sean indetectables después de la primera media hora (Holland et al., 2001). Figura 9. Técnica de Woo: (A) Centrífuga para centrifugación de tubos capilares. (B) Fases que se definen en el capilar por gradientes de concentración tras la centrifugación. (C) Colocación del tubo capilar sobre un portaobjeto para posterior visualización de tripomastigotes móviles sobre la capa leucocitaria. Analizando sangre de caballos infestados se obtuvo una sensibilidad del 71,1 % para el MHCT (Monzón et al., 1990). En un estudio experimental en búfalos, se alcanzó una sensibilidad muy parecida a la cuarta semana post-infestación, en este caso del 72%, obteniéndose valores de sensibilidad del 100% a partir de la séptima semana, con pequeñas variaciones hasta el final del estudio (Holland et al., 2001). En un estudio experimental en ratones inoculados con T. evansi se obtuvo un porcentaje de detección del 60% a través de la técnica de Woo, llegando a ser este método dos veces más sensible que el método de la gota gruesa, probablemente porque el método MHCT utiliza mayor volumen de sangre (70-75 microlitros) que la gota gruesa (5 microlitros) y los parásitos se concentran cerca de la capa leucocitaria, lo cual facilita su observación (Fernández et al., 2009). Revisión bibliográfica 98 En conejos inoculados experimentalmente con T. evansi solamente se pudo detectar la parasitemia con la técnica de Woo en la fase aguda, con un porcentaje de detección del 100%, pero fue imposible el diagnóstico a través de este método tanto en la fase crónica como en el periodo de prepatencia, mostrando una tasa de detección total para todo el curso de la infestación del 59%. Se ha concluido que este método de concentración es efectivo para la detección de los parásitos en parasitemias altas, pero presenta limitaciones para la detección en caso de baja parasitemia, lo cual es característico de las fases crónicas (Ramírez-Iglesias et al., 2011). De acuerdo a Holland et al. (2001), a través del método de concentración del hematocrito se puede clasificar y estimar la parasitemia de acuerdo a los tripanosomas visualizados por capilar: Puntuación Tripanosomas por capilar Parasitemia estimada (tripanosomas/ ml sangre) 5+ Enjambre en capa leucocitaria >106 4+ >100 >105-106 3+ 11-100 >104>105 2+ 2-10 >103>104 1+ 1 2,5 x 102-103 0 0 <2,5 x 102 Tabla 1. Parasitemia estimada de acuerdo a la técnica de Woo (MHTC) (Holland et al., 2001) Una variante del MHCT es la “técnica de doble centrifugación”, que consiste en realizar una segunda MHCT partiendo esta vez de la capa leucocitaria obtenida en una primera centrifugación. Este procedimiento convierte esta alternativa en una técnica más exigente y que ofrece sólo una ligera mejora en la sensibilidad, mientras su reproducibilidad no resulta tan buena (Desquesnes, 2004). Revisión bibliográfica 99 Por otro lado y a modo documental, existe otro método alternativo a la técnica de Woo, denominado con las siglas QBC (Quantitative Buffy Coat method) o técnica leucocítica cuantitativa. La relevancia de esta técnica para el diagnóstico de la enfermedad del sueño en humanos está todavía en investigación y su sensibilidad ha sido tema de controversia entre autores. No se ha contemplado su uso en medicina veterinaria debido a los costes prohibitivos de los tubos especiales que emplea el método (Desquesnes, 2004). 6.1.2.2. Técnica de Murray o de la capa de leucocitos en campo oscuro o contraste de fases (BCM o BCT) La técnica de Murray o de la capa de leucocitos en campo oscuro o contraste de fases, también denominadas BCM (Buffy Coat Method) o BCT (Buffy Coat Technique), es un método muy parecido a la técnica de Woo descrita anteriormente, pero en vez de realizarse una observación directa del capilar centrifugado al microscopio sobre un porta objetos, se corta el capilar unos 5 mm por debajo de la capa leucocitaria y se vierte ésta en un porta, colocando encima un cubre objetos y de esta forma se realiza la observación al microscopio (Murray et al., 1977; OIE, 2010). La sensibilidad relativa de la técnica de concentración del microhematocrito (MHCT) y de BCM ha sido tema de controversia entre autores y según la especie de tripanosoma objeto de estudio (Desquesnes, 2004). Así, de acuerdo a Murray et al. (1977), quienes describieron por primera vez esta técnica utilizando sangre de vacas para diagnóstico de varias especies de tripanosomas, aunque no fue testada en ese momento para T. evansi, este método constituye una técnica más fiable que los métodos de inoculación en animales, técnicas de examen directo al microscopio u otras técnicas de concentración. No obstante, aplicando BCM para diagnóstico de T. evansi sobre sangre de caballos y búfalos, se obtuvo menos sensibilidad que utilizando otros métodos de concentración e inoculación de ratones (Monzón et al., 1990; Holland et al., 2001). Por otro lado, además de la capacidad diagnóstica per se del BCM, Murray et al. (1977) apuntaron al mismo tiempo a la utilidad que tenía este método para la identificación de los tripanosomas, basada en un patrón de comportamiento mostrado por las distintas Revisión bibliográfica 100 especies estudiadas. No obstante, actualmente no se cita la posibilidad de este método para diferenciar T. evansi de otras especies, utilizándose otros métodos para tal fin (OIE, 2010). 6.1.2.3. Técnica del mini-intercambio aniónico y centrifugación La técnica del mini-intercambio aniónico y centrifugación desarrollada por Lanhan y Godfrey (1970), tiene como fundamento separar los tripanosomas de las células sanguíneas a través de la carga, siendo estas últimas más negativas y quedando adheridas a una columna de dietilaminoetil celulosa (DEAE-celulosa), mientras los tripanosomas son eludidos reduciendo su viabilidad y capacidad infestiva. Dado que las cargas superficiales difieren entre especies de tripanosomas de la sección Salivaria y que la carga negativa de los eritrocitos también varía entre las distintas especies mamíferas, la técnica debe por tanto ser adaptada a la especie de tripanosoma y a la especie hospedadora (Gutiérrez et al., 2004b). Aplicando la técnica del mini-intercambio aniónico y centrifugación sobre sangre de búfalos infestados experimentalmente, se obtuvo una sensibilidad del 100 % a partir de la séptima semana hasta la decimoquinta semana, donde se fijó el final del experimento. Se demostró de esta forma la alta sensibilidad del método, excepto en infestaciones muy recientes, siendo esta sensibilidad inferior a la obtenida por PCR o inoculación en ratones (Holland et al., 2001). Aplicando la técnica del mini-intercambio aniónico y centrifugación sobre sangre de cabras inoculadas experimentalmente se obtuvieron resultados similares, siendo esta técnica más sensible que la tinción de frotis y BCM, pero menos sensible que la inoculación en ratones, concluyéndose que en caso de bajo grado de parasitemia en cabras, éste es un método adecuado para el diagnóstico cuando otros tests no han sido efectivos (Gutiérrez et al., 2004b). Reid et al. (2001) utilizaron la capa buffy en vez de sangre entera en la técnica del miniintercambio aniónico y centrifugación obteniendo una sensibilidad diez veces mayor. A Revisión bibliográfica 101 pesar de que esta técnica ha sido desarrollada para diagnóstico de tripanosomosis en humanos, usualmente se emplea para purificación de los parásitos (OIE, 2010). 6.1.3. Inoculación en animales La inoculación de animales de laboratorio, generalmente ratones y ratas, puede realizarse para revelar infestaciones subclínicas en animales domésticos (OIE, 2010). Ha sido considerada como método estándar para la detección de infestaciones por T. evansi (Reid et al., 2001; Taylor et al., 2008). La sensibilidad obtenida en la inoculación de ratones con sangre procedente de búfalos inoculados experimentalmente con T. evansi ha sido superior a la de otras técnicas como la de Woo y la del mini-intercambio aniónico y centrifugación. La inoculación en ratones alcanzó un 100 % de detección semanal a partir de la sexta semana en adelante, con escasas variaciones hasta el final del estudio que fue de 15 semanas. En contraste, la sensibilidad de la inoculación en ratones en general fue inferior a la obtenida por PCR, excepto en las dos primeras semanas de este estudio, momento en el cual la inoculación en ratones se mostró como la prueba más sensible (Holland et al., 2001). En otro estudio realizado en caballos se utilizó también la técnica de la inoculación experimental. Aunque la inoculación en ratones no alcanzó la sensibilidad del 100 %, el porcentaje de detección fue superior a los obtenidos por MHCT y BCM, mostrándose como una técnica adecuada cuando se requiere alta sensibilidad en la detección de T. evansi (Monzón et al., 1990). En cabras inoculadas experimentalmente se obtuvo una sensibilidad diagnóstica a través de inoculación de ratones superior a la obtenida por la técnica del mini-intercambio aniónico y centrifugación (Gutiérrez et al., 2004b). Una mejora en la eficacia de este método se consigue a través de inoculación en roedores de la capa buffy en vez de sangre entera, obteniéndose un incremento de aproximadamente diez veces en la sensibilidad y pudiéndose de esta forma detectar una concentración tan baja como de 1,25 tripanosomas por mililitro de sangre (Reid et al., 2001). Revisión bibliográfica 102 A pesar de que el período de incubación observado en los roedores es normalmente corto, entre dos y cinco días, éste puede extenderse hasta dos semanas, dependiendo de la cepa inoculada, concentración del inóculo, así como de la línea de animal de laboratorio empleada, influyendo así todos estos factores en la virulencia de T. evansi (OIE, 2010). La inoculación de roedores, a pesar de su alta eficacia en la detección, puede no ser recomendada para diagnóstico de campo debido al coste de los animales de laboratorio, falta de instalaciones en el campo y el tiempo necesario que toma este método para revelar la positividad de las muestras; sin embargo, en laboratorio puede utilizarse como prueba de confirmación (Pathak et al., 1997). En caso de ser muy importante detectar un hospedador potencialmente infestado, como puede ser una importación a un área libre de la enfermedad, se puede justificar el empleo de roedores inmunodeprimidos por diferentes procedimientos (OIE, 2010). 6.1.4. Detección de ADN tripanosómico 6.1.4.1. PCR convencional La detección de ADN tripanosómico es el fundamento de los denominados métodos de biología molecular para el diagnóstico de T. evansi. Actualmente la reacción en cadena de la polimerasa constituye la técnica de uso rutinario dentro de los métodos moleculares y se basa en la detección del agente infestante tras la amplificación de material genético procedente del mismo. Se trata del método de mayor sensibilidad para la detección de la infestación por T. evansi, pudiéndose llevar a cabo a varios niveles taxonómicos (OIE, 2010). Teniendo en cuenta que el ADN tripanosómico no se mantiene en la sangre de los hospedadores por un tiempo superior a 24-48 horas una vez que los tripanosomas han muerto, la detección de este material puede ser un medio adecuado para identificar animales con una infestación activa (OIE, 2010). Se ha demostrado que la señal de la Revisión bibliográfica 103 PCR se torna negativa a las 24 horas de la administración de tratamiento tripanocida (Holland et al., 2001). La principal ventaja de la PCR radica en su especificidad de especie, siendo superior a cualquier otra técnica a este respecto, mostrándose así como una herramienta esencial capaz de identificar varias especies de tripanosomas que estén presentes en una población objeto de estudio, ya sean procedentes de animales hospedadores y/o insectos vectores (Desquesnes, 2004). La PCR tiene además la ventaja de que las muestras de ADN pueden ser almacenadas para análisis posteriores, y las muestras de sangre puede incluso almacenarse en papel de filtro, permitiendo llevar a cabo estudios epidemiológicos en regiones remotas donde la accesibilidad y las condiciones para almacenar otro tipo de muestras presentan dificultades (Fernández et al., 2009; Ramírez-Iglesias et al., 2011). En el diagnóstico de T. evansi en distintas especies hospedadoras, la PCR ha mostrado un porcentaje de detección superior a los obtenidos por otros métodos serológicos, de concentración y/o directos (Holland et al., 2001; El-Metanawey et al., 2009; Fernández et al., 2009; Ramírez-Iglesias et al., 2011). Varios factores como el nivel de parasitemia, cantidad de ADN del parásito en la muestra de sangre, métodos de extracción de ADN utilizados, diversidad de las cepas de ADN y/o diferencias en los programas de la PCR o de la concentración de los cebadores influyen en la sensibilidad, no siendo ésta una constante numérica y divergiendo de unos trabajos a otros según los autores (Fernández et al., 2009). Algunas técnicas para preparar las muestras de sangre (buffy coat, papel de filtro, sedimentación de plasma centrifugado, tratamiento con resina, purificación de ADN) pueden aumentar la sensibilidad diagnóstica al utilizar una PCR (Desquesnes, 2004). De esta forma, la sensibilidad obtenida fue superior cuando se partió de ADN tripanosómico purificado en vez de utilizarse sangre entera, debido a que de la primera forma se reduce cualquier tipo de interacción con el ADN del hospedador (Fernández et al., 2009; Pruvot et al., 2010). Revisión bibliográfica 104 A pesar de que la PCR ofrece la sensibilidad y especificidad requerida para la detección de la infestación por tripanosomas, puede también presentar resultados falsos negativos (OIE, 2010). Aunque en teoría la PCR muestra una sensibilidad diagnóstica muy alta, detectando incluso una única molécula de ADN en una muestra, este método presenta como limitación biológica los periodos de aparasitemia que pueden aparecer en el curso de la enfermedad, momentos en los cuales la detección de los parásitos no es posible porque no se encuentran circulantes en el torrente sanguíneo (Desquesnes, 2004). Otra de las limitaciones en el diagnóstico ocurre cuando aparecen tasas de parasitemia inferiores a un tripanosoma por volumen de muestra evaluada (Desquesnes, 2004). A pesar de que la PCR es una técnica muy sensible, no es capaz de detectar T. evansi en infestaciones tempranas (Holland et al., 2001). Sin embargo y a este respecto, durante los periodos de baja parasitemia si existe un solo tripanosoma en la muestra a evaluar, la proporción del ADN del agente infestante en relación al ADN total contenido en la muestra de sangre, constituye un factor crucial para el diagnóstico de la enfermedad. De esta forma, cuando se utiliza la PCR para diagnóstico de tripanosomas es necesario tener en cuenta la calidad del ADN y por lo tanto el método de extracción utilizado para esta molécula (Ramírez-Iglesias et al., 2011). Así, cuando existen parasitemias inferiores a 103 parásitos/ml, en el periodo prepatente es necesario al menos 100ng de ADN en la muestra para asegurar la detección del parásito a través de PCR, apareciendo por debajo del nivel de detección y generando falsos negativos con cantidades inferiores (10ng) (Fernández et al., 2009). Dependiendo de la cantidad inicialmente utilizada de ADN, cuando fue extraído de la buffy coat se observó además que aumentando la cantidad de 100 a 300 ng de ADN, se pudo obtener el diagnóstico positivo de T. evansi unos tres-cuatro días antes durante el periodo de prepatencia. En el caso de la fase crónica de la enfermedad solamente se pudo detectar presencia del protozoo utilizando una cantidad inicial de 300 ng, pero no con 100 ng (Ramírez-Iglesias et al., 2011). En contraste, cuando se partía de muestras de sangre con alta parasitemia, al utilizarse 300 ng de DNA, la PCR diseñada con algunos cebadores se inhibía total o parcialmente, lo que se atribuía a un exceso en la cantidad de ADN en la reacción (Fernández et al., 2009). Revisión bibliográfica 105 Teniendo en cuenta por tanto que la sensibilidad de la PCR depende de la cantidad de ADN disponible y que es proporcional a la parasitemia, teóricamente esta técnica es más sensible en la detección de T. evansi en especies hospedadoras altamente susceptibles como camellos, caballos y perros, que en especies hospedadoras con susceptibilidad media o baja (OIE, 2010). De acuerdo con Fernández et al. (2009), otro factor que contribuye a la sensibilidad de la PCR es la selección de una secuencia apropiada para el diseño de los cebadores específicos. Existen dos parámetros que contribuyen a la selección de la secuencia para el diseño de los cebadores, que se citan a continuación pero que podrían no ser logrados para esta especie dado que el genoma completo de T. evansi no ha sido secuenciado todavía: • La similitud entre los cebadores y la secuencia seleccionada, teniendo en cuenta la complementariedad de bases y la conservación de las secuencias. Se establece que a mayor conservación de la secuencia, mayor es la probabilidad de que los cebadores reconozcan la secuencia seleccionada en diferentes organismos del mismo género. • El número de copias de la secuencia elegida presente en el genoma del parásito, lo cual está directamente correlacionado a la probabilidad de obtener un producto de amplificación por PCR y por consiguiente asociado a la sensibilidad del método. Sin embargo, por lo general se utiliza el genoma referenciado de Trypanosoma brucei (Berriman et al., 2005) para el diseño de cebadores en la especie T. evansi debido a la homología genética entre las dos especies y al hecho de que ambas especies están contenidas en el mismo grupo (Fernández et al., 2009). La OIE (2010) recomienda la PCR basada en los cebadores NRP (Moser et al., 1989) y TBR (Masiga et al., 1992), para detección del subgénero Trypanozoon, como el método de referencia dentro de la aplicación de esta técnica. Respecto a esta última pareja de cebadores diseñadas hace casi veinte años, denominados TBR 1 y TBR 2 (Masiga et al., 1992), y de acuerdo a lo anterior (OIE, 2010), se realizó una comparativa frente a otras cinco parejas de cebadores que ya han mostrado su habilidad para amplificar el ADN de Revisión bibliográfica 112 En general la sensibilidad de la IFI es buena, pero su especificidad es baja y pueden darse reacciones cruzadas (Desquesnes, 2004). En un estudio sobre epidemiología de tripanosomosis por T. evansi en camellos, la IFI mostró la mayor sensibilidad, pero la menor especificidad respecto a CATT/ T. evansi y ELISA, también evaluados (Dia et al., 1997a). En caballos se requieren más estudios para determinar la sensibilidad y especificidad de la IFI (Wernery et al., 2001). Aparte de la baja especificidad, otras desventajas mostradas por la IFI son la subjetividad a la hora de interpretar los resultados y la pérdida de cuantificación de la respuesta de los anticuerpos (Eisler et al., 2004). Este método fue ampliamente usado, particularmente para estudios epidemiológicos y ha sido sustituido por las técnicas de ELISA indirectas (detección de IgG) desde los años ochenta (Desquesnes, 2004). 6.2.2. Enzimainmunoensayo (ELISA indirecto o IgG-ELISA) Hace más de 30 años, Luckins et al. (1978) abrieron el camino a la aplicación del enzimainmunoensayo en el diagnóstico de infestaciones por T. evansi. Cuando se utiliza un IgG-ELISA o ELISA indirecto en primer lugar se realiza extracción de antígenos de los tripanosomas, y con estos antígenos solubles se cubre las placas de poliestireno que actúan como fase sólida. A continuación, a estos antígenos se unen los anticuerpos específicos producidos por el hospedador contra los especímenes bajo investigación. Los complejos antígeno-anticuerpo se pueden a su vez detectar mediante anti-inmunoglobulinas de la especie hospedadora conjugadas con un enzima. La enzima puede ser la peroxidasa, la fosfatasa alcalina o cualquier otra enzima apropiada. La enzima conjugada unida al complejo antígeno/anticuerpo, reacciona a continuación con un substrato adecuado para producir un cambio de color característico del substrato mismo o de un indicador añadido (cromógeno), y la lectura se realiza visualmente o con un espectrofotómetro a la longitud de onda apropiada para el cromógeno (OIE, 2010; Desquesnes, 2004). Las VSG podrían ser demasiado específicas para ser usadas como un antígeno universal en la aplicación de ELISA, teniendo en cuenta la presencia de cepas RoTat frente a otras Revisión bibliográfica 113 cepas de T. evansi non RoTat. En contraste, el ELISA que utiliza antígenos solubles procedentes del lisado de tripomastigotes enteros de T. evansi no es un método cepaespecífico y por tanto está calificado como un test universal (OIE, 2010). Con respecto a esto, se ha confirmado resultados de reproducibilidad similares para el enzimainmunoensayo con antígenos solubles parasitarios de cepas de T. evansi procedentes de orígenes geográficos muy distantes, lo cual permite un uso amplio a nivel mundial de antígenos procedentes del lisado de tripomastigotes enteros (Desquesnes et al., 2009a). No obstante, teniendo en cuenta la posibilidad de aparición de reacciones cruzadas, deben hacerse por tanto consideraciones en áreas donde conviven múltiples especies de tripanosomas (OIE, 2010). Se ha desarrollado recientemente un enzimoinmunoensayo que utiliza antígenos recombinantes y basado en una proteína no variable de superficie denominada ISG 75. Se ha indicado el potencial para el desarrollo de una nueva referencia diagnóstica de surra en camellos, al haberse comparado con otros métodos diagnósticos ya establecidos basados en la VSG RoTat 1.2 y presentar concordancia los resultados obtenidos; se indica también su aplicación en otras especies del subgénero Trypanozoon y en otras especies hospedadoras (Tran et al., 2009). En la puesta en marcha de un diagnóstico a través de ELISA, en cuanto al factor que supone en sí la especie hospedadora en estudio, se han utilizado anti-inmunoglobulinas conjugadas específicas dirigidas frente a inmunoglobulinas de especies hospedadoras estrechamente relacionadas (Verloo et al., 2000), aunque se recomienda que se lleve a cabo utilizando anti-inmunoglobulinas conjugadas monoespecíficas (OIE, 2010). En especies donde no están disponibles anti-IgG conjugadas frente a inmunoglobulinas de la especie hospedadora en estudio, se han realizado pasos intermedios para producir inmunoglobulinas diana sobre las que utilizar luego anti-IgG conjugadas comerciales (Molina et al., 2000; Atarhouch et al., 2003). Como alternativa en estos casos, se ha empleado con éxito proteína A-peroxidasa (Desquesnes et al., 2009b). Se observó una alta sensibilidad diagnóstica de T. evansi mediante ELISA, presentando generalmente una especificidad que se incrementa al aumentar el corte del porcentaje de positividad que discrimina entre resultados positivos y negativos (Verloo et al., 2000; Holland et al., 2005). Revisión bibliográfica 114 En un estudio comparativo entre diferentes métodos diagnósticos el enzimainmunoensayo con respecto al CATT/T. evansi obtuvo una sensibilidad equiparable y una especificidad ligeramente inferior en búfalo, estableciendo como método estándar de oro la inoculación en roedores (Verloo et al., 2000). En contraste, utilizando como pruebas de referencia las técnicas de concentración del hematocrito y del mini-intercambio aniónico y centrifugación en el diagnóstico para T. evansi en ganado vacuno, el ELISA presentó una especificidad superior al CATT/T. evansi y una sensibilidad inferior con respecto al CATT/T. evansi a dilución 1:4, dilución a la cual mostró este último método los valores más equilibrados para estos parámetros (Reid y Copeman, 2003). Tomando como método estándar de oro la inmunotripanolisis, en cerdos se obtuvieron valores ligeramente superiores de ambos parámetros en ELISA con respecto al CATT/ T. evansi con la dilución 1:8 a la cual mostró en este caso este método de aglutinación los valores más equilibrados para estos parámetros (Holland et al., 2005). En camellos, utilizando el test de inmunotripanolisis como referencia se obtuvo para ELISA, utilizando como antígeno RoTat 1.2, una sensibilidad de 98,92% y una especificidad de 98,9%. Para un nuevo antígeno testado, ISG 75, se obtuvo una sensibilidad de 94,62% y una especificidad del 100% (Tran et al., 2009). A pesar de que por regla general es difícil determinar a través de métodos diagnósticos serológicos la diferencia entre infestaciones actuales o pasadas, Verloo et al. (2000) confirmaron en búfalos en Vietnam que el enzimainmunoensayo puede ser utilizado para identificar animales con una infestación activa en el momento de su aplicación. En la misma línea se planteó el ELISA como método adecuado para confirmar el status de cerdos infestados por T. evansi (Holland et al., 2005). El ELISA presenta mayor probabilidad de identificar correctamente animales no infestados, mientras que el CATT/T. evansi presenta mayor probabilidad de identificar correctamente a los infestados (OIE, 2010). En estudios recientes donde se aplicó el enzimainmunoensayo en el diagnóstico de T. evansi, se confirmó un valor predictivo negativo alto de la técnica (Desquesnes et al., 2009a). Revisión bibliográfica 115 6.2.3. Prueba de aglutinación en tarjeta (CATT/ T. evansi y LATEX/T. evansi) 6.2.3.1. CATT/T. evansi La prueba de aglutinación sobre tarjeta fue inicialmente desarrollada por Magnus et al. (1978) con un propósito diagnóstico de la enfermedad del sueño en humanos, y se le denominó Testryp CATT. Diez años más tarde un test similar fue evaluado por Bajyana Songa y Hamers (1988) para el diagnóstico de la surra, basado en el uso del tipo antigénico variable RoTat 1.2. El repertorio de VSG de T. evansi es limitado y el tipo antigénico variable RoTat 1.2 presenta un carácter predominante, convirtiéndose en un buen candidato como reactivo diagnóstico en métodos diagnósticos basados en la detección de anticuerpos, como es el caso del CATT/T. evansi (Verloo et al., 2001). El test CATT/T. evansi ha sido validado como método diagnóstico de campo para la detección de T. evansi en camellos (Dia et al., 1997a, b; Gutiérrez et al., 2000; Ngaira et al., 2003), búfalos (Davidson et al., 1999; Verloo et al., 2000) y vacas (Reid y Copeman, 2003). En cerdos los métodos de aglutinación se han citado como inadecuados para el diagnóstico serológico de surra, con disminución de sensibilidad y especificidad a medida que avanza el tiempo tras la infestación (Holland et al., 2005). Actualmente el test CATT/T evansi está disponible en forma de kit con un coste medio de sus reactivos en torno a 0,5 €/test, procedente del Instituto de Medicina Tropical Príncipe Leopoldo en Amberes, figurando actualmente este centro belga como laboratorio de referencia de la OIE para diagnóstico de esta enfermedad (OIE, 2010). Este método se basa en una reacción de aglutinación directa que se produce cuando suero o plasma de un animal que presenta anticuerpos frente a T. evansi entra en contacto con parásitos liofilizados que expresan RoTat 1.2. Aunque el fabricante del CATT/T. evansi no especifica en el manual de instrucciones qué tipo de inmunoglobulinas detecta el test, se ha encontrado contradicción en la bibliografía acerca de este tema. Davidson et al. (1999) citan que principalmente detecta IgG, mientras que otras fuentes más recientes proponen la IgM como anticuerpo diana principal para este método (Desquesnes, 2004; OIE, 2010). Revisión bibliográfica 116 Figura 11. CATT/T. evansi (Instituto de Medicina Tropical Príncipe Leopoldo, Amberes, Bélgica): (A) Interpretación de las aglutinaciones producidas. (B) Tampón para dilución de los sueros e hidratación del reactivo y los controles. (C) Reactivo compuesto por parásitos liofilizado que expresan el antígeno RoTat 1.2. (D) Rotator para la mezcla del suero y reactivo durante 5 min a 70 rpm. De acuerdo al fabricante, el CATT/T. evansi es un método no estrictamente específico de especie, lo cual podría complicar la interpretación de los resultados en áreas donde existan otros tripanosomas de la sección Salivaria y, por tanto, se podrían obtener falsos positivos. La fiabilidad del test es robusta cuando es usado en una especie y/o una región con infestaciones monoespecíficas por T. evansi (Desquesnes, 2004). Wernery et al. (2001) observaron en suero de caballos supuestamente libres de la enfermedad, aglutinaciones ligeras a través de CATT/T. evansi y sugirieron que el suero de los équidos podría haber reaccionado a otras proteínas en la suspensión de antígeno. Aparte de que con el CATT/T. evansi se pueden producir resultados positivos como consecuencia de reacciones inespecíficas, se ha citado como otro de los inconvenientes Revisión bibliográfica 117 que los resultados positivos no discriminan en el diagnóstico de la surra entre exposiciones previas o infestaciones activas (Konnai et al., 2009). Además de las posibilidades anteriormente citadas sobre resultados falsos positivos a través de este método diagnóstico, se han registrado también resultados seronegativos a través de CATT/T. evansi en animales parasitológicamente positivos, los cuales representarían por tanto resultados falsos negativos (Diall et al., 1994; Dia et al., 1997a, b; Ngaira et al., 2003; Njiru et al., 2004; El-Metanawey et al., 2009). Como causas de este fenómeno se ha sugerido la presencia de cepas de T. evansi carentes del gen que codifica para la glicoproteína RoTat 1.2 y/o la no expresión de esta glicoproteína variable de superficie, así como infestaciones tempranas en las cuales los animales no han producido niveles detectables de anticuerpos (Njiru et al., 2004). Se ha citado la aparición de anticuerpos específicos frente al tipo antigénico variable RoTat 1.2 entre 6 y 32 días tras la inoculación de T. evansi en conejos (Verloo et al., 2001). De acuerdo a la OIE (2010) el CATT/T. evansi detecta principalmente IgM, que son anticuerpos pentavalentes que presentan una vida media corta, por lo que se propone como un medio adecuado para la detección de infestaciones tempranas o tardías con circulación reciente de parásitos en el torrente sanguíneo, pudiendo detectar infestaciones activas con un valor predictivo positivo alto. En estudios previos sobre camellos infestados de forma natural, utilizando CATT/T. evansi se obtuvieron respectivamente sensibilidades y especificidades del 89% y 73% en Mali (Diall et al., 1994), 86,95% y 83,03% en Mauritania (Dia et al., 1997b) y 100% y 96% en las Islas Canarias (Gutiérrez et al., 2000). En contraste, se describieron valores más bajos de sensibilidad del CATT/T. evansi, de alrededor del 65%, en esta especie en Kenia (Ngaira, et al., 2003; Njiru et al., 2004), lugar donde se confirmaron cepas de T. evansi carentes tanto del gen que codifica para el antígeno RoTat 1.2 como de la glicoproteina asociada, así como cepas que presentaron el gen pero sin embargo ausencia de la proteína codificada en dicho gen (Ngaira et al., 2004). En una evaluación de varios métodos diagnósticos para detección de anticuerpos y antígenos en búfalo afectados de forma natural por surra, el CATT/T. evansi mostró una especificidad absoluta, superior a la de los otros métodos evaluados; la sensibilidad del Revisión bibliográfica 118 78%, fue inferior en este caso a la obtenida con ELISA para detección de IgG, que mostró la mayor sensibilidad entre los métodos utilizados (Davidson et al., 1999). En contraste, aplicando el CATT/T. evansi sobre suero de vacas a dilución 1:4, la especificidad fue del 96% y la sensibilidad del 83%, siendo los valores de estos parámetros inferior y superior respectivamente que cuando se aplicó ELISA para detección de anticuerpos (Reid y Copeman, 2003). De acuerdo a las indicaciones del fabricante, el CATT/T. evansi se realiza sobre suero o plasma preparados a una dilución 1:4 o 1:8, y para cada especie testada deben ser determinadas las condiciones óptimas. Se ha observado que conforme se emplean mayores diluciones, se mejora de forma moderada la especificidad, pero disminuye de forma drástica la sensibilidad (Verloo et al., 2000; Reid y Copeman, 2003; Holland et al., 2005). Como ventaja, el CATT/T. evansi es un test rápido y fácil que se puede aplicar en condiciones de campo sin ningún equipamiento especial (Gutierrez et al., 2000). No obstante, aunque la observación directa de los resultados obtenidos por el CATT/ T. evansi es fácil, algunas veces la interpretación de la aglutinación producida puede ser distinta, aumentando así la probabilidad de error del operador (Reid y Copeman, 2003; Desquesnes, 2004). Se ha apuntado al CATT/T. evansi como el método más común para clasificación correcta de animales verdaderamente infestados, y puede ser usado para seleccionar animales de forma individual para tratamiento con drogas tripanocidas (Davidson et al., 1999; OIE, 2010). 6.2.3.2. LATEX/T. evansi Existe un formato alternativo al test CATT/T. evansi, denominado LATEX/T. evansi y que a diferencia del primero, consiste en una aglutinación indirecta pero basada también en la glicoproteína variable de superficie nativa RoTat 1.2, unida de forma covalente a partículas de látex. En la actualidad este método se encuentra en evaluación (OIE, 2010). Revisión bibliográfica 119 Este método se ha descrito como una herramienta epidemiológica adecuada en la surra en búfalos, para detectar infestaciones activas y anticuerpos específicos persistentes (Verloo et al., 2000). En cambio, en cerdos se citó su limitado valor para diagnóstico serológico (Holland et al., 2005). En un estudio sobre cabras infestadas experimentalmente por T. evansi se obtuvieron resultados similares tanto con CATT/T. evansi como con LATEX/T. evansi, pero en la conclusión como método adecuado para evaluar la enfermedad en caprino sólo se citaba el primero de los métodos (Gutierrez et al., 2004). 6.2.4. Prueba de inmunotripanolisis (ITL) La prueba de inmunotripanolisis fue confirmada por Van Meirvenne et al. (1995) como una herramienta valiosa para el diagnóstico serológico en la enfermedad del sueño en humanos, basada en distintas poblaciones de T. brucei gambiense con distintos tipos antigénicos variables. Este método adaptado al diagnóstico de tripanosomosis por T. evansi, está basado en la glicoproteína variable de superficie RoTat 1.2 y puede ser por lo tanto sólo positiva con hospedadores que producen inmunoglobulinas tripanolíticas dirigidas frente a este tipo de antígeno variable (OIE, 2010). La prueba de inmunotripanolisis se realiza utilizando suero a dilución 1:4 del animal sospechoso de padecer surra, que se incuba junto a formas tripomastigotes vivos de T. evansi durante una hora, en presencia de suero de cobaya como complemento. Bajo el microscopio, cuando en el suero a testar están presentes anticuerpos específicos, en presencia del complemento se observa lisis de los tripanosomas que expresan el tipo antigénico variable RoTat 1.2. Las muestras se consideran positivas cuando se produce lisis como mínimo del 50% de los tripanosomas, indicando infestación actual o pasada (Verloo et al., 2000, 2001). Revisión bibliográfica 120 La prueba de inmunotripanolisis ha sido citada como un método de referencia adecuado en búfalo, cerdos y camellos, para la detección de anticuerpos anti-RoTat 1.2 (Verloo et al., 2000; Holland et al., 2005; Tran et al., 2009). Al tratarse de una prueba con una alta especificidad, se utiliza para confirmación individual de muestras sospechosas que eran positivas utilizando otros tests, presenta un coste bastante elevado (250€/test), y puede ser realizado bajo petición en el Instituto de Medicina Tropical de Amberes (OIE, 2010). Revisión bibliográfica 121 7. MEDIDAS DE CONTROL DE LA ENFERMEDAD El control de una enfermedad incluye todas las medidas destinadas a interferir en la aparición incontrolada de la misma. El objetivo del control de una enfermedad es la reducción de la morbilidad y mortalidad de la misma, lo que puede lograrse a través del tratamiento de los animales enfermos, lo cual reduciría la prevalencia, o a través de medidas preventivas, lo cual produciría también una reducción de la prevalencia y además un descenso de la incidencia (Thrusfield, 2007). A pesar de que se ha notificado un caso de un animal afectado por T. evansi en el que se observó curación sin necesidad de tratamiento terapéutico (Dia et al., 2000), este fenómeno no constituye la norma común. Así, el control y erradicación de la tripanosomosis es difícil debido al desarrollo de resistencia a las drogas empleadas, y a la complejidad del control de los vectores. Se necesita una monitorización regular de las infestaciones para evitar grandes pérdidas en áreas endémicas (Wernery y Kaaden, 2002). Debido a la aparición de resistencia a la quimioterapia descrita en numerosas zonas del mundo, surge la necesidad de la denominada “estrategia frente a la enfermedad”, la cual requiere un conocimiento preciso de la interacción tripanosoma-hospedador, pudiéndose así definir nuevos puntos para establecer intervenciones curativas y preventivas (Antoine-Moussiaux et al., 2009). En este sentido, recientemente se ha realizado un estudio proteómico de la infestación por T. evansi en roedores que supone un primer paso para la identificación de posibles candidatos para el posterior desarrollo de vacunas contra la enfermedad, así como también permite localizar nuevas dianas para medicamentos, localizar biomarcadores diagnósticos y ampliar el conocimiento de la biología de la enfermedad (Roy et al., 2010). 7.1. Quimioterapia actual frente a la surra La quimioterapia sigue siendo la forma más eficiente en el control de la surra y depende del uso de cuatro drogas actualmente disponibles: aceturato de diminaceno, suramina, Revisión bibliográfica 128 inyección intravenosa lenta, evitando su extravasación, que podría producir flebitis (Wernery y Kaaden, 2002). El uso profiláctico en camellos, en los que previene entre 6 y 12 semanas, se debe a la lenta eliminación del cuerpo, y depende de la dosis empleada y del grado de cambio que muestren los tripanosomas (Wernery y Kaaden, 2002). En caballos infestados por T. evansi se ha descrito el tratamiento con una solución acuosa del 10% de suramina (Naganol®, Bayer), empleándose en tres ocasiones una dosis de 7 mg/kg cada 7 días por vía intravenosa, tras haber fallado la terapia con diminazeno (Monzón et al., 1995). En cambio, en ovejas infestadas por T. evansi se administró suramina intravenosa a dosis de 10 mg/kg sin éxito en la eliminación de los parásitos, por lo cual se empleó un segundo y definitivo tratamiento tripanocida, esta vez con sulfato de quinapiramina a dosis de 5 mg/kg por inyección intramuscular (Onah et al., 1999). En cuatro osos negros del Himalaya (Selenarctos thibethanus), una especie en la que recientemente se informó la primera infestación natural por T. evansi, se realizó tratamiento de forma eficaz con suramina sódica dos veces y con casi el doble de la dosis recomendada para otras especies, sin observarse efectos adversos (Muhammad et al., 2007). En otro caso atípico de infestación por T. evansi padecida por un paciente humano, tras comprobarse ausencia de parásitos en líquido cefalorraquídeo, se decidió el tratamiento con 1 gramo de suramina administrada semanalmente por vía intravenosa, durante 5 semanas (Joshi et al., 2005; Powar et al., 2006). La suramina, que es el fármaco de elección en la etapa temprana de la forma aguda de la enfermedad del sueño en humanos cuando no existe afección del SNC, obtuvo un resultado satisfactorio frente a T. evansi, por lo que debe tomarse en consideración frente a otros casos de infestación por T. evansi en humanos, si ocurrieran (Joshi et al., 2006). 7.1.3. Derivados de la acridina La quinapiramina es un colorante de origen sintético, de color amarillo, derivado de la acridina, que se empleó durante la Segunda Guerra Mundial como antipalúdico, y Revisión bibliográfica 129 además presenta actividad frente a tenias (Sumano López y Ocampo Camberos, 2006). Este principio activo, que presenta actividad frente a Trypanosoma congolense, Trypanosoma vivax y Trypanosoma brucei spp., fue retirado del mercado en 1974 debido a una amplia aparición de resistencias, pero fue reintroducido más tarde exclusivamente para el tratamiento de la surra (Zhang et al., 1993). Existen varias denominaciones comerciales del sulfato de quinapiramina para uso terapéutico: Trypacide sulphate® (May and Baker, Rhône-Merieux), Antrycide® (Alkaline Chemical Corp., India; Bella Trading Khartoum, Sudan), Noroquine® (Norbrook) y Quintrycide® (Gharda) (Mehlhorn, 2001). El sulfato de quinapiramina (Trypacide sulphate®, Antrycide®) es usado en la quimioterapia de infestaciones por T. evansi, mientras que la mezcla de sulfato y cloruro de quinapiramina (3:2 w/w) (Trypacide Prosalt®, Antrycide Prosalt®) es usado principalmente como quimioprofiláctico. Este principio activo principalmente se emplea en caballos y en camellos, aunque también se utiliza en cerdos y perros, y se indican dosis de 3-5 mg/kg, administradas por inyección subcutánea (Desquesnes, 2004; Holmes et al., 2004). La mezcla de sulfato y cloruro de quinapiramina presenta en camellos un efecto profiláctico de 4 a 6 meses (Wernery y Kaaden, 2002). En ovejas infestadas por T. evansi se ha descrito el empleo de quinapiramina de forma efectiva a una dosis de 5 mg/kg, por inyección intramuscular profunda (Onah et al., 1999). Un estudio de toxicidad in vivo en ratones infestados por T. evansi mostró que la administración de quinapiramina a una dosis de 5 mg/kg fue letal (Gillingwater et al., 2010). La quinapiramina administrada a ratones infestados por T. evansi a dosis de 1 mg/kg durante 4 días consecutivos obtuvo una gran eficacia, con la curación de todos los animales tratados, reduciéndose el porcentaje de efectividad al disminuir la dosis por debajo de este valor (Gillingwater et al., 2009). La quinapiramina puede producir reacciones locales y sistémicas tales como salivación, temblores, diarrea y colapso (Mehlhorn, 2001). Para evitar reacciones alérgicas, se ha tratado a caballos afectados por T. evansi con maleato de clorfenamina media hora antes de la aplicación de la terapia tripanocida basada en sulfato de quinapiramina; además se Revisión bibliográfica 130 ha sugerido el suplemento con antioxidantes en el régimen terapéutico establecido para contrarrestar el estrés oxidativo (Ranjithkumar et al., 2011). Se han observado patrones de sensibilidad distintos a quinapiramina in vivo e in vitro entre cepas de distintos orígenes geográficos (Zhang et al. 1993; Gillingwater et al., 2007). Además se ha advertido que subclones con resistencia inducida in vivo a aceturato de diminaceno, melarsamina y suramina llegaron a ser más sensibles a quinapiramina que sus clones parentales (Zhang et al., 1993). La observación de patrones homogéneos en el cariotipo entre cepas de T. evansi que han sufrido a nivel de campo una alta presión terapéutica con quinapiramina, podría conducir a la existencia de tripanosomas resistentes a esta droga (El Rayah y El Malik, 2006). 7.1.4. Arsenicales Los arsenicales tienen alta afinidad por los grupos sulfhidrilo, y se cree que su mecanismo de acción se produce por bloqueo del metabolismo energético del parásito como consecuencia de una inhibición de la glucólisis (Anadón y Matínez-Larrañaga, 2008). El dihidrocloruro de melarsamina es el único arsenical utilizado para el tratamiento curativo de la surra y se encuentra bajo la denominación comercial Cymelarsan® (Merial). No se encuentra autorizado como medicamento veterinario para esta enfermedad en España, pero sí para la terapia curativa de adultos de Dirofilaria immitis en perros, bajo el nombre comercial Immiticide® (Merial) (AEMPS, 2011). En humanos que padecen la fase tardía de la enfermedad del sueño se utiliza melarsoprol (Nok, 2003), un arsenical distinto al utilizado en medicina veterinaria. Debido a la posibilidad de refugio de T. evansi en focos extravasculares tales como el líquido cefalorraquídeo, se ha citado al clorhidrato de melarsamina como el tripanocida más conveniente a utilizar, siendo el único capaz de traspasar esta barrera a dosis altas de 0,5-1 mg/kg (Desquesnes et al., 2009b). De acuerdo con las indicaciones del fabricante, Cymelarsan® (Merial) está indicado en camellos a una dosis de 0,25 mg/kg administrada de forma profunda en las tablas del Revisión bibliográfica 131 cuello, teniendo como respuesta una rápida actividad tripanocida que conduce a destrucción de los tripanosomas en pocas horas y presentando buena tolerancia en el animal, produciéndose en algunos casos una ligera hinchazón en la zona de inyección que remite en pocos días. Figura 12. Cymelarsan® (Laboratorio Merial). En caprinos infestados experimentalmente con T. evansi, y posteriormente tratados con Cymelarsan® (Merial), se consiguió remisión de la parasitemia a dosis de 0,5 mg/kg y 0,625 mg/kg y se observaron recidivas a dosis de 0,3 mg/kg (Gutiérrez et al., 2008). En vacas infestadas con T. evansi que fueron tratadas con Cymelarsan® (Merial) la droga mostró efectividad en la curación a dosis de 0,5 mg/kg y 0,75 mg/kg (Payne et al., 1994a, b). Estudios en conejos infestados con T. evansi mostraron recidiva de la parasitemia cuando se realizó el tratamiento con Cymelarsan® (Merial) a los 21 días tras la infestación, pero no se observó recurrencia en animales tratados a los 7 días después de la infestación (Biswas y Hunter, 1993). Wernery et al. (2001) trataron con Cymelarsan® (Merial) a tres caballos con dosis únicas de 0,5 mg/kg para cada équido en los días 99, 104 y 106 tras la inoculación con T. evansi y observaron recidiva a los 76 días posttratamiento en el caballo tratado más tardíamente. Revisión bibliográfica 132 El Cymelarsan® (Merial), oficialmente registrado para quimioterapia en caballos camellos y cabras, presentó una IC50 en el rango >0,1 a 2,8 ng/ml en varias cepas de T. evansi de distintos orígenes geográficos en las que se estudió la sensibilidad in vitro (Gillingwater et al., 2007). En un modelo murino, este principio activo demostró la mayor eficacia terapéutica entre las drogas actualmente disponibles en el mercado, pero como desventaja presenta el mayor coste (aproximadamente 7 € por camello) y su disponibilidad está limitada a ciertas zonas del mundo como Oriente Medio y África (Gillingwater et al., 2009). Este fármaco se considera no citotóxico, al observarse in vitro una IC50 mayor de 150 nM sobre mioblastos de rata, y en cuanto a toxicidad in vivo sobre ratones se observó una dosis letal de 20 mg/kg vía intraperitoneal (Gillingwater et al., 2010). En un ensayo de toxicidad en caprino con dosis de 15 mg/kg administradas por vía subcutánea se produjo una hinchazón en el punto de inoculación, pero no se observó reacción tóxica sistémica (Gutiérrez et al., 2008). En cepas de T. evansi resistentes a melarsamina de forma inducida in vivo, se han observado además patrones de resistencia cruzada frente a diminazeno y pentamidina. En el caso de cepas en las que se indujo resistencia a diminazeno se observó variabilidad en la sensibilidad a melarsamina (Zhang et al., 1993). De acuerdo con el fabricante de Cymelarsan® (Merial) se trata de un fármaco seguro en hembras gestantes y que presenta un periodo de retirada 14 días, tanto para carne como para leche. No obstante, se ha observado en camellos que la cantidad de arsénico en suero todavía no ha retornado a niveles normales a los 42 días post-tratamiento, y se ha descrito que las cabras presentan mayor susceptibilidad a acumular arsénico que los camellos tratados con melarsamina (Youssif et al., 2008). Aunque el efecto residual de esta droga en el camello todavía no se conoce totalmente, esta especie aparentemente ha permanecido libre de T. evansi durante 90 días tras el tratamiento (Wernery y Kaaden, 2002). Revisión bibliográfica 133 7.2. Medidas preventivas frente a la surra 7.2.1. Inmunización frente a Trypanosoma evansi Frente a la surra no existen actualmente vacunas disponibles (OIE, 2010). Tanto en el caso de T. evansi como en los de otros tripanosomas africanos, la existencia de una vacuna ha sido impedida por las características de la cubierta que presentan estos organismos, conformada por glicoproteinas variables de superficie, lo que les permite evadir la respuesta inmunológica del hospedador. De forma previsible, esto dificultará durante muchos años el desarrollo de esta medida como alternativa profiláctica potencial (Antoine-Moussiaux et al., 2009). La inmunización de mamíferos contra T. evansi ha sido obtenida por infestación seguida de tratamiento, pero se trata de un protección generalmente efectiva sólo contra infestaciones homólogas con la misma variante y cuando la cantidad de parásitos inoculados es pequeña (Desquesnes, 2004). Se han empleado otras estrategias innovadoras en la búsqueda de vacunas, no centradas precisamente en la glicoproteínas de superficie. Así, se han indicado como prometedoras las inmunizaciones contra los antígenos de la bolsa flagelar, y se ha citado también la inmunización contra la cisteína proteasa (Desquesnes, 2004). Por otro lado, frente a T. brucei se han realizado estudios preliminares de las propiedades inmunógenicas de la proteína P15 asociada a los microtúbulos del parásito (Rasooly y Balaban, 2004). De la misma forma, se ha demostrado experimentalmente que otros componentes del citoesqueleto, tales como la actina recombinante y la beta-tubulina recombinante de T. evansi, son potenciales candidatos para el desarrollo de una vacuna para prevenir tanto la surra como las tripanosomosis animales causadas por T. equiperdum y T. brucei (Li et al., 2007, 2009). 7.2.2. Inmunización frente a vectores transmisores de Trypanosoma evansi Desde otro punto de vista y basada en un nuevo concepto, se ha enfocado la inmunización de los mamíferos hospedadores dirigida contra los parásitos hematófagos, Revisión bibliográfica 134 partiendo para ello de extractos de antígenos internos de los parásitos (Desquesnes, 2004). Se ha investigado el efecto que produjo sobre la alimentación de ejemplares de Stomoxys calcitrans sobre conejos la inmunización previa de éstos con diferentes tejidos procedentes del díptero señalado. Se observó una mortalidad de las moscas de los establos superior a la observada en los grupos control, y también se produjo una disminución de la viabilidad de los huevos (Schlein y Lewis, 1976; Webster et al., 1992). En estudios con ejemplares de Stomoxys calcitrans y Haematobia irritans, que se alimentaban sobre bovinos previamente inmunizados con antígenos procedentes de forma separada de los intestinos de estas dos especie pertenecientes a la subfamilia Stomoxynae, no se observaron diferencias en la mortalidad de dichos insectos, pero sí una disminución en la ovoposición con respecto al grupo control (Bautista et al., 2004; 2007). Recientemente se han investigado estrategias de control de las moscas de los establos y de las moscas de los cuernos, a través de la capacidad inmunógena que pueden producir ciertos antígenos contenidos en las glándulas salivares de estos insectos sobre los hospedadores (Cupp et al., 2004; Ameri et al., 2008; Cupp et. al., 2010). En el caso de los tábanos, para su control se indica como estrategia probable a seguir el abordaje a través de la selección de animales resistentes de forma natural a estos insectos, o emplear la ingeniería genética en animales que no expresen esta resistencia de forma natural. Como pre-requisito para continuar este tipo de investigaciones sobre tábanos, se necesita desarrollar métodos estandarizados para la cría de estos insectos en condiciones de laboratorio (Desquenes, 2004). 7.2.3. “Quimioterapia Curativa” frente a “Quimioterapia Preventiva” Con las herramientas actualmente disponibles para luchar y controlar la enfermedad, si el diagnóstico y el tratamiento de la surra son perfectamente efectivos, no compensa Revisión bibliográfica 135 adoptar una estrategia preventiva sobre una estrategia basada en tratamientos curativos durante todo el año. Sin embargo, si existen largos periodos de retraso o inefectividad en el diagnóstico y el tratamiento, así como si se producen incrementos en el riesgo de la infestación, el bienestar animal exige adoptar una estrategia basada en quimioterapia preventiva (Seidl et al., 2001). Cuando ocurre un brote epizoótico de tripanosomosis debe emplearse quimioprofilaxis en los animales susceptible, como por ejemplo tratamiento con quinapiramina (Desquesnes, 2004). En el Pantanal Brasileño, donde existe una población de 49000 caballos ligados a labores ganaderas, se estiman pérdidas anuales en torno al 13 % debido a T. evansi si no se toman medidas de control. Dentro de los métodos de control se muestra como más eficaz desde el punto de vista de reducción de la mortalidad el tratamiento preventivo y le siguen en orden decreciente de eficacia en segundo lugar una estrategia de tratamientos curativos durante todo el año, y por último una estrategia de tratamiento curativo estacional (Seidl et al., 2001). Desde el punto de vista económico se propone el tratamiento curativo durante todo el año (Seidl et al., 1998). Mediante modelos para T. evansi en los que se evaluaron varias estrategias encaminadas al control de la enfermedad en Filipinas, se concluyó que empleando una droga eficaz y tratando todos los animales dos veces al año o monitorizando mensualmente con tratamiento de los animales enfermos se produce un beneficio sustancial sobre la estrategia consistente en chequeo anual y tratamiento de seropositivos. Se recomienda el tratamiento dirigido a los animales enfermos, entre las dos opciones citadas que añaden beneficios, debido a que se produce una reducción de los costes y de la mano de obra necesaria, mejor actividad tripanocida frente a la disminución de la eficacia, y por último reducción del riesgo de la selección de resistencia a los medicamentos. Como desventaja, la opción recomendada produce una reducción de la prevalencia a más largo plazo (Dobson et al., 2009). 7.2.4. Vigilancia fronteriza en áreas libres de la enfermedad En zonas libres de surra donde existe la presencia de tabánidos de forma estacional y grandes poblaciones de hospedadores reservorios potenciales, la introducción de T. Revisión bibliográfica 136 evansi daría lugar a una situación con grandes posibilidades de que el área llegara a ser endémica. De acuerdo a que el movimiento de ganado es el factor clave para la distribución de T. evansi, existe la necesidad de constante vigilancia en áreas no endémicas de surra que son fronterizas con zonas endémicas (Reid, 2002). Se establecen diferencias entre distintas zonas del mundo, en cuanto al valor en la epidemiología de ciertas especies como puede ser el ganado vacuno, que en Latinoamérica actúa como fondo de saco epidemiológico más que como reservorio, a diferencia de la situación que acontece en Asia, pero no por ello se debe relajar la vigilancia (Desquesnes, 2004). Los animales de nuevo ingreso en granjas o países, deben ser tratados utilizando tripanocidas que eliminen totalmente el parásito, incluso si la granja que recibe dicho animales se encuentra infestada por T. evansi, para así evitar la introducción de nuevas cepas genéticamente y fenotípicamente diferentes (Desquesnes, 2004). 7.2.5. Educación en prevención de la enfermedad El gobierno de Filipinas ha aplicado un programa de control denominado MUSCA (Mindanao Unified Surra Control Approach) para reducir la incidencia de la enfermedad, evitar pérdidas económicas y prevenir la expansión de la enfermedad a otras provincias. Aparte de emplearse como herramienta fundamental el tratamiento con diminazeno, también se ha enfocado el programa a la realización de una labor educativa sobre todos los agentes implicados, desde ganaderos a laboratorios, observándose una reducción del daño producido por la enfermedad (Dobson et al., 2009). Dentro de cada colectivo de animales se deben extremar las precauciones para limitar la transmisión iatrogénica de organismos infecciosos e infestantes tales como T. evansi, dado que se contempla la posibilidad de contagio en prácticas zootécnicas y veterinarias donde se comparta material sin las adecuadas medidas higiénicas (Ngeranwa y Kilalo, 1994; Reid, 2002; Fowler, 2010). Se deben tomar precauciones mediante medidas sencillas como es emplear agujas de un solo uso (Desquesnes, 2004). Para evitar la transmisión por vía oral de T. evansi a perros y gatos, se debe evitar que accedan a despojos y carne de animales potencialmente infestados. Así, en Sudamérica Revisión bibliográfica 137 cuando existe la posibilidad de contagio por mordedura de vampiros, se propone como medida preventiva guardar el ganado en refugios durante la noche (Desquesnes, 2004). El manejo ganadero y el diseño de la explotación pueden influir en el control de la enfermedad. Así, el empleo de telas mosquiteras puede evitar las picaduras de insectos vectores. Para algunas especies de tábanos que evitan entrar en lugares cerrados, podría ser necesario tener un corral techado. La limpieza y no acúmulo de estiércol y materia orgánica en descomposición facilitan el control de Stomoxys spp. En cuanto al pastoreo del ganado, se reduce la exposición a tábanos en pastizales abiertos, ya que estos insectos tienen preferencia por la vegetación espesa, así como también se reduce el riesgo practicando el movimiento de animales en base a la actividad diaria o estacional de los tábanos (Hall y Wall, 2004). 7.2.6. Control sobre los vectores transmisores de Trypanosoma evansi 7.2.6.1. Control sobre Desmodus rotundus Para reducir el movimiento de T. evansi entre hospedadores y murciélagos vampiros se justifica el control de estos últimos animales, considerados tanto vectores como reservorios del parásito (Desquesnes, 2004). Se han citado métodos de control de murciélagos descritos en la década de los setenta del pasado siglo, encuadrados en el marco de la prevención de la rabia, pero también de utilidad en la prevención de la transmisión de T. evansi. El control se aborda desde la perspectiva de la intoxicación de los vampiros con un anticoagulante, la difacinona, aplicado en mezcla con vaselina sobre el dorso de ejemplares capturados con redes y que posteriormente son liberados, contaminando así a sus congéneres (Linhart et al., 1972). Otra alternativa consiste en el tratamiento del ganado con 1 mg/kg de difacinona vía intraruminal, lo que es inocuo para el vacuno, pero supone una dosis letal para los vampiros que muerden a estos animales en las 72 horas posteriores al tratamiento (Thompson et al., 1972). Bibliografía 240 Rodrigues, A., Fighera, R.A., Souza, T.M., Schild, A.L., Barros, C.S.L., 2009. Neuropathology of naturally occurring Trypanosoma evansi infection of horses. Vet. Pathol., 46:251-258. Rodríguez, N.F., Tejedor-Junco, M.T., Hernández-Trujillo, Y., González, M., Gutiérrez, C., 2010. The role of wild rodents in the transmission of Trypanosoma evansi infection in an endemic area of the Canary Islands (Spain). Vet. 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Parecía que nunca iba a llegar…Con una mezcolanza de sentimientos un tanto contradictorios, en los que aparece nostalgia por haber dejado atrás tantos momentos, también aparece la alegría por llevar guardados con cariño esos tantos recuerdos, que se agarran de la mano a la ilusión y curiosidad por lo bueno que pueda deparar el futuro. Aunque unas veces fue agradable al tránsito y otras se tornaba un tanto pedregoso, no habría sido posible el haber recorrido este camino durante estos últimos cuatro años, sin la cantidad de personas que me han mostrado su apoyo en el plano profesional o personal, así como en ambos. Se suele decir que es de bien nacido ser agradecido, y por tanto no quisiera ser menos, pretendiendo con las siguientes líneas mostrar mi gratitud a todos ellos. Sin lugar a dudas, las primeras líneas van a ir dirigidas a mis directores. En primer lugar a Carlos Gutiérrez, quien me ha visto crecer desde que era estudiante de último año hasta estos momentos, mostrándome una calidad profesional y sobre todo humana que me ha permitido seguir por la senda adecuada durante estos años...horas en el laboratorio, en el campo, tertulias agradables de camino a las granjas y siempre valorados consejos, permitiéndome desde el primer momento integrarme como uno más del grupo. A mis codirectoras Margarita González y Mayte Tejedor, que siempre han estado al pie del cañón durante las largas jornadas compartidas en el laboratorio del CULP, cantidad de revisiones de todo el material escrito, consejos, etc., junto a la amistad forjada desde el comienzo. ¡Gracias equipo! porque ustedes han sido el cimiento de este proyecto cuyo esfuerzo ha sido compartido. A las instituciones y administraciones correspondientes, especialmente a la ULPGC, desde donde se obtuvieron los fondos y la beca para iniciar esta andadura. A mi hermana y a mis padres, por inculcarme la constancia, el espíritu de lucha, permitirme tomar decisiones con libertad y tener la certeza de que puedo contar siempre con ustedes. A ustedes que siempre me han apoyado, a pesar de no entender muy bien que casi un tercio de mi existencia la haya invertido en esta Facultad, y haber además padecido sobre todo los peores momentos, más que los éxitos, derivados de esta inversión. Por todo esto les estoy 248 profundamente agradecido. Espero a partir de ahora poder compensarles el tiempo que les he robado... También a mis tíos y a mis primos, que siempre se han interesado por mi trayectoria tanto personal como profesional. A Joha, por haber sido una persona muy importante que me acompañó durante los comienzos de mi andadura en este proyecto, por el recuerdo que tengo del entusiasmo que le caracteriza, y por hacerme ver que habían cosas más importantes a valorar que el propio trabajo…aunque te encuentres casi en las antípodas, desde aquí mi agradecimiento. A los ganaderos de la isla de Gran Canaria, y de forma especial a Paco Jiménez y sus trabajadores…sin sus animales, permiso de accesos a las explotaciones y colaboración no habría podido plantearse este proyecto. A los compañeros veterinarios Guaci Jiménez, Elsa Díaz, Alejandro “el de Valleseco”, el Inglés, Antonio “el de Teror”, Guillermo “el de la Aldea”, Samuel “el de Ingenio”, Sergio y Yeray “Los Haemonchus”, Jorge González, Paco Doreste, Alexis Ruiz, Luigi, Pitti…sin ustedes el acceso a muchas explotaciones muestreadas habría sido imposible. A Alberto y Cande, por permitirme el uso del Laboratorio de Patología, y a Juan Alberto por haberme ayudado en algunas cuestiones relativas a los rumiantes y los camellos. Al Dr. Angelo Santana del Pino del Departamento de Matemáticas de la ULPGC, por su amable asesoramiento en la planificación estadística del estudio en rumiantes. Al Dr. Javier Lucientes de la Universidad de Zaragoza, que aunque él a lo mejor no lo recuerde, me dio las primeras recomendaciones en el diseño de la trampa de insectos a través de mail. Al Dr. Marco Báez Fumero de la Universidad de La Laguna, quien me enseñó algunos aspectos de la entomología canaria y me ayudó a la identificación de vectores a través de teléfono, mail y envío de insectos recolectados a la isla vecina. A Juan Manuel Santana, por ser un referente antes de empezar mi carrera, y a su equipo de la C.V. Arucas por dedicarme tiempo de formación durante las “estancias de verano” en mi etapa de estudiante. A los antiguos compañeros buiatras, Marcos Suárez y Juan Manuel Arencibia, que me permitieron dar los primeros pasos como veterinario de campo. A mis antiguos compañeros veterinarios del HCV de la Facultad de Veterinaria (Oliver, Juanmi, Armiche Fernández, Elena Lezcano, Jana Arteaga, Miguel “el chicharrero”, Sonia Peinado, Carlos Melián) y su personal (los inseparables Antonio y Paco, Tere, Déborah, Mayeya, Nadia). La Agradecimientos 249 experiencia personal y profesional acumulada durante este tiempo con todos ustedes ha sido, sin duda, muy valiosa. A los compañeros doctorandos que fueron llegando a goteo al despacho: Elena Carretón, Luca Gradilone y Jorgelina Méndez. Aparte de la amistad surgida, gracias a la compañía de ustedes se ha hecho, sobre todo, más llevadera la escritura de esta tesis… ¡se va el veterano de guerra, así que mi mesa sale a sorteo! Sepan que les voy a echar mucho de menos. A Irene Cabello, mi técnico de laboratorio que siempre está al pie del cañón ¡Muchas gracias Irenita!...aparte de la buena amistad surgida, tu asistencia con un “sí” y una sonrisa por respuesta en las labores de laboratorio y de campo, ha hecho menos pesado este esfuerzo. A Sara López, que me ayudó en muestreos mientras disfrutaba de su beca para alumnos de últimos curso. A Diana Rodríguez, que ya habiendo cumplido sus horas de estancias, arriesgaba sus exámenes por ayudarnos en los chequeos de los camellos ¡tienes mucho mérito! A la compañera de Tolousse, Claudia Ribeiro que, durante su estancia con el equipo, colaboró activamente en todo el trabajo programado. A todos aquellos alumnos de la Facultad de Veterinaria, con los que tuve el placer de poder compartir mis humildes conocimientos. A todas las personas que conocí y me ayudaron en Ciudad Real durante mi estancia en el IREC, agradeciendo de forma especial al Dr. de la Fuente y a la Dra. Ruth Galindo, por permitirme mucho de su tiempo y de sus conocimientos, a pesar del volumen de trabajo que tenían, y a Rosa Fernández y su familia por la hospitalidad recibida en su casa. Sin duda, guardo un grato recuerdo de esta etapa en las tierras manchegas, que ha supuesto para mí una experiencia vital. Agradecer al Dr. Álvaro Hernández, que aparte de brindarme su amistad, me orientó en las ayudas para la movilidad. A mis amigos, sobre todo a los aruquenses que son los que más cerca tengo y ello ha facilitado poder mantener un contacto más frecuente (Airam, Aday, Víctor, Miguel, Nico, Laure, Aníbal, Fátima, José Alberto). ¡De forma especial a Héctor y a David, además de amigos, agradecerles su soporte informático, que se convierte en un apoyo moral muy importante cuando los “cacharros” no quieren funcionar! Y de nuevo a David, por la ayuda en la maquetación, impresión, encuadernación…. Gracias a ustedes por respetar y entender el tiempo que he sacrificado durante este periodo, y darle sentido a la profundidad que entraña la palabra amistad.