Impacto de la concentración mínima inhibitoria (cmi) y de los puntos de corte clínicos (clsi y eucast) de las combinaciones betalactámicos / inhibidores de betalactamasas en el pronóstico de bacteriemias por enterobacteriaceae

UNIVERSIDAD DE SEVILLA Facultad de Medicina Departamento de Microbiología TESIS DOCTORAL IMPACTO DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI) Y DE LOS PUNTOS DE CORTE CLÍNICOS (CLSI Y EUCAST) DE LAS COMBINACIONES BETALACTÁMICOS/INHIBIDORES DE BETALACTAMASAS EN EL PRONÓSTICO DE BACTERIEMIAS POR ENTEROBACTERIACEAE Trabajo realizado para alcanzar el grado de Doctor por la Licenciada en Farmacia Dña. Mª Mercedes Delgado Valverde Sevilla, mayo de 2017 UNIVERSIDAD DE SEVILLA Facultad de Medicina Departamento de Microbiología Dr. D. Jesús Rodríguez Baño, Profesor Titular del Departamento de Medicina de la Universidad de Sevilla y Dr. D. Álvaro Pascual Hernández, Catedrático de Microbiología de la Universidad de Sevilla, CERTIFICAN: Que la tesis para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla que lleva por título “IMPACTO DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI) Y DE LOS PUNTOS DE CORTE CLÍNICOS (CLSI Y EUCAST) DE LAS COMBINACIONES BETALACTÁMICOS/INHIBIDORES DE BETALACTAMASAS EN EL PRONÓSTICO DE BACTERIEMIAS POR ENTEROBACTERIACEAE” ha sido realizada por Dña. Mª Mercedes Delgado Valverde bajo nuestra supervisión, considerando que reúne los requisitos necesarios para su presentación como compendio de publicaciones. Y para que conste donde proceda firmamos el presente certificado en Sevilla a 18 de mayo de 2017. Fdo. Dr. D. Jesús Rodríguez Baño Fdo. Dr. D. Álvaro Pascual Hernández UNIVERSIDAD DE SEVILLA Facultad de Medicina Departamento de Microbiología Dr. D. Javier Aznar Martin, Catedrático de Microbiología de la Universidad de Sevilla, CERTIFICA: Que la tesis para optar al trabajo de Doctor por la Universidad de Sevilla que lleva por título “IMPACTO DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI) Y DE LOS PUNTOS DE CORTE CLÍNICOS (CLSI Y EUCAST) DE LAS COMBINACIONES BETALACTÁMICOS/INHIBIDORES DE BETALACTAMASAS EN EL PRONÓSTICO DE BACTERIEMIAS POR ENTEROBACTERIACEAE” ha sido realizada por Dña. Mª Mercedes Delgado Valverde bajo mi tutela, considerando que reúne los requisitos necesarios para su presentación como compendio de publicaciones. Y para que conste donde proceda firmo el presente certificado en Sevilla a 18 de mayo de 2017. Fdo. Dr. D. Javier Aznar Martin AGRADECIMIENTOS Parecía que nunca llegaría este momento y al fin aquí estoy intentando expresar mi más sincero agradecimiento a todas las personas que han hecho posible este trabajo. A mis directores de tesis…. A Jesús, por tantas horas empleadas en explicarme como hacer los análisis estadísticos y tantas otras cosas, por transmitirme tus conocimientos y ayudarme a entender e interpretar todos esos números. Por tu infinita paciencia y por haber depositado tu confianza en mí para llevar a cabo este trabajo. A Álvaro, por haber confiado en mí desde el principio y haberme dado la oportunidad de llevar a cabo este proyecto. Aún recuerdo aquel día hace más de 5 años en el que nos reunimos para hablar de la posibilidad de hacer la tesis, no puedo más que agradecerte que apostarás por mí, tus consejos y haber estado siempre atento y disponible para ofrecerme tu ayuda. Al Dr. Javier Aznar agradecerle haber sido mi tutor del Trabajo Fin de Máster y del Proyecto de Tesis Doctoral. A todos los investigadores de los trece centros participantes que han colaborado en la recogida de datos clínicos y de aislados, gracias a todos vosotros este proyecto no habría sido posible. A todos mis compañeros de la cátedra, a los que están y los que se han ido. A Eva Torres, por toda tu ayuda con las microdiluciones y esas horas pasando datos a la tabla Excel. A Fran, Paula, Lara y Fany por estar siempre ahí y ofrecerme vuestra ayuda cuando lo he necesitado. A todas las profesoras que también habéis resuelto mis dudas y me habéis ayudado cuando lo he necesitado. A Rafa y Fernando por aguantarme en el despacho con mis innumerables preguntas sobre como modificar el Word, como escribir esta frase en inglés o como hacer que una tabla quede bonita. A Mónica, has estado ahí mostrándome tu apoyo y dándome ánimos para terminar de escribir la tesis. Siempre recordaremos estos últimos meses compartiendo mesa y picándonos haber quien ponía más citas bibliográficas o quien acababa la tesis antes y con más páginas. A mi familia… A mi madre, mama como no voy a agradecértelo. Por fin termino la tesis, cuantas veces me has preguntado: pero Mercedes ¿cuándo vas a terminar la tesis? Gracias por tu dedicación y por animarme a que siempre consiga mis objetivos, tu ayuda ha sido muy valiosa. A mi padre, mi fan número uno, y a mi hermana y mi sobrina por una vez más estar interesados por el trabajo que hago y animarme a terminarlo. A Toni, siempre has mostrado interés por lo que hago y me has apoyado y animado para continuar aunque eso supusiera pasar menos tiempo juntos. Gracias por hacerme ser mejor persona y apoyarme en este camino. ÍNDICE DE CONTENIDOS ABREVIATURAS ...............................................................................................................11 TESIS COMO COMPENDIO DE ARTÍCULOS PREVIAMENTE PUBLICADOS ..........13 1. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 17 1.1. Las resistencias bacterianas como problema de salud pública y el uso de antimicrobianos ................................................................................................17 1.2. Estudios de sensibilidad de los microorganismos a los antibióticos. Técnicas y limitaciones .........................................................................................20 1.3. Puntos de corte de sensibilidad ............................................................................24 1.3.1. Organismos internacionales: CLSI, EUCAST ............................................24 1.3.1.1. CLSI...................................................................................................24 1.3.1.2. EUCAST ............................................................................................25 1.3.2. Puntos de corte epidemiológicos (epidemiologic cut-off o ECOFF) ..........27 1.3.3. Puntos de corte clínicos ..............................................................................30 1.3.4. Puntos de corte farmacocinéticos/farmacodinámicos (FC/FD) ................32 1.3.5. Principales discrepancias entre las recomendaciones de CLSI y EUCAST ........................................................................................................32 1.4. Evidencias para la toma de decisión en puntos de corte ....................................33 1.4.1. Datos in vitro, distribución de CMI y ECOFF ............................................33 1.4.2. Datos farmacocinéticos/farmacodinámicos (FD/FD) ................................34 1.4.3. Estudios in vitro ........................................................................................... 35 1.4.4. Modelos animales ........................................................................................36 1.4.5. Datos clínicos ...............................................................................................36 1.5. Enterobacterias ......................................................................................................37 1.5.1. Aspectos microbiológicos generales ...........................................................37 1.5.2. Aspectos generales de las infecciones por Enterobacterias .......................39 Mercedes delgado ValVerde IntroduccIón 17 1. INTRODUCCIÓN 1.1. LAS RESISTENCIAS BACTERIANAS COMO PROBLEMA DE SALUD PÚBLICA Y EL USO DE ANTIMICROBIANOS Durante más de 60 años, los antibióticos han sido considerados como la panacea para el tratamiento de las enfermedades infecciosas, independientemente de si su uso era o no apropiado. Los Centros de Control y Prevención de Enfermedades (CDC) de Estados Unidos han calculado que anualmente se realizan en la práctica clínica más de 60 millones de prescripciones de antibióticos innecesarias1. La mayor parte del consumo de antibióticos en España, al igual que en otros países, se produce en el ámbito extrahospitalario donde alcanza aproximadamente el 90% del total. En 1945, Alexander Fleming, al recibir el premio Nobel por el descubrimiento de la penicilina advirtió de que las bacterias podrían volverse resistentes a estos fármacos. La predicción de Fleming fue acertada: cada vez que se ha puesto en uso un nuevo agente antimicrobiano en el ámbito clínico, al poco tiempo se han detectado aislados resistentes al mismo(Figura 1)2. Figura 1. Línea temporal de descubrimiento de nuevos antibióticos y aparición de resistencias. 18 IntroduccIón Mercedes delgado ValVerde El desarrollo de resistencias es un proceso evolutivo normal para los microorganismos, pero en los últimos años se ha acelerado debido a la presión selectiva ejercida por el uso generalizado de los antibióticos. Además, las cepas resistentes son capaces de diseminarse cuando no se toman medidas de prevención y control de las infecciones3. La frecuencia de bacterias resistentes en la comunidad ha extendido el problema de la resistencia más allá de los límites del hospital, de manera que las cepas resistentes pueden ser transferidas de la comunidad al hospital y viceversa4. Estos hechos han dado lugar a un escenario en el que las bacterias con mecanismos de resistencia emergentes se están diseminando por todo el mundo, amenazando nuestra capacidad para tratar enfermedades infecciosas bacterianas comunes, y originando un aumento de la morbimortalidad de las mismas 5 . La diseminación de bacterias multirresistentes es por lo tanto un problema de salud pública, estimándose que causan unas 700.000 muertes atribuibles al año y en ausencia de medidas eficaces, se estima que esta cifra continuara aumentando hasta alcanzar los 10 millones de muertes en el año 2050 6 . Además de para el tratamiento de infecciones en humanos, los antibióticos también se utilizan como profilaxis de infecciones en la cirugía y otros procesos, en veterinaria, acuicultura, agricultura y con fines no terapéuticos como desinfectantes, conservantes y aditivos de alimentos y piensos7. En este sentido, el uso de los antimicrobianos en ganadería y agricultura tanto en profilaxis y tratamiento como para promover el crecimiento es un tema muy debatido. Se ha demostrado que este uso induce un aumento de la resistencia a antimicrobianos en bacterias de origen animal, que estas cepas se han transmitido a humanos y contribuyen a la creación y establecimiento de reservorios de genes de resistencia8, 9. Por un amplio período de tiempo los antibióticos han permitido la progresión de avances en medicina. Este hecho se hace evidente en áreas como la quimioterapia anticancerosa, el trasplante de órganos o células hematopoyéticas o en la cirugía10. En muchas ocasiones las alternativas terapéuticas en pacientes con infecciones por bacterias multirresistentes son muy limitadas, motivando el uso de combinaciones de antibióticos, así como antibióticos que habían dejado de usarse años atrás debido a su poca actividad o elevada toxicidad11. Sin embargo, a pesar de la clara necesidad de nuevas moléculas con actividad antibiótica que amplíen los espectros de acción de las actuales o tengan como objetivo nuevas dianas de acción, el número de nuevos antibióticos que se encuentran en fases precomercialización es muy escaso y son pocas las posibilidades de poder tener una gran cantidad de nuevos fármacos en los próximos años. Debido a la importancia mundial del problema, múltiples organizaciones han tomado conciencia de ello y han desarrollado medidas para el control de las resistencias a antibióticos. Todas coinciden en una serie de estrategias principales: 1. Prevención de infecciones: si prevenimos las infecciones evitaremos el uso de antibióticos de amplio espectro para tratarlas, así como la diseminación de bac- Mercedes delgado ValVerde IntroduccIón 19 terias multirresistentes. Las medidas más básicas pueden llegar a ser en muchas ocasiones las más eficaces en la prevención de las infecciones. Entre estas medidas se encuentran la higiene de manos, la desinfección de superficies inertes, el aislamiento de pacientes colonizados o con infección por bacterias multirresistentes o la vacunación12-15. 2. Reducir el uso de antibióticos en veterinaria: aunque existen fármacos específicos para uso veterinario, en la mayoría de los casos son los antibióticos para uso humano los que se aplican en este campo o pertenecen a las mismas familias16. El Parlamento Europeo ha aprobado un proyecto legislativo por el cual quedará estrictamente restringido el uso de antibióticos para el tratamiento colectivo y preventivo en los animales destinados a alimentación, con el fin de atajar el grave riesgo para la salud pública en que se ha convertido la resistencia antimicrobiana por el abuso en el consumo de antibióticos, fundamentalmente de forma indirecta a través de la cadena alimentaria de carnes17. 3. Desarrollo de nuevos antibióticos: desde el descubrimiento de la penicilina se han introducido más de cien nuevos antibióticos en clínica en menos de 50 años, pero en la última década ha habido una disminución en el desarrollo de nuevas moléculas con actividad antimicrobiana. Desde hace varios años, las compañías farmacéuticas invierten poco en la búsqueda de nuevos antibióticos. Se da la paradoja de que se necesitan nuevas clases de antibióticos eficaces en especies bacterianas resistentes pero que serán necesariamente fármacos de uso restringido. El resultado es la disminución de las alternativas terapéuticas disponibles. En el año 2010 la Infectious Diseases Society of America propuso una acción coordinada para llevar a cabo una iniciativa que se denominó 10x20 con la que se proponía el desarrollo de 10 nuevos antibióticos antes del año 202018. Recientemente, en Febrero de este año, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha publicado una lista de las bacterias que necesitan urgentemente nuevos antibióticos, entre las de mayor prioridad se encuentran los bacilos gramnegativos multirresistentes, incluyendo Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii y varias enterobacterias como Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Serratia spp. y Proteus spp19. 4. Recuperar antiguos antibióticos y nuevas indicaciones: debido a esta problemática cada vez es más frecuente encontrar tratamientos en los que están presentes antibióticos que habían caído en desuso o tenían otras indicaciones, como la colistina o la fosfomicina. Además, se emplean antibióticos clásicos con nuevas indicaciones o pautas de dosificación, así como tratamientos combinados. 5. Uso racional y optimizado de los antibióticos: aunque son muchos los factores que favorecen la selección y diseminación de la resistencia a los antibióticos20, el uso inapropiado e indiscriminado de los mismos es uno de los factores principales que contribuyen a este fenómeno21 junto al control deficiente de la infección 20 IntroduccIón Mercedes delgado ValVerde bacteriana. El uso de antibióticos es excesivo y frecuentemente inadecuado tanto en atención primaria como en la atención hospitalaria. Se estima que más del 50% de los tratamientos antimicrobianos en humanos son inadecuados, tanto en el ámbito hospitalario como en atención primaria22. Existe un consenso generalizado en la necesidad de mejorar el uso de antibióticos. Hay un alto grado de evidencia científica de que las intervenciones dirigidas a mejorar el uso de antibióticos reducen la presión antibiótica y contribuyen al control de las resistencias tanto en el ámbito hospitalario como comunitario23, 24. Las intervenciones son diversas y deberán adaptarse al medio. Las recomendaciones de la OMS y la Comisión Europea indican que para tener éxito en la lucha contra la resistencia a antimicrobianos se requiere un planteamiento global y multidisciplinario, en el que se incluyan todos los agentes implicados tales como diferentes profesionales sanitarios con capacidad para prescribir los medicamentos (médicos y veterinarios), farmacéuticos, farmacólogos clínicos, microbiólogos, profesionales dedicados a la medicina preventiva, profesionales de enfermería, así como los dedicados a la vigilancia y al estudio de las resistencias, profesionales con actividades en el campo de la veterinaria, entidades sociales que favorezcan la difusión de los mensajes a la opinión pública y, de manera muy relevante, responsables de la Administración con capacidad de implementar estas estrategias de control25. Acciones tales como una adecuada prescripción, la notificación a la red de vigilancia de la existencia de microorganismos resistentes, la rápida identificación de mecanismos de resistencia y clones epidémicos, el fomento de las buenas prácticas profesionales y la promoción, fomento y difusión del estudio y la investigación de las resistencias son vitales para conseguir el uso óptimo de los antibióticos26, 27. 1.2. ESTUDIOS DE SENSIBILIDAD DE LOS MICROORGANISMOS A LOS ANTIBIÓTICOS. TÉCNICAS Y LIMITACIONES Los estudios de sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos se realizan mediante técnicas de antibiograma, cuyo objetivo es evaluar la respuesta de un microorganismo a la exposición a un antimicrobiano. De este modo, el antibiograma define la actividad in vitro de un antimicrobiano frente a un microorganismo concreto y su resultado se utiliza como factor predictor de su eficacia clínica. Las pruebas de sensibilidad han de estar normalizadas y sujetas a un control para asegurar su reproducibilidad. Los métodos de sensibilidad tuvieron un gran desarrollo durante la década de1940; con la aparición de numerosas técnicas y el gran avance de las mismas pronto se hizo evidente la necesidad de estandarización. Así, en 1961 la OMS publicó un informe sobre la metodología para estudios de sensibilidad a antimicrobianos28, 29. Actualmente, el European Committee for Antimicrobial Susceptility Testing (EUCAST) y el Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI) proporcionan las recomendaciones más aceptadas (estos organismos se describen más adelante). Mercedes delgado ValVerde IntroduccIón 21 Existen diferentes métodos para realizar el antibiograma, y en función del método usado los resultados de sensibilidad se expresaran como diámetro de halo (en mm) o como concentración mínima inhibitoria (CMI) (en mg/L). 1.2.1. Método de difusión con discos El antibiograma mediante difusión con disco está basado en el trabajo de Bauer, Kirby y colaboradores30, 31. En 1975, este método se convirtió en la base de los estándares de difusión con discos del entonces llamado National Committe for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), que aun en la actualidad siguen vigentes. La técnica consiste en depositar, sobre una superficie de agar previamente inoculada con un microorganismo, discos de papel de filtro impregnados con una concentración conocida de antibiótico. Una vez que el disco se pone en contacto con la superficie del agar, el antibiótico comienza a difundir radialmente a través del mismo formándose un gradiente de concentración. Transcurridas entre 18-24 horas de incubación se genera un halo de inhibición alrededor del disco (figura 2). Todo el procedimiento está detalladamente estandarizado, así como los medios de cultivo, el inóculo bacteriano necesario, la lectura de los halos de inhibición y la interpretación de los resultados32-34. El método es fácil de realizar, rápido, barato y reproducible, siempre y cuando se realice de acuerdo a la recomendación de los estándares. Los resultados se expresan en mm, que corresponden al diámetro del halo de inhibición que se genera alrededor del disco de antibiótico. La principal limitación es que no permite conocer el valor de la CMI y la necesidad de esperar 18-24 horas para conocer los resultados. Figura 2. Antibiograma realizado por difusión con discos. 1.2.2. Método de Epsilon test (E-test) El E-test se describió por primera vez en 1988 como un nuevo método para determinar la CMI mediante difusión en placa y se introdujo en el mercado en 1991 tras ser aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA)35, 36. La técnica se basa también en la difusión del antibiótico por la superficie de agar; sin embargo, con el E-test podemos mediante lectura directa determinar la CMI. En concreto, se trata de una tira de plástico no poroso que incorpora un gradiente de concentración del antimicrobiano en cuestión. La metodología es la misma que para 22 IntroduccIón Mercedes delgado ValVerde el antibiograma mediante difusión en disco. Al poner en contacto la tira de E-test con la superficie de agar se produce de forma inmediata la difusión del antibiótico desde la tira hasta el agar, creándose un gradiente exponencial de concentraciones del antimicrobiano. Tras la incubación de la placa se observa una zona de inhibición con forma de elipse, de manera que el valor de la CMI coincidirá con el punto en el que el extremo de inhibición intersecciona con la tira (figura 3). Por lo tanto, el E-test se considera una alternativa para el estudio cuantitativo de sensibilidad a antimicrobianos, que además es sencillo, rápido y tiene una buena correlación con el método de referencia. Figura 3. Antibiograma realizado por difusión con E-test. 1.2.3. Microdilución Actualmente es el método de referencia para determinar la CMI a la mayoría de antimicrobianos. Se necesita un control y normalización cuidadosa para la reproducibilidad intra- e interlaborarotio, ya que los resultados pueden estar significativamente influidos por el método utilizado. Por ello, el método se encuentra completamente estandarizado y todas las recomendaciones se basan en la norma ISO37. En la microdilución se prueba la capacidad de los microorganismos de producir crecimiento visible en los pocillos de placas de microdilución, que contienen diluciones seriadas de los antimicrobianos (dilución en caldo). Teniendo en cuenta que la mayoría de placas disponibles tienen 96 pocillos (12x8), podemos estudiar con cada una de ellas, y para el mismo microorganismo 8 antimicrobianos y 11 diluciones o viceversa. El resultado se expresa como una concentración (en mg/L o µg/mL) que corresponde a la CMI. La interpretación de los resultados, que a veces resulta compleja, se facilita tomando como referencia el crecimiento observado en los pocillos usados como control positivo, dichos controles positivos deben presentar una clara turbidez o un botón de al menos 2 mm de diámetro (figura 4). La CMI corresponde a la concentración más baja de un agente antimicrobiano Mercedes delgado ValVerde IntroduccIón 23 que, en condiciones in vitro definidas, impide la aparición de crecimiento visible de un microorganismo antes de transcurrido un periodo de tiempo definido. La CMI proporciona información sobre la sensibilidad o resistencia del organismo al antimicrobiano y puede ayudar en la toma de las decisiones terapéuticas correctas. Generalmente se acepta que los ensayos para determinar la CMI en caldo son reproducibles dentro de un intervalo del doble de la dilución del punto final, es decir, ±1 pocillo en una serie de dilución al doble. Figura 4: Antibiograma realizado por microdilución en caldo. 1.2.4. Dilución en agar Este método se describió por primera vez en 1940, durante esa década aparecieron numerosas publicaciones en las que se aplicada el método para el estudio de diferentes antibióticos en diferentes especies bacterianas28. El agente antimicrobiano se incorpora dentro al medio con agar. Para lograr el rango de concentración deseado se prepara una serie de placas, cada una con una determinada concentración de antibiótico. Los inóculos de los distintos microorganismos se pueden aplicar simultáneamente sobre la superficie del agar utilizando replicadores de Steers (figura 5). La mayoría de los replicadores existentes tienen una capacidad para inocular entre 32 a 36 microorganismos. En la actualidad, la técnica de dilución en agar continua siendo el único de método de referencia para determinar la CMI de fosfomicina, aunque es un método recomendado para el estudio de sensibilidad del resto de antibióticos excepto daptomicina38-40. La principal limitación de este método es el tiempo que requiere para preparar el material necesario y la imposibilidad de automatización. 24 IntroduccIón Mercedes delgado ValVerde Figura 5. Replicador de Steers. 1.3. PUNTOS DE CORTE DE SENSIBILIDAD En términos generales, un punto de corte de sensibilidad representa una concentración de antibiótico que separa a poblaciones de microorganismos41. Partiendo de esta premisa, los puntos de corte son usados para definir la sensibilidad y la resistencia de los microorganismos a los antibióticos. Dependiendo del método de antibiograma utilizado, se expresan como concentración (mg/L) si utilizamos técnicas como la microdilución o la dilución en agar o como diámetro de halo (mm) si utilizamos la técnica de difusión con discos. Todos los métodos de estudio de sensibilidad requieren de puntos de corte y de criterios de interpretación para poder expresar los resultados del antibiograma como categorías clínicas (sensible, intermedio o resistente)42. El principal objetivo de los puntos de corte es por lo tanto predecir la sensibilidad o resistencia de un microorganismo en particular a un determinado antibiótico, pero la definición de sensibilidad o resistencia a un antibiótico es compleja y conlleva un significado diferente según el objetivo. Mientras que los términos parecen claros, su significado es ambiguo, ya que pueden referirse a la interacción directa entre un microorganismo y un agente antimicrobiano (significado microbiológico), o a la respuesta que presentará un paciente frente a un tratamiento con ese antimicrobiano (significado clínico). 1.3.1. Organismos internacionales: CLSI, EUCAST En la actualidad, los puntos de corte clínicos que se utilizan en la mayoría de laboratorios del mundo son publicados por dos grandes organismos internacionales: CLSI y EUCAST. 1.3.1.1. CLSI En 1968, 31 médicos y científicos que representaban a 15 organizaciones se reunieron para discutir cómo mejorar la práctica con los pacientes y desarrollar un documento de consenso formal para la normalización de las intervenciones clínicas, entonces fundaron el NCCLS. En 1977, CLSI fue acreditado por el American National Standards Institute como una organización voluntaria de estándares. Al mismo tiempo, CLSI se con- Mercedes delgado ValVerde IntroduccIón 25 virtió en la sede del National Reference System for the Clinical Laboratory que constaba de una red de varios sistemas de referencia que tenían como objetivo mejorar la reproducibilidad de los resultados de las pruebas analíticas, de acuerdo con las necesidades de la práctica clínica. En 1985, el NCCLS como el Centro de Estándares del laboratorio Clínico de la OMS. En 2005, se le otorgó una nueva designación y pasó a denominarse CLSI43. Desde su inicio en 1968, CLSI ha evolucionado hasta convertirse en una institución internacional con 1.500 organizaciones miembros y miembros individuales, así como más de 2.000 voluntarios, todos trabajando juntos para avanzar en la calidad de las pruebas de atención de la salud. En la actualidad, CLSI es una organización sin ánimo de lucro que reúne a la comunidad mundial de laboratorios por la causa común de fomentar la excelencia en el laboratorio clínico mediante el desarrollo de normas para las pruebas clínicas de laboratorio basado en las aportaciones y el consenso entre la industria, el gobierno y los profesionales de la salud (www.clsi.org). Es importante conocer que en el comité de CLSI están representadas las empresas farmacéuticas. 1.3.1.2. EUCAST Durante muchos años en Europa existían varios comités nacionales para el establecimiento de puntos de corte clínicos. En 2002 había al menos seis comités activos: BSAC (Reino Unido), CA-SFM (Francia), SWAB (Países Bajos), DIN (Alemania), NWGA (Noruega) y SRGA (Suecia). En otros países donde no había comités específicos se utilizaban los puntos de corte de CLSI. Las diferencias en la interpretación de los estudios de sensibilidad eran considerables, originando confusión entre los clínicos, así como impidiendo la comparación de la tasas de resistencia entre los países europeos. En 1997, la European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) junto a varias agencias nacionales de Europa y el European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC) se unieron para formar el EUCAST, con el principal objetivo de lograr la armonización de los puntos de corte clínicos en todos los países europeos y de este modo actuar como un comité europeo único comparable al CLSI en EEUU44, 45. Se crearon diferentes subcomités con la finalidad de abordar todos los aspectos referentes a las pruebas de sensibilidad, incluyendo la terminología, los puntos de corte y la metodología. Sin embargo, en ese momento no existía una relación formal con los comités nacionales por lo que la armonización de los puntos de corte no era posible. Entre los años 2001 y 2002 EUCAST sufrió una reorganización para dar un mayor protagonismo a los comités nacionales. Se formó el comité directivo de EUCAST compuesto por un presidente, un secretario científico, representantes de todos los comités nacionales activos y dos representantes del comité general de EUCAST. El comité general de EUCAST tiene representantes de todos los países europeos, de la industria farmacéutica y de fabricantes de sistemas para estudios de sensibilidad. Esta estructura organizativa permanece vigente en la actualidad. Entre 2002 y 2010, EUCAST armonizó los puntos de corte en toda Europa y para cada agente se elaboró y publicó un documento de justificación que describe el proceso de armonización, enumera los datos utilizados y las excepciones pertinentes46. En 2010 ya había un conjunto completo de puntos de corte europeos, aceptados por las autoridades europeas47. Desde entonces cada vez más laboratorios clínicos en 32 IntroduccIón Mercedes delgado ValVerde les, y/o que tienen valores de CMI que se incluyen dentro del intervalo en el cual habría que sospechar la presencia de mecanismos de resistencia específicos y en los que la eficacia clínica del antimicrobiano frente al aislado no se ha demostrado de forma fiable. 1.3.4. Puntos de corte farmacocinéticos/farmacodinámicos (FC/FD) El punto de corte FC/FD es el valor de CMI que permite alcanzar un valor de probabilidad poblacional para alcanzar el objetivo terapéutico farmacodinámico o probabilidad de alcanzar el objetivo (PAO) mayor al 90% con un determinado régimen de dosificación. De este modo, se pueden considerar tratamientos con elevada probabilidad de éxi- to aquellos que permitan obtener, para un valor dado de CMI, un PAO superior al 90%. El valor de PAO se calcula a partir de simulaciones de Montecarlo, las cuales consideran la variabilidad individual de los parámetros tanto FC como FD, donde cada grupo de parámetros se describe como una distribución de valores para los cuales se asocia una probabilidad de inhibir al microorganismo implicado. De esta manera podemos estimar estocásticamente la proporción de una población determinada de personas en la que se podrá alcanzar el objetivo farmacodinámico requerido para una CMI determinada. En el caso de los antibióticos betalactámicos el parámetro FC/FD que se asocia con la erradicación bacteriana y la respuesta microbiológica es el tiempo durante el cual las concentraciones permanecen por encima de la CMI (T>CMI), dado que son antibióticos con actividad dependiente del tiempo. Para las penicilinas es fT>CMI >50%, es decir, el tiempo durante el cual la concentración de fármaco libre está por encima de la CMI debe ser superior al 50% del intervalo de dosificación61, 63. Desde el año 2013, EUCAST publica en su documento sobre puntos de corte clínico los puntos de corte FC/FD no relacionados con especies para diversos antibióticos, añadiendo progresivamente datos para más antibióticos. En el documento se indica que estos puntos de corte solo deben usarse en ausencia de puntos de corte clínicos específicos de cada especie64. 1.3.5. Principales discrepancias entre las recomendaciones de CLSI y EUCAST Los puntos de corte clínicos, como ya se ha mencionado anteriormente, afectan a la toma de decisiones clínicas al determinar si un antibiótico es informado como sensible o resistente para un aislado bacteriano en cuestión. Básicamente, los puntos de corte de CLSI se basan en las distribuciones de CMI, en propiedades FC/FD y en los mecanismos de resistencia. Las medidas para la determinación de puntos de corte en EEUU están reguladas por la FDA. Sin embargo, desde su creación, EUCAST basa sus puntos de corte en los ECOFF, estudios FC/FD y datos clínicos. Se han publicado numerosos trabajos en los que se comparan los puntos de corte de CLSI y EUCAST para diferentes parejas de microorganismo/antimicrobiano65-71. Las recomendaciones de CLSI tienen una serie de inconvenientes con respecto a EUCAST; en primer lugar, para su consulta se requiere de una suscripción económica anual y esto puede ser un problema para los laboratorios de microbiología con pocos recursos. En segundo lugar, los detalles sobre la toma de decisiones no están disponibles para su consulta pública. En tercer lugar, la presencia de representantes de la industria farmacéutica en el comité de votación Mercedes delgado ValVerde IntroduccIón 33 plantea la cuestión de la existencia de potenciales conflictos de interés en el establecimiento de los estándares. En el caso de EUCAST, la industria solo desempeña un papel consultivo y no se le permite financiar o participar en la toma de decisiones. Además, EUCAST fomenta la formación de Comités Nacionales que pueden estar representados en el Comité General de EUCAST y que de este modo puedan formar parte del proceso de toma de decisiones45. Por último, en CLSI no existen estándares para los antibióticos que no están aprobados en los EEUU. 1.4. EVIDENCIAS PARA LA TOMA DE DECISIÓN EN PUNTOS DE CORTE El establecimiento de puntos de corte clínicos es un proceso complejo para el que se requieren numerosos datos y herramientas. Hace cincuenta años, cuando se determinaban los primeros puntos de corte, estos se basaban en los valores de CMI y en las concentraciones séricas alcanzadas por los antimicrobianos. Todas las especies tenían el mismo punto de corte para un mismo agente antimicrobiano. Hoy en día las indicaciones de uso de los antibióticos son muy específicas y los puntos de corte para un antimicrobiano son específicos para cada especie, género o familia de microorganismos. En los últimos años se han desarrollado múltiples herramientas para facilitar el establecimiento de puntos de corte de calidad, de manera que lo que solía ser un “arte” es ahora una metodología basada en la mejor evidencia científica disponible47. De hecho, en el proceso por el cual se establecen los puntos de corte clínicos se emplean una amplia variedad de datos, incluyendo datos de actividad in vitro, datos de FC/FD de animales y humanos y datos clínicos sobre el pronóstico de los pacientes cuando existen. Ningún conjunto de datos por si mismo proporciona toda la información necesaria. Un aspecto básico en la discusión sobre el establecimiento de puntos de corte es hasta qué punto deben ser únicos para todas las infecciones, y por tanto sencillos (lo que requiere una interpretación posterior) o diversificarlos (y por tanto, aumentar la complejidad) para las distintas localizaciones de las infecciones, en las que la concentración de los antimicrobianos es distinta a igualdad de dosis, como ocurre por ejemplo en las meningitis, infecciones del tracto urinario, osteomielitis o neumonías42, 72. Es importante destacar que la existencia de evidencias clínicas sobre la capacidad de predicción de los puntos de corte es, desafortunadamente, escasa en general, y difícil de generar. 1.4.1. Datos in vitro, distribución de CMI y ECOFF Realizar una buena curva de distribución de CMI para las combinaciones microorganismo/antimicrobiano es el primer paso en el desarrollo de puntos de corte clínicos para ese antimicrobiano. Los datos de distribución de CMI deben basarse en la prueba de un mínimo de 500 aislamientos clínicos recientes usando metodologías recomendadas por CLSI y EUCAST72, 73. Como ya se ha comentado, EUCAST publica tablas e histogramas que muestran las distribuciones de CMI para un gran número de microorganismos y antibióticos. Con la observación del histograma fácilmente podemos estimar donde se encuentra la CMI que divide la población salvaje de la que presenta mecanismos de resistencia adquiridos, valor que coincide con el ECOFF. Existen análisis estadísticos que 34 IntroduccIón Mercedes delgado ValVerde permiten determinar de manera fiable los ECOFF sin necesidad de estimar los valores visualmente74, 75. Cuando se establecen puntos de corte clínicos generalmente se considera inadecuado que estos estén dentro del rango de valores de CMI de las cepas de tipo salvaje. Si esto ocurre se genera una situación en las que cepas clínicamente resistentes tienen un valor de CMI dentro del intervalo de las cepas salvajes que por definición carecen de mecanismos de resistencia adquiridos42, 76. Clásicamente las distribuciones de CMI eran el parámetro principal en el que se basaban las organizaciones para el desarrollo de puntos de corte clínico, pero esto tenía el inconveniente de que no se conseguía predecir una relación óptima entre la dosis y el efecto bacteriológico o clínico77. 1.4.2. Datos farmacocinéticos/farmacodinámicos (FD/FD) El desarrollo del conocimiento sobre la farmacodinamia de los antimicrobianos ha permitido su aplicación en el establecimiento de los puntos de corte clínicos78, 79. La farmacodinamia hace referencia al estudio de los mecanismos de acción de los fármacos y los efectos bioquímicos, fisiológicos o farmacológicos que desarrollan los fármacos al reaccionar con el organismo. Por otro lado, la farmacocinética estudia los procesos a los que es sometido el fármaco al interaccionar con el organismo, desde que es administrado hasta su eliminación. Dicho de otro modo, la farmacodinamia estudia los efectos del fármaco sobre el microorganismo diana y la farmacocinética los efectos del organismo del huésped sobre el fármaco. Los conceptos de FC/FD en antimicrobianos fueron inicialmente definidos entre 1940 y 1950 por Eagle, quien a través de experimentos en modelos animales con roedores identificó el patrón tiempo-dependiente de la actividad bactericida de la penicilina, la naturaleza concentración-dependiente de la estreptomicina y el patrón mixto de la actividad bactericida de las tetraciclinas80, 81. Para los antibióticos, la FC/FD es el estudio de la relación entre las variables FC y la acción bacteriostática o bactericida in vivo y por extensión del resultado clínico82, 83. Esta actividad antibacteriana in vivo dependería de la exposición del microorganismo al fármaco en el lugar de infección. Se han descrito tres parámetros FC/FD que predicen la eficacia de la mayoría de los antimicrobianos. De este modo, los antibióticos pueden clasificarse de acuerdo a cuál de estos parámetros describe mejor su patrón de actividad. Los primero son los antibióticos concentración-dependiente (su acción depende de la concentración plasmática alcanzada), siendo el parámetro FC/FD que define su actividad la relación entre la concentración máxima alcanzada por el antibiótico y la CMI (Cmax/CMI). Dentro de este grupo se encuentran los aminoglucósidos o las quinolonas. El segundo grupo de antibióticos son los tiempo-dependiente (su actividad se relaciona con el tiempo en el cual su concentración plasmática se encuentra por encima de la CMI); en este caso el parámetro FC/FD predictor de la eficacia es el tiempo de exposición del patógeno a concentraciones del fármaco que superan la CMI (fT>CMI). Ejemplos de este tipo de antibióticos son los betalactámicos y los macrólidos. En último lugar se encuentran los fármacos cuya actividad depende del cociente entre el área bajo la curva de concentraciones (ABC) y la CMI del microorganismo que se está tratando (ABC/CMI); estos antibióticos son también predominantemente concentración-dependientes. En este grupo se encontrarían la vancomicina y las tetraciclinas79, 82. Mercedes delgado ValVerde IntroduccIón 35 La relación entre un índice FC/FD y la respuesta al tratamiento permite la definición de un objetivo farmacodinámico. Idealmente, el objetivo farmacodinámico debería calcularse a partir de datos de ensayos clínicos en pacientes, pero en general esto no es posible. Por tanto, el objetivo se define en general en base a los resultados de modelos dinámicos in vitro o modelos de infección en animales de experimentación. A continuación, como se explicó arriba, se realizan modelos estocásticos que estiman la probabilidad de alcanzar ese objetivo con distintas dosis teniendo en cuenta la variabilidad de las concentraciones del fármaco (farmacocinética) conocida a raíz de estudios realizados en individuos (idealmente pacientes con la infección). Para lograr el objetivo farmacodinámico en un paciente concreto se deben cumplir dos condiciones. La primera es que la exposición del microorganismo al antimicrobiano sea adecuada en ese paciente. En la práctica clínica, sin embargo, las dosis que se prescriben son estándares, a pesar de que la exposición varía entre los pacientes debido a la variabilidad interindividual de los parámetros FC como el aclaramiento y el volumen de distribución, los cuales deben tenerse en cuenta al tratar de predecir el resultado del tratamiento basado en el objetivo. La segunda condición es que la CMI sea lo suficientemente baja como para alcanzar un valor de índice FC/FD por encima del objetivo. Los microorganismos con CMI que tengan índices FC/FD inferiores al objetivo FD deben considerarse resistentes (baja probabilidad de curación), mientras que aquellos con CMI que dan como resultado valores de índices FC/FD más altos que el objetivo PD deben considerarse sensibles (alta probabilidad de curación). De este modo, el punto de corte clínico de CMI se basa en el valor del índice FC/FD que diferencia entre los dos grupos. Es evidente que el valor del punto de corte depende directamente de la exposición esperada del microorganismo al agente antimicrobiano en el paciente a tratar. Por lo tanto, el primer paso es verificar la dosis y el régimen de dosificación que más se usa en el tratamiento para una determinada indicación. El método más sencillo para determinar el punto de corte de CMI relacionado con una exposición particular y un objetivo terapéutico es usar la curva farmacocinética simulada (basada en las propiedades farmacocinéticas y las ecuaciones estándares) para un agente y calcular directamente el valor de punto de corte84. 1.4.3. Estudios in vitro Las propiedades PD de un antibiótico se determinan inicialmente in vitro. Tradicionalmente los modelos in vitro eran estáticos y analizaban la naturaleza de actividad antibacteriana, el efecto post-antibiótico (EPA) y los efectos de las concentraciones sub-in- hibitorias. El EPA se refiere a la capacidad del antibiótico para suprimir el crecimiento bacteriano una vez que su concentración sérica ha decrecido hasta estar por debajo de la CMI. Dicho de otro modo, es la supresión del crecimiento bacteriano que persiste después de una corta exposición del microorganismo a los antimicrobianos85. En base al EPA los antibióticos se clasifican en aquellos con un EPA prolongado o con un EPA leve o moderado86. La demostración del EPA in vitro requiere de su validación en un modelo animal, ya que este efecto observado in vitro puede estar ausente in vivo87. Con la combinación de los datos de la actividad antibacteriana in vitro y el patrón de EPA es 36 IntroduccIón Mercedes delgado ValVerde posible definir las propiedades PD in vitro y con ello poder realizar predicciones sobre las propiedades FC/FD in vivo. Los modelos FC/FD han evolucionado hasta la actualidad, hoy en día se usan modelos más sofisticados donde se simula la FC de los fármacos en humanos y se mide el efecto antibacteriano de los mismos88, 89. Estos modelos tienen las características de ser flexibles, adaptables, económicos y además presentar una buena correlación con datos en animales y humanos. Estas cualidades les hacen ser una excelente herramienta de investigación, no solo para predecir el efecto antibacteriano, sino también para conocer la actividad frente a bacterias con sensibilidad disminuida, explicar fracasos clínicos y determinar los valores FC/FD necesarios para prevenir la aparición de subpoblaciones resistentes90. 1.4.4. Modelos animales Los modelos animales han sido un pilar fundamental para la compresión de las características FC/FD de los antibióticos. Desde que Eagle iniciará su investigación en este campo los conocimientos han evolucionado enormemente. En su primer trabajo, demostró la importancia del intervalo de dosificación en la eficacia de penicilina91. Sin embargo, la importancia de sus trabajos no fue apreciada hasta años más tarde: entre finales de 1970 y principios de 1990, los conceptos FC/FD fueron redescubiertos y ampliados a través de experimentos con roedores82. Desde entonces los modelos de infección en animales han permitido la evaluación in vivo del efecto de los antimicrobianos para el tratamiento de infecciones inducidas de forma experimental. En los últimos veinte años, ha habido un aumento considerable de la información sobre FC/FD de diferentes antibióticos para el tratamiento de infecciones en pacientes. Hoy, la información FC/ FD extraída de las infecciones en modelos animales sirve como base fundamental para seleccionar las dosis y los intervalos de dosificación de los antimicrobianos y aportan información útil para el establecimiento de los puntos de corte clínicos92. La utilidad de la información obtenida en modelos animales para el manejo de pacientes ha sido evaluada, y en general existe una buena concordancia entre los datos FC/FD de los antibióticos en modelos animales y pacientes. Los extensos estudios realizados en animales y en modelos in vitro de FC en los últimos 20 años han llevado a una clara comprensión de las relaciones FC/FD de la mayoría de los antibacterianos93. 1.4.5. Datos clínicos Los datos clínicos deberían constituir el punto más relevante en la toma de decisiones para el establecimiento de puntos de corte, pero desgraciadamente estos datos no suelen estar disponibles, ya que son necesarios ensayos clínicos o estudios prospectivos muy bien diseñados y con suficiente tamaño muestral para poder obtener datos de calidad. Estos datos son difíciles de evaluar debido a la gran cantidad de factores de confusión que entrar en juego en la respuesta de un paciente al tratamiento antimicrobiano. Como parte del proceso para el establecimiento de puntos de corte, los resultados clínicos se correlacionan con los de sensibilidad in vitro. Durante el proceso, se examinan los efectos del tratamiento, medidos como curación, mejoría Mercedes delgado ValVerde IntroduccIón 37 o fracaso clínico y/o microbiológico, de acuerdo a la especie y el lugar de infección. Generalmente, no se dispone de datos suficientes para apoyar los puntos de corte solamente en ellos, por lo que estos datos sirven para apoyar al resto de información y con el conjunto de todos ellos establecer los puntos de corte clínicos. Con frecuencia, los datos clínicos se obtienen de análisis post-hoc de los pacientes tratados con un fármaco concreto en estudios aleatorizados, que utilizan regímenes de dosificación predefinidos. Estos estudios tienen la ventaja de que el antibiótico raramente se usa en combinación por lo que podemos analizar fácilmente los efectos antibacterianos del antibiótico a estudio. La variable resultado de estos suele ser el resultado clínico respecto a la CMI del patógeno causante de la infección. Sin embargo, con frecuencia los estudios aleatorizados presentan una serie de limitaciones para este objetivo: (1) En muchas ocasiones se excluyen pacientes con aislados resistentes; cuando se trata de ensayos clínicos previos a la comercialización de nuevos antibióticos esta definición de resistencia suele estar basada en las curvas de distribución de CMI, es decir, en los puntos de corte epidemiológicos que como ya se ha comentado no siempre tienen porque coincidir con los clínicos. En este caso no es posible establecer si el punto de corte puede estar por encima de los predefinidos. (2) Es frecuente que la distribución de CMI de los aislados sea heterogénea con lo que el tamaño muestral para determinadas CMI suele ser insuficiente para evaluar la eficacia. Los únicos estudios clínicos con un número de pacientes suficiente son aquellos que se realizan para nuevos fármacos con fines regulatorios 42, 94 , pero en muchos de los pacientes no hay diagnostico etiológico, y las propias características de los ensayos hacen que se seleccionen pacientes con bajo riesgo de patógenos resistentes. (3) No suelen incluir todas las especies que pueden ser de interés para un cuadro clínico en particular, por lo que los puntos de corte pueden ser inapropiadamente extrapolados al resto de especies no incluidas. (4) Los estudios suelen realizarse para un síndrome concreto, por lo que los resultados podrían no ser extrapolables a otros síndromes. (5) Finalmente, existe poco consenso sobre cuales deber ser las tasas de curación y/o erradicación microbiológica aceptables, al no tener en cuenta la respuesta inmunitaria de huésped. Por este motivo, pueden ser de gran utilidad los estudios observacionales diseñados para este fin. Un estudio clínico ideal debería reclutar un número significativo de casos en los que el patógeno tiene una CMI en ambos lados del puntos de corte epidemiológico y FC/FD para sí poder ayudar en la validación clínica de los puntos de corte clínicos definitivos. Por todo ello, son necesarios más estudios prospectivos de práctica clínica habitual para analizar la relevancia y aplicabilidad de los puntos de corte actuales. 1.5. ENTEROBACTERIAS 1.5.1. Aspectos microbiológicos generales Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son bacilos gramnegativos, de tamaño intermedio (0,3 a 1,0 x 1,0 a 6,0 µm). Se definen por compartir un antígeno común (an- 38 IntroduccIón Mercedes delgado ValVerde tígeno de Kunin, también conocido como ECA, del inglés enterobacterial common antigen), ser inmóviles o móviles con flagelos perítricos, no producir esporas y en ocasiones ser capsulados. Se consideran anaerobios facultativos, ya que todos los miembros pueden crecer rápidamente de forma aerobia o anaerobia en varios medios no selectivos y selectivos. Son microorganismos quimio-organotrofos, poseedores a la vez de un metabolismo respiratorio y fermentativo, fermentadores de la glucosa (con o sin producción de gas), catalasa positivos, oxidasa negativos y nitrato reductasa positivos95, 96. La familia Enterobacteriaceae pertenece al dominio Bacteria, filo Proteobacteria, clase Gammaproteobacteria y orden Enterobacteriales97y comprende numerosos géneros y especies relevantes desde el punto de vista médico. El nombre de la familia Enterobacteriaceae fue acuñado por Rahn en 1937, y si bien fue ampliamente utilizado durante años98, 99, en 1979 Lapage sostuvo que esa nomenclatura era incorrecta. Él consideraba ilegítimo el nombre Enterobacteriaceae y propuso Enterobacteraceae (sin “i”). Se basaba en que etimológicamente derivaba de Enterobacter (un género de la familia) y el sufijo –aceae, que denota “familia”, y no –iaceae (sic)100. Pero estas reglas del Código Internacional de Nomenclatura no existían cuando Rahn había planteado el nombre de la familia101. Una Comisión Judicial del Comité Internacional de Bacteriología Sistemática determinó finalmente que la nomenclatura válida era Enterobacteriaceae (Rahn 1937)99, y su género tipo sería Escherichia (según Castellani y Chalmers 1919)102, como queda reflejado en las Listas Aprobadas de Nombres Bacterianos de 1980 donde figura dentro de los nomina conservanda familiarum (nombres de familias conservados)103, 104. Una explicación etimológica fue expuesta por Brenner en la 7ª edición de “Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology”, aquí se propuso enterobacterium para denotar “bacteria intestinal” y el sufijo –aceae para “familia”. Esta etimología sí explicaría el porqué del nombre Enterobacteriaceae105. En febrero de 1980, se publicaron en las Listas Aprobadas de Nombres Bacterianos sólo 19 géneros dentro de la familia Enterobacteriaceae104. A la fecha de escritura de este trabajo, ese número ha aumentado de forma considerable, siendo 53 los géneros válidamente publicados (Tabla1)106. El número de especies dentro de la familia es más difícil de apreciar, ya que numerosas especies han sido reclasificadas dentro de otros géneros en forma de nuevas combinaciones. Actualmente el número de especies diferentes válidamente publicadas rondaría las 340106. Se caracterizan por ser microorganismos ubicuos, ya que se encuentran de forma universal en el medio ambiente (suelo, agua y vegetación), además forman parte de la flora intestinal de muchos animales, incluido el ser humano. Mercedes delgado ValVerde IntroduccIón 39 Tabla 1. Géneros pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. Arsenophonus Biotrasticola Brenneria Buchnera Budvicia Buttiauxella Calymmatobacterium Cedecea Citrobacter Cosenzaea Cronobacter Dickeya Edwarsiella Enterobacter Erwinia Escherichia Ewingella Gibbsiella Hafnia Klebsiella Kluyvera Leclercia Leminorella Levinea Lonsdalea Mangrovibacter Moellerella Morganella Obesumbacterium Pantoea Pectobacterium Phaseolibacter Photorhabdus Plesiomonas Pragia Proteus Providencia Rahnella Raoultella Saccharobacter Salmonella Samsonia Serratia Shigella Shimwellia Sodalis Tatumella Thorsellia Trabulsiella Wigglesworthia Xenorhabdus Yersinia Yokenella 1.5.2. Aspectos generales de las infecciones por Enterobacterias Las enterobacterias son el grupo de microorganismos que con mayor frecuencia se aísla en los laboratorios de Microbiología Clínica como agentes causales de una amplia variedad de infecciones en el ser humano. Son responsables de un tercio de todas las bacteriemias, de dos tercios de las infecciones del tracto urinario (ITU), así como de un elevado número de infecciones gastrointestinales. Habitualmente, las enterobacterias aisladas con mayor frecuencia en un laboratorio de Microbiología Clínica son E. coli y Klebsiella spp., seguidas por Enterobacter spp., Citrobacter spp. y diferentes especies del grupo Proteus-Morganella-Providencia o Salmonella spp. 40 IntroduccIón Mercedes delgado ValVerde Dentro de la familia hay especies consideradas patógenas primarias para el ser humano, como Shigella que produce cuadros de enteritis, Salmonella serotipo Typhi y Paratyphi cuya infección causa fiebre tifoidea y paratifoidea, o Yersinia pestis agente causal de la peste; mientras que otras especies forman parte de la flora comensal normal del ser humano y producen infecciones oportunistas, entre estas se encuentran los géneros Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Proteus o Serratia, con la excepción de las cepas de E. coli patógenas intestinales que son causa de enfermedad diarreica aguda (Tabla 2). Tabla 2. Especies de la familia Enterobacteriaceae con importancia clínica. Citrobacter freundii Proteus penneri Citrobacter koseri Providencia stuartii Edwardsiella tarda Providencia rettgeri Enterobacter cloacae Salmonella enterica Enterobacter aerogenes Serratia marcescens Escherichia coli Shigella dysenteriae Klebsiella pneumoniae Shigella flexneri Klebsiella oxytoca Shigella sonnei Morganella morganii Shigella boydii Pantoea agglomerans Yersinia pestis Proteus mirabilis Yersinia enterocolitica Proteus vulgaris Yersinia pseudotuberculosis Los mecanismos de trasmisión de estos microorganismos son muy variados y difieren de unas especies a otras. En general está estrechamente relacionado con el hábitat natural de las especies; de este modo pueden originar infecciones desde reservorios animales como la mayoría de las especies de Salmonella y Yersinia, a través de portadores humanos como en el caso de Shigella o Salmonella serotipo Typhi, o bien por diseminación endógena de los microorganismos en el tracto gastrointestinal del propio huésped como en el caso de las especies oportunistas96. Aunque se han descrito infecciones por enterobacterias en múltiples órganos y sistemas del ser humano, en la figura 9 se muestran los principales sistemas afectados, así como los principales géneros causantes de infección en los mismos. Son de especial relevancia las infecciones en el ámbito hospitalario, siendo las especies oportunistas las principales implicadas afectando a pacientes sondados, intubados, e inmunodeprimidos, causando infecciones urinarias, colecistitis, neumonía, infecciones de heridas quirúrgicas o sepsis. Mercedes delgado ValVerde IntroduccIón 41 Figura 9. Localizaciones más frecuentes de infección por enterobacterias. 1.6. ANTIBIÓTICOS BETALACTÁMICOS: PENICILINAS Y COMBINACIONES CON INHIBIDORES DE BETALACTAMASAS Los antibióticos betalactámicos (BL) son agentes en general bactericidas que ejercen su acción al inhibir la última etapa de la síntesis de la pared celular bacteriana, al impedir la elongación del peptidoglicano en formación. Son análogos estructurales del aminoácido terminal de las subunidades peptídicas precursoras de la pared de peptidoglicano, lo que facilita su unión de carácter irreversible al sitio activo de las peptidasas PBPs (penicilling binding proteins), interrumpiendo la elongación del peptidoglucano de la pared celular. Hasta hoy se han desarrollado gran cantidad de antibióticos BL naturales y derivados semisintéticos, que han convertido a esta familia de antimicrobianos en la más utilizada para el tratamiento de las enfermedades infecciosas causadas por enterobacterias107. Las penicilinas contienen un anillo betalactámico y un anillo de tiazolidina (figura 10), formando el ácido 6-aminopenicilanico. La presencia de una cadena lateral característica en la posición 6 del anillo betalactámico define el espectro bacteriano y las propiedades farmacológicas de las distintas penicilinas. De este modo, las penicilinas 48 IntroduccIón Mercedes delgado ValVerde 6. Producción de betalactamasas tipo OXA: por lo general este tipo de enzimas son resistentes a la acción de los IBL130. En los últimos se ha producido una gran diseminación de estas enzimas. 7. Inhibitor-resistant TEM betalactamases (IRT): en los primeros años de la década de los noventa se describieron betalactamasas plasmídicas resistentes a la inhibición por el ácido clavulánico. El estudio de su secuencia reveló que eran variantes de las betalactamasas TEM-1 y TEM-2, por ello se les denominó IRT. Estas enzimas se encontraron inicialmente en aislados de E. coli131, pero también se han detectado en Klebsiella spp., E. cloacae, P. mirabilis, C. freundii y S. sonnei132-136. Los aislados productores de IRT son resistentes a amino-, carboxi- y ureidopenicilinas pero sensibles a cefalosporinas, cefamicinas, carbapenémicos y en la mayoría de casos a PTZ. Sin embargo son resistentes a ampicilina-sulbac- tam e intermedios o resistentes a AMC. Las mutaciones que dan lugar a estas enzimas se producen en sitios muy específicos sobre la estructura del gen de TEM-1 y/o TEM-2. Los cambios más frecuentes se han descrito en la metionina 69, arginina 244, arginina 275 y aspártico 276 en las derivadas de TEM-1, y en lisina 39 en las IRT que derivan de TEM-2. (Tabla 5) La prevalencia real de estas enzimas se encuentra infraestimada, siendo quizás una de las principales razones para ello las discrepancias entre CLSI y EUCAST en los puntos de corte de las combinaciones de BL/IBL, así como en la concentración de clavulánico que se usa para realizar las pruebas de sensibilidad a AMC. En general, para la detección de IRT es preferible el uso de una concentración fija de clavulánico de 2 mg/L, tal como recomienda EUCAST, frente al uso de un ratio 2:1 como recomienda CLSI. Además se ha de tener en cuenta que el nivel de resistencia a las combinaciones BL/IBL se correlaciona con el número de copias de la enzima, por lo que una producción de bajo nivel podría ser indetectable cuando se utiliza un ratio 2:1128. 8. Complex mutant TEM (CMT): en algunos casos se producen mutaciones en TEM que además de afectar a la sensibilidad de los inhibidores afecta a las cefalosporinas de amplio espectro, dando lugar a las enzimas CMT. Para la aparición de estas enzimas es necesario que se produzcan simultáneamente mutaciones en TEM tipo BLEE e IRT. Las CMT se caracterizan por afectar de forma variable a la actividad de las oximino-cefalosporinas y de los IBL. Hasta la fecha se han descrito 10 enzimas de esta familia (https://www.lahey.org/Studies/), las cuales han sido identificadas en diferentes especies de enterobacterias, incluidas E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis y E. aerogenes137-140. La detección en el laboratorio de estas enzimas puede ser difícil, ya que el resultado del test de sinergia con doble disco de clavulánico puede verse reducido debido a un alto nivel de resistencia a ácido clavulánico y a la actividad variable sobre cefalosporinas128, 139. Mercedes delgado ValVerde IntroduccIón 49 Tabla 5: Sustituciones aminoacídicas en IRT derivadas de TEM-1 y TEM-2. Fuente: Canton, 2008128. 1.6.2. Sensibilidad a piperacilina-tazobactam. Puntos de corte CLSI y EUCAST PTZ es un antibiótico BL/IBL de amplio espectro con actividad frente a bacterias gramnegativas y grampositivas. En la actualidad CLSI y EUCAST difieren en el punto de corte de sensibilidad del mismo, de modo que CLSI recomienda considerar a los aislados con CMI ≤16/4 mg/L como sensibles, 32-64/4 mg/L como intermedios y ≥128/4 mg/L como resistentes141, mientras que EUCAST considera los aislados con CMI ≤8/4 mg/L sensibles, 16/4 mg/L como intermedios y ≥32/4 mg/L resistentes39. Ambos comités utilizan una concentración fija de 4 mg/L de tazobactam para determinar la CMI de la 50 IntroduccIón Mercedes delgado ValVerde combinación. La diferencia en el punto de corte origina discrepancias en la interpretación del antibiograma y diferentes porcentajes de resistencia en función del comité usado en la interpretación. En Europa, en el control de calidad externo del European Antimicrobial Resistance Surveillance System realizado en 2014, en el que participaron 837 centros de 30 países se determinó la sensibilidad a PTZ en E. coli y K. pneumoniae. Un 20% de los centros usaron los criterios CLSI, mientras que un 72% usó EUCAST. En E. coli, los resultados del control de calidad mostraron grandes discrepancias en los informes de sensibilidad con una concordancia del 57,3%; los centros que usaron los puntos de corte CLSI informaron el aislado como sensible en un 59,5% de los casos frente a un 38,9% en los centros que seguían recomendaciones EUCAST, el aislado fue informado como intermedio en un 28% de los casos independientemente del punto de corte aplicado, y resistente en un 12,3% según CLSI frente a un 32,6% según EUCAST. Sin embargo, la concordancia en K. pneumoniae fue del 98,8%142. En general el número de aislados de enterobacterias resistentes a PTZ no es elevado, el porcentaje de resistencia descrito en diferentes publicaciones se encuentra en torno al 10%143, 144. 1.6.3. Sensibilidad a amoxicilina-clavulánico. Puntos de corte CLSI y EUCAST. Controversia sobre el método AMC es un antibiótico BL/IBL de amplio espectro con actividad frente a bacterias gramnegativas y grampositivas. CLSI y EUCAST difieren en el punto de corte y en la concentración de ácido clavulánico que se debe usar para determinar la CMI. CLSI recomienda usar un ratio de concentración 2:1 de AMC, y considera a los aislados con CMI ≤8/4 mg/L sensibles, 16/8 mg/L intermedios y ≥32/16 mg/L resistentes141. Por otro lado, EUCAST propone usar una concentración fija de 2 mg/L de clavulánico cuando se use su punto de corte, según el cual los aislados con CMI ≤8/2 mg/L son sensibles y con CMI >8/2 mg/L resistentes, la categoría intermedia no existe39. Estas diferencias han originado una gran variabilidad en los niveles de resistencias en enterobacterias entre los centros que realizan el antibiograma de acuerdo a CLSI o EUCAST. La concordancia en los resultados de CMI entre los métodos ha demostrado ser muy baja. Díez-Aguilar et al. determinó una concordancia menor del 30% en la CMI de AMC por microdilución en caldo en aislados clínicos de E. coli, en este estudio un 79% de los aislados fueron resistentes de acuerdo a EUCAST, mientras que por CLSI lo fueron el 60%69. En otro trabajo realizado en Holanda, los autores también informaron de una mayor tasa de resistencia en aislados de E. coli de pacientes con bacteriemia cuando se aplicaban las recomendaciones y los puntos de corte de EUCAST, en este caso las CMIs se determinaron mediante sistemas automatizados y E-Test. En este trabajo además se correlacionó la CMI de AMC con el pronóstico clínico de pacientes con bacteriemia, mostrando la metodología EUCAST una mejor correlación con la respuesta clínica de los pacientes70. Sin embargo, este trabajo tiene importantes limitaciones para evaluar la respuesta clínica: además de ser retrospectivo, no incluyó un análisis del impacto de posibles factores de confusión (como el foco de infección o la gravedad de los pacientes) en la respuesta clínica; no se conoce si se cambió el antimicrobiano o cuanta fue la duración de la exposición al mismo; y finalmente usó un criterio de respuesta poco específica. En general, la CMI Mercedes delgado ValVerde IntroduccIón 51 determinada usando un ratio 2:1 origina mayores porcentajes sensibilidad que cuando se determina usando una concentración fija de ácido clavulánico y aunque se ha indicado que esta última parece predecir mejor la eficacia clínica del tratamiento con AMC, las evidencias al respecto son débiles145, 146. Además, los datos de concordancia de los métodos de CLSI y EUCAST para especies de Enterobacteriaceae distintas de E. coli son escasos. 1.6.4. Efecto inóculo: controversias El efecto inóculo se define como la influencia de la concentración bacteriana en la sensibilidad antibiótica, de modo que se considera que existe efecto inóculo cuando al aumentar la concentración de microorganismos se produce un aumento de la CMI. Diferentes trabajos han establecido considerar la presencia de este efecto cuando la CMI aumenta 8 veces o más147, 148. El efecto inoculo en antibióticos BL ha sido ampliamente estudiado, la mayoría de estos experimentos se han realizado in vitro, sin embargo pocos trabajos han demostrado la existencia in vivo de este efecto, por lo tanto es difícil establecer la trascendencia que tiene en la terapéutica antimicrobiana. Parece haber consenso en cuanto a la existencia de este efecto en PTZ tanto en aislados no productores de betalactamasas como en aislados productores de las mismas. En los aislados productores de betalactamasas, parece que el efecto es más marcado cuando la betalactamasa pertenece a la familia SHV147-149. López-Cerero et al. estudiaron el efecto inóculo de AMC y PTZ en aislados de E. coli en ensayos in vitro, los resultados mostraron que la actividad de PTZ, pero no la de AMC, se veía afectada por la concentración bacteriana inicial del ensayo. En este estudio se usaron cepas de E. coli productoras de distintas betalactamasas y dos cepas sin estos mecanismos de resistencia. En estos casos se observó que la existencia de un efecto inóculo era independiente de la producción de betalactamasas148. Posteriormente, Docobo-Pérez et al. estudiaron la influencia del efecto inóculo en la eficacia del tratamiento con AMC y PTZ en un modelo de sepsis peritoneal murino. De nuevo, se puso de manifiesto el efecto inóculo en PTZ pero no en AMC en una cepa no productora de betalactamasa. Sin embargo, esto no ocurrió con una cepa productora de CTX-M-14. Esto pudo ser debido a la menor semivida de eliminación del ácido clavulánico respecto al tazobactam150. Con los datos disponibles no se puede asegurar que el efecto inóculo tenga relevancia en el tratamiento de los pacientes, ya que se desconoce si su existencia es un artefacto de laboratorio o un efecto con implicaciones clínicas151. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Mercedes delgado ValVerde HIpótesIs y objetIVos 55 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 2.1. HIPÓTESIS DE TRABAJO 2.1.1. Los pacientes con bacteriemia por bacterias de la familia Enterobacteriaceae tratados con piperacilina-tazobactam no tienen peor pronóstico si la cepa tiene una CMI cercana al punto de corte de las cepas sensibles, usando los criterios EUCAST. 2.1.2. La metodología para el estudio de sensibilidad de EUCAST y CLSI para amoxicilina-clavulánico no proporcionan resultados concordantes para distintas bacterias de la familia Enterobacteriaceae. 2.1.3. Las metodologías de EUCAST y CLSI no tiene el mismo valor predictor del pronósticos de los pacientes con bacteriemia por Enterobacteriaceae tratados con amoxicilina-clavulánico. 2.2. OBJETIVOS DEL ESTUDIO 2.2.1. Objetivos principales 2.2.1.1. Evaluar si los pacientes con bacteriemia por Enterobacteriaceae con CMI en el límite de sensibilidad (8-16 mg/L) de piperacilina-tazobac- tam y tratados con este antimicrobiano presentan peor pronóstico que aquellos con cepas que presentan CMI menores a 8 mg/L. 2.2.1.2. Evaluar la concordancia de valores de CMI de amoxicilina-clavuláni- co en Enterobacteriaceae aisladas de hemocultivos entre las metodologías de EUCAST y CLSI. 2.2.1.3. Estudiar el valor predictivo de las CMI de amoxicilina-clavulánico obtenidas mediante EUCAST y CLSI para el pronóstico de los pacientes con bacteriemia por Enterobacteriaceae, controlando el efecto de posibles variables confusoras. 2.2.2. Objetivo secundario 2.2.2.1. Conocer los factores predictores del pronóstico en pacientes con bacteriemia por Enterobacteriaceae tratados con piperacilina-tazobac- tam y amoxicilina-clavulánico. RESULTADOS 64 resultados Mercedes delgado ValVerde Table 4. Univariate analysis of the association between different variables and clinical failure at day 21 Variable Category No. of patients who failed at day 21/no. of patients in category (%) RR (95% CI) P Gender male 15/179 (8.4) Reference female 9/96 (9.4) 1.12 (0.51–2.46) 0.78 Age ≤65 4/81 (4.9) reference .65 20/193 (10.4) 2.09 (0.74–5.95) 0.147 Mechanical ventilation no 21/266 (7.9) reference yes 3/9 (33.3) 4.22 (1.54–11.63) 0.035 Charlson index ,2 5/132 (3.8) reference ≥2 19/143 (13.3) 3.51 (1.35–9.09) 0.005 Pitt score 0–1 7/177 (4.0) reference ≥2 17/97 (17.5) 4.42 (1.90–10.31) 0.0001 Onset nosocomial 17/167 (10.2) reference community 7/108 (6.5) 0.64 (0.27–1.48) 0.289 Source urinary tract 5/71 (7.0) reference others 19/204 (9.3) 1.32 (0.51–3.41) 0.559 biliary tract 5/133 (3.8) reference others 19/142 (13.4) 3.56 (1.37–9.26) 0.005 abdominal 5/27 (18.5) reference others 19/248 (7.7) 0.414 (0.16–1.01) 0.071 vascular catheter 1/12 (8.3) reference others 23/263 (8.7) 1.049 (0.15–7.14) 1 respiratory 6/15 (40.0) reference others 18/260 (6.9) 0.173 (0.08–0.37) 0.001 Severe sepsis or septic shock no 8/182 (4.4) reference yes 16/92 (17.4) 3.95 (1.76–8.93) 0.0001 MIC of piperacillin/tazobactam low 22/248 (8.9) reference borderline 2/27 (7.4) 0.83 (0.21–3.36) 1 Aetiology E. coli 15/174 (8.6) reference others 9/101 (8.9) 1.03 (0.47–2.28) 0.934 ESBL producer no 22/262 (8.4) reference yes 2/13 (15.4) 1.831 (0.48–0.69) 0.316 Antibiotic changed no 11/59 (18.6) reference yes 13/216 (6.0) 0.322 (0.15–0.68) 0.002 50% fT .MIC no 0/4 (0) yes 20/237 (8.4) — 1 100% fT .MIC no 5/45 (11.1) reference yes 15/196 (7.7) 0.689 (0.26–1.79) 0.547 Table 5. Multivariate analysis of variables associated with clinical failure at day 21 and at end of treatment with piperacillin/tazobactam and mortalityat day 30 among patients with bacteraemia due to Enterobacteriaceae Variable Failure at day 21 Failure at end of treatment with piperacillin/tazobactam Mortality at day 30 OR (95% CI) POR (95% CI) POR (95% CI) P Charlson index 1.30 (1.09–1.55) ,0.01 1.14 (0.98–1.33) 0.09 1.36 (1.14–1.63) ,0.001 Pitt score 1.28 (1.00–1.63) 0.05 1.24 (0.99–1.54) 0.05 1.41 (1.09–1.82) ,0.01 Severe sepsis or septic shock 2.8 (0.95–8.30) 0.06 2.07 (0.88–4.88) 0.09 3.43 (1.16–10.2) 0.02 Source in biliary tract 0.37 (0.13–1.07) 0.06 0.22 (0.53–0.09) 0.001 4.52 (1.44–14.22) 0.01 Borderline MIC 0.96 (0.18–4.88) 0.96 0.47 (0.10–2.26) 0.35 1.48 (0.33–6.68) 0.6 Delgado-Valverde et al. 526 at UNIVERSIDAD DE SEVILLA on January 15, 2016http://jac.oxfordjournals.org/Downloaded from Mercedes delgado ValVerde resultados 65 The final multivariate model is shown in Table 5. According to this model, a biliary tract source showed an independent protective effect against mortality, whereas severe sepsis or septic shock, Pitt score and Charlson index were associated with increased mortality. Borderline MIC of piperacillin/tazobactam showed no association. Again, severe sepsis/shock or source of bacteraemia did not show significant modification effects. In this model, the area under the ROC curve was 0.85. Again, the MIC of piperacillin/tazobactam as a continuous variable caused no change; the MIC showed an RR of 1.05 (95% CI¼0.9–1.24), P¼0.5. %fT .MIC did not improve the model [OR (95% CI) was 0.99 (0.94–1.04), P¼0.59] and MID concentration/MIC and END concentration/ MIC showed no impact on this model (data not shown). We additionally performed analyses using 7 and 14 day mortality as outcomes; the adjusted OR (95% CI) for piperacillin/tazobactam borderline MIC was 1.98 (0.15–25.31) and 1.93 (0.32–11.48), respectively. The outcomes according to MIC were analysed in the subgroup of patients with a source of bacteraemia different from biliary or urinary tract (71 patients); only seven of them had isolates with a borderline MIC. No trends towards higher failure or mortality were shown; in fact, both failure and mortality were 14.3% (one patient) among those with borderline MIC and 35.9% and 26.6% among those with a low MIC, respectively. The results of the multivariate analysis and CART classification tree (Figure S1, available as Supplementary data at JAC Online) indicated that Charlson index, biliary source, age and severe sepsis or septic shock were the important prognostic factors for this kind of infection. The MIC had no influence. The sensitivity and specificity of the analysis were 69.9% and 89.7% respectively; the AUC Table 6. Univariate association between epidemiological, clinical and microbiological variables and mortality at day 30 among patients with bacteraemia due to Enterobacteriaceae Variable Category No. of patients who died/no. of patients in category (%) RR (95% CI) P Gender male 19/179 (10.6) reference female 10/96 (10.4) 0.981 (0.475–2.025) 0.96 Age ≤65 4/81 (4.9) reference .65 25/193 (13.0) 2.625 (0.94–7.299) 0.05 Mechanical ventilation no 24/266 (9.0) reference yes 5/9 (55.6) 6.173 (3.06–12.356) 0.001 Charlson index ,2 5/132 (3.8) reference ≥2 24/143 (16.8) 4.425 (1.742–11.256) 0.0001 Pitt score 0–1 9/177 (5.1) reference ≥2 19/97 (19.6) 3.846 (1.815–8.197) 0.0001 Onset nosocomial 21/167 (12.6) reference community 8/108 (7.4) 0.588 (0.27–1.282) 0.17 Source urinary tract 6/71 (8.5) reference others 23/204 (11.3) 1.33 (0.566–3.144) 0.51 biliary tract 5/133 (3.8) reference others 24/142 (16.9) 4.504 (1.767–11.494) 0.0001 abdominal 6/27 (22.2) reference others 23/248 (9.3) 0.417 (0.186–0.935) 0.049 vascular catheter 1/12 (8.3) reference others 28/263 (10.6) 1.277 (0.189–8.62) 1 respiratory 7/15 (46.7) reference others 22/260 (8.5) 0.181 (0.093–0.355) 0.0001 Severe sepsis or septic shock no 8/182 (4.4) reference yes 20/92 (21.7) 4.95 (2.268–10.753) 0.0001 MIC of piperacillin/tazobactam low 26/248 (10.5) reference borderline 3/27 (11.1) 1.059 (0.343–3.268) 1 Aetiology E. coli 15/174 (8.6) reference others 14/101 (13.9) 1.608 (0.809–3.195) 0.17 ESBL producer no 28/262 (10.7) reference yes 1/13 (7.7) 0.719 (0.106–4.878) 1 Antibiotic changed no 12/59 (20.3) reference yes 17/216 (7.9) 0.39 (0.196–0.765) 0.006 50% fT .MIC no 0/4 (0) yes 22/237 (9.3) — 1 100% fT .MIC no 6/45 (13.3) reference yes 16/196 (8.2) 0.612 (0.254–1.477) 0.263 Piperacillin/tazobactam MIC related to bacteraemic-patient outcome 527 JA C at UNIVERSIDAD DE SEVILLA on January 15, 2016http://jac.oxfordjournals.org/Downloaded from 66 resultados Mercedes delgado ValVerde (0.84) showed an excellent classification and diagnostic performance of the model. Discussion In this prospective cohort study and using carefully designed and executed assessments of outcome, we did not find that a borderline piperacillin/tazobactam MICwas associated with a worse outcome than a lower MIC among patients with bacteraemia due to Enterobacteriaceae treated with this antibiotic. The influence of other variables was as expected: severity of chronic underlying illness as measured by the Charlson index; severity of acute condition according to Pitt score; presentation with severe sepsis or septic shock were independent factors associated with a worse prognosis; while a biliary tract source had a protective effect. An overall interpretation of these results would be that the specific MIC of piperacillin/tazobactam, if susceptible, has no significant impact on outcome, which would therefore reinforce established breakpoints. Specifically, we think that our data are not enough to suggest that EUCAST susceptibility breakpoint should be changed to 16 mg/L. In fact, to interpret the data presented accurately, several important considerations should be mentioned. Clinical studies are needed to help establish susceptibility breakpoints, but, because such studies are scarce, 22–25 decisions about breakpoints are mainly based on in vitro and PK-PD studies. Designing and developing an observational study with this objective (finding an MIC cut-off to predict clinical outcomes) presents a challenge, since it requires a large number of patients infected with organisms with different MICs treated with a specific antibiotic, carefully chosen inclusion criteria that avoid exposure bias, accurate outcome definitions and assessment, and appropriate control for confounders. One systematic review of previous studies performed in Enterobacteriaceae that provided information on MIC-related outcomes disclosed that they were not designed for that purpose and so lacked essential data such as dosing, determination of MIC using reference methods or control for confounders, among other limitations. 25 Consequently, meta-analyses of data from those studies provided limited results. We tried to overcome these limitations in our study. None the less, some limitations must be taken into account, including low statistical power to detect differences because of a smaller number of patients with a borderline MIC and the fact that we mainly evaluated the impact of empirical piperacillin/ tazobactam, because the therapy was changed in a substantial proportion of patients; however, in bacteraemic patients, empirical therapy is an important determinant of outcome. 26 In this study, we compared the clinical outcomes of patients with low (≤4 mg/L) and borderline susceptible (8–16 mg/L) MICs; we included isolates with MIC¼16 mg/L (considered intermediate according to EUCAST breakpoints) because some PK studies using Monte Carlo simulation suggested that satisfactory target attainment rates can be achieved for pathogens with MICs up to 16 mg/L when piperacillin/tazobactam is administered at 4.5 g every 6 or 8 h in continuous infusion (94% and 82%, respectively), but are much lower for higher MICs or other doses. 15 In our study, most patients received 4.5 g every 8 h, using either a bolus or continuous infusion (infusion duration ≥3 h). Unfortunately, due to the low numbers, we could not make a comparison between these two methods of administering the drug. Whatever the infusion time, this dose seems to be appropriate according to our data, and is the usual dose in most European countries. 7 We cannot provide data for 3.375 g every 8 h, which is frequently used in the USA and other countries, but we would expect lower probability for target attainment. Interestingly, even though we could not measure piperacillin/ tazobactam levels due to funding limitations, our estimates of exposure suggested that most patients with susceptible isolates reached at least 50% of the time above the MIC for the isolate with the dose used. Piperacillin/tazobactam concentrations have been shown to vary widely in critically ill patients, 27–29 although it should be noted that the majority of our patients were not critically ill (only 3.5% were under mechanical ventilation at the onset of bacteraemia), although a substantial proportion had severe sepsis or severe shock. Preliminary data of piperacillin/tazobactam concentrations measured in a very similar population also supported the notion that the PK-PD target was attained in a sample of similar patients with bacteraemia due to Enterobacteriaceae. 30 Our results would therefore mainly apply to patients who are not critically ill. Another critical variable is the infection source. A previous small series of bacteraemic infections caused by ESBL-producing E. coli showed that the piperacillin/tazobactam MIC had no influence on urinary tract infections, but had a possible impact on other sources. 31 The most common source in our cohort was the biliary tract, even more than the urinary tract, reflecting the fact that piperacillin/tazobactam is frequently used in empirical therapy for healthcare-associated biliary tract infections in Spain. This a relatively benign source when compared with nosocomial pneumonia or other complicated intra-abdominal infections; 26 in our analysis, it was a protective factor. Even though the source effect was controlled for in the multivariate analysis, we do think that more studies investigating the impact of piperacillin/tazobactam MIC within the susceptible range should be carried out for other types of infection. One aspect of specific interest is the influence of piperacillin/ tazobactam MICs in the treatment of patients with infection caused by ESBL-producing Enterobacteriaceae. Previous data suggested that piperacillin/tazobactam at the doses used in this study would be efficacious for the treatment of bacteraemia due to susceptible ESBL-producing E. coli, particularly if the sources are the urinary or biliary tracts, 31,32 but some doubts were raised for isolates with borderline MICs from other sources. 33 The ESBL producers with borderline MICs were not associated with worse outcomes in univariate or multivariate analyses in our study; however, only two of these cases had a source different than urinary or biliary tract, precluding any further analysis. Other limitations of our study should also be considered when interpreting the results. First, the sample size was small, particularly in the borderline MIC group, which limited its power to detect the potential influence of MIC. None the less, this is, to the best of our knowledge, the largest study to date specifically to investigate this topic. Secondly, piperacillin/tazobactam was not always maintained throughout the full course of treatment of the patient. Since we had anticipated that this would be the case, we collected the reasons why therapy was changed, included clinical response at the end of piperacillin/tazobactam therapy as one of the outcome variables, and considered any change as failure, unless performed for de-escalation or dosage convenience. Finally, piperacillin/tazobactam exposure was estimated using a PK model because we could not measure plasma concentrations. Delgado-Valverde et al. 528 at UNIVERSIDAD DE SEVILLA on January 15, 2016http://jac.oxfordjournals.org/Downloaded from Mercedes delgado ValVerde resultados 67 In conclusion, we did not find that higher piperacillin/ tazobactam MIC within the susceptible or intermediate susceptibility range had a significant influence on the outcome of patients with bacteraemia due to Enterobacteriaceae. These results applied mainly to non-critically ill patients receiving 4.5 g every 8 h with biliary and urinary tract infections. More studies of other populations are needed. Acknowledgements Other investigators from the REIPI/GEIH-SEIMC BACTERAEMIA-MIC group Marina de Cueto (Unidad Clı ´nica Intercentros de Enfermedades Infecciosas, Microbiologı ´a y Medicina Preventiva, Hospitales Universitarios Virgen Macarena y Virgen del Rocı ´o, Seville, Spain), Ana Maria Planes Reig (Departamento de Microbiologı ´a, Hospital Universitari Valld’Hebron, Barcelona, Spain), Fe Tubau Quintano (Servicio de Microbiologı ´a, Hospital Universitario de Bellvitge-IDIBELL, Barcelona, Spain), Carmen Pen˜a (Servicio de Enfermedades Infecciosas, Hospital Universitario de Bellvitge-IDIBELL, Barcelona, Spain), M. Elvira Gala ´n Otalora (Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona, Spain), Carlos Ruı ´z de Alegrı ´a (Servicio de Microbiologı ´a, Hospital Universitario Marque ´s de Valdecilla, Santander, Spain), M. Isabel Morosini (Servicio de Microbiologı ´a, Hospital Universitario Ramo ´n y Cajal and Instituto Ramo ´n y Cajal de Investigacio ´n Sanitaria (IRYCIS), Madrid, Spain), Jose ´Antonio Lepe (Unidad Clı ´nica Intercentros de Enfermedades Infecciosas, Microbiologı ´a y Medicina Preventiva, Hospitales Virgen Macarena y Virgen del Rocı ´o, Seville, Spain), Jose ´Miguel Cisneros (Unidad Clı ´nica Intercentros de Enfermedades Infecciosas, Microbiologı ´ay Medicina Preventiva, Hospitales Universitarios Virgen Macarena y Virgen del Rocı ´o, Seville, Spain), Shawna Morey (Vassar Brothers Medical Center, Poughkeepsie, NY, USA, and Optimum Dosing Strategies, Bloomingdale, NJ, USA) and Mohd-Hafiz Abdul-Aziz (University of Queensland, Brisbane, Australia). Funding The study was funded by the Instituto de Salud Carlos III, Ministry of Economy and Competitiveness, Spain (FIS; PI10/02021) co-financed by European Development Regional Fund ‘A way to achieve Europe’ ERDF, Spanish Network for Research in Infectious Diseases (REIPI RD12/ 0015). J. A. R. is funded, in part, by an Australian National Health and Medical Research Council Research Fellowship (APP1048652). Transparency declarations B. A. has been a scientific advisor for AstraZeneca, Merck, Pfizer, Novartis, Astellas and Gilead, and has been a speaker for AstraZeneca, Merck, Pfizer, Astellas, Gilead and Novartis. R. C. is currently Chairman of EUCASTand has participated in educational programmes organized by AstraZeneza and MSD. J. A. R. has been a scientific advisor for InfectoPharm and Merck. J. R.-B. has been a scientific advisor for AstraZeneca, Merck, Roche, Achaogen, InfectoPharm and Basilea, and has been a speaker for Astellas, AstraZeneca, Merck, Pfizer and Novartis. All other authors: none to declare. Supplementary data Table S1 and Figure S1 are available as Supplementary data at JAC Online (http://jac.oxfordjournals.org/). References 1Mouton JW, Brown DF, Apfalter P et al. The role of pharmacokinetics/ pharmacodynamics in setting clinical MIC breakpoints: the EUCAST approach. Clin Microbiol Infect 2012; 18: E37–45. 2EUCAST. Breakpoint Tables for Interpretation of MICs and Zone Diameters, Version 5.0. 2015. http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/. 3Dudley MN, Ambrose PG. Pharmacodynamics in the study of drug resistance and establishing in vitro susceptibility breakpoints: ready for prime time. Curr Opin Microbiol 2000; 3: 515–21. 4Turnidge J, Paterson DL. Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints. Clin Microbiol Rev 2007; 20: 391–408, table of contents. 5Craig WA. Pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters: rationale for antibacterial dosing of mice and men. 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Artículo 2: MIC of amoxicillin/clavulanate according to CLSI and EUCAST: discrepancies and clinical impact in patients with bloodstream infections due to Enterobacteriaceae MIC of amoxicillin/clavulanate according to CLSI and EUCAST: discrepancies and clinical impact in patients with bloodstream infections due to Enterobacteriaceae Mercedes Delgado-Valverde 1 , Adoraci� on Valiente-Mendez 1 , Eva Torres 1 , Benito Almirante 2 , Silvia G� omez-Zorrilla 3 , Nuria Borrell 4 , Ana Isabel Aller-Garc� ıa 5 , Mercedes Gurgui 6,7 , Manel Almela 8 , Mercedes Sanz 9 , Germ� an Bou 10 , Luis Mart� ınez-Mart� ınez 11,12 , Rafael Cant� on 13 , Jose Antonio Lepe 1 , Manuel Causse 14 , Bele´n Gutie´rrez-Gutie´rrez 1 , � Alvaro Pascual 1,15 † and Jes� us Rodr� ıguez-Ba~ no 1,16 *†, on behalf of the REIPI/GEIH-SEIMC BACTERAEMIA-MIC Group‡ 1 Unidad Cl� ınica Intercentros de Enfermedades Infecciosas, Microbiolog� ıa y Medicina Preventiva, Hospitales Universitarios Virgen Macarena y Virgen del Roc� ıo—IBiS, Seville, Spain; 2 Departamento de Enfermedades Infecciosas, Hospital Universitari Vall d’Hebron, Barcelona, Spain; 3 Servicio de Enfermedades Infecciosas, Hospital Universitari de Bellvitge-IDIBELL, Barcelona, Spain; 4 Servicio de Microbiolog� ıa, Hospital Son Espases, Palma de Mallorca, Spain; 5 Unidad Cl� ınica de Enfermedades Infecciosas y Microbiolog� ıa, Hospital Universitario de Valme, Seville, Spain; 6 Servicio de Enfermedades Infecciosas, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona, Spain; 7 Facultad de Medicina, Universitat Aut� onomade Barcelona, Barcelona, Spain; 8 Servicio de Microbiolog� ıa, Hospital Cl� ınic, Barcelona, Spain; 9 Departamento de Enfermedades Infecciosas, Hospital San Pedro–CIBIR, Logro~ no, Spain; 10 Servicio de Microbiolog� ıa, Complejo Hospitalario Universitario A Coru~ na, A Coru~ na, Spain; 11 Servicio de Microbiolog� ıa, Hospital Universitario Marque´s de Valdecilla-IDIVAL, Santander, Spain; 12 Departamento de Biolog� ıa Molecular, Universidad de Cantabria, Santander, Spain; 13 Servicio de Microbiolog� ıa, Hospital Universitario Ram� on y Cajal and Instituto Ram� on y Cajal de Investigaci� on Sanitaria (IRYCIS), Madrid, Spain; 14 Unidad de Gesti� on Cl� ınica de Microbiolog� ıa, Hospital Universitario Reina Sof� ıa-Instituto Maim� onides de Investigaci� on Biome´dica de C� ordoba (IMIBIC), C� ordoba, Spain; 15 Departamento de Microbiolog� ıa, Universidad de Sevilla, Seville, Spain; 16 Departamento de Medicina, Universidad de Sevilla, Seville, Spain *Corresponding author. Unidad de Enfermedades Infecciosas, Hospital Universitario Virgen Macarena, Avda. Dr. Fedriani 3, 41009 Sevilla, Spain. Tel: +34 677906512; E-mail: [email protected] †These authors contributed equally to authorship. ‡Other members are listed in the Acknowledgements section. Received 17 August 2016; returned 25 November 2016; revised 1 December 2016; accepted 2 December 2016 Objectives: To compare results of amoxicillin/clavulanate susceptibility testing using CLSI and EUCAST methodologies and to evaluate their impact on outcome in patients with bacteraemia caused by Enterobacteriaceae. Patients and methods: A prospective observational cohort study was conducted in 13 Spanish hospitals. Patients with bacteraemia due to Enterobacteriaceae who received empirical intravenous amoxicillin/clavulanate treatment for at least 48 h were included. MICs were determined following CLSI and EUCAST recommendations. Outcome variables were: failure at the end of treatment with amoxicillin/clavulanate (FEAMC); failure at day 21; and 30 day mortality. Classification and regression tree (CART) analysis and logistic regression were performed. Results: Overall, 264 episodes were included; the urinary tract was the most common source (64.7%) and Escherichia coli the most frequent pathogen (76.5%). Fifty-two isolates (19.7%) showed resistance according to CLSI and 141 (53.4%) according to EUCAST. The kappa index for the concordance between the results of both committees was only 0.24. EUCAST-derived, but not CLSI-derived, MICs were associated with failure when considered as continuous variables. CART analysis suggested a ‘resistance’ breakpoint of .8/4 mg/L for CLSI-derived MICs; it predicted FEAMC in adjusted analysis (OR "1.96; 95% CI: 0.98–3.90). Isolates with EUCAST-derived MICs .16/2 mg/L independently predicted FEAMC (OR "2.10; 95% CI: 1.05–4.21) and failure at day 21 (OR"3.01; 95% CI: 0.93–9.67). MICs .32/2 mg/L were only predictive of failure among patients with bacteraemia from urinary or biliary tract sources. Conclusions: CLSI and EUCAST methodologies showed low agreement for determining the MIC of amoxicillin/ clavulanate. EUCAST-derived MICs seemed more predictive of failure than CLSI-derived ones. EUCAST-derived MICs .16/2 mg/L were independently associated with therapeutic failure. V CThe Author 2017. Published by Oxford University Press on behalf of the British Society for Antimicrobial Chemotherapy. All rights reserved. For Permissions, please email: [email protected]. 1 of 10 J Antimicrob Chemother doi:10.1093/jac/dkw562 Journal of Antimicrobial Chemotherapy Advance Access published January 15, 2017 at UNIVERSIDAD DE SEVILLA on January 17, 2017http://jac.oxfordjournals.org/Downloaded from 70 resultados Mercedes delgado ValVerde Introduction Clinical breakpoints for the interpretation of antimicrobial susceptibility testing of microorganisms in the laboratory are set by international expert committees to help guide clinical decisions in antimicrobial therapy. 1 EUCAST 2 and CLSI 3 use a range of information to do this, including: MIC distributions for large collections of microorganisms; genotypic resistance markers; pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of the antimicrobials; and clinical outcomes observed in patients relative to MIC values, when available. 1,4 Unfortunately, clinical data supporting the establishment of clinical breakpoints are usually lacking particularly for older drugs, so that in vitro data, animal experiments and pharmacokinetic and pharmacodynamic stochastic models are frequently the only dataavailable for these decisions. 5 Amoxicillin/clavulanate is a broad-spectrum b-lactam/ b-lactamase inhibitor combination with activity against Gramnegative and -positive bacteria. EUCASTrecommends using a fixed concentration of 2mg/L clavulanate for susceptibility testing of the amoxicillin/clavulanate combination; Enterobacteriaceae with MICs 8/2 mg/L are considered as susceptible and those with MICs .8/2 mg/L are considered as resistant for invasive infections. 2 CLSI recommends using a 2:1 ratio of amoxicillin/clavulanate, and considers Enterobacteriaceae with MICs 8/4mg/L as susceptible, but classifies those with MICs 16/8mg/L as intermediate and those with MICs 32/16 mg/L as resistant. 3 The rationale for using a fixed concentration for clavulanate in EUCAST recommendations is based on the fact that a minimum concentration of the drug is needed to exert its inhibitory effect on b-lactamases; such concentrations would not be reached for low concentrations of amoxicillin if using a 2:1 ratio. Previous studies on Escherichia coli isolates have shown low agreement between the results obtained with the two methods, with EUCAST methodology providing higher rates of resistance; 6,7 data on other Enterobacteriaceae and a more detailed analysis of the clinical implications of the results obtained using these two methods are needed. The objective of this study was to evaluate the impact of amoxicillin/clavulanate MIC values on the clinical outcome of patients with bacteraemia caused by Enterobacteriaceae when treated following the recommendations of these two methodologies. Patients and methods This study forms part of the Bacteraemia-MIC project, aimed at investigating the impact of the MICs of different antimicrobials on the outcome of bacteraemia due to Enterobacteriaceae, 8 and was designed as a prospective observational multicentre cohort study, conducted between January 2011 and December 2013 at 13 Spanish university hospitals belonging to the Spanish Network for Research in Infectious Diseases (REIPI) (www.reipi. org). Patients aged .17 years with monomicrobial bacteraemia due to Enterobacteriaceae, and monotherapy with a b-lactam or fluoroquinolone as initial treatment were identified by daily communication with the microbiology laboratory; patients were included in the Bacteraemia-MIC database if the first antibiotic dose was administered in the first 12h after blood cultures were obtained and for at least 48h. Patients with any of the following criteria were excluded: transient bacteraemia (occurring after an invasive procedure such as digestive tract endoscopy that cleared without treatment and had no complications); polymicrobial bacteraemia; nonhospitalized patients; patients with do-not-resuscitate orders; neutropenic patients (total neutrophil count ,500/mm 3 ); and survival ,24h after blood cultures were obtained. In this analysis, only patients initially treated with intravenous amoxicillin/clavulanate in monotherapy for at least 48h were included; patients could be changed later to another antibiotic. Ethics The study was approved by the Ethics Committee of the Hospital Universitario Virgen Macarena, which waived the need to obtain consent because of the observational nature of the study. Variables and definitions The outcome variables were: (i) clinical response at the end of treatment with amoxicillin/clavulanate; (ii) clinical response at day 21, irrespective of whether amoxicillin/clavulanate continued for the full course of treatment or was changed to another antibiotic; and (iii) all-cause 30day mortality. Clinical response at the end of therapy with amoxicillin/clavulanate was classified as: (i) ‘clinical cure’ if all symptoms and signs of infection were completely resolved and no further antibiotics were needed; (ii) ‘improvement’ if all symptoms and signs of infection were completely or partially resolved and antibiotic therapy for the episode was continued with another drug because of one of the following reasons: (a) de-escalation, (b) switch to an oral drug, (c) change to a more convenient parenteral drug for outpatient therapy, or (d) reported in vitro resistance to amoxicillin/clavulanate; and (iii) ‘failure’, if a switch to, or addition of, another antibiotic was needed because infection-related symptoms or signs worsened or persisted, or death from any cause occurred. Clinical response at day 21 was classified as: (i) ‘clinical cure’ if all symptoms and signs of infection were completely resolved and all antibiotics were stopped; (ii) ‘improvement’ if symptoms and signs of infection improved, but had not completely resolved; and (iii) ‘failure’ if there were persistent, recurrent or new symptoms or signs present related to the infection, or death occurred. Clinical response at the end of treatment with amoxicillin/clavulanate and at day 21 was determined by a trained clinical investigator at each site; however, because of the subjectivity of this endpoint, one investigator (J. R. B.), blinded with respect to exposure (MIC of amoxicillin/clavulanate), assessed the clinical response data of all cases according to vital signs, evolution of Pitt 9,10 and SOFA 11 scores, and laboratory data at the end of treatment with amoxicillin/clavulanate and at day 21. When the assessment of clinical response made by the blind investigator differed from the one indicated by the local investigator, a query was sent to the local team with the indication to review the case, and agreement was reached based onavailable data. Data collected included: patient demographics; height; weight; site of acquisition, classified as community, healthcare-associated or nosocomial according to Friedman’s criteria; 12 chronic underlying diseases; severity of underlying condition according to the Charlson score 13 and McCabe classification; 14 severity of acute condition according to Pitt and SOFA scores; invasive procedures; source of bacteraemia according to standard clinical and microbiological criteria; 15 severity of systemic inflammatory response syndrome at presentation, classified as sepsis, severe sepsis or shock; baseline creatinine level; aetiology; treatment; and outcome. Vital signs were recorded daily, if available, until day 7, and thereafter weekly; Pitt and SOFA scores were recorded at the end of therapy with amoxicillin/clavulanate and at days 14 and 21, and all key laboratory data were recorded as available. Patients were followed for 1 month after the onset of bacteraemia to assess clinical outcome, including mortality. Microbiological studies The first blood isolate from each patient was frozen at #80C and sent to the reference laboratory (Hospital Universitario Virgen Macarena), where identification was confirmed and the amoxicillin/clavulanate MIC for each isolate was determined by manual broth microdilution following EUCAST and CLSI methodologies. 16,17 Briefly, amoxicillin (Sigma–Aldrich, Madrid, Delgado-Valverde et al. 2 of 10 at UNIVERSIDAD DE SEVILLA on January 17, 2017http://jac.oxfordjournals.org/Downloaded from Mercedes delgado ValVerde resultados 71 Spain) MICs in the presence of potassium salt clavulanate (Sigma–Aldrich) were determined by standard broth microdilution (BBL–Mueller–Hinton II cation-adjusted broth; Becton-Dickinson, Madrid, Spain). For the EUCAST methodology, panels were freshly prepared with a range of concentrations of amoxicillin, from 0.03 to 64mg/L, and a fixed 2mg/L concentration of clavulanate, while for CLSI, the panels were freshly prepared using amoxicillin/clavulanate in a 2:1 ratio with the same range of concentrations. E. coli ATCC 25922 and E. coli ATCC 35218 were used as the control strain in microdilution. The reading of the results was performed fully manually by three independent researchers. ESBL production was determined by standard phenotypic methods. 18,19 PCR assays were used to characterize b-lactamase genes. PCR conditions and previously described group-specific primers covering the most frequent ESBLs in our area (SHV, 20 CTX-M-9, 21 CTX-M-1 22 and TEM 20 ) were used to amplify the bla genes, and the amplicons were sequenced. When OXA-1 production was suspected, the presence was determined by PCR with specific primers. 23 Statistical analysis Discrepancies between susceptibility methods were analysed by means of essential and categorical agreement. Essential agreement referred to amoxicillin concentration and was considered when the same MIC values (+1 dilution) were obtained for both microdilution methods, using EUCAST as the reference. The kappa index was used to evaluate concordance. 24 For categorical agreement, MICs were classified into clinical categories according to EUCAST and CLSI interpretive criteria; 19,25 very major, major and minor errors were calculated according to established guidelines, with EUCAST considered as the reference method. 26 For analysis of the independent impact of MIC breakpoints on outcome, a univariate analysis of associated variables was first performed; proportions were compared using the v 2 or Fisher’s exact test as appropriate. MIC breakpoints potentially predictive of clinical outcomes were initially explored by classification and regression tree (CART) analysis (CART software 7.0, Salford Systems) for both CLSI- and EUCAST-derived MICs once converted into their base 2 logs; however, the different breakpoints recommended by CLSI and EUCAST, as well as others, were also tested. The independent association between MIC values (base 2 log) or specific breakpoints and the different outcomes were assessed by multivariate logistic regression. Potential confounders (age, Charlson index, Pitt score, presentation with severe sepsis or shock, source, Enterobacteriaceae and site) were included in the models if their univariate Pvalue was ,0.1. To control for the site effect, participating centres were classified into those with lower and higher rates of the different outcomes after considering all other variables using TreeNet (Salford Systems). Interaction between MIC breakpoints and source was also investigated. The variables in the final model were selected by a stepwise backward procedure; variables with P,0.1 were kept in the models. The MIC breakpoint was always kept. Subgroup analyses of patients with and without a urinary tract source, and with urinary or biliary tract sources were also performed. All analyses were performed using SPSS 18.0. Results Description of the cohort During the study period, 1058 episodes of bacteraemia due to Enterobacteriaceae were included in the Bacteraemia-MIC cohort. Of these, 264 were initially treated with amoxicillin/clavulanate and included in this analysis. Demographic, epidemiological, clinical and microbiological data and the outcomes of episodes are shown in Table 1. The most common source of bacteraemia was the urinary tract. E. coli and Klebsiella pneumoniae were the most frequent pathogens. ESBL-producing Enterobacteriaceae were identified in 15 (5.7%) episodes: nine were E. coli, five K. pneumoniae and one Proteus mirabilis (4.5%, 14.7% and 9.1% of total specific species, respectively). The ESBL genes were bla CTX-M-15 (seven isolates), bla CTX-M-14 (two), bla CTX-M-1 (one) and bla SHV-12 (five). The OXA-1 gene was detected in five (1.9%) isolates, all of which were also ESBL producers (four E. coli and one K. pneumoniae). The median duration of therapy with amoxicillin/clavulanate was 4 days for 135 patients who were changed to another drug and 11 days for those treated with amoxicillin/clavulanate for the whole course of treatment. The most frequent dose was 1g of amoxicillin plus 0.2 g of clavulanate (1.2 g) every 8 h intravenously; we have no information about the reasons why some patients were administered 2.2g every 8 h; finally, some patients received other doses because of adjustments due to renal insufficiency. The most common reasons for switching from amoxicillin/clavulanate to another drug were: report of resistance, 41 patients (15.5%); de-escalation, 39 patients (14.8%); and unsatisfactory clinical evolution, 31 patients (11.7%). The most frequently used antibiotics after amoxicillin/clavulanate were cephalosporins (31.1%), fluoroquinolones (29.6%), carbapenems (20.7%) and piperacillin/tazobactam (13.3%). MIC distributions and concordance between CLSI and EUCAST methodologies Figure 1shows the MIC distributions according to the CLSI and EUCAST methods. Overall, the essential agreement was 73.1% and categorical agreement was only 65.5%. The kappa index was 0.24, indicating weak concordance. Taking the EUCAST criteria as reference, there were 45 (17%) very major errors, 1 (0.4%) major error and 45 (17.0%) minor errors. For E. coli, essential agreement was 74.3% and categorical agreement was 58.9%; the kappa index was 0.19. For Enterobacteriaceae other than E. coli, the percentages for essential and categorical agreement were 69.4% and 87.1%, respectively, and the kappa index was 0.28. The data for specific microorganisms are shown in Table 2. E. coli and Klebsiella spp. were more frequently considered resistant by EUCAST than by CLSI, although Proteus spp. was more frequently susceptible. All other Enterobacteriaceae were resistant by both methods. We analysed the crude outcomes of patients with bacteraemia due to isolates with concordant and discrepant categories. The rate of failure at the end of amoxicillin/clavulanate treatment was 13.1% (16 of 122) for patients with isolates classified as susceptible and 23.5% (12 of 51) for those classified as resistant by both CLSI and EUCAST [relative risk (RR)"1.76; 95% CI: 0.90–3.45; P"0.09]. The failure rate for isolates classified as susceptible or intermediate by CLSI and resistant by EUCAST lay between the two [17.8% (16 of 90)]. All failures among discrepant isolates occurred in those with MICs of 8/4 or 16/8mg/L by CLSI. The results were similar for failure at day 21 (Table S1, available as Supplementary data at JAC Online). Association of CLSI-derived MICs and outcomes Associations between MICs and categories obtained with CLSI methodology and outcomes are shown in Table 3and Figure 2. Crude comparisons of outcomes according to recommended breakpoints are also shown in Table 3; only failure at the end of Amoxicillin/clavulanate MIC related to bacteraemic outcome JAC 3 of 10 at UNIVERSIDAD DE SEVILLA on January 17, 2017http://jac.oxfordjournals.org/Downloaded from 72 resultados Mercedes delgado ValVerde Table 1. Characteristics, clinical features and outcomes of patients with bloodstream infections caused by Enterobacteriaceae treated with amoxicillin/clavulanate according to CART-derived breakpoints for both CLSI and EUCAST methods Variable All isolates (N"264) CLSI EUCAST MIC (mg/L) MIC (mg/L) 8/4 (N"167) .8/4 (N"97) 32/2 (N"189) .32/2 (N"75) Age (years), median (IQR) 75 (64–82) 75 (65–82) 76 (64–84) 76 (65–83) 75 (63–80) Male 123 (46.6) 73 (43.7) 50 (51.5) 84 (44.4) 39 (52.0) Hospital-acquired episode 109 (41.3) 60 (35.9) 49 (50.5) a 68 (36.0) 41 (54.7) a Comorbidities diabetes mellitus 86 (32.6) 58 (34.7) 28 (28.9) 68 (36.0) 18 (24.0) chronic pulmonary disease 42 (15.9) 26 (15.6) 16 (16.5) 29 (15.3) 13 (17.3) congestive heart failure 27 (10.2) 17 (10.2) 10 (10.3) 20 (10.6) 7 (9.3) malignancy 47 (17.8) 28 (16.8) 19 (19.6) 30 (15.9) 17 (22.7) renal failure (end-stage renal disease) 35 (13.3) 18 (10.8) 17 (17.5) 21 (11.1) 14 (18.7) liver cirrhosis 4 (1.5) 2 (1.2) 2 (2.1) 2 (1.1) 2 (2.7) immunocompromised 22 (8.3) 13 (7.8) 9 (9.3) 13 (6.9) 9 (12.0) Ultimately or rapidly fatal disease (according to McCabe classification) 62 (23.5) 36 (21.6) 26 (26.8) 152 (80.4) 50 (66.7) a Age-weighted Charlson comorbidity index, median (IQR) 2 (0–3) 2 (0–3) 2 (0.5–3.5) 2 (0.5–3) 2 (0–4) Pitt score, median (IQR) 1 (0–2) 1 (0–2) 1 (0–2) 1 (0–2) 1 (0–2) Previous invasive procedures mechanical ventilation 1 (0.4) 1 (0.6) 0 (0) 0 (0) 1 (1.3) major surgery 21 (8.0) 9 (5.4) 12 (12.4) a 10 (5.3) 11 (14.7) a urinary catheter 34 (12.9) 17 (10.2) 17 (17.5) 16 (8.5) 18 (24.0) a Severe sepsis or septic shock 49 (18.6) 28 (16.8) 21 (21.6) 30 (15.9) 19 (25.3) Source of bloodstream infections urinary tract 171 (64.7) 105 (62.9) 67 (69.1) 125 (66.1) 47 (62.7) biliary tract 44 (16.7) 33 (19.8) 11 (11.3) 34 (18.0) 10 (13.3) abdominal 14 (5.3) 9 (5.4) 5 (5.2) 8 (4.2) 6 (8.0) vascular catheter 5 (1.9) 1 (0.6) 4 (4.1) 2 (1.1) 3 (4.0) respiratory 7 (2.7) 4 (2.4) 3 (3.1) 5 (2.6) 2 (2.7) others 22 (8.3) 15 (9.0) 7 (7.2) 15 (7.9) 7 (9.3) Aetiology E. coli 202 (76.5) 130 (77.8) 72 (74.2) 152 (80.4) 50 (66.7) a K. pneumoniae 34 (12.9) 25 (15.0) 9 (9.3) 26 (13.8) 8 (10.7) K. oxytoca 2 (0.8) 1 (0.6) 1 (1.0) 1 (0.5) 1 (1.3) E. cloacae 7 (2.6) 0 (0) 7 (7.2) a 0 (0) 7 (9.3) a P. mirabilis 11 (4.2) 10 (6.0) 1 (1.0) 10 (5.3) 1 (1.3) S. marcescens 3 (1.1) 0 (0) 3 (3.1) a 0 (0) 3 (4.0) a others 5 (1.9) 1 (0.6) 4 (4.1) a 0 (0) 5 (6.7) a ESBL producer 15 (5.7) 7 (4.2) 8 (8.2) 0 (0) 5 (6.7) a OXA-1 producer 5 (1.9) 0 (0) 5 (5.2) a 6 (3.2) 6 (12.0) a Reason for changing amoxicillin/clavulanate to another antibiotic resistance 41 (15.5) 0 (0) 41 (42.3) a 3 (1.6) 38 (50.7) a de-escalation 39 (14.8) 29 (17.4) 10 (10.3) 30 (15.9) 9 (12.0) unsatisfactory evolution 31 (11.7) 19 (11.4) 12 (12.4) 20 (10.6) 11 (14.7) Dose 1.2 g/8 h 210 (79.5) 135 (80.8) 75 (77.3) 154 (81.5) 56 (74.7) 2.2 g/8 h 23 (8.7) 17 (10.2) 6 (6.2) 18 (9.5) 5 (6.7) others 31 (11.7) 15 (9.0) 16 (16.5) 15 (8.0) 14 (18.7) a Outcome at the end of treatment with amoxicillin/clavulanate clinical cure 115 (43.6) 82 (49.1) 33 (34.0) a 91 (48.1) 24 (32.0) a continued Delgado-Valverde et al. 4 of 10 at UNIVERSIDAD DE SEVILLA on January 17, 2017http://jac.oxfordjournals.org/Downloaded from Mercedes delgado ValVerde resultados 73 therapy with amoxicillin/clavulanate was near statistical significance when susceptible and non-susceptible isolates were compared. Considered as a continuous variable, base 2 log-converted MIC obtained with CLSI methodology was not significantly associated with failure at the end of therapy with amoxicillin/clavulanate in adjusted analysis (OR per increase in MIC value "1.13; 95% CI: 0.92–1.39; P"0.20), failure at day 21 (OR"1.22; 95% CI: 0.85–1.75; P"0.27) or mortality (OR"0.91; 95% CI: 0.66–1.25; P"0.58). We first analysed MIC .8/4 mg/L, which is the present CLSI breakpoint for non-susceptibility, which was also selected by exploratory CART analysis as predictive of failure at the end of therapy with amoxicillin/clavulanate. The characteristics of patients with isolates showing MICs 8/4mg/L (n"167) or .8/4 mg/L (n"97) are compared in Table 1. Several differences were found: nosocomial infection, major surgery and specific aetiologies (Enterobacter cloacae,Serratia marcescens) were more frequent in the MIC .8/4 mg/L group. The failure rate at the end of treatment with amoxicillin/clavulanate was significantly higher in the MIC .8/4mg/L group in crude analysis (22.7% versus 13.2%, RR"1.72; 95% CI: 1.00–2.94; P"0.04) and in adjusted analysis (Table 4). An MIC .8/4 mg/L was not predictive of failure at day 21 or mortality in multivariate analyses (Table 4). Subgroup analyses of patients according to the source of bacteraemia showed similar results (data not shown). Multivariate analysis was also performed using MIC .16/8 mg/L as the breakpoint, which is the CLSI breakpoint for resistance; no association with any studied outcome could be identified (Table 4). Exploratory CART analysis selected .4/2mg/L as a predictor of failure at day 21; the rates of failure were 2.1% (2 of 95) for MIC Table 1. continued Variable All isolates (N"264) CLSI EUCAST MIC (mg/L) MIC (mg/L) 8/4 (N"167) .8/4 (N"97) 32/2 (N"189) .32/2 (N"75) improvement 105 (39.8) 63 (37.7) 42 (43.3) 74 (39.2) 31 (41.3) failure 44 (16.7) 22 (13.2) 22 (22.7) a 24 (12.7) 20 (26.7) a Outcome at day 21 clinical cure 208 (78.8) 135 (80.8) 73 (75.3) 154 (81.5) 54 (72.0) improvement 41 (15.5) 25 (15.0) 16 (16.5) 29 (15.3) 12 (16.0) failure 15 (5.7) 7 (4.2) 8 (8.2) 6 (3.2) 9 (12.0) a Mortality at day 30 19 (7.2) 12 (7.2) 7 (7.2) 11 (5.8) 8 (10.7) Data are expressed as number of patients (%) except where specified. a P,0.05. S I R CLSI CLSI (microdilution 2:1) EUCAST (microdilution 2 mg/L) EUCASTSR 80 60 Number of isolates 40 20 0 0.25 0.5 MIC (mg/L) 1 2 4 8 16 32 64 128 Figure 1. MIC distribution of amoxicillin/clavulanate for all isolates according to the method used: microdilution with a 2:1 amoxicillin/clavulanate ratio (CLSI) and microdilution with fixed 2 mg/L clavulanate (EUCAST). I, intermediate; R, resistant; S, susceptible. Table 2. Distribution of Enterobacteriaceae causing bacteraemia, according to EUCAST and CLSI criteria for susceptibility to amoxicillin/ clavulanate Susceptible Intermediate Resistant All isolates (n"264) EUCAST 123 (46.6) – 141 (53.4) CLSI 167 (63.3) 45 (17.0) 52 (19.7) E. coli (n"202) EUCAST 91 (45.0) – 111 (55.0) CLSI 130 (64.4) 42 (20.8) 30 (14.8) Klebsiella spp. (n"36) EUCAST 24 (66.7) – 12 (33.3) CLSI 26 (72.3) 3 (8.3) 7 (19.4) Proteus spp. (n"12) EUCAST 8 (66.7) – 4 (33.3) CLSI 11 (91.7) 0 1 (8.3) Other (n"14) a EUCAST 0 – 14 (100) CLSI 0 0 14 (100) Data are presented as number of isolates (%). a Enterobacter spp. (8), Serratia spp. (4) and Morganella morgannii (2). Amoxicillin/clavulanate MIC related to bacteraemic outcome JAC 5 of 10 at UNIVERSIDAD DE SEVILLA on January 17, 2017http://jac.oxfordjournals.org/Downloaded from 80 resultados Mercedes delgado ValVerde Análisis pronóstico en función de la CMI y otras variables Los resultados del análisis crudo mostraron un aumento del riesgo de fracaso clínico en el día 21 en función del índice de Charlson, la escala de Pitt, la presentación como sepsis grave o shock séptico, la necesidad de ventilación mecánica y el origen respiratorio de la infección; sin embargo, el origen biliar y el cambio de tratamiento antibiótico fueron factores protectores. Cuando se analizó el fracaso clínico al final del tratamiento con PTZ (fuera este cuando fuera) en vez de en el día 21, los resultados fueron similares; en este caso las variables clínicas asociadas con el fracaso en el análisis univariante fueron la necesidad de ventilación mecánica, el índice de Charlson, la escala de Pitt, la adquisición nosocomial, la presentación como sepsis grave o shock séptico y el origen respiratorio o de catéter. Nuevamente, el origen biliar fue un factor protector. Por último se analizó la asociación de las variables clínicas y la CMI con la mortalidad en el día 30 tras la infección, en este caso las variables estadísticamente asociadas con las mortalidad fueron la edad >65 años, la necesidad de ventilación mecánica, el índice de Charlson, la escala de Pitt, la presentación como sepsis grave o shock séptico y el origen abdominal o respiratorio de la bacteriemia. Como en los análisis anteriores el origen biliar fue un factor protector, en este caso además también lo fue el cambio de tratamiento antibiótico. La CMI de PTZ no fue predictor de ninguna de las variables resultado estudiadas en los análisis crudos. Se realizaron los análisis multivariante para todas las variables resultado (fracaso en el día 21, fracaso al final del tratamiento con PTZ y mortalidad en el día 30); en todos los casos la variable CMI no se relacionó de manera independiente con el pronóstico. Tampoco lo hizo cuando se midió de manera cuantitativa ni como interacción con otras variables. Del mismo modo, tampoco mostró relación independiente la estimación de la exposición a PTZ, calculada como %fT>CMI. En todos los análisis, el índice de Charlson, la escala de Pitt y la presentación como sepsis grave o shock se asociaron con peor pronóstico, mientras que origen biliar de la bacteriemia se confirmó como factor protector independiente del pronóstico de la bacteriemia. 3.2. Artículo 2: MIC of amoxicillin/clavulanate according to CLSI and EUCAST: discrepancies and clinical impact in patients with bloodstream infections due to Enterobacteriaceae Los objetivos de este estudio fueron evaluar la concordancia de los resultados de sensibilidad para AMC en enterobacterias causantes de bacteriemia usando las recomendaciones de EUCAST y CLSI para microdilución en caldo, así como estudiar el impacto de la CMI de AMC en el pronóstico clínico de pacientes con bacteriemia producida por enterobacterias tratados con este antibiótico y la capacidad de predicción de ambos métodos en el pronóstico. Descripción de la cohorte Se estudiaron los 264 pacientes de la cohorte Bacteriemia-MIC tratados con AMC. El origen de la infección más frecuente fue el urinario (171, 64.7%), siendo E. coli y K. Mercedes delgado ValVerde resultados 81 pneumoniae los patógenos más frecuentemente aislados. De entre todas las enterobacterias, 15 (5,7%) fueron productoras de BLEE y 5 (1,9%) de OXA-1, todas estas últimas conjuntamente con BLEE. Un 79,5% de los pacientes recibieron una dosis intravenosa de AMC igual a 1,2g cada 8 horas. La duración media del tratamiento con AMC fue de 11 días para aquellos pacientes en los que se mantuvo el antibiótico durante todo el seguimiento, mientras que en aquellos pacientes en los que el tratamiento se cambió por otro antibiótico fue de 4 días; en 41 pacientes el motivo para el cambio fue un informe de resistencia y en 31 una mala evolución clínica. Distribución de CMI y concordancia entre CLSI y EUCAST Cuando se compararon las CMI determinadas de acuerdo a las recomendaciones de ambos comités, la concordancia entre las CMI fue del 73,1% y entre las categorías clínicas del 65,5%. Si consideramos EUCAST como método de referencia, obtuvimos 45 errores máximos, 1 error mayor y 45 errores mínimos. Para medir el impacto de los errores definidos, se analizó el pronóstico clínico entre los pacientes con resultados concordantes y discrepantes. Para aislados con clasificados dentro de la misma categoría hubo un 13,1% de fracasos al final del tratamiento con AMC cuando fueron sensibles y un 23,5% entre los resistentes [Riesgo Relativo (RR) = 1,76; IC 95%: 0,90–3,45; p = 0,09]. Si los aislados eran categorizados como resistentes de acuerdo a EUCAST e intermedios o sensibles según CLSI el porcentaje de fracaso al final del tratamiento se situó en un porcentaje intermedio (17,8%). En cuanto a los datos por especies, E. coli y Klebsiella spp. fueron identificadas como resistentes con más frecuencia usando la metodología EUCAST que con CLSI, pero lo contrario ocurrió para Proteus spp. El resto de las enterobacterias fueron resistentes con ambos métodos. Asociación entre las CMI determinadas por CLSI y el pronóstico No se encontró relación entre la CMI considerada como variable continua y el pronóstico. El punto de corte de no sensibilidad seleccionado con el análisis CART para predecir el fracaso al final del tratamiento con AMC fue >8/4 mg/L; efectivamente, los pacientes con CMI >8/4 mg/L presentaron significativamente mayor fracaso clínico al final del tratamiento con AMC incluso en el análisis ajustado (OR=1,96; IC 95%: 0,98-3,90; p=0,05). Por otra parte, el análisis CART seleccionó el punto de corte >4/2 mg/L como factor predictor del fracaso clínico en el día 21; sin embargo, este punto de corte no fue predictor del fracaso en el día 21 en el análisis multivariante. En un análisis por subgrupos, los pacientes con bacteriemias de origen distintos al biliar o urinario presentaron una tendencia mayor hacia el fracaso al final del tratamiento con AMC al aplicar este punto de corte (OR: 2,28; IC 95%: 0,92 - 5,68; p=0,07). Asociación entre las CMI determinadas por EUCAST y el pronóstico Cuando se consideró la CMI como una variable continua, se encontraron diferencias significativas para el fracaso clínico al final del tratamiento con AMC (OR por incremento de CMI = 1,22; IC 95%: 1,03–1,43; p = 0,01) y en el día 21(OR por incremento de 82 resultados Mercedes delgado ValVerde CMI = 1,42; IC 95%: 1,06–1,92; p = 0,01), pero no para la mortalidad. El análisis CART seleccionó una CMI >32/2 mg/L como factor predictor del fracaso al final del tratamien- to con AMC; el análisis crudo de ambos grupos mostró un mayor número de fracasos en el grupo con CMI >32/2 mg/L tanto medido al final del tratamiento con AMC (12,7% versus 26,7%; RR = 2,10; IC 95%: 1,23–3,56; p = 0,006) como en el día 21 (3.2% versus 12.0%, RR = 3.78; 95% CI: 1.39–10.25; p = 0,01). Estas diferencias se confirmaron en el análisis multivariante, donde la CMI >32/2 mg/L demostró asociarse de manera independiente con el fracaso clínico al final del tratamiento con AMC y en el día 21. En el análisis de subgrupos, esta asociación solo se mantuvo para aquellos pacientes con bacteriemia de origen urinario o biliar (OR = 2,34; IC 95%: 1,00–5,44; p = 0,04), pero no para el resto (aunque el pequeño tamaño muestral es una limitación). Cuando se analizó el punto de corte >16/2 mg/L también se encontró asociación estadísticamente significativa con el fracaso al final del tratamiento con AMC (RR=1,88; IC 95%: 1,09-3,21; p=0,02) y en el día 21 (RR=3,12; IC 95%: 1,1-8,84; p=0,02), confirmándose en el análisis multivariante (OR = 2,10; IC 95%: 1,05–4,21; p = 0,03 y OR = 3,01; IC 95%: 0,93–9,67; p = 0,03, respectivamente). DISCUSIÓN Mercedes delgado ValVerde dIscusIón 85 4. DISCUSIÓN 4.1. ASPECTOS GENERALES En general, existen pocos datos clínicos disponibles para apoyar el establecimiento de puntos de corte de sensibilidad para la mayoría de los agentes antimicrobianos debido a las dificultades de realizar estudios que aborden esta cuestión. Por ello, debido a que estos estudios son escasos, las decisiones sobre puntos de corte se basan principalmente en estudios in vitro y FC/FD42. El diseño y desarrollo de un estudio observacional con este objetivo (encontrar un valor de CMI para predecir los resultados clínicos) presenta un gran desafío, ya que requiere un elevado número de pacientes infectados con microorganismos con diferentes valores de CMI y que sean tratados con un antibiótico específico. Para evitar el sesgo de exposición, las definiciones de las variables resultado deben de ser precisas y la evaluación de las mismas exhaustiva, además se debe de llevar a cabo un control adecuado de los factores de confusión. Sería imposible, y en todo caso no ético, asignar al azar a los pacientes para recibir un tratamiento empírico de acuerdo a la CMI, ya que esto implicaría tratar a pacientes con un fármaco potencialmente inactivo frente a la infección; además los análisis post-hoc de pacientes incluidos en ensayos clínicos aleatorizados están limitados por el hecho de que los pacientes más graves o aquellos con aislamientos resistentes normalmente están infrarrepresentados. Los estudios observacionales bien diseñados pueden ser muy útiles para este propósito, aunque el diseño de estos estudios también presenta desafíos. Hay que tener en cuenta varios aspectos. En primer lugar, sólo deben incluirse pacientes tratados en monoterapia con el antibiótico de interés. Segundo, todos los pacientes deben recibir el antibiótico lo suficientemente pronto y durante un período mínimo de tiempo para poder medir el efecto del antibiótico en la respuesta. En tercer lugar, deben evaluarse las razones para el cambio a otro antibiótico para así poder medir su impacto en el resultado. Cuarto, se deben incluir todos los posibles factores de confusión como covariables y proporcionar definiciones adecuadas para ellos para poder medir su efecto sobre el resultado. En quinto lugar, se deberá hacer una definición clara de la población de estudio y utilizar criterios de inclusión y exclusión clínicos muy estrictos, así como definir los criterios para la asignación de pacientes a cada grupo de tratamiento. Sexto, siempre que sea posible deben diseñarse como estudios prospectivos y multicéntricos; Además, los investigadores deberán asegurarse de que los datos recogidos de los pacientes sean de calidad y si es posible que se haga por dos investigadores independientes; en el caso de estudios multicéntricos el investigador principal deberá asegurarse de que las definiciones queden claras para todos los participantes y se haga una correcta interpretación de las mismas en todos los centros. Finalmente, los proyectos deben registrarse por adelantado en sitios web públicos, incluyendo la hipótesis, los objetivos, la metodología y el análisis estadístico que se prevea hacer con los datos recogidos, los métodos estadísticos que se utilicen para el análisis han de ser adecuados para controlar todos los posibles factores de confusión y obtener resultados de calidad152. De hecho, en la literatura hay un número muy limitado de estudios que evalúen el impacto de la CMI 86 dIscusIón Mercedes delgado ValVerde de un antibiótico en la respuesta clínica del paciente, y en general, los que hay incluyen un número muy pequeño de casos70, 153-159. Recientemente, nuestro grupo ha publicado una revisión sistemática y metaanálisis en el que se evaluó el impacto de las CMI límite en el pronóstico de infecciones invasivas por enterobacterias tras tratamiento con antibióticos betalactámicos160. Una conclusión importante fue verificar que los estudios incluidos no estaban diseñados con este propósito y, por lo tanto, presentaban limitaciones importantes como no especificar las dosis usadas, determinación de las CMI mediante distintos métodos y no siempre de referencia o la falta de un adecuado control de los factores de confusión. Ese trabajo puso de manifiesto la necesidad de disponer de estudios clínicos bien diseñados que apoyen los puntos de corte clínicos para infecciones por este grupo de bacterias y de este modo poder modificar los puntos de corte actuales cuando sea necesario basándose en datos de práctica clínica real. En consecuencia, los metaanálisis de datos de estudios publicados con otra finalidad proporcionan resultados limitados, aunque son necesarios para mostrar las deficiencias actuales y la necesidad de estudios clínicos bien diseñados con esta finalidad. Con nuestro estudio hemos intentado superar estas limitaciones, ya que el proyecto Bacteriemia-MIC fue diseñado específicamente para investigar el impacto de las CMI de betalactámicos y fluoroquinolonas sobre el pronóstico de pacientes con bacteriemia debida a Enterobacteriaceae. 4.2. PRIMER ARTÍCULO En este estudio de cohortes prospectivo en el que se evaluó la asociación entre la CMI de PTZ y el pronóstico clínico de pacientes con bacteriemia por enterobacterias, no encontramos que una CMI cercana al punto de corte de PTZ se asociará con mayores tasas de fracaso respecto a CMI más bajas cuando los pacientes fueron tratados con este antibiótico, a las dosis utilizadas (la más habitual, 4,5 g cada 8 horas, administradas en bolo de 30 minutos). En cambio, si encontramos asociación de otras variables clínicas con el pronóstico de la bacteriemia. La influencia de estas otras variables fue la esperada y ya descrita previamente en otros trabajos161-164; las variables que se asociaron de manera independiente con el fracaso clínico medido en diferentes momentos de la infección (fin del tratamiento con PTZ, día 21 y mortalidad cruda) fueron la gravedad de la enfermedad crónica de base medida con el índice de Charlson, la gravedad de la situación aguda de acuerdo a la escala de Pitt y la presentación de la infección como sepsis grave o shock séptico. Sin embargo, los pacientes con una bacteriemia de origen biliar tuvieron significativamente menor tasa de fracaso clínico que el resto, por lo que el origen biliar de la bacteriemia resulto ser un factor de protección en el pronóstico. Los puntos de corte EUCAST de PTZ para Enterobacteriaceae consideran los aislados con CMI ≤8 mg/L como sensibles, aquellos con CMI >16 mg/L como resistentes y por lo tanto a los que tienen CMI de 16 mg/L como intermedios; de acuerdo a la interpretación de la categoría clínica aquellos pacientes con una CMI categorizada como intermedia podrían ser tratados con altas dosis de PTZ39. Por otro lado, los puntos de corte Mercedes delgado ValVerde dIscusIón 87 CLSI para este antibiótico difieren con los de EUCAST. CLSI recomienda considerar sensibles a aquellos aislados con una CMI ≤16 mg/L, intermedios cuando la CMI se encuentre entre 32-64 mg/L y resistentes si la CMI es ≥128 mg/L38. En este trabajo analizamos la asociación entre el pronóstico y la CMI comparando dos grupos de pacientes, aquellos con aislados con CMI baja (≤4 mg/L) y pacientes con aislados con CMI cercana al puntos de corte, incluyendo sensibles e intermedios para EUCAST (8-16 mg/L). Teniendo en cuenta los puntos de corte descritos y la interpretación de los mismos, una interpretación general de nuestros resultados podría ser que dentro de los aislados no resistentes, el valor de CMI para PTZ no tiene un impacto significativo en el resultado clínico, ya que no hay diferencias entre el grupo de pacientes con CMI baja y aquellos con CMI cercana al punto de corte e intermedios; estos resultados podrían reforzar los puntos de corte actuales y, desde luego, sugieren que no es necesario bajarlos. Por otro lado, en función de nuestros resultados el punto de corte de sensibilidad de CLSI podría ser más adecuado que el de EUCAST para las dosis utilizadas en nuestros pacientes. Sin embargo, deben tenerse en cuenta algunas consideraciones antes de concluir que el punto de corte de sensibilidad de EUCAST debe cambiarse a 16 mg/L. Para el análisis de los resultados se realizó la estratificación de los grupos que se ha indicado previamente (CMI baja y CMI cercana al punto de corte); aunque la interpretación de la CMI se hizo de acuerdo a los puntos de corte EUCAST, y por lo tanto los aislados con CMI de 16 mg/L fueron clasificados como intermedios, nosotros decidimos incluir aquellos aislados con CMI igual a 16 mg/L dentro del grupo de CMI cercano al punto de corte de sensibilidad. Esta decisión se tomó en base a los resultados de algunos trabajos que estudian la farmacocinética y farmacodinamia de PTZ165-167. En un trabajo de Lodise et al.168 se estudió la farmacodinamia de piperacilina en presencia de tazobactam mediante simulación de Monte Carlo; sus resultados estimaron que la probabilidad de alcanzar el objetivo terapéutico administrando 3g de piperacilina cada 6 horas es >95% para CMI de PTZ ≤8 mg/L, y de un 72,7% para 16 mg/L. La administración de piperacilina cada 4 horas tuvo un perfil farmacodinámico superior y proporcionaba tasas de objetivo terapéutico superiores al 95% para CMI de ≤16 mg/L. Felton et al.167 demostraron que la infusión de 4,5g de PTZ en infusión prolongada (durante 3 o 4 horas) cada 6 o 8 horas resultaba en un PAO superior al 98% para microorganismos con CMI ≤8 mg/L. En el caso de aislados con CMI de 16 mg/L, la PAO fue del 94% cuando PTZ fue administrado durante 3 horas cada 6 horas y del 82% cuando se administró durante 4 horas cada 8 horas. Sin embargo, cuando la CMI del microorganismo era superior a 16 mg/L, la PAO disminuía bruscamente hasta tasas cercanas al 0% independientemente del régimen de tratamiento utilizado. En nuestro estudio, la mayoría de los pacientes recibieron una dosis de 4,5 g cada 8 horas, principalmente en bolo pero algunos en infusión prolongada. Por ello era de esperar que los pacientes con infección causada por microorganismos con CMI de 16 mg/L tuvieran una alta probabilidad de alcanzar el objetivo farmacodinámico. Habría sido ideal poder comparar los dos regímenes de tratamiento más utilizados en nuestro estudio (bolo y perfusión prolongada), pero debido al bajo número del segundo no se pudo realizar. Independientemente del tiempo de infusión empleado, la dosis más frecuente entre nuestros pacientes parecer ser apropia- 88 dIscusIón Mercedes delgado ValVerde da de acuerdo a los resultados obtenidos tras los análisis, siendo esta la dosis habitual utilizada en la mayoría de países europeos169, a diferencia de la que tradicionalmente se ha venido usando en EEUU (3,4 g cada 6 u 8 horas). Habría sido ideal poder medir los niveles plasmáticos del antibiótico en todos los pacientes, pero la financiación del proyecto no permitió esta posibilidad. En su lugar, realizamos una estimación de la exposición al fármaco utilizando los parámetros predictores de la misma descritos en la literatura para PTZ (peso, talla y aclaramiento de creatinina)167, 170. El parámetro PD predictor de eficacia descrito para este antimicrobiano es una concentración plasmática de fármaco libre por encima del valor de CMI durante al menos el 50% del intervalo entre dosis (50%fT>MIC)83. Las estimaciones realizadas en nuestros pacientes sugirieron que la inmensa mayoría de los pacientes con aislados sensibles e intermedios a PTZ alcanzaron este objetivo con la dosis administrada. Diferentes estudios publicados previamente han demostrado que las concentraciones plasmáticas de PTZ tienen una gran variabilidad en los pacientes críticos171-173, aunque en nuestra serie en la mayoría de los casos los pacientes no podrían describirse basalmente como tales (solo el 3,5% necesitaban ventilación mecánica), sí que hubo una proporción importante de casos con sepsis grave o shock séptico (33,1%). Se han publicados datos preliminares sobre las concentraciones de PTZ medidas en una población de pacientes no críticos con bacteriemia por Enterobacteriaceae, y por lo tanto muy similar a nuestra cohorte, que apoyan los resultados de las estimaciones FC/FD que se alcanzaron en nuestra serie174, 175. Por lo tanto, creemos que nuestros resultados serían aplicables principalmente a pacientes no críticos, aunque inicialmente puedan presentar datos de gravedad. Para realizar una correcta interpretación de nuestros resultados es necesario tener en cuenta las limitaciones del estudio. La primera consideración que hay que resaltar es que, desde el punto de vista estadístico, nuestro estudio podría tener una capacidad limitada para detectar diferencias entre los dos grupos analizados, debido al bajo número de pacientes con aislados con CMI límite. Sin embargo, este es el mayor estudio publicado hasta la fecha que aborda específicamente este tema. Esto es una limitación inherente a la baja frecuencia de cepas con estas CMI en la realidad clínica. En segundo lugar, la evaluación del impacto de la CMI se ha realizado principalmente en relación al tratamiento empírico de la bacteriemia. La implicación de la terapia empírica en el pronóstico de las infecciones graves como la bacteriemia ha sido ampliamente estudiada176, habiéndose demostrado que la terapia empírica es un factor importante y estrechamente relacionado con el resultado clínico, de tal modo que una terapia empírica inadecuada se ha asociado independientemente con el aumento de la mortalidad en pacientes con bacteriemia177. Sin embargo, el tratamiento dirigido es también relevante, y dado que no es ético forzar a mantener el tratamiento con un fármaco informado como intermedio o resistente para el pronóstico, hubimos de diseñar una forma de controlar el efecto del cambio de tratamiento. Por este motivo recogimos en nuestro estudio el momento y los motivos para el cambio, y se han tenido en cuenta en los análisis, además de considerar la variable resultado “fracaso al final del tratamiento con PTZ”. Mercedes delgado ValVerde dIscusIón 89 En tercer lugar, debemos tener en cuenta que otra variable crítica para analizar los resultados es el foco de la infección. Una pequeña serie publicada previamente por nuestro grupo de pacientes con bacteriemia causadas por E. coli productor de BLEE mostró que la CMI de PTZ no influyó en el pronóstico de las infecciones del tracto urinario pero sí para bacteriemias de otros focos, en las que se encontró menor mortalidad para los aislados con CMI ≤16 mg/L (sensibles e intermedias) que para los que tenían una CMI >16 mg/L (resistentes)178. El origen de la bacteriemia más común en nuestra cohorte fue el biliar, incluso más que el tracto urinario, lo que refleja el hecho de que PTZ se utiliza con frecuencia en el tratamiento empírico para las infecciones del tracto biliar asociadas a la asistencia sanitaria en nuestro país. Las bacteriemias de origen biliar son relativamente benignas en comparación con la neumonía nosocomial u otras infecciones intraabdominales complicadas177; de hecho, en nuestro análisis la bacteriemia de origen biliar resulto ser un factor protector del pronóstico clínico tanto en el análisis univariante como en el multivariante. La falta de asociación de las cepas con CMI límite con el pronóstico es independiente de que la bacteriemia fuera originada en un foco biliar, pero a pesar de que ello, consideramos son necesarios más estudios que investiguen el impacto de la CMI de PTZ dentro de las categorías sensible e intermedia en otros focos de infección. Un aspecto de interés especial es la influencia de la CMI de PTZ en el tratamiento de pacientes con infección causada por Enterobacteriaceae productoras de BLEE. Se han publicado estudios previos cuyos resultados sugieren que las dosis utilizadas en nuestro trabajo serán eficaces para el tratamiento de la bacteriemia por E. coli productor de BLEE sensible a PTZ, más concretamente cuando el origen de la bacteriemia fuera urinario o biliar153, 178, pero como hemos comentado, un análisis específico sugirió que PTZ puede ser menos efectiva en pacientes con infecciones bacterianas graves no urinarias causadas por cepas de E. coli productor de BLEE con CMI cercanas al punto de corte157. Recientemente, Gutiérrez-Gutiérrez et al. han publicado los resultados de un proyecto multicéntrico en el que han demostrado que las combinaciones de BL/IBL no son inferiores a los carbapenémicos para el tratamiento de la bacteriemia por enterobacterias productoras de BLEE independientemente del origen de la infección y de la especie, siempre y cuando los aislados sean sensibles a PTZ y se administren las dosis apropiadas. En este trabajo no se hizo un análisis comparativo entre las CMI de PTZ y su implicación en el tratamiento; sin embargo, en la tesis doctoral de esta autora se comunicaron estos análisis, y los resultados sugieren que entre los aislados con CMI sensibles no hubo diferencias en el resultado clínico, pero si mostraron una tendencia de mayor mortalidad según aumentaba la CMI de PTZ por encima de 16 mg/L179. En nuestro estudio, los aislados productores de BLEE fueron muy escasos como para obtener conclusiones. Como conclusión general de esta publicación, no encontramos que una CMI mayor dentro de la categoría sensible o un valor de CMI categorizado como intermedio para PTZ, tuviera una influencia significativa en el pronóstico de los pacientes con bacteriemia debida a Enterobacteriaceae. Estos resultados podrán ser aplicados principalmente Mercedes delgado ValVerde conclusIones 97 5. CONCLUSIONES De los resultados obtenidos en los trabajos expuestos en este proyecto de Tesis Doctoral se pueden extraer las siguientes conclusiones: 1. El valor de la CMI de piperacilina-tazobactam de enterobacterias sensibles o intermedias a este antimicrobiano (criterios EUCAST) no afecta significativamente al pronostico en pacientes con bacteriemia tratados con este antimicrobiano a dosis de 4,5 g cada 8 horas. 2. Los factores asociados de manera independiente con un peor pronóstico en estos pacientes son una mayor puntuación en el índice de Charlson o en la escala de Pitt, y la presentación como sepsis grave o shock séptico, mientras que el origen biliar se asoció con mejor pronóstico. 3. Existe un alto grado de discordancia en los valores de CMI de amoxicilina-clavulá- nico para enterobacterias obtenidos usando las recomendaciones de CLSI (ratio de concentración 2:1) y las de EUCAST (concentración fija de ácido clavulánico de 2 mg/L), obteniéndose mayores tasas de resistencia con estas últimas para E. coli y Klebsiella spp., y menores para Proteus spp. 4. En los pacientes con bacteriemia por enterobacterias tratados con amoxicilina-clavulánico, la CMI (analizada como variable continua) de este antimicrobiano determinada con las recomendaciones de EUCAST muestra mejor capacidad predictiva del pronóstico que con las de CLSI. 5. Usando la metodología EUCAST, los aislados con CMI >16/2 mg/L (y >32/2 mg/L para bacteriemias de origen urinario) se asocian de forma independiente con mayor riesgo de fracaso terapéutico tanto al final del tratamiento con el fármaco como en el día 21, y estos podrían por tanto ser considerados como los puntos de corte para no sensibilidad. No hemos podido encontrar un punto de corte consistentemente asociado con el pronóstico utilizando la metodología recomendada por CLSI. BIBLIOGRAFÍA Mercedes delgado ValVerde bIblIografía 101 6. BIBLIOGRAFÍA 1. Levy Hara G, Sosa A. Uso y abuso de los antibióticos. ¿Dónde estamos y adónde queremos llegar? Montevideo, Uruguay: Arena Latinoamericana ed., 2006. 2. Centers for Disease Control and Prevention. Antibiotic resistance threats in the United States. https://www.cdc.gov/drugresistance/pdf/ar-threats-2013-508.pdf. 3. World Health Organization. Antimicrobial resistance: global report on surveillance. http://www.who.int/drugresistance/documents/surveillancereport/en. 4. Levy SB, Marshall B. Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and responses. Nat Med 2004; 10: S122-9. 5. Schwaber MJ, Carmeli Y. Mortality and delay in effective therapy associated with extended-spectrum beta-lactamase production in Enterobacteriaceae bacteraemia: a systematic review and meta-analysis. 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