Efecto de variantes aplicadas a los procedimientos tecnológicos en la conservación seminal de la especie canina

INSTITUTO UNIVERSITARIO DE SANIDAD ANIMAL Y SEGURIDAD ALIMENTARIA. UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA D. MIGUEL BATISTA ARTEAGA, PROFESOR TITULAR DE UNIVERSIDAD, DOCTOR EN VETERINARIA Y ADSCRITO AL DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA ANIMAL, PRODUCCIÓN ANIMAL, BROMATOLOGÍA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA INFORMA: Que Dª MELANIA MARÍA SANTANA CRUZ, licenciada en Veterinaria, ha realizado bajo mi dirección el presente trabajo titulado “Efecto de variantes aplicadas a los procedimientos tecnológicos en la conservación seminal de la especie canina" y considero que reúne las condiciones y calidad científica necesarias para optar al grado de Doctor en Veterinaria por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. La Doctoranda El Director Las Palmas de Gran Canaria, a 10 de Octubre de 2011 Algunos resultados del presente trabajo han sido aceptados para publicación o se encuentran en fase de revisión en las siguientes revistas: - Santana M, Batista M, Alamo D, Cabrera F, González F, Gracia A. Influence of sexual stimulation and the administration of hCG on plasma testosterone levels in dogs (in press). Reproduction in Domestic Animals. - Batista M, Santana M, Niño T, Alamo D, Cabrera F, González F, Gracia A. Sperm viability of canine and caprine semen samples preserved in a dry shipper (major revision). Animal Reproduction Science. - Santana M, Batista M, Niño T, Alamo D, Cabrera F, González F, Gracia A. Influence of the preservation temperature over the seminal quality in fresh and frozen-thawed canine semen samples (major revision). Reproduction in Domestic Animals. A los maravillosos seres de mi vida…… a mis padres y a mis animales, ambos ejemplos de amor incondicional porque les debo lo que soy, y siempre formarán parte de mí Agradecimientos AGRADECIMIENTOS Érase una vez “una niña que no quería ser Veterinaria”…………. Cuando analizo como he llegado hasta aquí, simplemente sé que no lo sé. Son muchas las cosas que deben haber pasado en mi vida para que, teniendo la certeza de que no podía ser veterinaria, hoy esté intentando luchar por ser Doctora Veterinaria. El destino y nuestro esfuerzo se alían para ser quién eres y, en mi caso, sólo sé que sin darme cuenta hoy estoy dónde quiero estar. A continuación me espera un futuro incierto, pero a día de hoy estoy segura que, pase lo que pase, el camino ha merecido la pena. En ese camino me han acompañado muchas vivencias y muchos seres importantes que las han hecho posible, y es a ellos a los que que quiero agradecer y dedicar este trabajo. A mi director de Tesis, Dr. Miguel Batista, por qué él ha sido el primer eslabón de toda esta cadena. Sin sus interesantes propuestas e ideas de trabajo, su constancia, su confianza en mis posibilidades y sus consejos, nada de esto hubiese sido una realidad. A él le debo una tesis, una formación profesional y una gratitud infinita por permitirme haber aprendido de los mejores. A los componentes de la Unidad de Reproducción y Obstetricia de la Facultad de Veterinaria de Las Palmas de Gran Canaria, Anselmo Gracia, Fernando González y Fernando Cabrera, por poner a mi disposición sus instalaciones y hacerme sentir como una más dentro de la Unidad, proporcionándome en ocasiones sus interesantes puntos de vista sobre el trabajo realizado. Sin todo ello, este trabajo nunca hubiese podido llevarse a cabo a este nivel. Mil gracias a los propietarios que han cedido sus mascotas al servicio de la ciencia, colaborando con este trabajo y permitiendo que hiciésemos cuanto era necesario a sus animales por el simple hecho de confiar en lo que hacíamos, en nuestros propósitos y en lo que este estudio podía aportar al mundo científico. El creer en los demás es una virtud, y ellos han dado ejemplo de ello. A mis “grandes maestros” fuera de mi Universidad. A la Dra. Xiomara Lucas y al Dr. Alain Fontbonne, por mostrarme todo cuánto sabían simplemente por el placer de enseñar. Pero no sólo por permitirme acceder a sus increíbles conocimientos como profesionales, sino por demostrarme que, en este difícil mundo de la clínica e investigación en la especialidad veterinaria, “los grandes genios también son grandes personas”. Y por supuesto, a todos los que con ellos trabajaban (a Marta, a Fernando, a Manu, a Florannce,…), haciéndome llegar su sabiduría con paciencia, cercanía y gran amistad, pero también por transmitirme esas ganas de seguir luchando y aprendiendo. A mis incomparables compañeros de laboratorio. A ti, Desi, mi mentora, por poner a mi disposición cuánto tenías (tu tiempo, tus conocimientos y tus Beaguelitos); me enseñaste todo lo que sabías y me introdujiste en este mundo de la tecnología seminal con una estupenda formación y, ahora, eres la única que queda para rememorar nuestras “batallas”. A Tara, mi amiga-compañera caprina, aunque ya lejos, gracias por todo ese trabajo en grupo, esa gran capacidad de organización, por esas horas de incertidumbre en compañía y tantos recuerdos. A Robert, dicen que la vivencias cortas son intensas, cómo tú; te dejaste ver tarde y demasiado rápido, pero tu aportación valió por años. Y por supuesto a los numerosas alumnas que han Agradecimientos pasado por nuestra unidad (Carla, Dácil, etc.), estado siempre ahí para colaborar con una inmensa fuerza de voluntad y entusiasmo. A todos mis compañeros de la Universidad. Al Dr. Tacho Argüello y la Dra. Noemí Castro, por permitirme desenvolverme en la granja con total comodidad, aportando siempre todo lo que hiciese falta y tratándome como una más de sus becarios, incluyendo grandes consejos y por ayudarme con partes tan imprescindibles de esta Tesis como la estadística. A mis niños de la granja, incondicionales apoyos en el terreno laboral y en grandes etapas de mi vida en lo personal...el tiempo avanza y la gente se separa, pero lo vivido a vuestro lado fue de lo mejor y siempre estará conmigo. A todo el personal laboral de la granja por su colaboración en este trabajo. Y por supuesto a aquellas personas que han estado ahí indirectamente y que, aun estando detrás de toda la parte profesional, me han apoyado y sigue apoyando a nivel personal porque, un gran profesional no es nada si no tiene a quién querer… A mis increíbles padres, que han estado ahí desde el primer momento cuando, siendo niña, nadie entendía de dónde me venía esa “extraña pasión por los seres de 4 patas”. Ellos han sido testigos de mis dudas, de mis logros y de mis fracasos, pero siempre han estado ahí sin cuestionar si lo que estaba haciendo estaba bien o mal, sólo creyendo en mí. Puede que esa sea la función de los padres, pero yo les agradezco el saber haberlo hecho tan bien. Es un orgullo ser vuestra hija. A los numerosos amigos que me han acompañado en todos estos años (a Mine, Cris, Vane, Mª José y todos lo que sin nombrar saben que son especiales para mí) y los que siguen llegando…….todos ellos forman parte de mi y de lo que soy, y aunque no siempre que queremos podemos estar juntos, hacen que nunca me sienta sola en este camino. Todos para uno y uno para todos! Y por supuesto, los protagonistas de esta historia, “mis animales”. Ellos han dado a mi vida el sentido que tiene. Mis dulces compañeros de andaduras….mis mascotas (las que siguen ahí y las que ya se han ido), haciéndome compañía durante mi tiempo de transformación para ser una veterinaria, a mis pies en las horas de estudio y, recordándome cada día que por mucho que los conozca, “nunca dejarán de sorprenderme”. Y a todos los animalitos que han tenido que sufrir “mi maldades” en mi lucha por hacerme una profesional, saludándome con un alegre movimiento de cola independientemente de si les esperaba una caricia o una manipulación clínica. Ellos siempre serán especiales para mí… Índice ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN 1 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 6 2.1. Anatomía del aparato genital del macho 7 2.1.1. Testículos 7 2.1.2. Escroto 8 2.1.3. Epidídimo 9 2.1.4. Cordón espermático 9 2.1.5. Pene y prepucio 10 2.1.6. Próstata 11 2.2. Fisiología, gametogénesis y endocrinología del macho 12 2.2.1. Endocrinología del sistema reproductor del perro 12 2.2.2. La gametogénesis en el perro 13 2.2.3. Espermatogénesis 14 2.2.4. Esteroidogénesis en el perro 15 2.2.5. Concentraciones plasmáticas de testosterona en la especie canina 16 2.2.5.1. Concentraciones plasmáticas de testosterona en perros sanos 16 2.2.5.2. Relación entre hormonas exógenas y las concentraciones de testosterona 17 2.2.5.3. Técnicas de medición hormonal de testosterona 18 2.3. Recogida y contrastación seminal 19 2.3.1. La eyaculación y el semen 19 2.3.1.1. Mecanismo de la eyaculación 19 2.3.1.2. El semen 20 2.3.2. Extracción seminal 21 2.3.2.1. Estimulación manual 22 2.3.2.2. Cono o capuchón de látex 24 2.3.2.3. Vagina artificial 24 2.3.2.4. Electroeyaculación 25 2.3.2.5. Farmacología 26 2.3.2.6. Punción epididimaria 26 2.3.3. Factores que determinan la eyaculación y la calidad del semen 27 2.3.3.1. Factores que pueden influir sobre el mecanismo de la eyaculación 27 2.3.3.2. Factores que afectan a la calidad del semen 27 2.4. Valoración seminal 30 2.4.1. Estudio macroscópico 30 2.4.1.1. Color 30 2.4.1.2. Volumen 30 2.4.2. Estudio microscópico 31 3.4.2.1. Motilidad espermática 31 3.4.2.2. Concentración espermática 34 3.4.2.3. Morfología espermática 36 3.4.2.4. Vitalidad espermática 38 3.4.2.5. Acrosomías 39 3.4.2.6. Pruebas de viabilidad espermática 40 3.4.2.7. Otros aspectos a valorar del semen 41 2.4.3. Estudio bioquímico 41 Índice 2.5. Diluyentes seminales 42 2.5.1. Componentes básicos de un diluyente 42 2.5.1.1. Fuentes de energía 42 2.5.1.2. Soluciones tampones y electrolitos 43 2.5.1.3. Estabilizadores de membrana 43 2.5.1.2. Antibióticos 43 2.5.1.3. Otros componentes 44 2.5.2. Efecto de los diluyentes sobre las propiedades de los espermatozoides 44 2.5.3. Clasificación de los diluyentes 45 2.5.3.1. Diluyentes naturales 46 2.5.3.2. Diluyentes sintéticos 46 2.6. Conservación del semen canino 46 2.6.1. Semen fresco 46 2.6.2. Semen refrigerado 47 2.6.2.1. Dilución de eyaculados y principales diluyentes utilizados en refrigeración seminal en el perro 48 2.6.2.2. Proceso y tasa de dilución 50 2.6.2.3. Conservación del semen refrigerado 50 2.6.2.4. Transporte de semen refrigerado 51 2.6.3. Semen congelado 51 2.6.3.1. Criobiología espermática 51 2.6.3.2. Contrastación de las muestras seminales previo al proceso de congelación 52 2.6.3.3. Dilución de eyaculados, proceso y tasa de dilución 53 2.6.3.4. Principales diluyentes utilizados en congelación seminal en el perro 54 2.6.3.5. Periodo de equilibrado y envasado del semen 56 2.6.3.6. Congelación en nitrógeno líquido 58 2.6.3.7. Congelación en ultracongeladores 59 2.6.3.8. Transporte del semen congelado 60 2.7. Descongelación y contrastación seminal post-congelación 61 2.7.1. Procedimiento de descongelación 61 2.7.2. Dilución y longevidad del semen descongelado 63 2.7.3. Contrastación del semen congelado-descongelado 65 2.7.4. Estimulación de la motilidad espermática post-congelación 66 3. MATERIAL Y MÉTODOS 67 3.1. Experiencia 1: Características seminales post-descongelación en muestras conservadas en diferentes protocolos de criopreservación 68 3.1.1. Animales, plan sanitario, alimentación y alojamiento 68 3.1.2. Diseño experimental 69 3.1.3. Recogida de semen 72 3.1.4. Estudio y contrastación seminal 72 3.1.4.1. Estudio macroscópico 72 3.1.4.2. Estudio microscópico 73 3.1.5. Dilución y congelación seminal 76 3.1.5.1. Procedimiento de dilución seminal 76 3.1.5.2. Procedimiento de congelación seminal 79 Índice 3.1.6. Descongelación del semen y valoración del semen congelado-descongelado 80 3.1.7. Análisis estadístico 82 3.2. Experiencia 2: Características del semen conservado a diferentes temperaturas a lo largo del tiempo 82 3.2.1. Animales, plan sanitario, alimentación y alojamiento 82 3.2.2. Diseño experimental 83 3.2.3. Recogida y contrastación del semen 83 3.2.4. Diluyo-conservación del semen 84 3.2.5. Conservación en distintas temperaturas y congelación seminal 84 3.2.6. Valoración de la calidad seminal en los diferentes protocolos de conservación 85 3.2.7. Análisis estadístico 86 3.3. Experiencia 3: Viabilidad del semen congelado-descongelado conservado a diferentes temperaturas tras su descongelación 88 3.3.1. Animales, plan sanitario, alimentación y alojamiento 88 3.3.2. Diseño experimental 88 3.3.3. Recogida y contrastación del semen 89 3.3.4. Dilución y congelación seminal 89 3.3.5. Descongelación del semen y conservación en distintas temperaturas 90 3.3.6. Valoración de la calidad seminal posterior a los diferentes tiempos 90 3.3.7. Análisis estadístico 91 3.4. Experiencia 4: Influencia del tiempo de refrigeración previo a la congelación sobre la calidad del semen 93 3.4.1. Animales, plan sanitario, alimentación y alojamiento 93 3.4.2. Diseño experimental 93 3.4.3. Recogida y contrastación del semen 94 3.4.4. Dilución y refrigeración a distintos tiempos 94 3.4.5. Congelación seminal 96 3.4.6. Descongelación del semen y valoración de la calidad seminal 96 3.4.7. Análisis estadístico 96 3.5. Experiencia 5: Características del semen tras someterse a distintos tiempos de equilibrado y de vapores de nitrógeno líquido 98 3.5.1. Animales, plan sanitario, alimentación y alojamiento 98 3.5.2. Diseño experimental 98 3.5.3. Recogida y contrastación del semen 99 3.5.4. Dilución y distintos tiempos de equilibrado 99 3.5.5. Congelación seminal a diferentes tiempos en vapores de nitrógeno líquido 100 3.5.6. Descongelación del semen y valoración de la calidad seminal 101 3.5.7. Análisis estadístico 101 3.6. Experiencia 6: Características del semen congelado y almacenado en nitrógeno líquido vs nitrógeno seco 103 3.6.1. Animales, plan sanitario, alimentación y alojamiento 103 3.6.2. Diseño experimental 103 3.6.3. Recogida, contrastación, dilución y congelación seminal 103 3.6.4. Descongelación y valoración seminal post-descongelación 105 3.6.5. Análisis estadístico 105 Introducción De esta forma, los objetivos de la presente tesis doctoral han sido los siguientes: 1. Evaluar la calidad del semen de Dogo Canario criopreservado en nitrógeno líquido y en ultracongeladores de -152ºC, valorando la influencia del tiempo de preservación sobre la calidad seminal y el efecto de diferentes concentraciones de Equex. 2. Valorar la capacidad de supervivencia y la calidad del semen canino fresco, conservado a distintas temperaturas (37ºC, 25ºC y 4ºC) a lo largo del tiempo. 3. Estimar la capacidad de supervivencia y la calidad del semen congeladodescongelado conservado a distintas temperaturas (37ºC, 25ºC, 15ºC y 4ºC) tras su descongelación. 4. Establecer las características del semen congelado-descongelado tras haber sido sometido a diferentes periodos de refrigeración (1, 6, 12, 24 y 48 horas) previos a la congelación. 5. Determinar las características del semen canino criopreservado cuando se combinan diferentes periodos de tiempo de equilibrado (30, 60, 90 y 120 minutos) y de exposición a vapores de nitrógeno líquido (5, 10 y 15 minutos). 6. Valorar la calidad y longevidad del semen canino conservado en contenedores de nitrógeno seco. 7. Evaluar la influencia de la estimulación sexual asociada a la recogida seminal sobre los niveles plasmáticos de testosterona en perros de raza Beagle. 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Revisión Bibliográfica 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.1. ANATOMÍA DEL APARATO GENITAL DEL MACHO En la especie canina, el aparato reproductor del macho ha sido estudiado al detalle, por lo que las características estructurales y funcionales del mismo se encuentran perfectamente descritas. Los órganos genitales del macho constan de dos testículos envueltos por el escroto, los epidídimos, los conductos deferentes, el pene, la glándula prostática y la uretra (Evans, 1993). 2.1.1. Testículos Las gónadas masculinas están representadas por los testículos, cuya función principal es la producción de espermatozoides y de hormonas esteroideas como los andrógenos (Hewitt, 2000). En el feto, independientemente de la especie animal y sexo final del embrión, las gónadas primitivas se desplazan hasta quedar localizadas a nivel renal, siendo imposible distinguir, en esta fase, un testículo de un ovario (Hewitt, 2000). Asimismo, a diferencia de otras especies animales, los testículos de los perros no están localizados en el escroto en el momento del nacimiento. De hecho, el descenso testicular y la definitiva disposición de los testículos a nivel escrotal es un proceso complejo que sucede en las primeras etapas de vida del perro (Colin, 2004). Las gónadas masculinas, localizadas en el interior del escroto, se caracterizan por presentar forma oval y superficie lisa (Evans, 1993). En posición normal, los testículos del perro se sitúan en posición longitudinal con respecto al eje mayor (Allen, 1992), de forma que se observan más gruesos dorsoventral que latero-medialmente (Feldman y Nelson, 2007), mientras el testículo izquierdo queda ligeramente caudal respecto al derecho (Feldman y Nelson, 2007). Los testículos están formados por el parénquima testicular, estructura que se distribuye de forma compartimentada mediante septos de tejido conectivo procedentes de la túnica albugínea, lo que permite que el testículo se organice en espacios interseptales (Sandoval, 2000; Bacha y Bacha, 2001). Más detalladamente, la distribución interior de los testículos se caracteriza por presentar una compartición parcial o completa del parénquima testicular que, a su vez, se encuentra estructurado en lobulillos testiculares que contienen los túbulos seminíferos. El conjunto de túbulos seminíferos desembocan a nivel del mediastino, en la zona central del testículo, compuesto por tejido conectivo laxo procedente de la fusión de los septos conocidos como rete testis, responsable de la recolección de los espermatozoides formados a Revisión Bibliográfica nivel de los túbulos seminíferos. Esta región se continúa con los conductos colectores, denominados vasos eferentes, que presentan una conexión directa con el epidídimo (Evans, 1993; Hewitt, 2000; Sandoval, 2000; Bacha y Bacha, 2001; Johnston y cols., 2001). Con respecto al tamaño testicular, se trata de un parámetro relacionado directamente con las distintas conformaciones raciales, guardando una estrecha relación con el tamaño y/o masa corporal del animal (Hewitt, 2000; Feldman y Nelson, 2007). De hecho, se ha descrito una correlación positiva del peso corporal con el peso y volumen testicular, masa epididimaria total y anchura escrotal (Johnston y cols., 2001), habiéndose estimado que para un perro de unos 11 kg de peso, la longitud media de los testículos es de 3 cm y la anchura de 2 cm (Evans, 1993). No obstante, de forma general se ha establecido como referencia que el rango estimado de tamaño para los testículos caninos debe ser de 1 a 5 cm de longitud por 1 a 3 cm de diámetro, aproximadamente (Feldman y Nelson, 2007), mientras que otros autores proponen medidas de 3 x 2 x 1.5 cm para los testículos caninos (Hewitt, 2000; Johnston y cols., 2001). 2.1.2. Escroto En la especie canina, el escroto es una bolsa de piel pigmentada y delgada, que se encuentra dividida internamente en dos cavidades por un septo escrotal, cada una ocupada por un testículo, su epidídimo y la parte distal del cordón espermático (Evans, 1993; Anderson, 1994; Johnston y cols., 2001). Además, presenta una cobertura pilosa dispersa, con una textura relativamente lisa, blanda y uniforme al tacto, de forma que la piel pueda desplazarse libremente sobre los testículos (Feldman y Nelson, 2007). En el perro, el escroto se caracteriza por presentar forma pendular, donde los testículos se sitúan de forma ligeramente horizontal (Hewitt, 2000) u oblicuos al mismo (Johnston y cols., 2001). Debido a la función de producción y almacenaje de espermatozoides que poseen los testículos, la temperatura a la que se encuentren se presenta como un factor decisivo a la hora de determinar la calidad del semen. A este nivel, el escroto se presenta como una estructura que actúa a modo de eficaz sistema de termorregulación para los testículos y epidídimos, ya que además de sus peculiares características (delgada piel con presencia de glándulas sudoríparas, presencia de glándulas sebáceas bien desarrolladas y la inexistencia de grasa cutánea) que le permiten el enfriamiento de la sangre arterial, cuenta con un mecanismo de contracción y relajación desarrollado por el músculo cremaster que permite el desplazamiento testicular hacia el interior del escroto o del cuerpo del animal para controlar su temperatura (Evans, 1993; Hewitt, 2000; Johnston y cols., 2001; Álamo, 2007). Revisión Bibliográfica 2.1.3. Epidídimo El epidídimo es el lugar donde los espermatozoides quedan almacenados antes de la eyaculación (Evans, 1993) y se presenta como una estructura tubular que aparece situado junto al testículo (Álamo, 2007). El tamaño epididimario debe ser proporcional al tamaño testicular (Root, 2005a), pero es comparativamente largo en la especie canina (Evans, 1993). Anatómicamente se puede dividir en tres regiones: cabeza, cuerpo y cola del epidídimo (Hewitt, 2000), situándose de forma que queda adherido a la superficie dorsoventral de los testículos con la cola localizada en el extremo caudal del testículo y la cabeza en la extremo craneal del mismo (Evans, 1993; Feldman y Nelson, 2007) La cabeza comienza sobre la superficie medial del testículo pero inmediatamente gira alrededor del extremo craneal para fijarse a nivel lateral; ésta se continua con el cuerpo que se dispone a lo largo de la superficie dorsolateral del órgano hasta transformarse en la cola (Evans, 1993). La cola del epidídimo se mantiene unida a la porción caudal del testículo a través del ligamento propio del testículo (Johnston y cols., 2001), donde desempeña la función de almacenamiento y maduración de los espermatozoides (Ruberte y Sautet, 1998), continuándose craneodorsalmente con el cordón espermático a través del conducto deferente (Evans, 1993). 2.1.4. Cordón espermático El cordón espermático, que comienza en la región profunda del anillo inguinal, está conformado por la asociación del conducto deferente con su arteria y vena, los vasos sanguíneos como la arteria espermática y el plexo venoso pampiniforme, el músculo cremáster, vasos linfáticos y nervios. Estas estructuras quedan englobadas dentro del proceso vaginal y permiten que el cordón espermático adquiera una apariencia tubular, localizado entre el testículo y la pared abdominal del macho (Evans, 1993; Johnston y cols., 2001; Feldman y Nelson, 2007). Medial y dorsal a cada testículo se localizan los conductos deferentes, estructuras que representan la continuación de la cola del epidídimo y que se despliegan a través del anillo inguinal interno para introducirse en la cavidad abdominal adyacente al cordón espermático (Álamo, 2007; Feldman y Nelson, 2007). Los conductos deferentes discurren por el interior del saco vaginal hasta la uretra, donde desembocan en la región de la próstata craneal, antes de abrirse en la uretra prostática (Hewitt, 2000). Revisión Bibliográfica 2.1.5. Pene y prepucio El prepucio es una prolongación de la mucosa peneana que se continúa como mucosa prepucial en forma de estructura cutánea que cubre por completo la porción libre del pene, para protegerlo en ausencia de erección. Consta de una lámina externa, constituida por la porción de piel exterior que se continúa con la lámina interna observable durante la erección (Evans, 1993; Hewitt, 2000; Sandoval, 2000; Johnston y cols., 2001; Álamo, 2007). El pene es un órgano localizado bajo la pelvis. Su tamaño no erecto depende de la raza del perro; sin embargo, se ha establecido que el rango de longitud se sitúa entre los 6.5 y los 24 cm (Evans, 1993). No obstante, en la especie canina se caracteriza por alcanzar un gran volumen gracias a la gran cantidad de tejido eréctil de tipo cavernoso y esponjoso que contiene. El pene se encuentra dividido en tres partes: la raíz, el cuerpo y el glande del pene (Evans, 1993; Sandoval, 2000). En la región proximal del pene se encuentra localizada la raíz de este órgano. La raíz del pene queda conformada por los pilares y el bulbo del pene, quedando constituida principalmente por los cuerpos cavernosos, envueltos por una densa túnica albugínea fibroelástica, de la que emerge un septo que actúa separando ambos cuerpos cavernosos en toda su longitud; en su interior existe una entramada red de trabéculas que, al quedar entrelazadas con el tejido de la zona, permite la existencia de cavernas que actúan como lugares de retención sanguínea en esta región, permitiendo el crecimiento y consistencia adecuada en el momento de la erección (Sandoval, 2000; Johnston y cols., 2001). A este nivel también se observa el denominado bulbo del pene, una estructura que corresponde a un formación bilobulada y espongiforme, que aparece como continuación de los cuerpos esponjosos alrededor de la uretra peneana y, que actúa a modo de saco donde se acumula la sangre (Evans, 1994). Por otro lado, el cuerpo del pene presenta un aspecto corto, cilíndrico y poco aparente, que se caracteriza por presentar un escaso desarrollo de los cuerpos cavernosos que se prolongan indistintamente desde la raíz del pene hasta el cuerpo (Evans, 1994; Sandoval, 2000). El glande del pene corresponde a la porción más visible, que en estado no eréctil queda localizada en el interior del prepucio. Se corresponde con la distensión del cuerpo esponjoso a continuación del bulbo del pene; tiene su origen alrededor de la uretra a nivel del bulbo peneano, y se prolonga a través del glande hasta su terminación en el conducto uretral e inicio con la Revisión Bibliográfica mucosa prepucial. A su vez, consta de dos partes bien diferenciadas; por un lado, el bulbo del glande, que es una expansión en forma de barril de los cuerpos esponjosos situada en la base o extremo proximal del glande que rodea la uretra y el hueso peneano y que, en erección, permite la sujeción temporal del pene en la vagina durante el coito. Por otro lado, la porción larga del glande o pars longa del glande sólo contiene tejido eréctil en la zona dorsal y longitudinal al hueso peneano y la uretra. Esta zona del glande presenta una morfología cilíndrica en todo su trayecto para cambiar drásticamente en su porción distal, momento en el que se aplana considerablemente (corona del glande) quedando el proceso uretral localizado centralmente. De este modo, la apertura de la uretra durante la eyaculación se desplaza de la superficie ventral a dorsal con el objeto de direccionar el eyaculado (Evans, 1993; Hewitt, 2000; Sandoval, 2000). Por otro lado, los cánidos se caracterizan por presentar a nivel del pene una estructura ósea no existente en el resto de las especies domésticas. Se trata del hueso peneano, estructura rígida que confiere al glande la consistencia suficiente para penetrar en la hembra antes de conseguir una erección completa. Este hueso peneano presenta, en su superficie ventral, un profundo canal a través del que transcurre la porción de uretra peneana, que permite el tránsito de la orina o el semen a lo largo del pene hasta el orificio externo de la uretra (Allen, 1992; Anderson y Anderson, 1994; Sandoval, 2000). 2.1.6. Próstata La próstata es una glándula andrógeno-dependiente de estructura semioval, bilobulada y simétrica, donde la simetría viene determinada por la división de la misma en dos lóbulos del mismo tamaño, firmes y lisos, como consecuencia de la presencia de un tabique en su región medial (Hewitt, 2000; Johnston y cols., 2001; Feldman y Nelson, 2007). El tamaño y peso de la próstata pueden variar dependiendo de factores como la edad, raza y peso corporal del perro. A diferencia del resto de especies, se caracteriza por ser la única glándula sexual accesoria en la especie canina. Su función básica es la de generar un volumen de secreciones apropiado al eyaculado mediante la aportación de un medio compuesto por citrato, lactacto, colesterol y numerosas enzimas que otorga a los espermatozoides las propiedades necesarias para ejecutar su función correctamente (Evans, 1993; Hewitt, 2000; Johnston y cols., 2001). Revisión Bibliográfica La glándula prostática se caracteriza por envolver a la uretra en su región proximal, a nivel del cuello de la vejiga urinaria donde, a su vez, se encuentran la porción terminal de los conductos deferentes que se insertan en la superficie craneodorsal de la próstata. Asimismo, las estructuras encargadas de transportar y depositar los fluidos producidos a nivel prostático reciben el nombre de colículos seminales, y se sitúan a nivel de la zona de apertura de los conductos deferentes en la uretra prostática (Evans, 1993; Hewitt, 2000; Johnston y cols., 2001). 2.2. FISIOLOGÍA, GAMETOGÉNESIS Y ENDOCRINOLOGÍA DEL MACHO El eje hipotálamo-hipofisario-gonadal se encarga de controlar, mediante interacciones hormonales, los procesos de espermatogénesis y la esteroidogénesis (producción de espermatozoides y hormonas, respectivamente), ambos desarrollados en áreas del testículo bien diferenciadas (Knol y cols., 1993). Para ello, el testículo presenta una compartimentación funcional, donde se puede diferenciar el compartimento intersticial en el que se encuentran las células de Leydig productoras de testosterona, el compartimento basal donde se encuentran las células de Sertoli y espermatogénicas y el compartimento adluminal donde finaliza el proceso de producción de espermatozoides (Hewitt, 2000; Sandoval, 2000; Johnston y cols., 2001). 2.2.1. Endocrinología del sistema reproductor del perro La hormona liberadora de gonadotropina o GnRH es producida en el hipotálamo a nivel de la base del encéfalo. Su secreción se lleva a cabo de forma episódica en pulsos cada 1.5 horas, aproximadamente. Esta hormona es transportada mediante un sistema especializado de vasos sanguíneos hasta la hipófisis anterior, donde se une a receptores específicos localizados en las membranas plasmáticas de las células gonadotropas. Bajo su estimulación, estas células se encargan de la secreción de las hormonas responsables del control de la reproducción en el perro a nivel central: - La hormona FSH: hormona folículo-estimulante - La hormona LH: hormona luteinizante Ambas hormonas son liberadas al sistema circulatorio, siendo transportadas hasta las gónadas. Una vez localizadas a nivel testicular, ejercen su acción sobre las células de Leydig que comienzan a sintetizar y secretar testosterona (Hewitt, 2000; Hill y cols., 2006). A su vez, la testosterona producida por las células de Leydig es capaz de actuar, de forma conjunta con la FSH procedente de la hipófisis, a nivel de las células de Sertoli presentes en los testículos. El Revisión Bibliográfica resultado de esta interacción permite que se incremente la producción de sustancias paracrinas necesarias para la re-activación de la espermatogénesis (Hill y cols., 2006). Sin embargo, junto a la testosterona son múltiples las hormonas encargadas de controlar los procesos relacionados con la reproducción en los machos de la especie canina. Mediante su acción conjunta, se desencadenan una serie de interacciones denominadas “feed-back” cuya función es la regulación de la secreción de las mismas. Así, bajo influencia de la gonadotropinas se desarrolla un proceso de feed-back positivo o negativo para aumentar o disminuir la producción de testosterona y espermatozoides. De esta forma, mediante control hormonal, se mantiene activo un complejo sistema que permite la interacción entre dichos órganos. Las principales hormonas encargadas (Hewitt, 2000; Feldman y Nelson, 2007) de dicha regulación son: - La testosterona, tras ser sintetizada por las células de Leydig, es liberada al torrente circulatorio, terminando por alcanzar el cerebro donde actúa a nivel de la hipófisis y el hipotálamo. Una vez allí, es responsable de ejercer un efecto de retroalimentación negativa sobre el eje hipotalámico-hipofisario con el objeto de limitar la secreción de gonadotropinas. - La inhibina, sintetizada por las células de Sertoli, se encarga de disminuir la liberación de gonadotropinas mediante acción directa sobre la hipófisis. - La activina, tras ser secretada por las células de Sertoli, se encarga de producir el efecto contrario a la inhibina, es decir, estimular la producción de gonadotropinas. 2.2.2. La gametogénesis en el perro Como se ha citado con anterioridad, son las gonadotropinas y la testosterona las hormonas responsables del control de la espermatogénesis y esteroidogénesis (Hill y cols., 2006). De hecho, ambos procesos comienzan cuando la GnRH se sintetiza a nivel hipotálámico, actuando sobre la hipófisis para activar la liberación de la FSH y LH. La secreción de la FSH, consecuente a la liberación de la GnRH, se caracteriza por realizarse de forma pulsátil, siendo más gradual y lenta que la de LH. A su vez, ésta última (LH), se encarga de producir el incremento en la secreción de testosterona. Durante la espermatogénesis, la FSH y la testosterona, actúan directamente sobre las células de Sertoli estimulándolas para que las células germinales se diferencien a nivel de los túbulos seminíferos. Para que este proceso se lleve a cabo es necesario que las células de Sertoli reciban la señal por parte de la FSH, siendo las únicas células que presentan receptores para esta hormona (Hewitt, 2000). Asimismo, para que la espermatogénesis se desarrolle correctamente y en un medio adecuado, los niveles de Revisión Bibliográfica testosterona alcanzados en los túbulos seminíferos deben superar las concentraciones plasmáticas (Hewitt, 2000). Por otro lado, se ha observado como la testosterona actúa a otros niveles como son los conductos eferentes, el epidídimo y los conductos deferentes con el objeto de incrementar sus actividades secretorias y de absorción (Feldman y Nelson, 2007). Un ejemplo de ello sería la influencia que tiene esta hormona en el mecanismo de la eyaculación, actuando como estimulador de las contracciones a nivel del epidídimo (Hess, 2002). 2.2.3. Espermatogénesis Las células primordiales que se encuentran a nivel del epitelio germinal de los túbulos seminíferos sufren una serie de divisiones y cambios madurativos hasta dar origen a los espermatozoides en un proceso denominado espermatogénesis. El tiempo que tarda en llevarse a cabo la espermatogénesis en el perro es de aproximadamente unos 62 días. Este proceso consta de diferentes etapas que, mientras se van sucediendo, se acompañan de la migración por parte de los gametos en desarrollo desde la membrana basal de dichos túbulos hacia el lumen (Hewitt, 2000; Johnston y cols., 2001; Fahrig, 2003). Las fases involucradas se citan a continuación: I. Espermatocitogénesis El proceso comienza con la diferenciación de las espermatogonias, que son las células menos diferenciadas o células madres. Mediante mitosis, se consigue la multiplicación de este tipo celular, con el objeto de incrementar el número de espermatozoides finales a partir de un número reducido de espermatogonias iniciales. De esta división celular surgen las espermatogonias tipo A y B; tras ello, la división mitótica hace que aparezcan los espermatocitos primarios, que después de una primera división meiótica darán lugar a los espermatocitos secundarios. A continuación, una segunda meiosis se encarga de producir una reducción de la dotación cromosómica a la mitad, originando las denominadas espermátidas haploides (Allen, 1992; Hewitt, 2000; Johnston y cols., 2001; Fahrig, 2003). II. Espermiogénesis Como continuación del proceso de espermatocitogénesis, las espermátidas esféricas resultantes del mismo se transforman en espermátidas maduras, en la última fase de diferenciación conocida como espermiogénesis (Hewitt, 2000). Para que esto se haga efectivo, a nivel celular se desarrolla un complejo proceso que comprende una serie cambios a nivel de la membrana, citoplasma y núcleo de la célula, que le otorga a la célula forma de espermatozoides (Allen, Revisión Bibliográfica En el perro, el semen no se elimina de forma conjunta durante la eyaculación sino que, por el contrario, ésta ocurre de forma progresiva, quedando el eyaculado fraccionado en 3 partes bien diferenciadas, separadas entre ellas por un periodo de latencia en caso de animales muy entrenados (Allen, 1992; Peña, 1997; Hewitt, 2000; Johnston y cols., 2001; Root, 2005a; Álamo, 2007; Feldman y Nelson, 2007). Por ello, a la hora de proceder al estudio del eyaculado en el perro, debemos distinguir las siguientes fracciones: a) Primera fracción: también denominada fracción preespermática o uretral. Procedente de próstata, se caracteriza por presentar un número muy escaso de espermatozoides o bien ausencia completa de ellos, lo que le confiere un aspecto acuoso y transparente. Se elimina de forma muy rápida, oscilando el tiempo entre 30 segundos y 1 minuto, y su principal función es la de limpieza, eliminando de la uretra los posibles residuos de orina y contaminación a este nivel (Allen, 1992; Peña, 1997). b) Segunda fracción: conocida como fracción espermática, es la porción del eyaculado que contiene los espermatozoides procedentes de la cola del epidídimo y de los conductos deferentes. Presenta un aspecto más o menos denso de color blanco lechoso aunque, en función de la concentración, en ocasiones adquiere tonalidad blanco opalescente. Su tiempo de emisión oscila entre 1-2 minutos, siendo la fracción rica en espermatozoides (Allen, 1992; Peña, 1997). c) Tercera fracción: descrita como fracción prostática. Nuevamente procedente de la próstata, se trata de una fracción que prácticamente no contiene espermatozoides o están presentes en un bajo número ya que su función es la de proporcionar volumen al eyaculado y facilitar el ascenso de los espermatozoides en su camino al útero. Es por ello que presenta un aspecto acuoso, transparente o ligeramente amarillento. Su eliminación se prolonga en el tiempo entre 3-30 minutos (Allen, 1992; Peña, 1997). 2.3.2. Extracción seminal El proceso para la recolección del semen varía mucho entre individuos aunque, se use el método que se use, nunca debería alterar la calidad de los espermatozoides (Kutzler, 2005). En cualquier caso, este tipo de práctica debe llevarse a cabo en un ambiente donde el animal se encuentre tranquilo y seguro (Hewitt, 2000). Revisión Bibliográfica La utilización de un reclamo sexual para incrementar la líbido y estimulación del perro es un tema controvertido. Algunos autores afirman que para facilitar la estimulación y que la recogida seminal tenga más posibilidades de éxito, sería conveniente el uso de un perra en celo que permitiese observar la aptitud del macho con respecto a la monta y por tanto, su receptividad a la recogida, si bien esto no es necesario en todos los casos (Peña 1997; Hewitt, 2000). Sin embargo, otros autores describen innecesario el uso de una hembra en machos entrenados o habituados al procedimiento de obtención de semen (Allen, 1992; Kutzler, 2005; Álamo, 2007). En cualquier caso, el reclamo sexual más habitualmente utilizado y el protocolo con el que se obtiene una mayor calidad del semen (principalmente en la concentración de espermatozoides), precisa de la participación de perras en celo. Para llevar a cabo correctamente la estimulación deseada, se hace necesario que la perra u otra montura (p.e., un macho castrado) se encuentre bien sujeta para permitir el acceso del perro a su parte trasera durante el olfateo e intento de monta; asimismo, en la mayoría de los casos, la perra se puede retirar en cuanto empiece la eyaculación (Peña 1997; Hewitt, 2000; Kutzler, 2005; Root, 2005a; Feldman y Nelson, 2007). No obstante, una alternativa al uso de monturas es la utilización de gasas impregnadas con secreciones vaginales. Habitualmente este tipo de reclamos se mantiene conservado en congelación (-20ºC) y en el momento de la recogida seminal, tras su descongelación, deben situarse en la región vulvar de la montura (normalmente perras que no se encuentran en celo) o, permitir que el animal destinado a la recolección seminal, las olfatee directamente (Peña 1997; Hewitt, 2000; Root, 2005a). Otro tipo de estímulo sería el utilizar gasas bañadas en feromonas sintéticas de ácido metil éster p-hidroxibenzoico comerciales (Hewitt, 2000; Johnston y cols., 2001; Kutzler, 2005); no obstante, este método sólo se recomienda en determinadas ocasiones para producir una mejoría en la líbido del macho, aunque en general es menos efectivo que los anteriormente descritos (Feldman y Nelson, 2007). Los métodos de recogida seminal más habitualmente utilizados en la especie canina se describen a continuación: 2.3.2.1. Estimulación manual En la especie canina, la recogida seminal mediante estimulación manual es el método más utilizado en la mayoría de los estudios (England, 1991; England y Ponzio, 1996; Iguer-Ouada y Verstegen, 2001a, b; Álamo y cols., 2005; Verstegen y cols., 2005). La técnica se basa en producir una estimulación directa del pene con la mano del técnico, centrando su acción a nivel Revisión Bibliográfica del bulbo del glande. Si la estimulación manual del técnico se realiza de forma correcta, se consigue generalmente una adecuada erección y eyaculación por parte del animal. Asimismo, el semen debe ser recogido en un embudo de vidrio o plástico colocado sobre un tubo colector como material de recolección, previamente atemperado (37ºC), aunque algunos autores aconsejan el uso de un tubo de cristal acoplado a embudo de cristal como instrumental de recolección (Peña, 1997; Hewitt, 2000). La recolección seminal por estimulación manual es uno de los métodos más sencillos y útiles, ya que permite aislar las 3 fracciones del eyaculado de forma muy sencilla (Allen, 1992; Kutzler, 2005; Álamo, 2007), si bien en circunstancias de sobrexcitación existen animales que suprimen la liberación de la primera fracción (Peña, 1997). La separación de las tres fracciones del eyaculado nos va a facilitar el manejo de ellas en función de las técnicas reproductivas que queramos aplicar o los procesos de tecnología seminal. Es el caso de la recogida seminal para realizar inseminación artificial o crioconservación, procedimientos donde tanto la primera fracción y como la tercera son innecesarias (Kutzler, 2005; Feldman y Nelson, 2007). Sin embargo, en ocasiones, puede ser necesario la recogida de una parte de la tercera fracción con el fin de diluir la segunda fracción; esto se realiza cuando el eyaculado se encuentra muy concentrado o para terminar de recolectar los espermatozoides procedentes de la segunda fracción que quedan retenidos a nivel uretral o adheridos a las paredes del embudo (Allen, 1992). La utilización de otro tipo de materiales en el instrumental de recogida, así como el uso de lubricantes ha generado controversia. Diversos autores consideran que el látex resulta tóxico para los espermatozoides, ya que el flujo del eyaculado sobre el látex templado tiene un efecto negativo sobre los mismos (Arthur y cols., 1991; Allen, 1992; Feldman y Nelson, 2007); se ha comprobado que existe una marcada reducción de la motilidad de los espermatozoides, de 1 a 5 minutos después de haber estado en contacto el semen con guantes de látex durante 60 segundos, mientras el efecto fue mínimo al contacto del semen con guantes de vinilo o polvos de talco (Althouse, 1999). No obstante, Root (2005) se posicionó contraria a esta teoría defendiendo que la reducción en la motilidad espermática sólo se produce en aquellos casos donde el contacto del semen con el látex es superior a 20 minutos, periodo de tiempo muy superior al habitualmente empleado en los procedimientos de recogida. Por otro lado, también existen discrepancias sobre el uso de lubricantes en el momento de la recogida seminal. Algunos autores proponen la utilización de lubricante hidrosoluble no Revisión Bibliográfica espermicida sobre la mucosa peneana para facilitar la retracción del prepucio; sin embargo, se debe evitar el contacto de este tipo de sustancias con el semen, ya que puede resultar perjudicial para los espermatozoides (Johnston y cols., 2001; Kutzler, 2005; Feldman y Nelson, 2007). Finalmente, tras la eyaculación, y cuando la erección desaparece escasos minutos tras liberar el pene de la presión digital, debemos controlar que éste recupere la conformación que presentaba previa erección y que su posicionamiento en el interior del prepucio sea el correcto (Feldman y Nelson, 2007). 2.3.2.2. Cono o capuchón de látex La recolección seminal mediante la utilización de un cono o capuchón de látex consiste en la colocación de este dispositivo, basado una banda de caucho en forma de embudo, directamente sobre el bulbo del glande. Este tipo de instrumental se sostiene con la mano, al mismo tiempo que se continua produciendo la estimulación del bulbo de forma que, cuando la eyaculación se produce, el semen liberado desciende por sus paredes hasta un tubo colector conectado en su extremo más agudo donde se deposita (Peña, 1997; Álamo, 2007). Este sistema tiene la ventaja de ser más seguro que el uso de instrumental de recogida de cristal. Por ejemplo, cuando utilizamos embudos de cristal para la recolección en perros muy nerviosos que se muevan en exceso o aquellos que ejerzan intensos movimientos pélvicos durante la estimulación, este material debe mantenerse a cierta distancia del pene para evitar traumatismos (Peña, 1997; Johnston y cols., 2001; Kutzler, 2005). Sin embargo, esta técnica presenta varios inconvenientes; entre ellos, se puede citar la necesaria y exhaustiva limpieza del material cuando se utiliza para diferentes machos debido a la imposibilidad de ser esterilizado (Johnston y cols., 2001; Kutzler, 2005), la dificultad de obtener muestras de semen estéril por el contacto que se produce con las paredes del cono contaminadas con la flora bacteriana normal de la mucosa peneana y la uretra distal (Johnston y cols., 2001) y, la problemática que conlleva para la separación de las tres fracciones del eyaculado (Arthur, 1991; Allen, 1992; Peña, 1997). 2.3.2.3. Vagina artificial Este dispositivo permite la simulación de las condiciones de temperatura, presión y lubrificación de la cópula natural para la correcta estimulación del perro. Se trata de una construcción sencilla, conformada principalmente por un cilindro de goma dura exterior que presenta un revestimiento interior de látex o camisa de caucho, que se reinvierte en sus extremos. Esto permite crear una Revisión Bibliográfica cavidad entre ambas donde se deposita agua caliente y aire insuflado a través de una válvula de tal forma que, en el interior de esta estructura, la zona en contacto directo con el pene adquiera temperaturas próximas a los 37ºC y presión similar a la de la vagina (Johnston y cols., 2001; Feldman y Nelson, 2007). Asimismo, en el extremo libre del cilindro, se acopla una extensión de látex cónica o embudo de caucho que lleva un tubo de vidrio graduado adaptado para la recolección del semen tras la eyaculación (Olar y cols., 1983; Peña, 1997; Johnston y cols., 2001). Con respecto al lubricante, éste debe aplicarse en la cara interna de la vagina y debe ser estéril. Para su correcta utilización, el proceso comienza con la estimulación del perro, de forma que cuando la erección supere el 50% y el animal continúe con los movimientos coitales, el pene con el bulbo exteriorizado se redirige a la vagina artificial, permitiendo que el pene penetre en ella a modo de vagina natural (Álamo, 2007). Esto se debe realizar al tiempo que se mantiene una suave presión digital alrededor del bulbo para mantener la erección (Johnston y cols., 2001; Feldman y Nelson, 2007). Aunque se considera un sistema de recogida eficaz, su empleo puede llegar a ser incómodo y complicado; además, presenta el inconveniente de que, como ocurría en el método anterior, no permite la separación de las fracciones eyaculatorias ni evita la contaminación del semen con los fluidos prepuciales (Peña, 1997). 2.3.2.4. Electroeyaculación En perros domésticos, la estimulación eléctrica es uno de los métodos menos utilizados para la obtención de semen. De manera general, el equipo está constituido por un electrodo bipolar conectado a una fuente variable de corriente alterna. Su funcionamiento consiste en la introducción del mismo vía rectal hasta situarlo a nivel de la próstata. Una vez allí, se comienza la aplicación de descargas de diferentes intensidades y de forma alternativa, siendo el protocolo más utilizado el consistente en utilizar estímulos de 3 segundos para detenerse otros 3, aplicándose en sesiones de 3 series de 30 a 40 estímulos cada una. Estas descargas actúan sobre los nervios que controlan el sistema reproductivo, produciendo la eyaculación (Howard y cols., 1986). Este método de recogida seminal se considera una técnica eficaz y normalmente utilizada para la obtención de semen en cánidos salvajes como el lobo o el zorro. Sin embargo, Revisión Bibliográfica en el perro, este sistema sólo es indicado en circunstancias muy específicas, como por ejemplo, en animales con daño medular (Howard y cols., 1986; Root, 2005a; Ohl y cols., 2010). Entre los inconvenientes de este procedimiento se citan la necesidad de someter al animal a una anestesia general (Feldman y Nelson, 2007) y una peor calidad seminal cuando se comparan con las muestras recogidas por estimulación manual (Ohl y cols., 1994). 2.3.2.5. Farmacología Aunque no existen trabajos rigurosos que especifiquen con absoluta claridad como este método de recogida puede afectar a la calidad del semen (Kutzler, 2005), sí que se han realizado estudios preliminares para determinar si la eyaculación puede ser inducida por agentes farmacológicos. Como resultado de los mismos, se ha concluido que este tipo de estimulación podría ser utilizada en animales que no son capaces de eyacular mediante estimulación manual (casos en que el animal sufra dolor o temor), así como si tampoco la electroeyaculación fuera una posibilidad factible. Entre los protocolos que se han testado, se ha descrito como la administración intravenosa de una dilución de hidroclorato de pilocarpina se mostró efectiva para conseguir un incremento en el volumen del eyaculado (Juniewicz y cols., 1989). Otros autores, mediante la utilización farmacológica de xilacina e imipramina combinada (Kutzler, 2005a), han conseguido inducir la eyaculación, si bien ésta se encontraba asociada a un detrimento de la calidad del semen debido a que parte de los mismos se redirigieron hacia la vejiga. Finalmente, también se han testado otras sustancias farmacológicas como las prostaglandinas F2-α, GnRH, inhibidores de prolactina (cabergolina) y nutricéuticos como las glicosaminoglicanos y antioxidantes (Hess, 2006), para comprobar su influencia sobre la calidad seminal. 2.3.2.6. Punción epididimaria Como se ha citado con anterioridad, la cola del epidídimo contiene la mayor parte de los espermatozoides maduros. De ahí, su interés como fuente de extracción de semen y que se hayan realizado estudios para valorar el volumen testicular, el área epididimaria y los parámetros seminales, con el fin de establecer la relación que entre ellos podría existir (England, 1991). Sin embargo, la obtención de semen directamente de la cola del epidídimo y conductos deferentes es uno de los métodos menos utilizados. Este procedimiento se lleva a cabo tras la orquidectomía o en perros vasectomizados (Hewitt, 2001). Revisión Bibliográfica 2.3.3. Factores que determinan la eyaculación y la calidad del semen La eyaculación y, por tanto, la calidad del semen secretado durante la misma, vienen determinados por múltiples aspectos que pueden influir sobre los mismos. A continuación, se describen brevemente los factores que pueden intervenir sobre los procesos relacionados con la eyaculación o/y modificar la calidad seminal. 2.3.3.1. Factores que pueden influir sobre el mecanismo de la eyaculación El estado físico y psicológico del animal son aspectos de vital importancia a la hora de conseguir una adecuada eyaculación. En primer lugar, a nivel físico, cualquier proceso que altere el equilibrio orgánico del perro podría traducirse en un descenso en la producción de testosterona y, con ello, una falta de líbido y de estimulación. Ejemplos pueden ser situaciones de desnutrición, existencia de enfermedades sistémicas, aplicaciones de fármacos, etc. Por otro lado, la edad del animal es determinante en este proceso; así, perros muy jóvenes pueden presentar falta de líbido consecuente a la inmadurez de su aparato reproductivo, mientras que en cánidos de avanzada edad, generalmente mayores de 8 años, puede existir una disminución de la excitación sexual (Hewitt, 2000). Otros factores capaces de afectar la correcta erección y eyaculación en la especie canina son los relacionados con el estado psíquico del animal. De este modo, aspectos como el entorno en el que se encuentre el animal, su estado de ánimo y el manejo al que sea sometido, pueden influir de forma definitiva en los resultados obtenidos (Hewitt, 2000; Kutzler, 2005; Root, 2005b; Feldman y Nelson, 2007). 2.3.3.2. Factores que afectan a la calidad del semen En la especie canina, la raza, el tamaño del ejemplar y, por tanto, el tamaño genital, son factores que influyen de forma concluyente en los parámetros seminales del individuo. Se han realizado numerosos estudios al respecto, pero en general se ha descrito como la producción espermática diaria y, por tanto, el número de espermatozoides en el eyaculado, se incrementa a medida que aumentan el peso y tamaño testicular (Johnston y cols., 2001; Feldman y Nelson, 2007). Revisión Bibliográfica Asimismo, existen algunos estudios que han establecido una aparente influencia de la raza con respecto a las características del eyaculado. Siguiendo esta línea, Olar y cols. (1983) intentaron determinar la relación existente entre el tamaño testicular, la producción diaria de espermatozoides, la cantidad de espermatozoides eyaculados y la reserva extragonadal de espermatozoides en la especie canina. De forma general se puede afirmar que canes de razas pequeñas producen un menor número de espermatozoides que los machos de razas grandes con testículos de mayor tamaño (Feldman y Nelson, 2007). Esta afirmación se encuentra relacionada con la mayor concentración espermática del eyaculado en perros de mayor talla ya que, se ha establecido que la producción espermática está directamente relacionada con los gramos de tejido testicular; de esta forma, aquellos ejemplares pertenecientes a razas pequeñas no son capaces de producir tantos espermatozoides como los de razas de mayor tamaño (Johnston y cols., 2001; Feldman y Nelson, 2007; Santana, 2009). Otro aspecto a tener en cuenta es la frecuencia de eyaculación o de la recogida seminal. Se ha demostrado que la frecuencia eyaculatoria posee un efecto directo sobre el volumen seminal y la concentración de espermatozoides, en cuanto a que produce una reducción en la cantidad que se encuentran almacenados en los epidídimos (Feldman y Nelson, 2007). De esta forma, se ha establecido que la cantidad de reserva espermática disminuye de forma drástica y rápida cuando la recogida seminal es diaria (Root, 2005a, b). De hecho, cuando se produce una segunda recogida seminal, en menos de dos horas después de la primera, el contenido de espermatozoides y el volumen eyaculado puede descender hasta un 50% con respecto a la primera (Root, 2005a), si bien los porcentajes de motilidad espermática, espermatozoides vivos y morfoanomalías no se ven afectadas en el eyaculado obtenido (England, 1999). En conclusión, la mayoría de los autores afirman que la calidad del semen no disminuye cuando se obtienen un máximo de dos eyaculados cada 2 días (England, 1999; Álamo, 2007). Por otro lado, sería necesario valorar los periodos de abstinencia o reposo sexual y su influencia sobre la calidad espermática. En primer lugar, se ha descrito un detrimento de la calidad del semen tras periodos prolongados de inactividad sexual, consecuencia de la acumulación de espermatozoides envejecidos en los conductos deferentes, que pueden llegar a representar aproximadamente un 10% del total en el eyaculado. Para evitar este efecto, antes de proceder a la recogida seminal con fines reproductivos, se aconseja que se realice previamente alguna recogida seminal con el objetivo de descartar este tipo de tipo de eyaculados y renovar los espermatozoides epididimarios (Peña, 1997; Hewitt, 2000; Root, 2005a). Revisión Bibliográfica La edad es otro de los factores determinantes en la calidad del semen de forma que, tanto perros muy jóvenes como muy mayores, suelen presentar una pobre calidad del semen (Johnston y cols., 2001). En la especie canina, la pubertad y, por tanto, el momento en el cual se comienza a producir espermatozoides a pleno rendimiento, es a los 9 meses aproximadamente. Sin embargo, se ha confirmado que los primeros eyaculados en los machos caninos después de alcanzar la pubertad se caracterizan por presentar a menudo espermatozoides anormales y muertos (Johnston y cols., 2001). Por otro lado, se ha establecido que el perro mantiene su nivel reproductivo y/o nivel de fertilidad máxima hasta los 4-5 años de edad; a partir de este momento, la calidad del eyaculado sufre una disminución sobre todo en referencia a la concentración seminal (Peña, 1997; Hewitt, 2000, Álamo, 2007, Feldman y Nelson, 2007). Otros trabajos han descrito como en perros menores a 6 años de las razas Dálmata y Rottweiller, la calidad del semen era significativamente mejor en cuanto a motilidad y concentración, que en animales de edades superiores (Schubert y cols., 1991; Seager y Schubert, 1996). Sin embargo, otros trabajos concluyen que la espermatogénesis por sí sola no disminuye durante el envejecimiento del animal (Peters y cols., 2000). Otros aspectos como el fotoperiodo y la temperatura ambiental, también ejercen su función sobre la calidad del eyaculado, habiéndose determinado que la estación reproductiva es determinante en parámetros como la concentración de espermatozoides. En este sentido, se ha descrito la existencia de valores máximos en primavera e inicios de verano y menores a final de verano y comienzo del otoño, aunque se asume que un perro sin alteraciones debe ser fértil durante todo el año (Feldman y Nelson, 2007). Esto puede estar relacionado con la influencia que las estaciones puede ejercer a nivel hormonal; por ejemplo, Mello y cols. (2006) citan como en perros localizados en zonas tropicales se ha observado una disminución de la concentración de testosterona durante el verano, lo que podría llegar a reflejarse en la calidad seminal. Sin embargo, se ha descrito que las variaciones estacionales producen sólo ligeros cambios a nivel reproductivo, concluyendo que en perros saludables, la producción de semen y fertilidad se mantiene constante a través de todo el año (Ortega-Pacheco y cols., 2006). Finalmente, otros factores que pueden disminuir la producción de semen son la exposición a radiaciones, el contacto con productos tóxicos, el exceso de calor en el área reproductiva, la falta de vitamina A, etc… (Hewitt, 2000; Feldman y Nelson, 2007). Revisión Bibliográfica 2.5. VALORACIÓN SEMINAL La valoración seminal en la especie canina consiste en realizar un estudio de los parámetros que determinan las características del semen. Para realizar este tipo de análisis existen numerosos métodos, aunque se suele comenzar con la determinación de los aspectos observables macroscópicamente como son volumen, color y olor del eyaculado. A continuación se procede a realizar la valoración de los parámetros microscópicos como la motilidad espermática, la concentración, la vitalidad, el porcentaje de morfoanomalías y estado del acrosoma (Peña, 1997; Johnston y cols., 2001). 2.4.1. Estudio macroscópico Tras la recogida, el estudio del semen comienza con la evaluación de aquellos parámetros observables de forma directa a través del tubo colector graduado de cristal o plástico, habitualmente transparente (Peña, 1997). 2.4.1.1. Color En la especie canina, el color normal es el blanco opalescente, si bien su intensidad puede modificarse cuando varía la concentración del eyaculado. En función de esto, cualquier diferencia de coloración se asume como una alteración en el eyaculado (Peña, 1997; Feldman y Nelson, 2007). Las modificaciones más habituales son debidas a la presencia de sangre de origen prostático, testicular o peneano, que dota al semen de una tonalidad roja o marronácea. Por otro lado, si la apariencia del eyaculado es de un color verdoso puede ser indicativo de exudado purulento procedente de una infección genital, mientras la presencia de coloraciones amarillentas pueden aparecer en el caso de contaminarse con orina o exudado inflamatorio (Peña, 1997; Johnston y cols., 2001; Root, 2005a; Feldman y Nelson, 2007). 2.4.1.2. Volumen El volumen del eyaculado es un parámetro de importancia a la hora de evaluar el semen (Johnston y cols., 2001; Root, 2005a; Santana, 2009). Sin embargo, al tratarse de un parámetro variable en función de la edad y tamaño del ejemplar, la frecuencia de recogida y la cantidad de fracción prostática, suele ser muy inconstante y, por tanto, no es referente a la hora de determinar la calidad seminal (Feldman y Nelson, 2007). Debido a esta variabilidad, es difícil establecer con claridad el volumen medio del eyaculado en la especie canina, siendo numerosos los autores que intentan definir este Revisión Bibliográfica significativamente inferior cuando el porcentaje de morfoanomalías supera el 60% (Oettlé, 1993; Johnston y cols., 2001). Las técnicas existentes para valorar la morfología que presentan los espermatozoides son muy variadas. El método más sencillo consiste en tomar una gota del semen fresco sin diluir y depositarlo entre un portaobjetos y un cubreobjetos con el fin de formar una fina capa de espermatozoides que pueda ser valorada sin coloración mediante microscopía de contraste de fases (Root, 2005a; Feldman y Nelson, 2007). Sin embargo, otras técnicas más específicas se basan en la realización de un frotis seminal y su combinación con determinadas tinciones que permitan la evaluación de las características morfológicas de los espermatozoides, como pueden ser la integridad de la membrana plasmática, el estado de capacitación y reacción acrosomal. Una de las técnicas más habitualmente utilizadas es la tinción con eosina-nigrosina, elaborada a base de una combinación de ambos colorantes. Se inicia depositando una gota de semen y una gota de tinción eosina-nigrosina (del mismo volumen) sobre un portaobjetos, para tras realizar una extensión fina de la muestra, se valore en un microscopio de contraste de fase con objetivo de inmersión a 100X. Al realizar un recuento de 100 o 200 espermatozoides, se puede estimar el porcentaje de ellos que se encuentran no teñidos, es decir, incoloros y, por tanto, vivos, así como el porcentaje de teñidos (muertos), así como su morofología (Allen, 1992; Root, 1998; Johnston y cols., 2001; Peña, 2004; Root, 2005a; Batista y cols., 2006). Otro tipo de tinción es la denominada tinción Spermac, capaz de teñir de distintos colores las diferentes partes del espermatozoide de modo que el núcleo espermático queda teñido de rojo, mientras que el acrosoma, pieza intermedia y cola se tiñen de verde (Rota y cols., 2007). Por el contrario, la tinción Wright-Giemsa como el Diff Quick, efectiva y de fácil disponibilidad, presenta el inconveniente de no teñir el área acrosómica del espermatozoide (Johnston y cols., 2001; Feldman y Nelson, 2007; Santana, 2009). No obstante, algunos autores han descrito como los sistemas basados en el uso de tinciones presentan el inconveniente de poder modificar los resultados de morfoanomalías espermáticas, alterando la objetividad del procedimiento. Este tipo de estudios permite concluir que pueden existir amplias variaciones de los resultados dependiendo de la técnica utilizada, el laboratorio que la lleve a cabo, así como resultado de evaluar la morfología espermática con tinciones realizadas manualmente y de forma subjetiva (Root, 1998; Peña, 2004; Rijsselaere y cols., 2004a; Verstegen y cols., 2005). Como consecuencia, se ha propuesto la utilidad de Revisión Bibliográfica combinar los métodos tradicionales de tinción con las técnicas de análisis de imagen, para la evaluación de cambios estructurales en la morfología de los espermatozoides (Dahlbom, 1997). En este sentido, en los últimos años se han puesto en práctica la combinación de tinciones fluorescentes que permiten el examen de las características funcionales de los espermatozoides sin necesidad de inmovilizarlos (citometría de flujo) y el análisis mediante la utilización de sistemas como el CASA, con el que se obtiene información detallada y objetiva de características morfométricas con la consiguiente estandarización y validación de este tipo de determinaciones (Rijsselaere y cols., 2004a; Verstegen y cols., 2005). 2.4.2.4. Vitalidad espermática El estudio del semen para determinar la cantidad de espermatozoides que se encuentran vivos o muertos se conoce con el nombre de vitalidad espermática. La principal técnica utilizada para valorar este parámetro es la utilización de tinciones supravitales, elaboradas a partir de colorantes vitales como la eosina-nigrosina, eosina-azul anilina, trypan blue o el hypo-osmotic swelling test (HOST), capaces de teñir a los espermatozoides en función de la integridad y permeabilidad de la membrana plasmática (Peña, 2004). Entre ellas, la tinción eosina-nigrosina suele ser la técnica de tinción de elección dada su rapidez y sencillez de preparación, constituyendo el procedimiento más ampliamente utilizado hasta hace pocos años. El fundamento de este sistema se basa en la alteración que se ocasiona en la membrana plasmática de aquellos espermatozoides dañados y/o muertos y, en consecuencia, la entrada del colorante hacia el interior de las células alteradas y permeables que quedan totalmente teñida de color rosa (England y Ponzio, 1996; England, 1999; Iguer-Ouada y Verstegen, 2001a, b; Peña, 2004; Verstegen y cols., 2005; Santana 2009). Estudios más recientes han demostrado la eficacia de sistemas computerizados para determinar la vitalidad espermática en un pool de semen canino. Este tipo de trabajos permite estimar rápidamente la calidad del semen a través del análisis simultáneo de miles de células en una misma muestra, utilizando, por ejemplo, sistemas de citometría de flujo unido a tinciones de fluorescencia dobles o triples (Rijsselaere y cols., 2004a). De hecho, la viabilidad espermática es el principal parámetro estudiado mediante estos sistemas, siendo valorado en función de la integridad de la membrana de los espermatozoides. Otros trabajos, realizados con el fin de comparar la viabilidad de los espermatozoides caninos en citometría de flujo frente a las técnicas de tinción con eosina-nigrosina, han mostrado una alta correlación en los resultados obtenidos por ambos métodos (Peña y cols., 1998c; Peña y cols., 1999; Peña y cols., 2001). Revisión Bibliográfica Se considera que, a pesar de que algunos trabajos hayan registrados valores entre un 85 y un 95% de vitalidad, el valor medio de un semen fresco debe ser superior al 90% (Peña, 1997; Rijsselaere y cols., 2004a; Álamo, 2007). 2.4.2.5. Acrosomías El acrosoma corresponde a una estructura situada en la mitad anterior de la cabeza del espermatozoide. En la especie canina, adquiere una forma acuminada a modo de capuchón (Feldman y Nelson, 2007), por lo que las alteraciones más frecuentes suelen corresponder con acrosomas desprendidos o prominentes. La valoración de esta estructura presenta gran interés a la hora de determinar la calidad seminal de un eyaculado, sobre todo en los protocolos de congelación y descongelación seminal, ya que la separación del acrosoma antes de tiempo ,se relaciona con el proceso de capacitación espermática prematuro y, por tanto, inefectivo. Por el contrario, una pequeña cantidad de acrosomas anormales en el semen canino no implica consecuencias relevantes (Allen, 1992; Feldman y Nelson, 2007). En general, se ha determinado que el porcentaje de acrosomas normales en el semen fresco canino debe situarse entre el 85 y el 95% (England y Ponzio, 1996). En la especie canina, se pueden utilizar diversas técnicas para evaluar el estado de los acrosomas: técnicas de tinción para microscopio de campo claro, uso de marcadores fluorescentes y test de endósmosis, estudio de muestras seminales con microscopía de contraste de fase o interferencia de contrastes, etc... (Peña, 1997). En la actualidad, se sigue haciendo uso de tinciones no fluorescentes (Trypan blue y Giemsa o Trypan blue, Bismarck Brown y Rosa de Bengala) para la estimación combinada de vitalidad, morfoanomalías y acrosomías; se trata de tinciones óptimas para evaluar el semen fresco, existiendo otras tinciones como el Spermac® de mayor utilidad a la hora de evaluar semen congelado, si bien presenta el inconveniente de no hacer distinción entre espermatozoides vivos y muertos (Peña, 2004; Rijsselaere y cols., 2005). No obstante, al igual que sucede para otros parámetros seminales, la tendencia actual es la utilización de métodos más objetivos como las tinciones fluorescentes analizadas a través del uso de microscopia fluorescente o citometría de flujo, que nos permite discriminar perfectamente los acrosomas intactos y los alterados (Peña y cols., 2001; Peña, 2004). Revisión Bibliográfica 2.4.2.6. Pruebas de viabilidad espermática I. Capacitación espermática La capacitación espermática es un proceso que sucede en el espermatozoide cuando interactúan con las sustancias presentes en el tracto reproductivo femenino, necesario para que se produzca la fecundación. Para que este fenómeno acontezca, en el espermatozoide debe producirse una serie de cambios bioquímicos a nivel celular (Petrunkina y cols., 2003; Albarracín y cols., 2005). Numerosos trabajos se han realizado con el objeto de determinar la capacidad de los espermatozoides para realizar la capacitación espermática in vitro. Algunos autores han confirmado que este proceso puede completarse en un medio sin la adición de glucosa ni de ningún otro azúcar como fuente de energía (Petrunkina y cols., 2003; Albarracín y cols., 2004). Por otro lado, se ha comprobado que uno de los factores más concluyentes para que posteriormente se produzca la reacción acrosómica es la concentración de calcio en el diluyente espermático; de hecho, una alta concentración de este ión incrementa los niveles de reacción acrosómica, si bien este proceso viene también influenciado por la temperatura (Sirivaidyapong y cols., 2000). Asimismo, otros ensayos describen como que la adición de fluoresceinated lectins (Pisum sativatum agglutinin–PSA-, Peanut agglutinin-PNA-) era altamente tóxica cuando se añadía a muestras de semen incubadas en condiciones de capacitación; sin embargo, no se detectaba ninguna toxicidad cuando las muestras de semen tanto fresco como congelado eran incubadas en un Tris-buffer o en el diluyente de criopreservación, respectivamente (Peña, 2004). Finalmente, otro estudio realizado por Martins-Bessa y cols. (2009) valoró el efecto de la suplementación con taurina, hipotaurina y diferentes concentraciones de ionóforo en la reacción acrosómica en espermatozoides descongelados. En este trabajo se comprobó que existía un alto porcentaje de reacción acrosómica en semen canino congelado-descongelado tras haberle adicionado entre 2.5 y 10 mM de ionóforo calcio; sin embargo, la incorporación de taurina e hipotaurina no tuvo efecto sobre este tipo de parámetro seminal. II. Test hiposmótico El test hiposmótico constituye uno de los métodos indirectos más frecuentemente utilizados gracias a su fiabilidad y repetibilidad a la hora de determinar la integridad de la membrana plasmática de los espermatozoides en la especie canina (England y Plummer, 1993; RodríguezGil, 1993; Martins-Bessa y cols. 2006). Revisión Bibliográfica El test se basa en la peculiaridad que presentan los espermatozoides caninos para distenderse en condiciones hiposmóticas, resultado de la entrada de agua y consecuente expansión de la membrana de los espermatozoides (Kumi-Diaka, 1993). Posteriormente, el resultado se obtiene estableciendo el número de espermatozoides incrementados de volumen, valor que es inversamente proporcional al número de espermatozoides con la membrana dañada; en otras palabras, se basa en la incapacidad de los espermatozoides dañados de incrementar de tamaño (England y Plummer y cols., 1993). 2.4.2.7. Otros aspectos a valorar del semen: El eyaculado del perro se caracteriza por tener una amplia composición. Aparte de los espermatozoides procedentes de testículos y los fluidos prostáticos, está constituido por diversos tipos celulares como eritrocitos, células epiteliales, leucocitos, macrófagos, linfocitos (Allen, 1992; Johnston y cols., 2001; Feldman y Nelson, 2007), que en determinadas cantidades suelen ser indicativos de anomalías y/o presencia de patologías. La presencia de eritrocitos suele estar asociado a la existencia de una hemorragia a nivel de la glándula prostática o en el pene, apareciendo con una incidencia mayor en eyaculados de individuos mayores de 5 años. No obstante, no es indicativo necesariamente de enfermedad, si bien se considera inadecuada ya que dificulta la motilidad espermática (Allen, 1992; Feldman y Nelson, 2007). Asimismo, las células epiteliales suelen asociarse a una contaminación uretral o prepucial del semen tras grandes periodos de reposo sexual (Feldman y Nelson, 2007), mientras la aparición de gran cantidad de leucocitos en el semen sugiere la presencia de una infección (Hewitt, 2000). 2.4.3. Estudio bioquímico A la hora de determinar el pH de un eyaculado, habitualmente se utiliza el pH de la tercera fracción del eyaculado siendo, por tanto, la fracción prostática la que determina dicho valor (Johnston y cols., 2001; Kustritz, 2005). El valor del pH seminal habitual en la especie canina es de 6,5, si bien se consideran normal cuando se sitúan dentro de un rango de entre 6.3 y 6.7 (Bartlett, 1962; Hewitt, 2000; Johnston y cols., 2001). Por tanto, un aumento por encima de estos registros indicaría alteraciones como la existencia de una eyaculación incompleta o de patologías de origen inflamatorio a nivel testicular, epididimario o de la glándula prostática (Feldman y Nelson, 2007). Revisión Bibliográfica Por otro lado, la presión osmótica se considera un parámetro de interés debido a la intensa relación entre osmolaridad y el punto crioscópico del semen. Los valores de osmolaridad en el perro alcanzan registros de 300mOsm de concentración, cuando el punto crioscópico de la muestra se sitúa en -0.55ºC (Peña, 1997). 2.5. DILUYENTES SEMINALES Los espermatozoides pueden conservarse durante largos periodos de tiempo mediante la reducción de su actividad metabólica, lo que se consigue con la dilución en un medio adaptado a cada especie y una reducción de temperatura adecuada (Pinto, 2005). La refrigeración y la congelación se consideran los principales procesos utilizados para disminuir la tasa metabólica del semen, que puede conservarse y prolongar la vida espermática (Stornelli y cols., 2006). Para ello, el eyaculado debe ser procesado, diluido y enfriado de una manera particular en función de sus características, lo que le permite su preservación a lo largo del tiempo y que permanezca fértil (Feldman y Nelson, 2007). Para que esto sea posible, es necesario adicionarle diluyentes seminales, que son medios elaborados a partir de una serie de componentes capaces de conservar el semen, impidiendo su deterioro (Celma, 2004; Pinto, 2005; Álamo, 2007). Estas sustancias tienen la capacidad de aportar los nutrientes necesarios para al mantenimiento metabólico de los espermatozoides, proteger a las membranas de los espermatozoides de los daños que ocasionan los cambios de temperatura mientras que, a su vez, estabilizan el pH, evitan el desarrollo microbiano y controlan la osmolaridad y la concentración iónica del medio (Linde-Forberg, 1991; Johnston y cols., 2001; Pinto, 2005). El semen de cada especie animal presenta unas peculiaridades propias a las que el diluyente debe adaptarse (Holt, 2000). A continuación se describen brevemente los principales componentes de los diluyentes seminales en la especie canina. 2.5.1. Componentes básicos de un diluyente 2.5.1.1. Fuentes de energía Las principales fuentes de energía utilizadas por los espermatozoides para mantener su metabolismo y generar el movimiento flagelar que le permita desplazarse, son los azúcares simples como dio tri-sacáridos y azucares glicozables como la glucosa, fructosa y manosa (Álamo, 2007; Feldman y Nelson, 2007). Revisión Bibliográfica 2.5.1.2. Soluciones tampones y electrolitos Los diluyentes seminales deben presentar componentes iónicos y no iónicos que permitan mantener unos valores constantes de osmolaridad y pH. Así, el pH óptimo de los diluyentes caninos debe ser de entre 6.75 y 7.50, mientras que la osmolaridad se debe situar entre los 300 y 325 mOSm (Johnston y cols., 2001). Este tipo de sustancias son, entre otras, el citrato sódico, leche desnatada en polvo, leche desnatada uperizada, lactosa, ácido cítrico, TES (N-Tris hidroximetil-2-aminometano ácido sulfónico), PIPES (piperazina etano ácido sulfónico) e hidróxido potásico, si bien el Tris (Tris hidroximetil aminometano) es el más utilizado (Peña y Linde-Forsberg, 2000; Celma, 2004). 2.5.1.3. Estabilizadores de membrana Existen sustancias orgánicas como las proteínas de la leche, la yema de huevo y la albúmina sérica bovina capaces de proteger a los espermatozoides contra el choque frío durante el enfriamiento, preservando las membranas acrosómicas y mitocondrial de los mismos (Johnston y cols., 2001; Feldman y Nelson, 2007). Uno de los más utilizados es la yema de huevo, ya que sus fosfolípidos y proteínas de baja densidad tienen la capacidad de proteger a los espermatozoides del shock por frío (Stornelli y cols., 2006). Además, la función de este tipo de sustancias se puede potenciar con la adición de otras como el Equex STM en pasta, que se suele añadir al diluyente para maximizar el efecto protector de la yema de huevo (Peña y Linde-Forsberg, 2000; Peña y cols., 2006). Por otro lado, los crioprotectores son sustancias sustancias que actúan a distintos niveles para mantener la capacidad de la célula de adaptarse a los distintos procesos de dilución y descenso de temperatura que sufren cuando se conserva, minimizando los efectos de la pérdida osmótica de agua celular producida por los solutos extracelulares y disminuyen el punto crioscópico intracelular (Cabrera, 1999; Pinto, 2005). Los crioprotectoraes más utilizados en el preservación seminal en la especie canina son el DMSO (dimetilsulfóxido) y el glicerol (Andersen, 1975; Peña y Linde-Forsberg, 2000; Hewitt y cols., 2001; Silva y cols., 2006). 2.5.1.4. Antibióticos Este tipo de sustancias sirven para controlar el crecimiento microbiano, que puede verse favorecido por algunos componentes de los diluyentes como la glucosa y por las temperaturas a las que se conserva el semen. Los antibióticos más habitualmente usados son la penicilina y la estreptomicina (Pinto, 2005). Revisión Bibliográfica 2.5.1.5. Otros componentes Para elaborar los diluyentes seminales, resulta fundamental incluir en su composición aquellas sustancias destinadas a disolver los componentes que lo conformen. Para ello, se suelen utilizar sustancias como el agua bidestilada o ultrapura (Celma, 2004; Álamo, 2007). Finalmente, en función de las variantes de diluyentes que se elaboren, son diversos los componentes que se pueden añadir. Es el caso de los aditivos, como enzimas (α y β-amilasa, βglucuronidasa, catalasa), detergentes (SDS-dodecil sulfato sódico, STLS-trietanolamina laurel sulfato sódico), aminoácidos (alanina, prolina, glicina-betaína, glicina-betaína+prolina) y otros compuestos (cafeína, prostaglandinas) que pueden mejorar la fertilidad (Thomas y cols., 1993; Peña y Linde-Forsberg, 2000). 2.5.2. Efecto de los diluyentes sobre las propiedades de los espermatozoides En la actualidad, son múltiples los estudios que se están realizando con la finalidad de encontrar y perfeccionar la composición de los diluyentes utilizados para conservar el semen, tanto en refrigeración como en congelación. Los estudios basados en la influencia del tipo de azúcares sobre las características del semen han confirmado una notable modificación de diferentes parámetros seminales, en función del tipo de azúcar empleado. Por ejemplo, Rigau y cols. (2001) describieron como el uso de fructosa como fuente de energía inducía un patrón de motilidad lineal en los espermatozoides, mientras que la glucosa ocasionaba que éstos se moviesen de forma más oscilatoria. Mientras, otros trabajos al respecto han comprobado que la adición de azúcares a los diluyentes no mejoró la motilidad ni la viabilidad durante el equilibrado, mientras que el porcentaje de acrosomas dañados en las células espermáticas se redujo cuando se utilizó galactosa, lactosa, trehalosa, maltosa y sucrosa en el medio (Yildiz y cols., 2000). Por otro lado, algunos autores han determinado que la concentración de calcio en el diluyente espermático tiene relación directa con la reacción acrosómica en los espermatozoides de perro. Unas concentraciones de calcio elevadas en el medio permiten que la reacción acrosómica se potencie en mayor medida, siendo un factor que se encuentra influenciado además por la temperatura (Sirivaidyapong y cols., 2000). Revisión Bibliográfica Uno de los aspectos más estudiados en la composición de los diluyentes seminales en la especie canina es el uso del Equex. Ciertos trabajos al respecto, sugieren que este detergente como parte del diluyentes beneficia la motilidad de los espermatozoides después de la criopreservación (Alhaider y Watson, 2006), comprobando como los espermatozoides congelados con medios que contenían Equex eran más resistentes a los efectos del congelado que los congelados con diluyentes sin este componente (Alhaider y Watson, 2006); no obstante, este trabajo sugiere que la respuesta de los espermatozoides a la adición de Equex en perros varía de manera individual. Asimismo, Peña y cols. (2003) habían observado resultados semejantes en un estudio previo realizado en la especie canina. En este trabajo se comparaba el uso de diferentes tipos de Equex comerciales y los efectos que tenían sobre la supervivencia, longevidad y concentraciones de calcio intracelulares en espermatozoides congelados-descongelados; entre las conclusiones de este estudio se indica que la adición de 0.5% de Equex STM en pasta a los diluyentes seminales mejoraba significativamente la longevidad in vitro de los espermatozoides y prolongaba su supervivencia, lo que parece obedecer a un incremento de las concentraciones intracelulares de calcio. Este principio se repitió en muestras de semen extraídas del epidídimo de perro donde, la utilización de Equex STM en pasta, previno el daño en la integridad de la membrana inducida por la criopreservación y prolongó la motilidad durante la incubación in vitro tras la descongelación (Ponglowhapan y Chatdarong, 2008). Por otro lado, se han realizado trabajos donde se compara el uso de diluyentes con Equex frente a diluyentes con un 6% LDL (lipoproteínas de baja densidad) comercializado en forma de kit comercial, observándose que ambos presentan las mismas cualidades crioprotectoras (Bencharif y cols., 2010). Otro de los aspectos valorados en la manipulación de los diluyentes es la capacidad de aumentar los índices de fertilidad del semen congelado mediante la adición de sustancias como la taurina y la hipotaurina, habiéndose comprobado que el uso de las mismas no es efectivo con tal fin (Martins-Bessa y cols., 2009). 2.5.3. Clasificación de los diluyentes El proceso de dilución y preservación seminal mediante frío es diferente en función de si se pretende refrigerar o congelar el semen. Con este fin, son múltiples las variedades de diluyentes que se han desarrollado, pudiendo clasificarse en base a la naturaleza de los componentes utilizados para su elaboración. Revisión Bibliográfica 2.5.3.1. Diluyentes naturales Los diluyentes naturales son aquellos elaborados básicamente a partir de distintas variedades de leche, ya sean de origen animal o vegetal. La elección del diluyente de tales características depende de la relación precio-calidad, del tiempo de transporte, y del tiempo de conservación previo inseminación. Este tipo de diluyentes es más utilizado en la conservación seminal de rumiantes, si bien se han descrito algunos de uso canino (Celma, 2004; Pinto, 2005). 2.5.3.2. Diluyentes sintéticos Se caracterizan por tener sustancias amortiguadoras como Tris ó citrato, fuentes de energía a base de glucosa o fructosa y protectores de las membranas celulares como la yema de huevo (Celma, 2004). Dentro de este grupo existe gran variedad de diluyentes, en los que a partir de una solución acuosa, se incorporan distintas sustancias sintéticas como ácido cítrico, citrato de sodio dihidrato, glucosa, fructosa, yema de huevo, glicerol, antibióticos, etc., en distintas cantidades para crear diferentes combinaciones de diluyentes (Linde-Forsberg, 1995; Iguer-Ouada y Verstegen, 2001c; Peña y cols., 2006; Feldman y Nelson, 2007). 2.6. CONSERVACIÓN DEL SEMEN CANINO 2.6.1. Semen fresco De manera general, para mantener la calidad del semen, éste no debe ser sometido a cambios bruscos de temperatura, alteraciones mecánicas fuertes como una excesiva agitación, ni contacto con sustancias como el agua, germicidas y detergentes. No obstante, de todos ellos, la temperatura es el factor que más se ha estudiado debido a que los espermatozoides de la especie canina pueden fácilmente sufrir shock térmico por calor; sin embargo, se muestran más resistentes al frío que en otras especies (Kutzler, 2005). Por esta razón, tras la correspondiente recogida seminal, el semen canino se debe conservar en baño María a 37ºC en los tubos calibrados de plástico o cristal donde se depositó durante la recogida, evitando alteraciones hasta el momento de su utilización. Si esto no fuera posible, no debemos permitir que la muestra se enfríe con demasiada rapidez, utilizándola siempre antes de 15 minutos tras la recogida (Allen, 1992). Revisión Bibliográfica frescos de baja calidad que no son capaces de soportar este tipo de procesado, siendo prácticamente inservibles tras la descongelación. Es por ello que antes de comenzar con el proceso de congelación seminal, siempre se debe realizar una correcta evaluación de todo semen considerado interesante de criopreservarse (Johnston y cols., 2001; Feldman y Nelson, 2007). En función de la metodología de trabajo, pueden diferir los parámetros evaluados para decidir si una muestra de semen se debe someter al proceso congelación. Sin embargo, la mayor parte de los estudios tienen en común que se debería realizar la valoración del volumen, la motilidad espermática (subjetiva o mediante sistemas computerizados), la concentración, la vitalidad y/o la morfología espermáticas (England y Ponzio, 1996; Ivanova-Kicheva y cols. 1997; Peña y cols., 1998a, b; Hori y cols., 2006; Martins-Bessa y cols., 2009). En base a estos parámetros, cada estudio establece sus propios requisitos a la hora de determinar si un semen presenta la suficiente calidad para ser o no congelado. Así, Martins-Bessa y cols. (2006) solo procesaban eyaculados que presentasen al menos un 75% de motilidad progresiva, un 75% de espermatozoides de morfología normal y una concentración de 250 x 106 de espermatozoides totales, mientras Peña y cols. (2003) congelaban eyaculados con valores medios de motilidades y de células normales en torno al 85% y concentraciones de entre 250 y 450 millones de espermatozoides aproximadamente. Otros trabajos establecen los valores medios para considerar un semen canino apto cuando se encuentran en más de 80% de motilidad y por encima del 80% de espermatozoides de morfología normal (Hermansson y Linde-Forsberg, 2006). 2.6.3.3. Dilución de eyaculados, proceso y tasa de dilución Antes de comenzar con la dilución y procesado de los espermatozoides, algunos autores realizan “lavados” del semen. Este proceso tiene por objeto eliminar el plasma seminal antes de resuspender el pellet con el correspondiente diluyente de congelación. Peña y cols. (2006), tras la recogida seminal, diluyen el semen con un diluyente a base de Tris, glucosa, ácido cítrico y antibióticos en proporción 1:1, centrifuga durante 8 minutos a 700 g y elimina el plasma seminal. Sin embargo, otros autores prefieren centrifugar directamente el semen a 700 g durante 5-6 minutos, sin añadir ningún tipo de medio previamente (Peña y cols., 2003; Hermansson y LindeForsberg, 2006; Martins-Bessa y cols., 2006; Rota y cols., 2006; Schäfer-Somi y cols., 2006). Revisión Bibliográfica A continuación debe definirse el volumen de diluyente que debe añadirse a la muestra de semen para almacenar una cantidad determinada de espermatozoides por dosis seminal, lo que se conoce como tasa de dilución; este parámetro puede variar dependiendo del grupo de trabajo. Un estudio sobre el grado de dilución óptimo para obtener una mejor calidad de semen post-descongelación, evaluó la respuesta del mismo al congelarse en diluciones de 50, 100, 200 y 400 millones de espermatozoides por mililitro, estimándose que los mejores resultados se obtenían cuando la concentración de la dilución seminal a criopreservar era de 200 x 106 espermatozoides/ml (Peña y Linde-Forsberg, 2000a). Otros autores (Peña y cols., 2003; Hermansson y Linde-Forsberg, 2006; Peña y cols., 2006) diluyen el semen de forma que obtienen una concentración final de 150-200 millones de espermatozoides/ml, mientras que otros trabajos prefieren utilizar concentraciones inferiores como 50-80 x 106 espermatozoides/ml (Martins-Bessa y cols., 2006; Martins-Bessa y cols., 2007; Martins-Bessa y cols., 2009). No obstante, Okano y cols. (2004) no encontraron influencia del ratio de dilución y la concentración de espermatozoides/ml de dilución final, sobre las características del semen ras la descongelación. 2.6.3.4. Principales diluyentes utilizados en congelación seminal en el perro La principal diferencia entre los diluyentes de refrigeración y los de congelación viene determinada por el uso que en estos últimos se hace de los crioprotectores, sustancias que ayudan a mantener la integridad de la membrana celular durante los procesos de congelacióndescongelación (Root, 2005a). De ahí, que la composición y el uso de los diluyentes intervengan directamente en la congelabilidad del semen, si bien no tienen la capacidad de mejorar directamente su cualidades para ser congelado cuando la calidad seminal es deficiente (Farstad, 2009). Al igual que sucede para los protocolos, tasas y métodos de congelación, existen diversas propuestas para fabricar los diluyentes de congelación para el semen canino (Root, 2005a). Así, los diluyentes más habitualmente empleados para la congelación seminal en la especie canina, suelen estar compuestos por una mezcla de un buffer como el Tris, ácido cítrico, una fuente de energía a base de glucosa o fructosa, protectores de membrana como la yema de huevo y agentes crioprotectores como el glicerol (Peña y Linde-Forsberg, 2000a; Peña y cols., 2006; Schäfer-Somi y cols., 2006; Farstad, 2009). Revisión Bibliográfica El glicerol es el crioprotector más frecuentemente utilizado para la congelación seminal en diferentes especies, entre ellas la canina (Silva y cols., 2003). La adición del glicerol, y el papel que este juega sobre la calidad del semen en la descongelación, es uno de los aspectos más limitantes en el proceso de crioconservación y, por tanto, uno de los más estudiados (Peña y cols., 1998b; Peña y Linde-Forsberg, 2000b; Silva y cols., 2003; Martins-Bessa y cols., 2006; Peña y cols., 2006; Rota y cols., 2006; Silva y cols., 2006). Los espermatozoides caninos son de los que mayor tolerancia presentan al glicerol (Peña y cols., 2006), soportando concentraciones de entre 4 y 5% y, por tanto, sobrellevando ratios de congelación más bajos (20-30ºC min), si bien se ha determinado que la motilidad espermática y la integridad del acrosoma era superiores cuando el diluyente estaba compuesto por un 8% de glicerol (Peña y cols., 1998b). Por otro lado, también se han realizado estudios para determinar la forma ideal de adicionar los diluyentes glicerolados al semen a criopreservar con el fin de minimizar el deterioro del mismo. Para determinar la manera más adecuada, se ha comparado los efectos que sobre la calidad del semen canino tenía el añadir el diluyente glicerolado en 1 solo paso o en 3 pasos a intervalos de 5 minutos (Silva y cols., 2003), como se suele hacer en otras especies como el caprino (Batista y cols., 2006; Batista y cols., 2009); los resultados indican que no existen diferencias importantes en la forma de añadir el diluyente, recomendándose, por tanto, la adición de 1 sola vez en base a su sencillez y practicidad (Silva y cols., 2003). El Equex representa uno de los componentes cruciales en la elaboración de los diluyentes seminales empleados en la congelación. De hecho, se ha comprobado como el uso del Equex STM Paste genera que los espermatozoides vivos tras la descongelación presenten una elevada concentración de calcio intracelular, siendo probable que este hecho sea un signo de crio-capacitación y de funcionalidad espermática, manteniendo la motilidad y la vitalidad durante largos periodos de tiempo (Peña, 2004). De hecho, estudios sobre los indicadores de viabilidad del semen canino demuestran que cuando los diluyentes contienen Equex, la termorresistencia de los espermatozoides aumenta considerablemente, incrementándose de forma más pronunciada cuando éste se adiciona tras el adecuado periodo de equilibrado, es decir, justo antes de la congelación (Peña y Linde-Forsberg, 2000b). A lo largo de la historia de la tecnología seminal los protocolos de congelación seminal y, por tanto, los diluyentes utilizados para este fin han ido modificándose paulatinamente. Uno de los más conocidos es el “diluyente de Andersen” elaborado a partir de 240 mM de Tris, 63 mM Revisión Bibliográfica de ácido cítrico, 70mM de fructosa, 8% de glicerol y 20% de yema de huevo (Yildiz y cols., 2000; Hewitt y cols., 2001; Milani y cols., 2010). Sin embargo, en la actualidad, el diluyente más utilizado es el “diluyente Upssala” (Peña y Linde-Forsberg, 2000a, b; Batista y cols., 2006; Hermansson y Linde-Forsberg, 2006; Schäfer-Somi y cols., 2006), que consta de dos diluyentes compuestos como a continuación se describe: - Diluyente 1: 2.4 g de Tris, 1.4 g de ácido cítrico, 0.8 g de glucosa, 0.06 g de Na bencilpenicilina, 0.1 g de estreptomicina sulfato, 20 ml de yema de huevo, 3 ml de glicerol (es decir, un 3% de glicerol) y hasta 100 ml de agua destilada. - Diluyente 2: 2.4 g de Tris, 1.4 g de ácido cítrico, 0.8 g de glucosa, 0.06 g de Na bencilpenicilina, 0.1 g de estreptomicina sulfato, 20 ml de yema de huevo, 7 ml de glicerol (es decir, un 7% de glicerol), un 1% (v/v) de Equex STM Paste y hasta 100 ml de agua destilada. No obstante, al igual que ocurría para el semen refrigerado existen diversas fórmulas comerciales destinadas a este uso, como el Freezing Medium, TEST York Buffer con glicerol 9971 de Irvine Scientific (Root, 2005a). Otro de los diluyentes comerciales más conocidos en la congelación del semen en la especie canina es el perteneciente al sistema CLONE (Cryogenetics Laboratories, New England). Este método de congelación comercial fue evaluado tras utilizarlo para crioconservar el semen canino, y los resultados concluyeron que la resistencia térmica era menor y la degradación acrosómica mayor cuando el semen era congelado con CLONE en lugar de procesado con diluyentes compuestos a base de Tris, fructosa, ácido cítrico, glicerol y huevo (Ström y cols., 1997). 2.6.3.5. Periodo de equilibrado y envasado del semen Tras la correcta dilución, el semen procesado debe comenzar a descender progresivamente su temperatura para adaptarse de forma paulatina a estos cambios, evitando posibles daños por shock térmico antes de la congelación (Álamo, 2007); es lo que se conoce con el nombre de periodo de equilibrado. El periodo de equilibrado puede realizarse en distintos etapas del proceso y con una duración variable. Si se utilizan diluyentes de congelación que incluyan detergentes tipo Equex, el procedimiento requiere de un período de equilibrado entre la adición del diluyente I (sin Equex) y del diluyente II (con Equex). De este modo, tras añadir al semen un diluyente glicerolado a temperatura ambiente, se realiza un periodo de equilibrado a 4-5ºC durante 60-75 minutos para Revisión Bibliográfica posteriormente añadir en frío la correspondiente fracción del diluyente con el Equex (Peña y Linde-Forsberg, 2000a; Martins-Bessa y cols., 2006; Peña y cols., 2006; Rota y cols., 2006; Martins-Bessa y cols., 2007), en ocasiones esperando incluso hasta 2 horas (Schäfer-Somi y cols., 2006). Asimismo, en alguno de los trabajos donde se usa el Equex en el segundo diluyente, se puede considerar que existe otro período de equilibrado de menor duración tras esta parte final de la dilución. En estos casos, antes almacenar el semen, y tras añadir el segundo diluyente, debemos esperar a 4ºC durante 10 (Rota y cols., 2006) o 15 minutos (Peña y cols., 2003). Otros autores prefieren equilibrar el semen a la misma temperatura pero durante un mayor periodo de tiempo, hasta 3 horas (Ivanova-Kicheva y cols., 1997). Es por ello que, dependiendo del protocolo de congelación, se pueden combinar diferentes tiempos de equilibrado, tanto previos como posteriores a la adición del diluyente I y II. Un estudio sobre este aspecto, realizado con los diluyentes elaborados a partir de los compuestos más habituales (Tris, citrato, glucosa y yema de huevo) determinó que los mejores resultados se alcanzaban cuando se combinaba el enfriamiento del semen a 4ºC durante 2 a 3 horas previa adición del diluyente II y, posteriormente 1 hora de periodo de equilibrado con el mismo. Sin embargo, cuando esta etapa de frío era de 3 horas, el efecto del periodo de equilibrado cuando éste se encontraba entre 0 y 4 horas era inexistente (Okano y cols., 2004). Tras la correspondiente dilución y equilibrado, debe realizarse el almacenaje del semen en dosis individuales. En la especie canina, el semen puede ser congelado en pellets, ampollas de vidrio o pajuelas, si bien la elección de uno u otro dependerá del grupo de investigación y la metodología de congelación. Los pellets, denominados también “píldoras” se forman cuando el semen refrigerado se deposita en alícuotas de 50 o 100 µl dentro de orificios existentes en placas de hielo seco, almacenándose posteriormente en recipientes de nailon perforados en nitrógeno líquido (Johnston y cols., 2001; Feldman y Nelson, 2007), obteniéndose los mejores resultados de supervivencia espermática cuando el volumen del pellet congelado en hielo seco era de 100 µl (Fahrig, 2000). Sin embargo, los pellets de hielo seco han sido evaluados frente al uso de tubos de aluminios de 5 ml como alternativa para el almacenaje del semen a congelar, confirmándose que en el semen criopreservado en los tubos presentaban una mejor calidad que los pellets (Ivanova-Kicheva y cols. 1997). Revisión Bibliográfica No obstante, el método de almacenaje más habitual consiste en depositar el semen en pajuelas de polivinilcloruro que se rellenan con el semen equilibrado, dejando siempre una cámara de aire (Johnston y cols., 2001; Feldman y Nelson, 2007). Existen 2 formatos de pajuelas, pudiendo encontrarlas de 0.25 o 0.5 ml; el uso de uno u otro formato depende del grupo de trabajo; así, Silva y cols. (2003, 2006) hicieron uso de pajuelas de 0.25 ml para el almacenaje del semen canino. Sin embargo, la mayor parte de los trabajos realizados sobre congelación seminal de la especie canina utilizan pajuelas de 0.5 ml para almacenar el semen a criopreservar (Peña y cols., 2003; Martins-Bessa y cols., 2006; Rota y cols., 2006; Milani y cols., 2010). Además, estudios al respecto aconsejan la utilización de pajuelas de 0.5 ml en lugar de las de 0.25 ml, tras demostrar que la motilidad espermática, 60 minutos tras su descongelación, era mayor en el semen conservado en pajuelas de 0.5 ml en comparación con las pajuelas de 0.25 ml, mientras que el porcentaje de acrosomas anormales era inferior (Nöthling y Shuttleworth, 2005). 2.6.3.6. Congelación en nitrógeno líquido Una vez finalizado el período de equilibrado y envasado del semen, se comienza con el proceso de congelación en sí. Este paso es crucial para el semen, ya que el descenso de temperatura que se produzca durante esta etapa va a determinar la supervivencia y calidad seminal postdescongelación, si bien el semen de cada individuo presenta diferente respuesta a este proceso. Para llevar a cabo la criopreservación en la especie canina, el método más estandarizado es la congelación mediante el uso de nitrógeno líquido en caja de poliestireno. El proceso comienza con la colocación de las pajuelas a cierta distancia sobre la superficie del nitrógeno líquido durante un periodo de tiempo concreto. Para ello, habitualmente se suele hacer uso de un dispositivo metálico en forma de rejilla o bandeja que permite el paso de los vapores de nitrógeno hasta las pajuelas colocadas en el mismo (Álamo, 2007). La distancia que separa el nitrógeno y las pajuelas, así como la duración de esta fase depende del equipo de trabajo. Así, uno de los protocolos más utilizados es depositarlas durante 10 minutos a 4 cm sobre su superficie, dejando que los vapores de nitrógeno líquido hagan su efecto (England y Ponzio, 1996; Peña y Linde-Forsberg, 2000a; Peña y cols., 2003; Martins-Bessa y cols., 2006; Schäfer-Somi y cols., 2006). Por el contrario, algunos autores aconsejan situar las pajuelas a 8 cm del nitrógeno líquido durante 10-15 minutos (Okano y cols., 2004; Nöthling y Shuttleworth, 2005; Nöthling y cols., 2007), mientras que otros (Silva y cols., 2003; Silva y cols., 2006) prefieren situar las pajuelas a 5 cm del nitrógeno sólo durante un periodo de 5 minutos, si bien en Revisión Bibliográfica este caso, a diferencia del resto de autores citados, se hacía uso de pajuelas de 0.25 ml. No obstante, un trabajo realizado con el fin de estandarizar esta fase del proceso, evaluaba las características del semen congelado en pajuelas que habían sido sometidas a diferentes distancias sobre los vapores de nitrógeno (5, 7 y 15 cm) durante distintos periodos de tiempo (5, 10 y 15 minutos), describió que la mejor calidad la presentaban aquellos dosis seminales situadas a 7 cm durante 10 minutos y a 10 cm durante 15 minutos (Hori y cols., 2006). Transcurrida la fase de vapores de nitrógeno, las pajuelas debe sumergirse directamente en nitrógeno líquido (Martins-Bessa y cols., 2006; Peña y cols., 2006; Rota y cols., 2006). Posteriormente, el proceso finaliza con el almacenamiento e inventario de las dosis seminales congeladas, debiendo realizarse un exhaustivo control del número de dosis, la localización de las mismas y monitorización habitual del tanque de nitrógeno para comprobar que los niveles sean los suficientes para mantener la temperatura a -196ºC (Root, 2005a). 2.6.3.7. Congelación en ultracongeladores Como resultado de la continua evolución en el campo de la tecnología y la criopreservación seminal, han aparecido nuevos sistemas de almacenamiento y conservación del semen que suponen una alternativa factible al tradicional uso del nitrógeno líquido como única posibilidad de crio-preservación seminal. Concretamente la utilización de ultracongeladores ya ha mostrado su eficacia en la preservación del semen en diferentes especies. Los ultracongeladores son congeladores capaces de adquirir temperaturas inferiores a las habituales, lo que permite la preservación de diferentes materiales de origen biológico. Existen diferentes modelos que pueden alcanzar distintas temperaturas; sin embargo, para la congelación seminal, los ultracongeladores de -152ºC han demostrado ser eficaces para la conservación de semen en la especie caprina y canina (Medrano y cols., 2002; Álamo y cols., 2005; Batista y cols., 2011). El estudio de este tipo de congeladores comenzó cuando Medrano y cols. (2002), demostraron la posibilidad de criopreservar el semen de macho cabrío en los ultracongeladores de -152ºC durante 2 meses. Estos resultados fueron evaluados posteriormente in vitro e in vivo, confirmando la eficiencia de este tipo de dispositivos para la congelación y almacenaje del semen caprino, evaluando su eficacia en muestras conservadas hasta 1 año en ultracongeladores de -152ºC (Batista y cols. 2009). En la especie canina, uno de los primeros estudios fue realizado por Álamo y cols. (2005) al comprobar que la calidad del semen congelado y almacenado en ultracongelador durante 4 meses se mantuvo en niveles Revisión Bibliográfica equiparables a los crio-preservados en nitrógeno líquido. Posteriormente, otro estudio realizado en el Dogo Canario se encargó de valorar los parámetros de dosis seminales congeladas y criopreservadas durante 8 meses mediante esta técnica, confirmando que el uso de ultracongeladores a -152ºC es una alternativa potencial al nitrógeno líquido para almacenar el semen canino por largos periodos de tiempo (Batista y cols., 2006). Entre las ventajas de utilizar este procedimiento con respecto a la congelación convencional con nitrógeno líquido se encuentran la gran capacidad de almacenaje, la reducción en el tiempo de trabajo tras el periodo de equilibrado y la simplificación del proceso que evita los riesgos asociados al manejo del nitrógeno líquido (Álamo y cols., 2005; Batista y cols., 2006). Además, otro inconveniente de los problemas que conlleva la crioconservación con nitrógeno líquido es la reposición periódica que se debe realizar, lo que supone un importante coste económico, frente al coste global que requiere la adquisición de un ultracongelador. En base a estas premisas, se proponen los ultracongeladores a -152ºC como una alternativa frente al uso tradicional del nitrógeno líquido en los procesos de congelación y criopreservación del semen canino (Álamo y cols., 2005; Batista y cols., 2006). No obstante, aunque este dispositivo presente numerosas ventajas, existen muchos factores que deben ser evaluados antes de considerar la congelación y conservación de semen a -152 °C una alternativa viable, como el costo del congelador, el gasto de electricidad y el riesgo de interrupciones de la corriente eléctrica (Medrano y cols., 2002). 2.6.3.8. Transporte del semen congelado En general, la forma más habitual de trasladar el semen congelado es mediante el uso de criocontenedores de nitrógeno líquido de volumen variable o criocontenedores de nitrógeno seco. Sin embargo, existen muy pocos trabajos sobre el transporte de semen congelado en criocontenedores de nitrógeno seco y los efectos que sobre la calidad del semen postdescongelación tienen estos sistemas (Root, 2005a). Algunos trabajos desarrollas en bovino, han validado este tipo de dispositivos para el transporte de embriones y semen, concluyendo que los vapores de nitrógeno líquido presentes en los tanques de nitrógeno seco suponen una forma segura de almacenar por un corto de tiempo este tipo de muestras biológicas, sin peligro de contaminación bacteriana o vírica (Bielanski, 2005). Revisión Bibliográfica Este tipo de dispositivo consiste en un tanque (con diferentes tamaños) con las paredes revestidas con una sustancia capaz de absorber el nitrógeno líquido. Por tanto, este tipo de dispositivos, sin contener propiamente nitrógeno líquido, son capaces de mantener la temperatura interior cercana a -196ºC, conservando las muestras a estas temperaturas por un corto periodo de tiempo. A diferencia de los contenedores de transporte tradicionales basados en el almacenamiento y transporte de las muestras sumergidas en nitrógeno líquido, en el caso de los tanques de nitrógeno seco, al no utilizar esta sustancia en estado líquido, las compañías aéreas y de transporte permiten su transporte sin problemas. Una vez en el lugar de destino, las muestras deben transferirse a un tanque de almacenaje con nitrógeno líquido (Root, 2005a) o bien utilizar las muestras en un breve periodo de tiempo. 2.7. DESCONGELACIÓN Y CONTRASTACIÓN SEMINAL POST-CONGELACIÓN. 2.7.1. Procedimiento de descongelación El proceso de descongelación seminal, al igual que ocurre con los procesos de congelación, puede variar mucho dependiendo de la metodología de trabajo, del procedimiento de envasado del semen, etc. Esta fase del proceso es crítica, ya que influye al mismo nivel que la congelación en la supervivencia espermática. En cualquier caso, cuando el semen congelado es enviado para ser usado en otro laboratorio o clínica, es recomendable seguir las instrucciones de descongelación del responsable de la congelación para limitar generar daños en el semen (Root, 2005a; Eilts, 2005; Feldman y Nelson, 2007). Además, se han descrito que existen variaciones significativas entre perros, por lo que es imposible diseñar un sistema estandarizado de descongelación (Yu y cols., 2002). De manera general, el fundamento de este proceso implica que si una muestra seminal ha experimentado un proceso de congelación con cambios rápidos de temperaturas, también va a requerir de una descongelación rápida para revertir el balance osmótico, así como rehidratar y restaurar la configuración de los lípidos y las proteínas de la membrana, de forma similar a los cambios sufridos durante la congelación. Sin embargo, existen multitud de protocolos de descongelación, que difieren, entre otras cosas, en función del dispositivo de almacenamiento utilizado para congelar el semen (Farstad, 1996). Así, cuando el semen se encuentra criopreservado en forma de pellets congelados en nitrógeno seco, la forma habitual de realizar la descongelación consiste en sumergir el pellet durante 5 segundos en 0.5 ml de una solución de cloruro sódico al 0.9%, atemperada a 55ºC. Otros autores prefieren introducir el pellet en un tubo eppendorf con 1 ml de solución a 37ºC (dilución 1:3), y agitar vigorosamente durante 30 Revisión Bibliográfica segundos (Fahring, 2000). Cuando el sistema de envasado es mediante tubos de aluminio, la descongelación suele llevarse a cabo por inmersión y agitación de los tubos en baño María a 65ºC durante 12-15 segundos (Ivanova-Kicheva y cols., 1997). Sin embargo, como las pajuelas son el principal método de envasado del semen, es aquí donde se observan una mayor variedad de protocolos de descongelación, con evidentes variaciones con respecto a la temperatura de descongelación, así como el tiempo a la que las dosis seminales deben ser sometidas a esa temperatura. Independientemente de estos factores, la descongelación siempre se realiza de la misma forma, es decir, sumergiendo las pajuelas en Baño María. En caso de utilizarse pajuelas de 0.25 ml, el método de descongelación habitualmente descrito es a 37ºC durante 30 segundos (Yildiz y cols., 2000) o 39ºC durante ese mismo periodo de tiempo (Hewitt y cols., 2001); sin embargo, si el volumen de envasado de la pajuela asciende a 2.5 ml, el semen debe ser descongelado durante 45 segundos a temperatura de 50ºC (Thomas y cols., 1993). No obstante, las pajuelas más utilizadas son las de 0.5 ml y, por tanto, para las que se han descrito más variedad de protocolos de descongelación, entre los que podemos encontrar:  Temperatura de 38ºC durante 30 segundos (Thomas y cols., 1993; Petrunkina y cols., 2004; Layne y cols., 2008)  Temperatura de 37ºC durante 45 segundos (Hori y cols. 2006).  Temperatura de 37-38ºC durante 60 segundos (Rota y cols., 1997; Silva y cols., 2003; Oliveira y cols., 2006; Rota y cols., 2006; Milani y cols., 2010).  Temperatura de 39ºC durante 30 segundos (Hewitt y cols., 2001).  Temperatura de 50ºC durante 10 segundos (Root, 2005a).  Temperatura de 70ºC durante 8 segundos (Ström y cols., 1997; Peña y cols., 1999; Peña y Linde-Forsberg, 2000a; Martins-Bessa y cols., 2006; Schäfer-Somi y cols., 2006).  Temperatura de 70ºC durante 6 segundos (Hay y cols., 1997)  Temperatura de 75ºC durante 7 segundos (Oliveira y cols., 2006). Asimismo, algunos estudios que comparan diferentes temperaturas de descongelación para un semen procesado y sometido a idénticas condiciones, sugieren que la eficiencia de la supervivencia celular post-descongelación puede mejorar cuando la temperatura de descongelación se encuentra bien ajustada (Oliveira y cols., 2006). Un estudio más específico, comparó dos temperaturas de descongelación (37ºC durante 2 minutos y 70ºC durante 5 Material y Métodos 69 3.1.2. Diseño experimental Esta experiencia pretendía definir las características seminales en ejemplares de Dogo Canario, así como determinar la calidad post-congelación en muestras de semen preservadas mediante diferentes protocolos de crioconservación. Concretamente se valoró la calidad seminal postdescongelación comparando muestras preservadas en nitrógeno líquido frente a ultracongeladores de -152ºC, así como evaluando la variabilidad individual y la influencia del tiempo de congelación sobre la longevidad del semen. De esta forma, el primer paso fue obtener los eyaculados que, tras la contrastación seminal correspondiente (volumen, color, motilidad, concentración, vitalidad, acrosomías, morfoanomalías), fueron procesado de forma individual hasta alcanzar una concentración final de 200 x 106 espermatozoides/ml (20% yema de huevo, 3% glicerol). Tras esta primera dilución, el semen era dividido en tres alícuotas para ser sometido a tres protocolos de diluyoconservación y crioconservación seminal: grupo A, el semen tenía una concentración final del 0.5% de Equex, 20% yema de huevo y 5% glicerol, siendo crioconservado en nitrógeno líquido; grupo B: el semen tenía una concentración final del 0.5% de Equex, 20% yema de huevo y 5% glicerol, siendo crioconservado en ultracongeladores de -152ºC; grupo C: el semen tenía una concentración final del 1.0% de Equex, 20% yema de huevo y 5% glicerol, siendo crioconservado en ultracongeladores de -152ºC. El número de congelaciones realizadas en cada ejemplar osciló entre 3 y 4. Finalmente, se procedió a determinar la calidad seminal en el semen congeladodescongelado de cada uno de los protocolos, valorando prácticamente los mismos parámetros que en el semen fresco (motilidad, morfoanomalías y acrosomías). Los periodos de evaluación se establecieron tras 1 día, 1 mes, 3 meses, 12 meses y 18 meses tras la congelación. Las figuras 3.1 y 3.2 muestran la planificación del trabajo experimental y las valoraciones realizadas en los diferentes grupos. Material y Métodos 70 Figura 3.1. Planificación de la recogida de muestras, contrastación y crioconservación seminal NL: Muestras congeladas y conservadas en nitrógeno líquido UF: Muestras congeladas y conservadas en ultracongeladores de -152ºC, con una concentración final de 0.5% de Equex (UF-0.5) o un 1% de Equex (UF-1) Vitalidad Acrosomías Morfoanomalía s Motilidad Concentración ANIMALES Perros: 1,2,3,4,5,6,7 y 8 RECOGIDA SEMINAL CONTRASTACIÓN SEMINAL CRIOCONSERVACIÓN SEMINAL 18 pajuelas en UF-0.5 18 pajuelas en UF-1 30 pajuelas en NL Material y Métodos 71 Figura 3.2. Planificación del procedimiento de la descongelación seminal 1: Esta figura representa el número de pajuelas evaluadas en cada protocolo de criopreservación para cada uno de los 8 ejemplares. Motilidad Acrosomías Morfoanomalías VALORACIÓN POST-DESCONGELACIÓN 1 DÍA (6 pajuelas) 1 MES (6 pajuelas) 3 MESES (6 pajuelas) 1 DÍA (6 pajuelas) 1 MES (6 pajuelas) 3 MESES (6 pajuelas) 12 MESES (6 pajuelas) 18 MESES (6 pajuelas) 30 pajuelas en NL 18 pajuelas en UF-1 18 pajuelas en UF-0.5 DESCONGELACIÓN SEMINAL1 1 DÍA (6 pajuelas) 1 MES (6 pajuelas) 3 MESES (6 pajuelas) Material y Métodos 72 3.1.3. Recogida de semen Las recogidas seminales se efectuaron durante un periodo de seis meses (Diciembre de 2007Junio de 2008). El número de recogidas seminales se determinó por la concentración espermática de cada uno de los donantes y, por tanto, variaba en función del animal; si bien siempre se situó en 3-5 recogidas por animal. En todos los machos, se descartaron aquellos eyaculados que presentaban una calidad insuficiente para el estudio o bien cuando la erección no había sido óptima, de forma que si se consideraba inadecuado se repetía la recogida seminal una vez pasados 45 minutos de la primera. La técnica seleccionada para realizar la recogida seminal fue la estimulación manual sobre el pene. Con el comienzo de la eyaculación se iniciaba también la recolección de las diferentes fracciones del semen. El material utilizado fueron tubos de cristal graduados de 10 ml acoplados a embudos de cristal, todo ello atemperado a 37ºC. Se utilizaron un mínimo de 3 tubos en cada recogida seminal, uno para cada fracción del eyaculado, que se intentaban obtener por separado; se prestaba especial atención a la recogida de la segunda fracción, desechando gran parte de la tercera. A continuación, los tubos de recogida eran depositados en un baño María a 37ºC (Baño termostático Selecta, Modelo Tectron 3473100) hasta finalizar las técnicas de contrastación seminal. 3.1.4. Estudio y contrastación seminal Con el fin de determinar las características del semen tras su recogida, se realizó un minucioso estudio de sus parámetros macro y microscópicos, definiendo la calidad de cada uno de los eyaculados por separado. Durante toda la experiencia, el procesado, preparación y valoración de muestras fue realizada siempre el mismo técnico, evitando así variaciones debidas al mismo. 3.1.4.1. Estudio macroscópico El análisis macroscópico tenía por objetivo determinar visualmente dos parámetros: color y volumen del eyaculado. Esta valoración fue realizada inmediatamente tras la recogida seminal. El color del eyaculado fue evaluado por observación directa a través del tubo de cristal graduado donde se había recogido el semen. Al mismo tiempo y, utilizando para ello la graduación de dichos tubos, se determinó el volumen (mililitros) de semen obtenido. Material y Métodos 73 3.1.4.2. Estudio microscópico Los parámetros analizados a nivel de microscópico fueron los siguientes: - Motilidad individual progresiva - Concentración espermática (por ml y concentración total) - Vitalidad espermática - Porcentaje de morfoanomalías (cabeza, pieza intermedia y cola) - Porcentaje de acrosomas anormales Para el estudio de los parámetros microscópicos citados anteriormente se hizo necesario la utilización de instrumental diverso. A grandes rasgos, para la observación del semen se usaron portaobjetos, cubreobjetos y pipetas Pasteur de cristal. Todo el material, se encontraba atemperado a 37ºC mediante placas calefactores (modelo HT-200, Minitüb® GMBH), evitando así cualquier alteración de las características seminales del semen fresco valorado. I. Motilidad espermática Con el fin de evaluar el porcentaje de espermatozoides móviles, se tomaba una alícuota del semen con una pipeta de cristal atemperada y se depositaba una pequeña gota en la superficie de un portaobjetos. Seguidamente, esta gota era cubierta con un cubreobjetos, con lo permitíamos que la muestra se dispusiera en una fina capa que facilitaba una correcta visualización de los espermatozoides. Para cada una de las muestras, la motilidad espermática se determinaba tanto de forma subjetiva como objetiva. El equipo utilizado para valorar la motilidad espermática constaba de un microscopio de contraste de fases U-CTR30-2 (Olympus CX41), que incluía platina calefactora (37ºC). Se realizaba una observación directa por parte del técnico con el fin de establecer un valor subjetivo de la motilidad espermática. Para ello, se valoraban entre 4 y 5 campos por visualización directa a través del microscopio. En cada uno de ellos se estimó un cálculo subjetivo de la motilidad para, finalmente, definir la media de las valoraciones de los diferentes campos observados, aproximándolo al 5% más cercano. Los campos evaluados se situaban en el centro de la preparación, ya que es en esta zona de la muestra donde se mantiene el calor durante más tiempo y, por tanto, más inalterada se encuentra la motilidad (Álamo, 2007). Material y Métodos 74 La valoración objetiva de la motilidad espermática se realizó mediante un sistema computerizado asistido de análisis espermático (Sperm Vision Lite®, Minitüb Ibérica, Spain). Las variables seminales incluidas en el análisis fueron el porcentaje total de espermatozoides mótiles, el porcentaje de espermatozoides con motilidad progresiva, el porcentaje de espermatozoides con motilidad local y el porcentaje de espermatozoides no mótiles. Para definir los parámetros de motilidad de cada muestra se contabilizaba la motilidad espermática de los espermatozoides contenidos en 7 campos (seleccionados de manera aleatoria) o bien de un número máximo de 2.000 espermatozoides. Los parámetros del análisis espermático eran los siguientes: número de fotogramas 16; fotogramas por segundo, 25; velocidad límite para espermatozoides no mótiles, 10 µm/s; velocidad límite para espermatozoides con motilidad local, 20 µm/s; velocidad límite para espermatozoides con motilidad baja, 30 µm/s; velocidad límite para espermatozoides con velocidad media, 60 µm/s; filtro para partículas, 20%. Tras las correspondientes valoraciones, se desecharon las muestras que presentasen una motilidad progresiva inferior a un 85%. II. Concentración espermática La determinación del número de espermatozoides presente en cada eyaculado se realizó mediante un fotómetro especialmente diseñado para la medición de la concentración espermática (Fotómetro Spermacue, modelo 12300/0500, Minitüb®). Para ello, sirviéndonos de una pipeta Pasteur, se rellenaba una microcubeta del sistema con una pequeña muestra de semen. Acto seguido, la microcubeta era introducida en el fotómetro determinando la concentración de espermatozoides por ml de eyaculado. Para cada muestra de semen, dicho procedimiento se realizaba por duplicado con el objeto de estimar el valor medio. Finalmente, el valor se multiplicaba por el volumen de eyaculado, obteniendo de esta manera el número de espermatozoides totales. Del mismo modo, en varias ocasiones al comienzo de las diferentes experiencias, la concentración espermática también se valoraba mediante la dilución del semen a razón de 1:40 en solución salina formolada al 0.3% y recuento en una cámara cuentaglóbulos (Thoma Double Zuzi); con ello se perseguía comprobar la sensibilidad y fiabilidad del fotómetro en la determinación de la concentración espermática. Material y Métodos 75 Basándonos en los valores publicados en la raza Dogo Canario (Batista y cols., 2006), se decidió desechar todas aquellas muestras que contuviesen una concentración espermática total inferior a 800 x 106 totales (Batista y cols., 2006). III. Vitalidad espermática El porcentaje de espermatozoides vivos fue determinado mediante la utilización de una doble tinción vital, denomina Eosina-Nigrosina. La tinción consta de un 1 gramo de Eosina B azulada y 8 gramos Nigrosina, diluidos en 100 mililitros de agua destilada hasta su correcta disolución. Sobre un portaobjetos a 37ºC, se mezclaba una gota de semen con una gota de colorante también preservado a 37ºC antes de su utilización. Posteriormente, ambas gotas eran mezcladas con el extremo lateral de otro portaobjetos, y apoyándose éste sobre el que portaba la mezcla, se deslizaba en un ángulo de 45º para realizar la extensión de la misma. Tras comprobar que la preparación se encontraba seca, se procedió a su estudio en un microscopio óptico (Olympus BH2-NIC-2), a 1000 aumentos con aceite de inmersión. La valoración consistía en considerar vivos aquellos espermatozoides que mostraban sus cabezas de color blanco (indicativo de la impermeabilidad de la membrana citoplasmática, que no permitía, por tanto, el paso de la tinción). Asimismo, eran clasificados como muertos a todos los espermatozoides que presentaran una coloración rosada de la cabeza. El porcentaje de espermatozoides vivos y muertos se determinó tras realizar un recuento de un mínimo de 100 espermatozoides. La vitalidad espermática fue un parámetro que sólo se determinó en las muestras seminales en fresco. IV. Porcentaje de Morfoanomalías Para determinar el porcentaje de espermatozoides anormales, se hizo uso de una tinción con capacidad de colorear con diferentes tonalidades las diferentes regiones de la célula espermática. En concreto, se utilizó la tinción denominada SpermacTM, que permite detectar fácilmente el espermatozoide, diferenciando el acrosoma en tono verde, la cabeza de color rosa, y la pieza intermedia y la cola de color verde. Material y Métodos 76 La preparación de la tinción consistía en realizar una extensión de una gota de semen tomada directamente del eyaculado; así, sobre un portaobjetos atemperado y, con ayuda de otro porta, se preparaba de manera similar a lo descrito para la tinción eosina-nigrosina. Tras secar la muestra al aire por período no superior a 5 minutos, se procedió a desarrollar la tinción comenzando con la fijación de la preparación por inmersión de la misma en la solución fijadora del kit comercial. Posteriormente, y tras esperar un mínimo de 15 minutos a que la muestra se secase, la preparación se introducía progresivamente en 3 colorantes diferentes (colorantes A, B y C) durante 2, 1 y 1 minutos, respectivamente. Antes de comenzar esta fase de tinción y entre cada uno de ellos se realizaba un exhaustivo lavado de la muestra con agua destilada. En último lugar, la preparación se dejaba secar antes de ser estudiada a microscopía óptica (Olympus BH2-NIC-2) en objetivo de inmersión (X100). La valoración se realizaba a cada una de las células por separado, identificando las anomalías en las regiones de la cabeza (macrocefalia, microcefalias, dobles cabezas, cabezas en flechas,…), pieza intermedia (piezas intermedias dobladas, presencia de gotas citoplasmáticas proximales,…) y cola (colas enrolladas, dobladas, dobles,...). El número de espermatozoides contabilizados para establecer el porcentaje de formas anormales fue siempre superior a 100 células. V. Acrosomías En último lugar, se valoraba el porcentaje de espermatozoides que presentaban anomalías en el acrosoma (acrosomas desprendidos, rugosos, aplanados, etc). El porcentaje de acrosomías se determinaba en la misma extensión realizada para estimar el porcentaje de morfoanomalías y siguiendo la misma pauta (microscopio óptico de contraste de fases, Olympus BH2-NIC-2, a 1000 aumentos). El procedimiento también fue el mismo, es decir, con contaje de un mínimo de 100 espermatozoides. 3.1.5. Dilución y congelación seminal 3.1.5.1. Procedimiento de dilución seminal Después de determinar que la motilidad espermática y la concentración de los eyaculados eran adecuadas para que el semen se considerara apto para el estudio, se comenzaba con el procesado del mismo para evitar su deterioro. Material y Métodos 77 Del mismo modo, antes de comenzar con los procedimientos de diluyo-conservación seminal, se prepararon los diluyentes para tal fin. La tabla 3.1 expresa la composición del diluyente 1 (similar para todos los protocolos de preservación) y el diluyente 2 (cuya diferencia básica era la concentración final de Equex). Tabla 3.1. Composición de los diferentes diluyentes (Dil-1, Dil-2a, Dil-2b) empleados en la experiencia (por cada 100 ml de diluyente) Componentes Dil-1 Dil-2a Dil-2b Tris (Hidrometil) Aminometano (Panreac) D(+)-Glucosa anhidra (Panreac) Acido cítrico anhidro (Sigma) Glicerol -Glicerina- (Panreac) Na Bencilpenicilina (Hoechst) Dihidroestreptomicina sulfato (Hoechst) Yema de huevo Equex (Equex STM paste; Nova Chemical Inc.) Agua destilada 2.4 g 0.8 g 1.4 g 3 ml 0.06 g 0.1 g 20 ml - hasta 100 ml 2.4 g 0.8 g 1.4 g 7 ml 0.06 g 0.1 g 20 ml 1 ml hasta 100 ml 2.4 g 0.8 g 1.4 g 7 ml 0.06 g 0.1 g 20 ml 2 ml hasta 100 ml El primer paso consistía en procesar la fracción espermática para separar los espermatozoides del resto de fluido prostático contenido en el eyaculado. Para tal fin, el eyaculado era centrifugado a 700 x g en una centrífuga Kubota 5100 durante 8 minutos, con el objeto de conseguir una mayor concentración de espermatozoides. Posteriormente, se aspiró y desechó el sobrenadante con una pipeta Pasteur, para una vez aislado el sobrenadante, se resuspendía lentamente con el primer diluyente (Dil-1); la cantidad a añadir se estimaba a partir del número total de espermatozoides presente en cada eyaculado, de forma que se obtuviese 200 x 106 de espermatozoides por ml de semen diluido. Este paso se realizaba en el laboratorio a temperatura ambiente (25ºC), con ayuda de una jeringa para adicionar cuidadosamente el diluyente y de una pipeta Pasteur para homogeneizar la mezcla. A continuación, el semen diluido era trasladado a una cámara frigorífica (Uniblock Zanotti, 805121T02G), donde debía permanecer durante la etapa de equilibrado, a una temperatura de 4ºC durante 1 hora. La temperatura de la cámara estaba controlada de forma automática y, podía comprobarse en todo momento por visualización del monitor exterior del Material y Métodos 78 sistema. Al mismo tiempo, el segundo diluyente y el resto de material a utilizar durante el proceso de diluyo-congelación (pipetas, jeringas, pajuelas,…) eran situados en el interior de la cámara frigorífica, con el objetivo de que estuviesen a la misma temperatura que la dilución del semen (a 4ºC) en el momento de su utilización. Transcurridos los 60 minutos de la fase de equilibrado, se depositaba una gota de la dilución entre un portaobjetos y un cubreobjetos atemperados, siendo posteriomente valorada para determinar los parámetros relacionados con la motilidad (sistema CASA). De esta forma, se pretendía comprobar que el semen procesado no hubiese perdido excesiva calidad, permitiéndonos seguir con el procesado. Acto seguido, el segundo diluyente (Dil-2a o Dil-2b) era adicionado a la dilución atemperada. El volumen a añadir venía determinado por el número de espermatozoides, de manera que la dilución final debía contener 100 x 106 espermatozoides por mililitro. Asimismo, con esto conseguíamos almacenar en cada pajuela de 0.5 mililitros, 50 x 106 espermatozoides, por lo que el número de pajuelas utilizadas e identificadas dependían directamente de este parámetro. El segundo diluyente era añadido cuidadosamente siguiendo el mismo procedimiento que el diluyente 1, evitando así alteraciones en los espermatozoides debidas a las distintas concentraciones de glicerol entre diluyentes. Alrededor de 10 minutos tras la adición del 2º diluyente en la cámara de refrigeración, el semen procesado era envasado en las pajuelas. Para ello las pajuelas eran introducidas en grupos de 2-3 en la dilución final y, mediante succión directa del mismo a través del extremo no sumergido, se conseguía su almacenamiento en el interior de la pajuela. En el extremo abierto de cada pajuela se dejaba una cámara de aire de aproximadamente 1 cm de longitud. El periodo de envasado de las pajuelas nunca fue superior a los 10-15 minutos en total. Durante el desarrollo del estudio se llevaron a cabo dos procedimientos de dilución seminal con diferentes concentraciones finales de Equex para los ultracongeladores a -152ºC. Es por ello que algunos eyaculados fueron procesados con los diluyentes Dil-1 y Dil-2a mientras que otros fueron diluidos con Dil-1 y Dil-2b. En el primer caso (Dil-1 y Dil-2a), la dilución seminal final era almacenada en pajuelas que era distribuidas en dos grupos, uno conservado en nitrógeno líquido (NL) y otro en ultracongeladores de -152ºC (UF), ambos con una concentración final de Equex del 0.5%. Por otro lado, la dilución seminal procesada con el segundo protocolo Material y Métodos 85 De esta forma, las alícuotas A (de los 5 ejemplares) y PA (resultante del pool) se mantuvieron en baño María a 37ºC durante toda la experiencia. Las alícuotas B (de cada individuo) y PB (pool) se depositaron en una gradilla a temperatura ambiente (aproximadamente a 25ºC) de nuestro laboratorio. Finalmente, las alícuotas C (perros 1, 2, 3, 4 y 5) y PC (pool) fueron trasladadas a una cámara de refrigeración a 4ºC, para su preservación. Por otro lado, las alícuotas D (de cada macho) y PD (pool), destinadas a congelación en NL, se procesaron siguiendo el protocolo aplicado para las dosis en NL de la Experiencia 1, utilizando el mismo instrumental, procedimiento y diluyentes (Dil-1 y Dil-2a, tabla 3.1). 3.2.6. Valoración de la calidad seminal en los diferentes protocolos de conservación Cada una de las alícuotas procesadas de manera individual (A, B y C) o partir del pool (PA, PB y PC), sometidas a las diferentes temperaturas de conservación (37ºC, 25ºC, 4ºC) fueron evaluadas a lo largo del tiempo. La motilidad espermática se valoró de forma exhaustiva hasta la completa inactivación del semen; asimismo, la presencia de formas espermáticas anormales y acrosomas alterados se evaluó en los periodos de tiempo establecidos en la tabla 3.3, que recoge los parámetros seminales valorados y el momento de estudio del total de las alícuotas. Tabla 3.3. Parámetros evaluados en las alícuotas almacenadas en diferentes temperaturas de preservación (37ºC, 25ºC, 4ºC) a lo largo del periodo experimental Parámetro Horas de conservación Hora 1 Hora 2 Hora 4 Hora 8 Hora 12 Hora 24  24 Horas Motilidad X X X X X X X Morfoanomalías X X X Acrosomías X X X No obstante, la evaluación de estos parámetros para las alícuotas C y PC situadas en refrigeración se iniciaba exactamente a las 2 horas de haberse desplazado a la cámara de refrigeración. Se realizó de esa manera, puesto que se esperó 1 hora para que el semen alcanzara la temperatura de 4ºC y, a continuación, 1 hora más para evaluar la resistencia del semen a esa temperatura a lo largo del tiempo. Material y Métodos 86 Por otro lado, las alícuotas congeladas (D y PD) fueron sometidas a descongelación por el procedimiento habitual, es decir, inmersión en agua a 70ºC durante 8 segundos, secado de la pajuela y descarga de su contenido en 0.5 ml de solución tampón PBS que se encontraba a 37ºC. Posteriormente, las muestras descongeladas se mantenían a 37ºC (Baño María) y se realizaba la evaluación de los parámetros seminales detallados en la tabla 3.3, como se ha descrito hasta el momento. Para llevar a cabo la valoración de la motilidad (total y progresiva), se resuspendía las diluciones con extrema suavidad, se tomaba una gota de cada alícuota con ayuda de una pipeta Pasteur y se depositaba entre un porta y un cubreobjetos situado sobre una placa calefactora (37ºC), dónde se esperaba unos minutos (alrededor de 5) antes de comenzar su valoración, con el objeto de que se activasen los espermatozoides. La preparación y valoración de las muestras para determinar el porcentaje de anomalías morfológicas y acrosomías, se realizó también de forma idéntica a la definida en la Experiencia 1. 3.2.7. Análisis estadístico Los resultados han sido presentados como media (± error estándar de la media). Los datos fueron analizados con el programa estadístico SAS (Versión 9.0, SAS Institute, Inc., Cary, NC). El modelo de estudio se realizó mediante un análisis ANOVA de medidas repetidas con el objeto de determinar el efecto de los diferentes parámetros estudiados así como la interacción existente entre los mismos; de este modo, las variantes estudiadas fueron el sistema de procesado utilizado (de forma individual y pool), la temperatura de conservación (37ºC, 25ºC, 4ºC, Congelación-descongelación-37ºC) y el tiempo de conservación (0, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 264, 288, 312, 336 y 360 horas). Las variables (motilidad espermática, espermatozoides con morfología anormal y espermatozoides con acrosomas alterados) se expresaban en porcentajes calculados a partir de la transformación de los datos mediante el arcoseno antes del análisis. Las diferencias significativas entre medias quedaban establecidas cuando se comparaban utilizando un test de Tukey, considerando que los valores eran estadísticamente significativos cuando p<0.05. Material y Métodos 87 Figura 3.3. Planificación del trabajo experimental en la Experiencia 2 Material y Métodos 88 3.3. EXPERIENCIA 3: VIABILIDAD DEL SEMEN CONGELADO-DESCONGELADO CONSERVADO A DIFERENTES TEMPERATURAS TRAS SU DESCONGELACIÓN 3.3.1. Animales, plan sanitario, alimentación y alojamiento Los animales participantes en la experiencia 3 fueron exactamente los mismos que intervinieron en la experiencia 2. Es por ello, que aquellos aspectos relacionados con la raza, peso, edad, estado sanitario y régimen de alojamiento y alimentación de los animales fueron similares en esta experiencia. Por otro lado, ambos ensayos (experiencias 2 y 3) se llevaron a cabo de manera consecutiva, en un plazo inferior a 1 mes entre ambos, lo que nos permitió considerar que las características reproductivas de los ejemplares no se encontraban modificadas con respecto a las asumidas en la experiencia previa. Como sucedía en los casos anteriores, los perros participantes eran trasladados a la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Las Palmas para realizar de forma programada los ensayos. 3.3.2. Diseño experimental El objetivo de esta tercera experiencia fue determinar la capacidad de supervivencia y las características del semen conservado a distintas temperaturas a lo largo del tiempo, después de haber sido congelado y descongelado. La figura 3.4 muestra la planificación del trabajo experimental y las valoraciones realizadas en los diferentes grupos. Con esta finalidad, el ensayo comenzaba con la extracción seminal de los 5 ejemplares participantes y una vez definida su calidad, se mezclaba para formar un pool, que sería sometido a congelación y conservación en nitrógeno líquido. Posteriormente, se procedía a realizar la descongelación de las pajuelas, en grupos de 4, que se mezclaban y conservaban a diferentes temperaturas: 37ºC (baño María), 25ºC (temperatura ambiente), a 15ºC (cámara de refrigeración) y a 4ºC (refrigeración). La experiencia se repitió 2 veces, a intervalos de una 1 semana, utilizando un total de 10 eyaculados (2 por animal), mientras que el número de pajuelas congeladas-descongeladas que fueron valoradas se situó en 100. Material y Métodos 89 Con el objeto de evaluar la influencia de la temperatura de conservación sobre la calidad y viabilidad del semen congelado-descongelado, se realizaba la valoración de determinados parámetros seminales en distintos periodos de tiempo para cada uno de los grupos experimentales (37ºC, 25ºC, 15ºC, 4ºC). Así, la motilidad espermática, total y progresiva, se pretendía estimar a las 1, 2, 4, 6, 12 y 24 horas de haber comenzado la exposición a las diferentes temperaturas; por otro lado, la determinación del porcentaje de anomalías morfológicas y acrosomías se planificó a las 1, 6 y 24 horas tras el comienzo del periodo de conservación post-descongelación. 3.3.3. Recogida y contrastación del semen El procedimiento seguido para la obtención del semen fue exactamente el descrito para las experiencias anteriores, donde el semen se recolectó por estimulación manual, se conservó en baño María a 37ºC y se valoró (volumen, color, motilidad espermática subjetiva, total y progresiva, concentración espermática, porcentaje de vitalidad, anomalías morfológicas y porcentaje de acrosomías) para determinar su calidad en fresco. No consideramos necesario realizar una recogida previa para determinar la calidad seminal ni la libido del animal, puesto que los perros ya habían testados y entrenados por su participación en el experimento 2. Una vez definidos unos parámetros mínimos de calidad seminal (> 70% motilidad total, > 65% motilidad progresiva), los eyaculados se mezclaron para constituir el pool correspondiente. Una vez homogeneizada perfectamente la mezcla, se determinaron nuevamente las características seminales del pool a procesar. 3.3.4. Dilución y congelación seminal A partir del pool y una vez determinada su concentración final, se comenzaba con el procedimiento de diluyoconservación seminal. Para ello, se utilizaron los diluyentes empleados en la primera experiencia para congelación en nitrógeno líquido (Dil-1 y Dil-2a, expuestos en la tabla 3.1) en volumen suficiente para obtener una concentración final de 100 x 106 de espermatozoides/ml, 20% de yema de huevo, 5% glicerol y 0.5% Equex. Tras el correspondiente tiempo de equilibrado y empajuelado, las dosis seminales se congelaban en nitrógeno líquido, para finalmente conservarse en este medio hasta el momento de su valoración. El número de pajuelas resultantes fue superior a las 50 pajuelas en cada uno de los 2 ensayos, con una concentración de 50 x 106 de espermatozoides/ml por pajuela. Material y Métodos 90 3.3.5. Descongelación del semen y conservación en distintas temperaturas Las pajuelas se descongelaron mediante inmersión de las mismas a 70ºC durante 8 segundos, es decir, siguiendo el procedimiento usual. Tras el adecuado manejo de la pajuela, su contenido era vertido en 0.5 ml de PBS atemperado en baño María a 37ºC. Las valoraciones se realizaron de forma programada, de manera que las pajuelas se descongelaban y valoraban individualmente en grupos de 4. A continuación, el contenido de cada una de las 4 pajuelas era depositado en un único tubo de cristal para hacer un pool homogéneo, alcanzando un volumen final de 4 ml (2 ml de semen + 2 ml de PBS). A continuación, la mezcla era valorada, determinando los aspectos relacionados con motilidad, morfoanomalías y acrosomías. Inmediatamente, la preparación era distribuida en 4 alícuotas (1 ml) que se colocaban en tubos separados, con el objeto de ser sometidas a diferentes temperaturas de conservación. Así, conseguimos la siguiente distribución: - Alícuota A: 1 ml a 37ºC - Alícuota B: 1 ml a temperatura ambiente (25ºC, aproximadamente) - Alícuota C: 1 ml a 15ºC - Alícuota D: 1 ml a 4ºC Este procedimiento se repitió de forma consecutiva hasta descongelar un total de 50 pajuelas en cada una de las 2 reproducciones del experimento. 3.3.6. Valoración de la calidad seminal posterior a los diferentes tiempos Se realizó un estudio preliminar para comprobar el tiempo que las alícuotas tardaban en alcanzar las temperaturas propuestas (37ºC, 25ºC, 15ºC, 4ºC) inmediatamente tras la descongelación y poder determinar, de esta forma, a partir de qué momento se podría realizar la valoración. Este procedimiento se realizó mediante un termómetro Crison con sonda de inmersión que era introducida en el semen, permitiendo monitorizar el descenso de la temperatura en cada una de las alícuotas. Las alícuotas A (37ºC) y B (25ºC) alcanzaban la temperatura propuesta en un plazo inferior a los 5-10 minutos, mientras las alícuotas C (15ºC) precisaban de unos 15 minutos para alcanzar su temperatura de conservación. Con respectos a las alícuotas D (4ºC) se registró que era necesario 1 hora para alcanzar la temperatura de preservación. Por tanto, en las muestras conservadas a 4ºC, se consideró como hora 1, cuando la alícuota había estado sometida a esa Material y Métodos 91 temperatura durante 1 hora de equilibrado, es decir, alrededor de 2 horas después de ponerlo en cámara frigorífica. Esto se realizó con la finalidad de evaluar la capacidad de conservación del semen procesado cuando su temperatura era de 4ºC, por lo que si la valoración se hubiese realizado antes probablemente éste no hubiese alcanzado tal temperatura. Los parámetros que se pretendían evaluar a lo largo del periodo experimental son los reflejados a continuación: - Hora 1: Motilidad, Morfoanomalías y Acrosomías - Hora 2: Motilidad - Hora 4: Motilidad - Hora 6: Motilidad, Morfoanomalías y Acrosomías - Hora 12: Motilidad - Hora 24: Motilidad, Morfoanomalías y Acrosomías Como en los ensayos anteriores, el procedimiento seguido para valorar motilidad, anomalías morfológicas y acrosomías fue el descrito en las experiencias previas. 3.3.7. Análisis estadístico Los resultados han sido presentados como media (± error estándar de la media). Los datos fueron analizados con el programa estadístico SAS (Versión 9.0, SAS Institute, Inc., Cary, NC). El modelo de estudio se realizó mediante un análisis ANOVA Factorial con el objeto de determinar el efecto de los parámetros estudiados y el resultado de su interacción; las variantes estudiadas fueron la temperatura de conservación (37ºC, 25ºC, 15ºC y 4ºC) y el tiempo de conservación (1, 2, 4 y 6 horas para las motilidades y 1 hora para las morfoanomalías y acrosomías espermáticas). Las variables (motilidad espermática, espermatozoides con morfología anormal y espermatozoides con acrosomas alterados) se expresaban en porcentajes calculados a partir de la transformación de los datos mediante el arcoseno antes del análisis. Las diferencias significativas entre medias quedaban establecidas cuando se comparaban utilizando un test de Tukey, considerando que los valores eran estadísticamente significativos cuando p<0.05. Material y Métodos 92 Figura 3.4. Plan experimental del la Experiencia 3 Material y Métodos 93 3.4. EXPERIMENTO 4: INFLUENCIA DEL TIEMPO DE REFRIGERACIÓN PREVIO A LA CONGELACIÓN SOBRE LA CALIDAD DEL SEMEN 3.4.1. Animales, plan sanitario, alimentación y alojamiento En el desarrollo de la experiencia 4 participaron 6 machos de diferentes razas (1 Doberman, 1 Pastor Belga, 1 Bulldog inglés y 3 Beagles). El rango de pesos se situaba entre los 12 y los 30 kilos. Con respecto a la edad, los animales tenían edades comprendidos entre los 2 y los 5 años. Nuevamente los animales pertenecían a propietarios privados, que decidieron colaborar en el estudio. Se continuó con el mismo protocolo que se ha descrito en las experiencias anteriores en lo referido a requerimientos sobre su estado sanitario, régimen de alojamiento y alimentación, así como se desarrollo un riguroso control de la capacidad/calidad reproductiva de los individuos, que confirmase su validez para el estudio. 3.4.2. Diseño experimental El propósito de la experiencia 4 era evaluar la capacidad del semen para resistir los procesos de congelación seminal tras haber sido sometido a diferentes periodos de refrigeración, valorando detalladamente las modificaciones en la calidad del semen tras la congelación. La experiencia se realizó a intervalos de una 1 semana aproximadamente, con un total de 3 repeticiones. La figura 3.5 expone de forma esquemática el plan experimental desarrollado en la experiencia 4. La experiencia comenzaba con la recogida y contrastación seminal de los eyaculados para, una vez definida su calidad, mezclarlos y constituir un pool que posteriormente se distribuía en 6 alícuotas. La alícuota A se procesó siguiendo el método de congelación tradicional, es decir, un primer diluyente con un 3% de glicerol y 1 hora de equilibrado en cámara a 4ºC, mientras las otras cinco alícuotas (R1, R6, R12, R24 y R48) eran destinadas a refrigerarse con diluyente de refrigeración (sin glicerol) a distintos tiempos (1, 6, 12, 24 y 48 horas). Pasado este tiempo, se añadía el diluyente 2, con un 7% de glicerol para la alícuota A y con un 10% de glicerol para el resto. A continuación, las diluciones eran empajueladas, congeladas y almacenadas en NL, siguiendo el método habitual. A posteriori, el semen se descongelaba y valoraba (motilidad espermática total y progresiva, anomalías morfológicas y acrosomías), como se realizaba en experiencias anteriormente descritas. Material y Métodos 94 El número de pajuelas congeladas y evaluadas para cada tiempo y protocolo de refrigeración/congelación fue de 10. Por tanto, tras haber repetido la experiencia 3 veces, el número total de pajuelas trabajadas fue de 180 pajuelas, 30 para cada protocolo. 3.4.3. Recogida y contrastación del semen Previo al estudio, a todos los animales se les realizó una recogida seminal con el fin de habituarlos al procedimiento y valorar la calidad de su semen en fresco. Al igual que para el resto de las experiencias desarrollados en la tesis, el procedimiento de elección fue la estimulación manual. Además, el manejo y valoración del semen fresco durante las repeticiones fue siempre el descrito con anterioridad: conservación en baño María a 37ºC y valoración del volumen, color, motilidad espermática total y progresiva, concentración espermática, porcentaje de vitalidad, anomalías morfológicas y porcentaje de acrosomías. 3.4.4. Dilución y refrigeración a distintos tiempos Tras comprobar que todos los eyaculados tenían una calidad aceptable, se procedió a realizar la mezcla de los mismos, obteniendo de esta manera un pool de trabajo, que se mantuvo a 37ºC. Tras homogeneizar la mezcla con ayuda de una pipeta Pasteur, se procedió a evaluar las características seminales con el objeto de fijar los valores iniciales antes de la aplicación de los protocolos de tecnología seminal. Acto seguido, se extrajo 1/6 parte del volumen del pool seminal (alícuota A) con la finalidad de ser procesada por el método de congelación tradicional, donde los diluyentes 1 y 2 tendrían un porcentaje de glicerol del 3 y 7%; esta fracción se considero como “alícuota control”. Por otro lado, en un vaso de precipitado permanecía la 5/6 parte del volumen del pool de semen (alícuota R) con el propósito de procesarse posteriormente durante diferentes periodos de refrigeración, antes de ser congeladas. Una vez aisladas ambas alícuotas (alícuotas A y R, representando 1/6 y 5/6 del volumen eyaculado, respectivamente), se realizó una valoración de la concentración espermática en ambas fracciones para confirmar la cantidad de espermatozoides en ellas. A continuación, estas partes se centrifugaron por separado y, tras desechar el respectivo sobrenadante, se les añadió la cantidad correspondiente del diluyente 1, calculada para obtener una dilución seminal de 200 x 106 de espermatozoides/ml. La composición del diluyente 1 añadido a la alícuota control (alícuota A, 1/6) era la misma que la especificada en la experiencia 1 (tabla 3.1), es decir, presentaba un 20% de yema de huevo y un Material y Métodos 101 Tabla 3.4. Grupos experimentales definidos en función del tiempo de equilibrado (30, 60, 90, 120 minutos) y la posterior exposición a vapores de nitrógeno líquido (5, 10, 15 minutos) Periodo de equilibrado a 4ºC Congelación en vapores NL 30 Minutos 60 Minutos 90 Minutos 120 Minutos 5 Minutos A5 B5 C5 D5 10 Minutos A10 B10 C10 D10 15 Minutos A15 B15 C15 D15 3.5.6. Descongelación del semen y valoración de la calidad seminal La descongelación se realizó de la forma habitual (70ºC, 8 segundos). Posteriormente, se depositaba su contenido en 0.5 ml de PBS (37ºC), esperando unos 5 minutos a que la muestra se atemperase, antes de comenzar con la evaluación post-descongelación. Las pajuelas de cada uno de los 12 grupos experimentales se valoraron de manera individual. La motilidad espermática total y progresiva se evaluó en la totalidad de las pajuelas descongeladas (entre 15 y 20 pajuelas/grupo), mientras el porcentaje de espermatozoides normales (cabeza, pieza intermedia, cola) y de acrosomas alterados se determinó en 1 de cada 2 pajuelas descongeladas. La metodología empleada fue similar a las experiencias previas. 3.5.7. Análisis estadístico Los resultados han sido presentados como media (± error estándar de la media). Los datos fueron analizados con el programa estadístico SAS (Versión 9.0, SAS Institute, Inc., Cary, NC). El modelo de estudio se realizó mediante un análisis ANOVA de medidas repetidas con el objeto de determinar el efecto de los diferentes parámetros estudiados así como la interacción existente entre los mismos; de este modo las variantes estudiadas fueron el tiempo de equilibrado (30, 60, 90 y 120 minutos) y el tiempo de exposición a vapores de nitrógeno líquido (5, 10 y 15 minutos). Las variables (motilidad espermática, espermatozoides con morfología anormal y acrosomías) se expresaban en porcentajes calculados a partir de la transformación de los datos mediante el arcoseno antes del análisis. Las diferencias significativas entre medias quedaban establecidas cuando se comparaban utilizando un test de Tukey, considerando que los valores eran estadísticamente significativos cuando p<0.05. Material y Métodos 102 Figura 3.6. Plan experimental de la Experiencia 5 Material y Métodos 103 3.6. EXPERIENCIA 6: CARACTERÍSTICAS DEL SEMEN CONGELADO Y ALMACENADO EN NITRÓGENO LÍQUIDO VS NITRÓGENO SECO 3.6.1. Animales, plan sanitario, alimentación y alojamiento La experiencia 6 fue llevada a cabo utilizando 5 machos de distintas razas (1 Beagle, 1 Bulldog Francés, 1 Teckel, 1 Labrador Retriever y 1 mestizo) pertenecientes, como en casos anteriores, a propietarios particulares. Una vez más, se solicitaba que los animales se encontrasen dentro de los requerimientos sanitarios y capacidades reproductivas exigidas, para catalogarlos aptos para nuestro estudio. En función de la combinación de razas utilizadas, el peso de los animales participantes se sitúo entre los 6 y 25 kilos, mientras que su edad se comprendía entre 1 y 4 años. 3.6.2. Diseño experimental La experiencia comenzaba con la recogida y estudio seminal de los 5 perros, se generaba un pool y finalmente el semen se sometía al protocolo habitual de congelación seminal en nitrógeno líquido. Una vez congeladas en nitrógeno líquido, las pajuelas se distribuían en 2 grupos: un grupo continuaba almacenado en el criocontenedor de nitrógeno líquido (NL), mientras el segundo grupo se almacenaba en el criocontenedor de nitrógeno seco (NS). El plan experimental aparece reflejado en la figura 3.7. Posteriormente, las pajuelas eran descongeladas tras varios días de crioconservación en ambos protocolos. El objetivo era valorar las características seminales (motilidad espermática total y progresiva, anomalías morfológicas y acrosomías), contrastando si la calidad seminal se modificaba en función del tiempo almacenado y el método de almacenamiento. Siguiendo este procedimiento, el número de pajuelas valoradas fueron 10 para cada método (NL y NS) a los días 1, 2, 3, 5 y 7 post-congelación. 3.6.3. Recogida, contrastación, dilución y congelación seminal La experiencia comenzaba con la obtención del semen mediante estimulación manual y se continuaba con una valoración del mismo, para determinar sus características, mientras se conservaba a baño María de 37ºC. Después de seleccionar los eyaculados adecuados para el estudio, se procedió a realizar la mezcla de los mismos y generar un pool. Material y Métodos 104 Tras definir las características del pool (motilidad espermática total y progresiva, concentración espermática, anomalías morfológicas y acrosomías), se continuó con los procesos de diluyo-conservación, de forma similar a lo descrito para la experiencia 1. Brevemente, en primer lugar se adicionó el diluyente 1 (Dil-1, tabla 3.1) en volumen suficiente para obtener una dilución seminal de 200 x 106 millones de espermatozoides/ml. Seguidamente, tras pasar el correspondiente periodo de equilibrado en cámara frigorífica a 4ºC (1 h) y comprobar que el semen mantenía suficiente calidad para continuar el proceso, se proseguía con la adición del diluyente 2 (Dil-2a, tabla 3.1) hasta alcanzar una concentración final de 100 x 106 millones de espermatozoides/ml, 20% de yema de huevo, 5% de glicerol y 1% Equex. Posteriormente, el semen fue empajuelado y las pajuelas expuestas a vapores de nitrógeno líquido durante 15 minutos, para terminar por sumergirlas en nitrógeno líquido. Finalmente, las pajuelas fueron equitativamente distribuidas en globelets formando 2 grupos: uno de ellos se almacenó en el criocontenedor de nitrógeno líquido (NL), mientras que el otro se dispuso en un criocontenedor de nitrógeno seco (NS). El criocontenedor de NS había sido previamente rellenado con NL y una vez que la temperatura en la cámara interna del criocontenedor de NS era inferior a -160ºC, el nitrógeno líquido residual fue eliminado. Durante el resto del periodo experimental no se añadió más nitrógeno líquido al criocontenedor de nitrógeno seco. El criocontenedor de nitrógeno seco utilizado fue el modelo Cryogenic Dry Shipper PSX1000 (Cryoport System®). Las dimensiones externas del mismo eran de 62.2 cm x 7.1 cm de diámetro, mientras que el radio de acceso a la zona interna de stock de muestras era de 7.1 mm. Su capacidad de almacenaje es de 290 pajuelas de 0.5 ml, el volumen de nitrógeno líquido capaz de absorber es 5 litros y puede mantener (según las indicaciones del fabricante) una temperatura inferior a -160ºC, hasta 8 días aproximadamente. El número de pajuelas congeladas fue de 100, de manera que en cada uno de los métodos testados se almacenaron un total de 50 pajuelas. Material y Métodos 105 3.6.4. Descongelación y valoración seminal post-descongelación Con el objetivo de evaluar las modificaciones que pudieran ocasionarse en los parámetros seminales cómo resultado del método de almacenamiento y el tiempo de permanencia en los mismos, se estandarizó un protocolo de descongelaciones seriadas los días 1, 2, 3, 5 y 7 postcongelación. Por tanto, para cada día de descongelación propuesto se llevo a cabo la descongelación de 20 pajuelas (10 almacenadas en NL y 10 almacenadas en NS). El procedimiento seguido fue idéntico que los descritos con anterioridad, es decir, depositar el contenido de la pajuela en 0.5 ml de tampón Tris Buffer, tras haber sumergido la pajuela durante 8 segundos en un baño a 70ºC. La valoración de los diferentes parámetros seminales (motilidad espermática subjetiva, total y progresiva, anomalías morfológicas y acrosomías) se realizó siguiendo el procedimiento descrito en las experiencias anteriores. La motilidad espermática se valoró en todas las pajuelas, alrededor de 5 minutos tras la descongelación de las mismas, una vez que el semen se hubiese atemperado a 37ºC. Asimismo, las acrosomías y morfoanomalías se valoraron en 1 de cada dos pajuelas, seleccionadas al azar. Por otro lado, con el fin de monitorizar las variaciones de temperatura en el criocontenedor de NS, este parámetro se valoró todos los días evaluados (1, 2, 3, 5 y 7) haciendo uso de un termómetro Crison. Para ello, la sonda se introducía hasta el fondo del criocontenedor dónde, tras cerrar herméticamente el recipiente, la temperatura se registraba (a través de la pantalla digital). El tiempo que se empleaba en la determinación de la temperatura era alrededor de 5 minutos. 3.6.5. Análisis estadístico Los resultados han sido presentados como media (± error estándar de la media). Los datos fueron analizados con el programa estadístico SAS (Versión 9.0, SAS Institute, Inc., Cary, NC). El modelo de estudio se realizó mediante un análisis ANOVA Factorial con el objeto de determinar el efecto y la interacción de los parámetros estudiados, que en este experimento fueron el método de congelación (NL y NS) y el tiempo de criopreservación (1, 2, 3, 5 y 7 días). Las variables (motilidad espermática, espermatozoides con morfología anormal y espermatozoides con acrosomas alterados) se expresaban en porcentajes calculados a partir de la transformación de los datos mediante el arcoseno antes del análisis. Las diferencias significativas entre medias quedaban establecidas cuando se comparaban utilizando un test de Tukey, considerando que los valores eran estadísticamente significativos cuando p<0.05. Material y Métodos 106 Figura 3.7. Plan experimental de la Experiencia 6 Material y Métodos 107 3.7. EXPERIENCIA 7: NIVELES PLASMÁTICOS DE TESTOSTERONA EN FUNCIÓN DE LA ESTIMULACIÓN SEXUAL 3.7.1. Animales, plan sanitario, alimentación y alojamiento En esta fase experimental se utilizaron 4 machos de raza Beagle, con pesos comprendidos entre los 12 y 14 kilos y un rango de edad que se situaba entre los 3 y 6 años. Dos de ellos pertenecían a la Unidad de Reproducción y Obstetricia de la Facultad de Veterinaria (ULPGC), mientras que los otros dos eran de propietarios particulares. En cualquier caso, e independientemente del origen, al igual que para el resto de experiencias descritas, se realizó un control adecuado de su estado sanitario, alimentación, alojamiento y cualidades reproductivas (líbido y características reproductivas). 3.7.2. Diseño experimental El objetivo de esta experiencia era determinar si se producían variaciones en los niveles plasmáticos de testosterona alrededor de la estimulación sexual y la eyaculación. El plan experimental se muestra en la figura 3.8. Para ello se utilizaron 4 perros de la raza Beagle, a los que se le extrajeron muestras de sangre durante diferentes tiempos distribuidos en torno a la estimulación sexual (justo antes de la mismas y 10, 30, 60 y 120 minutos después). Este protocolo de extracción sanguínea se repitió un total de 9 veces, distribuidas en 3 ciclos: - Ciclo 1, grupo control: 3 repeticiones sin estimulación sexual, para determinar los niveles plasmáticos de testosterona basal en ausencia de estímulo. - Ciclo 2, estimulación hormonal: 3 repeticiones con estimulación mediante la aplicación de hCG. - Ciclo 3, estimulación sexual: 3 repeticiones con recogida seminal mediante estimulación manual. Una vez procesadas las muestras, se almacenaron en congelación hasta el momento de su valoración. La determinación de los niveles plasmáticos de testosterona se realizó mediante quimioluminiscencia en un laboratorio especializado. Material y Métodos 108 3.7.3. Extracción de sangre La extracción de sangre para determinar la concentración de testosterona en plasma se realizaba por punción de las venas braquiales y/o yugulares. Al tratarse de 6 tomas de sangre, se alternó los vasos de extracción para producir el mínimo daño posible al animal, intentando no puncionar dos veces seguidas el mismo vaso sanguíneo. El volumen de sangre extraída oscilaba entre 2 y 3 ml y se disponía inmediatamente en un tubo heparinizado (Venoject Terumo®), homogeneizando adecuadamente con el fin de evitar siempre que se produjese la coagulación. Las muestras eran almacenadas en refrigeración hasta el momento de su procesado; en cualquier caso, el periodo máximo de refrigeración antes de su procesado nunca fue superior a 1 hora. Las muestras se centrifugaban en una centrífuga Kubota (Modelo 5100) durante 15 minutos a una velocidad de 2.000 x g. A continuación, el plasma resultante era depositado en tubos debidamente identificados que se almacenaban en congelación a -80ºC para la correcta conservación del plasma. 3.7.4. Métodos de estimulación: recogida seminal y hCG Como se expuso en el plan experimental, el ensayo fue repetido un total de 9 veces. Los primeros 3 ensayos (grupo control, ciclo 1), se caracterizaban por la ausencia de estimulación sexual, mientras que en los 6 ensayos restantes se produjo algún tipo de estimulación, bien tras administración de un tratamiento hormonal (ciclo 2) o por recogida seminal (ciclo 3). En el grupo control, las muestras sanguíneas se recogieron durante 2 horas consecutivas, concretamente a los 0, 10, 30, 60 y 120 minutos, realizando este proceso en 3 ocasiones. Tras finalizar la fase control, se realizó un nuevo ciclo de 3 repeticiones que se desarrollo en un periodo de 2 semanas. En este caso, se pretendía valorar la influencia de la administración de hCG exógena sobre la función esteroidogénica. El producto que se utilizó fue la Gonadotropina Coriónica humana (hCG Lepori, Farma Lepori®) a una dosis de 1000 UI y la vía de administración fue subcutánea. El protocolo llevado a cabo en esta fase se describe a continuación: 1º) Extracción de sangre  justo antes de la administración de hCG. 2º) Administración de hCG  Inmediatamente después de la 1º extracción sanguínea. 3º) Extracción de sangre  10 minutos después de la administración de hCG. Material y Métodos 109 4º) Extracción de sangre  30 minutos después de la administración de hCG. 5º) Extracción de sangre  60 minutos después de la administración de hCG. 6º) Extracción de sangre  120 minutos después de la administración de hCG. Por otro lado, el último ciclo del experimento constaba de 3 repeticiones y también tuvo lugar en un periodo de 2 semanas (al menos con 3-4 días de descanso entre extracciones). En este caso, la toma de muestras de sangre fue acompañada de una recogida seminal (estimulación manual) y eyaculación. El protocolo seguido en esta fase fue el siguiente: 1º) Extracción de sangre  justo antes de la recogida seminal. 2º) Recogida seminal  Inmediatamente después de la 1º extracción sanguínea. 3º) Extracción de sangre  10 minutos después de la recogida seminal. 4º) Extracción de sangre  30 minutos después de la recogida seminal. 5º) Extracción de sangre  60 minutos después de la recogida seminal. 6º) Extracción de sangre  120 minutos después de la recogida seminal. En este grupo, el momento 0 se definió cuando los perros completaron la eyaculación. El tiempo que transcurría entre el inicio de la estimulación sexual hasta la completa eyaculación osciló entre 5-6 minutos en todos los perros. No se utilizó una hembra en celo para inducir la estimulación sexual. El semen obtenido fue valorado en fresco para determinar los parámetros de calidad seminal. Así, utilizando los protocolos habituales, se definieron la motilidad espermática subjetiva, total y progresiva, concentración de espermatozoides, anomalías morfológicas y acrosomías. 3.7.5. Determinación de los niveles plasmáticos testosterona Finalmente, tras finalizar la recogida de muestras sanguíneas, una vez obtenido el plasma se almacenó, para posteriormente ser enviado a un laboratorio de referencia (VetLab, Barcelona) para la determinación de los niveles hormonales de testosterona en sangre en los distintos tiempos propuestos. Material y Métodos 110 La técnica utilizada para tal fin fue la electroquimioluminiscencia, definida como la emisión de radiación electromagnética producida por una reacción química. Se utilizó un kit comercial de testosterona (Testosterona, Roche Diagnostics®) que el laboratorio había validado para su utilización en la especie canina. El procedimiento presenta un principio básico donde la muestra (50 μl) se incuba con un anticuerpo específico antitestosterona y un derivado de testosterona marcado con quelato de rutenio. Los puntos de fijación del anticuerpo marcado son ocupados, según sea la concentración de testosterona presente en la muestra, en parte por la testosterona de la muestra y en parte por el hapteno marcado con rutenio, provocando la formación del inmunocomplejo respectivo. En una segunda incubación, tras la incorporación de micropartículas recubiertas de estreptavidina, el complejo formado se fija a la fase sólida por la interacción entre la biotina y estreptavidina. Finalmente, la mezcla de reacción es trasladada a la célula de lectura donde, por magnetismo, las micropartículas se fijan temporalmente a la superficie del electrodo. Al aplicar una corriente eléctrica definida, se produce una reacción quimioluminiscente cuya emisión de luz se mide directamente con un fotomultiplicador. El protocolo incluía la utilización de un analizador automático Elecsys 1010/2010 (Roche Diagnostics®). La curva de referencia presentaba un rango que oscilaba entre 0.1 y 20 ng/ml. La sensibilidad del ensayo fue de 0.04 ng/ml y los coeficientes de variación intraensayo fueron del 2.8% y 11.2%, para unas muestras conocidas con baja (0.5 ng/ml) y alta (8 ng/ml) concentración de testosterona, respectivamente. 3.7.6. Análisis estadístico Los resultados han sido presentados como media (± error estándar de la media). Los datos fueron analizados con el programa estadístico SAS (Versión 9.0, SAS Institute, Inc., Cary, NC). El modelo de estudio se realizó mediante un análisis ANOVA de medidas repetidas con el objeto de determinar el efecto de los diferentes parámetros estudiados así como la interacción existente entre los mismos; de este modo las variantes estudiadas fueron los machos (4 perros), el tratamiento experimental (control, administración de hCG y recogida seminal) y el tiempo de la medición hormonal (0, 10, 30 60 y 120 minutos tras la estimulación). Las variables (motilidad espermática, espermatozoides con morfología anormal y espermatozoides con acrosomas alterados) se expresaban en porcentajes calculados a partir de la transformación de los datos mediante el arcoseno antes del análisis. Las diferencias significativas entre medias quedaban establecidas cuando se comparaban utilizando un test de Tukey, considerando que los valores eran estadísticamente significativos cuando p<0.05. Resultados 117 Tabla 4.3. Motilidad total (media ± sem) post-descongelación de muestras preservadas en ultracongelador (0.5% Equex) a lo largo del tiempo xy: Letras diferentes dentro de la misma fila representan diferencias significativas (p<0.05) En la tabla 4.4 quedan registrados los porcentajes de motilidad total del semen procesado con un 1.0% de Equex y posteriormente almacenadas en ultracongeladores durante distintos periodos de tiempo. En el día 1 post-congelación, los porcentajes de motilidad total se situaban siempre por debajo del 80%, alcanzando los valores más bajos en los perros 4 y 7. Dentro de cada individuo, estos valores se mantuvieron prácticamente inalterados transcurridos 30 días de conservación, con porcentajes bastante similares con respecto al día 1 post-congelación (nunca superior a un 10% de diferencia). No obstante, a los 3 meses de conservación los valores medios individuales oscilaron de forma más notoria, mostrando un rango que se situaba entre un 50 y un 80%. En cualquier caso, al analizar las valores medios del total de individuos, se constató que los porcentajes de motilidad siempre se situaban entre un 66-67%, independientemente del periodo de tiempo transcurrido, por lo que evidentemente no se detectaron diferencias significativas entre estos valores para los tiempos evaluados. Periodos de evaluación 1 día 1 mes 3 meses Perro 1 76.43 ± 5.07 48.78 ± 6.77 71.41 ± 7.03 Perro 2 76.55 ± 5.21 57.41 ± 8.95 80.67 ± 5.76 Perro 3 79.90 ± 0.87 79.74 ± 3.05 82.71 ± 2.99 Perro 4 59.71 ± 4.39 64.39 ± 4.97 59.43 ± 7.16 Perro 5 63.79 ± 4.27 60.36 ± 4.03 62.16 ± 4.36 Perro 6 65.99 ± 7.40 73.99 ± 3.77 72.70 ± 4.57 Perro 7 59.68 ± 3.80 61.59 ± 2.43 66.69 ± 1.87 Perro 8 71.00 ± 3.87 77.95 ± 3.57 79.74 ± 1.99 Media 68.71 ± 1.76xy 66.36 ± 2.16y 71.71 ±2.11x Resultados 118 Tabla 4.4. Motilidad total (media ± sem) post-descongelación de muestras preservadas en ultracongelador (1.0% Equex) a lo largo del tiempo Periodos de evaluación 1 día 1 mes 3 meses Perro 1 69.87 ± 2.83 63.74 ± 1.69 71.41 ± 7.03 Perro 2 67.03 ± 4.13 75.84 ± 3.02 76.14 ± 2.12 Perro 3 79.10 ± 2.68 74.72 ± 4.73 82.90 ± 2.64 Perro 4 57.92 ± 2.72 55.84 ± 3.56 49.50 ± 3.24 Perro 5 59.65 ± 4.96 64.43 ± 4.64 63.78 ± 2.65 Perro 6 74.82 ± 4.96 78.10 ± 4.15 60.75 ± 5.16 Perro 7 57.40 ± 4.15 55.68 ± 3.64 55.00 ± 4.47 Perro 8 63.09 ± 6.27 71.90 ± 4.21 67.76 ± 3.76 Media 66.14 ± 1.69 67.76 ±1.68 66.13 ± 2.05 La tabla 4.5 representa los porcentajes medios de motilidad total obtenidos en los diferentes métodos de congelación para los distintos periodos de tiempos establecidos. Cuando se realiza una comparativa de los métodos de congelación para un periodo de tiempo determinado, se puede evidenciar como, en el día 1 de preservación, el porcentaje de motilidad total de las muestras almacenada en NL se mostró significativamente mayor (72%, p<0.01) que el obtenido para las conservadas en UF-1 (66%), no evidenciando diferencias con respecto a los porcentajes obtenidos para las muestras conservadas a UF-0.5. Asimismo, tras 1 mes de conservación, las alícuotas procesadas en NL fueron las que seguían manteniendo los valores más elevados, si bien sólo se observaron diferencias significativas (p<0.01) con respecto a las dosis procesadas con el protocolo UF-0.5. Finalmente, 3 meses después de la preservación seminal, los porcentajes registrados en NL y UF-0.5 (próximos al 72%) fueron significativamente superiores (p<0.01 y p<0.05, respectivamente) que los observados en UF-1 (66%). Resultados 119 Tabla 4.5. Motilidad total (media ± sem) post-descongelación de muestras preservadas en los diferentes protocolos de criopreservación a lo largo del tiempo Protocolos de criopreservación Periodos de evaluación NL UF-0.5 UF-1 1 día 72.38 ± 1.54x,1 68.71 ± 1.76xy,12 66.14 ± 1.692 1 mes 73.83 ± 1.52x,1 66.36 ± 2.16y,2 67.76 ±1.6812 3 meses 72.96 ± 1.92x,1 71.71 ± 2.11x,1 66.13 ± 2.052 12 meses 73.82 ± 1.47x - - 18 meses 64.72 ± 1.94y - - xy: Letras diferentes dentro de la misma columna representan diferencias significativas (p<0.05) 12: Números diferentes dentro de la misma fila representan diferencias significativas (p<0.05) NL: muestras preservadas en nitrógeno líquido. UF-0.5: muestras preservadas en ultracongeladores y un 0.5% de Equex; UF-1: muestras preservadas en ultracongeladores y un 1.0% de Equex 4.1.3. Evolución de la motilidad progresiva post-descongelación en los diferentes protocolos de congelación En la tabla 4.6 quedan reflejados los porcentajes de motilidad progresiva en las muestras de semen almacenadas en NL durante diferentes periodos de tiempo. En general, los valores registrados 1 día post-congelación se situaban entre el 52% y el 72% aproximadamente, de forma que la mitad de los ejemplares (perros 2, 3, 6 y 8) presentaban valores por encima del 60% mientras que la otra mitad (perros 1, 4, 5 y 7) se encontraban por debajo de este porcentaje. Este rango de motilidad progresiva prácticamente se mantuvo transcurridos 30 y 90 días de preservación en nitrógeno líquido, alcanzando en ambos periodos valores superiores al 60% en 5 de los individuos, mostrando el perro 5 los valores más bajos, con registros del 43% y 37%, respectivamente para 1 y 3 meses. Por otro lado, 12 meses después de la congelación, los registros fueron algo más heterogéneos que los descritos para los periodos anteriores, de forma que en el 75% (6/8) de los animales, los porcentajes se mantuvieron por encima del 55%, si bien en 3 de ellos, incluso, se situaron próximos o superiores al 70%. Transcurridos 18 meses de almacenamiento en NL, se detectó una disminución de la motilidad en la totalidad de los animales con valores siempre por debajo del 63%. Asimismo, se pudo observar que para todos los periodos de estudio, los animales Resultados 120 que presentaron continuamente los mayores registros fueron los perros 3, 6 y 8, mientras que el perro 5 se caracterizó por manifestar siempre los menores porcentajes. Con respecto a los valores de motilidad progresiva medios, éstos se situaron en torno al 60% desde el día 1 post-congelación hasta transcurridos 12 meses de la misma; sin embargo, el decrecimiento en los porcentajes de este parámetro después de 18 meses de congelación quedo de manifiesto con el 47% registrado en este periodo, valor significativamente inferior (p<0.01) al resto de los resultados medios detectados con anterioridad. Tabla 4.6. Motilidad progresiva (media ± sem) post-descongelación de muestras preservadas en nitrógeno líquido Periodos de evaluación 1 día 1 mes 3 meses 12 meses 18 meses Perro 1 55.97 ± 8.26 60.61 ± 8.08 56.12 ± 7.66 55.28 ± 6.30 57.67 ± 8.95 Perro 2 61.10 ± 9.83 66.46 ± 3.70 61.09 ± 5.71 49.26 ± 5.66 35.57 ± 8.06 Perro 3 64.44 ± 2.88 72.72 ± 4.77 71.62 ± 3.76 75.28 ± 3.27 40.74 ± 4.80 Perro 4 53.12 ± 4.50 56.83 ± 5.26 51.68 ± 8.35 57.70 ± 4.35 63.28 ± 2.81 Perro 5 51.95 ± 4.63 43.27 ± 3.83 37.66 ± 9.01 49.79 ± 9.65 45.19 ± 10.30 Perro 6 66.92 ± 4.02 65.81 ± 5.42 68.76 ± 3.27 70.38 ± 3.44 62.24 ± 2.78 Perro 7 57.87 ± 3.01 51.84 ± 3.56 60.91 ± 2.25 56.62 ± 2.90 41.78 ± 7.11 Perro 8 71.59 ± 3.16 73.41 ± 1.91 70.80 ± 2.64 69.78 ± 5.12 37.18 ± 5.36 Total 60.57 ± 1.81x 62.03 ± 2.07x 60.10 ± 2.30x 60.65 ± 2.08x 47.53 ± 2.53y xy: Letras diferentes dentro de la misma fila representan diferencias significativas (p<0.05) La tabla 4.7 recoge los datos de motilidad progresiva para las muestras seminales congeladas en ultracongelador tras haber sido procesadas con un 0.5% de Equex. Tras un día de congelación, los porcentajes de motilidad fueron superiores al 55% en 5 de los perros (ejemplares 1, 2, 3, 6 y 8); no obstante, en los restantes machos, los valores obtenidos fueron inferiores, situándose Resultados 121 en torno al 50% e incluso por debajo (perro 7). Posteriormente, 1 mes post-congelación, los porcentajes oscilaron de forma no uniforme, de manera que se incrementaron en algunos ejemplares mientras que en otros decrecieron; en cualquier caso, el rango en este periodo se situó entre el 30% y el 70% aproximadamente, si bien en la mitad de los ejemplares los registros se encontraron por debajo del 50%. Por otro lado, a los 3 meses de preservación, los porcentajes de motilidad progresiva no mostraron un descenso importante con respecto a los valores obtenidos al mes, e incluso en dos de los ejemplares (perros 1 y 2), los registros de motilidad fueron equiparables a los obtenidos tras 1 mes de conservación. Al analizar el total de ejemplares, sólo se observaron diferencias significativas (p<0.05) entre las muestras preservadas durante 1 y 3 meses (53.5% y 59.9%, respectivamente), no evidenciándose diferencias con el valor medio obtenido el día 1 de preservación. Tabla 4.7. Motilidad progresiva (media ± sem) post-descongelación de muestras preservadas en ultracongelador (0.5% Equex) a lo largo del tiempo xy: Letras diferentes dentro de la misma fila representan diferencias significativas (p<0.05) Periodos de evaluación 1 día 1 mes 3 meses Perro 1 66.54 ± 6.21 29.96 ± 6.33 59.17 ± 9.41 Perro 2 67.20 ± 5.48 43.59 ± 10.85 72.01 ± 7.79 Perro 3 69.42 ± 2.38 66.58 ± 4.90 71.86 ± 6.45 Perro 4 50.51 ± 4.61 58.80 ± 5.57 49.68 ± 8.43 Perro 5 50.47 ± 4.96 47.31 ± 5.81 45.34 ± 4.14 Perro 6 57.13 ± 8.20 64.30 ± 4.53 61.38 ± 3.43 Perro 7 42.42 ± 3.89 40.82 ± 2.79 52.91 ± 3.53 Perro 8 59.25 ± 2.67 70.10 ± 4.62 69.10 ± 2.88 Media 57.21 ± 1.99xy 53.54 ± 2.76x 59.98 ± 2.55y Resultados 122 Los porcentajes de motilidad progresiva de las muestras procesadas con un 1% de Equex y posteriormente congeladas y almacenadas en ultracongelador durante 3 meses quedan expuestos en la tabla 4.8. Transcurridas 24 horas de almacenamiento en ultracongelador, los porcentajes alcanzaron valores superiores al 60% en 2 de los perros y por debajo del 40% en otros 2, estableciéndose los registros medios en un 52%, aproximadamente. Asimismo, 1 mes después del procesado y almacenamiento, estos registros sólo descendieron de forma notoria en el perro 1, mientras que en el resto de los ejemplares se mantuvieron iguales o, incluso, aumentaron ligeramente, lo que produjo que el valor medio se estableciese en torno a un 55%. Algo similar sucedió después de 3 meses de preservación, ya que los porcentajes no disminuyeron en todos los ejemplares, situándose siempre entre el 41% y el 72%, mientras que el registro medio se situó en tormo a un 55%. Por tanto, al comparar las medias en la totalidad de los animales, la motilidad progresiva mostró unos valores muy similares para los distintos periodos de tiempos evaluados en UF-1, no registrándose diferencias significativas. Tabla 4.8. Motilidad progresiva (media ± sem) post-descongelación de muestras preservadas en ultracongelador (1.0% Equex) a lo largo del tiempo Periodos de evaluación 1 día 1 mes 3 meses Perro 1 54.71 ± 3.14 44.11 ± 3.55 - Perro 2 52.91 ± 5.77 62.72 ± 5.45 64.59 ± 3.40 Perro 3 66.97 ± 4.02 62.56 ± 6.69 72.46 ± 4.22 Perro 4 39.57 ± 5.76 41.15 ± 6.56 45.41 ± 5.82 Perro 5 41.32 ± 6.94 54.16 ± 5.94 45.68 ± 3.59 Perro 6 68.30 ± 6.62 68.65 ± 4.68 53.30 ± 7.52 Perro 7 39.62 ± 4.23 38.79 ± 5.19 41.51 ± 6.37 Perro 8 52.43 ± 6.62 61.61 ± 6.32 56.24 ± 5.76 Media 51.84 ± 2.32 54.55 ± 2.31 54.59 ± 2.54 Resultados 123 La tabla 4.9 muestra los resultados medios de motilidad progresiva obtenidos en el semen procesado y almacenado en los diferentes métodos (NL, UF-0.5 y UF-1) a lo largo del periodo experimental. Cuando analizamos los resultados entre los distintos métodos para un periodo de tiempo determinado, se puede observar como el porcentaje de motilidad progresiva del semen almacenado en UF-1 (52%) fue inferior (p<0.01 para NL; p<0.05 para UF-0.5) a los alcanzados en NL y UF-0.5 (en torno al 57-60%). Transcurrido 1 mes de preservación, la motilidad progresiva continuó siendo superior en el protocolo con NL (60%, p<0.01) con respecto a los valores alcanzados para las muestras procesadas en el ultracongelador (53-54%), que no mostraban diferencias entre sí. Finalmente, 3 meses después de la congelación, los porcentajes de motilidad presentes para NL y UF-0.5 (60%) fueron ligeramente superiores al existente en UF-1 (55%), sin llegar a mostrar diferencias significativas entre ellos. Tabla 4.9. Motilidad progresiva (media ± sem) post-descongelación de muestras criopreservadas en los diferentes protocolos a lo largo del tiempo Protocolos de criopreservación Periodos de evaluación NL UF-0.5 UF-1 1 día 60.57 ± 1.81x,1 57.21 ± 1.99 xy,1 51.84 ± 2.322 1 mes 62.03 ± 2.07x,1 53.54 ± 2.76y,2 54.55 ± 2.312 3 meses 60.10 ± 2.30x 59.98 ± 2.55x 54.59 ± 2.54 12 meses 60.65 ± 2.08x - - 18 meses 47.53 ± 2.53y - - xy: Letras diferentes dentro de la misma columna representan diferencias significativas (p<0.05) 12: Números diferentes dentro de la misma fila representan diferencias significativas (p<0.05) NL: muestras preservadas en nitrógeno líquido. UF-0.5: muestras preservadas en ultracongeladores y un 0.5% de Equex; UF-1: muestras preservadas en ultracongeladores y un 1.0% de Equex Resultados 124 4.1.4. Porcentaje de morfoanomalías post-descongelación en los diferentes protocolos de criopreservación Las tabla 4.10 muestra los registros de cabezas anormales presentes en el semen preservado, que mostraban una distribución bastante homogénea. De esta manera, en la mayor parte de los periodos valorados e independientemente del método, el valor máximo alcanzado siempre estuvo por debajo de un 10%, a excepción de una muestra crioconservada en UF-0.5% (1 día de conservación, 13%). Los porcentajes de cabezas anómalas en las dosis conservadas en NL fueron muy similares durante los 3 primeros meses de almacenamiento, presentando valores medios que se situaban entre el 2.9% y 3.4%, sin mostrar diferencias significativas entre ellos. Asimismo, transcurridos 12 y 18 meses de la congelación, los porcentajes de anomalías en la cabeza se mantuvieron prácticamente inalterables (en torno al 2%) en ambos intervalos de tiempo, siendo (p<0.05) con respecto a los periodos de tiempos previos (1 día, 1 mes, 3 meses). Por el contrario, en las dosis seminales conservadas en ultracongeladores, los porcentajes de cabezas anómalas se mostraron bastante homogéneas a lo largo del tiempo, de forma que tanto en UF-0.5 como en UF-1 no existieron diferencias importantes en los porcentajes medios a lo largo de todo el periodo experimental, oscilando entre un 2 y un 3% aproximadamente. Por otro lado, cuando realizamos un análisis de los resultados obtenidos entre los distintos métodos de criopreservación para un periodo de tiempo concreto, no se detectaron diferencias significativas entre los distintos métodos tras 1 día de congelación. No obstante, en las muestras conservadas durante un mes post-congelación, el porcentaje de cabezas anómalas en NL (3.4%) fue significativamente superior (p<0.05) al alcanzado (2.4%) en las muestras conservadas en UF-1, si bien ninguna de ellas mostró diferencias relevantes respecto al obtenido en UF-0.5. Tras 3 meses de conservación, el NL registró una cantidad de anomalías de cabezas significativamente mayor (p<0.05) que las halladas en el UF-0.5, mientras que el porcentaje (2.8%) detectado en UF-1 no estableció diferencias en relación a los otros dos métodos. Resultados 125 Tabla 4.10. Porcentaje de cabezas espermáticas anormales (media ± sem) postdescongelación de muestras criopreservadas en los diferentes protocolos Protocolos de criopreservación Periodos de evaluación NL UF-0.5 UF-1 1 día 2.91 ± 0.29x (0.00-9.00) 3.21 ± 0.42 (0.00-13.00) 2.48 ± 0.36 (1.00-8.00) 1 mes 3.40 ± 0.34x,1 (1.00-8.00) 3.11 ± 0.2012 (1.00-5.00) 2.40 ± 0.282 (0.00-5.00) 3 meses 3.25 ± 0.34x,1 (1.00-6.00) 2.38 ± 0.312 (0.00-5.00) 2.84 ± 0.3612 (0.00-6.00) 12 meses 1.97 ± 0.29y (0.00-6.00) - - 18 meses 2.04 ± 0.36y (0.00-7.00) - - Media total 2.71 ± 0.15 2.93 ± 0.19 2.55 ± 0.19 xy: Letras diferentes dentro de la misma columna representan diferencias significativas (p<0.05) 12: Números diferentes dentro de la misma fila representan diferencias significativas (p<0.05) NL: muestras preservadas en nitrógeno líquido. UF-0.5 : muestras preservadas en ultracongeladores y un 0.5% de Equex; UF-1: muestras preservadas en ultracongeladores y un 1.0% de Equex Los porcentajes de piezas intermedias anómalos (tabla 4.11) detectados en NL fluctuaron a lo largo del tiempo, de manera que los mayores valores se alcanzaron el día 1 post-congelación. Sin embargo, estos valores fueron descendiendo progresivamente a lo largo del tiempo, si bien sólo se establecieron diferencias significativas (p<0.05) entre los registros hallados el día 1 (3.9%) y a los 12 meses (2.2%) de preservación. Analizando el protocolo UF-0.5, los registros de piezas intermedias anormales se situaton entre un 3-4%, no existeiendo diferencias significativas a lo largo del tiempo. Una evolución similar se observó en los porcentajes de piezas intermedias alteradas en las muestras preservadas en UF-1, donde no existía variación en los valores medios (en torno a 2.5-3%) para los distintos periodos de tiempos evaluados. Por otro lado, tampoco se detectaron diferencias relevantes entre métodos cuando se analizó la evolución de los porcentajes de anomalías a nivel de la pieza Resultados 126 intermedias en un mismo periodo de tiempo. Con respecto a los porcentajes de piezas intermedias, la mayor parte de los registros se situaron entre un 0% y un 16%, y sólo una medición puntual en un individuo mostró un porcentaje mayor (24%, día 1, UF-0.5). Tabla 4.11. Porcentaje de piezas intermedias anormales (media ± sem) post-descongelación de muestras criopreservadas en los diferentes protocolos Protocolos de criopreservación Periodos de evaluación NL UF-0.5 UF-1 1 día 3.91 ± 0.71x (0.00-16.00) 3.85 ± 0.84 (0.00-24.00) 2.81 ± 0.54 (0.00-11.00) 1 mes 3.13 ± 0.45xy (0.00-9.00) 2.93 ± 0.49 (0.00-9.00) 2.96 ± 0.47 (0.00-8.00) 3 meses 2.67 ± 0.52xy (0.00-13.00) 2.92 ± 0.55 (0.00-13.00) 2.47 ± 0.48 (0.00-6.00) 12 meses 2.20 ± 0.49y (0.00-11.00) - - 18 meses 3.22 ± 0.73xy (0.00-14.00) - - Media total 3.07 ± 0.27 3.28 ± 0.39 2.77 ± 0.29 xy: Letras diferentes dentro de la misma columna representan diferencias significativas (p<0.05) 12: Números diferentes dentro de la misma fila representan diferencias significativas (p<0.05) NL: muestras preservadas en nitrógeno líquido. UF-0.5: muestras preservadas en ultracongeladores y un 0.5% de Equex; UF-1: muestras preservadas en ultracongeladores y un 1.0% de Equex Con respecto al porcentaje de anomalías de colas espermáticas (tabla 4.12), en las muestras conservadas en NL, los porcentajes obtenidos los días 1, 30 y 90 de conservación se encontraban cercanos al 5%, siendo estos valores significativamente inferiores (p<0.01) a los alcanzados a los 12 y 18 meses post-congelación (con un 8.9 y 10.1%, respectivamente). En cambio, estas diferencias no se detectaron cuando el método utilizado para la conservación fue el ultracongelador. De esta forma, los porcentajes de anomalías en las dosis seminales conservadas Resultados 133 Tabla 4.15. Características (media ± sem) del semen fresco de los diferentes ejemplares y del pool Perro 1 Perro 2 Perro 3 Perro 4 Perro 5 Media Individual Pool Volumen 6.37 ± 0.55 (5.50-7.00) 2.13 ± 0.29 (1.80-2.60) 5.00 ± 0.35 (5.00-6.00) 1.33 ± 0.41 (1.00-2.00) 2.75 ± 0.35 (2.50-3.00) 3.68 ± 0.60 (1.00-7.00) 3.17 ± 0.54 (2.50-4.00) Concentración (x 106 esp/ml) 504.33 ± 52.16 (454.0-589.0) 228.00 ± 28.80 (185.0-266.0) 139.67 ± 31.66 (98.0-187.0) 472.33 ± 88.44 (328.0-549.0) 657.00 ± 96.17 (589.0-725.0) 381.93 ± 55.8 (98.0-725.0) 361.33 ± 8.73 (351.0-375.0) Motilidad Subjetiva 93.33 ± 2.04 (90.00-95.00) 78.33 ± 7.36 (70.00-90.00) 75.00 ± 3.54 (70.00-80.00) 80.00 ± 7.07 (70.00-90.00) 75.00 ± 21.51 (40.00-95.00) 80.33 ± 9.93 (40.00-95.00) 86.67 ± 4.08 (80.00-90.00) Motilidad Total 98.22 ± 1.11 (96.54-99.66) 88.53 ± 4.95 (82.92-96.38) 86.65 ± 1.75 (85.20-89.51) 86.63 ± 6.95 (76.38-95.97) 91.12 ± 9.92 (74.93-99.77) 90.23 ± 2.24 (74.93-99.77) 96.99 ± 1.00 (95.36-97.85) Motilidad Progresiva 92.20 ± 1.50 (89.96-94.18) 81.56 ± 5.63 (75.80-90.64) 78.05 ± 2.21 (75.75-81.60) 76.65 ± 8.09 (66.02-88.76) 81.13 ± 14.09 (58.18-94.14) 81.92 ± 2.91 (58.18-94.18) 89.94 ± 1.30 (87.83-91.24) Morfoanomalías 2.00 ± 1.07 (0.00-4.00) 4.00 ± 1.07 (2.00-6.00) 3.56 ± 0.48 (2.00-5.00) 2.67 ± 0.19 (2.00-3.00) 3.44 ± 1.28 (2.00-6.00) 3.13 ± 0.40 (0.00-6.00) 4.44 ± 0.11 (1.00-.6.00) Acrosomías 1.00 ± 0.58 (0.00-2.00) 4.00 ± 2.08 (0.00-7.00) 3.33 ± 1.45 (1.00-6.00) 2.00 ± 0.58 (1.00-3.00) 1.33 ± 0.33 (1.00-2.00) 2.33 ± 0.55 (0.00-7.00) 3.62 ± 0.31 (2.00-5.00) Resultados 134 Las Figuras 4.1, 4.2 y 4.3 presentan los resultados de motilidad total obtenidos para las muestras de semen individual y en pool expuestas a los diferentes protocolos de preservación: baño María (37ºC), temperatura ambiente (25ºC), 4ºC y/o congelación-descongelación (y conservación a 37ºC). Los valores de motilidad total registrados inicialmente (hora 0) fueron siempre superiores al 90%, tanto para medias individuales como en el pool (91% y 97%, respectivamente). En las alícuotas preservadas a 37ºC (Figura 4.1), se detectó un descenso significativo (p<0.01) de los porcentajes de motilidad total desde la hora 1 (con respecto al momento inicial), presentando valores que se mantuvieron muy estables (alrededor del 60-65%) hasta las 8 h. de preservación en el pool y 4 h. en las muestras individuales, no observándose diferencias importantes a lo largo de este periodo de tiempo. Sin embargo, pasadas 8 h. de incubación a 37ºC, las muestras individuales sufrieron una considerable (p<0.01) disminución de la motilidad total (42.1%) con respecto a las 4 h., continuando este descenso a las 12 h. (28.4%). Al comparar muestras individuales y muestras en pool no se detectaron diferencias significativas, si bien los valores del pool fueron superiores a las 8 y 12 h. de incubación. Tras 24 h., la motilidad total alcanzó valores prácticamente indetectables. Las muestras conservadas a 25ºC (Figura 4.1 y Figura 4.3) presentaron unos valores de motilidad total que perduraron en niveles aceptables (> 50%) prácticamente el doble de tiempo que las preservadas a 37ºC. En las muestras procesadas individualmente, los porcentajes de motilidad total oscilaron entre el 55% y el 70%, entre las horas 1 y 24 de conservación, sin diferencias relevantes entre ellos. Sin embargo, a partir de las 48 horas de preservación, la motilidad espermática sufrió una abrupto descenso, con valores inferiores al 10%, muy por debajo (p<0.01) a los registrados hasta ese momento. En referencia al pool seminal, los porcentajes registrados tampoco mostraron diferencias trascendentes a lo largo del tiempo entre 1 y 24 horas de conservación, con valores en torno a un 60-70% de motilidad total. Posteriormente, a las 48 y 72 h. de preservación, el porcentaje de motilidad total se redujo aproximadamente hasta el 20%, detectándose diferencias significativas (p<0.01) con los registros existentes entre las 0 y 24 horas. Además, continuaron disminuyendo progresivamente a las 96 y 120 horas, alcanzando valores inapreciables tras 6 días de preservación en estas condiciones. All comparar las muestras preservadas a 37ºC y a 25ºC, los valores fueron bastante similares durante las primeras 8 h., pero a partir de ese momento, se registraron mejores porcentajes en las muestras conservadas a 25ºC. Resultados 135 Las muestras conservadas a 4ºC (Figura 4.2 y Figura 4.3) fueron las que más perduraron en el tiempo respecto al resto de temperaturas de preservación, con porcentajes de motilidad total que disminuyeron de manera mucho más progresiva. De este modo, en las medias de las muestras individuales, el porcentaje de motilidad total se mantuvo por encima del 50% (rango 52-71%) desde la hora 1 a la hora 48, no existiendo diferencias relevantes entre los valores detectados en esos periodos de tiempo. Sin embargo, entre los días 3 y 4 de preservación, la motilidad descendió hasta situarse en valores próximos al 41-48%, produciéndose diferencias significativas respecto a los registros en los periodos de tiempos anteriores (p<0.05). A partir de 5 días de preservación, el descenso fue muy progresivo, de tal manera que tras 10 días de conservación a 4ºC, el semen presentó valores inferiores al 10% de motilidad total. Con respecto al pool, de manera general, a lo largo del tiempo se registraron porcentajes de motilidad total algo superiores a los existentes en las medias individuales. De hecho, durante las primeros 4 días, los registros oscilaron entre un 65-80%, con valores prácticamente equiparables a los observados en la hora 0 (96%). A partir de los 7 días de conservación, los porcentajes de motilidad se mantuvieron en torno al 50-60%, para a partir del día 11 comenzar un progresivo descenso, aunque siempre con porcentajes superiores a los detectados en las medias individuales. Finalmente, el semen congelado-descongelado y posteriormente preservado a 37ºC (CD37ºC) mostró datos de motilidad total más bajos así como menor perdurabilidad a lo largo del tiempo (Figura 4.2). Los valores medios de las muestras individuales revelaron unos porcentajes próximos al 40% a las 1 y 2 horas, para sufrir una reducción significativa (p<0.05) tras 4 horas de conservación. Esta evolución se repitió (p<0.01) a las 8 horas, alcanzando en este periodo valores inferiores al 10% de motilidad total. En las muestras del pool, no se detectó una reducción tan patente, presentando valores en torno al 40% durante las primeras 4 horas, para mostrar un valor medio del 27% tras 8 horas de preservación, justo antes de la inactivación (12 h.) de las alícuotas. En cualquier caso, no se detectaron diferencias significativas entre las muestras individuales y las muestras del pool. Resultados 136 Figura 4.1. Motilidad espermática total (media ± sem) en muestras preservadas a 37ºC y 25ºC durante las primeras 24 h. de conservación Figura 4.2. Motilidad espermática total (media ± sem) en muestras preservadas a 4ºC y en muestras congeladas-descongeladas (CD-37ºC) durante las primeras 24 horas de conservación 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 1 2 4 8 12 24 Motilidad espermática total (%) Horas de preservación 37 ºC Individual 37 ºC Pool 25ºC Individual 25ºC Pool 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 1 2 4 8 12 24 Motilidad espermática total (%) Horas de preservación 4 ºC Individual 4 ºC Pool CD-37 ºC Individual CD 37 ºC Pool Resultados 137 Figura 4.3. Evolución de la motilidad espermática total (media ± sem) en muestras preservadas a 25ºC y 4ºC hasta su completa inactivación 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Motilidad espermática total (%) Días de preservación 25 ºC Individual 25 ºC Pool 4 ºC Individual 4 ºC Pool Resultados 138 Las Figuras 4.4, 4.5 y 4.6 muestran los porcentajes de motilidad progresiva registrados para las diferentes alícuotas de semen que, de forma individual y a modo de pool, se mantuvieron conservadas a distintas temperaturas a lo largo del tiempo. En general, se pudo observar como en la casi totalidad de las muestras (tanto en medias individuales como en pool) preservadas durante 1 hora en cualquier temperatura, se registraron porcentajes de motilidad progresiva significativamente (p<0.05) inferiores a los detectados en el momento inicial (hora 0) de valoración. Las muestras preservadas a 37ºC (Figura 4.4) obtuvieron unos registros muy homogéneos (rango aproximado: 40-50%) de motilidad progresiva entre las horas 1 y 4 para la alícuotas valoradas individualmente. Sin embargo, transcurridas 8 horas de preservación se produjo una reducción significativa (p<0.01) de la motilidad (25.4%) que se hizo más evidente tras 12 horas de incubación, para finalmente inactivarse a las 24 horas. Un comportamiento algo similar fue el observado en las muestras del pool, con porcentajes de motilidad elevados (rango: 42-53%) durante las primeras 8 horas, siendo a partir de las 12 horas de preservación cuando los valores se redujeron aproximadamente a la mitad (23.8%), alcanzando también porcentajes del 0% de motilidad progresiva a las 24 horas. Al comparar las muestras individuales con las muestras del pool, no se detectaron diferencias significativas, si bien los valores medios fueron más elevados en las alícuotas del pool a partir de 8 horas de conservación. Los porcentajes de motilidad progresiva en las alícuotas conservadas a 25ºC (Figura 4.4 y Figura 4.6) siempre se mantuvieron con registros muy homogéneos, con valores medios entre un 40 y un 55%, sin existir diferencias significativas entre muestras individuales y muestras del pool, durante las primeras 24 horas. No obstante, tras 24 horas de preservación, las muestras individuales iniciaron un notable descenso de la motilidad progresiva, para mostrar una abrupta caída (p<0.01) ya evidente a partir de las 48 horas (< 5%), e inactivarse completamente tras 4 días de preservación. Por otro lado, en las muestras de pool seminal, a las 24 horas de preservación los porcentajes de motilidad se redujeron hasta el 30%, valor que se mostró significativamente diferente (p<0.01) al registro detectado 12 horas antes. A partir de este momento, la motilidad progresiva en el pool descendió muy gradualmente, alcanzando valores inferiores al 10% tras 3 días de preservación, hasta que el semen se inactivó a los 5 días de conservación a 25ºC. Resultados 139 El estudio de las alícuotas conservadas a 4ºC (Figura 4.5 y Figura 4.6) puso de manifiesto una mayor calidad espermática a lo largo del tiempo. En general, se pudo observar como el descenso de este parámetro fue siempre muy progresivo, aunque el pool siempre obtuvo registros superiores a los existentes en las muestras individuales. De este modo, las muestras individuales preservadas a 4ºC se mantuvieron con unos porcentajes de motilidad progresiva superiores al 40% (sin evidenciar diferencias importantes) hasta pasadas 8 horas de conservación. Entre las 12 y las 96 horas de conservación, los valores se situaron entre un 20 y un 30%, no existiendo diferencias entre ellos, pero si con respecto a los valores registrados durante las primeras 4 horas de preservación (p<0.05). Después del 5º día, el descenso en los porcentajes de motilidad progresiva fue tan gradual que no se volvieron a detectar diferencias significativas entre registros consecutivos hasta la inactivación seminal. Por otro lado, en el semen valorado en forma de pool, la motilidad progresiva presento porcentajes bastante elevados (rango: 40.0%-64.7%) durante los primeros 7 días de preservación, no existiendo diferencias relevantes a lo largo de este periodo de tiempo. A partir de este momento, el decrecimiento del porcentaje de motilidad continuo siendo gradual, presentando valores superiores al 20% hasta los 10 días de preservación, para inactivarse completamente a las 360 horas del comienzo de las valoraciones. Por último, las muestras de semen congeladas-descongeladas y posteriormente conservadas en baño María (CD-37ºC), revelaron los porcentajes de motilidad progresiva más bajos y la menor perdurabilidad en el tiempo (Figura 4.5). De esta forma, en muestras individuales, la motilidad progresiva presentó valores superiores al 20% sólo durante las primeras 2 horas de preservación, para posteriormente mostrar un rápido descenso (p<0.05) a las 4 horas; finalmente, el movimiento progresivo de los espermatozoides fue inapreciable tras 8 horas de incubación. En las muestras del pool seminal, los valores de motilidad progresiva tuvieron un descenso más gradual, de forma que presentaron porcentajes cercanos al 20% durante las primeras 4 horas de preservación, sin mostrar diferencias significativas, para terminar inactivándose a las 8 horas del inicio del estudio de este protocolo de conservación. Resultados 140 Figura 4.4. Motilidad progresiva (media ± sem) en muestras preservadas a 37ºC y 25ºC durante las primeras 24 h. de conservación Figura 4.5. Motilidad progresiva (media ± sem) en muestras preservadas a 4ºC y en muestras congeladas-descongeladas (CD-37ºC) durante las primeras 24 horas de conservación 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 1 2 4 8 12 24 Motilidad espermática progresiva (%) Horas de preservación 37 ºC Individual 37 ºC Pool 25ºC Individual 25ºC Pool 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 1 2 4 8 12 24 Motilidad espermática progresiva (%) Horas de preservación 4 ºC Individual 4 ºC Pool CD-37 ºC Individual CD 37 ºC Pool Resultados 141 Figura 4.6. Evolución de la motilidad progresiva (media ± sem) en muestras preservadas a 25ºC y 4ºC hasta su completa inactivación 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Motilidad espermática progresiva (%) Días de preservación 25ºC Individual 25ºC Pool 4 ºC Individual 4 ºC Pool Resultados 142 4.2.2. Morfoanomalías del semen conservado en diferentes temperaturas de preservación La tabla 4.16 recoge los porcentajes medios de anomalías morfológicas de las cabezas espermáticas detectadas en el semen sometido a distintas temperaturas de preservación (37ºC, 25ºC, 4ºC y congelado-descongelado) a lo largo del periodo experimental (0-24 h.). En general, el porcentaje de anomalías de cabeza siempre presentó un rango muy pequeño (0-5%), en todos los protocolos de preservación valorados. Al analizar los valores medios individuales, no se detectaron diferencias significativas entre las muestras conservadas a 37ºC, 25ºC, 4ºC y semen congelado-descongelado que, mostraban valores muy equiparables en los diferentes periodos de tiempo evaluados (0, 1, 8 y 24 h.). Del mismo modo, cuando se registraron los valores medios dentro de cada temperatura de conservación, no se encontraron diferencias a lo largo del periodo experimental en aquellas muestras preservadas a 37ºC, 25ºC y 4ºC. No obstante, sí se detectaron diferencias significativas en las muestras congeladas-descongeladas, con un porcentaje de morfoanomalías de cabeza ligeramente superior en aquellas alícuotas preservadas durante 1 hora (p<0.05), en comparación con las muestras evaluadas inmediatamente tras ser descongeladas. Con respecto al pool y, al analizar los datos registrados dentro de cada protocolo de preservación (37ºC, 25ºC, 4ºC, CD-37ºC), no se encontraron diferencias en los diferentes periodos de tiempo evaluados. Del mismo modo, al comparar el porcentaje de anomalías de cabeza espermática entre los distintos métodos de conservación, se observó que los valores eran muy similares entre muestras (1.0-2.5%), con independencia de la temperatura de preservación de las mismas. Finalmente, no se encontraron diferencias entre los registros medios en los valores observados en el semen (individual y pool) sometido a una determinada temperatura (37ºC, 25ºC, 4ºC, CD-37ºC) y correspondientes a un periodo de tiempo concreto.