Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas

Universidade do Minho Escola de Ciências Ana Rita Melo Ribeiro dezembro de 2020 Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas Ana Rita Melo Ribeiro Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas UMinho|2020 Universidade do Minho Escola de Ciências Ana Rita Melo Ribeiro dezembro de 2020 Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas Trabalho efetuado sob a orientação da Professora Doutora Sílvia Pereira Lima e da Doutora Helena Felgueiras Dissertação de Mestrado Mestrado em Técnicas de Caracterização e Análise Química ii Direitos de Autor e Condições de Utilização do Trabalho por Terceiros Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Atribuição CC BY https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ iii Agradecimentos A ciência, a investigação e a procura por novos projetos desafiantes é, de certa forma, um desafio em períodos normais, porém, num ano tão atípico como o que acabamos de enfrentar, os obstáculos que foram necessários enfrentar superaram todas as minhas expectativas. Foram muitos percalços pelo caminho, muitas imposições e limitações. Todos passamos por algo inimaginável, no entanto, previsível de ocorrer a qualquer momento, em qualquer altura. 2020, o ano da minha dissertação no Mestrado de Técnicas de Caracterização e Análise Química, não deveria ter sido a altura escolhida, mas sendo um assunto fora do nosso controlo, coube-nos a hercúlea tarefa de fazer com que resultasse. Não poderia estar mais orgulhosa por tudo o que alcancei a nível pessoal, académico e profissional, desde o exponencial crescimento do meu currículo científico, ao culminar da entrega desta dissertação. Este projeto envolve por si só muito amor à ciência, mas também muito amor próprio e muito amor social que nos foi retirado nestes últimos tempos. Tudo isto não seria possível sem o constante apoio incondicional da minha família, especialmente dos meus pais e irmão, que nunca me deixaram desistir face a todas as adversidades que foram aparecendo. A eles devo tudo. Ao Tiago, por toda a paciência, amor e dedicação. Às minhas amigas por todo o incentivo e por serem sempre um porto seguro. Por me devolverem o amor à química e à investigação, fico eternamente grata à Professora Doutora Sílvia Pereira Lima e Professora Doutora Susana Costa por sempre me mostrarem para lá daquilo que era visível aos olhos e por serem sempre uma luz ao fundo de um túnel. À Doutora Helena e à Martinha, por me darem a conhecer o mundo de possibilidades que a têxtil representa, por toda a inovação e conhecimento científico sem o qual este trabalho nunca poderia ter avançado. Gostava ainda de agradecer ao Centro de Ciência e Tecnologia Têxtil (2C2T) por permitir a realização deste projeto nos seus laboratórios e ainda à Fundação da Ciência e Tecnologia (FCT) pelo financiamento do projeto onde este trabalho foi inserido, projeto PEPTEX PTDC/CTMTEX/28074/2017 (POCI-01-0145-FEDER-028074). Agradeço ao Departamento de Química da Universidade do Minho pela oportunidade de desenvolver grande parte do meu projeto de investigação e essencialmente por me ter colocado no Lab.40, junto à Maria José, à Carolina e à Cátia, que tantas vezes nos rimos com os fracassos obtidos, mas nos rimos ainda mais por todos os sucessos alcançados e conhecimentos adquiridos. iv Declaração de Integridade Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho v Resumo Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas Uma ferida cutânea se não for devidamente tratada pode incorrer numa ferida crónica suscetível a infeções generalizadas, as quais podem resultar na morte do paciente. Atualmente, a engenharia de tecidos é descrita como um campo interdisciplinar que combina princípios de engenharia, química e biologia para gerar soluções que permitam reparar, restaurar e/ou melhorar as funções de tecidos lesados. No mesmo sentido, a área têxtil aborda soluções com base em fibras poliméricas, produzidas a partir de uma vasta gama de polímeros, que permitem gerar estruturas com uma grande área superficial, porosidade e resistência mecânica passivas de serem utilizadas como pensos bioativos que promovam uma atividade cicatrizadora e antimicrobiana eficiente. Os péptidos com atividade antimicrobiana (AMPs) têm despertado muita atenção pela possibilidade de serem uma alternativa promissora aos antibióticos, na busca de agentes mais eficazes contra as bactérias, evitando que estas desenvolvam resistência e por ser possível a sua síntese e manipulação para serem aplicados como o elemento biomédico nos pensos bioativos. Este projeto resulta da colaboração entre o Departamento de Química e o Centro de Ciência e Tecnologia Têxtil (2C2T), e visa a síntese dos AMPs Peptaibolin e Tiger 17, através de metodologias de síntese em fase sólida assistida por micro-ondas, a sua caracterização química, estrutural e antimicrobiana, e posterior imobilização em estruturas nanofibrosas poliméricas produzidas por eletrospinning. Para atingir este objetivo, técnicas como a Ressonância magnética nuclear de protão (1HRMN) e a Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foram aplicadas na caraterização do péptido, assim como testes antimicrobianos de concentração mínima inibitória ou cinética de evolução microbiana. A técnica de eletrospinning foi utilizada para o processamento de nanofibras a partir do polímero natural, acetato de celulose (CA), e do sintético, policaprolactona (PCL). As matrizes poliméricas geradas foram caracterizadas recorrendo a técnicas como MO, SEM, ATR-FTIR, TGA, DSC, ensaios de hidratação e determinação indireta de porosidade, e medições de ângulos de contacto e, consequente, determinação da energia de superfície. Sendo possível concretizar todos os objetivos propostos para este trabalho, e fruto de uma extensa otimização de processos e investigação futura, esta inovação poderá resultar numa terapia única com vista a proteger as feridas contra infeções, e simultaneamente acelerar a cicatrização e regeneração dos tecidos. Palavras-chave: Biomateriais; Péptidos antimicrobianos; Resistência bacteriana; Síntese peptídica em fase sólida assistida por microondas. vi Abstract Synthesis and application of antimicrobial peptides in cutaneous wound dressings A skin wound if not properly treated can result in a chronic wound susceptible to widespread infections, which can result in the patient's death. Currently, tissue engineering is described as an interdisciplinary field that combines principles of engineering, chemistry and biology to generate solutions that allow to repair, restore and/or improve the functions of injured tissues. In the same sense, the textile area addresses solutions based on polymeric fibers, produced from a wide range of polymers, which allow the generation of structures with a large surface area, porosity and mechanical resistance that can be used as bioactive dressings that promote a healing and efficient antimicrobial activity. Antimicrobial peptides (AMPs) have attracted a lot of attention due to the possibility of being an alternative to antibiotics in the search for more effective agents against bacteria, preventing them from developing resistance. They can be applied as the biomedical element in bioactive dressings because their synthesis and manipulation are possible. This project results from the collaboration between the Department of Chemistry and the Center for Science and Textile Technology (2C2T), and aims at the synthesis of AMPs Peptaibolin and Tiger 17, through solid phase synthesis methodologies assisted by microwave, their chemical, structural and antimicrobial characterization, and subsequent immobilization on polymeric nanofiber structures produced by electrospinning. To achieve this objective, techniques such as Proton Nuclear Magnetic Resonance (1H RMN) and High Performance Liquid Chromatography (HPLC) were applied to the peptide characterization, as well as antimicrobial tests with minimal inhibitory concentration or kinetics of microbial evolution. The electrospinning technique was used to process nanofibers from the natural polymer, cellulose acetate (CA), and the synthetic, polycaprolactone (PCL). The polymeric matrices generated were characterized using techniques such as MO, SEM, ATR-FTIR, TGA, DSC, hydration tests and indirect porosity determination, measurements of contact angles and, consequently, determination of surface energy. As it is possible to achieve all the objectives proposed for this work, and as a result of extensive optimization process and future research, this innovation may result in a unique therapy with a view to protecting wounds against infections, while simultaneously accelerating healing and tissue regeneration. Keywords: Antimicrobial peptides; Bacteria resistance; Biomaterials; Microwave assisted solidphase peptide synthesis. vii Índice AGRADECIMENTOS ......................................................................................................................... III RESUMO .......................................................................................................................................... V ABSTRACT ...................................................................................................................................... VI ÍNDICE ........................................................................................................................................... VII ÍNDICE DE FIGURAS ......................................................................................................................... X ÍNDICE DE ESQUEMAS .................................................................................................................. XIII ÍNDICE DE TABELAS ...................................................................................................................... XIV ABREVIATURAS .............................................................................................................................. XV I. INTRODUÇÃO ................................................................................................................................ 1 1. RESISTÊNCIA AOS ANTIBIÓTICOS: O MERCADO E A INDÚSTRIA FARMACÊUTICA ........................ 2 2. PÉPTIDOS TERAPÊUTICOS ........................................................................................................... 4 2.1 PÉPTIDOS COM ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ......................................................................................................... 8 2.1.1 Mecanismo de ação dos AMPs .......................................................................................................... 10 2.1.2 Aplicações dos AMPs ........................................................................................................................ 15 3. SÍNTESE PEPTÍDICA .................................................................................................................. 17 3.1 REAGENTES DE ACOPLAMENTO ......................................................................................................................... 17 3.2 SÍNTESE PEPTÍDICA EM FASE SÓLIDA ................................................................................................................. 21 3.2.1 Suportes sólidos ................................................................................................................................ 25 3.2.2 Grupos protetores ............................................................................................................................. 27 3.3 SÍNTESE PEPTÍDICA EM FASE SÓLIDA ASSISTIDA POR MICRO-ONDAS .......................................................................... 30 4. BIOMATERIAIS PARA A CICATRIZAÇÃO E REGENERAÇÃO DA PELE EM FERIDAS CUTÂNEAS ..... 31 4.1 TIPOS DE BIOMATERIAIS .................................................................................................................................. 34 4.2 PRODUÇÃO DE NANOFIBRAS PELA TÉCNICA DE ELETROSPINNING ............................................................................ 38 4.3 ESTRATÉGIAS PARA INCORPORAÇÃO DE PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS ....................................................................... 41 4.4 TÉCNICAS DE CARACTERIZAÇÃO DE PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS ............................................................................ 43 4.4.1 Espetroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Protão (1H RMN) ............................................... 43 4.4.2 Cromatografia de Alta Eficiência (HPLC) ............................................................................................ 44 4.5 ANÁLISE E CARACTERIZAÇÃO DE NANOFIBRAS ..................................................................................................... 44 4.5.1 Microscopia Ótica de Campo Claro .................................................................................................... 45 4.5.2 Microscopia Eletrónica de Varrimento (SEM) ...................................................................................... 45 4.5.3 Termogravimetria (TGA) e Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC) ............................................. 46 xiv Índice de Tabelas Tabela 1Vantagens e desvantagens dos péptidos em relação a biomoléculas sintéticas mais pequenas. ................................................................................................................................. 6 Tabela 2 - Parâmetros que afetam a produção de nanofibras pela técnica de eletrospinning.92 39 Tabela 3 - Propriedades dos solventes utilizados na realização deste projeto para preparação das soluções poliméricas.90 ............................................................................................................ 41 Tabela 4 - Diferentes métodos de imobilização de péptidos em nanofibras produzidas por eletrospinning. ........................................................................................................................ 42 Tabela 5 - Fatores que afetam as curvas obtidas pela técnica de TGA e DSC. ......................... 48 Tabela 6 – Comparação entre as duas sínteses do Peptaibolin, tendo em conta a combinação de reagentes de acoplamento. ..................................................................................................... 55 Tabela 7 - Solventes testados e o seu efeito em contacto com o Peptaibolin num volume total de 1 mL. ..................................................................................................................................... 58 Tabela 8 - Condições aplicadas e resultados obtidos na 1ª síntese de Tiger 17 usando TFA:H2O (95:5) na clivagem do péptido da resina. ................................................................................. 61 Tabela 9 - Condições aplicadas e resultados obtidos na 2ª síntese de Tiger 17 usando TFA:TIPS:H2O (95:2,5:2,5) na clivagem do péptido da resina. .................................................. 62 Tabela 10 – Grau de swelling (%) dos filmes poliméricos de PCL e PCL/CA em contacto com 1 mL de SBF num período de 7 dias. ......................................................................................... 74 Tabela 11 – Porosidade (%) dos filmes poliméricos de PCL e PCL/CA em contacto com 1 mL de etanol por um período de 7 dias. ............................................................................................. 74 Tabela 12 – Componente Polar e Dispersiva da energia superficial para os solventes testados onde 𝛾 L é o valor da tensão superficial total do solvente e 𝛾 Ld e 𝛾 Lp são os valores da componente dispersiva e polar da energia superficial do solvente, respetivamente.114 ................................... 76 Tabela 13 - Condições testadas no equipamento eletrospinning para otimização da produção de fibras. ..................................................................................................................................... 93 xv Abreviaturas 1H RMN Ressonância magnética nuclear de protão ACN Acetonitrilo Aib Ácido aminoisobutírico AMPs Péptidos com atividade antimicrobiana (do inglês A ntimicrobial Peptides ) Arg Arginina Asp Aspartato ATR-FTIR Espetroscopia no infravermelho por transformada de Fourier acoplada a um equipamento de reflexão total atenuada (do inglês: Fourier Transform Infrared Spectroscopy – Attenuated Total Reflectance ) Boc terc -butiloxicarbonilo CA Acetato de celulose DCC N,N' -diciclo-hexilcarbodiimida DCM Diclorometano DIC N , N ’-Diisopropilcarbodiimida DIPEA Diisopropiletilamina DMF N , N ’-Dimetilformamida DMSO Dimetilsulfóxido DNA Ácido desoxirribonucleico DSC Calorimetria diferencial de varredura (do inglês: Differential Scanning Calorimetry ) Eq. Equivalentes EtOH Etanol EUA Estados Unidos da América FDA Administração de alimentos e fármacos (do inglês: Food and Drug Administration ) Fmoc Grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo Glu Glutamina Gly Glicina HBTU 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametilurónio hexafluorofosfato His Histidina HOAt 1-hidroxi-7-azabenzotriazole HOBt N -Hidroxibenzotriazole HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência (do inglês: High Performance/Pressure Liquide Cromatography ) xvi Iva Isovalina J Constante de acoplamento Leu Leucina MeOH Metanol MIC Concentração mínima inibitória (do inglês: Minimum Inibitory Concentration ) MO Microscópio ótico MW-SPPS Síntese peptídica em fase sólida assistida por micro-ondas (do inglês: Microwave Assisted Solid Phase Peptide Synthesis ) Oxima 2-ciano-2(hidroxiimino)acetato de etilo Oxima Etil-2-ciano-2-(hidroxiimino)acetato Pbf 2,2,4,6,7-pentametill-2,3-dihidrobenzofurano-5-sulfonil PBS Tampão fosfato-salino (do inglês: Phosphate buffered saline ) PCL Policaprolactona PEG Polietilenoglicol Phe Fenilalanina Phol Fenilalaninol PLA Poliácido lático PLGA Poli(ácido lático-co-ácido glicólico) ppm Partes por milhão R&D Investigação e Desenvolvimento (do inglês: Research and Development ) RMN Ressonância magnética nuclear RNA Ácido ribonucleico SBF Fluido Corporal Simulado (do inglês: Simulated Body Fluid ) SEM Microscopia Eletrónica de Varrimento (do inglês: Scanning Eletron Microscopy ) SPPS Síntese Peptídica em Fase Sólida (do inglês: Solid Phase Peptide Synthesis ) TFA Ácido trifluoroacético TGA Termogravimetria THC Clorohidrato de Tetraciclina THF Tetrahidrofurano TLC Cromatografia em Camada Fina (do inglês: Thin-Layer Chromatography ) Trt Tritilo UFC Unidade de formação de colónias xvii “A cura fundamental para a pobreza não é dinheiro, mas conhecimento” Sir Arthur Lewis , Prémio Nobel em Ciências Económicas, 1979 I. INTRODUÇÃO I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 2 1. Resistência aos Antibióticos: O Mercado e a Indústria Farmacêutica Em pleno século XXI, o desenvolvimento de fármacos é considerado uma ciência estabelecida por parte das indústrias farmacêuticas que requer uma compreensão e interligação de várias disciplinas, implicando uma parceria entre especialistas em diversos assuntos, desde a química à economia. O crescimento da indústria e do mercado farmacêutico permitiu a descoberta de novos fármacos, resultando numa maior esperança média de vida, assim como, melhor qualidade de vida tendo consequentemente, nas últimas décadas, representado enormes ganhos em saúde para a humanidade. Com o decorrer dos anos, tornou-se cada vez mais evidente que as indústrias farmacêuticas gastam recursos significativos para a descoberta e desenvolvimento de novos fármacos, resultando muitas vezes em aumentos substanciais dos custos dos cuidados de saúde.1 Estimase que no ano de 2019, 20,7% das despesas industriais em pesquisa e desenvolvimento (R&D) de todo o mundo, foi apenas na indústria farmacêutica. Em Portugal, só no último ano, as indústrias farmacêuticas gastaram uma média de 100 milhões de euros nesses mesmos processos para novos lançamentos e otimização de fármacos já existentes no mercado.2,3 O processo de R&D sofreu diversas alterações ao longo dos anos, sendo agora a etapa mais rigorosa e restrita de todo o processo de desenvolvimento de um fármaco e o seu alcance do mercado. Este processo incorpora desde a descoberta do composto ativo mais apropriado para um dado propósito, até à compreensão de todas as vias metabólicas relacionadas com uma patologia específica e a necessidade de as modificar para assegurar a segurança e eficácia do fármaco. Numa etapa posterior são realizados milhares de testes para provar a segurança, eficácia, capacidade de fabrico, qualidade da forma de dosagem, entre outros, seguida de uma outra fase de ensaios clínicos onde o fármaco é efetivamente administrado a humanos.4 Porém, o desenvolvimento de um fármaco e o seu lançamento no mercado não é um processo fácil ou rápido, sendo que se estima que entre 10000 a 50000 compostos ativos que são estudados, apenas 1 desenvolve potencialidades para ser admitido como fármaco devido à falta de eficácia, elevada toxicidade e baixa segurança.5,6 Após essa descoberta, em média, o tempo de alcance do mercado desde a primeira síntese do composto ativo escolhido é de 12 anos, tornando lógica a I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 3 necessidade do elevado investimento de tempo e dinheiro por parte das indústrias farmacêuticas. Atualmente, para que um dado fármaco chegue ao mercado é necessário seguir um conjunto de regras restritas impostas pelo governo e autoridades de saúde as quais, na maioria das vezes, representam um grande obstáculo a que novos fármacos cheguem ao seu destino final, exigindo um investimento cada vez maior por parte das indústrias.7,8,9 De forma a combater este problema e tentar tornar todo o processo de R&D e lançamento no mercado de um novo fármaco o mais breve possível, as indústrias farmacêuticas procuraram novas soluções, tendo sido uma delas o processo de transformação de uma biomolécula ativa num fármaco. Esta solução demonstrou-se igualmente favorável no combate a um dos maiores problemas de saúde global do século XXI: a resistência aos antibióticos. No início do século, apenas uma pequena percentagem do desenvolvimento e investigação das grandes indústrias farmacêuticas foi em antibióticos e tal acontece por duas razões maioritárias: primeiro, o desenvolvimento de antibióticos não representa lucros para a indústria farmacêutica, visto ser um fármaco usado apenas para o tratamento de patologias temporárias, não sendo necessário um consumo constante como acontece com fármacos prescritos para diversas doenças crónicas, como por exemplo, a insuficiência cardíaca; a segunda maior razão depreende-se pelos inúmeros obstáculos colocados às farmacêuticas por parte das entidades reguladoras que exigem toda uma burocracia extenuante desde as fases clínicas até ao controlo de efeitos secundários, resultando num maior investimento que acaba por não alcançar um lucro rentável.10,11 Dessa forma, os vários anos em que não existiu desenvolvimento de novos compostos com atividade antibacteriana aliada ao consumo excessivo dos antibióticos para travar patologias e sintomas que muitas vezes não estão ligados a infeções bacterianas, fez com que os organismos patogénicos desenvolvessem resistência aos antibióticos mais convencionais, deixando estes de ter o efeito desejado no tratamento de doenças. Como tal, a introdução de péptidos com potencialidades terapêuticas nos processos de R&D de grandes farmacêuticas tornou-se uma opção para lidar com estes dois grandes problemas ao mesmo tempo e, que até agora, tem mostrado resultados verdadeiramente positivos. I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 4 2. Péptidos Terapêuticos Os péptidos são biomoléculas envolvidas numa diversidade de processos bioquímicos e funções fisiológicas. De acordo com a Food and Drug Administration (FDA), um péptido pode conter até 40 aminoácidos, possuindo um peso molecular baixo em comparação com compostos sintéticos e proteínas, e podem deter estruturas secundárias e terciárias.12 Os péptidos são na sua maioria seletivos para um determinado alvo, atuam a baixas concentrações, possuem um elevado grau de eficácia, especificidade, atividade, e baixa toxicidade, evitando efeitos secundários indesejáveis ao serem biologicamente aceites pelo metabolismo humano através da sua capacidade de mimetização de diversas vias metabólicas, tornando-se assim um dos melhores candidatos para o desenvolvimento de fármacos.13,14 Devido a estas propriedades, o uso de péptidos como fármacos tem ganho imensa atenção por parte da indústria farmacêutica, resultado este dos desenvolvimentos nas áreas da biotecnologia e bioengenharia. Foi no século XX que os péptidos começaram a ser utilizados como fármacos, sendo que inicialmente eram extraídos de fontes naturais, como microorganismos e plantas transgénicas.15 Desde o aparecimento e evolução dos processos de síntese peptídica que a utilização de péptidos como soluções terapêuticas evoluiu ao longo do tempo, representando neste momento uma boa parte do mercado farmacêutico. Até agora, cerca de 60 fármacos de natureza peptídica foram aprovados pela FDA e chegaram ao mercado para serem comercializados como tratamento para as mais diversas patologias, como a diabetes, osteoporose, diversos tipos de cancro, doenças cardiovasculares (Figura 1) e em tratamentos antimicrobianos (Figura 2) e antifúngicos. Além disso, 155 tipos de péptidos estão atualmente em desenvolvimento e em fases clínicas e préclínicas avançadas, exemplificando a demanda urgente de péptidos.16,17 I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 5 Figura 1 - Estrutura química do lipopéptido com propriedades antibióticas, comercializado com o nome Cubicin®. Este fármaco atua ao nível das bactérias Gram-positivas, como Staphylococcus aureus, no tratamento de infeções cutâneas. Figura 2 - Estrutura química do péptido Bivalirudin, comercializado com o nome Angiomax®. Este fármaco atua como inibidor da trombina, ligando-se diretamente ao seu local ativo, reduzindo o risco de complicações a nível isquémico e de morte por enfarte do miocárdio. Numa primeira fase existiam imensas limitações à utilização de péptidos como possíveis fármacos terapêuticos porque, comparativamente aos fármacos sintéticos, apresentavam baixa biodisponibilidade quando administrados oralmente, um reduzido tempo de vida, uma rápida metabolização e excreção, menor seletividade perante diversos alvos, pouca estabilidade, e baixa capacidade para ultrapassar diversas barreiras fisiológicas.6,16,18 Apesar dos fármacos sintéticos com um tamanho mais reduzido serem geralmente administrados por via oral devido a possuírem uma boa estabilidade metabólica e a serem de fácil produção e baixo custo, estes fármacos continuam a apresentar demasiados obstáculos que não I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 6 podem ser ultrapassados e que resultam na maior parte das vezes em efeitos secundários indesejáveis. Contrariamente, a forte ligação e especificidade dos péptidos e proteínas aos seus alvos moleculares pode reduzir a quantidade necessária a ser administrada para um mesmo efeito. Esta elevada seletividade leva a menores efeitos secundários, o que é considerado como um dos maiores benefícios dos péptidos relativamente a biomoléculas mais pequenas (Tabela 1).14 Apesar das vantagens ultrapassarem as desvantagens, os péptidos continuam a ter limitações, o que faz com que ainda hoje existam restrições na sua utilização. Uma das maiores limitações continua a ser a sua baixa biodisponibilidade devido à degradação enzimática, característica do metabolismo humano. Um fator importante é também o seu tamanho, uma vez que permite que os péptidos possam ser facilmente excretados por diversas vias, mas ao mesmo tempo, isso pode ser um benefício pois permite uma maior facilidade de ultrapassar as membranas celulares. A necessidade urgente de alternativas fez com que a investigação se aprofundasse no campo de novas vias de administração (por exemplo, cutânea e subcutânea), no prolongamento do tempo de vida dos fármacos baseados em péptidos e modificações químicas e/ou estruturais de forma a obter a melhor versão possível.19, 20 Tabela 1Vantagens e desvantagens dos péptidos em relação a biomoléculas sintéticas mais pequenas. Vantagens Desvantagens Elevada atividade, especificidade e seletividade Baixa estabilidade metabólica Poucos efeitos secundários Risco de efeitos secundários imunogénicos Não possui/menor degradação tóxica de produtos resultantes Menor tempo de vida Não existência de interação fármacofármaco Elevado custo de síntese Possibilidade de efetuar interações proteína-proteína Baixa biodisponibilidade oral Variados locais de interação Baixa permeabilidade membranar Variedade química e biológica Eliminação corporal rápida se o peso for <5.000 Da Maior predictabilidade in-vivo Baixa solubilidade em água I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 13 Apesar da maioria dos AMPs conhecidos até ao momento seguirem um dos mecanismos de ação expostos acima, vários péptidos continuam a ser investigados por apresentarem mecanismos diferentes. Na sua generalidade, este tipo de péptidos leva à morte celular através de processos intracelulares, não atuando diretamente nas membranas. Por exemplo, o mecanismo de ação do péptido PP-39 atua ao nível da inibição da síntese de proteínas induzindo também a degradação das proteínas necessárias para a replicação do ADN, interrompendo dessa forma o normal funcionamento das células.38 Entre a diversidade de estruturas e mecanismos de ação que os AMPs podem apresentar, este projeto focou-se inicialmente numa família de péptidos naturais denominada peptaibols. Os peptaibols foram isolados, numa primeira fase, da estirpe de fungos Trichoderma e possuem propriedades antibacterianas e antifúngicas. A principal característica deste tipo de AMP é a presença de aminoácidos não-proteínogénicos, ou seja, que não são codificados pelo ADN (exemplo, o ácido α-aminobutírico (Aib) e a isovalina (Iva)) (Figura 8). Esta classe de aminoácidos é frequentemente usada em péptidos com interesse farmacológico uma vez que não são reconhecidos por enzimas hidrolíticas, melhorando a sua biodegradabilidade e aumentando a sua biodisponibilidade. O terminal amino é geralmente acetilado e o terminal carboxilo é um β-amino álcool que pode variar entre um fenilalaninol, leucinol, valinol e isoleucinol. Esta família de péptidos ganhou especial interesse em estudos para compreender a conformação α-hélice e de que forma esta interagia com as membranas.39 Foi demonstrada que a ação antimicrobiana dos peptaibols ocorre pela dispersão do material citoplasmático dentro do microrganismo, resultando na morte celular. Os mecanismos de ação diferem dentro da própria família de peptaibols, onde geralmente os que possuem uma maior cadeia de aminoácidos atuam ao nível da formação de canais iónicos na membrana celular, enquanto que os peptaibols com menor peso molecular, tendem a penetrar a membrana através da flutuação na bicamada lipídica.40,41 I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 14 Figura 8 - a) Estrutura do ácido aminobutírico (Aib). b) As duas conformações possíveis do aminoácido isovalina (Iva). No presente projeto, especial atenção foi prestada ao Peptaibolin, o péptido mais pequeno da família dos peptaibols que possui uma estrutura tridimensional equiparável aos peptaibols maiores (Figura 9): um grupo acetilo N -terminal e um resíduo de fenilalaninol (Phol) C -terminal juntamente com apenas 4 aminoácidos (Ac-Leu-Aib-Leu-Aib-Phol). Figura 9 - Sequência de aminoácidos presentes no Peptaibolin (Ac-Leu-Aib-Leu-Aib-Phol). Crima et al . estudaram o Peptaibolin e chegaram à conclusão que este pequeno péptido possuía atividade antimicrobiana, ainda que moderada, em bactérias Gram-positivas. O seu modo de ação baseia-se na permeabilização da membrana celular provocando a sua rutura. Através de estudos conformacionais por cristalografia de raio-X foi comprovado que o Peptaibolin possui uma estrutura secundária tipo α-hélice extremamente dobrada (Figura 10) e a sua atividade antimicrobiana lhe está diretamente relacionada com este facto, visto que essa conformação permite a agregação, característica pouco usual em péptidos com poucos resíduos de aminoácidos.40 H2N OH O a) Aib H2N OH O H2N OH O b) (S)-Iva e (R)-Iva H N O N H O H N O N H O H N O OH I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 15 Figura 10 - a) Estrutura tridimensional do peptaibol Alameticina que possui 19 aminoácidos em comparação com a b) estrutura tridimensional do peptaibol Peptaibolin com apenas 4 aminoácidos.39 A síntese do Peptaibolin e de todos os peptaibols no geral é significativamente prejudicada pelo impedimento estereoquímico em resíduos como o Aib, onde a reatividade durante a reação de acoplamento é diminuída em comparação com resíduos de outros aminoácidos. Para superar essa dificuldade é necessário utilizar uma seleção de reagentes de acoplamento adequados que permitam a melhor ativação possível do terminal carboxilo do aminoácido Aib.42 Em contexto laboratorial, Peptaibolin foi sintetizado através de Síntese Peptídica em Fase Sólida assistida por Microondas (MW-SPPS) com o intuito de avaliar a sua atividade antimicrobiana contra um leque de bactérias tanto Gram-positivas como Gram-negativas: Staphylococcus aureus , Staphylococcus epidermidis , Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. 2.1.2 Aplicações dos AMPs Alguns AMPs, tal como os da família peptaibols, têm um papel determinante enquanto alternativas aos antibióticos. Esses péptidos além de utilizarem vários dos mecanismos de ação contra bactérias acima referidos são parte integrante do sistema imunológico inato, deste modo não sendo reconhecidos como organismos estranhos pelo corpo humano. Recentemente, uma nova vertente de péptidos com atividade antimicrobiana tem vindo a ser investigada pelo seu importante potencial de promover a cicatrização cutânea ao mesmo tempo b) a) I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 16 que atua como barreira à invasão de microrganismos. Tang et al . sintetizaram pela primeira vez um péptido chamado Tiger 17, baseado em tigerininas. As tigerininas são AMPs identificados em secreções cutâneas de Fejervarya cancrívora , um anfíbio da família Ranidae encontrado no Sudeste Asiático. Essa classe de AMPs foi descoberta em 2001 por Sai et al . quando foram purificados e caracterizados três péptidos entre 11-12 resíduos de aminoácidos (Figura 11), encontrados em secreções cutâneas da espécie R. tigerina . Esses péptidos possuem dois resíduos de cisteína ligados entre si formando uma ponte ditiol, ciclizando numa sequência de 9 aminoácidos, conhecida por anel nonapeptidíco e adotam uma conformação em folha β,&tendo um terminal -COOH.43,44 Figura 11 - Sequência de aminoácidos dos AMPs Tigerinina 1 e 3. Tendo como ponto de partida os AMPs da família das Tigerininas, o péptido Tiger 17 possui 11 aminoácidos e um peso molecular de 1377 Da. De acordo com Tang et al . este AMP demonstrou uma grande capacidade de cicatrização de feridas profundas demonstrado in vivo em estudos com ratos. O Tiger 17 exerceu efeitos significativos nas três etapas mais fulcrais do processo de cicatrização de feridas. Estas etapas incluem (1) a indução do recrutamento de macrófagos para o local do ferimento aquando da reação inflamatória; (2) a promoção da migração e proliferação de queratinócitos e fibroblastos, levando à reepitelização e formação de novo tecido; e (3) fase de remodelação do tecido, devolvendo a sua estrutura e funcionalidade. Com os resultados obtidos, os investigadores concluíram que o péptido Tiger 17 é capaz de promover com sucesso a proliferação e migração de células até ao local da ferida cutânea, assegurando a reepitelização do local afetado e acelerando o processo de cicatrização.45 Até à data, nenhuma investigação foi publicada avaliando o potencial antimicrobiana deste péptido, permanecendo assim uma incógnita. Phe-Cys-Thr-Met-Ile-Pro-Ile-Pro-Arg-Cys-Tyr-NH2 Tigerinina 1 Arg-Val-Cys-Tyr-Ala-Ile-Pro-Leu-Pro-Ile-Cys-Tyr-NH2 Tigerinina 3 I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 17 3. Síntese Peptídica A versatilidade e elevada afinidade para os seus alvos terapêuticos conduziram a estudos aprofundados dos péptidos ao longo dos anos, por forma a compreender os seus mecanismos e princípios biológicos e consequentemente aperfeiçoaras suas propriedades terapêuticas para posterior aplicação médica e farmacêutica.46 Um péptido é uma combinação de diferentes aminoácidos ligados através de uma ligação peptídica. Para formar essa ligação é necessário que uma reação de condensação entre um terminal carboxílico de um aminoácido e o terminal amina funcional de outro α-aminoácido ocorra, acompanhada por perda de água. A formação desta ligação engloba dois passos, sendo que o primeiro é a ativação do grupo carboxílico de um dos aminoácidos recorrendo a reagentes de acoplamento, e o segundo passo corresponde ao ataque nucleofílico do terminal amina de um outro aminoácido (Figura 12). Embora a ligação peptídica seja o esqueleto fundamental na produção de péptidos, a presença destas ligações não é restrita a um contexto biológico visto que também é possível encontrá-las em diversas moléculas, como por exemplo, fármacos sintéticos.47,48 Figura 12 - Formação da ligação peptídica entre dois aminoácidos. 3.1 Reagentes de acoplamento De forma a obtermos uma ligação peptídica no processo de síntese de péptidos, o terminal carboxilo de um resíduo de aminoácido tem de ser funcionalizado de forma a tornar-se numa espécie eletrofílica, para assim permitir o ataque nucleofílico do terminal amina de um outro resíduo de aminoácido. Reagentes de acoplamento baseados em carbodiiamidas, como o N,N' -diciclohexilcarbodiimida (DCC) e o N,N '-diisopropilcarbodiimida (DIC) (Figura 13) são considerados R1 O O R NH2+HO O NHR2 R Reagente acoplamento R1O O NH R NHR2 R O I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 18 ativadores fortes capazes de fornecer a energia necessária para a ativação do grupo carboxílico, pelo que têm vindo a ser utilizadas na maior parte das sínteses peptídicas das últimas décadas. 47,49 Figura 13 - Exemplos de carbodiiamidas que podem ser utilizadas como reagentes de acoplamento. Porém, este tipo de reagente de acoplamento pode promover a racemização do aminoácido (conversão da espécie oticamente ativa em inativa) durante o passo de ativação, podendo causar a perda de quiralidade do resíduo carboxílico e resultar em fracos rendimentos de reação. Para superar esse obstáculo é adicionado um supressor de racemização ou nucleófilo auxiliar, sendo que um dos mais utilizados é o 1—hydroxibenzotriazole (HOBt) (Figura 14). Na presença de uma carbodiimida, um aminoácido N -protegido forma uma O -acilisoureia, em que o HOBt aprisiona a O -acilisoureia e ataca o grupo carbonilo, libertando a ureia e formando um éster ativo, tornando assim o átomo de carbono do terminal carboxilo mais suscetível ao ataque nucleofílico que parte do terminal amina e impedindo a racemização (Esquema 1).50,51 NCN DCC NCN DIC I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 19 Esquema 1 - Processo de ação das carbodiiamidas como agentes de acoplamento, na presença de HOBt. Estes nucleófilos ajudam a assegurar a integridade ótica do aminoácido evitando a racemização do carbono α.&A racemização pode ocorrer no terminal C do aminoácido durante a reação de acoplamento devido à remoção do hidrogénio no carbono α&e/ou à formação de um intermediário de oxazolona (Esquema 2). A taxa de racemização depende do efeito dos aceitadores de eletrões da cadeia de aminoácido, da temperatura, do solvente e da base ativadora.52, 51 R1COOH +R’ NCNR’ R’ NC H N OCO R1 R’ R’ H NC O H NR’ +R1COBt O R1CNH O R2NH2 Oacilisoureia Carbodiimida Aminoácido HOBt HOBt R2 I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 20 Esquema 2 - Mecanismo de racemização no carbono α. São possíveis duas vias: A) Enolização direta e B) Formação de oxazolona. Atualmente, existe uma grande variedade de reagentes de acoplamento disponíveis comercialmente desde as carbodiiamidas mais tradicionais referidas acima (DCC, DIC), com os nucleófilos auxiliares como HOBt e 1-hidroxi-7-azabenzotriazole (HOAt) ou reagentes baseados em sais de urónio e fosfónio como o 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametilurónio hexafluorofosfato (HBTU).50 Em 2009, foi introduzido no mercado a Oxima (etil-2-ciano-2-(hidroxiimino)acetato) (Figura 14), um novo nucleófilo auxiliar para o reagente de acoplamento DIC que possui uma elevada capacidade de supressão de racemização e uma grande eficácia de acoplamento. Esta R’ H N O OH O R’ H N O X OH N X OR O R’ R’ NX O O H N X O R’ O HR H N NHR’’ O R’ O HR N O O HR N O O R N O O H R R’ R’ D,L-péptido BH+ BH+ caminho B caminho AAtivação Base Oxazolona H2N-R’’ H2N-R’’ R’ I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 21 alternativa revelou-se ainda mais positiva pelo facto de permitir substituir o tradicional HOBt com as suas propriedades explosivas.53,54,55 Figura 14 - Estruturas de dois nucleófilos auxiliares utilizados como reagentes de acoplamento, HOBt e Oxima. Dependendo do número de aminoácidos a acoplar e de condições químicas como solubilidade e estabilidade, é de elevada relevância a escolha do reagente de acoplamento adequado, oferecendo uma maior reatividade através da redução simultânea da epimerização. A epimerização é um processo estereoquímico em que há mudança na configuração de apenas um centro quiral, formando um diastereómetro. Esta mudança, em determinadas situações, pode levar à toxicidade ou inativação da molécula.56 3.2 Síntese peptídica em fase sólida Foi em 1963 que Bruce Merrifield publicou pela primeira vez a síntese de um tetrapéptido utilizando o método agora conhecido como síntese peptídica em fase sólida (SPPS-“ Solid Phase Peptide Synthesis ”). Porém, durante as décadas de 50 e 60 em pleno século XX, a descoberta de péptidos biologicamente ativos de ocorrência natural estimulou a procura e desenvolvimento de outros métodos que serviram de base para futuros trabalhos na área da síntese de péptidos e proteínas.14, 46 Antes da descoberta do método de SPPS, os péptidos eram sintetizados via métodos clássicos de síntese em solução (Esquema 3) que requeriam um enorme dispêndio de tempo, reagentes e purificação de intermediários, finalizando com baixos rendimentos. Com a inovação da SPPS, a N N N OH 1—Hidroxi-benzotriazole (HOBt) C COOEtNC N OH Etil-2-ciano-2(hidroxiimino)acetato (Oxima) I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 22 purificação e a síntese de péptidos passou de durar meses para ser atingida em apenas algumas horas ou dias, tendo-se tornado no método de síntese preferencial. Esquema 3 - Esquema geral da síntese peptídica em solução. H2NCOOH R1 H2NCOOGP R1 COOH R2 GPHN H NCOOGP R2 R1 O H N N HCOOGP R3R1 R2 O O COOH R3 GPHN GPNN H2N H N N HCOOH R3R1 R2 O O Proteção no terminal carbonilo (R1) e amino (R2) Acoplamento Desproteção do terminal amino Desproteção do terminal C e N H2N H NCOOGP R2 R1 O GPNH Acoplamento com AA protegido em N GP= Grupo protetor H2NCOOH R2 + + I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 29 Figura 18 - Estruturas químicas dos grupos protetores do terminal amino, Fmoc e Boc. Esquema 5 - Mecanismo de remoção do grupo Fmoc por ação da piperidina. ON H O Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonilo) CON H O Boc ( terc -butiloxicarbonilo) O O NH R R’ O N + Péptido N H Piperidina + CO2 +NH2 R R’ O H N I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 30 3.3 Síntese peptídica em fase sólida assistida por micro-ondas Nos anos 90, o uso de aquecimento por radiação micro-ondas em síntese orgânica tornou-se num novo parâmetro para melhorar a velocidade e rendimento das reações. Desde esse momento, a radiação micro-ondas passou a ser amplamente usada em síntese de péptidos permitindo melhores rendimentos, produtos com elevado grau de pureza, menores percentagens de racemização e capacidade de síntese peptídica com um maior número de aminoácidos.63,64 65 O aquecimento via micro-ondas ocorre através da irradiação de energia diretamente no solvente e/ou reagentes, devido à interação do material com um campo elétrico alternado, aquecendo o meio reacional. Contrariamente, no aquecimento convencional condutivo, a energia é transferida para a mistura de reação através de correntes convectivas ou condutividade térmica, não proporcionando um aquecimento tão rápido. Para se obter um aquecimento rápido, é importante escolher adequadamente os solventes, sendo preferível que sejam capazes de absorver a energia de micro-ondas e de converter essa energia absorvida em calor.66 Alguns desses solventes são o DMF, o acetonitrilo (ACN) , o butanol, cetonas e água (H2O). Para além do aquecimento, as microondas oferecem outro benefício relacionado com o facto de os péptidos em crescimento no suporte sólido terem a tendência a enrolar-se à medida que o tamanho da cadeia aumenta. O aquecimento por micro-ondas promove uma agitação das moléculas impossibilitando agregações inter e intramoleculares que tende a existir nos aminoácidos que são propensos a formar folhas β,&devido à presença de ligações de hidrogénio e forças hidrofóbicas, estendendo assim a cadeia peptídica e expondo os grupos funcionais terminais, facilitando a reação (Figura 19).67,68 I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 31 Figura 19 - Ação da energia de micro-ondas durante o crescimento da cadeia peptídica. Utilizando a radiação micro-ondas, uma reação orgânica consegue ser concluída num curto espaço de tempo porque ainda que a irradiação não afete diretamente o valor da energia de ativação dos reagentes, a energia que é irradiada é suficiente para superar essa barreira mais rapidamente, sendo também possível controlar a temperatura e a pressão no interior do equipamento. Apesar de todas as vantagens que este método proporciona, realizar uma síntese peptídica assistida por micro-ondas acarreta um elevado dispêndio económico tendo em conta os custos do equipamento e das resinas compatíveis. Para além disso, quando estamos na presença de aminoácidos como Cys, His e Asp, as condições de utilização têm de ser ajustadas.69,70 4. Biomateriais para a Cicatrização e Regeneração da Pele em Feridas Cutâneas Recentemente, os péptidos com atividade antimicrobiana têm sido estudados em combinação com biomateriais por forma a que a sua atividade possa ser expandida a outras aplicações ou controlada para uma libertação direcionada. Existem inúmeros AMPs já investigados que demonstraram uma elevada eficácia no combate a enfermidades, como feridas cutâneas, resultantes de diversas patologias. Muitos desses péptidos possuem uma atividade antibacteriana I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 32 eficaz contra as bactérias mais comuns encontradas em feridas cutâneas, e podem ainda acelerar o processo de cicatrização. Enquanto objeto de estudo deste projeto, é pretendido verificar se estas duas propriedades são também elas encontradas em simultâneo no péptido Tiger 17. O desenvolvimento de novos biomateriais para a reparação e cicatrização da pele requer numa primeira instância o reconhecimento da estrutura da pele e do processo de cicatrização e restauração da barreira cutânea. A cicatrização de feridas é um processo bem organizado onde existe uma resposta por parte do organismo a uma rutura física de um tecido ou órgão e visa restabelecer a homeostasia. Este processo decorre em diferentes fases: (1) inflamação; (2) proliferação e (3) remodelação do tecido danificado. Na primeira fase de inflamação, o sistema imunitário tenta repor a homeostasia removendo o tecido que foi danificado e assegurando uma resposta eficaz para prevenir infeções por microrganismos. Já na fase proliferativa, que acontece 4-21 dias após a lesão, inicia-se a formação do tecido saudável e o recrutamento e proliferação de células do tecido conjuntivo levando à reepitelização superficial da ferida. Por fim, a última fase é caracterizada pela deposição de uma matriz extracelular acompanhada da remodelação do tecido e contração da ferida.71 Numa ferida crónica, o processo normal de cicatrização é interrompido e a degradação gradual dos tecidos pode ocorrer, na qual agentes químicos e bioquímicos, como enzimas proteolíticas derivadas de neutrófilos, estão envolvidas. Muitos dos tratamentos para este tipo de feridas tornam-se ineficazes para muitos indivíduos devido às diferenças biológicas existentes de pessoa para pessoa, designando-se as feridas como microambientes muito próprios, tornando o processo de desenvolvimento de um método 100% eficaz para uma população em geral, extremamente exaustivo.72,73 Os antibióticos usados atualmente foram desenvolvidos principalmente para atingir microrganismos em crescimento exponencial, e são geralmente pouco eficazes contra a formação e combate de biofilmes. Um biofilme, por definição, é um conjunto de células microbianas que se encontram irreversivelmente associadas a uma superfície e envolvidas numa matriz de material principalmente polissacarídeo. Diversas estratégias foram desenvolvidas ao longo do tempo de forma a atuar direta ou indiretamente nos mecanismos envolvidos na formação dos biofilmes como, por exemplo, impedindo o processo de adesão bactéria-superfície. A estratégia de anti-adesão, utilizada para combater a formação de biofilmes, passa por impedir a interação das bactérias com as superfícies de biomateriais através da sua modificação. Geralmente, quando já estamos na presença de um I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 33 biofilme em estado avançado de agregação, estes têm tendência a desenvolver uma crescente resistência e tolerância a antibióticos, impedindo a eficácia dos diversos tratamentos atualmente estipulados em ambiente clínico. Essa resistência é desenvolvida devido aos microrganismos intitulados como “persistentes”. Esses microrganismos são geralmente bactérias que desenvolvem um determinado fenótipo que lhes permite sobreviver na presença de 1000 vezes mais do que a concentração mínima inibitória (MIC) de vários antibióticos, tornando-se dessa forma praticamente impenetrável.74,75,76 Durante o processo de cicatrização da pele numa ferida cutânea, os pensos são usados como proteção da integridade da derme e dos tecidos epidérmicos. Atualmente, a fabricação de pensos atingiu um elevado patamar de qualidade de forma a criar um ambiente adequado para que ocorra um processo de cicatrização e regeneração da pele em condições ótimas por forma a acelerar o processo e evitar a colonização microbiana. Os pensos bioativos tornaram-se nos últimos anos sistemas com uma importância relevante visto que combinam as propriedades físicas e bioquímicas dos polímeros naturais e sintéticos, com compostos ativos que possuem propriedades benéficas para a cicatrização e regeneração de feridas cutâneas. Os AMPs são a aquisição mais recente destes sistemas, onde controlar a proliferação e colonização microbiana de bactérias, promover a síntese de proteínas essenciais para a cicatrização como o colagénio, potenciar a migração e proliferação celular e modular a resposta imune do hospedeiro são os principais objetivos (Esquema 6).77,78 A eficácia antimicrobiana de um penso está dependente da estabilidade e atividade exibida pelo AMPs enquanto este permanecer ativo e funcionalizado à superfície das suas fibras. Esquema 6 - Potencialidades dos AMPs para promover a cicatrização e regeneração de feridas cutâneas. Migração e proliferação celular Atividade antimicrobiana Síntese de colagénio Modular a resposta do hospedeiro AMPs I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 34 4.1 Tipos de biomateriais De acordo com o National Institute of Health um biomaterial é definido como “qualquer matéria, superfície ou construção que interaja com sistemas biológicos. Os biomateriais podem ser derivados da natureza ou sintetizados em laboratório usando componentes metálicos, polímeros, cerâmicas ou materiais compostos. Dispositivos médicos feitos de biomateriais são frequentemente usados para substituir ou aumentar uma função natural." 79 Os biomateriais têm recebido especial atenção por parte de diversos investigadores pelas suas potencialidades em diversos campos. Como aplicação biomédica, estes materiais podem ter como alvo as fases inflamatórias, proliferativas ou de remodelação do tecido, assim como modular as vias de sinalização celular, desencadeando o crescimento, a diferenciação e o funcionamento dos principais agentes do processo de cicatrização como os fibroblastos, queratinócitos, macrófagos e células endoteliais. Dentro de um vasto leque de biomateriais, os biopolímeros têm sido amplamente aplicados como material no tratamento de feridas devido às suas excelentes propriedades de biocompatibilidade, regeneração, baixa antigenicidade, capacidade de suportar o crescimento celular, biodegradabilidade e durabilidade.80,81 Um dos pré-requisitos mais essenciais para definir um material como biomaterial é definitivamente a sua biocompatibilidade, ou seja, a capacidade de um material funcionar com uma resposta apropriada ao hospedeiro dependendo da sua ação específica. A resposta por parte do hospedeiro depende de diversos fatores que vão desde as propriedades químicas, físicas e biológicas dos materiais até à forma e estrutura do scaffold (estrutura tridimensional) usado. Algumas das propriedades inerentes aos biomateriais de origem polimérica que podem afetar a sua biocompatibilidade são: as características químicas do polímero, peso molecular, solubilidade, forma e estrutura, propriedades hidrofílicas e hidrofóbicas, tensão superficial, absorção de água e degradação. O segundo pré-requisito mais importante é a biodegradabilidade dos materiais e para este fator é indispensável que a biocompatibilidade seja demonstrada ao longo do tempo. Os scaffolds poliméricos quando aplicados a organismos vivos devem persistir sem alterações físicas e químicas durante tempo suficiente para permitir a formação de novo tecido, mas também é necessário que tenham a capacidade de se degradar em tempo útil de forma a serem substituídos pelo novo tecido.82,83 Os polímeros de origem natural possuem na sua estrutura sequências ou apenas monómeros de aminoácidos e ácidos nucleicos que ligados por ligações covalentes podem formar péptidos, I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 35 polissacarídeos, polifenóis, etc. São produzidos de forma natural por organismos vivos tais como plantas, animais, fungos e algas e dentro dos mais comuns encontramos a celulose, o quitosano, o alginato e o ácido hialurónico. Todos estes biopolímeros apresentam propriedades medicinais diferentes, entre elas: efeito anti-inflamatório, atividade antimicrobiana, poder cicatrizante, etc. Apesar dos seus benefícios em termos biológicos, as suas propriedades mecânicas tendem a ser insuficientes para suportar os movimentos e esforços mecânicos inerentes a muitas áreas do corpo, incluindo a pele. Misturas com polímeros de origem sintética oferecem múltiplos benefícios neste sentido, para além de tornarem o seu processamento por técnicas de nano e micro fiação muito mais simples. No presente projeto, o acetato de celulose, polímero de origem natural, foi combinado com o polímero sintético policaprolactona (PCL) para a produção de nanofibras a partir da técnica de eletrofiação (eletrospinning). A celulose é o biopolímero mais abundante na natureza, estando presente nas paredes celulares das plantas e é também produzida por certas bactérias pertencentes aos géneros Acetobacter , Sarcina ventriculi e Agrobacterium . Após um processo de extração, purificação e acetilação, a celulose é convertida no seu éster, acetato de celulose (CA) (Figura 20), visto esta forma molecular permitir um manuseamento mais fácil.84 A sua utilização em pensos bioativos deve-se às suas propriedades de retenção de humidade o que em feridas crónicas é visto como um fator positivo por induzir uma cicatrização mais rápida devido ao fornecimento adequado de fatores de crescimento e outras moléculas essenciais para os tecidos em cicatrização. Ao mesmo tempo, auxilia na absorção de exsudatos, é um material de baixo custo, resistente ao calor e a sua estrutura porosa resultante das repetições de β-D-glucose imita a matriz extracelular da pele, agilizando o processo de regeneração.81 I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 36 Figura 20 - Estrutura do acetato de celulose. Este polímero de origem natural é várias vezes encontrado na literatura juntamente com outros tipos de polímeros de origem sintética pois dessa forma, os scaffolds produzidos beneficiam da relação simbiótica entre a origem natural, eficaz em contacto com tecidos vivos, e a origem sintética com todas as suas vantagens mecânicas. Um dos biopolímeros mais utilizados com o CA é a PCL. O PCL é um polímero hidrofóbico, semi-cristalino, com boa solubilidade e baixo ponto de fusão pertencente à família dos poliésteres alifáticos. Foi produzido sinteticamente pela primeira vez em 1930 pelo grupo de investigação de Wallace Carothers e durante décadas caiu no esquecimento. Recentemente, foi ressurgindo em vários trabalhos de investigação pela sua ótima capacidade de mistura com outros tipos de biopolímeros para ser aplicado em nanofibras com potenciais biomédicos. O seu interesse reemergiu pela necessidade crescente de polímeros de baixo custo e que ao mesmo tempo tenham propriedades mecânicas específicas, como a viscoelasticidade, que sejam não imunogénicos e que sejam reabsorvidos naturalmente pelo organismo numa escala de meses e/ou anos (muito mais tempo do que os poliésteres alifáticos projetados para usos semelhantes).85,86 Este polímero pode ser preparado por três vias: (1) abertura do anel da εcaprolactona por polimerização usando uma variedade de catalisadores aniónicos, catiónicos e de coordenação; (2) abertura do anel do radical livre de 2-metileno-1-3-dioxepano via polimerização; e (3) condensação do ácido 6-hidroxicapróico (sendo que esta via é mais rara de todas) (Esquema 7).87 RO O RO OR OR O O OR OR RO OR n R = H ou CH3 O I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 37 Esquema 7 – Vias possíveis para a síntese do polímero PCL por três vias possíveis: (1) abertura do anel da ε-caprolactona por polimerização usando catalisadores aniónicos, catiónicos ou de coordenação ou (2) abertura do anel do radical livre de 2-metileno-1-3-dioxepano ou (3) condensação do ácido 6hidroxicapróico. Nina Liao et al. investigaram o poder antimicrobiano e a capacidade de proliferação celular do antibiótico clorohidrato de tetraciclina (THC). Este foi aplicado a scaffolds para feridas cutâneas produzidos pela técnica de eletrospinning através da mistura de CA, PCL e dextrano. A utilização do CA deveu-se à sua excelente compatibilidade com o corpo humano e o seu baixo custo; porém, a sua baixa resistência mecânica e eletrospinabilidade limitou a sua aplicação individual. De forma a superar estes obstáculos, o PCL foi utilizado na mistura para fornecer toda a resistência mecânica que anteriormente estava em falta.88 Também Kamyar Khoshnevisan et al. produziram nanofibras recorrendo à técnica de eletrospinning com uma solução polimérica de CA/PCL. Após a obtenção das fibras, observadas por microscopia eletrónica de varrimento (SEM), procederam a um processo de imobilização por impregnação de extrato de própolis, conhecido pelas suas propriedades terapêuticas e medicinais, incluindo atividade antibacteriana, anti-inflamatória, O O ε-caprolactona O O H2C 2-metileno-1-3-dioxepano OH OH O Ácido 6-hidroxicapróico O On PCL Condensação Abertura do anel radical por polimerização Abertura do anel por polimerização utilizando catalizadores iónicos I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 38 antifúngica, antiviral e anti tumoral. O scaffold produzido demonstrou atividade antimicrobiana e alta atividade antioxidante tendo sido considerado uma superfície biocompatível e biodegradável para aplicação na cicatrização de feridas.89 4.2 Produção de Nanofibras pela Técnica de Eletrospinning A técnica de eletrospinning é um método simples e eficaz que usa a força electroestática para produzir fibras em nanoescala a partir de polímeros de origem natural e sintética. A sua invenção data de há 120 anos, mas apenas a partir da década de 80 é que começou a ganhar mais atenção pela sua versatilidade, reprodutibilidade, a escala a que opera, relação volume-superfície, porosidade ajustável e possibilidade de produzir fibras maleáveis que se adaptam a uma ampla variedade de tamanhos e formas e, pela possibilidade de controlar facilmente a composição das fibras para atingir as propriedades e funcionalidade desejadas. No geral, o funcionamento desta técnica assenta em três princípios fundamentais: (1) a fonte de alimentação elétrica; (2) o uso de um spinneret (a agulha através da qual sai a solução polimérica para formar a fibra); e (3) o coletor (Figura 21).90 De forma sucinta, no eletrospinning uma solução polimérica é preparada nos solventes apropriados e introduzida numa seringa ligada diretamente ao spinneret . O próximo passo é a aplicação de um elevado potencial elétrico (kV) entre a agulha e o coletor. Quando o campo elétrico aplicado ultrapassa a tensão superficial da gota, um feixe carregado da solução polimérica é expelido da ponta da agulha. A este feixe dá-se o nome de “Cone de Taylor” que adquire a forma de um cone ao sair da agulha tornando-se mais longo e fino consoante as altas voltagens aplicadas, acabando por se subdividir geometricamente em feixes de nanofibras que são coletadas a uma distância ideal, terminando na solidificação dos polímeros devido à evaporação do solvente. Assim, as nanofibras solidificadas são depositadas no coletor até formar um filme com uma espessura apropriada para a utilização pretendida. I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 45 interesse avaliar as propriedades físicas, químicas e mecânicas das nanofibras obtidas com o intuito de verificar se a escolha de polímeros, solventes e parâmetros de processamento são os adequados para a obtenção de estruturas com potencial para dar origem a pensos bioativos. 4.5.1 Microscopia Ótica de Campo Claro Numa primeira fase, a confirmação da presença de nanofibras nos filmes de eletrospinning é feita utilizando um microscópio ótico (MO). Existem misturas poliméricas onde é possível visualizar, apenas com este equipamento, se existem ou não fibras; porém, alguns polímeros onde os índices de refração não são compatíveis com o componente ótico do microscópio, esta tarefa não é possível. A microscopia ótica é uma das técnicas mais fáceis de usar. Com recurso a um sistema de lentes e à manipulação da amostra numa ampla variedade de condições de iluminação é possível obter imagens óticas. Isto significa que há um caminho direto da fonte de iluminação para o observador e, portanto, na ausência de amostras ou utilizando amostras transparentes, a região será brilhante. A morfologia da amostra será visível apenas se esta absorver a luz ou a espalhar com força suficiente em grandes ângulos para que parte da luz não seja recolhida pela lente objetiva. Quando pretendemos analisar a morfologia de superfícies contendo polímeros é necessário ter em atenção que estes são, na sua maioria transparentes e, portanto, a distribuição de pigmentos ou outras partículas pode ser vista em MO apenas se as amostras forem relativamente espessas. Na presença de misturas poliméricas, o contraste de fase é um método comum usado para visualizar amostras que têm pouco ou nenhum contraste. Se os vários polímeros são transparentes, muitas vezes têm uma pequena diferença no índice de refração resulta em pouca ou nenhuma absorção e num espalhamento fraco.103 No entanto, se a amostra possuir agregados, estes serão facilmente visualizados graças à acumulação dos polímeros ou à presença de solventes. 4.5.2 Microscopia Eletrónica de Varrimento (SEM) Quando nanofibras ou agregados não são passíveis de visualização através do MO recorresse ao SEM. O SEM é uma técnica de microscopia eletrónica que capta imagens de uma superfície I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 46 de amostra por meio da varredura de um feixe de eletrões energético focalizado. É uma das ferramentas mais comuns para estudar a morfologia de superfícies, pois permite uma resolução de imagem muito superior ao MO (até 1000x mais), até 1 nm, podendo não só confirmar-se a presença de fibras, mas também o seu diâmetro e distribuição de porosidades.104 Em estudos utilizando SEM, e especialmente quando a amostra é polimérica, esta deverá ser eletricamente condutora, pelo menos à superfície, de forma a evitar a sobrecarga de energia electroestática e a presença de artefactos nas imagens obtidas. Como tal, materiais poliméricos são geralmente cobertos por um revestimento ultrafino de um material eletricamente condutor, como ouro.105 Após esse tratamento inicial, a amostra é colocada no equipamento SEM onde os eletrões primários interagem com os átomos na superfície da amostra emitindo vários sinais. Estes eletrões são emitidos por um canhão de eletrões tais como: cátodos de filamento de tungsténio ou cátodos de hexaboreto de lantânio (LaB6). Os eletrões são normalmente acelerados com uma energia de 2 - 40 keV e focalizados espacialmente por uma ou duas lentes condensadoras num ponto de cerca de 0,4 - 5 nm de diâmetro. Ao atingir a amostra, os eletrões perdem energia devido ao seu espalhamento pela superfície e a absorção dos eletrões pela própria amostra. Esta absorção vai permitir a emissão dos eletrões secundários a diferentes profundidades (5 - 10 nm), fornecendo vários sinais de morfologia da amostra a diferentes graus de profundidade. Os sinais emitidos são recolhidos por detetores especializados e amplificados, transformando-se em imagens.106 4.5.3 Termogravimetria (TGA) e Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC) A análise do comportamento dos polímeros na presença de temperatura pode ser seguido através das técnicas de TGA e DSC. A técnica de TGA é utilizada para medir variações de massa de uma determinada amostra aquando o seu aquecimento (ou arrefecimento) ou quando mantida a uma temperatura específica. Esta perda de massa pode ocorrer através de diferentes fenómenos, nomeadamente evaporação, decomposição, sublimação ou até oxidação, e podem ser originados pela formação ou rutura de ligações químicas e libertação de produtos voláteis. Para serem detetadas estas variações de massa, o equipamento de TGA contém uma termobalança que permite a pesagem contínua da I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 47 amostra em função da temperatura, cuja gama pode atingir um máximo de 1000°C sob uma atmosfera inerte (nitrogénio, hélio ou árgon). As curvas de variação de massa obtidas permitem tirar conclusões sobre a estabilidade térmica da amostra, sobre a sua composição e estabilidade dos compostos intermediários e sobre a composição dos resíduos resultantes. Geralmente, os polímeros exibem perda de massa pelo facto de a elevadas temperaturas ocorrer a evaporação de compostos voláteis.107 Através do TGA são obtidos dois tipos de gráficos: o gráfico TG, onde é dada a progressão da perda de massa ao longo da temperatura (Figura 22), e o gráfico de dTG que é simplesmente a derivada do primeiro gráfico onde é possível ver um vértice que representa a temperatura do momento principal de degradação da amostra. Figura 22 - Representação de uma curva típica de TGA através de um gráfico de TG. Existem diversos fatores que podem afetar o comportamento de uma dada amostra em determinada gama de temperatura, influenciando as curvas obtidas. No que toca a fatores condicionados pelo equipamento, estes são controlados pelo fabricante ou pelo operador enquanto que os fatores ligados à amostra dependem do seu pré-tratamento, manuseamento e das suas propriedades intrínsecas (Tabela 5). Temperatura (°C) Perda de massa (%) Tonset Tendset TiTf Resíduos intermediários Variação de massa I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 48 Tabela 5 - Fatores que afetam as curvas obtidas pela técnica de TGA e DSC. Fatores Instrumentais Características da Amostra Velocidade de aquecimento do forno Compactação da amostra Atmosfera Quantidade de amostra Sensibilidade da balança Natureza da amostra Posição da amostra no forno Tamanho das partículas Material dos cadinhos (DSC) Condutividade Térmica Termopares (DSC) Natureza dos resíduos intermediários Comparativamente a outras técnicas de análise térmica, o DSC é a mais utilizada pelo facto de permitir analisar o comportamento térmico de uma amostra através da comparação com um material de referência quando a amostra é exposta a um programa controlado de temperatura. Esta técnica origina gráficos de fluxo de calor (mW) em função da temperatura e fornece informações tais como: determinação da temperatura de transição vítrea, de cristalização polimérica e de derretimento; o calor de fusão; calor de reação; determinação de pureza; avaliação cinética de reações químicas (ex. degradação térmica oxidativa), etc. Pela sua natureza abrangente, e o facto de necessitar de pouca quantidade de amostra, esta é uma técnica geralmente aplicada a polímeros e fármacos, sendo também possível analisar moléculas orgânicas e inorgânicas.108 Em DSC é possível determinar qualitativamente e quantitativamente as mudanças na temperatura em termos de capacidade exotérmica, endotérmica, e térmica de um material. Para a técnica de DSC é necessário a utilização de cadinhos, nos quais a amostra é colocada assim como o material de referência. Utilizam-se geralmente cadinhos de alumínio, colocados em cima de termopares, e o material de referência é usualmente a alumina (Figura 23). Esta técnica baseia-se na medição da diferença de temperatura entre a amostra e o material de referência enquanto tanto a amostra como a referência são submetidas a um programa de temperatura controlada. O registo depende da diferença entre as capacidades caloríficas da amostra e da referência, da velocidade de aquecimento (dT/dt), e da resistência térmica. Tal como no TGA, existem também fatores relacionados tanto com o equipamento como com a amostra (Tabela 5).107 I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 49 Figura 23 - Representação esquemática de um equipamento de DSC. O resultado da técnica de DSC é exibido na forma de um gráfico ou curva, conhecido como curva DSC. Este gráfico é traçado com base no fluxo de calor em função da temperatura ou tempo, sendo mais usual a utilização da medida de temperatura. Numa curva típica de DSC, podem estar representados eventos exotérmicos e endotérmicos, caracterizados por picos com direção para cima ou para baixo (Figura 24). Essa curva obtida é usada para medir as entalpias de transições de fase, integrando o pico que corresponde a determinada transição, utilizando para isso a equação apropriada.107 Figura 24 - Exemplo de uma curva típica de DSC, onde é possível visualizar as diferentes transições ocorridas. Material de Referência Amostra ! Termopar Termopar Computador que monitoriza a temperatura e o fluxo de calor I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 50 4.5.4 Espetroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier acoplada a Reflexão Total Atenuada (ATR-FTIR) Para a caracterização química de determinado material, em especial amostras poliméricas no formato de filmes nanofibrosos, é utilizado o ATR-FTIR. Em geral, os materiais poliméricos ao longo do tempo sofrem diferentes reações químicas que provocam a sua degradação, induzindo alterações nas cadeias poliméricas por rutura dessa mesma cadeia, por intermédio de processo químicos de crosslinking , ou pela formação de novos grupos funcionais. Para estudar essas modificações ou seguir ao longo do tempo a evolução da amostra, a análise por ATR-FTIR estuda as características químicas dos materiais (neste caso, as nanofibras), fornecendo uma “impressão digital” acerca de todos os elementos que as compõe.109 A imagem obtida por FTIR usando equipamento ATR representa uma abordagem complementar ao uso da imagem FTIR nos modos de transmissão ou reflexão. O equipamento ATR é a ferramenta mais amplamente utilizada juntamento com um equipamento FTIR por ser a mais rápida. O ATR-FTIR permite a análise de amostras pequenas, sem preparação prévia, e fornece todas as informações necessárias sobre a transformação de diferentes grupos funcionais na estrutura polimérica. Uma das principais vantagens do ATR é a sua capacidade de penetração na amostra, qualquer que seja a sua espessura, utilizando um único feixe de infravermelhos. Nesta técnica, a amostra é pressionada contra um diamante, um selenito de zinco ou um cristal de germânio, e a absorção da onda evanescente é medida (Figura 25).110 Figura 25 - Representação do caminho efetuado por um feixe de IV em contacto com uma amostra no equipamento de ATR. O feixe que atravessa o cristal do equipamento ATR e entra em contacto com a amostra é depois recolhido por um detetor onde as imagens FTIR são obtidas com recurso a um computador. A medição consecutiva numa série de pontos na amostra permite obter um mapa de espetros Amostra Feixe de Infravermelho Cristal de ATR Saída para o detetor I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 51 com bandas a diferentes comprimentos de onda (cm-1) com uma determinada percentagem de transmitância, que pode ser usada para gerar espetros da composição química da amostra. 4.5.5 Ângulo de Contacto e Energia de Superfície O ângulo de contacto de uma superfície resulta da medição da molhabilidade de um sólido, neste caso de uma superfície, por um solvente teste. É definido geometricamente como o ângulo formado entre a superfície sólida e a superfície líquida quando estas se encontram. 111 A medição do ângulo de contato é comumente usado para a caracterização da hidrofilicidade/hidrofobicidade da superfície de um biomaterial. Sendo um dos métodos mais antigos usados para analisar superfícies de biomateriais, fornece informações muito úteis para o campo das aplicações biomédicas, pois a hidrofilicidade de uma superfície é crucial para as funções dos biomateriais, nomeadamente a adesão e propagação celular.112 É um método relativamente simples para amostras sólidas e normalmente não é necessário nenhum tipo de preparação especial da amostra, sendo apenas necessário estarem suficientemente limpas e não modificarem o seu comportamento e morfologia em contacto com os solventes testados, como por exemplo, o filme dissolver em contacto com um dos solventes teste. Há duas formas de descrever os fenómenos que acontecem quando o solvente entra em contacto com a superfície: uma é a abordagem termodinâmica que tem em conta a adsorção, e a outra afeta as tensões superficiais correspondentes. As medições são efetuadas utilizando o método da gota séssil onde uma gota de solvente puro é depositada verticalmente na superfície da amostra e os ângulos de contacto são medidos por meio de um goniómetro, fornecendo informações acerca da simetria, estabilidade e capilaridade da superfície da amostra analisada (Figura 26)..113 Normalmente são testados tanto solventes polares como apolares e a água destilada serve como solvente padrão. Além da química da superfície, a rugosidade da superfície também é um fator crucial para a medição do ângulo de contacto.106 A energia superficial é uma medida relativa de energia de uma determinada superfície, relacionada com a força das interações químicas no material e a sua área de exposição. Este valor é calculado recorrendo a um conjunto de equações e, geralmente, uma energia superficial alta I. Introdução Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 52 significa uma maior molhabilidade das superfícies, resultando em ângulos de contacto menores.114,115,116 Figura 26 - Método da gota séssil (a) numa superfície com boa hidrofilicidade ou (b) boa hidrofobicidade. 𝜃 CA é o ângulo de contato do líquido e 𝛾 SL, 𝛾 SG e 𝛾 LG representam as interfaces sólido/líquido, sólido/gás e líquido/gás, respetivamente. II. Resultados e Discussão II. Resultados e Discussão Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 54 Em resposta ao aumento da resistência a antibióticos por parte de microorganismos patogénicos, a aplicação de AMPs com um amplo espetro de atividade é recebida pela comunidade ciência e médica como uma possível solução capaz de reduzir este fenómeno. O desenvolvimento de soluções para a cicatrização de feridas cutâneas, com recurso a pensos antimicrobianos modificados com estas biomoléculas, tenta prevenir o aparecimento de infeções crónicas e ajudar ao normal funcionamento do processo de cicatrização. Entre os vários tipos de AMPs já descritos anteriormente, existe o Peptaibolin com uma estrutura carateristicamente helicoidal que tem sido alvo de estudos de relação estrutura-atividade com vista ao desenvolvimento de novos agentes terapêuticos antimicrobianos. Outros AMPs, possuem atividade promotora de cicatrização, contudo pouco se sabe sobre a sua contribuição antimicrobiana, como é o caso do Tiger 17. O objetivo deste trabalho de investigação foi a síntese do Peptaibolin e Tiger 17, através de metodologias de síntese em fase sólida assistida por micro-ondas, respetiva caracterização estrutural e avaliação da sua capacidade antimicrobiana. Simultaneamente, foram produzidas matrizes poliméricas nanofibrosas com recurso à técnica de eletrospinning com o objetivo de imobilizar as biomoléculas desenvolvidas e criar assim potenciais veículos para uma ação antimicrobiana local e sustentável (libertação controlada). Por forma a verificar as suas propriedades físicas e químicas técnicas de caracterização avançada foram utilizadas: ATR-FTIR, TGA, DSC, ângulo de contacto e energia de superfície, determinação indireta de porosidade e hidratação ( swelling ), SEM. II. Resultados e Discussão Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 61 Tabela 8 - Condições aplicadas e resultados obtidos na 1ª síntese de Tiger 17 usando TFA:H2O (95:5) na clivagem do péptido da resina. 1ª Metade da Resina 2ª Metade da Resina Tiger 17 (a) Tiger 17 (b) Tiger 17 (c) Tiger 17 (d) Tempo da 1ª exposição (h) 2 - 4 - Tempo da 2ª exposição (h) - 2 - overnight Massa (g) 0,0399 0,4795 0,0232 0,1039 Rendimento (%) 18,23a 219,05b 10,60a 47,46a a Rendimento após ciclização. b Rendimento sem ciclização. De acordo com os dados apresentados na Tabela 8, após a segunda exposição à mistura de clivagem obteve-se uma grande quantidade de sólido, ultrapassando drasticamente o valor de rendimento máximo. Uma vez que entre a primeira tentativa de separação e a segunda passou praticamente uma semana, prevê-se que o sólido em excesso esteja relacionado com a degradação da resina. Para confirmação destas suposições, recorreu-se a um teste de cromatografia em camada fina (TLC) onde foi possível visualizar várias manchas, confirmando a ideia de que o segundo precipitado continha vários componentes. Apesar deste resultado, o 1H RMN de ambos os precipitados não apresentava diferenças significativas. Optou-se por avançar com a separação do péptido da segunda metade da resina usando a mesma mistura de clivagem, mas aumentando o tempo de clivagem para 4 h (Tabela 8Tiger 17 (c)), seguida de reação overnight com nova mistura de clivagem (Tabela 8Tiger 17 (d)). Como os 1H RMN dos sólidos obtidos apresentavam sinais que poderiam corresponder aos aminoácidos esperados (exceto o Tiger 17 (d)) decidiu-se colocar os sólidos Tiger 17 (a) e (c) numa mistura de H2O:ácido acético (AcOH) 95:5, geralmente usada para promover a formação das ligações ditiol entre as cisteínas.118 Após 48 h em agitação a mistura foi liofilizada para remoção de solvente e o sólido obtido analisado por HPLC. II. Resultados e Discussão Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 62 1.2.2 Clivagem do Tiger 17 com recurso a scavenger Em face dos resultados obtidos o péptido foi sintetizado novamente e foi testada a clivagem com uma mistura contendo um scavenger . O scavenger selecionado foi o Triisopropil silano (TIPS) na proporção TFA:TIPS:H2O (95:2,5:2,5). Desta vez, foi utilizada a totalidade da resina de uma única vez para o procedimento de clivagem. Como na primeira tentativa de síntese se verificou que a exposição da resina à mistura de clivagem por períodos longos não melhorava os resultados, optou-se por submeter a resina a 2 h de exposição à mistura de clivagem seguida de 2 h com nova mistura ambas sob atmosfera de nitrogénio (requisito na utilização deste scavenger ). O sólido obtido por precipitação com éter etílico foi submetido às condições de formação da ponte ditiol, anteriormente descritas. Os resultados obtidos estão descritos na Tabela 9. Tabela 9 - Condições aplicadas e resultados obtidos na 2ª síntese de Tiger 17 usando TFA:TIPS:H2O (95:2,5:2,5) na clivagem do péptido da resina. 2ªSíntese Tiger 17 (e) Tiger 17 (f) Tempo da 1ª exposição (h) 2 - Tempo da 2ª exposição (h) - 2 Massa (g) 0,1459 0,1777g Rendimento (%) 40,0a 48,71a a Rendimento após ciclização Na segunda síntese a quantidade de sólido obtido estava mais dentro daquilo que era expectável, permitindo a obtenção de melhores rendimentos. Mais uma vez, o espetro de 1H RMN (Figura 30) mostrou-se bastante complexo, o que não foi surpresa visto que o péptido é composto por 11 aminoácidos e possivelmente deverá estar impuro. Existem alguns sinais que teoricamente correspondem a elementos presentes no péptido (zona aromática e zona alifática), porém dada a imensidão de sinais e a falta de uma linha de base mais estável, não foi possível identificar sinais que nos permitisse distinguir o que poderia ser o péptido ou contaminações. II. Resultados e Discussão Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 63 Figura 30 - Espetro de 1H RMN do Tiger 17 (f) com a combinação de reagentes de acoplamento DIC/Oxima. 1.2.3 Análise por HPLC Foi usada uma coluna RP-18 e testada uma gama de eluentes, com polaridades maiores e menores. Numa corrida de HPLC, o desejado é a obtenção de períodos de retenção que não sejam muito curtos, uma vez que a obtenção de tempos de retenção curtos significa que o analito correu apenas o “tempo de circuito” do equipamento não sofrendo qualquer separação na coluna. Foram testadas diversas misturas eluentes de diferentes polaridades variando entre ACN/H2O (1:9) e ACN 100% com 0,1% de TFA. Este estudo foi necessário porque na maior parte das misturas testadas o tempo de retenção era muito pequeno indicando que muito provavelmente estava a ser eluído tudo ao mesmo tempo da coluna, sem qualquer retenção. Na Figura 31 estão apresentados os perfis cromatográficos obtidos com as misturas eluentes que apresentaram maior tempo de retenção. II. Resultados e Discussão Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 64 Figura 31 - Picos obtidos por HPLC analítico do Tiger 17. a) Tiger 17 (f) num eluente ACN/H20 (1:1)+0,1% TFA e b) Tiger 17 (f) num eluente ACN/H20 (1:3)+0,1% TFA. Para ambas as injeções foram utilizados fluxos de 0,4 mL/h e comprimento de onda de 215 nm. Os resultados de HPLC com a mistura ACN/H20 (1:1)+0,1% TFA confirmaram o resultado dos espetros de 1H RMN, o péptido está impuro. Para a confirmação da existência efetiva do péptido nos sólidos obtidos, dever-se-ia recorrer à técnica de espetroscopia de massa, mas até à data de entrega desta dissertação, os resultados não foram conhecidos e, consequentemente, o péptido não foi submetido a testes microbiológicos para avaliação da sua atividade antimicrobiana. Em alternativa avaliou-se a atividade antimicrobiana do péptido Tiger 17 comercial, por forma a estabelecer as características bases do péptido no combate a microrganismos, nunca antes verificadas. 1.2.4 Concentração Mínima Inibitória do Tiger 17 O MIC do Tiger 17, nomeadamente da sua formulação comercial (Tiger 17C) foi estabelecido contra a bactéria S. aureus , uma das mais prevalentes e difíceis de eliminar em infeções cutâneas. Após 24 h de incubação, o MIC foi determinado em 250 µg/mL. Este é o primeiro relatório sobre a capacidade do Tiger 17 de prevenir a ação microbiana. Considerando que o seu efeito foi mais importante é registado na indução da regeneração de tecidos e cicatrização de feridas crónicas, a adição de recursos antimicrobianos à sua ação é extremamente promissora em engenharia de tecidos e aplicações biomédicas, particularmente na cicatrização de feridas. a) b) II. Resultados e Discussão Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 65 2. Produção de Nanofibras via Eletrospinning Após todo o processo de síntese peptídica e caracterização, e tendo em vista a aplicação no tratamento de feridas cutâneas, decidiu-se aliar a química analítica à área têxtil, nomeadamente à produção de filmes poliméricos nanofibrosos. Considerando os dados anteriores, apenas o péptido Tiger 17 foi considerado para imobilização nas fibras. Contudo, até chegar a essa etapa, foi necessária uma extensa otimização tanto da solução polimérica, como dos parâmetros de processamento requeridos para a produção de nanofibras pela técnica de eletrospinning. 2.1 Otimização das Soluções Poliméricas Para a produção de filmes nanofibrosos por eletrospinning é exigido que a solução polimérica possua um rácio apropriado, nomeadamente entre o CA e o PCL, que ambos os polímeros sejam dissolvidos em solventes compatíveis, e que a viscosidade, a tensão superficial e a condutividade sejam favoráveis. Previamente ao início deste trabalho, sabíamos que a relação entre os dois polímeros escolhidos poderia ser um obstáculo e que uma solução polimérica envolvendo os dois polímeros poderia ser “ não eletrospinável ”. Para avaliar todas as vertentes, estudou-se uma gama de soluções poliméricas com diferentes rácios de PCL e CA em diferentes solventes. Apesar de saber que o PCL produziria nanofibras mais facilmente, para a aplicação biomédica seria de interesse possuirmos um maior rácio de CA, visto que é o CA que promove uma maior adesão celular. No entanto, um rácio superior de PCL pode fornecer melhores propriedades mecânicas às nanofibras, característica igualmente importante tendo em conta a aplicação em meios fisiológicos. Para que a obtenção de fibras seja alcançada, não basta que os polímeros sejam os ideais, é também necessário que estes estejam dissolvidos em solventes ideais. Numa primeira fase, os solventes utilizados eram o ácido acético/acetona (para dissolver o PCL) e ácido acético (para dissolver o CA). Porém, utilizando estes solventes, era possível visualizar ao MO e SEM a presença de agregados e não de fibras. Isto pode dever-se ao facto de o ácido acético (solvente utilizado nos dois polímeros), apesar de possuir um bom efeito de dissolução tanto para o PCL como o CA, formar gotículas ao sair da agulha de eletrospinning e, portanto, favorecer a produção de agregados de solvente e não de fibras. Pela literatura, um dos solventes mais adequados para o PCL seria o clorofórmio dado que dissolve em perfeitas condições o PCL e, para além disso sempre II. Resultados e Discussão Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 66 que foi utilizado, a obtenção de fibras foi geral.119 Já em relação ao CA, o melhor solvente é a acetona graças ao seu poder de dissolução para este polímero. Infelizmente, este solvente graças à sua elevada volatilidade não pode ser usado isoladamente, sendo necessário recorrer a uma mistura de solventes.120 Para esta mistura, optou-se pela DMF, um solvente comum e que em estudos anteriores, provou que em combinação com alguns polímeros (como PCL e CA) favorece a formação de fibras uniformes. Assim, testaram-se quinze combinações poliméricas tendo-se chegado à conclusão que a solução PCL a 14%wt em CDCl3/DMF era a ideia, e que conforme se aumentava a % do PCL na mistura PCL/CA fibras mais regulares eram obtidas, tendo-se chegado à conclusão de que PCL/CA 14%:10%wt (3:1) em acetona/DMF (para o CA) e CDCl3/DMF (para o PCL) era a melhor opção. Optou-se por produzir filmes utilizando as duas soluções de forma a que as fibras PCL 14%wt em CDCl3/DMF servissem como controlo. Fibras exclusivamente de CA não foram passíveis de processar devido à instabilidade do feixe elétrico e à incapacidade de produzir fibras de modo contínuo e sem defeitos. 2.2 Parâmetros de Processamento Os parâmetros mais importantes para o eletrospinning são: o fluxo, a voltagem aplicada, a altura ao coletor e o diâmetro da agulha utilizada. Ao testar ambas as soluções poliméricas, todos esses parâmetros foram variados, à exceção da agulha, que se manteve com um diâmetro de 18 gauge (G). Ao fazer variar as condições de eletrospinning é preciso encontrar um equilíbrio entre todos os fatores e, muitas vezes, um feixe estável não significa que uma nanofibra esteja a ser produzida. Para a solução polimérica de PCL/CA 14%:10%wt (3:1), as condições otimizadas foram: 24,7 kV, 3,2 mL/h e 21 cm. Já para a solução de PCL 14%wt em CDCl3/DMF foram: 12 kV, 0,7 mL/h e 17 cm. 3. Análise e Caracterização das Fibras 3.1 Visualização ao MO e SEM Obtidos os filmes poliméricos procedeu-se à sua caracterização física e química. A prioridade inicial era avaliar que de facto a obtenção de nanofibras foi concretizada, recorrendo-se para tal a II. Resultados e Discussão Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 67 equipamentos de microscopia. Todo o processo de otimização da solução polimérica e dos parâmetros de processamento referidos anteriormente foi acompanhada pela análise por MO no qual foi possível avaliar a existência de fibras ou não, utilizando lentes (objetiva mais ocular) com uma ampliação de até 1000x. Como visualizado na Figura 32, as soluções poliméricas com maior teor polimérico de CA apresentaram em todas as combinações a presença de agregados. Figura 32 – Imagens obtidas por microscopia ótica. a) PCL/CA 14%:10%wt (1:3) com condições de: 25 kV, 0,8 mL/h, 18 cm e b) PCL/CA 14%:10%wt (1:3) com condições de: 29 kV, 0,8 mL/h, 17 cm. Após uma mudança de estratégia e com recurso a diferentes condições de otimização, verificou-se que, de igual forma, as soluções poliméricas com maior conteúdo de CA, testando soluções com rácios equilibrados (1:1) de CA e PCL e aumentando o peso molecular de PCL para 80.000, mantinham a presença de agregados e não fibras (Figura 33). Figura 33 - Imagens obtidas por microscopia ótica de uma solução polimérica PCL/CA 14%:10%wt (1:1) com condições de: 25 kV, 2,5 mL/h, 18 cm. a) b) II. Resultados e Discussão Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 68 Por fim, aquando analisadas as soluções poliméricas que posteriormente foram consideradas ideais, PCL/CA 14%:10%wt (3:1) em 24,7 kV, 3,2 mL/h e 21 cm e PCL 14%wt em CDCl3/DMF em 12 kV, 0,7 mL/h e 17 cm, os resultados obtidos foram bastante satisfatórios sendo possível visualizar a presença de fibras mesmo em MO (Figura 34). Figura 34 - Imagens obtidas por microscopia ótica de uma solução polimérica (a) PCL 14% e (b) PCL/CA 14%|10% (3:1). Após confirmação por MO, os mesmos filmes foram analisados através de SEM para verificar a morfologia e os diâmetros das fibras. Para a obtenção dos diâmetros das fibras recorreu-se a micrografias de uma ampliação de 10.000x das quais se fez uma medida de 100 diâmetros de cada imagem. Por análise das imagens e gráficos de distribuição de diâmetros da Figura 35, o PCL isolado formou fibras com maiores diâmetros, porém, era esperado que a distribuição de diâmetros fosse o mais uniforme possível. Tal não aconteceu visto que o desvio padrão obtido representa um valor bastante elevado. Esse acontecimento pode justificar-se por diversos fatores da natureza química do polímero como a possível ocorrência de interações químicas e electroestáticas com o solvente. Analisando os resultados obtidos em (b), retirados da combinação polimérica de PCL/CA, pela imagem SEM é notória a presença de fibras com diâmetros elevados e outras com diâmetros bastante menores. A interação entre o CA e PCL através de ligações de hidrogénio é estabelecida entre o grupo hidroxilo do CA e o grupo carbonilo do PCL. No entanto, como o desvio padrão tem um valor elevado isso sugere que há apenas uma parcial miscibilidade entre o CA e o PCL. a) b) II. Resultados e Discussão Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 69 Figura 35 - Imagens de SEM com uma ampliação de 10.000x e respetivo gráfico de distribuição de diâmetros. Em a) PCL 14%wt em CDCl3/DMF em condições de 12 kV, 0,7 mL/h e 17 cm e b) PCL/CA 14%:10%wt (3:1) em condições de 24,7 kV, 3,2 mL/h e 21 cm. Fibras com diâmetros menores são vantajosas para este tipo de aplicações biomédicas visto que promovem uma maior adesão celular e aumentam a porosidade dos filmes poliméricos, resultando numa maior permeabilidade ao oxigénio e vapor de água. 3.2 Caracterização por ATR-FTIR A composição química das fibras formadas pelo polímero PCL e pela mistura PCL/CA foi avaliada por espetros de ATR-FTIR. Os dois espetros PCL e PCL/CA são mostrados na Figura 36. Pela literatura, a estrutura do PCL é caracterizada por bandas de absorção típicas a 2948 e 2868 cm-1 correspondendo ao grupo químico CH2, a 1725 cm-1 do grupo C=O e a 1246 e 1166 cm-1 do grupo C–O–C. Por comparação, à primeira vista os dois espetros obtidos (PCL isolado e mistura a) b) a) b) II. Resultados e Discussão Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 70 PCL/CA) aparentam ser iguais apenas com % de transmitância mais intensas em alguns picos característicos. Esses picos são a 1369 cm-1 e 1236 cm-1 do grupo CH3, 1167 cm-1 correspondendo às vibrações simétricas de alongamento C–O–C (maior presença no PCL) e a 1048 cm-1 do grupo funcional C–O–C (maior presença no CA). O pico 1728 cm-1 característico do grupo C=O (presente em ambos os polímeros) não apresenta qualquer diferença de intensidade. Isto pode dever-se ao estabelecimento de ligações entre os polímeros pelo grupo carbonilo do PCL e o grupo hidroxilo de CA. Era já esperado que os espetros não fossem muito variáveis tendo em conta que mesmo na mistura polimérica, o rácio de PCL ultrapassa em três vezes o do CA (3:1). Figura 36 - Espetro de ATR-FTIR obtido para os dois filmes poliméricos de PCL e PCL/CA. 3.3 Caracterização por TGA A estabilidade térmica dos filmes poliméricos foi determinada pela técnica de TGA (Figura 37). Considerando que a mistura polimérica de PCL/CA era composta de 75% de PCL e apenas 25% de CA era esperado que o comportamento térmico deste filme fosse, mais uma vez, similar ao do filme contendo apenas PCL. No entanto, com a presença do CA, é notório que a amostra possui uma maior degradação e que esta se inicia a menores temperaturas (290ºC) do que quando temos apenas PCL (300ºC). Conclui-se que a temperatura de decomposição térmica das 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Transmitância (%) Número de Onda (cm-1) PCL PCL/CA 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 Número de onda (cm-1) Transmitância (%) 1162 1236 1048 1369 II. Resultados e Discussão Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 77 (Figura 41). Os dados relataram uma ação antimicrobiana melhorada nos filmes imobilizados com o péptido apenas na primeira hora de cultura. Figura 41 - a) Evolução do número de bactérias S. aureus ao longo do tempo (até 24h de incubação), em contato com o Tiger 17C (T17C). O controlo positivo para esta bactéria atingiu ≈ 8,1x105 unidade de formação de colónias (UFC)/mL. (b) Redução do log de S. aureus em relação ao tempo 0h. Os filmes foram modificados com o péptido Tiger 17C, no valor 2xMIC, por 72 h. No entanto, devido à natureza altamente hidrofóbica dos filmes baseados em PCL, a repulsão do péptido era esperada mesmo após um período de contacto tão longo (os filmes permaneceram no banho de incubação do péptido). Esses resultados demonstram que a quantidade de péptido ligado foi pequena e que este foi libertado muito rapidamente. É provável que o péptido ligado à superfície tenha interagido com os polímeros por meio de ligações fracas. Dos dois filmes poliméricos, o PCL/CA parecia ter mais ligação ao Tiger 17C. Este é um resultado muito interessante, considerando que a hidrofobicidade dos filmes PCL/CA foi ainda mais importante do que a do PCL. É provável que devido à exposição prolongada dos filmes ao péptido, algumas moléculas se tenham encaminhado para os grupos hidroxilo livres do CA, formando mais interações. Após 2 h de incubação, uma redução contínua no número de células é observada para todas as superfícies. Isso é promovido pelos filmes poliméricos nanoestruturados, que retêm muitas células bacterianas. Ainda, entre as 6 h as 24 h de cultura, a importância da estrutura do filme é anulada pelo contínuo crescimento da bactéria. Sem o péptido antimicrobiano para inibir o seu II. Resultados e Discussão Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 78 crescimento, as bactérias continuaram a evoluir, superando a redução inicial introduzida ou pelo péptido ou pelo filme polimérico. Para melhorar a relação entre os filmes poliméricos e o péptido, seria de interesse que em trabalho futuro os filmes fossem submetidos a tratamentos específicos de forma a anular alguma da sua hidrofobicidade que impede uma ligação mais eficaz com o Tiger 17. Algumas alternativas passam, por exemplo, por submeter os filmes a um tratamento por oxidação na superfície (por exemplo por UV ou plasma), imersão em solução de NaOH/EtOH para gerar radicais livres e proporcionar mais pontos de ligação entre o péptido e a superfície polimérica e, assim, aumentar a hidrofilicidade dos filmes poliméricos. III. Conclusão e Perspetivas Futuras III. Conclusões Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 80 Este projeto de investigação foi assente na ambição de criar soluções para combater um grande problema de saúde global: a resistência aos antibióticos e o seu impacto nas feridas cutâneas. A resistência de microorganismos a antibióticos não é um tópico recente, porém, nos últimos anos tem ganho um enorme destaque devido às elevadas estatísticas de mortalidade em todo o mundo. O seu uso inadequado e excessivo fez com que bactérias desenvolvessem mecanismos naturais de resistência tornando os antibióticos, na sua maioria, ineficazes. A bactéria S.aureus tem uma elevada incidência em tecidos lesados e sendo uma das bactérias com maior poder de sobrevivência a antibióticos 𝛽 -lactâmicos, provoca infeções crónicas e generalizadas. A utilização de AMPs surgiu como uma resposta eficaz a este problema, tendo substituído os antibióticos convencionais em diversas utilizações. Uma delas é a aplicação desses mesmos AMPs em pensos bioativos de forma a reparar mais rapidamente, por intermédio de uma ação localizada, uma ferida com um determinado grau de infeção ou já considerada crónica. Neste momento, a forma de travar a exposição de uma ferida ao ambiente circundante é pela aplicação de um penso que previna qualquer sujidade e contaminação exterior. Um penso pode ser constituído por vários tipos de tecidos e a busca por soluções inteligentes, mais económicas e automatizadas é um dos pilares da evolução da indústria têxtil. Pensos bioativos contêm elementos biológicos que permitem que o próprio penso produza uma ação médica consequente da sua ligação às fibras. Estas fibras são, geralmente, provenientes de materiais poliméricos com características químicas e mecânicas aprazíveis para a aplicação biomédica. Neste trabalho, sintetizou-se o AMP Peptaibolin através do método de síntese MW-SPPS, numa resina de Wang, com o objetivo de avaliar a sua atividade antimicrobiana e possível imobilização em fibras produzidas pelo equipamento de eletrospinning. O Peptaibolin, por ter natureza apolar, era expectável que a sua dissolução num solvente apropriado para os testes microbianos fosse um obstáculo, o que se comprovou, visto que este AMP se solubilizou apenas em 10% DMSO/H2O. De qualquer forma, o teste de MIC foi conduzido utilizando as bactérias Staphylococcus aureus , Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa, onde se concluiu que o péptido não apresentava qualquer atividade antimicrobiana tanto nas bactérias Gram-positivas como Gram-negativas e, portanto, deixou de ser o objeto de estudo para este projeto. III. Conclusões Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 81 Outro péptido foi igualmente sintetizado, o Tiger 17, no mesmo método de MW-SPPS, mas numa resina Fmoc-Rink-Amide. Embora seja um péptido pouco explorado (até agora), era de interesse testar se este péptido poderia ter atividade antimicrobiana contra as bactérias mais prevalentes em feridas cutâneas, nomeadamente a S. aureus , visto que estudos prévios já haviam demonstrado a sua elevada capacidade cicatrizante em tecidos lesados. Por ser um péptido nunca antes sintetizado em contexto laboratorial académico, procedeu-se a diversos processos de otimização, tendo-se concluindo que o péptido sintetizado se encontrava impuro e sem condições para que os testes microbianos fossem realizados. Como forma de estabelecer a sua atividade antimicrobiana característica, o péptido Tiger 17 obtido comercialmente foi submetido a testes microbianos de MIC e cinética de crescimento microbiano onde se demonstrou que este péptido possui atividade antimicrobiana que aliada à sua capacidade de regeneração de tecidos e cicatrização de feridas crónicas se torna numa alternativa extremamente promissora em engenharia de tecidos e aplicações biomédicas, particularmente na cicatrização de feridas. Para aplicação dos AMPs, todo um método de produção de nanofibras teve de ser otimizado. O equipamento utilizado foi o eletrospinning que permite a produção de nanofibras através da aplicação de elevadas voltagens a uma solução polimérica previamente preparada. Com uma mistura polimérica de PCL/CA e uma solução controlo de PCL, obtiveram-se filmes poliméricos nanofibrosos, cuja gama de diâmetros foi confirmada por MO e SEM. Estes filmes poliméricos foram submetidos a diversos testes de análise e caracterização de superfícies, de entre os quais se pode destacar o ATR-FTIR, TGA e DSC, testes de swelling , porosidade e molhabilidade. Ambos os filmes de PCL e PCL/CA são considerados de natureza hidrofóbica e resistentes à temperatura e a adição do CA não permitiu um aumento de forma eficaz de características vantajosas para a utilização dessas fibras em pensos bioativos. É possível que o grau de miscibilidade entre os dois polímeros não seja suficiente o que justifica que o péptido possua fraca imobilização na superfície polimérica e seja necessário alcançar melhores soluções para que os péptidos tenham uma ação e libertação mais controlada. 1.1 Perspetivas Futuras Os resultados obtidos em tempo útil para a escrita desta dissertação são, sem dúvida, de uma matéria bastante promissora no campo da engenharia têxtil, aliada à química e à engenharia III. Conclusões Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 82 de tecidos. Contudo, considerando as inconveniências provocados pela situação pandémica atual, que restringiram a atividade prática e a utilização dos equipamentos de processamento e caracterização, algumas questões ficaram por responder e por aprofundar. Num futuro próximo, é de interesse estudar mais estratégias de otimização para que a síntese do Tiger 17, por forma a aumentar a sua eficácia . A utilização de outras técnicas de caracterização estrutural e de massa, permitiria ainda a confirmação de parâmetros como pureza, essencial para que testes antimicrobianos sejam conduzidos com maior sucesso. A nível de produção de nanofibras, apesar de já ter sido efetuado um exaustivo processo de otimização de parâmetros de processamento e de solução polimérica, seria importante o estudo de novos rácios entre PCL e CA ou de novas formas de tratamento dos filmes poliméricos pósprodução para que a sua molhabilidade seja aumentada. Mais ainda, um estudo mais aprofundado sobre os tipos de ligações geradas entre os polímeros e a influência da sua natureza para a produção de soluções homogéneas seria extremamente útil para a compreensão dos fenómenos observados. IV. Secção Experimental IV. Secção Experimental Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 84 1. Materiais e Reagentes A síntese em micro-ondas foi realizada no sintetizador peptídico manual Discover SPPS (CEM Corporation). Os suportes sólidos usados foram a resina Fmoc-Phe-Wang com um grau de funcionalização de 0,51 mmol/g e a resina Fmoc-Rink Amide com um grau de funcionalização de 0,53 mmol/g, ambas adquiridas à AAPPtec. Os espetros de ressonância magnética nuclear de 1H foram obtidos no aparelho Bruker Avance III 400 numa frequência de 400 MHz para 1H, usando o pico do solvente como referência interna, a 25°C. O solvente deuterado utilizado foi o clorofórmio (CDCl3) com grau de deuteração superior a 99,8% (Acros Organics) e DMSO-d6 com grau de deuteração superior a 99,8% (Acros Organics). Os deslocamentos químicos (δ) estão definidos em partes por milhão (ppm). Para verificação da pureza e conteúdo de aminoácidos no péptido foi utilizada cromatografia em camada fina (TLC), usando placas de gel de sílica com 0,25 mm de espessura e com indicador de fluorescência F254 (Nagel DC-Fertiplatten Kieselgel 60). A visualização foi feita pela incidência de radiação ultravioleta/visível (UV/vis, λmax 254 e 365 nm) numa câmara CN-6 de luz UV/vis e utilização de uma câmara de iodo. A análise por HPLC analítico foi realizada com uma coluna Licrospher 100 RP18 (5 µm) num sistema de HPLC composto por uma bomba Jasco PU-980, acoplada a um detetor UV/vis Shimadzu SPD-GAV e um registador Shimadzu C-RGA Chromatopac. A produção dos filmes fibrosos através da técnica de eletrospinning foi efetuada no equipamento de eletrospinning MECC NF-103. Os testes de TGA foram realizados no aparelho STA 449 F3 da NETZSCH Q500 utilizando um cadinho de alumínio. A curva de TGA foi obtida numa gama de temperaturas entre 25-600ºC em atmosfera de nitrogénio, com um fluxo de 200 mL/min e aumento de temperatura gradual de 10ºC/min. A técnica de DSC foi realizada no aparelho Power Compensation Diamond DSC (Perkin Elmer, MA) com um Intracooler ILP, baseado nas normas ISO 11357-1:1997, ISO 11357-2:1999 e ISO 11357-3:1999. Os testes foram conduzidos sobre atmosfera de nitrogénio com um fluxo de 20 mL/min e uma taxa de aumento de temperatura de 10ºC/min. O espetrofotómetro Nicolet Avatar 360 Fourier Transform Infrared (FTIR) (Madison, WI) com um acessório de Refletância Total Atenuada foi usado para traçar os espetros de ATR-FTIR dos IV. Secção Experimental Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 85 filmes de PCL e PCL/CA. Para cada filme, foram feitos um total de 45 scans com uma resolução espectral de 8 cm-1 com um alcance de entre 400-4000 cm-1. Para os testes antimicrobianos, os meios de cultura caldo de soja tríptico (TSB) e agar de soja tríptico (TSA) foram adquiridos na VWR (USA). O meio de cultura de Mueller Hinton (MHB) foi obtido do CondaLab (Spain). Todas as bactérias testadas foram fornecidas pela American Type Culture Collection (ATCC, Spain), abrangendo as bactérias Gram-positivas S. aureus (ATCC 6538) e S. epidermidis (ATCC 35984) e as Gram-negativas E. coli (ATCC 25922) e P. aeruginosa (ATCC 25853). Os reagentes e solventes secos foram usados conforme adquiridos comercialmente (AAPPtec, Acros Organic, Sigma Aldrich, Merck). A resina e os aminoácidos que não foram preparados no laboratório foram adquiridos comercialmente (AAPPtec). 1.1 Síntese do péptido Peptaibolin (Ac-Leu-Aib-Leu-Aib-Phol) por MWSPPS na resina Wang 1.1.1 Reagente de acoplamento: DIC/HOBt Partindo de 1,1 g de resina Fmoc-Phe-Wang (0,51 mmol/g), procedeu-se à remoção do grupo protetor adicionando 5 mL de uma solução de piperidina 20% em DMF ao vaso reacional contendo a resina, colocou-se o vaso reacional com a fibra ótica para medição de temperatura no microondas e escolheu-se o programa de desproteção SPPS a 75°C e 20 W durante 30s. Após esta desproteção inicial, filtrou-se a solução de piperidina 20% em DMF e adicionou-se novamente 7 mL desta solução, tendo-se selecionado novamente o mesmo programa, durante 3 min. Filtrou-se H N O N H O H N O N H O H N O OH IV. Secção Experimental Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 86 a solução e realizaram-se as lavagens: DMF (3x) e MeOH (3x), repetindo 4 vezes este ciclo de lavagem. De seguida, acoplaram-se sequencialmente todos os aminoácidos na ordem Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Aib-OH e Fmoc-Leu-OH. Dissolveu-se o aminoácido N -protegido (0,0028 mol, 5 equiv.), HOBt (0,0028 mol, 0,4756 g, 5 equiv.) e DIC (0,0028 mol, 0,35 mL, 5 equiv.), sendo que a mistura reacional contendo o aminoácido Aib necessitava de um período de agitação de 2 h, enquanto a mistura reacional contendo o aminoácido Leu permaneceu em agitação durante 5 min. Após dois ciclos de irradiação com microondas com as condições de 75°C e 20 W durante 5 min, procedeu-se com as seguintes lavagens: DMF (3x) e MeOH (3x), 3 ciclos de lavagem. Antes da separação do péptido da resina, procedeu-se à acetilação na qual se suspendeu a resina em 7 mL de DMF seca, adicionou-se 1 mL de DIPEA (14 equiv.) e de seguida 0,4 mL de anidrido acético (7 equiv.). Deixou-se a mistura sob agitação durante 1,5 h. Após esse período, lavou-se a resina com DMF (2x), MeOH (2x), DCM (3x) e éter etílico (3x), e posteriormente foi seca no exsicador à temperatura ambiente. Após obtenção da sequência final e acetilação procedeu-se à separação redutora do péptido, Ac-Leu-Aib-Leu-Aib-Phol, da resina Wang. Num balão de 3 entradas, suspendeu-se NaBH4 (5 equiv.) em THF seco (16 mL/g de resina) sob atmosfera de nitrogénio e adicionou-se etanol seco (4 mL/g de resina e LiBr (5 equiv.). Agitou-se vigorosamente a mistura durante 15 min em banho de gelo e mais 15 min à temperatura ambiente. Adicionou-se a resina à mistura anterior e deixou-se em agitação à temperatura ambiente por um período de 24 h. A separação da resina da mistura reacional foi feita através da filtragem para um funil de placa porosa e lavou-se com THF (2x), EtOH (2x) e EtOAc (2x), diretamente para um balão de fundo redondo de 100 mL. Ácido acético foi adicionado gota a gota de forma a eliminar todo o borohidreto presente na mistura. Evaporou-se o solvente sem aquecimento e procedeu-se à extração, utilizando uma combinação de H2O:acetato de etilo:solução saturada de NaCl (3x). Recolheu-se a fase orgânica e secou-se utilizando MgSO4 anidro. Após filtração, o solvente foi evaporado sem aquecimento, à secura. Adicionou-se éter etílico e colocou-se no frio. Centrifugouse a solução até se obter sólido branco. Obteve-se 0,1222 g de péptido, correspondente a um rendimento de 40,6% de sólido branco puro, como confirmado por cromatografia de HPLC usando como eluente ACN/H2O (1:1) com 0,1% de TFA. A estrutura do composto foi confirmada por espetroscopia de 1H RMN. IV. Secção Experimental Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 93 dissolvido em acetona/DMF (2:1) para o CA e DMF/CDCl3 (1:9) para o PCL, e PCL sozinho a 14%wt dissolvido em duas combinações de solventes THF/DMF (1:1) e CDCl3/DMF (9:1). 1.5 Produção de Filmes Poliméricos por Eletrospinning No equipamento de eletrospinning testou-se inicialmente as soluções poliméricas de PCL/CA 12%:10%wt e PCL/CA 14%:10%wt fazendo variar parâmetros como a voltagem, o fluxo, a distância da agulha ao coletor, e o diâmetro interno da agulha. Foram testadas diversas condições com voltagens entre 16-25 kV, fluxos entre 0,4-2 mL/h, distâncias entre 10-20 cm e diâmetros de agulha entre 18-22G.Com as restantes combinações de solução polimérica, foi iniciado um estudo de otimização onde foram testadas diversas condições para se alcançar a formação de fibras (Tabela 13). Tabela 13 - Condições testadas no equipamento eletrospinning para otimização da produção de fibras. Combinação polimérica Voltagem (kV) Fluxo (mL/h) Distância ao coletor (cm) Diâmetro agulha (G) PCL/CA 14%|10% (1:3) 25,0 0,8 18,0 18 PCL/CA 14%|10% (1:3) 29,0 0,8 17,0 PCL/CA 14%|10% (1:3) 25,0 0,8 17,0 PCL/CA 18%|10% (1:3) Não se obteve estabilidade do feixe PCL/CA 14%|10% (1:1) 25,0 2,5 18,0 PCL/CA 14%|10% (1:1) 15,6 1,4 16,0 PCL/CA 14%|10% (1:1) 15,6 2,2 15,0 PCL/CA 14%|10% (1:2) 15,6 2,2 15,0 PCL/CA 14%|10% (1:2) 15,6 2,2 14,5 PCL/CA 14%|10% (1:2) 15,6 1,7 15,0 PCL/CA 14%|10% (3:1) 24,7 3,2 21,0 PCL 14% em THF/DMF 13,0 0,7 16,0 PCL 14% em THF/DMF 13,0 0,7 18,0 PCL 14% em THF/DMF 12,0 0,8 17,0 PCL 14% em CDCl3/DMF 12,0 0,8 17,0 IV. Secção Experimental Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 94 Foram produzidos 3 filmes da combinação PCL/CA 14%:10%wt (3:1) e 5 filmes da combinação PCL 14%wt em CDCl3/DMF com uma duração de 2 h cada. 1.6 Caracterização das Fibras 1.6.1 Tamanho, Porosidade e Morfologia Imagens de microscopia eletrónica de varrimento (SEM) com canhão de emissão de campo (FEG-SEM) foram recolhidas dos filmes de PCL e PCL/CA (NOVA 200 Nano SEM FEI Company) com uma voltagem de aceleração de 10 kV. Os filmes foram inicialmente revestidos com uma película fina (10 nm) de Au-Pd (80-20% em peso) usando um aplicador de alta resolução 208HR (Cressington Company, Watford WD19 4BX, Reino Unido) acoplado a um controlador de espessura de alta resolução (MTM-20 Cressington). A distribuição de diâmetros das fibras obtidas de cada filme foi determinada fazendo 100 medições do diâmetro das fibras em três imagens de cada tipo de composição, simulando a distribuição de diâmetros com uma função log normalizada. As imagens usadas foram as de magnitude de 10.000x e foram processadas com o software ImageJ (versão 1.53). A porosidade dos filmes foi avaliada indiretamente medindo as diferenças de massa antes e depois da imersão em etanol. Amostras de 11 mm de diâmetro, recolhidas de cada combinação de polímero, foram examinadas durante 7 dias de incubação a 37°C (valor de massa constante). A porosidade (ϵ) foi calculada usando a seguinte equação. Em que W2 é o peso antes da imersão em etanol e W1 o peso após imersão. %'𝑃𝑜𝑟𝑜𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 =𝑊!− 𝑊" 𝜌𝑉 ×100 1.6.2 Análise por ATR-FTIR Os grupos químicos característicos dos polímeros foram analisados por ATR-FTIR. Os espectros ATR-FTIR foram desenhados usando um espectrofotómetro IRAffinity-1S, SHIMADZU (Kyoto, Japão), com um cristal de diamante. Aqui, aplicou-se uma resolução espectral de 8 cm-1, para 45 varreduras, numa gama de 4000-400 cm-1. IV. Secção Experimental Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 95 1.6.3 Estabilidade Térmica: Análise por TGA E DSC As propriedades térmicas, incluindo a degradação térmica dos filmes de PCL e PCL/CA, foram analisadas por TGA e DSC. O TGA avaliou as variações de perda de peso com aumento de temperatura na faixa de 25-600°C, a uma taxa de aquecimento de 10°C/min e uma taxa de fluxo de 200 mL/min (atmosfera inerte de nitrogénio) num STA 7200 Hitachi® (Fukuoka, Japão), usando cadinhos de alumínio. A massa inicial de cada amostra era de 5±2 mg. Os resultados foram extrapolados como percentagem de perda de massa vs temperatura. O DSC também foi utilizado para avaliar a estabilidade térmica dos filmes. Aqui, foi usado um DSC 822 Mettler Toledo (Columbus, EUA). Os filmes foram submetidos a uma única etapa de aquecimento de 0-250°C a uma taxa de aquecimento de 10°C/min, sob atmosfera de nitrogénio e um fluxo de 20 mL/min (ambiente inerte). As curvas DSC foram traçadas com fluxo de calor vs temperatura em que os picos exo tem direção para cima. 1.6.4 Medição de Ângulo de Contacto e Energia de Superfície O ângulo de contacto e a energia superficial das superfícies dos filmes PCL e PCL/CA para dH2O (líquido polar), benzeno (líquido apolar) e polietilenoglicol (apolar e polar), foi avaliada usando um equipamento OCA 200 (medição de ângulo de contacto ótico e sistemas de análise de contorno, instrumentos Dataphysics, Filderstadt, Alemanha) juntamente com o Software OCA15 plus (versão 1.2), seguindo o método da gota séssil. O volume das gotas de líquido foi estabelecido em 5 µL. Os valores dos ângulos foram recuperados 8 segundos após o contacto com a superfície. O valor de ângulo de contacto é reportado como a média de 6 valores de ângulos consecutivos na mesma superfície. A energia superficial das superfícies foi calculada aplicando o seguinte conjunto de equações. 114,123 𝜎#= 𝜎# $+ 𝜎% & 𝜎# é o valor total da energia superficial de uma superfície e 𝜎% & e 𝜎# $ são as componentes polar e dispersiva da energia superficial de uma superfície, respetivamente. IV. Secção Experimental Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 96 𝜎'(cos𝜃 + 1) 2( @ 𝜎' $)= ( @ 𝜎# &)( @ 𝜎' &) ( @ 𝜎' $)+ ( @ 𝜎# $) 𝜎' é o valor total da energia superficial de um solvente, 𝜎' & e 𝜎' $ são as componentes polar e dispersiva da energia superficial de um solvente, respetivamente. 1.6.5 Grau de Swelling Amostras secas de 11 mm de diâmetro de cada filme foram cortadas e pesadas (md em mg). De seguida, foram incubadas numa solução de fluido corporal simulado (SBF a pH 7,4) a 37°C por 1, 3 e 7 dias. As amostras foram pesadas após cada intervalo e o grau de hidratação ou swelling (DS) foi calculado como: 𝐷𝑆#(%) = (m w – 𝑚 d ) 𝑚 w ×100 onde mw é o peso húmido da amostra (mg). Os períodos de pesagem foram definidos com o objetivo de garantir a saturação total da superfície. 1.7 Funcionalização das Fibras com Tiger 17C Os filmes PCL e PCL/CA foram funcionalizados com Tiger 17C-NH2 por meio de adsorção física. Amostras de 6 mm de diâmetro foram imersas numa solução de péptido 2xMIC, preparada em dH2O, por 24 h a 37°C e 100 rpm. Esta estratégia e período de imobilização foram selecionados para garantir uma ligação ideal com os filmes, sem risco de perder da configuração cíclica do péptido. Após a incubação, os filmes foram lavados três vezes com PBS, durante 5 min, sob agitação constante de 100 rpm, para remover moléculas de péptido fracamente ligadas. IV. Secção Experimental Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 97 1.8 Avaliação da Atividade Antimicrobiana 1.8.1 Teste de Cinética do Crescimento Microbiano com Fibras funcionalizadas com Tiger 17C Amostras de filmes de 6 mm de diâmetro funcionalizadas com o péptido a 2xMIC foram combinadas com suspensões de S. aureus ajustadas para 1x105 UFC/ mL em TSB. Filmes não modificados foram usados como controlo. Soluções de filme polimérico imobilizado com a bactéria foram incubados a 37°C e 100 rpm, seguindo as diretrizes da norma ASTM-E2149-01. Após 0 (antes da ação do agente), 1, 2, 4, 6 e 24 h de incubação, as bactérias foram diluídas em série (101 a 104 em PBS), cultivadas em placas de TSA e posteriormente incubadas por mais 24 h a 37°C. A atividade antimicrobiana foi apresentada quantitativamente em termos de % de redução bacteriana calculada como a razão entre o número de colónias de bactérias sobreviventes presentes nas placas de TSA, antes e após o contacto com os filmes. A redução logarítmica em relação ao tempo 0 h foi também apresentada. V. Referências Bibliográficas V. Referências Bibliográficas Síntese e aplicação de péptidos antimicrobianos no desenvolvimento de pensos para cicatrização de feridas cutâneas 99 (1) DiMasi, J. A.; Hansen, R. W.; Grabowski, H. G. The Price of Innovation: New Estimates of Drug Development Costs. J. Health Econ. 2003, 22 (2), 151–185. (2) Hernández, H.; Grassano, N.; Tübke, A.; Amoroso, S.; Csefalvay, Z.; and Gkotsis, P. 2019 EU Industrial R&D Investment Scoreboard ; 2020. (3) The Pharmaceutical Industry in Figures ; 2020. (4) Mittal, B. Pharmaceuticals: A Highly Innovative Business. 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