Potencial de própolis no desenvolvimento de têxteis com propriedades funcionais

1 Andreia Coelho Cardoso Potencial de própolis no desenvolvimento de têxteis com propriedades funcionais Dissertação de Mestrado Mestrado em Bioquímica Aplicada Ramo de Biotecnologia Trabalho efetuado sob a orientação da: Professora Doutora Cristina Alexandra de Almeida Aguiar e da Mestre Diana Isabel Azevedo de Sousa março 2021 Universidade do Minho Escola de Ciências Universidade do Minho Universidade do Minho Universidade do Minho Universidade do Minho Universidade do Minho Universidade do Minho Universidade do Minho Universidade do Minho Universidade do Minho Universidade do Minho Universidade do Minho Universidade do Minho Universidade do Minho ii Direitos de autor e condições de utilização do trabalho por terceiros Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Licença concedida aos utilizadores deste trabalho Atribuição-NãoComercial-SemDerivações CC BY-NC-ND https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ iii “O querer e o trabalho transformam o sonho em realidade” (Anónimo) iv Agradecimentos Com a finalização da dissertação de mestrado não posso deixar de agradecer a algumas pessoas que, direta ou indiretamente, contribuíram para que esta caminhada tão importante da minha vida pessoal e profissional se concretizasse. Em primeiro lugar quero agradecer à professora Cristina Aguiar, por toda a sua incansável ajuda, tempo, paciência e amizade durante este ano, e por me ter proporcionado a oportunidade de trabalhar com ela. Agradeço também às Mestres Diana Sousa e Alice Ribeiro por tão amavelmente me receberem no CeNTI e pela orientação e dedicação que demonstraram ao longo deste caminho. Um especial agradecimento à amável Ana Sofia por toda a paciência, apoio, ajuda e transmissão de conhecimento ao longo desta etapa. E a todas as pessoas presentes no laboratório que sempre se mostraram muito disponíveis para ajudar, em especial à Leonor e à Liliana pela paciência e suporte. Agradeço também a todo o pessoal técnico que trabalha no Departamento de Biologia, por toda a ajuda, que tornou este trabalho mais fácil de realizar, em especial ao Senhor Luís. Um obrigado ao pessoal do CeNTI pela ajuda e cedências de material para a realização dos ensaios. Não seria possível estar aqui se não fossem os meus pais por sempre acreditarem em mim, por nunca me deixarem desistir, por me darem a oportunidade de sonhar e todas as bases para o concretizar, o meu mais profundo obrigada. Por último, mas não menos importante, um enorme obrigada às minhas grandes amigas que estiveram sempre presentes, que me apoiaram, me fizeram rir, foram um ombro amigo e que nunca deixaram de acreditar em mim. v Declaração de integridade Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. vi Resumo O aumento da atividade industrial, especificamente no setor têxtil, exige cada vez mais a implementação de processos tecnologicamente inovadores e mais sustentáveis. O processo de tingimento convencional utiliza corantes sintéticos e envolve o consumo de muitos recursos, nomeadamente água e energia, para além de ser altamente prejudicial para organismos vivos. A consciencialização do impacto ambiental e toxicidade inerentes a este processo, assim como o aumento da procura de têxteis técnicos, tem conduzido a um crescente interesse no desenvolvimento de corantes mais ecológicos e, em paralelo, ao desenvolvimento de agentes funcionais mais sustentáveis. Neste contexto, o presente projeto teve como objetivo avaliar o potencial do própolis, enquanto agente funcional, no tratamento de malhas 100 % algodão. Para além de propriedades corantes, este produto natural produzido pelas abelhas e depositado nas colmeias, possui propriedades antioxidantes e antibacterianas de grande interesse, criando assim uma alternativa ecológica e inovadora à coloração e funcionalização de têxteis. A extração dos compostos bioativos do própolis foi realizada através de uma extração em etanol, sendo posteriormente preparada uma solução adequada à coloração da malha têxtil pela tecnologia de esgotamento. No sentido de aumentar a reatividade superficial e melhorar a afinidade ao própolis, foram realizados pré-tratamentos na malha com alúmen de potássio, ácido tânico, plasma atmosférico (oxigénio) e quitosano. A caracterização dos provetes coloridos e funcionalizados envolveu a avaliação da cor e das atividades antioxidante e antibacteriana, prévia e posteriormente a vários ciclos de lavagem. Na análise da cor verificou-se que, de modo geral, as diferenças de cor aumentaram com o aumento de ciclos de lavagens. A avaliação da atividade antioxidante, por ABTS, permitiu confirmar que a solução de biocoloração conferiu à malha de algodão capacidade redutora superior a 90 %. A funcionalização do algodão com alúmen de potássio e com a solução de biocoloração permitiu manter esta percentagem, mesmo após 5 ciclos de lavagem. A análise antibacteriana revelou inibição do crescimento de Staphylococcus aureus para o algodão funcionalizado apenas com a solução de biocoloração. A amostra em estudo demonstrou uma diminuição na ação inibitória com as lavagens, mas o uso de alúmen de potássio permite manter a propriedade antibacteriana após 5 ciclos de lavagem. Palavras – chave: biocoloração, bioatividade, própolis, têxteis multifuncionais, sustentabilidade vii Abstract The increase in industrial activity, particularly in the textile sector, increasingly requires the implementation of technologically innovative and more sustainable processes. The conventional dyeing process uses synthetic dyes and involves the consumption of many resources, namely water and energy, in addition to being highly harmful to living organisms. The awareness of the environmental impact and toxicity inherent to this process, as well as the increased demand for technical textiles, have led to a growing interest in the development of more ecological dyes and, in parallel, to the development of more sustainable functional agents. In this context, this project aims to evaluate the potential of propolis as a functional agent in the treatment of 100% cotton knits. In addition to colouring properties, this natural product produced by bees and deposited in hives, has antioxidant and antibacterial properties of great interest, thus creating an ecological and innovative alternative to the colouring and functionalization of textiles. The extraction of bioactive compounds from propolis was carried out through an ethanol extraction, after which a suitable solution was prepared for the colouring of the textile mesh by the depletion technology. In order to increase the surface reactivity and improve the affinity to propolis, mesh pretreatments were carried out with potassium alum, tannic acid, atmospheric plasma (oxygen) and chitosan. The characterization of the coloured and functionalized test pieces involved the evaluation of colour and of the antioxidant and antibacterial activities, before and after several washing cycles. In the colour analysis it was found that, in general, the colour differences increased with the increase of washing cycles. The evaluation of antioxidant activity, by ABTS, allowed to confirm that the biocoloration solution gave the cotton fabric a reduction capacity greater than 90%. The functionalization of cotton with potassium alum and with the solution of biocoloration allowed to maintain this percentage, even after 5 washing cycles. Antibacterial analysis revealed an inhibition of Staphylococcus aureus growth for the functionalized cotton with only the biocoloration solution. The sample under study showed a decrease in the inhibitory action with washing, but the use of potassium alum allows to retain the antibacterial property after 5 washing cycles. Key Words: Biocoloration, bioactivity, propolis, multifunctional textiles, sustainability xiv algodão à solução de biocoloração. C – Banho termostático onde decorre a etapa de esgotamento. .............................................................................................................................................. 32 Figura 15. Condições testadas na biocoloração e funcionalização de provetes de malha 100 % algodão com própolis. AP - alúmen de potássio, AT - ácido tânico, Gli - glioxal e SA - sulfato de alumínio. O sinal “+” indica mordentagem simultânea e “_pt” indica pré-tratamento. .............. 32 Figura 16. Capacidade de captura do radical livre DPPH•, apresentada em valores de IC50 (μg/mL), dos extratos etanólicos de amostras de própolis do Gerês (G.EEs) recolhidas entre 2011 e 2019. G17.EE não foi considerado nesta análise pelo facto de se tratar de uma amostra diferente, conforme atrás referido. Realizou-se o teste One-way ANOVA (letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas pelo teste Tukey (p ≤ 0,05)). ..................................................... 43 Figura 17. Atividade antioxidante da solução de biocoloração (SB) pelo método ABTS. L-cisteína (0,3 g/L) representa o controlo positivo. Os resultados são exibidos como a média das três réplicas efetuadas e respetivo desvio padrão. ....................................................................................... 46 Figura 18. Avaliação da atividade antibacteriana da solução de biocoloração (SB) contra as bactérias Bacillus cereus , Escherichia coli , Bacillus subtilis , Methicillin susceptible Staphylococcus aureus (MSSA) (A) e Methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Bacillus megaterium , Propionibacterium acnes (B). O controlo foi uma placa de meio LB sem SB. As bactérias foram cultivadas em LB a 37 °C, 200 rpm, até ser obtida uma D.O.600 entre 0,4 e 0,6. Posteriormente, as culturas foram diluídas de forma seriada até à diluição 10-⁴ e 5 μL de cada diluição foram pipetados para meio sólido, em placas contendo diferentes concentrações de SB. a - meio LBA, b – LBA e etanol, c - meio LBA contendo SB a 0,1 % e d - meio LBA com SB a uma concentração 0,2 %. ..................................................................................................................................... 48 Figura 19. Força colorística (K/s) dos provetes biocoloridos com a solução de biocoloração (SB). As amostras utilizadas foram algodão (CO), algodão tratado simultaneamente com alúmen de potássio (CO + AP), algodão pré-tratado com alúmen de potássio (CO_ptAP) e algodão tratado simultaneamente com 1 % de glioxal e 1 % de sulfato de alumínio (CO + 1%Gli-1%SA). As amostras foram analisadas previamente às lavagens (0 ciclos), e após 1, 3 e 5 ciclos de lavagem, numa máquina de lavar doméstica. Os resultados são apresentados como a média de duas réplicas efetuadas, para cada condição, e respetivo desvio padrão. ...................................................... 54 xv Figura 20. Diferença de cor (ΔE), calculada pela equação 1, para cada condição testada, após os diferentes ciclos de lavagem. Os resultados são apresentados como a média de duas réplicas para cada condição. ....................................................................................................................... 55 Figura 21. Atividade antioxidante de têxteis funcionalizados com a solução de biocoloração (SB) e dos respetivos têxteis controlo não tingidos. L-cisteína (0,3 g/L) foi usada como controlo positivo. Os resultados são apresentados em termos da média de três réplicas para cada condição e respetivo desvio padrão. As médias foram analisadas através de comparações múltiplas entre controlo positivo, a solução de biocoloração (SB) e o algodão (CO) com as restantes amostras, recorrendo ao teste One-way ANOVA (letras diferentes entre 2 valores indicam diferenças estatísticas significativas pelo teste Tukey (p≤ 0,05)). .............................................................. 57 Figura 22. Atividade antioxidante de têxteis funcionalizados com a solução de biocoloração (SB) num intervalo de 8 meses. A atividade antioxidante foi avaliada em janeiro e em setembro de 2020, após cada uma das funcionalizações. O controlo positivo foi L-cisteína (0,3 g/L) e o controlo negativo é constituído pelos têxteis não tingidos. As amostras utilizadas foram algodão (CO), algodão tratado simultaneamente com alúmen de potássio (CO + AP), algodão pré-tratado com alúmen (CO_ ptAP) e algodão tratado simultaneamente com glioxal e sulfato de alumínio a 10 g/L (CO + 1%Gli-1%SA). Os resultados são apresentados como a média de três réplicas para cada condição e respetivo desvio padrão. As médias foram analisadas através de comparações múltiplas, recorrendo ao teste One-way ANOVA (letras diferentes entre 2 valores indicam diferenças estatísticas significativas pelo teste Tukey (p≤ 0,05)). .............................................................. 60 Figura 23. Atividade antioxidante da malha de algodão funcionalizada com a solução de biocoloração (CO + SB) medida logo após o tingimento e decorridos 8 meses, usando L-cisteína (0,3 g/L) como controlo. Os resultados são apresentados como a média de três réplicas para cada condição e respetivo desvio padrão. As médias foram analisadas recorrendo ao teste One-way ANOVA (letras diferentes entre 2 valores indicam diferenças estatísticas significativas pelo teste Tukey (p≤ 0,05))..................................................................................................................... 61 Figura 24. Atividade antioxidante de têxteis funcionalizados com a solução de biocoloração (SB) e respetivos controlos após 1, 3 e 5 ciclos de lavagem. L-cisteína (0,3 g/L) foi usada como controlo positivo. As amostras utilizadas foram algodão (CO), algodão tratado simultaneamente com alúmen de potássio (CO + AP), algodão pré-tratado com alúmen (_ptAP) e algodão tratado simultaneamente com glioxal e sulfato de alumínio a 10 g/L (CO + 1%Gli-1%SA). Os resultados são xvi apresentados como a média de três réplicas para cada condição e respetivo desvio padrão. As médias foram analisadas através de comparações múltiplas, recorrendo ao teste One-way ANOVA (letras diferentes entre 2 valores indicam diferenças estatísticas significativas pelo teste Tukey (p≤ 0,05)). .................................................................................................................................... 62 Figura 25. Curva de crescimento de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com malhas de algodão funcionalizadas com solução de biocoloração (SB) e os respetivos controlos. As amostras utilizadas foram algodão (CO), algodão tratado simultâneamente com alúmen de potássio (CO + AP) ou com ácido tânico (CO + AT). Os têxteis foram colocados numa cultura bacteriana em meio LB com uma D.O.600 inicial de 0,05, sendo a incubação a 37 °C e 200 rpm. A D.O.600 foi medida ao longo de 5,5 horas. Apresentam-se os valores médios de três réplicas efetuadas, para cada ponto, e respetivo desvio padrão. ........................................................... 65 Figura 26. Curva de crescimento de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com malhas de algodão funcionalizadas com solução de biocoloração (SB). As amostras utilizadas foram algodão (CO), algodão pré-tratado com alúmen de potássio (CO_ptAP) e algodão pré-tratado com alúmen de potássio e simultaneamente com ácido tânico (CO_ptAP + AT). Os têxteis foram colocados numa cultura bacteriana em meio LB com uma D.O.600 inicial de 0,05, sendo a incubação a 37 °C e 200 rpm. A D.O.600 foi medida ao longo de 5,5 horas. Apresentam-se os valores médios de três réplicas efetuadas, para cada ponto, e respetivo desvio padrão. ........... 67 Figura 27. Curva de crescimento de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com malhas de algodão funcionalizadas com solução de biocoloração (SB). As amostras utilizadas foram algodão (CO), algodão pré-tratado com ácido tânico (CO_ptAT) e algodão pré-tratado com ácido tânico simultaneamente com alúmen de potássio (CO_ptAT + AP). Os têxteis foram colocados numa cultura bacteriana em meio LB com uma D.O.600 inicial de 0,05, sendo a incubação a 37 °C e 200 rpm. A D.O.600 foi medida ao longo de 5,5 horas. Apresentam-se os valores médios de três réplicas efetuadas, para cada ponto, e respetivo desvio padrão. .............................................. 68 Figura 28. Curva de crescimento de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com malhas de algodão funcionalizadas com solução de biocoloração (SB). As amostras utilizadas foram algodão (CO), algodão tratado simultaneamente com glioxal e sulfato de alumínio a 10 g/L (CO + 1%Gli-1%SA) e tratado simultaneamente com glioxal e sulfato de alumínio a 15 g/L e 5 g/L, respetivamente (CO + 1,5%Gli-0,5%SA). Os têxteis foram colocados numa cultura bacteriana em meio LB com uma D.O.600 inicial de 0,05, sendo a incubação a 37 °C e 200 rpm. A D.O.600 foi xvii medida ao longo de 5,5 horas. Apresentam-se os valores médios de três réplicas efetuadas, para cada ponto, e respetivo desvio padrão..................................................................................... 68 Figura 29. Curva de crescimento de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com malhas de algodão funcionalizadas com solução de biocoloração (SB). As amostras utilizadas foram algodão (CO), algodão pré-tratado com quitosano (CO_ptQ), algodão pré-tratado com quitosano simultaneamente com alúmen de potássio (CO_ptQ + AP) e algodão pré-tratado com quitosano simultaneamente com ácido tânico (CO_ptQ + AT). Os têxteis foram colocados numa cultura bacteriana em meio LB com uma D.O.600 inicial de 0,05, sendo a incubação a 37 °C e 200 rpm. A D.O.600 foi medida ao longo de 5,5 horas. Apresentam-se os valores médios de três réplicas efetuadas, para cada ponto, e respetivo desvio padrão. ........................................................... 71 Figura 30. Curva de crescimento de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com malhas de algodão funcionalizadas com solução de biocoloração (SB). As amostras utilizadas foram algodão (CO), algodão pré-tratado com plasma (CO_ptP), algodão pré-tratado com plasma simultaneamente com alúmen de potássio (CO_ptP + AP) e algodão pré-tratado com plasma simultaneamente com ácido tânico (CO_ptP + AT). Os têxteis foram colocados numa cultura bacteriana em meio LB com uma D.O.600 inicial de 0,05, sendo a incubação a 37 °C e 200 rpm. A D.O.600 foi medida ao longo de 5,5 horas. Apresentam-se os valores médios de três réplicas efetuadas, para cada ponto, e respetivo desvio padrão. ........................................................... 72 Figura A1. Percentagem de redução de DPPH• ( = 517 nm) em função da concentração de ácido gálico. …………………………………………………………………………………………………….……..96 Figura A2. Scan da solução de trabalho de ABTS realizado no UV-Vis. .................................... 97 Figura A3. Reta de calibração com L-cisteína, o composto padrão utilizado na avaliação da atividade antioxidante pelo método de ABTS. .......................................................................... 97 Figura A4. Curva de crescimento de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com malhas de algodão usada no rastreino inicial (CO do rastreio) e uma nova malha de algodão utilizada nos últimos ensaios (CO). Os têxteis foram colocados numa cultura bacteriana em meio LB com uma D.O.600 inicial de 0,05, sendo a incubação a 37 °C e 200 rpm. A D.O.600 foi medida periodicamente ao longo de 6,5 horas. ............................................................................................................ 98 Figura A5. Curva de crescimento de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com a nova malha de algodão após lavagem com água e com detergente padrão. Os têxteis foram colocados xviii numa cultura bacteriana em meio LB com uma D.O.600 inicial de 0,05, sendo a incubação a 37 °C e 200 rpm. A D.O.600 foi medida periodicamente ao longo de 6,5 horas. Apresentam-se os valores médios de duas réplicas efetuadas, para cada ponto, e respetivo desvio padrão……………………..98 xix Índice de tabelas Tabela 1. Classificação dos corantes naturais segundo a sua estrutura química (adaptado de Siva, 2007; Patel, 2011; Saxena e Raja, 2015, Gürses, 2019). ......................................................... 9 Tabela 2. Estirpes de bactérias utilizadas nos ensaios para avaliação da atividade antibacteriana. .............................................................................................................................................. 36 Tabela 3. Rendimentos de extração etanólica, em percentagem, dos extratos etanólicos de amostras de própolis do Gerês (G.EEs) recolhidas entre 2011 e 2019. *G17.EE não foi considerado nesta análise pelo facto de se tratar de uma amostra diferente, conforme referido. .................. 41 Tabela 4. Atividade antibacteriana do extrato etanólico preparado com a amostra de própolis do Gerês recolhida em 2019 (G19.EE). A atividade antibacteriana foi expressa em valores de concentração mínima inibitória (CMI) (μg/mL). ....................................................................... 44 Tabela 5. Valores obtidos para a força colorística (K/s) e fotografias dos têxteis tingidos com a solução de biocoloração (SB). Os resultados são apresentados como a média de três réplicas para cada condição e respetivo desvio padrão................................................................................. 50 Tabela 6. Resultados obtidos após coloração, por esgotamento, com a solução de biocoloração (SB), antes e após os vários ciclos de lavagem, numa máquina de lavar convencional a 30 °C durante aproximadamente 1 h. As amostras utilizadas foram algodão (CO), algodão tratado simultaneamente com alúmen de potássio (CO + AP), algodão pré-tratado com alúmen de potássio (CO_ptAP) e algodão tratado simultaneamente com 1 % de glioxal e 1 % de sulfato de alumínio (CO + 1%Gli-1%SA). ................................................................................................................. 53 Tabela 7. Parâmetros do crescimento - taxa específica de crescimento (h-1), densidade ótica final, duração da fase de latência (h) e atividade antibacteriana (%) - de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com malhas de algodão (CO), algodão tratado simultaneamente com alúmen de potássio (C + AP) ou com ácido tânico (CO+ AT) não funcionalizadas e funcionalizadas com a solução de biocoloração (SB). “-” indica não determinável. ...................................................... 66 Tabela 8. Parâmetros de crescimento - taxa especifica de crescimento (h-1), densidade ótica final, fase de latência (h) e atividade antibacteriana (%) - de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com malhas de algodão (CO), algodão pré-tratado com alúmen de potássio (CO_ptAP), algodão pré-tratado com alúmen de potássio simultaneamente com ácido tânico (CO_ptAP + AT) e funcionalizadas com a solução de biocoloração (SB). “-” indica não determinável. ................ 67 xx Tabela 9. Parâmetros do crescimento - taxa específica de crescimento (h-1), densidade ótica final, duração da fase de latência (h) e atividade antibacteriana (%) - de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com malhas de algodão (CO), algodão pré-tratado com ácido tânico (CO_ptAT), algodão pré-tratado com ácido tânico simultaneamente com alúmen de potássio (CO_ptAT + AP) e funcionalizadas com a solução de biocoloração (SB). “-” indica não determinável. ................ 69 Tabela 10. Parâmetros do crescimento - taxa específica de crescimento (h-1), densidade ótica final, duração da fase de latência (h) e atividade antibacteriana (%) - de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com malhas de algodão (CO), algodão tratado simultaneamente com glioxal e sulfato de alumínio a 10 g/L (CO + 1%Gli-1%SA) e tratado simultaneamente com glioxal e sulfato de alumínio a 15 g/L e 5 g/L, respetivamente (CO + 1,5%Gli-0,5%SA) e funcionalizadas com a solução de biocoloração (SB). “-” indica não determinável. ...................................................... 69 Tabela 11. Parâmetros do crescimento - taxa específica de crescimento (h-1), densidade ótica final, duração da fase de latência (h) e atividade antibacteriana (%) - de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com malhas de algodão (CO), algodão pré-tratado com quitosano (CO_ptQ), algodão pré-tratado com quitosano simultaneamente com alúmen de potássio (CO_ptQ + AP) e algodão pré-tratado com quitosano simultaneamente com ácido tânico (CO_ptQ + AT) e funcionalizadas com a solução de biocoloração (SB). “-” indica não determinável. ................... 71 Tabela 12. Parâmetros do crescimento - taxa específica de crescimento (h-1), densidade ótica final, duração da fase de latência (h) e atividade antibacteriana (%) - de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com malhas de algodão (CO), algodão pré-tratado com plasma (CO_ptP), algodão pré-tratado com plasma simultaneamente com alúmen de potássio (CO_ptP + AP) e algodão pré-tratado com plasma simultaneamente com ácido tânico (CO_ptP + AT) e funcionalizadas com a solução de biocoloração (SB). “-” indica não determinável. ................... 73 Tabela 13. Análise da densidade ótica final e da atividade antibacteriana (%) após 24 h de crescimento em meio LB a 37 °C e 200 rpm de Staphylococcus aureus ATCC 6538 quando em contacto com algodão tingido/funcionalizado com a solução de biocoloração (SB), previamente às lavagens e após 5 ciclos. ........................................................................................................ 74 Tabela A1. Capacidade de captura do radical livre DPPH•, apresentada em valores de IC50 (μg/ mL), dos extratos etanólicos preparados com amostras de própolis do Gerês (G.EEs) recolhidas entre 2011 a 2016, 2018 e 2019. Os valores são apresentados na forma de média ± desvio xxi padrão. Realizou-se o teste One-way ANOVA (letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas pelo teste Tukey (p ≤ 0,05))………………………………………………………………..……100 Tabela A2. Atividade antibacteriana dos extratos etanólicos preparados com amostras de própolis do Gerês recolhidas entre 2011 e 2016, 2018 e 2019. A atividade antibacteriana foi expressa em valores de CMI (μg/mL). ...................................................................................................... 101 1 1. Introdução 2 Atualmente, a poluição aquática é um dos maiores problemas a nível global, devido à libertação de vários produtos químicos nos cursos de água como consequência de processos industriais (Shanmugam et al. , 2018). Os corantes residuais de diferentes origens, tais como das indústrias têxtil e cosmética, são os principais responsáveis pela poluição aquática. Em 2019 foi estimada uma libertação anual de mais de 280 000 toneladas de corantes têxteis nos cursos de água (Tabasum et al. , 2019). Os corantes têxteis são amplamente utilizados para tingir nylon , lã, seda, algodão e couro devido aos seus reduzidos custos, reprodutibilidade e ampla gama de tonalidades (Baaka et al. , 2017). Porém, alguns corantes têxteis, nomeadamente os sintéticos, são prejudiciais para os seres humanos devido à sua possível toxicidade e carcinogenicidade (Benkhaya et al ., 2020). Além disso, também podem afetar a atividade fotossintética das plantas aquáticas, ao evitar a penetração da luz solar, e serem tóxicos para a fauna e flora aquáticas devido à presença de sais metálicos, entre outros (Selvaraj et al. , 2020). A necessidade de contornar este problema para o ambiente tem conduzido ao incentivo da utilização de produtos naturais, especialmente a reintrodução de corantes naturais no tingimento de fibras têxteis (Ticha et al. , 2016). Estes corantes naturais apresentam diversas vantagens quando comparados com os sintéticos: para além de serem obtidos a partir de várias fontes naturais como plantas, insetos e/ou fungos, o resíduo resultante do tratamento do efluente é biodegradável e compatível com o meio ambiente, apresentando baixa toxicidade e efeitos alergénicos reduzidos (Ibrahim et al , 2010; Hou et al. , 2013). Adicionalmente, conferem frequentemente a possibilidade de transferência de diversas propriedades biológicas, nomeadamente a atividade antimicrobiana e antioxidante, possibilitando assim a funcionalização dos substratos (Haji e Naebe, 2020). Portanto, torna-se essencial reforçar a investigação nesta área, de forma a otimizar e a rentabilizar a utilização de tais corantes naturais para um desenvolvimento capaz de responder às necessidades das indústrias têxteis. No seguimento desta problemática, de encontrar alternativas aos processos de tingimento convencionais, os objetivos do presente trabalho centram-se na avaliação do potencial de própolis, um produto natural proveniente das colmeias, na coloração e funcionalização de têxteis de algodão, avaliando-se a performance dos substratos biocoloridos em termos da solidez da cor e das propriedades antimicrobiana e antioxidante à lavagem. Inicialmente, a preparação do extrato de própolis e a avaliação das suas bioatividades (atividade antimicrobiana e antioxidante) foram realizadas no Departamento de Biologia da 9 Tabela 1. Classificação dos corantes naturais segundo a sua estrutura química (adaptado de Siva, 2007; Patel, 2011; Saxena e Raja, 2015, Gürses, 2019). Do ponto de vista ambiental, a utilização de corantes naturais no processo de tingimento é bastante vantajosa e confere maior segurança para o planeta, pois sendo renováveis e biodegradáveis contribuem para a redução do uso de corantes de base petroquímica (Ibrahim, et al. , 2010; Hou et al. , 2013; Beldean-Galea et al ., 2018; Zerin et al. , 2020). Assim, podem ajudar a ultrapassar muitos dos problemas associados aos corantes sintéticos, como a poluição da água e a produção de efeitos colaterais nos seres vivos (Ticha et al. , 2016), para além de proporcionarem a produção de cores suaves e atrativas para o consumidor (Haji e Naebe, 2020). Classe Estrutura química Antraquinonas α-hidroxinaftoquinonas Antocianinas Carotenóides Diidropiranos Flavonóides Indigo 10 Apesar das suas inerentes vantagens, os corantes naturais apresentam também algumas limitações. Entre elas incluem-se a dificuldade de reproduzir as cores pretendidas de forma contínua e a falta de conhecimento técnico aprofundado acerca dos processos de extração e de tingimento. Baixos rendimentos de extração requerem, por vezes, maior quantidade de corante e mais tempo de tingimento. Adicionalmente, a aplicação dos corantes naturais nos têxteis como passo único não é suficiente para ocorrer ligação ao substrato, daí ser frequentemente necessário recorrer à utilização de auxiliares para melhorar a fixação da cor e, consequentemente, a sua solidez (Kumar e Konar, 2011; Zerin et al. , 2019; Haji e Naebe, 2020). 1.2.1.1. Otimização dos processos de biocoloração têxtil Tendo em conta as limitações do tingimento com corantes naturais, já mencionadas, torna-se fundamental a adição de agentes auxiliares no processo (Kumar e Konar, 2011). Estes auxiliares - que podem ser mordentes (como alúmen de potássio), ou agentes de ligação (como o glioxal) ou enzimas (como a lacase) – podem ser adicionados durante a etapa de coloração, ou ser utilizados para efetuar um pré ou pós-tratamento ao substrato têxtil (Ratnapandian, 2013). Muitos destes processos já estão estabelecidos na coloração de têxteis para melhorar a afinidade e a solidez às lavagens. Utilização de mordentes Os mordentes são compostos utilizados para facilitar a ligação entre o corante e os têxteis (Shahid et al ., 2013). Na indústria têxtil, os mais utilizados são os derivados de metais, como alumínio, ferro, cobre e estanho, na forma de sais. O alúmen de potássio, de baixo custo, boa disponibilidade e uso seguro, é o mordente metálico mais usado. Os taninos e o ácido tânico, compostos fenólicos presentes nas plantas, podem também ser usados como mordentes e introduzem grupos hidroxilo e carboxilo nas fibras (Shahid et al ., 2013; Tang et al. , 2018). Os diferentes tipos de mordentes podem originar cores distintas a partir do mesmo corante natural, bem como influenciar o brilho e a solidez da cor (Kumar e Konar, 2011). O mordente ideal será aquele que produzir um bom rendimento tintorial, em condições de tingimento exequíveis e a baixo custo, sem comprometer as propriedades das fibras. É igualmente importante que o mordente não produza qualquer efeito nocivo. Os mordentes podem ser aplicados em 3 fases distintas: pré-mordentagem, mordentagem em simultâneo ( in situ ) ou pós-mordentagem. Na pré-mordentagem, os têxteis são inicialmente 11 tratados com uma solução aquosa que contém os mordentes e posteriormente tingidos. Por sua vez, quando a mordentagem é realizada em simultâneo com a coloração, o mordente é adicionado diretamente no banho de coloração, onde o têxtil ficará submerso. Relativamente ao processo pósmordentagem, o têxtil é tingido primeiro e posteriormente tratado com o mordente, utilizando-se um banho distinto daquele previamente usado na coloração (Kundal et al ., 2016). Yusuf et al. (2012) recorreram a extratos de folhas de Lawsonia inermis para investigar as propriedades de tingimento em fios de lã, realizando uma pré-mordentagem com sais metálicos, como o alúmen de potássio e o sulfato de ferro. Demonstraram que a utilização de mordentes se traduziu numa melhor absorção do corante e em melhores propriedades de solidez da cor (exposição à luz, lavagem e fricção), comparativamente aos resultados obtidos sem prémordentagem. Ali et al. (2010) testaram um corante natural extraído da casca de Acacia nilotica no tingimento de tecidos de algodão, comparando os ensaios com e sem mordentes, em termos de características de cor e propriedades de solidez. Os autores verificaram que a pré-mordentagem com ácido tânico, sulfato ferroso, sulfato de zinco e sulfato de alumínio não só melhorou a profundidade da cor e o brilho, mas também as propriedades de solidez do corante natural (Ali et al. , 2010). Utilização de enzimas O recurso a enzimas para alterar a superfície de um têxtil também é possível, com diferentes tipos de enzimas como proteases, amilases, lipases, diastases e lacases a poder ser aplicadas nas diferentes etapas do processamento (Shahid et al ., 2013). A sua utilização permite o desenvolvimento de metodologias não prejudiciais ao meio ambiente, durante o processamento de fibras têxteis, e de estratégias que visam melhorar a qualidade do produto final. As enzimas possuem características que as tornam favoráveis relativamente aos compostos químicos convencionais, ou aos catalisadores microbianos, tais como a elevada eficiência de catálise, o nível de especificidade elevado e a ausência de reações paralelas. Para além disso, são biodegradáveis, não poluentes e permitem a operação a baixas temperaturas. Estudos mostraram que o tratamento com enzimas (amilase, amiloglicosidase e tripsina) melhora a absorção de corante e as propriedades de resistência das fibras ao encolhimento (Vankar e Shanker, 2008, Su et al. , 2018). A utilização destas enzimas na indústria têxtil permite assim a substituição da elevada quantidade de compostos químicos utilizados no processo de tingimento convencional. 12 Modificação da superfície têxtil A modificação da superfície têxtil corresponde a uma alteração do têxtil com o objetivo de modificar a sua composição e características químicas e obter propriedades específicas, como maior capacidade de tingimento e afinidade (Patiño et al. , 2011). Um dos processos de pré-tratamento muito utilizado no têxtil de algodão é a cationização, que possibilita a transferência de cargas positivas para a celulose, tornando-a mais reativa face aos corantes. Este processo oferece vantagens significativas, tais como o tingimento em menos tempo e, consequentemente, a utilização de menos energia e compostos químicos, traduzindo-se num menor impacto ambiental, maior rendimento na coloração e melhores propriedades de solidez da cor em comparação com o algodão sem pré-tratamento (Acharya et al. , 2014). A cationização é normalmente realizada com compostos químicos mas uma abordagem mais ecológica poderá ser o uso de biopolímeros anexados a grupos amino como, por exemplo, o quitosano (Rattanaphani et al. , 2007). Este é um polissacarídeo policatiónico, que adquiriu grande importância na aplicação têxtil principalmente devido à sua biocompatibilidade, não toxicidade e excelentes propriedades biológicas. Quimicamente (Figura 4), é bastante semelhante à celulose, sendo composto por 2-amino-2desoxi-β-Dglucopiranose ligado a β–(1,4), obtido por desacetilação da quitina, amplamente presente na natureza como no exosqueleto de insetos e de invertebrados marinhos (caranguejos e camarões) (Shahid-ul-Islam et al ., 2018). Devido à sua natureza policatiónica, o quitosano possui boas propriedades antimicrobianas contra bactérias e fungos através da interação iónica na superfície das células, tornando-se uma opção atraente para o tingimento e acabamento antimicrobiano de algodão e Figura 4. Estruturas químicas da celulose, da quitina e do quitosano (adaptado de Kumar, 2000). 13 outros têxteis (Ye et al. , 2005). No entanto, devido à presença de grupos amina, os derivados do quitosano podem perder as suas propriedades em condições alcalinas, para além de poderem apresentar baixa ancoragem em superfícies de têxteis, o que limita a sua aplicação (Pan et al. , 2019). Este problema poderá ser ultrapassado através da utilização de agentes de ligação, como o glioxal, o glutaraldeído ou o ácido cítrico, de forma a aumentar a durabilidade do quitosano nos substratos têxteis (Sadeghi-Kiakhani et al ., 2015; Jawad et al. , 2019). No contexto do tingimento, o quitosano incrementa também a absorção do corante pelas fibras de algodão, podendo ser utilizado como agente de ligação na etapa de coloração (Shahidi et al ., 2013). Com efeito, Gupta e Haile (2007) demonstraram que o algodão pré-tratado com quitosano apresenta maior capacidade para ser colorido e que foi possível obter tons brilhantes com elevada solidez à lavagem. Também Silva et al. (2018) aplicaram um pré-tratamento de quitosano em algodão que foi tingido com extratos de folhas de eucalipto e verificaram que este pré-tratamento poderá substituir a utilização de mordentes, uma vez que proporcionou aos tecidos maior resistência à cor e melhores propriedades de solidez, tornando o processo de tingimento mais sustentável. Nos últimos anos, têm sido desenvolvidas outras abordagens de modificação de superfície têxtil, como por exemplo o tratamento com plasma (Figura 5). Também conhecido pelo “quarto estado da matéria”, o plasma é um gás eletricamente neutro e configura atualmente um dos métodos mais utilizados, por ser mais sustentável e ecológico, não requerendo banhos de funcionalização nem produzindo resíduos pós-tratamento (Hussain e Wahab, 2018). Na prática, o tratamento com plasma induz uma modificação físico-química da superfície das fibras têxteis através de vários processos simultâneos, como ativação, ataque químico, adição de grupos funcionais químicos e reticulação (Zanini et al. , 2018). Este tratamento utiliza diversos gases, como oxigénio, azoto, hidrogénio, árgon, na sua forma pura ou em diferentes combinações. O tratamento dos têxteis com plasma com oxigénio produz radicais, grupos funcionais e aumenta a rugosidade devido ao bombardeamento de iões na superfície dos substratos. A rugosidade aumenta a aderência dos materiais de deposição aos extratos (Rani et al ., 2018). A aplicação da tecnologia de plasma é de grande interesse para os processos de pré-tratamento e de acabamento uma vez que apenas altera as propriedades químicas e topográficas da camada mais externa do substrato, sem alterar as propriedades do têxtil (Zanini et al. , 2018). 14 De uma forma geral, o plasma pode ser dividido em duas categorias: térmicos ou quentes e não térmicos ou frios. Os primeiros excedem temperaturas extremamente elevadas, acima de 700 °C enquanto os segundos são gerados pela aplicação de um campo elétrico elevado no qual a temperatura permanece próxima da temperatura ambiente. O plasma não térmico é particularmente adequado para a modificação e para o processamento de superfícies têxteis, uma vez que estes são normalmente polímeros sensíveis ao calor (Ratnapandian, 2013; Zille et al ., 2015). Na indústria têxtil, o tratamento de plasma não térmico à pressão atmosférica (Figura 6) é mais adequado do que o tratamento químico ou de baixa pressão, porque apresenta maior eficácia, maior rapidez e é mais económico e amigo do ambiente (Prysiazhnyi et al. , 2013). Segundo a literatura, o tratamento com plasma melhora o tingimento (Kamel et al. , 2011), a solidez da cor (Yaman et al. , 2009) e aumenta os grupos funcionais de oxigénio dos têxteis de algodão (Rani et al ., 2018). Ibrahim et al. (2012) melhoraram as funcionalidades anti-UV e antibacterianas de tecidos contendo celulose utilizando um pré-tratamento com plasma de oxigénio. Figura 5. Efeito do pré-tratamento de plasma na funcionalização da superfície da celulose (adaptado de Shahidi et al ., 2013). Figura 6. Sigma Technologies International – Atmospheric Plasma Treatment System - Equipamento do CeNTI para o pré-tratamento a nível industrial de substratos têxteis com plasma não térmico à pressão atmosférica. 15 1.2.2. Avaliação da cor nos têxteis A cor é a parte da perceção visual que os humanos têm face a tudo que os rodeia, e que resulta dos diferentes comprimentos de onda da luz (King, 2017). Para que um material possua cor é necessário que tenha a capacidade de absorver e refletir radiações eletromagnéticas com um determinado comprimento de onda e intensidade. Para os humanos, a luz visível é a zona do espectro eletromagnético com radiação entre um comprimento de onda de 380 a 780 nanómetros (nm). Dependendo do observador, e da intensidade da cor, os valores típicos do espectro eletromagnético, na zona do visível, são a 450 nm azul, de 500 a 550 nm verde, a 580 nm amarelo, a 600 nm laranja e a 650 nm vermelho (Hu et al. , 2020) (Figura 7). A cor é uma componente altamente significativa no quotidiano do ser humano. Por exemplo, a perceção visual da cor dos alimentos está entre os primeiros estímulos sensoriais a serem notados ao ingerir um alimento. A cor domina também a indústria têxtil e do vestuário, onde encontramos cores específicas associadas a determinados momentos (King, 2017). Como a cor é uma perceção visual do olho humano e é dependente do observador, a sua quantificação requer estudos de colorimetria, que por sua vez englobam um conjunto de técnicas referentes à medição, avaliação e quantificação da cor, sendo a base fundamental para a especificação da aparência de cores uniformizada pela Comissão Internacional da Iluminação (CIE) (Cukurel et al , 2012). Na indústria têxtil, utiliza-se o sistema CIELab para quantificar a cor (Broadbent, 2001). O método baseia-se na obtenção dos valores das coordenadas L*, a* e b*. L* é uma medida da Figura 7. Espectro eletromagnético (adaptado de Hu et al ., 2020). 16 luminosidade do têxtil, que varia entre 0 (preto) a 100 (branco); a* é uma medida do carácter vermelho-verde do têxtil, correspondendo valores positivos (+) ao vermelho e os valores negativos (-) ao verde; e b* é uma medida do tom amarelo-azul do têxtil, em que os valores positivos (+) são relativos ao amarelo e os valores negativos (-) ao azul (Figura 8) (Rossi et al. , 2017). Os valores de L*, a* e b* da amostra a estudar, neste caso um têxtil colorido, são determinadas num colorímetro. As coordenadas de cor obtidas permitirão a quantificação das diferenças de cor entre o controlo e as amostras (ΔE), através da equação 1. ∆𝐸 = √(∆L ∗)2+(∆𝑎 ∗)2+(∆𝑏 ∗)2 (𝐸𝑞𝑢𝑎çã𝑜 1) onde, ∆𝐸 é a diferença de cor entre as referências e as amostras, enquanto ∆L*, ∆a* e ∆b* correspondem, respetivamente, à diferença entre a amostra padrão e as amostras em estudo relativamente aos valores nos eixo a*, b* e L* (Broadbent, 2001). A medida da cor baseia-se na razão entra a radiação absorvida (K) e a radiação dispersa (S) pelo substrato têxtil, sendo definida como a força colorística (K/s), na região visível do espectro (400-700 nm), e expressa pela equação de Kubelka-Munk (equação 2): Ks ⁄=(1 − R)2 2R (𝐸𝑞𝑢𝑎çã𝑜 2) onde K é o coeficiente de absorção, R a refletância da amostra tingida e s é o coeficiente de dispersão (Yusuf et al. , 2016). Figura 8. Representação das coordenadas de cor L*, a*, b* segundo o sistema CIELab (adaptado de Liew et al ., 2008 e Cortez et al ., 2017). 17 1.3. Funcionalização têxtil com compostos naturais A crescente preocupação com a saúde e com o bem-estar leva a indústria têxtil a procurar novas tecnologias para o desenvolvimento de produtos que correspondam às necessidades e expectativas dos consumidores (Shahid et al. , 2017). Em paralelo, o rápido crescimento da população e a melhoria do estilo de vida, principalmente nas áreas da saúde e bem-estar, impulsionam o desenvolvimento de têxteis com propriedades funcionais como atividade antimicrobiana e antioxidante - funcionalizações consideradas primordiais para a saúde, uma vez que podem proteger as pessoas de serem infetadas por microrganismos nocivos ou impedir o stresse oxidativo causado por espécies nocivas, como radicais ativos de oxigénio. Segundo a literatura, os têxteis funcionais destinados a uma aplicação na saúde eram, geralmente, tratados com produtos químicos, como por exemplo aminas aromáticas, compostos contendo formaldeído e derivados de fenóis (Hoenich, 2006; Monier e Abdel-Latif, 2013; Zhang et al. , 2013). No entanto, estas substâncias químicas apresentam elevada toxicidade e dificuldade em degradar-se naturalmente (Dong et al. , 2019). Portanto, recentemente, assiste-se a um interesse mundial pelos compostos naturais, devido às suas características de biocompatibilidade, biodegradabilidade, reduzida toxicidade e inúmeras propriedades multifuncionais, tais como repelência de insetos, proteção ultravioleta, atividade antimicrobiana, capacidade antioxidante, entre outras, que podem ser transferidas para diferentes substratos, como os têxteis (Shahid et al. , 2017). O desenvolvimento de têxteis funcionais com compostos naturais bioativos afigura-se altamente promissor, uma vez que existe um alto potencial químico, biológico e farmacológico em muitos compostos biologicamente ativos. Nos últimos anos tem-se assistido a um esforço para identificar novas fontes de corantes naturais (Haddar, et al. , 2014) e para os reintroduzir no processo de tingimento e de funcionalização têxtil (Bechtold et al. , 2003; Zhou et al. , 2015; Shahid et al. , 2017). Uma das formas mais usuais para a funcionalização de têxteis, sem comprometer o seu aspeto original, é através do processo de acabamento, comumente usado para melhorar o aspeto do têxtil e aumentar a sua durabilidade. De seguida, serão abordados dois tipos de funcionalidades, a atividade antioxidante e a antimicrobiana, por serem das mais procuradas e contempladas no presente trabalho. 18 1.3.1. Têxteis com atividade antioxidante Uma das funcionalidades têxteis recentemente explorada tem sido a atividade antioxidante. Os antioxidantes podem ser definidos como substâncias capazes de estabilizar, quelar e remover radicais livres, sem eles próprios se tornarem prejudiciais ou instáveis, prevenindo as consequências adversas das espécies reativas de oxigénio (ROS), como o radical hidroxilo, o peróxido de hidrogénio, e de espécies reativas de azoto (RNS), nomeadamente o óxido nítrico (Alonso et al. , 2013). A maioria dos radicais livres produzidos pode ser eliminados através da remoção das enzimas que os geram ou da ativação de defesas enzimáticas (catalase) e/ou não enzimáticas (flavonoides). No entanto, um desequilíbrio entre a produção de radicais e a capacidade antioxidante, poderá levar a danos oxidativos nos lipídios da membrana, proteínas e ácidos nucleicos, levando à morte celular ou à aceleração de várias doenças como cancro, doenças cardiovasculares e neurodegenerativas (Ferreira et al. , 2007; Karamian e Ghasemlou, 2013). Assim, os antioxidantes desempenham um papel fundamental na defesa do organismo contra os radicais livres, que estão envolvidos na patogénese de várias doenças crónicas e degenerativas (Alonso et al. , 2013). Para avaliar o potencial antioxidante existem diferente metodologias, sendo os métodos de ABTS [2,2’-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido-sulfónico)] e do DPPH (2,2-difenil-1picrilhidrazil) dos mais usados. O ABTS é um composto quimicamente estável, solúvel em água e que se apresenta incolor na forma reduzida. Pode ser convertido num catião radicalar estável de cor azul-esverdeada (ABTS•+), por reações de oxidação com radicais orgânicos ou inorgânicos e espécies não radicalares (Erel, 2004). Este método consiste na análise espectrofotométrica da atividade oxidante do radical catiónico (ABTS•+), que pode ser produzido através da reação em solução aquosa entre o ABTS e o persulfato de potássio, originando uma solução azul-esverdeada. A adição de substâncias com poder antioxidante ao ABTS•+, como os compostos fenólicos, por exemplo, provoca uma alteração estrutural que se traduz na descoloração e perda da capacidade de absorver a 734 nm (Figura 9) (Pannala et al. , 2001; Zemljič et al. , 2014). 25 et al ., 2000; Huang et al. , 2014; Silva-Carvalho et al ., 2015). Já o própolis de áreas tropicais, por exemplo, principalmente o do sudeste do Brasil, é rico em fenilpropanoides pré-alquilados, e alguns compostos não típicos como kaempferide e isosakuranetin também foram encontrados (Bankova et al ., 2000). Na Europa, os principais compostos bioativos do própolis são os flavonoides (flavonas, flavononas e flavonóis), ácidos fenólicos e os seus esteres (Huang et al. , 2014; Silva-Carvalho et al ., 2015). Um estudo sobre os compostos fenólicos de própolis português, demonstrou a presença de flavonoides, bem como de novos derivados metilados, incluindo esterificados e hidroxilados de flavonóides, e derivados de pinocembrina/pinobanksina que contêm um radical derivado de ácido fenilpropanóico na sua estrutura (Falcão et al. , 2010, 2013). Silva-Carvalho e colaboradores (2014) demonstraram que o própolis do Pereiro (distrito da Guarda, Beira Alta) apresenta uma elevada concentração de compostos fenólicos. Freitas et al. (2019) analisaram a composição química de amostras de própolis do Gerês de diferentes anos e, de uma forma geral, verificaram que os compostos fenólicos são coincidentes ao longo dos quatro anos consecutivos. Além disso, os principais compostos fenólicos dos extratos etanólicos de própolis do Gerês correspondem aos descritos anteriormente em outras amostras de própolis portuguesas e europeia (Bankova, 2005; Falcão et al. , 2010, 2013; Cruz et al. , 2016; Freitas et al. , 2019). Algumas das atividades biológicas estão sempre presentes no própolis, independentemente das diferentes áreas geográficas e/ou climatéricas. Os principais compostos responsáveis pelas atividades biológicas são os ácidos aromáticos, os ácidos diterpénicos, os compostos fenólicos e derivados do ácido cinâmico, incluindo ésteres de ácido cafeico, no entanto, muitas vezes diferentes tipos de própolis possuem compostos bioativos distintos (Borrelli et al. , 2002). O elevado interesse neste produto natural deve-se ao seu amplo espectro de propriedades biológicas e farmacológicas, que nos últimos anos foram validadas numa panóplia de estudos. Nestes estavam incluídas as atividades antibacteriana (Falcão et al. , 2010; Oliveira et al. , 2017; Chen et al. , 2018; Roh e Kim, 2018), antioxidante (Sheng et al. , 2007; Moreira et al. , 2008; Falcão et al. , 2010; Cruz et al. , 2016; Mašek et al. , 2018) antifúngica (Falcão et al. , 2010; de Castro et al. , 2012; Roh e Kim, 2018), anti-inflamatória (Sforcin, 2007; Sheng et al. , 2007; Moreira et al. , 2008; Falcão et al. , 2010), antineurodegenerativa (Chen et al. , 2008; Falcão et al. , 2010), 26 antiprotozoário (Falcão et al. , 2013), antitumoral (Sforcin, 2007; Moreira et al. , 2008; SilvaCarvalho et al. , 2014) ou antiviral (Sheng et al. , 2007; Moreira et al. , 2008), entre outras. 27 2. Materiais e Métodos 28 Neste capítulo serão identificados os reagentes e os solventes utilizados em todos os ensaios e serão descritos os procedimentos usados na preparação do extrato de própolis e da solução de biocoloração e na caracterização das suas bioatividades. Serão igualmente apresentados os procedimentos usados na preparação dos têxteis coloridos e funcionalizados com própolis e na caracterização das suas propriedades finais, como a cor e as atividades antioxidante e antibacteriana. 2.1. Extração de compostos ativos de própolis do Gerês A amostra de própolis utilizada neste trabalho foi gentilmente fornecida pelo Eng. Amadeu Fortunas, da Casa do Couto, e provém de um apiário que se localiza perto do rio Cávado, nas aldeias de Paradela e Sirvozelo em Montalegre, Gerês (G), Portugal (41°45’41.62’’ N; 7°58’03.34’’ W). Foi recolhida em 2019 (G19) e foi usada na preparação de um extrato etanólico (EE). A extração etanólica foi feita de acordo com Freitas et al. , 2019, a partir de aproximadamente 15 g de própolis. O própolis foi incubado com 80 mL de etanol absoluto (Carlo Erba Reagents S.A.S) a 25 °C e com uma agitação orbital de 100 rotações por minuto (rpm) (Orbital shaker, Bibby Stuart S01), durante 24 h, no escuro. A suspensão resultante foi filtrada através de papel de filtro de Macherey-Nagel, colocado sobre um funil de Buchner e um sistema de quitasato ligados a uma bomba de vácuo (600 milibar). O filtrado foi reservado e colocado a 4 °C enquanto os resíduos obtidos foram recolhidos e extraídos novamente, com 50 mL de etanol absoluto. O filtrado resultante foi adicionado ao previamente obtido e procedeu-se à evaporação do solvente no Büchi Rotavapor RE 121, a 40 °C e 40 rpm. Obteve-se o extrato etanólico (EE) de própolis - G19.EE - que foi armazenado a 4 °C, no escuro, até à sua utilização. 29 2.2. Biocoloração e funcionalização têxtil com própolis 2.2.1. Preparação da solução de biocoloração com própolis Os compostos com potencial de coloração e de funcionalização têxtil foram obtidos através da extração etanólica do própolis G19 (Figura 11. A), realizada no departamento de Biologia da Universidade do Minho, como referido no subcapítulo 2.1. Seguidamente, no CeNTI, preparou-se uma solução de 1 % (v/v) de G19.EE em 5 % etanol:95 % água (Figura 11. B), que foi armazenada a 4 °C no escuro até posterior utilização. 2.2.2. Pré-tratamento dos substratos têxteis O substrato têxtil (malha) usado ao longo do presente projeto foi o 100 % algodão (CO), com uma gramagem de 157 ± 0,2 g/m2. Previamente à etapa de coloração e funcionalização, algumas malhas foram submetidas a diferentes tratamentos, nomeadamente impregnação por esgotamento com alúmen de potássio e ácido tânico, plasma atmosférico e impregnação por foulardagem com quitosano. A pré-mordentagem com alúmen de potássio (AP, fornecido gentilmente pelo CITEVE) e com ácido tânico (AT; Alfa Aesar) foi realizada por esgotamento no banho termostático Grant OLS 200 (Figura 12). Cada solução aquosa, preparada numa concentração de 10 g/L, foi adicionada ao substrato de algodão, ficando sob agitação constante (100 rpm), a 60 °C durante 60 min. A razão utilizada foi de 1 g de têxtil para 20 mL de solução. Posteriormente, as malhas foram retiradas e secas à temperatura ambiente, durante 24 h. Figura 11. Solução de própolis para biocoloração (B) obtida a partir de G19.EE (A) em 5% de etanol: 95 % de água. A B 30 No pré-tratamento por plasma atmosférico (P) recorreu-se ao equipamento plasma de pressão atmosférica ( Sigma Technologies International – Atmospheric Plasma Treatment System ) (Figura 6), onde se usou o oxigénio como gás reativo, a 100 % da potência máxima do equipamento e a um caudal de 15000 sccm, e ao árgon como gás de arraste, a 45 % da potência máxima do equipamento e a um caudal de 450 sccm. A amostra de algodão foi tratada, em ambas as faces, com recurso a elétrodos metálicos nas seguintes condições: diâmetro dos rolos – 250 mm; comprimentos dos elétrodos – 4 m; velocidade de passagem – 3,3 Hz. A modificação da superfície da amostra de algodão por impregnação por foulardagem com quitosano (Q) decorreu no equipamento foulard (Mathis), na Unidade de Tinturaria do CITEVE (Figura 13. A). A técnica consiste num método de incorporação semi-contínuo em que o têxtil passa por um banho, e posteriormente através do interior de dois rolos controlados por uma determinada pressão e velocidade (Broadbent, 2001) (Figura 3). Em primeiro lugar, preparou-se uma solução stock de quitosano (Primex) 1 % (p/v) em ácido acético (Sigma - Aldrich) a 1 % (v/v). Para a preparação desta solução, adicionou-se lentamente o quitosano alternando com a adição igualmente lenta do ácido acético, mantendo a mistura sob agitação para evitar a formação de grumos. A malha 100 % algodão foi submersa na solução de quitosano, fazendo impregnação na mesma durante 1 min e, seguidamente, de modo a facilitar a ligação do quitosano à superfície do substrato têxtil, a malha foi colocada no foulard a uma velocidade de 2 m/min e a uma pressão de 3 bar. A amostra foi depois submetida a uma secagem a 100 °C, durante 6 min e a uma termofixação a 140 °C, durante 4 min, na secadeira Werner Mathis AG (Figura 13. B). Figura 12. Equipamento Grant OLS200 utilizado para os banhos de esgotamento realizados ao longo deste projeto. 31 2.2.3. Coloração e funcionalização dos substratos têxteis com a solução de própolis A tecnologia usada para a coloração e funcionalização têxtil foi o método de esgotamento num banho termostático Grant OLS200, a 40 °C, durante 90 min e a 100 rpm, tal como demonstrado na Figura 14. C. A razão de banho utilizada foi de 1 g têxtil para 20 mL de solução de biocoloração. As malhas selecionadas foram algodão (CO), algodão pré-tratado com alúmen de potássio (CO_ptAP), algodão pré-tratado com ácido tânico (CO_ptAT), algodão pré-tratado por plasma atmosférico (CO_ptP) e algodão pré-trado com quitosano (CO_ptQ). Em determinados ensaios, foi testada a adição simultânea de auxiliares de coloração/funcionalização ao banho de esgotamento, nomeadamente dois mordentes: o alúmen de potássio (CO + AP) e o ácido tânico (CO + AT); e de um agente de ligação - o glioxal (Sigma - Aldrich) (Gli) - juntamente com um catalisador - o sulfato de alumínio (Acros - Organics) (SA) - como referido por Sharaf e colaboradores (2013) (CO + Gli-SA). Assim, os provetes de algodão, previamente cortados, foram enxaguados com água, e de seguida colocados na solução de biocoloração contendo um dos mordentes a uma concentração de 10 g/L (mordentagem em simultâneo) ou contendo o agente de ligação glioxal e o catalisador sulfato de alumínio. Neste último caso, testou-se o glioxal a 10 g/L e a 15 g/L com o sulfato de alumínio a 10 g/L e a 5 g/L, respetivamente. Após a etapa de coloração e funcionalização, as amostras foram secas à temperatura ambiente durante 24 h. A B Figura 13. Equipamentos utilizados no tratamento dos substratos têxteis com quitosano por impregnação: Foulard Mathis (A) e secadeira Werner Mathis AG (B). 32 Resumidamente, durante este projeto foram testados quatro pré-tratamentos (alúmen potássio, ácido tânico, plasma atmosférico e quitosano) na malha de algodão, dois mordentes (alúmen de potássio e ácido tânico) e um agente de ligação com um catalisador (glioxal e sulfato de alumínio, respetivamente), além do tratamento unicamente com própolis (Figura 15). Figura 15. Condições testadas na biocoloração e funcionalização de provetes de malha 100 % algodão com própolis. AP - alúmen de potássio, AT - ácido tânico, Gli - glioxal e SA - sulfato de alumínio. O sinal “+” indica mordentagem simultânea e “_pt” indica pré-tratamento. Malha 100 % algodão Sem pré-tratamento Sem mordente CO Com mordente 10 g/L Alúmen de potássio CO + AP 10 g/L Ácido tânico CO + AT Com Agente de ligação 10 g/L Glioxal e 10 g/L Sulfato de alumínio CO + 1%Gli-1%SA 15 g/L Glioxal e 5 g/L Sulfato de alumínio CO + 1,5%Gli-0,5%SA Com pré-tratamento Alúmen de potássio Sem mordente CO_ptAP Com mordente 10 g/L Ácido tânico CO_ptAP + AT Ácido tânico Sem mordente CO_ptAT Com mordente 10 g/L Alúmen de potássio CO_ptAT + AP Plasma atmosférico Sem mordente CO_ptP Com mordente 10 g/L Alúmen de potássio CO_ptP + AP 10 g/L Ácido tânico CO_ptP + AT Quitosano Sem mordente CO_ptQ Com mordente 10 g/L Alúmen de potássio CO_ptQ + AP 10 g/L Ácido tânico CO_ptQ + AT Figura 14. Etapas da biocoloração/funcionalização dos provetes de algodão com própolis. A - Colocação da solução de biocoloração nos copos de esgotamento. B – Adição dos provetes de algodão à solução de biocoloração. C – Banho termostático onde decorre a etapa de esgotamento. A B C 33 2.3. Avaliação das propriedades de cor dos têxteis biocoloridos De forma a avaliar as cores obtidas e as diferenças de cor foram efetuados estudos de colorimetria nas malhas de algodão. Para esta análise traçaram-se os espectros de refletância na zona do visível entre os 400 e 700 nm com recurso a um espectrofotómetro UV-Vis PerkinElmer Lambda 35, com esfera interna de 60 mm. Durante o ensaio foram consideradas as normas ASTM D 23244 - 05 Standard Practice for Calculation of Color Tolerances and Color Differences from Instrumentally Measured Color Coordinates e ASTM E 308 - 01 Standard Practice for Computing the Colors Of Objects by Using the CIE System , que consideram um iluminante D65 e um ângulo de observação de 10 °. Inicialmente, fez-se a baseline para 100 % e 0 % de refletância com recurso a um padrão de refletância difusa labsphere® branco e opaco. Seguidamente, procedeu-se à medição da refletância de cada um dos têxteis coloridos, realizada no “lado direito” do têxtil. Uma vez obtidas as curvas de refletância, fez-se a conversão da percentagem de refletância (% R) nas coordenadas de cor - L* a* b* - que por sua vez permitiram calcular o valor de força colorística (K/s) seguindo a equação 2. Numa fase mais avançada, com o intuito de avaliar a solidez da cor às lavagens, foram calculados os valores de ΔE entre o substrato têxtil sem funcionalização e os provetes funcionalizados, após vários ciclos de lavagens. Os valores de ΔE foram calculados (equação 1) tendo em consideração os valores das coordenadas de cor. 2.4. Avaliação das bioatividades 2.4.1. Avaliação da atividade antioxidante 2.4.1.1. Extrato etanólico de própolis Para a avaliação in vitro da capacidade antioxidante do G19.EE foi utilizado o método de DPPH, método que tem vindo a ser usado no grupo para caracterização desta bioatividade em própolis. O G19.EE foi dissolvido em etanol absoluto para obter concentrações de 0,5 a 50 μg/mL (0,5; 1; 5; 10; 25 e 50 μg/mL). Em seguida, 50 μL de cada uma destas soluções foram misturados com 100 μL de DPPH• (Sigma) seguindo-se uma incubação de 20 min, à temperatura 34 ambiente e no escuro. A absorvância da reação foi medida a 517 nm no leitor de microplacas Spectra Max Plus 384 usando-se G19.EE dissolvido em etanol como branco. O controlo foi preparado com DPPH• e etanol em substituição do extrato de própolis. A atividade de eliminação de DPPH• por G19.EE foi calculada e comparada com a do ácido gálico (Sigma) (AG), aqui usado como padrão antioxidante. Os resultados foram expressos em percentagem de redução em relação aos valores do controlo, de acordo com a seguinte equação (equação 3): Atividade antioxidante (%)=Acontrolo − Aamostra Acontrolo ×100 (Equação 3) em que Acontrolo é a absorvância do controlo com DPPH• e etanol absoluto e Aamostra é a absorvância do extrato com DPPH•, após 20 min de reação. O IC50 (metade da concentração máxima de inibição) definido como a concentração de amostra necessária para obter uma redução de 50 % (Sebaugh, 2011), correspondente neste caso à concentração de G19.EE necessária para eliminar 50 % do DPPH• inicial, nas condições experimentais utilizadas, foi obtido por interpolação na curva padrão de ácido gálico (Figura A1, Apêndice I) a partir da análise de regressão linear. A capacidade antioxidante total do G19.EE foi calculada e expressa em equivalentes de ácido gálico por adição da concentração. 2.4.1.2. Solução de biocoloração A análise da capacidade antioxidante da solução de biocoloração (SB) foi realizada através do método espectrofotométrico do radical ABTS, no CeNTI. Em primeiro lugar, foi preparada uma solução aquosa 7 mM de ABTS (Sigma - Aldrich) em persulfato de potássio (Sigma - Aldrich) 2,45 mM e armazenada no escuro, à temperatura ambiente, durante 16 h. Sempre que necessário, a solução de trabalho de ABTS foi diluída com tampão fosfato 0,1 M a pH=7,4 e efetuou-se um varrimento de modo a garantir uma absorvância de 0,700 ± 0,025 no comprimento de onda máximo entre 700 e 800 nm (Figura A2, Apêndice II), medida por um espectrofotómetro UV-Vis (PerkinElmer Lambda 35). Para o ensaio propriamente dito foram adicionados 2,970 mL da solução de trabalho a 30 μL de SB e, após 6 min de contacto à temperatura ambiente, mediu-se a absorvância no comprimento de onda correspondente ao pico entre 700 e 800 nm. Ao longo do ensaio foi utilizada uma concentração de cisteína (Sigma - Aldrich), um composto padrão utilizado na avaliação da atividade antioxidante, de 0,3 g/L como o 41 Tabela 3. Rendimentos de extração etanólica, em percentagem, dos extratos etanólicos de amostras de própolis do Gerês (G.EEs) recolhidas entre 2011 e 2019. *G17.EE não foi considerado nesta análise pelo facto de se tratar de uma amostra diferente, conforme referido. Extratos etanólicos de Própolis Rendimento de extração (%) Referência G11.EE 67,7 (Freitas, 2015) G12.EE 88,0 G13.EE 75,5 G14.EE 76,42 G15.EE 66,17 (Gonçalves, 2017) G16.EE 76,45 Freitas A., comunicação pessoal G17.EE * G18.EE 61,63 G19.EE 83,53 Este trabalho O própolis que designamos Gerês resulta de uma mistura de própolis provenientes de três apiários distintos - Toutelo, Felgueiras e Bogalho. Em 2017, um incêndio destruiu as colmeias do apiário Bogalho, pelo que o própolis G17 não foi incluído para comparação no presente trabalho. Após a extinção das colmeias do Bogalho, as amostras G18 e G19 passaram a ser constituídas por uma nova mistura, agora originária dos apiários de Toutelo, Felgueiras e Roca (este localizado numa zona de vegetação idêntica à do apiário Bogalho). 3.1.1. Potencial antioxidante de G19.EE Entre as diversas ações dos antioxidantes, um dos mecanismos consiste na eliminação de radicais livres, processo avaliado frequentemente nos estudos da atividade antioxidante através de técnicas simples e rápidas que averiguam a atividade de eliminação de radicais de compostos específicos in vitro . Dos diversos métodos disponíveis, o de DPPH é dos mais utilizados para avaliar esta atividade (Gulcin, 2020) e tem sido usado para estimar o potencial antioxidante dos vários G.EEs e outros EE de própolis que o grupo tem vindo a estudar (Moreira et al. , 2008; Gonçalves, 42 2017; Freitas et al. , 2019; Gomes, 2019). Nesta metodologia, os resultados são expressos pela diminuição percentual da absorvância da solução do radical na presença do composto (neste caso o extrato), em função das concentrações testadas, e pelo valor de IC50. Quanto maior a redução de radical pelo extrato de própolis, para uma dada concentração, menor será o IC50 e, portanto, maior será a atividade antioxidante do extrato (Moreira et al. , 2008). O potencial antioxidante de G19.EE, estimado utilizando ácido gálico como padrão, revela um valor de IC50 igual a 24,29±0,07 μg/mL. Comparando com amostras de própolis oriundas da mesma proveniência, mas colhidas em anos anteriores, constata-se alguma variabilidade nesta bioatividade (Figura 16). A capacidade antioxidante de G19.EE é idêntica à de G13.EE (IC50=25,24±2,45 μg/mL), por sua vez semelhante ao potencial antioxidante de amostras de própolis irlandesas e checas (IC50=26,45 ± 3,8 µg/mL e 27,72 ± 5,2 µg/mL, respetivamente) (ALAni et al. , 2018). Em relação a outros G.EEs, G19.EE apresenta diferenças significativas, sendo a sua capacidade antioxidante inferior, apesar de se ter obtido um dos maiores rendimentos na sua extração. Esta diferença poderá estar relacionada com diferentes quantidades de alguns compostos associados às propriedades antioxidante do própolis, como apigenina, kaempferol, galangina, éster isoprenílico do ácido cafeico (isómero) (Chen et al. , 2009; Boisard et al. , 2014). De acordo com Freitas e colaboradores (2019), a abundância dos compostos principais diferencia todos os G.EEs, isto é, os G.EEs são caracterizados pela prevalência dos mesmos compostos, mas alguns mais abundantes como crisina, éster isoprenílico do ácido cafeico e pinocembrina e outros menores, como pinobanksina e derivados de ácidos fenólicos. Assim, G19.EE poderá apresentar mais compostos responsáveis por outras atividades, por exemplo atividade antimicrobiana (pinocembrina, ácido ferúlico e galangina), do que pela atividade antioxidante, mas seria necessário fazer a sua análise química para se fazer uma análise mais detalhada. Sabe-se que própolis pode exibir grande diversidade em termos de potencial antioxidante, se proveniente de origens diferentes. Esta diversidade foi já observada a nível nacional, com Moreira et al. (2008) a reportarem que própolis de Bornes e do Fundão apresentam elevada atividade antioxidante, com valores de IC50 de aproximadamente 6 μg/mL e de 52 μg/mL, respetivamente. A diversidade é mesmo observada em própolis recolhido num mesmo apiário, mas em diferentes estações do ano, como constatado por Miguel et al. (2010) em própolis do Algarve. 43 O G19.EE, em comparação com os estudos apresentados, apresenta uma forte atividade de eliminação de radicais livres de DPPH, tornando-se muito atrativo para futuras aplicações. 3.1.2. Atividade antibacteriana de G19.EE Na avaliação da atividade antibacteriana de G19.EE, através do método de difusão em agar, determinou-se a menor concentração de extrato para a qual não se observou crescimento de cada uma das bactérias testadas (Tabela 4). As bactérias Gram-positivas revelam maior suscetibilidade ao extrato do que a única bactéria Gram-negativa testada, sugerindo que as bactérias Gram-positivas são também mais suscetíveis a G19.EE, conforme genericamente descrito na literatura para a resposta deste tipo de bactérias a diferentes amostras de própolis (Bankova et al ., 2000; Sforcin et al. , 2000; Uzel et al. , 2005; Ramos e Miranda, 2007; El-Guendouz et al. , 2018; Oryan et al ., 2018; Freitas et al. , 2019). A razão que tem sido apontada prende-se com o facto de as bactérias Gram-negativas possuírem uma parede celular mais complexa e terem um teor em lípidos maior que as Gram-positivas, nomeadamente a presença de uma membrana externa, que inibe ou retarda a penetração do própolis (Cushnie e Lamb, 2005a; Silva et al. , 2012). Figura 16. Capacidade de captura do radical livre DPPH•, apresentada em valores de IC50 (μg/mL), dos extratos etanólicos de amostras de própolis do Gerês (G.EEs) recolhidas entre 2011 e 2019. G17.EE não foi considerado nesta análise pelo facto de se tratar de uma amostra diferente, conforme atrás referido. Realizou-se o teste One-way ANOVA (letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas pelo teste Tukey (p ≤ 0,05)). 44 Tabela 4. Atividade antibacteriana do extrato etanólico preparado com a amostra de própolis do Gerês recolhida em 2019 (G19.EE). A atividade antibacteriana foi expressa em valores de concentração mínima inibitória (CMI) (μg/mL). Bactéria CMI (μg/mL) de G19.EE Gram-positiva Bacillus megaterium 100 Bacillus subtilis 100 Bacillus cereus 100 Propionibacterium acnes 500 Staphylococcus aureus (MSSA) 500 Staphylococcus aureus (MRSA) >2000 Gram-negativa Escherichia coli >2000 MRSA - Staphylococcus aureus resistente à meticilina, do inglês Methicillin resistant Staphylococcus aureus ; MSSA - Staphylococcus aureus suscetível à meticilina, do inglês Methicillin susceptible Staphylococcus aureus G19.EE exibe maior efeito antibacteriano contra as bactérias do género Bacillus (CMI =100 μg/mL) seguidas de Propionibacterium acnes e de Staphylococcus aureus (MSSA) com valores semelhantes (CMI = 500 μg/mL). Em relação à estirpe de Staphylococcus aureus resistente à meticilina, MRSA, não é detetada atividade na gama de concentrações de extrato testadas, tal como observado relativamente a Escherichia coli . Estes resultados são semelhantes a resultados obtidos em anos anteriores para própolis do Gerês (Tabela A2, Anexo I), verificando-se uma constância nesta bioatividade ao longo dos anos, um comportamento invulgar em amostras de própolis já reportado por Freitas et al. (2019). Este facto poderá ser de particular relevância, por exemplo para a indústria farmacêutica, para garantir homogeneidade e qualidade no produto final. A maior atividade antibacteriana de G19.EE e dos restantes G.EEs contra Bacillus sp. sugere ainda que as bactérias formadoras de esporos, como Bacillus cereus , de particular importância na indústria alimentar por estar associada a intoxicações alimentares, são mais sensíveis ao própolis, em comparação com as bactérias não esporulantes (Ramanauskiene et al. , 2009), o que poderá 45 sugerir um espectro de atividade específica de G.EEs contra bactérias Gram-positivas formadoras de esporos (Freitas et al. , 2019). Propionibacterium acnes também se mostra suscetível ao extrato testado, embora sendo necessária uma maior concentração para inibir o seu crescimento, em comparação com as bactérias do género Bacillus. Tal como já sugerido por outros autores (Boyanova et al. , 2006), própolis tem potencial para ser utilizado no tratamento de problemas associados a esta estirpe, nomeadamente no tratamento da acne. Em relação ao género Staphylococcus , MSSA demonstra uma suscetibilidade semelhante a Propionibacterium acnes, mas o extrato não revela atividade, nas concentrações testadas, contra MRSA. Como já referido, resultados semelhantes foram obtidos com própolis do Gerês recolhido entre 2011 e 2016 (Tabela A2, Anexo I); no entanto, seria aconselhável aumentar a gama de concentrações testadas, atendendo que Dias et al . (2012) demonstraram a eficácia de amostras de própolis da região dos Trás-os-Montes contra MRSA. Resultados idênticos foram obtidos por ALAni et al. (2018) com EE de própolis de várias origens geográficas, nomeadamente da Alemanha, Irlanda e República Checa. Não se detetou atividade contra a bactéria Gram-negativa na gama de concentrações testada, uma vez mais à semelhança do ocorrido com própolis do Gerês de anos anteriores (Freitas et al. , 2019). Esta ausência de suscetibilidade foi também observada face a EE de própolis de várias regiões do país Basco (norte de Espanha) (Bonvehí e Gutiérrez, 2012); porém, outras amostras de própolis mostraram-se ativas contra esta bactéria (Rahman et al ., 2010; Silva et al. , 2012; AL-Ani et al. , 2018). Esta variabilidade entre amostras de própolis de diferentes origens e mesmo em amostras de origem semelhante, quer nesta atividade como noutras bioatividades, parece ser uma constante neste produto natural. A diferença observada entre a atividade antibacteriana pode dever-se a vários fatores, tais como a complexa e variável composição química do própolis, as diferentes técnicas que são frequentemente aplicadas para determinar os valores de CMI, sendo também testadas diferentes gamas de concentração, bem como estirpes, dificultando assim a comparação dos resultados com outros trabalhos. Embora desconhecido ainda o mecanismo de ação do própolis do Gerês, a atividade antibacteriana deste produto natural parece poder ocorrer por diversos mecanismos de ação, 46 como a inibição da divisão celular, dissociação da membrana citoplasmática e da parede celular, inibição da síntese proteica e RNA polimerase ou através da inibição enzimática (Cushnie e Lamb, 2005b). Baixas concentrações de própolis podem interferir com enzimas de produção de energia, e concentrações mais elevadas podem desnaturar as proteínas (Tiwari et al. , 2009). 3.2. Caracterização da solução de biocoloração 3.2.1. Potencial antioxidante da solução de biocoloração A avaliação da capacidade antioxidante da solução de biocoloração (SB) - própolis a 1 % (p/v) em 5 % etanol:95 % água (Figura 11. B) - foi realizada recorrendo ao método de ABTS que tem por base a redução de um radical livre, quando em contacto com uma amostra com poder antioxidante, provocando a descoloração da solução de radical, detetada por espectrofotometria. Como previsto, a L-cisteína (controlo positivo), testada numa concentração de 0,3 g/L, exibiu uma redução de 47,47 ± 13,51 % do radical livre, em linha com os resultados da curva de calibração efetuada (Figura A3, Apêndice II). A SB apresenta uma atividade antioxidante de, aproximadamente, 90 % (Figura 17), demonstrando que a atividade do própolis G19.EE se manteve e passou para a solução. Esta atividade pode estar intimamente associadas aos compostos flavonóides, apesar de se desconhecer a composição do extrato G19.EE, mas segundo Freitas et al. (2019), em G.EEs de anos anteriores encontra-se apigenina, kaempferol, galangina, éster isoprenílico do ácido cafeico (isómero) que podem estar associados a esta atividade. Tendo em consideração os resultados obtidos, decidiu-se prosseguir as etapas de coloração/funcionalização têxtil. Figura 17. Atividade antioxidante da solução de biocoloração (SB) pelo método ABTS. L-cisteína (0,3 g/L) representa o controlo positivo. Os resultados são exibidos como a média das três réplicas efetuadas e respetivo desvio padrão. 47 3.2.2. Atividade antibacteriana da solução de biocoloração Para além da atividade antioxidante, pretendeu-se avaliar também, no presente trabalho, o potencial da SB conferir atividade antibacteriana aos têxteis de algodão. Neste sentido, estudouse a capacidade da SB inibir o crescimento de seis bactérias Gram-positivas e de uma bactéria Gram-negativa (Tabela 2). Neste ensaio foi usado o método de difusão em agar, observando-se a presença ou ausência de crescimento de cada uma das bactérias testadas na presença de SB (Figura18). Pela observação dos resultados, verifica-se que os controlos estão de acordo com o previsto, já que não se observa inibição do crescimento bacteriano para nenhuma diluição quer em meio de cultura apenas (Figura 18. A e B, a) quer na presença de etanol (Figura 18. A e B, b). As bactérias do género Bacillus não cresceram na presença de SB (Figura 18. A e B, c e d). Staphylococcus aureus demonstrou uma suscetibilidade semelhante às bactérias do género Bacillus . Contrariamente, a solução não se revela eficaz, nas concentrações testadas, contra MRSA, a estirpe de Staphylococcus aureus resistente à meticilina, embora se observe alguma inibição de crescimento (Figura 18. B, d). Um comportamento idêntico é exibido por Propionibacterium acnes . Eventualmente será possível inibir o crescimento desta bactéria na presença de concentrações superiores, uma vez que na diluição 10-4 não existe crescimento (Figura 18. B, d). Relativamente a Escherichia coli , as concentrações testadas não demonstraram atividade antibacteriana, sendo possível observar crescimento nas placas, um resultado que corrobora o que se obteve para G19.EE (subcapítulo 3.1.2) e que ilustra o que amplamente se refere sobre a menor suscetibilidade destas bactérias Gram-negativas a própolis (Bankova et al ., 2000; Sforcin et al. , 2000; Uzel et al. , 2005; Ramos e Miranda, 2007; El-Guendouz et al. , 2018). Para além de permitir analisar a atividade antibacteriana da SB, esta experiência permitiu ainda selecionar a bactéria a usar nos ensaios antibacterianos com os têxteis funcionalizados com própolis. Nestes testes, Staphylococcus aureus e Escherichia coli são as bactérias referenciadas nos procedimentos normativos como indicadores de suscetibilidade (Ristić et al. , 2011), por serem as mais comuns em infeções hospitalares e também as que mais degradam os materiais têxteis (Lee et al ., 2009; Ibrahim et al ., 2010). Face ao exposto e aos resultados ilustrados na Figura 18, foi selecionada para tais ensaios Staphylococcus aureus , ou MSSA, por ser mais suscetível. 48 a 10-1 10-2 10-3 10-4 b 10-1 10-2 10-3 10-4 c 10-1 10-2 10-3 10-4 d 10-1 10-2 10-3 10-4 Bacillus cereus Escherichia coli Bacillus subtilis MSSA Bacillus cereus Escherichia coli Bacillus subtilis MSSA Bacillus cereus Escherichia coli Bacillus subtilis MSSA Bacillus cereus Escherichia coli Bacillus subtilis MSSA 10-1 10-2 10-3 10-4 a 10-1 10-2 10-3 10-4 b 10-1 10-2 10-3 10-4 c 10-1 10-2 10-3 10-4 d MRSA Bacillus megaterium Propionibacterium acnes MRSA Bacillus megaterium Propionibacterium acnes MRSA Bacillus megaterium Propionibacterium acnes MRSA Bacillus megaterium Propionibacterium acnes A. B. Figura 18. Avaliação da atividade antibacteriana da solução de biocoloração (SB) contra as bactérias Bacillus cereus , Escherichia coli , Bacillus subtilis , Methicillin susceptible Staphylococcus aureus (MSSA) (A) e Methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Bacillus megaterium , Propionibacterium acnes (B). O controlo foi uma placa de meio LB sem SB. As bactérias foram cultivadas em LB a 37 °C, 200 rpm, até ser obtida uma D.O.600 entre 0,4 e 0,6. Posteriormente, as culturas foram diluídas de forma seriada até à diluição 10-⁴ e 5 μL de cada diluição foram pipetados para meio sólido, em placas contendo diferentes concentrações de SB. a - meio LBA, b – LBA e etanol, c - meio LBA contendo SB a 0,1 % e d - meio LBA com SB a uma concentração 0,2 %. 49 Com a confirmação de ambas as atividades na solução de biocoloração concluiu-se que, usando o solvente água/etanol, as atividades de G19.EE se mantêm na SB. Assim, poderemos sugerir que a água será um bom veículo para obtenção de uma solução mais económica a nível industrial. 3.3. Caracterização dos têxteis biocoloridos e funcionais Após caracterização de G19.EE e da SB, procedeu-se à coloração e funcionalização dos têxteis com o objetivo de verificar a capacidade da solução em estudo prover cor, bem como atividade antioxidante e/ou atividade antibacteriana aos mesmos. Pela importância já referida no setor, os têxteis utilizados foram malhas de algodão. Com o intuito de melhorar a ancoragem da SB aos têxteis, vários processos de modificação de superfície têxtil e/ou de mordentagem foram testados, mencionados nos subcapítulos 2.2.2 e 2.2.3. Assim, para este rastreio inicial, foram produzidas várias amostras de têxteis biocoloridas, nomeadamente algodão tingido com solução de biocoloração (CO + SB), algodão tingido simultaneamente com alúmen de potássio e solução de biocoloração (CO + AP + SB), algodão tingido simultaneamente com ácido tânico e solução de biocoloração (CO + AT + SB), algodão tingido simultaneamente com 1 % glioxal, 1 % sulfato de alumínio e solução de biocoloração (CO + 1%Gli-1%SA + SB), algodão tingido simultaneamente com 1,5 % glioxal, 0,5 % sulfato de alumínio e solução de biocoloração (CO + 1,5%Gli-0,5%SA + SB), algodão pré-tratado com alúmen de potássio e tingido com solução de biocoloração (CO_ptAP + SB), algodão pré-tratado com alúmen de potássio e tingido simultaneamente com ácido tânico e solução de biocoloração (CO_ptAP + AT + SB), algodão pré-tratado com ácido tânico e tingido com solução de biocoloração (CO_ptAT + SB), algodão pré-tratado com ácido tânico e tingido simultaneamente com alúmen de potássio e solução de biocoloração (CO_ptAT + AP + SB), algodão pré-tratado com plasma e tingido com solução de biocoloração (CO_ptP + SB), algodão pré-tratado com plasma e tingido simultaneamente com alúmen de potássio e solução de biocoloração (CO_ptP + AP + SB), algodão pré-tratado com plasma e tingido simultaneamente com ácido tânico e solução de biocoloração (CO_ptP + AT + SB), algodão pré-tratado com quitosano e tingido com solução de biocoloração (CO_ptQ + SB), algodão pré-tratado com quitosano e tingido simultaneamente com alúmen de potássio e solução de biocoloração (CO_ptQ + AP + SB) e algodão pré-tratado com quitosano e tingido simultaneamente com ácido tânico e solução de biocoloração (CO_ptQ + AT + SB) (ver Figura 15). 50 3.3.1. Análise de cor Para analisar de forma mais objetiva a cor dos substratos tingidos e funcionalizados com SB, foi realizado um ensaio de leitura da refletância de todas as amostras do rastreio inicial (Figura 15), recorrendo-se a um espectrofotómetro UV-Vis. Através dos resultados obtidos e, tendo em consideração as normas ASTM D 2244-05 e E 308-01, foram calculadas as coordenadas de cor L*a*b*, assim como o valor correspondente da força colorística de cada um dos têxteis. Na Tabela 5, apresentam-se os resultados obtidos para a variável K/s, bem como fotografias de cada uma das amostras, ilustrando a sua cor. Tabela 5. Valores obtidos para a força colorística (K/s) e fotografias dos têxteis tingidos com a solução de biocoloração (SB). Os resultados são apresentados como a média de três réplicas para cada condição e respetivo desvio padrão. Amostra Força colorística (K/s) Cor obtida CO 0,024±0,001 CO + SB 2,622±0,063 CO + AP + SB 3,107±0,318 CO + AT + SB 3,022±0,138 CO + 1%Gli-1%SA + SB 6,001±1,508 CO + 1,5%Gli-0,5%SA + SB 4,814±0,323 CO_ptAP 0,030±0,001 CO_ptAP + SB 3,736±0,076 CO_ptAP + AT + SB 6,147±1,428 CO_ptAT 0,116±0,002 CO_ptAT + SB 2,789±0,149 CO_ptAT + AP + SB 2,847±0,127 CO_ptP 0,030±0,001 CO_ptP + SB 2,683±0,350 CO_ptP + AP + SB 2,766±0,349 CO_ptP + AT + SB 2,403±0,136 CO_ptQ 0,039±0,002 CO_ptQ + SB 5,227±0,377 CO_ptQ + AP + SB 2,624±0,044 CO_ptQ + AT + SB 5,608±0,169 57 biocoloração (88,66 ± 0,39), bem como à da amostra de algodão tingida (CO + SB) (91,64 ± 2,86 %), mostrando que o mordente ácido tânico tem capacidade de eliminar o radical livre ABTS. Este resultado tem eco na literatura, com Koh e Hong (2017) a constatar que o algodão pré-tratado com uma solução de ácido tânico a 10 g/L apresentou uma atividade antioxidante de, aproximadamente, 90 %. A elevada atividade antioxidante do ácido tânico poderá estar associada à presença de compostos polifenólicos, que apresentam capacidade de eliminar radicais livres (Zhang et al. , 2019). Desta forma, os provetes que contêm este mordente não serão tão interessantes para o presente estudo, uma vez que não se saberia se atividade antioxidante presente provinha do própolis presente na solução, do ácido tânico ou de uma eventual sinergia entre os dois. Por outro lado, é possível verificar que todos os têxteis tingidos/funcionalizados com a solução de biocoloração conferiram às malhas uma maior capacidade antioxidante, em Figura 21. Atividade antioxidante de têxteis funcionalizados com a solução de biocoloração (SB) e dos respetivos têxteis controlo não tingidos. L-cisteína (0,3 g/L) foi usada como controlo positivo. Os resultados são apresentados em termos da média de três réplicas para cada condição e respetivo desvio padrão. As médias foram analisadas através de comparações múltiplas entre controlo positivo, a solução de biocoloração (SB) e o algodão (CO) com as restantes amostras, recorrendo ao teste One-way ANOVA (letras diferentes entre 2 valores indicam diferenças estatísticas significativas pelo teste Tukey (p≤ 0,05)). Solução de biocoloração Têxteis controlo Têxteis tingidos/funcionalizados com a 58 comparação com os têxteis controlos. Isto poderá ser explicado pela presença de compostos funcionais, transferidos aquando do banho de esgotamento da SB para o algodão. É de notar que a amostra sem qualquer pré-tratamento ou adição de agentes auxiliares, o provete CO + SB, apresentou um valor de atividade antioxidante elevado, mais especificamente de 91,64 ± 2,86 %. Este é um resultado particularmente interessante e promissor a nível industrial, pela possibilidade de remover os custos com mordentes e, também, por permitir que o processo seja mais sustentável, evitando efluentes com resíduos tóxicos. Relativamente ao mordente alúmen de potássio (Figura 21), este não influencia significativamente a obtenção de têxteis com atividade antioxidante, existindo distinção entre as malhas tingidas e não tingidas. No entanto, o provete pré-tratado com este mordente (CO_ptAP) apresenta um ligeiro aumento de atividade antioxidante (29,05 ± 16,81 %) quando comparado com o algodão (CO) (15,08 ± 3,00 %). Esta diferença entre amostras poderá dever-se a uma ligeira heterogeneidade do tratamento, ou seja, a uma diferença na concentração do alúmen de potássio em diferentes zonas da mesma malha, que se reflete também na amplitude dos desvios padrão obtidos. No caso dos têxteis biocoloridos e tratados com alúmen de potássio nos diferentes processos de mordentagem utilizados - simultânea (CO + AP + SB) e pré (CO_ptAP + SB) - ambos apresentam atividade antioxidante estatisticamente idêntica à da solução, e entre si (87,73 ± 2,06 % e 96,35 ± 0,71 %). Relativamente ao agente de ligação glioxal e ao catalisador sulfato de alumínio verifica-se que estes não influenciam a atividade analisada, não havendo distinção entre as malhas com e sem este auxiliar (Figura 21). Por outro lado, a atividade antioxidante das amostras têxteis funcionalizadas com diferentes concentrações destes agentes de ligação (CO + 1%Gli-1%SA + SB e CO + 1,5%Gli-0,5%SA + SB) é estatisticamente semelhante (95,82 ± 0,41 % e 94,43 ± 0,49 %). Assim, para os ensaios subsequentes, optou-se por uma destas condições, que foi a que apresentava menor concentração do agente de ligação glioxal (CO + 1%Gli-1%SA + SB), não só para efeitos de comparação pois trata-se de um tratamento já utilizado para funcionalizar têxteis com própolis (Sharaf, et al ., 2013) mas também por representar uma melhor opção a nível industrial. Apesar do mordente de alúmen de potássio e do agente de ligação glioxal serem considerados seguros, a crescente consciencialização ambiental leva à necessidade de procurar métodos alterativos que gerem o mínimo de efluentes. A tecnologia de plasma permite induzir 59 grupos funcionais sem a necessidade de químicos ou solventes e não produz efluentes. As amostras de algodão foram submetidas ao pré-tratamento com plasma e a um processo de mordentagem em simultâneo com alúmen de potássio ou com ácido tânico, com o objetivo de analisar o efeito entre os dois tipos de tratamento. Pela análise da Figura 21 conclui-se que, após o tratamento com plasma, a malha (CO_ptP) não exibe atividade antioxidante, não havendo distinção entre a malha com (19,68 ± 4,24 %) e sem pré-tratamento (15,08 ± 3,00 %). Nos têxteis impregnados com a solução de biocoloração todas as amostras apresentaram um aumento significativo da atividade antioxidante. Relativamente ao efeito da utilização de dois tratamentos, e excluindo a análise do pré-tratamento com ácido tânico uma vez que este mordente por si só tem atividade, constata-se não haver diferenças significativas na atividade antioxidante comparativamente a metodologias mais rápidas (provetes CO_ptP + AP + SB e CO + AP + SB por exemplo). Desta forma, e pensando em termos de escala industrial, seria mais vantajoso recorrer apenas ao mordente alúmen de potássio tendo em conta a duração, custo e conhecimento mais avançado do processo. Outra alternativa sustentável para potencializar a ligação dos compostos funcionais ao têxtil pode ser através de um pré-tratamento com quitosano. Da mesma forma que para a tecnologia de plasma, foi igualmente testado o efeito do pré-tratamento com quitosano juntamente com a mordentagem simultânea com alúmen de potássio. Analisando os controlos, o algodão prétratado (CO_ptQ) não apresenta atividade antioxidante, demonstrando-se semelhante à malha não tratada (CO). Relativamente aos têxteis biocoloridos, todas as amostras tiveram um aumento significativo da atividade analisada em comparação com as malhas com e sem pré-tratamento. Contudo, tal como o pré-tratamento com plasma, este tratamento não apresenta diferenças relativamente aos métodos mais simples, que continuam assim a mostrar-se mais vantajosos. Uma vez que os resultados do rastreio inicial da avaliação da atividade antioxidante nos têxteis desenvolvidos foram positivos, no sentido em que houve transferência desta bioatividade da SB para o algodão, pretendeu-se avaliar a durabilidade da funcionalidade ao logo do tempo e à lavagem com detergente. Para o efeito, optou-se pelas amostras CO + SB, CO + AP + SB, CO_ptAP + SB e CO + 1%Gli-1%SA + SB, a par dos respetivos controlos. Os critérios subjacentes a esta escolha tiveram em linha de conta não apenas os resultados da atividade antioxidante, mas também o facto do tempo e dos gastos com a energia e os recursos humanos serem inferiores no caso destas amostras, a par da constatação de que os respetivos têxteis controlos não possuem atividade antioxidante. E para estudar a capacidade da solução de biocoloração funcionalizar os 60 têxteis em fases temporais diferentes e, consequentemente, a sua estabilidade ao longo do tempo, procedeu-se a uma nova funcionalização têxtil após 8 meses e avaliou-se por ABTS a atividade antioxidante destas amostras. A comparação entre os resultados obtidos para a atividade antioxidante das amostras tratadas em janeiro de 2020 e então avaliadas para esta bioatividade com os das amostras tingidas com a mesma solução em setembro do mesmo ano encontram-se na Figura 22. Os provetes biocoloridos e funcionalizados com 8 meses de intervalo apresentam idêntico potencial antioxidante, o que demonstra que a solução de biocoloração com própolis se mantém estável, pelo menos, durante este período. Trata-se de uma grande vantagem a nível industrial, uma vez que as empresas poderão armazenar a solução a 4 °C e usá-la em processos de tingimento e de funcionalização durante este período, sem necessidade de prepararem nova solução a cada ensaio. Paralelamente, voltou a avaliar-se a atividade antioxidante da amostra tingida/ funcionalizada com a solução de biocoloração (CO + SB) em janeiro 2020, isto é, decorridos 8 meses após o tratamento (Figura 23). Constata-se que o provete em estudo manteve a atividade Figura 22. Atividade antioxidante de têxteis funcionalizados com a solução de biocoloração (SB) num intervalo de 8 meses. A atividade antioxidante foi avaliada em janeiro e em setembro de 2020, após cada uma das funcionalizações. O controlo positivo foi L-cisteína (0,3 g/L) e o controlo negativo é constituído pelos têxteis não tingidos. As amostras utilizadas foram algodão (CO), algodão tratado simultaneamente com alúmen de potássio (CO + AP), algodão pré-tratado com alúmen (CO_ ptAP) e algodão tratado simultaneamente com glioxal e sulfato de alumínio a 10 g/L (CO + 1%Gli-1%SA). Os resultados são apresentados como a média de três réplicas para cada condição e respetivo desvio padrão. As médias foram analisadas através de comparações múltiplas, recorrendo ao teste One-way ANOVA (letras diferentes entre 2 valores indicam diferenças estatísticas significativas pelo teste Tukey (p≤ 0,05)). 61 funcional, o que demonstra que se pode tingir uma maior quantidade de malha e armazená-la durante pelo menos 8 meses sem que a atividade antioxidante se perca, o que representa outra vantagem a nível industrial. Uma das principais limitações inerentes ao desenvolvimento de têxteis funcionais, sobretudo com produtos naturais, é a sua capacidade de manter a atividade inicial, particularmente depois de sujeitos a várias condições da sua utilização, como a lavagem. Neste sentido, para averiguar a solidez da atividade antioxidante à lavagem, os têxteis, entretanto selecionados, e os seus respetivos controlos, foram submetidos a vários ciclos de lavagem, numa máquina de lavar convencional e com recurso a um detergente para roupa delicada (Soflan). Os resultados obtidos para estes ensaios com diferentes ciclos de lavagem estão representados na Figura 24. Analisando os controlos (CO, CO_ptAP e CO +1 %Gli-1%SA) (Figura 24) verifica-se, de um modo geral, que ocorreu um decréscimo na atividade em comparação com os têxteis não lavados. Isto pode estar associado com a eliminação de impurezas de acabamento têxtil que, antes da lavagem, influenciavam, ligeiramente, o método de ABTS. Figura 23. Atividade antioxidante da malha de algodão funcionalizada com a solução de biocoloração (CO + SB) medida logo após o tingimento e decorridos 8 meses, usando L-cisteína (0,3 g/L) como controlo. Os resultados são apresentados como a média de três réplicas para cada condição e respetivo desvio padrão. As médias foram analisadas recorrendo ao teste One-way ANOVA (letras diferentes entre 2 valores indicam diferenças estatísticas significativas pelo teste Tukey (p≤ 0,05)). 62 A amostra tratada unicamente com a solução de biocoloração (CO + SB) teve uma perda de atividade antioxidante, mas apenas após 5 ciclos de lavagem, apresentando diferenças significativas em comparação com os provetes que foram sujeitos a 1 e a 3 ciclos de lavagem, resultados que vão ao encontro das conclusões retiradas na análise da cor (Figura 19 e 20). Este resultado está também de acordo com o que tem sido reportado na literatura relativamente às limitações do tingimento e da funcionalização natural, e que é a baixa solidez às principais condicionantes do ciclo de vida do artigo têxtil, sobretudo à lavagem, requerendo a utilização de compostos auxiliares para melhorar a ancoragem e a durabilidade dos compostos funcionais presentes nos substratos têxteis (Zerin et al. , 2019; Eid e Ibrahim, 2020; Haji e Naebe, 2020). Contudo, após 5 ciclos de lavagem, esta amostra ainda apresenta uma atividade antioxidante consideravelmente maior que o respetivo provete controlo (CO), ou seja, 62,75 ± 8,65 % em relação a 7,75 ± 0,35 %, respetivamente. Mesmo assim, a amostra CO + SB poderá fornecer benefícios cosméticos como antienvelhecimento, útil em determinadas aplicações de utilização Figura 24. Atividade antioxidante de têxteis funcionalizados com a solução de biocoloração (SB) e respetivos controlos após 1, 3 e 5 ciclos de lavagem. L-cisteína (0,3 g/L) foi usada como controlo positivo. As amostras utilizadas foram algodão (CO), algodão tratado simultaneamente com alúmen de potássio (CO + AP), algodão pré-tratado com alúmen (_ptAP) e algodão tratado simultaneamente com glioxal e sulfato de alumínio a 10 g/L (CO + 1%Gli-1%SA). Os resultados são apresentados como a média de três réplicas para cada condição e respetivo desvio padrão. As médias foram analisadas através de comparações múltiplas, recorrendo ao teste One-way ANOVA (letras diferentes entre 2 valores indicam diferenças estatísticas significativas pelo teste Tukey (p≤ 0,05)). 63 única ou com eficácia até 3 ciclos de lavagem, como numa máscara, por exemplo, descartável ou reutilizável 2-3 vezes. Relativamente às malhas coloridas/funcionalizadas, quer utilizando um tratamento simultâneo ou um pré-tratamento com alúmen de potássio (CO + AP + SB e CO_ptAP + SB), a atividade antioxidante mantém-se após os vários ciclos de lavagem. De realçar que, após 5 ciclos, ambas as amostras apresentaram uma atividade antioxidante idêntica à da solução de biocoloração (88,66 ± 0,39 %) (Figura 17). Estes resultados apontam para um papel crucial do mordente alúmen de potássio na durabilidade da funcionalidade dos têxteis tratados com própolis. Uma vez que ambas as condições de mordentagem apresentam um desempenho semelhante no que diz respeito à atividade antioxidante, a nível industrial será sempre mais favorável realizar tal processo em simultâneo com o tingimento, diminuindo o tempo, os gastos com a energia e os recursos humanos. De modo a compreender se a adição de um agente de ligação confere aos têxteis coloridos/funcionalizados uma melhor ancoragem, submeteu-se o provete CO + 1%Gli-1%SA + SBa vários ciclos de lavagem. As amostras continuaram a ter uma atividade antioxidante igual ao provete não lavado (Figura 24). Porém, não se verificam efeitos positivos na utilização de glioxal em comparação com o alúmen de potássio, ou seja, o algodão tratado com glioxal e com a solução de biocoloração (CO + 1%Gli-1%SA + SB) exibe a mesma capacidade redutora que o têxtil tratado com alúmen de potássio e com a solução (CO + AP + SB). Assim, o alúmen de potássio será um melhor auxiliar na coloração/funcionalização, dada a menor toxicidade, diminuindo o impacto do posterior descarte das águas residuais geradas pela coloração/funcionalização (Vankar, 2017). Dado que os resultados obtidos após 5 ciclos de lavagem foram bastante promissores em termos da funcionalidade têxtil, seria interesante, futuramente, testar a atividade antioxidante após a realização de mais ciclos de lavagem. 3.3.3. Potencial antibacteriano dos têxteis biocoloridos e funcionalizados Com o intuito de oferecer aos consumidores cada vez mais conforto, higiene e bem-estar, a indústria têxtil tem trabalhado arduamente no desenvolvimento de têxteis técnicos e funcionais com propriedades diversas, entre as quais antimicrobianas. Estes produtos permitem controlar os maus odores e atrasar a degradação do artigo têxtil, problemas causados pelos microrganismos presentes na pele humana, bem como ajudar na mitigação de doenças cutâneas, estas causadas 64 por microrganismos patogénicos ou oportunistas. Nos últimos anos tem sido notório o interesse no desenvolvimento destes artigos, e com compostos funcionais mais sustentáveis, sobretudo de base natural. Vários estudos têm mostrado que as fibras celulósicas tratadas com agentes antibacterianos naturais, como extratos de aloé vera (Ali et al. , 2014; Khurshid et al. , 2015), tulsi (Sathianarayanan et al. , 2010), flor de joio espinhoso (Thilagavathi e Kannaian, 2008) e chá verde (Ibrahim et al ., 2017) apresentam boas atividades contra vários microrganismos. Estes estudos de algum modo suportam o presente trabalho, onde um dos objetivos é a utilização de própolis para funcionalização de têxteis com propriedades antibacterianas. Após preparação das malhas 100 % algodão coloridas/funcionalizadas, foram efetuados testes qualitativos e quantitativos de avaliação de desempenho antimicrobiano, com recurso à bactéria Staphylococcus aureus , por demonstrar suscetibilidade à solução de biocoloração com própolis (subcapítulo 3.2.2). Considerando as metodologias disponíveis, optou-se por um ensaio de seguimento da curva de crescimento da bactéria , quando colocada em contacto com os têxteis tingidos com a solução de biocoloração. Realizou-se um controlo de crescimento, que consistiu apenas numa cultura de bactérias em meio líquido e condições de crescimento apropriadas, um controlo positivo, que consistiu na colocação do antibiótico ampicilina na cultura e vários controlos negativos, correspondentes a culturas em contacto com os têxteis sem tingimento/funcionalização. Numa primeira fase, e tal como na análise da cor e da propriedade antioxidante, procedeuse a um rastreio com o objetivo de selecionar os tratamentos mais promissores para prosseguir os estudos de avaliação da solidez da funcionalidade à lavagem. As curvas de crescimento da Staphylococcus aureus encontram-se nas Figuras 25 a 30. De modo a tornar a análise mais percetível, alguns parâmetros foram compilados numa tabela, sendo eles a taxa específica de crescimento, que permite avaliar o aumento do número total de células durante a fase exponencial; a densidade ótica final, a duração da fase de latência, ou seja, o tempo que as células demoram a adaptar-se ao novo meio líquido e a percentagem de atividade antibacteriana (Tabelas 7 a 12). No que diz respeito aos controlos, de forma geral, todos exibiram o perfil esperado. Nas curvas de crescimento de Staphylococcus aureus e de Staphylococcus aureus na presença da malha de algodão (CO) é possível observar uma diferença entre a densidade ótica final, a duração da fase de latência e a taxa específica de crescimento (Figura 25, Tabela 7). Estas diferenças poderão dever-se à retenção e adesão de microrganismos ao provete, reduzindo a quantidade de 65 bactérias livres em suspensão no meio líquido, devido à natureza rugosa das superfícies têxteis e à constante agitação durante o ensaio. Segundo Wang et al. (2018) a malha de algodão faz com que exista alguma redução no crescimento da bactéria, proporcionado pela adesão de bactérias à superfície da amostra. No entanto, o algodão sem qualquer tratamento (CO) não apresenta atividade antibacteriana, atingindo valores de D.O. final superiores a 1, mesmo quando tratado com alúmen de potássio (CO + AP), indicando que este mordente não apresenta atividade antibacteriana. Por sua vez, a curva de crescimento bacteriano na presença do mordente ácido tânico (CO + AT), por si só, é semelhante à da curva na presença ampicilina (controlo positivo), atingindo valores de D.O. próximos de zero, indicando neste caso que o mordente tem atividade antibacteriana. Todos os têxteis coloridos/funcionalizados com a solução de biocoloração têm capacidade de inibir o crescimento bacteriano quando em contacto com a cultura líquida e a fase de latência mantém-se ao longo de todo o ensaio, o que não permite a determinação da taxa específica de crescimento. Em particular, destaca-se o algodão tratado apenas com a solução de biocoloração (CO + SB) - nestas condições, a fase de latência tem uma duração de pelo menos 5,5 h, a D.O. final é próxima de zero e a atividade antibacteriana praticamente 100 %. Os compostos bioativos da solução passados para os têxteis parecem inibir a multiplicação da bactéria, pelo menos durante o tempo do ensaio, um comportamento semelhante ao observado na presença de ampicilina. Figura 25. Curva de crescimento de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com malhas de algodão funcionalizadas com solução de biocoloração (SB) e os respetivos controlos. As amostras utilizadas foram algodão (CO), algodão tratado simultâneamente com alúmen de potássio (CO + AP) ou com ácido tânico (CO + AT). Os têxteis foram colocados numa cultura bacteriana em meio LB com uma D.O.600 inicial de 0,05, sendo a incubação a 37 °C e 200 rpm. A D.O.600 foi medida ao longo de 5,5 horas. Apresentam-se os valores médios de três réplicas efetuadas, para cada ponto, e respetivo desvio padrão. 66 Tabela 7. Parâmetros do crescimento - taxa específica de crescimento (h-1), densidade ótica final, duração da fase de latência (h) e atividade antibacteriana (%) - de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com malhas de algodão (CO), algodão tratado simultaneamente com alúmen de potássio (C + AP) ou com ácido tânico (CO+ AT) não funcionalizadas e funcionalizadas com a solução de biocoloração (SB). “-” indica não determinável. Taxa especifica de crescimento (h-1) Densidade ótica final Fase latência (h) Atividade antibacteriana (%)* Controlo de crescimento 1,17 3,18 2 Ampicilina - 0,09 5,5 100±0 CO 1,07 1,59 2,5 37,95±10,01 CO + AP 1,05 1,20 3 24,45±20,07 CO + AT - 0,04 5,5 99,98±0,01 CO + SB - 0,02 5,5 99,95±0,05 CO + AP + SB - 0,02 5,5 99,86±0,20 CO + AT + SB - 0,02 5,5 99,99±0,003 *Atividade antibacteriana expressa a % de redução de células viáveis observada na presença de ampicilina ou de um dado provete, calculada segundo a equação 5. Desta forma, valores iguais ou inferiores ao observado na presença da malha de algodão não traduzem atividade antibacteriana, mas apenas a interferência do provete no crescimento desta bactéria. No que se refere aos dois processos de mordentagem - simultânea (Figura 25, Tabela 7) ou prévia (Figura 26, Tabela 8) - o perfil de crescimento da bactéria Staphylococcus aureus , a D.O. final e a fase de latência são semelhantes, bem como quando é comparado com aplicação ou não de alúmen de potássio. De ressalvar que a análise do mordente ácido tânico não foi contabilizada, uma vez que o auxiliar por si só tem atividade (Figura 27). Tal como mencionado para a atividade antioxidante, a melhor opção a nível industrial será sempre a que se traduzir num menor tempo e menos gastos energéticos e de recursos humanos. Assim, a utilização da solução de biocoloração apenas (CO + SB) (Figura 25) afigura-se muito promissora, sendo, contudo, necessário ainda fazer uma análise da solidez da atividade à lavagem. 73 Tabela 12. Parâmetros do crescimento - taxa específica de crescimento (h-1), densidade ótica final, duração da fase de latência (h) e atividade antibacteriana (%) - de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com malhas de algodão (CO), algodão pré-tratado com plasma (CO_ptP), algodão pré-tratado com plasma simultaneamente com alúmen de potássio (CO_ptP + AP) e algodão pré-tratado com plasma simultaneamente com ácido tânico (CO_ptP + AT) e funcionalizadas com a solução de biocoloração (SB). “-” indica não determinável. Taxa especifica de crescimento (h-1) Densidade ótica final Fase latência (h) Atividade antibacteriana (%)* Controlo de crescimento 1,19 3,01 2 Ampicilina - 0,08 5,5 100±0 CO 0,84 1,28 2,5 17,30±4,26 CO _ptP 0,74 1,07 2,5 24,50±19,86 CO_ptP + SB - 0,005 5,5 99,96±0,02 CO_ptP + AP + SB - 0,006 5,5 99,13±0,72 CO _ptP + AT + SB - 0,021 5,5 99,99±0,008 *Atividade antibacteriana expressa a % de redução de células viáveis observada na presença de ampicilina ou de um dado provete, calculada segundo a equação 5. Desta forma, valores iguais ou inferiores ao observado na presença da malha de algodão não traduzem atividade antibacteriana, mas apenas a interferência do provete no crescimento desta bactéria. Para o estudo da solidez da funcionalidade antibacteriana dos têxteis a vários ciclos de lavagem com detergente, foram selecionadas duas amostras: algodão tingido/funcionalizado com a solução de biocoloração (CO + SB) e algodão tratado simultaneamente com o mordente alúmen de potássio e a solução de biocoloração (CO + AP + SB), bem como os respetivos controlos. Não foi possível a determinação da curva de crescimento bacteriano na presença destas amostras uma vez que a malha 100 % algodão utilizada nos novos tingimentos apresentava atividade (Figura A4, Apêndice III) quando comparada com a malha anteriormente utilizada (Figura 25, por exemplo). Isto poderá dever-se à heterogeneidade da etapa de acabamento, já efetuado pelo fornecedor do substrato têxtil antes do processo de tingimento, consistindo este na preparação da malha para confeção e onde poderão ter sido usados compostos com propriedades antibacterianas que, mesmo após as lavagens, poderão ficar ainda retidos na malha. Desta forma, a malha utilizada para este novo tingimento foi sujeita a uma lavagem prévia com o detergente padrão, por se tratar de um detergente mais agressivo, permitindo a remoção de compostos que estivessem a provocar a atividade antibacteriana ao algodão sem qualquer tratamento. Mesmo assim, verificou-se que este algodão influencia o crescimento da cultura bacteriana de forma mais acentuada que a malha 74 utilizada no início do presente trabalho, mantendo-se em fase de latência cerca de 8 h, embora recupere e, após 24 h, se encontre na fase exponencial (Figura A5, Apêndice III). Nestas circunstâncias, dado que o tempo do ensaio antibacteriano era inferior a este período de latência, o estudo da funcionalidade antibacteriana passou a realizar-se através da avaliação da sobrevivência de Staphylococcus aureus após 24 h em contacto com os substratos, por meio de contagem de células viáveis (UFC). Após a otimização do protocolo para este novo ensaio, a atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus foi testada após 5 ciclos de lavagem numa máquina doméstica. Nesta fase, de modo diferente do ocorrido para a análise da atividade antioxidante, os têxteis foram submetidos a lavagens de processo com detergente padrão (40 °C durante 1,5 h) uma vez que se verificou alteração do perfil de crescimento bacteriano na presença dos controlos têxteis (Figura A4, Apêndice III), assemelhando-se ao perfil na presença de ampicilina (controlo positivo), bem como a um têxtil funcionalizado com atividade antibacteriana. Posteriormente às lavagens, os têxteis foram biocoloridos/ funcionalizados e de seguida sujeitos a 5 ciclos de lavagem numa máquina doméstica a 30 °C durante 1 h com detergente Soflan (Tabela 13). Tabela 13. Análise da densidade ótica final e da atividade antibacteriana (%) após 24 h de crescimento em meio LB a 37 °C e 200 rpm de Staphylococcus aureus ATCC 6538 quando em contacto com algodão tingido/funcionalizado com a solução de biocoloração (SB), previamente às lavagens e após 5 ciclos. Densidade ótica final Atividade antibacteriana (%)* Ciclos de lavagem Ciclos de lavagem 0 5 O 5 CO 2,67 4,23 55,95±16,35 44,42±10,40 CO + AP 2,63 4,04 45,92±14,71 46,51±1,84 CO + SB 0,005 2,24 99,97±0,001 78,35±1,94 CO + AP + SB 0,27 2,33 89,06±4,11 93,14±4,47 Controlo de crescimento 5,37 Ampicilina 0,096 100 *Atividade antibacteriana expressa a % de redução de células viáveis observada na presença de ampicilina ou de um dado provete, calculada segundo a equação 5. 75 Neste caso, apesar do controlo de algodão (CO) apresentar atividade antibacteriana elevada e próxima dos 45 %, a D.O. final é próxima do controlo de crescimento (Tabela 13). Adicionalmente, a atividade antibacteriana dos controlos têxteis (CO, CO_ptAP) parece manter-se após lavagens. No que se refere ao teste de solidez para os têxteis funcionalizados, verifica-se, após 5 ciclos de lavagem, que houve incremento de crescimento bacteriano na presença de CO + SB, atingindo-se uma D.O. final superior à D.O. final obtida sem lavagens, consequentemente uma redução na atividade antibacteriana de, aproximadamente, 22 %. Este resultado vem comprovar novamente a já reconhecida limitação dos corantes naturais em termos da sua baixa durabilidade às lavagens. No entanto, comparando com o controlo negativo, a densidade ótica final é inferior e a redução da viabilidade bacteriana é maior (78,35 ± 1,94 %), o que revela ainda alguma funcionalidade. Por outro lado, relativamente ao têxtil com a solução de biocoloração e o mordente (CO + AP + SB), após 5 ciclos, e comparando com o controlo negativo (CO + AP), a D.O. final obtida é também inferior semelhante à registada na amostra sem mordentagem (CO + SB). No entanto, a atividade antibacteriana é semelhante à registada pela mesma amostra sem lavagens e superior à da amostra CO + SB, após 5 ciclos (Tabela 13). Este resultado permite inferir acerca do benefício da utilização do mordente alúmen de potássio na ancoragem da solução de biocoloração com própolis e na durabilidade da funcionalidade têxtil após as lavagens. Apesar desta condição de ensaio utilizar um mordente metálico, permite-nos igualmente obter um algodão biocolorido e funcional de material mais sustentável, uma vez que é produzido com baixo impacto ambiental. Suneeta et al . (2020) analisaram as propriedades antibacterianas de substratos têxteis de algodão tingidos com extratos de folhas de nim com o mordente alúmen de potássio e verificaram que os tecidos tratados apresentavam atividade após 5 ciclos de lavagem. Outro estudo realizado por Yusuf et al. (2012) analisou as propriedades antibacterianas de substratos têxteis de lã tingidos com Lawsonia inermis com e/ou sem alúmen de potássio. Os provetes coloridos apenas com o extrato apresentaram atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus ; contudo, após 5 ciclos de lavagem, esta teve uma redução de, aproximadamente, 50 % da bioatividade inicial. No entanto, quando os autores adicionaram alúmen ao tingimento verificaram menor redução na atividade, como constatado no presente estudo. 76 Conforme mostrado na análise da cor, aumentar o número de ciclos de lavagem de 1 para 5 resulta numa diminuição no valor de K/s em CO + SB (Figura 19, Tabela 6), apresentando uma maior diferença de cor comparativamente à amostra não lavada, bem como uma diminuição da atividade antioxidante e da atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus . Porém, a aplicação do mordente alúmen de potássio no banho permite aumentar a ancoragem entre o corante e o algodão, exibindo o provete CO + AP + SB maior solidez nas lavagens e durabilidade das funcionalidades estudadas. 77 4. Conclusões e Perspetivas futuras 78 Este projeto foi desenvolvido com o objetivo de aproveitar e rentabilizar o própolis recolhido na localidade de Gerês, um produto natural que tem vindo a revelar bioatividades de interesse, e consequentemente um potencial de utilização para possíveis aplicações em várias indústrias. No âmbito deste projeto, cujo objetivo principal consistiu na exploração e valorização de novas funcionalidades, foi utilizada uma amostra recolhida em 2019, e testada na biocoloração e funcionalização têxtil. Numa fase inicial do estudo, e após preparação do extrato etanólico de própolis (G19.EE), realizou-se a sua análise utilizando o método de DPPH e difusão em agar, para a avaliação das propriedades antioxidante e antibacteriana, respetivamente. Desta caracterização concluiu-se que amostra em estudo exibe um forte potencial antioxidante, equivalente ao do própolis do Gerês de 2013. Relativamente à avaliação da atividade antibacteriana, os espectros de atividade de G19.EE são relativamente idênticos aos das amostras recolhidas anualmente desde 2011, apresentando valores de CMI idênticos. A análise destes parâmetros permite constatar que o própolis do Gerês tem exibido um espectro de bioatividades relativamente constante ao longo dos anos. G19.EE foi então utilizado para preparar uma solução de biocoloração e analisaram-se as atividades antioxidante e antibacteriana da mesma. Os resultados desta solução mostraram-se promissores para a propriedade antioxidante, bem como para a atividade antibacteriana contra a bactéria Gram-positiva Staphylococcus aureus . Assim, na fase seguinte, procedeu-se à coloração e funcionalização dos substratos têxteis, recorrendo-se à técnica de esgotamento. Com o objetivo de melhorar a ancoragem da solução de biocoloração ao substrato têxtil, este foi submetido a processos de mordentagem (prévia e simultânea) com alúmen de potássio e com ácido tânico, a uma adição de um agente de ligação (glioxal) e a modificações da superfície do têxtil (equipamento de plasma atmosférico e utilização de quitosano). De uma forma geral, a solução de própolis foi capaz de colorir todos os substratos de algodão, tendo-se obtido tonalidades diferentes consoante o mordente e a modificação de superfície utilizados. Além disso, também se verificou que os provetes biocoloridos apresentaram propriedades antioxidante e antibacterianas. A malha de algodão colorida/funcionalizada com a solução de biocoloração (CO + SB), a tratada simultaneamente com alúmen de potássio e colorida/ funcionalizada com a solução de biocoloração (CO + AP + SB), a pré-tratada com alúmen de potássio e colorida/ funcionalizada com a solução de biocoloração (CO_ptAP + SB), a tratada simultaneamente com o glioxal e sulfato 79 de alumínio a 10 g/L e colorida/ funcionalizada com a solução de biocoloração (CO + 1%Gli-1%SA + SB) demonstraram-se as mais interessantes para serem analisadas quanto à solidez da cor e das funcionalidades às lavagens com detergente (Soflan). De uma forma geral, apresentaram, logo após a primeira lavagem, uma diminuição no valor de K/s e, consequentemente, uma perda de cor, continuando a diminuir com o aumento dos ciclos de lavagem. Verificou-se ainda que, com o aumento de número de ciclos, os valores de ΔE foram aumentando. Contudo, a amostra CO + AP +SB revelou ser ainda promissora, por se ter observado a obtenção de cores com tonalidades fortes, como também uma solidez da cor e força colorística elevadas, comparativamente ao têxtil tingido unicamente com a solução de biocoloração (CO + SB). Adicionalmente, esta amostra apresentou resultados muito satisfatórios no que diz respeito à durabilidade das atividades antioxidante e antibacteriana, após as lavagens. Desta forma, o objetivo deste estudo foi atingido, tendo-se alcançado um substrato têxtil tingido e funcionalizado com própolis (CO + AP + SB) onde se obteve uma cor amarela forte e valores de atividades antioxidante e antibacteriana interessantes, e com solidez à lavagem. Futuramente, e tendo em conta os resultados promissores obtidos ao longo desta investigação, seria interessante explorar novas técnicas e novos conceitos, tais como: ➢ Otimizar o processo de tingimento, de modo a contornar o problema da heterogeneidade da cor; ➢ Estudar a solidez das atividades testadas a outros fatores inerentes ao ciclo de vida de um produto têxtil, entre os quais: abrasão, luz solar, suor e secagem na máquina; ➢ Testar as atividades antioxidante e antibacteriana após a realização de mais ciclos de lavagem; ➢ Estudar a atividade antibacteriana dos têxteis biocoloridos contra micróbios patogénicos da área da dermatologia, por exemplo causadores da acne ( Propionibacterium acnes ); ➢ Avaliar a possível atividade dos têxteis biocoloridos contra leveduras e fungos, para além da propriedade antibacteriana; ➢ Utilizar uma maior diversidade de têxteis, com composições diferentes, explorando a possibilidade de uma maior impregnação e afinidade entre a solução de biocoloração e esses substratos têxteis; ➢ Explorar a eficácia destes têxteis funcionais in vivo , por exemplo, em animais com patologias dermatológicas, recorrendo à colocação de patches sobre a pele de voluntários. 80 81 Referências Bibliográficas Abdullah, N. 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Curva de crescimento de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com a malha de algodão usada no rastreio inicial (CO do rastreio) e uma nova malha de algodão utilizada nos últimos ensaios (CO) descritos na Tabela 13. Os têxteis foram colocados numa cultura bacteriana em meio LB com uma D.O.600 inicial de 0,05, sendo a incubação a 37 °C e 200 rpm. A D.O.600 foi medida periodicamente ao longo de 6,5 horas.Figura A4. Reta de calibração com L-cisteína, o composto padrão utilizado na avaliação da atividade antioxidante pelo método de ABTS. Figura A5. Curva de crescimento de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com a malha de algodão usada no rastreio inicial (CO do rastreio) e uma nova malha de algodão utilizada nos últimos ensaios (CO) descritos na Tabela 13. Os têxteis foram colocados numa cultura bacteriana em meio LB com uma D.O.600 inicial de 0,05, sendo a incubação a 37 °C e 200 rpm. A D.O.600 foi medida periodicamente ao longo de 6,5 horas.Figura A6. Reta de calibração com L-cisteína, o composto padrão utilizado na avaliação da atividade antioxidante pelo método de ABTS. 97 Apêndice II O gráfico representado na Figura A2 apresenta o espectro obtido na preparação da solução de trabalho de ABTS, de modo a verificar qual o pico máximo entre 700 nm e 800 nm e a absorvância correspondente. Na Figura A3 a reta representa a absorvância de uma solução de L-cisteína em função da concentração, estudo realizado para selecionar a concentração ideal a utilizar no controlo positivo dos ensaios da atividade antioxidante pelo método de ABTS. Figura A3. Reta de calibração com L-cisteína, o composto padrão utilizado na avaliação da atividade antioxidante pelo método de ABTS. Figura A389. Curva de crescimento de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com a malha de algodão usada no rastreio inicial (CO do rastreio) e uma nova malha de algodão utilizada nos últimos ensaios (CO). Os têxteis foram colocados numa cultura bacteriana em meio LB com uma D.O.600 inicial de 0,05, sendo a incubação a 37 °C e 200 rpm. A D.O.600 foi medida periodicamente ao longo de 6,5 horas.Figura A390. Reta de calibração com L-cisteína, o composto padrão utilizado na avaliação da Figura A2. Scan da solução de trabalho de ABTS realizado no UV-Vis. Figura A131. Reta de calibração com L-cisteína, o composto padrão utilizado na avaliação da atividade antioxidante pelo método de ABTS. Figura A132. Curva de crescimento de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com a malha de algodão usada no rastreio inicial (CO do rastreio) e uma nova malha de algodão utilizada nos últimos ensaios (CO) descritos na Tabela 13. Os têxteis foram colocados numa cultura bacteriana em meio LB com uma D.O.600 inicial de 0,05, sendo a incubação a 37 °C e 200 rpm. A D.O.600 foi medida periodicamente ao longo de 6,5 horas.Figura A133. Reta de calibração com L-cisteína, o composto padrão utilizado na avaliação da atividade antioxidante pelo método de ABTS. Figura A134. Curva de crescimento de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com a malha de algodão usada no rastreio inicial (CO do rastreio) e uma nova malha de algodão utilizada nos últimos ensaios (CO) descritos na Tabela 13. Os têxteis foram colocados numa cultura bacteriana em meio LB com uma D.O.600 inicial de 0,05, sendo a incubação a 37 °C e 200 rpm. A D.O.600 foi medida periodicamente ao longo de 6,5 horas.Figura A135. Reta de calibração com L-cisteína, o composto padrão utilizado na avaliação da atividade antioxidante pelo método de ABTS. Figura A136. Curva de crescimento de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com a malha de algodão usada no rastreio inicial (CO do rastreio) e uma nova malha de algodão utilizada nos últimos ensaios (CO) descritos na Tabela 13. Os têxteis foram colocados numa cultura bacteriana em meio LB com uma D.O.600 inicial de 0,05, sendo a incubação a 37 °C e 200 rpm. A D.O.600 foi medida periodicamente ao longo de 6,5 horas.Figura A137. Reta de calibração com L-cisteína, o composto padrão utilizado na avaliação da atividade antioxidante pelo método de ABTS. 98 Apêndice III O gráfico apresenta os perfis de crescimento de Staphylococcus aureus quando os têxteis de controlo do novo ensaio foram comparados com a malha de algodão do rastreio. Este estudo foi feito com o objetivo de verificar a atividade antimicrobiana do algodão, mostrando simultaneamente a heterogeneidade entre lotes de malha. O gráfico apresenta os perfis de crescimento para Staphylococcus aureus quando os têxteis de controlo (CO da Figura A4) foram submetidos a uma lavagem com água ou com o detergente padrão. Este estudo foi feito com o objetivo de verificar se a lavagem com o detergente permitiria retirar algum composto que estivesse a influenciar a atividade antibacteriana do algodão (CO). Figura A4. Curva de crescimento de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com a malha de algodão usada no rastreio inicial (CO do rastreio) e uma nova malha de algodão utilizada nos últimos ensaios (CO). Os têxteis foram colocados numa cultura bacteriana em meio LB com uma D.O.600 inicial de 0,05, sendo a incubação a 37 °C e 200 rpm. A D.O.600 foi medida periodicamente ao longo de 6,5 horas. Figura A5. Curva de crescimento de Staphylococcus aureus ATCC 6538 em contacto com a nova malha de algodão após lavagem com água e com detergente padrão. Os têxteis foram colocados numa cultura bacteriana em meio LB com uma D.O.600 inicial de 0,05, sendo a incubação a 37 °C e 200 rpm. A D.O.600 foi medida periodicamente ao longo de 6,5 horas. Apresentam-se os valores médios de duas réplicas efetuadas, para cada ponto, e respetivo desvio padrão.