Utilidad de las cadenas ligeras libres en líquido cefalorraquídeo como biomarcador de conversión a esclerosis múltiple clínicamente definida.

I Utilidad de las Cadenas Ligeras Libres en Líquido Cefalorraquídeo como biomarcador de conversión a Esclerosis Múltiple Clínicamente Definida Tesis Doctoral de: Paloma Menéndez Valladares Directoras: María Isabel García Sánchez Carmen Bermudo Guitarte Universidad de Sevilla Facultad de Medicina Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular e Inmunología Sevilla 2017 II III TESIS DOCTORAL Utilidad de las cadenas ligeras libres en líquido cefalorraquídeo como biomarcador de conversión a Esclerosis Múltiple Clínicamente Definida Trabajo realizado por la Licenciada Paloma Menéndez Valladares para optar al grado de Doctor en Bioquímica por la Universidad de Sevilla Directoras de tesis Dra. María Isabel García Sánchez Dra. Carmen Bermudo Guitarte Tutor de tesis Dr. Víctor Sánchez Margalet Universidad de Sevilla Facultad de Medicina Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular e Inmunología Programa de Doctorado de Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica Sevilla, 2017 IV V Doña María Isabel García Sánchez, Doctora en Ciencias Químicas y Coordinadora del Nodo Biobanco Hospitalario Virgen Macarena de Sevilla, Certifica que: Doña Paloma Menéndez Valladares, Licenciada en Química y en Bioquímica, y Especialista en Bioquímica Clínica, ha realizado el trabajo titulado: “Utilidad de las cadenas ligeras libres en líquido cefalorraquídeo como biomarcador de conversión a Esclerosis Múltiple Clínicamente Definida”, en la Unidad de Gestión Clínica de Bioquímica Clínica del Hospital Universitario Virgen Macarena de Sevilla, y en el Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular e Inmunología de la Facultad de Medicina, en la Universidad de Sevilla bajo mi dirección. Considero que dicho trabajo reúne los méritos suficientes para ser sometido a juicio del tribunal correspondiente en la Facultad de Medicina de la Universidad de Sevilla para optar al grado de Doctora. Y para que conste, firmo el presente certificado, en Sevilla a 28 de Junio de 2017. Fdo.: María Isabel García Sánchez VI VII Doña Carmen Bermudo Guitarte, Doctora en Medicina y Jefa de Sección en la Unidad de Gestión Clínica de Bioquímica Clínica del Hospital Universitario Virgen Macarena de Sevilla, Certifica que: Doña Paloma Menéndez Valladares, Licenciada en Química y en Bioquímica, y Especialista en Bioquímica Clínica, ha realizado el trabajo titulado: “Utilidad de las cadenas ligeras libres en líquido cefalorraquídeo como biomarcador de conversión a Esclerosis Múltiple Clínicamente Definida”, en la Unidad de Gestión Clínica de Bioquímica Clínica del Hospital Universitario Virgen Macarena de Sevilla, y en el Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular e Inmunología de la Facultad de Medicina, en la Universidad de Sevilla bajo mi dirección. Considero que dicho trabajo reúne los méritos suficientes para ser sometido a juicio del tribunal correspondiente en la Facultad de Medicina de la Universidad de Sevilla para optar al grado de Doctora. Y para que conste, firmo el presente certificado, en Sevilla a 28 de Junio de 2017. Fdo.: Carmen Bermudo Guitarte VIII IX Don Víctor Sánchez Margalet, Doctor en Medicina, Catedrático del Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular e Inmunología de la Universidad de Sevilla, y Facultativo Especialista en Área de Bioquímica Clínica del Hospital Universitario Virgen Macarena de Sevilla, Certifica que: Doña Paloma Menéndez Valladares, Licenciada en Química y en Bioquímica, y Especialista en Bioquímica Clínica, ha realizado el trabajo titulado: “Utilidad de las cadenas ligeras libres en líquido cefalorraquídeo como biomarcador de conversión a Esclerosis Múltiple Clínicamente Definida”, en la Unidad de Gestión Clínica de Bioquímica Clínica del Hospital Universitario Virgen Macarena de Sevilla, y en el Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular e Inmunología de la Facultad de Medicina, en la Universidad de Sevilla bajo mi tutela. Considero que dicho trabajo reúne los méritos suficientes para ser sometido a juicio del tribunal correspondiente en la Facultad de Medicina de la Universidad de Sevilla para optar al grado de Doctora. Y para que conste, firmo el presente certificado, en Sevilla a 28 de Junio de 2017. Fdo.: Víctor Sánchez Margalet XVI Ampliación del estudio………………………………………………………………………..68 Obtención, procesamiento y almacenamiento de las muestras…………………..….69 Parámetros de laboratorio…………………………………………………………….…….………...70 Cuantificación de cadenas ligeras libres en LCR y en suero Nefelometría…………………….………………………………………....………….70 Turbidimetría…………………………………………………………………………..80 Determinaciones previas al estudio Determinación de bandas oligoclonales......................................86 Determinación del Índice de IgG (Índice de Tibbling)…………. …..87 Parámetros clínicos………………………………………………………………………...……..………87 Resonancia magnética…………………………………………………………………………87 Escala Expandida del Estado de Discapacidad (EDSS).............................88 Estadística………………………………………………………………………………………………..…….88 RESULTADOS………………………………………………………………………………………………………………91 Estudio piloto…...................................................................................................92 Primera búsqueda de un punto de corte de conversión de SNA a EM…...99 Segunda búsqueda de un punto de corte de conversión de SNA a EM…104 Tercera búsqueda de un punto de corte de conversión de SNA a EM.…108 Correlación del índice kappa con el estadío EDSS...................................115 Correlación del índice kappa con otros parámetros estudiados.......…….118 Correlación del índice kappa con el tratamiento del paciente……...……..121 Estudio de validación del índice kappa………………………………………………………….123 Utilidad clínica del índice kappa………………………………………….....…………………….127 XVII DISCUSIÓN…………………………..…………………………………………………………………………………..130 Características de los pacientes………………………………………………………………….…132 Evaluación de las CLL kappa y lambda en LCR, y sus respectivos índices……….134 Correlación del índice kappa con el estadío EDSS………………………………………...147 Correlación del índice kappa con otros parámetros estudiados………………….…148 Correlación del índice kappa con el tratamiento del paciente……………………….148 Validación del índice kappa………………………………………………………………….……….149 Utilidad clínica del índice kappa……………………………………………………………………150 Consideraciones finales y perspectivas futuras……………………………………………..151 CONCLUSIONES………………………………………………………………………………………………………..153 BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………………………………..…………156 ANEXOS……………………………………………………………………………………………………………….…..173 ANEXO 1. Formulario de información y consentimiento informado escrito para donación de muestras biológicas al biobanco para investigación biomédica…………...174 ANEXO 2. Documento de aprobación del “Comité de Ética de la Investigación de Centro Hospital Universitario Virgen Macarena”……………………………………………….…….185 ANEXO 3. Documento de aprobación del “Comité de Ética de la Investigación de los Hospitales Universitarios Virgen Macarena y Virgen del Rocío”………………………….188 ANEXO 4. Artículos publicados………………………………………………………………..………..193 Comunicaciones a congresos……………………………………………………..……..195 Otros méritos…………………………………………………………………………………….197 XVIII ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Mapa de prevalencias por país (2013) Figura 2. Incidencia de EM en hombres y en mujeres en un periodo de 20 años en el distrito norte de Sevilla Figura 3. Incidencia de EM en hombres y en mujeres en incrementos de 5 años durante un periodo de 20 años en el distrito norte de Sevilla Figura 4. Diferencia entre un axón en una neurona normal y el de un paciente con EM Figura 5. Esquema de la conducción nerviosa en una fibra nerviosa Figura 6. Patrones de evolución de la EM Figura 7. Principales síntomas presentes en la EM Figura 8. Escala de discapacidad de Kurtzke (EDSS) Figura 9. Algoritmo de tratamiento en pacientes con EMRR Figura 10. Eficacia y seguridad de los fármacos empleados en EM Figura 11. Mecanismo de actuación de los LT en la patogénesis de la EM Figura 12. Estructura de una Ig Figura 13. Estructura de una Ig y de las CLL  y  Figura 14. Construcción de cadenas ligeras Figura 15. Producción de CLL Figura 16. Mecanismo físico del isoelectroenfoque Figura 17. Patrones de bandas BOCG Figura 18. Fórmula descrita por Tourtellotte XIX Figura 19. Reibergrama Figura 20. Reibergrama, resultados obtenidos en 2 pacientes, un sujeto sano y uno con EM Figura 21. Reibergrama para IgG Figura 22. Esquema de un detector turbidimétrico y de un nefelómetro Figura 23. Mecanismo de las técnicas nefelométricas Figura 24. Representación gráfica de la curva de calibración obtenida para la determinación de los valores de CLL  en el BNII™ Figura 25. Representación gráfica de la curva de calibración obtenida para la determinación de los valores de CLL  en el BNII™ Figura 26. Gráfico de Levey-Jennings para los controles QC1 (nivel bajo) de CLL  en el BNII™ Figura 27. Gráfico de Levey-Jennings para los controles QC2 (nivel alto) de CLL  en el BNII™ Figura 28. Gráfico de Levey-Jennings para los controles QC1 (nivel bajo) de CLL  en el BNII™ Figura 29. Gráfico de Levey-Jennings para los controles QC2 (nivel alto) de CLL  en el BNII™ Figura 30. Representación gráfica de la curva de calibración obtenida para la determinación de los valores de CLL  en el SpaPlus® Figura 31. Gráfico de Levey-Jennings para los controles QC1 (nivel bajo) de CLL  en el SpaPlus® Figura 32. Gráfico de Levey-Jennings para los controles QC2 (nivel alto) de CLL  en el SpaPlus® XX Figura 33. Diagrama de cajas para las CLL kappa en LCR Figura 34. Diagrama de cajas para las CLL lambda en LCR Figura 35. Diagrama de cajas para el índice kappa Figura 36. Diagrama de cajas para el índice lambda Figura 37. Representación de las medianas del índice kappa y del índice lambda Figura 38. Histograma para las CLL kappa en LCR Figura 39. Histograma para las CLL kappa en LCR del grupo control con HN Figura 40. Representación de la curva de supervivencia mediante el análisis Kaplan- Meier de los pacientes con Síndrome Neurológicamente Aislado Figura 41. Comparación de curvas ROC para el índice IgG, CLL  en LCR, y CLL  en LCR Figura 42. Comparación de curvas ROC para el índice kappa, y para el índice lambda Figura 43. Representación de la curva de supervivencia mediante el análisis Kaplan- Meier de los pacientes con Síndrome Neurológicamente Aislado (índice kappa) Figura 44. Representación de la curva de supervivencia mediante el análisis Kaplan- Meier de los pacientes con Síndrome Neurológicamente Aislado Figura 45. Representación gráfica de los pacientes según el punto de corte del índice kappa de 10,62 frente a la escala de discapacidad EDSS Figura 46. Diagrama de sectores de los pacientes según el punto de corte del índice kappa de 10,62 frente a la escala de discapacidad EDSS Figura 47. Diagrama de cajas para el índice kappa según el momento de la punción lumbar XXI Figura 48. Diagrama de cajas para el índice kappa según el momento de la punción lumbar y la conversión a EM Figura 49. Diagrama de cajas para el índice kappa según el tratamiento del paciente Figura 50. Curva ROC para el índice kappa en el equipo SpaPlus® Figura 51. Curva SROC Figura 52. Representación forest plot de la sensibilidad Figura 53. Representación forest plot de la especificidad Figura 54. Representación forest plot de la odds ratio diagnóstica XXII ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Criterios de Poser (1983) Tabla 2. Criterios de McDonald 2001 Tabla 3. Evolución de los criterios de McDonald desde 2001 a 2010 Tabla 4. Fármacos empleados en el manejo de la diversa sintomatología de la EM Tabla 5. Características de cada grupo de estudio: grupo control y grupo casos Tabla 6. Características de cada grupo de estudio Tabla 7. Datos obtenidos para la calibración de CLL  en el BNII™ Tabla 8. Datos obtenidos para la calibración de CLL  en el BNII™ Tabla 9. Datos obtenidos para los controles procesados en el equipo en el BNII™ Tabla 10. Rangos de medición para las CLL según la dilución de la muestra en el BNII™ Tabla 11. Estudio de precisión para CLL en suero para el equipo de medición BNII™ proporcionado por el fabricante Tabla 12. Estudio de precisión para CLL en LCR para el equipo de medición BNII™ proporcionado por el fabricante Tabla 13. Datos obtenidos para los controles procesados en el en el SpaPlus® Tabla 14. Estudio de precisión para CLL en suero para el equipo de medición SpaPlus® proporcionado por el fabricante Tabla 15. Estudio de precisión para CLL en LCR para el equipo de medición SpaPlus® proporcionado por el fabricante Tabla 16. Características basales de los pacientes del estudio piloto XXIII Tabla 17. Datos de laboratorio y clínicos para pacientes con síndrome neurológicamente aislado empleando un punto de corte para las CLL  en LCR de 0,38 mg/L Tabla 18. Datos extraídos del análisis de las curva ROC para las variables CLL  y  en LCR, y el índice IgG Tabla 19. Datos de laboratorio y clínicos para pacientes con síndrome neurológicamente aislado empleando un punto de corte para las CLL  en LCR de 0,73 mg/L Tabla 20. Datos extraídos del análisis de las curva ROC para los índices kappa y lambda Tabla 21. Datos de laboratorio y clínicos para pacientes con síndrome neurológicamente aislado empleando un punto de corte para el índice kappa de 10,62 Tabla 22. Datos de laboratorio y clínicos para pacientes con síndrome neurológicamente aislado empleando un punto de corte para el índice lambda de 1,77 Tabla 23. Análisis de las tablas de contingencia para BOCG y BTC; y análisis multivariante combinando BTC con BOCG, y BTC con el índice kappa Tabla 24. Pacientes del estudio piloto agrupados de acuerdo al nivel de discapacidad según la escala EDSS Tabla 25. Datos extraídos del análisis de las curva ROC para la variable índice kappa en el equipo SpaPlus® Tabla 26. Datos de laboratorio y clínicos para pacientes con sospecha de síndrome neurológicamente aislado empleando un punto de corte para el índice kappa de 12,33 Tabla 27. Datos de laboratorio y clínicos para todos los pacientes estudiados empleando el punto de corte para el índice kappa de 12,33 Tabla 28. Edad y sexo de los pacientes con EM en aquellos artículos en los que se hace referencia al índice kappa XXIV Tabla 29. Punto de corte para las CLL  en LCR, sensibilidad y especificidad que predice conversión a Esclerosis Múltiple en los diferentes estudios publicados hasta la fecha Tabla 30. Descripción de las características clínicas de los pacientes en aquellos artículos en los que se hace referencia al índice kappa en pacientes con sospecha de Esclerosis Múltiple Tabla 31. Punto de corte para el índice kappa, sensibilidad y especificidad que predice conversión a Esclerosis Múltiple en los diferentes estudios publicados hasta la fecha Tabla 32. Punto de corte para el índice lambda, sensibilidad y especificidad que predice conversión a Esclerosis Múltiple en los diferentes estudios publicados hasta la fecha Tabla 33. Datos de la odds ratio diagnóstica XXV ABREVIATURAS ABC: área bajo la curva AEM: Agencia Europea del Medicamento AQP4: Aquaporina-4 BBSSPA: Biobanco del Sistema Sanitario Público de Andalucía BHE: Barrera Hematoencefálica BOC: Bandas Oligoclonales BOCG: Bandas Oligoclonales IgG BTC: criterios de Barkhof-Tintoré CLL: Cadenas Ligeras Libres CLSI: Clinical & Laboratory Standards Institute CPAs: Células Presentadoras de Antígeno CV: Coeficiente de Variación DLE: Difusión Lesiones en la materia blanca del cerebro en el Espacio DLT: Difusión Lesiones en la materia blanca del cerebro en el Tiempo DS: Desviación Estándar EAE: Encefalomielitis Autoinmune Experimental EACA: ácido E-amino-n-caproico ELA: Esclerosis Lateral Amiotrófica EDSS: Expanded Disability Status Scale (Escala Expandida del Estado de Discapacidad) EM: Esclerosis Múltiple EMCD: Esclerosis Múltiple Clínicamente Definida EMCP: Esclerosis Múltiple Clínicamente Probable EMPP: EM Primaria Progresiva EMPR: EM Progresiva Recurrente 4 ralentiza la progresión de la enfermedad y, por lo tanto, disminuye los costes y cargas asociadas a los niveles de mayor discapacidad de la EM. El objetivo de esta tesis ha sido evaluar la utilidad clínica del biomarcador kappa en la conversión de pacientes con SNA a EM empleando para ello el índice kappa. En este trabajo se ha evaluado el valor diagnóstico predictivo que presentan los niveles altos de CLL  y en LCR, y sus respectivos índices, y se ha relacionado con los parámetros clínicos y paraclínicos empleados actualmente en el diagnóstico de la EM. 5 6 INTRODUCCIÓN 7 INTRODUCCIÓN 1. ASPECTOS HISTÓRICOS Los principios de la esclerosis múltiple (EM) en el campo de la medicina se remontan a mediados del siglo XIX. Robert Carswell y Jean Cruveilhier, ambos patólogos e ilustradores describieron sus observaciones acerca de las lesiones patológicas de la EM, que quedaron reflejadas en sus ilustraciones. Robert Carswell ilustró en su atlas Pathological anatomy: illustrations of the elementary forms of disease (1838) dos casos de lesiones de médula espinal con atrofia, características de la EM. Jean Cruveilhier no sólo se limitó a ilustrar sus hallazgos, sino que también incluyó datos clínicos de los pacientes, resaltando la importancia de relacionar los hallazgos de la autopsia con la clínica. Es en el libro Atlas d’Anatomie Pathologique de Jean Cruveilhier (1835-1842) donde se menciona por primera vez la esclerosis en placas diseminadas (sclérose en plaques disseminées) y donde se utiliza por primera vez el término grise masses disseminées (materia gris dispersa). Jean-Martin Charcot (1825-1893), reconocido como el padre de la neurología por sus trabajos en La Salpetrière (Paris) fue el primero en reconocer la EM como una enfermedad, estableciendo correlaciones clínico-anatomopatológicas. Charcot describe en Leçons sur les maladies du systéme nerveux (1888) algunos de los elementos que son considerados en la actualidad distintivos de la sintomatología de EM: vértigo, trastornos visuales, paresias y alteraciones de la sensibilidad. En definitiva, Charcot es consciente en esa época tanto de los síntomas que presentan los pacientes como del transcurso de la enfermedad con recaídas y remisiones (Charcot JM, 1888; Villoslada P, 2010). A pesar de que a mediados del siglo XIX ya se conocía la sintomatología de la EM, apenas se tenían conocimientos de su patogenia. A ello contribuirían los futuros 8 avances en el campo de la tecnología y el mayor conocimiento del sistema inmune. En esta época coexistían dos hipótesis que trataban de explicar la patogenia de la EM: por un lado una etiología neurodegenerativa (sostenida por Charcot, Muller y Strumpell), mientras que por otro se sostenía que los cambios iniciales se debían a compromisos de los vasos sanguíneos e inflamación (Rindfleish, Williamson y Dejerine). Rindfleish concluyó en sus estudios que las placas de EM eran secundarias a inflamación crónica (Villoslada P, 2010). Strumpell por el contrario creía en la teoría de un supercrecimiento glial asociado a fenómenos precipitantes (tóxicos o infecciosos). En 1884, Pierre Marie, contribuyó al estudio de la EM documentando el curso clínico de la enfermedad. Incluyó por primera vez la EM benigna e hizo una distinción entre las formas progresiva primaria y progresiva secundaria. Thomas Rivers estableció en 1935 la EM como una enfermedad autoinmune, mediante la producción de encefalitis alérgica experimental por inoculación de tejido neural en monos. Kabat y cols identificaron en 1942 proteínas anormales en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de personas con EM, mediante el estudio de patrones conocidos como bandas oligoclonales (BOC). Estos descubrimientos permitieron evidenciar el gran papel que juega el sistema inmune en la EM (Moreira MA, 2002). 2. DEFINICIÓN DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE La EM es una enfermedad crónica autoinmune del sistema nervioso central (SNC), que se caracteriza por inflamación, desmielinización y daño axonal. Afecta a adultos jóvenes de entre 20-40 años, siendo más común en mujeres en una proporción 3:1. La etiología de la EM es desconocida, se encuentran implicados factores ambientales (infecciones, latitud, etc.), genéticos, e inmunológicos. Es la principal causa de discapacidad neurológica no traumática en adultos jóvenes, con un gran impacto negativo en su calidad de vida (Izquierdo G, 2015). 9 Europa es considerada una región de alta prevalencia de EM a nivel global (mapa de prevalencias mundial mostrado en figura 1), dado que presenta a más de la mitad de la población diagnosticada con EM, con una prevalencia general ≥ 30/100.000. No todas las regiones Europeas se ven afectadas de igual forma, existiendo grandes diferencias entre ellas. Se ha determinado que la incidencia varía de < 1/100.000 a >10/100.000 (Kingwell E, 2013). Se ha sugerido a nivel global, que existe una asociación entre la distribución de la EM y la latitud (menor prevalencia de EM en el sur respecto al norte), a excepción de Italia y el norte de Escandinavia (Simpson S, 2011). Figura 1. Mapa de prevalencias por país (2013). Se estima que 2,3 millones de personas en el mundo presentan EM (2013). España es uno de los países con mayor prevalencia de EM a nivel global. Extraído de “Atlas of MS 2013. Multiple Sclerosis International Federation”. En España, más en concreto en el distrito norte de Sevilla (entre las latitudes 37,24 y 38,19), en un estudio longitudinal desarrollado en un periodo de 20 años (desde enero de 1991 a diciembre de 2011), se determinó una prevalencia de EM de 90,2/100.000 habitantes; y una incidencia de 4,6/100.000 habitantes; también se concluyó que durante los 20 años incluidos en el estudio, la incidencia se había incrementado en mujeres pero no en hombres (Figuras 2 y 3). También se observó que la mayoría de pacientes fueron diagnosticados con edades situadas en la década de los 30 años, con una relación mujer/hombre de 2,5:1 (Izquierdo G, 2015). Número de personas con EM por cada 100,000 habitantes >100 60-100 20-60 5-20 0-5 Sin datos P 10 Figura 2. Incidencia de EM en hombres y en mujeres en un periodo de 20 años (desde enero de 1991 a diciembre de 2011) en el distrito norte de Sevilla (España) (Izquierdo G, 2015). Figura 3. Incidencia de EM en hombres y en mujeres en incrementos de 5 años durante un periodo de 20 años (desde enero de 1991 a diciembre de 2011) en el distrito norte de Sevilla (España) (Izquierdo G, 2015). Número de pacientes con EM por cada 100,000 habitantes Mujeres Hombres Lineal (Mujeres) Lineal (Hombres) Mujere s Hombres Incidencia de EM 11 3. FISIOPATOLOGÍA Los investigadores siguen tratando de comprender la patogénesis de la EM para poder prevenir así su progresión. Se cree que la EM es una patología mediada por el sistema inmune que se presenta fundamentalmente en individuos susceptibles genéticamente. Los familiares de primer grado de un paciente con EM, tienen un riesgo de desarrollar EM menor al 5%. Pero si esto se extrapola a la población general, estos familiares directos de los individuos con EM, presentan un riesgo relativo entre 20-40 veces superior a la población general. Se cree que son varios mecanismos patogénicos los implicados en la EM, dada la heterogeneidad de manifestaciones clínicas, genéticas y de imágenes en las pruebas de resonancia magnética (RM) que contribuyen a la EM. La principal característica patológica de la enfermedad es la placa de EM, la cual se observa en el análisis macroscópico del cerebro, como un área hipocelular bien delimitada, localizada en la sustancia blanca, rosada, que contrasta con la sustancia blanca preservada. La placa de EM se caracteriza por la pérdida de mielina, relativa preservación de los axones y la formación de cicatrices astrocíticas. Las placas suelen ser pequeñas, redondeadas u ovoideas, aunque con frecuencia presentan extensiones con forma de dedo a lo largo de los pequeños o medianos vasos sanguíneos (dedos de Dawson). Estas placas de EM pueden ser de tres tipos: placas agudas, placas crónicas activas y placas crónicas inactivas. Las placas agudas se caracterizan por la presencia de un infiltrado inflamatorio perivascular con un área de desmielinización y pérdida axonal a su alrededor; por lo general son de pequeño tamaño, centradas en el vaso con el infiltrado inflamatorio. Aunque se localizan frecuentemente en el espacio perivascular, las células inflamatorias también penetran en el parénquima, aunque con menor densidad. La composición del infiltrado inflamatorio varía de acuerdo al estadío de actividad desmielinizante. Lo habitual es la presencia de linfocitos y macrófagos. Estos últimos predominan en las lesiones activas, determinadas por la identificación de productos de degradación de mielina en los macrófagos. Se observa que la frecuencia de placas 12 activas en los pacientes con EM es muy baja. Esto se debe probablemente a que el infiltrado inflamatorio es un fenómeno de corta duración (alrededor de un mes), que además se presenta en las fases iniciales de la EM, en las que es difícil observarlas (la mayoría de estudios se han realizado en autopsias de pacientes con formas progresivas). Las placas crónicas activas suelen ser de mayor tamaño que las placas agudas. Se caracterizan por presentar en el borde de las mismas un límite bien delimitado de desmielinización activa, con presencia de mielina alterada y macrófagos. Esto indica un crecimiento centrífugo de las placas en su periferia. En estas placas no se observan infiltrados inflamatorios perivasculares, y el proceso de desmielinización es completo a excepción de los bordes. Las placas crónicas inactivas suelen ser extensas y confluir con placas vecinas. Se caracterizan por una desmielinización completa, una densidad de axones escasa y un reducido número de oligodendrocitos. A diferencia de las placas crónicas activas, los bordes están bien delimitados, pero no se observa desmielinización activa en ellos. A estas placas también se les conoce como placas glióticas, debido a la abundante presencia de astrocitos en las mismas. Las lesiones producidas en las placas de EM tienen una predilección por los nervios ópticos, la materia blanca periventricular, el tronco encefálico, el cerebelo y la médula espinal (Noseworthy JH, 2000; Villoslada P, 2010). A escala microscópica, se observan en la placa de EM tres alteraciones típicas:  infiltrados inflamatorios perivasculares  desmielinización  pérdida axonal La presencia de infiltrados inflamatorios y la ausencia de patógenos es lo que define la EM como una enfermedad de carácter autoinmune. Los bordes de las placas crónicas pueden aumentar su extensión al seguir creciendo. En ellos se observan macrófagos con restos de mielina, ocasionalmente linfocitos T (LT), y raramente 13 linfocitos B (LB). En los infiltrados predominan los linfocitos CD3+ y macrófagos hematógenos. También se han encontrado abundantes linfocitos CD4+, aunque los linfocitos predominantes son los linfocitos CD8+ (Villoslada P, 2010). La desmielinización consiste en la presencia de axones sin las características vainas densas de mielina (Figura 4 y 5). Sin la vaina de mielina, la membrana axonal queda expuesta generando cambios en el potencial de acción de membrana y en la distribución de canales iónicos. El impulso nervioso se transmite de forma saltatoria entre nódulos de Ranvier, lo que permite una elevada velocidad de conducción. En las situaciones en las que esta vaina de mielina es escasa o nula, como es el caso de la EM, el impulso nervioso se transmite a una velocidad más lenta (Martínez-Altarriba MC, 2015). Se puede observar la desmielinización a nivel histológico mediante la tinción de Luxor-fast blue, o mediante inmunohistoquímica con anticuerpos específicos para las proteínas de la mielina [proteína básica de mielina (PBM), glicoproteína de mielina de oligodendrocitos (GMO), nucleótido cíclico fosfodiesterasa (NCF)]. También se estudia la desmielinización mediante microscopía electrónica. En la lesión aguda la mielina se presenta desestructurada y vesiculizada. Existe una correlación entre la desmielinización activa y la presencia de macrófagos. Sin embargo, no existe relación entre la presencia de infiltrados linfocitarios y desmielinización. Se ha observado desmielinización activa en áreas sin presencia de linfocitos B o T. Esto indica que existen otros mecanismos patogénicos diferentes a la respuesta inmune adaptativa. Los pacientes con EM presentan diferencias notables en cuanto a la patogénesis de la destrucción de mielina (Henderson AP, 2009). 20 afecta a más de un tercio del total de pacientes, siendo notable en etapas iniciales de la EM. Se observa déficit de atención, deterioro de la memoria, alteraciones del razonamiento abstracto y procesado lento de la información. Otro síntoma frecuente es la depresión (Villoslada P, 2010). Para cuantificar la discapacidad de los pacientes con EM se han desarrollado diversos instrumentos en las últimas décadas, que además han servido de herramienta para evaluar la efectividad de las intervenciones terapéuticas. El instrumento más popular y más ampliamente empleado por los clínicos es la Expanded Disability Status Scale (EDSS) de Kurtzke (Kurtzke JF, 1983). Emplea una escala ordinal que va del 0 (normal) al 5-6 (máxima discapacidad), dividida por sistemas funcionales en 8 grupos: 1. Función piramidal 2. Función cerebelosa 3. Función del tronco cerebral 4. Función sensitiva 5. Función visual 6. Función intestinal y vesical 7. Función cerebral (cognitiva) 8. Otras funciones Tras la evaluación el resultado se engloba en una escala que va de 0 (normal) a 10 (muerte por EM). Actualmente se emplea la escala ampliada en la que cada escalón se divide en dos (0, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5,…, 10) (Figura 8). Valores de EDSS 4-6 afectan a la capacidad de andar (Meyer-Moock S, 2014; Villoslada P, 2010). 21 Figura 8. Escala de discapacidad de Kurtzke: Expanded Disability Status Scale (EDSS). La escala va de 0 (normal) a 10 (muerte por EM) con divisiones de 0.5 a partir de 1. 5. DIAGNÓSTICO El diagnóstico de la EM es fundamentalmente clínico, y se basa en demostrar la presencia de síntomas y signos relacionados con la difusión de las lesiones en la materia blanca del cerebro en el espacio (DLE) y en el tiempo (DLT). Se realiza un diagnóstico diferencial que permite excluir otras enfermedades con una clínica similar a la EM, como podría ser la presencia de otras enfermedades desmielinizantes. Además de los aspectos clínicos, los profesionales se apoyan en los métodos de RM, en el estudio del LCR, y de los potenciales evocados (PE). Mediante las técnicas de RM es posible detectar y demostrar las lesiones en la materia blanca del cerebro. El análisis del LCR es clave en la confirmación del diagnóstico definitivo, puesto que apoya los hallazgos encontrados en la clínica del paciente. Se ha encontrado en el análisis de LCR de pacientes con EM niveles elevados de inmunoglobulinas, así como la presencia de BOC en más del 90 % de los pacientes. El estudio electrofisiológico de los PE se emplea para medir la capacidad de respuesta del SNC a los estímulos visuales, somatosensoriales y auditivos. Las latencias retardadas, así como los tiempos prolongados de conducción motora central son característicos de los procesos de desmielinización, pudiendo indicar lesiones clínicamente silenciosas. 1.0-1.5 0 2.0-2.5 3.0-3.5 4.0-4.5 5.0-5.5 6.0-6.5 7.0-7.5 8.0-8.5 9.0-9.5 10.0 22 Dada la heterogeneidad de síntomas, comienzo y desarrollo de la enfermedad, el diagnóstico no es sencillo. Actualmente, no existe una única característica clínica o test diagnóstico capaz de diagnosticar la EM (Milo R, 2014). Se han propuesto diferentes conjuntos de criterios para el diagnóstico de la EM, en los que se incluyen características clínicas y paraclínicas. Los primeros intentos de establecer unos criterios se remontan a 1965, “Criterios de Schumacher”, con la introducción de los fundamentos de DLE y DLT. Estos criterios especifican que la presencia exclusiva de síntomas no es suficiente para el diagnóstico, y se diagnosticará como EM cuando los signos y síntomas presentados, no puedan ser explicados por otra enfermedad. Estaba restringido a pacientes entre 10-50 años (Shumacher FA, 1965). Los siguientes criterios propuestos fueron los “Criterios de Poser” en 1983 (Tabla 1). En ellos se incluyó el estudio de los PE y del LCR, como apoyo a los criterios de RM. Los pacientes estaban divididos en 2 grupos, posibles y probables. Cada criterio consistía en dos subgrupos principales de pruebas clínicas y de laboratorio con evidencias fundamentadas (Poser CM, 1983). 23 Categoría Número de brotes Evidencia clínica Evidencia Paraclínica BOCG LCR o índice IgG A) EM Clínicamente definida (EMCD) EMCD A1 2 2 EMCD A2 2 1 y 1 B) EM Definida apoyada por el laboratorio (EMALD) EMALD B1 2 1 o 1 + EMALD B2 1 2 + EMALD B3 1 1 y 1 + C) EM Clínicamente probable (EMCP) EMCP C1 2 1 EMCP C2 1 2 EMCP C3 1 1 y 1 D) EM probable apoyada por el laboratorio (EMALP) EMALP D1 2 + Tabla 1. Criterios de Poser (1983) en los que se incluye el estudio del LCR; se define un “BROTE” como la presencia de un síntoma de disfunción neurológica de más de 24 horas de duración; Evidencia clínica: signos de disfunción neurológica demostrables; Evidencia paraclínica: tomografía computarizada o RM, potenciales evocados; BOCG LCR (bandas oligoclonales IgG en LCR), o IgG (síntesis intratecal de IgG) (Poser CM, 1983). 24 Los criterios de Poser fueron evaluados en posteriores estudios, empleando casos confirmados de EM. Se demostró que eran sensibles en etapas tempranas de la enfermedad con una precisión para la EMCD del 94% (485/518). Mientras que para la Esclerosis Múltiple Clínicamente Probable (EMCP) la precisión fue del 66%. Ello puede deberse a un examen incompleto de los nervios ópticos, generando un diagnóstico incorrecto de falsos negativos (Izquierdo G, 1985; Engell T, 1988). Los criterios de Poser fueron ampliamente aceptados durante la década de los 90. El Grupo de Trabajo Internacional de la EM liderado por el Dr. Ian McDonald modificó los criterios y recomendaciones de Poser, que se recogen en los criterios de McDonald de 2001 (Tabla 2) (McDonald WI, 2001). Con estos criterios se consiguió un diagnóstico temprano de EM en muchos casos de pacientes con SNA, presentando una especificidad del 83%, una sensibilidad del 83%, un valor predictivo positivo (VPP) del 75%, y un valor predictivo negativo (VPN) del 89% para la conversión de SNA a EM (Dalton CM, 2002). En resumen, los criterios de McDonald de 2001 definen la presencia de DLE por el cumplimiento de al menos tres de los cuatro criterios de Barkhof-Tintoré (BTC) o por la presencia de al menos dos lesiones en RM junto con síntesis intratecal de IgG (Barkhof F, 1997; Tintoré M, 2000). 25 Presentación Clínica Datos adicionales necesarios para el diagnóstico de EM Dos o más brotes; evidencia clínica objetiva de 2 o más lesiones Ninguno Dos o más brotes; evidencia clínica objetiva de 1 lesión - Diseminación en el espacio (DLE) en RM o - 2 o más lesiones en RM consistentes con EM, y LCR positivo o - Futuros brotes clínicos en diferente localización Un brote; evidencia clínica objetiva de 2 o más lesiones - Diseminación en el tiempo (DLT) en RM o - Segundo brote clínico Un brote; evidencia clínica objetiva de 1 lesión (síndrome neurológico aislado) - DLE en RM o - 2 o más lesiones en RM consistentes con EM, y LCR positivo; junto con DLT en RM o - Segundo brote clínico Progresión neurológica insidiosa sugestiva de EM Presencia de LCR positivo (BOCG positivas, realizadas preferentemente mediante isoelectroenfoque) junto con: - DLE en RM demostrada por: o 9 o más lesiones cerebrales en T2 o 2 o más lesiones en médula espinal o 4-8 lesiones cerebrales y 1 lesión de médula espinal o - PE positivos con 4-8 lesiones en RM, o con menos de 4 lesiones y 1 lesión de la médula espinal; junto con DLT en RM o - Progresión continuada por 1 año Tabla 2. Criterios de McDonald 2001 (McDonald WI, 2001). 26 La primera revisión de los criterios de McDonald se realizó en 2005. Esta revisión permitió mejorar la sensibilidad y precisión diagnóstica respecto a los criterios de McDonald originales, en la conversión de SNA a EM (Swanton JK, 2006). Para determinar las lesiones DLE se mantenían los requerimientos iniciales del cumplimiento de tres de los cuatro criterios de BTC, mientras que para las lesiones DLT se simplificaron los criterios de RM. Asimismo, las lesiones de la médula espinal adquirieron mayor importancia. El estudio del LCR fue reducido a los pacientes con EMPP (Polman CH, 2005). En 2010, se realizó una nueva revisión de los criterios de McDonald, realizada por el Grupo de Trabajo Internacional de la EM, en la que se mantenía la sensibilidad y especificidad respecto a los criterios previos. En esta revisión, los criterios para DLE fueron simplificados, y los criterios para DLT se modificaron. Además, se excluyó el estudio del LCR para el diagnóstico de EMRR (Tabla 3). Sin embargo, se afirma que la presencia de LCR positivo (Indice IgG elevado o presencia de BOCG) puede servir de apoyo para evaluar diagnósticos alternativos, y para predecir EMCD. Concluyen en la necesidad de realizar más estudios combinados de RM y BOCG para evaluar el valor diagnóstico del LCR (Polman CH, 2011; Milo R, 2014). 27 Criterios de McDonald 2001 2005 2010 Criterios de RM para DLE ≥3 de las siguientes: • ≥9 lesiones en T2 • ≥3 lesiones periventriculares • ≥1 lesión yuxtacortical • ≥1 lesión infratentorial ≥3 de las siguientes: • ≥9 lesiones en T2 • ≥3 lesiones periventriculares • ≥1 lesión yuxtacortical • ≥1 lesión infratentorial ≥1 lesión en T2 en ≥2 de las siguientes áreas: • Periventricular • Yuxtacortical • Infratentorial • Médula espinal Criterios de RM para DLT ≥3 meses después de debut de SNA ≥1 lesión nueva en T2 ≥3 meses después de brote de SNA ≥3 meses después de debut de SNA ≥1 lesión nueva en T2 ≥30 días después de brote de SNA - Lesiones asintomáticas gadolinio (Gd) positivas y no Gd positivas o - ≥1 lesión nueva en T2 - Gd positiva en el seguimiento por RM con independencia del tiempo LCR Sí Sí (para EMRR) No Tabla 3. Evolución de los criterios de McDonald desde 2001 a 2010 (Milo R, 2014). A pesar de que el LCR no se incluye en los últimos criterios diagnósticos de McDonald de 2010, se han observado BOCG positivas en pacientes con SNA, considerándose un factor predictor de conversión a EMCD independientemente de otros factores (Tintoré M, 2008; Kuhle J, 2015). En un estudio reciente se han encontrado BOCG positivas en un 86% de pacientes con SNA. En estos pacientes, la probabilidad de conversión a EMCD y en un periodo de tiempo inferior fue superior que en los pacientes con SNA cuyas BOCG fueron negativas. Un 74% de los pacientes con SNA que presentaron BOCG positivas finalmente convirtió a EM. Dentro del grupo de pacientes que cumplían los criterios de McDonald de 2010, un 93% presentó BOCG positivas, convirtiendo finalmente a EM un 88%. Estos hallazgos encontrados, ponen de manifiesto la importancia del LCR en el diagnóstico diferencial de la EM. En concreto, es de gran interés el estudio de las BOCG en aquellos pacientes que presentan un SNA en ausencia de lesiones, permitiendo establecer un tratamiento temprano (Huss AM, 2016). 28 Sería recomendable estudiar el LCR en todos los pacientes con sospecha de EM o SNA, para poder realizar un primer diagnóstico diferencial, así como efectuar una reevaluación del diagnóstico de EM en pacientes con BOCG negativas (Schwenkenbecher P, 2016). DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL En ocasiones la clínica puede sugerir la necesidad de considerar otro diagnóstico en pacientes con sospecha de EM. Se ha sugerido en diversos estudios, que los diagnósticos alternativos más comunes ante un diagnóstico incorrecto de EM son debidos a enfermedades psiquiátricas, migraña y otros desórdenes crónicos de dolor. La presencia de síntomas poco específicos junto con hallazgos en RM poco específicos pueden llevar a un diagnóstico incorrecto de EM (Toledano M, 2015). Si dividimos los criterios de diagnóstico diferencial de acuerdo a criterios radiológicos y clínicos, nos encontramos con las siguientes enfermedades alternativas a la EM (Przybek J, 2015): Criterios radiológicos: - Tumores (glioma, linfoma aislado de SNC) - Neuromielitis óptica (NMO) o enfermedad de Devic - Encefalomielitis aguda diseminada - Esclerosis concéntrica de Balo Criterios clínicos: - Neuroborreliosis - Mielopatía - Vasculitis - Sarcoidosis - Sífilis - Neurocisticercosis - Enfermedad de Behcet Una presentación clínica hiperaguda (máximo déficit de minutos a horas) de los síntomas neurológicos focales sugiere otro diagnóstico distinto a una enfermedad desmielinizante; comúnmente está causado por un evento isquémico. 29 Las recaídas son comunes en pacientes con EM, sin embargo, la presencia de brotes en la misma localización del SNC es menos frecuente. Esto puede sugerir una lesión estructural, como un angioma cavernoso con hemorragia recurrente, un ataque isquémico transitorio o incluso síntomas transitorios referentes a un tumor. La NMO se asocia con una discapacidad visual más severa que la discapacidad asociada a EM. Tanto las características clínicas como los hallazgos en RM ayudan a diferenciar la NMO de la EM. La detección de autoanticuerpos frente a aquaporina-4 (AQP4) confirma el diagnóstico de NMO en la mayoría de pacientes con esta patología. Sin embargo, un 20-30% de los pacientes no presentan autoanticuerpos frente a AQP4. La presencia de BOCG positivas o Indice IgG elevado se detecta sólo en un 20% de los pacientes con NMO. Se han descrito procesos de neuritis óptica y mielitis transitoria en pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES) y síndrome de Sjögren. El diagnóstico diferencial se basa en la presencia de encefalopatía, dolor de cabeza, convulsiones y neuropatía periférica, síntomas no característicos de EM. La afectación aislada del nervio craneal es inusual de la EM y debe considerarse otra alternativa diagnóstica. Es común en ciertas infecciones como la enfermedad de Lyme, o en procesos infiltrativos como la sarcoidosis, linfomatosis o carcinomatosis. Además, en estas enfermedades se presenta una clínica característica de fiebres, sudores nocturnos o pérdida de peso (Toledano M, 2015). 6. TRATAMIENTO En la EM los objetivos del tratamiento están enfocados a mejorar los síntomas, a prevenir la discapacidad, reduciendo la frecuencia y duración de los brotes, y restablecer la funcionalidad. Lo ideal sería un tratamiento en el que los efectos secundarios fueran mínimos. La mayoría de tratamientos actuales se basan en el origen autoinmune de la EM. Podemos dividir el tratamiento en dos grupos: 36 disminuye las recaídas y el riesgo de progresión. Esta terapia se asocia con un riesgo incrementado en infecciones del tracto respiratorio superior y con infecciones del tracto urinario. Presenta efectos a largo plazo sobre el sistema inmune, lo que puede ser un tratamiento interesante en aquellos pacientes con una progresión de la EM altamente activa. En un reciente estudio, un 70,1% de los pacientes tratados con alemtuzumab permanecieron libres de nuevas lesiones y de actividad en la RM (Arnold D, 2015). La mitoxantrona es un derivado sintético de la antracenediona que interactúa con el DNA. Es un potente agente inmunosupresor dirigido contra células inmunes proliferativas, inhibiendo su proliferación e induciendo la apoptosis de LT, LB y macrófagos. A pesar de la eficacia mostrada en algunos estudios, en torno al 60-70%, su uso está disminuyendo debido al alto riesgo de complicaciones que presenta (Torkildsen O, 2016). El estudio de nuevos tratamientos se centra en la protección de la discapacidad frente a nuevas recaídas, y no a la debida a la progresión de la enfermedad. Aunque menos del 2% de los pacientes con EMRR evolucionarán a formas progresivas de EM, es necesario un tratamiento personalizado en función de las características de los pacientes y de la progresión de la EM. En diversos estudios en los que se han comparado pacientes con tratamiento frente a la EM y pacientes sin tratamiento, se ha sugerido que un tratamiento temprano de la EMRR podría proteger frente a graves discapacidades, o incluso la muerte, debido a una lenta progresión de la enfermedad en los pacientes con tratamiento (Hauser SL, 2013; Torkildsen O, 2016). El tratamiento ideal sería una terapia individualizada. Hoy en día se trata de proporcionar el tratamiento más seguro capaz de eliminar tanto la clínica de los pacientes con EM, como los hallazgos radiológicos que muestran la actividad de la enfermedad. Aquellos pacientes que presenten una progresión de la enfermedad con recaídas que afecten a su discapacidad y/o nuevas lesiones en RM durante el último 37 año, deben ser reevaluados y considerarse un nuevo tratamiento con terapias más potentes (Torkildsen O, 2016). La recuperación de la función neurológica de los pacientes con EM será posible si se desarrollan terapias enfocadas a la remielinización y regeneración. En esta línea se investigan futuras terapias basadas en células madres. Las células madre mesenquimales se muestran como un tratamiento prometedor para la EM dadas sus propiedades inmunoreguladoras y tróficas, además de considerarse una terapia segura (Harris VK, 2015). 7. COMPONENTE INMUNOLÓGICO La EM se ha considerado históricamente, como una enfermedad desmielinizante de origen autoinmune debida a una respuesta inmune anormal frente a los antígenos del SNC; donde los LT son cruciales en el proceso inmunopatológico que induce el daño en la vaina de mielina. Hoy en día se reconoce como una enfermedad mucho más compleja de lo que se predecía en estudios iniciales (Hellings N, 2002; McFarland HF, 2007). La inflamación aguda es la primera respuesta ante un estímulo dañino (lesión tisular, infecciones baterianas), implicando la liberación de macrófagos y mastocitos, seguido por la liberación de mediadores inflamatorios (quimiocinas, citocinas, aminas, péptidos vasoactivos). Cuando esta respuesta inmune innata no es exitosa (no se consigue eliminar el agente infeccioso o no se consigue reparar el tejido dañado), se desencadena la respuesta inmune adaptativa. La EM comienza con la formación de una lesión inflamatoria aguda caracterizada por la ruptura de la BHE. Esta lesión presenta frecuentemente una clínica “silente”. La BHE es crucial en el mantenimiento de la homeostasis cerebral, dado que restringe el intercambio de factores humorales y células entre la sangre y el cerebro. La disfunción de la BHE es clave en el inicio de algunas enfermedades neurológicas inflamatorias entre las que se encuentra la EM y la NMO. Una vez que la 38 BHE se ha visto afectada, comienzan a formarse focos desmielinizantes y se produce la infiltración de LT alrededor de los pequeños vasos. La ruptura en la BHE provoca que con el tiempo, puedan observarse lesiones mediante RM. El grado de las lesiones está determinado por aspectos tanto inmunológicos, como genéticos. Las lesiones en la EM empeoran como consecuencia de una masiva infiltración de LT, un aumento en la expresión de las moléculas de adhesión en la superficie de las células endoteliales, y ante la liberación de citocinas y anticuerpos inflamatorios (McFarland HF, 2007: Shimizu F, 2013). En el SNC, la inflamación se caracteriza por la infiltración de células inmunitarias circulantes (principalmente neutrófilos y monocitos), y por la activación de células del SNC: células endoteliales, microglía y astrocitos (Farina C, 2007). Los astrocitos ejercen una influencia crítica en el fenotipo de la BHE debido a su estrecha yuxtaposición a la microvasculatura cerebral; permiten que la BHE mantenga su integridad y su inactividad inmune a través de mecanismos dependientes del contacto, y liberando factores esenciales solubles. Por el contrario, en condiciones neuropatológicas, los astrocitos pueden liberar citocinas inflamatorias. Las neuronas y la microglía modulan el fenotipo de la BHE mediante la liberación de factores que afectan al mantenimiento de la misma, mediante la expresión de moléculas inmunes como quimiocinas y moléculas de adhesión celular. Todo ello, conduce a un incremento de la permeabilidad de la BHE que tiene como consecuencia la migración leucocitaria al SNC a través de la BHE, que desencadena el desarrollo de las lesiones en la EM (Larochelle C, 2011). El estudio de la EM en modelos animales, como la encefalomielitis autoinmune experimental (1), ha sido de gran importancia para constatar la naturaleza inmunológica de la enfermedad. En la actualidad, está ampliamente aceptado que la respuesta inmune adaptativa es iniciada por las células CD4 de los lintocitos T helper tipo 1 (LTh1) [liberando interferón-], y LTh17 [liberando interleucina-17 (IL-17)], de manera similar a lo demostrado en la EAE (Figura 11). La participación de las células CD4 en el proceso mediado por LT, es consistente con la asociación de riesgo genético con moléculas de clase HLA-II. Se ha observado que los genes de HLA-II son los que confieren un mayor riesgo genético de EM. Además, se 39 ha sugerido en diversas publicaciones, que las células CD8 de los LT también participan en el desarrollo de lesiones en la EM. Una mayor frecuencia de células CD8 reconocen las proteínas de mielina en pacientes con EM respecto a pacientes sanos. Se podría concluir que las lesiones en la EM son iniciadas por las células CD4, pero la amplificación y daño es mediado por CD8 (McFarland HF, 2007; Legroux L, 2015). Figura 11. Mecanismo de actuación de los LT en la patogénesis de la EM. 1. Los antígenos solubles del SNC y las células presentadoras de antígeno (CPAs), como las células dendríticas, que han engullido mielina o antígenos neuronales pasan del SNC a los ganglios linfáticos cervicales; 2. Las CPAs activan las células CD4 y CD8 de los LT; 3. Los LT activados pasan de los ganglios linfáticos cervicales a la sangre periférica, donde realizan la vigilancia inmunológica; 4. Los LT activados son capaces de atravesar la BHE debido a la elevada expresión de los mediadores (receptores de quimiocinas, moléculas SANGRE BHE SNC 40 de adhesión, integrinas y citocinas); 5. Una vez que los LT han atravesado la BHE, pueden ser localmente reactivados en el SNC; 6. Los LTh1, LTh17, células CD8 y macrófagos secretan mediadores solubles de inflamación; 7. Estos mediadores solubles pueden dañar las estructuras de los oligodendrocitos unidos a las vainas de mielina y de los axones de las neuronas, provocando el consecuente proceso de desmielinización y causando daño axonal. A pesar del importante papel que juegan los LT en la patogénesis de la EM, estudios histopatológicos han sugerido la participación del sistema inmune humoral, en el que intervienen los LB y las células plasmáticas productoras de anticuerpos. Diversos estudios sugieren la implicación de un agente infeccioso o de autoantígenos en la patogénesis de la EM. Los anticuerpos frente a diferentes agentes infecciosos y los autoantígenos que no forman parte del repertorio de IgG, parecen ser irrelevantes, a pesar de haberse demostrado una relación directa en algunos estudios. Se han asociado diversos microorganismos con la EM, pero se ha observado que ninguno está estrechamente vinculado con la enfermedad. A pesar de la síntesis intratecal de anticuerpos frente a algunos virus en algunos pacientes, tampoco se han podido correlacionar con la duración ni la severidad de la enfermedad. ANTICUERPOS CONTRA PROTEÍNAS MIELÍNICAS Uno de los posibles autoantígenos que podría influir en la EM es la PBM. Las diferencias metodológicas junto con la detección de actividad en grupos control, indican la falta de especificidad para a la EM. La GMO, componente menor de la mielina, presenta actividad secundaria a la destrucción tisular, y no es causante de la desmielinización, por lo que tampoco sería un autoantígeno de interés en la patogenia de la EM. Se han estudiado otros antígenos de mielina en pacientes con EM, que tampoco han mostrado resultados satisfactorios: NCF1, presente en la superficie de los oligodendrocitos; proteína proteolipídica (PLP), componente más abundante de 41 mielina; glicoproteína asociada a mielina (GAM); proteína específica de oligodendrocitos (PEO). ANTICUERPOS CONTRA OTROS COMPONENTES DEL SNC La -arrestina o antígeno-S es una proteína soluble que se une a calcio, que forma parte de las proteínas dominantes de la retina de mamíferos. Se han descrito anticuerpos contra arrestina retiana y arrestina cerebral en pacientes con EM. La autorreactividad frente a arrestina podría explicar el proceso de remielinización defectuoso de la EM (Ohguro H, 1993). Las heat shock proteins (HSP) o chaperonas, son proteínas que intervienen en el correcto plegamiento de las proteínas sintetizadas o desnaturalizadas por el estrés celular. Existen numerosas familias de HSP. Se conoce que los títulos de anticuerpos contra la familia de HSP60 y HSP70, están elevados en el LCR de pacientes con EM y otras enfermedades neurológicas (Birnbaum G, 1995). Los neurofilamentos (Nf) son un componente principal del citoesqueleto axonal y su número está correlacionado con su tamaño y forma. Los Nf están compuestos por 4 subunidades: un triplete de Nf de cadenas ligeras (NfL) (68 kDa), Nf de cadenas medias (150 kDa), Nf de cadenas pesadas (NfH) (190-210 kDa), y -internexina en el SNC o periferina en el Sistema Nervioso Periférico. Los Nf son expresados por los axones y las células dendríticas. Se han visto niveles elevados de NfL y NfH en todos los estadíos de EM, siendo estos niveles mayores durante las recaídas y ante el incremento de lesiones en las imágenes por RM. En estudios previos se ha observado que las mediciones de NfL podrían ser superiores a las de NfH para detectar los efectos del tratamiento en el LCR de los pacientes con EMRR (Kuhle J, 2013). La AQP4 es un marcador altamente específico para la NMO, dirigido contra el canal acuoso aquaporina-4. Este marcador ha permitido demostrar un mecanismo humoral patogénico diferenciado de la EM (Lennon VA, 2004). Aunque se desconoce el papel de los LB en la patogénesis de la EM, es posible que tanto los LB como las células plasmáticas produzcan anticuerpos frente a algún 42 agente infeccioso, aún no identificado, causante de la EM. En el proceso inflamatorio del SNC, existe una población de LB residentes en el LCR, que constituye aproximadamente el 5% de las células del LCR. En este proceso inflamatorio, se produce la maduración por afinidad dirigida por antígenos y la diferenciación terminal de los LB. Estos procesos contribuyen a la secreción clonal de IgG, localizada dentro de los infiltrados perivasculares y en los folículos linfoides de las meninges del SNC. Todavía no se ha determinado si las células productoras de Ig en la EM proceden de la diferenciación de los LB o de los LB de memoria. La presencia de IgG en el SNC de pacientes con EM está bien establecida aunque no se ha podido confirmar la unión de IgG a la superficie de las vainas de mielina (Burgoon MP, 2004; Cepok S, 2005). Las inmunoglobulinas (Ig) o anticuerpos, son las estructuras de reconocimiento de los LB. Se localizan en la superficie de estas células, y una vez liberadas por los LB maduros o por las células plasmáticas, se encuentran como moléculas efectoras libres. Las Ig son proteínas heterodiméricas compuestas por dos cadenas ligeras (L), y dos cadenas pesadas (H), unidas entre sí por puentes disulfuro (Figura 12). Las cadenas pesadas pueden ser de tipo  y , definiéndose 5 clases (isotipos) de Ig o anticuerpos: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Las cadenas ligeras pueden ser de dos tipos: cadena o cadena , y cada Ig puede tener cualquiera de las dos, pero no las 2. Las Ig están divididas funcionalmente en un dominio variable, con capacidad de reconocimiento de los antígenos, y un dominio constante, con especificidad de las funciones efectoras. Entre el dominio constante y el variable de las cadenas pesadas, se encuentra una región denominada “bisagra” que confiere flexibilidad a las Ig. La variabilidad de Ig está determinada por un mecanismo que se produce tras la exposición al antígeno. Con ayuda de los LT, los genes de los dominios variables sufren una hipermutación somática (Schroeder HW, 2010). 43 Figura 12. Estructura de una Ig. H=cadena pesada; L=cadena ligera; Fab=dominio variable; Fc=dominio constante; N=extremo amino terminal; C=extremo carboxi terminal; s-s=puente disulfuro; Gm y Km=alotipos (marcadores genéticos) (Schroeder HW, 2010). Hay aproximadamente el doble de moléculas  que . Cada cadena ligera libre (CLL) contiene unos 220 aminoácidos en una cadena polipeptídica que se pliega para formar los dominios constante y variable. Los dominios constantes presentan pocas variaciones, mientras que los dominios variables presentan una enorme diversidad estructural (Figura 13) (Bradwell AR, 2008). Figura 13: Estructura de una Ig (izquierda) y de las CLL  y  (derecha). 44 Las CLL  se construyen a partir de 40 segmentos de genes V, 5 segmentos de genes Jy un gen C. Mientras que las CLL  se construyen a partir de 30 segmentos de genes V, 4 pares de segmentos de genes J, y un gen C (Figura 14). Las CLL se incorporan a las Ig durante el desarrollo de los LB y se expresan inicialmente en la superficie de las pre-células B. En individuos normales se producen 500 mg/día de CLL en la médula ósea y en las células de los ganglios linfáticos. Estas moléculas pasan al torrente sanguíneo y rápidamente se dividen entre el compartimento intravascular y el extravascular. Las células plasmáticas producen 1 de cada 5 cadenas pesadas junto con la CLL  o Hay un 40% de exceso de CLL aproximadamente respecto a las cadenas pesadas, lo que permite una adecuada conformación de las moléculas de Ig intactas. Las CLL  normalmente son monoméricas, mientras que las CLL  suelen ser diméricas, unidas por un puente disulfuro (Figura 15). En individuos normales, las CLL se aclaran y metabolizan rápidamente a través de los riñones según su tamaño molecular. Las CLL monoméricas (cadenas ) se aclaran en 2-4 horas con una tasa de filtrado glomerular del 40%; las CLL diméricas (cadenas ) se aclaran en 3-6 horas con una tasa de filtrado glomerular del 20%. Figura 14. Construcción de cadenas ligeras (CLL). 45 Figura 15. Producción de CLL. CLL  en forma monomérica; CLL en forma dimérica. 8. PAPEL DEL LABORATORIO EN EL DIAGNÓSTICO DE LA ESCLESORIS MÚLTIPLE El laboratorio ha desarrollado un papel importante en la ayuda al diagnóstico de la EM. A comienzos del siglo XX, Freund mostró que la relación de proteínas totales en LCR respecto al suero en los humanos era similar a la relación encontrada en conejos inmunizados pasivamente, donde esta relación resultó en 1/300. Se ha estudiado ampliamente en varias condiciones neurológicas, que existen cambios en las proporciones de proteínas en el LCR, y que la variación de proteínas séricas ejerce un efecto en la composición de las proteínas de LCR (Kabat EA, 1942). En los pacientes con EM las concentraciones de albúmina en LCR son similares a las concentraciones en pacientes sanos. Sin embargo, las concentraciones de globulinas gamma en pacientes con EM son significativamente mayores que en los individuos sanos, por lo que la fracción de gammaglobulinas debe sintetizarse en el SNC en algunos pacientes con EM. Se estudió la posibilidad de que en la “aparentemente” materia blanca normal del cerebro, que rodea las placas activas en la EM, se encontraran concentraciones elevadas de gammaglobulinas debido a su difusión de las placas activas, donde se sintetizan las gammaglobulinas, a la materia blanca. Se encontraron en muestras de materia blanca “normales” en las que la cantidad de mielina era normal, concentraciones tan elevadas de gammaglobulinas o incluso mayores, que en muestras que no contenían mielina. Esto apoyaba la teoría de 52 En 1971, Delpech y cols definen una ecuación en la que relacionan el cociente IgG/albúmina del LCR con el cociente IgG/albúmina de suero, estableciendo un punto de corte de 0,85 como valor superior de la distribución normal (Delpech B, 1972). Esta fórmula para cuantificar la síntesis intratecal de IgG es conocida como Índice de IgG o índice de Tibbling-Link (Link H, 1977): Tourtellotte y Parker establecieron una correlación positiva entre la concentración de IgG en las placas de desmielinización (en pacientes con EM) y su concentración en LCR. Tourtellotte describiría en 1969 uno de los primeros índices para cuantificar los niveles de IgG sintetizados por el SNC en mg al día (síntesis intratecal), eliminando la IgG procedente de la disfunción de la BHE en condiciones no hemorrágicas (Figura 18). Tourtellotte validó dicha fórmula empírica basándose en estudios de isótopos: empleó IgG y albúmina marcadas radiactivamente en suero, que fueron seguidas desde el torrente sanguíneo hasta al LCR durante 21 días en 9 pacientes con EMCD. La tasa de síntesis de IgG fue calculada por el método de intercambio de isótopos y comparada con los valores obtenidos mediante la fórmula empírica mostrando una buena correlación. Como consecuencia de estos estudios, la síntesis de novo de IgG del SNC (índice de Tourtellotte) fue calculado como: ⁄ ( ) ( ) ( ) En este estudio, la media encontrada en pacientes con EM de IgG sintetizada al día por el SNC fue de 16 mg/día con un rango entre 0-100 mg (Tourtellotte W, 1970). 53 Figura 18. Fórmula descrita por Tourtellotte, se cuantifican los niveles de IgG sintetizados al día por el SNC en mg. Se obtiene mediante la diferencia del IgG producido en el SNC (calculado a partir de la diferencia de IgG en LCR menos 5,5 unidades, que es la media + 2DS de IgG en LCR en sujetos sanos) con el valor de IgG procedente de daño en la BHE (calculado mediante la multiplicación de la fracción IgGsuero/Albúminasuero por la diferencia de la albúmina en LCR menos 34,3 unidades, que es el valor de la media + 2DS de albúmina en LCR en sujetos sanos). Esta diferencia corresponde a los mg de IgG/100 mL de LCR. Al día se producen unos 500 mL de LCR, por lo que el resultado se multiplica por 5. El índice de Tourtellotte requiere sólo una muestra de LCR y suero emparejados, que permite calcular la tasa de novo de síntesis de IgG en el SNC de los pacientes con EM (Tourtellotte WW, 1980). Se han descrito índices para otras inmunoglobulinas de la misma manera que el índice de IgG o índice de Link, para el cálculo de la síntesis intratecal: índice IgA (Fryden A, 1978), índice IgM (Sindic CJ, 1982), índice IgE (Sindic CJ, 1984) e índices de CLL para las cadenas  y  (Fagnart OC, 1988). Dentro de los índices no lineales descritos en la literatura, nos encontramos con el índice logarítmico de Thompson (McLean BN, 1990): [ ] IgGLCR = [(IgGLCR - 5,5 ) - LCR - 34,3 )] x 5 Media + 2DS de IgG de LCR en pacientes normales Media + 2DS de albúmina de LCR en pacientes normales mg IgG/100 mL LCR En el adulto sano se producen aproximadamente 500 mL de LCR al día IgG producido en exceso en el SNC IgG procedente de daño en la BHE 54 Con el fin de mejorar el índice de IgG se desarrolló una nueva fórmula no lineal: el índice de IgG ampliado o índice de Ohman (Ohman S, 1989), que presenta una mayor sensibilidad, y disminuye el número de falsos positivos respecto al índice de IgG: ⁄ ( ⁄ ) En 1983 Schuller y cols describieron otra fórmula no lineal en la que observaron una síntesis local de IgG significativamente mayor en aquellos pacientes que presentaban altos niveles de discapacidad además de un curso clínico progresivo de la enfermedad, en comparación con pacientes que presentaban menores grados de discapacidad o con un curso de la enfermedad remitente recurrente. Este índice se conoce como Fórmula de Schuller (Schuller E, 1983): ( ) La fórmula propuesta por Reiber H. se basa en el hecho de que cuanto mayor es el valor del Qalb, menos densa es la BHE. Debido a este mayor radio hidrodinámico, la IgG atraviesa la BHE con dificultad. La gráfica de evaluación para diferentes disfunciones de la BHE se describe en la figura 19. 55 Figura 19. Reibergrama. Representación de las diferentes disfunciones de la BHE divididas en 6 áreas en el que se representa en el eje de ordenadas QIgG y en el eje de abscisas QAlb. 0: Rango biológico irrelevante. 1: Rango normal. 2: Rango de disfunción de la BHE con incremento proporcional de QAlb y QIgG. 3: Rango de disfunción de la BHE con incremento desproporcionado de QIgG. 4: Rango de disfunción de la BHE con síntesis intratecal de IgG en el SNC. 5: Rango de síntesis intratecal de IgG en el SNC (Reiber H, 1980). Los datos obtenidos en este estudio permitieron diferenciar entre dos tipos de disfunción de la BHE: en un caso tenía lugar un incremento proporcional de los cocientes proteicos, y en otro caso este incremento no era proporcional con pérdida de la función de filtro de la barrera. De acuerdo al gráfico de la figura 19, el perfil proteico se puede dividir en 5 rangos. Se muestran ejemplos de pacientes normales y con EM presentados en el estudio de Reiber H. y cols en la figura 20. 56 Figura 20. Reibergrama, resultados obtenidos en 2 pacientes, un sujeto sano y uno con EM. En el eje de abscisas se representa QAlb (A); y en el eje de ordenadas se representa QIgG (I); Los puntos negros representan el valor de ambos cocientes para cada sujeto. Derecha: Paciente control con un perfil normal; Izquierda: paciente con enfermedad inflamatoria crónica del SNC (EM), en el que se observa un QIgG incrementado respecto al Qalb (Reiber H, 1980). Reiber H describió una fórmula para calcular la fracción de IgG patológica (IgGp) mediante la cual, cualquier valor de IgGp > 0 confirmaba una producción local de IgG con una probabilidad de un 96%: ( ) Esta fórmula está limitada al uso sólo en aquellos casos en los que no haya interferencias debidas a la disfunción de la BHE (Qalb < 7,4) (Reiber H, 1980). Debido a la clarificación de los principios matemáticos de la transferencia de proteínas en la BHE fue posible cuantificar la síntesis intratecal de proteínas empleando una fórmula mejorada a la propuesta por Reiber H para la determinación de la fracción de IgGp. La fórmula de Reiber y Felgenhauer se describió para las inmunoglobulinas G, A y M: [ √ ] [Donde X= G, A o M; Para IgG: a/b= 0,8; b2=15; c=1,8. Para IgA: a/b= 0,72; b2=80; c=5,1. Para IgM: a/b=0,65: b2=150; c=7,5.] 57 Por tanto, la fórmula de Reiber y Felgenhauer para IgG se representa (Reiber H, 1987): [ √( ) ] La fórmula de Reiber y el índice de Ohman son las que presentan una mayor especificidad con la menor pérdida de sensibilidad según el estudio publicado por Cordero M y cols. (Cordero M, 1997). Para facilitar el análisis e interpretación de los resultados obtenidos mediante las fórmulas descritas se ha desarrollado software para su análisis acoplado a los nefelómetros. Se ha comprobado en la relación no lineal entre QIgG y Qalb, que la mejor relación numérica o gráfica es la línea de discriminación hiperbólica conocida como Reibergrama (Dorta-Contreras AJ, 2004). El diagrama de las razones de Reiber o Reibergrama es un elemento esencial en el análisis del LCR en las enfermedades neurológicas, y en ellos se analiza de forma integrada, la funcionalidad de la BHE y la síntesis intratecal de inmunoglobulinas. Para confeccionar los Reibergramas se cuantifican los niveles de albúmina, IgG, IgA e IgM tanto en suero como en LCR en el nefelómetro. Las curvas siguen una distribución hiperbólica obtenida experimentalmente a partir de miles de perfiles de LCR donde se comprobó que a medida que aumenta Qalb se incrementa QIgG (Figura 21). 58 Figura 21. Reibergrama para IgG. Se representa Qalb en el eje de abscisas, y QIgG en el eje de ordenadas. Clasificación por regiones: (1) Rango normal; (2) disfunción de la BHE; (3) disfunción de la BHE con síntesis intratecal de IgG en el SNC; (4) síntesis intratecal de IgG en el SNC; (5) cualquier valor en esta área indica un error metodológico. En 1986 Rudick y cols. publicaron un estudio en el que cuantificaron las CLL  y  empleando el radioinmunoensayo (RIA). La falta de sensibilidad y especificidad hasta la fecha dificultó la determinación de las CLL. En este estudio un 84% de los pacientes con EM presentaron CLL  detectables mientras que en el grupo control, sólo presentaban CLL  detectables el 2,4% de los pacientes (Rudick RA, 1986). La determinación de CLL no ha sido fácil debido a dos hechos: la poca sensibilidad y la baja especificidad de los métodos existentes. La baja concentración de CLL en suero y en LCR ha hecho necesaria la búsqueda de técnicas con una alta sensibilidad. El desarrollo de métodos basados en anticuerpos ha permitido superar estas dificultades. Se han desarrollado diferentes inmunoensayos: inmunoelectroforesis, western blot, ensayo de hemoaglutinación y nefelometría. Un paso crítico en el desarrollo de inmunoensayos es la selección de anticuerpos frente a CLL  y CLL  respectivamente. Los primeros ensayos empleaban 59 anticuerpos policlonales, pero su especificidad no era buena. Los anticuerpos monoclonales permitieron mejorar la especificidad de las determinaciones. Actualmente, se emplean métodos de nefelometría y tubidimetría para determinar las CLL. Una de las limitaciones de la nefelometría, es el exceso de Ag. En los ensayos se pueden infravalorar concentraciones muy elevadas de proteínas. Algunos equipos de medición identifican estos problemas y recomiendan diluir la muestra (Bradwell AR, 2010). Una de las principales ventajas que presenta la determinación de CLL mediante nefelometría, además de ser un método cuantitativo, es que es automatizable y no depende de la habilidad y experiencia del personal de laboratorio. Esto permite que pueda estandarizarse y emplearse de forma rutinaria en los laboratorios clínicos. Esta metodología presenta buena linealidad y reproducibilidad en la cuantificación de las CLL en suero. Las CLL en LCR a pesar de presentar valores 10 veces inferiores a los de suero en condiciones normales, presentan una alta linealidad y reproducibilidad. Los valores elevados de CLL  en LCR en pacientes con SNA pueden predecir la conversión a EM. En un estudio realizado por Villar LM et al. en 2012, se obtuvo un punto de corte para las CLL  de 0,53 mg/L (sensibilidad 90%; especificidad 82,14%) (Villar LM, 2012). En otro estudio realizado, el punto de corte para las CLL  fue de 0,87 mg/L (sensibilidad 96,2%; especificidad 98,1%) (Hassan Smith G, 2014). Se ha empleado el índice  en diversos estudios, calculado como: Este índice considera la función de la BHE, mejorando la precisión en el análisis de las CLL y evitando falsos positivos debidos a la disfunción de la BHE. Las CLL  han mostrado menor relevancia en diversos estudios, al presentar valores inferiores de sensibilidad y especificidad clínica en el estudio de la EM. En los diferentes estudios en los que se ha determinado el punto de corte para la conversión de SNA a EM se han 60 obtenido valores para el índice  de: 20 (sensibilidad 69,7%; especificidad 81,8%) (Desplat-Jego S, 2005); 5,9 (sensibilidad 96%; especificidad 86%) (Presslauer S, 2008; Presslauer S, 2014); y 12 (sensibilidad 95%; especificidad 91%) (Duranti F, 2013). En todos ellos se han determinado las CLL mediante nefelometría. 61 68 PACIENTES (N) EDAD MEDIA (rango) MUJERES (%) GRUPO CONTROL Grupo 1: HN 41 75,72 (40-87) 11 (26,8) Grupo 2: ENNI 15 39,11 (15-71) 10 (66,7) Grupo 3: ENI 14 44,77 (30-75) 9 (64,3) TOTAL 70 61,69 (15-87) 30 (42,9) GRUPO CASOS Grupo 4: SNA 77 35,26 (15-62) 60 (77,9) Grupo 5: EMRR 29 34,81 (17-57) 17 (58,6) TOTAL PACIENTES 176 45,70 (15-87) 107 (60,8) Tabla 5. Características de cada grupo de estudio: grupo control y grupo casos, en relación al número de pacientes, edad y sexo, divididos a su vez en subgrupos. Grupo 1: Hidrocefalia Normotensiva (HN); Grupo 2: enfermedades neurológicas no inflamatorias (ENNI) diferentes de la HN; Grupo 3: enfermedades neurológicas inflamatorias (ENI) diferentes de la EM; Grupo 4: Síndrome Neurológicamente Aislado (SNA); Grupo 5: Esclerosis Múltiple Remitente Recurrente (EMRR). AMPLIACIÓN DEL ESTUDIO Se realizó un estudio longitudinal prospectivo para validar la información obtenida en el estudio piloto. La cohorte de estudio estaba formada por pacientes con sospecha de EM a los que se les realizó una punción lumbar. Los diagnósticos definitivos de los pacientes con EM se realizaron mediante la evaluación clínica y la RM del paciente (criterios de McDonald), y con apoyo de las pruebas de laboratorio (determinación de BOCG). Tras la presentación de la primera clínica, se realizó el seguimiento de estos pacientes durante un año. Todos los sujetos procedían de la Unidad de Gestión Clínica de neurología del área Hospitalaria Virgen Macarena. Se 69 dividió a los pacientes en dos grupos de estudio de acuerdo al punto de corte establecido para el índice kappa en el estudio piloto, grupo 1 (índice kappa normal), y grupo 2 (índice kappa patológico) (ver tabla 6). Al igual que en el estudio piloto, se excluyeron los pacientes pediátricos con edades inferiores a 14 años, por ser casos atípicos de EM muy temprana. PACIENTES (N) EDAD MEDIA (rango) MUJERES (%) GRUPO 1 (Índice kappa patológico) 34 39,25 (22-73) 21 (61,8) GRUPO 2 (Índice kappa normal) 124 50,09 (15-89) 68 (54,8) TOTAL PACIENTES 158 48,43 (15-89) 89 (56,3) Tabla 6. Características de cada grupo de estudio en relación al número de pacientes, edad y sexo; Grupo 1: índice kappa patológico, Grupo 2: índice kappa normal. 2. OBTENCIÓN, PROCESAMIENTO Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS El LCR se extrae mediante punción lumbar previo consentimiento firmado del paciente (documento mostrado en el anexo 1). Una vez separadas las células del LCR se alicuota y conserva a una temperatura de -80:C en condiciones de Biobanco hasta su posterior uso (tiempo desde la extracción de la muestra hasta su conservación a - 80:C inferior a 2 horas). A la vez, se toma una muestra de sangre del paciente para la obtención posterior del suero. Con el LCR y el suero se realiza la determinación de las BOCG como ayuda al diagnóstico de manera asistencial. Previa firma del consentimiento informado de Biobanco el material excedente de las pruebas diagnósticas se almacena en los equipos frigoríficos del Biobanco para su posterior uso en proyectos de investigación. 70 3. PARÁMETROS DE LABORATORIO CUANTIFICACIÓN DE CADENAS LIGERAS LIBRES EN LCR Y EN SUERO NEFELOMETRÍA En el estudio piloto los niveles de CLL han sido cuantificados mediante una técnica nefelométrica en el equipo BNII™ (Siemens Healthcare Diagnostics Inc.), usando el kit para kappa libre humana Freelite® (The Binding Site Group Ltd., Birmingham, UK) y el kit para lambda libre humana Freelite® (The Binding Site Group Ltd., Birmingham, UK). La determinación se realizó siguiendo el protocolo establecido para la determinación de Freelite® en el BNII™ según el fabricante del reactivo (The Binding Site Group Ltd., Birmingham, UK). El analizador BNII™ es un sistema cerrado. Los reactivos se introducen en el equipo en viales destapados y a temperatura ambiente, al igual que los viales para la realización de la calibración y de los controles. PRINCIPIO DEL TEST Empleamos la técnica de nefelometría de punto final para la cuantificación de las CLL en suero y en LCR (Figura 22). Esta determinación consiste en la determinación de un antígeno soluble, CLL  o CLL  respectivamente. Se añade la muestra a la cubeta de reacción que contiene una solución con el anticuerpo correspondiente. Durante la reacción Antígeno-Anticuerpo un rayo de luz pasa a través de la cubeta incrementando su intensidad mientras se forman complejos inmunológicos insolubles. Se mide la luz dispersada en un ángulo fijo de 13-24: respecto a la luz incidente. El anticuerpo presente en la cubeta está en exceso, por lo que la cantidad de complejo inmunológico formado será proporcional a la concentración del antígeno. El nefelómetro BN™II emplea partículas de látex con el anticuerpo específico fijado, más en concreto, partículas de látex poliestireno recubiertas con antisuero de oveja con el anticuerpo policlonal específico para CLL  o para CLL fijado en dichas partículas, con lo que se consigue aumentar la sensibilidad de las mediciones (Figura 23). Esto se basa en que el aumento del tamaño final del complejo inmunológico formado, al estar unido al látex, permite detectar concentraciones bajas de antígeno. 71 Figura 22. Esquema de un detector turbidimétrico y de un nefelómetro. El detector de turbidimetría se sitúa a 180: y mide la luz transmitida por la fuente de luz. El detector de nefelometría se sitúa entre 15-90: y mide la luz dispersada ganando sensibilidad respecto al detector de turbidimetría. Figura 23. Mecanismo de las técnicas nefelométricas. En la figura A se representa la dispersión de la luz que ocurre al pasar el haz de luz a través de la cubeta que contiene los complejos Ag-Ac. En la figura B se muestra la interacción de los Ag de la muestra con los Ac de las partículas de látex. La luz pasas a través de la cubeta que contiene el complejo Ag-Ac Se mide mediante la nefelometría la cantidad de luz dispersada por el complejo Ag-Ac Partículas de látex recubiertas con el Ac MUESTRA (Ag) Ag se une al Ac fijado en las partículas de látex A B 72 REACTIVOS Reactivo Látex: anticuerpo monoespecífico fijado a partículas de látex poliestireno. Lleva un conservante incluido formado por 0,05% de ProClin™*, 0,1% de ácido E-amino-n-caproico (EACA) y 0,01% de benzamidina. Calibradores y controles: sueros humanos normales con CLL policlonales Kappa y Lambda respectivamente. Se encuentran en forma líquida estable. Contienen un 0,099% de azida sódica, 0,1% de EACA y 0,01% de benzamidina como conservantes. Reactivo adicional: conservante 0,099% de azida sódica. *ProClin™ es una marca registrada de Rohm and Haas Corp., Philadelphia, PA. CALIBRACIÓN Para asegurar la calidad de las determinaciones, se realizó una calibración (6 puntos) al comienzo del estudio. La concentración de antígeno de los calibradores es conocida, y se emplea para realizar una curva de calibración sobre la relación entre la medición de la luz difundida y la concentración de antígeno. Las muestras con concentración de antígeno desconocida pueden ensayarse y leerse los resultados en la curva de calibración. Los 6 puntos de la curva de calibración se obtienen de las diluciones que realiza el equipo: 1/10; 1/20; 1/40; 1/80; 1/160; y 1/320. En las tablas 7 y 8 se muestran las mediciones de la luz difundida (bits) y las concentraciones de antígeno (mg/L) de ambas series de calibradores, kappa libre humano y lambda libre humano respectivamente; también se indican las desviaciones respecto al valor verdadero y la desviación media para kappa libre humano y lambda libre humano. Además se muestra la representación gráfica de las curvas de calibración (Figuras 24 y 25). 73 PUNTO DILUCIÓN CONCENTRACION (mg/L) VALOR (bits) DESVIACIÓN 1 1/320 0,0534 147 -0,44 2 1/160 0,1069 284 1,91 3 1/80 0,2438 549 -3,14 4 1/40 0,4275 1227 4,29 5 1/20 0,8550 2248 -3,75 6 1/10 1,7100 4194 1,28 Calibración para CLL kappa 2,47 Tabla 7. Datos obtenidos para la calibración de CLL  en el BNII™. Se indican las diluciones empleadas para cada punto de la curva, con sus correspondientes concentraciones (mg/L), el valor de la medición de la luz difundida (bits) y la desviación de cada punto respecto al valor verdadero. Figura 24. Representación gráfica de la curva de calibración obtenida para la determinación de los valores de CLL  en el BNII™. En el eje de ordenadas se representa el resultado de la medición de la luz difundida en bits, y en el eje de abscisas se representa la concentración de CLL  en mg/L para cada punto de la curva de calibración. 74 PUNTO DILUCIÓN CONCENTRACION (mg/L) VALOR (bits) DESVIACIÓN 1 1/320 0,0490 108 -2,11 2 1/160 0,0981 250 5,46 3 1/80 0,1961 535 -3,06 4 1/40 0,3922 1330 -1,72 5 1/20 0,7845 3379 4,39 6 1/10 1,5690 6639 -2,52 Calibración para CLL lambda 3,21 Tabla 8. Datos obtenidos para la calibración de CLL  en el BNII™. Se indican las diluciones empleadas para cada punto de la curva, con sus correspondientes concentraciones (mg/L), el valor de la medición de la luz difundida (bits) y la desviación de cada punto respecto al valor verdadero. Figura 25. Representación gráfica de la curva de calibración obtenida para la determinación de los valores de CLL  en el BNII™. En el eje de ordenadas se representa el resultado de la medición de la luz difundida en bits, y en el eje de abscisas se representa la concentración de CLL en mg/L para cada punto de la curva de calibración. El analizador está preparado para rechazar las curvas de calibración con una desviación media de todos los puntos de > 7%. En aquellos casos en los que el valor medio es aceptado, debe rechazarse si en alguno de los puntos la desviación es ≥ 10%. 75 Durante la realización del estudio no fue necesario realizar nuevas calibraciones. El lote de los controles y reactivos se mantuvo a lo largo del análisis. Se deben realizar nuevas curvas de calibración cuando se realice un cambio en los lotes de los controles y/o reactivos. En el caso de que alguno de los controles se encontrara fuera del rango aceptado, estaríamos ante otra situación en la que sería necesario repetir la curva de calibración. CONTROLES Antes de proceder a analizar las muestras se procesaron diariamente un control de calidad bajo (QC1) y un control de calidad alto (QC2) para la determinación de CLL  y CLL  respectivamente. El volumen mínimo de muestra para poder realizar las determinaciones es de 300 L. Los controles fueron rechazados para desviaciones > 1,96*DS. Se representan en las figuras 26-29 los gráficos de Levey-Jennings que recogen los resultados de los controles medidos al comienzo de cada día de estudio: QC1 y QC2 para CLL  y CLL  respectivamente. La línea continua representa el valor medio esperado para cada QC, y las líneas punteadas representan 1,96*DS. Figura 26. Gráfico de Levey-Jennings para los controles QC1 (nivel bajo) de CLL  en el BNII™. 76 Figura 27. Gráfico de Levey-Jennings para los controles QC2 (nivel alto) de CLL  en el BNII™. Figura 28. Gráfico de Levey-Jennings para los controles QC1 (nivel bajo) de CLL  en el BNII™. 77 Figura 29. Gráfico de Levey-Jennings para los controles QC2 (nivel alto) de CLL  en el BNII™. Los coeficientes de variación (CV) más bajos se obtuvieron para los valores bajos de los QC, tanto para las CLL , como para las CLL , 8,43% y 4,28% respectivamente. Como se observa en las figuras 26-29, todos los puntos de QC se encuentran dentro del rango de aceptación de la media ± 1,96*DS (ver resto de datos de QC en tabla 9). 84 Tabla 13. Datos obtenidos para los controles procesados en el SpaPlus®: valor asignado por el fabricante (mg/L), media de los valores medidos (mg/L), desviación estándar (DS), y coeficiente de variación (CV) para cada control. Además, se indica el intervalo de aceptación de los controles empleando la media calculada ± 1,96*DS. MUESTRAS Las muestras de LCR se procesaron sin necesidad de hacer diluciones en primera instancia. Antes de cada medición de LCR se realizó un lavado de las cubetas con hipoclorito sódico, para evitar un posible carryover (contaminación) debido a la mayor concentración de CLL en las muestras de suero respecto a las de LCR. Sin embargo, las muestras de suero al presentar concentraciones mayores de CLL fueron diluidas directamente a 1/10 de manera automática por el equipo de medición. El rango de medición aproximado del equipo sin dilución es de 0,1-18 mg/L. Para una dilución 1/10, el rango es de 1-180 mg/L. Por lo que para algunas muestras de LCR fue necesario realizar una dilución 1/10 que se realizó de forma manual con el diluyente proporcionado por el fabricante. La sensibilidad del equipo es de 0,1 mg/L. Para evitar las interferencias debidas al exceso de Ag, el SpaPlus® presenta un sistema de detección automático del exceso de Ag. CLL KAPPA QC1 QC2 VALOR ASIGNADO (mg/L) 15,80 31,40 MEDIA VALORES MEDIDOS (mg/L) 15,54 28,90 DS 1,5750 3,0026 CV 0,1014 0,1039 CV (%) 10,14 10,39 MEDIA ± 1,96*DS 12,45-18,63 23,01-34,78 85 Dentro de las características técnicas proporcionadas por el fabricante, se indica la precisión obtenida para las CLL en suero, siguiendo las guías CLSI Precision Performance of Clinical Chemistry Approved Guideline (EP5-A), se procesaron las muestras durante 21 días, realizando dos mediciones por día (resultados en tabla 14). Mientras que para el estudio de la precisión de CLL en LCR, se realizaron mediciones de cada muestra durante 5 días, realizando dos repeticiones por día (resultados en tabla 15). INTRAENSAYO PARA CLL (SUERO) Suero 1 Suero 2 Suero 3 MEDIA (mg/L) 7,21 35,72 123,77 CV (%) 3,3 1,6 1,8 INTERENSAYO PARA CLL (SUERO) Suero 1 Suero 2 Suero 3 MEDIA (mg/L) 7,21 35,72 123,77 CV (%) 4,2 1,9 2,3 Tabla 14. Estudio de precisión para CLL en suero para el equipo de medición SpaPlus® (The Binding Site Group Ltd., Birmingham, UK) proporcionado por el fabricante. INTRAENSAYO PARA CLL (LCR) LCR 1 LCR 2 LCR 3 MEDIA (mg/L) - - - CV (%) 9,8 3,3 1,8 INTERENSAYO PARA CLL (LCR) LCR 1 LCR 2 LCR 3 MEDIA (mg/L) - - - CV (%) 10,1 4,0 6,8 Tabla 15. Estudio de precisión para CLL en LCR para el equipo de medición SpaPlus® (The Binding Site Group Ltd., Birmingham, UK) proporcionado por el fabricante. 86 DETERMINACIONES PREVIAS AL ESTUDIO Aunque el diagnóstico de EM sigue basándose principalmente en datos clínicos, en ciertos casos, es de gran utilidad la determinación de la síntesis intratecal de IgG. Es importante su determinación en aquellos casos en los que los resultados clínicos son dudosos o insuficientes para alcanzar un diagnóstico adecuado. La concentración de IgG en LCR está incrementada en los pacientes con EM debido a la síntesis intratecal. La detección de un perfil oligoclonal de IgG exclusivo del LCR permite confirmar el diagnóstico de EM en el contexto clínico adecuado. La principal limitación de la determinación de IgG de origen local en SNC viene dada por la falta de especificidad, ya que la síntesis intratecal se presenta en diversas enfermedades neurológicas diferentes a la EM, especialmente las que presentan una afectación inflamatoria central. El análisis cualitativo de la síntesis intratecal se realiza mediante el estudio de BOCG, incluido dentro de los Criterios de McDonald de 2001. La cuantificación de la IgG permite distinguir entre enfermedades asociadas a una mayor o menor producción intratecal de IgG. Como ya se ha descrito en la introducción, son numerosos los índices y fórmulas descritos en la bibliografía que permiten cuantificar la síntesis intratecal de IgG (Cordero M., 1997) de los cuáles el más utilizado hasta la fecha es el índice de Tibbling-Link (índice IgG). Debido a la gran importancia que tienen la determinación de BOC y el análisis del índice IgG en el apoyo al diagnóstico de la EM y en el desarrollo de nuestro estudio, detallaré la metodología que se emplea en nuestro laboratorio para su análisis. DETERMINACIÓN DE BANDAS OLIGOCLONALES El análisis de BOC se realiza por el método de isoelectroenfoque. Esto se basa en el principio de que todas las proteínas presentes en LCR y suero se separan según su punto isoeléctrico empleando un gradiente de pH, en un gel de agarosa. Una vez finalizado el isoelectroenfoque, se transfieren las proteínas a una membrana de nitrocelulosa donde se incuban con anticuerpos frente a IgG e IgM marcados. Se añade una solución sustrato que permite visualizar las bandas. La presencia de bandas en LCR pero no en suero, es indicativo de EM. 87 DETERMINACIÓN DEL INDICE IgG (INDICE DE TIBBLING-LINK) En nuestro laboratorio empleamos el índice IgG o índice de Tibbling-Link, que se encuentra integrado en un software acoplado al equipo de nefelometría. Los niveles de IgG y albúmina tanto en suero como en LCR son cuantificados en el equipo automatizado BNII™ de Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Para observar los resultados de una manera más visual, se construyen los diagramas de Reiber o Reibergramas empleando el software Protein Statistic in CSF Analysis with Reibergrams, Versión 4.17, desarrollado por los Dres. Werner Albaum y Hansotto Reiber de la Universidad de Gottingen, Alemania (2012-2013) y de descarga gratuita. Este software se encuentra validado por el Laboratorio Clínico de la Universidad de Gottingen, Alemania. En estos diagramas, se representan gráficamente QAlb en el eje de abscisas y QIgX en el eje de ordenadas (IgX= IgG, IgA e IgM) en función de una línea base que sirve de patrón para obtener el porcentaje de secreción intratecal que presentan los pacientes. 4. PARÁMETROS CLÍNICOS RESONANCIA MAGNÉTICA Los resultados de las resonancias magnéticas realizadas a los pacientes son claves para el diagnóstico de EM. En el servicio de neurología se sigue un protocolo para el diagnóstico de la esclerosis múltiple, en el que se mide en cada RM el número de lesiones en T1, el número de lesiones en T2, el número de lesiones en T1 con captación de Gd, y el número de criterios de Barkhof-Tintoré que cumple la RM. Estos datos fueron obtenidos de las historias clínicas de los pacientes en colaboración con los neurólogos de la Unidad de Neurología del Hospital Universitario Virgen Macarena. 88 ESCALA EXPANDIDA DEL ESTADO DE DISCAPACIDAD (EDSS) Para establecer el grado de discapacidad de los pacientes se les asigna un valor de acuerdo a la escala EDSS de Kurtzke, que va de 0 (normal) a 10 (muerte por EM), presentando una discapacidad máxima a partir de valores 5-6. Esto datos fueron recogidos de las historias clínicas de los pacientes en colaboración con los neurólogos de la Unidad de Neurología del Hospital Universitario Virgen Macarena. 5. ESTADÍSTICA Para el análisis estadístico empleamos el programa informático SPSS Statistics versión 20 (2011), el MedCalc versión 11.4.2.0 (2010) y el Epidat (programa para análisis epidemiológico de datos) versión 3.1 (2006) para el cálculo del tamaño muestral. El primer paso fue calcular el tamaño muestral para el estudio piloto, y a posteriori para la ampliación realizada del estudio. Se definieron las diferentes variables mediante el análisis descriptivo para poder categorizarlas, y se aplicó el test de Kolmogorov-Smirnov para determinar si las variables seguían la normalidad. Para muestras con menos de 30 casos, se aplicó el test de Shapiro-Wilks. Para comparar variables cuantitativas (variable dependiente o resultado) frente a variables cualitativas policotómicas (variable independiente o predictora) se emplea el análisis de varianza (ANOVA), que es una generalización del contraste de igualdad de medias para dos muestras independientes. En nuestro caso, no se cumple la normalidad en las variables estudiadas, por lo que empleamos test no paramétricos. Para la comparación entre grupos, usando la mediana de cada uno de ellos, se empleó la prueba de Kruskal-Wallis. Para comparar dos grupos independientes, empleamos la U de Mann-Whitney. Por otro lado, en el caso de que la variable predictora sea ordinal, lo más adecuado es emplear el test de Jonckheere-Terpstra. Para comparar variables cualitativas entre los grupo estudiados, empleamos el test de Chi cuadrado y el test de Fisher (para tamaños de muestra pequeños). Para el 89 estudio de variables cuantitativas entre diferentes grupos empleamos el test t de Student. Mediante el análisis de curvas ROC se determinó la sensibilidad, especificidad, VPP y VPN de algunas variables, y se establecieron puntos de corte para las variables en estudio. Mediante el análisis Kaplan-Meier se compararon curvas de supervivencia entre los grupos definidos en el estudio para tal fin. Se obtuvieron los tiempos de conversión medios aplicando el test log-rank. Los Hazard Ratios (que permiten comparar curvas entre sí), se calcularon mediante la regresión de Cox univariante y multivariante. El resumen de estimación de un conjunto de cohortes mediante metaanálisis fue realizado con el programa MetaDisc (ES)® (versión beta 1.1.1.), y los resultados se sintetizaron con la representación gráfica mediante figuras forest plot. Para el metaanálisis se empleó el método de efectos aleatorios (DerSimonian y Laird), y se estimó la heterogeneidad por el valor estadístico Q. El modelo de efectos aleatorios asume que los estudios incluidos en la revisión constituyen una muestra aleatoria de todos los estudios existentes. 90 91 RESULTADOS 92 RESULTADOS 1. ESTUDIO PILOTO Para el estudio piloto se estudiaron un total de 176 pacientes, de los cuales un 60,8% eran mujeres (Tabla 5). El porcentaje mayor de mujeres respecto a los hombres es consecuente con los estudios previos, así como la media de edad encontrada en el grupo 5 (EMRR) con una media de 34,81 años (Tabla 5) (Izquierdo G, 2015). El grupo control formado por 70 pacientes se dividió en 3 grupos como se especifica en el diseño del estudio:  Hidrocefalia Normotensiva (HN)  Enfermedades neurológicas no inflamatorias (ENNI) diferentes de la HN  Enfermedades neurológicas inflamatorias (ENI) diferentes de la EM El grupo de casos lo forman 77 pacientes con Síndrome Neurológicamente Aislado (SNA) y 29 pacientes con Esclerosis Múltiple Remitente Recurrente (EMRR). 93 N CLL kappa en LCR (mg/L) CLL lambda en LCR (mg/L) Índice kappa Índice lambda GRUPO CONTROL Grupo 1: HN 41 0,16 (0,10-0,22) 0,15 (0,09-0,25) 1,62 (0,99-2,27) 1,28 (0,93-1,68) Grupo 2: ENNI 15 0,12 (0,10-0,20) 0,08 (0,05-0,10) 3,37 (1,95-7,05) 1,35 (0,96-1,90) Grupo 3: ENI 14 0,14 (0,04-0,20) 0,07 (0,58-0,14) 2,87 (1,47-7,00) 1,10 (0,81-2,71) TOTAL 70 0,15 (0,10-0,20) 0,11 (0,07-0,18) 1,96 (1,13-3,56) 1,27 (0,93-1,69) GRUPO CASOS Grupo 4: SNA 77 0,73 (0,13-3,2) 0,18 (0,07-0,68) 35,61 (4,48-132,73) 3,81 (1,49-16,95) Grupo 5: EMRR 29 1,45 (0,52-6,67) 0,22 (0,09-0,82) 88,00 (33,96- 295,13) 5,43 (2,01-19,40) Tabla 16. Características basales de los pacientes del estudio piloto divididos en 5 grupos: HN (Hidrocefalia Normotensiva), ENNI (enfermedades neurológicas no inflamatorias) diferentes de la HN, ENI (enfermedades neurológicas inflamatorias) diferentes de la EM; SNA (Síndrome Neurológicamente Aislado); EMRR (Esclerosis Múltiple Remitente Recurrente). Se indican las medianas y el rango intercuartílico (RIC) del 95% de cada grupo de estudio. Dado que las variables estudiadas: CLL  en LCR, CLL  en LCR, índice kappa e índice lambda no siguen la normalidad [una vez aplicados los test de normalidad: Kolmogorov-Smirnov y Shapiro-Wilks (para muestras menores de 30 casos)], se calcularon las medianas y los rangos intercuartílicos para cada grupo. Inicialmente estudiamos las CLL  y en LCR, y sus respectivos índices. Como se ha observado en estudios previos publicados, es el índice kappa el que muestra una mayor sensibilidad y especificidad clínica para detectar pacientes que presenten EM, siendo el índice lambda menos informativo (Desplat-Jego S, 2005). Como se muestra en la tabla 16, la mediana de los controles para el índice kappa de 1,96 (rango intercuartílico (RIC) del 95%: 1,13-3,56), fue mucho menor que las presentadas por los grupos 4 (SNA) y 5 (EMRR), cuyas medianas fueron 35,61 (RIC del 95%: 4,48-132,73), y 100 Métodos orientados a datos: incluyen dicotomizar una variable continua basándose en el cálculo de los cuantiles. Métodos orientados a resultados: proporcionan un valor de punto de corte que se corresponden con la relación más significativa de los resultados, y se basan en los estadísticos log rank, likelihood ratio y de Wald. Se espera que se obtengan mejores indicadores empleando los métodos orientados a resultados que los orientados a datos (Mandrekar JN, 2003). En una primera aproximación determinamos un punto de corte empleando un método orientado a datos. Para ello, calculamos el punto de corte de las CLL  en LCR, en base al artículo previamente publicado por la Dra. Villar en 2012 (Villar LM, 2012). En él se obtiene un punto de corte a partir de la media más 2 desviaciones estándar (DS) del grupo control. En nuestra cohorte de pacientes, los valores de CLL en LCR no siguen una distribución normal (Figura 38), por lo que lo más correcto en este caso, sería emplear la mediana o realizar una transformación de los datos. Sin embargo, en el grupo control con HN, las CLL en LCR, sí siguen una distribución normal (Figura 39). Por tanto, empleamos el valor medio de CLL  obtenido para este grupo: 0,18±0,10 mg/L [media±DS]. En esta primera aproximación obtuvimos un punto de corte de 0,38 mg/L para las CLL  en LCR. 101 Figura 38. Histograma para las CLL kappa en LCR. Figura 39. Histograma para las CLL kappa en LCR del grupo control con HN (Hidrocefalia Normotensiva). N = 41 Media = 0,18 Desviación típica = 0,10 102 Con el punto de corte para las CLL  en LCR de 0,38 mg/L, dividimos a los pacientes que presentaban SNA en 2 subgrupos (Tabla 17):  Subgrupo 1: pacientes con CLL  en LCR > 0,38 mg/L  Subgrupo 2: pacientes con CLL  en LCR < 0,38 mg/L Ambos subgrupos son homogéneos en cuanto a edad y sexo de los pacientes. En el subgrupo 1 todos los pacientes presentan BOCG positivas e índice IgG > 0,56. Además, un mayor número de pacientes cumple criterios de BTC (29) respecto al subgrupo 2 (7). Al combinar criterios de BTC con BOCG, es también en el grupo 1 donde se encuentra un mayor número de pacientes que cumple ambos criterios, 67,4% frente al 13% en el subgrupo con CLL  en LCR inferior a 0,38 mg/L. No existen diferencias estadísticamente significativas entre ambos subgrupos en la presencia de contraste con Gd (Gadolinio) positivo, que sería indicativo de actividad de la enfermedad. 103 Tabla 17. Datos de laboratorio y clínicos para pacientes con síndrome neurológicamente aislado (SNA) empleando un punto de corte para las CLL  en LCR de 0,38 mg/L. Subgrupo 1: pacientes con CLL en LCR>0,38 mg/L; subgrupo 2: pacientes con CLL  en LCR<0,38 mg/L. IC: intervalo de confianza. BOCG: bandas oligoclonales IgG, BTC: criterios de Barkhof- Tintoré; Gd: gadolinio; RM: resonancia magnética. En lo referente a la conversión de SNA a EM, un 77,8% de los pacientes con CLL  en LCR con un valor superior a 0,38 mg/L convierten a EM. Por otro lado, sólo el 9,4% de los pacientes del subgrupo 2 convierten a EM. La probabilidad de conversión a EM de los pacientes con SNA considerando el punto de corte de 0,38 mg/L para las CLL  en LCR, se representa mediante una curva de supervivencia (p<0,0001) (Figura 40), obteniéndose un hazard ratio (HR) = 9,66 (IC del 95%: 5,10-18,30). La mediana de conversión del subgrupo 1 fue de 14 meses con un error estándar de 0,0755. CLL  en LCR (0,38 mg/L) Subgrupo 1 Subgrupo 2 Valor p Pacientes (N) 45 32 - Mujeres (%) 37 (82,2) 23 (71,9) 0,281 Edad media (IC del 95%) 34,6 (31,8-37,3) 36,2 (31,9-40,6) 0,446 BOCG (+/-) 45/0 3/29 <0,0001 BOC IgM (+/-) 23/21 3/11 0,064 Indice IgG (>0,56/<0,56) 45/0 17/15 <0,0001 ≥3 criterios de BTC (%) 29 (67,4) 7 (30,4) 0,004 Contraste con Gd positivo (%) 12 (18,8) 3 (7,3) 0,153 Cumple criterios de RM y BOCG (si/no) 29/14 3/20 <0,0001 Conversión a EM (%) 35 (77,8) 3 (9,4) <0,0001 104 Figura 40. Representación de la curva de supervivencia mediante el análisis Kaplan-Meier de los pacientes con Síndrome Neurológicamente Aislado (SNA), en la que se muestra la probabilidad de permanecer como SNA de acuerdo al punto de corte para las CLL en LCR de > 0,38 mg/L (línea roja), valores inferiores a 0,38 mg/L (línea azul). Se representa el tiempo en meses desde el primer evento clínico o SNA. BOCG: bandas oligoclonales IgG. SEGUNDA BÚSQUEDA DE UN PUNTO DE CORTE DE CONVERSIÓN DE SNA A EM En una segunda aproximación analizamos las CLL  y en LCR, empleando un método orientado a resultados: las curvas ROC (Receiver Operating Characteristic) presentan la sensibilidad de una prueba diagnóstica que produce resultados continuos, en función de los falsos positivos (complementario de la especificidad), para distintos puntos de corte. El área bajo la curva (ABC) permite evaluar la bondad de una prueba 105 diagnóstica con resultados continuos. Se suele aceptar como valor aceptable de discriminación cuando ABC supera el valor de 0,7. Desarrollamos curvas ROC para las variables en estudio (CLL y CLL en LCR) y para el índice IgG (Figura 41). Para ello analizamos los valores del grupo control (n=70) frente a los valores del grupo EMRR (n=29). El mayor ABC encontrada para las CLL  en LCR fue: 0,906, con una sensibilidad del 75,86% (intervalo de confianza (IC) del 95%: 56,5-89,7) y una especificidad del 97,14% (IC del 95%: 90,1-99,7), para un punto de corte de 0,73 mg/L. Estos resultados son ligeramente mejores que los obtenidos para el índice IgG: ABC=0,886, con una sensibilidad del 75,86% (IC del 95%: 56,5-89,7) y una especificidad del 94,29% (IC del 95%: 86,0-98,4), para un punto de corte de 0,56. Esta punto de corte para el índice IgG es similar el encontrado en otros estudios previos (Cordero M, 1997). Mientras que las CLL en LCR no presentan valores aceptables: ABC=0,677, con una sensibilidad del 44,83% (IC del 95%: 26,4-64,3) y una especificidad del 97,14% (IC del 95%: 90,1-99,7), para un punto de corte de 0,41 mg/L (Tabla 18). CLL kappa en LCR (mg/L) CLL lambda en LCR (mg/L) Índice IgG Sensibilidad (IC del 95%) 75,86 (56,5-89,7) 44,83 (26,4-64,3) 75,86 (56,5-89,7) Especificidad (IC del 95%) 97,14 (90,1-99,7) 97,14 (90,1-99,7) 94,29 (86,0-98,4) VPP (IC del 95%) 91,7 (73,0-99,0) 86,7 (59,5-98,3) 84,6 (65,1-95,6) VPN (IC del 95%) 90,7 (81,7-96,2) 81 (70,8-88,7) 90,4 (81,2-96,1) ABC (valor p) 0,906 (p<0,0001) 0,677 (p=0,0086) 0,886 (p<0,0001) Punto de corte 0,73 0,41 0,56 Tabla 18. Datos extraídos del análisis de las curva ROC para las variables CLL  y  en LCR, y el índice IgG. [IC: intervalo de confianza. VPP: valor predictivo positivo. VPN: valor predictivo negativo. ABC: área bajo la curva]. 106 Figura 41. Comparación de curvas ROC (Receiver Operating Characteristic) para el índice IgG (línea discontinua azul), CLL  en LCR (línea continua roja), y CLL  en LCR (línea continua verde). Cada punto de la curva ROC corresponde a un posible punto de corte del test diagnóstico, y nos informa de su sensibilidad (eje Y), y de 1-especificidad (eje x). Ambos ejes incluyen valores entre 0 y 1 (0%-100%). La línea trazada desde el punto 0,0 al punto 1,0 recibe el nombre de línea de referencia. Con los datos obtenidos del análisis de las curvas ROC obtuvimos un punto de corte para las CLL  en LCR con unas características de sensibilidad y especificidad aceptables. Con este punto de corte de 0,73 mg/L, dividimos a los pacientes con SNA en 2 subgrupos:  Subgrupo 1: pacientes con CLL  en LCR >0,73 mg/L  Subgrupo 2: pacientes con CLL  en LCR<0,73 mg/L La edad media de ambos subgrupos fue similar, 35,2 y 35,4 respectivamente (p=0,928), con un porcentaje de mujeres mayor respecto al de hombres en cada subgrupo. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los 107 subgrupos 1 y 2 (Tabla 19). Todos los pacientes del subgrupo 1 presentaron BOCG positivas e índice IgG>0,56. En cuanto a la clínica, un 70,3% de los pacientes cumplía ≥ 3 criterios de BTC. Al combinar los criterios de RM con BOCG, este porcentaje se mantuvo (un 70,3% cumplía ambos criterios). Sin embargo, en el subgrupo 2, la mayoría de pacientes mostraban BOCG negativas (74,4%), presentaban un índice de IgG<0,56 (71,8%), y no cumplían con ≥ 3 criterios de BTC (65,5%). Al combinar criterios de RM y BOCG, un 79,3% no cumplía los mismos. No se observan diferencias estadísticamente significativas entre los subgrupos en la presencia de contraste con Gd. Además, un 78,9% de los pacientes que presentaron CLL en LCR>0,73 mg/L convirtieron a EM, frente a un 20,5% de los pacientes del subgrupo 2. CLL  en LCR (0,73 mg/L) Subgrupo 1 Subgrupo 2 Valor p Pacientes (N) 38 39 - Mujeres (%) 32 (84,2) 28 (71,8) - Edad media (IC del 95%) 35,2 (32,2-38,1) 35,4 (31,6-39,2) 0,928 BOCG (+/-) 38/0 10/29 <0,0001 BOC IgM (+/-) 28/35 8/26 0,042 Indice IgG (>0,56/<0,56) 38/0 11/28 <0,0001 ≥3 criterios de BTC (%) 26 (70,3) 10 (34,5) 0,004 Contraste con Gd positivo (%) 10 (16,9) 5 (10,9) 0,415 Cumple criterios de RM y BOCG (si/no) 26/11 6/23 <0,0001 Conversión a EM (%) 30 (78,9) 8 (20,5) <0,0001 Tabla 19. Datos de laboratorio y clínicos para pacientes con síndrome neurológicamente aislado (SNA) empleando un punto de corte para las CLL  en LCR de 0,73 mg/L. Subgrupo 1: pacientes con CLL en LCR>0,73 mg/L; subgrupo 2: pacientes con CLL  en LCR<0,73 mg/L. IC: intervalo de confianza. BOCG: bandas oligoclonales IgG, BTC: criterios de Barkhof- Tintoré; Gd: gadolinio; RM: resonancia magnética. 108 TERCERA BÚSQUEDA DE UN PUNTO DE CORTE DE CONVERSIÓN DE SNA A EM En una tercera y última aproximación analizamos el índice kappa y el índice lambda empleando un método orientado a resultados: las curvas ROC. De acuerdo con estudios previos, el índice kappa es el que muestra la mayor sensibilidad y especificidad en la detección de EM. Es probable que el índice lambda mejore los resultados obtenidos anteriormente respecto al análisis de las CLL en LCR. Desarrollamos curvas ROC para los índices kappa y lambda (Figura 42), analizando los valores del grupo control (n=70) frente a los valores del grupo EMRR (n=29). Figura 42. Comparación de curvas ROC (Receiver Operating Characteristic) para el índice kappa (línea continua roja), y para el índice lambda (línea discontinua verde). Cada punto de la curva ROC corresponde a un posible punto de corte del test diagnóstico, y nos informa de su sensibilidad (eje Y), y de 1-especificidad (eje x). Ambos ejes incluyen valores entre 0 y 1 (0%- 100%). La línea trazada desde el punto 0,0 al punto 1,0 recibe el nombre de línea de referencia. 109 El mayor ABC encontrada fue para el índice kappa: 0,971, siendo mayor que la mostrada para las CLL en LCR, con una sensibilidad del 93,1% (intervalo de confianza (IC) del 95%: 77,2-99,2) y una especificidad del 95,7% (IC del 95%: 88,0-99,1), para un punto de corte de 10,62. Estos resultados mejoran los obtenidos para las CLL  en LCR y para el índice IgG (Figura 41). Para el índice lambda, se obtuvo un ABC=0,870, con una sensibilidad del 82,8% (IC del 95%: 64,2-94,2) y una especificidad del 80% (IC del 95%: 68,7-88,6), para un punto de corte de 1,77 (Tabla 20). Con estos resultados se confirma que el índice lambda mejora las características globales respecto a las CLL  en LCR, mostrando en este caso un valor aceptable de ABC. índice kappa índice lambda Sensibilidad (IC del 95%) 93,1 (77,2-99,2) 82,8 (64,2-94,2) Especificidad (IC del 95%) 95,7 (88,0-99,1) 80 (68,7-88,6) VPP (IC del 95%) 90,0 (73,1-98,0) 63,2 (45,7-78,4) VPN (IC del 95%) 97,1 (89,9-99,6) 91,8 (81,9-97,3) ABC (valor p) 0,971 (<0,0001) 0,870 (<0,0001) Punto de corte 10,62 1,77 Tabla 20. Datos extraídos del análisis de las curva ROC para los índices kappa y lambda. [IC: intervalo de confianza. VPP: valor predictivo positivo. VPN: valor predictivo negativo. ABC: área bajo la curva]. Con los datos obtenidos del análisis de las curvas ROC obtuvimos un punto de corte para el índice kappa con unas buenas características de sensibilidad y especificidad. Con este punto de corte de 10,62, dividimos a los pacientes con SNA en 2 subgrupos:  Subgrupo 1: pacientes con índice kappa >10,62  Subgrupo 2: pacientes con índice kappa <10,62 116  Grupo 1: pacientes con EDSS < 2, sin patología  Grupo 2: pacientes con EDSS 2-2.5, discapacidad mínima  Grupo 3: pacientes con EDSS 3-3.5, discapacidad leve-moderada  Grupo 4: pacientes con EDSS ≥ 4, limitación para caminar Calculamos las medianas de los índices kappa y lambda en cada grupo de discapacidad agrupado en base a la escala EDSS (Tabla 24). Encontramos diferencias estadísticamente significativas entre ellos aplicando el test de Jonckheere-Terpstra (p=0,031) para la variable índice kappa, pero no así para la variable índice lambda (p=0,151). EDSS N Índice kappa Índice lambda Grupo 1: sin patología 49 17,09 (4,00-153,35) 2,80 (1,34-11,06) Grupo 2: discapacidad mínima 45 56,65 (21,12-293,03) 9,66 (2,01-18,58) Grupo 3: discapacidad leve-moderada 9 62,33 (16,64-214,74) 17,47 (1,66-33,24) Grupo 4: limitación para caminar 6 83,62 (25,46-247,68) 1,70 (1,43-2,88) Tabla 24. Pacientes del estudio piloto agrupados de acuerdo al nivel de discapacidad según la escala EDSS. 117 Si agrupamos a los pacientes según el punto de corte de 10,62 para el índice kappa, se pueden observar gráficamente las diferencias para cada grupo de discapacidad en las figura 45 y 46. Debemos considerar que un número mayor de pacientes presentan valores más bajos en la escala EDSS, y sólo un pequeño porcentaje de pacientes presentan valores de EDSS por encima de 3 en su primera consulta con el neurólogo (13,76%). Figura 45. Representación gráfica de los pacientes según el punto de corte del índice kappa de 10,62 frente a la escala de discapacidad EDSS. 118 Figura 46. Diagrama de sectores de los pacientes según el punto de corte del índice kappa de 10,62 frente a la escala de discapacidad EDSS (divididos en dos grupos según presenten <2 o ≥2 en la escala). 3. CORRELACIÓN DEL ÍNDICE KAPPA CON OTROS PARÁMETROS ESTUDIADOS Los pacientes que presentaron un brote en el momento de la punción lumbar, tenían un valor más elevado de la mediana del índice kappa como se observa en la figura 47. Esta diferencia fue estadísticamente significativa aplicando la U de Mann- Whitney (p=0,005). Además, se ha observado dentro del grupo de pacientes que no presentaban ningún brote en el momentos de la punción lumbar, que los 4 outliers (asteriscos azules en la figura 47), son pacientes que han convertido a EM, así como los otros 3 puntos situados fuera del rango intercuartílico (Figuras 47 y 48). 119 Figura 47. Diagrama de cajas para el índice kappa según el momento de la punción lumbar. Pacientes que no se encontraban en brote (azul), pacientes en brote (rojo); se representan la mediana y los percentiles 25 y 75 (cajas coloreadas); el mínimo y máximo (barras de error); y los outliers (*). 120 Figura 48. Diagrama de cajas para el índice kappa según el momento de la punción lumbar y la conversión a EM. Se representan los pacientes que no se encontraban en brote, y los pacientes en brote, divididos según la conversión a EM; se muestran la mediana y los percentiles 25 y 75 (cajas coloreadas); el mínimo y máximo (barras de error); y los outliers (*). Se representa la conversión a EM en rojo, y en azul los pacientes que no han convertido a EM. Analizamos el sistema funcional afectado en el brote. Para ello dividimos a los sistemas funcionales en: cerebelo, funciones sensoriales, vejiga, funciones visuales, funciones neuropsicológicas; y tracto piramidal, tronco cerebral. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre el valor del índice kappa y el sistema funcional afectado en el brote (p=0,145). Por otro lado, estudiamos el motivo de la conversión a EM: ya sea por presentar un brote, o por presentar criterios de EM (RM + BOCG). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre el valor del índice kappa y el modo de conversión a EM (p=0,634). 121 4. CORRELACIÓN DEL ÍNDICE KAPPA CON EL TRATAMIENTO DEL PACIENTE En el momento de la punción lumbar tan sólo 4 pacientes se encontraban en tratamiento. De los pacientes que habían recibido un primer tratamiento, 6 (7,2%) presentaban un índice kappa <10,62, y 57 (68,7%) un índice kappa >10,62, de los cuales, un 94,7% terminó convirtiendo a EM. En cuanto al mecanismo de acción, no se observan diferencias estadísticamente significativas con el resultado del índice kappa. De los pacientes en tratamiento con interferón, 35 presentaban un índice kappa >10,62, y 6 un índice kappa <10,62. El resto de pacientes en tratamiento presentaban un índice kappa > 10,62, y fueron tratados con acetato de glatiramer (10), natalizumab (7), y fingolimod (5). No se observaron diferencias significativas entre mantener el tratamiento o cambiarlo a uno de segunda línea en relación con el valor del índice kappa. Un total de 34 pacientes con índice kappa>10,62 mantuvieron el tratamiento en primera línea, y 10 en segunda línea, frente a 12 que cambiaron. De los 6 pacientes con índice kappa <10,62, los 6 mantuvieron el tratamiento: 4 convirtieron a EM y 2 permanecieron como SNA. De los pacientes a los que se les cambió el tratamiento, todos presentaban un índice kappa >10,62: de los pacientes en tratamiento con interferón, cambiaron a terapia de segunda línea, 4 a natalizumab, 2 a fingolimod y 1 a betaferon; 1 paciente en tratamiento con acetato de glatiramer fue cambiado a fingolimod, y de los pacientes en tratamiento con terapia de segunda línea (natalizumab), 2 fueron cambiados a fingolimod. Al analizar los diversos fármacos con el valor del índice kappa, no encontramos diferencias estadísticamente significativas (p=0,168). Pero si agrupamos los fármacos en terapia de primera línea (interferón y acetato de glatimer), y en terapia de segunda línea (natalizumab y fingolimod), si se observan diferencias estadísticamente significativas (p=0,026). Los pacientes que reciben una terapia de segunda línea (n=19), ya sea como primer tratamiento o como segunda opción, presentan valores superiores de índice kappa, con una mediana de 143; mientras que los pacientes en tratamiento 122 con terapia de primera línea (n=42) presentan una mediana del índice kappa de 59 (Figura 49). Figura 49. Diagrama de cajas para el índice kappa según el tratamiento del paciente. Terapia de primera línea (interferón o acetato de glatimer) [azul] con una mediana del índice kappa de 59, o terapia de segunda línea (natalizumab o fingolimod) [rojo] con una mediana de 143. 123 5. ESTUDIO DE VALIDACIÓN Con el punto de corte de 10,62 obtenido para el índice kappa en el estudio piloto, se incorpora este parámetro en la clínica de rutina del hospital. En ese momento, se establece que los pacientes que presenten un índice kappa superior 10,62, tienen una probabilidad de conversión a EM 7,34 veces mayor que los pacientes con valores del índice kappa inferiores a 10,62. Para validar este resultado, se hace un seguimiento de los pacientes a los que se les realiza una punción lumbar con sospecha de SNA durante un periodo de un año. En esta ampliación del estudio, y por motivos ajenos al mismo referentes a cambios en la gestión del laboratorio de inmunología, se modificó el equipo de medición, por lo que las muestras fueron analizadas en el equipo de turbidimetría SpaPlus® (The Binding Site Group Ltd., Birmingham, UK). Se empleó el kit para kappa libre humana Freelite® (The Binding Site Group Ltd., Birmingham, UK) adaptado a cada equipo. Se ha determinado en estudios previos que a pesar de las diferencias encontradas entre ambos equipos (BNII™ y SpaPlus®), no existen diferencias en lo referente a la predicción de un resultado positivo del test (Zeman D, 2016). Lo más adecuado sería establecer un punto de corte adaptado a cada equipo de medición, al igual que se establece para otros parámetros bioquímicos cuando se produce un cambio de metodología. Para establecer un punto de corte para el índice kappa en el SpaPlus®, realizamos una nueva curva ROC (Figura 50), en la que analizamos los valores del grupo que no convertía a EM (n=127), frente a los valores del grupo de pacientes que convirtieron a EM (n=26). Para ello descartamos los pacientes que presentaban un SNA, por ser casos en los que es posible una conversión a EM. Empleando estos datos para obtener un punto de corte para el índice IgG, obtuvimos un punto de corte de 0,58, similar al obtenido previamente. 124 índice kappa Índice IgG Sensibilidad (IC del 95%) 84,62 (65,1-95,6) 73,08 (52,2-88,4) Especificidad (IC del 95%) 96,06 (91,1-98,7) 92,13 (86,0-96,2) VPP (IC del 95%) 81,5 (61,9-93,7) 65,5 (45,3-82,3) VPN (IC del 95%) 96,8 (92,0-99,1) 94,4 (88,7-97,7) ABC (valor p) 0,941 (<0,0001) 0,871 (<0,0001) Punto de corte 12,33 0,58 Tabla 25. Datos extraídos del análisis de las curva ROC para la variable índice kappa en el equipo SpaPlus® y para el índice IgG. VPP: valor predictivo positivo. VPN: valor predictivo negativo. ABC: área bajo la curva. El punto de corte para el índice kappa de 12,33 es ligeramente superior al calculado en el estudio piloto de 10,62. Sin embargo, no existen diferencias entre ambos puntos de corte calculados en cuanto a la positividad del test. En el estudio piloto se había definido un grupo control lo más homogéneo posible tanto en edad como en diagnóstico. Esto supone un sesgo muestral en el estudio debido a la selección de las muestras. A pesar de la pérdida de sensibilidad y VPP en el estudio de validación, lo más correcto sería emplear el nuevo punto de corte obtenido de 12,33. En este estudio de validación se recoge una muestra más representativa de nuestra población real respecto al estudio piloto. Dentro del rango de 10,62-12,33 para el índice kappa, nos encontramos con 3 pacientes, 1 perteneciente al estudio piloto (conversión a EM), y 2 pertenecientes al estudio de validación (sin conversión a EM). 125 Figura 50. Curva ROC (Receiver Operating Characteristic) para el índice kappa (línea continua roja) en el equipo SpaPlus® (The Binding Site Group Ltd., Birmingham, UK), y para el índice IgG (línea discontinua azul). Cada punto de la curva ROC corresponde a un posible punto de corte del test diagnóstico, y nos informa de su sensibilidad (eje Y), y de 1-especificidad (eje x). Ambos ejes incluyen valores entre 0 y 1 (0%-100%). La línea trazada desde el punto 0,0 al punto 1,0 recibe el nombre de línea de referencia. Dividimos a los pacientes en dos grupos de acuerdo al valor del índice kappa, estableciendo como punto de corte 12,33: grupo 1 con índice kappa > 12,33, y grupo 2 con índice kappa < 12,33 (Tabla 26). En la tabla 26 se puede observar como en el grupo 1 (índice kappa > 12,33) un mayor número de pacientes presentan BOCG positivas e índice IgG > 0,58. Además, un 75% cumplen criterios de BTC, frente al 3,2% del grupo 2 (índice kappa < 12,33). En el grupo 2 la gran mayoría de los pacientes presentan BOCG negativos y un índice IgG < 0,58.