Inmunodeficiencias primarias causadas por defectos en la inmunidad dependiente de los sistemas Interleucina (IL)-12/Interferon gamma (IFN-γ) e IL-23/IL-17-IL22

Tesis doctoral Inmunodeficiencias primarias causadas por defectos en la inmunidad dependiente de los sistemas Interleucina (IL)-12/ Interferon gamma (IFN-γ) e IL-23/ IL-17-IL-22. Ithaisa Sologuren Marrero Las Palmas de Gran Canaria, 2016 Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Facultad de Ciencias de la Salud Departamento de Ciencias Clínicas Programa de Doctorado: Microbiología Clínica y Enfermedades Infecciosas Tesis doctoral Inmunodeficiencias primarias causadas por defectos en la inmunidad dependiente de los sistemas Interleucina (IL)-12/Interferon gamma (IFN-γ) e IL-23/IL-17-IL-22. Ithaisa Sologuren Marrero Las Palmas de Gran Canaria, 2016 Me gustaría citar tras cada nombre de amigo y compañero lo que han significado para mí, pero no es mi vida la que tengo que contar aquí. Aunque mi corazón sí que se ve obligado a nombrar al menos a algunos de ellos aunque sea en mensaje encriptado: Al Dr. Pedro Lara por su comprensión. Al Dr. Gregorio Carretero por confiar en mi y financiar mis primeros años como investigadora en este laboratorio. Al Dr. Jose Carlos Rodríguez, Antonio Macías y a Fran, por darme la oportunidad en mis comienzos y poder conocer de primera mano el trabajo llevado a cabo en la unidad de investigación del hospital. A Elisa Bordón, por sus buenos consejos y por su apoyo desde el principio y por compartir tan buenos momentos. A las "Siames" por su buen hacer y su espíritu de sacrificio. A Nereida por estar siempre ahí, para lo bueno y lo malo y a Yanira por ser mi compi de fatigas, por aguantarme y por colaborar en todas las publicaciones científicas. Bien merecido tiene un hueco en todas ellas. A Ayoze mi compañero y amigo desde los inicios, por su cariño incondicional, su paciencia y su disposición para enseñar a cualquiera que lo necesitara. A mi querido Javi "el rubio", por revolucionarnos el laboratorio y transmitirnos siempre su buen feeling y darnos el mejor consejo, y es que -hay más vida después del labo-. A veces nos olvidamos de que hay que VIVIR. A las 3 Marías o Mari Cármenes; A M. Carmen Quintana, la "súper" por sus consejos, su apoyo y su cariño, a M. Carmen Marrero, por hacerme ver que siempre hay que ponerse en el lugar de los demás y comprender que nadie nace sabiendo, y a M. Carmen Acevedo por ser mi alma gemela en estos últimos años. A Maite por ser nuestra nueva capitana y por estar siempre dispuesta a ayudarnos. A la Dra. Isabel García, por su paciencia conmigo, sus buenas palabras, sus consejos y sobre todo ser tan buena compañera y una gran profesional en este mundillo, ¡Qué gran señora!. A Fany por comprendernos siempre a la perfección sin apenas decirnos nada y por apoyarnos cuando se avecinaba un chaparrón. Y a Marta cómo no, una de las últimas investigadoras supervivientes en nuestro laboratorio. Gracias por los momentos compartidos estos últimos años. A todos los compis de laboratorio y de otros servicios con los que he vivido algunos instantes; Antoli, Vero, Tony, Euse, Gina, Belén, Isa Mo, Rita, Mari Nieves, Judith, Ruth, Almudena, Nuria, Yanira B, Ángela, Érika, Lidia, Pedro Valerón, Luis Dehesa, Candy y Esther Robaina. En cuanto al apoyo logístico, quería dar las gracias a Juan Verona, por estar siempre dispuesto a colaborar y embellecer nuestro trabajo. A Ruymán y Dani Rodríguez por aportar su pequeño granito de arena y llenarme de buenas ideas. A Julio por su cooperación, paciencia y gran ayuda para el diseño final y maquetado de la tesis. Y por último una mención especial si cabe a mis amigos y personas cercanas; a mi gran amiga Haleh por su cariño y su fe en mí cuando me flaqueaban las fuerzas para seguir adelante. Nunca te agradeceré lo suficiente. A Irma, Ibalia, John, Sole Cano y Manu por creer en mí y animarme siempre. A Salva por todo, gracias. Quiero dar las gracias a todos pacientes y a sus familiares. Sin ellos todo este trabajo no hubiera sido posible. También agradecer a Jean-Laurent Casanova y a su equipo, su estrecha colaboración en todo cuanto pudiéramos necesitar y sacar adelante nuestras investigaciones. Este trabajo ha sido financiado por: Fundación Canaria de Investigación Sanitaria (FUNCANIS) Servicio Canario de Salud (SCS) LISTA DE PUBLICACIONES Esta tesis está basada en las siguientes publicaciones, las cuales están indicadas en números romanos como capítulos independientes. I: Oesophageal squamous cell carcinoma in a young adult with IL-12R beta 1 deficiency. Cárdenes M, Angel-Moreno A, Fieschi C, Sologuren I, Colino E, Molinés A, GarcíaLaorden MI, Campos-Herrero MI, Andújar-Sánchez M, Casanova JL, Rodríguez-Gallego C. J Med Genet. 2010 Sep;47(9):635-7. II. Partial recessive IFN-γR1 deficiency: genetic, immunological and clinical features of 14 patients from 11 kindreds. Sologuren I, Boisson-Dupuis S, Pestano J, Vincent QB, Fernández-Pérez L, Chapgier A, Cárdenes M, Feinberg J, García-Laorden MI, Picard C, Santiago E, Kong X, Jannière L, Colino E, Herrera-Ramos E, Francés A, Navarrete C, Blanche S, Faria E, Remiszewski P, Cordeiro A, Freeman A, Holland S, Abarca K, Valerón-Lemaur M, Gonçalo-Marques J, Silveira L, García-Castellano JM, Caminero J, Pérez-Arellano JL, Bustamante J, Abel L, Casanova JL, Rodríguez-Gallego C. Hum Mol Genet. 2011 Apr 15;20(8):1509-23. III. Clinical features of Candidiasis in patients with inherited interleukin 12 receptor β1 deficiency. Ouederni M, Sanal O, Ikinciogullari A, Tezcan I, Dogu F, Sologuren I, Pedraza-Sánchez S, Keser M, Tanir G, Nieuwhof C, Colino E, Kumararatne D, Levy J, Kutukculer N, Aytekin C, Herrera-Ramos E, Bhatti M, Karaca N, Barbouche R, Broides A, Goudouris E, Franco JL, Parvaneh N, Reisli I, Strickler A, Shcherbina A, Somer A, Segal A, Angel-Moreno A, Lezana-Fernandez JL, Bejaoui M, Bobadilla-Del Valle M, Kachboura S, Sentongo T, BenMustapha I, Bustamante J, Picard C, Puel A, Boisson-Dupuis S, Abel L, Casanova JL, Rodríguez-Gallego C. Clin Infect Dis. 2014 Jan;58(2):204-13. INDICE ..............................................................................................................ABREVIATURAS 13 ...........................................................................................INTRODUCCIÓN GENERAL 18 1. ........................................................................................................MICOBACTERIAS 18 2. ..............................................................................................................CANDIDA SPP. 21 3. .................................................................................EL SISTEMA INMUNOLÓGICO 23 3.1. ..................................................................................................................Definición 23 3.2. ....................................................................................Inmunidad innata y adquirida 23 3.3. ..........................................................................................................Th1, Th2, Th17 25 4. ............................................................INMUNIDAD FRENTE A MICOBACTERIAS 29 4.1. ...........................................................................................Modelos Experimentales 29 4.2. ............................................................Estudios de asociación genética en humanos 31 4.3. ...............................Inmunodeficiencias primarias y enfermedad por micobacterias 33 4.4. ...................Susceptibilidad mendeliana a enfermedad por micobacterias (MSMD) 35 4.4.1. ................................Deficiencia del receptor 1 de Interferón gamma (IFN-γR1) 40 4.4.2. ................................Deficiencia del receptor 2 de Interferón gamma (IFN-γR2) 42 4.4.3. ........................Deficiencia de la cadena β1 del receptor de la IL-12 (IL-12Rβ1) 43 4.4.4. .....................................Deficiencia de la subunidad p40 de la IL-12 (IL-12p40) 44 4.4.5. ...........................................................................................Deficiencia de ISG15 45 4.4.6. ..............................................................................................Deficiencia de IRF8 45 4.4.7. .........................................................................................Deficiencia de STAT1. 46 4.4.8. .........................................................................................Deficiencia de NEMO. 47 4.4.9. ......................................................................................Deficiencia de gp91phox 48 5. ..................................................................INMUNIDAD FRENTE A CANDIDA SPP. 49 11 5.1. ............................................................................................Modelos experimentales 49 5.2. ................................Inmunodeficiencias primarias y enfermedad por Candida spp. 50 .........................................................................................................................HIPÓTESIS 57 ...............................................................................................OBJETIVOS GENERALES 61 ..............................................................................................OBJETIVOS CONCRETOS 65 .................................................................................................................CAPÍTULO I 65 ................................................................................................................CAPÍTULO II 69 ..............................................................................................................CAPÍTULO III 73 ..................................................................................................DISCUSIÓN GENERAL 134 ....................................................................................CONCLUSIONES GENERALES 156 ...............................................................................................................BIBLIOGRAFÍA 160 ÍNDICE 12 ABREVIATURAS ADNmt ADN mitocontrial AIRE Regulador autoinmune (autoimmune regulator) APECED Síndrome de poliendocrinopatía de tipo I (autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy) APS-I Poliendocrinopatía autoinmune de tipo I (autoimmune polyendocrinopathy syndrome type I) BCG Bacilo de Calmette-Guérin (bacille Calmette-Guérin) CCL Quimiocina con dominio de unión C-C (chemokine C-C motif ligand) CIDs Inmunodeficiencias combinadas (combined immunodeficiencies) CMC Candidiasis mucocutánea crónica CMCD Candidiasis mucocutánea crónica aislada CXCL Quimiocina con dominio de unión C-X-C (Chemokine C-X-C motif ligand) CMV Citomegalovirus CTLs Linfocitos T citotóxicos CD8+ (cytotoxic T lymphocytes). DCs Células dendríticas (dendritic cells) DP-IFN-γR1 Autosómica dominante parcial IFN-γR1 (autosomal dominant partial IFN-γR1) EBV-B Linfocitos B transformados con el virus de Epstein-Barr ELISA Enzimoinmunoanálisis de adsorción (enzyme-linked immunosorbent assay) FQ Fibrosis quística GAF Factor gamma activado (gamma activated factor) GAS Secuencias activadas por IFN-γ (interferon-gamma activated sequence) GOF Ganancia de función (gain-of-function) GW Genome-wide GWAS Estudios de asociación del genoma completo (genome-wide association study) HHV8 Herpesvirus humano 8 HLA Antígeno leucocitario humano (human leukocyte antigen) 13 IC Intervalo de confianza IDP Inmunodeficiencia primaria IFN Interferón IL Interleucina IP-10 Proteína 10 inducible por IFN-γ (IFN-γ-induced protein 10) IRF8 Factor 8 regulador de interferón (interferon regulatory factor 8) IRF9 Factor 9 regulador de interferón (interferon regulatory factor 9) ISG15 Gen 15 estimulado por interferón (interferon-stimulated gene 15) ISGF3 Gen del factor 3 estimulado por interferón (interferon-stimulated gene factor 3) ISRE Elemento de respuesta estimulado por IFN (IFN-stimulated response elements) KS Sarcoma de Kaposi LPS Lipopolisacárido. mAb Anticuerpo monoclonal MAC Complejo Mycobacterium avium (Mycobacterium avium complex) MHC Complejo mayor de histocompatibilidad (major histocompatibility complex) MIG Monocina inducida por IFN-γ (monokine induced by IFN-γ). MRCA Antecesor común más reciente (Most recent common ancestor) MSMD Susceptibilidad mendeliana a enfermedad por micobacteria (Mendelian susceptibility to mycobacterial disease) MBTC Complejo Mycobacterium tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis complex) NEMO Modulador esencial de NF-κB (NF-κB essential modulator). NF-κB Factor nuclear κB (nuclear factor κB). NLR Receptores tipo NOD (NOD-like receptors). NOD Dominio de oligomerización y de unión a nucleótidos (nucleotide-binding oligomerization domain) PHA Fitohemaglutinina (phytohemagglutinin). PBMCs Células monocucleares de sangre periférica (peripheral blood mononuclear cells). ABREVIATURAS 14 PRR Receptores de reconocimiento de patrones (pattern recognition receptors). RC-IFN-γR1 Autosómica recesiva completa IFN-γR1 (autosomal recessive complete IFN-γR1) RIG Gen inducido por ácido retinoico (retinoic acid-induced gene). RLR Receptores tipo RIG (RIG-like receptors) RP-IFN-γR1 Autosómica recesiva parcial IFN-γR1 (autosomal recessive partial IFN-γR1) SCC Carcinoma de células escamosas (squamous-cell carcinoma) SCEC Carcinoma esofágico de células escamosas (squamous-cell carcinoma of the esophagus) SCID Inmunodeficiencia combinada grave (severe combined immunodeficiency) SIDA Síndrome de la inmunodeficiencia adquirida STAT Transductor de señal y activador de la transcripción (signal transducer and activator of transcription) Tfh Linfocito T folicular TGF-β Factor de crecimiento transformante β (transforming growth factor β) Th1 Linfocitos T colaborador tipo 1 Th17 Linfocitos T colaborador tipo 17 Th2 Linfocitos T colaborador tipo 2 Th22 Linfocitos T colaborador tipo 22 Th9 Linfocitos T colaborador tipo 9 TLR Receptor tipo Toll (Toll-like receptor) TNF Factor de necrosis tumoral (Tumor necrosis factor) Treg Linfocito T regulador iTreg Linfocito T regulador inducido nTreg Linfocito T regulador natural UI Unidades internacionales UV Ultravioleta VIH Virus de la inmunodeficiencia humana VPH Virus del papiloma humano ABREVIATURAS 15 sistema inmunológico innato y adquirido del huésped (Vinh DC, 2011; Richardson JP et al, 2015). Las diferentes morfologías de C. albicans presentan distinta capacidad para polarizar las diversas subpoblaciones de células Th1, Th2 y Th17. En el individuo normal, ante una exposición ambiental con este patógeno, C. albicans induce de forma específica a las células Th17. Experimentos in vitro mostraron que la forma de levadura promueve la diferenciación de células productoras de interferón γ (IFN-γ) e induce la producción de interleucina (IL)-12, así como altas concentraciones de IL-2. Las hifas en cambio, desencadenan la producción de IL-17 en ausencia de IFN-γ y la producción de IL-23, pero no de IL-12. Estos resultados sugieren que la morfología filamentosa de C. albicans, podría desencadenar la respuesta Th17 in vivo. Estos datos proporcionan un ejemplo de disociación entre la producción de IL-12 e IL-23 en el contexto de un patógeno natural y sugieren una posible conexión entre la respuesta innata a C. albicans y la polarización sesgada hacia Th17 de las células T de memoria específicas de C. albicans (AcostaRodriguez EV et al, 2007). Un factor de virulencia clave en la patogénesis de C. albicans es su capacidad de transformación entre diferentes morfologías (levadura, hifas y pseudohifas), utilizando la transición reversible a una forma de crecimiento filamentoso como respuesta a señales ambientales y así bloquear o evitar el reconocimiento por parte de los receptores de reconocimiento de patrones (PRRs -pattern recognition receptors-) localizados en la superficie de las células del sistema inmunológico (Rizzetto L et al, 2015). CANDIDA SPP. 22 3. EL SISTEMA INMUNOLÓGICO 3.1. Definición Algunos microorganismos pueden atravesar las barreras anatómicas y fisiológicas del organismo causando infección. Estas barreras incluyen la piel, las mucosas, el pH ácido del estómago, la saliva y otras secreciones, proporcionando la primera línea de defensa frente a patógenos (Turvey SE et al, 2010). En humanos la respuesta inmunológica, tiene lugar a través de dos sistemas conectados: el sistema inmunológico innato y el sistema inmunológico adquirido. La combinación de ambos sistemas permite identificar al patógeno, contenerlo y por último eliminarlo con la máxima eficacia y el mínimo daño en el huésped y protegerlo frente a una reinfección con el mismo patógeno (Beutler B, 2009; Medzhitov R, 2009; Palm NW et al, 2009; Rosenzweig DS et al, 2011). 3.2. Inmunidad innata y adquirida La inmunidad innata aumenta la protección ofrecida por las barreras físico-químicas. Una vez que el microorganismo logra traspasar estas barreras, la respuesta se inicia rápidamente puesto que los mecanismos de defensa celulares y bioquímicos ya están presentes constitutivamente incluso antes de producirse la infección (Turvey SE et al, 2010). La inmunidad innata es capaz de reconocer estructuras moleculares, no específicas, compartidas por un gran número de patógenos, a través de mecanismos efectores muy eficientes pero limitados para evitar un daño colateral en los tejidos del huésped. El reconocimiento de estas estructuras comunes permite al sistema inmunológico discriminar entre lo propio y lo extraño (Medzhitov R et al, 1997; Janeway CA et al, 2002; Palm NW et al, 2009). La inmunidad innata juega un papel clave en la activación y orientación de la inmunidad adquirida y en el mantenimiento de la integridad de los tejidos y su reparación. Entre los elementos que conforman la inmunidad innata se incluyen diversos tipos celulares de origen hematopoyético; neutrófilos, macrófagos, células dendríticas (DCs - dendritic cells-), mastocitos, eosinófilos y las células citolíticas naturales (células NK - natural killer-), y células de origen no hematopoyético; células epiteliales y fibroblastos (Janeway CA et al, 2002; Koenderman L et al, 2014). Para aumentar las defensas celulares, la inmunidad innata posee además diversos componentes humorales, entre los que se incluyen las proteínas del sistema del complemento y mediadores de la inflamación, así como proteínas de señalización intracelular denominadas citocinas, que actúan regulando la INTRODUCCIÓN GENERAL 23 Introducción actividad de las células de la inmunidad innata y adquirida (Turvey SE et al, 2010; Rosenzweig DS et al, 2011). Las células de la inmunidad innata poseen PRRs capaces de reconocer diversos patrones moleculares ampliamente distribuidos presentes en los microorganismos, los denominados patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs - pathogenassociated molecular patterns-) (Medzhitov R et al, 1997; Soehnlein O et al, 2010; Turvey SE et al, 2010). Dentro de estas categorías se engloban los receptores tipo Toll (TLRs -Toll-like receptors-), los receptores tipo NOD (nucleotide oligomerization domain -NOD-like receptors-) (o NLR), los receptores tipo RIG (cytoplasmic retinoic acidinducible gene, RLRs -RIG-like receptors-) o los receptores KIR (Killer-cell immunoglobulin -KIR-like receptors). Cada uno responde de manera distinta alcanzando diferentes efectos en la respuesta inflamatoria (Beutler B, 2009; Abdullah Z et al, 2014; Iwasaki A et al, 2015). La inmunidad adquirida actúa con posterioridad a la inmunidad innata, tardando entre 4 y 7 días en entrar en acción los mecanismos efectores, siendo un mecanismo de protección adicional desarrollado en vertebrados. Sus componentes actúan a través de receptores altamente específicos, capaces de reconocer sustancias microbianas y no microbianas y diferenciando entre moléculas y microorganismos diferentes, incluso los estrechamente relacionados. La inmunidad adquirida puede potenciar la eficacia de la respuesta inmunológica de una manera antígeno-específica a la vez que minimiza un daño colateral innecesario. Esta inmunidad dota al sistema inmunológico de la capacidad para recordar infecciones previas y proporcionar protección frente a futuras exposiciones con un mismo patógeno. Es esta capacidad para generar memoria inmunológica lo que la hace tan efectiva, ya que la memoria inmunológica resulta en una mejora tanto cualitativa como cuantitativa en segundas o posteriores exposiciones a un microorganismo. La inmunidad adquirida está compuesta por los linfocitos T y los linfocitos B. Los linfocitos T y B responden de una manera específica a sustancias extrañas denominadas antígenos, las cuales son reconocidas mediante el uso de receptores producidos por recombinación somática. El proceso de recombinación da lugar a un extensísimo repertorio de receptores de la célula T (TCR -T-cell receptor-) y a la generación de receptores de la célula B (BCR - B-cell receptor-), lo cual proporciona la especificidad y diversidad existente en los linfocitos (LaRosa DF et al, 2008; den Haan JM et al, 2014). Tras el reconocimiento, algunos linfocitos T y B se transforman en células efectoras de la respuesta inmunológica, mientras que otras permanecerán como células de memoria. Estas células de memoria son EL SISTEMA INMUNOLÓGICO 24 las encargadas de facilitar una respuesta más rápida e intensa en futuras exposiciones frente al mismo patógeno (Medzhitov R, 2009; Palm NW et al, 2009). La inmunidad adquirida podría clasificarse en inmunidad humoral e inmunidad celular. Los anticuerpos o inmunoglobulinas producidos por los linfocitos B conforman la inmunidad humoral. Estos anticuerpos reconocen antígenos microbianos activando diferentes mecanismos efectores para su posterior eliminación, siendo el principal mecanismo de defensa frente a microorganismos extracelulares. La defensa del sistema inmunológico frente a infección por microorganismos intracelulares como virus y algunas bacterias, está a cargo de los linfocitos T. Estos actúan favoreciendo la eliminación de células infectadas por dichos microorganismos a la vez que producen citocinas que activan a los linfocitos B, potencian la fagocitosis y controlan la respuesta inmunológica (Iwasaki A et al, 2015). Las células del sistema inmunológico se encuentran distribuidas ampliamente a lo largo del cuerpo y están en constante migración entre la sangre y los órganos linfoides secundarios. Esta migración facilita la detección rápida de patógenos invasores, garantizando medidas preventivas frente a la infección. (Cahalan MD et al, 2006). Dentro de las poblaciones de linfocitos T podemos distinguir dos grupos principales, los linfocitos T colaboradores CD4+ (Th -T helper cell-) y los linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTLs -cytotoxic T lymphocytes-). Los linfocitos Th CD4+ por un lado estimulan, a través de la producción de citocinas, a las células B antígeno-específicas que se diferencian a células plasmáticas productoras de anticuerpos y a células B de memoria, y por otro reclutan y activan a los fagocitos y linfocitos T CD8+ que cooperan con la aclaración del patógeno. Algunas células T naïve o vírgenes se diferencian a células de memoria encargadas de la defensa frente a futuras reinfecciones por el mismo patógeno. En función de las citocinas secretadas, se pueden diferenciar diversas poblaciones de linfocitos Th. 3.3. Th1, Th2, Th17 En base al perfil de citocinas que producen, la expresión de factores de transcripción específicos y la función que lleven a cabo durante la respuesta inmunológica, se han definido inicialmente, ya en los años 80, dos subpoblaciones de linfocitos Th efectores, denominados linfocitos Th1 y linfocitos Th2 (Annunziato F et al, 2008; Annunziato F et al, 2012). Los linfocitos Th1 y Th2 se diferencian a partir de linfocitos T CD4 naïve. Los linfocitos Th1 se caracterizan por la producción de IL-2, factor de necrosis tumoral α INTRODUCCIÓN GENERAL 25 Introducción (TNF-α) e IFN-γ y por la expresión del factor de transcripción T-bet (T-box-containing protein expressed in T cells). La función principal de estas células es la protección frente a microorganismos intracelulares a través de la activación de los macrófagos. La diferenciación de linfocitos Th1 se ve favorecida por la presencia de IL-12, secretada por las células presentadoras de antígeno. Las células Th2 expresan GATA-3 y producen IL-4, IL-5 e IL-13 involucradas en la erradicación de helmintos. En presencia de IL-4 las células TCD4+ naïve se diferencian a células Th2. Sin embargo, el paradigma Th1/Th2 introducido por Mosmann y Coffman se ha expandido tras el descubrimiento en el año 2005 por Harrington et al (2005), Langrish et al (2005) y Park et al (2005), de una tercera subpoblación de linfocitos Th CD4+ efectores denominados Th17 presentes tanto en humanos como en ratón. Estos linfocitos se caracterizan por la presencia de los factores de transcripción expresados (STAT3 y RORγt (-Retinoic acid receptor (RAR)-related orphan receptor gamma-t-) y por la producción de IL-17A, IL-17F e IL-22, cuya función es proteger al huésped frente a patógenos extracelulares y hongos. Además los linfocitos Th17 se han relacionado con la patogénesis de varias enfermedades autoinmunes (AcostaRodriguez EV et al, 2007; Matsuzaki G et al, 2007; Annunziato F et al, 2008; Korn T et al, 2009; Annunziato F et al, 2012; McGeachy MJ et al, 2012). La participación de TGF-β en la diferenciación de las células Th17 coloca al linaje Th17 en estrecha relación con los linfocitos CD4+CD25+Foxp3+ T reguladores (Tregs - regulatory T cells-) (Korn T et al, 2009). Existe una cierta controversia sobre el papel de TGF-β en la diferenciación de las células Th17 en ratones y humanos, posiblemente debido a que los requerimientos entre las células Th17 humanas y de ratón son diferentes. IL-6, IL-1β e IL-23 promueven la expresión de RORγt y CCR6 (Chemokine (C-C motif) Receptor 6) y la producción de IL-17, mientras que TGF-β, que se muestra esencial para la diferenciación de las células Th17 de ratón, inhibe la diferenciación de las células Th17 humanas (Acosta-Rodriguez EV et al, 2007b; Sallusto F et al, 2012). Estudios posteriores han confirmado el efecto inhibitorio que tiene TGF-β a altas dosis. Sin embargo TGF-β es necesario a bajas dosis para la diferenciación de células Th17 humanas (Sallusto F et al, 2012; Jönsson B et al, 2012). TGF-β, en combinación con otras citocinas, promueve la diferenciación de otras subpoblaciones de linfocitos Th en los compartimentos linfoides periféricos, estableciendo una posible relación en el desarrollo de varias subpoblaciones de células T (Korn T et al, 2009). Actualmente se distinguen otras subpoblaciones de linfocitos Th CD4+ distintas a las ya mencionadas con diversas funciones efectoras, como EL SISTEMA INMUNOLÓGICO 26 las células Th9, Th22, Tregs o T foliculares (Tfh) (Figura 1). En la Tabla 1 se detallan las características principales de todas ellas. Figura 1. Subpoblaciones de células T CD4+. INTRODUCCIÓN GENERAL 27 Introducción Tipo Función inmunológica Marcador superficie Marcador superficie Marcador superficie Factor de transcripción Activador Inhibidor Citocina efectora Tipo Función inmunológica Co * Ch* Cy* Factor de transcripción Activador Inhibidor Citocina efectora Th1 Microorganismos intracelulares -Virus - Bacterias CD26 CD94 CD278 (ICOS) Tim-3 CCR5 CCR4hi CXCR3lo CD178 CD212 T-bet STAT1 STAT4 IL-2 IL12(p70) IL-18 IL-27 RANKL IL-4 IL-10 IL-21 IFN-γ LT-α TNF Perforina Granzima A Granzima B Th2 Microorganismos extracelulares Tim-1 CCR3 CCR4lo CXCR3 CXCR4hi CD30 IL-33α GATA3 STAT5 STAT6 IRF4 IL-2 IL-4 IL-25 IL-31 IL-33 TSLP IFN-γ TGF-β IL-4 IL-5 IL-6 IL-10 IL-13 IL-31 Th9 -Parásitos extracelulares VDR GATA3 STAT6 IRF4 IL-4 TGF-β IFN-γ IL-9 IL-10 CCL17 CCL22 TGF-β Th17 Microorganismos extracelulares en mucosas - Bacterias - Infecciones fúngicas CD161 (NK1) CD278 (ICOS) CCR4hi CCR6 CXCR3lo IL-21R IL-23R RORγt STAT3 IRF4 IL-1 IL-6 IL-21 IL-23 TGF-β IFN-γ IL-2 IL-4 IL-12 IL-27 IL-17A IL-17F IL-21 IL-22 IL-24 IL-26 TNF CCL20 Th22 - Patógenos microbianos CCR4 CCR6 CCR10 CD140 AhR IL-6 TNF TGF-β IL-22 TNF Tfh - Ayuda a células T y B CD84 (SLAMF5) CD150 (SLAMF1) CD200 (OX-2) CD272 (BTLA) CD278 (ICOS) CD279 (PD-1) CCR4 CXCR5 CD126 CD153 CD154 IL-21R MAF Bcl-6 STAT3 IL-6 IL-21 CXCL13 IFN-γ IL-4 IL-17A IL-117F IL-21 nTreg -Regulación respuesta inmunológica Tolerancia inmune CCR7 CD25hi CD127lo FOXP3 STAT5 TGF-β IL-10 IL-35 iTreg -Regulación tolerancia CD152 (CTLA-4) CD223 (LAG3) CD279 (PD-1) Expresión variable CD25hi CD127lo FOXP3 STAT5 IL-2 Ácido retinoico TGF-β IL-1 IL-21 IL-23 IL-10 IL-35 TGF-β Tabla 1. Diferenciación de las células T CD4+. Las subpoblaciones de células T CD4+ se clasifican según la expresión de receptores de quimiocinas o de citocinas. * Como marcadores de superficie, se muestran las principales moléculas coestimuladores (Co), los receptores de quimiocinas (Ch) y los receptores de citocinas (Cy). EL SISTEMA INMUNOLÓGICO 28 4. INMUNIDAD FRENTE A MICOBACTERIAS 4.1. Modelos Experimentales Estudios genéticos en ratón han mostrado que existen diversos genes que afectan a la susceptibilidad a infecciones micobacterianas. En los macrófagos de ratón, la secreción de IFN-γ y de TNF-α, activan los mecanismos microbicidas frente a micobacterias (Ottenhoff TH et al, 2002). En los humanos, una vez que se ha formado el fagosoma, los macrófagos infectados y las DCs muestran antígenos específicos de M. tuberculosis a través de las moléculas MHC de clase II. Estas células presentadoras de antígeno profesionales (APC) viajan hasta los nódulos linfáticos donde activan a las células Th CD4+ que regulan la expresión de citocinas y se encargan de la formación y mantenimiento de los granulomas. La cascada de señalización de citocinas proinflamatorias (IFN-γ, IL-2, TNF-α), conduce a la atracción de células mononucleares y linfocitos T y, junto con los linfocitos B y las DCs, construyen un granuloma, característico de la reacción del tejido a la tuberculosis (Muñoz L et al, 2015). En los humanos, los granulomas son heterogéneos y se encuentran bien organizados, y pueden llegar a ser necróticos, calcificados y caseosos, lo cual es un sello distintivo de la infección por M. tuberculosis (Fortin A et al, 2007). El modelo de ratón se ha utilizado para el estudio de la vacunación con BCG y definir qué factores a nivel molecular intervienen en la inmunidad protectora frente a M. tuberculosis. Uno de los principales genes estudiados para evaluar diferencias en la respuesta a M. bovis (cepa BCG) ha sido el gen Nramp1 (-Natural resistance-associated macrophage protein 1-, conocido también como Slc11a1). Nramp1 se expresa en la membrana de los lisosomas de macrófagos y actúa como transportador de cationes pHdependiente en la membrana fagosomal. La depleción de los cationes divalentes mediado por Nramp-1 inhibe las funciones del macrófago, como su capacidad bactericida y la inducción del estallido oxidativo, indispensables para la defensa contra infecciones (Fortin A et al, 2007; Abel L et al, 2014). La IL-12 es crucial para combatir la infección por M. tuberculosis mediante la inducción de la expresión de IFN-γ y la activación de los linfocitos antígeno-específicos capaces de formar granulomas (Cooper AM et al, 1997; Flynn JL et al, 2001). Experimentos en ratones BALB/c infectados con M. tuberculosis mostraron que la administración temprana de IL-12 resultó en una disminución significativa en el número de bacterias y en un incremento en el tiempo de supervivencia, aunque los ratones aún INTRODUCCIÓN GENERAL 29 Introducción sucumbían a la infección. Por el contrario, IL-12 tuvo un efecto menor en la carga bacteriana en ratones C57BL/6. Este enfoque evalúa in vivo el impacto que tiene el efecto genético sobre la susceptibilidad a la infección por M. tuberculosis. La desventaja es que este efecto genético puede ser difícil de analizar en cruces de ratón estándar (Flynn JL et al, 2001; Fortin A et al, 2007). Cooper et al (1997) utilizó ratones deficientes en el gen IL-12p40. Comparado con los ratones del grupo control, los ratones IL-12p40-/- fueron más susceptibles a la infección, con un incremento en la carga bacteriana y una disminución en el tiempo de supervivencia, posiblemente debido a una reducción en la producción de IFN-γ (Cooper AM et al, 1997; Cooper AM et al, 2002). Al igual que en humanos, los ratones con deficiencias genéticas que resultan en la pérdida de inducción, producción o respuesta a IFN-γ, son susceptibles a infecciones por bacterias intracelulares, incluyendo micobacterias y salmonela. Experimentos con ratones IFN-γ-/- demostraron que éstos eran susceptibles a infección por BCG y que presentaban defectos en la estructura del granuloma con resultados letales. Sin embargo, los ratones silvestres 129/Sv x C57BL/6 F2 fueron resistentes a la infección. Estos resultados revelan la importancia del IFN-γ en la protección inmune frente al BCG y en el desarrollo de granulomas maduros en ratón. Se ha visto además, que los ratones IFN-γ-/- 129/Sv x C57BL/6 F2 son más susceptibles a M. tuberculosis que los ratones silvestres (Cooper AM, 2015; Jouanguy E et al, 1999). Además, defectos en los genes del IFNG e IFNGR1 en ratones, causan una susceptibilidad no sólo a infección por micobacterias, sino también a infecciones por otras bacterias tanto intracelulares como extracelulares, y a infecciones por virus. Otro estudio en ratones deficientes en IFNGR2 mostraron tener una producción defectuosa de IFN-γ y una susceptibilidad a la infección por Listeria monocytogenes (Caragol I et al, 2003). La citocina IL-23, no es esencial en la resistencia primaria a M. tuberculosis, pero se requiere para la generación de una respuesta de células T CD4+ productoras de IL-17 específica de micobacterias (Khader SA et al, 2007). Sin embargo, en el caso de ratones que carecen del gen de IL-12p35 y por tanto la IL-12p70 está ausente, IL-23 es necesaria para la generación de células T CD4+ antígeno-específicas productoras de IFN-γ, la inducción de genes antimicobacterianos, y el control del crecimiento bacteriano (Khader SA et al, 2005). Aunque la señalización del receptor de la IL-17 (IL-17RA) no es requerida para el control primario de M. tuberculosis, la mejora en el reclutamiento de células Th1 efectoras en ratones vacunados con antígenos para M. tuberculosis, está mediada por IL-17A a través de la regulación de algunos ligandos de quimiocinas como MIG (monokine INMUNIDAD FRENTE A MICOBACTERIAS 30 induced by IFN-γ), IP-10 (IFN-γ-induced protein 10) y CXCL11 (chemokine (C-X-C motif) ligand 11). Estas quimiocinas son críticas para la movilización de las células Th1 productoras de IFN-γ al granuloma y para restringir el crecimiento bacteriano. Las células Th17 protegen frente a bacterias extracelulares Gram-negativas y hongos. Se ha encontrado que durante la infección por Klebsiella pneumoniae, Bacteroides fragilis, Citrobacter rodentium, Escherichia coli, Borrelia burgdoferi y algunas especies de hongos, existe un predominio de células T productoras de IL-17, mientras que esta citocina desempeña un papel más modesto en la protección frente a micobacterias intracelulares (Ouyang W et al, 2008; Annunziato F et al, 2008). La IL-22, es producida principalmente por las células T y NK. Un linaje de células T denominado Th22 produce IL-22, y las células Th17 productoras de IL-17A pueden producir IL-22 en una forma IL-23 dependiente. Experimentos en ratón demostraron que la ausencia de IL-22 en ratones silvestres, no tuvo ningún efecto aparente sobre el control de la infección por M. tuberculosis. Los ratones IL-22-/- presentaron cargas bacterianas normales, y no se observaron diferencias de supervivencia a largo plazo tras la infección por M. tuberculosis cuando se comparó con los ratones del grupo control C57BL/6 (Behrends J et al, 2013; Mayer-Barber KD et al, 2015). Otros estudios en modelos animales, incluyendo conejos, primates no humanos, o zebrafish, son esenciales para proporcionar información complementaria a la obtenida en los estudios humanos (Abel L et al, 2014; Flynn JL et al, 2006). Sin embargo, en los últimos años diversas evidencias han mostrado diferencias entre los modelos animales y la enfermedad en humanos in natura. Los modelos de ratón tienen una serie de limitaciones a la hora de comparar los resultados obtenidos con lo que sucede en humanos. La mayoría de las infecciones en pacientes con susceptibilidad mendeliana a enfermedad por micobacteria (MSMD -mendelian susceptibility to mycobacterial disease-) ocurre de manera natural, mientras que en los ratones, estas infecciones son experimentales y se administran con frecuencia vía intravenosa, controlando la cepa y la dosis del patógeno que se inocula. 4.2. Estudios de asociación genética en humanos Los patógenos infecciosos son una de las fuerzas selectivas más potentes que actúan sobre las poblaciones humanas. Sin embargo, la genética del huésped influye en la susceptibilidad de los individuos a enfermedades infecciosas (Karlsson EK et al, 2014). El desarrollo de tuberculosis u otras enfermedades micobacterianas, es el resultado de una INTRODUCCIÓN GENERAL 31 Introducción Figura 4. Receptor de la IL-23. La cadena IL-12Rβ1 del receptor de IL-23 se asocia con TYK-2 en una forma dependiente de ligando con STAT3. La cadena IL23R interactúa directamente con JAK-2. La activación de STAT3 inducida por IL-23 conduce a la unión directa de STAT3 fosforilado a los promotores de IL-17 e IL-17F. STAT3 aumenta la expresión de ROR-γ, un regulador transcripcional específico de Th17 que es crítico para la expresión de IL-17A e IL-17F. La activación de JAK2 inducido por IL-23 desencadena las vías PI3K/AKT y NF-kB vías que son requeridas para la producción de IL-17 e IL-22 que actúan sobre las células KC y PMN. TYK-2: Tirosina kinasa; JAK-2: Janus kinasa-2; STAT3: transductor de señal y activador de la transcripción 3; PI3K/AKT: vía fosfatidilinositol-3-kinasa/AKT; NF-κB: Factor nuclear κB; KC: keratinocitos; PMN: células polimorfonucleares (neutrófilos). Desde 1996, han sido descritos 9 genes causantes de MSMD, siete genes autosómicos (IFNGR1, IFNGR2, STAT1, IL12B, IL12RB1, IRF8, ISG15) y dos genes ligados al cromosoma X (IKBKG, CYBB). La mayoría de los productos génicos están inmunológicamente relacionados e involucrados en la inmunidad mediada por IFN-γ. Tres genes controlan la respuesta a IFN-γ, IFNGR1, IFNGR2, STAT1; cuatro genes están INMUNIDAD FRENTE A MICOBACTERIAS 38 involucrados en la producción de IFN-γ, IL12B, IL12RB1, IKBKG, ISG15; uno está involucrado en la secreción de IL-12 dependiente de IFN-γ, IRF8; y otro gen que controla el estallido respiratorio en los macrófagos (CYBB), el cual puede estar desencadenado por el IFN-γ. Los defectos genéticos en IFNGR1, IFNGR2, STAT1 e IRF8 dañan la respuesta celular a IFN-γ y los defectos en IL12B e IL12RB1, además de ocasionar una deficiencia de producción de IFN-γ, conllevan un defecto en el desarrollo de las Th17 y de la producción de IL-17. Mutaciones específicas en IKBKG y CYBB causan susceptibilidad mendeliana a enfermedad por micobacterias ligada al cromosoma X. El alto nivel de heterogeneidad alélica muestra hasta 18 etiologías genéticas diferentes basadas en el modo de heredabilidad (dominante o recesivo), el impacto de la mutación (nula o hipomórfica) y la expresión (expresión o no de los receptores en la superficie celular) y función del alelo mutante (fosforilación, unión al ADN o ambos) como responsables de MSMD (Al-Muhsen S et al, 2008; Bustamante J et al, 2014). En la Tabla 2 se muestra la clasificación actualizada de las etiologías genéticas causantes de la MSMD. Gen Heredabilidad Defecto Proteína IL12B AR C E− IL12RB1 AR C E+ AR C E− IFNGR1 AR C E+ AR C E− AR P E+ AD P E+++ IFNGR2 AR C E+ AR C E− AR P E+ AD P E+ STAT1 AD P E+P− AD P E+B− AD P E+P−B− IRF8 AD P E+ NEMO XR P E+ CYBB XR C E+ ISG15 AR C E− Tabla 2. Etiología genética de las MSMD. Modificado de Bustamante J et al, Seminars in Immunology, 2014. Modo de herencia AR: autosómico recesivo; AD: autosómico dominante; XR: recesivo ligado al cromosoma X. Defecto funcional C: defecto completo; P: defecto parcial. Proteína mutante E+: expresada; E−: no expresada; P−: no fosforilada; B−: incapaz de unirse al ADN bajo estimulación con IFNs. INTRODUCCIÓN GENERAL 39 Introducción A pesar de los avances realizados, estos defectos representan sólo la mitad de los pacientes con MSMD conocidos y aproximadamente en la mitad de todos los pacientes con enfermedad diseminada por MNT, el defecto en el eje IL-12/IFN-γ no está identificado (Wu UI et al, 2015; Bustamante J et al, 2014). De las deficiencias conocidas causantes de MSMD, la deficiencia de IFN-γR1 y la deficiencia IL12-Rβ1 son las más frecuentes, y representan casi el 80% de todos los casos diagnosticados genéticamente (Figura 5). Figura 5. Defectos genéticos en la inmunidad mediada por el IFN-γ. Modificado de Bustamante J et al, Seminars in Immunology, 2014. Se han identificado 9 genes causantes de MSMD. Las proteínas afectadas se muestran en rojo. 4.4.1. Deficiencia del receptor 1 de Interferón gamma (IFN-γR1) La primera etiología genética de MSMD fue identificada en 1996, con mutaciones nulas en el gen IFNGR1, bajo el término de deficiencia autosómica recesiva completa de IFN-γR1 (RC-IFN-γR1 -autosomal recessive complete IFN-γR1-) y es el resultado de mutaciones en las que no se observa expresión de este receptor (Jouanguy E et al, 1996). La mayoría de los pacientes portan mutaciones homocigotas, con sólo unos pocos heterocigotos identificados. Hasta la fecha hay identificados 33 pacientes procedentes de INMUNIDAD FRENTE A MICOBACTERIAS 40 27 familias y 25 mutaciones diferentes: deleciones (n=10), inserciones (n=4), sin sentido (n=2), missense (n=5) y en sitios de empalme (n=4) (Bustamante J et al, 2014; Olbrich P et al, 2015). Se han descrito dos formas de deficiencia RC-IFN-γR1, con o sin expresión en superficie del receptor (Dorman SE et al, 2004). En la deficiencia de RC-IFN-γR1 el fenotipo celular se caracteriza por la pérdida total de respuesta a IFN-γ in vitro de los leucocitos y fibroblastos en términos de producción de IL-12p70 o TNF-α. El plasma de estos pacientes contiene niveles muy elevados de IFN-γ (Al-Muhsen S et al, 2008). Los pacientes presentan un fenotipo clínico grave que se caracteriza por infecciones por BCG o MNT (M. fortuitum, M. smegmatis, M. chelonae, M. peregrinum, M. mageritense y M. scrofulaceum) de comienzo temprano y diseminadas. En ausencia de trasplante de médula ósea (el único tratamiento curativo) la mortalidad es cercana al 50% antes de los 10 años de edad (Wu UI et al, 2015). La infección por M. tuberculosis sólo se ha identificado en dos pacientes incluyendo un paciente que murió por enfermedad diseminada a pesar del tratamiento antibiótico. La penetrancia clínica en la infancia es completa con un comienzo de infecciones antes de los tres años de edad. La salmonelosis ha sido descrita en menos del 5% de los niños con esta deficiencia (3 pacientes) (Jouanguy E et al, 1996; Newport MJ et al, 1996; Dorman SE et al, 2004). Otras infecciones causadas por patógenos como Listeria monocytogenes y Toxoplasma spp., así como virus incluyendo citomegalovirus (CMV) o herpesvirus humano 8 (HHV8), virus respiratorio sincitial (VRS) y el virus de varicela-zóster (VZV), se han descrito en pacientes individuales. Sin embargo, no se puede descartar que otros factores, distintos a la señalización por IFN-γ, puedan influenciar la susceptibilidad a otras infecciones en estos pacientes. (Al-Muhsen S et al, 2008; Bustamante J et al, 2014). El tratamiento con IFN-γ no está indicado por la pérdida de receptores específicos. El trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT -hematopoietic stem cell transplantation-) es el único tratamiento de curación conocido (Roesler J et al, 2004). La forma más común de deficiencia de IFN-γR1 es la forma autosómica dominante parcial IFN-γR1 (DP-IFN-γR1 -autosomal dominant partial IFN-γR1-), identificada por primera vez en 1999 (Jouanguy E et al, 1999b), (68 pacientes procedentes de 43 familias), resultante de mutaciones en heterocigosis en el segmento citoplasmático de IFNGR1, dando lugar a un incremento de moléculas truncadas no funcionales que se acumulan en la superficie celular. Estas moléculas se unen a IFN-γ pero no transducen la señal, ejerciendo un efecto dominante negativo. Todas las mutaciones confieren un fenotipo celular similar que se caracteriza por una respuesta residual a estimulación con IFN-γ in vitro. El fenotipo INTRODUCCIÓN GENERAL 41 Introducción clínico es menos grave que en los niños con deficiencia RC-IFN-γR1, dado que sólo 1 paciente de los 68 descritos ha fallecido (Bustamante J et al, 2014) y varios pacientes han alcanzado o han sido diagnosticados en la edad adulta. Los pacientes suelen presentar infecciones recurrentes y moderadamente graves por MNT (M. abscessus, M. avium complex, M. chelonae, M. kansasii) y BCG. Sólo se han descrito casos de infección por Salmonella spp. en un 5% de los pacientes con DP-IFN-γR1. Más de un 70% de los pacientes presentaron osteomielitis. Además se han detectado otros patógenos asociados como Histoplasma capsulatum y VZV en pacientes individuales, mientras que dos pacientes sufrieron tuberculosis, uno debido a M. tuberculosis y el otro por M. bovis, como única infección. El pronóstico en estos pacientes es bueno y la infección por micobacterias puede ser controlada con tratamiento antibiótico con o sin IFN-γ (Jouanguy E et al, 1999b; Dorman SE et al, 2004; Filipe-Santos O et al, 2006; Al-Muhsen S et al 2008; Bustamante J et al, 2014). No todos los pacientes con deficiencia de IFN-γR1 presentan estas formas. En 1997 se publicaron dos pacientes homocigotos para la mutación p.I87T en IFNGR1 que presentaban una respuesta parcial a IFN-γ in vitro y una presentación clínica más leve. El fenotipo celular mostró que el IFN-γR1 podía ser detectado en la superficie celular aunque en expresión variable. Estos receptores sí son capaces de unir IFN-γ y se observó una respuesta baja pero detectable a altas concentraciones de IFN-γ in vitro (Jouanguy E et al, 1997). 4.4.2. Deficiencia del receptor 2 de Interferón gamma (IFN-γR2) La deficiencia de IFN-γR2 fue identificada en 1998 y es una de las etiologías MSMD más raras (Moncada-Vélez M et al, 2013). Tanto la deficiencia AR completa como la AR parcial del IFN-γR2 son responsables de causar MSMD. Los pacientes con deficiencia AR completa muestran una respuesta celular a IFN-γ suprimida en cuanto a fosforilación de STAT-1, activación del factor gamma activado (GAF) y la inducción de genes diana dependientes de GAF. Las manifestaciones comienzan en la infancia temprana con infecciones a menudo mortales. Los patógenos más comunes identificados incluyen a M. bovis BCG, M. avium, M. fortuitum, M. abscessus, M. simiae y M. porcium (Toyoda H et al, 2010; Martínez-Barricarte R et al, 2014). El HSCT es el único tratamiento curativo en pacientes con mal pronóstico. INMUNIDAD FRENTE A MICOBACTERIAS 42 La deficiencia AR parcial de IFN-γR2 daña pero no suprime la respuesta a IFN-γ. Las infecciones por micobacterias encontradas son causadas por BCG, M. bovis, M. abscessus, M. elephantis, M. fortuitum y M. simiae. En este caso los antibióticos suplementados IFN-γ parecen ser efectivos (Moncada-Vélez M et al, 2013; Bustamante J et al, 2014). Se ha identificado hasta la fecha un único paciente con deficiencia AD parcial de IFN-γR2 y MSMD (Kong XF et al, 2013). Las células del paciente mostraron una respuesta a IFN-γ ligeramente dañada, de manera similar a la de aquellos pacientes con MSMD con deficiencia AR parcial IFN-γR2 o deficiencia de STAT1. Es probable que la mutación en heterocigosis que porta el paciente en el gen IFNGR2 y que origina la deficiencia de tipo AD IFN-γR2, sea la causante de MSMD. La penetrancia clínica de esta forma de enfermedad es incompleta debido a la variabilidad en la respuesta celular a IFN-γ en estos individuos, ya que otros individuos heterocigotos identificados han permanecido sanos, incluido un familiar del paciente (padre). De hecho es la penetrancia más baja encontrada entre las AD IDPs por haploinsuficiencia (Bustamante J et al, 2014). 4.4.3. Deficiencia de la cadena β1 del receptor de la IL-12 (IL-12Rβ1) La deficiencia AR completa de IL-12Rβ1 es probablemente la causa más frecuente de MSMD. Fue descrita por primera vez en 1998 (Jong R et al, 1998) y hasta la fecha se han diagnosticado 181 pacientes de 137 familias, habiéndose identificado 78 mutaciones: mutaciones sin sentido (n=18), missense (n=24), sitios de empalme (n=13), pequeñas deleciones (n=16), deleciones largas (n=3) inserciones (n=1), y duplicaciones (n=3) (Bustamante J et al, 2014; Senanayake MP et al, 2015). Las células T activadas y NK de los pacientes con deficiencia AR IL-12Rβ1 no expresan el receptor en la superficie. De hecho los pacientes analizados no responden a IL-12 e IL-23, y todos producen bajos niveles de IFN-γ (Fieschi C et al, 2004). El fenotipo clínico es muy heterogéneo. Algunos pacientes fallecen a edades tempranas (32%) mientras que otros no han manifestado la enfermedad en edad adulta (la penetrancia clínica global es del 79% entre los 7 y los 20 años) (de Beaucoudrey L et al, 2010). Las infecciones más frecuentemente observadas son las debidas a infecciones por MNT (BCG, M. avium, MAC, M. chelonae, M. fortuitum, M. fortuitum-chelonae complex, M. genevense, M. gordonae, M. tilburgii, M. triplex y M. simiae) (Bustamante J et al, 2014). Además, se han descrito varios pacientes no relacionados que sufrieron tuberculosis grave como único fenotipo infeccioso. La segunda causa más frecuente de infección es la salmonelosis no tifoidea extraintestinal, descrita en INTRODUCCIÓN GENERAL 43 Introducción casi la mitad de los pacientes afectos (Wu UI et al, 2015). Se han descrito otras infecciones en estos pacientes debidas a patógenos como K. pneumoniae e infecciones fúngicas por Paracoccidioides brasiliensis, Coccidiodes spp., Histoplasma spp. y Cryptococcus neoformans. Además, se han documentado casos raros de infecciones parasitarias como toxoplasmosis y leishmaniasis. La mortalidad es cercana al 30%, la mayoría debida a infecciones graves por MNT (de Beaucoudrey L et al, 2010; Prando C et al, 2013; BoissonDupuis S et al, 2015). El pronóstico en estos pacientes es variable. El tratamiento frente a micobacterias incluye antibióticos potentes y de uso prolongado así como IFN-γ subcutáneo. El tratamiento profiláctico con antibióticos puede ser considerado en episodios recurrentes de salmonelosis (Al-Muhsen S et al, 2008; Bustamante J et al, 2014) y no se contempla el trasplante de médula ósea salvo en casos raros. 4.4.4. Deficiencia de la subunidad p40 de la IL-12 (IL-12p40) La IL-12 se compone de las subunidades p35 y p40 codificadas por los genes IL12A e IL12B respectivamente. En 1999 se publicó la deficiencia en el gen codificante de la subunidad IL-12p40 (IL12B). La subunidad p40 también puede asociarse con p19 y formar la IL-23. La deficiencia de IL-12p40 fue la primera inmunodeficiencia descubierta que resulta en un defecto de citocina heredado. Se han identificado diversas mutaciones en numerosos pacientes en familias procedentes de varios países. Todas las mutaciones confieren un defecto AR completo. Prácticamente todos los pacientes vacunados con BCG sufrieron enfermedad por BCG. Se han descrito además infecciones causadas por M. tuberculosis y MNT. La salmonelosis se ha descrito en un 25% de los pacientes y a menudo se manifiesta de forma recurrente. Otras infecciones son causadas por varios patógenos, entre los que se incluyen hongos del género Candida y bacterias como Klebsiella spp. y Nocardia spp. La penetrancia clínica es de un 50% antes de los 12 años de edad. El tratamiento de estos pacientes se lleva a cabo mediante el uso prolongado de antibióticos e IFN-γ recombinante, y no se recomienda HSCT en la mayoría de los casos (Filipe-Santos O et al, 2006; Bustamante J et al, 2014; Wu UI et al, 2015). INMUNIDAD FRENTE A MICOBACTERIAS 44 4.4.5. Deficiencia de ISG15 La deficiencia ISG15 fue descrita por primera vez en 1979. El gen ISG15 (interferonstimulated gene 15), codifica para la proteína intracelular ISG15. Esta proteína ISG15 puede ser liberada en los humanos por los neutrófilos, monocitos, linfocitos y por los gránulos secretores de los granulocitos. La ISG15 secretada actúa sobre las células T y NK induciendo la producción de IFN-γ. El defecto en ISG15 causa un daño en la producción de IFN-γ, aunque ésta no está completamente suprimida. Los pacientes con deficiencia AR completa de ISG15 presentan enfermedad grave por micobacterias (Bogunovic D et al, 2013; Al-Muhsen S et al, 2008). 4.4.6. Deficiencia de IRF8 El factor 8 regulador de interferón (IRF8 -interferon regulatory factor 8-), es un miembro de la familia de factores reguladores de IFN que se expresa a altos niveles en fagocitos mononucleares y regula la diferenciación de macrófagos y granulocitos y el desarrollo de DCs. IRF8 puede activar o suprimir la transcripción génica bajo la estimulación con IFN-γ, lipopolisacárido (LPS) y otros estímulos microbianos. IRF8 juega un papel importante en la defensa frente a patógenos intracelulares, activando las defensas antimicrobianas, la producción de IL-12 en respuesta a IFN-γ y la defensa frente a la infección por M. tuberculosis (Hambleton S et al, 2011; Marquis JF et al, 2011). En 2011 se describen los primeros 3 pacientes con deficiencia IRF8: un niño con deficiencia AR completa de IRF8 y dos pacientes, un varón adulto y una joven adolescente con deficiencia AD IRF8. Los dos pacientes con deficiencia AD parcial IRF8 presentaron un recuento normal de linfocitos circulantes, monocitos y granulocitos, pero mostraron una pérdida selectiva de la principal subpoblación de DCs mieloides (DR+CD11c+CD1c+). Las manifestaciones clínicas en ambos pacientes fueron episodios recurrentes de enfermedad BCG diseminada sin otras enfermedades infecciosas. Un adecuado tratamiento con antibióticos micobacterianos ha permitido que en la actualidad los dos pacientes estén sanos y sin tratamiento (Hambleton S et al, 2011; Bustamante J et al, 2014). El paciente con deficiencia AR de IRF8 presentó una ausencia de monocitos y DCs, y sufrió varias enfermedades infecciosas incluyendo enfermedad BCG diseminada, candidiasis oral e infecciones respiratorias graves, y recibió HSCT como tratamiento INTRODUCCIÓN GENERAL 45 Introducción curativo además de terapia antibiótica y antifúngica. Debido al amplio fenotipo infeccioso y defectos en los estudios hematológicos e inmunológicos de rutina, esta forma de la enfermedad no se considera una etiología MSMD (Salem S et al, 2014). 4.4.7. #Deficiencia de STAT1. La deficiencia STAT1 ha sido descrita en varios pacientes e implica al factor de transcripción STAT-1, clave en la respuesta celular mediada por citocinas incluyendo IFNs de tipo I (INF-α/β), tipo II (IFN-γ) y tipo III (INF-λ) (Bustamante J et al, 2014). Además de en la señalización por parte del IFN-γR, STAT-1 se encarga de la respuesta intracelular mediada por los receptores de interferones tipo I (IFN-α, β) y tipo III (IFN-λ). La señalización por estos receptores induce la formación y fosforilación de los heterodímeros STAT1-STAT2, que interactúan con el factor 9 regulador de interferón (IRF9 - interferon regulatory family-9-). Este heterodímero se transloca al núcleo y se une a una secuencia de ADN específica denominada elementos de respuesta estimulados por IFN (ISRE -IFNstimulated response elements-), induciendo la transcripción de genes (Kristensen IA et al, 2011; Sampaio E et al, 2012). Se han encontrado varias mutaciones en el gen STAT1. Estas mutaciones confieren defectos de deficiencia AR completa o parcial de STAT1 o AD STAT1 (Averbuch D et al, 2011; Boisson-Dupuis S et al, 2012). La deficiencia AD de STAT1, descrita en 2001, predispone a los individuos a enfermedad por micobacterias, debido a un daño en la inmunidad mediada por IFN-γ, pero dado que no afecta a la inmunidad mediada por IFN-α/β, los pacientes no son particularmente susceptibles a infecciones virales. Los pacientes desarrollan infecciones causadas por BCG y MNT, como M. avium. Sin embargo, se han descrito algunos pacientes con esta deficiencia pero permanecen asintomáticos, por lo que la penetrancia clínica es incompleta. El pronóstico en estos pacientes es bueno y no existen muertes causadas por MSMD en pacientes con deficiencia AD de STAT1. El tratamiento con antibióticos e IFN-γ es efectivo para tratar las infecciones (Chapgier A et al, 2009; Bustamante J et al, 2014). Dos desórdenes relacionados, como las formas recesiva completa y parcial de la deficiencia de STAT1 dañan la respuesta a IFN-α/β e IFN-λ y confieren una vulnerabilidad más amplia a micobacterias y virus, por lo que no se incluyen en la clasificación de MSMD (Döffinger R et al, 2001; Dupuis S et al, 2003; Chapgier A et al, 2009; Bustamante J et al, 2014). La deficiencia AR completa de STAT1 se caracteriza por una ausencia en la INMUNIDAD FRENTE A MICOBACTERIAS 46 expresión de la proteína normal y una respuesta celular suprimida, tanto a IFN-γ antimicobacteriano como a los INF-α y -β e IFN-λ antivirales. Los pacientes presentaron una susceptibilidad muy grave a infecciones por micobacterias y virus y por tanto una clínica diferente a la que presentan los pacientes con MSMD (Chapgier A et al, 2006). En la deficiencia AR parcial de STAT1, la respuesta a IFN-γ e IFN-α está dañada pero no completamente suprimida, y los pacientes son susceptibles a infecciones por BCG, M. avium, M. szulgai, Salmonella spp. y virus (virus del herpes simple -VHS-, molluscum contagiosum, VRS y VZV). En este caso, el fenotipo infeccioso es más amplio que en pacientes con MSMD (Bustamante J et al, 2014). El resultado clínico depende de la medida en que el defecto disminuya la respuesta a estas citocinas (Boisson-Dupuis S et al, 2012; Shamriz O et al, 2013). 4.4.8. Deficiencia de NEMO. La deficiencia de NEMO (NF-kB essential modulator) (IKKγ) fue descrita inicialmente en 1986. Las mutaciones en este gen dañan la activación de NF-κB. Este factor de transcripción juega un papel clave en la respuesta inflamatoria e inmunológica, así como en el control de la apoptosis (Döffinger R et al, 2001; Bustamante J et al, 2014). NF-κB es activado por una gran variedad de estímulos y son diversos los genes y respuestas biológicas que controla. El gen NEMO (o IKBKG), localizado en el cromosoma X, codifica para un modulador esencial de NF-κB (NEMO). NEMO es una subunidad reguladora del complejo IKK que activa la vía de señalización NF-κB canónica, regulando la expresión de varios genes diana. Mutaciones en este gen confieren diferentes fenotipos tanto a nivel clínico como celular. Defectos completos en NEMO causan incontinencia pigmenti dominante ligada al cromosoma X en mujeres, pero es letal in utero en fetos masculinos. Defectos parciales que dañan pero no suprimen por completo la señalización de NF-κB, confieren fenotipos que van desde la displasia anhidrótica ectodérmica a la osteoporosis y el linfedema. Los pacientes son susceptibles a MNT, bacterias encapsuladas, virus y Pneumocystis jirovecii (Puel A et al, 2004; Uzel G, 2005; Picard C et al, 2011), aunque la mayoría sufren de enfermedad neumocócica invasiva. Se han identificado dos mutaciones específicas en NEMO, (E315A y R319Q) que causan MSMD (Filipe-Santos O et al, 2006b). Estos pacientes sufren de infecciones por BCG y MNT. No se han descrito otras infecciones graves, con la excepción de infección invasiva por Haemophilus influenzae de tipo b en un paciente. El pronóstico difiere entre pacientes, que pueden verse INTRODUCCIÓN GENERAL 47 Introducción Hipótesis HIPÓTESIS - Los defectos en los sistemas IL-12-IL-23/IFN-γ confieren susceptibilidad a sufrir enfermedad causada por micobacterias y, en menor grado, por salmonela. - Debido al defecto de respuesta a IL-23, los pacientes con deficiencia de IL-12RB1 son más susceptibles a la infección por Candida spp. - La incidencia de las inmunodeficiencias primarias englobadas dentro de las MSMD puede ser elevada en pacientes con infecciones causadas por micobacterias, en particular en aquellos con infecciones diseminadas por micobacterias ambientales no tuberculosas. HIPÓTESIS 57 Hipótesis Objetivos generales OBJETIVOS GENERALES Es necesario ampliar nuestro conocimiento acerca del papel que ejercen los sistemas IL-12/IFN-γ e IL-23/IL-17-IL-22 en la defensa frente a infecciones causadas principalmente por micobacterias, salmonela y Candida spp. El estudio de pacientes con deficiencia en estos sistemas, puede aportar importantes datos acerca del papel de la inmunidad mediada por IFN-γ e IL-17 en la defensa frente a estas infecciones. Además, estos estudios podrían ayudar al diagnóstico y manejo terapéutico de pacientes con inmunodeficiencias primarias, asociadas a la predisposición a infecciones por micobacterias, salmonela y/o Candida spp. Para ello, los objetivos generales son: 1. Estudiar la base molecular del defecto en pacientes con sospecha de susceptibilidad mendeliana a enfermedad por micobacterias. 2. Mejorar las técnicas para el diagnóstico de estas inmunodeficiencias primarias. 3. Analizar el fenotipo clínico/infeccioso y el pronóstico de los pacientes. 4. Evaluar la posible implicación de los defectos de IL-12Rβ1 en la susceptibilidad a enfermedad causada por Candida spp. OBJETIVOS GENERALES 61 Objetivos Objetivos concretos doi: 10.1136/jmg.2009.071910 2010 47: 635-637J Med Genet María Cárdenes, Alfonso Angel-Moreno, Claire Fieschi, et al. 1 deficiencyβyoung adult with IL-12R Oesophageal squamous cell carcinoma in a http://jmg.bmj.com/content/47/9/635.full.html Updated information and services can be found at: These include: References http://jmg.bmj.com/content/47/9/635.full.html#related-urls Article cited in: http://jmg.bmj.com/content/47/9/635.full.html#ref-list-1 This article cites 9 articles, 3 of which can be accessed free at: service Email alerting the box at the top right corner of the online article. Receive free email alerts when new articles cite this article. Sign up in Collections Topic (4 articles)Oesophageal cancer Articles on similar topics can be found in the following collections Notes http://group.bmj.com/group/rights-licensing/permissions To request permissions go to: http://journals.bmj.com/cgi/reprintform To order reprints go to: http://group.bmj.com/subscribe/ To subscribe to BMJ go to: group.bmj.com on October 13, 2011 - Published by jmg.bmj.comDownloaded from Conclusiones 1. Entre los estudios inmunológicos realizados, destaca que las PBMCs de los dos pacientes estudiados, no producían IFN-γ en respuesta a la estimulación de linfocitos T con diferentes mitógenos solos o en combinación con IL-12. 2. Las líneas T linfoblastoideas activadas con PHA/IL-2 de ambos pacientes mostraron un profundo defecto de producción de IFN-γ en respuesta a concentraciones crecientes de IL-12. 3. Los pacientes 1 y 2 no produjeron IL-17 en respuesta a la estimulación con CD2+CD28. 4. La células T activadas con PHA/IL-2 de los pacientes 1 y 2 no expresaron la cadena IL-12Rβ1. 5. Los análisis genéticos revelaron que los pacientes 1 y 2 eran homocigotos para una mutación que implica un cambio de timidina por guanina en el nucleótido 1791 del gen, del segundo nucleótido (1791 +2 T>G) en el intrón 15, justo tras la región que codifica el dominio transmembrana del gen IL12RB1. El fenotipo clínico de un tercer paciente de esta familia sugiere también una deficiencia en homocigosis de IL-12Rβ1. 6. Uno de los pacientes presentó a los 25 años candidiasis oral y esofágica sobre un carcinoma de células escamosas (SCC -squamous cell carcinoma-) bien diferenciado en ausencia de factores de predisposición, aparte de su inmunodeficiencia, a este tipo de cáncer. Los pacientes con deficiencias del sistema IL-12/IFN-γ pudieran presentar una mayor susceptibilidad a cáncer. OBJETIVOS CONCRETOS 71 Capítulo I CAPÍTULO II Objetivos Los células de los pacientes con defectos genéticos en el receptor 1 del IFN-γ se caracterizan por presentan un daño en la señalización mediada por IFN-γ. Dependiendo de la gravedad con la que esta señalización esté afectada, dará lugar a las diferentes formas de enfermedad, que pueden asociarse a presentaciones clínicas y pronósticos diferentes. La deficiencia autosómica recesiva completa de IFN-γR1 (RC-IFN-γR1) es el resultado de mutaciones que suprimen la respuesta a IFN-γ. Las células de estos pacientes producen moléculas de IFN-γR1 que son incapaces de unir IFN-γ, resultando en una pérdida completa de respuesta a IFN-γ. La deficiencia de tipo autosómica dominante parcial de IFN-γR1 (DP-IFN-γR1), resulta de mutaciones en heterocigosis en el segmento citoplasmático de IFNGR1, que da lugar a un incremento de moléculas truncadas que se acumulan en la superficie celular. Estas moléculas se unen a IFN-γ pero no transducen las señales, ejerciendo un efecto dominante negativo. En el momento de realizar los estudios a nuestros pacientes sólo se había descrito la deficiencia autosómica recesiva parcial (RP) de IFN-γR1 en dos pacientes de una familia homocigotos para la mutación p.I87T, los cuales parecían presentar un fenotipo clínico menos grave que el de las formas RC-IFN-γR1. Se pretende diagnosticar y describir las características inmunológicas de una serie de 14 pacientes, 5 de ellos de la isla de Gran Canaria, procedentes de 11 familias no relacionadas y diferentes países, que sufrieron de enfermedad causada por BCG, enfermedad causada por micobacterias ambientales no tuberculosas, tuberculosis, salmonelosis y/o toxoplasmosis. Los datos iniciales de expresión de IFN-γR1 en estos pacientes sugerían que se pudiera tratar de un defecto de expresión de IFN-γR1. Los objetivos son: 1. Analizar la producción de IFN-γ, así como la respuesta a IL-12 y a IFN-γ en células procedentes de los pacientes. 2. Analizar el fenotipo funcional en las células de estos pacientes mediante técnicas que combinan cultivos celulares y estudios funcionales mediante citometría de flujo (FCM -flow cytometry-): - Analizar la expresión del IFN-γR1 con diferentes anticuerpos monoclonales (mAb) en monocitos de sangre periférica y los linfocitos B transformados con el OBJETIVOS CONCRETOS 73 Capítulo II virus de Epstein-Barr (EBV-B) de pacientes con sospecha de deficiencia de IFNγR1. - Evaluar la funcionalidad de las mutaciones encontradas, mediante el desarrollo de diversas técnicas: •Un nuevo ensayo fluorescente de unión a IFN-γ en monocitos de sangre periférica de los pacientes con sospecha de deficiencia de IFN-γR1. •Analizar los eventos celulares tempranos en respuesta a IFN-γ, como la fosforilación de STAT-1, en los monocitos de los pacientes. •Analizar los eventos celulares tardíos en respuesta a IFN-γ, como la producción de citocinas y quimiocinas en cultivos in vitro y la inducción de CD64, en monocitos de los pacientes. 3. Determinar la base genética de la deficiencia en estos pacientes mediante secuenciación del ADN genómico. 4. Analizar la translocación de STAT-1 al núcleo y su unión al ADN en células EBV-B de los pacientes mediante ensayo ELISA y compararla con las de células de pacientes con defecto recesivo completo o dominante parcial de IFN-γR1. 5. Analizar un posible efecto fundador responsable de esta inmunodeficiencia en los pacientes canarios. 6. Estudiar la presentación clínica de estos pacientes mediante revisión del historial clínico. 7. Estudiar la incidencia de inmunodeficiencias primarias englobadas dentro de las MSMD en pacientes pediátricos con infección diseminada por micobacterias no tuberculosas sin factores de riesgo conocidos de la isla de Gran Canaria (838.397 habitantes en 2009) entre los años 1997-2009. CAPÍTULO II 74 Partial recessive IFN-gR1 deficiency: genetic, immunological and clinical features of 14 patients from 11 kindreds Ithaisa Sologuren1, { , Ste ´phanie Boisson-Dupuis4,5, { , Jose Pestano6, { , Quentin Benoit Vincent4, { , Leandro Ferna ´ndez-Pe ´rez7, { , Ariane Chapgier4, Marı ´aCa ´rdenes1,9, Jacqueline Feinberg4, M. Isabel Garcı ´a-Laorden1, Capucine Picard4,10, Esther Santiago1, Xiaofei Kong5, Lucile Jannie `re4, Elena Colino12, Estefanı ´a Herrera-Ramos1, Adela France ´s13, Carmen Navarrete16, Ste ´phane Blanche11, Emilia Faria17, PawełRemiszewski19, Ana Cordeiro18, Alexandra Freeman20, Steven Holland20, Katia Abarca21,Mo ´nica Valero ´n-Lemaur14, Jose ´Gonc¸alo-Marques22, Luisa Silveira23, Jose ´Manuel Garcı ´a-Castellano2,15, Jose ´Caminero3, Jose ´Luis Pe ´rez-Arellano8,13, Jacinta Bustamante4, Laurent Abel4, Jean-Laurent Casanova4,5,11, } and Carlos Rodrı ´guez-Gallego1,8,9,∗, } 1 Department of Immunology, 2 Laboratory of Molecular Oncology, Research Unit and 3 Department of Respiratory Diseases, Gran Canaria Dr Negrı ´n University Hospital, Las Palmas de Gran Canaria, Spain, 4 Laboratory of Human Genetics of Infectious Diseases, Necker Faculty, INSERM U980, Necker Medical School, University Paris Descartes, Paris, France, 5 St Giles Laboratory of Human Genetics of Infectious Diseases, Rockefeller Branch, The Rockefeller University, New York, NY, USA, 6 Department of Biochemistry, Molecular Biology, Physiology, Genetics and Immunology, 7 Department of Clinical Sciences-Pharmacology Unit, Molecular and Translational Endocrinology Group and 8 Department of Medical and Surgical Sciences, School of Medicine, University of Las Palmas de Gran Canaria, Las Palmas de Gran Canaria, Spain, 9 Canarian Institute for Cancer Research, La Laguna, Santa Cruz de Tenerife, Spain, 10 Study Center of Primary Immunodeficiencies and 11 Pediatric Immunology and Hematology Unit, Assistance Publique Ho ˆpitaux de Paris, Necker Hospital, Paris, France, 12 Department of Pediatrics, Unit of Infectious Diseases, 13 Department of Infectious Diseases, 14 Pediatric Intensive Care Unit and 15 Department of Orthopedic Surgery, Insular-Materno Infantil Hospital, Las Palmas de Gran Canaria, Spain, 16 Department of Immunology, Hospital de Nin ˜os Roberto del Rı ´o, Santiago de Chile, Chile, 17 Primary Immunodeficiency Consultation and 18 Department of Medicine, Coimbra Pediatric Hospital, Coimbra, Portugal, 19 IIIrd Department of Lung Diseases, National Tuberculosis and Chest Diseases Research Institute, Warsaw, Poland, 20 Laboratory of Clinical Infectious Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA, 21 Department of Pediatrics, School of Medicine, Pontificia Universidad Cato ´lica de Chile, Santiago de Chile, Chile, 22 Department of Pediatric Infectious Diseases, Santa Maria-Centro Hospitalar Lisboa Norte Hospital, Lisbon, Portugal and 23 Department of Pediatrics, Santo Espirito de Angra do Heroı ´smo EPE Hospital, Angra do Heroı `smo, Portugal Received November 9, 2010; Revised and Accepted January 19, 2011 We report a series of 14 patients from 11 kindreds with recessive partial (RP)-interferon (IFN)-gR1 deficiency. The I87T mutation was found in nine homozygous patients from Chile, Portugal and Poland, and the V63G mutation † The authors wish it to be known that, in their opinion, the first two authors should be regarded as joint First Authors. ‡ The authors wish it to be known that, in their opinion, these authors should be regarded as joint Second Authors. } These two authors should be regarded as Senior Authors. ∗ To whom correspondence should be addressed at: Servicio de Inmunologı´a, Hospital Universitario de Gran Canaria Dr Negrı´n, Barranco de la Ballena s/n, 35010 Las Palmas de Gran Canaria, Spain. Tel: +34 928449511; Fax: +34 928449293; Email: [email protected] #The Author 2011. Published by Oxford University Press. All rights reserved. For Permissions, please email: [email protected] Human Molecular Genetics, 2011, Vol. 20, No. 8 1509–1523 doi:10.1093/hmg/ddr029 Advance Access published on January 25, 2011 at ULPGC. Biblioteca Universitaria on October 9, 2011hmg.oxfordjournals.orgDownloaded from was found in five homozygous patients from the CanaryIslands. Founder effects accountedfor the recurrence of both mutations. The most recent common ancestors of the patients with the I87T and V63G mutations probably lived 1600 (875–2950) and 500 (200–1275) years ago, respectively. The two alleles confer phenotypes that are similar but differ in terms of IFN-gR1 levels and residual response to IFN-g. The patients suffered from bacillus Calmette-Gue ´rin-osis (n56), environmental mycobacteriosis (n56) or tuberculosis (n51). One patient did not suffer from mycobacterial infections but had disseminated salmonellosis, which was also present in two other patients. Age at onset of the first environmental mycobacterial disease differed widely between patients, with a mean value of 11.25 +++++ 9.13 years. Thirteen patients survived until the age of 14.82+++++ 11.2 years, and one patient died at the age of 7 years, 9 days after the diagnosis of long-term Mycobacterium avium infection and the initiation of antimycobacterial treatment. Up to 10 patients are currently free of infection with no prophylaxis. The clinical heterogeneity of the 14 patients was not clearly related to either IFNGR1 genotype or the resulting cellular phenotype. RP-IFN-gR1 deficiency is, thus, more common than initially thought and should be considered in both children and adults with mild or severe mycobacterial diseases. INTRODUCTION Mendelian susceptibility to mycobacterial disease (MSMD) is a rare primary immunodeficiency (1,2). Patients with MSMD present an apparently selective and inherited predisposition to mycobacterial diseases, suffering from severe clinical disease caused by weakly virulent mycobacterial species, such as bacillus Calmette-Gue´rin (BCG) vaccines and nontuberculous, environmental mycobacteria (EM) (2–4). The patients are also susceptible to Mycobacterium tuberculosis (4,5). Other infections are rare, with the exception of extraintestinal salmonellosis, which has been documented in less than half the patients (2–4,6). In the last 13 years, MSMD-causing germline mutations in five autosomal (IFNGR1,IFNGR2,STAT1,IL12B,IL12RB1) and one X-linked gene (NEMO) have been reported (2–4). Most of the affected gene products are immunologically related, as they are involved in IL-12-dependent and interferon (IFN)-g-mediated immunity. Disorders of IL12B,IL12RB1 and NEMO result in impairment of the secretion of IL-12-dependent IFN-gand IL-23-dependent IL-17 (2–4,7). Disorders of IFNGR1,IFNGR2 and STAT1 impair cellular responses to IFN-g(2–4). The high level of allelic heterogeneity accounts for the definition of up to 13 different genetic disorders causing MSMD (2–4). Two related disorders, complete and partial recessive forms of signal transducer and activator of transcription 1 (STAT-1) deficiency, also impair IFN-a/band IFN-lresponses, thus conferring a broader susceptibility to mycobacteria and viruses (8–10). Other mutations in NEMO are also associated with a broader infectious phenotype (11). The first genetic etiology of MSMD was described in 1996, with null mutations in IFNGR1 (12,13). Three other molecular forms of IFN-gR1 deficiency have since been described (2–4). Autosomal recessive complete IFN-gR1 (RC-IFN-gR1) deficiency is the result of mutations abolishing the response to IFN-g(4,14). Most patients present null mutations, due to the presence of stop codons upstream from the exon encoding the transmembrane domain, preventing the production of IFN-gR1 (12,15–18). In-frame deletions and missense mutations in the segment encoding the extracellular domain of IFN-gR1 have been reported in four patients with RC-IFN-gR1 deficiency. The cells of these patients produced IFN-gR1 molecules that were unable to bind IFN-g, resulting in a complete loss of responsiveness to IFN-g(18). One patient with a mutation in the initiation codon of the IFNGR1 gene and residual IFN-gsignaling due to weak IFN-gR1 expression presented an immunological and clinical form of the disease almost as severe as that of patients with RC-IFN-gR1 deficiency (19). The most common form of IFN-gR1 deficiency, the dominant partial (DP) type (54 patients from 35 kindreds), results from heterozygous mutations in the cytoplasmic segment of IFNGR1, giving rise to truncated molecules that accumulate at the cell surface (4). These molecules bind IFN-gbut cannot transduce signals; they therefore have a dominant-negative effect (4,14). RC-IFN-gR1 deficiency confers a predisposition to severe and often fatal mycobacterial infection, mostly at an early age, whereas autosomal dominant partial IFN-gR1 (DP-IFN-gR1) deficiency is less severe, several patients with this deficiency having reached or having been diagnosed in adulthood (14). Not all patients with IFN-gR1 deficiency present with these forms. In particular, the I87T mutation was shown 10 years ago to lead to an autosomal recessive form of partial (RP)-IFN-gR1 deficiency in two patients from a Portuguese kindred (20). The cells of these patients expressed the receptor at the cell surface, and displayed weak, but not completely abolished IFN-g-mediated signaling. The mechanism by which the I87T mutation exerts its deleterious effect remained unclear. This disorder was thought to be restricted to this single family, until recently, when a patient from Poland was reported to be homozygous for the same mutation (21). We report here six new patients homozygous for the I87T mutation, from five unrelated families of Portuguese and Chilean descent. We also report four unrelated Spanish kindreds with five patients homozygous for the V63G mutation. We demonstrate that homozygosity for the V63G allele, previously identified as potentially responsible for the RC-IFN-gR1 deficiency in another kindred (22), actually confers a RP form of defect. We show that both the V63G and I87T mutations result from a founder effect and provide age estimates for the most recent common ancestor (MRCA) of each mutation. Finally, we compare the immunological data and clinical features of the 14 patients with 1510 Human Molecular Genetics, 2011, Vol. 20, No. 8 at ULPGC. Biblioteca Universitaria on October 9, 2011hmg.oxfordjournals.orgDownloaded from RP-IFN-gR1 deficiency with those from patients with RC and DP-IFN-gR1 deficiencies. RESULTS IFNGR1 genotype and familial segregation We investigated 14 patients with mycobacterial disease from 11 unrelated families (Table 1; Fig. 1). The sequencing of two different polymerase chain reaction (PCR) products generated from the coding regions of the IFNGR1 mRNA revealed that patients I.1, I.2, II.1, III.1 and IV.1 were homozygous for a T "G nucleotide substitution at position 188 (exon 2), leading to the conservative replacement of a valine residue by a glycine residue at position 63 (V63G) in the extracellular domain of the IFN-gR1 molecule. Homozygosity for the mutation was confirmed by genome analysis. The parents of the five patients, one brother of patients I.1 and I.2, one brother of patient III.1 and one brother of patient IV.1 were heterozygous for the V63G allele and the wild-type allele and are all healthy. The V63G mutation was not found in 128 unrelated healthy individuals from the population of Gran Canaria. The V63G mutation is, therefore, not an irrelevant polymorphism. It segregates with the clinical phenotype as an autosomal recessive trait. Direct sequencing of IFNGR1 exons and flanking intron regions showed that patients V.1, VI.1, VII.1, VIII.1, IX.1 and IX.2 were homozygous for a nucleotide substitution at position 260 (T"C, exon 3), leading to the non-conservative replacement of an isoleucine residue by a threonine residue at position 87 (I87T). The I87T mutation causes a recessive hypomorphic lesion in IFNGR1 previously identified in only three known patients with RP-IFN-gR1 deficiency (patients X.1, X.2 and XI.1 in this study) (20,21). Residues 63 and 87 are highly conserved in mammals, being identical in 14 of the 18 species considered. Any changes observed are always conservative, with these residues being replaced by another branched-chain amino acid (V, L or I) in all but one case (Fig. 1). Founder effect analysis An analysis of the SNP Array 6.0 data showed that patients carrying the I87T mutation had a common homozygous haplotype around IFNGR1, encompassing 2.8 Mb (corresponding to 968 SNPs) for patients VI.1 and X.1 (Fig. 2). A similar pattern was observed for the V63G mutant, with a longest shared haplotype of 4.7 Mb (corresponding to 1540 SNPs) for the three patients analyzed (Fig. 2). The ESTIAGE method estimated the age of the MRCA at 20 generations [95% CI (8–51)] for the V63G mutation and 64 generations [95% CI (35–118)] for the I87T mutation. Assuming a generation time of 25 years, the MRCA of the patients with the V63G and I87T mutations lived 500 (200–1275) and 1600 (875–2950) years ago, respectively. Unlike the patients with the V63G mutation, all of whom came from Gran Canaria and had homozygous haplotypes of similar lengths around IFNGR1, the patients with the I87T mutation came from different countries and had shared haplotypes of different lengths. An analysis of these haplotypes by subgroup for the patients with the I87T mutation showed that the most closely related patients were the two Portuguese patients, with a MRCA estimated to have lived 475 (150–1725) years ago. The next most closely related patients were the two Chileans, who were estimated to have a MRCA with the two mainland Portuguese patients 1000 (475–2175) years ago, followed by the patient from the Azores, with a MRCA 1300 (675–2600) years ago, and finally the Polish patient, who was the most distantly related (age of MRCA estimated at 1600 years when considering all the patients as mentioned above). Studies based on autosomal markers in the current population of Gran Canaria highlight a major European influence, mostly from the Iberian peninsula (23). However, due to a strong sexually asymmetric bias favoring mating between European men and indigenous women of north-west African Berber origin, there is an autochthonous contribution, mostly from maternal lineages (24,25). We tried to determine the most probable origin of the families carrying the V63G mutation, by analyzing haplotype variation for the uniparentally inherited Y chromosome and mitochondrial DNA (mtDNA) (Supplementary Material, Tables S1 and S2). MtDNAs from the patients and their parents belonged to haplogroups of probable pre-Hispanic origin, although haplogroups H (patients I.1, I.2 and their mother) and J (patients II.1 and III.1 and their mothers, and the father of patient IV.1—no samples from patient IV.1 were available) are also observed in Europeans. Similarly, we cannot rule out the possibility of a sub-Saharan origin, through the slave trade, for haplogroups L1b (mother and brother of patient IV.1) and L3e4 (father of patients I.1 and I.2). The Y chromosomes of the male patients and their fathers were mostly of European origin. In contrast, haplogroup E1b1b, of possible pre-Hispanic origin, was found in the father of patient IV.1 (haplogroup J for mtDNA). However, as haplogroup E1b1b is present at low frequency on the Iberian Peninsula, we cannot rule out the possibility of inheritance from Iberian colonizers. IFN-gR1 expression and IFN-gbinding Monocytes from patients bearing the I87T allele have been shown to express IFN-gR1 molecules on their surface (20). We found that monocytes from patients bearing the V63G allele showed only weak specific fluorescence with four anti-IFN-gR1 mouse monoclonal antibodies (mAbs) (GIR94, GIR208, BB1E2 and 92101), whereas fluorescence was normal or nearly normal with the fifth mAb (MMHGR-1) (Fig. 3). We then compared IFN-gR1 levels on Epstein Barr virus-transformed B (EBV-B) cells from patients homozygous for the V63G and I87T mutations (Fig. 4). EBV-B cells from V63G homozygous patients were stained slightly less strongly with the five mAbs than most I87T homozygous EBV-B cells, but these differences were not statistically significant. However, staining was variable in cells from patients with the same mutation and in healthy controls, particularly for the MMHGR1 mAb (Supplementary Material, Table S3). No IFN-gR1 expression was observed with any of the five mAbs in EBV-B cells from a patient with RC-IFN-gR1 deficiency, suggesting that IFN-gR1 labeling was specific. Human Molecular Genetics, 2011, Vol. 20, No. 8 1511 at ULPGC. Biblioteca Universitaria on October 9, 2011hmg.oxfordjournals.orgDownloaded from Table 1. Infections and organisms isolated from the IFN-gR1 deficient patients Patient I.1 (Spain) Patient I.2 (Spain) Patient II.1 (Spain) Age Episode Age Episode Age Episode 5 days Urinary infection and omphalitis 2 years Varicella 1 month Bronchiolitis; respiratory syncytial virus Klebsiella pneumoniae 5 years 6 months Varicella; unremarkable course 3 years Gastroenteritis. Shigella sonnei 4 months– 37 months Acute respiratory failure (8×) Gastroenteritis. Cryptosporidium spp. a 5 years 9 monts Aseptic meningitis b 4 years Pneumonia, controlled with amoxicillin b 47 months Haemophilus influenzae (1×) 16 years Mediastinal conglomerate; pericardiectomy 6 years Laterocervical lymphadenopathies b 4 years 1 months Erythema nodosum (6×). Anti-A60, lymphadenopathies. Mantoux-positiveLasted 1–2 years. Surgical excision 16 years 6 months Osteomyelitis, retroperitoneal lymphadenopathies. Acid-fast bacilli c 21 years Prophylactic isoniazid for 6 months 5 years Mycobacterium abscessus 22 years Osteomyelitis. Acid-fast bacilli c 10 years 2 months Erythema nodosum (4×). Anti-A60, lymphadenopathies, diarrhea b 27 years Healthy. No prophylaxis 31 years Healthy. No prophylaxis 12 years 6 months Septic shock. Salmonella enteritidis 14 years Healthy. No prophylaxis Patient III.1 (Spain) Patient IV.1 (Spain) Patient V.1 (Chile) Age Episode Age Episode Age Episode 22 months Pain in the left ankle 23 months Diagnosed with juvenile chronic arthritis 1 day BCG vaccination 33 months Multifocal osteomyelitis, Mycobacterium avium 41 months Lumbar pain 4 months Axilary adenopathy 6 years 11 months, 7 years 1 month Lumbar pain. Arthrodesis. Suspicion of Langerhans cell histiocytosis Osteomyelitis. Mycobacterium avium 11 months Hepatosplenomegaly. BCGosis 71 2years Molluscum contagiosum 6 years 3 months Healthy. No prophylaxis 7 years 2 months Septic shock, multiorgan dysfunction syndrome. Exitus 8 years 6 months Healthy. No prophylaxis Patient VI.1 (Portugal) Patient VII.1 (Chile) Patient VIII.1 (Chile) Age Episode Age Episode Age Episode 2 days BCG vaccination 2 days BCG vaccination 2 days BCG vaccination 14 weeks Adenopathy. Hepatomegaly. BCGosis 7 months Axillary lymphadenitis. Osteomyelitis, Cerebral infection. BCGosis 5 months BCGitis, multifocal osteomyelitis 5 years On anti-mycobacterial therapy 5 years 6 months On anti-mycobacterial therapy plus IFN-g26 months On anti-mycobacterial therapy plus IFN-g Patient IX.1 (Portugal-Azores) Patient IX.2 (Portugal—Azores) Patient X.1 (Portugal) Age Episode Age Episode Age Episode 2 days BCG vaccination 2 months Disseminated Salmonella spp. 1 month BCG vaccination. BCGosis 2 months BCGitis 6 years Disseminated Salmonella enteritidis 7 years Pneumonia, controlled with ampicillin b 12 years Pneumonitis (2×): Legionella spp. and Mycoplasma pneumoniae 8 years 3 months Encephalitis. Toxoplasma gondii 3 years 8 months Healthy. No prophylaxis 28 years Healthy. No prophylaxis 8 years 11 months On anti-toxoplasma therapy Patient X.2 (Portugal) Patient XI.1 (Poland) Age Episode Age Episode 3 years Clinical tuberculosis b 1 month BCG vaccination. No complications 6 years Pneumonitis. Mycoplasma pneumoniae 20 years Osteomyelitis. Suspicion of Langerhans cell histiocytosis (steroids and cyclosporine A). Diabetes 21 years Osteomyelitis. Brain and lung infiltration. Mycobaterium avium 22 years Healthy. No prophylaxis 29 years No infections without prophylaxis. Anti-A60, IgG antibodies against mycobacterial antigen 60; BCG, Bacillus Calmette-Gue´rin. a Unlike patients with other primary immunodeficiencies and IFNg -deficient mice (52–55), the patient spontaneously recovered from the disease without specific drug treatment and no recurrences were observed. b Unidentified microorganism. c Histological examination (Ziehl-Neelsen staining). 1512 Human Molecular Genetics, 2011, Vol. 20, No. 8 at ULPGC. Biblioteca Universitaria on October 9, 2011hmg.oxfordjournals.orgDownloaded from We investigated the functional relevance of the V63G mutation, by first analyzing the binding of IFN-gto the surface-expressed V63G IFN-gR1 molecules in a novel fluorescent IFN-g-binding assay (Fig. 5). Monocytes from patients I.1, I.2 and III.1 displayed lower levels of specific binding of IFN-gat low concentrations of the cytokine (1 IU IFN-g/ml) than control cells: mean fluorescence intensity (MFI) was 12.3 +9.7 in cells from the patients versus 114.9 +45.7 in cells from the controls (P¼0.019; the values given are MFI after incubation with rhIFN-gminus MFI after incubation with medium alone +standard deviation). However, these differences were less marked at medium (10 3 IU IFN-g/ml; MFI 55.1 +24.7 for the patients’ cells versus 144.5 +60.2 for the control cells; P¼0.076) and high IFN-gconcentrations (10 5 IU IFN-g/ml; MFI 110.7 +47.1 for the patients’ cells versus 190.5 +135.9 for the control cells; P¼0.39). EBV-B cell lines homozygous for I87T have been shown to be capable of signal transduction at medium and high IFN-g concentrations, consistent with an ability to bind IFN-g(20). Thus, these results suggest that patients homozygous for either the I87T or the V63G IFNGR1 allele displayed IFN-gR1 deficiency with the detectable expression of IFN-gR1 molecules on the surface of their cells. The deficiency observed thus resulted from the presence of too few receptors on the surface of the cell, low levels of IFN-g binding to the receptors present or both. Consistent with the expression of abnormal IFN-gR1 molecules, plasma IFN-gconcentrations were high in our patients (51 pg/ml in I.1, 70 pg/ml in I.2, 51 pg/ml in II.1, 129 pg/ml in III.1, 40 pg/ml in V.1, 915 pg/ml in VI.1, 222 pg/ml in VII.1, 89 pg/ml in IX.1, 55 pg/ml in IX.2 and 48 pg/ml in XI.1), whereas no IFN-gwas detected in the plasma of healthy individuals. Analysis of a plasma sample from patient III.1 7 months after diagnosis showed plasma IFN-gconcentration to be 76 pg/ml. However, plasma IFN-gconcentration was excessively high in patient IV.1, in the 3 days preceding his death (post-mortem analysis): 15253, 25972 and 17360 pg/ ml 1, 2 and 3 days before death, respectively. Tumor necrosis factor-a(TNF-a), IL-1band IL-2 were undetectable or present at very low concentrations in the plasma of this patient, but high levels of IL-6 (846 pg/ml), IL-8 (927 pg/ ml) and IL-10 (108.4 pg/ml) were also detected. The very high concentrations of IFN-gobserved in two patients (VI.1 and VII.1) probably reflect the fact that the plasma samples from these patients were obtained during the course of mycobacterial disease. Patient IV.1 was the only other patient from whom plasma samples were collected during mycobacterial disease. The IFN-glevels observed in patient IV.1 may reflect a high mycobacterial burden due to late diagnosis of the infection. No differences in serum IFN-gconcentrations were observed between patients bearing the V63G and the I87T alleles, when patient IV.1 was excluded from the comparison. These results contrast with the very high plasma IFN-gconcentrations observed in patients with RC-IFN-gR1 deficiency (249 +101 pg/ml). This cytokine was undetectable in the plasma of patients with the DP-IFN-gR1 deficiency and in healthy individuals (26). We previously showed that these high IFN-gconcentrations result from high levels of IFN-g production and/or impaired clearance of this cytokine in the mouse model (27). Our results reflect the impairment, but not the abolition, of IFN-gbinding and clearance from the blood in patients with RP-IFN-gR1 deficiency. Plasma IFN-gconcentration appears to be a good indicator of the Figure 1. Missense mutations in the gene encoding the IFN-gR1 chain identified in the patients and their relatives. (A) Pedigrees of the 11 unrelated families of the IFN-gR1-deficient patients. The patients are indicated by a black square or circle. The IFNGR1 genotypes (V63G and I87T: the V63G and I87T mutants, respectively; wt, wild-type; E?, unknown) of all family members are indicated. Roman numerals indicate the kindred and Arabic numerals indicate the patients in each kindred. The index patients are indicated by an arrow. (B) Alignment of the extracellular portion of the human IFN-gR1 molecule containing residues 63 and 87 and the corresponding regions in 17 other species. The mutated residues are indicated in gray and by a thick arrow. Residues 61 and 77, found to be mutated (C77Y, C77F, V61Q) in patients with RC-IFN-gR1 deficiency, are indicated by a thin arrow. The alignment was edited manually with Bioedit software (51). Human Molecular Genetics, 2011, Vol. 20, No. 8 1513 at ULPGC. Biblioteca Universitaria on October 9, 2011hmg.oxfordjournals.orgDownloaded from Sequencing of the IFNGR1 gene RNA was isolated from phytohemagglutinin-activated T-cell blasts grown in suspension, with the RNAeasy Mini Kit (Qiagen), used according to the manufacturer’s instructions. Reverse transcriptase (RT)–PCR was performed with the First Strand complementary DNA (cDNA) Synthesis Kit for RT– PCR (Roche). The resulting cDNA was amplified with specific oligonucleotides, as previously reported (22). The PCR products were subjected to agarose gel electrophoresis, excised from the gel and purified with the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). The purified amplification products were sequenced by dideoxynucleotide termination with BigDye terminator kit v3.0 and the PCR primers (Applied Biosystems), in an ABI Prism 3100 apparatus (Applied Biosystems). Primers and conditions are available upon request. Genomic DNA was isolated from whole blood, according to a standard phenol-chloroform procedure, and the IFNGR1 exons and flanking introns were amplified and sequenced, as reported elsewhere (18,20). Screening for the V63G mutation in the population of Gran Canaria was carried out by PCR amplification for refractory mutations. Primers and conditions are available upon request. Founder effect analysis Founder effect analyses were carried out in a subset of 6 [two Chilean, two Portuguese from mainland Portugal and one Azorean (Portuguese nationality), one Polish] apparently unrelated patients with the I87T mutation and three apparently unrelated patients from Gran Canaria with the V63G mutation. Genotypes were obtained for .900 000 SNPs from the Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0. SNPs with 100% call rates were scanned for continuous stretches of homozygosity upand downstream from the IFNGR1 locus on chromosome 6. Pairwise comparisons within each mutation group revealed the limits of the longest shared haplotype and the positions of subsequent recombination breakpoints. The likelihood-based ESTIAGE method (33) was used to estimate the age of the MRCA for each mutation, from the observed shared haplotypes and the recombination rates and haplotype frequencies obtained in the HapMap Project (43). Analyses of Y chromosome and mtDNA haplotypes Hypervariable sequences I and II of mtDNA were sequenced with the primer pairs and PCR conditions used in a previous study (24,44). Sequences were sorted into haplogroups according to the most recent classification (45). For the analysis of Y chromosome haplotypes, we amplified 16 Y-chromosomal short tandem repeat (STR) loci with the Applied Biosystems Y-filerTM PCR Amplification kit (www.appliedbiosystems.com). STR alleles were named according to current recommendations (46–48). IFN-gR1 detection with antibodies Non-specific binding to monocytes was minimized by the prior incubation of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)- treated whole blood samples with purified mouse IgG1, IgG2a and IgG2b isotype controls (BD Biosciences). After 15 min of incubation, the samples were washed twice and stained with phycoerythrin (PE)-labeled mAbs specific for human IFN-gR1 92101 (R&D Systems), GIR-94 (BD Biosciences), GIR-208 (BD Biosciences) and MMHGR-1 (Caltag Laboratories), the human IFN-gR1-specific fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled mAb BB1E2 (Cytognos) or isotype-matched negative controls (BD Biosciences). Erythrocytes were lysed with Lysing Solution (BD Biosciences), and washed twice. White blood cells were then resuspended in phosphate-buffered saline (PBS) and analyzed by flow cytometry. Monocytes were gated on the basis of forward/side light scattering and positive staining with an allophycocyanin (APC)-labeled mAb directed against human CD14 (BD Biosciences). EBV-B cells were stained by incubation with purified mouse IgG1, IgG2a and IgG2b isotype controls, followed by washing and incubation with PE-labeled 92101, GIR-94 and GIR-208 mAbs, FITC-labeled BB1E2 mAb or isotypematched negative controls. Purified MMHGR-1 (Biomedical Laboratories) or an isotype-matched negative control was also used for the staining of EBV-B cells. After incubation with these antibodies, cells were washed twice and incubated with biotinylated goat anti-mouse antibody (Caltag Laboratories) and streptavidin-PE (Caltag Laboratories). EBV-B cells and gated monocytes were analyzed on a FACSCalibur flow cytometer, with CellQuest Pro software (BD Biosciences). IFN-gbinding assay PBMCs were obtained from EDTA-treated whole blood by the standard density gradient centrifugation procedure, in Ficoll Hypaque. PBMCs were prepared at a density of 5 × 10 6 cells/ml in RPMI 1640 (Bio-Whittaker) and 200 mlof cell suspension was cultured with medium alone or with variable concentrations of recombinant human IFN-g(rhIFN-g, R&D Systems) for 20 min at 48C. The samples were washed once with 0.1% sodium azide in PBS, and 0.5 mg/ml purified mouse anti-human IFN-gmonoclonal antibody (clone 4S.B3; BD Biosciences) or an isotypic control (purified mouse IgG1, BD Biosciences) was added and incubated with the samples for 30 min at 48C. Samples were washed twice in calciumand magnesium-free PBS (Euroclone), and incubated with goat anti-mouse IgG1 biotin conjugate (Caltag Laboratories) for 30 min at 48C. Finally, samples were washed twice with calciumand magnesium-free PBS and incubated for 30 min with APC-conjugated anti-human CD14-antibody and PE-conjugated streptavidin. The samples were analyzed with a FACSCalibur cytometer and CellQuest Pro software. Phosphorylation of STAT-1 in monocytes in response to IFN-g PBMCs were obtained from EDTA-treated whole blood by density gradient centrifugation. STAT-1 phosphorylation was assessed as previously described (49). As a positive control, cells were incubated with high concentrations of IFN-a. Intracellular labeling was carried out with an Alexa Fluor 488-labeled anti-human STAT-1-pY701 (BD Biosciences) mAb or with the relevant isotypic control. STAT-1 phosphorylation at STAT-1-pY701 was assessed on monocytes 1520 Human Molecular Genetics, 2011, Vol. 20, No. 8 at ULPGC. Biblioteca Universitaria on October 9, 2011hmg.oxfordjournals.orgDownloaded from gated on the basis of forward/side light scattering and positive staining with an APC-conjugated antibody against CD14 in a FACSCalibur flow cytometer, with CellQuest Pro software. Antibody binding to monocytes is expressed as MFI. Nuclear translocation of STAT-1 EBV-B cells were stimulated for 30 min with 10 3 and 10 5 IU rhIFN-g/ml or with 10 5 IU IFN-a/ml. We quantified the translocation of STAT-1 homodimers to the nucleus and their binding to DNA with the TransAM STAT family kit (Active Motif Europe), used according to the manufacturer’s protocol. Briefly, nuclear extracts from rhIFN-g-stimulated EBV-B cell lines were incubated in the wells of ELISA plates coated with oligonucleotides containing a STAT consensus binding site. The wells were then washed and incubated with anti-STAT-1a antibodies specific for an epitope present only on DNA-bound-activated STAT-1, washed again and incubated with a horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody. The plates were washed again, a developing solution was added and absorbance was measured at 450 nm. Late responses to IFN-gin blood cells Late events in IFN-g-mediated stimulation were studied in heparin-treated whole-blood cultures. We analyzed the production of IL-12p40 in response to IFN-g, by incubating whole blood with BCG, with or without rhIFN-g, as previously described (50). For analysis of the induction of CD64 expression in response to IFN-g, whole blood was diluted 1:4 in RPMI 1640 and incubated with medium alone or with various concentrations of rhIFN-gfor 24 h at 378C and under an atmosphere containing 5% CO 2 . The erythrocytes were lysed and the cell surface expression of CD64 on blood monocytes was assessed with an FITC-labeled anti-human CD64 mAb (BD Biosciences), by flow cytometry with CellQuest Pro software. Monocytes were gated on the basis of forward/side light scattering and positive staining for CD14 with an APC-CD14 mAb. The production of IL-12p70 and TNF-ain response to rhIFN-gwas assessed in whole blood cultures diluted 1:2 in RPMI 1640 and left unstimulated or stimulated with 100 ng/ ml LPS from S. enteritidis (Sigma), alone or in combination with various concentrations (10 2 –10 5 IU/ml) of rhIFN-g. Supernatants were collected after 24 h of incubation at 378C under an atmosphere containing 5% CO 2 . The production of (IP-10, CXCL10) and (MIG, CXCL9) was assessed in whole blood diluted 1:2 with RPMI 1640 and incubated with medium alone or with various concentrations (1–5 ×10 5 IU/ ml) of rhIFN-gat 378C, under an atmosphere containing 5% CO 2 . Supernatants were collected after 24 h. Determination of cytokine levels Levels of IL-12p40 in cultures and of IFN-gin plasma were determined by ELISA, as previously reported (26,50). The levels of TNF-a, IL-12p70, IP-10 and MIG in cultures were determined with a flow cytometry-based bead array system (BD Biosciences), according to the manufacturer’s protocols. AUTHORS’ CONTRIBUTIONS I.S., S.B.-D., J.P., A.C., L.F.-P., Q.B.V., M.C., J.F., M.I.G.-L., J.B., C.P., E.S., X.K., L.J., E.H.-R., L.A. and C.R.-G. performed research and analyzed and interpreted data. E.C., A.F., C.N., S.B., E.F., P.R., A.C., A.F., S.H., K.A., M.V.-L., J.G.-M., L.S., J.M.G.-C., J.C. and J.L.P.-A. were responsible for the clinical evaluation of the patients and also collected data. J.-L.C. and C.R.-G. designed the research, analyzed and interpreted data and wrote the manuscript. SUPPLEMENTARY MATERIAL Supplementary Material is available at HMG online. ACKNOWLEDGEMENTS We would like to thank the patients and their families for their trust. We are highly indebted to Lluis Quintana-Murci for help with founder effect analysis, and to Yanira Florido and Ayoze Garcı´a-Saavedra for technical assistance. Conflict of Interest statement. None declared. FUNDING This work was supported by grants from the Institute of Health Carlos III, Ministry of Health (RedRespira-ISCiii-RTIC-03/ 11, FIS 06/1031, with the funding of European Regional Development Fund-European Social Fund—FEDER-FSE); Fundacio ´n Canaria de Investigacio ´n y Salud (Canarian Government, INREDCAN 05/06); Research Prize of Foundation Caja Rural de Canarias-Chil y Naranjo 2004; Canarian Institute for Cancer Research (ISCiii-RTICCC-C03/10 to M.C.); Proyecto Biorregion 2006 to M.I.G.-L.; and Universidad de Las Palmas de Gran Canaria (fellowship to E.H.-R.). J.-L.C. was an International Scholar of the Howard Hughes Medical Institute. The sponsors of the study had no role in designing the study, collecting, analyzing and interpreting the data, or writing the paper. REFERENCES 1. Casanova, J.L. and Abel, L. (2007) Primary immunodeficiencies: a field in its infancy. Science,317, 617–619. 2. Casanova, J.L. and Abel, L. (2002) Genetic dissection of immunity to mycobacteria: the human model. Annu. Rev. Immunol.,20, 581–620. 3. Rosenzweig, S.D. and Holland, S.M. (2005) Defects in the interferon-gamma and interleukin-12 pathways. Immunol. Rev.,203, 38–47. 4. Filipe-Santos, O., Bustamante, J., Chapgier, A., Vogt, G., de Beaucoudrey, L., Feinberg, J., Jouanguy, E., Boisson-Dupuis, S., Fieschi, C., Picard, C. et al. (2006) Inborn errors of IL-12/23and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Semin. Immunol.,18, 347–361. 5. Alcais, A., Fieschi, C., Abel, L. and Casanova, J.L. (2005) Tuberculosis in children and adults: two distinct genetic diseases. J. Exp. Med.,202, 1617–1621. 6. 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Patient I.1 presented urinary infection and omphalitis caused by Klebsiella pneumoniae at the age of five days. At the age of five years and six months, he presented chicken pox, which followed an unremarkable course. Three months later, he suffered from aseptic meningitis, which resolved without treatment. At the age of 16 years, a CT scan showed a large mediastinal mass, leading to surgical resection of mid-pulmonary lobe and partial pericardiectomy. Six months later the patient presented vertebral osteomyelitis, followed four months later by retroperitoneal lymphadenopathies and a new mediastinal mass requiring surgical intervention. Lymph nodes contained well delimited paucibacillary epithelioid granulomas containing giant cells. No mycobacteria were cultured. The patient responded well to antimycobacterial treatment with rifampicin (six months), isoniazid (six months) and pyrazinamide (four months). A brother of patient I.1 (patient I.2) had uneventful chicken pox at the age of two years and gastroenteritis caused by Shigella sonnei at the age of three years. At the age of four years, he developed pneumonia of unknown etiology that was controlled with amoxicillin. At the age of six years he was admitted to hospital with laterocervical lymphadenopathies, which had persisted for one to two years and were excised surgically. A Mantoux test was negative. At the age of 21 years, the patient was treated prophylactically with isoniazid for six months, following the diagnosis of mycobacterioses in his brother (patient I.1). Seven months after the end of isoniazid treatment, he was admitted to hospital with right hip and lumbar pain of five months’ duration. Multifocal osteomyelitis was diagnosed on the basis of CT scan and gammagraphy. Histological examination of bone marrow aspirates revealed multiple histiocytes and visible acid-fast bacilli (Ziehl-Neelsen staining). Cultures of bone marrow biopsy specimens and biological fluids (sputum, blood, urine) were negative for mycobacteria. The infection resolved after antimycobacterial treatment with isoniazid, pyrazinamide, rifampicin, clarithromycin, and amikacin for 18 months. Patients I.1 and I.2 are now doing well at the ages of 27 years and 31 years, respectively, without prophylactic treatment. Tests of IFN-γ production in response to M. tuberculosis peptides (Quantiferon-TB Gold, Cellestis) were negative for patients I.1 and I.2, despite normal levels of IFN-γ production in response to phytohemmaglutinin and IL-12, suggesting probable infection with non tuberculous EM. Patient II.1 suffered from bronchiolitis due to respiratory syncytial virus at the age of one month, and an episode of gastroenteritis caused by Cryptosporidium spp. at the age of 37 months, with an unremarkable course. Between the ages of four months and 47 months, she suffered from eight episodes of acute respiratory failure, at least six of which were associated with airway infections. In one episode (at the age of four months) Haemophilus influenzae was cultured from bronchial aspirates. In the last two episodes, she was treated with intravenous (IV) methylprednisolone and IV hydrocortisone, followed by two months of montelukast sodium. Between the ages of four years and one month and four years and eight months, she presented six episodes of erythema nodosum. At this age, large laterocervical lymphadenopathies were observed and, three months later, the patient presented with retroperitoneal and mesenteric lymphadenopathies and a positive Mantoux test (>25 mm, necrotic). No serum IgG antibodies against mycobacterial antigen 60 (A60) were detected. Multiple cultures of lymph node biopsy specimens and biological fluids (sputum, blood, urine, gastric juice) were negative for mycobacteria. No acid-fast bacilli were observed on Ziehl-Neelsen staining of a laterocervical lymph node with a reactive, nonspecific infiltrate. Tuberculosis was suspected and the patient was treated with rifampicin, isoniazid and pyrazinamide. After one year on antimycobacterial treatment with no clinical improvement, high levels of serum IgG against A60 were observed (1200 IU/ml). The patient underwent immunological analysis, and IFN-γR1 deficiency was diagnosed. A multiresistant strain of M. abscessus was subsequently cultured from a lymph node. The patient was treated with amikacin, clarithromycin, linezolid and subcutaneous IFN-γ (50 µg/m2 three times weekly) for two months, with a rapid clinical and echographic response, but the treatment was stopped due to toxicity problems. The patient was doing well without prophylaxis when, at the age of 10 years and 2 months, she presented lymphadenopathies and diarrhea, several episodes of erythema nodosum and high serum concentrations of IgG against A60 (up to 1768 IU/ml). Cultures of blood, sputum and urine were negative. The patient responded well to clarithromycin and linezolid treatment, which again had to be stopped after two months due to anemia, headaches and photosensitivity. This episode may have been a recurrence due to the short course of antimycobacterial treatment. The patient was doing well at the age of 12 years when she suffered from septic shock due to S. enteritidis. She is now healthy, at the age of 14 years, without prophylactic treatment. Patient III.1 was admitted to hospital at the age of 22 months for swelling and pain in the left ankle of two months’ duration. Magnetic resonance imaging and gammagraphy results were normal. At the age of 33 months, the patient presented swelling of the left forearm. Multifocal osteomyelitis was diagnosed, and cultures of sputum, bone and gastric juice were positive for M. avium. The patient was treated with ethambutol, rifabutin, ciprofloxacin and clarithromycin for 24 months. He is now healthy at the age of six years and three months, with no prophylaxis. Serological analyses at the age of 33 months detected IgG antibodies against Epstein-Barr virus and human herpes virus 8, together with IgM, but not IgG, antibodies against cytomegalovirus. Patient IV.1 was admitted to hospital at the age of six years and 11 months, for abdominal and lumbar pain of six days’ duration. He had no fever or other clinical signs of inflammation, and no abnormalities were observed on lumbar MRI scans. The patient was discharged because he responded well to anti-inflammatory drugs (ibuprofen). Two months later, he presented dorsolumbar and abdominal pain, an erythrocyte sedimentation rate (ESR) of 73 mm during the first hour, mild neutrophilia (8400 polymorphonuclear neutrophils-PMN-/mm3, 66.5% leukocytes), a C-reactive protein (CRP) concentration of 30.7 mg/l and no fever. The Mantoux test was positive (7 mm). Vertebral flattening at D12, surrounded by a moderate mass of soft tissue suggestive of Langerhans cell histiocytosis, was documented on CTscans and MRI. The patient underwent arthrodesis, and M. avium was cultured from the biopsy specimen. Cultures of sputum, gastric juice, blood and urine were negative. The patient was treated with ethambutol, rifabutin, ciprofloxacin and clarithromycin. Immunological analysis was requested, but the patient died four days later, at the age of seven years and two months, due to septic shock complicated by an acute respiratory distress syndrome and multiorgan dysfunction syndrome. Temperature and inflammatory markers, such as CRP concentration (up to 220.7 mg/l), leukocytosis (up to 25,900 leukocytes/mm3, 64% PMN) and fibrinogen (maximum 715.77 mg/dl) increased during the patient’s stay in hospital. Previously, at the age of 12 months, he had suffered from long-term (19 days) acute gastroenteritis with chronic diarrhea of unknown etiology. At the age of 23 months, he consulted for fever (40º C) with diarrhea and pain in the right hip, right knee and right hand. He had an ESR of 83 mm/h, leukocytosis (21,100 leukocytes/mm3, 58% PMN) and a serum CRP level of 110 mg/l. No abnormalities were observed on X ray or ultrasound scans and he was diagnosed with juvenile chronic arthritis. At the age of 34 months, he suffered pain in the left hip and at the age of 41 months, he presented lumbar pain. Microbiological cultures of blood, stools and urine were negative, but no cultures for mycobacteria were carried out. Patient V.1 was born to second-degree cousins in Chile. He was vaccinated with BCG on the first day of life. At the age of four months, an axillary adenopathy was noticed. At the age of 11 months, the patient suffered a febrile syndrome lasting one month and hepatosplenomegaly. A spleen biopsy showed a granulomatous reaction with positive Ziehl-Neelsen and Kinyoun staining. Cultures from the spleen and liver were negative. The Mantoux test was positive. PCR from a liver biopsy with primers to detect IS6110 insertion elements was positive, indicating infection with a bacterium of the M. tuberculosis complex, probably BCG. Antimycobacterial treatment was administered for 18 months, with isoniazid, rifampin and pyrazinamide, with a good clinical outcome. The patient suffered from molluscum contagiosum at the age of seven years. He is now doing well at the age of eight years and six months, in the absence of prophylaxis. Patient VI.1 was born to first-cousin Portuguese parents. She was vaccinated with BCG in the first days of life, and at the age of 14 weeks she was admitted to Coimbra Pediatric Hospital for disseminated BCG disease. She presented with a left axillary adenopathy, and abdominal ultrasound indicated homogeneous hepatomegaly without nodules or peritoneal effusion. A liver biopsy specimen revealed granulomatous inflammation with massive mycobacterial infiltration, and cultures were positive for Mycobacterium bovis. No coagulation or liver enzyme abnormalities were observed. Tritherapy with rifampicin, isoniazid and pyrazinamide was initiated, with little improvement in clinical status. Nine days later, streptomycin was added and a decrease in the size of the left axillary adenopathy and inflammatory signs was observed. After 11 months on treatment, cultures from axillary lymph nodes no longer tested positive. The patient was also treated with IFN-γ until the age of two years. At the age of five years, she is doing well on rifampicin, ethambutol and clarithromycin. She has two healthy brothers. Patient VII.1 was born to non consanguineous parents in Chile. He was vaccinated with BCG on the second day of life. At the age of seven months, he developed axillary lymphadenitis leading to the culture of BCG. He was treated with isoniazid, which was later withdrawn because it was not well tolerated by this patient. Clinical status worsened and X-ray analysis revealed osteolytic lesions in the ribs and femur, whilst cerebral CT-scans showed nodular lesions. Biopsy specimens from the femur and rib were negative for mycobacteria (Ziehl-Neelsen staining). A brain biopsy showed poorly defined granulomas and positive Kinyou staining. The patient was treated with streptomycin, isoniazid, ethambutol and rifampicin, but new cerebral granulomas developed during the second week of treatment. IFN-γ treatment was initiated, but with no clinical response. At the age of two years and eight months, cultures from an open scalp wound and a lung lesion were positive for multidrug-resistant BCG. He was treated with isoniazid, ethambutol, azithromycin, linezolid, levofloxacin and clofazamine. IFN-g was also introduced, with little improvement until the addition of IFN-α to the regimen. The patient, now aged five years and six months, is doing well on azithromycin, levofloxacin and IFN-γ. Patient VIII.1 was born to non consanguineous parents in Chile. She was vaccinated with BCG at the second day of life. At the age of five months, imaging studies showed multiple osteolytic lesions (right tibia, both femurs, sacroiliac region and skull). The patient also had axillary and cervical adenitis. MRI of the entire spinal column showed involvement of the lumbar spine, back and neck, and the patient later presented left arm monoparesis with functional impotence of the neck, which progressed favorably. Brain MRI showed a mass in the occipital region of the cranium in contact with the cerebral cortex. A biopsy of the right tibia and left femur showed positive Ziehl-Neelsen staining. Cultures were negative but PCR was positive for M. bovis. At the age of 26 months, the patient is currently treated with isoniazid, ciprofloxacin, rifampicin, ethambutol and rhIFN-γ, and her clinical status is gradually improving. Patient IX.1 was born to first degree cousins from the Azores (Portugal). He was vaccinated with BCG at the age of two days. At the age of two months, he developed axillary lymphadenitis with an extensive area of ulceration and necrosis. Treatment with isoniazid, ethambutol and rifampicin was initiated at the age of six months. A granuloma emerged on the anterior left side of the thorax while on maintenance treatment with isoniazid and rifampicin, and Streptomycin and ethambutol were added, with a good clinical outcome. At the age of seven years, the patient developed pneumonia with effusion of unknown etiology that was controlled with ampicillin. An extensive nasal and sinusal polyposis emerged, which was responsive to steroids. At the age of eight years and three months, the patient suffered Toxoplasma encephalitis, which responded to treatment. He is now doing well, at the age of eight years and eleven months, on pyrimethamine and clindamycin. A sister of patient IX.1 (patient IX.2) was not vaccinated with BCG. At the age of two months she was admitted to hospital for severe gastroenteritis. Cultures of stools and blood were positive for Salmonella spp, and she was treated with ampicillin for five days. Two days later she was admitted again with gastroenteritis due to Salmonella spp., which was controlled with ceftriaxone. She is doing well at the age of three years and eight months in the absence of prophylaxis. Patients X.1 and X.2 have been reported elsewhere (20). They were born to consanguineous Portuguese parents. Patient X.1 was vaccinated with BCG at one month of age and rapidly developed disseminated BCG infection. Skin and lymph node granulomas were tuberculoid. He responded well to appropriate antimycobacterial therapy. At the age of six years, he was diagnosed with disseminated Salmonella enteritidis infection, which responded to treatment with amoxicillin. He had two episodes of pneumonitis thought to be due to a Legionella species and Mycoplasma pneumoniae (at the age of 12 years), based on positive specific serology tests. His sister (patient X.2) was not vaccinated with BCG. At the age of three years, she developed a persistent cough with fatigue, anorexia and erythema nodosum. A chest X ray showed a lung infiltrate. Cultures were negative and she was diagnosed with clinical tuberculosis, which responded well to antituberculous drugs (rifampicin, isoniazid and ethambutol) but poorly to common antibiotics. A few weeks after her brother, at the age of six years, she also suffered from pneumonitis typical of M. pneumoniae infection, which was confirmed by specific antibody responses. Both patients are doing well at the ages of 28 years and 22 years, respectively, with no antibiotic prophylaxis. Patient XI.1 has been described elsewhere (21). She was born to healthy, unrelated parents, in Poland. She was vaccinated with BCG in infancy, without complications. She was healthy until the age of 20 years, when she presented fever, diffuse bone pain and general fatigue. A massive infiltration of the left iliac bone was observed and histological examination led to the diagnosis of Langerhans cell histiocytosis, which was treated with steroids, etoposide and cyclosporine A. Eight months later, multifocal osteomyelitis with brain and lung infiltration by acid-fast bacilli was found. The patient was treated in accordance with the results of susceptibility tests, with rifampicin, isoniazid and streptomycin, with the maintenance of corticosteroids, but her condition continued to worsen. After one month, M. avium was cultured from sputum and cutaneous pus. Two months later, the antimycobacterial drugs administered were changed to amikacin, rifabutin, cycloserine and clofazimine. One year later, following spondylodesis, brain lesions progressed and treatment with rifabutin, clarithromycin, clofazimine and cotrimoxazole was initiated, with the addition of IFN-γ (50 µg/m2 three times weekly). This patient is now 29 years old and no new infectious episodes have occurred in the absence of prophylaxis. frequencies of these subhaplogroups in natives of the Canary Islands (23% and 27% respectively) (70), suggest a pre-Hispanic heritage. However, both subhaplogroups are also present in the Iberian Peninsula (2% and 5% for subhaplogroups E-M78 and E-M81, respectively) (69), suggesting that an Iberian origin is also possible. Supplementary Table 3. IFN-γ γ R1 expression on EBV-B cells from patients homozygous for the V63G or I87T mutations and from healthy controls Mean fluorescence intensitya p-valueb Monoclonal antibody Healthy Controls (N=2) I87T Patients (N=5) V63G Patients (N=3) I87T vs. Controls V63G vs. Controls I87T vs. V63G BB1E2 19.42 ± 1.90 9.13 ± 4.67 4.59 ± 1.39 0.034 0.001 0.162 92101 69.92 ± 44.36 10.63 ± 11.07 3.20 ± 0.58 0.308 0.279 0.304 GIR 94 44.51 ± 8.43 22.77 ± 10.84 7.08 ± 0.29 0.054 0.100 0.051 GIR 208 93.10 ± 39.03 18.27 ± 19.50 4.73 ± 1.90 0.015 0.192 0.289 MMHGR1 178.5 ± 97.13 75.88 ± 69.73 65.78 ± 51.65 0.167 0.176 0.837 aValues are the mean fluorescence intensity for each monoclonal antibody minus the mean fluorescence intensity for the isotype control, expressed as means ± SD. bp-values: t-test. References supplementary tables 56. Bertranpetit, J., Sala, J., Calafell, F., Underhill, P.A., Moral, P. and Comas, D. (1995) Human mitochondrial DNA variation and the origin of Basques. Ann. Hum. 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El análisis con cinco mAb específicos de IFN-γR1 de los monocitos y de los linfocitos EBV-B de los pacientes procedentes de Gran Canaria, mostró una expresión disminuida de IFN-γR1. 2. El estudio genético de los pacientes de Gran Canaria y de sus familiares confirmó una deficiencia autosómica recesiva de IFN-γR1 debido a una mutación que produce la sustitución de un nucleótido en la posición 188 (c.188T>G, exón 2), dando lugar a un cambio conservativo de un residuo de valina por un residuo de glicina en la posición 63 (p.V63G) en el dominio extracelular de la molécula IFNγR1. 3. El estudio genético de los pacientes de Chile, Portugal y Polonia y de sus familiares confirmó una deficiencia autosómica recesiva de IFN-γR1 debido a una mutación que produce la sustitución de un nucleótido en la posición 260 (c. 260T>C, exón 3), dando lugar a un cambio no conservativo de un residuo de isoleucina por uno de treonina en la posición 87 (p.I87T) en el dominio extracelular de la molécula IFN-γR1. 4. Los monocitos de los pacientes homocigotos para la mutación p.V63G mostraron menores niveles de unión específica a IFN-γ a bajas concentraciones de la citocina que las células control. Sin embargo, estas diferencias fueron menos marcadas a altas concentraciones de la citocina, mostrando que las células de los pacientes son capaces de unir IFN-γ. 5. Los análisis de eventos tempranos (fosforilación de STAT-1, translocación de STAT-1 al núcleo) y tardíos (expresión de CD64, producción de IL-12p70 y TNF-α y la producción de IP-10) inducidos por IFN-γ in vitro, mostraron que las células de los pacientes homocigotos para IFNGR1 p.V63G mostraban una respuesta muy disminuida o ausente a dosis bajas de IFN-γ. Sin embargo, a dosis altas se apreciaba respuesta a IFN-γ, aunque esta era discretamente menor que en las células de individuos control. OBJETIVOS CONCRETOS 107 Capítulo II 6. La mutación p.V63G del IFNGR1 confiere un defecto autosómico recesivo parcial, no completo, de IFN-γR1. 7. El análisis de los linfocitos EBV-B de pacientes procedentes de Portugal, Chile y Polonia mostró una expresión disminuida de IFN-γR1. 8. Los ensayos de translocación de STAT-1 al núcleo en células EBV-B estimuladas con IFN-γ, mostraron que las células de pacientes homocigotos para p.V63G o p.I87T presentan un defecto celular menos grave que el observado en células de pacientes con deficiencia recesiva completa o dominante parcial de IFN-γR1. 9. La presencia de las mutaciones IFNGR1 p.V63G e p.I87T son consecuencia de un efecto fundador. El ancestro común más reciente de los pacientes homocigotos para p.V63G se estima que vivió hace aproximadamente 500 (200-1275) años, El ancestro común más reciente (MRCA -most recent common ancestor-) de los pacientes homocigotos para p.I87T se estima que vivió hace aproximadamente 1600 (875-2950) años. 10. La deficiencia RP-IFN-γR1 debida a las mutaciones p.V63G e p.I87T de IFNGR1 en homocigosis confiere un fenotipo clínico menos grave que el defecto autosómico recesivo completo y probablemente menor que el observado en pacientes con defecto dominante parcial de IFN-γR1. 11. En las deficiencias RP, RC y DP de IFN-γR1 se puede apreciar una correlación entre el fenotipo celular de respuesta a IFN-γ y el fenotipo clínico. CAPÍTULO II 108 CAPÍTULO III Objetivos La deficiencia de IL-12Rβ1 es el defecto genético más frecuente responsable de MSMD. El fenotipo clínico en estos pacientes es muy heterogéneo. Debido a que la cadena IL-12Rβ1 es necesaria para la señalización tanto de la IL-12 como de la IL-23, y dado que la IL-23 es necesaria para la expansión de los linfocitos Th17, estos pacientes podrían tener una mayor susceptibilidad a candidiasis. Los objetivos planteados son: 1. Recoger datos epidemiológicos y datos clínicos de episodios de candidiasis en pacientes con deficiencia de IL-12Rβ1 procedentes de diferentes países. 2. Estudiar la presentación clínica, la mortalidad y la respuesta al tratamiento de las infecciones por cándidas en estos pacientes mediante la revisión del historial clínico. OBJETIVOS CONCRETOS 109 Capítulo III MAJOR ARTICLE Clinical Features of Candidiasis in Patients With Inherited Interleukin 12 Receptor β1Deficiency Monia Ouederni,1,2 Ozden Sanal,5Aydan Ikinciog˘ullari,6Ilhan Tezcan,5Figen Dogu,6Ithaisa Sologuren,12 Sigifredo Pedraza-Sánchez,16 Melike Keser,9Gonul Tanir,7Chris Nieuwhof,19 Elena Colino,13 Dinakantha Kumararatne,20 Jacov Levy,22 Necil Kutukculer,10 Caner Aytekin,8Estefanía Herrera-Ramos,12 Micah Bhatti,23 Neslihan Karaca,10 Ridha Barbouche,3Arnon Broides,22 Ekaterini Goudouris,26 José Luis Franco,27 Nima Parvaneh,28 Ismail Reisli,11 Alexis Strickler,29 Anna Shcherbina,30 Ayper Somer,9Anthony Segal,21 Alfonso Angel-Moreno,14,a José Luis Lezana-Fernandez,18 Mohamed Bejaoui,1,2 Miriam Bobadilla-Del Valle,17 Salem Kachboura,4 Timothy Sentongo,24 Imen Ben-Mustapha,3Jacinta Bustamante,31,32 Capucine Picard,31,32,33 Anne Puel,31,32,b Stéphanie Boisson-Dupuis,31,32,25,b Laurent Abel,31,32,25 Jean-Laurent Casanova,31,32,25,34 and Carlos Rodríguez-Gallego12,15 1 Pediatric Hematology-Immunology Unit, National Bone Marrow Transplantation Center, Tunis, 2 Faculty of Medicine, University of Tunis El Manar, 3 Laboratory of Cytoimmunology, Pasteur Institut of Tunis, and 4 Department of Cardiology, Ariana Hospital, Tunis, Tunisia; 5 Department of Pediatric Immunology and Allergy, Ankara University School of Medicine, 6 Immunology Division, Hacettepe University Children’s Hospital, 7 Department of Pediatric Infectious Diseases, Dr Sami Ulus Maternity and Children’s Health and Diseases Training and Research Center, and 8 Department of Pediatric Immunology, Dr Sami Ulus Children’s Health and Diseases Training and Research Center, Ankara, 9 Department of Pediatric Infectious Diseases and Clinical Immunology, Istanbul University and Istanbul Medical Faculty, 10 Department of Pediatric Immunology, Ege University Faculty of Medicine, Izmir, and 11 Department of Pediatric Immunology, Necmettin Erbakan University Meram Medical Faculty, Konya, Turkey; 12 Department of Immunology, Gran Canaria Dr Negrín University Hospital, 13 Department of Pediatrics and 14 Department of Internal Medicine, Complejo Hospitalario Universitario Insular Materno Infantil, and 15 Department of Medical and Surgical Sciences, School of Medicine, University of Las Palmas de Gran Canaria, Spain; 16 Unit of Biochemistry and 17 Laboratory of Microbiology, National Institute of Medical Sciences and Nutrition Salvador Zubirán (INCMNSZ), and 18 Department of Pediatric Pulmonology, Laboratory of Pulmonary Physiology, Hospital Infantil de México Federico Gómez, Mexico City; 19 Department of Internal Medicine, University Hospital, Maastricht, Netherlands; 20 Department of Clinical Biochemistry and Immunology, Addenbrookes Hospital, Cambridge, and 21 Department of Medicine, University College London, United Kingdom; 22 Pediatric Department, Soroka Medical Center, Faculty of Health Sciences, Ben Gurion University, Beer Sheva, Israel; 23 Department of Pediatric Infectious Diseases, Comer Children’s Hospital, University of Chicago Medicine, and 24 Department of Pediatrics, University of Chicago Medical Center, Illinois; 25 St Giles Laboratory of Human Genetics of Infectious Diseases, Rockefeller Branch, Rockefeller University, New York, New York; 26 Department of Pediatrics, UFRJ–Federal University of Rio de Janeiro, Brazil; 27 Group of Primary Immunodeficiencies, University of Antioquia, Medellin, Colombia; 28 Department of Pediatrics, Pediatric Infectious Diseases Research Center, Tehran University of Medical Sciences, Iran; 29 Department of Pediatrics, Hospital Puerto Montt, Chile; 30 Department of Сlinical Immunology, Center for Pediatric Hematology, Oncology, Immunology, Moscow, Russia; 31 Laboratory of Human Genetics of Infectious Diseases, Necker Branch, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 32 University Paris Descartes, Imagine Institute, 33 Study Center for Primary Immunodeficiencies, Necker Hospital, APHP, and 34 Pediatric Hematology-Immunology Unit, Necker-Enfants Malades Hospital, AP-HP, Paris, France Background.Interleukin 12Rβ1 (IL-12Rβ1)–deficient patients are prone to clinical disease caused by mycobacteria, Salmonella, and other intramacrophagic pathogens, probably because of impaired interleukin 12–dependent interferon γproduction. About 25% of patients also display mucocutaneous candidiasis, probably owing to impaired interleukin 23–dependent interleukin 17 immunity. The clinical features and outcome of candidiasis in these patients have not been described before, to our knowledge. We report here the clinical signs of candidiasis in 35 patients with IL-12Rβ1deficiency. Results.Most (n = 71) of the 76 episodes of candidiasis were mucocutaneous. Isolated oropharyngeal candidiasis (OPC) was the most common presentation (59 episodes, 34 patients) and was recurrent or persistent in 26 patients. Esophageal candidiasis (n = 7) was associated with proven OPC in 2 episodes, and cutaneous candidiasis (n = 2) with Received 26 May 2013; accepted 25 October 2013; electronically published 1 November 2013. a Present affiliation: Department of Internal Medicine, Puerta de Hierro Hospital, Madrid, Spain. b A. P. and S. B. D. contributed equally to this work. Correspondence: Carlos Rodríguez-Gallego, PhD, Servicio de Inmunología, Hospital Universitario de Gran Canaria Dr Negrín, Barranco de la Ballena s/n, 35010 Las Palmas de Gran Canaria, Spain ( [email protected]). Clinical Infectious Diseases 2014;58(2):204–13 © The Author 2013. Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious Diseases Society of America. All rights reserved. For Permissions, please e-mail: [email protected]. DOI: 10.1093/cid/cit722 204 •CID 2014:58 (15 January) •Ouederni et al at ULPGC - Universidad de Las Palmas de Gran Canaria on January 22, 2014http://cid.oxfordjournals.org/Downloaded from infections, and/or onychomycosis due to C. albicans were the most common forms of mucocutaneous candidiasis in patients with AD-HIES (43%–56% of patients) [26,27], APS-I (all patients by age 40 years and 30% in the first 2 years of life) [28, 29], or CMCD due to mutations of IL17F,IL17RA or ACT1 or gain-of-function mutations of STAT1 [18–22]. Oropharyngeal C. albicans infection was by far the most common presentation of Candida infection in our series of patients and was present in 6 patients at birth. Other forms of mucocutaneous candidiasis were rare in our patients. Only 3 episodes of VVC were recorded in the 9 female patients in our series. Vulvovaginal candidiasis, even if recurrent, is also common in healthy women with no known risk factors [30,31]. In the absence of large epidemiological studies, it is probably not possible to associate the occurrence of VVC with impairments of immunity mediated by the IL-23/IL-17/interleukin 22 axis. Likewise, only 2 episodes of dermal infection were documented, and no onychomycosis was observed. Other patients with MSMD due to mutations impairing IFNγ–mediated responses (IFNGR1,IFNGR2, or STAT1 deficiencies due to loss-of-function alleles) do not seem to be prone to Candida infections, even when treated with prolonged courses of antibiotics or long-term prophylaxis [32,33]. Overall, our data indicate a potentially causal role of IL-23/IL-17 circuit impairment, but not of IL-12/IFN-γcircuit impairment, in susceptibility to mucocutaneous candidiasis in patients with IL-12Rβ1 deficiency. The absence of onychomycosis in our patients and their lower incidence of oral and skin infections than in patients with other primary immunodeficiencies (PIDs) resulting in impaired IL-17 immunity may reflect a milder impairment of IL-17–mediated responses in patients with IL-12Rβ1deficiency than in those with AD-HIES, APS-I, or CMCD [9,18–22]. Esophageal candidiasis was observed in 5 patients (7 episodes) in our series. Patient 2 had esophageal candidiasis at age 25 years, coinciding with the diagnosis of SCEC, in the absence of overt predisposing factors [25]. Esophageal candidiasis is relatively common in patients with APS-I (14 of 91 Finnish patients with APS-I), but it is unusual in patients with AD-HIES [26–29,34]. It has been suggested that there is an association between CMC and predisposition to oral and esophageal carcinomas [35]. We cannot formally exclude the possibility that candidiasis was an SCEC-predisposing factor in our patient, but the 2 conditions, candidiasis and SCEC, were diagnosed simultaneously. The IL-12/IFN-γaxis has a dramatic antitumor effect, and IL-17–producing T cells have been reported to have both antiand protumorigenic effects [36]. Other patients with MSMD have also had cancer at young ages [25]. Most IL-12Rβ1–deficient patients continued to have recurrent or persistent OPC despite treatment with oral nystatin or fluconazole. Remarkably, fluconazole prophylaxis did not control candidiasis in 2 of 4 patients with OPC and in 1 of 2 patients with esophageal candidiasis; itraconazole prophylaxis did not eradicate candidiasis in 1 of 4 patients, but it controlled the infection in 1 patient with esophageal candidiasis. Poor Table 4. Infections and Outcome for the Interleukin 12Rβ1–- Deficient Patients With or Without Candidiasis a Infections and Outcomes Interleukin 12Rβ1–Deficient Patients, No. (%) b Without Candidiasis (n = 96) With Candidiasis (n = 32) Age at last follow-up or death, mean ± SD, y 10.9 ± 9.48 c 10.49 ± 10.06 Male sex 50 (52) 21 (66) Mycobacterial disease 74/96 (77) 25/32 (78) BCG disease 59/96 (61) 18/32 (56) BCG resistant d 18/77 (23) 6/24 (25) EM disease 8/96 (8) 6/32 (19) In BCG-vaccinated patients 4/77 (5) 3/24 (12) In patients with BCG disease 2/59 (3) 1/18 (6) Mycobacterium tuberculosis disease 7/96 (7) 2/26 (8) Salmonellosis 35/96 (36) 15/32 (47) Mortality e 20/96 (21) 19/32 (59) Mean age at death, mean ± SD, y 6.69 ± 8.22 y c 9.0 ± 8.54 y Abbreviations: BCG, bacille Calmette-Guérin; EM, environmental mycobacteria (nontuberculous mycobacteria); SD, standard deviation. a Data are from reference [6]; only those patients for whom information about Candida infection was available were included. b Values represent No. (%) of patients unless otherwise specified. c No data were available for 1 patient. d BCG-vaccinated patients resistant to BCG disease. e Mortality was 23% for the 13 of the 141 patients described elsewhere [6], for whom no information about Candida infection was available. Figure 3. Kaplan–Meier estimation of survival for patients with interleukin 12Rβ1deficiency with (dashed line) or without (solid line)Candida infections (log-rank χ 2 14.56; P= .0001). IL12RB1 Deficiency and Candidiasis •CID 2014:58 (15 January) •211 at ULPGC - Universidad de Las Palmas de Gran Canaria on January 22, 2014http://cid.oxfordjournals.org/Downloaded from responses to treatment with azoles were found to be unrelated to resistances to these antifungals in 2 patients with OPC treated with oral fluconazole or intravenous fluconazole. Likewise, itraconazole and fluconazole prophylaxis did not control esophageal candidiasis by a C. albicans strain sensitive to both drugs. No antifungal prophylaxis was documented in patients without candidiasis. (For a proposal of antifungal treatment in IL-12Rβ1–deficient patients with candidiasis see Supplementary Material 3 [37].) Remarkably, disseminated candidiasis was observed in 4 of our 35 patients, with a total of 5 episodes. Three of these 5 episodes were nosocomial, and the clinical course of the invasive candidiasis in patient 20 does not exclude the possibility that it was hospital acquired. However, 1 patient had disseminated community-acquired candidiasis in the absence of predisposing factors other than the PID. Disseminated candidiasis is extremely rare in patients with APS-I, AD-HIES, or CMCD and is thought to be nosocomial [26–29,34,38]. Likewise, patients with isolated inborn errors of IL-17 or IFN-γimmunity do not seem to display invasive candidiasis, even though the latter also have severe mycobacterial and salmonella infections and often require similar in-hospital procedures [32,33]. By contrast, invasive and fatal Candida infections, such as meningeal candidiasis, are observed in patients with CARD9 deficiency, the only known PID conferring a predisposition to invasive candidiasis . However, CARD9 deficiency may impair several immune responses to Candida and other fungi through mechanisms other than the impaired IL-17–mediated immunity [16,17]. We acknowledge several limitations to our study. First, no data were available on the occurrence of candidiasis in 13 previously reported patients [6]. In addition, we cannot exclude the possibility that some episodes, particularly of OPC, were treated by primary care physicians and that they were not reported to the physicians providing care at tertiary hospitals. Second, 16 of the 35 patients studied were from a single country (Turkey), which could bias our data. However, the remaining 19 patients were from 13 countries in Europe, Africa, North and South America, and the Middle East. Third, it is difficult to know whether some episodes of candidiasis were only consequence of the PID or could have been secondary to other factors, such as hospital exposure, particularly in patients with invasive candidiasis who underwent surgery or in those with central lines. Fourth, our data suggest that IL-12Rβ1–deficient patient with candidiasis may have a poorer prognosis than those without candidiasis. However, there is not enough information to ascertain whether the groups of patients with or without candidiasis were comparable in terms of severity, exposure to healthcare, or other comorbid conditions; therefore, a causal relationship cannot be established. Immune responses to Candida are anatomically compartmentalized, and the roles of the IL-12/IFN-γand IL-23/IL-17 circuits in predisposition to invasive candidiasis remain unclear [21,30,31,39,40]. In a mouse model of oral infection, the IL12/IFN-γcircuit was found to be more relevant than the IL-23/ IL-17 axis for limiting the invasiveness of the fungus beyond the oral cavity [30,31]. Thus, the pathogenesis of invasive candidiasis may involve the combined impairment of IL-17 and IFN-γimmunity, as in IL-12Rβ1–deficient patients. However, candidemia is the fourth most common cause of nosocomial bloodstream infections in much of the developed world [37]. Further data are needed to draw firm conclusions about susceptibility to invasive candidiasis in IL-12Rβ1–deficient patients. Finally, our data expand the known infectious phenotype of IL-12Rβ1 deficiency and indicate that candidiasis may be the first clinical manifestation in IL-12Rβ1–deficient patients. Notes Acknowledgments. We thank the patients and their families for their trust. Author contributions. M. O., I. S., E. H. R., J. B., C. P., A. P., S. B. D., L. A., J. L. C., and C. R. G. performed the research and analyzed and interpreted data. O. S., A. I., I. T., F. D., S. P. S., M. K., G. T., C. N., E. C., D. K., J. L., N. Kutukculer, C. A., M. Bhatti, N. Karaca, R. B., A. B., E. G., J. L. F., N. P., I. R., A. Strickler, A. Shcherbina, A. Somer, A. Segal, A. A. M., J. L. L. F., M. Bejaoui, M. B. D. V., S. K., T. S., and I. B. M. were responsible for the clinical evaluation of the patients and also collected data. J. L. C. and C. R. G. designed the research, analyzed and interpreted data, and wrote the manuscript, and M. O. collaborated in the writing of the manuscript. Disclaimer. The sponsors of the study had no role in its design, the collection, analysis, and interpretation of the data, or the writing of the manuscript. Financial support. This work was supported by Fondo de Investigaciones Sanitarias, Ministerio de Economía y Competitividad (grants PI06/ 1031 and PI10/01718), the European Regional Development Fund–European Social Fund (FEDER-FSE), Fundación Canaria de Investigación y Salud (Canarian government; INREDCAN 05/06), Foundation Caja Rural de Canarias-Chil y Naranjo (research prize 2004), Universidad de Las Palmas de Gran Canaria (fellowship to E. H. R), INSERM, University Paris Descartes, Rockefeller University, National Center for Research Resources and the National Center for Advancing Sciences of the National Institutes of Health (grant 8UL1TR000043), Laboratoire d’Excellence “Integrative Biology of Emerging Infectious Diseases”(grant ANR-10-LABX-62-IBEID), the European Research Council, Agence Nationale de la Recherche (grant GENCMCD 11-BSV3-00501), the St Giles Foundation, the Candidoser Association, and Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de Mexico (grants 69992 and 182817). Potential conflicts of interest. All authors: No reported conflicts. All authors have submitted the ICMJE Form for Disclosure of Potential Conflicts of Interest. Conflicts that the editors consider relevant to the content of the manuscript have been disclosed. References 1. Filipe-Santos O, Bustamante J, Chapgier A, et al. Inborn errors of IL-12/23and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Semin Immunol 2006; 18:347–61. 2. Bogunovic D, Byun M, Durfee LA, et al. Mycobacterial disease and impaired IFN-γimmunity in humans with inherited ISG15 deficiency. Science 2012; 337:1684–8. 3. Hambleton S, Salem S, Bustamante J, et al. IRF8 mutations and human dendritic-cell immunodeficiency. N Engl J Med 2011; 365:127–38. 212 •CID 2014:58 (15 January) •Ouederni et al at ULPGC - Universidad de Las Palmas de Gran Canaria on January 22, 2014http://cid.oxfordjournals.org/Downloaded from 4. Bustamante J, Arias AA, Vogt G, et al. 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Patients BCG vaccination BCG disease EM disease M. tuberculosis Salmonellosis Candidiasis Other infections 1a 141 patients 108 patients 89 patients 21 patients 9 patients 57 patients 32 patientsb N. nova (1), T. gondii chorioretinitis (1), Toxoplasma retinitis (1), Disseminated P. brasiliensis (1), Disseminated histoplasmosis (1), K. pneumoniae (4), Klebsiella spp (1), Visceral leishmaniasis (1) 2 P1c P2d YES NO YES NO NO M. spp NO NO NO NO NO NO NO NO 3 P1 NR NO M. spp YES NO Disseminated Nocardia spp. 4 P1e YES YES NO NO NO NO NO 5 P1 YES YES NO NO YES NO NO 6 P1 Probable NO M. spp NO NO NO NO 7f P1 YES YES NO NO NO Recurrent OPC NO 8 P1 P2 NR NR NO NO NO NO NO NO YES NO NO NO Disseminated Coccidioides spp. Disseminated Coccidioides spp. ! # 9 P1 P2 P3g YES YES YES NO NO NO NO NO NO Pulmonary Pulmonary (6 months) Disseminated (6 years) Scrofulodermah NO NO NO NO NO NO Cutaneous leishmaniasis. Cutaneous leishmaniasis. 10k P1 NO NO M. genavense NO NO OPC, esophageal NO 11 P1 YES YES NO NO YES Recurrent OPC NO 12 P1 NR NO M. spp NO YES NO C. neoformans osteomyelitis BCG = Bacille Calmette-Guérin; EM: environmental micobacteria (nontuberculous mycobacteria); N. nova: Nocardia nova; T. gondii: Toxoplasma gondii; P. brasiliensis: Paracoccidioides brasiliensis; K. pneumoniae: Klebsiella pneumoniae; M. spp = patient had mycobacterial infection but the species concerned was not identified; NR; not reported; OPC: oropharyngeal candidiasis; C. neoformans: Cryptococcus neoformans. a This reference corresponds to reference [6] in the main manuscript; b 25 of the 32 patients with candidiasis were included in our study; c Genetic confirmation of IL-12Rβ1 deficiency, S. Boisson-Dupuis personal communication; d Brother of P1. He died with unproven, suspected, IL-12Rβ1 deficiency; e Genetic confirmation of IL-12Rβ1 deficiency, D. Kumararatne and R. Doffinger personal communication; f This reference corresponds to reference [23] in the main manuscript. The patient was included in our study (P26 in Table 1 of the main manuscript); g Brother of P2, died with unproven, suspected, IL-12Rβ1 deficiency; h Suspected, unproven, tuberculosis. No microbiological confirmation. k This reference corresponds to reference [24] in the main manuscript. The patient was included in our study (P34 in Table 1 of the main manuscript); no data about candidiasis was included in the original report. !$! Supplementary Material 2 Patient 3. This patient had recurrent oropharyngeal candidiasis (OPC), caused by C. albicans, from the age of seven years. At the age of 27 years, the patient consulted the Emergency Unit for fever, dyspnea, and hemoptysis. Physical examination revealed oral thrush, as well as systolic mitral and diastolic aortic murmurs. Electrocardiogram showed a negative T wave in all derivations, and Chest X rays showed cardiomegaly with images of acute pulmonary edema. Ultrasounds showed a severe aortic valve failure by sigmoid rupture and severe mitral failure with cordage rupture and image of vegetations in the mitral valve. He undergone rapid surgery, and active endocarditis with multiple vegetations on the mitral and aortic valves, with cordage rupture, was observed, requiring mitral and aortic valves replacement. Cultures of mitro-aortic valvular vegetations were positive for Candida of a species other than albicans. The infection was community-acquired and occurred in the absence of any known risk factor. P3 received i.v. amphotericin-B (1 mg/kg/day) for six weeks, and clinical remission was achieved 11 days after the start of treatment. Patient 9. This patient had numerous episodes of candidiasis (OPC, vulvovaginal) since the age of four years. At the age of 27 years and two months, she suffered from sepsis. Cultures from a drain tip (for antimycobacterial treatment) and blood cultures were positive for C. albicans. P9 was treated with i.v. fluconazole for six weeks and the clinical response obtained was good. One month after candidemia, P9 underwent a laparotomy for ileus, during which adhesiolysis and gastro-entero(jejuno)stomy were performed, with terminal ileum resection. Cultures of intestinal tissue, ascites, stools, urine and blood were positive for Mycobacterium avium, but negative for Candida, and antimycobacterial treatment was initiated. However, from one month after laparotomy, repeated feces cultures tested positive for C. albicans. Ten months after laparotomy, two ileum biopsy specimens were found to be positive for C. albicans. The patient was treated with i.v. fluconazole and, one month later, biopsy specimen cultures were negative for Candida. At the age of 28 years and five months, this patient underwent allogeneic BMT. She received several courses of fluconazole before BMT, but feces cultures established during conditioning were positive for C. glabrata, which was treated with fluconazole. The patient died at the age of 28 years and five months, shortly after BMT. Patient 12. The patient presented an episode of candidemia at the age of 17 years, whilst on antimycobacterial treatment. C. albicans was detected in blood cultures and a central venous line despite prophylaxis with oral itraconazole. The patient was treated with amphotericin B and caspofungin, but developed septic shock one day !%! later. Thereafter, multidrug-resistant Acinetobacter baumannii was isolated from transtracheal aspirate and blood cultures. This bacterium accelerated the septic phase. The patient died 15 days after the onset of candidemia. Concomitant fungal and bacterial infections may have been responsible for the patient’s death. Patient 20. He is a male with a history of disseminated Mycobacterial infection at the age of 8 months, secondary to BCG vaccination. He had two episodes of bone infections by non-thyphoidal Salmonella spp at the ages of 2 and 4 years. At the age of 4 years and five months he was admitted to hospital with a clinical picture characterized by weight loss, OPC, hepatosplenomegaly and multiple fistulized abscesses (neck, thorax, sacral region and pelvic limbs), in spite that he was receiving isoniazid, rifampin, ethambutol and ciprofloxacin during the past eight months. He received, through a peripheral catheter, i.v. treatment with fluconazole, Dicloxacylin and Cefotaxime during 8 days. Oral candidiasis disappeared, but three days after admission, the patient developed non-specific neurological symptoms (sleepiness, hypo activity, irritability) and seven days later a dorsolumbar abscess required debridement. A culture from the excised material was positive for M. bovis resistant to isoniazid, rifampim and pyrazinamide. With these findings an additional treatment with ethambutol, ciprofloxacin, prothionamide and IFN-γ was started. During the following two weeks, a progression of neurological signs was noted. Neurological symptoms included bilateral pyramidal syndrome, with reduced velocity on conductivity of tibial nerve, and loss of legs motility, the Glasgow score was 12/15. A nuclear magnetic resonance scan showed hydrocephaly, dilatation of the lateral, third and fourth ventricles plus arachnoids inflammation with the presence of arachnoids cyst, indicating a chronic infection at the central nervous system. With this picture, a ventricular-abdominal shunt was set on patient. During the procedure, a sample for microbiological cultures was obtained, which was positive for Mycobacterium spp, and Candida albicans was identified in three consecutive cultures of CSF and in one urine culture. Patient continued with anti-mycobacterial drugs plus i.v. amphotericin-B and oral fluconazole during 4 weeks. During hospitalization, the patient suffered from hospital-acquired pneumonia, and three consecutive blood cultures were positive for Klebsiella pneumoniae. He was treated with piperacillin/tazobactam plus aminoglucosid. Three weeks after the cranial surgery, patient developed clinical sings of obstruction of the ventricular-abdominal catheter, and a new surgical procedure was programmed. In spite of treatment (ciprofloxacin, streptomycin, ethambutol, prothionamide clindamycin, and recombinant human IFN-γ), patient’s condition worsened and he developed fever, a systemic inflammatory response, wasting and neurological symptoms, like aphasia and paralysis. Patient died with signs of multi organic failure after 75 days of hospital stay at the age of 4 years and eight months old. !&! Supplementary Material 3 In our experience, due to the high rate of recurrent or persistent candidiasis in patients with IL-12Rβ1 deficiency, the first episode of mucocutaneous candidiasis should be treated with oral fluconazole for 14-21 days. If candidiasis persists despite treatment or recurs after a period of remission, a more prolonged course of oral fluconazole is required, provided the fungal strain is susceptible to fluconazole. In patients unresponsive to fluconazole, or infected by fluconazole-resistant Candida isolates, switching to other azoles as itraconazole, posaconazole or voriconazole is recommended provided the strain is susceptible to those latest antifungals. In the absence of response to azoles, parenteral treatment with a lipid formulation of amphotericin B (LFAmB) or an echinocandin is recommended for azole resistant strains. Even though echinocandins or LFAmB are recommended as first line therapy in patients with invasive candidiasis [14-16], two out of the five episodes of invasive candidiasis (one episode of candidemia, and one episode of invasive infection of the ileum) in one of our patients were treated with intravenous fluconazole alone, and the patient responded to the treatment with microbiological and clinical remission. However, some situations may require other antifungals as in patients with invasive candidiasis and resistant Candida strains. IL-12Rβ1-deficient patients with VVC responded to standard topical treatments. Due to the low mortality associated with mucosal candidiasis, the risk of selection of fluconazole-resistant Candida strains, and that of drug interactions, primary prophylaxis is not recommended. Secondary prophylaxis is advisable in the most severe cases. For treatment about Candida infections see references 13-16. !'! Supplementary Material References 1. de Beaucoudrey L., Samarina A, Bustamante J, et al. Revisiting human IL-12Rbeta1 deficiency: a survey of 141 patients from 30 countries. Medicine (Baltimore) 2010;89:381-402. 2. A. Xie N, Jiang LP, Kong XF, et al. Primary immunodeficiency complicated with Bacillus Calmette-Guerin infection: identification and clinical phenotype of a case of novel interleukin-12Rbeta1 gene mutation. Zhonghua Er Ke Za Zhi 2008;46:601-4. 3. Luangwedchakarn V, Jirapongsaranuruk O, NiemeLa JE, et al. A novel mutation of the IL12RB1 gene in a child with nocardiosis, recurrent salmonellosis and neurofibromatosis type I: first case report from Thailand. Asian Pac J Allergy Immunol 2009;27:161-5. 4. Senanayake MP, Doffinger R, Kumararatne DS. Recurrent and unusual manifestations of tuberculosis in a boy with interleukin 12 receptor defect. Ceylon Med J 2009;54:54-5. 5. van de Vosse E, Ottenhoff TH, de Paus RA, et al. 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Potjewijd J, de Paus RA, van Wengen A, Damoiseaux J, Verbon A, van de Vosse E Disseminated Mycobacterium genavense infection in a patient with a novel partial interleukin-12/23 receptor β1 deficiency. Clin Immunol 2012;144:83-6. 11. Filiz S, Kocacik Uygun DF, Verhard EM, et al. (2012) Cutaneous leukocytoclastic vasculitis due to Salmonella enteritidis in a child with interleukin-12 receptor beta-1 deficiency. Pediatr Dermatol [in press]. DISCUSIÓN GENERAL El eje IL-12/IFN-γ juega un papel clave en el sistema inmunológico para, entre otras funciones, la defensa frente a micobacterias y otros microorganismos intramacrofágicos. Los defectos genéticos en el sistema IL-12/IFN-γ se han asociado con un incremento en la susceptibilidad a infecciones por micobacterias. Hasta la fecha, se han identificado mutaciones en siete genes autosómicos (IFNGR1, IFNGR2, STAT1, IL12B, IL12RB1, IRF8, ISG15) y en dos genes ligados al cromosoma X (IKBKG, CYBB), implicados en MSMD. La heterogeneidad alélica resulta en la definición de hasta 18 etiologías genéticas diferentes basadas en el modo de heredabilidad, en el impacto de la mutación y en la expresión y función del alelo mutante como responsables de MSMD. La designación MSMD no recapitula todas las características clínicas, siendo también más propensos a salmonelosis y, más raramente, a infecciones por otros microorganismos intramacrofágicos, (Bustamante J et al, 2014; Ramirez-Alejo N et al, 2014; Boisson-Dupuis S et al, 2015). La deficiencia de IL-12Rβ1 es la etiología MSMD más común. Hasta la fecha han sido descritos 181 individuos pertenecientes a 137 familias (Bustamante J et al, 2014; Senanayake MP et al, 2015). En nuestro laboratorio se estudiaron tres pacientes relacionados de las Islas Canarias con sospecha de deficiencia de IL-12Rβ1. El caso índice presentaba infecciones recurrentes por S. enteritidis desde la infancia. A la edad de tres años presentó infección diseminada por M. avium lo que hizo sospechar un defecto en el sistema IL-12/IFN-γ. Posteriormente se estudió a un segundo paciente (se supo que eran familiares tras el diagnóstico), un varón nacido de parientes consanguíneos en 2º grado, que presentaba salmonelosis recurrente desde la infancia, incluyendo tres episodios de osteomielitis por Salmonella spp. En los estudios inmunológicos clásicos realizados al caso índice, no se observaron evidencias de laboratorio que sugirieran una inmunodeficiencia primaria. Sin embargo, los estudios realizados al segundo paciente, a la edad de 28 años, mostraron, una profunda linfopenia T. El paciente tenía en sangre periférica en el momento del estudio, 221 linfocitos T TCRαβ+/mm3, 114 linfocitos T CD4/mm3 y todos los linfocitos T CD4+ eran CD45R0+, lo cual es un marcador de linfocitos T de memoria. La revisión de los estudios de subpoblaciones linfocitarias realizados a este paciente mostró que los valores de linfocitos T habían disminuido progresivamente desde los primeros estudios a los 13 años 134 de edad. Además, los linfocitos T del paciente presentaban una respuesta proliferativa a PHA muy disminuida, con respuestas proliferativas normales a anticuerpos anti-CD3. Puesto que no se supo que estos pacientes eran familiares hasta después del diagnóstico definitivo, estos estudios sugerían en este paciente, una posible inmunodeficiencia combinada atípica o de debut tardío. El análisis de producción de citocinas por las PBMCs de los pacientes en respuesta a mitógenos, así como la respuesta a IFN-γ, mostró que los pacientes no producían IFN-γ ni respondían a IL-12, mientras que producían cantidades normales de IL-2. Estos datos sugerían una posible deficiencia de IL-12Rβ1. El estudio de la expresión de receptor IL-12Rβ1 por citometría de flujo en las células de los pacientes, mediante el establecimiento de líneas de linfocitos T activados con PHA/IL-2 mostró que los pacientes no expresaban el receptor IL-12Rβ1. Los análisis genéticos revelaron que ambos pacientes eran homocigotos para la mutación 1791+2 T>G en el gen IL12RB1. El genotipo de ambos pacientes había sido descrito previamente (Fieschi C et al, 2003). Un hermano de este segundo paciente había fallecido a la edad de 6 años y 11 meses como consecuencia de una infección diseminada por S. enteritidis. Los tres pacientes presentaron episodios de candidiasis mucocutánea. El fenotipo clínico del paciente fallecido, sugiere que también padecía una deficiencia homocigota de IL-12Rβ1. Los pacientes con deficiencia de IL-12Rβ1 no suelen mostrar defectos en los estudios inmunológicos clásicos. La profunda deficiencia de linfocitos T, en especial de linfocitos T CD4, del paciente adulto de la familia anteriormente descrita sugería inicialmente una inmunodeficiencia combinada de inicio tardío. Probablemente esa deficiencia de linfocitos T es debida a la cronicidad de sus infecciones y a la exhaución del sistema inmunológico, en concreto de los linfocitos T. De hecho, prácticamente todos sus linfocitos T CD4+ eran células de memoria. Esto puede explicar la ausencia de respuesta proliferativa a PHA con respuestas normales a anticuerpos anti-CD3. La mayoría de los pacientes con deficiencia de IL-12Rβ1 experimentan enfermedad por micobacterias y muchos sufren salmonelosis diseminada. La penetrancia es incompleta existiendo individuos adultos sanos sin infecciones. Se estima que la penetrancia clínica de esta inmunodeficiencia a los 20 años de edad es de 79% (de Beaucoudrey L et al, 2010). En estos pacientes, la vacunación con BCG protege frente a posteriores infecciones por MNT, aunque no parece proteger de la tuberculosis (especie más virulenta). De hecho la enfermedad recurrente por BCG es rara (Fieschi C et al, 2003; Beaucoudrey L et al, 2010). DISCUSIÓN GENERAL 135 Discusión Por tanto, los pacientes tienen afectada la inmunidad frente a infecciones primarias causadas por especies de micobacterias, pero la inmunidad a infección por micobacterias latente o secundaria parece estar intacta. Otras infecciones presentes en estos pacientes son las debidas a patógenos como K. pneumoniae, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidiodes spp., Histoplasma spp., Cryptococcus neoformans, nocardiosis y leishmaniasis. Los pacientes con enfermedad grave causada por estos y, posiblemente, otros microorganismos deben ser investigados en relación a la deficiencia de IL-12Rβ1 (Beaucoudrey L et al, 2010). Algunos pacientes pueden experimentar sólo enfermedad por Salmonella spp., sin embargo un porcentaje bajo de pacientes con deficiencia de respuesta a IFN-γ (IFN-γR1, IFN-γR2 o STAT1), sufrió de salmonelosis invasiva (Fieschi C et al, 2003; McLennan C et al, 2004). Dado que la deficiencia de IL-12Rβ1 también conlleva una deficiencia en la señalización inducida por IL-23, la cual es necesaria para la expansión de linfocitos Th17, se postula que el defecto combinado de señalización por IL-23 e IL-12 confiera una mayor susceptibilidad a infección grave por salmonela en estos pacientes que en pacientes con deficiencias de respuesta a IFN-γ (Prando C et al, 2013). Nuestros tres pacientes de Gran Canaria experimentaron infecciones diseminadas recurrentes por S. enteritidis, y sólo uno de ellos presentó micobacteriosis. Por último, no se ha observado recurrencia de enfermedad por MNT en pacientes IL-12Rβ1 deficientes y sólo se han descrito dos casos de infecciones múltiples por MNT; uno de ellos presentó infecciones sucesivas por M. avium, M. triplex y M. genavense y otro pacientes tuvo infección por M. chelonae and M. fortuitum, seguido de una infección por M. avium (de Beaucoudrey et al. 2010). Sin embargo, la paciente que representó el caso índice en el estudio en Gran Canaria presentó infección recurrente y diseminada por la misma cepa de M. avium, tras altas dosis de corticosteroides y terapia con ciclosporina A para el tratamiento de anemia y trombocitopenia autoinmune, después de un largo periodo de remisión clínica y microbiológica, falleciendo a la edad de 7 años y 5 meses. Estos datos sugieren la necesidad de una terapia antimicobacteriana a largo plazo (o quimioprofilaxis secundaria cuando se trata de un tratamiento inmunosupresor) en pacientes con deficiencia de IL-12Rβ1. Estas observaciones ponen de relieve la variabilidad en el espectro clínico de la deficiencia de IL-12Rβ1 y sugieren que el ambiente y factores relacionados con el huésped, distintos de la deficiencia IL-12Rβ1, podrían influir en el fenotipo clínico de estos pacientes. Esta deficiencia, puede predisponer a formas más graves de enfermedad de lo que se creía anteriormente. Al igual que otros trastornos relacionados con MSMD, la deficiencia de IL-12Rβ1 debe sospecharse en pacientes con infecciones graves o 136 diseminadas por micobacterias o salmonela y también en aquellos con infecciones graves por otros microorganismos de crecimiento intramacrofágico. Un paciente de la isla de Gran Canaria con deficiencia de IL-12Rβ1 desarrolló un SCEC a la edad de 25 años. El SCEC no es común en el mundo desarrollado, donde la media de edad al diagnóstico es de 67 años y se relaciona frecuentemente con ingesta de alcohol y tabaco, mientras que el paciente con deficiencia de IL-12Rβ1 no tenía esos factores de riesgo. La frecuencia de cáncer de esófago en individuos jóvenes menores de 30 años es extremadamente rara. Nuestro paciente es el único individuo menor de 30 años diagnosticado con cáncer esofágico en las Islas Canarias en el periodo 1993-2003. Por el contrario, 14, 227 y 485 casos fueron diagnosticados para un rango de edad de 30-39, 40-59 y mayor de 60 años, respectivamente, en el mismo periodo. Coincidente con el SCEC, el paciente presentaba también una candidiasis esofágica. Se han documentado cuatro casos de SCEC a edades jóvenes (29-42 años) en pacientes con CMCD o CMC con hipotiroidismo (2 de ellos tuvieron deficiencia selectiva de IgA) (Rosa DD et al, 2008; Koch D et al, 2009). Seis de los 91 pacientes finlandeses con APS-I han sido diagnosticados de SCC oral y esofágica a una media de edad de 37 años (29-44 años), siendo la única malignidad diagnosticada en estos pacientes (Perheentupa J et al, 2006). Nuestro paciente fue diagnosticado de SCEC a una edad más joven que los pacientes con APS-I, en los que el SCEC sigue típicamente a la CMC. Es plausible una relación entre la deficiencia de IL-12Rβ1 y el SCEC en nuestro paciente. La incidencia de cáncer se incrementa con la edad, y la mayoría de los pacientes con deficiencia en el eje IL-12/23 son niños y adultos jóvenes. El paciente recuerda a dos individuos deficientes de IFN-γR1 con sarcoma de Kaposi (KS) asociado a HHV-8 y enfermedad de Hodgkin (asociada con frecuencia a infección por EBV) diagnosticados a la edad de 11 y 19 años respectivamente, así como un paciente joven con deficiencia del IFN-γR2 con SCC cutáneo (Camcioglu Y et al, 2004; Han J-Y et al, 2004; Toyoda H et al, 2010). Más recientemente, se han diagnosticado pacientes con inmunodeficiencias primarias y cáncer. Bax et al (2013), describe el primer caso de linfoma de células B asociado a EBV, en un paciente con deficiencia completa de IFN-γR1. Los análisis inmunológicos realizados, mostraron una ausencia de expresión del IFN-γR1 en superficie, y una pérdida completa de respuesta a IFN-γ in vitro. El paciente resultó tener una mutación que confería una deficiencia RC-IFN-γR1. A los 18 meses de edad, presentó una infección diseminada por MAC, que fue tratada con terapia antimicobacteriana. A la edad de 13 años sufrió DISCUSIÓN GENERAL 137 Discusión linfadenopatía axilar y submandibular por M. abscessus, siendo detectado el microorganismo en tejido y sangre y el paciente tratado con antibióticos. Sin embargo, dos años más tarde, M. abscessus fue detectado en varios órganos del paciente. Tras varios ciclos de terapia antimicobacteriana, los cultivos permanecían positivos para dicho microorganismo. A los 18 años, el paciente manifestó fiebre y pérdida de peso y se detectó una masa nodular con necrosis en el hígado y en el pulmón derecho. Los estudios llevados a cabo, llevaron al diagnóstico de un linfoma no Hodgkin de células B, positivo para EBV. Sin embargo, el paciente rehusó un tratamiento quimioterapéutico, en parte debido a la persistencia de la micobacteriemia y la posibilidad de empeoramiento tras el tratamiento. Finalmente, el paciente murió a los 20 años de edad, a causa de la progresión del cáncer. Además, un hermano del paciente falleció a los 6 años, debido a infección diseminada por MNT. De entre los más de 150 pacientes con defectos en el IFN-γR, y sólo un caso de linfoma no Hodgkin (de los cuales un proporción importante han fallecido), sugiere que, la incidencia de linfoma no Hodgkin en pacientes con estas deficiencias IFN-γR, puede ser mayor que la de la población general, como se predijo en estudios previos de ratón y los estudios en humanos, constituyendo un factor de riesgo para los pacientes con predisposición a infecciones micobacterianas (Bax HI et al, 2013). En el año 2014 se describió el primer caso de un paciente, de 11 años de edad con deficiencia RC-IFN-γR1 y germinoma intracraneal. A la edad de 2 años y 10 meses, el paciente presentó una osteomielitis multifocal por M. scrofulaceum. El estudio genético reveló que portaba una mutación en IFNGR1, que confería un defecto RC-IFN-γR1. El paciente respondió a la terapia antibiótica y permaneció estable clínicamente hasta los 11 años. Sin embargo, los hallazgos histológicos llevaron al diagnóstico de un germinoma intracraneal. El paciente recibió quimioterapia e irradiación local en la región pineal, experimentando un remisión completa. Tras un seguimiento de cuatro años, el paciente ha permanecido libre de tumores. En el caso de este paciente, el buen resultado posiblemente esté favorecido por el buen pronóstico global de este tipo de tumores y por la posibilidad de un adecuado tratamiento a pesar de la inmunodeficiencia (Taramasso L et al, 2014). Tres parientes en 2º grado (todas mujeres) de una paciente noruega diagnosticada con deficiencia de IL-12Rβ1 (de Jong R et al, 1998), desarrollaron cáncer gástrico de tipo intestinal (Vogelaar IP et al, 2015). El estudio genético en dos de las mujeres (la otra mujer había fallecido por cáncer gástrico previo al inicio de este estudio familiar), mostró que las pacientes portaban la misma mutación en IL12RB1 que el caso índice, aunque en 138 heterocigosis. Los autores también analizaron a 29 pacientes con cáncer gástrico con sospecha de una predisposición genética, basada en la historia personal y/o familiar para mutaciones en la línea germinal de los genes IL12RB1 e IL12RB2. Para el análisis de las mutaciones en este grupo, se seleccionaron aquellos pacientes que fueron negativos para mutaciones en CDH1, puesto que es el gen de mayor susceptibilidad a cáncer gástrico (1-3% de todos los pacientes con cáncer gástrico). No se encontraron mutaciones en estos genes, en ninguno de los 29 pacientes. La paciente que representó el caso índice tampoco presentó mutaciones en CDH1. La incidencia de cáncer gástrico en mujeres noruegas es de 7 por cada 100.000 personas cada año. Por tanto, es poco probable que las mutaciones en IL12RB1 e IL12RB2 inactivadas en heterocigosis, estén implicadas con frecuencia, en la predisposición a cáncer gástrico. Sin embargo, no hay suficientes datos que determinen si las familias con mutaciones en IL12RB1 tienen mayor riesgo de sufrir cáncer gástrico (Vogelaar IP et al, 2015). Estos resultados ponen de manifiesto la necesidad de controlar, no sólo las enfermedades infecciosas sino vigilar también la aparición de tumores, en pacientes con MSMD. Se han descrito tasas de detección del VPH altamente divergentes en los carcinomas esofágicos de alto riesgo (tasas altas) y de bajo riesgo (tasas bajas) (Syrjanen KJ, 2002; D’Souza G et al, 2007). Aunque España no es área de alto riesgo para SCEC, estos resultados ponen de manifiesto la posibilidad de que las deficiencias en el sistema IL-12IL-23/IFN-γ puedan predisponer a tumores inducidos por virus. Sin embargo ningún ADN del VPH se amplificó de la biopsia de nuestro paciente con el Linear Array HPV (Roche®). Actualmente, la asociación entre el VPH y el SCEC sigue siendo objeto de investigación y debate. Existen numerosas publicaciones sobre las regiones de alto y bajo riesgo para carcinomas esofágicos a nivel mundial, y la fuerte asociación o no con el VPH. En gran parte, esta controversia puede deberse al diseño de los estudios, el tipo de escala y tamaño muestral utilizado. El consenso que prevalece, basado en un estudio de metaanálisis reciente, es que existe una fuerte asociación entre el VPH y SCEC. Sin embargo, parece que en una cohorte de casos, el VPH no está implicado en la patogénesis de SCEC (Liyanage SS et al, 2013). Es muy posible que la amplia variación sobre la implicación del VPH en el mecanismo de carcinogénesis observado en estos pacientes, pueda ser multifactorial e incluir factores ambientales, la dieta y la resistencia inmunológica a las DISCUSIÓN GENERAL 139 Discusión infecciones por VPH. Es necesario un estudio prospectivo y multicéntrico que confirme dicha asociación. El eje de IL-12/IFN-γ ha sido ampliamente implicado en los mecanismos de vigilancia antitumoral. Los modelos de tumor experimentales mostraron que la IL-12 tiene un efecto anti-tumoral dramático y que el IFN-γ es crítico para la progresión de la respuesta anti-tumoral, aunque se han demostrado efectos anti-tumorales de IL-12 independientes de IFN-γ (Colombo MP et al, 2002; Langrish C et al, 2004; Pestka S et al, 2004; Shi X et al, 2004; Dunn GP et al, 2006). Las células tumorales, particularmente en carcinomas esofágicos, son una diana para el IFN-γ en el proceso de eliminación del tumor. De hecho, el desarrollo de insensibilidad a IFN-γ es uno de los mecanismos que permite a los tumores escapar de la eliminación por la respuesta inmunológica (Dunn GP et al, 2006). Las deficiencias del sistema IL-12-IL-23/IFN-γ pueden predisponer a cánceres no inducidos por virus, como se ha demostrado en ratón. Por ejemplo, la IL-12 ha demostrado reducir las lesiones en el ADN inducidas por radiación ultravioleta (UV), y ratones deficientes en IL-12 son más sensibles a tumores de piel inducidos por radiación UV que su homólogo normal (Meeran SM et al, 2006). Los pacientes deficientes en IL-12Rβ1 son también deficientes en el receptor de la IL-23 (IL-23R). La IL-23 promueve la expansión de las células Th17 polarizadas, que están reducidas en estos pacientes. Sin embargo, la IL-23 puede ejercer un papel dual en cáncer; la administración de cantidades excesivas de IL-23 está asociada con respuestas inmunológicas antitumorales significativas en modelos tumorales de ratón mientras que la IL-23 endógena se ha descrito que promueve la incidencia del tumor y el crecimiento in vivo. Este último efecto puede suceder a través de vías efectoras proinflamatorias y angiogénicas que nutren al tumor el cual puede ser mediado por IL-17. La expresión de IL-23, pero no la de IL-12, está incrementada en los tumores humanos, y ambas citocinas regulan antagónicamente las respuestas inflamatorias locales en el microambiente del tumor (Langowski JL et al, 2006; Germano G et al, 2008; Chen D et al, 2015). Un estudio reciente reveló, que el genotipo 378 GG/GC en el gen IL12RB1, que se asocia con una disminución de IL-12p40, puede contribuir a la susceptibilidad a cáncer de esófago (Tao YP et al, 2012). Estos datos y los artículos previos, apoyan que la patogénesis de tumores implica mayoritariamente daños en la inmunidad mediada por IFN-γ, y que las deficiencias del sistema IL-12-IL-23/IFN-γ podrían predisponer a cáncer. 140 Como se ha descrito anteriormente, los tres pacientes de Gran Canaria con deficiencia de IL-12Rβ1 padecieron al menos un episodio de candidiasis mucocutánea. Este hecho, unido a la observación de que aproximadamente un 25% de los pacientes con esta inmunodeficiencia descritos hasta 2010 había sufrido episodios de candidiasis (de Beaucoudrey L et al, 2010), fue el que originó que se realizaran estudios de candidiasis en pacientes con deficiencia de IL-12Rβ1. En la serie de 151 pacientes con deficiencia de IL-12Rβ1 en los que había información acerca de la presencia de candidiasis, 43 (más de un 25%) habían presentado esta complicación. Se recogió información de 76 episodios en 35 pacientes, y se pudo constatar que la candidiasis orofaríngea por C. albicans era la presentación más común de infección por Candida spp. en los pacientes con deficiencia de IL-12Rβ1, la cual estaba presente en 6 de los pacientes desde el nacimiento. La candidiasis esofágica se observó en 5 pacientes (7 episodios). Otras formas de candidiasis mucocutánea se presentaron con menor frecuencia. Sólo 3 episodios de candidiasis vulvovaginal fueron registradas en las 9 mujeres de esta serie de pacientes, no siendo recurrente en ninguno de los casos, y al menos un caso estuvo asociado con tratamiento inmunosupresor. Se han descrito pacientes con deficiencia de APS-I y AD-HIES que sufrieron candidiasis vulvovaginal después de la pubertad. Sin embargo, la candidiasis vulvovaginal, incluso recurrente, es también común en mujeres sanas sin factores de riesgo conocidos (Pirofski LA et al, 2009; Conti HR et al, 2010). En ausencia de estudios epidemiológicos con un mayor tamaño muestral, los cuales no son factibles actualmente, probablemente no sea posible sacar conclusiones acerca de la predisposición a candidiasis en pacientes con deficiencias del sistema IL-23/IL-17-IL-22. Por otra parte, sólo fueron documentados 2 episodios de infección cutánea y no se observó onicomicosis. En los pacientes con deficiencias en la inmunidad mediada por IL-17, las formas más comunes de CMC debido a C. albicans fueron la candidiasis orofaríngea, infecciones de la piel y/o la onicomicosis: 43%-56% de los pacientes con AD-HIES (Schimke LF et al, 2010; Woellner C et al, 2010), todos los pacientes a los 40 años y el 30% en los primeros 2 años de vida en pacientes con APS-I (Betterle C et al, 1998; Perheentupa J et al, 2006), y todos los pacientes con CMCD debido a mutaciones en IL17F, IL17RA, IL17RC (Ling Y et al, 2015) o ACT1 (Boisson B et al, 2013). De modo similar, la mayoría de pacientes con mutaciones de ganancia de función en STAT1 presentaron candidiasis mucocutánea, aunque pudiera haber un sesgo por selección debido a candidiasis, ya que en los últimos años se han publicado algunos pacientes que no DISCUSIÓN GENERAL 141 Discusión presentan candidiasis (Liu L et al, 2011; Puel A et al, 2011; van de Veerdonk F et al, 2011; Sampaio E et al, 2013). En cambio, los pacientes con MSMD debido a mutaciones que dañan la respuesta mediada por IFN-γ (deficiencias de IFN-γR1, IFN-γR2 o STAT1 con pérdida de función) no parecen ser propensos a infecciones por Candida spp., incluso cuando son tratados con ciclos prolongados de antibióticos o profilaxis a largo plazo (Dorman SE et al, 2004; Sologuren I et al, 2011). Estos resultados sugieren que la susceptibilidad a la candidiasis mucocutánea en los pacientes con deficiencia de IL-12Rβ1 es debida a deficiencias en la inmunidad dependiente del circuito IL-23/IL-17 pero no de IL-12/IFN-γ. La menor incidencia de infecciones orales y de piel y la ausencia de onicomicosis en nuestros pacientes comparado con otra IDP con un daño en la inmunidad de IL-17, puede deberse en parte a un menor deterioro de la respuesta mediada por IL-17 en pacientes con deficiencia de IL-12Rβ1 que en aquellos con AD-HIES, APS-I o CMCD (de Beaucoudrey L et al, 2008; Liu L et al, 2011; Puel A et al, 2011; van de Veerdonk F et al, 2011; Boisson B et al, 2013; Kumar N et al, 2014; Sharfe N et al, 2014) La candidiasis diseminada ha sido documentada en 4 de los 35 pacientes, con un total de 5 episodios. Tres de los episodios fueron nosocomiales. Sin embargo, un paciente sufrió candidiasis diseminada adquirida en la comunidad en ausencia de otros factores de predisposición más que la IDP. Además, el curso clínico de la candidiasis invasiva documentada en otro paciente, no excluye que esta fuera adquirida en el hospital. En los pacientes con daño selectivo de IL-23/IL-17, la candidiasis diseminada es muy poco frecuente. De 2 series incluyendo datos históricos de 132 pacientes con APS-I, se registraron sólo 2 episodios con candidiasis diseminada de origen nosocomial. En la deficiencia AD-HIES, de las series publicadas, sólo se ha descrito 1 paciente con candidiasis diseminada nosocomial, siendo también extremadamente rara en pacientes con CMCD, y, si ocurre, es generalmente nosocomial. (Betterle C et al, 1998; Kirkpatrick CH, 2001; Perheentupa J et al, 2006; Freeman AF et al, 2008; Schimke LF et al, 2010; Woellner C et al, 2010). Los pacientes con defectos innatos aislados de IL-17 o IFN-γ, no parecen mostrar candidiasis invasiva, aunque en el caso del IFN-γ, los pacientes tienen infecciones por micobacterias y salmonela graves y con frecuencia requieren de procedimientos hospitalarios similares (Dorman SE et al, 2004; Sologuren I et al, 2011). Por el contrario, las infecciones invasivas y fatales por Candida spp., como la candidiasis meníngea, se observaron en pacientes con deficiencia de CARD9, la única IDP conocida, junto con la 142 deficiencia de CGD que predispone a candidiasis invasiva (Lanternier F et al, 2015). Es importante señalar que los pacientes con deficiencia de CARD9 a menudo presentan además infecciones graves por dermatofitos. CARD9 es un adaptador que actúa regulando los receptores de tipo C de las lectinas, tales como Dectina-1, Dectina-2 y Mincle, los cuales reconocen componentes de los carbohidratos de la pared de los hongos. Por lo tanto, la deficiencia de CARD9 podría dañar varias respuestas inmunológicas frente a Candida spp. y otros hongos, a través de mecanismos distintos al deterioro de la inmunidad mediada por IL-17 (Puel A et al, 2012; Lanternier F et al, 2013). El primer episodio de la candidiasis en la serie de 35 pacientes, fue a edades más tempranas que las observadas para las infecciones definidas como MSMD clásicas, como las causadas por MNT, M. tuberculosis, o especies de Salmonella spp., y la mostrada para otras infecciones. Por el contrario, la enfermedad por vacunación con BCG indujo enfermedad a edades aún más tempranas que Candida spp. u otras infecciones. A pesar de ello, la candidiasis fue la primera infección documentada en 19 de los 35 pacientes, pese a la vacunación de 10 de los 19 pacientes con vacuna BGC. En conjunto, estos resultados indican que en más de un 10% de los pacientes con deficiencia de IL-12Rβ1, la candidiasis puede ser la primera infección que presenten. Es importante señalar que la mayoría de los episodios de candidiasis (n=53, 70% de los episodios) correspondieron a infecciones documentadas en pacientes con candidiasis persistente o recurrente, y que la mayoría de los pacientes deficientes de IL-12Rβ1 continuaron teniendo candidiasis recurrente o persistente a pesar del tratamiento con nistatina oral o fluconazol. Los datos obtenidos en el estudio de candidiasis en pacientes con deficiencia de IL-12Rβ1, amplían el fenotipo infeccioso de esta inmunodeficiencia y sugieren que esta inmunodeficiencia debe sospecharse en pacientes con candidiasis, incluso en ausencia de infecciones por micobacterias y salmonela, pudiendo la candidiasis presentarse como la primera manifestación clínica documentada. La tasa de mortalidad en los 35 pacientes con candidiasis (49%) fue mayor que la descrita previamente para 132 pacientes con deficiencia de IL-12Rβ1 sintomáticos (31,8%). Aunque no se han podido actualizar los datos para muchos de los pacientes descritos anteriormente, particularmente aquellos sin candidiasis, se analizó la mortalidad de los 128 pacientes sintomáticos deficientes de IL-12Rβ1 (de los 141 pacientes que se describen en el otro estudio) en los cuales la información sobre la infección por Candida spp. estaba disponible (de Beaucoudrey L et al, 2010). Las tasas de mortalidad fueron DISCUSIÓN GENERAL 143 Discusión