Análisis de la diversidad genética en poblaciones naturales de especies vegetales amenzadas: Ilex Perado SSP. Lopezilloi (Aquifoliaceae), Silene Nocteolens (Caryophyllaceae) y Sorbus Aria (Rosaceae)

i T TE ES SI IS S D DO OC CT TO OR RA AL L A AN NÁ ÁL LI IS SI IS S D DE E L LA A D DI IV VE ER RS SI ID DA AD D G GE EN NÉ ÉT TI IC CA A E EN N P PO OB BL LA AC CI IO ON NE ES S N NA AT TU UR RA AL LE ES S D DE E E ES SP PE EC CI IE ES S V VE EG GE ET TA AL LE ES S A AM ME EN NA AZ ZA AD DA AS S: : I IL LE EX X P PE ER RA AD DO O S SS SP P. . L LO OP PE EZ ZL LI IL LL LO OI I ( (A AQ QU UI IF FO OL LI IA AC CE EA AE E) ), , S SI IL LE EN NE E N NO OC CT TE EO OL LE EN NS S ( (C CA AR RY YO OP PH HY YL LL LA AC CE EA AE E) ) Y Y S SO OR RB BU US S A AR RI IA A ( (R RO OS SA AC CE EA AE E) ) EDNA AMADA GONZÁLEZ GONZÁLEZ Las Palmas de Gran Canaria 2011 v D. JUAN LUIS GÓMEZ PINCHETTI, SECRETARIO DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA, CERTIFICA, Que el Consejo de Doctores del Departamento en su sesión de fecha hoy tomó el acuerdo de dar el consentimiento para su tramitación a la tesis doctoral titulada “ANÁLISIS DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA EN POBLACIONES NATURALES DE ESPECIES VEGETALES AMENAZADAS: ILEX PERADO SSP. LOPEZLILLOI (AQUIFOLIACEAE), SILENE NOCTEOLENS (CARYOPHYLLACEAE) Y SORBUS ARIA (ROSACEAE)”, presentada por la doctoranda Dª. Edna Amada González González y dirigida por los Doctores D. Pedro A. Sosa y D. Miguel Ángel González Pérez. Y para que así conste, y a efectos de lo previsto en el Artº 73.2 del Reglamento de Estudios de Doctorado de esta Universidad, firmo la presente en Las Palmas de Gran Canaria, 30 de noviembre de 2011. Fdo.: Juan Luis Gómez Pinchetti Departamento de Biología Universidad de Las Palmas de Gran Canaria vii PROGRAMA DE DOCTORADO: ECOLOGÍA Y GESTIÓN DE LOS RECURSOS VIVOS MARINOS DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA ANÁLISIS DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA EN POBLACIONES NATURALES DE ESPECIES VEGETALES AMENAZADAS: ILEX PERADO SSP. LOPEZLILLOI (AQUIFOLIACEAE), SILENE NOCTEOLENS (CARYOPHYLLACEAE) Y SORBUS ARIA (ROSACEAE) Tesis Doctoral presentada por Dña. Edna Amada González González Dirigida por el Dr. Pedro Sosa Henríquez y el Dr. Miguel Ángel González Pérez El Director, El Director, La Doctoranda, Las Palmas de Gran Canaria, 30 de noviembre de 2011. ix Pedro Sosa Henríquez, Catedrático de Botánica del Departamento de Biología de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, y Miguel Ángel González Pérez Doctor en Biología y Personal Investigador del Departamento de Biología de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria; Hacen constar: Que el trabajo de investigación “ANÁLISIS DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA EN POBLACIONES NATURALES DE ESPECIES VEGETALES AMENAZADAS: ILEX PERADO SSP. LOPEZLILLOI (AQUIFOLIACEAE), SILENE NOCTEOLENS (CARYOPHYLLACEAE) Y SORBUS ARIA (ROSACEAE)” realizado bajo nuestra dirección por la licenciada en Biología Ambiental Dña. Edna Amada González González, se considera finalizado y puede ser presentado para su exposición y defensa como Tesis Doctoral en el Departamento de Biología de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. Fdo.: Pedro Sosa Henríquez Fdo.: Miguel Ángel González Pérez Las Palmas de Gran Canaria, 30 de noviembre de 2011. xi TESIS DOCTORAL ANÁLISIS DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA EN POBLACIONES NATURALES DE ESPECIES VEGETALES AMENAZADAS: ILEX PERADO SSP. LOPEZLILLOI (AQUIFOLIACEAE), SILENE NOCTEOLENS (CARYOPHYLLACEAE) Y SORBUS ARIA (ROSACEAE) EDNA AMADA GONZÁLEZ GONZÁLEZ LAS PALMAS DE GRAN CANARIA 2011 xiii A mi familia que tanto añoro, por su amor y apoyo a través de la distancia. xv A Ag gr ra ad de ec ci im mi ie en nt to os s Al Departamento de Biología y a la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria por proporcionar los recursos y el lugar de trabajo para la realización de esta investigación. A mis tutores, Dr. Pedro Sosa Henríquez y Dr. Miguel Ángel González Pérez, que con toda dedicación y paciencia me han enseñado las técnicas de laboratorio, los principios esenciales de la Genética de la Conservación y, además, han pulido mis manuscritos. Al Ministerio de Asuntos Exteriores y Cooperación y a la Agencia Española de Cooperación Internacional y Desarrollo que han depositado su confianza en mí al sufragar mis estudios a través de una beca MAECAECID. Al Programa de Mecenazgo Universitario INNOVA Canarias 2020® por la concesión de una Ayuda a mi investigación, especialmente a Nogal Metal, S.L y Vidrieras Canarias, S.A. por su patrocinio. Al Dr. Takeshi Torimaru por su cooperación tan desinteresada al compartir información no publicada sobre los microsatélites desarrollados para Ilex leucoclada. A Ángel Fernández y Cito Chinea (Parque Nacional de Garajonay), a Manuel Marrero, Eduardo Carqué y Manuel Izquierdo (Parque Nacional del Teide) y a Álvaro Rodríguez Felipe (Parque Nacional de la Caldera de Taburiente); también al personal de los parques nacionales de Cabañeros, Aigüestortes, Picos de Europa y Sierra Nevada por su asistencia en la recolección de muestras. A Nancy Cabanillas, Alicia Escandell, Juan Ojeda, Elisabeth Rivero y Carolina Medina por su colaboración en el muestreo y la recolección de datos de campo. xvi Al Dr. Gerard Oostermeijer por brindarnos su cooperación tanto en campo como en el análisis de los datos de Silene nocteolens. A Agustín Naranjo por su cooperación en campo y por la creación del mapa de distribución de las muestras de Silene nocteolens. Al Dr. Francisco Torrado por su ayuda en el conocimiento del complejo geológico Teide – Pico Viejo. Al Dr. Arnoldo Santos-Guerra por la revisión de la taxonomía de Silene. A la Dra. Pilar García por ayudarnos en la clonación de Sorbus aria. A todos los becarios y el resto del personal investigador del Departamento de Biología de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. De manera muy especial a Elisabet Rivero Santana, Técnico de Laboratorio, de quien recibí un gran respaldo en el procesamiento de las muestras. A mi familia por su amor y apoyo emocional: A mi padre por las palabras de aliento y motivación, a mi madre por sus consejos y por las horas de intercesión, a mi hermano y mi cuñada por escribirme y recordarme lo mucho que se enorgullecen de mí, a mi hermana por el contacto diario y buen humor… Fucho a todos! A mi abuelita postiza (Doña Gilma) por acompañar a mis viejos y recordarme en sus oraciones; a los pastores Suso y Hortencia y a la familia Pérez-Reyes por todas atenciones… muchas gracias. Pero por sobre todas las cosas al “Único y Sabio Dios” (Judas 1:25) que es “mi amparo, fortaleza y pronto auxilio en las tribulaciones” (Salmos 46:1); a quien debo todos mis logros sean grandes o pequeños. xvii C Co on nt te en ni id do o ÍNDICE DE TABLAS xxiii ÍNDICE DE FIGURAS xxv ANTECEDENTES 1 1.1. INTRODUCCIÓN 3 1.1.1. CONSERVACIÓN GENÉTICA DE LA BIODIVERSIDAD VEGETAL 4 1.1.2. MARCADORES MOLECULARES 7 1.2. GENÉTICA DE POBLACIONES 11 1.2.1. VARIABILIDAD GENÉTICA 12 1.2.1.1. RIQUEZA ALÉLICA 12 1.2.1.2. POLIMORFISMO 13 1.2.1.3. HETEROCIGOSIDAD OBSERVADA 14 1.2.1.4. HETEROCIGOSIDAD ESPERADA 14 1.2.2. ESTRUCTURACIÓN GENÉTICA DE LAS POBLACIONES 15 1.2.2.1. EQUILIBRIO HARDY-WEINBERG 16 1.2.2.2. ANÁLISIS DE AUTOCORRELACIÓN ESPACIAL 17 1.2.3. DIFERENCIACIÓN GENÉTICA ENTRE LAS POBLACIONES 18 1.2.3.1. DISTANCIA GENÉTICA 18 1.2.3.2. COEFICIENTE DE DIFERENCIACIÓN GENÉTICA Y AMOVA 19 1.2.3.3. DENDROGRAMAS UPGMA Y NJ 21 1.2.3.4. ANÁLISIS DE COORDENADAS PRINCIPALES 22 1.2.3.5. ANÁLISIS BAYESIANO 23 1.2.4. SISTEMAS DE CRUZAMIENTO 24 OBJETIVOS 27 2.1. OBJETIVO GENERAL 29 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 29 EL COMPLEJO ILEX 31 3.1. DESCRIPCIÓN DE LAS ESPECIES ESTUDIADAS 33 xxv Í Ín nd di ic ce e d de e F Fi ig gu ur ra as s Fig. 1 Ilex perado ssp. lopezlilloi ................................................................................................. 34 Fig. 2 Distribución de Ilex perado ssp. lopezlilloi en el Parque Nacional de Garajonay ............. 35 Fig. 3 Ilex perado ssp. platyphylla............................................................................................... 36 Fig. 4 Ilex canariensis ................................................................................................................. 38 Fig. 5 Ilex azorica ........................................................................................................................ 39 Fig. 6 Procedencia de las muestras recolectadas del género Ilex ............................................. 42 Fig. 7 Perfil de amplificación utilizado para el género Ilex .......................................................... 48 Fig. 8 Representación gráfica de los valores medios de FST obtenidos entre las poblaciones y taxones estudiados. .......................................................................................................... 56 Fig. 9 Dendrograma UPGMA basado en las distancias genéticas de Nei para las poblaciones del género Ilex analizadas ................................................................................................ 59 Fig. 10 Neighbor-Joining individual para las poblaciones del género Ilex analizadas ............... 60 Fig. 11 Análisis de coordenadas principales para los individuos de las poblaciones analizadas del género Ilex ................................................................................................................... 61 Fig. 12 Diagrama de barras para las proporciones inferidas con el análisis bayesiano en las poblaciones de Ilex ........................................................................................................... 62 Fig. 13 Silene nocteolens ............................................................................................................ 76 Fig. 14 Distribución de Silene nocteolens en el Parque Nacional del Teide .............................. 77 Fig. 15 Plántulas de Silene nocteolens germinadas a partir de semillas procedentes de Montaña Blanca y Pico Viejo ............................................................................................ 80 Fig. 16 Perfil de amplificación SASN60 ...................................................................................... 88 Fig. 17 Perfil de amplificación SASN55 ...................................................................................... 89 Fig. 18 Distribución geográfica de los individuos de Silene nocteolens según parcelas ........... 94 Fig. 19 Correlograma para las muestras de Silene nocteolens del grupo uno de Montaña Blanca ............................................................................................................................... 95 Fig. 20 Correlograma para las muestras de Silene nocteolens del grupo dos de Montaña Blanca ............................................................................................................................... 95 Fig. 21 Dendrograma UPGMA basado en las distancias genéticas de Nei entre estadios por población de Silene nocteolens ........................................................................................ 98 Fig. 22 Análisis de coordenas principales para los individuos naturales de Silene nocteolens a partir de las distancias genéticas de Nei por estadios y población .................................. 99 Fig. 23 Análisis de coordenadas principales basado en los valores de FST para los distintos estadios de vida de las poblaciones naturales de Silene nocteolens ............................. 100 Fig. 24 Gráficos para la determinación del valor más probable de K siguiendo el análisis bayesiano. LnPPD vs K e Incremento de LnPPD vs K ................................................... 101 Fig. 25 Diagrama de barras para las proporciones inferidas (K = 2) con el análisis bayesiano en las poblaciones de Silene nocteolens ............................................................................. 102 xxvi Fig. 26 Coeficiente de endogamia por estadio de vida y correlación entre la mortandad y el coeficiente de endogamia en la población de Silene nocteolens de Montaña Blanca ... 104 Fig. 27 Sorbus aria .................................................................................................................... 120 Fig. 28 Ubicación de Sorbus aria en el Parque Nacional de la Caldera de Taburiente ........... 121 Fig. 29 Ubicación de Sorbus aria en el Parque Nacional del Teide ......................................... 122 Fig. 30 Placa mostrando colonias de células competentes tras la clonación .......................... 131 Fig. 31 Perfil de amplificación para colonias ............................................................................ 132 Fig. 32 Perfil de amplificación para la secuenciación de fragmentos de ADN ......................... 133 Fig. 33 Perfil de amplificación SASN5572 ................................................................................ 137 Fig. 34 Perfil de amplificación SASN57 .................................................................................... 137 Fig. 35 Perfil de amplificación SASN58 .................................................................................... 137 Fig. 36 Foto del gel de electroforesis para la reamplificación de colonias ............................... 138 Fig. 37 Secuencias de las colonias (células clonadas con Sorbus aria) para el microsatélite SA07 ................................................................................................................................ 139 Fig. 39 Distribución de la ploidía y ocurrencia de alelos exclusivos en Sorbus aria ................ 140 Fig. 38 Perfil de fragmentos del microsatélite SA07 observado en Sorbus aria y secuencias correspondientes de la clonación de estos fragmentos que confirman la naturaleza triploide de esta especie en Canarias ............................................................................. 140 Fig. 40 Dendrograma UPGMA basado en las distancias genéticas de Nei entre las poblaciones de Sorbus aria ................................................................................................................. 147 Fig. 41 Neighbor-Joining individual para las poblaciones de Sorbus aria ................................ 148 Fig. 42 Análisis de coordenadas principales para las poblaciones naturales de Sorbus aria .. 149 Fig. 43 Diagrama de barras para las proporciones inferidas con el análisis bayesiano para las poblaciones de Sorbus aria............................................................................................. 150 ~1~ ANTECEDENTES A An nt te ec ce ed de en nt te es s ~3~ ANTECEDENTES 1 1. .1 1. . I In nt tr ro od du uc cc ci ió ón n Los recursos biológicos sustentan prácticamente todas nuestras necesidades: alimentos, medicinas, prendas de vestir, materiales de construcción, oxígeno liberado por las plantas, control del clima, ciclado de nutrientes por los bosques y las nuevas tecnologías van revelando muchos usos potenciales día a día (Beattie, 1995). Por desgracia parece que solo empezamos a apreciar nuestros recursos cuando estos comienzan a mermar. Según Frankel et al. (1995), en Inglaterra, donde la industrialización germinó antes que en otros países europeos, se podían reconocer los cambios en la vegetación ya a finales del siglo XIX. De ahí que desde entonces se haya atribuido gran parte de la pérdida de la riqueza biológica a los efectos de las actividades humanas relacionadas con el progreso industrial. Pese a todo, este también fue el génesis de los movimientos de conservación y de la percepción de la biodiversidad. El hito histórico de la conservación de la naturaleza fue el establecimiento del Parque Nacional Yellowstone en Estados Unidos hacia 1874. Aunque en un principio el énfasis estuvo en la preservación de los ecosistemas; la aparición del concepto “biodiversidad”, más de un siglo después, significó la integración de la ecología y la genética en términos de conservación, ya que vino a representar la diversidad en todos y cada uno de los niveles de la organización biológica: comunidades, especies, organismos y genes (CBD, 1992; Frankel et al., 1995; Frankham et al., 2009). En este aspecto, los recursos genéticos están teniendo más relevancia en la conservación de los recursos naturales tal como se ve reflejado en el propio Convenio sobre la Diversidad Biológica (CBD, 1992; Comisión Europea, 2006). Por otro lado, es un hecho ampliamente reconocido que las islas oceánicas, como las Canarias, son extensiones territoriales que atesoran una gran diversidad biológica; muchas veces exclusiva de cada isla en particular. Esa amplia diferenciación biológica no evita que las poblaciones de especies singulares y el número de individuos en cada población sean muy bajos, razón por la cual es imprescindible actuar antes de que la erosión genética nos ANTECEDENTES ~4~ impida conservar su riqueza alélica (Fernández-Palacios y Martín Esquivel, 2001; Francisco-Ortega y Santos, 2001; González-Pérez et al., 2009b; Sosa et al., 2010a). Sin embargo, la conservación de la diversidad biológica es un concepto en el que se encuentran implicados aspectos científicos, técnicos, sociológicos y económicos con el objetivo de implementar acciones específicas que finalicen en la reducción de los niveles actuales de pérdida de la biodiversidad (Bañares et al., 2002; Primack & Ros, 2002; Heywood & Iriondo, 2003). Por ello, previo a la planificación de la recuperación de una especie vegetal amenazada que se encuentre en regresión y con escasos efectivos, se debe conocer su estado biológico, identificar sus etapas críticas y averiguar las causas de las variaciones en etapas de vida demográficamente sensitivas (Schemske et al., 1994; Young & Clarke, 2000, Bañares et al., 2002; Bañares et al., 2004; González-Pérez et al., 2008; Sosa et al., 2010b). El estado de alta vulnerabilidad de las poblaciones de buena parte de los endemismos canarios no se debe solamente al impacto antropogénico, sino que también puede ser consecuencia de la propia dinámica de las poblaciones que tienen un reducido número de individuos; en las cuales, los fenómenos de aislamiento y consanguinidad son muy acusados. Por esto, se hace imprescindible redoblar los esfuerzos y desarrollar programas y proyectos de conservación que eviten que el desgaste genético en estos endemismos se torne irreversible, exhiba procesos de regresión por inestabilidad genética y/o demográfica y consecuentemente se produzca la extinción local de sus poblaciones (Silvertown & Charlesworth, 2001; Sosa, 2001; Oostermeijer et al., 2003; Frankham et al., 2009; Sosa et al., 2010b). 1 1. .1 1. .1 1. . C Co on ns se er rv va ac ci ió ón n G Ge en né ét ti ic ca a d de e l la a B Bi io od di iv ve er rs si id da ad d V Ve eg ge et ta al l La imperante necesidad de descubrir la riqueza genética contenida en las especies en riesgo ha dado paso al nacimiento de la Conservación Genética; una rama científica relativamente joven fundamentada en más de un siglo de avances en teoría evolutiva (incluyendo genética de poblaciones, genética cuantitativa, cultivo de plantas y crianza de animales) que se ha constituido en ~5~ ANTECEDENTES una disciplina cuantitativa cuya fortaleza recae en la fiabilidad de sus predicciones (Frankham et al., 2009). Según Frankham et al. (2009) la conservación genética es la aplicación de la genética teórica y técnica para reducir el riesgo de extinción en las especies amenazadas, con el fin último de preservar las especies como entidades dinámicas capaces de hacer frente a los cambios ambientales. Sin embargo, desde una perspectiva metodológica; es la población, más que la especie, la unidad funcional evolutiva y ecológica donde deberían concentrarse los esfuerzos multidisciplinarios para la conservación genética porque es en esta donde se producen los cambios genéticos y demográficos fundamentales que determinarán la viabilidad y, por ende, la capacidad adaptativa de las distintas especies (Schemske et al., 1994; Sosa et al., 2002). Además, la cantidad de variación genética en una población puede jugar un importante papel en el ecosistema por la relación que existe entre las especies (Frankham et al., 2009). Las aplicaciones más importantes de la genética de la conservación se derivan de la capacidad de ayudar a crear una imagen más precisa de los patrones y procesos de las especies en peligro de extinción. Particularmente, la cuantificación de la depresión endogámica, del tamaño efectivo de la población, de tamaño de la población mínima viable, de los niveles de variación genética y del flujo genético en poblaciones naturales; pueden proveer medidas específicas y comparables de cómo las poblaciones en riesgo están siendo afectadas (DeSalle & Amato, 2004). Se ha considerado a la demografía como el segundo pilar básico en el que se cimenta la biología de la conservación ya que se encarga de ponderar los procesos de natalidad, mortalidad, migración e inmigración que permiten conocer la distribución, estructura y dinámica poblacional en cada población para así comprender y explicar la situación actual de la especie amenazada y proyectar su situación previsible en el futuro. La caracterización estructural de una población toma como base la edad, el tamaño o los estadios de vida y proporciona los datos que permiten hacer aproximaciones matemáticas sobre cuyos resultados pueden apoyarse futuras actuaciones (García & Iriondo, 2002; Oostermeijer et al., 2003). ANTECEDENTES ~6~ Por lo tanto, los aportes para la conservación de las especies vegetales amenazadas no deben limitarse al descubrimiento de la diversidad genética existente en las poblaciones naturales, sino que también deben implementar la concatenación de esos resultados genéticos con la información generada en investigaciones demográficas y de biología reproductiva con el fin de poder ampliar el campo de visión sobre la situación específica de cada taxón. De esta manera se garantiza que la toma de decisiones y la planificación de estrategias de manejo en las especies vulnerables estén respaldadas de información fehaciente y actualizada (Bañares et al., 2002). Aunque se ha cuestionado la significancia de los factores genéticos para la conservación con base en que los factores demográficos, las fluctuaciones ambientales (estocasticidad) y las catástrofes pueden llevar a las poblaciones silvestres a la extinción antes que los factores genéticos tengan efecto; hay una clara base teórica y una creciente evidencia experimental de que los factores genéticos intervienen en la extinción porque pueden interactuar frecuentemente con las fluctuaciones demográficas, precipitando a las especies hacia la extinción (Frankham et al., 2009). En las últimas dos décadas la conservación genética ha progresado considerablemente de ser un campo meramente teórico en la biología de las poblaciones a convertirse en una disciplina empírica completamente desarrollada y esto ha sido gracias a los avances tecnológicos en genética molecular que han permitido el uso de marcadores moleculares neutrales en la biología de la conservación (Ouborg et al., 2010). Las emergentes técnicas moleculares hacen que hoy sea posible el estudio de las diferencias en la secuencia del ADN en sí, en cualquier especie (Allendorf & Luikart, 2007). Los marcadores moleculares han sido utilizados para una variedad de aplicaciones que incluyen el análisis de las relaciones genéticas entre individuos, la construcción de mapas de linaje, la selección asistida y los retrocruces, la genética de poblaciones y los estudios filogenéticos (Kalia et al., 2011); de hecho, su uso se ha extendido tan ampliamente a aspectos de conservación de especies amenazadas que algunos autores consideran que nos estamos acercando a la era de la conservación genómica (Allendorf et al., 2010; Ouborg et al., 2010). ~7~ ANTECEDENTES 1 1. .1 1. .2 2. . M Ma ar rc ca ad do or re es s M Mo ol le ec cu ul la ar re es s Los marcadores moleculares son fragmentos específicos del ADN que pueden ser identificados dentro del genoma cuya expresión permite un efecto cuantificable u observable que, además, puede detectarse fácilmente. Sin embargo, se habla de marcadores genéticos cuando estos se transmiten según las leyes básicas de la herencia mendeliana; por lo que no todos los marcadores moleculares se consideran marcadores genéticos (Nuez y Carrillo, 2000). En otras palabras, los marcadores genéticos son regiones del ADN que presentan variación en su secuencia sin que, necesariamente, se aprecien cambios sustanciales en las funciones del organismo. Por ello, se consideran herramientas útiles que han servido de base para la identificación de especies, cepas, híbridos, análisis de diversidad, recursos genéticos, determinación de paternidad, mapeo genómico con aplicación a genética de poblaciones, biología evolutiva, ecología molecular, genética de la conservación, etc. (Avise, 1994; Goldstein y Schlötterer, 1999; Chybicki y Burczyk, 2008). Un marcador molecular monomórfico es invariable en todos los organismos estudiados; pero cuando un marcador presenta diferencias en el peso molecular, actividad enzimática, estructura o sitios de restricción se dice que es polimórfico. A veces el grado de variación es tal que se denominan hipervariables (Frankham et al., 2009). Los marcadores moleculares pueden evaluarse desde que los individuos están en sus primeros estadios de desarrollo y se pueden aplicar usando a todo el individuo o solo parte de este. En términos generales existen dos tipos de marcadores moleculares: Marcadores Bioquímicos y Marcadores de ADN (Nuez y Carrillo, 2000). Los marcadores de ADN son porciones específicas de ADN formadas de secuencias cortas que se repiten. Ya que el número de repeticiones en estos marcadores es altamente variable entre los individuos, son efectivos para fines de caracterización. Existen varias técnicas para identificar marcadores de ADN, las cuales se pueden agrupar en tres categorías: las que aplican Hibridación, las que conllevan Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y las que combinan ambas metodologías (Nuez y Carrillo, 2000; Picca et al., 2002). ANTECEDENTES ~8~ La PCR, o reacción en cadena de la polimerasa, fue introducida por Mullis (Mullis et al., 1986; Allendorf & Luikart, 2007) y es una tecnología utilizada para multiplicar (sintetizar) in vitro fragmentos específicos de ADN con la finalidad de detectar una secuencia o gen conocido o desconocido en el genoma del individuo en estudio. Se basa en la amplificación de fragmentos de ADN a partir de secuencias de nucleótidos denominadas “cebadores”, que son capaces de reconocer una secuencia blanco para la cual el cebador es complementario. Una vez extraído y purificado el ADN del material a utilizar, los principales pasos del PCR son los siguientes: 1. Se separan las dos hebras (cadenas) de ADN; es decir, se promueve su desnaturalización a través de altas temperaturas (comúnmente 95 ºC). 2. Se induce el alineamiento o reconocimiento del cebador con las secuencias complementarias o molde del ADN. Esto se conoce como hibridación y ocurre al bajar la temperatura (p.e. 55 ºC). 3. Por medio de la enzima Taq polimerasa se lleva a cabo la extensión o alargamiento de la molécula iniciadora (cebador); o sea, la síntesis de la cadena complementaria. La temperatura de elongación suele ser de 72 ºC. 4. Los ciclos se repiten la cantidad de veces que sea necesario hasta obtener el número de copias de ADN que se requiere (Avise, 1994). Los procesos anteriormente mencionados tienen lugar en un termociclador, instrumento que se encarga de realizar los cambios de temperatura necesarios para que se desarrollen las etapas o ciclos pertinentes. Los RAPD‟s y los microsatélites (entre otros marcadores) utilizan esta metodología (Tautz, 1989; Williams et al., 1990). Los microsatélites son secuencias repetitivas de nucleótidos con una amplia ocurrencia, particularmente en organismos multicelulares; también se les conoce como SSR (Simple Sequence Repeats). Los microsatélites fueron descritos por Tautz en 1989 y se basan en regiones hipervariables constituidas ~9~ ANTECEDENTES por repeticiones en tándem de unos pocos pares de bases (1 – 6). El número de repeticiones puede variar, por lo que las diferencias o polimorfismos se detectan con una disparidad de tamaños y han ganado considerable importancia en la genética de la conservación de plantas debido a la gran cantidad de ventajas genéticas que poseen (Tautz, 1989; Engel et al., 1996; Ramel, 1997; Hoelzen, 1998; Goldstein & Schötterer, 1999; Silvertown & Charlesworth, 2001; Kalia et al., 2011). Los microsatélites se heredan siguiendo las leyes de Mendel y presentan un alto polimorfismo por locus (multialelismo) superior al observado por otros marcadores; por esto, por ser codominantes y genoma-específicos se les considera los marcadores ideales para la identificación genética individualizada (Tautz, 1989; Engel et al., 1996; Jones et al., 2010). Otros atributos incluyen hipervariabilidad, reproducibilidad, relativa abundancia, cobertura extensiva del genoma, localización específica en los cromosomas, docilidad en la automatización y alto grado de rendimiento de genotipado (Kalia et al., 2011). No obstante, una de las grandes desventajas de estos marcadores es que las regiones microsatelitales deben ser detectadas, secuenciadas y definidas para cada especie antes de ser utilizados por primera vez; lo que incrementa los tiempos y costes. Además, su implementación en un laboratorio requiere considerable infraestructura y presupuesto. A pesar de ello, son muchos los estudios que han elegido a los microsatélites para la investigación en especies amenazadas y, de ellos, una gran cantidad se centra en el descubrimiento y comparación de genotipos de especies vegetales. En las Islas Canarias, el uso de microsatélites es reciente. Se han empleado para detectar los patrones de expresión fenotípica y la heredabilidad de los rasgos relacionados con la luz en Olea europea (GarcíaVerdugo et al., 2010a), así como los efectos de la estructura de la población en la edad y el aislamiento por distancia en O. europea ssp. guanchica (GarcíaVerdugo et al., 2010b). También han sido utilizados para detectar la diversidad genética y los patrones de estructuración entre adultos y reclutas de Pinus canariensis (López de Heredia et al., 2010). ANTECEDENTES ~16~ La estructura genética intrapoblacional consiste en los diferentes tipos de alelos y sus frecuencias en dicha población. Existe una estructuración genética dentro de una población cuando las frecuencias alélicas no se distribuyen al azar, sino que siguen un determinado patrón o arquitectura que bien puede ser espacial o temporal. Por su parte, la estructura genética interpoblacional es el resultado de la distribución geográfica y en el espacio de subpoblaciones entre las cuales existen diferencias genéticas (Sosa et al., 2002; Frankham et al., 2009). 1 1. .2 2. .2 2. .1 1. . E Eq qu ui il li ib br ri io o H Ha ar rd dy y- -W We ei in nb be er rg g El principio de Hardy-Weinberg debe su nombre al famoso matemático inglés Godfrey Harold Hardy y al físico alemán Wilhelm Weinberg que establecieron el teorema independientemente en 1908, aunque en realidad fue utilizado por primera vez por el genetista estadounidense William E. Castle en una descripción de los efectos de la selección natural contra los alelos recesivos en 1903 (Allendorf & Luikart, 2007). Este principio establece que en una población donde el cruzamiento es aleatorio, la composición genética permanece en equilibrio mientras no hayan mutaciones, migraciones o selección natural. El equilibrio Hardy-Weinberg es simple y sin embargo fundamental para la conservación y la genética evolutiva (Frankham et al., 2009). La utilidad práctica de este teorema reside en que podemos evaluar la magnitud del cambio evolutivo en las poblaciones analizadas comparando las frecuencias genotípicas estimadas en las poblaciones naturales que estudiamos con las que esperaríamos encontrar según el equilibrio HardyWeinberg. El teorema funciona como hipótesis nula y la genética de poblaciones consiste en gran medida en investigar qué factores provocan la desviación significativa de esta hipótesis nula en las poblaciones naturales. Si se detecta un exceso de heterocigotos, esto puede indicar selección sobredominante o eventos estocásticos. En cambio, un defecto de heterocigotos puede deberse a selección, a la presencia de alelos nulos que den la impresión falsa de exceso de homocigotos, a la consanguinidad o al efecto Wahlund por la existencia de estructura poblacional que no se ha ~17~ ANTECEDENTES tomado en cuenta (Linhart et al., 1981; Waser, 1987; Eguiarte et al., 1992; Caujapé-Castells, 2006). En este sentido, el coeficiente de endogamia o índice de fijación (FIS) es una medida de la extensión de la endogamia en una población debido al apareamiento con individuos muy emparentados. FIS puede variar de 1 a –1; siendo un valor positivo indicativo de un defecto en la heterocigosis y un valor negativo considerado como un exceso de heterocigóticos en la población con respecto a las proporciones esperadas en el equilibrio de Hardy-Weinberg (Hartl & Clark, 1997; Caujapé-Castells, 2006). FIT es la medida de la desviación de la panmixia en el total de la población, es decir, la correlación entre los pares de genes homólogos en la unión de gametos con resto a la población en su globalidad (Wright, 1951). FIS, FIT y FST se conocen como los F-estadísticos y se relacionan mediante la expresión matemática: 1 1. .2 2. .2 2. .2 2. . A An ná ál li is si is s d de e A Au ut to oc co or rr re el la ac ci ió ón n E Es sp pa ac ci ia al l La autocorrelación espacial puede definirse como la relación entre los valores de una variable en función de la distribución de los puntos del espacio donde esa variable adquiere un valor determinado (Griffiths, 1987). El grado de estructuración genética intrapoblacional puede evaluarse gracias a la existencia de la autocorrelación espacial (Sokal, 1979; Vilches et al., 2004) que calcula la correlación a través del índice de Moran (Moran, 1948) existente entre las distancias genéticas detectada entre los individuos de una población y la distancia geográfica de los mismos. Para ello se calcula la distancia genética existente entre cada par de individuos y se compara con su separación física. Autocorrelaciones positivas obtenidas entre cada par de observaciones realizadas indican que los individuos más próximos geográficamente son también los de mayor similitud genética, mientras que autocorrelaciones negativas indican lo contrario (Sosa et al., 2002). ANTECEDENTES ~18~ Smouse y Peakall (1999) desarrollaron un nuevo enfoque para el análisis de la estructura espacial aplicado a matrices multialélicas codominantes e introdujeron un coeficiente de correlación (r) que es equivalente al estadístico I de Moran y, aunque ambos tienen similar comportamiento cualitativo, hemos preferido el coeficiente r porque es a la vez completamente general (multivariante) y brinda una correlación adecuada. 1 1. .2 2. .3 3. . D Di if fe er re en nc ci ia ac ci ió ón n G Ge en né ét ti ic ca a e en nt tr re e l la as s P Po ob bl la ac ci io on ne es s Para establecer la diferenciación genética entre las poblaciones es necesario calcular la distancia genética y el coeficiente de diferenciación genética entre las mismas. 1 1. .2 2. .3 3. .1 1. . D Di is st ta an nc ci ia a G Ge en né ét ti ic ca a El concepto de distancia genética fue desarrollado hacia 1953 por Sanghvi en un estudio de diferenciación genética de poblaciones humanas, extendiéndose y ampliándose posteriormente por otros autores como CavalliSforza y Edwards en 1967; pero fue solo hasta que los experimentos con electroforesis se hicieron populares que pudo desarrollarse una medida de esta distancia, adecuada al estudio de la evolución de las proteínas. Uno de los índices más utilizados es el de la distancia genética de Nei que puede estimar el número de genes o codones sustituidos por locus entre poblaciones (Nei, 1987). Nei (1972) definió el concepto de “identidad genética” entre dos poblaciones como la probabilidad de que dos alelos (uno de cada población) sean idénticos. Estos valores pueden variar entre cero (para poblaciones completamente distintas) hasta uno (si son genéticamente idénticas). Una vez calculado el valor para la identidad genética (I), la distancia genética (D) se obtiene mediante el logaritmo negativo de la primera: De esta manera, la distancia genética toma valores que oscilan entre cero y el infinito. Existe el inconveniente de que la distancia de Nei no es métrica, lo que puede tener incidencia en la elaboración de dendrogramas en los que no ~19~ ANTECEDENTES haga falta suponer que las tasas evolutivas sean homogéneas, como lo presupone Nei. Chakravorty & Jin (1995) desarrollaron un método para medir la distancia entre los alelos compartidos por los individuos de dos poblaciones, DAS (Distance of Allele Shared) que se obtiene según la expresión: donde nw1 y nw2 son el número medio de alelos compartidos entre individuos en las dos poblaciones y nb es el número medio de alelos compartidos entre dos individuos extraídos cada uno de las dos poblaciones. Se estima que las medias de todos los posibles pares de individuos pueden mostrar una evolución dinámica similar a la distancia genética estándar de Nei sobre la base locus-específica de frecuencia de alelos cuando el tiempo de divergencia entre dos poblaciones es pequeño. 1 1. .2 2. .3 3. .2 2. . C Co oe ef fi ic ci ie en nt te e d de e D Di if fe er re en nc ci ia ac ci ió ón n G Ge en né ét ti ic ca a y y A AM MO OV VA A Puesto que las especies raramente existen como sola unidad en la que cada individuo tiene la misma probabilidad de cruzarse con cualquier otro de la población (panmixia), la existencia de algún nivel de diferenciación genética entre las distintas poblaciones es la regla general para la mayoría de las especies. El coeficiente de diferenciación genética (FST) cuantifica este fenómeno natural y es también una medida indirecta del flujo genético a través del número de migrantes (Nm) entre las poblaciones (Sosa et al., 2002; Caujapé-Castells, 2006). Partiendo de un locus con dos alelos, FST es la varianza (σ2) en las frecuencias alélicas entre dos poblaciones normalizada por la frecuencia alélica media (p), entonces: y varía de 0 a 1. Un valor de cero indica que las frecuencias alélicas son idénticas en la poblaciones estudiadas, mientras un valor de 1 representa frecuencias alélicas fijadas y, por lo tanto, completamente distintas entre las poblaciones analizadas (Neff & Fraser, 2010). En la práctica, valores por ANTECEDENTES ~20~ debajo de 0,15 representan una escasa diferenciación genética, entre 0,15 y 0,25 indican que las poblaciones se encuentran considerablemente diferenciadas y si las cifras son superiores a 0,25 se consideran poblaciones fuertemente diferenciadas genéticamente (Hartl & Clark, 1997; Sosa et al., 2002). Curiosamente, el rango de distribución geográfica no se encuentra relacionado con la distribución de la variabilidad interpoblacional; así que otros factores como la capacidad de migración de la especie o la existencia de barreras geográficas y/o ecológicas deben ser considerados como responsables de esta variable (Hamrick & Godt, 1989; Frankham et al., 2009). También suele utilizarse la metodología desarrollada por Nei (1973) en donde la diversidad total (HT) está subdividida en la diversidad genética para cada población (HS) y la diversidad entre las subpoblaciones (DST), de manera que: y el coeficiente de diferenciación genética de la población total viene representado por: que equivale al FST de Wright. La diferenciación genética de las poblaciones (FST) se ve limitada por la tasa de migración (Nm), de modo que cuánto más flujo genético existe entre dos poblaciones, menor es la diferenciación genética existente entre ellas (Hartl y Clarck, 1997). Así pues, la relación entre estos dos parámetros se consigue mediante la fórmula: donde valores superiores a 1 son considerados como suficientes para evitar la diferenciación entre poblaciones (Wright, 1931). Otra medida de diferenciación que usa información sobre las relaciones genealógicas es el phi-st (ΦST) que se calcula en el marco del AMOVA ~21~ ANTECEDENTES (Excoffier et al., 1992) y utiliza el grado de diferenciación entre los alelos como un factor de ponderación que incrementa la métrica (por ejemplo FST) en proporción al número de diferencias mutacionales entre alelos (Allendorf & Luikart, 2007). El AMOVA puede probar la proporción de la variación genética en general atribuible a la variación dentro de las poblaciones, entre las poblaciones y entre los grupos de poblaciones en una región. Este análisis también puede usarse para determinar la distribución relativa a la variabilidad genética entre grupos, entre poblaciones dentro de grupos o dentro de las poblaciones; así que la estructura jerárquica es frecuentemente cuantificada a través del AMOVA (Allendorf & Luikart, 2007; DeWoody et al., 2010). 1 1. .2 2. .3 3. .3 3. . D De en nd dr ro og gr ra am ma as s U UP PG GM MA A y y N NJ J Los diagramas tipo árboles o dendrogramas pueden ser inferidos a partir de diversos tipos de datos. En el caso de la filogenia molecular esos datos son normalmente secuencia de genes o proteínas en forma de un alineamiento múltiple. Las metodologías utilizadas para la estimación de árboles evolutivos se dividen en cuatro categorías: matriz de distancias, parsimonia, invariantes y máxima probabilidad (Swofford & Olsen, 1990; Salemi & Vandamme, 2003). Los dendrogramas UPGMA y NJ son métodos de reconstrucción filogenética basados en distancias genéticas como la de Nei; es decir, resumen la información de un alineamiento múltiple en una matriz de distancias entre secuencias. Utilizan el alineamiento o diferenciación genética para calcular las distancias entre secuencias y posteriormente tratan de reconstruir un árbol evolutivo a partir de dichas distancias. El UPGMA (“Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic means”) es el método más sencillo de todos. Es un algoritmo de agrupamiento de abajo a arriba que recibe una matriz de distancias y a partir de ella genera un dendrograma. Inicialmente cada entidad de la matriz tiene su propio grupo. Cuando se unen los dos grupos más cercanos, se vuelven a calcular las distancias y se define la distancia entre los grupos como la media (sin ponderar) de las distancias que hay entre los miembros de cada grupo. Es decir, el nivel de agrupamiento es determinado por la media aritmética de las ANTECEDENTES ~22~ distancias entre cada individuo y el grupo previo (Avise, 1994; Allendorf & Luikart, 2007); de ahí su nombre. El NJ (Neighbor-Joining) también es un algoritmo de agrupamiento de abajo a arriba, pero no asume la existencia de un reloj molecular. Fue desarrollado por Saitou y Nei en 1987, su base es el principio de la evolución mínima en el cual el mejor árbol es aquel que minimiza la suma de las longitudes de todas las ramas; ya que frecuentemente se logra minimizar la longitud global del árbol al minimizarla a cada paso del análisis, aunque no siempre (Swofford & Olsen, 1990; Avise, 1994; Allendorf & Luikart, 2007). Esta técnica considera el concepto de vecinos en el cual para cada par debe existir una cercanía mutua y, a la vez, un alejamiento considerable hacia el resto. Los dendrogramas NJ no tienen raíz, así que para situar el ancestro común es necesario introducir un grupo externo como punto de referencia que bien puede ser un gen homólogo u otra familia o especie cercana, pero distinta a la que se analiza (Swofford & Olsen, 1990; Salemi & Vandamme, 2003). Sus virtudes más apreciadas están ligadas al hecho de ser extremadamente rápido y a que suele dar buenos resultados como aproximación preliminar. 1 1. .2 2. .3 3. .4 4. . A An ná ál li is si is s d de e C Co oo or rd de en na ad da as s P Pr ri in nc ci ip pa al le es s El análisis de coordenadas principales (PCoA) es una técnica multivariada que permite encontrar y trazar patrones dominantes en un conjunto de datos multivariados; estos datos pueden ser, por ejemplo, múltiples loci (variables) y múltiples muestras (observaciones) (Peakall & Smouse, 2006). En genética de poblaciones se utiliza para calcular una matriz de distancia y producir una configuración gráfica en un espacio Euclidiano de pocas dimensiones (dos o tres) de manera tal que, con la menor pérdida de información posible, puedan determinarse las relaciones genéticas entre los individuos, las poblaciones y/o las especies estudiadas. El análisis de componentes principales (PCA) es un análisis estadístico multivariante que se utiliza como un método de disminución de las dimensiones ~23~ ANTECEDENTES de los datos de un estudio (Hernández, 1992). El problema es que el PCA está basado en coeficientes de correlación o covarianza y estos pueden no ser siempre la medida más apropiada de asociación (Zuur et al., 2007). El PCoA es un método que está basado en una ecuación de valor propio; pero puede usar cualquier medida de asociación. Como el PCA, los ejes se trazan uno contra el otro en un espacio Euclidiano, pero el PCoA no produce un biplot (la combinación gráfica de variables y observaciones) (Zuur et al., 2007). 1 1. .2 2. .3 3. .5 5. . A An ná ál li is si is s B Ba ay ye es si ia an no o Los algoritmos de agrupamientos bayesianos se han constituido en importantes herramientas computacionales para inferir la estructura genética en la ecología molecular (Frantz et al., 2009), conservación genética y la genética de poblaciones (Corander y Marttinen, 2006; Patterson et al., 2006; François & Durand, 2010). En su mayoría, estos métodos asignan probabilísticamente individuos a grupos en función de sus genotipos multilocus minimizando los desequilibrios Hardy-Weinberg y de ligamiento, sin asumir poblaciones predefinidas (Pearse & Crandall, 2004). Métodos de cálculo intensivo con inferencia bayesiana a partir de simulaciones del proceso de coalescencia con migración, han sido desarrollados recientemente para estimar el tamaño de los grupos y las tasas de migración (en escala de tasa de mutación) a partir de los datos de secuencia de variabilidad de ADN para los conjuntos de poblaciones locales (Beerli, 2004; Hey & Nielsen, 2004). Cada población está caracterizada por un conjunto de frecuencias alélicas (P) para cada locus, donde P es un vector multidimensional con elementos pklj que representan la frecuencia del alelo j para el locus l en la población k (Falush et al., 2007). Dado un número de grupos (K) y asumiendo tanto el equilibrio HardyWeinberg como el equilibrio de ligamiento, pueden estimarse las frecuencias alélicas en cada grupo y la proporción de pertenencia como miembros de la población para cada individuo. En el modelo más simple (sin mezcla) se asume que cada individuo pertenece a un único grupo, mientras que en el modelo más general (mezcla) se estiman las proporciones de mezcla para cada individuo. ANTECEDENTES ~24~ Se hace uso de la Cadena de Markov Monte Carlo (MCMC) para integrar los parámetros en el espacio y hacer la asignación de grupos. Aunque el valor de K debe ser proporcionado al algoritmo, un método heurístico para la selección de K es de uso frecuente y se basa en la comparación penalizada del logaritmo de las probabilidades sobre tandas independientes con diferentes números de grupos. Considerando un grupo de datos con un número N de individuos en un loci L, se asume que los individuos muestreados tienen un ancestro en grupos discretos K, donde los grupos corresponden a poblaciones observadas. K es determinado por el investigador. Cada clado es caracterizado por un grupo de frecuencias de los alelos para cada locus. El vector tridimensional P contiene las frecuencias alélicas en cada grupo para cada alelo de cada locus, las frecuencias alélicas son típicamente desconocidas de antemano. En el modelo sin mezcla, los algoritmos asignan cada individuo a un grupo K (Hubisz et al., 2009). El enfoque bayesiano incorpora la información previa y puede ser especialmente útil en la biología de la conservación ya que facilita la toma de decisiones cuando se cuenta con pocos datos y se quiere integrar todo el conocimiento disponible; y en la biología de la conservación a menudo se deben tomar decisiones basadas en datos limitados. La principal desventaja del enfoque bayesiano es que está fuertemente influenciado por la información previa y, por lo tanto, puede ser menos objetivo que el enfoque clásico (Allendorf & Luikart, 2007). 1 1. .2 2. .4 4. . S Si is st te em ma as s d de e C Cr ru uz za am mi ie en nt to o Las inferencias sobre los sistemas de cruzamiento en plantas utilizan cada vez más marcadores moleculares altamente informativos e investigan las más finas facetas de estos (Ritland et al., 2002). Los sistemas de apareamiento por endogamia en plantas han sido tradicionalmente descritos por modelos de apareamiento mixto donde se asume que las plantas se autofertilizan a una tasa s. La fracción restante de la progenie se deriva de cruzamiento, que es el caso más simple, y se considera que ocurre al azar en el resto de la población. Algunas desviaciones de estos ~25~ ANTECEDENTES supuestos pueden ser modificados y ser tratados como aspectos adicionales del sistema de apareamiento. Si el apareamiento ocurre entre organismos emparentados (endogamia biparental), la tasa de autofecundación mono-locus (ts) debe ser superior a la tasa de autofecundación multilocus (tm) y la diferencia entre estas dos (tm – ts) es una estimación mínima de la autofecundación aparente debido a la endogamia biparental. Además, se supone que las matrices de progenie derivadas por cruzamiento están compuestas por medios hermanos y se asume que las tasas de autofecundación son constantes entre las matrices; pero en ambos casos el “modelo de apareamientos correlacionados” puede caracterizar la medida en que los hermanos comparten el mismo padre y la medida de la variación entre las matrices de tasa de fecundación. La variación en el sistema de apareamiento puede también examinarse con estimaciones a nivel individual (Ritland, 2002). El modelo de probabilidad subyacente en la estimación multilocus del sistema de apareamiento asume n loci no ligados. En el modelo mixto de apareamiento, la progenie es tanto producto de autofecundación como debida al cruzamiento aleatorio. La fecundación cruzada también ocurre al azar para un acervo de polen en equilibrio de ligamiento. El efecto de estos supuestos ha sido examinado en el caso de la heterogeneidad del acervo de polen (Smyth & Hamrick, 1984) y de enlace (Hedrick y Ritland, 1990). Las estimaciones de la tasa de autofecundación se encuentran maximizando la probabilidad de los datos con respecto a la tasa de autofecundación (y las frecuencias de polen, si también se estima) utilizando métodos numéricos como Newton-Raphson o el método de máxima expectación (EM; Cheliak et al., 1983). La filiación materna se puede deducir mediante el cálculo de probabilidades de matrices de descendencia a través de los posibles genotipos maternos y se elige el genotipo paterno según la mayor probabilidad dada; sin embargo, esto requiere asumir tanto que las familias son de hermanos completos (Schoen & Clegg, 1984) como de medios hermanos (Brown & Allard, 1970). Los errores de estimación pueden encontrase mediante repeticiones (bootstrap) donde las series totales de la progenie se vuelven a muestrear (Ritland, 1990). EL COMPLEJO ILEX ~36~ lluvia horizontal propia del Monteverde mesofítico donde la humedad ambiental es elevada casi todo el año y las temperaturas son más bien bajas (15 ºC en promedio anual). Requiere cierta luminosidad para progresar adecuadamente, por lo menos en los primeros estadios de vida. En cuanto a los requerimientos edáficos, prefiere suelos húmicos de carácter ándico bien desarrollados y abundante materia orgánica, los cuales se forman sobre sustrato geológico de tipo basáltico; y casi siempre crece al borde de los acantilados. Es común encontrar otras especies como Laurus novocanariensis (Laurel), Myrica faya (Faya), Erica arborea (Brezo), Ilex canariensis (Acebiño), Dryopteris oligodonta (Helecho macho), Asplenium onopteris (Chinobre), Hereda canariensis (Hiedra canaria), Adenocarpus foliolosus (Codeso) e Hypericum inodorum (Hipérico) como flora acompañante (Bañares et al., 2004). 3 3. .1 1. .2 2. . I Il le ex x p pe er ra ad do o s ss sp p. . p pl la at ty yp ph hy yl ll la a ( (W We eb bb b & & B Be er rt th he el l. .) ) T Tu ut ti in n Esta subespecie es la mayor y mejor desarrollada dentro del grupo perado. Fue descrita como Ilex platyphylla por Webb y Berthelot en 1836; pero luego se unió a las especies de Madeira y se denominó como Ilex perado var. platyphylla por Loesener (Lems, 1968). En 1977 Kunkel vuelve a plantear la posibilidad de que la subespecie platyphylla regresara al rango de especie, aunque sin considerarla demasiado cercana a I. perado. De acuerdo a sus observaciones, el autor concluyó que la principal diferencia entre ambos taxones radica en el tamaño de la lámina foliar y en la aparición de algunos pecíolos alados en la primera (Andrews, 1983). Recientemente se le ha incluido en la Lista Roja de Flora Vascular Española en la categoría de “Vulnerable” (Moreno et al., 2008). Este acebo es un árbol de hasta 15 m de altura, de corteza grisácea y ramas horizontales. Hojas brillantes, láminas Fig. 3 Ilex perado ssp. platyphylla ~37~ EL COMPLEJO ILEX maduras de 10 – 13,3 x 6 – 8,6 cm, de anchamente ovadas a orbiculares; bordes ondulados con espinas de entre 1,5 – 3,5 mm de longitud que apuntan hacia adelante o a veces más o menos enteros, pero con espina apical (Fig. 3). Pecíolos de 0,8 – 1,6 cm, usualmente pubescentes y algunas veces alados (Lems, 1968; Kunkel, 1977b; Andrews, 1983). Flores entre blanco y rosado. Cáliz de 1,3 – 2 mm de largo; sépalos de entre 0,7 – 1,1 x 1,5 – 2,2 mm; corola de 4,3 – 5,7 mm de longitud con pétalos de 4 – 5 x 2,6 a 3,5 mm; estambres 4, filamentos de 2 – 4 mm, anteras de 1,3 – 1,8 mm, estaminoides de 1,9 – 4 mm; ovario de 3 – 4 mm de largo, estigma de 1,6 – 2,5 x 0,6 – 1,4 mm, pistiloides de 0,9 – 1,3 mm (Andrews, 1983; Cabrera García et al., 2005). El fruto es entre rojo oscuro a negruzco cuando maduro, de 8 – 10 mm de diámetro, esféricos; pirenos 4, de 6,5 – 7,5 x 3 – 4 mm; pedicelos de 8 – 11 mm (Andrews, 1983; Cabrera García et al., 2005). Aunque la especie tiene una mayor distribución (Lems, 1968; Manen et al., 2010); de acuerdo con Kunkel (1977b), esta subespecie está restringida a las Islas Canarias. Según su opinión, las citas para Madeira hechas por Loesener en 1901 necesitaban una revisión crítica. En las Islas Canarias ha sido reportado para Tenerife y La Gomera. En Tenerife, es bastante frecuente en los bosques de Laurisilva de las laderas del Norte en la región de Anaga, Las Mercedes y Agua García. Rara en La Gomera (El Cedro) (Andrews, 1983; Cabrera García et al., 2005). Según Kunkel (1981) Ilex perado ssp. platyphylla es un elemento de la Laurisilva con preferencia de elevación entre los 500 – 900 msnm y es bastante exigente en cuanto a la humedad disponible; también parece requerir un suelo profundo en amplia sombra, pero ocasionalmente crece cerca de cumbres expuestas y entonces las hojas son más pequeñas que lo usual (Andrews, 1983). 3 3. .1 1. .3 3. . I Il le ex x c ca an na ar ri ie en ns si is s P Po oi ir r. . Se le conoce como el Acebiño de Canarias (Canary Holly). Es un árbol de la Laurisilva macaronésica que ha sido catalogado como “De Bajo Riesgo/Poco EL COMPLEJO ILEX ~38~ Amenazado” en la lista de especies amenazadas de la UICN (Lems, 1968; IUCN, 2011). Puede llegar a alcanzar los 15 – 20 m de altura. Desarrolla fuertes troncos de hasta 50 cm de diámetro con una corteza lisa y a veces escamosa, de color gris pálido u oscuro (Kunkel, 1977b). El acebiño se distingue fácilmente de Ilex perado por sus pequeñas hojas ovales u oblongo-ovadas, ápice redondeado o un poco acuminado. Borde usualmente entero, aunque las hojas jóvenes a menudo presentan espinas (Lems, 1968; Kunkel, 1977b; UICN, 2011). Las flores se producen en racimos que brotan sobre la axila foliar (Fig. 4). Los frutos redondeados pasan de verde a amarillo a rojos y continúan oscureciendo hasta llegar a ser negros. Cada fruto contiene entre 4 – 6 semillas de aproximadamente 35 mg (Lems, 1968; Kunkel, 1977b; Salvande et al., 2006). Ilex canariensis ha sido reportado exclusivamente para Madeira y cinco de las siete Islas Canarias (Gran Canaria, Tenerife, La Gomera, La Palma y El Hierro) (Lems, 1968; Kunkel, 1977b). Esta especie está normalmente presente en las altitudes más bajas y entre los matorrales de los bosques de Laurisilva del tipo fayal/brezal y en la Laurisilva de ladera (Arboal et al., 2005; IUCN, 2011); razón por la que se le considera una de las especies dominantes de la Laurisilva canaria junto a otras especies como Laurus novocanariensis (Laurel), Erica arborea (Brezo), Erica scoparia (Tejo), Prunus lusitanica (Laurel portugués), Myrica faya (Faya) y Viburnum tinus (Laurentilla) (Arévalo et al., 2007). Los frutos del acebiño son consumidos por varias especies de aves (Turdus merula, Erithacus rebecula, Columba spp.) que dispersan las semillas a través sus excrementos (Martín et al., 2000). Por otro lado, Salvande et al. (2006) han concluido que la predación post dispersión de semillas por ratas (Rattus rattus) puede tener un efecto importante sobre el reclutamiento de Ilex Fig. 4 Ilex canariensis ~39~ EL COMPLEJO ILEX canariensis, especialmente en áreas de sucesión iluminadas donde estos árboles pueden establecerse naturalmente. 3 3. .1 1. .4 4. . I Il le ex x a az zo or ri ic ca a G Ga an nd d. . Endemismo del archipiélago de Azores conocido como Azevihno y considerado internacionalmente como una especie diferente de Ilex perado por el IPNI (International Plant Names Index, http://www.ipni.org). No obstante, es denominada como Ilex perado Aiton ssp. azorica (Loes.) en la Base de Datos de Biodiversidad de Azores (http://www.azoresbioportal.angra.uac.pt) tal como fue reportado por Tutin (1933); por lo cual, algunos autores hacen referencia a esta última nomenclatura. Se trata de árboles o arbustos perennifolios. Los troncos adultos suelen estar fuertemente desarrollados. Las hojas son pequeñas, de color verdeoscuro lustrosas; las láminas de forma oblongo-elíptica miden entre 3 – 6,6 x 2,5 – 5 cm; margen entero o con solo pocas espinas, cuando presentes de 0,5 – 1,8 mm. Los pecíolos miden entre 0,3 – 0,9 cm, usualmente glabros (Fig. 5) (Andrews, 1983; Sjögren, 2001). El cáliz de las flores mide aproximadamente 0,8 – 1,5 mm con sépalos de entre 0,3 – 0,8 x 1 – 1,5 mm; la corola tiene una longitud de 2,5 – 4,3 mm, con pétalos de 2,3 – 3,9 x 2 – 3 mm, ciliados a poco glabros en la mitad superior. Estambres de 4 a 5, de unos 1,5 – 2 mm, con anteras de 0,8 – 1,1 mm; estaminoides de 1,1 – 1,9 mm; ovario de 1,5 – 2,5 mm de longitud con estigma de 0,5 – 0,25 x 1,1 – 2,5 mm; pistiloides de 0,5 – 1,1 mm de longitud (Andrews, 1983). Los frutos son esféricos, ocasionalmente oblongos de 8 – 9 x 7 – 10 mm; pirenos 3 a 4, de 6,5 – 7,5 x 3 – 4 mm y pedicelos de 6 – 11 mm de largo (Andrews, 1983). Fig. 5 Ilex azorica EL COMPLEJO ILEX ~40~ Según Sjögren (2001), Ilex azorica está presente en todas sus islas excepto en Graciosa; sin embargo, la Base de Datos de Biodiversidad de Azores (http://www.azoresbioportal.angra.uac.pt) no considera esta excepción. Se encuentra amenazado en Santa María y especialmente en la isla de Corvo donde solo un espécimen ha sido reportado desde 1978. Ilex azorica prefiere crecer sobre los 500 msnm, tanto en hábitats fuertemente sombreados como en aquellos con considerable exposición solar. Crece en barrancos, cráteres, lapiaces y como árbol solitario en amplios pastizales; pero es más frecuente en la Laurisilva donde los individuos presentan una dispersión gregaria con otras especies. En este ambiente, los troncos suelen tener una amplia cobertura de musgos y las hojas adultas logran amparar gran cantidad de hepáticas epífitas (Sjögren, 2001). ~41~ ~41~ EL COMPLEJO ILEX 3 3. .2 2. . M Ma at te er ri ia al le es s y y M Mé ét to od do os s 3 3. .2 2. .1 1. . R Re ec co og gi id da a d de e M Mu ue es st tr ra as s y y P Po ob bl la ac ci io on ne es s Se obtuvo un total de 393 individuos del género Ilex. Las muestras provinieron de 26 localidades de seis islas distintas e incluyeron las cuatro especies o subespecies de Ilex descritas hasta el momento para Canarias y Azores: Ilex perado ssp. lopezlilloi (32), Ilex perado ssp. platyphylla (93), Ilex azorica (39) e Ilex canariensis (229). El período de colecta osciló entre marzo de 2007 y marzo de 2009 (Tabla 1). Tabla 1 Número de individuos de Ilex recolectados por especie, localidad e isla TAXÓN LOCALIDAD ISLA Nº Ilex perado ssp. lopezlilloi Ancule La Gomera 12 Ancón de Pajarito La Gomera 8 Las Cancelas La Gomera 4 Lorito Plantado La Gomera 8 32 Ilex perado ssp. platyphylla Ancule La Gomera 1 Bailadero La Gomera 2 Zona de Parcelas La Gomera 5 Reventón Oscuro La Gomera 1 Apartacaminos La Gomera 8 El Moquinal Tenerife 28 Casa Forestal Tenerife 17 Cruz de Taganana Tenerife 31 93 Ilex azorica Troqueira São Miguel 10 Lagoa do Fogo São Miguel 10 Estrada do Mato Flores 10 Descida para Ponta Delgada Flores 9 39 Ilex canariensis Vallehermoso La Gomera 7 Lomo de la Jara Tenerife 11 El Moquinal Tenerife 31 Las Calderetas Tenerife 23 Los Tilos La Palma 26 Punta Llana La Palma 31 Breña Alta La Palma 33 La Galería del Barbusano Gran Canaria 2 Tamadaba Gran Canaria 26 El Brezal Gran Canaria 39 229 TOTAL 393 EL COMPLEJO ILEX ~42~ La totalidad de las muestras pertenecientes a Ilex perado ssp. lopezlilloi son de La Gomera debido a su carácter endémico. De esta subespecie se procuró tomar muestras de todos los árboles encontrados (a sabiendas de la existencia de clones producto de restituciones) con el fin de identificar la mayor cantidad de genotipos presentes. En algunos casos también se colectaron hojas de varios posibles chupones cercanos a los troncos principales por si se trataran de individuos diferentes. Los representantes de Ilex perado ssp. platyphylla pertenecen a cinco localidades de la isla de La Gomera y tres de la isla de Tenerife. Los individuos de Ilex azorica provinieron de dos localidades en la isla de São Miguel y dos localidades de la isla de Flores (Azores) y las muestras de Ilex canariensis proceden de una localidad de La Gomera, tres de Tenerife, tres de La Palma y dos de Gran Canaria (Islas Canarias) (Fig. 6). Las poblaciones de Ilex azorica de Estrada do Mato y Descida para Ponta Delgada, así como los individuos de Ilex canariensis de las poblaciones de La Galería del Barbusano, Punta Llana, Breña Alta, Brezal y dos individuos de la población de Los Tilos no se consideraron en el análisis estadístico ya que Fig. 6 Procedencia de las muestras recolectadas del género Ilex ~43~ ~43~ EL COMPLEJO ILEX presentaban un alto porcentaje de microsatélites sin amplificar y alelos inciertos. Por otro lado, las localidades de Ancule, Bailadero y Reventón Oscuro de la subespecie I. perado ssp. platyphylla de La Gomera fueron reunidas en una única población denominada SUGO-P. Análisis preliminares revelaron que entre las 32 muestras catalogadas como I. perado ssp. lopezlilloi examinadas, solo existían 5 genotipos distintos. Debido a esto, y dado que dichas muestras proceden en su mayoría de restituciones realizadas a través de esquejes y, por tanto, mediante reproducción asexual por parte del personal del Parque Nacional de Garajonay; no todas las muestras fueron consideradas en el análisis genético pues podrían constituir una distorsión en los resultados. Así, los cinco genotipos encontrados de Ilex perado ssp. lopezlilloi fueron reunidos en un mismo grupo de análisis que se denominó como la población ENGO-L. La reorganización establecida para efectos del análisis computacional se refleja en la Tabla 2. Tabla 2 Poblaciones de Ilex sometidas al análisis estadístico TAXÓN LOCALIDAD CÓDIGO ISLA Nº Ilex perado ssp. lopezlilloi La Gomera ENGO-L La Gomera 5 5 Ilex perado ssp. platyphylla Ancule, Bailadero y Reventón Oscuro SUGO-P La Gomera 4 Zona de Parcelas PARC-P La Gomera 5 Apartacaminos APAT-P La Gomera 8 El Moquinal MOQU-P Tenerife 28 Casa Forestal CAFO-P Tenerife 17 Cruz de Taganana CRTA-P Tenerife 31 93 Ilex azorica Troqueira TROQ-A São Miguel 10 Lagoa do Fogo LAFO-A São Miguel 10 20 Ilex canariensis Vallehermoso VAHE-C La Gomera 7 Lomo de la Jara LOJA-C Tenerife 11 El Moquinal MOQU-C Tenerife 31 Las Calderetas CALD-C Tenerife 23 Los Tilos TILO-C La Palma 24 Tamadaba TAMA-C Gran Canaria 26 122 TOTAL 240 Nº: Número de individuos EL COMPLEJO ILEX ~44~ 3 3. .2 2. .2 2. . A An ná ál li is si is s G Ge en né ét ti ic co os s Las muestras fueron transportadas y conservadas en bolsas plásticas de cierre hermético con gel de sílice hasta la extracción del ADN. Cada bolsa fue etiquetada con el código correspondiente a cada individuo y población de cada taxón. El ADN de las muestras se extrajo mediante la maceración de aproximadamente 1 cm2 de hoja deshidratada de cada individuo. En los primeros casos este procedimiento se hacía con la ayuda una pequeña cantidad de gel de sílice, un mortero y un pistilo. Posteriormente se realizó en un molinillo vibratorio (RETSCH MM 301), directamente en los tubos de ensayo de 1,5 ml de capacidad a los que también se les introducía un par de balines de acero inoxidable que contribuían a la trituración de la muestra. En ambos casos el resultado fue un polvo de coloración verde que se sometió al protocolo de extracción de Doyle & Doyle (1987) y en el caso de Ilex canariensis al de Dellaporta et al. (1983) modificado por Corniquel & Mercier (1994). Una vez extraído el ADN se procedió a su purificación, esto se hizo mediante kits de purificación comerciales (SIGMA Gene Elute PCR Clean-Up Kit) y utilizándose 150 μl del ADN total de cada muestra. Las concentraciones y calidad del ADN fueron determinadas por absorbancia. La concentración de ADN fue medida espectrofotométricamente (BECKMAN Coulter DU 530), pues se conoce que esta molécula presenta la mayor absorción a una longitud de onda (λ) de 260 nm. Para verificar la pureza del ADN se hicieron lecturas a 230 nm, región en la que se estima que se encuentran las impurezas (fenol y urea). Por último, se calculó la tasa de absorción a 260/280 nm para determinar la proporción ADN/ARN. La concentración del ADN purificado de las muestras osciló en el rango de 20 a 64 ng/µl. Se probaron 18 cebadores en el género Ilex (Tabla 3). Doce fueron descritos por Torimaru et al. (2004) para Ilex leucoclada y los seis restantes fueron cedidos amablemente por el Dr. Torimaru para este estudio. ~45~ ~45~ EL COMPLEJO ILEX Tabla 3 Microsatélites ensayados en el género Ilex. LOCUS REFERENCIA ESPECIE MOTIVO ILE03-01-76 Torimaru (com pers.) Ilex leucoclada - ILE03-01-30 Torimaru (com pers.) Ilex leucoclada - ILE03-01-47 Torimaru et al., 2004 Ilex leucoclada (CT)9 ILE03-01 Torimaru et al., 2004 Ilex leucoclada (CT)15 ILE03-38 Torimaru et al., 2004 Ilex leucoclada (AG)22 ILE03-53 Torimaru et al., 2004 Ilex leucoclada (GA)12 ILE03-65 Torimaru et al., 2004 Ilex leucoclada (TC)15 ILE03-86b Torimaru (com pers.) Ilex leucoclada (GA)8 ILE04-02 Torimaru et al., 2004 Ilex leucoclada (TA)11A(CA)10 ILE04-04 Torimaru et al., 2004 Ilex leucoclada (GA)7 ILE04-06 Torimaru et al., 2004 Ilex leucoclada (CT)24 ILE04-10 Torimaru et al., 2004 Ilex leucoclada (GA)22 ILE04-17 Torimaru et al., 2004 Ilex leucoclada (CA)17 ILE04-18 Torimaru et al., 2004 Ilex leucoclada (GA)6GG(GA)11 ILE04-59 Torimaru (com pers.) Ilex leucoclada - ILE05-81 Torimaru (com pers.) Ilex leucoclada (AG)22 ILE05-83 Torimaru et al., 2004 Ilex leucoclada (AG)16 ILE24 Torimaru (com pers.) Ilex leucoclada - Las amplificaciones de ADN se hicieron en placas de PCR de 96 pocillos de 200 μl. En cada pocillo se depositó aproximadamente 20 ng de ADN, 10 pmol de cada cebador y 24 μl de mezcla maestra para PCR (Reddy-Mix, ABgene, Surrey, UK) que incluye 0,625 unidades de la enzima ADN Taq polimerasa, Tris-HCl 75 mM, (NH4)2SO4 20 mM, Tween 20 0,01%, 1,5 mM (o 2mM) de MgCl2 y 0,2 mM de cada dNTP. 3 3. .2 2. .3 3. . A An ná ál li is si is s d de e D Da at to os s El análisis de los datos se circunscribe al genotipado de los productos de amplificación y al procesamiento estadístico de la matriz de datos obtenida a partir mismo. 3 3. .2 2. .3 3. .1 1. . G Ge en no ot ti ip pa ad do o Los productos de la amplificación fueron analizados usando un Secuenciador Capilar ABI 3130XL y el genotipado; es decir, los alelos de cada locus y su tamaño respectivo fueron identificados por los picos obtenidos a través de los programas GENSCAN 2.02 y GENOTYPER 1.1 (Applied Biosystems, Inc.). Los datos obtenidos para cada individuo y locus amplificado se incluyeron en una matriz de doble entrada (hoja de cálculo EXCEL). Se elaboró entonces EL COMPLEJO ILEX ~52~ heterocigosidad esperada para el género es alta (0,725) y en todas las poblaciones los valores fueron superiores a 0,314 con excepción de APAT-P. En cuanto al taxón, pueden apreciarse valores de 0,339; 0,435; 0,551 y 0,560 para Ilex azorica, I. perado ssp. lopezlilloi, I. canariensis e I. perado ssp. platyphylla; respectivamente. Ilex azorica presenta los niveles más bajos de heterocigosidad (Tabla 7). 3 3. .3 3. .3 3. . E Es st tr ru uc ct tu ur ra a G Ge en né ét ti ic ca a e en n l la as s P Po ob bl la ac ci io on ne es s 3 3. .3 3. .3 3. .1 1. . E Eq qu ui il li ib br ri io o H Ha ar rd dy y- -W We ei in nb be er rg g En la Tabla 8 se señalan los valores del coeficiente de endogamia (FIS) y el grado de significación de los mismos para las diferentes poblaciones analizadas en el género Ilex. Tres loci (ILE03-38, ILE05-81 e ILE03-86b) se mostraron en equilibrio Hardy-Weinberg para todas las poblaciones; el resto de los loci mostró desviación del equilibrio Hardy-Weinberg con valores predominantemente positivos, aunque en la mayor parte de los casos son valores no estadísticamente significativativos. Aunque globalmente Ilex azorica presenta un defecto de heterocigóticos significativo, esto es sobretodo debido a las desviaciones encontrados en un solo locus (ILE04-06). De manera similar, la desviación global encontrada en las poblaciones de MOQU-P y CRTA-P en Ilex perado ssp. platyphylla se deben al locus ILE04-02, pero en general todas las poblaciones analizadas están en equilibrio. Finalmente, y para el caso de Ilex canariensis, nos encontramos en una situación muy similar ya que la mayor parte de los loci se encuentran en equilibrio y aquellas poblaciones con exceso de heterocigóticos (LOJA-C, MOQU-C y TAMA-C) este se debe al desvío encontrado en un solo locus. Al aplicar la corrección de Bonferroni (p < 0,00625) el 90% de las pruebas y la mayor parte de las poblaciones (9 de 15) no mostraron desviación de las proporciones esperadas en equilibrio Hardy Weinberg. ~53~ ~53~ EL COMPLEJO ILEX Tabla 8 Análisis de probabilidad de desviación del equilibrio de Hardy-Weinberg en poblaciones del género Ilex TAXÓN POBLACIÓN ILE04-02 ILE04-10 ILE03-38 ILE03-53 ILE03-01 ILE04-06 ILE05-81 ILE03-86b FISHER I. perado ssp. lopezlilloi ENGO-L 1,000* -0,143ns -0,143ns -0,143ns -1,000ns 0,600ns -0,600ns -0,143ns -0,039ns I. perado ssp. platyphylla SUGO-P 1,000ns - 0,571ns 0,333ns - -0,600ns - - 0,205ns PARC-P 1,000** 0,172ns - -0,280ns -0,067ns -0,391ns - - 0,143ns APAT-P - - - -0,714ns -1,000* - -0,750ns -0,750ns -0,758* MOQU-P 0,725*** 0,223* -0,040ns 0,249* -0,053ns 0,168ns -0,180ns -0,071ns 0,158*** CAFO-P - 0,163* -0,059ns 0,686** -0,385ns -0,192ns 0,250ns 0,149ns 0,088ns CRTA-P 0,744*** -0,060ns -0,250ns 0,292* -0,209ns 0,318 ns 0,112ns 0,130ns 0,095** I. azorica TROQ-A 0,152ns - - - 0,182ns 0,333** - 0,460ns 0,268** LAFO-A 0,276*** -0,143ns - - - 0,412** - 0,301ns 0,251** I. canariensis VAHE-C - -0,171ns -1,000ns - -0,395ns 1,000ns -0,532ns - -0,240ns LOJA-C - 0,068** -0,071ns -0,191ns 0,200ns 0,568* -0,302ns - 0,070* MOQU-C - -0,714** -0,463ns -0,195ns -0,330* 0,118ns -0,002ns - -0,210** CALD-C - -0,540* -0,244ns -0,194ns -0,062ns 0,106ns -0,262ns - -0,221ns TILO-C 1,000ns -0,538ns -0,177ns -0,267ns -0,441ns -0,171ns -0,189ns -0,001ns -0,238ns TAMA-C -1,000*** -0,143ns 0,188ns 0,847*** -0,081ns - -0,375ns -0,113ns -0,196*** ns: no significativo; *: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001; - : locus monomórfico. 3 3. .3 3. .4 4. . D Di if fe er re en nc ci ia ac ci ió ón n G Ge en né ét ti ic ca a e en nt tr re e l la as s P Po ob bl la ac ci io on ne es s 3 3. .3 3. .4 4. .1 1. . I Id de en nt ti id da ad d y y D Di is st ta an nc ci ia a G Ge en né ét ti ic ca a En la Tabla 9 se muestran los valores de identidad y distancia genética (Nei, 1972) obtenidos para las diferentes poblaciones analizadas del género Ilex. El rango de la identidad varía ampliamente entre las poblaciones desde 0,972 entre las poblaciones de I. azorica (TROQ-A y LAFO-A) hasta 0,008 para la relación VAHE-C / TROQ-A (Ilex canariensis – Ilex azorica). Si solo se consideran las poblaciones de Ilex perado ssp. platyphylla, los valores de identidad genética varían desde I = 0,446 para CAFO-P / APAT-P (Casa Forestal – Apartacaminos) hasta I = 0,916 para CRTA-P / CAFO-P (Cruz de Taganana – Casa Forestal). Llama la atención que el 93,33% de los valores de identidad genética entre las poblaciones de I. perado ssp. platyphylla sean inferiores a 0,900 ya que se tratan de medidas intraespecíficas; el valor de identidad media en este taxón fue de 0,648 (Tabla 10). En el caso de I. azorica la identidad genética entre las dos poblaciones estudiadas es de I = 0,972; que como ya se mencionó es la más elevada de todas las comparaciones realizadas. Para I. canariensis la identidad genética con mayor valor es la presentada entre la población del Moquinal y Las EL COMPLEJO ILEX ~54~ Calderetas (MOQU-C / CALD-C), ambas de Tenerife, con I = 0,949; mientras que el valor más pequeño es el de Tamadaba (Gran Canaria) al compararse con Vallehermoso (La Gomera) (TAMA-C / VAHE-C) donde I = 0,637 (Tabla 9). En esta especie la 0,787 (Tabla 10) y el 86,67% de los valores fueron menores que 0,900. Ilex perado ssp. lopezlilloi consta de una sola población, por lo que no son factibles comparaciones a nivel de taxón. Tabla 9 Identidad y distancias genéticas de Nei (1972) entre las poblaciones analizadas del género Ilex ENGO -L SUGO -P PARC -P APATP MOQU -P CAFO -P CRTAP TROQ -A LAFOA VAHEC LOFAC MOQU -C CALDC TILOC TAMA -C ENGO-L 0,805 0,863 0,783 0,662 0,661 0,724 0,297 0,282 0,080 0,124 0,156 0,149 0,125 0,190 SUGO-P 0,217 0,899 0,726 0,491 0,479 0,581 0,196 0,187 0,082 0,143 0,110 0,104 0,112 0,116 PARC-P 0,148 0,107 0,670 0,507 0,517 0,642 0,177 0,167 0,075 0,121 0,104 0,105 0,121 0,154 APAT-P 0,244 0,320 0,400 0,516 0,446 0,537 0,233 0,229 0,046 0,095 0,085 0,095 0,084 0,166 MOQU-P 0,413 0,711 0,680 0,662 0,894 0,899 0,489 0,479 0,148 0,231 0,255 0,226 0,153 0,249 CAFO-P 0,414 0,737 0,661 0,807 0,113 0,916 0,376 0,379 0,137 0,250 0,271 0,254 0,161 0,235 CRTA-P 0,324 0,543 0,444 0,623 0,106 0,088 0,462 0,457 0,138 0,231 0,229 0,215 0,166 0,256 TROQ-A 1,213 1,631 1,729 1,455 0,716 0,979 0,772 0,972 0,008 0,078 0,031 0,021 0,010 0,025 LAFO-A 1,264 1,678 1,792 1,474 0,736 0,970 0,784 0,029 0,018 0,089 0,044 0,033 0,038 0,040 VAHE-C 2,530 2,498 2,593 3,079 1,910 1,985 1,984 4,863 4,036 0,737 0,791 0,676 0,782 0,637 LOFA-C 2,092 1,948 2,110 2,360 1,468 1,386 1,464 2,552 2,423 0,305 0,918 0,868 0,764 0,714 MOQU-C 1,860 2,204 2,266 2,467 1,365 1,305 1,476 3,482 3,131 0,234 0,086 0,949 0,843 0,783 CALD-C 1,902 2,268 2,253 2,356 1,486 1,373 1,536 3,843 3,402 0,392 0,141 0,053 0,780 0,813 TILO-C 2,078 2,186 2,113 2,475 1,878 1,830 1,794 4,636 3,266 0,246 0,269 0,171 0,248 0,755 TAMA-C 1,662 2,158 1,873 1,798 1,392 1,450 1,362 3,696 3,209 0,451 0,336 0,245 0,207 0,281 Identidad genética (arriba) y distancia genética (abajo). En rojo los menores valores y en verde los valores más altos. Al analizar los resultados de la identidad genética entre poblaciones de distintas especies y subespecies se puede observar que el 100% de los valores son inferiores a 0,900. Entre las poblaciones de Ilex perado ssp. lopezlilloi y las de su símil I. perado ssp. platyphylla se encontró una identidad media de 0,750 ( 0,750); en la relación entre I. perado ssp. lopezlilloi y su congénere I. azorica existe una mayor separación ( 0,290), mientras que entre Ilex perado spp. lopezlilloi e Ilex canariensis los resultados muestran una media ( ) de 0,137. Al comparar las poblaciones de I. perado ssp. platyphylla e I. azorica encontramos una media de la identidad genética de 0,319 y entre Ilex perado ssp. platyphylla e Ilex canariensis, la media fue de 0,159. Finalmente, entre Ilex azorica e Ilex canariensis 0,036 (Tabla 10). Tabla 10 Valores de identidad genética media entre taxones TAXÓN I. p. ssp. lopezlilloi I. p. ssp. platyphylla I. azorica I. canariensis I. p. ssp. lopezlilloi - 0,750 0,290 0,137 I. p. ssp. platyphylla 0,648 0,319 0,159 I. azorica 0,972 0,036 I. canariensis 0,787 ~55~ ~55~ EL COMPLEJO ILEX 3 3. .3 3. .4 4. .2 2. . C Co oe ef fi ic ci ie en nt te e d de e D Di if fe er re en nc ci ia ac ci ió ón n G Ge en né ét ti ic ca a y y A AM MO OV VA A Los análisis de la estructura genética interpoblacional de Ilex sp. se establecieron a través del coeficiente de diferenciación genética (FST) y el cómputo de las proporciones inferidas mediante el análisis de agrupamiento bayesiano. La Tabla 11 muestra los valores del coeficiente de diferenciación genética (FST) y el número de migrantes (Nm) estimado para las poblaciones de Ilex sp. analizadas. En la Tabla 12 se muestran los resultados del AMOVA para la diferenciación genética del complejo Ilex. El valor de FST varió considerablemente entre las diferentes comparaciones establecidas. El mínimo valor se encontró entre las poblaciones de I. azorica (FST = 0,030), mientras que la mayor diferenciación genética se encontró entre las poblaciones de I. perado ssp. platyphylla de Apartacaminos y la de I. canariensis de Vallehermoso (APAT-P / VAHE-C) ambas de La Gomera, que revelaron un FST = 0,524. Si comparamos la diferenciación genética media por especie y subespecie, se obtienen valores de 0,203; 0,173 y 0,030 para I. perado sp. platyphylla, I. canariensis e I. azorica; respectivamente. Los valores indican que I. perado ssp. lopezlilloi está muy diferenciada de I. azorica e I. canarienses ( 0,382 y 0,371; respectivamente); sin embargo, existe una menor diferenciación genética con I. perado ssp. platyphylla ( 0,134). Los rangos de diferenciación de I. perado ssp. platyphylla son similares con respecto a sus congéneres; esto es, 0,371 comparada con I. azorica y 0,384 en relación a I. canariensis. Finalmente, la diferenciación genética entre estas dos últimas especies es considerable ( 0,461). EL COMPLEJO ILEX ~56~ La representación gráfica de los valores medios de FST encontrados en y entre los diferentes taxones analizados del género Ilex se muestra en la Fig. 8. Como puede observarse, la diferenciación genética entre las subespecies de I. perado de Canarias es bastante escasa y presentan cifras que son más propias para poblaciones de una misma especie (tal como queda reflejado); mientras que los valores superiores a 0,25 se reservan predominantemente para las relaciones interespecíficas donde la diferenciación genética es más fuerte. IPLGIPPG IPLGIPPT IPLG-IAA IPLG-ICG IPLG -ICT IPLG-ICP IPLG -ICC IPPG IPPGIPPT IPPG-IAA IPPG -ICG IPPG-ICT IPPG-ICP IPPG-ICC IPPT IPPT-IAA IPPT-ICG IPPT-ICT IPPT-ICP IPPT-ICC IAA IAA-ICG IAA-ICT IAA-ICP IAA-ICC ICG-ICT ICG-ICP ICG-ICC ICT ICT-ICP ICT-ICC ICP-ICC 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,55 Valores medios de FST IPLG:Ilex perado ssp. lopezlilloi (La Gomera), IPPG:Ilex perado ssp. platyphylla (La Gomera), IPPT:Ilex perado ssp. platyphylla (Tenerife), IAA:Ilex azorica (Azores), ICG:Ilex canariensis (La Gomera), ICT:Ilex canariensis (Tenerife), ICP:Ilex canariensis (La Palma) e ICC:Ilex canariensis (Gran Canaria) Ilex canariensis I. azorica vs I. canariensis I. perado ssp. platyphylla vs I. canariensis I. perado ssp. lopezlilloi vs I. canariensis I. perado ssp. lopezlilloi vs I. perado ssp. platyphylla Fig. 8 Representación gráfica de los valores medios de FST obtenidos entre las poblaciones y taxones estudiados. En verde comparaciones intraespecíficas de la misma isla. ~57~ EL COMPLEJO ILEX Tabla 11 Coeficiente de diferenciación genética (FST) y número de migrantes (Nm) para las poblaciones de Ilex ENGO-L SUGO-P PARC-P APAT-P MOQU-P CAFO-P CRTA-P TROQ-A LAFO-A VAHE-C LOJA-C MOQU-C CALD-C TILO-C TAMA-C ENGO-L 2,198 2,596 1,338 1,341 1,286 1,582 0,395 0,415 0,361 0,428 0,426 0,393 0,477 0,472 SUGO-P 0,102ns 3,369 0,891 0,722 0,71 0,905 0,290 0,305 0,306 0,372 0,341 0,317 0,400 0,359 PARC-P 0,088 ns 0,069 ns 0,789 0,695 0,753 0,954 0,288 0,296 0,307 0,358 0,338 0,315 0,405 0,383 APAT-P 0,157*** 0,219*** 0,241*** 0,632 0,523 0,623 0,255 0,279 0,227 0,297 0,278 0,251 0,311 0,287 MOQU-P 0,157*** 0,257*** 0,264*** 0,283*** 3,670 4,440 0,757 0,780 0,440 0,525 0,531 0,477 0,553 0,565 CAFO-P 0,163*** 0,260*** 0,249*** 0,324*** 0,064*** 5,091 0,552 0,581 0,429 0,563 0,569 0,519 0,58 0,579 CRTA-P 0,136*** 0,216*** 0,208*** 0,286*** 0,053*** 0,047*** 0,655 0,676 0,397 0,501 0,488 0,446 0,533 0,539 TROQ-A 0,387*** 0,463*** 0,465*** 0,495*** 0,248*** 0,312*** 0,276*** 8,076 0,251 0,316 0,285 0,265 0,310 0,266 LAFO-A 0,376*** 0,451*** 0,458*** 0,473*** 0,243*** 0,301*** 0,270*** 0,030ns 0,272 0,337 0,307 0,286 0,341 0,292 VAHE-C 0,409*** 0,449*** 0,449*** 0,524*** 0,362*** 0,368*** 0,387*** 0,499*** 0,479*** 0,910 1,043 0,753 1,795 1,075 LOJA-C 0,369*** 0,402*** 0,411*** 0,457*** 0,323*** 0,307*** 0,333*** 0,442*** 0,426*** 0,215ns 1,208 1,033 1,359 1,027 MOQU-C 0,370*** 0,423*** 0,425*** 0,473*** 0,320*** 0,305*** 0,339*** 0,467*** 0,449*** 0,193* 0,171ns 1,255 1,680 1,173 CALD-C 0,389*** 0,441*** 0,442*** 0,499*** 0,344*** 0,325*** 0,359*** 0,486*** 0,467*** 0,249*** 0,195** 0,166** 1,361 1,321 TILO-C 0,344*** 0,385*** 0,382*** 0,446*** 0,311*** 0,301*** 0,319*** 0,446*** 0,423*** 0,122ns 0,155*** 0,130*** 0,155*** 1,884 TAMA-C 0,346*** 0,411*** 0,395*** 0,465*** 0,307*** 0,302*** 0,317*** 0,485*** 0,461*** 0,189*** 0,196*** 0,176*** 0,159*** 0,117*** Número de migrantes (sobre la diagonal) y coeficiente de diferenciación genética (bajo la diagonal). En rojo los menores valores y en verde los valores más altos. ns: no significativo; *: p < 0,05; ** p < 0,01; ***: p < 0,001. EL COMPLEJO ILEX ~58~ Los resultados del AMOVA (Tabla 12) revelaron que todas las pruebas de diferenciación para los distintos niveles jerárquicos considerados fueron altamente significativas. La mayor parte de la varianza se encontró entre los taxones (44,83%), seguidos muy de cerca por la diferenciación en las poblaciones (42,12%) y por último entre las poblaciones de los distintos taxones (13,05%). Tabla 12 Análisis jerárquico de varianza molecular (AMOVA) de la diversidad genética de Ilex sp. FUENTE DE VARIACIÓN GL SUMA DE CUADRADOS VARIANZA EN LOS COMPONENTES PORCENTAJE DE VARIACIÓN Entre taxones 3 788,578 5,232 44,83 FCT = 0,448 *** Entre las poblaciones en los taxones 11 317,634 1,523 13,05 FSC = 0,237 *** Dentro de las poblaciones 220 1081,542 4,916 42,12 Total 234 2187,753 11,671 100,00 FST = 0,579 *** GL: grados de libertad, FCT: coeficiente de diferenciación genética entre regiones, FSC: coeficiente de diferenciación genética entre poblaciones en las regiones, FST: coeficiente de diferenciación genética entre todas poblaciones, ***: p < 0,001. 3 3. .3 3. .4 4. .3 3. . U UP PG GM MA A y y N NJ J Los valores de la distancia genética de Nei (1972) sirvieron de base para la construcción del dendrograma UPGMA establecido sobre las poblaciones (Fig. 9) y en el cual se observa claramente la disgregación de las mismas en tres grupos bien definidos. En primera instancia se separa I. canariensis del resto de las especies del género con una fortaleza del 86%; la siguiente rama distingue las poblaciones de I. perado e I. azorica con un 84% de fortaleza. Sin embargo, el distanciamiento a nivel de las subespecies (I. perado ssp. platyphylla e I. perado ssp. lopezlilloi) no está lo suficientemente marcado. Según este dendrograma, las poblaciones de ambas subespecies se agrupan de acuerdo a su localidad de procedencia y, por tanto, la población de I. perado ssp. lopezlilloi está más relacionada con las poblaciones de I. perado spp. platyphylla de La Gomera (de donde la primera subespecie es endémica). ~59~ EL COMPLEJO ILEX Un segundo árbol (Neighbor-Joining; Fig. 10) basado en las distancias individuales DAS (Chakravorty & Jin, 1995) muestra otra vez la evidente separación de los individuos de I. azorica (triángulos violáceos) e I. canariensis (círculos). También es visible la mayor afinidad de los ejemplares de I. perado ssp. platyphylla de acuerdo a su isla de procedencia. No obstante, existen siete individuos pertenecientes a I. perado ssp. platyphylla de la población de Casa Forestal de Tenerife que aparecen incluidos entre los ejemplares de I. canariensis. Esta aproximación genética de los individuos de I. perado ssp. platyphylla con I. canariensis constituye un resultado inesperado considerando que son especies completamente distintas, a priori bien diferenciadas tanto morfológicamente como genéticamente según el dendrograma UPGMA previamente descrito. En cuanto a I. perado ssp. lopezlilloi (rombos rojos), este diagrama coincide con el anterior situando a los individuos de esta subespecie más próximos a algunos de I. perado ssp. platyphylla de su propia isla. Fig. 9 Dendrograma UPGMA basado en las distancias genéticas de Nei (1972) para las poblaciones del género Ilex analizadas. Los códigos de las poblaciones provienen de la Tabla 2. 86 APAT-P ENGO-L SUGO-P PARC-P La Gomera MOQU-P CAFO-P CRTA-P Tenerife Ilex perado TROQ-A LAFO-A Ilex azorica Gran Canaria TAMA-C La Gomera VAHE-C La Palma TILO-C CALD-C MOQU-C Tenerife Tenerife LOJA-C Ilex canariensis 75 42 43 49 48 54 100 84 74 46 41 30 56 0.00.10.20.30.40.50.6 Distancia Genética de Nei EL COMPLEJO ILEX ~60~ 3 3. .3 3. .4 4. .4 4. . A An ná ál li is si is s d de e C Co oo or rd de en na ad da as s P Pr ri in nc ci ip pa al le es s El análisis de coordenadas principales (PCoA) separa claramente las poblaciones de Ilex azorica (TROQ-A y LAFO-A) e I. canariensis (VAHE-C, LOJA-C, MOQU-C, CALD-C, TILO-C y TAMA-C) de las demás poblaciones analizadas. Las diferencias entre los individuos de I. perado ssp. lopezlilloi e I. perado ssp. platyphylla son prácticamente imperceptibles; mientras que los mismos siete individuos de la población de Casa Forestal de Tenerife vuelven a mezclarse con la población de I. canariensis (Fig. 11). Este agrupamiento puede deberse a un error en la identificación de las muestras o a un proceso de hibridación (ver discusión). Dos aspectos son destacables en este análisis; por un lado, la separación a nivel de especie dentro del género (con la excepción de los individuos de CAFO-P) y la similitud entre las subespecies I. perado ssp. platyphylla e I. perado ssp. lopezlilloi que se integran en el mismo espacio. Las dos coordenadas principales de este análisis explican el 70,84% de la variación encontrada. 0.05 ENGO-L SUGO-P PARC-P APAT-P MOQU-P CRTA-P TROQ-A LAFO-A VAHE-C LOJA-C MOQU-C CALD-C TILO-C TAMA-C CAFO-P Fig. 10 Neighbor-Joining individual para las poblaciones del género Ilex analizadas. Los códigos de las poblaciones provienen de la Tabla 2 7 individuos de CAFO-P ~61~ EL COMPLEJO ILEX 3 3. .3 3. .4 4. .5 5. . A An ná ál li is si is s B Ba ay ye es si ia an no o La base de datos para el análisis bayesiano del género Ilex incluyó 240 individuos, 8 loci y 15 poblaciones. Las pruebas se hicieron para valores de K = 1 – 10 obteniéndose la máxima probabilidad de los datos en K = 5, lo que sugiere niveles en estructuración adicionales al número de taxones (4) en la muestra total. La asignación de cada población a uno de los grupos definidos anteriormente se ilustra en un histograma para las proporciones inferidas a partir del análisis bayesiano (Fig. 12) en el cual cada línea vertical representa un organismo que tiene tantos segmentos coloreados como fracciones de pertenencia tenga en los grupos K. Las líneas negras separan las distintas poblaciones. En el gráfico puede observase que el primer grupo incluye a los individuos de Ilex perado ssp. lopezlilloi e Ilex perado ssp. platyphylla de La Gomera, mientras el segundo grupo inferido concentra las muestras de Ilex perado ssp. platyphylla de Tenerife. Todas los individuos de Ilex azorica analizados fueron 2da Coordenada (15,19%) 1ra Coordenada (55,65%) ENGO-L SUGO-P PARC-P APAT-P MOQU-P CAFO-P CRTA-P TROQ-A LAFO-A VAHE-C LOJA-C MOQU-C CALD-C TILO-C TAMA-C Ilex azorica Ilexcanariensis Ilex perado 7 individuos de CAFO-P Fig. 11 Análisis de coordenadas principales para los individuos de las poblaciones analizadas del género Ilex. Los códigos de las poblaciones corresponden a los presentados en la Tabla 2 EL COMPLEJO ILEX ~68~ de I. canariensis en los dendrogramas y el PCoA, el alto grado de pertenencia que los identifica con las poblaciones de I. canariensis y la estructuración intraespecífica de esta última especie encontrada en el análisis bayesiano para las poblaciones gomeras y tinerfeñas (no así en la de Gran Canaria); nos conducen a deducir la posibilidad de que se estén llevando a cabo eventos de hibridación e introgresión entre estos dos taxones en La Gomera y Tenerife donde ambas especies coexisten (Lems, 1968; Kunkel, 1977b; Andrews, 1983; Manen, 2004; Cabrera García et al., 2005), lo cual no sucede en Gran Canaria. Inicialmente, no creemos que haya sido un error de muestreo o una equivocación en la identificación o catalogación de estos 7 ejemplares como I. perado siendo I. canariensis, ya que las hojas recogidas presentan las características morfológicas propias de I. perado ssp. platyphylla tales como la presencia de espinas en el borde de las mismas. La revisión morfológica de las muestras (conservadas en gel de sílice) así lo vuelve a confirmar. Cuando en 1942 Loesener establecía las separación entre I. perado e I. canariensis basado en características anatómicas y morfológicas relacionó a I. canariensis con la especie americana I. opaca. Basado en estas deducciones Lems (1968) consideró a I. canariensis como una especie de conexión trasatlántica, al mismo tiempo que citaba la capacidad de I. perado para formar híbridos con I. aquifolium; también Baas (1978) asociaba la variación anatómica del género Ilex con la existencia de importantes procesos de hibridación en su evolución. Así pues, ni la disgregación de I. perado e I. canariensis ni la capacidad de hibridación entre las especies del género son conceptos novedosos. En este sentido, recientes investigaciones realizadas con distintos marcadores moleculares han demostrado la diferenciación genética entre I. perado e I. canariensis y, como resultado, son varios los estudios filogenéticos que sitúan a estos taxones en grupos biogeográficos disímiles. Las publicaciones coinciden en la dificultad de definir una posición filogenética determinada para I. canariensis y sugieren que las débiles barreras reproductivas han podido permitir eventos de hibridación e introgresión nuclear y/o plastídica interespecífica unilateral con I. perado como donador masculino ~69~ EL COMPLEJO ILEX (Cuénoud et al., 2000; Manen et al., 2002; Manen, 2004). La hibridación e introgresión entre varias especies ocurre frecuentemente en regiones de simpatría o en los límites de las zonas donde las especies se distribuyen y se ponen en contacto unas con otras; por esto, su ocurrencia en islas oceánicas provee buenos ejemplos de especiación y diferenciación vegetal, razón de más para considerar el importante papel que ha jugado en los procesos de evolución en Ilex (Setoguchi & Watanabe, 2000; Selbach-Schnadelbach et al., 2009; Manen et al., 2010). Sería importante abrir una línea de investigación en Canarias en este sentido, intentando averiguar y confirmar la existencia de elementos híbridos en el archipiélago, la extensión del fenómeno y el grado de recuperación que puede alcanzar en los ecosistemas a fin de determinar si es un proceso reciente o por el contrario un fenómeno que se remonta en el pasado evolutivo del género. 3 3. .4 4. .3 3. . I Im mp pl li ic ca ac ci io on ne es s p pa ar ra a l la a C Co on ns se er rv va ac ci ió ón n G Ge en né ét ti ic ca a Con base en los resultados obtenidos en el análisis de Ilex perado spp. lopezlilloi e I. perado ssp. platyphylla mediante de microsatélites puede sostenerse que ambas subespecies comparten el mismo acervo genético y que son probablemente el mismo taxón. Teniendo en cuenta que Ilex perado spp. lopezlilloi está clasificada como “en peligro de extinción”, se recomienda la revisión taxonómica de estas poblaciones y un posible cambio de enfoque en las acciones actuales de gestión para la conservación de estos efectivos. No obstante, es probable que esto no ocurra ya que resultados similares se encontraron entre los acervos genéticos de Myrica rivas-martinezii y M. faya (González-Pérez et al., 2009c) y a pesar de los mismos, M. rivas-martinezii sigue considerándose una especie fuertemente amenazada e incluida en el Catálogo Canario de Especies Protegidas (CCEP, 2010). Al parecer, en Tenerife (y posiblemente también La Gomera) se está llevando a cabo la hibridación e introgresión entre Ilex perado e I. canariensis. El monitoreo de las consecuencias de este fenómeno en lo referente a la EL COMPLEJO ILEX ~70~ evolución del genoma de ambas líneas genéticas a lo largo de las sucesivas generaciones debería ser considerado en futuros planes de manejo en la conservación genética de ambas especies. Será necesario también confirmar el grado de diversidad genética de Ilex azorica, a la vez que el importante número de alelos exclusivos detectados en las poblaciones analizadas. Los resultados encontrados en este estudio parecen mostrar que I. azorica es una especie diferenciada de I. perado por lo que, desde el punto de vista de la conservación, adquiriría una mayor relevancia este rango taxonómico. I. perado ssp. azorica se encuentra entre los 37 taxones incluidos en el Top100 de Azores siendo prioritaria en términos de futuras acciones de conservación en Azores (Cardoso et al., 2008). ~71~ SILENE NOCTEOLENS S Si il le en ne e n no oc ct te eo ol le en ns s ~73~ SILENE NOCTEOLENS 4 4. .1 1. . S Si il le en ne e n no oc ct te eo ol le en ns s W We eb bb b & & B Be er rt th he el l El género Silene L. (Caryophyllaceae) contiene cerca de 700 especies alrededor del mundo, distribuidas en las regiones templadas del hemisferio norte. El principal centro de su diversidad es el Mediterráneo (donde crece cerca de la mitad de las especies) y también el suroeste de Asia; especialmente Turquía, que cuenta con 135 especies (Melzheimer, 1988; Oxelman & Lidén, 1995; Duran & Menemen, 2003). En el género (incluyendo Lychnis y Melandrium) se exhibe una gran variedad de caracteres ecológicos y morfológicos (Chater & Walters, 1964), pudiéndose encontrar una amplia diversidad de sistemas reproductivos: dioecia (machos y hembras), ginodioecia (coexistencia de hembras y hermafroditas), trioecia (coexistencia de machos, hembras y hermafroditas) y hermafroditismo (Desfeux et al., 1996); por hablar en términos generales. Desfeux et al. (1996) compararon los resultados filogenéticos con la información compilada sobre los sistemas reproductivos y los ciclos de vida de las especies de Silene estudiadas hasta ese entonces y algunos géneros más cercanos (Tabla 13). Concluyeron que es poco probable que el hermafroditismo fuera el sistema de cruzamiento ancestral, aunque este parece haber derivado al menos dos veces de un estado de ginodioecia y estar asociado con la evolución hacia la autogamia. Opinan que la dioecia también pudo haber surgido dos veces (o quizá tres), bajo muy diferentes condiciones ecológicas. Aluden a la existencia de evidencias que sugieren que la determinación del sexo en varias especies de Silene está relacionada con genes tanto del núcleo como del citoplasma y esto, a su vez, apunta fuertemente a que la dioecia en Silene pueda provenir de una ginodioecia núcleo-citoplásmica original. No obstante, confirman que es ampliamente posible que los sistemas reproductivos (tipos sexuales) y de cruzamiento (nivel de autogamia) sean variables no solo dentro del género sino también dentro de algunas especies, a nivel intra e interpoblacional. SILENE NOCTEOLENS ~74~ Tabla 13 Sistemas reproductivos y ciclos de vida en el género Silene y similares Adaptado de Desfeux et al. 1996 con anotaciones del Dr. Santos-Guerra. Shykoff (1988), que probó la ginodioecia de S. acaulis, encontró que las plántulas que habían sido el resultado de una autopolinización pura exhibían depresión endogámica en las primeras etapas del cultivo. Las plantas hermafroditas fueron autocompatibles con flores protándricas. Según Eguiarte et al. (2007) en las especies hermafroditas autocompatibles una elevada tasa ESPECIE SECCIÓN SISTEMA REPRODUCTIVO SISTEMA DE CRUZAMIENTO REFERENCIAS Silene coronaria (P) Lychniformes GD1,17 S1 1. Knuth, 1908 2. Blaringhem, 1924 3. Correns, 1928 4. Marsden-Jones & Turill, 1957 5. Heslop-Harrison & HeslopHarrison, 1958 6. Chater & Walters, 1964 7. Pomonarev & Demyanova,1975 8. Bock, 1976 9. De Bilde, 1984 10. Dulberger & Horovitz, 1984 11. Jennersten et al. 1988 12. Shykoff, 1988 13. Biere, 1991 14. Pettersson, 1992 15. Hauser & Loeschcke, 1994 16. Harmanutz & Innes, 1994 17. Maurice & Desfeux (Obs. Per.) 18. Menges, 1995 19. Talavera et al., 1996 20. Soldaat et al., 1997 21. Pettersson, 1997 22. Maurice et al., 1998 23. Andersson, 1999 24. Lardon et al., 1999 25. Hemborg & Karlsson, 1999 26. Kephart et al., 1999 27. Buide & Guitián, 2002 H= Hermafroditismo GD= Ginodioecia GM= Ginomonoecia AM= Andromonoecia D= Dioecia SD= Subdioecia T= Trioecia A= Anual B= Bianual P=Perenne S=Autopolinizante (Selfpollination) O=Exogamia (Outcrossing) Cl= Cleistógama (*) Referencia añadida sobre la tabla original S. flos-cuculi (P) Lychniformes GD-GM1,2 H2,13,15 O15 S. viscaria (P) Lychniformes GD-GM1 GD-AM11 S. italica (P) Siphonomorpha GD-GM17, 21(*) S. nutans (P) Siphonomorpha GD-GM1,7,9,17 S. fruticosa (P) Siphonomorpha S. otites (B, P) Otites D20, SD6 O S. pseudotites = Silene otites (B, P) Otites D, SD6 O S. roemeri (B, P) Otites GD-AM3,6 O S. vulgaris (P) Inflatae GD4,10,14,23(*) S. uniflora (*) Inflatae GD-GM21 S. saxifraga (P) Suffruticosae AM-GM1 GM17 S. acaulis ssp. longiscapa (P) Nanosilene T8 O S. acaulis ssp. bryoides (P) Nanosilene D8 O S. acaulis (P) Nanosilene GD-T12,16 O S. acaulis ssp. exscapa (*) Nanosilene SD22 S. acaulis ssp. longiscapa (*) Nanosilene SD22 S. armeria (A, B) Compactae GD1,17 S. noctiflora (A) Elisanthe H1 GM-GD1,7 S S. latifolia [(A)-P] Elisanthe D6,24(*) O S. dioca (P) Cordifolia D6,25(*) O S. diclinis (P) Elisante D6 O S. inaperta (A) Rigidulae H Cl1 S. coeli-rosa (A) Eudianthe GD17 S. pendula (A) Erectorefractae GD5,17 S. stockenni (*) Erectorefractae GD-GM19 S. dichotoma (A) Dichotomae GD3 S. nocturna (A) Scorpioideae H S, Cl6 S. gallica (A) Silene H1 S, Cl1 S. cerastioides = S. sclerocarpa (A) Silene H1 Cl1,17 S. apetala = S. decipiens (A) Dipterosperma H Cl1 S. conica (A) Conoimorpha H S1,17 S. conoidea (A) Conoimorpha H17 Cl17 S. acutifolia (*) Cordifolia H27 S. regia (*) H18 S. douglassi (*) H26 Dianthus seguieri (P) GD1 Saponaria ocymoides (P) GD1 Agrostemma githago (A) GD1 S1 Cucubalus baccifer (P) GD1 ~75~ SILENE NOCTEOLENS de entrecruzamiento podría estar determinada, en parte, por la depresión endogámica. De hecho, los autofecundantes tienden a expresar más depresión endogámica tardía en sus ciclos de vida, mientras las especies con fecundación cruzada tienden a expresar la depresión por consanguinidad de manera substancial a lo largo del ciclo de vida. No obstante, las especies definido como hermafroditas y aquellas especies en las que no se han descrito flores femeninas, como S. gallica y S. conica, han sido reportadas como autógamas e incluso cleitógamas (Tabla 13; Desfeux et al., 1996). En la especie hermafrodita Silene douglasii, Kephart et al. (1999) encontraron altos niveles de depresión endogámica por familias maternas; al hacer uso de medias poblacionales, encontraron altos niveles en las primeras y postreras etapas del ciclo de vida y bajos niveles de supervivencia. Otros autores también han detectado depresión por consanguinidad en la producción de semillas (Husband & Schemske 1995, Kittelson & Maron 2000). Según Buide & Guitián (2002) el hermafroditismo no debe ser tan frecuente en el género Silene como se sugiere por muchas floras en las cuales no se hace referencia a la ginodioecia. Silene acutifolia es autocompatible y se ha comprobado que la dicogamia no constituye una barrera a la autofecundación; por esto, los autores sugieren que S. acutifolia ha surgido hace relativamente poco dentro del género. En Canarias se han reportado 26 especies del género Silene, 8 de las cuales son endémicas; a saber: S. berthelotina Webb (Tenerife y el Hierro), S. bourgeaui Webb ex Christ (La Gomera), S. canariensis Willd. (Gran Canaria), S. lagunensis C. Sm ex Christ (Tenerife), S. nocteolens Webb & Berthel (Tenerife), S. pogonocalyx (Svent.) Bramwell, S. sabinosae Pit. (El Hierro) y S. tamaranae Bramwell (Gran Canaria) (Izquierdo et al., 2004; Arechavaleta et al., 2010). La “Conejera de risco”, Silene nocteolens, es un endemismo exclusivamente tinerfeño y se encuentra catalogada como “En Peligro Crítico” por la UICN. Dispone, además, de otras figuras de protección en el Convenio de Berna y en el Catálogo Canario de Especies Protegidas donde aparece como “Vulnerable” en el Anexo II de la Ley 4/2010 (Moreno et al., 2008; CCEP, SILENE NOCTEOLENS ~76~ 2010). Se cree que las poblaciones se han visto mermadas debido a la depredación por los herbívoros (muflón y conejos) que destruyen las plantas en busca de sus raíces rizomatosas (Informe técnico, Parque Nacional El Teide; sin publicar). Silene nocteolens es una planta herbácea con base leñosa (Fig. 13); hemicriptófita de raíz perenne y tallos floríferos de unos 50 cm de largo, vellosos hacia sus extremos y pegajosos. Caducifolia o con follaje subpersistente. Hojas de estrechamente lanceoladas a linear-lanceoladas, de hasta de 10 cm de largo, agudas, tomentosas, agrupadas o subverticiladas, formando rosetas en la base. Florece de mayo a junio y fructifica en agosto. Las inflorescencias son largas, con 2 a 12 flores blancas o ligeramente rosáceas, hermafroditas, que exhalan durante la noche un suave perfume propio de un sistema de polinización por insectos nocturnos (el epíteto de la especie hace referencia a esta particularidad). Los frutos son cápsulas ovadas, de 8 – 10 mm, dehiscentes por 6 dientes y contiene una media de 35 semillas. Las semillas son muy pequeñas (1 – 1,4 x 1 – 1,5 mm), reniformes; con caras reticuladas ligeramente convexas y con la zona basal cóncava. Normalmente la dispersión es anemófila y las semillas no se alejan más de 10 m de la planta madre. No presentan problemas en la germinación (Kunkel, 1977a; Bañares et al., 2004). La distribución de Silene nocteolens se circunscribe a dos localidades de alta montaña dentro del Parque Nacional del Teide. Según el censo realizado en 2008, el número de efectivos en Montaña Blanca asciende a 1100 individuos en tanto en Pico Viejo se han detectado unos 1713 ejemplares Fig. 13 Silene nocteolens ~77~ SILENE NOCTEOLENS aproximadamente (Eduardo Carqué, comunicación personal). Entre una y otra población existe una distancia de 6,2 km en línea recta (Fig. 14). Ambas poblaciones se encuentran sobre los 2500 msnm y en ambientes donde los piroclastos constituyen el sustrato dominante. Es esta capa de piedra pómez, de varios centímetros de espesor sobre suelos más o menos profundos, la que le facilita a las plantas el mantenimiento de la humedad edáfica; ya que sufren heladas en invierno y se mantienen en ausencia de lluvias hasta entrado el verano. Los factores abióticos anteriormente expuestos hacen de este ambiente un lugar inhóspito para la mayor parte de la vegetación. De hecho, estos hábitats pueden describirse como matorrales laxos en donde la especie dominante es la violeta del Teide (Viola cheiranthifolia). También prosperan otras especies acompañantes como Erysimun scoparium (Alhelí del Teide), Argyranthemun teneriffae (Margaza), etc. (Bañares et al., 2004). Silene nocteolens está descrita como una especie hermafrodita (Bañares et al., 2004); pero sus hábitos reproductivos no han sido objeto de un análisis profundo. Siguiendo la directriz demostrada en sus congéneres (S. inaperta, S. nocturna, S. gallica, S. cerastioides, S. apelata, S. conica y S. conoidea) se Fig. 14 Distribución de Silene nocteolens en el Parque Nacional del Teide 6,68 Km SILENE NOCTEOLENS ~78~ esperaría que S. nocteolens fuera también autopolinizante y/o cleistógama, incluso puede que presente ginomonodioecia-ginodioecia como S. noctiflora (Desfeux et al., 1996). Pero si el hermafroditismo estricto fuera el caso, el régimen de polinización estaría afectando los patrones demográficos de las poblaciones ya que la progenie de los cruzamientos entre individuos hermafroditas se establece significativamente mejor que la de los individuos producidos por autofecundación (Schaal, 1984). ~85~ SILENE NOCTEOLENS La tasa de mortalidad de los diferentes estadios vitales de Silene nocteolens se estimó mediante visitas anuales a la población de Montaña Blanca realizadas por el personal del Parque Natural del Teide. En las primeras visitas se censó a los individuos en dependencia a su estadio de vida y en años sucesivos se realizó el recuento para determinar tanto el número de individuos que habían pasado al siguiente estadio vital como la cantidad de especímenes muertos desde la visita inmediatamente anterior. No se tienen datos semejantes para Pico Viejo. De esta manera puede decirse que la tasa de mortalidad por estadio (mE) para la población de Silene nocteolens de Montaña Blanca obedece a la siguiente igualdad: en donde FE es el número de defunciones por estadio de vida y PE el número total de individuos para ese determinado estadio. 4 4. .2 2. .2 2. .3 3. . A An ná ál li is si is s E Es st ta ad dí ís st ti ic co o El Anexo I muestra un resumen de los programas informáticos utilizados en la caracterización genética de las poblaciones vegetales estudiadas. La estadística elemental de variabilidad genética de Silene nocteolens corresponde al número medio de alelos por locus (A), la heterocigosidad observada (Ho), la heterocigosidad esperada (He; Nei, 1973) y se consideró también el porcentaje de loci polimórficos (P). Estos análisis fueron calculados entre poblaciones y estadios de vida utilizando POPGENE 3.2 (Yeh et al., 1999), programa que también sirvió para obtener los valores de identidad y distancia genética de Nei (Nei, 1972). Para determinar si las poblaciones analizadas se encontraban en equilibrio Hardy-Weinberg se calculó el índice de fijación (FIS) y se realizó un SILENE NOCTEOLENS ~86~ test de probabilidad de Fisher implementado en el GENEPOP V4 (Rousset, 2008) en el que la hipótesis nula (H0) señala la existencia de unión al azar de los gametos para ese locus. La prueba de alelos nulos se hizo a través de MICRO-CHECKER (Van Oosterhout et al., 2004). En el análisis de la dinámica reproductiva en Silene nocteolens, el coeficiente de endogamia [FIS(T)] se calculó adicionando los datos de las plantas madres y las plántulas de modo que se generaron nuevos valores de Ho y He. Los análisis de correlación entre el coeficiente de endogamia y la tasa de mortalidad (mE) se calcularon según el método de Pearson para un intervalo de confianza del 95% mediante PASW STATISTICS 18 (anteriormente SPSS STATISTICS, IBM Company, Chicago, IL). Se ha utilizado el método de autocorrelación espacial de Smouse y Peakall (1999) implementado en GENALEX 6.4 (Peakall & Smouse, 2006) para generar los autocorrelogramas. Se probó la significancia de los coeficientes de correlación sobre la hipótesis nula de una estructura al azar utilizando 1000 permutaciones, 1000 repeticiones y un intervalo de confianza del 95%. Las distancias entre poblaciones para la construcción de un dendrograma UPGMA con fortaleza en los agrupamientos (1000 repeticiones) para Silene nocteolens fueron calculadas utilizando POPULATION 1.2.30BETA (Langella, 2005). Todos los árboles fueron visualizados y editados en MEGA4 (Tamura et al., 2007) y TREEVIEW 1.1.6 (Roderic, 2001). La obtención de los coeficientes de diferenciación (FST) se realizó con GENALEX 6.4 (Peakall & Smouse, 2006). Este programa fue utilizado también para generar el análisis de coordenadas principales (PCoA) y el análisis molecular de varianza (AMOVA). La estructura de las poblaciones fue inferida mediante un análisis Bayesiano implementado en el programa STRUCTURE 2.2 (Falush et al., 2007). Se asumió un modelo de mezcla y frecuencias alélicas independientes. Se obtuvo una serie de carreras independientes para cada valor de K (el número de grupos) entre 1 y 10. El análisis consistió en 105 períodos de prueba y una longitud de carrera 106 réplicas. En total se corrieron 5 análisis con estas ~87~ SILENE NOCTEOLENS especificaciones a fin de corroborar los resultados obtenidos. Los individuos fueron asignados a un “grupo” si su proporción de pertenencia (qi) a ese grupo era igual o mayor que el umbral de 0,05. El sistema de cruzamiento de Silene nocteolens se evaluó mediante el modelo de apareamiento mixto descrito por Ritland & Jain (1981) utilizando el programa MLTR (Ritland, 2002). Este procedimiento estima el coeficiente de endogamia materno por locus (Fm), la tasa de cruzamiento (tm), la tasa media de cruzamiento en un locus (ts), la tasa de cruzamiento entre individuos emparentados y la correlación del cruzamiento paterno dentro de la progenie (es decir, la probabilidad de que al escoger aleatoriamente un par de descendientes compartan ambos progenitores, rp). A partir de este último parámetro puede obtenerse la paternidad efectiva (Nep = 1/rp). De esta manera, la información de los loci detectados con microsatélites ha servido para estimar los patrones de transmisión genética entre progenitores y descendientes; a la vez que confirma la identidad genética de las plantas madres y su progenie. Se utilizó el método numérico de ExpectaciónMaximización (EM) y el error estándar (SE) fue estimado por repeticiones (104) sobre las familias. SILENE NOCTEOLENS ~88~ 4 4. .3 3. . R Re es su ul lt ta ad do os s 4 4. .3 3. .1 1. . C Ce eb ba ad do or re es s y y P Pr ro ot to oc co ol lo os s F Fu un nc ci io on na al le es s Aún cuando se desarrollaron 15 cebadores específicos para Silene nocteolens (Tabla 19), únicamente seis de estos (SN01, SN02, SN06, SN14, SN20 y SN21) mostraron un carácter polimórfico aceptable y fueron utilizados en el resto de las muestras (Tabla 20). Tabla 20 Secuencia de los seis cebadores funcionales en Silene nocteolens LOCUS CEBADOR/SECUENCIAS (5’3’) RANGO (pb) MOTIVO TM (ºC) EMBL SN01 R: GGAGATGCGCGTGGTTTCT F: CTAAGGACCACTAGATCATACT 176-213 (AG)15 60 FN563106 SN02 R: AACTGTTTGTACTCATCTTGTC F: GAATTCAAAATAACAAAAAGAAGT 114-221 (CA)45 55 FN563107 SN06 R: CCTTACAATTTGGTGTAAATC F: GCCTTAGTATATAAGTTTCC 171-231 (AG)37 55 FN563108 SN14 R: GCCCTAAAACTCTGTTGCAC F: GAATTCCCTGCTTACCGCC 66-100 (GA)22 60 FN563110 SN20 R: GGTGTTGATGCAAATGAAG F: GTGCCTACAACATATGAAGA 162-234 (GT)9 60 FN563112 SN21 R: GTCTCCGGTTTAAGCTCAATC F: TTGCAAAGTTTGGGTCCTTATC 143-206 (CT)14 60 FN563113 F: Forward, R: Reverse, pb: pares de bases, Tm: Temperatura de hibridación, EMBL: código correspondiente a cada locus en el Banco Europeo de Secuencias Nucleotídicas Los cebadores SN01, SN14, SN20 y SN21 presentaron mejores resultados en las condiciones básicas de amplificación (Fig. 16): 3 min de desnaturalización a 95 ºC; seguidos de 35 ciclos de 30 s a 95 ºC, 30 s de hibridación a 60 ºC y 1 min 30 s de elongación a 72 ºC; luego, otros 5 min de elongación a 72 ºC y culmina a 4 ºC por tiempo indefinido; estas condiciones de amplificación se abreviaron como el perfil SASN60 (el número hace referencia a la temperatura de hibridación). 95 ºC 60 ºC 72 ºC 4 ºC 0 20 40 60 80 100 Temperatura (ºC) 35 Ciclos 30 s ∞ 90 s 3 min 30 s 5 min Fig. 16 Perfil de amplificación SASN60 ~89~ SILENE NOCTEOLENS Por su parte; SN02 y SN06 difirieron de los primeros en la temperatura de hibridación, mostraron mejores resultados a 55 ºC (Perfil SASN55, Fig. 17). SN02 necesitó otros requerimientos en la mezcla de amplificación (3 mM MgCl2, BSA y DMSO) y SN06 requirió MgCl2 2,5 mM. Fig. 17 Perfil de amplificación SASN55 Los requerimientos específicos para cada uno de estos cebadores se resumen en la Tabla 21. Tabla 21 Condiciones específicas ensayadas para los cebadores de Silene nocteolens NOMBRE Tm MgCl2 BSA DMSO SN 01 60ºC 1,5 mM - - SN 02 55ºC 3,0 mM + + SN 06 55ºC 2,5 mM - - SN 14 60ºC 1,5 mM - - SN 20 60ºC 1,5 mM - - SN 21 60ºC 1,5 mM - - Tm: Temperatura de hibridación; +: requiere adición. 4 4. .3 3. .2 2. . N Ni iv ve el le es s d de e D Di iv ve er rs si id da ad d G Ge en né ét ti ic ca a 4 4. .3 3. .2 2. .1 1. . F Fr re ec cu ue en nc ci ia as s A Al lé él li ic ca as s En las poblaciones naturales de Silene nocteolens (sin considerar las muestras para los análisis parentales) se detectaron 96 alelos, correspondientes a 6 loci, todos polimórficos. El número de alelos varió entre 27 para el locus SN02 y 5 alelos para el locus SN20. Existe una mayor proporción de alelos exclusivos en la población de Pico Viejo (40,63%) que los hallados en Montaña Blanca (13,54%), aunque la mayor parte de los alelos (45,83%) estaban presentes en ambas poblaciones (Anexo V). 95 ºC 55 ºC 72 ºC 4 ºC 0 20 40 60 80 100 Temperatura (ºC) 35 Ciclos 30 s ∞ 90 s 3 min 30 s 5 min SILENE NOCTEOLENS ~90~ Por otro lado, al considerar las frecuencias alélicas de acuerdo al estadio de vida de los individuos y a su población de procedencia (Anexo VI), el mayor número de alelos exclusivos se encontró en los virginales de Pico Viejo (PV-VI) que presentaron 5 alelos exclusivos (5,21%); en los vegetativos y reproductores jóvenes de Pico Viejo (PV-VE y PV-RJ) se encontraron 3 alelos exclusivos (3,13%); en los virginales de Montaña Blanca y en los reproductores adultos de Pico Viejo (MB-VI y PV-RA), 2 alelos exclusivos (2,08%) y para los vegetativos y reproductores de Montaña Blanca (MB-VE, MB-RJ y MB-RA) solo se reportó un alelo exclusivo (1,04%). En total, 18 alelos exclusivos; 5 para Montaña Blanca y 13 en Pico Viejo. No se encontraron alelos exclusivos en los estadios juveniles de ninguna de las poblaciones. Dieciséis alelos (SN01-184, SN01-186, SN01-188, SN02-154, SN02-156, SN06-187, SN06-189, SN14-66, SN14-68, SN14-78, SN14-90, SN20-228, SN20-230, SN20-232, SN21-170 y SN21-194) fueron detectados en todos los estadios de vida para ambas poblaciones analizadas. Sin embargo, no se reportaron alelos fijados ni en las poblaciones ni por estadio de vida. 4 4. .3 3. .2 2. .2 2. . V Va ar ri ia ab bi il li id da ad d G Ge en né ét ti ic ca a Las Tabla 22 y Tabla 23 detallan los niveles de diversidad genética en Silene nocteolens según los estadios de vida por población y considerando solo los diferentes estadios, respectivamente. En general, la población de Pico Viejo mostró una mayor riqueza alélica (A = 13,67) que la encontrada para la población de Montaña Blanca (A = 9,50); siendo la media entre las poblaciones A = 11,83. Al tomarse en cuenta la población de procedencia y el estadio de vida, el rango oscila de 6,17 para los reproductores adultos de Montaña Blanca (MB-RA) a 10,67 para las plantas virginales de Pico Viejo (PV-VI). Cuando se analizaron todos los individuos de S. nocteolens agrupándolos según su estadio de vida sin tener en cuenta la población de procedencia (Tabla 23), el valor más pequeño del número medio de alelos por locus correspondió a las plantas del estado vegetativo (10,83) mientras que los virginales presentaron el valor más alto (12,83). ~91~ SILENE NOCTEOLENS Tabla 22 Parámetros de diversidad genética de Silene nocteolens según el estadio de vida y población POBLACIÓN ESTADIO Nº A HO He P Montaña Blanca MB-JU 26 7,00 0,546 0,667 100% MB-VI 24 7,50 0,574 0,686 100% MB-VE 26 7,33 0,616 0,701 100% MB-RJ 26 6,33 0,615 0,667 100% MB-RA 25 6,17 0,582 0,705 100% Media MB 127 9,50 0,590 0,707 100% Pico Viejo PV-JU 26 9,50 0,680 0,782 100% PV-VI 30 10,67 0,719 0,771 100% PV-VE 23 8,33 0,636 0,756 100% PV-RJ 25 9,50 0,693 0,768 100% PV-RA 25 9,83 0,652 0,754 100% Media PV 129 13,67 0,679 0,778 100% Total 256 15,83 0,636 0,784 100% Nº: es el número de individuos analizados por población y estadio de vida, A: Número medio de alelos por locus, Ho: Heterocigosidad observada, He: Heterocigosidad esperada y P: Porcentaje de loci polimórficos. Estadios de vida según Tabla 14. Tabla 23 Índices de diversidad genética por estadios en Silene nocteolens ESTADIO Nº A HO He P JU 52 11,83 0,613 0,774 100% VI 54 12,83 0,656 0,781 100% VE 49 10,83 0,626 0,776 100% RJ 51 11,67 0,663 0,774 100% RA 50 12,17 0,617 0,779 100% Total 256 15,83 0,636 0,784 100% Nº: es el número de individuos analizados por estadio de vida, A: Número medio de alelos por locus, Ho: Heterocigosidad observada, He: Heterocigosidad esperada y P: Porcentaje de loci polimórficos. Estadios de vida según Tabla 14. Desde cualquier punto de vista (bien sea por estadios de vida, en cada población o en el total de ambas poblaciones analizadas) se obtuvo un 100% de polimorfismo en esta especie. De manera general, la especie muestra una alta heterocigosidad esperada ya que revela valores en torno a 0,784. En concordancia con los resultados para la riqueza alélica, la población de Pico Viejo presentó mayor heterocigosidad esperada (He = 0,778) que la de Montaña Blanca (He = 0,707). Si tenemos en cuenta los resultados al analizar solamente los estadios de vida, independientemente de la población de procedencia, la heterocigosidad esperada varía desde He = 0,774 en los juveniles y reproductores jóvenes hasta He = 0,779 en los reproductores adultos (Tabla 23). Pero al separar los SILENE NOCTEOLENS ~92~ estadios por población (Tabla 22), los juveniles y reproductores jóvenes de Montaña Blanca registran una He = 0,667 mientras que los juveniles de Pico Viejo alcanzan una He = 0,782; siendo estos los valores extremos. 4 4. .3 3. .3 3. . E Es st tr ru uc ct tu ur ra a G Ge en né ét ti ic ca a e en n l la as s P Po ob bl la ac ci io on ne es s 4 4. .3 3. .3 3. .1 1. . E Eq qu ui il li ib br ri io o H Ha ar rd dy y- -W We ei in nb be er rg g En la Tabla 24 se muestran los valores del coeficiente de endogamia (FIS) y sus respectivos grados de significación para los estadios de vida de ambas poblaciones analizadas de Silene nocteolens. En ambas poblaciones tres loci (SN02, SN06 y SN14) mostraron desviaciones del equilibrio Hardy-Weinberg, siendo además valores positivos en su mayor parte. Por el contrario, dos de los loci (SN20 y SN21) se encontraron en equilibrio Hardy-Weinberg en las dos poblaciones estudiadas; mientras que SN01 se encontró en equilibrio Hardy-Weinberg en la población de Pico Viejo, pero con un defecto de heterocigotos (FIS > 0) en Montaña Blanca. De manera global el valor de FIS fue positivo y altamente significativo en todos los estadios y poblaciones al considerar conjuntamente todos los loci (Tabla 24). Tabla 24 Análisis de probabilidad de desviación del equilibrio de Hardy-Weinberg según estadios de vida y poblaciones de Silene nocteolens ESTADIO SN01 SN02 SN06 SN14 SN20 SN21 FISHER MB-JU 0,265ns 0,257* 0,271*** 0,168*** 0,205ns 0,007ns 0,200*** MB-VI 0,372 ns 0,174ns 0,134* 0,401*** -0,064ns -0,037 ns 0,183*** MB-VE 0,459** -0,012ns 0,019 ns 0,130*** 0,452ns -0,011ns 0,136*** MB-RJ 0,190ns 0,061ns 0,034 ns 0,381*** -0,124ns 0,176ns 0,077*** MB-RA 0,451*** 0,240** 0,261** 0,163*** -0,112ns 0,130ns 0,199*** MB 0,351*** 0,150*** 0,145*** 0,388*** -0,006ns 0,027ns 0,163*** PV-JU 0,039ns 0,213*** 0,062ns 0,324*** 0,037ns 0,062** 0,151*** PV-VI 0,094ns 0,063ns 0,205** 0,337*** -0,007ns 0,002ns 0,088*** PV-VE 0,276ns 0,321* 0,283** 0,326*** -0,276ns 0,062* 0,178*** PV-RJ 0,076ns 0,111* 0,023ns 0,158*** 0,373ns -0,004ns 0,118*** PV-RA 0,042ns 0,075ns 0,250** 0,310*** 0,358ns 0,005ns 0,158*** PV 0,095* 0,140*** 0,165*** 0,275*** 0,045ns 0,052* 0,132*** ns: no significativo; *: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001. Ahora bien, en la población de Montaña Blanca existen parcelas de seguimiento definidas por el personal del Parque Nacional del Teide, las cuales están constituidas en dos grupos separados geográficamente. En el primer ~93~ SILENE NOCTEOLENS grupo se encuentran 6 parcelas muy próximas la una de la otra (menos de 5 m de separación entre ellas) y en el segundo grupo se encuentran otras tres; separados ambos grupos por aproximadamente 50 m (Fig. 18). Un segundo análisis de probabilidad de desviación del equilibrio HardyWeinberg fue realizado para las muestras naturales de Silene nocteolens de acuerdo a su agrupación por parcelas. La Tabla 25 muestra los valores de FIS y sus respectivos grados de significación para estas muestras en los distintos loci estudiados. El locus 14 presentó desviación para el equilibrio Hardy-Weinberg con valores de FIS > 0, lo que indica un defecto de heterocigotos. El resto de los loci estuvo predominantemente en equilibrio Hardy-Weinberg a nivel de parcelas (40 de los 54 casos, 74,07%); pero a nivel de grupo al juntar las parcelas los loci SN01, SN02, SN06 y SN14 se desviaron significativamente del equilibrio, debido probablemente al efecto Wahlund en esta población. Tabla 25 Análisis de probabilidad de desviación del equilibrio de Hardy-Weinberg según parcelas en la población de Silene nocteolens de Montaña Blanca PARCELA SN01 SN02 SN06 SN14 SN20 SN21 FISHER 1 0,118ns -0,021ns 0,125ns - -0,195ns -0,195ns -0,045ns 2 0,414ns 0,358** 0,200ns -0,037*** 0,125ns 0,125ns 0,161*** 3 0,394* 0,217* 0,143ns 0,357*** 0,274ns 0,274ns 0,269*** 4 0,190ns -0,042ns 0,881ns 0,333** -0,154ns -0,154ns 0,058ns 5 0,472** 0,127ns 0,310*** 0,514*** -0,055ns -0,055ns 0,213*** 6 0,500ns -0,111ns 0,000ns 0,333ns -0,103ns -0,103ns 0,000ns 1 A 6 0,355*** 0,133** 0,196*** 0,359*** 0,004ns 0,005ns 0,177*** 7 -0,105ns 0,082ns -0,091ns 0,059ns -0,217ns -0,217ns -0,049ns 8 0,525** 0,152ns -0,112ns 0,342*** 0,087ns 0,087* 0,171*** 9 0,271ns 0,166ns 0,197ns 0,487*** -0,302ns -0,302ns 0,115*** 7 A 9 0,340** 0,162** 0,050** 0,406*** -0,072ns 0,034ns 0,131*** ns: no significativo; *: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001. Análisis posteriores con el software MICRO-CHECKER (Van Oosterhout et al., 2004) manifestaron que los loci SN02, SN06 y SN14 mostraban evidencia de alelos nulos en ambas poblaciones, mientras que el locus SN01 los mostró sólo para Montaña Blanca; sugiriendo la posibilidad de que estos loci también estén en el equilibrio Hardy-Weinberg. 4 4. .3 3. .3 3. .2 2. . A An ná ál li is si is s d de e A Au ut to oc co or rr re el la ac ci ió ón n E Es sp pa ac ci ia al l El análisis de autocorrelación espacial fue aplicado únicamente a los individuos naturales de la población de Montaña Blanca, excluyendo a las SILENE NOCTEOLENS ~94~ plantas “madre”. Las muestras analizadas corresponden a los individuos situados dentro y alrededor de las parcelas de seguimiento de Silene nocteolens definidas por el personal del Parque Nacional del Teide (Fig. 18). Los cálculos de autocorrelación espacial se establecieron en ambos grupos por separado. En cada correlograma (Fig. 19 y Fig. 20) la línea azul es el coeficiente de autocorrelación (r), las líneas punteadas rojas representan los límites superior e inferior para intervalos de confianza del 95% (999 permutaciones) sobre la distribución aleatoria de los genotipos y las barras representan el error estándar a intervalos de confianza de 95% calculado a partir de 1000 repeticiones. En ambos casos el resultado fue la existencia de una importante correlación positiva entre las distancias genéticas y geográficas de los individuos analizados para la primera clase de distancia (0 – 5 m). Para el resto de las clases los valores no se alejaron significativamente de la distribución aleatoria esperada para los genotipos en cada grupo. Los interceptos con el eje de las abscisas fueron de 7,7 m y 8,1 m para cada grupo, respectivamente; Fig. 18 Distribución geográfica de los individuos de Silene nocteolens según parcelas ~101~ SILENE NOCTEOLENS Según Rosenberg et al., (2002), escoger un valor de K que maximice la probabilidad posterior de datos (PPD) puede ser difícil para un conjunto de datos complejos, incluyendo muchos grupos. Dado que K toma valores que incrementan de acuerdo a la diferencia de los grupos y separa primero los grupos más divergentes en distintos racimos. En el caso de datos muy estructurados una segunda opción para escoger K es considerar el incremento sucesivo de la probabilidad de datos posterior (PPD) en el aumento de los valores de K. Esto es, considerar el acrecentamiento de la información para cada adición de un conjunto de frecuencias de alelos. Al considerar las poblaciones naturales el PPD incrementó de K = 1 a K = 4 (Fig. 24) siendo este último su máximo valor promedio, notándose un decrecimiento posteriormente. No obstante, al evaluar el incremento de PPD se observó un alto valor para K = 2, mientras que para K > 2 el incremento en información se hace menor y va decreciendo progresivamente. Esto significa -100 0 100 200 300 400 500 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ln PPD Increse K -5800 -5700 -5600 -5500 -5400 -5300 -5200 -5100 -5000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ln PPD K Prueba 1 Prueba 2 Prueba 3 Prueba 4 Prueba 5 Fig. 24 Gráficos para la determinación del valor más probable de K siguiendo el análisis bayesiano. LnPPD vs K (arriba) e Incremento de LnPPD vs K (abajo) SILENE NOCTEOLENS ~102~ que la información obtenida a partir del tercer grupo no es tan importante como la de los dos primeros; así que se ha determinado que K = 2 y cada individuo de las distintas poblaciones será asignado de manera asimétrica a uno de estos dos grupos. La asignación de los miembros de cada población a uno de los grupos definidos anteriormente se ilustra en un histograma para las proporciones inferidas a partir del análisis bayesiano (Fig. 25). Cada línea vertical representa a un individuo, cada color ilustra la fracción de pertenencia a uno u otro grupo K y la línea negra es el límite entre las poblaciones. Se observa claramente que las poblaciones naturales de Silene nocteolens están bien definidas. De la misma manera que se observó en el PCoA y el UPGMA, algunos individuos parecen mantener una relación muy estrecha con la población adyacente; lo cual no es de extrañar al tratarse de una misma especie. 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 Montaña Blanca Pico Viejo Fig. 25 Diagrama de barras para las proporciones inferidas (K = 2) con el análisis bayesiano en las poblaciones de Silene nocteolens ~103~ SILENE NOCTEOLENS 4 4. .3 3. .5 5. . D Di in ná ám mi ic ca a R Re ep pr ro od du uc ct ti iv va a Los valores obtenidos para los coeficientes de endogamia según estadios para la población de Silene nocteolens en Montaña Blanca se muestran en la Tabla 29. El número de individuos utilizados para estos análisis varía con respecto a los realizados en apartados anteriores (Tabla 22) debido, por un lado, a la incorporación de la categoría “Plántulas” y, por otro, a la adición de las plantas “madre” en la categoría de “Reproductores Adultos”. Tabla 29 Número de individuos, índices de variación genética, coeficiente de endogamia y tasa de mortalidad para la población natural de Silene nocteolens de Montaña Blanca POBLACIÓN ESTADIO CÓDIGO Nº HO He FIS (T) me Montaña Blanca Plántulas MB-PL 152 0,555 0,653 0,186 0,503 Juveniles MB-JU 26 0,546 0,667 0,200 0,313 Virginales MB-VI 24 0,574 0,686 0,159 0,308 Vegetativos MB-VE 26 0,616 0,701 0,098 0,237 Reproductores Jóvenes MB-RJ 26 0,615 0,667 0,100 0,129 Reproductores Adultos MB-RA 37 0,630 0,699 0,078 0,129 Total 291 0,578 0,683 0,154 Nº: es el número de individuos por estadio de vida, Ho: Heterocigosidad observada, He: Heterocigosidad esperada, FIS (T): Coeficiente de endogamia considerando He total y me: tasa de mortalidad por estadio de vida Pudo observarse un defecto de heterocigotos en todos los estadios de vida con un valor promedio de FIS (T) = 0,154 (Tabla 29). El valor más alto del coeficiente de endogamia se encontró en los juveniles [FIS (T) = 0,200], en tanto que el menor valor fue para los reproductores adultos [FIS (T) = 0,078]. Los datos de mortalidad por estadio (me) proporcionados por el personal del Parque Nacional del Teide para Montaña Blanca mostraron un decrecimiento a lo largo de los sucesivos estadios de vida de la especie. La Fig. 26 muestra como la homocigosis relativa al cruzamiento aleatorio para la población de Silene nocteolens en Montaña Blanca presenta una tendencia a disminuir a través de los estadios de vida (MB-VI, MB-VE y MBRA). Además, se observó una relación entre estos resultados y los índices de mortalidad registrados en la población, ya que al cruzar los valores de endogamia con la tasa de mortalidad puede notarse una importante y significativa correlación (Pearson = 0,826; R2 = 0,681; p < 0,05) entre estas variables. SILENE NOCTEOLENS ~104~ Fig. 26 Coeficiente de endogamia por estadio de vida (izquierda) y correlación entre la mortandad y el coeficiente de endogamia (derecha) en la población de Silene nocteolens de Montaña Blanca Los parámetros del sistema de cruzamiento que fueron estimados utilizando el programa MLTR (Ritland, 2002) tomaron en consideración solamente los datos genéticos de las 12 familias de Montaña Blanca (Tabla 16), ya que los datos de Pico Viejo se consideraron insuficientes. Tabla 30 Parámetros del sistema de cruzamiento para Silene nocteolens PARÁMETRO VALORES Número de familias 12 Número de individuos 164 Fm 0,000 (0,024) tm 0,678 (0,074) ts 0,596 (0,066) tm-ts 0,082 (0,025) rp 0,152 (0,034) Nep (1/rp) 6,579 Fm: coeficiente de endogamia materno por locus, tm: tasa de cruzamiento multilocus, ts: tasa media de cruzamiento por locus, tm-ts: tasa de cruzamiento entre individuos emparentados, rp: correlación de paternidad y Nep: número de paternidad efectiva. Valores de la desviación estándar (SE) basados en 10 000 repeticiones, entre paréntesis. De acuerdo a estos resultados (Tabla 30), no se registra endogamia inherente a las plantas madres en la población de Montaña Blanca (Fm = 0,000). La tasa media de cruzamiento por locus (ts) fue menor que la tasa de cruzamiento multilocus (tm) y muestra la presencia de endogamia biparental. La estimación de la tasa de cruzamiento multilocus (tm = 0,678) indica que S. nocteolens se reproduce predominantemente por cruzamiento alógamo y, por lo tanto, que la proporción de autofecundación (1 – tm) es de aproximadamente 32,2%. La paternidad efectiva (Nep = 1/rp) fue de 6,579; lo cual sugiere que para cada planta madre de esta población existen aproximadamente 6 padres 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 MB-PL MB-JU MB-VI MB-VE MB-RJ MB-RA FIS (T) Person = 0,826; R2= 0,681; p < 0,05 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 Mortalidad por estadio de vida FIS (T) ~105~ SILENE NOCTEOLENS distintos que logran una fecundación efectiva, ya que rp es la probabilidad de que dos plántulas compartan ambos progenitores (es decir, que dos óvulos de un mismo ovario sean fecundados por polen del mismo donante). Por lo tanto, cuanto más alto es el valor de Nep mayor es la probabilidad de un número superior de donantes y menor la contribución de cada uno de ellos en la fecundación de los óvulos de la planta madre. Finalmente, se registró una baja probabilidad de correlación en el parentesco paternal entre los descendientes de las familias analizadas (hermandad completa; rp = 0,152). Consecuentemente, los resultados para la endogamia biparental (apareamiento entre parientes) fue bajo (tm – ts = 0,082); por lo cual, parece existir una mayor proporción de eventos de fertilización cruzada. Para todos los parámetros de cruzamiento obtenidos se han obtenido bajos valores de error estándar (SE < 0,080). SILENE NOCTEOLENS ~106~ 4 4. .4 4. . D Di is sc cu us si ió ón n 4 4. .4 4. .1 1. . D Di iv ve er rs si id da ad d G Ge en né ét ti ic ca a Gracias al desarrollo, optimización y amplificación de seis pares de cebadores específicos para este endemismo tinerfeño, se han detectado niveles de variabilidad genética considerablemente altos en las dos únicas poblaciones naturales descritas de Silene nocteolens. Los resultados han mostrado una mayor diversidad genética en la población de Pico Viejo (A = 13,67 y He = 0,778) que en la de Montaña Blanca (A = 9,50 y He = 0,707) (Tabla 22); así como un mayor porcentaje de alelos exclusivos (40,63%) en la primera (Anexo V). En comparación con otras especies del género analizadas con el mismo tipo de marcador, la diversidad genética encontrada en Silene nocteolens (A = 15,83 y He = 0,784; Tabla 22) es mayor que la reportada para su congénere amenazado S. tatarica (A = 5,00 y He = 0,455; Tero & Schlötterer, 2005) y se acerca a los niveles descritos en otras especies de Silene continentales de amplia distribución como S. flos-cuculi (A = 8,71 y He = 0,825; Galeuchet et al., 2002), S. vulgaris (A = 22,10 y He = 0,816; Teixeira & Bernasconi, 2007) y S. latifolia (A = 35,17 y He = 0,912; Juillet et al., 2003). De hecho, las poblaciones naturales de S. nocteolens ostentan una diversidad genética incluso mayor que la reportada para otras especies endémicas amenazadas del archipiélago canario analizadas mediante microsatélites entre las que se pueden citar a Bencomia exstipulata (He = 0,440; González-Pérez et al., 2009a), Sambucus palmensis (He = 0,500; Sosa et al., 2010b) y Myrica rivas-martinezii (He = 0,560; González-Pérez et al., 2009c); las cuales ya se consideraban con niveles de variación genética superiores al de otros endemismos en islas oceánicas (Sosa et al., 2010a). Estos niveles de diversidad genética tan elevados son sorprendentes dado que la especie tiene un área de ocupación real de apenas 10 000 m2 (Bañares et al., 2004) y está situada en un hábitat tan específico como lo es la ~107~ SILENE NOCTEOLENS alta montaña (Pico Viejo: 3000 – 3100 msnm y Montaña Blanca: 2400 msnm; Eduardo Carqué, comunicación personal). Generalmente, los niveles de variación genética están correlacionados con el tamaño poblacional, el sistema de cruzamiento y las relaciones filogenéticas de las especies (Weller et al., 1996; Sosa, 2001). De hecho, las especies de reducida distribución tienden a mantener menores niveles de diversidad genética que las especies de amplia distribución geográfica (Hamrick & Godt, 1989); no obstante, se conocen numerosas excepciones tanto en Canarias (González-Pérez et al., 2008; González-Pérez et al., 2009c; Rigueiro et al., 2009; García-Verdugo et al., 2010b; López de Heredia et al., 2010; Sosa et al., 2010) como en la Península Ibérica (Palop-Esteban & González-Candelas, 2002; Ruas et al., 2009; Segarra-Moragues & Catalán, 2010). Una posible explicación de los mayores niveles de diversidad genética en los endemismos canarios, comparados por ejemplo con los de las islas del Pacífico, es que algunos de ellos representen antiguos linajes que se refugiaron en la Macaronesia durante la glaciación y desertificación en Europa y el norte de África después del Mioceno; sin embargo, estudios filogenéticos de varios grupos no son compatibles con grandes edades en estos endemismos (Kim et al., 1996; Francisco-Ortega et al., 1997; Watson et al., 2000). Por otro lado, dado que la distancia entre Fuerteventura y la costa africana en ciertos períodos del Cuaternario se estima que llegó a ser de tan solo 60 km; otra posibilidad es que los endemismos canarios hayan sido originados de múltiples introducciones a partir de taxones continentales y que los fenómenos de deriva génica asociados con la colonización en las islas Canarias fueran menos extremos que el experimentado en archipiélagos más alejados de tierras continentales como Hawaii (Francisco-Ortega et al., 2000). La revisión de los datos referentes a las especies de Canarias realizada por Francisco-Ortega et al. (2000) no encontró una tendencia consistente de alta diversidad en especies endémicas de reproducción cruzada en comparación con aquellas que se reproducen por autofecundación; parece ser que otros factores distintos al sistema de cruzamiento y el tamaño poblacional SILENE NOCTEOLENS ~108~ son responsables de los altos valores de diversidad genética en las islas Canarias. Es difícil, por tanto, concretar las razones que han hecho que Silene nocteolens disponga de tan elevados niveles de diversidad genética ya que su ubicación geográfica en una isla oceánica, ser una especie endémica con poblaciones reducidas aisladas en la alta montaña y con bajo número de sus efectivos; son condiciones en las cuales se esperaría que una especie dispusiera de niveles inferiores a los detectados. Es posible, no obstante, que su sistema reproductivo (ver más adelante) y su hábitos perennes (las plantas resisten de manera latente las nevadas bajo el suelo y vuelven a brotar tras el cambio estacional) contribuyan a mantener estos elevados índices de variación genética. Tanto el análisis de coordenadas principales (PCoA) basado en el coeficiente diferenciación genética (Fig. 23) como el dendrograma UPGMA basado en las distancias genéticas de Nei (Fig. 21) y el diagrama de proporciones inferidas con el análisis bayesiano (Fig. 25) son categóricos en la separación de ambas poblaciones. Sin embargo, la diferenciación genética encontrada entre ambas poblaciones de Silene nocteolens fue baja (FST = 0,053) y, en consecuencia, se calcula que el número de migrantes sea considerablemente alto (Nm = 4,5); lo que significa que las poblaciones comparten información genética a pesar de su distanciamiento geográfico. Cabe destacar que aunque la distancia de separación entre ambas poblaciones sea tan sólo de aproximadamente 6 km en línea recta; entre ellas se alza el volcán del Teide en toda su plenitud, lo cual constituye una relevante barrera geográfica que disminuiría el flujo genético interpoblacional. No obstante, se sabe de plantas que crecen de manera esporádica entre ambos núcleos (Eduardo Carqué, comunicación personal) que pudieran estar actuando como peldaños y piedras de paso (stepping stones) en el intercambio genético entre las poblaciones y/o que ambas poblaciones estén más comunicadas entre ellas de lo que parece, geográficamente hablando. Otras especies congéneres endémicas con flores hermafroditas y polinización a través de insectos como S. tatarica (FST = 0,369; Tero et al., 2003) o polinizadas por colibríes como S. rotundifolia (FST = 0,831; Moyle, 2006) que fueron analizadas con marcadores nucleares y citoplásmicos, ~109~ SILENE NOCTEOLENS respectivamente; han mostrado mayor diferenciación genética que S. nocteolens. También S. latifolia (especie dioca, polinizada por polillas y de amplia distribución) ha mostrado valores superiores (FST = 0,110; Barluenga et al., 2011) mediante análisis realizado con microsatélites. Aunque S. diclinis, especie endémica dioca también poliniza por insectos, presentó valores inferiores a los de S. nocteolens (FST = 0,006; Prentice, 1984) en análisis con aloenzimas; esto puede deberse al tipo de marcador utilizado. Es bien sabido que el flujo genético en las plantas superiores ocurre vía dispersión de semillas y/o dispersión del polen (McCauley et al., 1996; Gehring & Delph, 1999; Ingvarsson & Giles 1999; Barluenga et al., 2011). De acuerdo con McCauley et al. (1996) e Ingvarsson & Giles, (1999), la baja dispersión de las semillas implica que los miembros de una misma cohorte pueden crecer muy cerca unos de los otros y este mecanismo no solamente crea una estructura familiar sino que, además, puede mantenerla pese al flujo genético. Adicionalmente, la dispersión de semillas determina la ubicación final de los genotipos; lo cual tiene un fuerte impacto sobre la estructura genética local, algunas veces a pesar del potencial de la dispersión del polen a grandes distancias (Grivet et al., 2009). Por su parte, la dispersión de polen a grandes distancias permite que la reproducción ocurra de manera aleatoria y esto se refleja en un bajo nivel de endogamia (como se verá más adelante en lo referente a la dinámica reproductiva). Hanson et al. (2008) concluyeron que la dispersión de polen a grandes distancias ayudaba a mantener el flujo genético en Dipterix panamensis incluso en paisajes fragmentados del neotrópico, mientras que Lowe et al. (2005) afirman que puede aumentar la cercanía genética de árboles en áreas fragmentadas y contrarrestar algunos efectos negativos de la degradación del hábitat. Silene nocteolens ha mostrado un leve patrón espacial en sus genotipos ya que los correlogramas (Fig. 19 y Fig. 20) muestran una distribución aleatoria de estos con la excepción de la primera clase de distancias. En este sentido, Williams (1994) comprobó que plantas herbáceas con dispersión de semillas por gravedad (caso del género Silene) presentan mayor estructuración genética a pequeñas escalas espaciales que aquellas especies con zoocoria. Esta deducción coincide perfectamente con los reportes biológicos hechos para S. SILENE NOCTEOLENS ~110~ nocteolens en los cuales se ha definido que las semillas no son dispersadas más allá de los 10 m de la planta madre (Bañares et al., 2004) y está apoyado, además, por los resultados obtenidos en la población de Montaña Blanca a través del análisis de autocorrelación que fue positivo para la primera clase de distancias (0 – 5 m), cortando el eje de las abscisas a los 8 m; así que puede verse claramente que existe una relación genética entre las plantas que coexisten a una distancia menor de 10 m. Lo anterior, sumado al elevado flujo genético, puede ser interpretado como un patrón espacial que se limita a la reorganización de los genotipos en cada generación debido al movimiento de polen entre las poblaciones. De esta manera, la estructura familiar puede mantenerse por varias generaciones (Ingvarsson & Giles, 1999). Patrones de estructura genética similares a los encontrados en S. nocteolens han sido reportados también para poblaciones de S. dioca del archipiélago Skeppsvik al norte de Suecia (Giles et al., 1998) y S. acaulis (Gehring & Delph, 1999) al ser analizadas con aloenzimas. En estos estudios se ha propuesto que el flujo genético puede estar ocurriendo en dos escalas espaciales diferentes; por un lado la dispersión localizada de semillas que dan lugar a la distribución gregaria de plantas emparentadas y, por el otro, la dispersión de polen a larga distancia con una frecuencia lo suficientemente alta como para que el flujo genético pueda contrarrestar la deriva genética. En cuanto a este último aspecto, Bañares et al. (2004) han interpretado que el suave aroma producido por las flores de S. nocteolens durante las noches puede estar relacionado con una polinización efectuada por insectos nocturnos; muy probablemente polillas como ocurre en S. latifolia (Barluenga et al., 2011) y en S. lagunensis, otro endemismo tinerfeño (Greg Anderson, comunicación personal). No obstante, será necesario un análisis exhaustivo de los agentes polinizadores y los patrones específicos de dispersión de polen entre las poblaciones naturales de S. nocteolens en futuros estudios. Una explicación alternativa para la falta de diferenciación genética entre las poblaciones de Silene nocteolens podría ser que las mismas hayan sido separadas hace relativamente poco tiempo o fueran recientemente fundadas por individuos con la misma población ancestral. Consecuentemente, las ~119~ SORBUS ARIA 5 5. .1 1. . S So or rb bu us s a ar ri ia a ( (L L. .) ) C Cr ra an nt tz z El género Sorbus L. (Rosaceae) está constituido por árboles de pequeño a mediano tamaño de las zonas templadas del hemisferio norte (Robertson et al., 1991). Son miembros de la subfamilia Maloideae y están relacionados con los géneros comerciales Malus y Pyrus (Campbell et al., 1995). En el género, que incluye mostajos y serbales; la hibridación, poliploidía, autopoliploidía y apomixis (tanto obligada como facultativa) han contribuido a los complejos patrones de variación que se han visto entre los taxones intermedios en Europa (Nelson-Jones et al., 2002; Robertson et al., 2004a y b; Chester et al., 2007; Robertson et al., 2010). Los estudios embriológicos han demostrado, además, que la apomixis en Sorbus es una aposporia gametofítica donde el desarrollo del embrión depende de la polinización para producir el endosperma; es decir, una pseudogamia (Robertson et al., 2004a, Robertson et al., 2010). Existen tres principales centros de diversificación y especiación del género Sorbus en Europa: Escandinavia, el Sureste de Europa y Gran Bretaña (Warburg & Kárpáti, 1968); continente para el cual se han descrito cinco especies diploides (Sorbus aria, S. aucuparia, S. torminalis, S. domestica y S. chamaemespilus) clasificadas en cinco subgéneros distintos (Nelson-Jones et al., 2002). En la mayor parte de estas especies diploides (las primeras cuatro) ha sido descrita la reproducción sexual por cruzamiento y la autoincompatibilidad; mientras que los citotipos poliploides suelen ser apomícticos (Raspé & Kroh, 2007; Robertson et al., 2010). Los grupos taxonómicamente complejos, como Sorbus, encierran importante información evolutiva sobre las interacciones entre la hibridación, la multiplicación del genoma y los sistemas de cruzamiento entre los taxones paternos y sus derivados (Robetson et al., 2010). El “Peralillo de cumbre”, Sorbus aria, se distribuye por las zonas montañosas de casi toda Europa y parte de Asia; desde la Península Ibérica e Irlanda, hasta el Himalaya. También está presente en Argelia, Marruecos y Canarias (Cabezudo et al., 2000). A pesar de su amplia distribución, generalmente se le encuentra de forma escasa y aislada. Es esta la principal SORBUS ARIA ~120~ razón por la que se le haya incluido como “Vulnerable” por la UICN (Cabezudo et al., 2000) y en el Anexo III del Catálogo Canario de Especies Protegidas (CCEP, 2010) como “De Interés para los Ecosistemas Canarios”. Son árboles que pueden alcanzar los 20 m de altura, aunque su porte suele ser menor. Las ramas jóvenes son tomentosas, con abundantes lenticelas; la corteza es lisa y gris con yemas de 5 – 16 mm, cónico ovoideas (Cabezudo et al., 2000). Las hojas son simples (Fig. 27), obovadas u ovado-lanceoladas de entre 4 – 12 x 2 – 9 cm; bordes serrados con dientes irregulares, lóbulos laterales marcados, base cuneada o redondeada, no coriáceas, verdes oscuras y glabras en el haz y blanco tomentosas en el envés donde la nerviación es destacable. Florece entre abril y mayo, los frutos maduran entre septiembre y octubre. Produce inflorescencias corimbiformes terminales con ramas densamente pelosas en la floración y casi glabras en la fructificación. Las flores hermafroditas, blancas de cinco pétalos con tricomas, sufren polinización entomófila (sobre todo abejas, dípteros y coleópteros) (Cabezudo et al., 2000). El fruto es un pomo subgloboso de aproximadamente 10 – 17 x 8 – 15 mm, a veces periforme, rojo, con lenticelas y agrupaciones de células taníferas muy evidentes. Es posible que algunos frutos se formen por apomixis y partenocarpia (Cabezudo et al., 2000). Semillas de 5 – 8 x 2 – 4,5 mm; de sección transversal anchamente elípticas, lisas, pardo rojizas. La dispersión de semillas se lleva a cabo por aves frugívoras. La tasa de germinación en condiciones experimentales no supera el 15% (MMA, 2003). En Canarias se distribuye exclusivamente en las islas de Tenerife y La Palma, por su preferencia a las zonas de alta montaña. En ambas islas el número de ejemplares es muy escaso, siendo más abundante en La Palma (Fig. 28) donde hasta ahora se conocen unos 49 individuos muy aislados y Fig. 27 Sorbus aria ~121~ SORBUS ARIA ampliamente separados tanto dentro como cerca del Parque Nacional de la Caldera del Taburiente (MMA, 2003). En Tenerife (Fig. 29), los individuos están muy separados unos de otros y se localizan dentro del Parque Nacional del Teide. Sorbus aria, es característica de los bosques frondosos de altura (entre 2000 y 3000 msnm) pudiendo soportar temperaturas por debajo de los 3 ºC. Prefiere suelos calizos, frescos y profundos; pero que sean sueltos y no demasiado húmedos. A veces crece en lapiaces, en zonas más rocosas y secas, en ocasiones como rupícola en roqueados. Soporta el pleno sol y la semisombra. Fig. 28 Ubicación de Sorbus aria en el Parque Nacional de la Caldera de Taburiente (La Palma). Fuente: Parque Nacional de la Caldera de Taburiente. 6,92 Km SORBUS ARIA ~122~ Fig. 29 Ubicación de Sorbus aria en el Parque Nacional del Teide (Tenerife). Fuente: Parque Nacional del Teide. 6,68 Km ~123~ SORBUS ARIA 5 5. .2 2. . M Ma at te er ri ia al le es s y y M Mé ét to od do os s 5 5. .2 2. .1 1. . R Re ec co og gi id da a d de e M Mu ue es st tr ra as s y y P Po ob bl la ac ci io on ne es s En Sorbus aria se analizaron 195 muestras: 145 de la Península Ibérica y 50 que procedían de las dos únicas islas del archipiélago Canario en las que se ha descrito la especie (Tenerife y La Palma) (Tabla 31). Los individuos colectados datan desde junio de 2007 a octubre de 2008. De La Palma se recogieron 46 ejemplares procedentes de seis localidades separadas geográficamente (Fig. 28). Las cuatro muestras de Tenerife provienen de las dos únicas localidades descritas en esta isla: Los Cachorros y Guajara (Fig. 29). Finalmente, dispusimos de muestras provenientes de la Península Ibérica y recogidas en los Parques Nacionales de Cabañeros (Castilla La Mancha), Aigüestortes (Cataluña), Picos de Europa (Asturias-Cantabria-Castilla-León) y Sierra Nevada (Andalucía) (Tabla 31). Tabla 31 Poblaciones y muestras de Sorbus aria sometidas a análisis estadístico LOCALIDAD CÓDIGO LUGAR Nº Guajara y Los Cachorros GYCT Tenerife 4 4 Curva del Observatorio COBP La Palma 3 El Espigón y Espigón del Roque de Los Muchachos EYMP La Palma 6 La Parcela Grande PAGP La Palma 5 Los Andenes LANP La Palma 29 El Espigón del Norte EPNP La Palma 3 46 Parque Nacional Cabañeros PNCA Castilla La Mancha 6 Parque Nacional Aigüestortes PNAI Cataluña 36 Parque Nacional Picos de Europa PNPE Asturias-Cantabria-Castilla-León 51 Parque Nacional Sierra Nevada PNSN Andalucía 52 145 TOTAL 195 Nº: Número de individuos 5 5. .2 2. .2 2. . A An ná ál li is si is s G Ge en né ét ti ic co os s Las muestras fueron transportadas y conservadas en bolsas plásticas de cierre hermético con gel de sílice hasta la extracción del ADN. Cada bolsa fue etiquetada con el código correspondiente a cada individuo de cada especie y población. SORBUS ARIA ~124~ Se maceró aproximadamente 1 cm2 de hoja deshidratada de cada individuo en un molinillo vibratorio (RETSCH MM 301) a fin de realizar la extracción del ADN. El tejido se colocó directamente en los tubos de ensayo de 1,5 ml de capacidad a los que también se les introducía un par de balines de acero inoxidable que contribuían a la trituración de la muestra y el producto triturado fue sometido al protocolo de extracción de ADN de Doyle & Doyle (1987). Una vez extraído el ADN se procedió a su purificación, esto se hizo mediante kits de purificación comerciales (SIGMA Gene Elute PCR Clean-Up Kit) y utilizándose 150 μl del ADN total de cada muestra. Las concentraciones y calidad del ADN fueron determinadas por absorbancia. La concentración de ADN fue medida espectrofotométricamente (BECKMAN Coulter DU 530) ya que el ADN presenta la mayor absorción a una longitud de onda (λ) de 260 nm. Para verificar la pureza del ADN se hicieron lecturas a 230 nm, región en la que se estima que se encuentran las impurezas (fenol y urea). Por último, se calculó la tasa de absorción a 260/280 nm para determinar la proporción ADN/ARN. La concentración del ADN purificado de las muestras osciló en el rango de 20 a 64 ng/µl. En la búsqueda de marcadores para Sorbus aria se analizaron individuos con 6 cebadores desarrollados para Sorbus torminalis y recomendados para S. aria (Oddou-Muratorio et al., 2001). De la misma manera se probaron 7 cebadores desarrollados para los géneros comerciales Malus (Gianfranceschi et al., 1998; Liebhard et al., 2002) y Pyrus (Yamamoto et al., 2002) (Tabla 32). Solo dos de los desarrollados para S. torminalis (MSS 05 y MSS 06) reflejaron un carácter polimórfico aceptable en las muestras de S. aria. Debido al poco éxito detectado con estos microsatélites y de manera similar al caso de Silene nocteolens, para Sorbus aria también hubo que aislar y caracterizar microsatélites específicos; labor que fue encargada a una empresa especializada (ATG GENETICS, Canadá) la cual desarrolló un total de 18 pares de microsatélites cuyas especificaciones originales de amplificación de detallan en la Tabla 33. ~125~ SORBUS ARIA Tabla 32 Microsatélites ensayados en Sorbus aria NOMBRE REFERENCIA ESPECIE MOTIVO BGT23b Yamamoto et al., 2002 Pyrus spp. (TC)18.5 CH01H01 Gianfranceschi et al., 1998 Malus x domestica (AG)25.5 CH01H10 Gianfranceschi et al., 1998 Malus x domestica (AG)21 CH02B03b Gianfranceschi et al., 1998 Malus x domestica (GA)22 CH02c09 Liebhard et al., 2002 Malus x domestica (AG)/(CT) CH02d08 Liebhard et al., 2002 Malus x domestica (AG)/(CT) MS14h03 Liebhard et al., 2002 Malus x domestica (GA)/(GT) MSS1 Oddou-Muratorio et al., 2001 Sorbus torminalis (GA)15 MSS3 Oddou-Muratorio et al., 2001 Sorbus torminalis (CA)12 MSS5 Oddou-Muratorio et al., 2001 Sorbus torminalis (GA)19 MSS6 Oddou-Muratorio et al., 2001 Sorbus torminalis (GT=CA)14 MSS13 Oddou-Muratorio et al., 2001 Sorbus torminalis (CA)12 MSS16 Oddou-Muratorio et al., 2001 Sorbus torminalis (CT=GA)28 Marcadores con amplificación aceptable subrayados Tabla 33 Descripción de los microsatélites desarrollados para Sorbus aria F: Forward, R: Reverse, pb: pares de bases, Tm: Temperatura de hibridación LOCUS CEBADORES/SECUENCIA (5'-3') TAMAÑO (PB) MOTIVO Tm (ºC) SA01 R: GGTGGAGGGACAATTGTGTC F: ATGGAGTTGAGCTCCACATC 229 (GA)13 64 62 SA02 R: ACGTAGCACTGAATGGTATAG F: CTAGGTATCATCTCCGACCA 293 (GA)16 56 59 SA03 R: ACTACTGCTACTTCTGTGGG F: CACTTCTTCCTGCTGTTTGG 234 (GA)12 56 62 SA04 R: GGTTTAGGCTTCTGACCGGA F: CCTGATACTATTCGCTTTACC 384 (GA)10…(GA)7 65 57 SA05 R: GAATTCTCCCTTCTGATTAC F: GAAGCCAAGAAGAAGAAAGG 181 (CT)17 54 60 SA06 R: TGCAGCGGTTGCAGATTGCA F: ATTTGATCCATGTGCGACTGCA 297 (GA)32 74 70 SA07 R: CTTCGCAGTTCATTAAGCAC F: ACGTTTTCAGTATGATGGCC 334 (GA)15 60 61 SA08 R: GAATTCTTGGCAGTTTGCCT F: CAGAGAGAGTGCACTGCCT 249 (CT)16 63 61 SA09 R: CCAATACTTGAGTAGCATAC F: CTTGTTGGACGGATTTCTTC 174 (AG)17 51 61 SA11 R: AAAACCTGCAACTCCGTGCA F: TGCACCTCGATCTTTTAGCCA 286 (TG)15 68 67 SA12 R: GAATTCATTGTTTAGGTGAAGG F: CCATTAGCTCTAGTTGAACAG 127 (CT)14 59 56 SA13 R: GTAGGTTATCACCCATCAATTTTC F: CCCCAACTGATGAATTATCAC 356 (TC)9 61 61 SA14 R: GAGGTAAAACCTACCAGTATAC F: ATGGATTTAGGTTAACAGTTGTC 203 (TC)30 53 58 SA15 R: CCCAATTCAGGGAGCAACAG F: TTCTAGGCGACGATCATTCGT 165 (CA)14 67 66 SA17 R: CTTGAGAGAGAACAGAAGTAA F: TTTAATCACGTGACTGGCTAA 259 (AC)15 53 60 SA19 R: TTGGATAGTTTAGGAACAAA F: GTAATTAATTACCTTGTTGT 305 (CA)n 54 47 SA19.1 R: GAATTCATGAAAGCAGCTAATG F: AAGTTTACAAGAGTGTGTTCAG 241 (GA)24 60 55 SA22 R: CCAAGTAGATAACCGTAAACC F: GCTTTGGCTCACAAATTCCAC 171 (CA)16 57 66 SORBUS ARIA ~126~ Las amplificaciones de ADN se hicieron en placas PCR de 96 pocillos. En cada pocillo se depositó aproximadamente 20 ng de ADN, 10 pmol de cada cebador y 24 μl de mezcla maestra para PCR (Reddy-Mix, ABgene, Surrey, UK) que incluye 0,625 unidades de la enzima ADN Taq polimerasa, Tris-HCl 75 mM, (NH4)2SO4 20 mM, Tween 20 0,01%, 1,5 mM (o 2 mM) de MgCl2 y 0,2 mM de cada dNTP. 5 5. .2 2. .3 3. . C Cl lo on na ac ci ió ón n La clonación de Sorbus aria se realizó con el propósito de verificar la ploidía de esta especie en las muestras analizadas, ya que los primeros ensayos con los microsatélites preseleccionados parecieron revelar una naturaleza triploide en Sorbus aria detectada en diferentes individuos y distintos loci y, con ello, la posibilidad de encontrarnos ante muestras triploides. Con el propósito de confirmar ese carácter triploide reflejado en los perfiles de los productos de amplificación por la detección de tres fragmentos en el mismo individuo, se procedió a la secuenciación de dichos productos de amplificación para verificar si los picos se correspondían realmente con mutaciones. Se seleccionó el ADN de algunos individuos en los que los productos de amplificación analizados previamente mostraban tres alelos para un determinado locus, escogiéndose las siguientes muestras y condiciones (Tabla 34): Tabla 34 Cebadores y temperatura de hibridación de los individuos clonados INDIVIDUO CEBADOR TM (ºC) 1 SA19,1 55 4 SA08 61 7 SA07 60 8 SA14 57 Tm: temperatura de hibridación, los detalles de los cebadores se describen en la Tabla 33 Se procedió a la amplificación de estas muestras en las condiciones específicas de cada cebador (la adición de 1µl de DMSO por cada individuo es recomendable). Los productos de amplificación fueron purificados y una ~127~ SORBUS ARIA fracción de ellos se sometió a electroforesis en gel de agarosa (1,8%) para corroborar la presencia de ADN. Se midió la absorbancia a 260 nm de otra fracción para determinar la concentración de ADN mediante espectrofotometría (Tabla 35). Tabla 35 Datos espectrofotométricos de las muestras MUESTRA 260 nm 280 nm 230 nm 260/280 nm 260/230 nm 1 0,013 0,011 0,009 1,184 1,358 4 0,016 0,012 0,022 1,349 0,719 7 0,019 0,015 0,063 1,295 0,309 8 0,012 0,007 0,010 1,762 1,206 Los microlitros de ADN de Sorbus aria requeridos de cada muestra para el ligado con el vector dependen del tamaño promedio de los fragmentos (kb) que se desean verificar y se obtuvo a través de la siguiente fórmula: Una vez obtenido este valor se determinaron los microlitros necesarios de cada producto de amplificación mediante la ecuación: Los resultados se muestran en la Tabla 36. Tabla 36 Resumen de los valores utilizados en la clonación de Sorbus aria en células competentes MUESTRA λ=260nm ng/µl CEBADOR ALELOS DE REFERENCIA (pb) INSERTO (kb) INSERTO (ng) (µl) 1 0,013 13 SA19,1 212, 236,248 232/1000 0,232 11,60 0,89 4 0,016 16 SA8 248, 258, 266 257,33/1000 0,257 12,85 0,80 7 0,019 19 SA7 329, 337, 349 338,33/1000 0,338 16,90 0,89 8 0,012 12 SA14 198, 203, 208, 214 205,75/1000 0,206 10,30 0,85 5 5. .2 2. .1 1. .1 1. . L Li ig ga ad do o Se conoce como ligado a la inserción de una fracción de ADN a un vector bacteriano. En esta etapa se procedió a una breve centrifugación del vector (pGEM-T) y el inserto de ADN control a fin de colectar el contenido de las tapas SORBUS ARIA ~128~ y paredes de los tubos que los contenían. Por otro lado, se agitó el tampón de ligado antes de su uso. Estas soluciones se mezclaron por pipeteo y se incubaron toda la noche a 4 ºC para un número máximo de transformaciones. Los volúmenes utilizados tanto para los insertos de S. aria preparados como para el inserto control se muestran en la Tabla 37. Tabla 37 Proporciones utilizadas para el ligado en vector REACTIVO REACCIÓN ESTÁNDAR CONTROL POSITIVO 2X Tampón de Ligado Rapid 5 µl 5 µl pGEM-T (50 ng) 1 µl 1 µl Producto PCR X µl - Inserto Control - 2 µl T4 DNA Ligasa (3 Weiss U/µl) 1 µl 1 µl H2O dd para un volumen final de 10 µl 10 µl 5 5. .2 2. .1 1. .2 2. . T Tr ra an ns sf fo or rm ma ac ci ió ón n e en n C Cé él lu ul la as s C Co om mp pe et te en nt te es s Una vez ligados los productos de amplificación al vector, se procedió a la transformación de las células competentes (JM109). Para ello se requirió la elaboración previa de un medio de cultivo SOC (Hanahan et al., 1991) y de placas de agarosa con medio de Luria-Bertani (LB) suplementado con ampicilina y enriquecido con IPTG (Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido) y XGal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido). Las cepas bacterianas se retiraron de su almacenamiento criobiológico a – 80 ºC y mantuvieron en cama de hielo hasta su uso. Estas células se trataron con sumo cuidado, evitando los movimientos bruscos al manipularlas. Implementos típicos de procesos microbiológicos (mechero, placas petri, asas microbiológicas, campaña de aislamiento, etc.) también fueron necesarios. Para la elaboración de 100 ml del medio SOC se mezclaron bactotriptona, bacto levadura (bactoyeast), NaCl 1 M, KCl 1 M y agua doble destilada para un volumen final de 97 ml. La solución se agitó hasta lograr su homogeneización, seguidamente se esterilizó mediante autoclave a 1 atmosfera de presión y temperatura de 121 ºC. Cuando la temperatura disminuyó a aproximadamente 30 - 40 ºC, se le añadió Mg+ 2 M y glucosa 2 M para alcanzar una ~135~ SORBUS ARIA fueron visualizados y editados en MEGA4 (Tamura et al., 2007) y TREEVIEW 1.1.6 (Roderic, 2001). Con el programa GENALEX 6.4 (Peakall & Smouse, 2006) se generó el análisis molecular de varianza (AMOVA) y el análisis de coordenadas principales (PCoA) mientras que la obtención de los coeficientes de diferenciación estandarizados (F’ST) se logró a través de GENODIVE 2.0B20 (Meirmans y Van Tienderen, 2004). La estructura de las poblaciones fue inferida mediante un análisis Bayesiano implementado en el programa STRUCTURE 2.2 (Falush et al., 2007). Se asumió un modelo de mezcla y frecuencias alélicas independientes. Se obtuvo una serie de carreras independientes para cada valor de K (el número de grupos) entre 1 y 10. El análisis consistió en 105 períodos de prueba y una longitud de carrera 106 réplicas. En total se corrieron 5 análisis con las mismas especificaciones a fin de corroborar los resultados obtenidos. Los individuos fueron asignados a un “grupo” si su proporción de pertenencia (qi) a ese grupo era igual o mayor que el umbral de 0,05. SORBUS ARIA ~136~ 5 5. .3 3. . R Re es su ul lt ta ad do os s 5 5. .3 3. .2 2. . C Ce eb ba ad do or re es s F Fu un nc ci io on na al le es s S So or rb bu us s a ar ri ia a Si bien es cierto que dos de los microsatélites desarrollados para otras especies (MSS 05 y MSS 06) reflejaron un carácter polimórfico admisible en las amplificaciones hechas para Sorbus aria, se prefirió utilizar aquellos cebadores desarrollados concretamente para esta especie. Los ensayos preliminares revelaron que de los 18 cebadores desarrollados (Tabla 33), solamente 9 resultaron ser polimórficos y útiles para las pruebas posteriores (Tabla 42). Tabla 42 Secuencia de los nueve cebadores funcionales en Sorbus aria LOCUS CEBADOR/SECUENCIA (5’  3’) RANGO (pb) MOTIVO TM (ºC) EMBL SA01 F: ATGGAGTTGAGCTCCACATC R: GGTGGAGGGACAATTGTGTC 212-254 (GA)13 60 FN563114 SA02 F: CTAGGTATCATCTCCGACCA R: ACGTAGCACTGAATGGTATAG 270-325 (GA)16 60 FN563115 SA03 F: CACTTCTTCCTGCTGTTTGG R: ACTACTGCTACTTCTGTGGG 206-249 (GA)12 60 FN563116 SA06 F: ATTTGATCCATGTGCGACTGCA R: TGCAGCGGTTGCAGATTGCA 248-297 (GA)32 60 FN563117 SA07 F: ACGTTTTCAGTATGATGGCC R: CTTCGCAGTTCATTAAGCAC 325-349 (GA)15 60 FN563118 SA08 F: CAGAGAGAGTGCACTGCCT R: GAATTCTTGGCAGTTTGCCT 233-287 (CT)16 60 FN563119 SA09 F: CTTGTTGGACGGATTTCTTC R: CCAATACTTGAGTAGCATAC 161-197 (AG)17 55 FN563120 SA14 F: ATGGATTTAGGTTAACAGTTGTC R: GAGGTAAAACCTACCAGTATAC 197-232 (TC)30 57 FN563121 SA19.1 F: AAGTTTACAAGAGTGTGTTCAG` R: GAATTCATGAAAGCAGCTAATG 212-250 (GA)24 58 FN563122 F: Forward, R: Reverse, pb: pares de bases, Tm: Temperatura de hibridación, EMBL: código correspondiente a cada locus en el Banco Europeo de Secuencias Nucleotídicas SA01, SA02, SA03, SA06, SA07 y SA08 mostraron mejores resultados en las condiciones básicas de amplificación (SASN60, Fig. 16); sin embargo, para SA02 y SA08 se requirió una concentración final de 2,5 mM de MgCl2. Por otro lado, SA09 precisó una temperatura de hibridación de 55 ºC y una extensión final de 30 s a 72 ºC además de 2,5mM de MgCl2 (Fig. 33). Para SN14 la temperatura de hibridación necesaria fue de 57 ºC (Fig. 34) y en SA19.1 fue de 58 ºC (Fig. 35) acompañada de otros requerimientos en la ~137~ SORBUS ARIA mezcla de amplificación (3 mM MgCl2, BSA y DMSO). Los detalles se muestran en la Tabla 43. Fig. 33 Perfil de amplificación SASN5572 Fig. 34 Perfil de amplificación SASN57 Fig. 35 Perfil de amplificación SASN58 95 ºC 55 ºC 72 ºC 4 ºC 0 20 40 60 80 100 Temperatura (ºC) 35 Ciclos 30 s ∞ 90 s 3 min 30 s 30 min 95 ºC 57 ºC 72 ºC 4 ºC 0 20 40 60 80 100 Temperatura (ºC) 35 Ciclos 30 s ∞ 90 s 3 min 30 s 5 min 95 ºC 58 ºC 72 ºC 4 ºC 0 20 40 60 80 100 Temperatura (ºC) 35 Ciclos 30 s ∞ 90 s 3 min 30 s 5 min SORBUS ARIA ~138~ Tabla 43 Condiciones específicas ensayadas para los cebadores de Sorbus aria NOMBRE TM MgCl2 BSA DMSO SA01 60ºC 1,5 mM - - SA02 60ºC 2,5 mM - - SA03 60ºC 1,5 mM - - SA06 60ºC 1,5 mM - - SA07 60ºC 1,5 mM - - SA08 60ºC 2,5 mM - - SA09* 55ºC 2,5 mM - - SA14 57ºC 1,5 mM - - SA19,1 58ºC 3,0 mM + + Tm: Temperatura de hibridación, *: extensión final de 30 min a 72 ºC; +: requiere adición. 5 5. .3 3. .3 3. . C Cl lo on na ac ci ió ón n Pese a que se utilizaron 4 individuos para la clonación del ADN de Sorbus aria en células competentes, no se encontraron colonias viables (blancas) en la placa sembrada con las amplificaciones de la primera muestra y, por ende, los resultados que se detallan a continuación se basan en los productos de las muestras 4, 7 y 8 (Tabla 34). Para la amplificación de las colonias se utilizó en primer lugar el cebador M-13; sin embargo, y a pesar de haberse reamplificado a partir de ADN amplificado en lugar de ADN puro, los fragmentos detectados en gel de agarosa presentaban muy baja intensidad, lo que refejaba una baja amplificación. Debido a esto, se hicieron amplificaciones con los cebadores caracterizados particularmente para esta especie (SA07, SA08 y SA14), obteniéndose los mejores resultados con este último procedimiento (Fig. 36) en el cual el cebador M-13 solo se aplicó a la muestra control (Blue). Fig. 36 Foto del gel de electroforesis para la reamplificación de colonias. L: escalera de pesos moleculares; P4, P7 y P8: muestras de colonias de células clonadas con los indiviuos 4, 7 y 8, respectivamente; SA8, SA7 y SA14: cebadores específcos para Sorbus aria; M13: cebador “Forward” y Blue: control negativo. ~139~ SORBUS ARIA Siguiendo el procedimiento correspondiente, las muestras que registraron el mejor bandeado en gel fueron purificadas y sometidas a secuenciación haciendo uso del cebador “Forward” específico y el M-13 como control negativo. La secuenciación de los diferentes productos de amplificación confirmó que los tres picos observados en los individuos de Sorbus aria se correspondían con verdaderos alelos y su variación se debía a un aumento o disminución del número de repeticiones del motivo dentro del microsatélite y no de mutaciones en las secuencias flanqueantes. En la Fig. 37 se muestran los resultados de secuenciación de ADN de células clonadas con Sorbus aria para el locus SA07 de un individuo y la Fig. 38 resume las secuencias halladas, demostrando el carácter triploide de la especie. Fig. 37 Secuencias de las colonias (células clonadas con Sorbus aria) para el microsatélite SA07. Cada nombre a la izquierda corresponde a una colonia y los picos inferiores representan los alelos encontrados en cada secuencia. SORBUS ARIA ~140~ Sin embargo, el carácter triploide no se detectó en todos los ejemplares de Sorbus aria analizados. Así, mientras que las poblaciones canarias presentan un carácter triploide, al igual que los individuos del Parque Nacional de Cabañeros (PNCA) y el Parque Nacional de Sierra Nevada (PNSN); los ejemplares del Parque Nacional de Aigüestortes (PNAI) fueron diploides. Finalmente, en el Parque Nacional de Picos de Europa (PNPE) se observó una mezcla de ambas ploidías, con un 21,56% de individuos triploides (Fig. 39). Fig. 39 Distribución de la ploidía y ocurrencia de alelos exclusivos (Ex) en Sorbus aria Fig. 38 Perfil de fragmentos del microsatélite SA07 observado en Sorbus aria y secuencias correspondientes de la clonación de estos fragmentos que confirman la naturaleza triploide de esta especie en Canarias ~141~ SORBUS ARIA 5 5. .3 3. .4 4. . N Ni iv ve el le es s d de e D Di iv ve er rs si id da ad d G Ge en né ét ti ic ca a 5 5. .3 3. .4 4. .1 1. . F Fr re ec cu ue en nc ci ia as s A Al lé él li ic ca as s En las muestras analizadas del género Sorbus aria se detectaron 141 alelos, correspondientes a 9 loci, todos polimórficos (Anexo IX). SA02, con 19 alelos, resultó ser el locus con mayor número de alelos y en orden descendente se encontraron 18 alelos para los loci SA06 y SA08, 17 alelos para los loci SA01 y SA09, 15 alelos para el locus SA14, 14 para el locus SA03, 12 para el locus SA19,1 y 11 para el SA07. Todos los ejemplares de Tenerife fueron genéticamente idénticos, mientras que en La Palma la proporción de genotipos idénticos alcanzó el 86,96%. Por el contrario, los 6 individuos del Parque Nacional de Cabañeros fueron genéticamente diferentes; así como el 92,16%, el 83,83% y el 23,08% de los individuos analizados en los Parques Nacionales de Picos de Europa, Aigüestortes y Sierra Nevada, respectivamente (Tabla 44). No se encontraron genotipos compartidos entre Canarias y la Península. Tabla 44 Porcentaje de genotipos idénticos encontrados en Sorbus aria por población POBLACIÓN CÓDIGO Nº Nº GI % Guajara y Los Cachorros GYCT 4 4 100,00 Tenerife 4 4 100,00 Curva del Observatorio COBP 3 3 100,00 El Espigón y Espigón del Roque de Los Muchachos EYMP 6 4 66,67 La Parcela Grande PGAP 5 3 60,00 Los Andenes LANP 29 27 93,10 El Espigón del Norte EPNP 3 3 100,00 La Palma 46 40 86,96 Canarias 50 44 88,00 Parque Nacional de Cabañeros PNCA 6 0 0,00 Parque Nacional de Aigüestortes PNAI 36 6 16,67 Parque Nacional de Picos de Europa PNPE 51 4 7,84 Parque Nacional de Sierra Nevada PNSN 52 40 76,92 Península 145 50 34,48 Total 195 94 48,21 Nº: número de individuos analizados por localidad, Nº GI: número de individuos genéticamente idénticos. La mayor proporción de alelos exclusivos en las poblaciones se encontró en PNPE (7,80%), seguida de PNAI (7,09%), PNSN (4,26%), GYCT (1,42%) y PNCA (0,71%). Tres alelos (SA01-254, SA07-349 y SA08-287) estuvieron presentes solamente en poblaciones de La Palma y dos alelos (SA01-226 y SA08-249) aparecieron en todas las poblaciones analizadas (Anexo IX). Al SORBUS ARIA ~142~ separar en dos grupos las muestras peninsulares y canarias (Anexo X), la mayor proporción de los alelos exclusivos se detectó en las muestras peninsulares (74,47%) y un porcentaje bastante menor (3,55%) en las canarias. Treinta y un alelos estuvieron presentes en ambas regiones. No se hallaron alelos fijados ni por población ni por región. Si se consideran solamente las poblaciones de la península, la ocurrencia de alelos exclusivos (Ex) decrece progresivamente desde Picos de Europa hacia Cabañeros (Fig. 39). 5 5. .2 2. .2 2. .1 1. . V Va ar ri ia ab bi il li id da ad d G Ge en né ét ti ic ca a La Tabla 45 muestra los diferentes índices de diversidad genética obtenidos para las poblaciones de Sorbus aria. Tabla 45 Diversidad genética detectada en las poblaciones de Sorbus aria POBLACIÓN PROCEDENCIA Nº NA HO HS P GYCT Tenerife 4 2,89 1,000 0,745 0,72% COBP La Palma 3 2,89 1,000 0,790 1,45% EYMP La Palma 6 3,00 0,981 0,687 7,25% PAGP La Palma 5 2,89 0,978 0,684 3,62% LANP La Palma 29 3,33 0,996 0,660 10,87% EPNP La Palma 3 2,67 1,000 - 0,00% Canarias 50 2,79 0,993 0,718 20,29% PNCA Castilla La Mancha 6 2,78 0,889 0,615 4,35% PNAI Cataluña 36 9,56 0,646 0,814 60,14% PNPE Asturias-Cantabria-Castilla-León 51 11,11 0,621 0,831 70,29% PNSN Andalucía 52 7,22 0,856 0,759 45,65% Península 145 3,86 0,753 0,762 94,93% Total 195 15,667 0,897 0,742 100,00% Nº: es el número de individuos analizados por localidad, NA: Número medio de alelos, Ho: Heterocigosidad observada, Hs: Heterocigosidad en las poblaciones y P: Porcentaje de loci polimórficos. El número medio de alelos en Sorbus aria varió desde NA = 2,67 para la población del Espigón del Norte en La Palma (EPNP) hasta NA = 11,11 para las muestras del Parque Nacional de Picos de Europa (PNPE). En general, las poblaciones de la Península mostraron mayor número de alelos que las poblaciones canarias; no obstante, el mayor número de alelos en Canarias (NA = 3,00) que corresponde a la población del Espigón del Roque de los Muchachos de La Palma (EYMP) fue mayor que el encontrado en la población del Parque Nacional de Cabañeros (PNCA, NA = 2,78), siendo este último el mínimo valor en las poblaciones peninsulares. ~143~ SORBUS ARIA A nivel de población, El Espigón del Norte (EPNP) en La Palma y el Parque Nacional de Picos de Europa (PNPE) presentaron los valores extremos de variabilidad genética, correspondientes al 0% de loci polimórficos para ESNP frente al 70,29% de PNPE; resultados que concuerdan con los del acápite anterior. A nivel regional, la Península muestra un 94,93% de loci polimórficos, frente a un 20,29% hallado en Canarias. Al igual que en los parámetros anteriores, la población del Espigón del Norte de La Palma (EPNP) mostró el mínimo valor de variación genética con Hs = 0 y la población del Parque Nacional de Picos de Europa (PNPE) ocupó el primer lugar en cuanto a los valores de heterocigosidad (Hs = 0,831). De acuerdo a la región, fue mayor la heterocigosidad en las muestras peninsulares (Hs = 0,762) que las canarias (Hs = 0,718) (Tabla 45). 5 5. .3 3. .5 5. . E Es st tr ru uc ct tu ur ra a G Ge en né ét ti ic ca a e en n l la as s P Po ob bl la ac ci io on ne es s 5 5. .3 3. .5 5. .1 1. . E Eq qu ui il li ib br ri io o H Ha ar rd dy y- -W We ei in nb be er rg g En la Tabla 46 se muestran los valores del coeficiente de endogamia GIS y sus respectivos grados de significación para las poblaciones de Sorbus aria analizadas con los distintos loci. Todos los loci mostraron desviación del equilibrio Hardy-Weinberg. En las poblaciones canarias, prácticamente todos los valores fueron negativos, reflejando un exceso de heterocigóticos (GIS < 0). Esta situación se repite entre las poblaciones peninsulares solamente para el locus SA02. En términos generales, solamente dos poblaciones (PNAI y PNPE) se encontraron en equilibrio Hardy-Weinberg (precisamente aquellas que contenían organismos diploides); el resto de las poblaciones mostraron desviación del equilibrio Hardy-Weinberg con valores negativos y altamente significativos (GIS < 0), con excepción de la población del Espigón del Norte de La Palma (EPNP) donde se halló un valor positivo y de menor significancia (defecto de heterocigóticos, GIS > 0). SORBUS ARIA ~144~ Tabla 46 Análisis de desviación del equilibrio de Hardy-Weinberg de Sorbus aria según poblaciones y loci POBLACIÓN SA01 SA02 SA03 SA06 SA07 SA08 SA09 SA14 SA19 TOTAL GYCT -0,286* -0,315* -0,286* -1,000* -0,286* -0,286* -0,286* -0,286* -0,286* -0,342*** COBP -1,000ns -0,200ns -0,200ns -1,000ns -0,200ns -0,200ns -0,200ns -0,200ns 0,100ns -0,266*** EYMP -0,697** -0,364** -0,286* -0,667** -0,333** -0,697** -0,364** -0,364** -0,298** -0,430*** PAGP -0,641* -0,333** -0,200* -1,000** -0,192* -1,000* -0,333** -0,333* -0,333* -0,429*** LANP -0,933*** -0,474*** -0,415*** -0,703*** -0,262*** -0,681*** -0,474*** -0,386*** -0,474*** -0,510*** EPNP -1,000ns -0,200ns -0,200ns -1,000ns -0,200ns -1,000ns -0,200ns -0,200*** 1,000ns 1,000* PNCA -0,364** -1,000** -0,100** -0,330ns -1,000** 0,216ns -0,364** -0,364ns -0,364** -0,446*** PNAI 0,465ns -0,020*** 0,344ns 0,650ns 0,280ns -0,022*** -0,058*** 0,019** 0,243ns 0,207ns PNPE 0,394ns -0,054*** 0,434ns 0,571ns 0,219ns 0,449ns 0,082ns -0,107ns 0,270ns 0,252ns PNSN 0,377*** -0,291*** -0,165*** -0,116*** -0,219*** 0,282*** -0,175*** -0,210*** -0,431*** -0,128*** Total -0,212*** -0,286*** -0,165*** -0,266*** -0,178*** -0,191*** -0,225*** -0,237*** -0,127*** -0,208*** ns: no significativo; *: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001. 5 5. .3 3. .6 6. . D Di if fe er re en nc ci ia ac ci ió ón n G Ge en né ét ti ic ca a e en nt tr re e l la as s P Po ob bl la ac ci io on ne es s 5 5. .3 3. .6 6. .1 1. . I Id de en nt ti id da ad d y y D Di is st ta an nc ci ia a G Ge en né ét ti ic ca a La identidad genética en Sorbus aria (Tabla 47) fluctuó de 0,116 entre las muestras de Tenerife y las del Parque Nacional Cabañeros (GYCT – PNCA) a 1,000 para la mayor parte de las comparaciones entre las poblaciones de La Palma (EYMP – COBP, PAGP – COBP, PAGP – EYMP, LANP – PAGP, EPNP – COBP, EPNP – EYMP, EPNP – PAGP y EPNP - LANP), lo cual es un reflejo de la gran proporción de genotipos idénticos encontrados en estas poblaciones. Al analizar los datos de acuerdo a la procedencia de las muestras se observó que los valores para las muestras de la Península oscilaron entre 0,362 y 0,751; no hubo valores iguales o superiores que 0,900. Por su parte, las muestras de Canarias variaron desde 0,670 hasta 1,000; con un 66,66% de valores superan el 0,900 (todos entre las poblaciones palmeras). La identidad media fue mayor para La Palma (0,997) y en general para las muestras procedentes de Canaria ( 0,911) que para las de los Parques Nacionales de la Península ( 0,469). Finalmente, al comparar los registros entre localidades se encontraron medias por debajo de 0,900; esto es, 0,738 entre Tenerife y La Palma; 0,239 entre La Palma y la Península e 0,209 entre Tenerife y la Península, en orden descendente. Entre Canarias y La Península la identidad media fue 0,234.