Dependencias tróficas y sinápticas del sistema oculomotor.

Facultad de Biología Departamento de Fisiología TESIS DOCTORAL Dependencias tróficas y sinápticas del sistema oculomotor Rosendo Miguel García Hernández Sevilla, 2018 ÁNGEL M. PASTOR LORO, Catedrático del Dpto. de Fisiología de la Facultad de Biología, Universidad de Sevilla. BEATRIZ BENÍTEZ TEMIÑO, Profesora Contratada Doctorada del Dpto. de Fisiología de la Facultad de Biología, Universidad de Sevilla. CERTIFICAN: Que D. Rosendo Miguel García Hernández, Licenciado en Biología por la Universidad de Sevilla, ha realizado bajo su dirección y supervisión el trabajo titulado “Dependencias tróficas y sinápticas del sistema oculomotor”, considerando que reúne todas las condiciones necesarias para ser presentado y defendido como Tesis Doctoral. Sevilla, 15 de Diciembre de 2017. Fdo. Ángel M. Pastor Loro Fdo. Beatriz Benítez Temiño i ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 1 1.1. Plasticidad del sistema nervioso central ................................................................... 3 1.1.1. Lesión como herramienta de estudio ................................................................. 3 1.1.2. Efectos derivados de la deaferentación en el sistema nervioso ........................ 4 1.1.3. Mecanismos de deaferentación ......................................................................... 5 1.1.4. Plasticidad sináptica ........................................................................................... 7 1.1.4.1. Plasticidad homeostática ............................................................................. 8 1.1.5. Regulación y reorganización de la plasticidad sináptica tras la lesión ............... 9 1.1.6. Mecanismos de compensación ........................................................................ 12 1.2. Factores neurotróficos y plasticidad neuronal ....................................................... 16 1.2.1. Neurotrofinas ................................................................................................... 18 1.2.2. Receptores de neurotrofinas ............................................................................ 18 1.2.3. Efectos biológicos de las neurotrofinas: papel en procesos de plasticidad sináptica ...................................................................................................................... 20 1.3. Sistema oculomotor ................................................................................................ 22 1.3.1. Organización anatómica del sistema oculomotor ............................................ 22 1.3.1.1. Musculatura extraocular ............................................................................ 22 1.3.1.2. Núcleos oculomotores ............................................................................... 25 1.4. Modelo experimental .............................................................................................. 27 1.4.1. Motoneuronas del recto medial del NMOC ..................................................... 27 1.4.1.1. Localización de las motoneuronas del recto medial ................................. 27 1.4.1.2. Fisiología de las motoneuronas del recto medial ...................................... 28 1.4.2. Aferencias a las motoneuronas del recto medial ............................................. 29 1.4.2.1. Neuronas internucleares del NMOE .......................................................... 29 1.4.2.2. Núcleo vestibular lateral ............................................................................ 31 1.4.2.3. Otras aferencias ......................................................................................... 32 1.5. Movimientos oculares ............................................................................................. 33 1.5.1. Movimientos sacádicos .................................................................................... 33 1.5.2. Fijaciones oculares ............................................................................................ 35 1.5.3. Reflejo vestíbulo-ocular .................................................................................... 37 1.5.4. Reflejo optocinético ......................................................................................... 38 ii 1.5.5. Movimientos de seguimiento ........................................................................... 39 1.5.6. Movimientos de vergencia ............................................................................... 40 2. OBJETIVOS ............................................................................................................. 43 3. MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................... 47 3.1. Animales de experimentación ................................................................................. 49 3.2. Preparación quirúrgica de los animales para el registro crónico extracelular ....... 51 3.3. Registros extracelulares unitarios ........................................................................... 54 3.4. Axotomía ................................................................................................................. 59 3.5. Adquisición de datos electrofisiológicos ................................................................. 60 3.5.1. Análisis de los movimientos oculares espontáneos ......................................... 61 3.5.2. Análisis de los movimientos oculares durante el reflejo vestíbulo-ocular ...... 61 3.5.3. Análisis de la actividad neuronal durante movimientos oculares espontáneos .................................................................................................................................... 62 3.5.4. Análisis de la actividad neuronal durante el reflejo vestíbulo-ocular .............. 63 3.5.5. Análisis cualitativo de la actividad neuronal durante movimientos oculares de vergencia .................................................................................................................... 64 3.6. Técnicas de marcaje anterógrado para microscopia óptica ................................... 64 3.7. Inyección de rodamina en los rectos mediales ....................................................... 65 3.8. Perfusión intracardiaca y obtención de cortes cerebrales ..................................... 65 3.9. Técnicas morfológicas ............................................................................................. 67 3.9.1. Técnicas morfológicas para microscopia óptica de campo claro ..................... 69 3.9.2. Técnicas inmunohistoquímicas para microscopía óptica confocal .................. 70 3.10. Análisis de los datos morfológicos ........................................................................ 73 3.10.1. Visualización y captura de imágenes .............................................................. 73 3.10.2. Análisis de imágenes ...................................................................................... 73 3.11. Western blot.......................................................................................................... 75 3.12. Estadística .............................................................................................................. 77 4. RESULTADOS ......................................................................................................... 79 4.1. Aferencias a las motoneuronas del recto medial ................................................... 81 4.1.1. Correlatos anatómicos...................................................................................... 81 4.1.2. Disparo neuronal de las aferencias a la subdivisión recto medial ................... 84 4.2. Movimientos oculares tras la axotomía .................................................................. 87 iii 4.2.1. Movimientos oculares espontáneos ................................................................ 87 4.2.2. Movimientos oculares espontáneos: Análisis .................................................. 89 4.2.3. Movimientos oculares durante el reflejo vestíbulo-ocular .............................. 93 4.2.4. Movimientos oculares durante el reflejo vestíbulo-ocular: Análisis ................ 95 4.3. Efectos de la deaferentación selectiva sobre el patrón de disparo de las motoneuronas del recto medial..................................................................................... 97 4.3.1. Aspectos cualitativos del patrón de disparo de las motoneuronas del recto medial durante movimientos oculares espontáneos ................................................. 97 4.3.2. Análisis de las propiedades de disparo durante fijaciones oculares ................ 98 4.3.3. Análisis de las propiedades de disparo durante movimientos sacádicos ...... 101 4.3.4. Aspectos cualitativos del patrón de disparo de las motoneuronas del recto medial durante estimulación vestibular ................................................................... 103 4.3.5. Análisis de las propiedades de disparo durante estimulación vestibular ...... 105 4.3.6. Aspectos cualitativos del patrón de disparo de las motoneuronas del recto medial durante movimientos de vergencia.............................................................. 108 4.4. Alteraciones sinaptológicas en las motoneuronas del recto medial tras la deaferentación selectiva .............................................................................................. 110 4.5. La sección selectiva del TAD o del FLM provoca un aumento en la presencia de la proteína de crecimiento axonal GAP-43 ...................................................................... 115 4.6. Cambios en la presencia de neurotrofinas en las motoneuronas del recto medial en respuesta a la sección unilateral del TAD o del FLM ............................................... 117 4.7. Evolución temporal de los cambios sinaptológicos tras la deaferentación selectiva de las motoneuronas del recto medial ........................................................................ 120 4.8. Distribución de neurotrofinas en el sistema oculomotor de la rata ..................... 126 4.8.1. Patrón de distribución de neurotrofinas en las motoneuronas del sistema oculomotor de la rata adulta .................................................................................... 128 4.8.2. Patrón de distribución de neurotrofinas en motoneuronas de otros núcleos del tronco del encéfalo ............................................................................................. 128 4.8.3. Análisis cuantitativo de la densidad óptica de neurotrofinas ........................ 131 4.8.4. Presencia de neurotrofinas en los músculos craneales ................................. 133 5. DISCUSIÓN .......................................................................................................... 137 5.1. Correlatos anatómicos .......................................................................................... 140 5.2. Efectos a corto plazo en los movimientos oculares y las propiedades de disparo tras la deaferentación selectiva de las motoneuronas del recto medial ..................... 141 iv 5.3. Efectos a largo plazo en el comportamiento ocular y el disparo tras la deaferentación selectiva de las motoneuronas del recto medial................................ 145 5.4. Cambios en la sinaptología aferente tras la sección unilateral del TAD o del FLM ...................................................................................................................................... 147 5.5. Posibles mecanismos moleculares en la reinervación de las motoneuronas del recto medial tras la deaferentación selectiva .............................................................. 149 5.6. Distribución trófica en sistemas motores craneales ............................................. 154 5.6.1. Presencia de BDNF en las motoneuronas del sistema oculomotor y facial y de NT-3 solo en las motoneuronas oculomotoras ........................................................ 156 5.6.2. El NGF está presente en el neuropilo de los núcleos motores troncoencefálicos ..................................................................................................... 159 5.6.3. Influencia trófica en la resistencia a la neurodegeneración durante la ELA de las motoneuronas extraoculares .............................................................................. 160 6. CONCLUSIONES.................................................................................................... 163 7. BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 167 v ABREVIATURAS ABC: Complejo avidina-biotina peroxidasa ANOVA: Test de análisis de la varianza BDNF: Factor neurotrófico derivado del cerebro BSA: Albúmina sérica bovina CGRP: Neuropéptido relacionado con el gen de la calcitonina ChAT: Acetilcolina transferasa Cy5: Indodicarbocianina DAB: Diaminobencidina EEM: Error estándar de la media ELA: Esclerosis lateral amiotrófica F0: Frecuencia de disparo con la mirada en el centro de la órbita (a cero grados) FD: Frecuencia de disparo FITC: Isotiocianato de fluoresceína FLM: Fascículo longitudinal medial FRPB: Formación reticular ponto-bulbar FRPP: Formación reticular pontina paramediana GAP-43: Proteína asociada al crecimiento axonal de 43 kDa GAPDH: Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa HRP: Peroxidasa de rábano i.m.: Intramuscular i.p.: Intraperitoneal IgG: Inmunoglobulina G ks: Sensibilidad neuronal a la posición ocular durante movimientos espontáneos kv: Sensibilidad neuronal a la posición ocular durante estimulación vestibular MIF: Fibras de inervación múltiple NBE: Neurona de brote excitador NBI: Neurona de brote inhibitorio NDS: Suero de burro NGF: Factor de crecimiento nervioso NMOC: Núcleo motor ocular común NMOE: Núcleo motor ocular externo NMOT: Núcleo motor ocular troclear NT-3: Neurotrofina 3 NT-4/5: Neurotrofina 4/5 NVL: Núcleo vestibular lateral NVM: Núcleo vestibular medial NVS: Núcleo vestibular superior PO: Posición ocular pa/s: Potenciales de acción por segundo PB: Tampón fosfato PBS: Tampón fosfato salino PBS-T: PBS con tritón rs: Sensibilidad neuronal a la velocidad ocular durante movimientos espontáneos rv: Sensibilidad neuronal a la velocidad ocular durante estimulación vestibular SIF: Fibras de inervación única SNC: Sistema Nervioso Central SNP: Sistema Nervioso Periférico TAD: Tracto ascendente de Deiters TB: Tampón Tris-Cl TBS: Tampón Tric-Cl salino TRITC: Tetrametil rodamina 5,6 isotiocianato Trk: Tropomiosina quinasa VO: Velocidad ocular VEGF: Factor de crecimiento del endotelio vascular Introducción 4 Así, tras un daño en el SNC podemos distinguir diferentes grupos neuronales según su participación en los procesos activos de degeneración y reorganización que siguen a la lesión: i. Las neuronas axotomizadas; ii. Las células que pierden sus aferencias al degenerar los cabos distales de los axones seccionados; iii. Las células que pierden su diana, al morir o atrofiarse las neuronas lesionadas; y iv. Las células que no se afectan directamente por la lesión, pero que pueden modificar su estructura y/o función de forma indirecta (Deller y Frotscher, 1997). Por consiguiente, otra manipulación que permite estudiar la reorganización funcional y estructural del SNC adulto es la lesión mecánica o el bloqueo funcional de la conectividad aferente. Sin embargo, no se conoce en profundidad el papel que tiene la conectividad, composición y actividad sináptica aferente en el mantenimiento de las propiedades fisiológicas y morfológicas de las neuronas, así como la respuesta y mecanismos de plasticidad que exhiben cuando estos parámetros se modifican. El presente trabajo se centra en los efectos de la deaferentación de neuronas centrales adultas en las propiedades electrofisiológicas y en la estructura de los circuitos neuronales. 1.1.2. Efectos derivados de la deaferentación en el sistema nervioso Tras la sección o eliminación de un tracto axonal, las neuronas diana de los axones lesionados pierden algunas de sus entradas. Esta pérdida de aferencias sobre la neurona postsináptica se conoce como deaferentación. La deaferentación puede producir alteraciones de las propiedades funcionales y morfológicas de la neurona afectada. Así, la deaferentación puede desembocar en modificaciones funcionales, como cambios en las propiedades de disparo (Degos y col., 2013; Francis y Manis, 2000; Reeves y Steward, 1988), en la excitabilidad neuronal (Desai y col., 1999; Gage y col., 1983c; Him y Dutia, 2001; Shao y col., 2009), en la composición y densidad de receptores en la membrana (Shao y col., 2009; Smith y Zheng, 2013) o en la expresión de determinadas proteínas (Garcia y col., 2000; Krügel y col., 2001; Park y col., 2013). Es destacable la relación existente entre cambios en la expresión de factores tróficos (DeCouto y col., 2003; Gómez-Pinilla y col., 2004; Grosheva y col., 2016; Johnson y col., 2000; Qin y col., 2006; Stowe y col., 2007; Widenfalk y col., 2001) y/o de sus receptores (Keast y Kepper, 2001; Widenfalk y col., 2001) y la retirada de aferencias a la neurona postsináptica a nivel del SNC y SNP, señalando el importante papel que estas moléculas ejercen en los cambios en la conectividad sináptica tras procesos de deaferentación. Por otro lado, se ha observado que tras la deaferentación parcial se pueden desencadenar modificaciones estructurales como la expansión o retracción del árbol dendrítico Introducción 5 de la neurona postsináptica (Marik y col., 2010; Wang y Rubel, 2012), cambios en la morfología de dendritas o espinas dendríticas (Caceres y Steward, 1983; Nitsch y Frotscher, 1993; Sorensen y Rubel, 2006) e incluso puede producirse degeneración transneuronal y atrofia o muerte de la neurona postsináptica, especialmente durante estadios postnatales (Harris y col., 2008; Poduri y col., 1995). Además, tras procesos de deaferentación, se puede producir el crecimiento de brotes que emergen de axones intactos y que establecen nuevas sinapsis para ocupar el espacio vacante sobre la membrana de la neurona denervada (Cotman y col., 1981; Mendell, 1984). Este remodelado de las conexiones sinápticas es una propiedad fundamental de las neuronas, que puede conllevar amplios cambios en la organización del cerebro que faciliten mecanismos compensatorios a nivel morfológico y/o funcional tras lesiones o enfermedades neurodegenerativas (Butz y col., 2009; Citri y Malenka, 2008; Deller y Frotscher, 1997; Jamann y col., 2017; Nys y col., 2015; Westlake y Byl, 2013). 1.1.3. Mecanismos de deaferentación Existen diversas manipulaciones para estudiar los procesos que subyacen a la deaferentación y la posterior remodelación sináptica en el sistema nervioso. Así, podemos distinguir entre deaferentación mecánica, química e inducida por lesión. La deaferentación mecánica consiste en la desconexión directa por axotomía de las aferencias. Es una de las formas de deaferentación más clásicamente usadas. Así, en la bibliografía actual se pueden encontrar numerosos estudios sobre denervación directa a nivel de corteza cerebral (Calford, 2002; Graziano y Jones, 2009; Nys y col., 2015; Newton y col., 2002), hipocampo (Frotscher y col., 1997; Gage y col., 1983a, b; Krügel y col., 2001) o médula espinal (Darian-Smith y col., 2013; Filli y Schwab, 2015; Zhang y col., 1995), entre otras zonas del SNC. La desconexión mecánica entre una célula y la fibra que la inerva supone, además de la deaferentación de la neurona de interés, un traumatismo en el sistema nervioso, lo que desencadena una respuesta compleja, que en muchos casos implica procesos de degeneración y regeneración tras la lesión, los cuales son independientes de la respuesta a la deaferentación. Existe otro tipo de deaferentación que resulta útil para estudiar los efectos directos de la inactividad sináptica sobre el disparo, la morfología y el fenotipo de la neurona postsináptica: la deaferentación química. Un ejemplo de deaferentación química es la utilización de toxina tetánica (González-Forero y col., 2005; Jiang y col., 1998), que se transporta transinápticamente desde la unión neuromuscular hasta los terminales aferentes a la motoneurona, donde bloquea la transmisión sináptica (Rind y col., 2005). Así, la inyección de toxina tetánica en el recto lateral Introducción 6 produce cambios reversibles en el patrón de disparo de las motoneuronas del núcleo motor ocular externo (NMOE) que dependen de la dosis: A dosis baja de toxina tetánica se bloquean exclusivamente los terminales aferentes inhibitorios, lo que desencadena un incremento en el patrón de disparo, mientras que a dosis más altas se produce un bloqueo de aferencias inhibidoras y excitadoras, produciendo una deaferentación completa de las motoneuronas abductoras, lo que conlleva un patrón de disparo monotónico y de bajas frecuencias (González- Forero y col., 2002, 2003), acompañado de cambios estructurales en la organización sináptica de dichas células (González-Forero y col., 2004). Otra molécula capaz de producir deaferentación química es la β-bungarotoxina, abundante en el veneno de las serpientes del género Bungarus, que bloquea la liberación de neurotransmisor en los terminales presinápticos. Así, inyecciones de β-bungarotoxina en la cóclea de ratas adultas causa muerte celular en las neuronas del ganglio ciliar sin verse daños sobre las células ciliadas ni en otras células del oído interno (Martinez-Monedero y col., 2006; Palmgren y col., 2010). La tetrodotoxina, una toxina de origen marino que bloquea canales de sodio, es otra sustancia comúnmente utilizada en los experimentos de deaferentación química, especialmente a nivel de la corteza somatosensorial (Frenkel y Bear, 2004; Harris y col., 2008). Finalmente, podemos hablar de la deaferentación inducida por pérdida de contacto eferente o deaferentación indirecta. La axotomía de una neurona en el SNC representa un método lesivo, que induce denervación y remodelación sináptica sobre la neurona lesionada. Los efectos producidos por este tipo de deaferentación son difíciles de estudiar, pues no es posible separar las consecuencias producidas por la deaferentación, la denervación eferente y las causadas por la lesión en sí. Se conoce que la axotomía produce la retirada de aferencias sobre la neurona lesionada debido a la pérdida del contacto con su diana, tanto a nivel del SNP como del SNC (Brännström y Kellerth, 1998; Delgado-García y col., 1988; Pastor y col., 2000). Existen evidencias morfológicas que sugieren que la deaferentación post-axotomía ocurre fundamentalmente en el soma y las dendritas proximales, y que la reducción en el número de contactos sinápticos podría afectar de manera diferente dependiendo de la naturaleza de los terminales presinápticos (Brännström y Kellerth, 1998; Delgado-García y col., 1988; Sumner, 1975). El presente trabajo se centra en el estudio del efecto de la deaferentación directa. Introducción 7 1.1.4. Plasticidad sináptica La plasticidad sináptica es la capacidad del sistema nervioso de modificar la efectividad o fuerza de una determinada sinapsis, así como de cambiar su número y las características intrínsecas de una o un grupo de células a lo largo de la red neuronal (Calford, 2002; Citri y Malenka, 2008; Holtmaat y Svoboda, 2009; Tsukahara, 1981). La plasticidad sináptica parece ser uno de los principales mecanismos que permite a los organismos aprender y adaptarse a las condiciones ambientales, capacidad que se retiene en el cerebro adulto incluso en condiciones patológicas (Guo y col., 2015; He y col., 2009; van Meer y col., 2012). La plasticidad inducida por lesión ha sido descrita en diferentes especies, prestando especial interés a la comprensión de los mecanismos que la generan y regulan. Se pueden distinguir dos tipos de plasticidad sináptica, funcional y estructural (Butz y col., 2009; Jamann y col., 2017). La plasticidad sináptica funcional abarca todos los mecanismos que modifican la efectividad de una sinapsis, como cambios en la configuración de receptores postsinápticos (Bentea y col., 2017; Kilman y col., 2002; MacGillavry y col., 2013), en la liberación de neurotransmisor por parte del terminal presináptico (Kaneko y col., 2017; Matz y col., 2010), en la excitabilidad de membrana (Munson y col., 1997; Wefelmeyer y col., 2015); así como cambios en el balance de excitación e inhibición (Marik y col., 2010). Por el contrario, cualquier cambio en la conectividad neuronal se define como plasticidad estructural, y abarca un amplio abanico de alteraciones. Se pueden dar modificaciones estructurales en las conexiones de un circuito neuronal mediante cambios en el número de sinapsis, ya sea eliminando sinapsis existentes (Bastrikova y col., 2008) u originando nuevas sinapsis (De Paola y col., 2006; Knott y col., 2002; Marik y col., 2010; Murphy y Corbett, 2009), proceso que se conoce como sinaptogénesis reactiva (Deller y Frotscher, 1997). También pueden deberse a cambios en el patrón de la conectividad sináptica (synapse turnover), que consisten en la retracción, modificación de la dirección y posterior contacto con un nuevo blanco de los terminales existentes (De Paola y col., 2006; Trachtenberg y col., 2002, Yamahachi y col., 2009). Además se pueden producir modificaciones en el patrón de ramificación dendrítica o axonal (Marik y col., 2010; Tailby y col., 2005; Schubert y col., 2013; Wang y Rubel, 2012), e incluso en determinados casos en el número de células (Altman y Das, 1965; Gould y Gross, 2002). Introducción 8 1.1.4.1. Plasticidad homeostática Procesos lesivos a nivel del SNC, como la deaferentación, pueden producir alteraciones en las propiedades intrínsecas de los circuitos neuronales. Así por ejemplo, se puede desbalancear el equilibrio eléctrico entre excitación e inhibición, originando patrones de actividad neuronal que tienden a exceder los límites funcionales (Jamann y col., 2017; Turrigiano, 2012; Turrigiano y Nelson, 2004). Se ha comprobado que estos cambios en el equilibrio excitación-inhibición pueden conducir a una excitabilidad en exceso que perturba las respuestas de la red neuronal al completo. La morfología y la fisiología sináptica están estrechamente relacionadas, y ambas pueden ser modificadas en función del uso de las sinapsis, en una forma dependiente de actividad (Katz y Shatz, 1996; Kilman y col., 2002; Walmsley y col., 1998). De aquí surge el concepto de plasticidad Hebbiana, que afirma que la actividad sináptica juega un papel en el mantenimiento, formación o eliminación de nuevas sinapsis. De esta forma, el uso repetido de una sinapsis tendería a estabilizarla así como incrementar su eficacia, mientras que el desuso de la misma desencadenaría su eliminación (Hebb, 1949). Sobre este concepto se basan los mecanismos dependientes de actividad de potenciación y depresión sináptica a largo plazo (Citri y Malenka, 2008; Massey y Bashir, 2007). Sin embargo, la regla hebbiana de plasticidad podría desestabilizar la actividad y organización de los circuitos neuronales al completo. Así, cambios en la eficacia sináptica de los terminales presinápticos desencadenarán modificaciones en la efectividad postsináptica, y a su vez este cambio producirá más potenciación. Como resultado, las entradas que se correlacionan positivamente se potenciarían, mientras que las entradas que están correlacionadas negativamente se deprimirían, perdiéndose la selectividad de las redes neuronales (Jamann y col., 2017; Turrigiano, 2012; Turrigiano y Nelson, 2000, 2004). Existen por lo tanto mecanismos que tienden a compensar el desbalance de actividad, actuando sobre la eficacia sináptica total y la excitabilidad neuronal. Al conjunto de estos procesos se le ha denominado plasticidad homeostática (Davis y Bezprovanny, 2001; Turrigiano, 2012). Se ha comprobado que la privación visual in vitro (Desai y col., 2002; Lambo y Turrigiano, 2013; Turrigiano y col., 1999) o in vivo (Keck y col., 2013) que conlleva la deaferentación de neuronas corticales, desencadena incrementos en los potenciales postsinápticos excitadores y en la excitabilidad de las células deaferentadas, relacionados con los procesos de plasticidad homeostática. Ambos procesos van acompañados de cambios en la densidad de receptores de glutamato en las membranas postsinápticas (Desai y col., 2002; Keck y col., 2013; Turrigiano, 1999), proceso que comparten Introducción 9 con los mecanismos de potenciación a largo plazo. Sin embargo, los procesos sinápticos de potenciación a largo plazo son rápidos y a nivel local, mientras que las variaciones en los potenciales postsinápticos excitadores ocurren a escala de tiempo y distancia mayores (Turrigiano y Nelson, 2004). Recientemente ha surgido un modelo que intenta explicar el mecanismo de regulación homeostática (Davis y Bezprovanny, 2001; Turrigiano, 2012). Este modelo sugiere que las células nerviosas son capaces de monitorizar mediante ¨sensores¨ ciertos parámetros de su actividad eléctrica, así como de la red neuronal de la que forman parte, manteniéndolos estables alrededor de determinados valores, de tal forma que la información recibida sería transmitida a vías intracelulares que finalmente actuarían sobre diferentes elementos de la membrana pre- y postsináptica, en cuyo proceso participarían señales moleculares de forma retrógrada y anterógrada, como factores neurotróficos, proteínas de membrana o neurotransmisores (Johnson y col., 2000; Novikov y col., 2000; Rutherford y col., 1997; Vlachos y col., 2013). Por tanto, para entender el concepto de plasticidad hay que verlo como un fenómeno que se produce en el seno de dos componentes que pueden tener efectos diametralmente opuestos: un componente hebbiano, que se refiere a mecanismos basados en la modificación constante de las propiedades de los circuitos neuronales; y un componente homeostático, con mecanismos que promueven la estabilidad de las vías neuronales (Turrigiano, 2012; Turrigiano y Nelson, 2000, 2004). Estos sistemas operan en paralelo permitiendo cambios a nivel molecular, celular, de sistema y de comportamiento, además de cambios homeostáticos y compensatorios en el conjunto de la red neuronal (Nys y col., 2015). 1.1.5. Regulación y reorganización de la plasticidad sináptica tras la lesión Tras una lesión en el SNC pueden diferenciarse dos mecanismos plásticos: las respuestas regenerativas del segmento proximal del axón dañado y la generación de nuevas colaterales axonales desde fibras nerviosas intactas (Frotscher y col., 1997). La axotomía de una neurona en el SNC produce la degeneración retrógrada del extremo proximal del axón y la pérdida del extremo distal (Rossi y col., 1997). Las neuronas axotomizadas se atrofian o mueren, dependiendo de diferentes factores que influyen en su supervivencia. Así, la cercanía de la lesión al soma o la interrupción del flujo trófico con su diana, parecen ser factores relevantes para la supervivencia de estas células (Sofroniew e Isacson, 1988). Además, la interacción de las neuronas axotomizadas con células gliales también parece ser fundamental, ya que éstas intervienen en los procesos de degeneración tras la lesión, además de tener un Introducción 10 papel neuroprotector, pues evitan que se propague la inflamación tras la lesión (Thanos y Mey, 1995; Scheib y Höke, 2013). El SNC posee una capacidad limitada de regeneración axonal (Rossi y col., 1997), opuesto a lo que sucede en el SNP, donde los axones lesionados tienen la capacidad de regenerar y contactar de nuevo con una diana (Scheib y Höke, 2013). En el SNC, en los alrededores de la lesión se producen respuestas abortivas de proliferación en el segmento proximal del axón lesionado (Filli y Schwab, 2015; Schnell y Schwab, 1993), sin que lleguen a restaurarse las conexiones ni la función previa a la lesión (Deller y Frotscher, 1997). La regeneración axonal, por tanto, es más efectiva en el SNP que en el SNC. Este hecho se ha comprobado en estudios donde se implantaron injertos de nervio periférico tras lesiones centrales, y se producía la regeneración de los axones lesionados a través del injerto (David y Aguayo, 1981; Hagg y col., 1990a), llegando a penetrar en el SNC hospedador y formar contactos sinápticos (Sauvé y col., 1995). Estas mismas respuestas, aunque menos amplias, se han visto cuando se implanta tejido embrionario (Benítez-Temiño y col., 2002) o bien células madres embrionarias (Morado-Díaz y col., 2014) en la zona de la lesión. Otra de las respuestas más comunes tras la deaferentación en el SNC es la generación de colaterales axonales desde fibras no lesionadas. Se acepta que ciertas regiones del SNC adulto tienen la potencialidad de formar nuevas uniones sinápticas en respuesta a estímulos internos o externos. Así, se ha demostrado que tras la deaferentación de neuronas corticales (Sugihara y col., 2003; Yamahachi y col., 2009; Zhang y col., 2013) del hipocampo (Frotscher y col., 1997; Gage y col., 1983a; Steward y col., 1988), talámicas (Bromberg y col., 1987), cerebelosas (Aoki y Sugihara, 2012; Grasselli y Strata, 2013), del tronco del encéfalo (Jain y col., 2000) o medulares (Darian-Smith y col., 2013; Rosenzweig y col., 2010; Zhang y col., 1995) se generan nuevas colaterales axonales de aferentes ya existentes o de fibras locales próximas. Estas respuestas parecen permitir la reinervación de las dianas deaferentadas, así como la restauración del número de sinapsis previo a la lesión. Entre los procesos descritos se incluye la formación de nuevas zonas activas a partir de sinapsis preexistentes (sinapsis múltiples), o bien la inervación de dendritas por nuevos terminales (Beier y col., 2017; Deller y col., 1995; Steward y col., 1988; Tropea y col., 2003), proceso denominado proliferación axonal terminal (Deller y Frotscher, 1997). La generación de colaterales es altamente selectiva en cuando al lugar del sistema nervioso donde tiene lugar, y al tipo de fibras que exhiben dicho fenómeno: incluso dentro del mismo tipo neuronal, algunas fibras tienen la capacidad de generar colaterales y Introducción 11 otras no (Deller y Frotscher, 1997; Tsukahara, 1981). Además, el proceso de reinervación no es azaroso, y se lleva a cabo mediante mecanismos competitivos (Proctor y col., 1979). La generación de colaterales axonales puede ser inducida por señales de diferente naturaleza. La aparición de espacios postsinápticos vacantes puede ser reconocida por las fibras supervivientes, que iniciarían el brote de nuevos terminales (Raisman, 1977). De este modo las células denervadas expanden sus campos receptores postsinápticos para maximizar el espacio sináptico disponible (Caceres y Steward, 1983; Nitsch y Frotscher, 1993). Otra señal que inicia la proliferación axonal terminal puede ser la pérdida en el balance entre las aferencias inhibidoras y excitadoras sobre una neurona (Deller y col., 1995; Marik y col., 2010; Zhang y col., 2013), e incluso la presencia de terminales lesionados degenerando también pueden inducir los procesos de regeneración axonal (Collyer y col., 2014; Ramer y col., 1997). Por otra parte, la deaferentación puede producir cambios en la actividad sináptica alterando el fenotipo de las neuronas denervadas. Así, previamente se ha demostrado una relación entre la denervación aferente, la generación de nuevas fibras axonales y el aumento en la expresión de ciertas proteínas asociadas al crecimiento y la organización axonal, muy abundantes durante el desarrollo. Entre ellas destacan proteínas como la GAP-43, proteína asociada al crecimiento axonal de 43 kDa (Allegra Mascaro y col., 2013; Grasselli y col., 2011; Zhang y col., 2005), proteínas de adhesión celular como moléculas de adhesión neuronales (NCAMs; Dityatev y col., 2000; Jucker y col., 1995) o proteínas L1 (L1CAMs; Jucker y col., 1996; Zhang y col., 2005), así como factores de transcripción relacionados con la expresión de proteínas estructurales y de regeneración como c-Jun (Nangle y Keast, 2009; Pearson y col., 2003). También se ha observado que la denervación produce cambios en la expresión de factores tróficos o en la densidad de sus receptores (Deller y Frotscher, 1997; Schinder y Poo, 2000), como se ha visto en experimentos in vitro e in vivo en neuronas de diferentes zonas del SNC como corteza (Desai y col., 1999; Stowe y col., 2005), hipocampo (Bramham y col., 1996; Zafra y col., 1991), cerebelo (Bessho y col., 1993) o médula espinal (Gomez-Pinilla y col., 2004; Johnson y col., 2000). Además, se ha demostrado la relación existente entre un aumento en la expresión de factores neurotróficos y la generación de nuevas colaterales axonales tras procesos lesivos (DeCouto y col., 2003; Hagg y col., 1990b; Jakeman y col., 1998; Koelsch y col., 2010; Koda y col., 2004; Scott y col., 2005; Schnell y col., 1994; Tropea y col., 2003; Zhou y col., 2009). Así, se ha comprobado que los factores tróficos estimulan la expresión de ciertos genes asociados al crecimiento y la regeneración (Gómez-Pinilla y col., 2004; Klöcker y col., 2001). Introducción 12 También, se ha puesto de manifiesto la relación entre los factores tróficos y ciertas proteínas de inhibición del crecimiento axonal. Así, los factores tróficos modulan la respuesta de los conos de crecimiento a dichas proteínas inhibidoras (Cai y col., 1999; Tuttle y O’Leary, 1998). Una vez generadas las nuevas colaterales, la formación de contactos sinápticos con los terminales postsinápticos parece ser dependiente de numerosos factores a nivel local, tanto precomo postsinápticos, los mismos que dirigen las conexiones neuronales durante el desarrollo (Goodman y Schatz, 1993; Sanes y Yamagata, 2009). 1.1.6. Mecanismos de compensación La respuesta óptima por parte del SNC tras la lesión sería la restauración funcional original de las conexiones existentes mediante la regeneración del axón dañado (Figura 1A). Desafortunadamente, y como se ha visto anteriormente, esta respuesta no ocurre en el SNC adulto, donde principalmente se producen respuestas regenerativas abortivas (Figura 1B, I). Una de las respuestas plásticas que destacan tras la lesión del SNC, o durante el transcurso de enfermedades neurodegenerativas, consiste en la generación de nuevas colaterales desde axones no lesionados. Estas nuevas colaterales aferentes pueden participar en mecanismos de compensación para la recuperación funcional y/o anatómica de la neurona denervada. El término compensación puede ser definido como el conjunto de procesos que tienen lugar para superar la pérdida o el déficit de aferencias sobre la neurona postsináptica mediante diferentes mecanismos neurales, que son necesarios tanto durante el desarrollo como en la etapa adulta, cambiando el funcionamiento de determinadas regiones del SNC tras la lesión (Møller, 2001). También, tras la deaferentación, las colaterales emergentes desde aferencias no lesionadas podrían participan en la recuperación funcional (Figura 1B, II) de la célula deaferentada mediante la reinervación de la misma, originando lo que se conoce como mecanismos de compensación morfo-funcionales (Bachmann y col., 2014; Gage y col., 1983a, b; Rosenzweig y col., 2010; Rossi y col., 1991a, b). Este tipo de mecanismos de compensación para recuperar la funcionalidad previa a la lesión se han comprobado mediante estudios a lo largo de todo el SNC: en corteza (Bachmann y col., 2014), hipocampo (Gage y col., 1983a, b), cerebelo (Aoki y Sugihara, 2012), tronco del encéfalo (Tropea y col., 2003) o médula espinal (Darian-Smith y col., 2013; Mendell y col., 1978). Introducción 13 Figura 1. Mecanismos de compensación tras la deaferentación en el SNC. A: Representación de un hipotético circuito neuronal a nivel del SNC, donde se ilustran las aferencias (células verde y azul) a una motoneurona (amarilla) y su salida motora. B: Se representa el mismo circuito que en A pero tras una lesión. Las neuronas axotomizadas (célula verde) que sobreviven poseen una capacidad limitada de regenerar, produciendo en su mayoría respuestas regenerativas abortivas (I). A nivel de la población deaferentada se pueden producir diversas respuestas funcionales y estructurales para compensar la retirada de terminales aferentes. Así, las entradas sinápticas preexistentes pueden aumentar la efectividad sináptica, o bien generar nuevas colaterales que formen más sinapsis con la neurona deaferentada; se trata de mecanismos de compensación que tienden a recuperar la funcionalidad previa a la lesión (II). Además se pueden producir nuevos contactos aferentes desde neuronas (célula morada) que normalmente no están conectadas con la neurona deaferentada, sin recuperar la funcionalidad, pero sin afectar negativamente al sistema (III). II y III son mecanismos de compensación adaptativos. Sin embargo, tras procesos lesivos, se pueden desencadenar mecanismos disfuncionales (IV), donde se potencian o interconectan circuitos locales (célula marrón) dando lugar a un mal funcionamiento del sistema, produciendo diversos trastornos neurológicos. Las nuevas colaterales axonales se representan en color rojo. Las sinapsis potenciadas tras la lesión se representan en fucsia. Introducción 20 conducen a incrementos en la efectividad de su acción, lo que permite un ajuste fino de su respuesta (Yoon y col., 1998). Figura 3. Modelos de activación de los receptores tirosina quinasa (Trk) y p75. Representación de las interacciones entre las neurotrofinas y sus receptores. La unión de una neurotrofina resulta en la dimerización de su receptor. Las neurotrofinas se unen selectivamente a los receptores Trk, o de forma inespecífica al receptor p75, al cual se unen también las formas pro- o inmaduras. Nótese la capacidad del factor neurotrófico NT-3 de unirse con baja afinidad a los receptores Trk específicos para otras neurotrofinas. Adaptado de Bradshaw y col., 2014; Skaper, 2012. 1.2.3. Efectos biológicos de las neurotrofinas: papel en procesos de plasticidad sináptica Las neurotrofinas tienen un extraordinario rango de funciones biológicas, que dependen del receptor al que se unan y si lo hacen como pro-neurotrofinas o como formas maduras (Bothwell, 2014; Lee y col., 2001). Las neurotrofinas son péptidos que actúan como factores de crecimiento durante el desarrollo, contribuyendo al mantenimiento de poblaciones neuronales en el sistema nervioso. Estas proteínas regulan muchas funciones de neuronas, incluyendo la supervivencia (Oppenheim Introducción 21 y col., 1992), diferenciación y migración de las células nerviosas (Lindholm y col., 1997; Tanaka y col., 2000), así como el crecimiento axonal o dendrítico (McAllister, 2001; McAllister y col., 1996), y la formación y funcionamiento de las sinapsis (Causing y col., 1997; Han y col., 2016). Pero no sólo son importantes en el sistema nervioso inmaduro, sino también durante la edad adulta, cuando intervienen activamente en procesos de plasticidad neuronal (Bothwell, 2014; Lewin y Barde, 1996; McAllister y col., 1999; Skaper, 2012), como cambios en la función sináptica y en la excitabilidad de la membrana, así como modificaciones morfológicas y de conectividad. Así, se han implicado en la regulación y mantenimiento de múltiples propiedades funcionales de adultos en condiciones control. Las neurotrofinas participan en procesos de plasticidad sináptica (McAllister y col., 1999; Gibon y Barker, 2017; Gómez-Palacio-Schjetnan y Escobar, 2013), modificando la efectividad sináptica de las conexiones neuronales en experimentos in vitro (Han y col., 2016; Kang y Schuman, 1995) e in vivo (Ramos-Languren y Escobar, 2013) a lo largo del sistema nervioso. Se ha demostrado que las neurotrofinas pueden modificar la liberación de neurotransmisores desde los terminales presinápticos a nivel del SNC (Lemtiri-Chlieh y Levine, 2010; Sala y col., 1998; Tyler y col., 2002) y producir cambios en la densidad de receptores en las membranas postsinápticas (Riffault y col., 2014; Sharma y col., 1993). En efecto, los factores neurotróficos pueden funcionar como neuromoduladores, alterando rápidamente las propiedades electrofisiológicas de las neuronas, que modifican la excitabilidad de la membrana (Holm y col., 2009; Nieto-González y Jensen, 2013; Yamuy y col., 2000; Zhang y col., 2012). Destaca el papel del BDNF sobre las propiedades eléctricas intrínsecas de neuronas, disminuyendo la excitabilidad de membrana, y sobre la composición sináptica, donde ejerce su acción sinaptotrófica fundamentalmente sobre las entradas inhibitorias (Holm y col., 2009; Huang y col., 1999; Nieto-Gonzalez y Jensen, 2013; Rutherford y col., 1997). Además, las neurotrofinas intervienen en el mantenimiento y modulación de las aferencias sinápticas (Causing y col., 1997; Roosen y col., 2001) en el adulto. También, las neurotrofinas pueden mediar cambios en la arborización axonal y dendrítica, que puede conducir a modificaciones en el número y localización de sinapsis funcionales (Gómez-Palacio-Schjetnan y Escobar, 2013; Han y col., 2016; Li y col., 2012; McAllister y col., 1999; Ramos-Languren y Escobar, 2013). Por otro lado, estos factores tróficos intervienen en diferentes procesos desencadenados en respuesta a la lesión. Se ha observado que la administración exógena de neurotrofinas tras lesiones a nivel del SNC favorece el mantenimiento de las propiedades Introducción 22 funcionales y morfológicas de las neuronas, o bien produce la recuperación de algunas de las funciones perdidas tras el trauma (Caleo y col., 2003; Davis-López de Carrizosa y col., 2009, 2010; Grill y col., 1997; Novikov y col., 2000); incluso puede favorecer la regeneración axonal en neuronas espinales, motoras o sensitivas, axotomizadas (Johnson y col., 2000; Kobayashi y col., 1997; Ye y Houle, 1997). Finalmente, se ha demostrado que tras lesiones del SNC se producen cambios en la expresión de neurotrofinas o de sus receptores (Bucklan y Cunningham, 1999; Gomez-Pinilla y col., 2004; Grosheva y col., 2016; Johnson y col., 2000; Kobayashi y col., 1997; Li y col., 2007; Morcuende y col., 2011; Tonra y col., 1998; Widenfalk y col., 2001). Además, numerosos estudios han puesto de manifiesto que estos factores tróficos favorecen la generación de colaterales axonales regenerativos tras procesos lesivos en el SNC (DeCouto y col., 2003; Schnell y col., 1994; Scott y col., 2005; Tropea y col., 2003; Ye y Houle, 1997). Así, la administración exógena de NGF favorece el brote nuevos terminales desde fibras colinérgicas y sensitivas a lo largo del SNC (Oudega y Hagg, 1996; Varon y col., 1995) y que la administración de anticuerpos frente a esta neurotrofina bloquea la generación de las fibras axonales emergentes (van der Zee y col., 1992; Holtzman y Lowenstein, 1995). Por todo ello, las neurotrofinas son mediadores clave en los procesos de plasticidad que tienen lugar en el SNC, fundamentales para el desarrollo de los mecanismos de compensación funcionales y/o estructurales tras procesos lesivos. Así, en el presente trabajo se estudiará el patrón neurotrófico de las neuronas centrales deaferentadas. 1.3. Sistema oculomotor 1.3.1. Organización anatómica del sistema oculomotor 1.3.1.1. Musculatura extraocular Las rotaciones del ojo se llevan a cabo por la contracción de 6 músculos extraoculares: recto medial o interno, recto lateral o externo, recto superior, recto inferior, oblicuo superior y oblicuo inferior (Figura 4A). Todos, con la excepción del oblicuo inferior, se originan en un anillo tendinoso en el vértice de la órbita, llamado anillo de Zinn. El músculo oblicuo inferior parte de la zona nasal e inferior de la órbita (Sharpe y Wong, 2005). El ojo, desde el punto de vista mecánico, es una esfera que puede realizar movimientos de gran rapidez y precisión en torno a tres ejes imaginarios y ortogonales, que intersectan en el Introducción 23 centro de la órbita: eje vertical, eje horizontal y eje antero-posterior. Así, el ojo puede realizar movimientos en torno al eje vertical, que corresponden a movimientos en el plano horizontal; movimientos en torno al eje horizontal, que corresponden a movimientos en el plano vertical; o bien movimientos giratorios alrededor del eje antero-posterior, que se denominan movimientos torsionales. Los movimientos horizontales pueden ser en dirección nasal o medial (aducción) o bien en dirección temporal o lateral (abducción). Por su parte, los movimientos verticales conllevan movimientos del ojo de elevación o bien depresión. Finalmente, existen movimientos giratorios en el eje antero-posterior: si el ojo se desplaza en dirección nasal se denomina intorsión, si lo hace en dirección temporal, extorsión (Porter y col., 1995; Sharpe y Wong, 2005) Los músculos extraoculares funcionan como tres pares de músculos antagónicos entre sí. El primer par lo conforman el recto medial y el recto lateral, que se insertan en el globo ocular en posición nasal y temporal respectivamente, y que producen los movimientos en el plano horizontal. El segundo par está formado por el recto superior y el recto inferior, que intervienen en los movimientos del ojo en el plano vertical, y se insertan en la parte superior e inferior de la órbita, respectivamente. Por último, el oblicuo superior y el oblicuo inferior, insertados 45 grados por encima y por debajo del recto medial, respectivamente, son los músculos que participan en las rotaciones del ojo en el eje antero-posterior (Figura 4A, Spencer y Porter, 2006). Los músculos extraoculares están compuestos por un número variable de fibras, siendo el recto medial el de mayor masa muscular y el oblicuo inferior el de menor (Spencer y Porter, 2006). Aunque poseen características variables, como longitud, masa o tamaño del tendón, otras propiedades son comunes a todos los músculos extraoculares. Así, están constituidos por paquetes de fibras musculares cuyo diámetro es variable, aunque de menor calibre que el de otros músculos esqueléticos. En la musculatura extraocular podemos distinguir dos capas: una primera capa externa llamada capa orbital, adyacente a los huesos de la órbita, y una segunda capa, más interna, llamada capa global, adyacente al ojo y al nervio óptico (Porter y col., 1995). Otra característica única de los músculos extraoculares es la rica inervación que reciben de las neuronas motoras. Cada motoneurona oculomotora inerva muy pocas fibras musculares si se compara con otros músculos estriados. Así, poseen unidades motoras muy pequeñas, dando lugar a fibras musculares inervadas por una sola neurona motora en la capa global y de 2 a 5 en la capa orbital, lo que ofrece un amplio rango dinámico y un control muscular fino y preciso de los movimientos del ojo (Porter y col., 1995; Spencer y Porter, 2006). Introducción 24 Figura 4. Organización del sistema oculomotor. A: Dibujo que muestra un ojo desde una perspectiva frontal y lateral junto con la musculatura extraocular que interviene durante los movimientos oculares. Los músculos extraoculares se organizan en tres pares antagónicos: los músculos recto lateral y recto medial, los músculos recto inferior y recto superior, y los músculos oblicuo superior y oblicuo inferior. La contracción y relajación coordinada de los mismos permite la realización de los diferentes movimientos oculares. B: Esquema sagital del tronco del encéfalo representando la posición anatómica de los núcleos del sistema oculomotor: núcleo motor ocular común (III, verde), núcleo motor ocular troclear (IV, rosa) y núcleo motor ocular externo (VI, azul). FLM: fascículo longitudinal medial (amarillo). CS: colículo superior. CP: comisura posterior. NIC: núcleo intersticial de Cajal. NriFLM: núcleo rostral del FLM. FRPP: formación reticular pontina paramediana. NRi: núcleo del rafe interpositus. NVI: nervio del VI par. OI: oliva inferior. Adaptado de Büttner-Ennever, 2008. Introducción 25 En la musculatura extraocular se han identificado hasta seis tipos de fibras musculares diferentes, las cuales pueden dividirse en dos categorías (Büttner-Ennever, 2006; Büttner- Ennever y col., 2001): fibras de inervación única, conocidas como SIF (del inglés singly innervated fiber) y fibras de inervación múltiple, llamadas MIF (del inglés multiply innervated fiber). En la capa orbital, alrededor del 80% de las fibras son inervadas individualmente. Estas fibras tienen un contenido alto de mitocondrias y enzimas oxidativas, lo que da a lugar a contracciones más rápidas a la vez que muestran más resistencia a la fatiga. El 20% restante de las fibras orbitales son fibras de inervación múltiple, con menor contenido en mitocondrias y enzimas oxidativas, por lo tanto de contracción más lenta y menor resistencia a la fatiga. En la capa global se distinguen cuatro tipos diferentes de fibras, tres de ellas son fibras de tipo SIF, diferenciándose entre ellas por la capacidad de contracción y la resistencia a la fatiga. El cuarto tipo son fibras tipo MIF, las menos abundantes, de contracción lenta y baja resistencia a la fatiga (Büttner- Ennever, 2006; Porter y col., 1995; Zimmermann y col., 2013). Así, la mayoría de las fibras musculares son fibras de contracción rápida, lo que explica la alta velocidad a la que pueden realizar algunos tipos de movimientos (Shall y Goldberg, 1992). 1.3.1.2. Núcleos oculomotores Las motoneuronas oculomotoras se distribuyen en tres núcleos, cuya organización está altamente conservada a través de la evolución filogenética de los vertebrados (Figura 4B). Núcleo motor ocular común (NMOC): también llamado complejo oculomotor, consiste en una masa alargada de células, ventrolaterales al fascículo longitudinal medial (FLM), situadas en posición ventral a la sustancia gris periacueductal del mesencéfalo, a nivel del tubérculo cuadrigémino superior (Figura 4B, III). Se extiende rostralmente hasta la comisura posterior y caudalmente hasta la unión ponto-mesencefálica. El complejo oculomotor se divide en dos regiones, rostral y caudal, ocupando cada una de ellas aproximadamente la mitad del núcleo. En la división rostral la columna de células está ampliamente separada de la línea media por el núcleo Edinger-Westphal. Experimentos previos en mono (Büttner-Ennever y col., 2001), en gato (Akagi, 1978; Gacek, 1974; Miyazaki, 1985; Naito y col., 1974), conejo (Akagi, 1978; Murphy y col., 1986) o rata (Glicksman, 1980; Labandeira-García y col., 1983) han demostrado que las motoneuronas del NMOC se organizan topográficamente, distinguiéndose diferentes poblaciones neuronales desde la región rostral a la caudal, aunque con cierto grado de solapamiento. Además, se ha comprobado que la organización interna básica del NMOC está bastante conservada en todos los órdenes de vertebrados (Büttner-Ennever, 2006). Este núcleo contiene las motoneuronas que inervan a los músculos recto inferior, recto medial y oblicuo Introducción 26 inferior homolaterales, así como al músculo recto superior contralateral. En la subdivisión rostral y en posición dorsal aparecen las motoneuronas que inervan al recto medial. También en la región rostral pero en disposición ventral, aparecen las motoneuronas del recto inferior. Las motoneuronas que inervan al recto superior se sitúan en la región caudal en posiciones mediales. Finalmente, las neuronas motoras del oblicuo inferior aparecen en la subdivisión caudal, en posiciones laterales (Evinger, 1988; Gacek, 1974). En el NMOC también se incluyen las motoneuronas que inervan el músculo elevador del párpado, cuya posición es variable entre los diferentes grupos de vertebrados (Büttner-Ennever, 2006). Las motoneuronas del NMOC proyectan a través del III par craneal, el más grande y complejo de los tres nervios oculomotores. Además, contiene fibras motoras viscerales que inervan al esfínter de la pupila y al músculo ciliar. Por otra parte, se han descrito diversas poblaciones de interneuronas en el NMOC (Chung y col., 1987; Clendaniel y Mays, 1994; Maciewicz y col., 1975). Estas células aparecen distribuidas entremezcladas con las motoneuronas oculomotoras, tanto dentro del núcleo como en la periferia del mismo, e incluso algunas de ellas aparecen dispersas dorsales al NMOC, en la región supraoculomotora (de la Cruz y col., 1998), proyectando a diferentes zonas como la médula espinal, el cerebelo o el NMOE, así como intranuclearmente. De todas ellas, la vía más estudiada y conocida es la proyección bilateral hacia el NMOE, la cual inerva monosinápticamente a las motoneuronas abductoras (Büttner-Ennerver y col., 2003; de la Cruz y col., 1992). Estas células poseen un disparo similar a las motoneuronas del recto medial del NMOC homolateral, participando en la coordinación de los músculos agonistas recto medial y recto lateral durante los movimientos conjugados de los ojos en el plano horizontal (Clendaniel y Mays, 1994; Ugolini y col., 2006). Núcleo motor ocular troclear (NMOT): localizado en la sustancia gris del mesencéfalo, a nivel del tubérculo cuadrigémino inferior e inmediatamente caudal al NMOC pero algo más lateral (Figura 4B, IV). Este núcleo contiene las motoneuronas que inervan mayoritariamente al músculo oblicuo superior contralateral (95% del total), y en menor medida al homolateral (5% del total; Miyazaki, 1985). Las motoneuronas del NMOT proyectan sus axones por el IV par craneal, el más pequeño de los tres pares craneales oculomotores (Sharpe y Wong, 2005). Núcleo motor ocular externo (NMOE): se encuentra dorsal en el puente, bajo la rodilla del nervio facial (Figura 4B, VI). El NMOE contiene dos poblaciones de neuronas bien definidas: por un lado las motoneuronas que inervan al recto lateral homolateral y cuyos axones discurren por el VI par craneal, y por otro las neuronas internucleares cuyos axones ascienden a través del Introducción 27 FLM contralateral hacia el NMOC, donde establecen contacto sináptico excitador con las motoneuronas del recto medial (Delgado-García y col., 1986b; Highstein y Baker, 1978). En gatos y ratas, las neuronas internucleares aparecen entremezcladas por todo el núcleo, aunque parecen ser más abundantes en la porción rostral. Además, la proporción de motoneuronas y neuronas internucleares en el NMOE es de 2/3:1/3 respectivamente (Cabrera y col., 1988; Steiger y Büttner-Ennever, 1978). Sin embargo, en primates, las neuronas internucleares se sitúan laterales a las raíces del VI par craneal (Büttner-Ennever, 2006). El tamaño de estas neuronas internucleares es ligeramente menor que el de las motoneuronas abductoras, tanto en gato (Spencer y Sterling, 1977) como en conejo (Labandeira-Garcia y col., 1989). Ambos tipos celulares presentan un disparo tónico-fásico, controlando cada población la actividad de músculos antagonistas para la realización de los movimientos horizontales conjugados (Delgado- García y col., 1986b; Fuchs y col., 1988). 1.4. Modelo experimental En el presente trabajo hemos tomado como modelo experimental el sistema oculomotor, y en particular las motoneuronas que inervan al músculo recto medial y sus aferencias. 1.4.1. Motoneuronas del recto medial del NMOC 1.4.1.1. Localización de las motoneuronas del recto medial La subdivisión del recto medial del NMOC está constituida por la población de motoneuronas que inervan al músculo recto medial homolateral, y que junto con las motoneuronas del NMOE homolateral controlan los movimientos oculares del ojo en el plano horizontal. En el gato, las motoneuronas que controlan al recto medial están localizadas principalmente en la subdivisión rostral del NMOC (Figura 5), la cual posee una forma redondeada en su porción más rostral, y se va alargando y estrechando caudalmente, hasta la mitad del núcleo. En la población de motoneuronas del recto medial se distinguen dos subgrupos; un subgrupo dorsolateral que comienza en la región más rostral y que se extiende sobre las 3/4 partes del núcleo; y un subgrupo ventrolateral al FLM, más caudal, que incluye algunas motoneuronas dispersas en este fascículo (Akagi, 1978; Gacek, 1974; Miyazaki, 1985; Naito y col., 1974). Esta misma organización se ha observado tras experimentos morfológicos con trazadores neuronales en la rata (Glicksman y col., 1980; Labandeira-García y col., 1983). Sin embargo, en el mono la subdivisión recto medial se divide en tres subgrupos claramente Introducción 28 distinguibles (Büttner-Ennever, 2006; Büttner-Ennever y Akert, 1981); el grupo A, en posición ventral, que se extiende hasta el FLM; el grupo B, dorsolateral, que posee las motoneuronas de mayor tamaño; y el grupo C, que contiene a las motoneuronas de menor tamaño y que se extiende dorsomedialmente en la periferia del NMOC, en la zona supraoculomotora (Büttner- Ennever y Akert, 1981; Büttner-Ennever y col., 2001). 1.4.1.2. Fisiología de las motoneuronas del recto medial Características morfológicas e histoquímicas: Las motoneuronas del sistema oculomotor poseen en general una forma poligonal y multipolar. El patrón de ramificación dendrítica de estas células presenta diferencias morfológicas y de tamaño con respecto a otras motoneuronas craneales y espinales (Carrascal y col., 2005, 2006; Grantyn y col., 1977; Grantyn y Grantyn, 1978). Específicamente, las motoneuronas que inervan el músculo recto medial presentan un tamaño de 20-60 µm (Markham y col., 1986). Las motoneuronas del recto medial de mayor tamaño poseen formas multipolares con varias dendritas principales que surgen desde el soma; sin embargo, las motoneuronas de menor tamaño son bipolares y fusiformes (Markham y col., 1986). Además, se ha demostrado que las motoneuronas del recto medial emiten colaterales axonales dentro del propio núcleo, hasta la zona supraoculomotora e incluso hacia la parte ventral y lateral del FLM, sin tener efecto sináptico recurrente sobre sí mismas u otras motoneuronas oculomotoras (Evinger y col., 1979; Spencer y col., 1982). Las motoneuronas del recto medial son colinérgicas (Kus y col., 2003). Estas células se caracterizan por expresar diferentes proteínas tamponadoras de calcio y receptores de moléculas tróficas en sus membranas. Así, se ha comprobado que las motoneuronas oculomotoras, incluyendo la subdivisión del recto medial, expresan los receptores TrkA, TrkB y TrkC para neurotrofinas en gato (Benítez-Temiño y col., 2004) y rata (Morcuende y col., 2011) adultos. Además, en rata también se ha comprobado que las motoneuronas oculomotoras presentan el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) en mayor proporción que otros núcleos troncoencefálicos no oculomotores (Silva-Hucha y col., 2017). Por otro lado, las neuronas motoras del recto medial son inmunopositivas para parvalbúmina, y presentan terminales aferentes positivos para parvalbúmina y calretinina, y en menor medida calbindina (de la Cruz y col., 1998). Además, estas neuronas presentan terminales inmunopositivos para GABA y glicina rodeando al soma y dendritas proximales (de la Cruz y col., 1992; Spencer y col., 1989; Wentzel y col., 1996, 1993), siendo ambos neurotransmisores inhibitorios. Sin embargo, y como veremos a continuación, las dos entradas principales a las motoneuronas del recto medial son de carácter excitador (Baker y Highstein, 1978). Introducción 29 Patrón de disparo: Las motoneuronas extraoculares muestran un patrón de disparo tónico-fásico, que se correlaciona durante la vigilia con la posición y la velocidad ocular (de la Cruz y col., 1989; Delgado-García y col., 1986a; Fuchs y col., 1988). Así, las motoneuronas del recto medial emiten brotes de potenciales de acción que preceden a los movimientos sacádicos de aducción, realizados en dirección nasal (on), cuya amplitud es directamente proporcional a la velocidad del ojo, mientras que su frecuencia de disparo disminuye o cesa durante los sacádicos en dirección temporal o de abducción (off). Además, durante las fijaciones oculares, una vez alcanzado el umbral de reclutamiento, muestran una tasa de disparo tónica directamente proporcional a la posición ocular, que se incrementa progresivamente para fijaciones cada vez más nasales (de la Cruz y col., 1989). Las motoneuronas del recto medial de un ojo actúan sinérgicamente con las motoneuronas del recto lateral del otro ojo durante los movimientos horizontales conjugados (Delgado-García y col., 1986a; Fuchs y col., 1988; González-Forero y col., 2003). 1.4.2. Aferencias a las motoneuronas del recto medial Las motoneuronas del recto medial poseen dos entradas principales de origen pontino que serán objeto de estudio en la presente tesis. En primer lugar reciben aferencias cruzadas desde las neuronas internucleares del NMOE contralateral, cuyos axones cursan por el FLM, y por otro lado, son inervadas por neuronas del núcleo vestibular lateral (NVL), cuyos axones forman el tracto ascendente de Deiters (TAD; Figura 5). 1.4.2.1. Neuronas internucleares del NMOE Las neuronas internucleares del NMOE proyectan a través del FLM contralateral para contactar monosinápticamente con las motoneuronas del recto medial (Figura 5; Highstein y Baker, 1978; Highstein y col., 1982). Esta proyección representa la principal entrada pontina a la subdivisión del recto medial. Es una entrada excitadora (Highstein y Baker, 1978; Nakao y Sasaki, 1980), que lleva información relativa a la posición y a la velocidad ocular durante todos los tipos de movimientos oculares (Büttner-Ennever y Akert, 1981; Delgado-García y col., 1986b; Fuchs y col., 1988), salvo para los de vergencia (Mays y Porter, 1984). Introducción 36 Figura 6. Movimientos oculares espontáneos e inducidos por estimulación vestibular. En cada panel se ilustra, de arriba hacia abajo, la posición del ojo derecho (HD) y del ojo izquierdo (HI), así como la velocidad ocular en el plano horizontal, (HD’ y HI’) y la velocidad de la mesa de registro (Mesa’). Los trazos hacia arriba y hacia abajo corresponden a desplazamientos de los ojos a izquierda (I) y derecha (D), respectivamente. A: Movimientos oculares espontáneos donde se señalan en color los sacádicos (en rojo) y las fijaciones (en azul). B: Se ilustra un ejemplo de convergencia ocular (en rojo). C: Movimientos oculares durante el reflejo vestíbulo-ocular, donde se señalan ejemplos de fases rápidas (en rojo) y lentas (en azul). Introducción 37 1.5.3. Reflejo vestíbulo-ocular El reflejo vestíbulo-ocular es un reflejo de tipo compensatorio, que estabiliza la imagen en la retina durante desplazamientos rotatorios de la cabeza, produciendo movimientos de los ojos con la misma velocidad pero en dirección opuesta a los de la cabeza (Figura 6C). Dependiendo de la frecuencia, velocidad y amplitud de rotación de la cabeza, el reflejo vestíbulo-ocular puede tener una o dos fases bien diferenciadas. Si la frecuencia del movimiento rotacional de la cabeza es alta el reflejo consta de una fase lenta y compensatoria, donde los ojos se mueven a igual velocidad pero en sentido opuesto a la cabeza. A frecuencias bajas y amplitudes altas de estimulación, el reflejo desencadena una fase lenta y compensatoria (Figura 6C, líneas azules) y otra rápida no compensatoria dirigida en la misma dirección que la rotación de la cabeza, que centra al ojo en la órbita (Figura 6C, líneas rojas). El conjunto de fases lentas y rápidas que ocurren durante el reflejo se denomina nistagmo vestibular. El reflejo vestíbulo-ocular usa información sensorial periférica, proveniente de los canales semicirculares y de los órganos otolíticos del oído interno, para generar el movimiento compensatorio de los ojos en respuesta a desplazamientos de la cabeza en las tres direcciones cartesianas del espacio. Existen tres canales semicirculares (horizontal, anterior y posterior) simétricamente localizados a ambos lados de la cabeza. Los canales semicirculares detectan la aceleración angular originada por la rotación de la cabeza, que activa a las células ciliares por el desplazamiento de la endolinfa que contienen (Fernandez y Goldberg, 1971). Por otro lado, los órganos otolíticos (utrículo y sáculo) detectan aceleración lineal de la cabeza. Así, a nivel sensorial podemos distinguir dos componentes, el reflejo vestíbulo-ocular rotacional, a nivel de los canales semicirculares, y el translacional, a nivel de los otolitos (Cullen y Van Horn, 2011). Las señales provenientes de las células ciliadas sensoriales se trasmiten a neuronas vestibulares de primer orden, cuyo soma se encuentra en el ganglio de Scarpa. De ahí la información se envía hasta el complejo vestibular del tronco del encéfalo por el VIII par craneal (Straka y Dieringer, 2004). La señal que reciben las células vestibulares se combina con información somatosensorial y propioceptiva procedente de estructuras superiores, las cuales son fundamentales para el correcto funcionamiento del reflejo (Cullen y Van Horn, 2011). Finalmente, las neuronas del complejo vestibular establecen sinapsis directamente con las motoneuronas extraoculares. Las neuronas abductoras reciben aferencias excitadoras del NVM contralateral durante la rotación de la cabeza en el plano horizontal. Las aferencias inhibitorias proceden del complejo vestibular homolateral. Las motoneuronas del recto medial reciben entradas excitadoras del NVL del lado homolateral y carecen de inhibición vestibular disináptica. Introducción 38 La organización del reflejo vestíbulo-ocular sigue un esquema simple que se ajusta a un arco trineuronal bilateral y recíproco formado por las neuronas sensoriales primarias del ganglio de Scarpa, las neuronas del complejo vestibular y las motoneuronas oculomotoras. 1.5.4. Reflejo optocinético El reflejo optocinético origina movimientos compensatorios lentos de los ojos, cuando la cabeza permanece estacionaria en el espacio y es el campo visual el que gira en torno al individuo. Consta de dos fases, una fase lenta y compensatoria en el mismo sentido y con la misma velocidad que el desplazamiento del campo visual, con una latencia de 100 a 200 ms tras el inicio del estímulo, y una fase rápida no compensatoria en dirección opuesta al movimiento del medio, que resitúa a los ojos en la posición central de la órbita. La combinación de fases lentas y rápidas durante el reflejo optocinético se denomina nistagmo optocinético (Büttner y Kremmyda, 2007). Este reflejo complementa al reflejo vestíbulo-ocular, fundamentalmente en el rango de frecuencias bajas, donde es poco operativo debido a la aceleración del estímulo (Robinson, 1981), y a diferencia de éste, utiliza información visual más que del aparato vestibular (Cullen y Van Horn, 2011). Durante las fases lentas del reflejo optocinético, podemos distinguir dos componentes, un primer componente directo, que ocurre directamente después del inicio del estímulo optocinético y relacionado con la respuesta de seguimiento ocular; y un segundo componente indirecto, que funciona como un almacén de información de velocidad del ojo (Cohen y col., 1977; Miles, 1998), produciendo un incremento gradual en la velocidad de las fases lentas cuando la estimulación optocinética persiste en el tiempo. La información sensitiva necesaria para desencadenar la fase lenta y compensatoria del reflejo optocinético procede de las células ganglionares de la retina que poseen grandes campos receptores. Las fibras de la retina proyectan a nivel del mesencéfalo, hasta los núcleos del sistema óptico accesorio (Gioli y col., 2006) y hacia el complejo nuclear pretectal, localizados en la unión entre el mesencéfalo y el diencéfalo (Simpson y col., 1988). Además, estos núcleos reciben información visual procedente de la corteza (Distler y col., 2002). Los núcleos del sistema óptico accesorio y del complejo pretectal proyectan hacia áreas del tronco del encéfalo más caudales, principalmente a nivel de los núcleos pontinos, del núcleo reticular tegmental pontino, la oliva inferior, el nucleo prepositus hipoglossi, y el NVM (Cullen y Van Horn, 2011; Mustari y col., 1994). Las neuronas de los núcleos pontinos y la oliva inferior dirigen aferencias al flóculo del cerebelo, que a su vez proyecta sobre los núcleos vestibulares (Distler y col., 2002; Ono y col., 2005). Finalmente, las neuronas vestibulares y del núcleo prepositus hipoglossi llevan Introducción 39 información directa hasta las motoneuronas del sistema oculomotor. Las fases rápidas durante el reflejo optocinético son producidas por las mismas neuronas de brote a nivel de la formación reticular del tronco del encéfalo que generan los movimientos sacádicos. En ausencia de estímulos visuales, por ejemplo en oscuridad, la estimulación optocinética continúa, gracias al componente indirecto que actúa como un almacén de velocidad, generando lo que se conoce como post-nistagmo optocinético, y que se debe a cambios en la sensibilidad a la velocidad a nivel de las neuronas vestibulares (Boyle y col., 1985; Büttner y Kremmyda, 2007). En situaciones reales, donde la estimulación vestibular y optocinética ocurren simultáneamente, las aferencias sensitivas vestibulares y visuales convergen a nivel de las neuronas del complejo vestibular, donde la información es integrada a nivel de cada célula, originando así respuestas compensatorias robustas, estabilizando y manteniendo la agudeza visual durante los movimientos del ojo (Cullen y Van Horn, 2011). 1.5.5. Movimientos de seguimiento Los movimientos de seguimiento son necesarios para mantener una imagen clara y estacionaria sobre la retina de un blanco visual que se desplaza lentamente sobre un entorno visual fijo. El objetivo principal es mantener una velocidad de seguimiento del ojo cercana a la velocidad de desplazamiento del objeto de interés, minimizando el deterioro de la imagen sobre la retina. Este tipo de movimiento se ha descrito únicamente en animales foveados o con un área equivalente (Büttner y Kremmyda, 2007). Se trata de una tarea voluntaria que depende del grado de atención. La latencia con la que se inician los movimientos de seguimiento es de 100 a 130 ms (Robinson, 1965), y aunque son considerados movimientos lentos pueden alcanzar velocidades de 100 grados/s en primates (Lisberger y col., 1981; Simons y Büttner, 1985); sin embargo el gato, dotado con area centralis y no con fóvea, solo puede llegar hasta los 20 grados/s (Robinson, 1981). La iniciación de este tipo de movimientos depende principalmente de señales visuales, mientras que el mantenimiento del desplazamiento depende de una señal de velocidad (Morris y Lisberger, 1987). En circunstancias normales, el seguimiento de un objeto en movimiento va acompañado de movimientos de la cabeza. El movimiento de la cabeza induce el reflejo vestíbulo-ocular, por lo que es necesario cancelarlo durante los movimientos de seguimiento. Así, en estudios recientes se ha sugerido que el SNC genera señales para cancelar este reflejo (Belton y McCrea, 2000; Fukushima y col., 1999). Introducción 40 Los movimientos de seguimiento son el resultado de un complejo proceso de transformación visuo-oculomotora, que involucra diversas estructuras a nivel de la corteza, cerebelo y tronco del encéfalo (Krauzlis, 2004; Thier e Ilg, 2005). Neuronas corticales premotoras del córtex parietotemporal que codifican la velocidad y la dirección del movimiento visual (Fukushima y col., 2005; Maunsell y Van Essen, 1983) proyectan sobre diversos núcleos pontinos, desde donde la señal es enviada al flóculo del cerebelo (Distler y col., 2002; Ono y col., 2005). Las neuronas del cerebelo contactan con neuronas vestibulares del NVM y del grupo Y (Chubb y Fuchs, 1982; Roy y Cullen, 2003). Finalmente, las células vestibulares proyectan directamente sobre los núcleos del sistema oculomotor que contienen las motoneuronas extraoculares para el desplazamiento del ojo (Lisberger y col., 1987). Los movimientos de seguimiento y los sacádicos son dos tipos de movimientos voluntarios que han sido considerados sistemas bien diferenciados. Sin embargo, recientemente se ha demostrado que ambos tipos de desplazamientos comparten redes neuronales similares tanto a nivel cortical como subcortical (Krauzlis, 2005). 1.5.6. Movimientos de vergencia Los movimientos de vergencia son desplazamientos disyuntivos de la mirada: ambos ojos se mueven en dirección opuesta, y son producidos cuando un objeto de interés se acerca o aleja del observador, con el fin de alinear la imagen en ambas fóveas. Si el objeto de interés se acerca, ambos ojos se dirigirán hacia una posición nasal, originado movimientos de convergencia (Figura 6B); mientras que si la diana se aleja, los ojos se separarán hacia posiciones laterales, dando lugar a movimientos de divergencia. La convergencia se lleva a cabo mediante la contracción y relajación simultánea de los músculos recto medial y recto lateral, respectivamente, en cada ojo. Por otra parte, la divergencia ocurre por la contracción de los músculos recto laterales (Hejtmancik y col., 2017). Los movimientos de vergencia, en general, son de pequeña amplitud (menos de 5 grados) y lentos, llevando hasta un segundo su ejecución. Su latencia oscila de 150 a 200 ms pero pueden ser muchos más rápidos cuando se realizan en conjunción con movimientos sacádicos (van Leeuwen y col., 1998). La sensación de profundidad es creada por el sistema visual cuando hay una disparidad retinal entre ambos ojos. Este mismo estímulo sirve al sistema de vergencia para controlar lo que se conoce como movimientos fusionados de vergencia, que cursan además con la acomodación del cristalino y el reflejo pupilar. En el macaco se ha descrito que existen neuronas premotoras para los movimientos de vergencia localizadas a nivel de la formación reticular mesencefálica, situadas dorsales y Introducción 41 dorsolaterales al NMOC (Judge y Cumming, 1986; Mays y Porter, 1984; Mays y col., 1986; Zhang y col., 1992). Estas neuronas se activan antidrómicamente desde la subdivisión recto medial del NMOC (Zhang y col., 1991; Zhang y col., 1992), incrementando su patrón de disparo neuronal durante movimientos convergentes (neuronas convergentes), o disminuyéndolo (neuronas divergentes). Además, algunas de estas células codifican el ángulo de vergencia (neuronas tónicas), otras codifican la velocidad del movimiento (neuronas fásicas) y otras ambas señales, combinando información de velocidad y posición durante los movimientos de vergencia (Mays y Porter, 1984; Mays y col., 1986; Zhang y col., 1992). Como es de esperar, estas neuronas no responden a movimientos conjugados de los ojos. Aunque previamente se sugirió que las neuronas internucleares del NMOE podrían proveer de la señal de vergencia a la población de motoneuronas del recto medial, esta idea fue refutada, ya que se demostró que estas células llevan una señal inapropiada para la vergencia (Gamlin y col., 1989a). Menos conocida aún es la estructura premotora que lleva la información de vergencia a las motoneuronas del NMOE. Se sugirió la posibilidad de que fueran las interneuronas del NMOC, cuyos axones proyectan a través del FLM contralateral (de la Cruz y col., 1992; Maciewicz y col., 1975), aunque otros estudios han demostrado que éstas células proyectan a las neuronas motoras información para movimientos conjugados horizontales, pero no para movimientos de vergencia (Clendaniel y Mays, 1994). Se sabe que hay un control premotor a nivel de la corteza, así como a nivel cerebelar, de la información de vergencia que llega a las motoneuronas del NMOE y del NMOC (Gamlin y col., 1996; Zhang y Gamlin, 1998), aunque no está del todo claro como sucede. Las motoneuronas del recto medial y lateral reciben señales de vergencia y de movimientos oculares conjugados, que se generan de manera independiente y se combinan a nivel de las mismas; de modo que ciertas células juegan un papel más importante que otras en vergencia (Mays y Porter, 1984). En el caso particular del NMOC, en estudios recientes en el mono, se ha determinado que las motoneuronas del subgrupo C, localizadas dorso-rostralmente en el núcleo oculomotor, podrían ser fundamentales para llevar las órdenes motoras al músculo recto medial durante movimientos convergentes (Bohlen y col., 2015, 2017; Büttner-Ennever y col., 1996, 2001). Introducción 42 OBJETIVOS Objetivos 45 2. OBJETIVOS El objetivo principal del presente trabajo ha sido la caracterización de la respuesta de las motoneuronas del recto medial tras la eliminación selectiva de sus dos principales entradas sinápticas, el FLM y el TAD, analizando tanto las propiedades de disparo como las aferencias sinápticas. Además, se ha querido conocer el desarrollo de posibles mecanismos plásticos tras la lesión, así como la respuesta trófica de las motoneuronas deaferentadas. Finalmente, y dada la particular resistencia de las motoneuronas oculomotoras a la neurodegeneración y su bien documentada dependencia trófica, se planteó como segundo objetivo principal conocer el patrón de distribución de neurotrofinas en el sistema oculomotor. En concreto, se han pretendido alcanzar los siguientes objetivos: 1. Caracterizar la respuesta fisiológica de las neuronas motoras del recto medial a la deaferentación selectiva, producida por la sección del TAD o del FLM. 2. Comprobar que ambas proyecciones conducen sus terminales axónicos hasta las motoneuronas del recto medial, así como su localización y extensión a través del tronco del encéfalo. 3. Demostrar la idoneidad del marcaje frente a calretinina para la identificación de las aferencias vestibulares y del NMOE sobre las motoneuronas del recto medial. 4. Analizar la cobertura sináptica a las motoneuronas del recto medial en control y a corto y largo plazo tras la sección unilateral del TAD o del FLM. 5. Determinar el curso temporal a corto plazo de la pérdida de los terminales sinápticos tras la deaferentación selectiva. 6. Investigar posibles mecanismos de compensación morfo-funcional tras la lesión, estudiando la expresión de la proteína GAP-43 y compararla con la situación control. Materiales y métodos 52 exacta fue aquélla en la que se requirió un menor umbral de estimulación eléctrica para conseguir el movimiento de aducción del ojo homolateral, en el caso del III par craneal, o de abducción en el caso del electrodo situado en el VI par craneal (pulsos cuadrados de 50 µs a una frecuencia de 1 Hz y con una intensidad inferior a 0,1 mA). Una vez implantados los electrodos, se atornillaron al cráneo 6 tornillos autorroscantes de acero inoxidable, que se utilizaron para la construcción y fijación de una torreta de cemento dental sobre la superficie del cráneo. Sujeto en el cemento se colocó un conector de 15 puertos que sirvió como conexión para la salida de la señal de los movimientos oculares y la entrada de las señales de estimulación. Además, se instaló en la torreta un sistema para la inmovilización de la cabeza del animal durante las sesiones de registro, que consistió en 3 tornillos de 35 mm de longitud y métrica 4, embebidos en la torreta de cemento, que permitieron la fijación de la cabeza del animal a la mesa de registro electrofisiológico (Figura 8B). La torreta de cemento dental se construyó respetando las ventanas de registro abiertas. Estas cámaras se cerraron asépticamente con una lámina circular de silicona, una gasa empapada en gentamicina (Cusí, Barcelona, España) y un cierre de plástico. Para el registro de los movimientos oculares se implantó, en cada globo ocular del gato, una bobina de dos vueltas de alambre de acero inoxidable de 250 mm de diámetro (Figura 7, bobina), aislada con hilo de teflón (Cooner Wire, Chastworth, California, EEUU). La bobina se suturó a la esclerótica mediante 5 puntos de sutura realizados con hilo de seda del 6/0 (Laboratorios Aragó, Barcelona, España) y una aguja semicircular de sección circular. Los extremos de la bobina periocular se dirigieron subcutáneamente hacia el hueso frontal, donde se soldaron al conector implantado en la torreta. Una vez finalizada la intervención quirúrgica, se aplicó una pomada antibiótica en la superficie corneal y en los bordes entre la torreta y la piel (gentamicina, Cusí). Además, se procedió a la hidratación de los animales con inyecciones subcutáneas de suero fisiológico (10 ml/kg, Laboratorios ERN, Barcelona, España) y de glucosado (10 ml/kg, Laboratorios Grifols, Barcelona, España). Durante el postoperatorio, se vigiló diariamente el estado del animal, prestando atención a la ingesta de alimento y agua, y se aplicó un tratamiento con antibióticos (0,04 ml/kg, i.m.; Fort Dodge Veterinaria, Girona, España) y analgésicos (0,3 mg/ml, i.m.; buprenorfina, Dechra, Skipton, Reino Unido) durante los primeros cinco días tras la operación. Además, se limpió la piel circundante a la torreta, los ojos y la zona periorbital con salino y antibióticos. Materiales y métodos 53 Figura 7. Diseño experimental para el registro de neuronas motoras del núcleo motor ocular común (NMOC). Diagrama simplificado del sistema oculomotor, con la localización de los núcleos y las conexiones implicadas en el estudio. El NMOC está constituido por diferentes poblaciones de motoneuronas que inervan la musculatura extraocular. La subdivisión del recto medial contiene neuronas motoras que inervan el músculo recto medial (RM) a través del III par craneal (III par). Estas motoneuronas reciben aferencias desde las neuronas internucleares del núcleo motor ocular externo (NMOE) contralateral a través del fascículo longitudinal medial (FLM) y de neuronas del núcleo vestibular lateral (NVL) homolateral a través del tracto ascendente de Deiters (TAD). Además, el NMOE contiene neuronas motoras que conectan con el músculo recto lateral (RL) a través del VI par craneal (VI par). Se llevó a cabo la deaferentación selectiva de las motoneuronas del recto medial mediante la sección unilateral del FLM o del TAD (líneas rojas paralelas). En el esquema también se representan el sitio de registro (Reg), las bobinas perioculares (Bobina) para el seguimiento de los movimientos oculares y los electrodos bipolares de estimulación implantados (Est). Materiales y métodos 54 3.3. Registros extracelulares unitarios Finalizado el periodo post-operatorio de 15 días, comenzaron las sesiones de registro, cuya duración fue de 3-4 horas, en días alternos y hasta 2 meses tras la axotomía. En las sesiones de registro el animal permaneció inmovilizado. Para ello se le introdujo en una bolsa de tela dejando la cabeza fuera, y tras permitirle adoptar una postura de reposo se le envolvió con vendas elásticas. Posteriormente, se situó al animal en una caja de metacrilato colocada dentro de la mesa de registro. La cabeza se fijó a la mesa por medio de los 3 tornillos implantados en la torreta, que se sujetaron a un sistema de barras metálicas dentro de la mesa de registro. El ángulo de inclinación de la cabeza del animal, una vez inmovilizado, fue de 22 grados hacia abajo. Con esta inclinación se aseguró la máxima estimulación de los canales semicirculares horizontales, con mínima intervención de los verticales, durante la rotación de la mesa de registro alrededor del eje vertical (Blanks y col., 1975). Los movimientos oculares se registraron según la técnica del seguimiento electromagnético de la posición ocular (Fuchs y Robinson, 1966): La mesa de registro constaba de un marco cúbico de metacrilato rodeado por dos pares de bobinas situadas en los ejes vertical y horizontal, que generaban un campo electromagnético. Las bobinas perioculares implantadas en la esclerótica rotaban por el movimiento ocular dentro del campo electromagnético producido por las bobinas de la mesa, generando una diferencia de potencial con cada movimiento, que fue proporcional al ángulo de desplazamiento de la mirada. De esta manera, estableciendo una equivalencia voltio/grado, se pudieron registrar los movimientos oculares en los planos horizontal y vertical. Durante la primera sesión de registro se calibraron los movimientos oculares. La calibración se efectuó rotando la mesa con un motor servocontrolado en el plano horizontal y en oscuridad, para inducir el reflejo vestíbulo-ocular. La rotación de la mesa consistió en movimientos sinusoidales de amplitud comprendida entre ± 25 y ± 30 grados y frecuencia de 0,125 Hz. Dado que en estas circunstancias la ganancia del reflejo es 1 (Donaghy, 1980), se pudo determinar la equivalencia entre la diferencia de potencial registrada y los grados de desplazamiento ocular. Materiales y métodos 55 Figura 8. Preparación del animal para el registro crónico y lesión. A: Esquema del cerebro del gato en visión sagital donde se representa la localización de los electrodos de estimulación, implantados bilateralmente en el III par craneal (+6 mm anteroposterior, ± 2 mm lateral y 24 mm en profundidad), y unilateralmente en el VI par craneal derecho (-1 mm anteroposterior, -3,5 mm lateral y 27 mm en profundidad), según el atlas de Berman (1968). Además se ilustran los tractos de registro para localizar el núcleo motor ocular común (NMOC) y el núcleo motor ocular externo (NMOE), con una inclinación de 22 y 27 grados rostrales, respectivamente. Además, en el caso del NMOC la pipeta se movió 15 grados laterales (no ilustrado). B: Representación del cráneo del gato en visión lateral con la torreta construida con cemento dental en posición dorsal. Se ilustra el conector al cual se conectaron las bobinas perioculares y los electrodos bipolares de estimulación. También se representan los tornillos de sujeción para la fijación de la cabeza, así como las ventanas de registro para acceder al NMOC y NMOE durante las sesiones de registro. C: Imagen de un electrodo de estimulación intracraneal. En el recuadro se observa con detalle el extremo del mismo. D: Microcuchilla empleada para seccionar el TAD, con una hoja cortante de 2 mm de ancho. La microcuchilla empleada para seccionar el FLM tenía una anchura de 0,6 mm. Materiales y métodos 56 Al inicio de casa sesión de registro se abrió la cámara de registro del NMOC, retirando el sello que la cubría y eliminando cuidadosamente, bajo anestesia local (lidocaína 2%, Cusí), el tejido de granulación que recubría la región de la corteza que era visible desde la ventana, a través de la cual se pudo acceder con los electrodos de registro al NMOC. Los electrodos de registro usados consistieron en micropipetas de vidrio obtenidas a partir de varillas de 3 mm de diámetro externo y pared de 0,5 mm de espesor (Pirex de Corning, Nueva York, EEUU), fabricados con un estirador de micropipetas (Narishige PE-2). Bajo un microscopio óptico se biseló la punta hasta obtener un diámetro de punta de 1-2 µm y una resistencia final de entre 1 y 5 MΩ. Las micropipetas se llenaron con una solución de NaCl 2 M y se fijaron a un micromanipulador (Narishige ME-7, modelo Camberra), para su aproximación al área de registro. Las coordenadas estereotáxicas del NMOC son 4 mm rostral y 0,5 mm lateral al cero estereotáxico (Berman, 1968). Para localizar el NMOC, la micropipeta se movió, con la ayuda de un micromanipulador, hacia unas coordenadas previamente calculadas con la ayuda de un mapa, en el cual se dibujaron las coordenadas estereotáxicas del NMOC y la posición exacta de la ventana y la aguja de referencia con respecto al cero estereotáxico. Así, en cada sesión de registro, la micropipeta se desplazó, desde la aguja, hasta la distancia anteroposterior y mediolateral necesaria para alcanzar el NMOC, de acuerdo a la posición relativa de la aguja respecto al cero estereotáxico, dirigiéndose hasta 20-22 mm de profundidad desde la superficie, con un ángulo de inclinación anteroposterior total de 22-27 grados, y mediolateral de 15 grados (Figura 8A). La localización final del NMOC se verificó al registrar el potencial de campo antidrómico producido al estimular eléctricamente el III par craneal homolateral al sitio de registro. Estos campos estuvieron compuestos por una pequeña onda positiva seguida de una onda negativa que aumentó de tamaño a medida que la micropipeta se aproximó al centro del núcleo (Lorente de Nó, 1947). Los registros electrofisiológicos se realizaron en el NMOC derecho; la pipeta de registro se conectó a un preamplificador (Nex 1, Biomedical Engineering Co., Nueva York, EEUU) por medio de un electrodo de plata y desde ahí la señal llegó a un amplificador (Tektronix AM 502, Bearerton, Oregón, EEUU) acoplado capacitativamente para eliminar las bajas frecuencias, filtrándose con un ancho de banda comprendido entre 10 Hz y 10 KHz. Desde aquí la señal se dirigió hacia un audiomonitor (Cibertec, Madrid, España) y hacia un osciloscopio analógico de dos canales (ISO-tech, ISR622, Corby, Reino Unido), para la visualización de la señal registrada Materiales y métodos 57 on-line, a través de un discriminador de ventana (Cibertec, PV 125). Desde este punto la señal se envió hacia una tarjeta de adquisición analógico/digital (CED Power 1401, Cambridge, Reino Unido), a la cual también llegarían señales de movimiento de la mesa de registro y de las bobinas perioculares. La señal digitalizada se dirigió hasta un ordenador para la adquisición y almacenamiento de todas las señales (Figura 9). Las motoneuronas del NMOC, en todas las situaciones experimentales, fueron identificadas mediante un test de colisión de la espiga antidrómica con la ortodrómica (de la Cruz y col., 1989; Delgado-García y col., 1986a). De esta manera, el test permite asegurar que la neurona registrada y la activada antidrómicamente son la misma. Para ello se estimuló eléctricamente desde el electrodo implantado en el nervio del III par craneal homolateral, usando pulsos cuadrados de 50 µs de duración, con una intensidad inferior a 0,1 mA y frecuencia de 1 Hz. Los pulsos se aplicaron mediante un estimulador (Cibertec, modelo CS-220A) que recibía la señal desde el adaptador de pulsos, visualizándose en un osciloscopio analógico (Hameg Instruments, HM407-2, Frankfurt, Alemania), que también recibía la señal eléctrica registrada desde el amplificador para la visualización on-line de los test de colisión (Figura 9). De las diferentes poblaciones que componen el NMOC, las únicas células que se registraron fueron las motoneuronas del recto medial, que se identificaron y diferenciaron del resto de poblaciones por tres criterios: i) el test de colisión entre los potenciales de acción ortodrómico y antidrómico después de la estimulación desde el III par craneal al sitio de registro; ii) su localización dorsolateral en el núcleo; iii) su patrón de actividad neuronal característico en relación a los movimientos oculares horizontales, con un incremento en el patrón de disparo asociado a movimientos nasales del ojo. Una vez finalizada la sesión de registro se procedió al sellado aséptico de la ventana de registro siguiendo el mismo procedimiento explicado en el apartado 3.2. Materiales y métodos 58 Figura 9. Sistema de registro y almacenaje de la información electrofisiológica. Las señales electrofisiológicas derivadas de la actividad de las motoneuronas del recto medial del NMOC (1, línea azul) se registraron mediante un preamplificador (2) y un amplificador diferencial (3). La señal se envió a un audiomonitor (4), un osciloscopio (5) y, a través de un discriminador de ventana (6), a un segundo osciloscopio (7). Los pulsos producidos por el discriminador de ventana se digitalizaron en la tarjeta de adquisición (8). Por otra parte, las señales derivadas de los movimientos oculares (9, línea verde) se separaron en horizontal y vertical mediante un detector de fases (10) y de ahí, la señal se dirigió al digitalizador (8). Por otro lado, mediante un generador de funciones (11), y un servoamplificador (12) se controló el movimiento de la mesa de registro. Las señales de posición y velocidad de la mesa (13) se digitalizaron (8, línea roja). La información digitalizada se almacenó en un ordenador (14). Finalmente, mediante un generador de pulsos (15), que recibía información de la señal registrada desde el discriminador de ventana (6), conectado a una unidad de aislamiento de estímulo (16) se identificaron los lugares de registro y las motoneuronas del recto medial, mediante el test de colisión (línea naranja). Materiales y métodos 59 Por otro lado, se realizaron registros electrofisiológicos de las neuronas del NVL ventral, que proyectan sobre las motoneuronas del recto medial. El NMOE se usó como referencia estereotáxica para localizar el NVL. Para la localización del NMOE, la micropipeta se guio mediante el micromanipulador hacia una posición 6 mm caudal y 1,3 mm lateral al cero estereotáxico (Berman, 1968), a través del cerebelo, hasta 17-19 mm de profundidad desde la superficie, con un ángulo de elevación de 3-5 grados respecto al eje vertical, lo que proporcionó una inclinación total de la micropipeta de unos 25-27 grados con respecto al plano horizontal. Al igual que en el caso del NMOC, para localizar el NMOE se movió la micropipeta de registro hacia coordenadas calculadas previamente con la ayuda de un mapa estereotáxico, donde se dibujaron las coordenadas del núcleo así como la posición de la ventana y la aguja de referencia implantada. De nuevo, se determinó la localización final del NMOE tras registrar el potencial de campo antidrómico producido al estimular eléctricamente desde el VI par craneal homolateral. Las neuronas internucleares del NMOE se distinguieron de las motoneuronas mediante test de colisión. A continuación, y siguiendo el método usado por Reisine y col. (1981), la micropipeta se movió 2 mm lateral al NMOE. Las neuronas cuyos axones discurren por el TAD se identificaron por su posición ventral en el núcleo y por su patrón de disparo. Estas células incrementan su frecuencia de descarga para movimientos en dirección contralateral al registro. 3.4. Axotomía Transcurrido el periodo control, que comprendió 30-45 días, se procedió a la sección unilateral del TAD (n = 4) o del FLM (n = 3) en el gato. Para la localización del TAD o del FLM, se tomó como referencia estereotáxica la posición del NMOE derecho, debido a la carencia de electrodos de estimulación implantados en ambos tractos. Para localizar el FLM, una vez localizado el NMOE, la micropipeta se dirigió rostralmente hacia una posición 5,5 mm anterior al NMOE (0,5 caudal al cero estereotáxico y 0,5-1 mm caudal al núcleo troclear), 0 mm lateral, con una inclinación anteroposterior de 43-45 grados, hasta una profundidad de 19-20 mm. La localización final del FLM se verificó al registrar axones vestibulares que transitan por este tracto y que aumentan su frecuencia de disparo durante movimientos oculares hacia abajo (Iwamoto y col., 1990). También, ocasionalmente, se registró axones de neuronas internucleares del NMOE. Se sustituyó la micropipeta por una microcuchilla de 0,6 mm de ancho para seccionar el FLM derecho a nivel del puente rostral y a través del cerebelo (Pastor y col., 2000). La microcuchilla se fabricó con un tubo de acero inoxidable en cuyo extremo se adhirió un fragmento de cuchilla (Figura 8D). Para realizar la sección del FLM, se Materiales y métodos 60 colocó el borde izquierdo de la cuchilla en la aguja de referencia, y se desplazó hacia las coordenadas anteriores, descendiendo hasta los 21-22 mm de profundidad. El procedimiento para realizar la sección del TAD fue similar. En este caso, la cuchilla tuvo un ancho de 2 mm y se colocó en la misma coordenada anteroposterior y utilizando el mismo ángulo que para la sección del FLM, pero esta vez se introdujo en una posición 0,6 mm lateral hacia la derecha de la línea media, descendiendo a la misma profundidad, lo que produjo la eliminación de la entrada vestibular a las motoneuronas del recto medial del NMOC derecho. Las sesiones de registro continuaron desde el día de la lesión hasta como máximo 60 días después de la misma. Al igual que durante las sesiones control, los animales se registraron en días alternos, salvo la primera semana posterior a la lesión en la que se hizo diariamente, siguiendo el procedimiento explicado previamente (véase apartado 3.3). En el caso de los animales que no se usaron para registro crónico sino que siguieron procedimientos inmunohistoquímicos a corto plazo, la deaferentación selectiva se realizó siguiendo el mismo procedimiento. Para la sección del TAD o del FLM en la rata, se colocó al animal anestesiado con una mezcla de clorhidrato de ketamina (20 mg/kg, i.m.; Merial Laboratorios) y xilacina (0,5 mg/kg, i.m.; KVP Pharma) en un marco estereotáxico para su sujeción. Seguidamente, se rasuró y desinfectó la piel de la cabeza y se practicó una incisión longitudinal sobre la línea media desde el borde anterior frontal hasta la sutura lamboidea, eliminándose las inserciones musculares subyacentes. Con la ayuda de un taladro se realizó una craneotomía en el hueso occipital. A continuación, se seccionó el FLM o el TAD mediante una microcuchilla de 0,2 mm o 0,5 mm de ancho, respectivamente. La lesión se realizó siguiendo coordenadas estereotáxicas: 35 grados de inclinación anteroposterior, 3,5 mm posterior, 0 μm o 200 μm lateral a Lambda para la sección del FLM o el TAD, respectivamente, y descendiendo hasta 7,5 mm de profundidad (Paxinos y Watson, 2007). 3.5. Adquisición de datos electrofisiológicos La posición ocular en los planos horizontal y vertical, así como la velocidad ocular en el plano horizontal de ambos ojos, junto con la actividad neuronal relacionada, la posición y la velocidad de la mesa se adquirieron y almacenaron de manera digital para su posterior análisis usando el programa Spike2 (Cambridge Electronic Design Ltd, Cambridge, Reino Unido). Este programa permitió visualizar dichos canales tanto on-line como off-line para su posterior Materiales y métodos 61 análisis. Los registros se analizaron con programas escritos en Matlab 7.0 (Mathworks, Natick, Massachusetts, EEUU) que permitieron asociar la frecuencia instantánea de disparo de cada célula registrada con la posición y velocidad ocular durante movimientos tanto espontáneos como inducidos por estimulación vestibular. 3.5.1. Análisis de los movimientos oculares espontáneos El rango de los movimientos oculares (en grados) de ambos ojos en el plano horizontal se determinó a partir de fragmentos de registro de 100 s de movimientos oculares espontáneos durante situación control y tras la sección unilateral del TAD o el FLM. Igualmente, a partir de estos fragmentos se obtuvieron las rectas de regresión entre la posición del ojo homolateral (afectado) y contralateral (control) a la lesión durante las diferentes condiciones experimentales, donde m fue el valor de la pendiente de dicha recta. Además, usando Spike2 y a partir de estos mismos fragmentos de registro, se analizaron la amplitud (en grados) y la velocidad máxima (en grados/s) de los sacádicos durante la situación control y tras la lesión. 3.5.2. Análisis de los movimientos oculares durante el reflejo vestíbulo-ocular El reflejo vestíbulo-ocular fue inducido por la rotación sinusoidal de la cabeza a una frecuencia de 0,125 Hz en el plano horizontal y en oscuridad. Se realizaron registros de la velocidad de la cabeza y de ambos ojos en la situación control y tras la deaferentación selectiva. Se seleccionaron fragmentos de 100 s que incluían más de 10 hemiciclos. Estos fragmentos, adquiridos en el programa Spike2, se exportaron hacia un programa escrito en Matlab 7.0, donde se determinó la ganancia del reflejo vestíbulo-ocular, calculada como el valor del cociente entre la velocidad del ojo y la velocidad de la cabeza. Por otro lado, con estos mismos fragmentos y usando Spike2, se determinó la velocidad pico (en grados/s) de las fases rápidas durante el reflejo, mediante cursores de medidas, separando las fases rápidas producidas durante los hemiciclos on, de las que ocurrieron durante los hemiciclos off. Los hemiciclos on fueron aquellos donde las fases lentas del reflejo vestíbuloocular se dirigían hacia la dirección de activación de la motoneurona (izquierda) y las fases rápidas hacia la dirección de inactivación (derecha), mientras que durante los hemiciclos off las fases lentas se dirigían a la derecha y las fases rápidas lo hacían a la izquierda. Materiales y métodos 68 Marcador Animal Anticuerpo primario Técnica Uso Anticuerpo secundario Uso Calretinina gato Conejo anti-calretinina (Swant) Microscopía óptica 1:1000 Biotinilado burro anticonejo (Vector) 1:250 Microscopía confocal Cy5 burro anti-conejo (Jackson) 1:50 rata Cabra anti-calretinina (Merck) Microscopía óptica 1:2500 Biotinilado burro anticabra (Vector) 1:250 Microscopía confocal 1:500 Cy5 burro anti-cabra (Jackson) 1:200 Sinaptofisina gato Ratón anti-sinaptofisina (Merck) Microscopía confocal 1:2000 FITC burro anti-ratón (Jackson) 1:50 GAP-43 gato Ratón anti-GAP-43 (Merck) Microscopía confocal 1:1000 FITC burro anti-ratón (Jackson) 1:50 BDNF gato Conejo anti-BDNF (Santa Cruz) Microscopía confocal 1:100 Biotinilado burro anticonejo (Vector) 1:250 rata Microscopía confocal 1:400 Biotinilado burro anticonejo (Vector) 1:500 Western blot 1:100 HRP cabra anti-conejo (Vector) 1:3000 NT-3 gato Conejo anti-NT-3 (Santa Cruz) Microscopía confocal 1:100 Biotinilado burro anticonejo (Vector) 1.250 rata Microscopía confocal 1:400 Biotinilado burro anticonejo (Vector) 1:500 Western blot 1.500 HRP cabra anti-conejo (Vector) 1:3000 NGF gato Conejo anti-NGF (Santa Cruz) Microscopía confocal 1:100 Biotinilado burro anticonejo (Vector) 1:250 rata Microscopía confocal 1:250 Biotinilado burro anticonejo (Vector) 1:500 Western blot 1.500 HRP cabra anti-conejo (Vector) 1:3000 ChAT rata Cabra anti-ChAT (Merck) Microscopía confocal 1:500 TRITC burro anticabra (Jackson) 1:50 GAPDH rata Ratón anti-GAPDH (Merck) Western blot 1:3000 HRP cabra anti-ratón (Vector) 1:3000 Tabla 1. Anticuerpos utilizados en las técnicas inmunohistoquímicas para microscopía óptica o confocal y Western blot. En las inmunohistoquímicas para neurotrofinas, la señal del anticuerpo secundario biotinilado fue amplificada por Streptavidina-Cy2 (1:800 en gato y 1:400 en rata, Jackson). Materiales y métodos 69 3.9.1. Técnicas morfológicas para microscopia óptica de campo claro Cortes cerebrales a nivel del NMOE, NVL y del sitio de la lesión, procedentes de todos los animales experimentales, siguieron un protocolo inmunohistoquímico dirigido contra calretinina. Las rodajas se lavaron tres veces con PBS durante 10 minutos, tras los cuales se sumergieron en una solución de bloqueo con suero de burro al 10% (NDS, Sigma Aldrich) preparado con PBS con tritón al 0,1% (PBS-T) durante 45 minutos. Posteriormente el tejido, se incubó durante 12 horas con una solución de PBS-T con NDS al 5% y azida sódica al 0,05% que contenía el anticuerpo primario, conejo anti-calretinina en gato (1:1000; Swant, 7697, Marly, Suiza) o cabra anti-calretinina en rata (1:2500; Merck, AB1550, Temecula, California, EEUU). A continuación, se lavaron los cortes con PBS-T tres veces durante 10 minutos, tras lo cual se sumergieron durante 2 horas en una dilución del anticuerpo secundario biotinilado (burro anti- IgG de conejo o anti-IgG de cabra, respectivamente, 1:250; Vector Labs., Burlingame, California, EEUU). Seguidamente las secciones se incubaron durante 90 minutos en el complejo avidinabiotina peroxidasa (ABC) al 1% preparado en PBS-T 30 minutos antes de su uso. A continuación, se lavaron 2 veces con PBS y 2 veces con tampón Tris-Cl 0,1 M pH 8 (TB). Tras ello, el tejido se preincubó en 3, 3’-tetrahidroclorhidrato de diaminobencidina (DAB) al 0,05% en TB durante 1 minuto, al que se añadió el peróxido de hidrógeno al 0,01% en agua. La reacción se detuvo añadiendo TB. Finalmente los cortes se lavaron con PBS, tres veces durante 10 minutos, montándose después en portaobjetos gelatinizados. Una vez secos, se deshidrataron en una batería de alcoholes de concentración creciente y se aclararon con xilol. Finalmente, se cubrieron con el medio de montaje DPX (Panreac, Barcelona, España). Todo el protocolo inmunohistoquímico se hizo a temperatura ambiente y en agitación suave. Cortes cerebrales a nivel del TAD o el FLM se usaron para el análisis de la extensión de ambas proyecciones. La cuantificación se realizó mediante el conteo del número de procesos axónicos inmunorreactivos para calretinina en el lado control. Secciones cerebrales procedentes de los animales que habían sido inyectados con biocitina se incubaron durante 90 minutos con solución ABC al 1% preparado en PBS-T 30 minutos antes de su uso. Posteriormente las secciones se lavaron con PBS y TB, y se preincubaron con DAB al 0,05% en TB, siguiendo el protocolo de revelado y montaje explicado anteriormente. Una vez que los cortes se secaron, se realizó una contratinción con la técnica de Nissl. Para ello, los cortes se sumergieron durante 1 minuto en el colorante, que consistió en una solución de azul de toluidina (Panreac) al 0,1% en tampón acetato pH 3,5. A continuación, se deshidrataron en una batería de alcoholes de concentración creciente, se aclararon con xilol y se cubrieron con medio de montaje DPX (Panreac). Materiales y métodos 70 3.9.2. Técnicas inmunohistoquímicas para microscopía óptica confocal Se seleccionaron cortes cerebrales de gato a nivel del NMOC para realizar tinciones inmunohistoquímicas dobles contra sinaptofisina y calretinina. Las secciones se lavaron en PBS durante 5 minutos y seguido se incubaron en una solución de borohidruro sódico al 1% durante 10 minutos, con el fin de desenmascarar antígenos. A continuación, se realizaron tres lavados de 10 minutos con PBS-T, y tras ello los cortes se sumergieron en NDS (Sigma Aldrich) al 10% en PBS-T durante 45 minutos. Posteriormente, los cortes se incubaron 12 horas en el anticuerpo primario, dirigido contra sinaptofisina (ratón anti-sinaptofisina, 1:2000; Merck, MAB329, Darmstadt, Alemania) preparado en PBS-T con 5% NDS y 0,05% de azida sódica. Tras tres lavados de 10 minutos en PBS-T, las secciones se incubaron durante 2 horas en una solución de PBS-T con el anticuerpo secundario burro anti-IgG de ratón conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC, 1:50; Jackson InmunoResearch, West Grove, Pensilvania, EEUU). Finalizado el protocolo de tinción inmunocitoquímica de la sinaptofisina, los cortes se lavaron tres veces con PBS-T, 10 minutos por lavado. Posteriormente se bloquearon nuevamente con NDS (Sigma Aldrich) al 10% en PBS-T durante 45 minutos. Tras ello, los cortes se incubaron durante 12 horas con el anticuerpo primario contra calretinina (conejo anti-calretinina, 1:1000; Swant), preparado en PBS-T con 5% de NDS y 0,05% de azida sódica. Al finalizar la incubación con el anticuerpo primario se realizaron tres lavados de 10 minutos en PBS-T. A continuación, las secciones se incubaron durante 2 horas en una solución de PBS-T con el anticuerpo secundario burro anti-IgG de conejo conjugado con indodicarbocianina (Cy5, 1:50; Jackson InmunoResearch). Tras tres lavados finales en PBS, las secciones se montaron sobre portaobjetos gelatinizados y se cubrieron con medio de montaje Dako (DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca). Se usaron secciones cerebrales de rata a nivel del NMOC para realizar tinciones inmunohistoquímicas contra calretinina. Los cortes se lavaron con PBS y se sumergieron en una solución de PBS-T con NDS al 10% durante 45 minutos. Tras el bloqueo, las rodajas cerebrales se incubaron durante 12 horas con el anticuerpo primario dirigido contra calretinina (cabra anticalretinina, 1:500; Merck) preparado en PBS-T con 5% NDS y 0,05% de azida sódica. A continuación, las secciones se lavaron tres veces con PBS-T, durante 10 minutos por lavado y se bañaron durante 2 horas en una solución de PBS-T con el anticuerpo secundario (burro anti-IgG de cabra marcado con Cy5, 1:200; Jackson InmunoResearch). Finalmente, se lavaron tres veces durante 10 minutos, se montaron en portas gelatinizados y se cubrieron con medio de montaje Dako (DakoCytomation). Materiales y métodos 71 Para la inmunohistoquímica frente a GAP-43, los cortes cerebrales se lavaron tres veces en PBS durante 10 minutos. Tras ello, se sumergieron en solución de bloqueo con NDS (Sigma Aldrich) al 10% en PBS-T durante 45 minutos. Después, los cortes se incubaron durante 12 horas en una solución de PBS-T con NDS al 5% y 0,05% de azida sódica y con el anticuerpo primario dirigido contra la proteína GAP-43 (ratón anti-GAP-43, 1:1000; Merck, MAB347, Billerica, Massachusetts, EEUU). Tras tres lavados de 10 minutos en PBS, se incubaron durante 2 horas en una solución de PBS-T con el anticuerpo secundario burro anti-IgG de ratón conjugado con FITC (1:50; Jackson InmunoResearch). Finalmente se lavaron tres veces durante 10 minutos en PBS y las secciones encefálicas se montaron sobre portaobjetos gelatinizados y se cubrieron con medio de montaje (DakoCytomation). Por último, se llevaron a cabo tinciones inmunohistoquímicas contra las neurotrofinas BDNF, NT-3 y NGF en rodajas cerebrales de gato a nivel de la subdivisión del recto medial y en cortes del tronco del encéfalo de rata control a nivel de los núcleos oculomotores (NMOC, NMOT y NMOE), del núcleo facial y del núcleo hipogloso. Las secciones encefálicas se lavaron en PBS durante 5 minutos y seguidamente se incubaron en una solución de borohidruro sódico al 1% durante 10 minutos. A continuación se realizaron tres lavados de 10 minutos con PBS-T, y tras ello las rodajas se sumergieron en NDS (Sigma Aldrich) al 10%, preparado en PBS-T, durante 45 minutos. Posteriormente, los cortes se incubaron 12 horas en el anticuerpo primario conejo anti-BDNF, sc-546, conejo anti-NT-3, sc- 547, o conejo anti-NGF, sc-548, (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, EEUU) preparados en PBS-T con 5% NDS y 0,05% de azida sódica. La concentración del anticuerpo primario varió dependiendo de la especie. En el gato los anticuerpos primarios frente a neurotrofinas se usaron a concentración 1:100. En la rata, los anticuerpos se utilizaron a una concentración de 1:400 para BDNF y NT-3. En la inmunohistoquímica frente a NGF en cortes de rata el protocolo usado hasta este punto varió ligeramente. Tras el lavado inicial con PBS los cortes se incubaron en tampón citrato 0,01 M pH 6, en un baño a 74ºC durante 40 minutos. Posteriormente se dejaron enfriar durante 20 minutos a temperatura ambiente y se lavaron tres veces con PBS-T durante 5 minutos. A continuación, las secciones encefálicas se incubaron en la solución bloqueo de NDS al 5% en PBS-T a 37ºC durante 30 minutos. Tras ello, los cortes se sumergieron en una solución con el anticuerpo primario (conejo anti-NGF, sc-548, Santa Cruz Biotechnology), con una dilución 1:250 en PBS-T con 5% NDS y 0,05% de azida sódica durante 72 horas a 4ºC. Materiales y métodos 72 Finalizada la incubación con el anticuerpo primario, los cortes se lavaron con PBS-T, y se incubaron con un anticuerpo secundario biotinilado a una concentración de 1:250 y 1:500 en gato y rata, respectivamente (burro anti-IgG de conejo, Vector Labs.), en PBS-T durante 2 horas. Se retiró el anticuerpo secundario, y tras tres lavados con PBS de 10 minutos cada uno, los cortes se sumergieron durante 45 minutos en una solución de Streptavidina-Cy2 en PBS (1:800 en gato y 1:400 en rata, Jackson InmunoResearch). Finalmente, las secciones encefálicas de gato se lavaron nuevamente con PBS, se montaron sobre portas gelatinizados y se cubrieron con medio de montaje Dako (DakoCytomation) para su visualización. Por otro lado, las motoneuronas del tronco del encéfalo de la rata se identificaron mediante marcaje con un anticuerpo primario contra acetilcolina transferasa (ChAT, cabra anti- ChAT; Merck, AB144P, Temecula, California, EEUU), dilución 1:500 en PBS-T con 5% NDS y 10% azida sódica. Brevemente, una vez finalizado el protocolo de tinción inmunocitoquímica contra las neurotrofinas, los cortes se sometieron a tres nuevos lavados con PBS-T y se bloquearon con NDS al 10% en PBS-T durante 45 minutos. A continuación, las secciones se incubaron en la solución con el anticuerpo primario frente a ChAT, durante 12 horas, y tras ello se lavaron 3 veces con PBS-T, 10 minutos por lavado, y se incubaron con el anticuerpo secundario acoplado al fluoróforo, tetrametil rodamina 5,6-isotiocianato (TRITC, burro anti-IgG de cabra, Jackson InmunoResearch), diluido a 1:50 en PBS-T, durante 2 horas. Tras este periodo se llevaron a cabo tres nuevos lavados con PBS de 10 minutos cada uno. Finalmente, los cortes se montaron en portaobjetos gelatinizados y se cubrieron con medio de montaje. Para todas las tinciones, salvo las realizadas en ratas control, la población de motoneuronas del recto medial se identificó mediante la presencia de rodamina previamente inyectada bilateralmente en el músculo recto medial como marcador retrógrado (véase 3.7). Además, todos los protocolos se llevaron a cabo a temperatura ambiente y en agitación suave. Materiales y métodos 73 3.10. Análisis de los datos morfológicos 3.10.1. Visualización y captura de imágenes Se tomaron fotografías con un microscopio óptico Axiophot (Zeiss, Jena, Alemania) conectado a una cámara fotográfica (AXIOCAM ERc 5s) en formato TIFF (24 bits). Se fotografiaron los cortes marcados mediante tinciones inmunohistoquímicas contra calretinina, revelados con DAB, procedentes de los sitios de lesión, los sitios de inyección de la biocitina y del NMOC con marcaje anterógrado. También se tomaron las imágenes de cortes de lesión teñidos mediante Nissl. Se capturaron imágenes a diferentes magnificaciones (1,25x, 2x, 5x, 10x, 20x y 40x). Los cortes teñidos con anticuerpos fluorescentes se fotografiaron mediante un microscopio confocal LSM 7 DUO (Zeiss), tomando imágenes de las motoneuronas de la subdivisión del recto medial control y lesionada, de animales en las diferentes situaciones experimentales. Además se fotografiaron secciones de la rata control a nivel de los núcleos del sistema oculomotor, el núcleo facial y el hipogloso. Este microscopio estaba equipado con tres láseres que permitían capturar la fluorescencia emitida por los fluorocromos asociados a los anticuerpos secundarios, FITC (láser de argón, longitud de onda de activación: 488 nm); rodamina o TRITC (longitud de onda de activación: 561 nm) y Cy5 (longitud de onda de activación: 631 nm). Las imágenes (1024x1024 píxeles) se capturaron por excitación con dos o tres láseres diferentes, según el tejido. La escala de grises se ajustó a su máximo rango dinámico. Se tomaron fotomicrografías a distintos aumentos (40x y 63x) en 2-6 planos focales diferentes, con una separación de 1 µm (63x) o 1,5 µm (40x). El programa utilizado fue ZEN 2012 SP2 (Zeiss). 3.10.2. Análisis de imágenes Las fotomicrografías se analizaron mediante el programa ImageJ (NIH, Bethesda, Maryland, EEUU). En imágenes adquiridas con el objetivo de 40x, se midió la densidad óptica (valor promedio de gris) en el neuropilo de secciones del NMOC inmunomarcados contra sinaptofisina (Figura 10A). Para ello, en dicho programa, se usaron campos de 30,5 x 30,5 µm, sustrayendo el valor correspondiente al color del fondo, evitando zonas del neuropilo ocupado por somas de motoneuronas (Figura 10B). Para cada corte procesado, los datos del lado lesionado se expresaron como % del lado control. Este mismo procedimiento se usó para el análisis de calretinina y de GAP-43 en el neuropilo. Materiales y métodos 74 Figura 10. Cálculo de la cobertura sináptica en el soma y el neuropilo de las motoneuronas del recto medial. A: Imagen de microscopía confocal, tomada con el objetivo de 40x, de una sección cerebral de 50 µm de espesor, donde se presenta la subdivisión del recto medial del NMOC. Las motoneuronas aparecen identificadas por rodamina como marcador retrógrado (rojo). En verde, señal inmunopositiva contra sinaptofisina, marcador específico de botones sinápticos. B: Medidas de cobertura sináptica en el neuropilo mediante la disposición al azar de cuadrados de 30,5 µm de lado (cuadrados blancos). Se evitó tomar mediciones en zonas ocupadas por motoneuronas (cuadrados blanco con aspa roja). Las medidas fueron corregidas tomando muestras de densidad óptica del fondo (cuadrados amarillos). C, D: Imágenes de microscopía confocal a 63x que muestran una motoneurona del recto medial identificada con rodamina. En C se muestra el perímetro de la célula, delimitado con líneas blancas. Nótese que se evitó tomar en la medida del perímetro cualquier proceso dendrítico. En D, se representa la región del perímetro somático ocupada por botones sinápticos positivos para sinaptofisina, resaltados con líneas blancas. El análisis de la cobertura sináptica de calretinina se hizo de la misma forma. Barras de calibración: A, 100 µm (A-B); C, 20 µm (C-D). Además, se analizó en imágenes tomadas a 63x, la densidad de terminales sinápticos aferentes a los somas de las motoneuronas del recto medial, comparándose el lado control con el lado lesionado en todos los animales experimentales (Pastor y col., 1997; Morado-Díaz y col., 2014). Por tanto, se midió el porcentaje de perímetro somático cubierto por botones sinaptofisina-positivos y calretinina-positivos (Figura 10C y D), el número de botones Materiales y métodos 75 inmunorreactivos para sinaptofisina o calretinina, la longitud media de los botones así como el perímetro celular. Las imágenes tomadas en el microscopio confocal de secciones cerebrales de gato y rata con marcaje frente a BDNF, NT-3 o NGF también se analizaron con el programa ImageJ. El soma de las motoneuronas, exceptuando el núcleo, se perfiló en la imagen con rodamina o ChAT en el gato y la rata, respectivamente, y en el área seleccionada se realizaron medidas de la densidad óptica de la imagen para las diferentes neurotrofinas. En el gato, los valores del lado lesionado se relativizaron a los obtenidos en el lado control. En las imágenes procedentes de cortes cerebrales de rata, se tomaron además cuatro muestras del fondo de un tamaño comparable al de una motoneurona, y se calculó la media. El valor de la densidad óptica de cada una de las células analizadas se dividió por la media de las densidades ópticas del fondo en su imagen correspondiente. Este valor se denominó “razón entre la intensidad de marcaje en el soma respecto al fondo” (IF). Las células se consideraron positivas para la expresión de una determinada neurotrofina cuando presentaron una densidad óptica al menos 5 veces superior al valor del fondo, es decir, la IF fue igual o superior a 5. 3.11. Western blot Para la realización de los Western blots se sacrificaron ratas adultas (n = 6) por decapitación bajo anestesia profunda (pentobarbital sódico, 35 mg/kg, i.p.) a las que se les extrajeron de forma inmediata los músculos extraoculares, el músculo buccinador y los músculos de la lengua. El tejido se homogeneizó incubándolo durante 20 minutos en tampón de lisis enfriado en hielo, que contenía un coctel de inhibidores de proteasas y fosfatasas (Morcuende y col., 2013). A continuación, el tejido se disgregó por sonicación (cuatro pulsos de 6 segundos) y se centrifugó a 4ºC y 13.000 rpm durante 30 minutos. Las proteínas, presentes en el sobrenadante, se cuantificaron por el método de Bradford (Bradford, 1976) usando albúmina sérica bovina (BSA) para realizar la recta de calibrado. Las proteínas se diluyeron en tampón de carga (Tris-HCl 0,1 M pH 6,8, glicerol 10%, dodecilsulfato sódico [SDS] 2%, β-mercaptoetanol 5% y azul de bromofenol 0,05%) y se desnaturalizaron en un baño a 95ºC durante 6 minutos. A continuación, se separaron por electroforesis usando 50 μg de proteínas por carril. La electroforesis se llevó a cabo en geles discontinuos, constituidos por un gel de empaquetamiento al 4% y otro de separación al 15% de acrilamida. El gel de separación se preparó en una dilución de acrilamida/bis-acrilamida al 30% en tampón Tris-HCl pH 8,8, SDS 10%, persulfato amónico (APS) 10% y tetrametiletilendiamina (TEMED) 0,1%. El gel de Materiales y métodos 76 empaquetamiento contenía los mismos componentes, excepto que el tampón utilizado fue Tris- HCl pH 6,8. Los geles cargados con las muestras se sumergieron en la cubeta que contenía tampón de electroforesis, a voltaje constante (100 mV) durante una hora. Concluida la electroforesis se realizó la transferencia a una membrana de polifluoruro de vinilideno (PVDF) en tampón de transferencia al 20% de metanol. La transferencia se hizo a voltaje constante (80 mV) durante 20 minutos en la cámara fría. Una vez transferidas las proteínas a la membrana se realizó el bloqueo de las uniones inespecíficas mediante BSA al 10% en TBS-Tween 0,1% (Tween 0,1% en tampón Tris-Cl salino) durante una hora, seguido de una incubación durante 12 horas a 4ºC en una solución con el anticuerpo primario: conejo anti-BDNF, 1:100, sc-546, conejo anti-NT- 3, 1:500, sc-547, o conejo anti-NGF, 1:500, sc-548, (Santa Cruz Biotechnology) preparado en TBS- Tween 0,1% y BSA al 5%. Posteriormente, las membranas se lavaron tres veces, 10 minutos por lavado, con TBS-Tween 0,1% y se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano (HRP, cabra anti-IgG de conejo, 1:3000, Vector Labs) preparado en TBS- Tween 0,1% durante 90 minutos a temperatura ambiente. Por último, las membranas se sometieron de nuevo a tres lavados de 10 minutos con TBS-Tween y a un lavado de 10 minutos con TBS. La inmunorreacción se detectó con el Kit WesternBright Quantum de Western blot (Advansta, K-12042, Menlo Park, California, EEUU) y las bandas se visualizaron mediante un equipo de imagen quimioluminiscente (LAS-3000, Fujifilm, Düsseldorf, Alemania). Tras el revelado quimioluminiscente, las membranas se lavaron con tampón de separación (Thermo Fisher Scientific, 21059, Rockford, Illinois, EEUU) durante 10 minutos y tras ello se sumergieron en una solución de BSA al 5% en TBS-Tween 0,1% durante 1 hora. A continuación, se incubaron durante 12 horas en una solución con un anticuerpo contra gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ratón anti-GAPDH, 1:3000; Merck, MAB374, Temecula, California, EEUU) que se utilizó como proteína control. Posteriormente, las membranas se lavaron tres veces durante 10 minutos con TBS-Tween 0,1% y se incubaron con una solución TBS-Tween 0,1% que contenía el anticuerpo secundario conjugado con HRP (cabra anti-IgG de ratón, 1:3000; Vector Labs) durante 90 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las membranas se lavaron tres veces con TBS-Tween 0,1% y una vez con TBS durante 10 minutos por lavado. Finalmente, se detectó la señal quimioluminiscente del mismo modo que para los anticuerpos de neurotrofinas. En la tabla 1 se especifican los anticuerpos primarios y secundarios utilizados, así como su concentración de uso. Las imágenes obtenidas con el equipo de quimioluminiscencia se sometieron a análisis de densitometría con el programa Multi-Gauge V.3.0 (Fujifilm), cuantificando la banda correspondiente a la forma madura (13 kDa), así como la banda de la isoforma pro-neurotrofina Materiales y métodos 77 (37, 35 y 27 kDa para BDNF, NT-3 y NGF, respectivamente) para cada factor neurotrófico. La GAPDH se cuantificó analizando la banda que se obtuvo en torno a 38 kDa de peso molecular. Para cada membrana, los datos se expresaron en relación a los valores de GAPDH tras substraerle la medida del fondo. Además, los datos obtenidos se normalizaron como porcentajes con respecto a los músculos extraoculares. Finalmente, se calcularon valores medios para la forma madura y la pro-neurotrofina en cada músculo. 3.12. Estadística Las comparaciones entre los grupos de datos se llevaron a cabo mediante el test de análisis de la varianza (ANOVA) para uno o dos factores, seguido de una comparación múltiple post hoc usando el método Holm-Sidak. En aquellos casos en se tuvo que comparar dos grupos se utilizó la prueba t-test. En todos los casos, el nivel de significación fue de 0,05 usando el programa Sigma Plot 11 (Systat Software GMBH, San Jose, California, EEUU). Los valores de los distintos datos numéricos se expresaron como la media ± el error estándar de la media (EEM). Resultados 84 Un marcador de las neuronas internucleares del NMOE y de las neuronas del NVL en el gato es la calretinina, proteína de unión a calcio de 29 kDa (de la Cruz y col., 1998; Baizer y Baker, 2006). A pesar de ello, aún no se ha demostrado la presencia de axones inmunopositivos para calretinina en el TAD. Mediante un estudio de la inmunorreactividad frente a la calretinina en secciones coronales a nivel de la protuberancia, se confirmó que ambos tipos celulares, las neuronas internucleares del NMOE (Figura 12A, delimitado por línea discontinua) y las neuronas vestibulares ventrolaterales, cuyos axones originan el TAD (Figura 12A, inserto), presentaron un marcaje positivo frente a calretinina. Estos resultados estuvieron en concordancia con los obtenidos en secciones cerebrales controles más rostrales, donde se hallaron axones inmunorreactivos a calretinina tanto a nivel del FLM como del TAD (Figura 12B). Sin embargo, tras la sección del TAD (Figura 12C) o del FLM (Figura 12E), sólo se vieron axones marcados a nivel del tracto no lesionado. En la figura 12D y F se puede observar la cicatriz en el tejido tras la sección unilateral del TAD (delimitado por flechas) o del FLM (delimitado por línea discontinua) mediante tinción de Nissl, respectivamente. Asimismo, se cuantificó el número de axones inmunomarcados para calretinina que discurrían por el TAD o el FLM. Este análisis reveló que el FLM presenta un mayor número de axones que el TAD (p < 0,001, t-test), con una extensión del FLM (818,3 ± 26,8 axones positivos por sección, n = 4) casi cuatro veces mayor que la proyección vestibular (243,3 ± 34,7, n = 4). Por lo tanto, se ha confirmado que tanto las neuronas internucleares del NMOE como las neuronas del NVL proyectan sobre la subdivisión del recto medial del NMOC, que dichas aferencias son inmunopositivas para calretinina y que la extensión del FLM es mayor que la del TAD, referida al número de axones que discurren por los mismos. 4.1.2. Disparo neuronal de las aferencias a la subdivisión recto medial Se estudiaron aspectos cualitativos del patrón de disparo de las neuronas aferentes a las motoneuronas del recto medial. Durante movimientos espontáneos, la actividad de las neuronas de la región ventral del NVL correlacionó con la posición ocular, incrementando la frecuencia de descarga para fijaciones desviadas hacia el lado contralateral (izquierdo), y disminuyéndola hacia posiciones homolaterales al lado de registro (derecho; Figura 13A). Por otra parte, las neuronas internucleares del NMOE presentaron un disparo tónico-fásico. Así, estas células presentan una tasa de disparo tónica, constante, que aumenta de forma proporcional a posiciones oculares cada vez más hacia la dirección de activación, homolateral. Además, emiten brotes de potenciales de acción de alta frecuencia durante movimientos sacádicos homolaterales, Resultados 85 mientras que reducen su disparo durante movimientos en la dirección de inactivación o contralateral (Figura 13B). Las neuronales vestibulares también mostraron pequeños brotes en el disparo hacia la dirección de activación (on) y pausas para la dirección opuesta, de inactivación (off), pero mucho menores que los registrados para las neuronas del NMOE (Figura 13A). Figura 13. Propiedades de descarga de las aferencias a las motoneuronas del recto medial. A, B: En cada panel se ilustra desde arriba hacia abajo: registro de la posición (PO, en grados) y de la velocidad ocular (VO, en grados/s) en el plano horizontal del ojo homolateral al registro, así como la frecuencia de disparo (FD, en potenciales de acción/s) de una neurona del NVL (A) y de una neurona internuclear del NMOE (B), durante movimientos oculares espontáneos. C, D: Lo mismo que en A y B, respectivamente, pero durante estimulación vestibular. En el registro de la velocidad ocular se ilustra la velocidad invertida de la cabeza (línea roja, en grados/s). I y D indican la dirección de movimiento del ojo hacia la izquierda o hacia la derecha, respectivamente. Resultados 86 También se estudió el comportamiento de las aferencias a las motoneuronas del recto medial durante el reflejo vestíbulo-ocular. Las neuronas internucleares del NMOE modularon su actividad en respuesta a la estimulación vestibular, de forma proporcional a la posición y velocidad de los ojos durante las fases lentas del reflejo, con brotes de actividad neuronal durante las fases rápidas en dirección homolateral, y pausas durante las fases rápidas en dirección contralateral (Figura 13D). Por otro lado las neuronas de Deiters también modularon su respuesta durante el reflejo vestíbulo-ocular, pero de forma más atenuada que las neuronas internucleares del NMOE (Figura 13C), codificando en su disparo principalmente velocidad de la cabeza. En la tabla 2 se muestran las sensibilidades neuronales a la posición y la velocidad, durante movimientos espontáneos o estimulación vestibular, así como el umbral del reclutamiento neuronal obtenidos de las neuronas del NVL registradas. Además, en esta misma tabla también se recogen estos parámetros para las neuronas internucleares del NMOE obtenidos de un estudio anterior (Benítez-Temiño y col., 2002). Para las neuronas vestibulares el valor más elevado se obtuvo para la sensibilidad neuronal a la velocidad durante el reflejo vestíbulo-ocular. Todos los parámetros analizados resultaron reducidos (p < 0,001, t-test) en comparación con los valores obtenidos previamente para las neuronas internucleares del NMOE. Neuronas del NVL Neuronas internucleares del NMOE ks (pa/s/grd) 1,9 ± 0,4* n = 12 6,9 ± 3,3 n = 87 rs (pa/s/grd/s) 0,16 ± 0,03* n = 12 1,6 ± 0,6 n = 36 kv (pa/s/grd) 1,4 ± 0,4* n = 12 10,5 ± 4,6 n = 30 rv (pa/s/grd/s) 1,4 ± 0,3* n = 12 2,2 ± 1,2 n = 30 U (grd) -42,8 ± 11,2* n =12 -11,7 ± 6,3 n = 87 Tabla 2. Propiedades fisiológicas de las neuronas del NVL y de las neuronas internucleares del NMOE. Se muestran la media ± EEM y la n de la sensibilidad neuronal a la posición y la velocidad ocular durante movimientos oculares espontáneos (ks y rs, respectivamente) y durante estimulación vestibular (kv y rv, respectivamente), así como el umbral de reclutamiento neuronal (U). Los datos de las neuronas internucleares del NMOE han sido tomados de Benítez-Temiño y col., 2002. Los asteriscos indican diferencias significativas entre las neuronas del NVL y las neuronas internucleares del NMOE (p < 0,001, t-test). Resultados 87 4.2. Movimientos oculares tras la axotomía 4.2.1. Movimientos oculares espontáneos La sección del TAD o del FLM produjo diferentes alteraciones en los movimientos oculares, tanto en magnitud como en duración. En la situación control los ojos se movieron de forma conjugada, realizando desplazamientos que abarcaron los dos hemicampos de visión alrededor de la posición primaria, 0 grados (Figura 14A). Tras la sección del TAD derecho, las alteraciones motoras observadas durante movimientos oculares espontáneos variaron dependiendo del momento tras la lesión. Así, durante los primeros 5 días tras la lesión (corto plazo), los movimientos de aducción del ojo homolateral a la lesión (Figura 14B, línea continua verde claro) disminuyeron en amplitud, viéndose parcialmente limitados al hemicampo derecho pero, sin afectación del ojo control (Figura 14B, línea discontinua). Sin embargo, a partir de la primera semana tras la lesión y hasta 2 meses, que fue el periodo de tiempo más largo medido (largo plazo), se observó una recuperación progresiva de los movimientos del ojo afectado (Figura 14C, línea continua verde oscuro). Inmediatamente después de la sección unilateral del FLM derecho, el ojo homolateral a la lesión (Figura 14D, línea continua azul claro) mostró una reducción severa de la amplitud de los movimientos en el plano horizontal, con una incapacidad para cruzar la posición primaria hacia posiciones mediales, en la dirección de aducción. Además, la sección del FLM a corto plazo produjo un marcado incremento en la aparición de movimientos oculares horizontales no conjugados, en comparación con la situación control. Todos estos efectos se observaron entre 0 y 5 días tras la lesión (corto plazo). Posteriormente y hasta el máximo periodo de tiempo estudiado (2 meses, largo plazo), los movimientos espontáneos del ojo afectado (Figura 14E, línea continua azul oscuro) presentaron cierto grado de recuperación motora, sin alcanzarla completamente, con notable dificultad para realizar desplazamientos en el hemicampo izquierdo. Además, el alto grado de conjugación en los movimientos espontáneos horizontales mostrado durante el periodo control nunca se recuperó. El efecto en los movimientos oculares espontáneos tras la axotomía del FLM a largo plazo fue muy similar al producido tras la sección del TAD a corto plazo. Resultados 88 Figura 14. Cambios en los movimientos oculares espontáneos horizontales en respuesta a la sección unilateral del TAD o del FLM. Registros de la posición ocular horizontal (PO, en grados) en control (A), 2 y 26 días tras la sección unilateral del TAD (B y C, respectivamente) o del FLM (D y E, respectivamente) durante movimientos oculares espontáneos. Las líneas continuas y discontinuas representan la velocidad del ojo homolateral y contralateral al sitio de la lesión, respectivamente. I y D indican la dirección de movimiento del ojo, hacia la izquierda o hacia la derecha, respectivamente. Los movimientos oculares del ojo afectado a largo plazo tras la lesión en el TAD son muy similares a los controles, a diferencia de la lesión en el FLM. Resultados 89 4.2.2. Movimientos oculares espontáneos: Análisis Los movimientos oculares espontáneos en el plano horizontal se analizaron midiendo la conjugación de los desplazamientos oculares, así como el rango oculomotor y la amplitud y velocidad máxima de las sacádicos. Se estudió el curso temporal de los datos obtenidos, para lo que se dividieron en rangos de tiempo: hasta 5 días, de 6 a 15 días, de 16 a 25 días y entre 25 y 60 días tras la lesión. Los primeros 5 días tras la lesión se consideraron como efectos a corto plazo y se representó en todas las figuras con colores claros, mientras que los datos tomados más de 25 días tras la lesión se consideraron como de largo plazo y se representaron con colores oscuros. Los rangos intermedios, entre corto y largo plazo se mostraron con líneas discontinuas y color gris. Los datos provenientes de animales con el TAD seccionado se representaron con colores verdes, mientras que los obtenidos de animales con lesión en el FLM se ilustraron con colores azules. La conjugación de los movimientos oculares espontáneos se analizó realizando las rectas de regresión lineal entre la posición del ojo afectado (derecho) y el ojo no afectado (izquierdo; Figura 15A y B). En la situación control, la relación entra la posición horizontal del ojo derecho y del ojo izquierdo es una recta cuya pendiente, m, tiene un valor aproximado de 1 (Figura 15A y B, recta negra). La sección del TAD produjo una reducción a corto plazo en la pendiente de la recta, debido a la disminución en la amplitud de los movimientos del ojo afectado, y en su desplazamiento hacia posiciones menos mediales que el ojo control (Figura 15A, recta verde claro). Estos valores se recuperaron a largo plazo e igualaron a los del ojo control (Figura 15A, recta verde oscuro). Por su parte, la sección del FLM produjo una reducción severa e irreversible en la amplitud de movimientos del ojo afectado, siendo más intensa durante la primera semana tras la axotomía, lo que se manifestó como un decremento de la pendiente de la recta (Figura 15B, recta azul claro). Así, el ojo derecho permaneció preferentemente en posiciones laterales, invadiendo esporádicamente el hemicampo izquierdo. A largo plazo hubo una ligera recuperación, que sin embargo no llegó a alcanzar los valores control (Figura 15B, recta azul oscuro). En las figuras 15A y B, se excluyen de las gráficas las nubes de dispersión de puntos para mejorar su visualización. Se analizó la evolución temporal del rango de los movimientos oculares espontáneos (Figura 15C). El rango motor medio durante la situación control fue de 33,5 ± 0,4 grados (n = 135 periodos de 100 s de movimientos oculares espontáneos). Tras la sección unilateral del TAD (n = 41) o del FLM (n = 27) el rango medio descendió hasta 28,0 ± 1,0 y 19,9 ± 0,9 grados, respectivamente (p < 0,001, ANOVA de dos factores, Test Holm-Sidak para comparaciones Resultados 90 múltiples), observándose una recuperación motora progresiva tras la lesión del TAD hasta alcanzar un rango de 31,6 ± 1,1 grados a largo plazo (n = 26, p = 0,082). Tras la sección del FLM, se observó cierto grado de recuperación motora que no fue completa (p < 0,001), con un rango motor a largo plazo de 26,0 ± 0,6 grados (n = 29, Figura 15C). El efecto en el rango oculomotor tras la sección del TAD fue menor que el producido en el mismo periodo de tiempo tras la lesión del FLM (p < 0,001). Figura 15. Análisis estadístico de los movimientos oculares espontáneos horizontales tras la sección del TAD o del FLM. A, B: Regresión lineal entre los movimientos espontáneos horizontales del ojo derecho (HD, homolateral a la lesión) y el ojo izquierdo (HI, contralateral a la lesión) en animales control (recta negra), y con el TAD (A, rectas verdes) o el FLM (B, rectas azules) lesionado, a corto (cp, colores claros) o largo plazo (lp, colores oscuros). La pendiente de la recta de regresión resultante es m, valor usado para medir la conjugación entre ambos ojos. Nótese la reducción de la pendiente de la recta de regresión a corto plazo tras los dos tipos de lesión, y la posterior recuperación a largo plazo en el ejemplo de lesión del TAD a largo plazo, siendo similar al control. C, D: Curso temporal del rango motor del ojo homolateral a la lesión (C, en grados) y del valor m (D), tras la sección del TAD (línea verde) o del FLM (línea azul). Se representan los valores medios ± EEM; 21 ≤ n ≤ 135 (intervalos de registro de 100 s) y se ilustran las diferencias significativas respecto al control (*), entre corto y largo plazo dentro de una misma lesión (•) y entre ambas lesiones en un mismo punto temporal (#; p < 0,05; ANOVA de dos factores, test Holm-Sidak). Para ambos parámetros, solo los registros realizados más de 15 días tras la lesión del TAD mostraron valores similares al control. Resultados 91 En la figura 15D, se muestra la cuantificación del valor m. A corto plazo, en ambas lesiones, se observó una disminución del valor medio de m (p < 0,001, ANOVA de dos factores, Test Holm-Sidak para comparaciones múltiples), que pasó de 0,9 ± 0,01 en control (n = 135 periodos de 100 s de movimientos oculares espontáneos) a 0,70 ± 0,03 y 0,55 ± 0,03 para la sección del TAD (n = 41) y del FLM (n = 27), respectivamente. Tras ambas lesiones, se vio una recuperación con el tiempo del valor m, siendo completa en animales con el TAD seccionado (0,88 ± 0,11, n = 21, p = 0,326, periodo de 16-25 días) pero no en animales con el FLM lesionado (largo plazo, 0,74 ± 0,03, n = 29, p < 0,001). Igual que ocurrió con los valores del rango motor, el valor m disminuyó más acusadamente en animales con el FLM seccionado que en animales carentes de la proyección vestibular en todos los puntos temporales (p < 0,001), donde los efectos en animales TAD a corto plazo se asemejaron a los que se mantenían en animales FLM a largo plazo. A continuación, se estudió la amplitud y la velocidad máxima de los sacádicos durante movimientos oculares espontáneos, analizándose por separado estos parámetros para sacádicos on (Figura 16A y C, respectivamente) y off (Figura 16B y D, respectivamente). En la situación control la amplitud y la velocidad máxima de los sacádicos on fue de 6,9 ± 0,2 grados y 101,4 ± 2,2 grados/s, respectivamente (n = 439 sacádicos). Ambos parámetros se redujeron significativamente (p < 0,001, ANOVA de dos factores, Test Holm-Sidak para comparaciones múltiples) a corto plazo tras la sección del TAD (5,1 ± 0,2 grados y 82,2 ± 3,4 grados/s, respectivamente, n = 201) o del FLM (2,8 ± 0,2 grados y 48,1 ± 1,9 grados/s, respectivamente, n = 194). Los animales con el TAD lesionado mostraron una recuperación tanto de la amplitud como de la velocidad máxima de los sacádicos on a partir de 6 días tras la deaferentación (5,1 ± 0,2 grados y 82,2 ± 3,4 grados/s, p = 0,253 y p = 452, respectivamente, n = 201, para el intervalo 6-15 días), y manteniéndose hasta 2 meses tras la misma (6,5 ± 0,2 grados y 98,9 ± 3,0 grados/s, p = 0,147 y p = 0,458, respectivamente, n = 197, largo plazo). Sin embargo, esto no se observó en los animales carentes de la entrada procedente del NMOE, donde ambos parámetros se mantuvieron reducidos y diferentes del control (p < 0,001) hasta al menos 2 meses tras la lesión (3,4 ± 0,2 grados y 54,4 ± 2,0 grados/s, n = 250). Resultados similares se obtuvieron cuando se analizaron los sacádicos off. Así, tanto la amplitud como la velocidad máxima tras la lesión del TAD (5,6 ± 0,3 grados y 68,2 ± 2,6 grados/s, respectivamente, n = 201) o del FLM (3,4 ± 0,2 grados y 50,2 ± 1,6 grados/s, respectivamente, n = 200) a corto plazo se vieron reducidos significativamente (p < 0,001, ANOVA de dos factores, Test Holm-Sidak para comparaciones múltiples) en comparación con los datos medidos durante situación control (7,7 ± 0,2 grados y 99,1 ± 2,5 grados/s, respectivamente, n = 388). Nuevamente, los animales con el FLM Resultados 92 seccionado mostraron significativamente reducidos (p < 0,001) ambos parámetros hasta el máximo periodo de tiempo analizado (4,5 ± 0,2 grados y 57,8 ± 2,1 grados/s para amplitud y velocidad máxima, respectivamente, n = 188, largo plazo). En cambio, los animales carentes de la entrada vestibular, mostraron una recuperación tanto de la amplitud como de la velocidad máxima de los sacádicos off que se mantuvo a largo plazo sin ser diferente de la situación control (7,3 ± 0,3 grados y 93,1 ± 3,4 grados/s, p = 0,230 y p = 0,134, respectivamente, n = 161, largo plazo). Asimismo, tanto la amplitud como la velocidad máxima obtenida en los animales con el TAD seccionado fueron estadísticamente mayores que las medidas en animales con lesión en el FLM, tanto para los sacádicos on como para los off. Figura 16. Estadística comparativa de la amplitud y velocidad máxima de los sacádicos durante movimientos oculares espontáneos tras la lesión. A-D: Curso temporal de la amplitud y velocidad máxima de los sacádicos on (A y C, respectivamente) u off (B y D, respectivamente) del ojo homolateral a la lesión del TAD (línea verde) o del FLM (línea azul) a corto (cp, colores claros) o largo plazo (lp, colores oscuros) durante movimientos oculares espontáneos. Se representan los valores medios ± EEM; 147 ≤ n ≤ 439 (n = número de sacádicos) y se ilustran las diferencias significativas respecto al control (*), entre corto y largo plazo dentro de una misma lesión (•) y entre ambas lesiones en un mismo punto temporal (#; p < 0,05; ANOVA de dos factores, test Holm-Sidak). Resultados 93 En conclusión, tras la sección selectiva del TAD o del FLM, los movimientos oculares espontáneos se vieron afectados tanto en amplitud como en el grado de conjugación de los mismos. Sin embargo, y aunque en ambos casos se observó una evolución temporal, solo los animales carentes de la aferencia vestibular recuperaron completamente la motilidad previa a la lesión. 4.2.3. Movimientos oculares durante el reflejo vestíbulo-ocular Se estudió el comportamiento ocular durante el reflejo vestíbulo-ocular en control y tras la axotomía del TAD o del FLM. La rotación de la cabeza produjo movimientos oculares compensatorios (fases lentas del reflejo vestíbulo-ocular), de amplitud similar pero dirección opuesta a la de la cabeza. Las fases rápidas de recentrado ocular se realizaron en dirección opuesta a las fases lentas e igual al movimiento de la cabeza. Así, cuando la cabeza se movió hacia la izquierda, los movimientos compensatorios del ojo fueron dirigidos hacia la derecha y las fases rápidas hacia la izquierda. Durante el nistagmo vestibular las fases lentas y rápidas se sucedieron de forma conjugada en ambos ojos. Considerando que nuestro estudio se centró en los efectos producidos tras la deaferentación del recto medial derecho, nos referiremos como hemiciclos on a aquellos donde las fases lentas se dirigieron en la dirección de activación (izquierda) y las fases rápidas se dirigían en la dirección de inactivación (derecha), mientras que en los hemiciclos off, las fases lentas se dirigieron hacia la derecha y las fases rápidas hacia la izquierda (Figura 17). En la figura 17A-E, se representa la velocidad ocular (grados/s), obtenida al derivar la posición ocular de los ojos homolateral (línea continua) y contralateral (línea discontinua) a la lesión. La velocidad de la cabeza se representa invertida por la línea roja. En control (Figura 17A), se observó un solapamiento muy exacto, al superponer los registros de la velocidad ocular de ambos ojos y de la cabeza. A corto plazo tras la sección unilateral del TAD, se observó que el ojo afectado presentaba una amplitud reducida tanto en las fases rápidas como lentas del reflejo vestíbulo-ocular, siendo la reducción ligeramente más prominente en los hemiciclos on (Figura 17B, línea verde claro). A pesar de ello, a partir de la primera semana tras la lesión del TAD, se vio una recuperación en la motilidad del ojo afectado, tanto en las velocidades on como off, presentando un comportamiento similar al de la situación control (Figura 17C, línea verde oscuro). La sección del FLM derecho, tanto a corto (Figura 17D, línea azul claro) como largo plazo (Figura 17E, línea azul oscuro) produjo una reducción en la amplitud de movimientos del ojo homolateral a la lesión tanto en los hemiciclos on como en los off. El ojo control, contralateral al sitio de lesión, no se vio afectado tras la sección del TAD o del FLM. Resultados 100 Figura 20. Cambios en la sensibilidad neuronal a la posición ocular durante movimientos espontáneos. A: Ejemplos de regresión lineal entre la frecuencia de disparo (FD, en potenciales de acción/s) de motoneuronas del recto medial derecho y la posición ocular (PO, en grados) en la situación control (línea negra), 2 (línea verde claro, cp) o 39 días (línea verde oscuro, lp) tras la sección del TAD y 4 (línea azul claro, cp) o 30 días (línea azul oscuro, lp) tras la sección del FLM. La pendiente de la recta de regresión representa la sensibilidad neuronal a la posición ocular (ks, en potenciales de acción/s/grado). B-D: Evolución en el tiempo de los valores medios ± EEM de ks (B), ks on (C, calculada en fijaciones posteriores a movimientos del ojo en la dirección de activación) y ks off (D, calculada en fijaciones posteriores a movimientos del ojo en la dirección de inactivación) tras la axotomía del TAD (línea verde) o del FLM (línea azul) con respecto al control (punto negro), 13 ≤ n ≤ 98 (n = células analizadas). Se ilustran las diferencias significativas respecto al control (*), respecto al corto plazo dentro de una misma lesión (•) y entre ambas lesiones en un mismo punto temporal (#; p < 0,05; ANOVA de dos factores, test Holm-Sidak). Por otro lado se analizaron por separado los componentes de las sensibilidades neuronales a la posición durante movimientos oculares realizados hacia la dirección on (ks on) u off (ks off). Los valores de ks on (Figura 20C) y ks off (Figura 20D) obtenidos durante la situación control (4,3 ± 0,2 y 3,4 ± 0,1 pa/s/grado, respectivamente, n = 98 células) fueron estadísticamente superiores (p < 0,001, ANOVA de dos factores, Test Holm-Sidak para comparaciones múltiples) a los obtenidos tras la sección del TAD (2,9 ± 0,2 y 2,2 ± 0,2 Resultados 101 pa/s/grado, respectivamente, n = 34) y del FLM (1,7 ± 0,3 y 1,4 ± 0,1 pa/s/grado, respectivamente, n = 13) a corto plazo, como ya ocurriese con la ks global. Nuevamente, sólo en los animales con el TAD seccionado se observó una recuperación funcional con el tiempo, siendo similar al control 6 días tras la lesión tanto la ks on (3,8 ± 0,2 pa/s/grado, n = 33, p = 0,135, intervalo 6-15 días) como ks off (3,0 ± 0,3 pa/s/grado, n = 33, p = 0,177, intervalo 6-15 días), y manteniéndose así a largo plazo (4,2 ± 0,4 y 3,4 ± 0,3 pa/s/grado, n = 23, p = 0,821 y p = 0,824, respectivamente). Por el contrario, igual que ocurrió con la ks, no se vio una recuperación de las ks on y ks off con el tiempo tras la lesión del FLM, permaneciendo diferentes del control a largo plazo (2,9 ± 0,3 y 1,8 ± 0,2 pa/s/grado, respectivamente, n = 21, p < 0,001). Por otro lado, mientras que en los animales con lesión en el TAD se observaron diferencias significativas entre corto y largo plazo en los valores ks on y ks off (p < 0,001); los animales con el FLM seccionado no presentaron una evolución temporal. 4.3.3. Análisis de las propiedades de disparo durante movimientos sacádicos En la figura 21A, se representa la recta de regresión de una célula ejemplo para cada situación experimental, resultante de enfrentar la frecuencia instantánea de disparo, tras sustraerle el componente de posición, frente a la velocidad ocular simultánea durante los movimientos sacádicos. Se han excluido de la gráfica las nubes de puntos por claridad. Se aprecia que, a corto plazo, tras la sección unilateral del TAD (recta verde claro) o del FLM (recta azul claro), la pendiente de la recta de regresión fue menor que la obtenida en control (recta negra). A largo plazo, al menos 25 días tras la lesión, solo las motoneuronas privadas de la señal vestibular (recta verde oscuro) se recuperaron, donde la pendiente de la recta de regresión fue similar a control, mientras que las células que carecían de la entrada procedente del NMOE (recta azul oscuro) mantuvieron una recta de regresión menor que el control y que células registradas en animales con el TAD seccionado (Figura 21A). Las motoneuronas del recto medial controles presentaron una sensibilidad neuronal a la velocidad ocular (0,48 ± 0,02 pa/s/grado/s, n = 98 células) que fue significativamente mayor (p < 0,001, ANOVA de dos factores, Test Holm-Sidak para comparaciones múltiples) que la obtenida en motoneuronas registradas a corto plazo tras la sección unilateral del TAD o del FLM (0,28 ± 0,02 y 0,15 ± 0,02 pa/s/grado/s, n = 34 y n = 13, respectivamente; Figura 21B). A partir de 16 días tras la sección del TAD, la sensibilidad neuronal a la velocidad, se recuperó, sin encontrarse diferencias con el control (0,42 ± 0,03 pa/s/grado/s, n = 22, p = 0,074, para el intervalo 16-25 días). Sin embargo, los animales con lesión en el FLM mantuvieron una rs menor (p < 0,001) que Resultados 102 el control (Figura 21B) en todos los periodos de tiempo registrado (0,21 ± 0,02 pa/s/grado/s, n = 21, largo plazo). Figura 21. Cambios en la sensibilidad neuronal a la velocidad ocular durante movimientos espontáneos del ojo. A: Ejemplos de rectas de regresión lineal entre la frecuencia de disparo obtenida tras sustraer el componente de posición (FD-ks·PO), en potenciales de acción/s) y la velocidad ocular (VO, en grados/s), durante movimientos sacádicos, para motoneuronas del recto medial en las diferentes situaciones experimentales: control (recta negra), 3 (recta verde claro, cp) o 39 días (recta verde oscuro, lp) tras la sección del TAD o bien 4 (recta azul claro, cp) o 30 días (recta azul oscuro, lp) tras la axotomía del FLM. La pendiente de la recta de regresión obtenida representa la sensibilidad neuronal a la velocidad ocular (rs, en potenciales de acción/s/grados/s). B-D: Curso temporal comparando los valores medios ± EEM de rs (B), rs on (C, calculada cuando el ojo se mueve hacia la dirección de activación) y rs off (D, calculada cuando el ojo se mueve hacia la otra dirección) tras la lesión del TAD (línea verde) o del FLM (línea azul) con respecto al control (punto negro). 13 ≤ n ≤ 98 células. Se ilustran las diferencias significativas respecto al grupo control (*), respecto al corto plazo dentro de una misma lesión (•) y entre ambas lesiones en un mismo punto temporal (#; p < 0,05; ANOVA de dos factores, test Holm-Sidak). Al igual que para el análisis realizado con la sensibilidad a la posición ocular, se cuantificó la sensibilidad neuronal a la velocidad ocular durante movimientos sacádicos en la dirección on (Figura 21C) o en la dirección off (Figura 21D). La rs on se comportó de manera similar a la rs. Así, Resultados 103 la sensibilidad neuronal a la velocidad ocular control durante sacádicos (0,43 ± 0,02 pa/s/grado/s, n = 98 células) fue mayor (p < 0,001) que tras las lesiones en el TAD o el FLM a corto plazo (0,25 ± 0,02 y 0,13 ± 0,01 pa/s/grado/s, n = 34 y n = 13, respectivamente), recuperándose funcionalmente la rs on en los animales con lesión en el TAD (0,37 ± 0,03 pa/s/grado/s, n = 22, p = 0,076, intervalo 16-25 días) y manteniéndose disminuida en el tiempo en animales sin la proyección del NMOE (0,19 ± 0,02 pa/s/grado/s, n = 21, p < 0,001, a largo plazo; Figura 21C). Además, en los animales con el TAD seccionado, tanto los valores promedio de rs como de rs on fueron diferentes, a partir de 16 días tras la lesión, de los valores obtenidos a corto plazo. Por otro lado, en todos los rangos temporales analizados, hubo diferencias entre las lesiones en el TAD y el FLM en ambos valores (Figura 21B y C). Por otra parte, el valor promedio de la rs off disminuyó a corto plazo (0,17 ± 0,02 y 0,14 ± 0,02 pa/s/grado/s, n = 34 y n = 13, p < 0,001, respectivamente) en comparación con el control (0,31 ± 0,02 pa/s/grado/s, n = 98). De nuevo, solo los animales privados de la proyección vestibular se recuperaron funcionalmente a largo plazo tras la lesión (0,33 ± 0,02 pa/s/grado/s, n = 23, p = 0,543), presentando una sensibilidad a la velocidad que también fue significativamente superior al valor a corto plazo (p < 0,001). Por el contrario, los animales con el FLM seccionado mantuvieron las diferencias con el control a lo largo del tiempo (p < 0,001). Solo a largo plazo, hubo diferencias significativas entre los dos tipos de lesiones (p < 0,001; Figura 21D). 4.3.4. Aspectos cualitativos del patrón de disparo de las motoneuronas del recto medial durante estimulación vestibular Se estudió el comportamiento de las motoneuronas del recto medial del NMOC durante el reflejo vestíbulo-ocular en las diferentes situaciones experimentales. En control, las motoneuronas del recto medial modularon su actividad en respuesta a la estimulación vestibular. Así, el perfil de disparo mostró una modulación sinusoidal, proporcional a la posición y velocidad de los movimientos oculares durante las fases lentas, con actividad en forma de brote durante las fases rápidas en dirección contralateral, o pausas durante las fases rápidas en dirección homolateral (Figura 22A). La lesión del TAD o del FLM también alteró la tasa de disparo de las motoneuronas del recto medial durante el reflejo vestíbulo-ocular, visible desde el mismo momento tras la lesión. La sección del FLM indujo una reducción en la modulación del disparo durante estimulación vestibular, con brotes de potenciales de acción de menor amplitud en comparación con el control, sin verse diferencias significativas entre corto (no mostrado) y largo plazo (Figura 22B). Por otro lado la lesión vestibular produjo efectos en el disparo de las motoneuronas del recto medial, que variaron dependiendo del tiempo tras la misma. A corto Resultados 104 plazo, la sección unilateral del TAD (Figura 22C) produjo efectos similares, aunque de menor magnitud, a los de la lesión del FLM a largo plazo; sin embargo, a largo plazo, se observó una recuperación de la modulación durante las fases lentas del reflejo vestíbulo-ocular, así como de los brotes durante las fases rápidas, con amplitudes comparables a las observadas en la situación control (Figura 22D). Figura 22. Disparo de las motoneuronas del recto medial durante el reflejo vestíbulo-ocular. A: Se ilustra de arriba a abajo: registro de la posición horizontal del ojo (PO, en grados) y de la velocidad ocular (VO, en grados/s) del ojo control (línea discontinua) y del ojo afectado (línea continua) en el plano horizontal, con la superposición de la velocidad invertida de la cabeza (línea roja, en grados/s), así como la frecuencia de disparo (FD, en potenciales de acción/s) de una motoneurona del recto medial control. B: Lo mismo que en A pero para una motoneurona registrada 30 días tras la sección unilateral del FLM. El registro del ojo control se representa en negro, el afectado en color azul. C, D: Igual que en A y B, pero en este caso representando motoneuronas del recto medial registradas 1 (C, verde claro) y 44 (D, verde oscuro) días tras la axotomía unilateral del TAD. Resultados 105 4.3.5. Análisis de las propiedades de disparo durante estimulación vestibular El análisis de la frecuencia de disparo se llevó a cabo durante las fases lentas del reflejo vestíbulo-ocular mediante un análisis de regresión múltiple. La frecuencia de disparo presentó dos componentes, uno relacionado con la velocidad y otro relacionado con la posición. Restando el componente de velocidad o el componente de posición a la tasa de disparo de las motoneuronas, y enfrentándolo a la posición o la velocidad ocular, se obtiene una recta de regresión, cuya pendiente es la sensibilidad neuronal a la posición (kv, Figura 23A) o la velocidad ocular (rv, Figura 24A) durante el reflejo vestíbulo-ocular, respectivamente. Se observó que a corto plazo tras la sección del TAD (recta verde claro) o del FLM (recta azul claro), la pendiente de la recta de regresión fue menor que cuando se comparó con la situación control (recta negra), tanto para la kv (Figura 23A) como para la rv (Figura 24A). A largo plazo sólo las células procedentes de animales con el FLM seccionado (recta azul oscuro), presentaron una recta con una pendiente menor que el control, mientras que células con lesión vestibular exhibieron una recta de regresión similar al control (recta verde oscuro), tanto para la kv (Figura 23A) como para la rv (Figura 24A). Esto se relaciona con menores sensibilidades a la posición (Figura 23B) y la velocidad (Figura 24B) ocular durante el reflejo vestíbulo-ocular (p < 0,001, ANOVA de dos factores, Test Holm-Sidak para comparaciones múltiples) a corto plazo tras la sección selectiva del TAD (2,7 ± 0,2 pa/s/grado y 0,43 ± 0,03 pa/s/grado/s, respectivamente, n = 23 células) o del FLM (1,6 ± 0,3 pa/s/grado y 0,39 ± 0,07 pa/s/grado/s, respectivamente, n = 11) cuando se compara con la situación control (5,1 ± 0,3 pa/s/grado y 0,72 ± 0,03 pa/s/grado/s, respectivamente, n = 56). Por otro lado, se vio una recuperación funcional en los animales carentes de la proyección del NVL, presentando valores similares al control tanto para la sensibilidad a la posición (4,7 ± 0,4 pa/s/grado, n = 19, p = 0,376, intervalo de 16-25 días; Figura 23B) como para la sensibilidad a la velocidad (0,64 ± 0,05 pa/s/grado/s, n = 24, p = 0,171, intervalo 6-15 días; Figura 24B) durante estimulación vestibular, y que se mantuvo a largo plazo (4,7 ± 0,4 pa/s/grado y 0,76 ± 0,08 pa/s/grado/s, p = 0,439 y p = 0,546, respectivamente, n = 20), datos que también fueron diferentes de lo obtenidos a corto plazo (p < 0,001). Sin embargo, en los animales carentes de la aferencia del NMOE, no se observó esta mejoría ni en la kv (Figura 23B) ni en la rv (Figura 24B), manteniéndose diferentes del control hasta al menos 2 meses tras la lesión (3,1 ± 0,4 pa/s/grado y 0,49 ± 0,07 pa/s/grado/s, p < 0,001 y p = 0,003, respectivamente, n = 13). Resultados 106 Al igual que se hiciera para el análisis de la actividad neuronal durante movimientos espontáneos, se calcularon las sensibilidades a la posición y a la velocidad on (fases lentas hacia la dirección de activación, izquierda; Figura 23C y Figura 24C, respectivamente) y off (fases lentas hacia la dirección de inactivación, derecha; Figura 23D y Figura 24D, respectivamente) durante el reflejo vestíbulo-ocular en las diferentes situaciones experimentales. Figura 23. Curso temporal de cambios en la sensibilidad neuronal a la posición ocular durante el reflejo vestíbulo-ocular. A: Gráfico de regresión parcial para la sensibilidad neuronal a posición ocular, donde se representa la frecuencia de disparo, a la que se le ha sustraído el componente de velocidad (FD-rv·VO, en potenciales de acción/s) frente a la posición ocular (PO, en grados). La pendiente de la recta de regresión obtenida es la sensibilidad neuronal a la posición ocular durante las fases lentas del reflejo vestíbuloocular (kv). Se representa una recta modelo para cada situación experimental: control (recta negra), sección del TAD a corto (cp, recta verde claro) y largo plazo (lp, recta verde oscuro) y lesión del FLM a corto (cp, recta azul claro) y largo plazo (lp, recta azul oscuro). B-D: Curso temporal comparando los valores de kv (B), kv on (C, calculada cuando el ojo se mueve hacia la dirección de activación) y kv off (D, calculada cuando el ojo se mueve en dirección contraria) tras la axotomía del TAD o del FLM con respecto al control. Se representan los valores medios ± EEM; 11 ≤ n ≤ 56 células. Se marcan (*) las diferencias significativas respecto al grupo control, respecto a corto plazo dentro de una misma lesión (•) y entre ambas lesiones en un mismo punto temporal (#; p < 0,05; ANOVA de dos factores, test Holm-Sidak). Resultados 107 Figura 24. Curso temporal de cambios en la sensibilidad neuronal a la velocidad ocular durante el reflejo vestíbulo-ocular. A: Gráfico de regresión parcial para la sensibilidad neuronal a velocidad ocular, donde se representa la frecuencia de disparo, a la que se le ha sustraído el componente de posición (FD-kv·PO, en potenciales de acción/s/grados/s) y la velocidad ocular (VO, en grados). La pendiente de la recta de regresión obtenida es la sensibilidad neuronal a la velocidad ocular durante las fases lentas del reflejo vestíbulo-ocular (rv). Se representa una recta modelo para cada situación experimental: control (línea negra), sección del TAD a corto (cp, línea verde claro) y largo plazo (lp, línea verde oscuro), o del FLM a corto (cp, línea azul claro) y largo plazo (lp, línea azul oscuro). B-D: Curso temporal comparando los valores de rv (B), rv on (C, calculada cuando el ojo se mueve hacia la dirección preferente de activación) y rv off (D, calculada cuando el ojo se mueve hacia la dirección no preferente) tras la lesión del TAD (línea verde) o del FLM (línea azul) con respecto al control (punto de color negro). Se ilustran los valores medios ± EEM; 11 ≤ n ≤ 56 células. Se marcan (*) las diferencias significativas respecto al grupo control, respecto a corto plazo dentro de una misma lesión (•) y entre ambas lesiones en un mismo punto temporal (#; p < 0,05; ANOVA de dos factores, test Holm-Sidak). A corto plazo tras la sección del TAD, se observó una disminución de las sensibilidades a la posición y la velocidad on (3,1 ± 0,3 pa/s/grado y 0,48 ± 0,03 pa/s/grado/s, p < 0,001 y p = 0,003, respectivamente, n = 23 células) y off (2,7 ± 0,3 pa/s/grado y 0,43 ± 0,04 pa/s/grado/s, p < 0,001 y p = 0,001, respectivamente, n = 23 células) en comparación con el control (on: 5,0 ± 0,2 pa/s/grado y 0,66 ± 0,03 pa/s/grado/s; off: 4,8 ± 0,2 pa/s/grado y 0,61 ± 0,03 pa/s/grado/s, respectivamente, n = 56). Sin embargo, entre 6 y 15 días tras la lesión, las células registradas, Resultados 108 presentaron un valor similar al control tanto en la kv on y la rv on (4,6 ± 0,4 pa/s/grado y 0,62 ± 0,05 pa/s/grado/s, p = 0,401 y p = 0,450, respectivamente, n = 24), como en la kv off y rv off (4,1 ± 0,4 pa/s/grado y 0,63 ± 0,05 pa/s/grado/s, p = 0,065 y p = 0,785, respectivamente, n = 24). Por otro lado, esta mejora funcional en las sensibilidades neuronales a la posición y la velocidad on y off, no se observó en los animales con el FLM lesionado, siendo diferentes del control a corto plazo (p < 0,001), y manteniendo estas diferencias a largo plazo tanto para la dirección on (3,0 ± 0,4 pa/s/grado y 0,48 ± 0,09 pa/s/grado/s, p < 0,001 y p = 0,021, respectivamente, n = 13) como la off (2,6 ± 0,3 pa/s/grado y 0,45 ± 0,06 pa/s/grado/s, p < 0,001 y p = 0,018, respectivamente, n = 13) durante el reflejo vestíbulo-ocular. Además, para un mismo punto temporal, los datos de animales privados de la entrada vestibular fueron superiores a los obtenidos en animales carentes de la proyección del NMOE, tanto en los análisis de movimientos en dirección on como off (Figuras 23B-D y 24). Por tanto los resultados del análisis de las propiedades de disparo indicaron que tras la deaferentación selectiva, las sensibilidades neuronales a la posición y la velocidad durante movimientos espontáneos del ojo o durante estimulación vestibular se vieron reducidas con respecto a la situación control, pero los animales con el TAD seccionado recuperaron los parámetros previos a la lesión, mientras que los animales privados de la entrada del FLM mantuvieron el efecto de la lesión a lo largo del tiempo. 4.3.6. Aspectos cualitativos del patrón de disparo de las motoneuronas del recto medial durante movimientos de vergencia Se estudió el comportamiento ocular y el disparo neuronal de las neuronas motoras del recto medial durante desplazamientos oculares de vergencia espontáneos. Se observó que durante la situación control (Figura 25A) y tras la sección unilateral del TAD (Figura 25B) o del FLM (Figura 25C) se produjeron movimientos convergentes, esto es, desplazamientos simultáneos de ambos ojos hacia una posición nasal, de manera espontánea. Además, el patrón de descarga de la motoneurona durante la convergencia correlacionó con la posición y la velocidad ocular del ojo homolateral al registro (derecho, Figura 25, asteriscos). Se analizó la aparición de movimientos divergentes espontáneos (no ilustrado), que son desplazamientos simultáneos de ambos ojos hacia posiciones laterales. Al igual que para los movimientos convergentes, la posición y la velocidad del ojo homolateral al registro correlacionaron con el disparo neuronal de la motoneurona del recto medial, tanto en la situación control como tras la Resultados 109 deaferentación selectiva. Estos resultados indican que ni las neuronas internucleares del NMOE ni las neuronas de Deiters codifican la información para la realización de tales movimientos, como previamente se había sugerido. Figura 25. Disparo neuronal de las motoneuronas del recto medial durante movimientos convergentes. En cada panel se ilustra, desde arriba hacia abajo: el registro de la posición ocular del ojo izquierdo (HI, en grados) y del ojo derecho (HD), la velocidad ocular (HI’ y HD’, en grados/s) en el plano horizontal, así como la frecuencia instantánea de disparo (FD, en potenciales de acción/s) para una célula registrada en situación control (A), 15 días tras la sección del TAD (B), y 23 días tras la axotomía del FLM (C) durante desplazamientos oculares espontáneos. Se señalan en rojo, tanto en posición como en velocidad, ejemplos de movimientos convergentes. Los asteriscos señalan el disparo de la célula durante los movimientos de vergencia. Nótese la modulación del disparo con el desplazamiento del ojo homolateral al registro (derecho). I y D indican la dirección de movimiento del ojo hacia la izquierda o hacia la derecha, respectivamente. Resultados 116 Figura 29. Cambios en la inmunorreactividad para GAP-43 en el neuropilo de las motoneuronas recto mediales tras la deaferentación selectiva en el gato. A-E: Imágenes de microscopía confocal de tinciones inmunocitoquímicas frente a GAP-43 (verde) de motoneuronas del recto medial de gatos con lesión en el TAD (A-B) o FLM (C-D), a corto (cp) y largo plazo (lp), respectivamente, y de un lado control (E). La población de motoneuronas del recto medial se identificó mediante rodamina (rojo). F: Histogramas comparando la densidad óptica (expresada en porcentaje con respecto al control) en la situación control y tras la sección del TAD o del FLM a corto y largo plazo. Los datos corresponden a los valores medios ± EEM; 145 ≤ n ≤ 899 medidas de densidad óptica. Nótese el aumento significativo de GAP-43 tras la deaferentación a corto plazo. Se indican las diferencias con respecto al grupo control (*), entre corto y largo plazo dentro de una misma lesión (•) y entre ambas lesiones en un mismo punto temporal (#; p < 0,05; ANOVA de dos factores, test Holm-Sidak). Barra de calibración: 100 µm en E para A-E. Resultados 117 Este incremento a corto plazo de la densidad óptica fue estadísticamente mayor (p < 0,001) en los animales carentes de la entrada vestibular que en los que carecían de la proyección del NMOE, lo que indicaría que tras la eliminación de la aferencia vestibular, los axones provenientes del FLM aumentaron más su expresión de GAP-43 que en el experimento inverso. El aumento en la proteína GAP-43, relacionada con el crecimiento axonal, en torno a la población de células recto medial, podría estar relacionado con la reorganización funcional de los tractos no lesionados, así como en la recuperación funcional de las propiedades de disparo de dichas neuronas, que es completa tras la lesión TAD, cuando hay un mayor incremento en la presencia de GAP-43 en los terminales remanentes, y parcial en el caso de la lesión del FLM, en la que la expresión de GAP-43 por parte de los axones intactos (provenientes del NVL) no aumenta tanto. 4.6. Cambios en la presencia de neurotrofinas en las motoneuronas del recto medial en respuesta a la sección unilateral del TAD o del FLM El incremento en la presencia de GAP-43 en el neuropilo de las motoneuronas del recto medial deaferentadas, podría estar en relación con la posible formación de nuevas colaterales aferentes hacia dichas células a partir de axones presentes en el núcleo, que son las aferencias que se mantuvieron intactas. A continuación, se quiso conocer si existía una relación entre el aumento de GAP-43 y cambios en el contenido de neurotrofinas en las motoneuronas deaferentadas, debido a que estudios previos han demostrado que los factores tróficos estimulan la expresión de esta proteína (Geremia y col., 2010; Sanna y col., 2017). Para ello, se estudió la presencia de neurotrofinas en estas neuronas en control y tras la sección unilateral del TAD o del FLM a corto y largo plazo. Las motoneuronas del recto medial fueron inmunopositivas para las tres neurotrofinas, observándose un marcaje punteado por todo el citoplasma celular, sin destacarse el perímetro o compartimentos dentro del soma neuronal en todas las situaciones experimentales. A simple vista, en las imágenes tomadas en el microscopio, se observó un aumento en el contenido de las diferentes neurotrofinas en el soma de las motoneuronas del recto medial, 3 días tras la sección del TAD (Figura 30D-F) o del FLM (Figura 30J-L), con respecto a la situación control (Figura 30A-C) y con su mismo tipo de lesión pero a largo plazo (Figura 30G- I y Figura 30M-O, respectivamente). Resultados 118 Figura 30. Neurotrofinas en las motoneuronas del recto medial tras la deaferentación selectiva en el gato. Imágenes de microscopía confocal de las motoneuronas del recto medial marcadas con un anticuerpo dirigido contra BDNF (primera columna), NT-3 (segunda columna) o NGF (tercera columna) en control (A-C), tras la sección del TAD o FLM a corto plazo (cp; D-F y J-L, respectivamente) o largo plazo (lp; G-I y M-O, respectivamente). Las motoneuronas fueron identificadas mediante inyecciones de rodamina en el músculo recto medial. Los insertos muestran el doble marcaje con rodamina y el anticuerpo dirigido contra la neurotrofina. Barra de calibración: 25 µm en O para A-O. Barra de calibración del inserto: 30 µm. Resultados 119 Posteriormente, se analizó la densidad óptica en el soma de las motoneuronas del recto medial en las diferentes situaciones, delimitando el perímetro somático y excluyendo el núcleo. Se cuantificó un aumento significativo (p < 0,001, ANOVA de dos factores, Test Holm-Sidak para comparaciones múltiples; Figura 31) de la densidad óptica a corto plazo en el soma de las motoneuronas recto mediales de los animales con el TAD o el FLM seccionado para las tres neurotrofinas, BDNF (114,6 ± 3,0% y 110,1 ± 2,0%, n = 54 y n = 56; Figura 31A, barra verde y azul claro, respectivamente), NT-3 (121,2 ± 4,9% y 117,8 ± 2,8%, n = 30 y n = 60; Figura 31B, barra verde y azul claro, respectivamente) y NGF (118,8 ± 4,1% y 110,1 ± 1,9%, n = 49 y n = 59; Figura 31C, barra verde y azul claro, respectivamente), con respecto a la situación control (100,0 ± 1,2%, n = 161 para BDNF; 100,0 ± 1,4%, n = 138 para NT-3 y 100,0 ± 1,3%, n = 169 para NGF; Figura 31A-C, respectivamente, barra negra). Sólo en el caso del NGF se detectaron diferencias entre ambos tipos de lesiones (p = 0,013) 3 días tras la misma. Por otro lado, no se observaron diferencias entre control y las lesiones a largo plazo del TAD (103,0 ± 2,2%, n = 37 para BDNF; 102,4 ± 4,4%, n = 24 para NT-3 y 102,3 ± 3,6%, n = 17 para NGF) o del FLM (93,6 ± 3,2%, n = 22 para BDNF; 105,2 ± 4,8%, n = 29 para NT-3 y 99,4 ± 2,7%, n = 40 para NGF) en el porcentaje de densidad óptica para ninguna de las tres neurotrofinas. En cambio, sí se vieron diferencias entre corto y largo plazo para las secciones del TAD o del FLM, con los tres factores neurotróficos (p < 0,001 para BDNF y NT-3; p = 0,001 para NGF y p < 0,001 para BDNF; p = 0,004 para NT-3 y NGF, respectivamente). Figura 31. Cuantificación de la presencia de neurotrofinas en las motoneuronas del recto medial tras la deaferentación selectiva. A-C: Diagramas de barras ilustrando la densidad óptica en el soma de las motoneuronas del recto medial (expresada en porcentajes relativos al control) de BDNF (A), NT-3 (B) y NGF (C) en control y tras la sección unilateral a corto (cp) y largo plazo (lp) del TAD (barras verdes) o del FLM (barras azules). Se muestran los valores medios ± EEM; 22 ≤ n ≤ 161 células para BDNF; 24 ≤ n ≤ 138 células para NT-3 y 17 ≤ n ≤ 169 células para NGF. Se señalan las diferencias significativas respecto al grupo control (*), entre corto y largo plazo dentro de una misma lesión (•) y entre ambas lesiones en un mismo punto temporal (#). Nótese el aumento significativo de marcaje a corto plazo con respecto a control y a largo plazo en ambas lesiones (p < 0,05; ANOVA de dos factores, test Holm-Sidak). Resultados 120 4.7. Evolución temporal de los cambios sinaptológicos tras la deaferentación selectiva de las motoneuronas del recto medial Para estudiar el curso temporal de la degeneración de los botones sinápticos presentes en el neuropilo y alrededor de los somas de las motoneuronas de la subdivisión del recto medial, se inició un segundo estudio morfológico para dilucidar los cambios en la sinaptología aferente 24, 48 y 96 horas tras la deaferentación selectiva. Este nuevo estudio se realizó mediante microscopia confocal en ratas adultas. Previamente, se demostró mediante microscopía óptica la lesión unilateral del TAD o del FLM (Figura 32). Así, y al igual que en el gato, no se observaron axones inmunopositivos para calretinina en estos tractos, tras la sección del TAD o del FLM (Figura 32A y B, respectivamente, asteriscos). Además, la zona lesionada mostró el fenotipo propio tras una lesión, con una llamativa degradación del tejido lesionado que estaba ausente en el lado control. En la figura 32C y D se puede observar la cicatriz en el tejido tras la sección unilateral del TAD (delimitado por flechas) o del FLM (señalado por la flecha) mediante tinción de Nissl, respectivamente. Mediante una tinción inmunohistoquímica contra calretinina, se estudiaron los cambios en la inervación a las motoneuronas del recto medial, en el lado control (Figura 33G) y 24 (Figura 33A y D), 48 (Figura 33B y E) y 96 horas (Figura 33C y F) tras la sección del TAD o del FLM, respectivamente. La tinción frente a calretinina dio como resultado un punteado localizado por todo el neuropilo de las motoneuronas del recto medial. La población de motoneuronas del recto medial fue identificada mediante la rodamina inyectada bilateralmente en los músculos rectos mediales. Cualitativamente, se distingue una mayor inmunorreactividad para calretinina en el lado control que en aquellos que sufrieron alguna de las posibles lesiones. Los análisis de las imágenes obtenidas (Figura 33H) mostraron una disminución progresiva de la densidad óptica para calretinina en el neuropilo circundante a los somas de las motoneuronas del recto medial (p < 0,001, ANOVA de dos factores, Test Holm-Sidak para comparaciones múltiples) 24, 48 y 96 horas tras la sección del FLM (80,7 ± 1,8%, 62,2 ± 1,4% y 59,8 ± 1,6%, n = 369, n = 304 y n = 400 medidas, respectivamente; Figura 33H, barras azules), en comparación con la situación control (100,0 ± 4,2%, n = 1820; Figura 33H, barra negra). Además, se observó que al tiempo más corto analizado, 24 horas, presentó una densidad óptica significativamente mayor que el resto (p < 0,001), indicando así la degeneración progresiva de los procesos axonales positivos para calretinina. Resultados 121 Figura 32. Demostración de la lesión del FLM y del TAD en la rata. A, B: Sección mesencefálica de un animal con el tracto ascendente de Deiters (TAD, A) o el fascículo longitudinal medial (FLM, B) seccionado. Nótese la ausencia de axones positivos para calretinina en dicho tracto así como la aparición de la cicatriz glial en el tejido señalado por los asteriscos. C, D: Demostración mediante tinción de Nissl de la lesión unilateral del TAD (C) o del FLM (D), señalando con flechas el tejido cicatricial producido por la cuchilla. En todas las imágenes los FLM están contorneados por círculos discontinuos. Las líneas verticales discontinuas señalan la línea media. Barra de calibración: 300 µm. Por otro lado, en los animales en los que se seccionó el TAD se observaron diferencias significativas en los tres grupos post-lesión con respecto al grupo control (p < 0,001). Así, se obtuvo una densidad óptica en el neuropilo de 80,0 ± 3,2%, 64,6 ± 4,2% y 90,2 ± 2,8% a las 24, 48 y 96 horas post-lesión (n = 180, n = 233, n = 325, respectivamente; Figura 33H, barras verdes), con respecto a la densidad óptica durante la situación control. Además, la densidad óptica de calretinina 48 horas post-lesión fue significativamente menor (p < 0,001) que a 24 y 96 horas. Asimismo, también se encontraron diferencias entre 24 y 96 horas tras la axotomía (p = 0,012). Resultados 122 Figura 33. Curso temporal a corto plazo de los cambios en la cobertura sináptica en el neuropilo de las motoneuronas del recto medial deaferentadas. A-G: Fotomicrografías obtenidas por microscopía confocal de la subdivisión recto medial de la rata identificada mediante rodamina (rojo) y tras la inmunofluorescencia para calretinina (CR, blanco) en control (G) y 24, 48 o 96 horas tras la sección del TAD (A-C, respectivamente) o del FLM (D-F, respectivamente). Barra de calibración: 100 µm. H: Histogramas comparando la densidad óptica de calretinina (expresada en porcentaje con respecto al control) en la condición control (barra negra) y 24, 48 o 96 horas tras la axotomía del TAD (barras verdes) o del FLM (barras azules). Los valores mostrados corresponden a la media ± EEM; 180 ≤ n ≤ 1820 medidas de densidad óptica. Se señalan las diferencias significativas respecto al grupo control (*), entre puntos de una misma lesión (•) y entre ambas lesiones en un mismo punto temporal (#; p < 0,05; ANOVA de dos factores, test Holm-Sidak). Resultados 123 Entre ambos tipos de lesiones solo se observaron diferencias significativas a 96 horas post-lesión (p < 0,001). Estos resultados indicaron que tras la sección unilateral del TAD, se produjo una bajada progresiva en la inmunorreactividad frente a calretinina hasta 48 horas postdeaferentación, para más tarde aumentar a 96 horas tras la lesión, siendo significativamente mayor que el resto de grupos post-lesión. Este resultado indicaría un posible mecanismo compensatorio de crecimiento y ramificación axonal, desencadenado en respuesta a la deaferentación. Asimismo, y al igual que se hiciera en el gato, se estudió, también mediante microscopía confocal, la distribución y cantidad de botones positivos para calretinina alrededor del cuerpo celular de las motoneuronas del recto medial control (Figura 34G y H), y tras la sección unilateral del TAD o del FLM a 24, 48 y 96 horas post-lesión (Figura 34A y B; Figura 34C y D; Figura 34E y F, respectivamente). En primer lugar se estudió la evolución temporal de la cobertura sináptica sobre la superficie somática de las motoneuronas. La cobertura se midió como porcentaje del perímetro somático ocupado por los botones marcados con calretinina. En control, las motoneuronas del recto medial presentaron un 19,6 ± 0,5% del perímetro somático cubierto por terminaciones inmunopositivas para calretinina (n = 307 células; Figura 35A, barra negra). La sección del TAD (Figura 35A, barras verdes) o del FLM (Figura 35A, barras azules) redujo significativamente el porcentaje de perímetro cubierto por axones terminales inmunorreactivos para calretinina en todos los tiempos post-lesión medidos (p < 0,001, ANOVA de dos factores, Test Holm-Sidak para comparaciones múltiples), salvo 24 horas tras la lesión del FLM (p = 0,631). Sin embargo, los resultados obtenidos para los dos tipos de lesiones fueron diferentes. En los animales con el TAD seccionado, se observó una caída progresiva hasta 48 horas en el perímetro somático cubierto por botones calretinina (11,0 ± 0,5% y 6,2 ± 0,4%, n = 95 y n = 80, para 24 y 48 horas, respectivamente), que se recuperó a 96 horas post-lesión (13,2 ± 0,8%, n = 78), siendo diferente de los grupos experimentales a tiempos más cortos (p = 0,049 y p < 0,001 para 24 y 48 horas, respectivamente). Por el contrario, en los animales carentes de la proyección del NMOE, disminuyó la cobertura de calretinina en las motoneuronas con el tiempo, que fue máxima a 96 horas post-lesión (7,0 ± 0,3%, n = 99). Además, en estos animales se cuantificaron diferencias significativas (p < 0,001) entre los diferentes grupos post-lesión. Resultados 124 Figura 34. Cambios en la cobertura sináptica somática tras la deaferentación selectiva de las motoneuronas del recto medial de la rata. Imágenes de microscopía confocal de las neuronas motoras del recto medial, identificadas mediante rodamina (rojo), y botones sinápticos inmunorreactivos a calretinina (blanco) en control (G, H) y 24 (A, B) 48 (C, D) o 96 horas (E, F) tras la sección unilateral del TAD o del FLM, respectivamente. Barra de calibración: 25 µm. Resultados 125 Figura 35. Curso temporal de los cambios en la cobertura sináptica somática en las motoneuronas del recto medial de la rata tras la deaferentación selectiva. A: Diagrama de barras donde se muestra el porcentaje de perímetro somático de neuronas del recto medial cubierto por botones inmunorreactivos para calretinina (CR) en control (barra negra) y 24, 48 o 96 horas tras la sección del TAD (barras verdes) o del FLM (barras azules). Los datos se presentan como los valores medios ± EEM; 78 ≤ n ≤ 307 células. Se señalan las diferencias significativas respecto al grupo control (*), entre puntos de una misma lesión (•) y entre ambas lesiones en un mismo punto temporal (#; p < 0,05; ANOVA de dos factores, test Holm-Sidak). B y C: Diagramas de barras como en A pero representando el perímetro somático (B) y el número de botones calretinina alrededor del soma (C). Resultados 132 Figura 39. La cuantificación del porcentaje de motoneuronas inmunopositivas para neurotrofinas fue mayor en el sistema oculomotor que en los núcleos facial e hipogloso. A, B: Histogramas que comparan la proporción de motoneuronas (Mns) inmunorreactivas para BDNF (A) y NT-3 (B) en los núcleos oculomotores (NMOC, NMOT y NMOE, barras azules) y en los núcleos facial (barras naranjas) e hipogloso (HIPO, barras burdeos). Los datos se presentan como los valores medios ± EEM; 84 ≤ n ≤ 520 células. C: Histogramas como en A y B pero representando la densidad óptica para NGF en el neuropilo de los núcleos motores troncoencefálicos analizados. Los datos se presentan como los valores medios ± EEM; 210 ≤ n ≤ 433 medidas de densidad óptica. Los asteriscos señalan diferencias significativas entre los grupos señalados (p < 0,05; ANOVA de un factor, test Holm-Sidak). Resultados 133 4.8.4. Presencia de neurotrofinas en los músculos craneales Mediante Western Blot se estudió la presencia de los factores neurotróficos BDNF, NT-3 y NGF en la musculatura extraocular, así como en el músculo buccinador y la lengua, inervados por las motoneuronas de los núcleos facial e hipogloso, respectivamente. Los tres pares de músculos extraoculares fueron procesados juntos, en la misma muestra. Las neurotrofinas analizadas estuvieron presentes en todos los músculos estudiados. Así, obtuvimos una banda de peso molecular alrededor de los 13 kDa para las tres neurotrofinas, correspondiente con las formas maduras, además de una serie de bandas de peso molecular mayor relacionadas con las formas precursoras. De todas ellas, nos centramos en las bandas de 37, 35 y 27 kDa para BDNF, NT-3 y NGF, respectivamente, correspondientes a las isoformas pro-neurotrofinas (Figura 40). La cantidad de proteína total de BDNF, NT-3 y NGF fue cuantificada mediante análisis de densidad óptica, y los valores obtenidos fueron normalizados a partir de los datos medidos para la musculatura extraocular. Así, la musculatura extraocular presentó una cantidad mayor (p < 0,001, ANOVA de un factor, Test Holm-Sidak para comparaciones múltiples) de proteína madura que el músculo buccinador y la lengua para las neurotrofinas BDNF (100%, 38,3 ± 7,5%, 30,9 ± 9,0%; Figura 41A), NT-3 (100%, 45,7 ± 6,5%, 29,1 ± 5,3%; Figura 41B) y NGF (100%, 39,4 ± 7,4%, 51,4 ± 12,5%; Figura 41C), respectivamente. La cantidad de proteína madura en el músculo buccinador y la lengua solo fue diferente para el NT-3 (p = 0,023). En relación a la isoforma proneurotrofina, la cantidad total varió dependiendo del factor neurotrófico. No se detectaron diferencias significativas entre los músculos estudiados, para las neurotrofinas BDNF (100%, 157,3 ± 29,7%, 228,0 ± 86,0% para la musculatura extraocular, buccinador y lengua, respectivamente, p = 0,245; Figura 41D) y NGF (100%, 58,7 ± 20,5%, 70,8 ± 19,6% para la musculatura extraocular, buccinador y lengua, respectivamente, p = 0,177; Figura 41F). Solo la isoforma pro-NT-3 fue estadísticamente más elevada en la musculatura extraocular que en el buccinador y la lengua (100%, 64,8 ± 7,5%, 51,5 ± 7,6%, respectivamente, p < 0,001, ANOVA de un factor, Test Holm-Sidak para comparaciones múltiples; Figura 41E). Finalmente, medimos la ratio entre la cantidad de proteína madura y la isoforma pro-neurotrofina, donde ratios mayores de 1 determinaron una cantidad más elevada de formas maduras que de isoformas inmaduras. Así, para la neurotrofina BDNF medimos una cantidad más elevada de la forma pro-neurotrofina que de la forma madura en los todos los músculos analizados (Figura 41G), mientras que la ratio fue estadísticamente menor (p < 0,001, ANOVA de un factor, Test Holm-Sidak para comparaciones múltiples) en el buccinador (0,2 ± 0,04) y la lengua (0,1 ± 0,03) que en la musculatura extraocular (0,7 ± 0,1). Para los factores NT-3 (1,3 ± 0,3, 0,9 ± 0,1 y 0,8 ± 0,3 para los músculos extraoculares, buccinador y lengua, respectivamente; Figura 41H) y NGF (0,1 ± 0,04, Resultados 134 0,1 ± 0,02 y 0,1 ± 0,02 para los músculos extraoculares, buccinador y lengua, respectivamente; Figura 41I) no se encontraron diferencias estadísticas entre los tres músculos craneales estudiados. Sin embargo, solo para la musculatura extraocular, con la neurotrofina NT-3 obtuvimos una ratio mayor de 1, que no se observó en los otros músculos. En el caso del NGF, la cantidad de proteína inmadura fue mucho más elevada que la de la proteína madura en todos los músculos analizados. Figura 40. Presencia de neurotrofinas en los músculos craneales de rata. Western blot usando anticuerpos frente a los factores neurotróficos BDNF, NT-3 y NGF en los músculos extraoculares (ME), músculo buccinador y lengua para las formas pro-neurotrofinas (37, 35 y 27 kDa, respectivamente) y maduras (13 kDa), tomando como referencia la presencia de GAPDH (37 kDa). Se observan bandas de diferente peso molecular representando otras isoformas de las distintas neurotrofinas. Resultados 135 Figura 41. Análisis de la cantidad de neurotrofina en los músculos craneales de la rata. A-C: Diagramas de barras que comparan los valores densitométricos de la forma madura (13 kDa) de BDNF (A), NT-3 (B) y NGF (C) en los músculos extraoculares (ME, barras azules), músculo buccinador (BUCC, barras naranja) y lengua (barras burdeos). D-F: Diagramas de barras como en A-C pero comparando los valores densitométricos de la forma pro-neurotrofina de BNDF (D), NT-3 (E) y NGF (F). G-I: Ratio forma madura/pro-neurotrofina en los músculos craneales analizados para los factores BDNF (G), NT-3 (H) y NGF (I). Los datos se presentan como los valores medios ± EEM; n = 6 ratas. Los asteriscos señalan las diferencias significativas respecto a la musculatura extraocular mientras que almohadilla indica diferencias con el músculo buccinador (p < 0,05; ANOVA de un factor, test Holm-Sidak). Resultados 136 DISCUSIÓN Discusión 139 5. DISCUSIÓN En el presente trabajo se han estudiado los efectos de la deaferentación selectiva de las motoneuronas del recto medial del gato adulto. De este modo, se ha caracterizado el papel de sus dos principales aferencias sobre los movimientos oculares en el plano horizontal, así como las propiedades de disparo de dichas neuronas motoras en ausencia de cualquiera de las dos entradas. Ambas lesiones produjeron alteraciones durante los movimientos oculares, tanto espontáneos, como inducidos por estimulación vestibular. Estos cambios también se reflejaron en las propiedades de disparo de las motoneuronas del recto medial, disminuyendo su sensibilidad a la posición y a la velocidad ocular durante ambos tipos de movimientos. Sin embargo, los efectos producidos variaron en magnitud y duración según el tipo de lesión. Así, los animales con el TAD seccionado presentaron una recuperación funcional tanto del comportamiento ocular como de las propiedades de descarga de las neuronas motoras, que no se observó en los animales con lesión en el FLM. Por otra parte, los resultados electrofisiológicos correlacionaron con los experimentos morfológicos. Se observó una disminución en la cobertura sináptica somática a corto plazo tras la deaferentación selectiva. Sin embargo, solo en los animales privados de la entrada vestibular se verificó una recuperación a largo plazo tras la lesión. Resultados anatómicos semejantes se obtuvieron en experimentos en la rata 24, 48 o 96 horas tras la sección del TAD o del FLM, que confirmaron la consistencia de los resultados obtenidos en el gato, y proporcionaron un curso temporal más afinado de los cambios sinápticos que ocurren tras ambas lesiones. Estos resultados señalan una mayor capacidad plástica de los circuitos neuronales en los animales con lesión en el TAD que en los animales carentes de la proyección de las neuronas internucleares del NMOE, indicando la posible generación de nuevas colaterales axonales desde las aferencias no lesionadas. Estos ajustes plásticos pueden estar mediados por factores tróficos, como las neurotrofinas, cuyo contenido aumenta en el soma de las motoneuronas deaferentadas, y que pueden participar en la regulación de la expresión de ciertas proteínas de regeneración o crecimiento axonal, como la proteína GAP-43. Los cambios en la presencia de neurotrofinas tras la lesión, junto con los resultados obtenidos en trabajos previos (Benítez-Temiño y col., 2004; Davis-López de Carrizosa y col., 2009, 2010; Morcuende y col., 2011, 2013), han puesto de manifiesto la particular sensibilidad Discusión 140 de las motoneuronas oculomotoras a los factores neurotróficos, como se discutirá a continuación. Por otra parte, estas neuronas presentan ciertas propiedades intrínsecas que las hacen menos vulnerables a la degeneración que tiene lugar durante la ELA (Nimchinsky y col., 2000), como se discutirá con detalle más adelante. En este marco contextual de plasticidad neuronal, se estudió la distribución de neurotrofinas en el sistema oculomotor control, observándose que las motoneuronas oculomotoras presentan un patrón neurotrófico más diverso en comparación con otras neuronas motoras vulnerables a neurodegeneración, lo que les podría conferir una resistencia fisiológica y capacidad plástica mayores frente a diferentes procesos lesivos o neurodegenerativos. 5.1. Correlatos anatómicos La población de motoneuronas del recto medial se localizó mediante su activación antidrómica, tras la estimulación del III par craneal, en la porción más rostral del NMOC, y en posición dorsolateral. Hacia regiones más caudales dentro del NMOC, las neuronas motoras del recto medial se extendieron hacia posiciones ventrolaterales. Estas premisas fueron confirmadas mediante análisis histológico, corroborando estudios previos, tanto morfológicos como electrofisiológicos en gato (Akagi, 1978; Baker y Highstein, 1978; Gacek, 1974; Miyazaki, 1985; Naito y col., 1974) y rata (Glicksman, 1980; Labanderia-García y col., 1983), que sugieren la existencia de dos subgrupos en la subdivisión del recto medial: un subgrupo dorsolateral que abarca las 3/4 partes más rostrales del núcleo, y un subgrupo, menor y ventrolateral al FLM, más caudal. La posición anatómica de la proyección contralateral de las neuronas internucleares del NMOE ha sido ampliamente estudiada morfológica (Büttner-Ennever, 2006; Graybiel y Hartwieg, 1974) y electrofisiológicamente (Highstein y Baker, 1978; Fuchs y col., 1988). El FLM se observó en una posición medial justo debajo del suelo del IV ventrículo, tanto en gatos como en ratas. Por su parte, el curso de los axones vestibulares del TAD en el tronco del encéfalo ha sido menos investigado. Buchanan (1937) y Gacek (1971) describieron por primera vez el TAD en gatos como una proyección que se originaba desde neuronas vestibulares de segundo orden de la región ventral del NVL homolateral, y que discurría a través de la protuberancia, lateral al FLM. En el presente trabajo, usando biocitina como marcador anterógrado, se ha comprobado que los axones procedentes del NMOE o del NVL terminaron en la subdivisión del recto medial del NMOC contralateral u homolateral, respectivamente. Además, los axones originados desde Discusión 141 ambos núcleos cursan en paralelo. Otras autores han sugerido la existencia de una pequeña proyección contralateral del TAD (Furuya y Markham, 1981), aunque nuestros resultados, junto con los de otros estudios anteriores (Nguyen y col., 1999a), no apoyan esta idea. Baker y Highstein (1978) observaron la activación ortodrómica a corta latencia de las motoneuronas del recto medial de gatos tras la estimulación eléctrica del NVL. Esta activación desaparecía tras realizar una lesión transversal a nivel del tegmento pontino, entre el FLM y el brachium conjuntivo (Baker y Highstein, 1978; Reisine y Highstein, 1979). A partir de estos trabajos previos, se realizó la sección unilateral del TAD, usando las mismas coordenadas anteroposteriores que para la sección del FLM, pero en posiciones 0,5 y 0,2 mm laterales a la línea media en el gato y la rata, respectivamente, para evitar lesionar el FLM. Además, mediante inmunohistoquímica frente a calretinina, que marca ambas proyecciones (Baizer y Baker, 2006; de la Cruz y col., 1998; Highstein y Holstein, 2006), se pudo visualizar la lesión a nivel del tronco del encéfalo. Asimismo, se observó una reducción del marcaje frente a calretinina a nivel de la subdivisión del recto medial tras la deaferentación selectiva, demostrando la localización adecuada de la lesión y la interrupción de las vías que conectan las motoneuronas del recto medial con sus aferencias. 5.2. Efectos a corto plazo en los movimientos oculares y las propiedades de disparo tras la deaferentación selectiva de las motoneuronas del recto medial La sección a corto plazo del TAD o del FLM causó alteraciones durante los movimientos espontáneos del ojo homolateral a la lesión. La lesión del FLM produjo la incapacidad del ojo afectado de cruzar la posición primaria hacia posiciones mediales, en la dirección de aducción. De acuerdo con estos resultados, se ha descrito que tras la sección del FLM se produce el síndrome de oftalmoplejia internuclear, que se caracteriza por la imposibilidad de realizar movimientos de aducción del ojo homolateral a la lesión, sin impedir los movimientos de vergencia (de la Cruz y col., 2000; Delgado-García y col., 1986b; Highstein y Baker, 1978). Además, se midió una reducción del rango motor, así como de la amplitud y la velocidad máxima de los sacádicos, tras ambas lesiones. Estos efectos también se observaron en los animales con el TAD lesionado, aunque con menos severidad. De ello se deduce que el TAD tiene una señal insuficiente tanto de velocidad como de posición para mantener por sí solo el patrón de disparo