Síntesis de compuestos organoselénicos derivados del hidroxitirosol. Determinación de su actividad como antioxidantes
Abstract
1. Introducción Los polifenoles son una amplia familia de compuestos que se encuentran, entre otros alimentos, en la fruta, la verdura, el vino, el té, el cacao y el aceite de oliva virgen extra y que muestran una marcada actividad antioxidante, que se traduce en una contrastada actividad en la prevención de enfermedades cardiovasculares, cáncer, enfermedades neurodegenerativas, diabetes u osteoporosis . Uno de los polifenoles más efectivos como antioxidante y atrapador de radicales libres es el hidroxitirosol (HT), 1, 4-(2-hidroxietil)-1,2-bencenodiol, un fenol simple que predomina en el olivo (Olea europea). La industria del aceite de oliva genera grandes cantidades de residuos (alperujo) que contienen una variedad de polifenoles entre los que destaca el HT. Recientemente, nuestro grupo de investigación ha desarrollado bajo patente un sistema para su purificación a escala semiindustrial, que permite obtenerlo con un alto grado de pureza (95%-99%) y a bajo coste. Un inconveniente importante es que el hidroxitirosol es químicamente inestable, a menos que se preserve seco en ausencia de aire y luz, por lo que la eficiencia de esta molécula añadida en su forma nativa a matrices biológicas no se puede garantizar; tampoco se puede añadir a preparados lipofílicos debido a su relativa polaridad. En base a estas consideraciones, sería útil producir derivados del hidroxitirosol más estables y que conservaran sus diversas propiedades biológicas, utilizando como materia prima el HT aislado del alperujo. Los compuestos que incluyen selenio en su estructura son objeto de controversia. Se ha demostrado el envenenamiento de animales por plantas acumuladoras de selenio en suelos seleníferos. Sin embargo, a mediados de los años 50 se consideró un nutriente esencial presente en algunas selenoproteínas como glutatión peroxidasa, implicada en un mecanismo de autodefensa contra el estrés oxidativo. Estudios epidemiológicos y clínicos en humanos, así como ensayos de laboratorio, apoyan el papel protector del selenio frente al desarrollo del cáncer. A lo largo del periodo de disfrute de la beca se ha desarrollado una amplia investigación que se puede englobar en los siguientes apartados: - Síntesis de dopamina a partir de hidorxitirosol. Síntesis de gluco y galactoderivados de dopamina. - Síntesis de selenoureas y selenuros de hidroxitirosol. - Síntesis de tioureas derivadas de hidroxitirosol y reacciones de oxidación de las mismas con dicloro-diciano-quinona (DDQ). - Reacciones de aldehídos catalizadas por el sistema CeCl3.7H2O-NaI-SiO2 - Evaluación de las propiedades biológicas in vitro y ex vivo de los compuestos sintetizados. 2. Resultados y discusión 2.1. Síntesis de dopamina y derivados glicosilados de dopamina 2.1.1. Síntesis de dopamina a partir de hidroxitirosol La síntesis de dopamina partiendo del hidroxitirosol (1) se ha abordado por dos vías diferentes: a) Por una parte, con objeto de evitar reacciones secundarias debida a las reactividad del fragmento de catecol, fácilmente oxidable, hemos llevado a cabo la protección de los hidroxilos aromáticos por reacción con ¿,¿-dicloro-o-xilileno para dar 2. Por tratamiento de 2 con tetrabromuro de carbono y trifenilfosfina se obtuvo el derivado bromado 3, que es fácilmente convertido en el azido derivado 4 por tratamiento con azida sódica en DMF. Por hidrogenación catalítica a temperatura ambiente, en presencia de ácido clorhídrico, se consigue la reducción del grupo azido y la eliminación simultanea del grupo protector (Esquema 1), obteniéndose así el hidrocloruro de dopamina (5), que se aísla por precipitación en etanol-éter. Esquema 1 b) Por otra parte, hemos obtenido el clorhidrato de la dopamina (5) en solo tres pasos y según se indica en el esquema 2, añadiendo al medio de reacción ascorbato sódico que evita la oxidación del fragmento de catecol. Los rendimientos obtenidos por ambos procedimientos son similares, aunque en este segundo procedimiento hay una etapa menos. Esquema 2 2.1.2. Síntesis de glicósidos de la dopamina A partir del hidroxitirosol (1), por tratamiento con cloruro de tosilo en piridina se obtuvo el compuesto tri-O-tosilado 8. De los tres grupos tosiloxi, sólo el que está sobre la cadena lateral se desplaza por el grupo azido para dar 9. El tratamiento de 9 con potasa metanólica rindió una mezcla de los regioisómeros 10 y 11 al 50%, según se deduce de los espectros de RMN, no separables cromatográficamente. (Esquema 3) Esquema 3 La preparación de los glicosilderivados de 10 y 11 se realizó por tratamiento de la mezcla de 10 y 11 con el bromuro de 2,3,4,6-tetra-O-acetil-¿-D-glucopiranosilo, que rindió los ¿-D-glucopiranosil derivados 12 y 13, y el bromuro de 2,3,4,6-tetra-O-acetil-¿-D-galactopiranosilo, que rindió los derivados 14 y 15. La des-O-acetilación y des-O-tosilación de estos compuestos se produce simultáneamente por tratamiento con potasa metanólica. La reducción catalítica en medio ácido de los glicosil derivados desprotegidos conduce a la formación de los glicosil derivados de dopamina 20-23, donde la presencia del azúcar pudiera ejercer una acción moduladora de la actividad biológica de la dopamina (Esquema 4). Esquema 4 2.2. Selenoderivados de hidroxitirosol 2.2.1. Selenoureas derivadas de hidroxitirosol Con objeto de combinar las propiedades antioxidantes del fragmento de catecol del hidroxitirosol con las que presentan los compuestos organoselénicos, hemos preparado selenoureas O-protegidas y no protegidas derivadas de la dopamina. Para las protegidas se partió de un derivado comercial del hidroxitirosol, el bromuro de 2-(3,4-dimetoxifenil)etilo 24, que fue convertido en el correspondiente azido derivado 25. La hidrogenación catalítica de 25 condujo a la formación de la dopamina di-O-metilada 26, y de un producto secundario con la estructura dimérica 27. (Esquema 5) Esquema 5 La amina protegida 26 o la dopamina 5 reaccionaron con los isoselenocianatos 28, 29 y 30, sintetizados previamente a partir de sus correspondientes arilaminas según un procedimiento desarrollado previamente por nuestro grupo de investigación. De esta manera hemos preparado las selenoureas 31-36, con rendimientos casi cuantitativos (Esquema 6) Esquema 6 La misma reación, llevada a cabo con el diisoselenocianato 37 condujo a la obtención las diselenoureas 38 y 39 (Esquema 7). Esquema 7 2.2.2. Síntesis de selenuros y diselenuros del hidoxitirosol. También hemos sintetizado selenuros y diselenuros derivados del hidroxitirosol. Para ello, hemos preparado previamente selenuro sódico (Na2Se) y diselenuro sódico (Na2Se2) a partir del selenio elemental según el método descrito por Milton y col. Por reacción del bromuro de 3,4-dihidroxifeniletilo 24 con selenuro sódico y diselenuro sódico se obtuvieron respectivamente el selenuro 40 y el diselenuro 41. La desprotección con tribromuro de boro según el tratamiento descrito por Thahanovsky y col. de 41 rindió el selenuro 43, pero en el caso del monoselenuro 40 en lugar del monoselenuro correspondiente, se obtuvo un compuesto inesperado, al que en base a datos espectroscópicos se ha asignado la estructura del selenonio 42. (Esquema 8) Esquema 8 Una ruta alternativa para la obtención del diselenuro 43 consiste en la acetilación de los grupos hidroxilo de catecol en el bromoderivado 6, seguida de tratamiento con la sal de selenio y posterior desacetilación mediante catálisis básica con carbonato potásico. (Esquema 9) Esquema 9 Reacciones análogas se llevaron a cabo utilizando como grupo protector de los hidroxilos aromáticos el xilileno. Así, la reacción del compuesto 3 con selenuro y diselenuro sódico condujo a la formación de los selenuro y diselenuro O-protegidos 46 y 47 respectivamente. Todos los intentos de eliminación del grupo protector en 46 y 47 han sido hasta el momento infructuosos. (Esquema 10) Esquema 10 2.3. Síntesis de tioureas derivadas de la dopamina De forma análoga a la descrita en el apartado 2.2.1., hemos llevado a cabo la preparación de las tioureas 53-57, que portan el fragmento de catecol, por reacción del hidrocloruro de dopamina con los isotiocianatos 48-52. (Esquema 11) Esquema 11 El tratamiento de las tioureas 53-57 con DDQ (58), según el método propuesto por Land condujo a la formación de los derivados de 8,9-dihidro-5-tia-7-azo-benzocicloheptano 59-63, según se indica en el Esquema 12: Esquema 12 La oxidación de las tioureas 53-57 con DDQ dio como subproducto el difenol 61, que mostró la misma movilidad cromatográfica que las tiacepinas 59-63, por lo que su separación y purificación no fue factible. Para solventar ese problema, la mezcla de reacción se acetiló con anhídrido acético y piridina, obteniéndose los compuestos 65-69 y el diacetil-dicloro-difenil benceno 70. Los acetil derivados 65-69 pudieron ser así separados cromatográficamente del subproducto 70. La desacetilación con carbonato potásico de 65-69 produjo la eliminación selectiva de los acetatos unidos a los oxígenos aromáticos, pero no la del grupo acetilo unido al nitrógeno ureídico, obteniéndose así los derivados 71-75. (Esquema 13) Esquema 13 2.4. Reacciones de aldehídos catalizadas por el sistema CeCl3.7H2O-NaI-SiO2 Con objeto de aplicar como reactivo la combinación de CeCl3-NaI-SiO2, desarollado por Marcantoni y col., en la preparación de derivados del hidroxitirosol en ausencia de disolvente (Química verde), se ha llevado a cabo en colaboración con dicho profesor, un estudio del empleo de este catalizado en diferentes reacciones. Concretamente, a partir de derivados del benzaldehído y de nitroacetato de etilo se ha podido llegar en un solo paso y en ausencia de disolvente a los isoxazoles 74 y 75. (Esquema 14) Esquema 14 2.5. Ensayos de capacidad antioxidante El objetivo principal de los ensayos de antioxidación es estudiar la actividad antioxidante de las estructuras derivadas del hidroxitirosol anteriormente descritas, obtenidas vía sintética. También se estudió por primera vez el efecto del hidroxitirosol sobre la enzima tirosinasa y su comparación con los derivados de hidroxitirosol que incluyen selenio en su molécula. La actividad inhibidora de otros derivados con selenio (carbohidratos conteniendo selenio, derivados de selenoureas,¿) había sido ya demostrada por otros autores. Para investigar la actividad antioxidante de los compuestos se han seguido las recomendaciones que existen hoy en día de utilizar al menos dos diferentes tipos de ensayos y también de combinar ensayos como el poder reductor o el de secuestro de radicales libres, tales como DPPH y ABTS, y ensayos que están asociados a la peroxidación de lípidos. En relación a estos últimos se han seguido los primeros estadíos de la peroxidación de lípidos mediante el método del tiocianato férrico y el estado final de la peroxidación mediante el método del ácido tiobarbitúrico (TBA). Se realizaron también ensayos ex vivo midiendo la capacidad de los nuevos productos sintéticos para inhibir la peroxidación lipídica en microsomas de hígados de ratas alimentadas con una dieta deficiente en vitamina E. 2.5.1. Ensayos in vitro Se evaluaron las actividades antioxidantes de los compuestos obtenidos por síntesis orgánica a partir del hidroxitirosol (1). Dentro de los selenoderivados se estudiaron tres derivados selenoureídos 34, 35 y 36, el diselenuro 43 y el selenonio 42 En los análisis llevados estos compuestos se comparan con las vitamina E (81) y vitamina C (82), ampliamente usadas por sus características antioxidantes y de origen natural. También con el hidroxitirosol (1) y 3,4-dihidroxifenil glicol (83), recuperados de los alperujos y con una importante actividad antioxidante; con el trolox (84), análogo a la vitamina E soluble en agua, que se utiliza como estándar, que se utiliza en muchos de los ensayos como referencia a la hora de expresar los resultado en términos de ¿Capacidad Antioxidante Equivalente al Trolox¿ (CAET). Y con la dopamina (5), compuesto de estructura similar al hidroxitirosol en el que el grupo hidroxilo se ha sustituido por un grupo amino, que posee una marcada importancia biológica como neurotransmisor (Esquema 15). Esquema 1 Además se probaron también las tioureas no comerciales 53-57. Se prepararon disoluciones madre de los compuestos a ensayar y a partir de ellas los distintos patrones de ensayo, cuyas concentraciones varían en función del experimento, si bien el hidroxitirosol, el 3,4-dihidroxifenilglicol y la dopamina se disolvieron en agua, la vitamina C, la vitamina E, las selenoureas 34, 35 y 36 y el selenonio 42, en metanol, y el resto en agua-metanol en proporción 1:1. Para investigar la actividad antioxidante de los compuestos se han seguido las recomendaciones que existen hoy en día de utilizar al menos dos diferentes tipos de ensayos y también de combinar ensayos como el poder reductor o el de secuestro de radicales libres, tales como DPPH y ABTS, y ensayos que están asociados a la peroxidación de lípidos. En relación a estos últimos se han seguido los primeros estadíos de la peroxidación de lípidos mediante el método del tiocianato férrico y el estado final de la peroxidación mediante el método del ácido tiobarbitúrico (TBA). Poder reductor La capacidad reductora de un compuesto puede ser un buen indicador de su potencial antioxidante. Con este ensayo se muestra la capacidad de donar hidrógeno o electrones de cada uno de los compuestos anteriores. El fundamento de este método es la reacción redox mediante la cual el Fe (III) se reduce a Fe (II) a expensas de un reductor, y el estudio colorimétrico del complejo formado por el Fe (II) con bipiridilo que absorbe a 490 nm. Para expresar los resultados se establece una curva de calibración con cantidades conocidas de trolox y el poder reductor de los compuestos se expresa en equivalentes Trolox (mM). Las líneas dosis-respuesta de todos los compuestos se ajustan a un modelo lineal con un r ¿ 0.90, siendo calculado el poder reductor por su ecuación de regresión individual. En Figura 1 se comparan los valores absolutos de poder reductor que se obtuvieron en los ensayos. El hidroxitirosol (1) mostró un poder reductor de 1.11 mM trolox, similar al glicol (1.18 mM trolox), y a la vitamina C (1.01 mM trolox). Los valores que presentaron las selenoureas 34, 35 y 36 fueron 2.5, 1.8 y 2.1 veces superiores al hidroxitirosol respectivamente, aunque en este sentido más interesantes fueron los selenoderivados 43 (5.0) y 42 (3.7). (Tabla 1) Actividad antirradical, captación de radicales DPPH y ABTS La capacidad de secuestro de radicales libres, los cuales inician o propagan la peroxidación de lípidos, también es un importante mecanismo antioxidante. El método del DPPH (1,1-difenil-2-pricrilhidrazil) es un método simple y altamente sensible que está basado en que el DPPH*, radical estable en disolución, acepta átomos de hidrógeno procedente de los antioxidantes neutralizando su carácter de radical libre. El efecto antioxidante es proporcional a la desaparición del DPPH* en los compuestos ensayados. La correlación entre concentración de antioxidante y descenso en DPPH* fue alta en todos los casos r ¿ 0.90. Los resultados se pueden expresar en comparando las pendientes de las rectas obtenidas con la correspondiente al Trolox (TEAC). Los mayores valores se obtuvieron para el diselenuro 43, el selenonio 12 y la selenourea 35. También puede representarse la EC50, la concentración efectiva (mM) de los compuestos ensayados necesaria para disminuir en un 50% la concentración inicial del radical DPPH* (Figura 2). En todos los casos la actividad antiradical de los derivados (valores de EC50 más bajo indican mayor actividad antioxidante) superan ampliamente a la de la vitamina E (81), son del orden del hidroxitirosol (1), siendo la actividad más importante la de la dopamina (5). (Tabla 2). Más notable es la diferencia de actividad antirradical en el caso del radical catión estable ABTS*+ que se obtiene por reacción del 2,2'-azinobis-(ácido 3-etilbenzotiazolin 6- sulfónico) con K2S2O8. En este caso la actividad antioxidante de los productos se determina por la decoloración del ABTS*+ que producen. Los resultados se pueden expresar igual en equivalentes Trolox (TEAC) o en EC50. Ambos ensayos de captación de radicales libres DPPH y ABTS se evalúan frente a soluciones estándar de trolox 30¿250 µM. El procedimiento en el caso del ABTS consistió en crear primero tres rectas patrón para el trolox (84) a tres longitudes de onda diferentes, 415 nm, 655 nm y 750 nm. Las pendientes de las rectas obtenidas se utilizaron para calcular los equivalente de trolox (TEAC) (Pendiente antioxidante/Pendiente trolox), y expresando el resultado como una media del valor a esas tres longitudes de onda. La capacidad antioxidante total del compuesto que está bajo estudio es expresada en equivalentes trolox (TEAC), que es definido como la concentración de un antioxidante que da el mismo porcentaje de cambio de absorbancia para DPPH o ABTS que 1 mM de trolox. La capacidad de captación de estos radicales por parte de los antioxidantes obtenidos por vía sintética es mayor que en el caso de vitamina E (81) e hidroxitirosol (1). Además de 42 y 43, también la selenourea 36 y la tiourea 56 superan en 5 veces la capacidad de captación de radicales ABTS del trolox (84). El resto de derivados sintéticos del hidroxitirosol muestran un TEAC entre 2 y 3.5 veces superior a 84, lo que pone de manifiesto el elevado poder antirradical de estas moléculas. Los valores más bajos obtenidos por los compuestos en los ensayos DPPH frente al método ABTS refleja la baja fuerza oxidante del radical DPPH. El radical ABTS parece más reactivo que el radical DPPH* y mientras que la reacción con DPPH* incluye una transferencia de átomos de hidrógeno, en el caso de la reacción con ABTS esta incluye un proceso de transferencia de electrones. Peroxidación de lípidos y productos de oxidación secundarios en los ensayos de actividad antioxidantes Ensayo del tiocianato férrico (TCF) En este ensayo se inicia la reacción de oxidación de un ácido graso insaturado como es el ácido linoléico en emulsión mediante la adición de 2,2'-azo-bis(2-amidinopropano) (ABAP), que produce radicales libres del tipo peroxilos de forma constante hasta formar hidroxiperóxidos durante el estado inicial de oxidación. Al añadir antioxidantes al medio, éstos competirán por los radicales, protegiendo al linoleico. La reacción determina los niveles de hidroxiperóxido lipídico de forma indirecta mediante un método colorimétrico. Al añadir tiocianato amónico y cloruro ferroso, el Fe(II) reacciona con los hidroperóxidos que se forman en la oxidación del ácido linoléico, pasando a Fe(III), que forma un complejo coloreado con los iones tiocianato. A menor formación de hidroperóxidos menos color, y por tanto menor absorbancia, siguiendo una curva del tipo y = a + b¿x para todos los compuestos ensayados con un r ¿ 0.90. De la ecuación de esa curva puede extraerse el EC50, es decir, la concentración mM de antioxidante que habría que añadir para inhibir la oxidación de linoleico un 50%. Valores bajos del EC50 indican una elevada capacidad para disminuir la oxidación del ácido linoleico. Los selenoderivados 42 y 43 vuelven a ser los más significativos, pues inhiben esta reacción con una concentración hasta diez veces menor que el hidroxitirosol. No obstante, los estándares vitamina E (81) y trolox (84) testados aportaron importantes valores en este ensayo. El diselenuro 43 inhibe la oxidación primaria hasta en un 80%, situándose las selenoureas 34-36, y las tioureas 53-57 entre el 30 y 50%, superando el 20% que inhibe el hidroxitirosol. (Tabla 4) Inhibición de la oxidación secundaria por el método del linoleico/TBA Al igual que en el caso anterior, las propiedades antioxidantes de los compuestos son probados en presencia de un inductor de la peroxidación. El ácido linoleico es oxidado con ABAP en un calentamiento prolongado a 50 ºC durante 24 horas y los productos finales o secundarios de esta reacción, como el malonaldehído, se hacen reaccionar con ácido tiobarbitúrico formando un compuesto coloreado, que puede ser detectado espectrofotométricamente. El grado de coloración indica la actividad del antioxidante que se mide por el descenso de absorción a 540 nm. El análisis de regresión de las curvas dosis-respuesta para los compuestos ensayados confirma que no es un modelo lineal sino que se ajusta a y = a + b¿x, con un r ¿ 0.90, de la que se extraen, igual que anteriormente, los valores de EC50. En este caso se necesitan concentraciones menores para evitar las reacciones de oxidación secundaria. En este menor rango de concentraciones el comportamiento de los antioxidantes es análogo a la inhibición de la oxidación primaria, siendo la concentración necesaria en torno a cuatro veces menor que la del hidroxitirosol. 2.5.2. Efecto sobre la actividad de la tirosinasa de hongos in vitro Se estudiaron las características inhibidoras sobre la tirosinasa de hongo de los compuestos sintetizados, conteniendo átomos de selenio en su molécula (42 y 43) y se compararon con las del hidroxitirosol natural de donde proceden. Este enzima cataliza las primeras dos reacciones de la síntesis de la melanina, la hidroxilación de la L-tirosina para dar 3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) y la oxidación de la L-DOPA a dopaquinona. Esta quinona es altamente reactiva y puede polimerizar espontáneamente a melanina. Los efectos de los compuestos 42 y 43, sobre las actividades de monofenolasa, utilizando L-tirosina como sustrato y de difenolasa sobre L-DOPA, se siguieron mediante la inhibición de la formación del dopacromo mediante medidas espectrofotométricas. Cuando la reacción enzimática se lleva a cabo con L-tirosina como sustrato se observa un marcado tiempo ¿lag¿ o de retraso, característico de actividad monofenolasa, tiempo necesario para alcanzar una concentración determinada de o-difenol. Este periodo se acorta o se elimina en presencia de los compuestos ensayados con o-difenoles en sus estructuras También se comprueba que los compuestos ensayados incluido el hidroxitirosol ralentiza la formación de dopacromo cuando L-tirosina se utiliza como sustrato, comportándose por tanto como inhibidor de la actividad monofenolasa de la tirosinasa del hongo. Gráfica 1. Inhibición de la actividad monofenolasa de la tirosinasa por el hidroxitirosol Cuando se estudia la actividad difenolasa, usando L-DOPA como sustrato en presencia de los compuestos también se confirma que todos producen una reducción de actividad difenolasa, siendo quizás el efecto sobre la actividad monofenolasa más importante que sobre la difenolasa. De todos los compuestos analizados el que presenta un efecto inhibidor más importante es el selenonio (42) el diselenuro (43) e hidroxitirosol (1). Concentraciones de los derivados de selenio entre 0.05-0.65 ¿M producen una importante inhibición de la monofenolasa. En el caso del hidroxitirosol se ha comprobado que se comporta de dos formas muy diferentes si se utilizan a una baja o media concentración (5-80 ¿M) o muy alta (1500-2000 ¿M), produciéndose en este caso una inhibición muy rápida e importante de la producción de dopacromo, en el caso de la monofenolasa. 2.5.2. Ensayos ex vivo. Inhibición de peroxidación microsomal. Los productos a ensayar se incubaron, siguiendo el protocolo de Mitchell y col. , con microsomas hepáticos (vesículas que resultan de la fragmentación del retículo endoplasmático de las células del hígado de ratas), tras 20 minutos de estrés oxidativo inducido por el quelato de Fe(II)-ADP y ascorbato. El daño oxidativo se midió entonces por la formación de TBARS (productos de la degradación oxidativa incluido el malonaldehído procedente de la peroxidación mediada por radicales libres de los ácidos grasos insaturados de la membrana lipídica): cuanto menor sea la cantidad de TBARS formado, mayor efecto protector en la membrana. Los microsomas obtenidos de ratas deficientes en vitamina E (¿VE) se emplearon para determinar el diferente efecto protector de los compuestos a testar, comparándolos con microsomas obtenidos de ratas sometidas a una adecuada dieta en VE (+VE), y con la vitamina E, que es el principal antioxidante lipídico soluble en membranas biológicas , y finalmente microsomas ¿VE a los que se adicionó tocoferol en las mismas concentraciones que los compuestos a ensayar. Los resultados obtenidos para el diselenuro 43 en concentraciones 0.250 mM, 0.100 mM y 0.050 mM, y el selenonio 42 en concentraciones finales de 0.266 mM, 0.106 mM y 0.053 mM se muestran en las Tabla 6. El selenonio 42 presenta una inhibición significativa a concentración 0,266 mM, y cuando es menor se convierte en prooxidante, es decir, favorece la oxidación en lugar de inhibirla. Sin embargo, el diselenuro 43 es un potentísimo inhibidor de la oxidación en microsomas a cualquiera de las concentraciones de ensayo, presentando valores análogos a los que proporcionan el ¿-tocoferol o los microsomas +VE, provenientes de ratas que no han sido sometidas a estrés oxidativo debido a una deficiencia de vitamina E. Los valores obtenidos para las selenoureas 34-36 aparecen representados en la Tabla 7. Todas las selenoureas muestran una inhibición prácticamente total a una concentración 0.250 mM, casi idéntica a la que proporciona el tocoferol. A concentración 0.100 mM el efecto inhibidor, aunque menor, continúa siendo alto para las selenoureas 34 y 36, y total para 35. Para disoluciones de selenoureas 0.050 mM en microsomas, se sigue observando una importante inhibición, algo mayor nuevamente para el selenoderivado 35. En las pruebas realizadas con los microsomas hepáticos tratados con las tioureas 54-57, se utilizaron concentraciones finales de los mismos de 0.250, 0.100 y 0.050 mM. También se emplearon los controles con +VE, y ¿-tocoferol. Los resultados obtenidos se expresan en la Tabla 9. Las cuatro tioureas ensayadas se comportan como buenos inhibidores de la oxidación microsomal a las concentraciones ensayadas, siendo el potencial inhibidor 56>54>57>55, es decir, mayor con las tioureas preparadas a partir de aminas alifáticas que a partir de aminas aromáticas. Actualmente la tesis se encuentra en fase de redacción. El procedimiento de síntesis y propiedades de la mayor parte de los compuestos de esta tesis ha sido incluido en una patente que ha sido presentada en la Oficina de Patentes y Marcas. Antioxidantes en los alimentos Aceites y grasas vegetales Los carbohidratos juegan un papel fundamental en importantes eventos biológicos como la infección, inflamación, señalización celular, metástasis tumoral, etc. En estos procesos tiene lugar la interacción proteina-carbohidrato. Esta interacción se caracteriza por una baja afinidad que es compensada en la naturaleza por la presentación de numerosas copias tanto de los carbohidratos como de los correspondientes receptores, para dar lugar a interacciones multivalentes que aumentan la afinidad y la selectividad de estos procesos de reconocimiento. Una familia importante de receptores son los PRRs (receptores de reconocimiento de patrones moleculares) que interaccionan con estructuras conservadas y necesarias para la supervivencia de microorganismos, participando de forma activa en la generación de la respuesta inmunitaria inicial. Uno de estos PRRs, DC-SIGN (dendritic cell-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin), juega un papel fundamental en los procesos infecciosos de muchos patógenos, como M. tuberculosis, Schistosoma mansoni, el virus de la hepatitis C, el citomegalovirus, el virus del Dengue, el VIH y el virus del ébola. Esta lectina, presente en la membrana celular de células dendríticas, es capaz de reconocer proteínas altamente glicosiladas, generalmente conteniendo estructuras de oligosacáridos manosiladas y fucosiladas. Basado en estos datos y en la experiencia previa de nuestro grupo de investigación en la preparación de sistemas multivalentes de carbohidratos, se han preparado en esta tesis doctoral estructuras glicodendríticas para la interacción con la lectina DC-SIGN y la evaluación de sus actividades biológicas. Usando una estrategia sintética convergente y la reacción de cicloadición entre azidas y alquinos catalizada por Cu(I) (CuAAC), se han podido sintetizar diferentes estructuras dendriméricas que se han funcionalizado con distintos carbohidratos. Esta aproximación ha permitido la formación de una pequeña biblioteca de glicodendrímeros derivados de manosa, fucosa y de un mimético del disacárido natural (man-¿-1,2-man) con buenos rendimientos, de forma eficiente. Algunos de estos compuestos han mostrado buenas actividades en ensayos de competición con la lectina DC-SIGN, utilizando para ello un biosensor con detección por SPR (IC50 ~ 1 ¿M) y un ensayo de inhibición de infección utilizando un modelo del virus del ébola (IC50 ~ 1 ¿M). Además, se ha seleccionado otro tipo de soporte multivalente para una presentación masiva de carbohidratos en su superficie. Este soporte está basado en una partícula viral no natural que se ha funcionalizado con glicodendrones de primera y segunda generación. Usando la reacción CuAAC, se han preparado dos partículas virales altamente monodispersas, con valencia de hasta 1620 copias de manosas, dando lugar a los sistemas multivalentes de carbohidratos con mayor valencia (de forma monodispersa) descritos hasta la fecha. Estos sistemas multivalentes de manosa han dado valores de inhibición en un ensayo de infección dependiente de DC-SIGN muy importantes, del orden del nM¿pM. Por último, en esta tesis doctoral también se han preparado glicodendrones de manosa y fucosa funcionalizados con un marcador fluorescente (derivado del BODIPY) para poder analizar los procesos de internalización y señalización celular mediados por el receptor DC-SIGN en células dendríticas. En estos ensayos, se ha demostrado que dichos glicodendrones se internalizan eficientemente de modo dependiente de esta lectina aunque no dan lugar a procesos de maduración de las células dendríticas, ni indujeron un cambio del tipo respuesta inmunitaria. Se puede concluir por tanto, que este tipo de sistemas es atractivo para su empleo como agentes transportadores de moléculas de interés en células dendríticas.
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D EPARTAMENTO DE Síntesis de compuestos organoselénicos derivados del hidroxitirosol. Determinación de su actividad como antioxidantes. EPARTAMENTO DE Q UÍMICA O RGÁNICA F ACULTAD DE Q UÍMICA U NIVERSIDAD DE S EVILLA Síntesis de compuestos organoselénicos derivados del hidroxitirosol. Determinación de su actividad como antioxidantes. Antonio Gómez Carretero Sevilla, Enero de 2012 Síntesis de compuestos organoselénicos derivados del hidroxitirosol. Determinación de Antonio Gómez Carretero
D EPARTAMENTO DE Síntesis de compuestos organoselénicos derivados del hidroxitirosol. su actividad como antioxidantes. EPARTAMENTO DE Q UÍMICA O RGÁNICA F ACULTAD DE Q UÍMICA U NIVERSIDAD DE S EVILLA Síntesis de compuestos organoselénicos derivados del hidroxitirosol. Determinación de su actividad como antioxidantes. Memoria presentada por el Antonio Gómez Carretero para grado de Doctor en Química. Sevilla, Enero de 2012 Síntesis de compuestos organoselénicos Determinación de Licenciado Antonio Gómez Carretero para optar al Enero de 2012
D EPARTAMENTO DE Fdo. Dr. José Mª Fernández Guzmán, Profesor Titular del Departamento de Química Orgánica de la Universidad de Sevilla EPARTAMENTO DE Q UÍMICA O RGÁNICA F ACULTAD DE Q UÍMICA U NIVERSIDAD DE S EVILLA Vº Bº de los Directores de la Tesis Fdo. Dr. José Mª Fernández -Bolaños Guzmán, Profesor Titular del Departamento de Química Orgánica de la Universidad de Sevilla Fdo. Dra. Inés Maya Castilla, Catedrática de Escuela Universitaria del Departamento de Química Orgánica de la Universidad de Sevilla Fdo. Dr. Juan Fernández-Bolaños Guzmán, Científico Titular del Instituto de la Grasa de Sevilla Fdo. Dra. Inés Maya Castilla, Catedrática de Escuela Universitaria del Departamento de Química Orgánica de la Universidad de Sevilla
Muchas cosas han pasado y cambiado desde aquél 4 de junio de 2007, día en que comencé esta etapa investigadora, y muchas son las personas que de una u otra forma me han acompañado durante esta odisea. A ellas quiero expresarle mi más sentido agradecimiento: A mis directores de Tesis de la Universidad de Sevilla, los Profesores Dr. José María Fernández-Bolaños Guzmán y Dra. Inés Maya Castilla, por su esfuerzo y dedicación en la realización de este trabajo, porque en su día confiaron en mí para llevarlo a cabo y por todo lo que con ellos he aprendido. A mi director del Instituto de la Grasa (C.S.I.C) Dr. Juan Fernández-Bolaños Guzmán, por haber dirigido una parte importantísima de esta investigación, pero sobre todo por su cariño, su amistad, y porque además de transmitirme conocimientos me ha enseñado valores tan importantes como la humildad que él mismo desprende y que sin duda, vaya donde vaya, intentaré llevar por norte. Al Ministerio de Ciencia e Innovación (“Glicodiversificación de moléculas bioactivas”, CTQ2008-02813) y a la Junta de Andalucía (“Optimización del aislamiento de polifenoles de la aceituna. Complejación con ciclodextrinas, derivatización y evaluación como agentes antioxidantes”, P08-AGR-03751, FQM-134, AGR-132), por la financiación de los Grupos de Investigación dentro del cual se ha realizado esta Tesis. A los servicios de Resonancia Magnética Nuclear y Espectroscopía de Masas de la Universidad de Sevilla por la labor realizada en el registro de espectros de RMN y masas.
Al Profesor Dr. Enrico Marcantoni de la Universidad de Camerino (Italia), por acogerme durante mi estancia de dos meses, y a los compañeros que allí tuve la oportunidad de conocer, especialmente Daniele, Mauro, Serena, Silvia, Simone y Roberto. A los Profesores Dr. Garry Duthie y Baukje de Roos del Insituto Rowett de la Universidad de Aberdeen (Escocia, RU) por acogerme durante dos meses y permitirme disfrutar y aprender con ellos y su grupo. Gracias también a Eva, Luisa, Phillip y Sharon por hacerme aquellos fríos días mucho más llevaderos. A los doctores Amancio Carnero y Mª Ángeles López por la magnífica labor desempeñada en los ensayos de actividad anticancerígena en el Instituto de Biomedicina de Sevilla. Al Director del Departamento de Química Orgánica Dr. Manuel Gómez Guillén, por su ayuda con los trámites administrativos durante todo este tiempo. A Guillermo Rodríguez por la inestimable ayuda y por los conocimientos que me ha ofrecido durante este tiempo, por su optimismo y su fortaleza para ver siempre el vaso medio lleno, y porque en definitiva es un director más de esta Tesis. A Óscar López, por tener siempre respuestas para todas mis dudas y por ofrecer la mejor de las versiones de lo que con esfuerzo y trabajo duro se puede llegar a ser en la vida.
A los componentes del grupo de Pared Celular del Instituto de la Grasa (CSIC): Ana, Rafael, Rocío y Sara J., por el compañerismo, amistad y cariño demostrados. A Blanca Vioque por su colaboración y ayuda con las medidas colorimétricas de pardeamiento en manzanas. A Elisa y Mª Ángeles, porque no habría palabras, besos ni abrazos que compensasen lo que en estos más de cuatro años me han ofrecido. Por tantas y tantas charlas, dentro y fuera del laboratorio, por haber compartido tantos momentos y experiencias, y por haber traspasado con creces la barrera del compañerismo, convirtiéndose en mis grandes (y espero que eternas) amigas. A todos los compañeros que han pasado por el laboratorio 3, especialmente Ana, Azucena, Chema, Irene, Javi, Nader, Penélope, Rocío, Sergio y Susana. Al resto de becarios (ya casi todos doctores) del Departamento de Química Orgánica de la Universidad de Sevilla, especialmente Antonio B., Antonio F., Aurora, Bea, Elena M., Elena S., Javi I., Paqui, Rocío C., etc., porque ellos también tienen su importante papel en el desarrollo y progreso de la Química. A mis compañeros de laboratorio en el Instituto de la Grasa (CSIC): Antonio L., Javi, Fátima, Olivia y Sara V., por todo lo que hemos compartido, pero sobre todo por esas risas diarias que conseguían subir el ánimo cuando los resultados no acompañaban.
Al resto de la plantilla del Instituto de la Grasa (CSIC), que por ser tantos me van a permitir no nombrar, por las conversaciones de pasillo, por esas animadas charlas y debates a la hora de la comida, y por estar siempre dispuestos cuando se les ha necesitado. Al Profesor Dr. Pedro Cintas de la Universidad de Extremadura, con quien inicié mi carrera investigadora, porque todo lo que aprendí con él, durante mi carrera y mi Tesina, que me enorgullece decir que fue muchísimo, ha servido de base y de cimientos para el desarrollo de mi labor investigadora. También a todos los compañeros que allí dejé, en especial a Diego Airado, que aunque nos separen cientos o miles de kilómetros siempre está dispuesto a colaborar. A mis compañeros de la carrera de Enología, por los vinos tomados y los que nos quedan por tomar. A todos los buenos amigos, en especial a esos “Burladeros”, porque las batallitas, lejos de ir quedando atrás, van formando el día a día. A los locos bajitos, en especial Aitana, Esther, Javier, José Antonio, Lucía, Miranda, Rubén, Soraya y sobre todo mi primo Manuel, porque a su corta edad son las personas de las que más aprendo y las que más me motivan cada día. A mis cuñad@s, suegros y demás familia política por el aprecio que sienten por mí y que intento devolverles. A mis hermanos, por su apoyo incondicional e imperecedero.
Índice ÍNDICE ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS 9 RESUMEN/SUMMARY 17 RELACIÓN DE COMPUESTOS 25 1. INTRODUCCIÓN GENERAL 31 OBJETIVOS DE LA TESIS 56 2. SÍNTESIS DE DOPAMINA Y GLICOSIL DERIVADOS DE DOPAMINA A PARTIR DE HIDROXITIROSOL 61 2.1. Introducción y antecedentes 63 2.1.1. Dopamina. Efectos fisiológicos. 63 2.1.2. Síntesis de dopamina 69 2.1.3. Síntesis de glicosil derivados de dopamina 66 2.2. Resultados y discusión 77 2.2.1. Síntesis de dopamina 77 2.2.2. Síntesis de glicosil derivados de dopamina 84 3. SÍNTESIS DE SELENOUREAS, SELENUROS Y DISELENUROS DE HIDROXITIROSOL. 91 3.1. Introducción y antecedentes 93 3.1.1. Selenoureas. Importancia biológica 93 3.1.2. Síntesis de selenuros y diselenuros 98
Índice 3.2. Resultados y discusión 104 3.2.1. Síntesis de selenoureas 104 3.2.2. Síntesis de selenuros y diselenuros derivados de hidroxitirosol 110 4. TIOUREAS DERIVADAS DE HIDROXITIROSOL. REACCIONES CON DDQ Y FORMACIÓN DE 2-AMINO- 1,3-BENZOTIAZEPINAS 121 4.1. Introducción y antecedentes 123 4.1.1. Propiedades de las tioureas 123 4.1.2. Transformación de tioureas en 2-amino-dihidro y 2- imino-tetrahidro-1,3-benzotiazepinas por oxidación con DDQ 128 4.2. Resultados y discusión 132 4.2.1. Tioureas derivadas de dopamina 132 4.2.2. Formación de 2-amino-dihidro y 2-imino-tetrahidro- 1,3-benzotiazepinas por oxidación de tioureas con DDQ 133 5. PRUEBAS DE ACTIVIDAD BIOLÓGICA 141 5.1. Introducción y antecedentes 143 5.1.1. Medida de la capacidad antioxidante 143 5.1.2. Inhibición de la actividad tirosinasa 151
Índice 5.1.3. Ensayos ex vivo. Inhibición de la peroxidación microsomal. 161 5.1.4. Ensayos in vivo. Inhibición de la melanosis en camarones. 165 5.2. Resultados y discusión 168 5.2.1. Ensayos in vitro. 169 5.2.1.1. Poder reductor del hierro. 169 5.2.1.2. Actividad antirradical. 178 5.2.1.3. Inhibición de la oxidación primaria del ácido linoleico en emulsión. Método del tiocianato férrico 189 5.2.1.4. Inhibición de la oxidación secundaria del ácido linoleico en emulsión. Método del ácido tiobarbitúrico (TBA). 196 5.2.1.5. Inhibición de la actividad tirosinasa.de hongos in vitro 205 5.2.2. Ensayos ex vivo. 234 5.2.2.1. Inhibición de la peroxidación lipídica en microsomas. 234 5.2.2.2. Ensayos de actividad anticancerígena 249 5.2.3. Ensayos in vivo. 251 5.2.3.1. Inhibición del pardeamiento en manzanas. 251
Índice 5.2.3.2. Inhibición de la melanosis en camarones 255 6.1. FORMACIÓN DE ISOXAZOLES CON EL CATALIZADOR CeCl 3 /NaI 267 6.1. Introducción y antecedentes 269 6.2. Resultados y discusión 280 7. CONCLUSIONES 291 8. PARTE EXPERIMENTAL 301 8.1. Métodos generales 303 8.2. Secado de disolventes y reactivos 306 8.3. Productos comerciales 307 8.4. Métodos para la determinación de la actividad antioxidante 311 8.4.1. Poder reductor del hierro. 311 8.4.2. Actividad antirradical 312 8.4.3. Inhibición de la oxidación primaria del ácido linoleico en emulsión. Método del tiocianato férrico 314 8.4.4. Inhibición de la oxidación secundaria del ácido linoleico en emulsión. Método del ácido tiobarbitúrico (TBA) 315 8.4.5. Inhibición de la peroxidación en microsomas 316
Índice 8.4.6. Estudio de la inhibición de la actividad tirosinasa 319 8.4.7. Estudio del pardeamiento en manzanas 320 8.4.8. Estudio de la inhibición de la melanosis en camarones 320 8.5. Materias primas 321 8.6. Nuevas investigaciones 326 8.6.1. Síntesis de dopamina y glicoderivados de dopamina a partir de hidroxitirosol 326 8.6.2. Síntesis de selenoureas, selenuros y diselenuros de hidroxitirosol 350 8.6.3. Tioureas derivadas de dopamina. Reacciones con DDQ y formación de 2-amino-1,3-benzotiazepinas. 376 8.6.4. Formación de isoxazoles con el catalizador CeCl 3 •7H 2 O/NaI-SiO 2 395 9. ESPECTROS REPRESENTATIVOS 399
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Abreviaturas y acrónimos 11 a Señal ancha Å Ångström ABAP 2,2’-azobis(2-amidinopropano) ABTS 2,2'-azinobis-(ácido etilbenzotiazolina-6-sulfúrico) sal de diamonio Ac Acetilo ac. Acuoso AcO Acetoxi ADN Ácido desoxirribonucleico ADP Adenosina difosfato ARNm Ácido ribonucleico mensajero t Bu terc-Butilo Bu Butilo c Cuartete calcd. Calculado cat. Catalítico c.c.f. Cromatografía en capa fina CD Ciclodextrina CIMS Chemical Ionization Mass Spectrometry cm Centímetro col. Colaboradores
Abreviaturas y acrónimos 12 COSY Correlated Spectroscopy d Doblete DA Dopamina DBU 1,8-Diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno DDQ 2,3-Dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona DHFG 3,4-Dihidroxifenilglicol dm Decímetro DMF N,N-Dimetilformamida DPPH Radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo EIMS Electron Impact Mass Spectrometry equiv. Equivalente Et Etilo eV Electronvoltio h Hora HPLC High Performance Liquid Chromatography HRCIMS High Resolution Chemical Ionization Mass Spectrometry HREIMS High Resolution Electron Impact Mass Spectrometry HSQC Heteronuclear Single-Quantum Correlation HT Hidroxitirosol Hz Hertzios
Resumen/Summary 20 Se han evaluado las propiedades antioxidantes de los compuestos sintetizados en esta Tesis, mediante la determinación in vitro del poder antioxidante de reducción férrica, actividad antirradical DPPH, actividad antirradical ABTS, inhibición de la oxidación primaria del ácido linoleico por el método el tiocianato férrico, e inhibición de la oxidación secundaria del ácido linoleico por el método del ácido tiobarbitúrico. También se ha estudiado la inhibición de la actividad monofenolasa y difenolasa de la tirosinasa usando L-tirosina y L-DOPA, respectivamente, como sustratos y HT, 3,4-DHFG y una serie de los compuestos sintetizados como inhibidores. En ensayos ex vivo se ha estudiado la capacidad de nuestros antioxidantes sintéticos para inhibir la peroxidación en microsomas de hígados de ratas, sometidos a una alimentación deficiente en vitamina E, encontrándose resultados muy prometedores para muchos de ellos, superiores a los descritos hasta la fecha para cualquier otro producto natural o sintético. Este apartado se realizó durante una estancia de dos meses en el Rowett Institute of Nutrition and Health, de la Universidad de Aberdeen (Escocia, Reino Unido), bajo la dirección de los doctores Garry Duthie y Baukje de Roos. Se ha evaluado la capacidad antitumoral de varios de los derivados organoselénicos (selenoureas, un diselenuro y una sal de selenonio) sintetizados, como inductores de apoptosis en las líneas celulares A-375 (melanoma), SF-268 (glioblastoma) y NCI-H460 (cáncer de pulmón) resultando ser dichos compuestos mucho más activos que el HT.
Resumen/Summary 21 Se han estudiado algunos de los antioxidantes preparados en esta Tesis en análisis in vivo como retardantes de la melanosis en camarones, con buenos resultados, y como inhibidores del pardeamiento en fruta, con pobres resultados. Por último, durante una estancia de dos meses en la Universidad de Camerino (Italia), bajo la dirección del Prof. Enrico Marcantoni se llevó a cabo la síntesis de isoxazoles a partir de aldehidos aromáticos o heteroaromáticos y exceso de nitroacetato de etilo, usando el catalizador CeCl 3 ·7H 2 O-NaI/SiO 2 , mediante reacciones en ausencia de disolvente.
Resumen/Summary 22 SUMMARY In this PhD Thesis, we have mainly focused our effort on the preparation of functional derivatives of hydroxytyrosol (HT), due to the remarkable biological and pharmacological properties exhibited by this polyphenol. The natural compound HT, isolated from olive mill wastewaters (OMW), a waste by-product of the olive oil industry, has been used as starting material, thus contributing to add value to this waste. The synthesis of neurotransmiter dopamine has been performed from HT in three steps via hydroxytyrosyl bromine and in four steps through a cathecol hydroxyls protection-deprotection strategy. Furthermore, HT could be transformed into O-glucopyranosyl and O-galactopuranosyl derivatives of dopamine. Selenourea, selenide, diselenide and selenonium derivatives of HT have been obtained by the first time, with unprotected and protected cathecol moiety. Furthermore, thioureas have been synthesized from HT by condensation of dopamine with commercial isothiocyanates. These thioureas have been oxidized with DDQ to obtain 2-amino-dihydro and 2- imino-tetrahydro-1,3-benzothiazepines which keep cathecol moiety on their structures. Antioxidant properties of the new synthesized products have been evaluated, using in vitro tests like ferric reducing antioxidant power, DPPH antiradical activity, ABTS antiradical activity, primary oxidation inhibition
Resumen/Summary 23 measured by ferric thiocyanate method, and secondary oxidation inhibition measured by thiobarbituric acid method. The inhibition of monophenolase and diphenolase activities of tyrosinase have been assayed using L-tyrosine and L-DOPA, respectively, as substrates and HT, 3,4-DHPG, and a series of the synthesized compounds, as inhibitors. The capacity of our synthetic antioxidants for avoiding microsome peroxidation in rat livers subjected to a diet deficient in vitamin E has been also studied by ex vivo assays, finding very promising results for many of them, better than those described to date for any other natural or synthetic product. This research was carried out in a two-month stay in the Rowett Institute of Nutrition and Health, University of Aberdeen (Scotland, UK), supervised by Dr. Garry Duthie and Dr. Baukje de Roos. Antitumor activity of several organoselenium derivatives (selenoureas, a diselenide and a selenonium salt) via apoptosis induction has been evaluated in A-375 (melanoma), SF-268 (glyoblastome) and NCF- H460 (lung cancer) cell lines, resulting all of them much more active than hydroxytyrosol. Some of our synthetic antioxidants have been assayed in vivo as shrimp melanosys retardant with good results, and as inhibitors of fruit browning with poor results. Finally, in a two months stay at the University of Camerino (Italy) supervised by Professor Enrico Marcantoni, we have carried out the synthesis of isoxazoles from aromatic or heteroaromatic aldehydes and
Resumen/Summary 24 excess of ethyl nitroacetate, using CeCl 3 ·7H 2 O−NaI/SiO 2 under solvent-free conditions.
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Relación de compuestos 27 RELACIÓN DE COMPUESTOS A continuación se indican los productos caracterizados en cada uno de los capítulos de esta Tesis: SÍNTESIS DE DOPAMINA Y GLICOSIL DERIVADOS DE DOPAMINA A PARTIR DE HIDROXITIROSOL 1 H O HO B r H O HO N 3 H O HO N H 2 . H C l 2 3 O OOH O OBr O ON 3 4 5 6 TsO TsO OTs TsO TsO Cl 89 TsO TsO N 3 10 TsO HO N 3 11 HO TsO N 3 12 HO HO OSi Ph Ph 7 O AcO O OAc OAc TsO N 3 O AcO O OAc OAc TsO N 3 AcO AcO O AcO AcO O OAc OAc TsO N 3 13 14 15 16 O HO O OH OH HO N 3 O HO O OH OH HO N 3 OH OH O HO HO O OH OH HO N 3 O HO HO O OH OH HO N 3 17 18 19 20 O AcO AcO O OAc O A c TsO N 3
Relación de compuestos 28 O HO O OH OH HO NH 2 .HCl O HO O OH OH HO NH 2 .HCl OH OH O HO HO O OH O H HO NH 2 .HCl O HO HO O OH O H HO NH 2 .HCl 21 22 23 2 4 SÍNTESIS DE SELENOUREAS, SELENUROS Y DISELENUROS DE HIDROXITIROSOL HO HO N Se N H H HO HO N Se N H H Me HO HO N Se N H H OMe HO HO N Se N H H N HN H Se OH OH 25 26 27 28 MeO MeO NH OMe OMe MeO MeO N 3 MeO MeO NH 2 29 30 31 MeO MeO N Se N H H MeO MeO N Se N H H Me MeO MeO N Se N H H OMe MeO MeO N Se N H H N HN H Se OMe OMe 32 33 34 35 AcO AcO Br MeO MeO Se OMe OMe MeO MeO OMe OMe Se Se 36 37 38 O OSe O O O OSe Se O O 39 40
Relación de compuestos 29 A cO A cO Se OAc OAc Se 41 HO HO O H OH Se Se HO H O Se OH O H HO OH Br 43 42 AcO A c O Se OAc O A c AcO OAc Br 44 TIOUREAS DERIVADAS DE HIDROXITIROSOL. REACCIONES CON DDQ Y FORMACIÓN DE 2-AMINO-1,3-BENZOTIAZEPINAS HO HO H NH NMe S HO HO H N H N S HO HO H N H N SMe HO HO H NH N S HO HO H NH N S 45 46 47 48 49 OAc OAc Cl Cl NC NC AcO AcO S N N AcO AcO S N N A cO AcO S N N AcO AcO S N NCH 3 Ac AcO AcO S N N Ac H 3 C 50 51 52 5 6 5554 53 Ac AcO AcO S N N Ac Me Ac Ac
1. Introducción General 36 como el cáncer o la aterosclerosis. 13,14 También previenen la degradación y enranciamiento de alimentos por inhibición de la oxidación lipídica. Además, la adición de antioxidantes naturales podría ser una vía para desarrollar alimentos funcionales, de forma que estos aditivos naturales incrementen, al mismo tiempo, los efectos saludables y el periodo de almacenamiento de los productos alimentarios. Existen pruebas fehacientes que relacionan el modelo de dieta Mediterránea, con la prevención de enfermedades coronarias, a pesar del elevado consumo de grasas. Este hecho pone de manifiesto que el tipo de grasa consumida es más importante que la cantidad ingerida. 15 La principal fuente de ácidos grasos monoinsaturados de esta dieta es el aceite de oliva, 16 cuyo contenido en ácidos grasos monoinsaturados, junto con el contenido polifenólico del aceite influye en el desarrollo de dichas propiedades preventivas. 17 La aceituna contiene, además de hidroxitirosol, una amplia variedad de compuestos polifenólicos 18,19 que juegan un importante papel en las propiedades químicas, organolépticas y nutricionales del aceite de oliva virgen y de la aceituna de mesa, habiendo puesto de manifiesto mediante estudios epidemiológicos las propiedades beneficiosas para la salud que 13 Aruoma, O.I. Mut. Res., 2003,523, 9-20. 14 López-Miranda, J. Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis. 2010, 20, 284-294. 15 Owen, R.W.; Giacosa, A.; Hull, W.E. Eur. J. Cancer Prev., 2004, 13, 319-326. 16 Keys, A. Am. J. Clin. Nutr.1995, 61,1321–1323. 17 Waterman, E.; Lockwood, B. Alt. Med. Rev. 2007, 12, 331-342. 18 Malheiro, R.; Sousa, A.; Casal, S.; Bento, A.; Pereira, J. A. Food Chem. Toxicol. 2011, 49, 450-457. 19 Bertin, L.; Ferri, F.; Scoma, A.; Marchetti, L.; Fava, F. Chem. Engin. J. 2011, 171, 1287- 1293.
1. Introducción General 37 supone la ingesta de dicho aceite. 20,21 Ya en la antigüedad el aceite de oliva era utilizado como medicamento en determinados casos de intoxicación, dolores de cabeza, problemas estomacales, picaduras de insectos y para la desinfección de cualquier parte del cuerpo y cuidado de la piel. 22 La aceituna tiene una composición fenólica característica, que depende de la variedad de la aceituna, estado de madurez, estación del año y condiciones climatológicas. 23 La oleuropeína (65) es el principal monoterpeno secoiridoide de las aceitunas inmaduras y su concentración disminuye con el proceso de maduración, mientras que la desmetiloleuropeína (66), el aglicón de la oleuropeína (67), y el 3,4- DHPEA-EDA (68) (forma dialdehídica del elenoato de hidroxitirosilo) se incrementan con la maduración. El 4-ȕ-glucósido de hidroxitirosol (69) es el fenol predominante en aceitunas maduras. 24 (Figura 1.1) 20 Owen, R.W.; Giacosa, A.; Hull, W.E.; Haubner, R.; Spiegelhalder, B.; Bartsch, H. Eur. J. Cancer, 2000, 36, 1235-1247. 21 Perez-Martinez, P.; Lopez-Miranda, J.; Blanco-Colio, L.; Bellido, C.; Jimenez, Y.; Moreno, J.A.; Delgado-Lista, J.; Egido J.; Perez-Jimenez, F. Atherosclerosis, 2007, 194, 141–146. 22 Wiesman, Z. Adv. Biotechnol. 2009. 303-327. Ed. Academic Press, Oxford (UK). 23 Romero, C.; Brenes, M.; Yousfi, K.; Garcia, P.; García, A.; Garrido, A. J. Agric. Food Chem., 2004, 52, 479. 24 Romero, C.; Brenes, M.; García, P.; Garrido, A. J. Agric. Food Chem., 2002,50, 3835.
1. Introducción General 38 Figura 1.1. Principales glicoconjugados del hidroxitirosol presentes en la aceituna. Por otra parte, la aceituna contiene verbascósido (70) y otros secoiridoides como el ligstrósido (71) y el oleurósido (72), isómero de la oleuropeína (65). Otros grupos de compuestos fenólicos son derivados de OH HO O O O Me OO OH HO HO OH O M e O Oleuropeína 65 OH HO O O OMe OO OH HO HO OH O H O Desmetiloleuropeína 66 OH HO O O O Me OH O M e O Aglicón de la oleuropeína 6 7 OH HO O O Me O OMeO 3,4-DHPEA-EDA 68 O HO O OH O OH HO HO OH Hidroxitirosol 4-β-glucósido 69 OH HO O OO OO OH HO HO OH OMeO Oleurósido 72 HO O OHO ORha O HO O OH OH Verbascósido 70 Ligstrósido 71 OH HO O OO OO OH HO HO OH OMeO Me
1. Introducción General 39 los ácidos fenilacético (ácido 3,4-dihidroxifenilacético), benzoico (ácido 4- hidroxibenzoico), y ácidos cinámicos (p-cumárico, ferúlico y cafeico). Otros fenoles encontrados en la pulpa de la aceituna son el catecol, metilcatecol, tirosol, hidroxitirosol (HT), y concentraciones relativamente altas de flavonoides (luteolina-7-glucósico, apigenina-7-glucósido, rutina y quercetina), y varios pigmentos del grupo de las antocianinas (cianidina-3- glucósido y cianidina-3-rutinósido o antirrinina), que proporcionan el intenso color púrpura oscuro a las aceitunas maduras. 25 El oleurósido 72 ha sido aislado de las hojas del olivo 26 y de los residuos de las almazaras. 27 Otros glicósidos del hidroxitirosol como 73 28 y 74 29 han sido aislados de la planta medicinal coreana Clematis mandshurica, y del tallo de la planta medicinal china Sargentodoxa cuneata, respectivamente. (Figura 1.2) Figura 1.2. Otros glicoconjugados del HT. 25 Romero, C.; García, P.; Brenes, M.; Garcia, A.; Garrido, A. Eur. Technol. Food Res. 2002, 215, 482. 26 Kuwajima, H.; Uemura, T.; Takaishi, K.; Inoue, K.; Inouye, H. Phytochemistry, 1988, 27, 1757. 27 Obied, H. K.; Allen, M.S.; Bedgood, D.R., Jr.; Prenzler, P.D.; Robards, K., J. Agric. Food Chem., 2005, 53, 9911. 28 Shi, S.-P.; Jiang, D.; Dong, C.-X.; Tu, P.-F. Helvetica Chim. Acta, 2006, 89, 1023. 29 Chang, J; Case, R. Phytochemistry, 2005, 66, 2752. OO OH HO HO O OH OH O OH OH OH OO OH HO HO O O MeO HO M e O HO OH 7 3 74
1. Introducción General 40 Los principales compuestos fenólicos presentes en aceite de oliva virgen son el tirosol, hidroxitirosol, acetato de hidroxitirosilo, las agliconas (o aglicones) de la oleuropeína y del ligstrósido, el verbascósido, y los lignanos pinorresinol y 1-acetoxipinorresinol. 30 La cantidad de estos compuestos en el aceite depende de la variedad del olivo, de la maduración de la aceituna, el tipo de prensado y el procedimiento de extracción del aceite. Así por ejemplo, la concentración del acetato de hidroxitirosol es similar a la del HT en la variedad Arbequina y es más del doble en la variedad Picual, y entre un tercio y un cuarto en los aceites de tipo Manzanilla y Hojiblanca. 31 Durante el procesado mecánico de la aceituna para la obtención del aceite de oliva, la mayor proporción de la fracción fenólica se encuentra en la fase acuosa, mientras que sólo una proporción minoritaria (< 1%) se halla en el aceite. 32 Esto explica la abundante proporción de polifenoles en las aguas residuales de las almazaras (alpechín), 33 procedentes del proceso tradicional de extracción en tres fases. El uso de un procedimiento moderno en dos fases conduce a aceite de oliva virgen con una mayor concentración de compuestos polifenólicos que en el caso del proceso en tres fases, aunque la mayor parte de los fenoles (en torno al 98 %), permanece en el residuo 30 Brenes, M.; García, A.; Ríos, J.J.; García, P.; Garrido, A. Inter. J. Food Sci. Technol., 2002, 37, 615. 31 Romero, C.; Medina, E.; Vargas, J.; Brenes, M., de Castro, A.; J. Agric. Food. Chem, 2007, 55, 680-686. 32 Vierhuis, E.; Servili, M.; Baldioli, M.; Schols, H.A.; Voragen, A.G.J.; Montedoro, G.F. J. Agric. Food Chem., 2001,49, 1218. 33 Fernández-Bolaños, J.; Rodríguez, G.; Rodríguez, R.; Guillén, R.; Jiménez, A. Grasas Aceites, 2006, 57, 95.
1. Introducción General 41 líquido-sólido llamado alperujo, 34 Así pues, ambos residuos alperchín y alperujo parecen ser una fuente abundante e inagotable de antioxidantes naturales. La tecnología para la extracción del aceite de oliva en España ha progresado significativamente desde principios de los años setenta cuando, haciendo obsoleto el antiquísimo procedimiento de prensado, apareció el sistema de centrifugación de tres fases. La producción de aceite de oliva mediante este sistema genera dos subproductos: el primero, un residuo líquido o “alpechín”, muy contaminante, mezcla del agua de vegetación de las aceitunas más el agua añadida en las diferentes etapas del proceso de extracción. El segundo subproducto es un residuo sólido u “orujo”. Es una combinación de pulpa, huesos de aceituna y un resto graso. El uso de un nuevo y moderno sistema de procesamiento de dos fases, desarrollado durante la década de los noventa, 35 ha reducido enormemente el volumen de residuos, y con ello su carga contaminante (sólidos en suspensión, alta concentración de compuestos orgánicos y sales minerales), aunque genera un nuevo subproducto, denominado “alperujo” semisólido, con un contenido de agua que oscila entre el 65-70 %. Es una mezcla del residuo líquido (alpechín) y sólido (orujo). Se estima una producción anual de alperujo de entre 3,5 y 6 millones de toneladas por campaña. 36 34 Fernández-Bolaños, J.; Rodríguez, G.; Rodríguez, R.; Heredia, A.; Guillén, R.; Jiménez, A. J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 6804. 35 Alba, J.; Hidalgo, F.; Ruiz, M.A.; Martínez, F.; Moyano, M.J.; Cert, A.; Pérez, M.C.; Ruiz, M.V. Grasas y aceites, 1996, 47, 163-181. 36 Aragón, J.M.; Palancar, M.C. Present and future of alpeorujo. 2000. 242-300. Ed. Complutense.
1. Introducción General 42 La sensibilidad de la población a los problemas medioambientales y la legislación vigente sobre vertidos ponen de manifiesto la necesidad de desarrollar sistemas para el tratamiento y aprovechamiento de los subproductos del aceite de oliva. Los usos potenciales de estos subproductos están relacionados con la salud (cosméticos, productos farmacéuticos, aditivos alimentarios, etc.), biofertilizantes y/o compost, alimentación animal, y con la producción de energía alternativa (biodiesel, gasificación, producción de metano, etc.). 37 El elevado contenido fenólico de alpechín y alperujo convierte a estos residuos en una buena fuente de antioxidantes naturales. Así pues, la industria del aceite de oliva genera grandes cantidades de residuos en los que quedan una gran cantidad de productos valiosos, por lo que en la última década han aparecido numerosos artículos y patentes sobre la extracción de compuestos fenólicos de dichos residuos. 19,38,39 Entre los compuestos polifenólicos más abundantes en los residuos de la industria de extracción del aceite de oliva se encuentra el hidroxitirosol. El aislamiento del mismo con un alto grado de pureza ha facilitado considerablemente el estudio de su estabilidad, bioactividad, biodisponibilidad, y toxicología. El acceso a hidroxitirosol puro y a precio asequible también está permitiendo la preparación de derivados aún más 37 Wiesman, Z.; Advances biotechnologies. 2009. 243-255. Ed. Academic Press, Oxford (UK). 38 Setti, L.; Pifferi, P.; Bordado, J. Plant for the treatment of waste waters. PCT WO 2003004419 A1 20030116 39 Khoufi, S.; Aloui, F.; Sayadi, S. J. Hazard. Mat. 2008, 151, 531-539.
1. Introducción General 43 potentes, con acciones biológicas y farmacológicas beneficiosas para la salud, y de mayor biodisponibilidad. Los polifenoles se pueden extraer del alpechín mediante: 40,41 - Extracción sólido-líquido del alpechín seco o centrifugado. - Técnicas de adsorción-desorción usando una resina adsorbente, como la resina Amberlite ® XAD o resinas de intercambio aniónico fuertemente básica en forma de cloruro como la Duolite ® . 42 Otros métodos empleados implican la adsorción con lechos fluidizados con materiales poliméricos seguida de la desorción de los antioxidantes mediante el empleo de disolventes orgánicos polares. 39 También se han llevado a cabo extracciones de compuestos fenólicos utilizando fluidos supercríticos (CO 2 ) como disolvente, con resultados similares a las llevadas a cabo con disolventes polares. 43 Se han publicado numerosos artículos sobre la producción de hidroxitirosol (de alta pureza) a partir de los desechos de la aceituna 44-48 40 Fernández-Bolaños, J; Rodríguez, G; Rodríguez, R; Heredia, A; Guillen, R; Jiménez, A. J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 6804-6811. 41 Romero, C.; Brenes, M.; Garcia, P.; Garrido, A. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 3835– 3839. 42 Bostyn, S.; Cagnon, B.; Fauduet, H. Talanta, 2009, 80, 1-7. 43 Lafka, T.I.; Lazou, A.E.; Sinanoglou, V.J.; Lazos, E.S. Food Chem. 2011, 125, 92-98. 44 Brenes, A.; Balbuena, M.; De Castro, A.; Gómez-Millán, A. Production of antioxidant substances (hydroxytyrosol and elenolic acid glucoside) from process solutions in the manufacture of olives. 2003, ES 2,186,467, A1 20030501. 45 Visioli, F.; Galli, C. Curr. Top. Nutraceutical Res., 2003, 1, 85-88. 46 Calero Barcoj, J.; Martínez Nieto, L.; García-Granados López de Hierro, A. Countercurrent extraction process for recovering acids, phenols, alcohols, and their derivatives, from olives-pressing waste. 1994, ES 2,051,238, A1 19940601
1. Introducción General 44 procedentes de la industria del aceite o de la aceituna de mesa. Algunos procesos parecen no ser efectivos; otros son métodos prácticos a escala de laboratorio pero no adecuados para el escalado industrial. En nuestro grupo de Biotecnología de los Alimentos (Instituto de la Grasa, CSIC) se ha conseguido una importante recuperación de productos de alto valor añadido 40,49-51 del alperujo mediante sistema de autohidrólisis por tratamiento al vapor, también conocido como “steam explosion”. Este método se basa en un tratamiento térmico con vapor a alta presión y temperatura, realizado a escala piloto, que consigue la separación de sus principales componentes (celulosa, hemicelulosa, sustancias pécticas, pseudolignina y polifenoles). El tratamiento térmico facilita la separación del alperujo en dos fases, sólida y líquida, y permite la recuperación de hidroxitirosol, 3,4-dihidroxifenilglicol y de otros productos de alto valor añadido tales como manitol, oligosacáridos, azúcares fermentables, otros compuestos fenólicos, etc. Entre los productos recuperados destaca el hidroxitirosol, uno de los principales compuestos fenólicos presentes, de forma libre o conjugada, en el alpechín y el alperujo, y que también está presente en el aceite de oliva y 47 Allouche, N.; Fki, I.; Sayadi, S. J. Agric. Food Chem., 2004, 52, 267-273. 48 Fernández-Bolaños, J.; Heredia, A.; Rodríguez, G.; Rodríguez, R..; Guillén, R.; Jiménez, A. Method for obtaining purified hydroxytyrosol from products and by-products derived from the olive tree. 2002, WO 064,537,; A1 20020822. 49 Felizón, B.; Fernández-Bolaños, J.; Heredia, A.; Guillén, A. J. Am. Oil Chem. Soc., 2000, 77, 15-22. 50 Fernández-Bolaños, J., Felizón, B., Brenes, M., Guillén, R.; Heredia, A. J. Amer. Oil Chem. Soc., 1998, 75, 1643-1649. 51 Fernández-Bolaños, J; Rodríguez, G; Gómez, E; Guillen, R; Jiménez, A; Heredia, A; Rodríguez, R. J. Agric. Food Chem., 2004, 52, 5849-5855.
1. Introducción General 45 en la aceituna de mesa, y que ha sido señalado como compuesto natural de elevado interés, debido a su remarcada actividad antioxidante y farmacológica. 52,53 Se ha desarrollado bajo patente un sistema para la purificación a escala semi-industrial del HT. 54 Uno de los pasos claves del sistema implica el uso de la resina intercambiadora de iones no activada aniónica fuerte (Amberjet 4200-Cl) para atrapar los polifenoles de la fracción acuosa, seguida de una elución con agua. Esta resina muestra una buena separación y alto rendimiento de recuperación; permite obtener fracciones de aproximadamente el 50% de pureza en peso de hidroxitirosol. A continuación, se utiliza una resina adsorbente no iónica XAD (Amberlita) en la que la matriz se lava con una mezcla de metanol o etanol y agua (30- 33%), lo que permitió obtener una fracción de hidroxitirosol del 95% de pureza además de fracciones de hasta el 99.6% de pureza. 40 De esta manera se recupera al menos el 75% del hidroxitirosol presente en los subproductos de la aceituna. El hidroxitirosol aislado con purezas del 50 ó 95-99% se obtiene así en grandes cantidades, y de manera práctica y sencilla, con unos costes comparables a los antioxidantes sintéticos comerciales derivados del petróleo. El precio aproximado es de 0.03 € el gramo con pureza del 50% y de 0.12 € el gramo con 99% de pureza, precios que contrastan con el 52 Hamdena, K.; Alloucheb, N.;Damakb, M.; Elfekia, A. Chem. Biol. Interact. 2009,180, 421–432. 53 Zhua,,L.; Liua, Z.; Fenga, Z.; Haoa, J.; Shena, W.; Lia,,X.; Sunc, L.; Sharmand, E.; Wange, Y.; Wertze, K.; Webere, P.; Shif, X.; Liuf, J. J.Nutr. Biochem. 2010, 21, 1089– 1098. 54 Fernández-Bolaños, J; Rodríguez, G; Rodríguez, R; Heredia, A; Guillen, R; Jiménez, A. (2002). Patente Internacional Nº PCT/ESO2/00058.
1. Introducción General 52 ambas formas con la misma eficacia en la biosíntesis de selenoproteínas, 106 pero se incorporan en diferentes puntos de la ruta metabólica. El selenio absorbido por el organismo se excreta principalmente por la orina. 107 El metil 2-acetamido-2-desoxi-1-seleno-ȕ-D-galactopiranósido (selenoazúcar-B) es el principal metabolito detectado en la orina cuando se ingiere en la dieta la cantidad de selenio recomendada. Sin embargo, si la ingesta de selenio es muy alta, se detecta un aumento de la cantidad de trimetilselenonio (TMSe) 107,108 en la orina. Recientemente se ha desarrollado un sistema en el cual los compuestos de selenio Na 2 SeO 3 y ácido metilselenínico quedan encapsulados en nanopartículas de quitosano, un polisacárido derivado de la quitina, liberándose de forma mucho más eficiente en las células y aumentando su biodisponibilidad, con lo cual se facilita la expresión de selenoproteínas cuando los niveles de selenio son bajos. 109 106 Shiobara, Y.; Yoshida, T.; Suzuki, K. T. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1998, 152, 309-314. 107 Kobayashi, Y.; Ogra, Y.; Ishiwata, K.; Takayama, H.; Aimi, N.; Suzuki, K. T. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99, 15932-15936. 108 Suzuki, K. T.; Kurasaki, K.; Okazaki, N.; Ogra, Y. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2005, 206, 1-8. 109 Zhang, S.; Luo, Y.; Zeng, H.; Wang, Q.; Tian, Fei.; Song, J.; Cheng, W.H. J. Nutr. Biochem. 2011, 22, 71-78. Me Se N H 2 OH O HSe OH NH 2 O Se OH N H 2 O Me SeMet SeCys MeSeCys Me Se Me M e TMSe
1. Introducción General 53 El selenio presenta cierta analogía química con el azufre. 110 Tiene mayor carácter metálico, mayor tamaño que el azufre (1.17 Å frente a 1.04 Å de radio covalente) y menos carácter electronegativo que el azufre. El selenuro es menos básico, pero más nucleófilo, a la vez que más polarizable que el azufre. Existen seis isótopos del selenio 111 , lo que permite una fácil detección por espectrometría de masas, al mostrar un patrón de picos característico. El selenio no recibió especial atención hasta principios del siglo XX en el campo de la química orgánica sintética ya que, en general, la estabilidad de los compuestos es menor a la de los isósteros de azufre, siendo característico en muchos de ellos el depósito de selenio rojo por exposición a la luz. Sin embargo, en la década de los 70, se empieza a emplear en un amplio número de transformaciones dentro de la química de los alcaloides, esteroides, terpenoides, antibióticos y carbohidratos. 110 El primer selenoazúcar sintetizado data de 1945 112 y el primer selenoazúcar natural descrito se aisló de la planta acumuladora de selenio 113 Astragalus racemosus en 1997. 110 Un amplio grupo de compuestos organoselénicos se ha empleado como intermedios en la preparación de derivados de azúcar, 110 selenoazúcares 114,115 y selenonucleósidos. 116 110 Witczak, Z. J.; Czernecki, S. Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1998, 53, 143-199. 111 Lide, D. R. Handbook of Chemistry and Physics, 76th Ed., Ed. CRC Press, 1995. 112 Raymond, A. L. Adv. Carbohydr. Chem. 1945, 1, 129-145. 113 Terry, N.; Zayed, A. M.; de Souza, M. P.; Tarun, A. S. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2000, 51, 401-432. 114 Tiwari, P.; Misra, A. K. Tetrahedron Lett. 2006, 47, 2345-2348. 115 Braga, H. C.; Stefani, H. A.; Paisao, M. W.; Santos, F. W.; Ludtke, D. S. Tetrahedron, 2010, 66. 3441-3446.
1. Introducción General 54 Existen numerosos ejemplos que confirman las interesantes propiedades biológicas de los compuestos organoselénicos. Además del ebselén y el ácido metilselenínico, ya comentados, podemos mencionar el ácido γ,γ’-diselenodivalérico, usado en el tratamiento del Kwashiorkor 117 (enfermedad tropical asociada a una gran malnutrición y a la consiguiente deficiencia en la cantidad y calidad de las proteínas), y las 1,3-selenazinas, efectivas contra Staphylococcus aureus resistente a meticilina, 118 además de poseer actividad anticancerígena. 119 Por otro lado, Pinto y col. han descrito la síntesis de selenoazúcares 120,121 análogos del salacinol, un inhibidor natural de glicosidasas aislado de la planta Salacia reticulata, usada en la medicina tradicional ayurvédica. Entre estos análogos destaca el blintol, 122 con utilidad el tratamiento de la diabetes tipo 2. 123 116 Jeong, L. S.; Tosh, D. K.; Kim, H. O.; Wang, T.; Hon, X.; Yun, H. S.; Kwon, Y.; Lee, S. K., Choi, J.; Zhao, L. X. Org. Lett. 2008, 10, 209-212. 117 Schwarz, K. Fed. Proc. 1961, 666-673. 118 Koketsu, M.; Ishihara, H.; Hatsu, M. Res. Commun. Mol. Pathol. Pharmacol. 1998, 101, 179-186. 119 Cho, S. I.; Koketsu, M.; Ishihara, H.; Matsushita, M.; Nairn, A. C.; Fukazawa, H.; Uehara, Y. Biochim. Biophys. Acta 2000, 1475, 207-215. 120 Nasi, R.; Sim, L.; Rose, D. R.; Pinto, B. M. J. Org. Chem. 2007, 72, 180-186 121 Liu, H.; Pinto, B. M. Can. J. Chem. 2006, 84, 1351-1362. 122 Liu, H.; Pinto, B. M. J. Org. Chem. 2005, 70, 753-755. 123 Pinto, B. M.; Johnston, B. D.; Ghavami, A.; Szczepina, M. G.; Liu, H.; Sadalapure, K. PCT WO 20040625, 2004 OH Se O 2 N Se HO R3 R 1 R 2 Ácido diselenovalérico 1,3-Selenazinas
1. Introducción General 55 Se ha demostrado que algunas selenazol-4-onas y selenoureas poseen actividad inhibitoria similar a la del ácido kójico frente a la actividad difenolasa (conversión de o-difenoles en o-quinonas) de la tirosinasa de hongos. 124-126 Sin embargo, la mayoría de estos selenoderivados aplicados en ensayos de inhibición sobre células melanómicas, mostraron tanto citotoxicidad como efectos despigmentantes, por lo que su uso está restringido en la industria cosmética y alimentaria. 127 124 Koketsu, M.; Choi, S. Y.; Ishihara, H.; Lim, B. O.; Kim, H.; Kim, S. Y. Chem. Pharm. Bull. 2002, 50, 1594-1596. 125 Khan, M. T. H. Pure Appl. Chem. 2007, 79, 2277-2295. 126 Ahn, S. J.; Koketsu, M.; Ishihara, H.; Lee, S. M.; Ha, S. K.; Lee, K. H.; Hang, T. H.; Kim, S. Y. Chem. Pharm. Bull, 2006, 54, 281-286. 127 Chang T. Int. J. Mol. Sci. 2009, 10, 2440-2475. S OH OH HO O H OSO 3 HO Se OH OH HO O H OSO 3 HO Salacinol Blintol Se NO R 2 R 3 R 1 1 , 3 - S e l e n a z o l - 4 - o n a
1. Introducción General 56 OBJETIVOS DE LA TESIS Pudiendo disponer de HT a reducido coste se busca transformarlo químicamente en derivados en los cuales se potencien sus propiedades antioxidantes y sus actividades biológicas. Así, en el segundo capítulo de esta Tesis Doctoral se plantea como objetivo la obtención de dopamina (3), un neurotransmisor implicado en enfermedades como la esquizofrenia, 128 depresión 129 y Parkinson, 130 partiendo de HT mediante reacciones químicas sencillas. No existe descrita ninguna transformación de hidroxitirosol en dopamina, a excepción de un trabajo reciente en nuestro grupo de investigación. 131 También se plantea la síntesis de derivados O-glicosilados de la dopamina a partir del hidroxitirosol. El interés de estos compuestos radica en su posible capacidad de para superar los inconvenientes que presenta el uso de L-DOPA, el principal fármaco utilizado en el tratamiento del Parkinson, que es capaz de penetrar en el sistema nervioso central, donde rápidamente se transforma en dopamina. Los derivados glicosilados de la 128 Matthisse S.. J. Psychiat. Res., 1974, 11, 107-113. 129 Willner, P. Brain Res. Rev. 1983, 6, 21 l-224. 130 Stocchi, F. Parkinsonism and Related Disorders. 2009, 15, 54–57. 131 López-García, M. A. Tio y aza derivados de hidroxitirosol. Síntesis y actividad biológica. Tesis Doctoral. 2011. N H 2 H O HO 3
1. Introducción General 57 dopamina pudieran traspasar la barrera hematoencefálica 132 debido a la intervención de los transportadores de glucosa, fundamentalmente el GLUT1, 133 que hacen que estos derivados puedan ser absorbidos desde el flujo sanguíneo al sistema nervioso central, para una vez en el cerebro ser hidrolizados enzimáticamente y liberar dopamina. 134 En el tercer capítulo se plantea como objetivo la síntesis de selenoureas derivadas de HT que combinen el potencial antioxidante de las selenoureas con el del hidroxitirosol, mediante reacciones sencillas de dopamina con arilisoselenocianatos descritos por nuestro grupo de investigación. 135,136 También se propone la síntesis de nuevos selenuros y diselenuros simétricos de hidroxitirosol, con objeto de analizar cómo influyen en la capacidad antioxidante de los nuevos compuestos la presencia de un segundo grupo catecol y las funciones de selenuro y diselenuro. En el cuarto capítulo se propone, partiendo de isotiocianatos comerciales, la síntesis de tioureas isósteras de las selenoureas anteriormente descritas, que mantengan el fragmento de catecol en su estructura. Tioureas e isotiocianatos se pueden aislar de extractos de plantas conteniendo glicosinolatos como el Tropaelum tuberosum, 137 y son 132 Dalpiaz, A.; Filosa R.; De Caprariis, P.; Conte, G.; Bortolotti F.; Biondi F.C.; Scatturin A; Prasad, P.D.; Pavanc, B. Int. J. Pharm. 2007,336, 133–139. 133 Mueckler, M. Eur. J. Biochem. 1994, 219,713-725. 134 Fernandez, C.; Nieto, O.; Fontenla, J.A.;,Rivas, E.; De Ceballos, M.L.; Fernández- Mayoralas A. Org Biomol Chem 2003, 1, 767–71. 135 Fernández-Bolaños, J.G.; López, O.; Ulgar, V.; Maya, I.; Fuentes, J. Tetrahedron Lett. 2004, 45, 4081–4084 136 López, O.; Maza, S.; Ulgar, V.; Maya, I.; Fernández-Bolaños, J.G.; Tetrahedron,, 2009, 65, 2556–2566 137 Johns, T.; Neil Towers, G.H. Phytochemistry, 1981, 20, 2687-2689.
1. Introducción General 58 conocidas sus propiedades antioxidantes, 138 antituberculosas, 139 supresoras de apetito, 140 antitumorales, 141 antimaláricas, 142 antifúngicas 143 y antivirales 144,145 en general y anti-VIH en particular. 146,147 También se propone la oxidación de las tioureas sintetizadas con DDQ (2,3-dicloro- 5,6-diciano-1,4-quinona), según el método propuesto por Land 148 , con objeto de obtener una serie de 2-amino-tetrahidro-1,3- benzotiazepina-7,8-dioles que sigan conservando el fragmento de catecol. Otros objetivos fundamentales en esta tesis son: a) El estudio in vitro de las propiedades antioxidantes de los compuestos previamente sintetizados, basándonos en métodos conocidos y en modificaciones de los mismos puestos a punto en nuestro grupo de 138 Abbott T.P.; Wohlman A.;, Isbell T.;, Momany F.A.; Cantrell C.;, Garlotta D.V.; Weisleder D. Industrial Crops and Products,2002,16, 43–57. 139 Liav, A.; Angala S.K.; Brennan, P.J.; Jackson. M. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18, 2649–2651. 140 Bhandari, K.; Srivastavaa, S.; Shankarb, G. Bioorg. Med. Chem. 2004, 12, 4189–4196. 141 Shusheng, Z.; Tianrong, Z.; Kun, C.; Youfeng, X.; Bo, Y. Eur. J. Med. Chem. 2008, 43, 2778-2783. 142 Ekoue-Kovi K.; Yearick, K.; Iwaniuk D.P.; Natarajan J.K.; Alumasa , De Dios J.A.; Roepe, P.D.; Wolf, C. Bioorg. Med. Chem., 2009, 17, 270–283. 143 Krishnamurthy R.; Govindaraghavan S.; Narayanasamy J.; Pestic. Sci. 1999, 52, 145– 151. 144 Todouloul, O.G.; Papadaki-Valiraki l A.E.; Filippatosl, E.C.; Ikeda S.; De Clercq, E.; Eur J Med Chem, 1994, 29, 127-131. 145 Di Grandi, M.J.; Curran, K.J.; Feigelson, G.; Prashad, A.; Ross, A.A.; Visalli, R.; Fairhurst, J.; Feld, B.; Bloom J.D. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2004, 14, 4157–4160. 146 Venkatachalam T.K.; Mao C.; Uckun F.M. Bioorg. Med. Chem., 2004, 12, 4275–4284. 147 Zhang H.; Vrang L.; Bäckbro K.; Lind P.; Sahlberg C.; Unge T.; Öberg B.; Antivir. Res. 1995, 28, 331–342. 148 Land, E.J.; Perona, A.; Ramsden, C.A.; Riley, P.A. Org. Biom. Chem. 2009, 7, 944-950.
1. Introducción General 59 investigación, 149 y el estudio de sus propiedades anti-ennegrecimiento, medidas por su capacidad para inhibir la actividad mono y difenoloxidasa de la tirosinasa, responsable del oscurecimiento del marisco y de vegetales. b) El estudio ex vivo de la inhibición de la peroxidación lipídica en microsomas hepáticos de ratas alimentadas con una dieta deficiente en vitamina E, utilizando los antioxidantes previamente sintetizados, según el protocolo descrito por Mitchell y col. 150 Este trabajo se realizó durante una estancia de dos meses en el Rowett Institute of Nutrition and Health de la Universidad de Aberdeen (Escocia, Reino Unido), bajo la dirección de los doctores Garry Duthie y Baukje de Roos c) Estudio de la actividad antitumoral de algunos de los selenoderivados preparados frente a diversas líneas celulares. Este estudio se ha llevado a cabo en el Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS), en colaboración con el Dr. Amancio Carnero y la Dra. Mª Ángeles López. Por último, en el sexto capítulo en se propone llevar a cabo reacciones químicas sencillas en sistemas “sin disolvente” y catalizadas por CeCl 3 /NaI/SiO 2 , 151 que presentan como principales ventajas el más fácil aislamiento de los productos de reacción y la menor contaminación medioambiental debido a la ausencia de disolvente. 152 Esta investigación 149 Jiménez, A.; Rodríguez, R.; Jaramillo, S.; Rodríguez, G.; Espejo, J.A.; Guillén, R.; Fernández-Bolaños J., Heredia, A. J. Agric. And Food Chem., 2005, 53, 5212-5217. 150 Mitchell, J.H.; Gardner, P.T.; McPhail, C.B.; Morrice, P. C.; Collins, A.R.; Duthie, G.G. Archiv. Biochem. Biophys, 1998, 360, 142-148. 151 Bartoli, G.; Bosco, M.; Marcantoni, E.; Petrini, M.; Sambri, L.; Torregiani E. J. Org. Chem. 2001, 66, 9052-9055. 152 Bartoli, G.; Marcantoni E.; Marcolini,M.; Sambri, L.; Chem. Rev. 2010, 110, 6104– 6143.
1. Introducción General 60 capítulo se realizó en la Universidad de Camerino (Italia) en una estancia de de dos meses bajo la dirección del profesor Enrico Marcantoni.
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2. Síntesis de dopamina y glicosil derivados de dopamina a partir de hidroxitirosol 68 el sueño y la sensibilidad al dolor. 177 La MDMA (3,4- metilenodioximetanfetamina) se caracteriza por sus efectos empatógenos y porque presentan efectos estimulantes más potentes que la propia metanfetamina. 178 A pH fisiológico la dopamina se encuentra tanto en forma neutra como sal de amonio. Se ha comprobado como la presencia de carga en el grupo amino (75), o en análogos en los que el grupo nitrogenado se sustituye por azufre (76) o por selenio (77), es fundamental para activar los receptores dopaminérgicos D-2, e inhibir la liberación de acetilcolina. 179,180 177 McNamara, R.; Kerans, A.; O´Neill, B.; Harkin, A., Neuropharmacol. 2006, 50, 69-80. 178 Bernschneider-Reif, S.; Oexler, F.; Freudenmann, R.W., Pharmazie, 2006, 61, 966-972. 179 Wallace, R.A.; Wallace, L.; Harrold; Miller, D.D.; Uretsky, N. Biochem. Pharm. 1989, 38, 2019-2025. 180 Sabol., B.; Boldry, R.; Farooqui, T.; Chang, Y.A.; Miller.D.; Uretsky, N. Biochem. Pharm. 1981, 36, 1679-1685. N H 2 N H M e O O O O MDA MDMA HO HO N H 3 C CH 3 CH 3 75 HO HO S C H 3 CH 3 76 HO HO Se C H 3 CH 3 77
2. Síntesis de dopamina y glicosil derivados de dopamina a partir de hidroxitirosol 69 2.1.2. Síntesis de dopamina. Existen numerosos métodos para la síntesis de dopamina, incluyendo algunas patentes. Belyakov y col. 181 sintetizaron hidrocloruro de dopamina por hidrólisis ácida de 2-(3,4-dietoxifenil)etilamina (78). Budnik 182 obtuvo el clorhidrato de dopamina mediante la desmetilación del hidroclururo de homoveratrilamina (79), en HCl acuoso, con un rendimiento del 92%. Murahashi y Kono 183 obtuvieron dopamina y otras fenetilaminas por hidrogenación catalítica de (Z) y (E) ȕ-nitroestirenos (80 y 81), utilizando paladio sobre carbón activo y ácido clorhídrico concentrado en medio etanólico (Esquema 2.1). Esquema 2.1 181 Belyakov, N. G.; Lomzakova, V. I.; Kosmynina, G. V. Hydrolytic method for the preparation of 2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethylamine hydrochloride from hydrochloric acid and 2-(3,4-diethoxyphenyl)ethylamine hydrochloride or its free base. 2001 RU 2164223, C2 2001 0320. 182 Budnik, J. 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)ethylamine hydrochloride. 1986 CS 227998 19840514. 183 Murahashi, S.; Kono, M. Preparation of phenethylamines from ȕ-nitrostyrenes. 1991 JP 03027345, A 19910205. E t O EtO N H 2 HO HO NH 2 .HCl HCl, 140-160ºC 78 3 80 R 1 =H; R 2 =NO 2 (Z) 81 R 1 =NO 2 ; R 2 =H (E) Pd/C,HCl, EtOH, H 2 HCl/H 2 O 3:1 24h, t.a. 150h, 95-100 ºC MeO MeO NH 2 .HC l HO HO R 1 R 2 79
2. Síntesis de dopamina y glicosil derivados de dopamina a partir de hidroxitirosol 70 Aihara y col. optimizaron la hidrólisis de la O-metildopamina 85 con el sistema O 2 −Cu 2+ −ácido ascórbico 184 y también obtuvieron dopamina a partir de vainillina 82 como se muestra en el Esquema 2.2: Esquema 2.2 Bernini y col. 185 obtuvieron dopamina a partir de tiramina (4- hidroxifeniletilamina) 86. En primer lugar protegieron el grupo amino con carbonato de dimetilo (DMC) en presencia de DBU. La introducción del segundo grupo hidroxilo es llevada a cabo utilizando ácido 2- yodoxibenzoico (IBX), o IBX soportado sobre polímero, capaz de convertir fenoles 186 y metil aril éteres 187 en o-quinonas con alta regioselectividad. La reducción con ditionito sódico (Na 2 S 2 O 4 ) y posterior N-desprotección dio lugar a la dopamina 3 (Esquema 2.3). 184 Aihara, K.; Iguchi, T.; Hirobe, M. Chem. Pharm. Bull. 1990, 38, 842-844. 185 Bernini,R.; Crisante, F.; Barontini, M.; Fabrizi, G. Synthesis, 2009, 22, 3838–3842. 186 Magdziak, D.; Rodriguez, A. A.; Van De Water, R. W.; Pettus, T. R. R. Org. Lett. 2002, 4, 285-288. 187 Ozanne, A.; Pouységu, L.; Depernet, D.; Francois, B.; Quideau, S. Org. Lett. 2003, 5, 2903-2906. M e O HO C H O M e O HO N R R ' O 2 -Cu 2+ Ácido ascórbico H O HO N R R ' HO HO NH 2 MeO HO NH 2 85 O 2 -Cu 2+ Ácido ascórbico 3 82 83 84
2. Síntesis de dopamina y glicosil derivados de dopamina a partir de hidroxitirosol 71 Esquema 2.3 Las drásticas condiciones necesarias para eliminar el grupo protector y ello proporcionó rendimientos muy bajos de 3, por lo que los mismos autores propusieron un método alternativo sustituyendo la protección con DMC por dicarbonato de di-terc-butilo, que permitió la desprotección del grupo N-Boc bajo condiciones más suaves, utilizando cloruro de trimetilsililo (TMSCl) en metanol, y la obtención de dopamina con buen rendimiento. Existen también métodos enzimáticos para la síntesis de dopamina. Loeffler y Zenk 188 describen la obtención de dopamina a partir de tiramina catalizado por tirosinasa obtenida de la planta Berberis stolonifera. Sung y col. 189 llevaron a cabo la síntesis enzimática de dopamina en dos etapas: obtención de L-DOPA (91), catalizada por una tirosina fenol-liasa (TPL) de bacterias del género Symbiobacterium, a partir de catecol (89) y piruvato de 188 Loeffler, S.; Zenk, M.H. Phytochemistry, 1990, 29, 3499-3503. 189 Lee, S.G.; Hong, S.P.; Sung, M.H. Enzyme Microb. Technol. 1999, 25, 298–302. HO NH 2 HO H N O OMe HO H N O OMeHO HO HO NH 2 .HCl 3 86 87 (95%) 88 DMC, DBU 16h, reflujo 1. IBX, MeOH 0ºC ó IBX-soportado DMC, t.a. 2. Na 2 S 2 O 4, H 2 O, 5mi n HCl
2. Síntesis de dopamina y glicosil derivados de dopamina a partir de hidroxitirosol 72 amonio (90), seguido de la conversión de L-DOPA a dopamina mediante la actuación de la L-DOPA descarboxilasa (DDC) extraída de hígados de rata (Esquema 2.4). Esquema 2.4 La descarboxilación de L-DOPA también fue llevada a cabo por Weissova y col., 190 utilizando cultivos de células inmovilizadas en lugar de extractos puros de enzimas. 2.1.3. Síntesis de glicosil derivados de dopamina. El uso de L-DOPA en tratamientos crónicos para paliar los efectos del Parkinson conlleva a la aparición de numerosos problemas. 162 El transporte de L-DOPA a través de la barrera hematoencefálica es mediado por el sistema 1, un transportador muy efectivo de aminoácidos neutros. Desafortunadamente, la conversión de L–DOPA en dopamina ocurre también en el sistema nervioso periférico por la enzima L-DOPA 190 Weissova, K.; Stano, J.; Nemec, P.; Kovkcs, P.; Kakoniova, D.; Liskov, D. Phytochemistry, 1995, 38, 859-860, H O HO H 3 C C O COO NH 4 H O HO N H 2 COOH H 2 O HO HO NH 2 CO 2 89 90 91 3 ++ TPL
2. Síntesis de dopamina y glicosil derivados de dopamina a partir de hidroxitirosol 73 descarboxilasa, lo que se traduce en problemas de disquinesia. 191 Estas limitaciones han estimulado la búsqueda de nuevas estrategias. 192,193 Una de ellas consiste en la búsqueda de derivados de dopamina capaces de penetrar la barrera hematoencefálica haciendo uso de trasportadores específicos. La glucosa, fuente de energía del cerebro, y otras hexosas son transportadas a través de la barrera hematoencefálica por medio de los transportadores de glucosa GLUT1. 194,195 Este transportador proteico se localiza en la membrana de las células endoteliales de los capilares del cerebro que componen la barrera hematoencefálica. Por lo tanto, se podría prever el transporte de dopamina hacia el sistema nervioso central (SNC) uniendo el neurotransmisor a una molécula de azúcar de modo que el glicoconjugado resultante pueda atravesar la barrera utilizando estos transportadores. 196 Al llegar al SNC, el profármaco debe ser liberado enzimáticamente con glicosidasas para convertirse en el compuesto activo. Sin embargo, investigaciones con los glucosil derivados 21 y 22 han demostrado la baja afinidad de estos compuestos por los transportadores GLUT-1. 197 El glucoderivado de la dopamina 21 ha sido hallado de forma natural en las semillas de la planta leguminosa tropical Entada pursaetha (“hierba 191 Dalpiaz, A.; Filosa, R.; De Caprariis, P.; Conte, G.; Bortolotti, F.; Biondi, C.; Scatturin, A.; Prasad, P.D.; Pavan, B. Int. J. Phram., 2007, 336, 133-139. 192 Madrid, Y.; Langer, L.F.; Brem, H.; Laner, R. Adv. Pharmacol., 1991, 22, 199-321. 193 Audus, K.L.; Chikhale, P.J.; Miller, W.D.; Thompson, S.E.; Borchardt, R.T., Adv. Drug. Res., 1992, 23, 713-725. 194 Oldendorf, W.H.; Am. J. Physiol., 1994, 221, 7114-7118. 195 Mueckler, Eur. J. Biochem. 1994, 219, 713-725. 196 Prokai, L.; Prog. Drug. Res. 1998, 51, 95-131. 197 Fernández, C.; Nieto, O.; Fontenla, J. A.; Rivas, E.; de Ceballos, M. L.; Fernández- Mayoralas, A. Org. Biomol. Chem. 2003, 1, 767-771.
2. Síntesis de dopamina y glicosil derivados de dopamina a partir de hidroxitirosol 74 de los sueños de África”) 198 y en la hemolinfa del gusano del tabaco (Manduca sexta). 199 Andrews y col. 200 demostraron la presencia de glucósidos de dopamina en habas (Vicia faba), sin poder elucidar si se trataba del 3-O- glucósido de dopamina 21, o el 4-O-glucósido 22. Se han propuesto rutas sintéticas para la obtención de los O- glicósidos de la dopamina. Fernández y col. 201 partieron de dopamina, cuyo grupo amino protegieron con bencilcloroformato para dar N- benciloxicarbonil dopamina, que tras la glicosilación con ȕ-D-glucosa pentaacetilada y posterior desprotección dio lugar a los derivados 21 y 22 como sales de trifluoroacetato (Esquema 2.5). 198 Larsen, P.O.; Pedersen, E.; Sorensen, H.; Sorup, P. Phytochemistry, 1973, 12, 2243- 2247. 199 Hopkins, T.L.; Morgan, T.K.; Mueller, D.D.; Tomer, K.B.; Kramer, K.J. Insect Biochem. Molec. Biol. 1995, 25, 29-37. 200 Andrews, R.S.; Pridham, J.B. Nature, 1965, 205, 1213-1214. 201 Fernández, C.; Nieto, O.; Rivas, E.; Montenegro, G.; Fontenla, J.A.; Fernández- Mayoralas, A. Carbohydr. Res. 2000, 327, 353-365. O HO HO O OH O H HO NH 3 O HO HO O OH O H HO NH 3 21 2 2
2. Síntesis de dopamina y glicosil derivados de dopamina a partir de hidroxitirosol 75 Esquema 2.5. (a) Bencilcloroformato, MeOH, Et 3 N, 0ºC, 2 h (b) BF 3 .OEt 2 , CH 2 Cl 2 , Ar, t.a. 4 h. (c) 0.1 M NaMeO-MeOH, t.a., 1.5 h. (d) H 2 , CF 3 COOH (1.6 equiv), MeOH, Pd-C, t.a., 1 h. Existen también métodos enzimáticos para la preparación de estos derivados glucosilados. Yoon y col. 202 emplearon la enzima glucosiltransferasa para obtener 21 y 22, partiendo de clorhidrato de dopamina y ciclomaltohexosa. Un método más sencillo fue llevado a cabo por Sivakumar y col., 203 glicosilando la dopamina usando la glucoamilasa de mohos Rhizopus y ȕ-glucosidasa soportada sobre perlas de alginato 202 Yoon, S.H; Fulton, D.B.; Robyt, J.F. Carbohydrate Res. 2009, 344, 2349-2356. 203 Sivakumar, R.; Divakar, S. Enzyme Microb. Technol. 2009, 44, 33-39. N H 2 HO OH 3 N H C b z HO OH 92 O AcO AcO O OAc OAc HO NHCbz O AcO AcO O OAc OAc HO NHCbz 93 94 O HO HO O OH OH HO NH 3 O HO HO O OH OH HO NH 3 21 22 O AcO AcO OAc OAc OAc a b c,d c,d - OOCF 3 C - OOCF 3 C
2. Síntesis de dopamina y glicosil derivados de dopamina a partir de hidroxitirosol 76 cálcico. Este método permitió además la obtención de los galactoderivados 23 y 24, y los manoderivados 95 y 96. Para determinar la estabilidad y capacidad de liberar dopamina después de alcanzar la corteza cerebral, se incubaron los compuestos 21 y 22 en presencia de enzimas específicas, plasma de ratas, y extractos de cerebro de ratas. 201 En experimentos in vitro la liberación de dopamina a partir de los glicósidos tiene lugar a partir de un mecanismo catalizado por glucosidasa de almendras. Sin embargo, fueron muy estables en plasma, debido a la baja concentración del enzima en sangre. 204 En el extracto de tejido cerebral, 21 y 22 fueron lentamente hidrolizados, mostrando diferentes ratios de hidrólisis (t 1/2 = 5.6 días para 21 y 2.8 días para 22 frente a t 1/2 = 3 horas de la dopamina en extractos de tejido cerebral). También se estudió la actividad antioxidante por el método del DPPH de los glicósidos derivados de dopamina 203 resultando un IC 50 de 204 De Bont, D.B.A.; Leenders, R.G.G.; Haisma, H.J.; Van der Meulen-Muileman. I.; Schreen, H.W. Bioor. Med. Chem., 1997, 5, 405-414. O HO O OH O H HO NH 2 O HO O OH OH HO NH 2 23 24 H O H O O HO O OH HO NH 2 O HO O OH HO NH 2 95 9 6 HO HO OH OH
2. Síntesis de dopamina y glicosil derivados de dopamina a partir de hidroxitirosol 77 0.98 mM para los glucoderivados 21 y 22, 0.93 mM para los galactopiranósidos 23 y 24, y 1,80 mM para los manopiranósidos 95 y 96. Considerablemente menos activos que la dopamina que presenta valores de IC 50 de 0.04 mM. 203 2.2. Resultados y discusión. 2.2.1. Síntesis de dopamina El objetivo del presente capítulo es la obtención de clorhidrato de dopamina partiendo de hidroxitirosol. Este procedimiento se basa en la sustitución del hidroxilo primario del HT por bromo, que es fácilmente desplazable por un grupo azido. La hidrogenación catalítica en medio ácido del azido derivado rindió el clorhidrato de dopamina 3 con un 98% de rendimiento. (Esquema 2.6) Esquema 2.6 La introducción del átomo de bromo en sustitución del hidroxilo alifático se llevó a cabo mediante el sistema trifenilfosfina–tetrabromuro de H O HO O H 64 H O HO B r 1 HO HO N 3 2 HO HO NH 2 .HCl 3 Ph 3 P-CBr 4, ascorbato, DMF, 0ºC t.a, 8h 80% NaN 3, , ascorbat o 5h, 55ºC EtOH:H 2 O 10:1 87% Pd/C, H 2 HCl, EtOH 98%
2. Síntesis de dopamina y glicosil derivados de dopamina a partir de hidroxitirosol 84 unido a otros sustituyentes como el amino o bromo. El carbono cuaternario del grupo terc-butilo aparece a 19.2 ppm como una señal característica. 2.2.1. Síntesis de glicosil derivados de dopamina El objetivo de este capítulo es la obtención de los glucosil y galactosil derivados de hidroxitirosol 21-24. Como estrategia sintética se propone la síntesis de azido compuestos derivados del hidroxitirosol, como precursores de los derivados glicosilados. Para ello se convirtió el hidroxilo de la cadena alifática en un grupo fácilmente desplazable por el grupo azido. Esta conversión se lleva a cabo mediante tosilación del hidroxitirosol con cloruro de tosilo (3.2 equiv), en piridina a 0 ºC, lo que condujo a la obtención de los correspondientes derivados tri- y di-O-tosilados 8 y 9, que se separan por cromatografía en columna con rendimientos del 44 y 20% respectivamente. La formación del derivado clorado 9 se explica mediante desplazamiento del grupo O-tosilo en el medio de reacción por el anión cloruro que proviene del cloruro de tosilo. Se obtienen así derivados de HT que contienen grupos en la cadena lateral fácilmente desplazables por el anión azida, quedando protegidos los hidroxilos aromáticos, lo cual puede evitar reacciones secundarias de degradación del fragmento catecol. El azido derivado 10 se obtuvo a partir de la mezcla de los derivados 8 y 9, por tratamiento con azida sódica en DMF durante 24 horas a temperatura ambiente más una hora adicional con un suave calentamiento a 50 ºC, obteniendo así 10 con un 86 % de rendimiento (Esquema 2.11) .
2. Síntesis de dopamina y glicosil derivados de dopamina a partir de hidroxitirosol 85 Esquema 2.11 La desprotección del azido derivado 10 mediante hidrólisis con potasa metanólica a temperatura ambiente durante una hora, siguiendo el procedimiento descrito por Kampouris, 212 condujo a la obtención de una mezcla de los derivados monotosilados 11 y 12 en la proporción aproximada 1:1 con un rendimiento del 75 %. Ambos regioisómeros presentan la misma movilidad cromatográfica en distintos eluyentes y no han podido ser separados. Se confirma así que el tratamiento con KOH metanólica sólo hidroliza a uno de los dos grupos O-tosilo presentes en la molécula. (Esquema 2.12) Esquema 2.12 Forzando las condiciones de reacción (KOH metanólica, a reflujo 4 horas), se observa la aparición de una mezcla compleja de productos más 212 Kampouris, E.M.; J. Chem. Soc., 1965, 2651-2654. HO H O O H TsCl, Py 0ºC, 14h TsO T s O O T s TsO T s O C l + 64 8 (44%) 9 (20%) NaN3 DMF TsO TsO N3 1 0 8 6 % TsO T s O N 3 10 TsO HO N 3 11 HO TsO N 3 1 2 + KOH, MeOH 1h, t.a.
2. Síntesis de dopamina y glicosil derivados de dopamina a partir de hidroxitirosol 86 polares fruto de la posible descomposición del producto buscado en medio básico a alta temperatura durante tratamiento prolongado. La fácil hidrólisis de uno de los grupos tosiloxi a baja temperatura y la dificultad de hidrolizar el segundo grupo tosiloxi se puede explicar teniendo en cuenta que, en medio básico, la presencia del ion fenóxido genera una cierta densidad de carga negativa sobre el carbono que porta el grupo tosiloxi dificultando así el ataque nucleófilo sobre el azufre unido a dicha posición, ya que el primer intermedio en la reacción de hidrólisis de este segundo tosiloxi implica la presencia de dos cargas negativas próximas. (Esquema 2.13) Esquema 2.13 La estructura de 8 se confirma por las señales en el espectro de 1 H- RMN correspondientes a los tres grupos tosilo a 7.66, 7.26 y 2.45 ppm. y mediante análisis elemental. Los protones correspondientes al grupo metileno que porta el átomo de cloro en 9 se encuentran más apantallados O TsO N 3 TsO O N 3 OH N 3 O S O OO O S O Ar O O Ar OH OH N 3
2. Síntesis de dopamina y glicosil derivados de dopamina a partir de hidroxitirosol 87 (3.66 ppm) que dichos protones en el producto tri-O-tosilado (4.17 ppm). La estructura del azido derivado 10 se confirma mediante 1 H-RMN observándose un apantallamiento de las señales correspondientes a los metilenos que portan el grupo azido (3.48 ppm). El espectro de 1 H-RMN de los monotosilados 11 y 12 en CDCl 3 confirma que se trata de una mezcla de regioisómeros en la proporción 1:1 y muestra a 5.92 ppm un singulete ancho correspondiente a los OH fenólicos de la mezcla de regiosiómeros. Los ȕ-D-glucopiranosil derivados 13 y 14, y los ȕ-D- galactoderivados 15 y 16 se prepararon mediante glicosilación en un sistema bifásico básico agua/diclorometano usando TBAB como agente de transferencia de fase, 213 y Į-acetobromoglucosa 101 y Į- acetobromogalactosa 102 comerciales como agentes de glicosilación (Esquema 2.14). La labilidad de los Į-acetobromoazúcares 101 y 102, y el prolongado tiempo de reacción requerido hacen que sea necesaria su adición en pequeñas porciones durante intervalos de 2 horas (0.45 equivalentes cada vez hasta un total de 1.8 equivalentes). Tras la última adición del Į- acetobromoazúcar y el hidróxido sódico se realizó un suave calentamiento a 50 ºC durante 2.5 horas para completar la reacción, obteniéndose los glucosil derivados 13, 14 y los galactosil galactosil derivados 15 y 16, con un rendimiento del 72 % y 94 % respectivamente (Esquema 2.14). 213 Adinolfi. M.; Iadonisi, A.; Pezzella, A.; Rabidà, A., Synlett, 2005, 1848-1852
2. Síntesis de dopamina y glicosil derivados de dopamina a partir de hidroxitirosol 88 Esquema 2.14 La desacetilación de las mezclas de 13/14 y 15/16 con potasa metanólica condujo, tras 7 horas a temperatura ambiente, a la eliminación de los grupos acetatos, pero también del tosilo, con lo cual se obtuvieron las azidas desprotegidas 17-20, con rendimientos del 43 % para los galactósidos 19 y 20, y del 62 % para los glucósidos 17 y 18. La reducción catalítica de 17-20 en etanol, utilizando paladio sobre carbón, y la posterior acidificación con un equivalente de HCl condujo a las glicosildopaminas 21-24, con rendimientos comprendidos entre el 85 y 88 % (Esquema 2.15). O R 2 AcO O OAc OAc TsO N 3 O R 2 AcO O OAc OAc TsO N 3 13 R 1 = H, R 2 = OAc 1 5 R 1 = O A c , R 1 = H 14 R 1 = H, R 2 = OAc 16 R 1 = OAc, R 1 = H TsO H O N 3 11 HO T s O N 3 12 + R 1 R 1 O R 2 AcO OAc OAc R 1 Br TBAB, NaOH H 2 O-CH 2 Cl 2 101 R 1 = H, R 2 = OAc 102 R 1 = OAc, R 1 = H t.a., 2h 50 ºC, 2.5h
2. Síntesis de dopamina y glicosil derivados de dopamina a partir de hidroxitirosol 89 Esquema 2.15 Los datos espectroscópicos confirman las estructuras propuestas para los derivados 13-24. Las señales correspondientes a los protones anoméricos del fragmento de azúcar en los espectros de 1 H-RMN aparecen entre 4.91 y 4.67 ppm. Las constantes de acoplamiento de los protones anoméricos están comprendidas en todos los casos entre 7.5 y 8.0 Hz, lo que indica que el anómero que se obtiene es siempre el ȕ. En los espectros de 13 C-RMN los carbonos anoméricos aparecen en torno a 105-104 ppm, mientras que el O R 2 AcO O OAc O A c TsO N 3 O R 2 AcO O OAc O A c TsO N 3 13 R 1 = H, R 2 = OAc 15 R 1 = OAc, R 1 = H 14 R 1 = H, R 2 = OAc 16 R 1 = OAc, R 1 = H R 1 R 1 O R 2 HO O OH OH HO N 3 O R 2 HO O OH OH HO N 3 17 R 1 = H, R 2 = OH 19 R 1 = OH, R 1 = H 18 R 1 = H, R 2 = OH 20 R 1 = OH, R 1 = H R 1 R 1 O R 2 HO O OH OH HO NH 2 .HCl O R 2 HO O OH OH HO NH 2 .HCl 21 R 1 = H, R 2 = OH 23 R 1 = OH, R 1 = H 22 R 1 = H, R 2 = OH 24 R 1 = OH, R 1 = H R 1 R 1 KOH, MeOH t.a., 7h 1. MeOH, H 2, Pd/C 2. HCl
2. Síntesis de dopamina y glicosil derivados de dopamina a partir de hidroxitirosol 90 resto de señales del fragmento de gluco o galactopiranosilo se visualizan entre 80 y 64 ppm. La espectroscopía de masas de alta resolución también confirma las estructuras propuestas. Estos datos concuerdan con los descritos en la bibliografía para los derivados 21-24. 203
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3. Síntesis de selenoureas, selenuros y diselenuros de hidroxitirosol 93 3. SÍNTESIS DE SELENOUREAS, SELENUROS Y DISELENUROS DE HIDROXITIROSOL. 3.1. Introducción y antecedentes. 3.1.1. Selenoureas. Importancia biológica. Los compuestos que incluyen selenio en su estructura han sido objeto de controversia en relación con su toxicidad. Si bien se ha demostrado el envenenamiento de herbívoros por plantas acumuladoras de selenio en suelos seleníferos, 214 desde de los años 50 el Se es considerado un nutriente esencial ya que se encuentra presente en el centro activo de más de 25 selenoproteínas, algunas tan importantes como la glutatión peroxidasa, la tiorredoxin reductasa implicadas en el mecanismo de autodefensa contra el estrés oxidativo, 215 y la yodotironina desyodinasa, implicada en la activación y desactivación de las hormonas tiroideas. 216 Entre los compuestos organoselénicos, las selenoureas son de interés tanto desde el punto de vista biológico como sintético. En relación con su actividad biológica, se ha descrito el uso de selenoureas como agentes despigmentantes, debido a su capacidad de inhibición de la tirosinasa, 217 y como atrapadores del radical superóxido. 218 Un claro ejemplo del 214 Quinn, C. F.; Galeas, M. L.; Freeman, J. L.; Pilon-Smits, E. A. H. Integr. Environ. Assess. Manag. 2007, 3, 460–462. 215 Wessjohann, L. A.; Schneider, A.; Abbas, M.; Brandt, W. Biol. Chem. 2007, 388, 997– 1006. 216 Naithani, R. Mini-Rev. Med. Chem. 2008, 8, 657–668. 217 Ha, S. K.; Koketsu, M.; Lee, K.; Choi, S. Y.; Park, J.-H.; Ishihara, H.; Kim, S. Y. Biol. Pharm. Bull. 2005, 28, 838-840. 218 Takahashi, H.; Nishina, A.; Fukumoto, R.-H.; Kimura, H.; Koketsu, M.; Ishihara, H. Life Sci. 2005, 76, 2185-2192.
3. Síntesis de selenoureas, selenuros y diselenuros de hidroxitirosol 100 diselenuro de difenilo 121 se obtiene por reacción de bromobenceno con nanopolvo de óxido de cobre y selenio. 262 Plano y col. 263 han descrito una serie de arilalquil selenocianatos y bis(arilalquil) diselenuros con potenciales propiedades contra la leishmaniasis, una enfermedad causada por protozoos y que provoca úlceras en la piel y algunos órganos. Por otra parte, la importancia de la ingesta apropiada de selenio para la salud humana 264 y la vinculación aparente de la toma de selenio con la reducción del riesgo de cáncer 265,266 ha despertado el interés por la síntesis de selenocompuestos, que en general muestran una mayor actividad anticarcinogénica que sus isósteros de azufre. 267-271 262 Singh, D.; Deobald, A.; Camargo, L. R. S.; Tabarelli, G.; Rodrigues, O. E. D.; Braga, A. L. Org. Lett. 2010, 12, 3288-3291. 263 Plano, D.; Baquedano, Y.; Moreno-Mateos, D.; Font, M.; Jiménez-Ruiz, A.; Palop, J. A.; Sanmartín, C. Eur. J. Med. Chem: 2011, 46, 3315-3323. 264 Rayman, M.P. Brit. J. Nutr., 2008, 100, 254–268. 265 Ellis, D.R.; Sors, T.G.; Brunk, D.G.; Albrecht, C.; Orser, C.; Lahner, B.; Wood, K.V.; Harris, H.H.; Pickering, I.J.; Salt, D.E. BMC Plant Biol., 2004,4, 1. 266 McKenzie, M.J.; Hunter, D.A.; Pathirana, R.; Watson, L.M.; Joyce, N.; Rowan, D.D.; Matich, A.J; Brummell, D.A. Transgenic Res., 2009, 18, 407–424. 267 El-Bayoumi, K.; Sinha, R.; Pinto, J.T..; Rivlin, R.S. J. Nutr., 2009, 136, 864-869. 268 Sharma, A.K., Sharma, A.; Desai, S.V. Madhunapantula, S.V.; Huh, S.J.; Robertson, G.P.; Amin, S.J. J. Med. Chem., 2008, 51, 7820-7826. 269 Desai, D.; Madhunapantula, S.V.; Gowdahalli, K.; Sharma, A.; Chandagaludoreswamy, R.; El-Bayoumi, E.; Robertson, G.P.; Amin, S. Bioor. Med. Chem. Lett., 2010, 20, 2038- 2043 270 Emmert, S.D.; Desaik, D.; Amin, S.; Richie, J.P.; Bioorg. Med. Chem. Lett., 2010, 20, 2675-2679. Ar (CH 2 ) n SeCN Ar (CH 2 ) n Se S e ( C H 2 ) n A r Arilalquil selenocianatos Arilalquil diselenuros n = 0, 1, 2 n = 0, 1, 2
3. Síntesis de selenoureas, selenuros y diselenuros de hidroxitirosol 101 En este contexto, Ibáñez y col. 271 han propuesto recientemente una estructura general para organoselenuros con potenciales propiedades terapéuticas en tratamientos contra el cáncer, que presentan simetría molecular. Los compuestos que incluyen en esta estructura el fragmento metilselanil muestran mayor potencial anticarcinogénico que los homólogos con el grupo bencilselanil, aunque ambos presentan mayor actividad que los metilsulfanil análogos. Investigaciones recientes muestran la actividad citotóxica sobre células tumorales, en ensayos in vitro, de tio y selenoderivados de la quinazolina y pirido[2,3-d]pirimidinas. 272 271 Ibáñez, E.; Plano, D.; Font, M.; Calvo, A; Prior, C.; Palop, J.A.; Sanmartín, C. Eur. J. Med. Chem. 2011, 46, 265-274. 272 Moreno, E.; Plano,D.; Lamberto, I.; Font, M.; Encío, I.; Palop, J. A.; Sanmartín, C. Eur. J. Med. Chem., 2011. Heteroarilo N HN Heteroarilo O OSe R R = M e , B n
3. Síntesis de selenoureas, selenuros y diselenuros de hidroxitirosol 102 El 1,4-fenilenobis(metileno)selenocianato (122) y el 1,4- bis((metilselanil)metil)benceno (123) son dos compuestos organoselénicos con propiedades biológicas relevantes, que actúan como reguladores del ciclo celular en procesos de angiogénesis, invasión celular y metástasis. 273 Okoronkwo y col. 274 han desarrollado un método para sintetizar alquinilselenoalcoholes a partir de alquinos terminales, selenio y bromoalcoholes, utilizando butillitio como base. Los alquinilselenoalcoholes, como el 4-[(feniletinil)selanil]butan-1-ol han 273 Pinto, J.T.; Sinha, R.; Papp, D.; Facompre, N.D.; Desai, D.; El-Bayoumy, K., Int. J. Cancer, 2007, 120, 1410-1417. 274 Okoronkwo, A.E., Rosário, A.R., Alves, D., Savegnago, L., Nogueira, C.W., Zeni, G., Tetrahedron Lett., 2008, 49, 3252–3256. X N N ZR' YR n = 0-5; m = 0-4; X = N, C Y = S, Se; Z = NH, O, Se; R = H, CH 3 R' = H, OH, CH 3, Ph, p-MeOC 6 H 4, p-MeSC 6 H 4, p-MeSeC 6 H 4 n m Tio y seleno derivados de quinazolin y pirido[2,3-d]pirimidina S e C N NCSe S e M e MeSe 122 123
3. Síntesis de selenoureas, selenuros y diselenuros de hidroxitirosol 103 mostrado un efecto antinociceptivo relacionado directamente con su potencial antioxidante. 275 Se han descrito numerosos métodos para la obtención de familias de monoselenuros, 276-280 y diselenuros de dialquilo y diarilo. 281-283 Sonoda y col. demostraron que el selenio elemental puede ser reducido por monóxido de carbono y agua en presencia de base para producir selenuro de hidrógeno, que se aplicó con éxito en la síntesis de diselenuros alifáticos a partir de cloruros de alquilo. 284 Tian y col. perfeccionaron este método para la obtención de diselenuros con el sistema Se/CO/H 2 O en ausencia de base y a presión atmosférica. 285 275 Acker, C.I.; Brandão, R.; Rosário, A.R..; Nogueira, C.W.; Environ. Toxicol. Pharm. 2009, 28, 280–287. 276 Müller, J.; Terfort, A. Inorg. Chim. Acta, 2006, 359, 4821-4827. 277 Dunne, S.J.; Summers, L.A.; Von Hagy-Felsobuki, E.I. J. Het. Chem. 1995, 32, 1671- 1677. 278 Haller, W.S.; Irgolic, K.J. J. Organomet. Chem., 1972, 38, 97-103. 279 Klayman, D.L.; Griffin, T.S. J. Am. Chem. Soc., 1973, 95, 197-199. 280 Syper, K.L.; Mlöchowsky, J.; Synthesis, 1984, 439-442. 281 Shimada, K.; Oikawa, S.; Nakamura, H.; Moro-oka, A.; Kikuchi, M.; Maruyama, A.; Suzuki, T.; Kogawa, H.; Inoue, Y.; Gong, Y.; Aoyagi, S.; Takikawa, Y. Bull. Chem. Soc. Jpn., 2005, 78, 899-905. 282 Sharpless, K.B.; Lauer, R.F. J.Am. Chem. Soc., 1973, 95, 2697-2699. 283 Gladysz, J.A.; Hornby, J.L.; Garbe, J.E. J. Org. Chem., 1978, 43, 1204-1207. 284 Nishiyama, Y.; Katsuura, A.; Negoro, A.; Hamanaka, S.; Miyoshi, N.; Yamana, Y.; Ogawa, A., Sonoda, N. J. Org. Chem., 1991, 56, 3776-3880. 285 Tian, S.; Yu, Z.; Lu, S. J. Org. Chem. 2004, 69, 4520-4523. R S e O H n Alquinilselenoalcohole s
3. Síntesis de selenoureas, selenuros y diselenuros de hidroxitirosol 104 3.2. Resultados y discusión 3.2.1. Síntesis de selenoureas En este apartado se describe la síntesis de nuevas selenoureas derivadas del hidroxitirosol que incluyen en su estructura el fragmento catecol, mediante reacción de isoselenocianatos aromáticos con dopamina. Los isoselenocianatos aromáticos 129-131 fueron obtenidos por reacción de p-toluidina (124) o p-anisidina (125) con formiato de etilo (Esquema 3.6), seguido de la deshidratacion de las formamidas correspondientes 127 y 128 y de la formamida comercial 126, por tratamiento con trifosgeno en diclorometano conteniendo Et 3 N. Los isocianuros así obtenidos se transformaron en los correspondientes isoselenocianatos por tratamiento one-pot con selenio elemental en diclorometano a reflujo (Esquema 3.7). Esquema 3.6 NH 2 R N R H C H O HCOOEt, AcOH Relujo, 4-5h 124 R = Me 125 R = OMe 127 R = Me 128 R = OMe
3. Síntesis de selenoureas, selenuros y diselenuros de hidroxitirosol 105 Esquema 3.7 Análogamente, la reacción de la 1,4-fenilenodiamina 132 con formiato de etilo condujo, tras 24 horas de calentamiento a reflujo, a la bisformamida 133, que fue transformada en el diisoselenocianato 134 por el mismo procedimiento descrito para la obtención de los mono isoselenocianatos (Esquema 3.8). Esquema 3.8 El mecanismo que se propone para la deshidratación de formamidas y formación de isoselenocianatos se recoge en el Esquema 3.9 N R H CHO NC R NCSe R 126 R = H 127 R = Me 1 2 8 R = O M e 129 R = H 130 R = Me 131 R = OM e O O OCCl 3 Cl 3 C Et 3 N, CH 2 Cl 2 reflujo, 3.5 h, Ar tamiz 4 Å Se negro, CH 2 Cl 2 reflujo, 6.5 h, osc. Ar, tamiz 4 Å NH 2 NH 2 N N H CHO HCOOEt, AcOH Relujo, 24 h HCHO 132 133 NC NC NCS e NCS e O O OCCl 3 Cl 3 C Et 3 N, CH 2 Cl 2 reflujo, 3.5 h, Ar tamiz 4 Å Se negro, CH 2 Cl 2 reflujo, 4.5 h, Ar, tamiz 4 Å 134
3. Síntesis de selenoureas, selenuros y diselenuros de hidroxitirosol 106 Esquema 3.9 Por reacción de los isoselenocianatos 129-131 con clorhidrato de dopamina en metanol conteniendo Et 3 N, atmósfera inerte y en la oscuridad, se obtuvieron las selenoureas 25-27 con rendimientos excelentes (Esquema 3.10). Esquema 3.10 Cuando esta reacción se llevó a cabo utilizando el diisoselenocianato 134 se obtuvo la diselenourea 28 con un 33% de rendimiento, (Esquema 3.11) probablemente debido a la dificultad en la purificación cromatográfica por la elevada polaridad del producto. Esquema 3.11 R N C H H OCl C Cl O R N C O H C O Cl ClH2 R N C H CO 2 + Cl R N C R N C S e Et 3 N Se Et 3 N N C S e R 129 R = H 130 R = Me 1 3 1 R = OMe HO HO NH 2 .HCl 3 HO HO H N Se H N R 25 R = H (93%) 26 R = Me (96%) 27 R = OMe (97%) MeOH, 1 h t.a., Ar Et 3 N N C S e NCSe HO HO NH 2 .HCl 3 MeOH, 1 h t.a., Ar 134 HO HO N Se N H H N N Se OH OH H H 28 (33%)
3. Síntesis de selenoureas, selenuros y diselenuros de hidroxitirosol 107 Las nuevas selenoureas 25-27 presentan la particularidad de poseer un fragmento de catecol y un fragmento de selenourea, lo que confiere a estas estructuras la capacidad de incorporar simultáneamente las características antioxidantes de ambos tipos de función y el efecto sinérgico que ello pudiera producir. También se ha abordado la síntesis de selenoureas derivadas de la dopamina di-O-metiladas. Así, hemos preparado la 3,4- dimetoxifenetilamina (también llamado homoveratrilamina) 30, por hidrogenación catalítica de la azida 29, la cual fue obtenida por reacción del bromuro de 3,4-dihidroxifenetilo comercial 135 con azida sódica en DMF (Esquema 3.12). Esquema 3.12 Como producto secundario en esta reacción se obtuvo de manera inesperada la amina secundaria 31 con un rendimiento del 40% y cuya formación puede ser explicada por un mecanismo del que no hemos encontrado antecedentes. Durante la hidrogenación se produce un ión amiduro que o bien capta un protón para dar la amina 30 (camino a), o bien ataca como nucleófilo al metileno unido al grupo azido de una segunda MeO MeO NH OMe OMe 31 (40%) MeO MeO NH 2 MeO MeO N 3 M e O MeO B r NaN 3 DMF, 5h, t.a. H2, Pd/C MeOH, t.a, 5h. 135 29 (89%) 30 (50%) +
3. Síntesis de selenoureas, selenuros y diselenuros de hidroxitirosol 108 molécula adsorbido al catalizador, y que actúa como grupo saliente (camino b). Este resultado contrasta con el obtenido en la preparación de dopamina a partir del hidroxitirosol (Esquema 2.6, pág. 77), probablemente debido a que los hidroxilos fenólicos protonan al amiduro generado antes de que actúe como nucleófilo.(Esquema 3.13) Esquema 3.13 Por reacción de la 3,4-dimetoxifenetilamina 30 con los isoselenocianatos 129-131 se obtuvieron las selenoureas 32-34 con rendimientos del 79-84% después de la purificación cromatográfica (Esquema 3.14). Esquema 3.14 H N N N R H N N N R HN N N R HH N N H NRR' H 2 CN N N ab RNH 2 R H 2 C N N N NNN R NH abCH 2 R' N C S e R 129 R = H 130 R = Me 1 3 1 R = O M e MeO MeO NH 2 30 MeO MeO H N Se H N R 32 R = H (79%) 33 R = Me (84%) 34 R = OMe (83%) CH 2 Cl 2, 0.5 h, t.a., Ar
3. Síntesis de selenoureas, selenuros y diselenuros de hidroxitirosol 109 Por otra parte, la reacción de 30 con el diisoselenocianato 134 condujo a la obtención de la diselenourea tetra-O-metilada 35 con un 67% de rendimiento (Esquema 3.15). Esquema 3.15 Los datos espectroscópicos confirman las estructuras propuestas. En los espectros de 1 H-RMN, la señal de los grupos metileno tiende a apantallarse ligeramente con el aumento del efecto electróndonante de los sutituyentes (Me, OMe) sobre el anillo aromático de las N-arilselenoureas (Tabla 3.1). En los espectros de 13 C-RMN se observa la aparición en todos los casos de señales entre 178.9 y 178.2 ppm que confirman la presencia del fragmento selenoureido en las estructuras propuestas. N C S e NCSe MeO MeO NH 2 30 134 35 (67%) CH 2 Cl 2, 0.5 h, t.a. MeO MeO N Se N H H N N Se OM e O M e H H
3. Síntesis de selenoureas, selenuros y diselenuros de hidroxitirosol 116 con un rendimiento del 67% después de purificación por cromatografía de columna (Esquema 3.24). Esquema 3.24 En la bibliografía se describe 293 la formación de un dimetil selenonio en la desprotección con BCl 3 del metilselanil derivado 136 (Esquema 3.25) cuya des-O-metilación conduce a la formación de la sal de selenonio 137, mediante desplazamiento nucleofílico por el átomo de selenio sobre el metilo del cloruro de metilo formado durante el proceso Esquema 3.25 El mecanismo de reacción propuesto para la formación del selenonio 43 se detalla en el Esquema 3.26. 293 Sadek, S.A.; Basmadjian, G.P.; Hsu, P.M.; Rieger, J.A. J. Med. Chem., 1983, 26, 947- 950. MeO MeO Se OMe OMe HO HO Se OH OH HO O H BrH 1. BBr 3, CH 2 Cl 2 Ar, tamiz, -78 ºC-t.a., 3h 2. H 2 O, 15 min 37 43 MeO MeO Se Me BCl 3 O O Se Me BCl O O Se Me BCl HO HO Se Me CH 3 Cl Me Cl Me Cl H 2 O 136 137
3. Síntesis de selenoureas, selenuros y diselenuros de hidroxitirosol 117 Esquema 3.26 La formación del selenonio 43 implica por tanto la formación de pequeñas cantidades del diselenuro 42, detectadas en los espectros de masas y en RMN. La confirmación de las estructuras de 42 y 43 también se ha llevado a cabo mediante la acetilación con anhídrido acético en piridina, lo que condujo a la formación de los derivados tetra-O-acetilado 41 y hexa-O- acetilado 44, respectivamente (Esquema 3.27). RSe RRSe RR SeH R BBr 3 BBr 3 BBr 2 Br RSe BBr 2 + Br R RSeH H 2 O R R Se Se RSe R RSe R R Br
3. Síntesis de selenoureas, selenuros y diselenuros de hidroxitirosol 118 Esquema 3.27 Las estructuras de los compuestos descritos en este apartado quedan confirmadas por sus datos espectroscópicos. En espectroscopía de masas se aprecian las señales correspondientes a la ruptura de los diselenuros por el enlace Se−Se, con lo cual se observan los picos [M/2] + y el patrón característico de picos isotópicos del selenio En la Figura 3.1 se muestra, a modo de ejemplo, el espectro de ionización química del diselenuro 40. HO HO OH OH Se Se 42 HO HO Se OH OH HO OH Br 43 Ac2O Py Ac2O Py AcO AcO O A c OA c Se Se 41 AcO AcO Se OAc OAc AcO OAc Br 44 (76%)
3. Síntesis de selenoureas, selenuros y diselenuros de hidroxitirosol 119 O O Se O O Se O O Se H O O Figura 3.1. Espectro de masas del diselenuro 40. En 1 H-RMN las diferencias más significativas se observan entre las señales de los metilenos unidos al selenio y al anillo aromático. En el caso de los metilenos unidos a diselenuros 38, 40, 41, 42 estas señales aparecen más desapantalladas (3.04−3.15 ppm) que cuando se trata de sus homólogos monoselenuros 37, 39 y selenonio 43, 44 (2.76−2.79 ppm), debido al mayor efecto de desapantallamiento inducido por la agrupación Se−Se. En el caso de los espectros de 13 C-RMN también se observan estas diferencias en los desplazamientos químicos en los carbonos unidos al Se−Se (29.9−32.3 ppm) frente a los δ de dichos carbonos unidos a Se o Se + (24.6−26.1 ppm); los carbonos unidos al anillo aromático son los que aparecen más desapantalladas (36.5−38.0 ppm) (Tabla 3.2).
3. Síntesis de selenoureas, selenuros y diselenuros de hidroxitirosol 120 Tabla 3.2. Desplazamientos químicos en ppm de los grupos metileno en 1 H- RMN y 13 C-RMN 1 H-RMN (į ppm) 13 C-RMN (į ppm) CH 2 -Ar CH 2 -Se į CH 2 -Se į CH 2 -Ar 37 (CDCl 3 ) 2.90 2.78 25.4 36.8 38 (CDCl 3 ) 2.99 3.15 31.1 37.2 39 (CDCl 3 ) 2.66 2.79 24.8 36.5 40 (CDCl 3 ) 2.89 3.04 30.6 36.8 41 (CDCl 3 ) 3.03 3.12 29.9 36.9 42 (MeOD) 2.87 3.09 32.3 38.0 43 (MeOD) 2.68 2.76 26.1 37.9 44 (CDCl 3 ) 2.94 2.76 24.6 36.5 Estos valores concuerdan con los encontrados en la bibliografía para compuestos análogos. 293,294 294 Müller, J.; Tefort, A. Inorg. Chim. Acta., 2006, 359, 4821-4827
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4. Tioureas derivadas de hidroxitirosol. Reacciones con DDQ y formación de 2-amino-1,3- benzotiazepinas 123 4. TIOUREAS DERIVADAS DE HIDROXITIROSOL. REACCIONES CON DDQ Y FORMACIÓN DE 2-AMINO-1,3-BENZOTIAZEPINAS. 4.1. Introducción y antecedentes. 4.1.1. Propiedades de la tioureas La química de los compuestos N-tiocarbonílicos ha despertado interés desde hace más de un siglo, cuando Schoorl 295 sintetizó la ȕ-D- glucopiranosil tiourea por condensación de D-glucosa con tiourea. Desde entonces se han publicado numerosos artículos acerca de este tipo de compuestos 296-299 considerados isósteros de ureas y de otros compuestos carbonílicos, 300 por lo que podrían ser empleados en estudios de estructuraactividad de compuestos naturales que presenten un grupo N-carbonílico. Las tioureas N,N’-disustituídas han mostrado tener actividad antiviral tanto in vitro como in vivo, 301,302 habiendo revelado el análisis de estructura-actividad que la presencia de un grupo NH-(C=S)-NH es esencial para dicho efecto. 303 Diversas familias de tioureas son también efectivas contra el VIH, 304 y actúan como bactericidas, 305 sustancias antimaláricas, 306 295 Schoorl, M. N. Rec. Trav. Chim. 1903, 22, 31-77. 296 Takemoto, Y.; Chem. Pharm. Bull. 2010, 58, 593-601. 297 Sahu, S.; Sahoo, P. R.; Patel, S.; Mishra, B. K. J. Sulfur Chem., 2011, 32, 171-197. 298 Li, A. F.; Wang, J. H.; Wang, F.; Jian, Y. B. K Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 3719-3745 299 Marques-López, E.; Herrera, R.; Christmann, M. Nat. Prod. Rep., 2010, 27, 1138-1167. 300 Werzel, M.; Light, M. E.; Davis, A. P.; Gale, P. A. Chem. Comm., 2011, 47, 7641-7643. 301 Kang, I. J.; Wang, L. W.; Lee, C. C.; Lee, Y. C.; Chao, Y. S.; Hsu, T. A.; Chern, J. H. Bioorg. Med. Chem, 2009, 19, 1950-1955. 302 Todoulou, O. G.; Papadaki-Valiradi, A. E.; Filippatos, E. C.; Ikeda, S.; De Clerq, E. Eur. J. Med. Chem., 1994, 29, 127-131. 303 Galabov, A.S.; Galabov, B.S.; Neykova, N.A., J. Med. Chem. 1980, 23, 1048-1051. 304 Weitman, M.; Lerman, K.; Ndelman, A.; Major, D. T.; Hizi, A.; Herschorn, A. E. J. Med. Chem. 2011, 46, 447-467.
4. Tioureas derivadas de hidroxitirosol. Reacciones con DDQ y formación de 2-amino-1,3- benzotiazepinas 124 antituberculosas 307 y antinociceptivas. 308 Las tetrahidronaftil tioureas han mostrado un elevado poder para suprimir el apetito en trastornos de obesidad, a partir de los experimentos llevados a cabo en animales. 309 Las 1,3-dialquil o diaril tioureas exhiben actividad antifúngica contra los patógenos de plantas Pyricularia orizae y Drechslera oryzae. 310 R HN S NH 2 Tetrahidronaftil tiourea s Los derivados de ureas y tioureas representan uno de los grupos de agentes anticancerígenos más utilizados, con un amplio rango de actividades contra varias leucemias y tumores sólidos, debido a su buena actividad inhibitoria contra los receptores tirosina quinasa (RTKs), las proteínas tirosina quinasa (PTKs) y las NADH oxidasas, que juegan un papel crítico en muchos aspectos de la tumorgénesis. 311-313 Recientemente han sido 305 Suresha, G. P.; Suhas, R.; Kapfo, W.; Gowda, D. C. Eur. J. Med. Chem., 2011, 46, 2530-2540. 306 Ekoue-Kovi, K.; Yearick, K.; Iwaniuk, D.P.; Natarajan, J.K.; Alumasa, J.; de Dios A.C.; Roepe, P.D.; Wolf, C. Bioog. Med. Chem. 2009, 17, 270-283. 307 Liav, A.; Angala, S.K.; Brennan, J.; Jackson, M. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18, 2649-2651. 308 dos Santos, L.; Azevedo-Lima, L; Cechinel-Filho, V.; Corrêa.R.; de Campos-Buzzi, F.; Nunes, R.J. Bioorg. Med. Chem. 2008, 16, 8526-8534. 309 Bhandari, K.; Srivastavaa, S.; Shankar, G. Bioorg. Med. Chem. 2004, 12, 4189-4196. 310 Krishnamurthy, R.; Govindaraghavan, S.; Narayanasamy, J. Pestic. Sci., 1999, 52, 145- 151. 311 Ullrich, A.; Schlessinger, J. Cell. 1990, 61, 203-212. 312 Hubbard, S. R.; Till, J. H. Rev. Biochem. 2000, 69, 373-398. 313 Dai, Y.; Guo, Y.; Frey, R. R.; Ji, Z.; Curtin, M. L.; Ahmed, A. A.; Albert, D. H.; Arnold, L.; Arries, S. S.; Barlozzari, T.; Bauch, J. L.; Bouska, J. J.; Bousquet, P. F.; Cunha, G. A.;
4. Tioureas derivadas de hidroxitirosol. Reacciones con DDQ y formación de 2-amino-1,3- benzotiazepinas 125 sintetizadas las tioureas 138, ópticamente activas, que han mostrado citotoxicidad contra carcinomas en ratas y en las células tumorales MCF-7 y HeLa. 314 Por el contrario otras tioureas como la etilentiourea 139 han mostrado ser cancerígenas. 315 Se han encontrado tioureas como la N,N’-bis(4-metoxibencil)tiourea, en extractos de plantas como la Tropaeolum tuberosum, en los que la hidrólisis enzimática de los glucosinolatos naturales da lugar a isotiocianatos, y éstos a tioureas simétricas. 316 Otros derivados como la N,N’-dietiltiourea, dibutiltiourea y difeniltiourea, 317 se usan en la industria del caucho y en la fabricación de neopreno, principalmente como aceleradores. También se usan en otros tipos de industrias, por ejemplo, como antioxidantes en la fabricación de tintas de impresora y de pinturas (especialmente la dietiltiourea). 318 Glaser, K. B.; Guo, J.; Li, J.; Marcotte, P. A.; Marsh, K. C.; Moskey, M. D.; Pease, L. J.; Stewart, K. D.; Stoll, V. S.; Tapang, P.; Wishart, N.; Davidsen, S. K.; Michaelides, M. R. J. Med. Chem. 2005, 48, 6066-.6083. 314 Manjula S.N.; Malleshappa-Noolvi, N.; Vipan-Parihar, K.; Manohara-Reddy, S.A.; Ramanit,V.; Gadad, A. K., Singh, G.; Gopalan-Kutty N.; Mallikarjuna-Rao, C. Eur. J. Med. Chem. 2009, 44, 2923-2929. 315 Chhabra,R.S.; Eustis, S.; Haseman, J. K.; Kurtz, J.; Carlton, D. Fundam. Appl. Toxicol. 1992, 18, 405-417. 316 Johns, T.; Towers, G. H. N. Phytochem. 1981, 20, 2687-2689. 317 Martinez Gonzalez, M.C.; Goday Bujan, J.J. ; Almagro, M.; Fonseca, E. Actas Dermosifiliogr. 2009, 100, 317-320. 318 McCleskey P.E.; Swerlick, R.A.; Cutis. 2001, 68, 387-396. H N H N F Cl S H R R' 138 HN NH S 139
4. Tioureas derivadas de hidroxitirosol. Reacciones con DDQ y formación de 2-amino-1,3- benzotiazepinas 132 4.2. Resultados y discusión 4.2.1. Tioureas derivadas de dopamina El objetivo del presente capítulo es la obtención de tioureas que contengan en su estructura el fragmento catecol presente en el hidroxitirosol y la dopamina. Las tioureas 45-49 se obtuvieron por reacción a temperatura ambiente en atmósfera inerte durante una hora de los isotiocianatos comerciales 147-151 con clorhidrato de dopamina 3, utilizando trietilamina como base y metanol como disolvente, mediante el procedimiento descrito en nuestro grupo de investigación. Los rendimientos de las tioureas obtenidas oscilaron entre el 40-90% (Esquema 4.2), después de su purificación por cromatografía en columna. Solo la tiourea 45 había previamente descrita. 363 Esquema 4.2 Los datos espectroscópicos confirman las estructuras propuestas para las tioureas 45-49. En los espectros de 1 H-RMN de 47 y 49 se observa como se produce un mayor desapantallamiento en el metileno unido a nitrógeno cuando el sustituyente sobre el otro nitrógeno de la función tioureido es HO HO NH 2 .HCl +RNCS HO HO H N H NR S 3147: R = Me- 148: R = n-Bu- 149: R = p-CH 3 C 6 H 4 - 150: R = PhCH 2 - 151: R = Ph- 45: R = Me- (63%) 46: R = n-Bu-(42%) 47: R = p-CH 3 C 6 H 4 - (74%) 48: R = PhCH 2 - (62%) 4 9 : R = Ph- (92%) MeOH Et 3 N, Ar, 1h
4. Tioureas derivadas de hidroxitirosol. Reacciones con DDQ y formación de 2-amino-1,3- benzotiazepinas 133 aromático (Tabla 1). El metileno del bencilo de 48 está más desapantallado, (4.66 ppm) que el metileno unido al segundo nitrógeno (3.66 ppm). En los espectros de 13 C-RMN la señal característica del carbono unido al azufre aparece entre 181.7 y 183.4 ppm. Tabla 1. Desplazamientos químicos en ppm más característicos de las tioureas 45-49. 1 H-RMN (į ppm) 13 C-RMN (į ppm) CH 2 -NH į CH 2 -Ar į CH 2 -NH į C=S 45 3.60 2.72 47.0 183.2 46 3.62 2.71 46.9 182.8 47 3.72 2.74 47.2 181.7 48 3.66 2.71 46.9 183.4 49 3.74 2.76 47.3 181.8 4.2.2. Formación de 2-aminodihidro y 2-iminotetrahidro-1,3- benzotiazepinas por oxidación de tioureas con DDQ En este apartado se describe la obtención de 1,3-benzotiazepinas a partir de tioureas derivadas de la dopamina que contienen en su estructura el fragmento catecol, lo que les confiere potencial actividad antioxidante, a pesar de proceder de una oxidación previa.
4. Tioureas derivadas de hidroxitirosol. Reacciones con DDQ y formación de 2-amino-1,3- benzotiazepinas 134 Para la oxidación de las tioureas 45-49 con DDQ (145) se siguió el procedimiento descrito por Land y col. 364 La DDQ es un agente oxidante capaz de actuar en presencia o ausencia de agua, que se emplea para la oxidación de catecoles a quinonas, 365 o para la desprotección de determinados éteres: bencil éteres, 366 tioacetales y acetales. 367 Actúa como aceptor de electrones y forma complejos de transferencia de carga con una amplia variedad de donadores. 368,369 La tiourea 45 se disolvió en MeOH-CHCl 3 1:9 y se trató con 1 equivalente de DDQ formándose un precipitado que se recristalizó en EtOH/HCl. La ausencia de señales en el espectro de 1 H-RMN y la presencia de tan sólo 4 señales en el espectro de 13 C-RMN a 162.2, 129.9, 114.0 y 102.8 ppm indicaron que el producto aislado era la hidroquinona 152, quedando la tiazepina 146 disuelta en las aguas madres en forma de hidrocloruro y mezclada con 152 (Esquema 4.3), mezcla que no fue posible separar por cromatografía en columna. 364 Land, E. J.; Perona, A.; Ramsden, C. A.; Riley, P. A. Org. Biomol. Chem., 2009, 7, 944- 950. 365 Aoyagi, Y.; Takahashi, Y.; Satake, Y.; Takeya, K.; Aiyama, R.; Matsuzaki, T.; Hashimoto, S.; Kurihara, T. Bioorg. Med. Chem., 2006, 14, 5285-5291. 366 Rahin, M. A.; Matsumura, S.; Toshima, K.; Tetrahedron Lett. 2005, 46, 7307-7309. 367 Mathew, L.; Sankararaman, S. J. Org. Chem. 1993, 58, 7576-.7577. 368 Foster, R. Organic Charge Transfer Complexes; Academic Press:New York, 1969. 369 Foster, R.; Foreman, M. L. En The Chemistry of the Quinonoid Compounds; Patai, S., Ed.; John Wiley & Sons: New York, 1974; Part 1, pp 257-333.
4. Tioureas derivadas de hidroxitirosol. Reacciones con DDQ y formación de 2-amino-1,3- benzotiazepinas 135 Esquema 4.3 La oxidación de las tioureas 45-49 con DDQ (Esquema 4.4) siguiendo el método usado por Aoyagi y col., 365 disolviendo las tioureas en tetrahidrofurano y adicionando DDQ en forma sólida, condujo a la formación de las benzotiazepinas 146 y 153-156, obtenidas siempre como mezclas con 152 incluso después de su intento de purificación por cromatografía en columna. Esquema 4.4 Para poder separar las benzotiazepinas 146 y 153-156 del producto 152 se llevó a cabo la acetilación con anhídrido acético en piridina de las mezclas de reacción. De esta forma se obtuvieron los productos acetilados 51-54, y el 3,6-diacetoxi-4,5-dicloroftalonitrilo 50 (Esquema 4.5). La HO HO H N S H NMe HO HO S N N HMe 45 146 145 O O Cl Cl NC NC O H OH Cl Cl NC NC ++ 152 MeOH-CHCl 3 (1:9) EtOH:HCl 2N HO HO S NH N HMe 146 OH OH Cl Cl NC NC + 152 Cl HO HO H N S H NRHO HO S N N HR 145 O O Cl Cl NC NC OH OH Cl Cl NC NC ++ 152 m/z: 228 45: R = Me- 46: R = n-Bu- 47: R = p-CH 3 C 6 H 4 - 48: R = PhCH 2 - 49: R = Ph- 146: R = Me- 153: R = n-Bu- 154: R = p-CH 3 C 6 H 4 - 155: R = PhCH 2 - 1 5 6 : R = Ph- THF
4. Tioureas derivadas de hidroxitirosol. Reacciones con DDQ y formación de 2-amino-1,3- benzotiazepinas 136 acetilación no sólo tuvo lugar en los hidroxilos aromáticos, sino también en el nitrógeno situado en la posición 3 del anillo de tiazepina, produciéndose un reordenamiento molecular hacia la formación preferente de los 2-imino derivados 51-54. Esquema 4.5 Con objeto de confirmar la estructura de 50 se procedió a la acetilación con anhídrido acético en piridina de 152, obteniéndose 50 con un 58% de rendimiento. En los espectros de 13 C-RMN se observaron las señales de los acetilos a 166.2 y 20.2 ppm, además de las señales de los carbonos aromáticos a 148.7, 135.3 y 110.6 ppm. La estructura de las benzotiazepinas 51-54 queda confirmada mediante espectroscopía 1 H-RMN donde sólo se aprecian las señales de dos protones aromáticos, frente a las tres que presentan las tioureas de partida. En la espectroscopía bidimensional HMBC se observan los acoplamientos entre carbonos y protones a larga distancia (2 y 3 enlaces). El carbonilo del grupo acilo muestra una señal de acoplamiento con los protones del metileno situado en C-4, a través de tres enlaces. Si el acetilo hubiera estado HO HO S N N HR O H OH Cl Cl NC NC + 152 153: R = n-Bu- 154: R = p-CH 3 C 6 H 4 - 155: R = PhCH 2 - 156: R = Ph- AcO AcO S N NR OAc OAc Cl Cl NC NC + 50 51: R = n-Bu- (95%) 52: R = p-CH 3 C 6 H 4 - (92%) 53: R = PhCH 2 - (91%) 5 4 : R = P h - ( 9 4 % ) Ac Ac 2 O Py
4. Tioureas derivadas de hidroxitirosol. Reacciones con DDQ y formación de 2-amino-1,3- benzotiazepinas 137 sobre el nitrógeno exocíclico el número de enlaces entre los protones en C-4 y el carbonilo serían cinco, por lo que no se detectaría ninguna correlación en el espectro HMBC (Figura 4.1). Figura 4.1. El tratamiento de la tiourea 45 con DDQ, seguido de acetilación del crudo de reacción, condujo a una mezcla de tautómeros 55 y 56 en proporción 2:1, según se deduce de las señales de los espectros de 1 H-RMN (Esquema 4.6, Figura 4.2). El menor volumen del grupo metilo favoreció en este caso la acetilación sobre el nitrógeno exocíclico, pudiéndose aislar la mezcla de ambos tautómeros por cromatografía en columna de gel de sílice. Esquema 4.6 AcO AcO S N NR HHO Me HO HO H N S H NMe HO HO S N N HMe 145 O O Cl Cl NC NC OH OH Cl Cl NC NC ++ 152 45 146 THF Ac 2 O Py Ac Ac Cl Cl NC NC + 50 AcO AcO S N NCH 3 Ac AcO AcO S N N Ac H 3 C 56 55 + 2:1 (76%)
4. Tioureas derivadas de hidroxitirosol. Reacciones con DDQ y formación de 2-amino-1,3- benzotiazepinas 138 Figura 4.2. Un seguimiento por espectroscopía de 1 H-RMN del equilibrio tautomérico 55/56 mostró que, después de 8 días, la proporción de los tautómeros 55 y 56 varió de 2:1 a 1:0.8, lo que demuestra la capacidad del grupo N-acilo de migrar de un nitrógeno a otro de la misma molécula. El tautómero mayoritario sigue siendo la 2-aminobenzotiazepina 55 frente al 2- iminoderivado 56 como demuestra el experimento HMBC, donde se observó la señal de acoplamiento del metileno en C-4 y el carbonilo acílico de 56. Al realizar el espectro NOESY sobre la mezcla de 55 y 56 no se observó correlación entre los protones del metileno C-4 y los protones del N-acetilo, por lo que la conformación preferente en torno al enlace N-
4. Tioureas derivadas de hidroxitirosol. Reacciones con DDQ y formación de 2-amino-1,3- benzotiazepinas 139 3ņCOCH 3 debe ser la E, como se describe en la Figura 4.3. La configuración del grupo imino debe ser la Z para evitar la interacción estérica entre el N-Me y el acetilo. En esta disposición ZE se evita la desestabilización que supone que los dipolos sobre el C=O y C=N estén paralelos, como ocurre en la disposición ZZ. Figura 4.3 El tratamiento de de las benzotiazepinas 51-54 con carbonato potásico en MeOH-CH 2 Cl 2 durante 1 hora a temperatura ambiente provocó la hidrólisis de los acetilos del fragmento catecol, si bien no se consiguió con este método hidrolizar la amida sobre nitrógeno en posición 3, obteniéndose los derivados 57-60 con rendimientos moderados entre el 43 y el 65 %. (Esquema 4.7) A c O AcO S N N Me Me O Z Z Isómero ZZ AcO AcO S N N Me O Me E Z Isómero ZE AcO AcO S N NMe Me O Z E Isómero EZ AcO AcO S N NMe O Me E Z Isómero EE
4. Tioureas derivadas de hidroxitirosol. Reacciones con DDQ y formación de 2-amino-1,3- benzotiazepinas 140 Esquema 4.7 La desacetilacion de la mezcla de 55 y 56 por este método solamente condujo al derivado 61. El medio básico parece catalizar la completa migración del acetilo hacia el regioisómero más estable con el acetilo sobre el nitrógeno endocíclico (Esquema 4.8). Esquema 4.8 El intento de N-desacetilación en condiciones ácidas de las 1,3- benzotiazepinas 57-61 no condujo a los correspondientes derivados desprotegidos, sino a mezclas de productos de descomposición. AcO AcO S N NR 51: R = n-Bu- 52: R = p-CH 3 C 6 H 4 - 53: R = PhCH 2 - 54: R = Ph- Ac K 2 CO 3, CH 2 Cl 2 :MeOH 1:1 t.a., 1h. H O HO S N NR 57: R = n-Bu- (65%) 58: R = p-CH 3 C 6 H 4 -(43% ) 59: R = PhCH 2 - (65%) 6 0 : R = P h - ( 6 0 % ) Ac A c O AcO S N NCH 3 Ac A c O AcO S N N Ac H 3 C 56 55 + K 2 CO 3, CH 2 Cl 2 :MeOH 1:1 t.a., 1h. HO HO S N N A c H 3 C 61 (46%)
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5. Pruebas de actividad biológica. 244 Gráfica 5.65. Inhibición de la peroxidacion lipídica de microsomas hepáticos con las tioureas 45-49 y la dopamina a una concentración de 0.100 mM. Gráfica 5.66. Inhibición de la peroxidacion lipídica de microsomas hepáticos con las tioureas 45-49 y la dopamina a una concentración de 0.050 mM. 0 2 4 6 8 10 12 0 5 10 15 20 25 MDA (µM) t (min) Tioureas 0.100 mM -VE +VE Tocoferol 45 46 47 48 49 Dopamina EtOH 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 5 10 15 20 25 MDA (µM) t (min) Tioureas 0.050 mM -VE +VE Tocoferol 45 46 47 48 49 Dopamina EtOH
5. Pruebas de actividad biológica 245 La dopamina no mostró potencial inhibidor a una concentración de 0.250 mM, pero sí a las demás concentraciones, mejorando el efecto del control aunque no el del etanol. Las tioureas 46-49 son buenos inhibidores de la peroxidación lipídica en microsomas para la concentración 0.250 mM, y su efecto va disminuyendo para las concentraciones más bajas. La tiourea 45 solo muestra el potencial inhibidor que es efecto del disolvente (EtOH). A la vista de los resultados de los ensayos de inhibición de la peroxidación en microsomas se comprueba la magnífica capacidad de la mayoría los compuestos estudiados, especialmente el diselenuro 42 y las selenoureas 25-27 para prevenir la peroxidación en un sistema lipídico modelo como son los microsomas de hígado de rata. El interés de este estudio radica en que la patología de muchas enfermedades está inducida por la peroxidación de membranas biológicas mediada por radicales libres. Los compuestos analizados ofrecen una alta protección contra la formación de fosfolípidos oxidados de las membranas celulares. Al igual que la vitamina E estos compuestos permitirían una buena nutrición y regeneración de los tejidos. El diselenuro 42 actúa al mismo nivel que la vitamina E, importante para prevenir el desarrollo de condiciones patogénicas y adquirida mediante la dieta a través de alimentos grasos. En todos los casos el diselenuro 42 ofrece la misma protección sobre los microsomas de hígados de ratas con dieta deficiente en vitamina E (-VE) que la que se produce al añadir Į- tocoferol a los mismos, y que es igual e incluso mejor que la que presentan los microsomas de hígados de ratas sometidos a una alimentación normal (+VE).
5. Pruebas de actividad biológica. 246 El hidroxitirosol (64) fracasa en la protección de la peroxidación de lípidos de los microsomas –VE, salvo a baja concentración (0.050 mM), a pesar de su aceptable capacidad de secuestrar radicales libres, superior incluso a la de la vitamina E (Tabla 5.7). El incremento en la lipofilicidad y el grado de de captación de radicales libres en los ensayos DPPH y ABTS, muy superior al mostrado por el HT, hace a los compuestos 42 y 43 muy importantes en cuanto a su eficacia antioxidante en microsomas. Caso particular es del selenonio 43, que pese a sus excelentes valores en cuanto a captación de radicales DPPH y ABTS, en los ensayos con microsomas no aporta tan buen valor, debido probablemente a que su condición de sal de bromo podría provocar un desequilibro osmótico. Los ensayos con selenoureas también aportan excelentes resultados, especialmente en el caso de la selenourea 26, algo más lipofílica que sus homólogos 25 y 27, Comparando los resultados de las selenoureas 25-27 con las tioureas 45-49, en el caso de los derivados de azufre su actividad, aunque muy buena, es inferior a la que muestran los derivados de selenio, por lo que todo parece indicar que el átomo de Se está implicado directamente en la inhibición de la peroxidación. La secuencia de capacidad de inhibición de las tioureas 45-49 sería 45 < 46 < 49 < 47 < 48, y sólo a concentraciones 0.050 mM la tiourea 47 supera ligeramente al derivado 48. Por tanto, representándolo en función de las cadenas laterales, la inhibición sería metil < butil < fenil < tolil < bencil. Existe una marcada influencia de la lipofilia de los sustituyentes sobre el potencial inhibidor. Comparando esta secuencia con la obtenida para la captación de radicales ABTS, donde 49 = 45 < 46 < 47 < 48 (fenil = metil <
5. Pruebas de actividad biológica 247 butil < tolil < bencil), nuevamente los sustituyentes bencilo y tolilo son los que proporcionan a las tioureas una mayor capacidad de inhibición, debido probablemente a la mayor longitud de las cadenas laterales. Este estudio ofrece por lo tanto información relevante sobre el comportamiento de los compuestos ensayados y su potencial antioxidante en modelos de membrana lipídica. La complementación de estos ensayos con los estudios sobre el efecto en el metabolismo podrían determinar los beneficios sobre la salud de los nuevos antioxidantes sintéticos. Aunque al preparar las muestras de microsomas se estimó una concentración de proteínas aproximada de 10 mg/mL se realizó la medida exacta de la misma en el total de la muestra (microsomas totales), del sobrenadante (microsomas sobrenadante) y del pellet (microsomas pellet) tras centrifugar a 37000 g durante 1 hora, frente a una recta patrón elaborada a partir de albúmina de suero bovino. Se utilizó para ello el método de Biuret. Del mismo modo se calculó la concentración de fenoles totales (una vez añadidos los compuestos antioxidantes) por el método de Singleton y Rossi en los microsomas totales (T), microsomas del sobrenadante (SN) y microsomas del pellet (P). (Tabla 5.22)
5. Pruebas de actividad biológica. 248 Tabla 5.22: Concentración de proteínas totales, fenoles totales y fenoles/proteínas en microsomas. Proteínas totales mg/mL Fenoles totales µg/mL ác. Gálico Fenoles/Proteínas (µg ác. Gálico/mg proteína) Compuesto T P SN T P SN T P SN 42 11.66 6.40 2.45 472.25 394.31 58.63 40.51 61.62 23.90 43 7.91 6.31 1.50 175.20 195.78 36.86 22.14 31.03 24.62 25 12.46 10.19 3.42 368.82 330.59 100.29 29.60 32.45 29.37 26 10.63 8.63 2.58 262.94 214.41 69.17 24.73 24.85 26.83 27 12.95 8.00 3.09 313.92 212.45 89.39 24.24 26.54 28.89 45 9.07 5.51 2.25 281.08 178.14 69.95 30.98 32.34 31.02 46 9.96 6.22 2.48 293.33 182.55 33.43 29.44 29.34 13.49 47 9.16 5.60 1.32 245.29 160.49 38.09 26.77 28.67 28.88 48 9.43 5.69 2.57 248.73 181.57 53.28 26.38 31.93 20.76 49 9.43 5.46 2.75 262.94 134.51 95.69 27.88 24.62 34.86 Dopamina (3) 9.70 5.29 2.48 282.55 185.98 87.11 29.14 35.19 35.16 Tocoferol (189) 10.99 8.32 2.60 206.57 173.73 44.78 18.80 20.89 17.25 EtOH 10.28 8.63 2.97 195.29 180.59 51.76 19.00 20.93 17.43 La cantidad de proteínas en microsomas es próxima a los 10 mg/mL. La mayor parte de esa cantidad se queda en el pellet una vez centrifugado, aunque una cantidad residual permanece suspendida en el sobrenadante. La mayor concentración de fenoles totales se obtuvo para el diselenuro 42, situándose la mayoría de los mismos en el pellet. En las selenoureas 25-27 la cantidad de fenoles tanto en el total como en el pellet es superior a las tioureas 45-49. Atendiendo a la relación existente entre la cantidad de fenoles por mg de proteína, como norma general éstos quedan adheridos en mayor proporción a los microsomas que forman el pellet, obteniéndose un elevado valor para el pellet del diselenuro 42.
5. Pruebas de actividad biológica 249 Investigaciones futuras permitirán determinar la concentración de fenol capaz de atravesar las membranas de los microsomas y la cantidad que se ha unido a las mismas. Con estos datos se podrá estudiar además la permeabilidad de las membranas celulares a los derivados sintéticos de hidroxitirosol descritos en el presente trabajo, de cara a estudiar sus potenciales aplicaciones farmacológicas. 5.2.2.2. Ensayos de actividad anticancerígena Debido a los prometedores resultados obtenidos con los ensayos de actividad antioxidante e inhibición de la peroxidación lipídica en microsomas hepáticos, se han llevado a cabo una serie de estudios preliminares de actividad antitumoral del HT, de las selenoureas 26 y 27, del diselenuro 42 y del selenonio 43, en el Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS), en colaboración con el Dr. Amancio Carnero y la Dra. Mª Ángeles López. En esta investigación se evalúa la capacidad de los citados selenoderivados para producir apoptosis (muerte celular programada) en líneas celulares A-375 (melanoma de piel humana), SF-268 (glioblastoma del sistema nervioso central), NCI-H460 (células grandes derivadas de cáncer de pulmón), siguiendo el procedimiento descrito por González- Vadillo y col., 489 y utilizando como referencia doxorrubicina, un potente y 489 González-Vadillo, A. M.; Álvarez-Valdéz, A.; Moneo, V.; Blanco, F.; Díaz, R. G. Carnero, A.; Navarro-Ranninger, C. J. Inorg. Biochem. 2007, 101, 551-558.
5. Pruebas de actividad biológica. 250 conocido fármaco utilizado como antitumoral, 490 y comparando los valores obtenidos con los del hidroxitirosol. Los resultados obtenidos se expresan en función del IC 50 , que representa la concentración de antioxidante necesaria para producir la apoptosis del 50% de las células tumorales, y se muestran en la Tabla 5.20: Tabla 5.20: Ensayos de actividad antitumoral en líneas celulares. De los datos de la tabla se deduce la gran diferencia existente entre los resultados obtenidos para el hidroxitirosol y los selenoderivados ensayados. Se observa que en las líneas celulares A-375 y SF-268 el diselenuro 42 es el más activo, unas 330 veces más activo que el hidroxitirosol. En las NCI-H460 es el selenonio 43 el que presenta mejor actividad, unas 170 veces más activo que el hidroxitirosol. En todos los selenoderivados analizados, los valores de IC 50 son notablemente inferiores a los mostrados por el HT (64), aunque no mejoran los de la doxorrubicina. Este estudio preliminar sirve de base para futuras investigaciones relacionadas con el potencial anticancerígeno de los selenocompuestos 490 De Beer, E. L.; Bottone, A. E.; Voest, E. E. Eur. J. Pharm. 2001, 415, 1-11. IC50 (µM) A-375 SF-268 NCI-H460 HT (64) 158,457 219,379 181,279 26 8,568 2,013 1,430 27 3,483 2,756 1,310 42 0,479 0,360 2,035 43 2,038 1,564 1,071 Doxorrubicina 0,028 0,023 0,012
5. Pruebas de actividad biológica 251 derivados de polifenoles, habiendo mostrado los compuestos analizados resultados muy prometedores en este campo. 5.2.3. Ensayos in vivo. 5.2.3.1. Inhibición del pardeamiento en manzanas. El objetivo de este apartado es estudiar la inhibición del pardeamiento en manzanas utilizando los antioxidantes naturales y sintéticos descritos en este trabajo. El pardeamiento en frutas también es debido a la acción de la enzima tirosinasa, devaluando el valor en el mercado de las mismas y llegando a producir importantes pérdidas económicas por rechazo del consumidor, 491 de ahí la importancia de los estudios encaminados a retardar e inhibir el mecanismo enzimático. Existen numerosos trabajos acerca de la inhibición del pardeamiento en zumo de manzana utilizando 4-hexilresorcinol, metil jasmonato, ȕciclodextrina, 492 L-cisteína y ácido kójico, 493 utilizando métodos enzimáticos y la técnica CIELAB para estudios colorimétricos. 491 Zarivi, O.; Bonfigli, A.; Colafarina, S.; Aimola, A.; agnelli, A. M.; Pacioni, G.; Miranda, M. Phytochemistry, 2011, 72, 2317-2324. 492 Álvarez-Parrilla, E.; de la Rosa, L. A.; Rodrigo-García, J.; Escobedo-González, R.; Mercado-Mercado, G.; Moyers-Montoya, E.; Vñazquez-Flores, A.; González-Aguilar, G. A. Food Chem, 2007, 101, 1346-1356. 493 Iyidogan, N. F.; Baymdirh, A.; J Good Engin, 2004, 62, 299-304.
5. Pruebas de actividad biológica. 252 Diversos autores han aplicado la metodología CIELAB para el estudio del pardeamiento en manzanas cortadas en rodajas 494 o cilindros 495 usando mezclas de ácido ascórbico, L-cisteína, NaCl, CaCl 2 , ácido cítrico y ascorbato sódico, consiguiendo buenos resultados de inhibición. Basándonos en estos datos estudiamos el efecto del HT (64), 3,4- DHFG (190), el diselenuro 42, la selenourea 25, el ácido kójico, y las tioureas 47 y 48 sobre rodajas de manzanas golden, sumergidas durante 5 minutos en 100 mL de disoluciones acuosas de los antioxidantes, utilizando como control una muestra con agua. Para hacer las rodajas se utilizó un cortador casero que dividió la manzana en 6 partes iguales, descartando el corazón. De esas piezas se realizaron las rodajas, que se sumergieron en grupos de 4 en las disoluciones a ensayar durante 5 minutos. Posteriormente se secaron y escurrieron, y se depositaron en bandejas de porcelana. Tres horas después se midieron en el colorímetro los parámetros L* (claridad), a* y b* (saturación de color) para cada una de las rodajas. Los resultados se expresaron en función de del cambio de color ∆E según la expresión: ∆E = [(L t – L inicial ) 2 + (a t – a inicial ) 2 + (b t – b inicial ) 2 ] 1/2 Para el cálculo del grado de inhibición del pardeamiento (% ∆L) y la inhibición del cambio de color (%∆E) se utilizaron las siguientes ecuaciones: % ∆L = (∆L control - ∆L tratamiento )/∆L control 494 Toivonem, P. M. A. Food Sci Tech, 2008, 41, 1607-1609. 495 Tortoe, C.; Orchard, J.; Beezer, A.. Int J Food Sci Tech, 2007, 42, 1475-1481.
5. Pruebas de actividad biológica 253 % ∆E = (∆E control - ∆E tratamiento )/∆E control Los resultados obtenidos para el 3,4-DHFG, HT y ácido kójico al 0.1% se muestran en la Tabla 5.21: Tabla 5.21: Estudio de la inhibición del pardeamiento en manzanas con HT y 3,4-DHFG ∆ ∆∆ ∆L ∆ ∆∆ ∆a* ∆ ∆∆ ∆b* ∆ ∆∆ ∆E % ∆ ∆∆ ∆L % ∆ ∆∆ ∆E P ∆ ∆∆ ∆E Control -7,18 2,57 4,22 8,72 Ac. Kójico 0,1 % -5,65 0,42 1,91 5,97 21% 31% 0.05 HT 0,005 mM -2,68 2,91 7,95 8,88 63% -2% 0.23 HT 0,01 mM -6,39 2,55 4,50 8,22 11% 6% 0.91 HT 0,05 mM -16,93 2,08 -0,92 17,08 -136% -96% 0.09 HT 0,1 mM -10,12 2,07 4,17 11,13 -41% -28% 0.36 HT 0,5 mM -8,86 2,82 5,18 10,64 -23% -22% 0.49 3,4 - DHFG 0,005 mM -5,23 2,55 6,53 8,75 27% 0% 0.27 3,4 - DHFG 0,01 mM -7,87 2,53 4,03 9,20 -10% -6% 0.54 3,4 - DHFG 0,05 mM -10,88 2,45 4,66 12,08 -51% -39% 0.56 3,4 - DHFG 0,1 mM -16,28 2,45 2,05 16,58 -127% -90% 0.04 3,4 - DHFG 0,5 mM -13,55 3,60 2,18 14,18 -89% -63% 0.65 HT 5 µM+ 3,4- DHFG 5 µM. -3,39 2,54 4,99 6,55 53% 25% 0.89 Según los datos de la tabla, solamente el ácido kójico previene el pardeamiento enzimático. Tanto el HT como el 3,4-DHFG parecen incluso favorecerlo. Pese a los demás resultados positivos de la tabla, como por ejemplo para el HT 0.01 mM, el análisis estadístico (p = probabilidad de error) de los datos indica una elevada dispersión de los mismos, no ajustándose a niveles de significancia respecto al control, a excepción del ácido kójico (p = 0.05).
5. Pruebas de actividad biológica. 260 almacenaje a 5 ± 1 ºC. Los resultados obtenidos tras dos días se expresan en la Tabla 5.27 y después de 5 días en la Tabla 5.28. Tabla 5.27: Cuarto ensayo con camarones utilizando el diselenuro 42, HT y 3,4-DHFG como inhibidores de la melanosis. Conteo y porcentajes tras 2 días almacenados a 5 ºC. Compuesto Malos Regular Buenos Total Control 28 21% 57 43% 47 36% 132 42 0.05 µ M 30 26% 51 44% 36 31% 117 42 0.001 mM 2 2% 42 37% 70 61% 114 42 0.01 mM 10 8% 48 40% 62 52% 120 42 0.02 mM 5 4% 36 29% 83 67% 124 3,4 - DHFG 0.001 mM 5 4% 44 35% 75 60% 124 3,4 - DHFG 0.05 mM 7 6% 34 31% 68 62% 109 3,4 - DHFG 0.075 mM 18 14% 49 39% 60 47% 127 HT 0.01 mM 11 8% 45 34% 75 57% 131 HT 0.05 mM 8 6% 59 48% 57 46% 124 HT 0.075 mM 26 26% 43 43% 32 32% 101 Tabla 5.28: Cuarto ensayo con camarones utilizando el diselenuro 42, HT y 3,4-DHFG como inhibidores de la melanosis. Conteo y porcentajes tras 5 días almacenados a 5 ºC. ŽŵƉƵĞƐƚŽ Malos Regular Buenos Total Control ϵϱ 74% ϮϮ 17% ϭϭ 9% ϭϮϴ 42 0.05 µM ϱϵ 49% ϯϲ 30% Ϯϲ 21% ϭϮϭ 42 0.001 mM ϴϳ 69% ϭϳ 13% ϮϮ 17% ϭϮϲ 42 0.01 mM ϲϬ 46% ϯϱ 27% ϯϱ 27% ϭϯϬ 42 0.02 mM ϲϳ 54% ϯϰ 27% Ϯϯ 19% ϭϮϰ 3,4 - DHFG 0.001 mM ϳϵ 64% ϮϬ 16% Ϯϰ 20% ϭϮϯ 3,4 - DHFG 0.05 mM ϰϮ 34% ϰϭ 33% ϰϬ 33% ϭϮϯ 3,4 - DHFG 0.075 mM ϱϬ 39% ϰϳ 37% ϯϭ 24% ϭϮϴ HT 0.01 mM ϳϰ 56% ϯϱ 26% Ϯϰ 18% ϭϯϯ HT 0.05 mM ϰϬ 34% ϱϰ 47% ϮϮ 19% ϭϭϲ HT 0.075 mM ϲϯ 62% Ϯϴ 28% ϭϬ 10% ϭϬϭ
5. Pruebas de actividad biológica 261 El diselenuro 42 también mostró un notable efecto inhibidor sobre la melanosis, similar al del 3,4-DHFG para concentraciones iguales, siendo muy llamativos los resultados obtenidos a los dos días de su almacenamiento. Finalmente se repitió el ensayo utilizando como inhibidores la selenourea 25 y la tiourea 47, seleccionando los camarones vivos de mayor tamaño (40 g en 100 mL), sumergiéndolos en las disoluciones durante 15 minutos, comparando los resultados con el glicol, usando como control camarones sumergidos en agua, y realizando las medidas tras dos (Tabla 5.29) y cinco días (Tabla 5.30) de almacenamiento a 5 ± 1 ºC. Tabla 5.29: Quinto ensayo con camarones utilizando la selenourea 25, la tiourea 47 y 3,4-DHFG como inhibidores de la melanosis. Conteo y porcentajes tras 2 días almacenados a 5 ºC. ŽŵƉƵĞƐƚŽ Malos Regular Buenos Total Control ϴ 5% ϵϬ 55% ϲϳ 41% ϭϲϱ 25 0.001 mM ϭϬ 6% ϳϴ 46% ϴϮ 48% ϭϳϬ 25 0.01 mM ϯ 2% Ϯϭ 15% ϭϭϴ 83% ϭϰϮ 25 0.02 mM ϰ 2% ϰϰ 27% ϭϭϴ 71% ϭϲϲ 47 0.001 mM ϭϴ 10% ϳϭ 41% ϴϱ 49% ϭϳϰ 47 0.01 mM ϭϬ 6% ϴϭ 51% ϲϵ 43% ϭϲϬ 47 0.02 mM ϳ 4% ϲϵ 40% ϵϲ 56% ϭϳϮ 3,4 - DHFG 0.02 mM ϲ 4% ϲϯ 39% ϵϭ 57% ϭϲϬ 3,4 - DHFG 0.05 mM ϵ 5% ϰϴ 29% ϭϬϳ 65% ϭϲϰ 3,4 - DHFG 0.075 mM ϳ 4% ϴϱ 51% ϳϰ 45% ϭϲϲ
5. Pruebas de actividad biológica. 262 Tabla 5.30: Quinto ensayo con camarones utilizando la selenourea 25, la tiourea 47 y 3,4-DHFG como inhibidores de la melanosis. Conteo y porcentajes tras 5 días almacenados a 5 ºC. ŽŵƉƵĞƐƚŽ Malos Regular Buenos Total Control ϴϲ 52% ϱϲ 34% Ϯϯ 14% ϭϲϱ 25 0.001 mM ϴϬ 44% ϳϴ 43% Ϯϱ 14% ϭϴϯ 25 0.01 mM ϳϱ 44% ϳϯ 43% ϮϮ 13% ϭϳϬ 25 0.02 mM ϳϯ 39% ϴϰ 45% Ϯϵ 16% ϭϴϲ 47 0.001 mM ϴϲ 50% ϱϰ 32% ϯϭ 18% ϭϳϭ 47 0.01 mM ϲϲ 42% ϳϵ 50% ϭϯ 8% ϭϱϴ 47 0.02 mM ϲϬ 34% ϵϭ 52% Ϯϯ 13% ϭϳϰ 3,4 - DHFG 0.02 mM ϲϭ 37% ϴϮ 50% Ϯϭ 13% ϭϲϰ 3,4 - DHFG 0.05 mM ϱϱ 34% ϱϰ 34% ϱϭ 32% ϭϲϬ 3,4 - DHFG 0.075 mM ϳϰ 46% ϱϮ 32% ϯϲ 22% ϭϲϮ Aunque se aprecian diferencias importantes entre la selenourea 25 y la tiourea 47 con respecto al control tras dos días, siendo los resultados mejores en el caso de la selenourea 25, éstas terminan por hacerse similares al quinto día. Nuevamente el mejor de los valores se obtuvo con el glicol a una concentración 0.05 mM. En las siguientes figuras pueden apreciarse, a modo de ejemplo gráfico, camarones en el día de su recolección (Figura 5.1), tras dos días almacenados a 5 ºC (Figura 5.2) y tras cinco días de almacenamiento a 5 ºC (Figura 5.3).
5. Pruebas de actividad biológica 263 Figura 5.1. Camarones. Día 0. Figura 5.2. Camarones. Día 2.
5. Pruebas de actividad biológica. 264 Figura 5.3. Camarones. Día 5. Los resultados obtenidos son muy interesantes, sobre todo teniendo en cuenta los siguientes factores: 1) Que las pruebas se han realizado de forma individual por un panel de hasta 6 observadores, con lo cual la reproducibilidad de las mismas ha estado condicionada a factores humanos (Figura 5.4), obteníendose los mismos resultados en todos los casos, independientemente de los observadores.
5. Pruebas de actividad biológica 265 Figura 5.4. Conteo de camarones. 2) El número de individuos en cada ensayo varía según el tamaño de los camarones en la partida adquirida, observándose que a pesar de esa variabilidad de tamaño y de individuos los resultados son similares y repetitivos. 3) Los experimentos se realizaron en distintas épocas del año, con lo que también se observa que los factores externos y los fisiológicos de los individuos tampoco condicionan los resultados. Teniendo en cuenta lo anterior, cabe destacar que a pesar de la variabilidad de individuos, observadores y condiciones externas, los
5. Pruebas de actividad biológica. 266 resultados han sido siempre similares, afianzando los efectos positivos observados. A dosis bajas, del orden de 0.01-0.05 mM de HT (64) o 3,4-DHFG (190), el efecto inhibidor es mayor que a dosis más altas. En el caso de los ensayos con tirosinasa de hongos, a partir de cierta concentración mínima se producía un efecto similar, que aunque no dependía directamente de la concentración sí que mostraba que las muestras más diluidas tenían mayor efecto inhibidor. Los ensayos llevados a cabo con los compuestos sintéticos 42, 25 y 47 muestran todos un buen efecto inhibidor, siendo el compuesto 42 el que presenta un mayor efecto, equiparable al mostrado por el 3,4-DHFG (190). Desde el punto de vista práctico el interés de las pruebas realizadas con camarones tienen una limitada aplicabilidad, puesto que los camarones por lo general son consumidos dentro de los dos primeros días desde su captura, con lo que no hay posibilidad de actividad melanósica alguna. Sin embargo, dado su pequeño peso y tamaño, el precio por unidad es muy bajo, siendo una fuente barata de individuos de estudio, estableciendo así unas directrices generales para ampliar futuros ensayos con otros tipos de marisco más grandes como gambas y langostinos y corroborar el efecto antimelanósico de los productos previamente ensayados con los camarones, buscando así su revalorización comercial. El interés de este estudio podría estar además enfocado a la utilización de los antioxidantes ensayados en melanomas humanos, como despigmentantes para su utilización en el mundo de los cosméticos y para el tratamiento de melanomas en cánceres de piel.
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6. Formación de isoxazoles con el catalizados CeCl 3 /NaI 269 6. FORMACIÓN DE ISOXAZOLES CON EL CATALIZADOR CeCl 3 /NaI 6.1. Introducción y antecedentes. Los estados de oxidación más estables para el cerio son +3 y +4, aunque el estado trivalente es el más común, siendo el cloruro de cerio (III) heptahidratado (CeCl 3 ·7H 2 O) la principal fuente comercial de Ce 3+ . Por este hecho el CeCl 3 ha sido ampliamente usado en un amplio número de aplicaciones tanto industriales como de investigación, conectando la Química con otras disciplinas tales como la Ciencia de Materiales, 496,497 la Física 498,499 y la Biología. 500,501 Además, en la Química Orgánica se está produciendo un interés creciente tanto en la llamada “Química Verde” (o respetuosa con el medio ambiente), como en las transformaciones químicas con economía (o eficiencia) atómica. 502 Investigaciones recientes han puesto de manifiesto las aplicaciones del tricloruro de cerio como un ácido de Lewis apto para Química Verde, de reducido impacto ambiental, y eficaz en síntesis orgánica moderna. 503 A estas propiedades hay que sumar el carácter oxofílico, un factor crucial en la quimio, regio y esteroselectividad de transformaciones 496 Polard, I.; Sonm, A.; Guillame, S. M. Chem. Eur. J.,2004, 10, 4054-4062. 497 Evans, W. J.; Giarikos, D. G.; Allen, N. T. Macromolecules, 2003, 36, 4256-4257 498 Charbonnière, L.; Ziessel, R.; Guardigli, M.; Roda, A.; Sabbatini, N.; Cesario, M. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 2436-2437. 499 Parker, D. Coord. Chem. Rev. 2000, 205, 109-130. 500 Andre, J. P.; Geralds, C. F. G. C.; Martins, J. A.; Merbach, A. E.; Prata, M. I. M.; Santos, A. C.; de Lima, J. J. P.; Toth, E. Chem. Eur. J. 2004, 10, 5804-5816. 501 Sammes, P. G.; Yahioglu, G. Nat. Prod. Rep., 1996, 13, 1-28. 502 Trost, B. M. Acc. Chem. Res. 2002, 35, 695-705. 503 Sabitha, G.; Yadav, J. S. In Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis; Paquette, L. A., Ed.; Wiley-VCH: Weinheim, 2006.
6. Formación de isoxazoles con el catalizados CeCl 3 /NaI 276 formación de nuevos enlaces carbono-nitrógeno. Sabitha y col. 509,528,529 han descrito la síntesis de 1,5-benzodiazepinas 208 usando el catalizador soportado sobre gel de sílice en ausencia de disolvente (Esquema 6.6). Esquema 6.6 También se ha utilizado para la reacción de aza-Michael, entre aminas secundarias y (Z)-enonas 530 para dar aminocetonas, muy útiles en la preparación de compuestos nitrogenados biológicamente activos. 531 Yaday y col. 532 mostraron que el glucal triacetato 209 reacciona con una variedad de alcoholes 210 en presencia del sistema CeCl 3 ·7H 2 O−NaI en acetonitrilo a reflujo, rindiendo los correspondientes 2-deoxi-Į- glicopiranósidos 211 con elevados rendimientos (Esquema 6.7). 528 Sabitha, G.; Satheesh Babu, R.; Rajkumar, M.; Yadav, J. S. Org. Lett. 2002, 4, 343-351. 529 Sabitha, G.; Satheesh Babu, R.; Rajkumar, M.; Srinivas Reddy, C.; Yadav, J. S. Tetrahedron Lett. 2001, 42, 3955-3958. 530 Bartoli, G.; Bosco, M.; Marcantoni, E.; Petrini, M.; Sambri, L.; Torregiani, E. J. Org. Chem. 2001, 66, 9052-9055 531 Juaristi, E.; Lopez-Ruiz, H. Curr. Med. Chem. 1998, 6, 983-1004. 532 Yadav, J. S.; Reddy, B. V. S.; Bhaskar Reddy, K.; Satyanarayana, M. Tetrahedron Lett. 2002, 43, 7009-7012. NH 2 NH 2 H 3 C +R 1 R 2 O CeCl 3 .7H 2 O-NaI SiO 2 N H NR 1 R 2 R 2 R 1 H 3 C 2 0 6 2 0 7 2 0 8
6. Formación de isoxazoles con el catalizados CeCl 3 /NaI 277 Esquema 6.7 Esta misma metodología se ha aplicado a la protección de grupos hidroxilo por tetrahidropiranilación 533 en ausencia de disolvente (Esquema 6.8). Esquema 6.8 Los isoxazoles presentan diversas actividades biológicas, siendo buenos candidatos para el diseño de fármacos, como el recientemente registrado leflunomida (Arava ® ), un conocido inmunodepresor. 534 Los isoxazoles también actúan como antiinflamatorios, 535 anticonvulsionantes, 536,537 antivirales, 538-540 antibacterianos, 541 hipoglucémicos, 542 analgésicos 543 e inmunológicos. 544,545 533 Bartoli, G.; Giovannini, R.; Giuliani, A.; Marcantoni, E.; Massaccesi, M.; Melchiorre, P.; Paoletti, M.; Sambri, L. Eur. J. Org. Chem. 2006, 1476-1482. 534 Pinto, P.;Douglas, M.; Acta Reumatol. Port. 2006, 31, 215-224. 535 Ko, D.-H.; Maponya, M. F.; Khalil, M. A.; Oriaku, E. T.; You, Z.; Lee, J. Med. Chem. Res. 1998, 8, 313–324. 536 Lepage, F.; Tombret, F.; Cuvier, G.; Marivain, A.; Gillardin, J.M. Eur. J. Med. Chem., 1992, 27, 581-593. R OH O AcO AcO OR CeCl 3 .7H 2 O-NaI CH 3 CN, reflujo 4.5-7.0 h O AcO O A c AcO 209 210 211 + O A c R OH O CeCl 3 .7H 2 O (2.5 mol %) NaI (2.5 mol %) t.a. ORO 210 212 213 +
6. Formación de isoxazoles con el catalizados CeCl 3 /NaI 278 Recientemente se ha demostrado el poder inmunosupresor del 5-(5- amino-3-metilisoxazol-4-il)-1,3,4-oxadiazol-2-amina 214, un compuesto importante para el diseño de otras moléculas con alta actividad biológica. 546 Algunos derivados del isoxazol han mostrado propiedades como inhibidores de la fosfatasa Ptp8 de la Mycobaterium tuberculosis, 547 o de la oxidasa de D-aminoácidos. 548 537 Eddington, N.D.; Cox, D.S.; Roberts, R.R.; Butcher, R.J.; Edafiogho, I.O.; Stables, J.P.; Cooke, N.; Goodwin, A.M.; Smith, C.A.; Scott, K.R. Eur. J. Med. Chem., 2002, 37, 635- .648. 538 Diana, G.D.; Cutcliffe, D.; Oglesby, R.C.; Otto, M.J.; Mallamo, J.P.; Akullian, V.; McKinlay, M. J. Med. Chem. 1989, 32, 450-455. 539 Lee, Y.-S.; Kim, B.H.; Bioorg. Med. Chem. Lett., 2002, 12, 1395-1397. 540 Tucker, J.A.; Clayton, T.L.; Chidester, C.G.; Schulz, M.W.; Harrington, L.E.; Conrad, S.J.; Yagi, Y.; Oien, N.L.; Yurek, D.; Kuo, M.-S. Bioorg. Med. Chem. 2000, 8, 601-615. 541 Kang, Y. Y.; Shin, K. J.; Yoo, K. H.; Seo, K. J.; Hong, C. Y.; Lee, C.-S.; Park, S. Y.; Kim, D. J.; Park, S. W. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000, 10, 95–99. 542 Conti, P.; Dallanoce, C.; Amici, M. D.; Micheli, C. D.; Klotz, K.-N. Bioorg. Med. Chem. 1998, 6, 401–408. 543 Mishra, A.; Jain, S. K.; Asthana, J. G. Orient. J. Chem. 1998, 14, 151–152. 544 Ryng, S.; Machón, Z.; Wieczorek, Z.; Zimecki, M.; Mokrosz, M.J.; Eur. J. Med. Chem., 1998, 33, 831-836. 545 Ryng, S.; Zimecki, M.; Sonnenberg, Z.; Mokrosz, M.J.; Arch. Pharm. Pharm. Med. Chem. 1999, 332, 158-162. 546 Ryng, S.; Zimecki, M.; Jezierska-Mazzarello, A.; Panek, J.J.; Maczynski, M.; Głowiak, T.; Sawka-Dobrowolska, W.; Koll, A.; J. Mol. Struct. 2011, 999, 60-67. 547 Soellner, M.B.; Rawls, K.A.; Grundner, C.; Alber, T.; Ellman, .J.A.; J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 9613-9620. 548 Ferraris, D., Duvall, B., Ko, Y.-S.; Thomas, A.G.; Rojas, C.; Majer, P.; Hashimoto, K.; Tsukamoto, T.; J. Med. Chem. 2008, 51, 3357-3359. N O NH 2 C H 3 O N N NH 2 214
6. Formación de isoxazoles con el catalizados CeCl 3 /NaI 279 Desde un punto de vista sintético, los isoxazoles son una clase importante de compuestos heterocíclicos utilizados como sintones versátiles en síntesis orgánica. Pueden ser convertidos en unidades sintéticas importantes como ȕ-hidroxicetonas, 549 Ȗ-aminoalcoholes, 550 oximas Į,ȕinsaturadas 551 y ȕ-hidroxinitrilos. 552 Se han descrito diversos métodos para la síntesis de isoxazoles. 553 Por ejemplo, la reacción de acetilendicarboxilatos de dialquilo 215 con 2- nitroetanoatos de alquilo 216 en presencia de trifenilfosfina conduce a isoxazoles funcionalizados 217 con buenos rendimientos 554 (Esquema 6.9). Esquema 6.9 Zhu y col. 555 han simplificado la síntesis de isoxazoles a partir de aldehídos, mediante la formación de oximas, cloración de las mismas y cicloadición 1,3-dipolar de dipolarófilos con óxidos de nitrilo generados in situ en una reacción one-pot. Este procedimiento es particularmente útil debido al ahorro de tiempo y costes para la obtención de isoxazoles a gran escala (Esquema 6.10). 549 Bode, J. W.; Carreira, E. M. Org. Lett. 2001, 3, 1587-1590. 550 Muller, I.; Jager, V. Tetrahedron Lett. 1982, 23, 4777-4780 551 Lee, S. Y.; Lee, B. S.; Lee, C.-W.; Oh, D. Y. J. Org. Chem. 2000, 65, 256-257 552 Yashiro, A.; Nishida, Y.; Kobayashi, K.; Ohno, M. Synlett, 2000, 361-362. 553 Padwa, A., Pearson, W. H., Eds.; Chemistry of Heterocyclic Compounds; Wiley: Hoboken, 2002; Vol. 59, pp 361–472. 554 Yavari, I.; Moradi, L.; Tetrahedron Lett., 2006, 47, 1627-1629. 555 Zhu, S.; Shi, S.; Gerritz, S.W. Tetrahedron Lett. 2011,52 , 4001–4004. PPh 3 + C O 2 R CO 2 R + R'O NO 2 O Tolueno Reflujo ON CO 2 R' RO 2 C RO 2 C 2 1 5 216 217
6. Formación de isoxazoles con el catalizados CeCl 3 /NaI 280 Esquema 6.10 6.2. Resultados y discusión. Esta investigación se realizó en la Universidad de Camerino (Italia) bajo la supervisión del profesor Enrico Marcantoni. El propósito de esta investigación consistía en el estudio de la reacción de adición nucleofílica entre el indol 223, el ácido de Meldrum (2,2-dimetil-1,3-dioxano-4,6-diona) 224 y benzaldehído 225, catalizada por el sistema CeCl 3 ·7H 2 O−NaI/SiO 2 . R O H R NO OO N O O 218 221 2 2 2 R N H 219OH NCS, HCl (g) DMF R N Cl 22OH Et 3 N, DMF NH 2 OH.HCl Et 3 N, DMF, t.a. N HO O O O OH 2 2 3 2 2 4 2 2 5
6. Formación de isoxazoles con el catalizados CeCl 3 /NaI 281 El ácido de Meldrum es un compuesto con un metileno activo preparado por Meldrum en 1908; 556 la acidez de los protones unidos a su carbono central le confiere un interés especial para las reacciones de condensación con aldehídos y cetonas a través de la reacción de Knoevenagel. 557 El catalizador de cerio (III) se preparó disolviendo 0.3 mmol de CeCl 3 ·7H 2 O y 0.3 mmol de NaI en 7 mL de acetonitrilo. Se añadieron 0.5 g de SiO 2 gruesa que permaneció en suspensión. La mezcla fue agitada durante toda la noche y al evaporar el disolvente se obtuvo el catalizador sólido, sobre el que se añadieron cantidades equimoleculares (1 mmol) de indol, ácido de Meldrum y benzaldehído, agitando a temperatura ambiente. La reacción fue seguida mediante cromatografía de gases, y cromatografía de gases-masas. Tras dos hora de reacción no fue detectado el pico m/z 349 correspondiente al compuesto esperado 229, sino los picos m/z 232 y 322 que pertenecen respectivamente a 230, formado por condensación del carbono nucleofílico de 227 y el C=O de 228, y el bis(indolilmetano) derivado 231, resultante de la doble adición nucleofílica de indol a benzaldehído (Esquema 6.11). 556 Meldrum, A. N.; J. Chem. Soc. 1908, 93, 598–601. 557 Chen, B.-C. Heterocycles 1991, 32, 529-597.
6. Formación de isoxazoles con el catalizados CeCl 3 /NaI 282 Esquema 6.11 Una modificación del orden de adición de los reactivos, añadiendo en primer lugar 227 y 228 y, una vez formado el producto de condensación 230, el indol 226, también condujo a la formación de una mezcla de 230 y 231 (Esquema 6.12). Esquema 6.12 N HO O O O OH 226 227 228 ++ HN O O O O HN NH O O O O 2 3 0 m/z: 232 231 m/z: 322 CeCl 3 .7H 2 O-NaI SiO 2, t.a., 2h. 229 O O O O 230 O O O O OH 227 228 + CeCl 3 .7H 2 O-NaI SiO 2, t.a., 2h. CeCl 3 .7H 2 O-NaI SiO 2, t.a., 2h. HN O O O O 229 N H 226 HN NH O O O O 230 231 +
6. Formación de isoxazoles con el catalizados CeCl 3 /NaI 283 En los casos en los que se intentó la reacción sin el catalizador de cerio (III) o sustituyendo el SiO 2 por acetonitrilo no se observó evolución alguna, obteniéndose los reactivos de partida sin reaccionar. Con el objeto de reducir la elevada nucleofilia del indol, se preparó su sulfonilderivado 233 por reacción de 226 con cloruro de bencenosulfonilo 232 en diclorometano, usando como base NaOH al 50% y Aliquat® 336 como agente de transferencia de fase, según el método descrito por Ottoni y col. 558 (Esquema 6.13). Esquema 6.13 Por reacción del p-nitrobenzaldehído 234 y el p-anisaldehído 235 con el ácido de Meldrum en presencia de CeCl 3 −NaI/SiO 2 , se obtuvieron tras 2 horas de reacción, los productos de condensación 236 y 237 respectivamente, con rendimientos del 65% en ambos casos. Se ensayó la reacción de 236 y 237 con el sulfonilderivado 233 pero tras 72 horas de agitación, a temperatura ambiente con el catalizador de cerio soportado sobre sílice, en ninguno de los dos casos se obtuvieron los productos esperados 238 y/o 239 (Esquema 6.14). 558 Ottoni, O.; Cruz, R.; Alves, R. Tetrahedron, 1998, 54, 13915-13928. N H 226 Aliquat, CH 2 Cl 2, NaOH 50% SO2Cl 232 N 233 SO O
6. Formación de isoxazoles con el catalizados CeCl 3 /NaI 284 Esquema 6.14 Por tanto, se concluyó que el sistema CeCl 3 ·7H 2 O−NaI/SiO 2 , en general un potente catalizador para la obtención de aductos de Michael, no es adecuado para formar las estructuras que se pretenden. Se sustituyó el ácido de Meldrum por otro nucleófilo, el nitroacetato de etilo 240. La condensación de Knoevenagel de los aldehídos 234 y 235 con 1.2 equivalentes de nitroacetato de etilo condujo de manera inesperada a los isoxazoles 62 y 241, aislándose 62 con un 23% de rendimiento (Esquema 6.15), no detectándose los esperados productos de adición. El isoxazol 241, detectado por cromatografía de gases-masas, no pudo ser aislado del medio de reacción y caracterizado como compuesto puro. O O O O 236 O O O O OH 227 234 + CeCl 3 .7H 2 O-NaI SiO 2, t.a., 2h. CeCl 3 .7H 2 O-NaI SiO 2, t.a., 72h. NO O O O 238 NO 2 O 2 N N 233 SO O SO O N O 2 O O O O 237 O O O O OH 227 235 + SiO 2, t.a., 2h. CeCl 3 .7H 2 O-NaI SiO 2, t.a., 72h. NO O O O 239 OMe MeO N 232 SO O SO O OMe CeCl 3 .7H 2 O-NaI
6. Formación de isoxazoles con el catalizados CeCl 3 /NaI 285 Esquema 6.15 El mecanismo propuesto para la obtención de derivados del isoxazol a partir de nitroacetato de etilo y aldehídos se muestra en el Esquema 6.16. Esquema 6.16 O H 235 OMe +NO 2 COOEt SiO 2, t.a., 24h. MeO N O COOEt EtOOC 240 241 m/z 319 CeCl 3 .7H 2 O-NaI (0.3 mmol) O H 234 NO 2 +NO 2 COOEt CeCl 3 .7H 2 O-NaI (0.3 mmol) SiO 2, t.a., 24h. O 2 N N O COOEt EtOOC 240 62 m/z 334 (23%) NO 2 O OEt R O N CO 2 Et OH OR CO 2 Et NOH O C e ( I I I ) NO 2 O OEtR O 2 NCH 2 CO 2 Et O N CO 2 Et OH CO 2 Et N O OH R Ce(III) O N CO 2 Et OH CO 2 Et R O N CO 2 Et OH R CO 2 Et O N CO 2 Et OH 2 R CO 2 Et O N CO 2 Et R CO 2 Et HONO H + H + H H 3 O + +
7. Conclusiones 293 7. CONCLUSIONES PRIMERA Se ha desarrollado una nueva ruta de síntesis de dopamina (3) a partir de hidroxitirosol, bien de forma directa en tres pasos vía el azido derivado 2 o bien en cuatro pasos empleando una estrategia de proteccióndesprotección de los hidroxilos aromáticos del hidroxitirosol con el grupo oxililenodiilo. SEGUNDA Se ha desarrollado la síntesis de los O-β-D-glucopiranosil y O-β-D- galactopiranosil derivados de dopamina a partir de hidroxitirosol, como mezclas de regiosómeros no separables cromatográficamente. TERCERA Se han sintetizado las primeras selenoureas derivadas de dopamina por reacción entre el hidrocloruro de dopamina (3) y su homólogo di-O- metilado, homoveratrilamina, (30) con isoselenocianatos aromáticos no comerciales. CUARTA Se han obtenido los primeros selenuros, diselenuros y selenonios de hidroxitirosilo con los hidroxilos del fragmento catecol libres o protegidos con grupos O-acetilo, O-metilo y O-xililenodiilo.
7. Conclusiones 294 QUINTA Se ha abordado la síntesis de nuevas tioureas por reacción entre el hidrocloruro de dopamina (3) con isotiocianatos comerciales. Hemos desarrollado también la transformaciónde dichas tioureas en 2-amino- dihidro- y 2-imino-tetrahidro-1,3-benzotiazepinas por oxidación de las tioureas con 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona (DDQ), y purificación mediante una estrategia de acetilación-desacetilación. SEXTA La mayoría de los nuevos productos sintetizados en esta Tesis han sido ensayados en pruebas in vitro (poder antioxidante de reducción férrica, capacidad de captación de radicales DPPH, capacidad de captación de radicales ABTS, inhibición de la oxidación primaria y secundaria del ácido linoleico), comprobándose que en la mayoría de los casos los nuevos compuestos preparados superan ampliamente la actividad mostrada por el hidroxitirosol (64) de partida. SÉPTIMA Se ha estudiado la inhibición in vitro de la actividad de la enzima tirosinasa por hidroxitirosol (64), 3,4-DHFG (190), y por diversos compuestos obtenidos en este trabajo. Se ha comprobado un efecto de inhibición de la actividad monofenolasa de la enzima al utilizar L-tirosina como sustrato, y selenonio 43 como inhibidor, tanto a una concentración elevada (672 µM, 42.6%) como diluida (11.2 µM, 42.2%). Para el hidroxitirosol, 3,4-DHFG y el diselenuro 42 se llegan a obtener inhibiciones
7. Conclusiones 295 del orden del 29-30%. El diselenuro 42 es activo incluso en el rango nanomolar (50 nM, 12.8 %). OCTAVA Se ha estudiado, utilizando L-DOPA como sustrato, la inhibición de la actividad de difenolasa por hidroxitirosol, 3,4-DHFG y una serie de compuestos preparados en esta Tesis. Se ha comprobado que actúan como moderados inhibidores, siendo la actividad no dependiente de la concentración. NOVENA Se han realizado estudios de inhibición del pardeamiento en manzanas y actividad antimelanósica en camarones con hidroxitirosol (64), 3,4-DHFG (190) y la mayoría de los nuevos compuestos, con resultados negativos para los ensayos de pardeamiento y positivos en la mayoría de los casos para la actividad retardante de la melanosis en camarones. El 3,4- DHFG y el diselenuro 42 mostraron los mejores efectos retardantes a baja concentración (0.001 – 0.05 mM). DÉCIMA Se ha realizado el estudio de la actividad antioxidante ex vivo de las selenoureas 25-27, el selenuro 42, el selenonio 43 y las tioureas 45-49 frente a la degradación de lípidos insaturados de microsomas de hígado de ratas alimentadas con dieta deficiente en vitamina E, comprobándose que la adición las selenoureas 25-27 y del diselenuro 42 suplementan a nivel oxidativo la falta de vitamina E en la dieta durante el tiempo de carencia. El
7. Conclusiones 296 carácter protector de estos compuestos en estos microsomas es muy superior al del hidroxitirosol y al del 3,4-DHFG, que a concentraciones de 0.1−0.25 mM se comportan como prooxidantes. UNDÉCIMA Se ha evaluado la capacidad antitumoral de las selenoureas 26 y 27, el diselenuro 42 y del selenonio 43 como inductores de apoptosis en las líneas celulares A-375 (melanoma), SF-268 (glioblastoma) y NCI-H460 (cáncer de pulmón). Todos los selenocompuestos analizados han resultado ser mucho más activos que el HT. Frente a A-375 y SF-268 el más activo resultó ser 42 (IC 50 0.48 y 0.36 µM) y frente a NCI-H460 el selenonio 43 (IC 50 , 1.07 µM) DUODÉCIMA Se ha desarrollado una estrategia sintética para la síntesis de los isoxazoles 62 y 63 a partir de aldehídos aromaticos y heteroaromaticos por reacción con nitroacetato de etilo, utilizando el catalizador CeCl 3 ·7H 2 O−NaI/SiO 2 en reacciones sin disolvente.
7. Conclusiones 297 8. CONCLUSIONS FIRST A new strategy in three steps for the synthesis of dopamine (3) from hydroxytyrosol has been developed, without protection of aromatic hydroxyl groups via azido derivative 2, or in four steps through hydroxyl protection with a xylylenodiyl group. SECOND Syntheses of O-β-D-glucopyranosyl and O-β-D-galactopyranosyl derivatives of dopamine, as non resolved regioisomer mixtures, have been carried out. THIRD The first selenoureas derived from dopamine have been prepared by coupling of dopamine hydrochloride (3) or its di-O-methyl derivative, homoveratrylamine, (30) with non-commercial aromatic isoselenocyanates. FOURTH The syntheses of hydroxytyrosyl selenides, diselenides and selenonia having the catechol moiety free or protected with O-acetyl, O-methyl and O-xylylenediyl groups have been developed. FIFTH The synthesis of new thioureas by coupling of dopamine hydrochloride (3) with commercial isothiocyanates has been accomplished. We have also studied the transformation of those thioureas into 2-amino-
7. Conclusiones 298 dihydro and 2-imino-tetrahydro-1,3-benzothiazepines by thiourea oxidation with 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone (DDQ). The heterocyclic compounds were purified following a acetylation/deacetylation strategy. SIXTH The antioxidant and antiradical activities of most of the new compounds prepared in this thesis have been tested in vitro following different assays (ferric-reducing antioxidant power assay, DPPH free radical scavenging capacity method, ABTS free radical scavenging method, inhibition of primary and secondary oxidation of linoleic acid). Most of the new compounds showed to be more active than starting hydroxytyrosol (64). SEVENTH The in vitro inhibition of tyrosinase by hydroxytyrosol (64), 3,4- dihydroxyphenylglycol (190), and a series of the new compounds obtained in this thesis has been studied. Monophenolase has been strongly inhibited using tyrosine as substrate, and selenonium 43 as inhibitor, at high and low concentrations (672 µM, 42.6%; 11.2 µM, 42.2%). Inhibitions of about 29- 30% are obtained with HT, 3,4-DHPG and diselenide 42. The last one is active in the nanomolar range (50 nM, 12.8%). EIGHTHT The inhibition of diphenolase activity of tyrosinase has been assessed using L-DOPA as substrate and hydroxytyrosol, 3,4-DHPG, and a
7. Conclusiones 299 series of synthesized compounds as inhibitors. Moderate inhibitions in a no concentration-dependent manner have been observed. NINTH Anti-browning of apples and antimelanosic activity on small shrimps by hydroxytyrosol (64), 3,4-dihydroxyphenylglycol (190) or most of the new compounds showed negative results for the browning assays and effective retarding melanosis on shrimps. The 3,4-DHPG and the diselenide 42 showed the best retarding effects at low concentrations (0.001 – 0.05 mM). TENTH Ex vivo antioxidant activity of selenoureas 25-27, selenide 42, selenonium 43 and thioureas 45-49 against unsaturated lipid degradation of rat liver microsomes fed with a vitamin E deficient diet has been checked. The results indicated that the addition of selenoureas and selenide supplements, at oxidative levels, the lack of vitamin E in the diet during the deprivation period. The protective nature shown by these compounds in the microsomes is much higher than the one shown by hydroxytyrosol and by 3,4-dihydroxyphenylglycol, which at 0.1−0.25 mM behave as pro-oxidants. ELEVENTH Antitumor activity of selenoureas 26 and 27, diselenide 42 and selenonium 43 has been evaluated by studying induced apoptosis in A-375 (melanoma), SF-268 (glioblastoma) and NCI-H460 (lung cancer) cell lines. The selenocompounds were found to be much more active than
7. Conclusiones 300 hydroxytyrosol; diselenide 42 was the most active against A-375 and SF- 268 cell lines (IC 50 0.48 and 0.36 µM), whereas selenonium 43 was the most active against NCI-H460 (IC 50 1.07 µM). TWELFTH A synthetic strategy for the synthesis of isoxazoles 62 and 63 from aromatic and heteroaromatic aldehydes by reaction with ethyl nitroacetate, using CeCl 3 ·7H 2 O−NaI/SiO 2 as catalyst in solvent-free reactions, has been developed.
8. Materiales y métodos 295 ͺǤ2
8. Materiales y métodos 309 Bencil isotiocianato (Sigma Aldrich) Bicarbonato sódico (Sigma Aldrich) Borohidruro sódico (Merk) Bromuro de 3,4-dihidroxifenetilo (Sigma Aldrich) Bromuro de tetrabutilamonio (Sigma Aldrich) Butanol (Sigma-Aldrich) Butanona (Panreac) Butil isotiocianato (Sigma Aldrich) Carbonato cálcico (Sigma Aldrich) Carbonato potásico (Sigma Aldrich) Cloruro de hierro (II) tetrahidrato (Sigma-Aldrich) Cloruro de hierro (III) (Sigma-Aldrich) Cloruro de terc-butildifenilsililo (Sigma Aldrich) Cloruro de p-tolueno-4-sulfonilo (Sigma Aldrich) Cloruro potásico (Scharlau) Cloruro sódico (Panreac) Diclorometano (SDS) Dihidrógenofosfato de sodio (Panreac) Dimetilformamida (Panreac) Dioxano (Sigma-Aldrich) Dopamina hidrocloruro (Acros Organics) Etanol (Panreac) Éter dietílico (SDS) Fenil isotiocianato (Sigma Aldrich)
8. Materiales y métodos 310 Ferrocianuro potásico (Merk) Ferrozina (Sigma-Aldrich) Formanilida (Acros Organics) Formiato de etilo (Panreac) Hexano (SDS) Hidrogenofosfato de disodio (Panreac) Hidrosulfito sódico (Sigma Aldrich) Hidróxido de paladio sobre carbón activo (Sigma Aldrich) Hidróxido de potasio (Riedel-de Haën) Hidróxido de sodio (SDS) Imidazol (Sigma Aldrich) Lauril sulfato sódico (SDS) (Merk) L-DOPA (Sigma-Aldrich) Metanol (Sigma Aldrich) Metil isotiocianato (Sigma Aldrich) Nitrato sódico (Sigma Aldrich) Paladio sobre carbón activo (Sigma Aldrich) Peroxodisulfato de potasio (Sigma-Aldrich) Piridina (Panreac) Potasio dihidrógeno fosfato (Sigma-Aldrich) p-Tolil isotiocianato (Sigma Aldrich) Selenio negro (Merk) Sulfato magnésico (Panreac) TBAB (Sigma Aldrich)
8. Materiales y métodos 311 Tetrabromuro de carbono (Sigma Aldrich) Tetrahidrofurano (Acros Organics) Tiocianato potásico (Sigma-Aldrich) Tirosina (Sigma-Aldrich) Tirosinasa de hongos (Sigma-Aldrich) Tolueno (Sigma Aldrich) Toluidina (Scharlau) Tribromuro de boro (Acros Organics) Trietilamina (Sigma Aldrich) Trifenilfosfina (Panreac) Trifosgeno (Acros Organics) Yema de huevo liofilizada (Sigma-Aldrich) 8.4. MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE. 8.4.1.- Poder de reducción del hierro. Se usó la modificación del método de Psarra y col. 559 por Jiménez y col. 560 Se empleó FeCl 3 como oxidante. Para la determinación del poder reductor se utilizó un lector de microplacas Bio-Rad iMark. En cada pocillo se añadieron por cuadruplicado 10 µL de cada estándar y 10 µL de FeCl 3 6 mM en ácido cítrico 5 mM. Para cada muestra se incluyó un blanco sin 559 Psarra, E.; Makris, D. P.; Kallithraka, S.; Kefalas, P. J. Sci. Food Agric. 2002, 82, 1014- 1020. 560 Jiménez, A.; Rodríguez, R.; Jaramillo, S.; Rodríguez, G.; Espejo, J.A.; Guillén, R.; Fernández-Bolaños J., Heredia, A. J. Agric. And Food Chem., 2005, 53, 5212-5217.
8. Materiales y métodos 312 FeCl 3 . La placa se incubó durante 20 minutos a 50 ºC. A continuación se agregaron 180 µL de un disolución de bipiridilo 5 g/L en ácido tricloroacético 1.2%, y transcurridos otros 30 minutos se procedió a la lectura de la placa a 490 nm. Para expresar los resultados se estableció una curva de calibración representando la absorbancia a 490 nm (A 490 ) frente la recta patrón del Trolox [Coeficiente de correlación (R) = 0.9936]. El poder reductor (P R ) se expresó como equivalentes Trolox (mM o µM Trolox) de la ecuación obtenida por regresión linear: P R = 1.932 x A 490 – 177.48 8.4.2.- Actividad antirradical La medida de captación de radicales DPPH se llevó a cabo utilizando el método de Sánchez-Moreno 561 con las modificaciones de Jiménez y col. 2 Alícuotas de 5 µL de muestra a diferentes concentraciones y 195 µL de la disolución de DPPH · (3.8 mg de DPPH en 50 mL de metanol) se adicionaron a los pocillos por triplicado. Para cada muestra se incluyó un blanco con metanol en lugar de DPPH · . Transcurridos 30 minutos desde la adición del radical, se procedió a la lectura de la placa a 490 nm en un lector de microplacas Bio-Rad iMark. Para cada muestra se expresó el descenso de la absorbancia (expresada como porcentaje de la absorbancia inicial). La concentración 561 Sánchez-Moreno, C.; Larrauri, J. A.; Saura-Calixto, F. J. Sci. Food Agric.,1998, 76, 270-276.
8. Materiales y métodos 313 eficiente EC 50 representa la cantidad de antioxidante necesaria para provocar una disminución de la absorbancia inicial del 50 %, y fue calculada a partir de una curva de calibración por regresión linear. El EC 50 se expresó en términos de la concentración (mM). A menores valores del EC 50 mayor actividad antirradical de la muestra. La capacidad de captación de radicales ABTS · fue determinada mediante los métodos descritos por Re y col. 562 y Gülçin 563 pero modificados para lector de placas Bio-Rad iMark por Gonçalves y col. 564 Se mezclaron 10 mL de una disolución 7 mM de 2,2’-azino-bis(3- etilbenzotiazilina-6-sulfonato) (ABTS) con 10 mL de persulfato de potasio (K 2 S 2 O 8 ), y la mezcla se mantuvo entre 12-16 horas al abrigo de la luz a temperatura ambiente. 200 µL del radical formado se diluyeron en 10 mL de etanol 80 %, etanol 96% o buffer fosfato sódico 0.1 M, pH 7.4, ajustando la absorbancia de la disolución resultante a 0.700±0.025. En las placas se añadieron 13 µL de muestra (o disolvente para el blanco), y 187 µL de la disolución de ABTS · por triplicado. Para cada muestra se incluyó un blanco con EtOH o buffer PBS en lugar del radical y se incluyó una muestra de oxidación total con disolvente (sin muestra). Transcurridos 30 minutos se procedió a la lectura de la absorbancia a tres longitudes de onda diferentes, 414, 655 y 750 nm. El resultado se expresa como la media de los cocientes de las pendientes de la rectas obtenidas para cada muestra con las calculadas para el Trolox a cada una de esas tres longitudes de onda. 562 Re, R.; Pellegrini, N.; Proteggente, A.; Pannala, A.; Yang, M., Rice-Evans, C. Free Radical Biol. & Med., 1999, 26, 1231–1237. 563 Gülçin, I. Chem-Biol Interact. 2009, 179, 71-80. 564 Gonçalves, B.; Falco, V.; Moutinho-Pereira, J.; Bacelar, E.; Peixoto, F.; Correia, C. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 265-273.
8. Materiales y métodos 314 Las rectas correspondientes al Trolox aparecen reflejadas en la Tabla 7.1: Tabla 7.1: Rectas obtenidas para el Trolox por el método del ABTS · Trolox EtOH 80 % PBS 415 nm y= 373,05x - 0,0191 y= 355,52x - 0,2500 655 nm y= 369,43x + 0,9805 y= 341,42x + 1,6749 750 nm y= 376,75x - 0,1317 y= 339,86x + 1,1966 8.4.3.- Inhibición de la oxidación primaria del ácido linoleico en emulsión. Método del tiocianato férrico. Este método se ha usado para la medida de la inhibición de la oxidación primaria (fase inicial de la peroxidación lipídica) según Mitsuda y col., 565 con algunas modificaciones. A 25 µL de la muestra se añaden 5 µL de ABAP (2,2'- Azobis(2-metil-propionamidina) dihidrocloruro) 0.07 M en agua, como iniciador de la reacción de oxidación, y 2 mL de una emulsión de ácido linoleico 1.3 mM con SDS 0.1 M en buffer fosfato 0,01 M (pH 7.4). Se prepara un blanco (sin ácido linoleico) para cada muestra. También se hace conjuntamente y por triplicado un ensayo de oxidación total (sin muestra). La mezcla se agita y se calienta a 50 °C. Después de 15.5 horas, se añaden 100 µL de tiocianato amónico al 30 % y 100 µL de FeCl 2 0,02 M en HCl 3.5 %. Durante la oxidación del ácido linoleico, se producen los peróxidos que oxidan el Fe 2+ a Fe 3+ . Los iones Fe 3+ forman un complejo de 565 Mitsuda, H.; Yasumoto, K.; Iwami, K. Eiyo to Shokuryo, 1996, 19, 210–214.
8. Materiales y métodos 315 color rojo con el tiocianato que tiene un máximo de absorbancia a 490 nm. Se mide la absorbancia de las soluciones coloreadas a esta longitud de onda en el lector de microplacas Bio-Rad iMark (Hercules, CA, EE. UU.). Una elevada absorbancia es indicativa de una alta concentración de peróxidos. Las determinaciones se realizan por cuadruplicado. Los resultados se expresan en función el EC 50 (mM), entendiéndose como la cantidad de producto necesaria para reducir la oxidación primaria en un 50%, y también del porcentaje de reducción 1 mM, siendo éste el grado de inhibición que produce el antioxidante el antioxidante ensayado a una concentración 1 mM. 8.4.4.- Inhibición de la oxidación secundaria del ácido linoleico en emulsión. Método del ácido tiobarbitúrico (TBA). El método se basa en la medida de la cantidad de malondialdehído (MDA), un subproducto formado en sistemas de lipoperoxidación. Para la determinación se usa la reacción del malondialdehído con el ácido tiobarbitúrico. Se sigue el procedimiento que se describe en Moon y col. , 566 con modificaciones. A 25 µL de muestra se añaden 5 µL de ABAP 0,07 M en agua y 1 mL de una emulsión de ácido linoleico 5,2 mM con SDS 0,1 M en buffer fosfato 0,01 M (pH 7,4). Se prepara un blanco (sin ácido linoleico) para cada muestra. También se hace conjuntamente y por triplicado un ensayo de oxidación total (sin muestra). La mezcla se agita y se calienta a 50 °C. Después de 24 horas de incubación, se toman 100 µL de la mezcla de reacción y se añaden 100 µL de ácido tricloroacético al 2,8 % (p/v) en agua y 100 µL de ácido tiobarbitúrico al 0,8 % en SDS 1,1 %. Esta mezcla se 566 Moon, J.K.; Shinamoto, T. J Agric Food Chem. 2009, 57, 1655–1666.
8. Materiales y métodos 316 agita vigorosamente en Vortex y se calienta a 90 °C durante 20 minutos. Después se enfría en baño de hielo durante 10 minutos, se añade 0,5 mL de n-butanol, se agita y centrifuga a 12000 rpm durante 3 minutos. La fase de butanol se separa después de la centrifugación y se mide la absorbancia de las soluciones coloreadas a 540 nm. Los resultados se dan como promedio de cuatro replicados. Los resultados se expresan en función el EC 50 (mM), entendiéndose como la cantidad de producto necesaria para reducir la oxidación primaria en un 50%, y también del porcentaje de reducción 1 mM, siendo éste el grado de inhibición que produce el antioxidante ensayado a una concentración 1 mM. 8.4.5. Inhibición de la peroxidación en microsomas. Obtención de los microsomas. Los microsomas se prepararon 567 a partir de hígados de machos de rata Lister Hooded (Cepa del Insituto Rowett) de la Universidad de Aberdeen (Escocia), alimentados con una dieta semisintética deficiente en vitamina E durante 12 semanas. A aproximadamente 10 g de hígado se añadieron 25 mL de KCl 0.154 M y se homogeneizó. Se centrifugó durante 20 minutos a 12000 rpm, descartando el pellet. El sobrenadante se centrifugó a 35000 rpm durante 1 hora. Se desechó el sobrenadante, y el pellet se disolvió resuspendiéndolo en KCl 0.154 M y se centrifugó nuevamente durante una hora a 35000 rpm. El pellet se redisolvió en 567 Lim, V.S.; Henriquez, C.; Seo, H.; Refetoff, S.; Mertigo, E.J. J. Clin. Invest., 1980, 66, 946-954.
8. Materiales y métodos 317 tampón fosfato pH 7.4 0.05 M y se calculó su concentración de proteínas por el método de Biuret, ajustando la misma a 10 mg/mL. Tratamiento de los microsomas con antioxidantes A una suspensión de 500 µL de microsomas se añadieron 20 µL de disoluciones de antioxidantes en etanol a concentraciones finales de 0.250 mM, 0.100 mM y 0.050 mM. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos y se congeló a -80 ºC hasta su posterior uso. Producción de malondialdehído en microsomas de hígados de rata. Se incubaron 100 µL de microsomas con 4.9 mL de tampón fosfato potásico 0.05 M pH 7.4, conteniendo ácido ascórbico 0.5 mM, Fe 2+ y ADP 2 mM. La incubación se hizo en un baño de agua a 37 ºC. Después de 0, 5, 10 y 20 minutos se tomó 1 mL de disolución y se añadió sobre 1 mL de ácido tricloroacético al 20 %. A continuación se adicionó 1 mL de ácido tiobarbitúrico 2 µM y 2 mL de agua y se hirvió durante 30 minutos. Después de enfriar en agua-hielo se inyectaron las muestras en un HPLC Waters 2695, equipado con una columna Luna 5µ, C18 100A 150x4.6 mm. Flujo 0.8 mL/min y tiempo total 13 minutos, enfriador ajustado a 4 ºC, detector a 30 ºC, volumen de inyección 50 µL. La fase móvil es 60 % KH 2 PO 4 50 mM pH 7.0 y 40 % MeOH. Los resultados se compararon con los obtenidos para una curva patrón de malondialdehído.
8. Materiales y métodos 318 Preparación de las muestras de microsomas para la determinación del contenido de proteínas y fenoles totales. Se añadieron 120 µL de las disoluciones 6.25 mM de antioxidantes a ensayar sobre 3 mL de microsomas de ratas sometidas a una dieta deficiente en vitamina E (-VE), estableciendo un control con hígados de rata alimentadas normalmente (+VE), de modo que la concentración final de antioxidante en microsomas sea 0.250 mM. Las muestras se agitaron durante 30 minutos en un agitador de rodillos, y se almacenaron congeladas a -80 ºC hasta su posterior uso. Tras descongelarlas se separó 1 mL de microsomas (microsomas totales), y el resto se centrifugó a 37000 g durante 1h, a temperatura 4 ºC. Se decantó el sobrenadante (microsomas sobrenadante) y el pellet (microsomas pellet) se redisolvió en 1 mL del tampón fosfato pH 7.4 0.05M.. Determinación del contenido de proteínas en microsomas de hígados de rata. Se determinó el contenido de proteínas en microsomas totales, microsomas del sobrenadante y microsomas del pellet. Se realizó por el método de Biuret frente a una recta patrón de albúmina de suero bovino. Se añadieron 4 mL de reactivo de Biuret a 1 mL de muestra o estándar, se agitó en vortex y se dejó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se leyó a 540 nm en un espectrofotómetro frente a un blanco con 1 mL de agua destilada, y se compararon los resultados con los obtenidos para la recta de la albúmina de suero bovino 1-10 mg, y = 0.0561x + +0.0012, r 2 = 0.9996.
8. Materiales y métodos 325 disolución a reflujo de la formamida 133 (100 mg, 0.61 mmol) y Et 3 N (0.73 mL, 5.25 mmol; 4.3 equiv.) en CH 2 Cl 2 seco (4 mL), con tamiz molecular de 4 Å y bajo atmósfera de Ar. Finalizada la adición, la mezcla se calienta a reflujo durante 2 h, se añade Se negro (192 mg, 2.44 mmol; 2.0 equiv.) y se calienta a reflujo en la oscuridad durante 3 h. A continuación, se filtra sobre un lecho de Celita, se concentra a sequedad y se purifica mediante cromatografía en columna (hexanoĺhexano−Et 2 O 1:1). Rendimiento: 148 mg, 85 %.
8. Materiales y métodos 326 8.6. NUEVAS INVESTIGACIONES 8.6.1. SÍNTESIS DE DOPAMINA Y GLICODERIVADOS DE DOPAMINA A PARTIR DE HIDROXITIROSOL 8.6.1.1 4-(2-Bromoetil)benceno-1,2-diol (1) HO HO Br Una disolución enfriada a 0 ºC de hidroxitirosol (500 mg, 3.246 mmol), tetrabromuro de carbono (6.491 mmol, 1.958 g, 2 equiv.), trifenilfosfina (9.737 mmol, 2.688 g, 3 equiv.) y ascorbato sódico (3.246 mmol, 642.8 mg, 1 equiv.) en DMF (10 mL), bajo atmósfera de argón, se agitó una hora a 0 ºC, y seguidamente otras 7 horas a t.a.. Se concentró a sequedad, y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna (AcOEt-hexano 1:20 ĺ AcOEt-hexano 1:5), obteniéndose el bromuro como un sólido. Rendimiento 564 mg, 80 %; R F 0.28 AcOEt/hexano (1:2); p.f.: 76-78 ºC. IR (KBr): ν max : 3439, 3323, 2926, 1617, 1531, 1449, 1375, 1269, 1210, 1122, 944, 863, 820, 790, 760 cm -1 . 1 H-RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ 6.81 (d, J 5,6 8.0 Hz, 1H, H-6), 6.73 (d, J 3,5 1.8 Hz, 1H, H-3), 6.65 (dd, J 5,6 8.0 Hz, J 3,5 1.8 Hz, 1H, H-5), 5.20 (s.a., 2H, OH), 3.51 (t, J 1’,2’ 7.6 Hz, 2H, CH 2 Br), 3.04 (t, J 1’,2’ 7.6 Hz, 2H, CH 2 Ar), ppm.
8. Materiales y métodos 327 13 C-RMN (75.5 MHz, CDCl 3 ): 143.6 (C-2), 142.3 (C-1), 132.1 (C-4), 121.2 (C-5), 115.8 (C-6), 115.5 (C-3), 38.7 (CH 2 Br), 33.2 (CH 2 Ar) ppm. EIMS m/z 346 ([M] + , 27%), 137 ([M-Br] + , 23%). HREIMS Calc. para C 8 H 9 79 BrO 2 ([M+] + ): 215.9786. Encontrado: 215.9793. 8.6.1.2. 4-(2-Azidoetil)benceno-1,2-diol (2) HO HO N 3 A una disolución de 1 (400 mg, 1.843 mmol) en etanol:agua (15 mL:1.5 mL), se añadió NaN 3 (2.764 mmol, 174.7 mg) y ascorbato sódico (1.843 mmol, 365.2 mg), y la mezcla se agitó a 55 ºC en atmósfera de argón durante 5 horas. Se concentró a sequedad, y el residuo bruto se pasó por una columna cromatográfica (hexano ĺ AcOEt/Hexano 1:4), dando 2 como un aceite oscuro muy viscoso. Rendimiento 287 mg, 87 %. R F 0.51 AcOEt/hexano (1:1). IR (KBr): ν max : 3330, 2931, 2105, 1689, 1527, 1259, 796 cm - 1 . 1 H-RMN (300 MHz, MeOH-d 4 ): δ 6.69 (d, J 5,6 8.0 Hz, 1H, H-6), 6.67 (d, J 3,5 2.1 Hz, 1H, H-3), 6.55 (dd, J 5,6 8.0 Hz, J 3,5 2.1 Hz, 1H, H-5), 3.41 (t, J CH2,CH2 7.1 Hz, 2H, CH 2 N 3 ), 2.72 (t,
8. Materiales y métodos 328 J CH2,CH2 7.1 Hz, 2H, CH 2 Ar) ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, MeOH-d 4 ): 146.3 (C-2), 145.0 (C-1), 131.2 (C- 4), 121.1 (C-5), 116.9 y 116.4 (C-6 y C-3), 53.9 (CH 2 N 3 ), 35.7 (CH 2 Ar) ppm. EIMS m/z 179 ([M] + , 20%), 123 ([M – CH 2 N 3 ] + , 100%). HREIMS Calc. para C 8 H 9 N 3 O 2 (M + ): 179.0695 Encontrado: 179.0694. 8.6.1.3. Dopamina hidrocloruro (3) HO HO NH 2 .HCl PROCEDIMIENTO A A una disolución de 2 (100 mg, 0.355 mmol) en etanol (3mL) se añadió HCl 2N (0.32 mL, 6.4 mmol) y una cantidad catalítica de paladio sobre carbón al 10 % (40 mg). Se desoxigenó la mezcla con nitrógeno y se hidrogenó a presión atmosférica y a temperatura ambiente durante 3 horas. Se filtró sobre un lecho de celita, lavando con etanol. Se disolvió en agua (50 mL) y se lavó con 3x20 mL de diclorometano. La fracción acuosa se concentró a sequedad, obteniendo 3 como un sólido blanco. Rendimiento 66 mg, 98 %. R F 0.61 (AcOEt/AcOH/MeOH/H 2 O 6:2:1:1).
8. Materiales y métodos 329 PROCEDIMIENTO B A una disolución de 6 (200 mg, 1.438 mmol) y paladio sobre carbón al 10 % (150 mg) en etanol (8 mL) se añadió HCl en EtOH 2N (3.62 mL, 7.24 mmol, 5 equivalentes). Se desoxigenó con nitrógeno y se hidrogenó a presión atmosférica en la oscuridad a temperatura ambiente durante 3 horas. Se filtró sobre celita y se concentró a sequedad. Se disolvió en la mínima cantidad de etanol y se fue añadiendo éter etílico hasta turbidez. Se dejó toda la noche a baja temperatura y se filtró el producto, que aparece como un sólido de color pardo. Rendimiento 136 mg, 50 %. R F 0.61 (AcOEt/AcOH/MeOH/H 2 O 6:2:1:1). p.f.: 235-240 ºC (Lit. 568 248-250 ºC) IR ν max : 3330, 3039, 2957, 1619, 1597, 1502, 1347, 1322, 1177, 1114, 814 cm -1 . 1 H-RMN (300 MHz, MeOH-d 4 ): δ 6.74 (d, J 5,6 7.9 Hz, 1H, H-6), 6.70 (d, J 3,5 2.0 Hz, 1H, H-3), 6.58 (dd, J 5,6 7.9 Hz, J 3,5 2.0 Hz, 1H, H-5), 3.10 (m, 2H, CH 2 NH 2 .HCl), 2.81 (m, 2H, CH 2 Ar) ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, MeOH-d 4 ): 146.7 (C-2), 145.6 (C-1), 129.1 (C- 4), 121.0 (C-5), 116.8 y 116.7 (C-6 y C-3), 42.2 (CH 2 NH 2 ), 33.9 (CH 2 Ar) ppm. 568 Kohno, M.; Sasa, S.; Murahashi, S. I. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1990, 63, 1252-1254.
8. Materiales y métodos 330 CIMS m/z 154 ([M] + , 72%), 137 ([M – NH 3 + ] + , 100%). HRCIMS Calc. para C 8 H 12 NO 2 (M + ): 154.0868 Encontrado: 154.0871. 8.6.1.4. 2-[3,4-(o-Xililendioxi)fenil]etanol (4) O OOH A una disolución de hidroxitirosol (100 mg, 0.649 mmol) en etanol (5 mL) y agua (0.5 mL) se añadió Į,Į’-dicloroxileno (0.649 mmol, 113.7 mg) y carbonato potásico (1.291 mmol, 189.4 mg), y la mezcla se agitó a reflujo durante una hora. Transcurrido ese tiempo se concentró a sequedad, se disolvió en agua (50 mL) y se extrajo con 3x35 mL de AcOEt. Las fracciones orgánicas se unieron y se lavaron con 2x50 mL de cloruro sódico saturado, se secaron con sulfato magnésico y se concentró a sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (hexanoĺAcOEt/hexano 1:2) obteniendo 4 como un sólido blanco. Rendimiento 86 mg, 52 %. R F 0.56 AcOEt/hexano (2:1); p.f.: 100-102 ºC. IR (KBr): ν max : 3427, 3251, 3028, 2931, 2868, 2406, 1583, 1503, 1450, 1377, 1283, 1044, 992, 746 cm -1 . 1 H-RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ 7.22 (m, 4H, H-3’, H-4’, H-5’ y H-6’), 6.87 (d, J 5,6 8.1 Hz, 1H, H-5), 6.81 (d, J 2,6 2.0 Hz, 1H, H-2), 6.63 (dd, J 2,6 2.0 Hz, J 5,6 8.1 Hz, 1H, H-6), 5.39 y 5.35 (2 s, 2x2H, CH 2 OAr), 3.66 (t, J CH2,CH2 7.0 Hz, 2H, CH 2 OH), 2.67
8. Materiales y métodos 331 (t, J CH2,CH2 7.0 Hz, 2H, CH 2 Ar), ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, CDCl 3 ): 150.7 (C-3), 149.1 (C-4), 137.5 y 137.1 (C-1’ y C-2’), 136.2 (C-1), 130.5, 129.9, 129.6 y 129.5 (C- 3’, C-4’, C-5’ y C-6’), 125.0 (C-6), 123.1 y 122.8 (C-2 y C- 5), 76.2 y 75.6 (2xCH 2 OAr), 64.1 (CH 2 OH), 39.4 (CH 2 Ar) ppm. FABMS m/z 256 ([M] + , 8%), 279 ([M+Na] + , 28%) HRFABMS Calc. para C 16 H 16 O 3 Na ([M+Na] + ): 279.0997. Encontrado: 279.0987. 8.6.1.5. 4-(2-Bromoetil)-1,2-(o-xililenodioxi)benceno (5) O OBr Una disolución de 4 (500 mg, 1.951 mmol), tetrabromuro de carbono (3.901 mmol, 1.307 g, 2 equivalentes) y trifenilfosfina (5.852 mmol, 1.551 g, 3 equivalentes) en acetonitrilo (15 mL), bajo atmósfera de argón, se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. Se concentró a sequedad, y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna (hexanoĺAcOEthexano 1:30), obteniéndose el bromuro 5 como un aceite muy viscoso. Rendimiento 492 mg, 79 %. R.f.: 0.69 AcOEt/hexano (1:2).
8. Materiales y métodos 332 IR (KBr): ν max : 2925, 2859, 1736, 1578, 1500, 1451, 1375, 1287, 1199, 1010, 749 cm -1 . 1 H-RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ 7.27 (m, 2H, H-3’y H-6’), 7.19 (m, 2H, H-4’ y H-5’), 6.94 (d, J 5,6 8.2 Hz, 1H, H-6), 6.83 (d, J 3,5 2.1 Hz, 1H, H-3), 6.74 (dd, J 3,5 2.1 Hz, J 5,6 8.2 Hz, 1H, H-5), 5.41 y 5.38 (2 s, 2x2H, CH 2 OAr), 3.49 (t, J CH2,CH2 7.7 Hz, 2H, CH 2 Br), 3.03 (t, J CH2,CH2 7.7 Hz, 2H, CH 2 Ar), ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, CDCl 3 ): 149.8 (C-2), 148.6 (C-1), 135.9 y 135.6 (C-1’ y C-2’), 134.5 (C-4), 129.2, 128.8, 128.5 y 128.4 (C- 3’, C-4’, C-5’ y C-6’), 123.6 (C-5), 122.0 y 121.9 (C-3 y C- 6), 75.4 y 75.1 (2xCH 2 O), 38.7 (CH 2 Ar), 32.7 (CH 2 Br) ppm. FABMS m/z 318 ([M] + , 7%), 239 ([M - Br] + , 8%). HRFABMS Calc. para C 16 H 15 O 2 79 Br ([M] + ): 318.0255. Encontrado: 318.0257. 8.6.1.6. 4-(2-Azidoetil)-1,2-(o-xililenodioxi)benceno (6) O ON 3 A una disolución de 5 (150 mg, 0,472 mmol) en dimetilformamida (5 mL), se añadió azida sódica (0.949 mmol, 61.3 mg), y la mezcla se agitó a 55 ºC durante 4 horas. Se eliminó el disolvente en bomba de aceite, se lavó con diclorometano y se concentró a sequedad. El crudo obtenido se
8. Materiales y métodos 333 purificó por cromatografía en columna (hexanoĺAcOEt/hexano 1:10), obteníendose 6 como un aceite viscoso. Rendimiento 110 mg, 83 %; R F 0.38 AcOEt/hexano (1:10). IR (KBr): ν max : 3447, 2924, 2859, 2094, 1688, 1534, 1258, 1005, 791 cm -1 . 1 H-RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ 7.27 (m, 2H, H-3’ y H-6’), 7.18 (m, 2H, H-4’ y H-5’), 6.94 (d, J 5,6 8.1 Hz, 1H, H-6), 6.84 (d, J 3,5 2.1 Hz, 1H, H-3), 6.75 (dd, J 3,5 2.1 Hz, J 5,6 8.1 Hz, 1H, H-5), 5.41 y 5.38 (2 s, 2x2H, CH 2 OAr), 3.43 (t, J CH2,CH2 7.2 Hz, 2H, CH 2 N 3 ), 2.76 (t, J CH2,CH2 7.2 Hz, 2H, CH 2 Ar), ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, CDCl 3 ): 149.9 (C-2), 148.6 (C-1), 136.0 y 135.7 (C-1’ y C-2’), 133.8 (C-4), 129.4, 128.9, 128.7 y 128.6 (C- 3’, C-4’, C-5’ y C-6’), 123.8 (C-5), 122.2 y 122.1 (C-3 y C- 6), 75.6 y 75.2 (2xCH 2 O), 52.5 (CH 2 N 3 ), 34.7 (CH 2 Ar) ppm. EIMS m/z 281 ([M] + , 15%), 225 ([M – CH 2 -CH 2 -N 3 ] + , 7%). HREIMS Calc. para C 16 H 15 N 3 O 2 ([M] + ): 281.1164. Encontrado: 281.1160.
8. Materiales y métodos 334 8.6.1.7. 4-[2-[terc-butildifenilsililoxi]etil]benceno-1,2-diol (7) HO HO OSi Ph Ph A una disolución de hidroxitirosol (400 mg, 2.594 mmol) e imidazol (3.113 mmol, 214.1 mg) en dimetilformamida seca (5 mL), bajo atmósfera de argón, se añadió cloruro de t-butildifenilsililo (3.113 mmol, 826 µL) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3.5 horas. Se concentró a sequedad en bomba de aceite y 7 se aisló puro del crudo de reacción por cromatografía en columna (HexanoĺAcOEt/Hexano 1:5). Rendimiento 815 mg, 80 %. R F 0.27 AcOEt/Hexano (1:3). p.f.: 82-87 ºC. IR ν max : 3243, 2957, 2930, 2853, 1606, 1519, 1445, 1359, 1276, 1106, 1087, 811 700 cm -1 . 1 H-RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ 7.59 (m, 4H, H-2’y H-6’), 7.37 (m, 6H, H-3’, H-4’ y H-5’), 6.74 (d, J 5,6 8.0 Hz, 1H, H-6), 6.63 (d, J 3,5 1.9 Hz, 1H, H-3), 6.57 (dd, J 3,5 1.9 Hz, J 5,6 8.0 Hz, 1H, H-5), 5.06 (sa, 2H, OH), 3.79 (t, J CH2,CH2 7.0 Hz, 2H, CH 2 OSi), 2.73 (t, J CH2,CH2 7.0 Hz, 2H, CH 2 Ar), 1.02 (s, 9H, 3xCH 3 ) ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, CDCl 3 ): 143.2 (C-2), 141.8 (C-1), 135.6 (C-2’ y C-6’), 133.8 (C-1’), 132.2 (C-4), 129.6 (C-4’), 127.6 (C-3’ y C-5’), 121.8 (C-5), 117.2 (C-6), 115.1 (C-3), 65.3 (CH 2 OSi),
8. Materiales y métodos 341 1 H-RMN (500 MHz, CDCl 3 ) į 7.73 (m, 4H, H-2 y H-6 Ts 13 y 14), 7.32 (m, 4H, H-3 y H-5 Ts 13 y 14), 7.07 y 7.04 (2 d, 2x1H, J 5,6 8.4 Hz, H-3 13 y H-6 14), 7.02, 6.88 (2 dd, 2x1H, J 5,6 8.4 Hz, H-4 13 y H-5 14), 7.01, 7.00 (2 d, 2x1H, J 3,5 2 Hz, H-6 13 y H-3 14), 5.23, 5.22 (2 m, 2x1H, J 3,4 2.1 Hz, J 3,2 1.7 Hz, H-3 Glc 13 y 14), 5.12 (m, 2H, H-2 Glc 13 y 14), 5.09 (m, 2H, J 4,5 9 Hz, H-4 Glc 13 y 14) , 4.91, 4.90 (2 d, 2x1H, J 1,2 7.9 Hz, H-1 Glc 13 y 14), 4.23, 4.21 (2 m, 2x1H, J 6a,6b 2.6 Hz, J 6a,5 12.0 Hz, H-6a Glc 13 y 14), 4.18, 4.14 (2 m, 2x1H, J 6b,5 12.3 Hz, H-6b Glc 13 y 14), 3.77 (m, 2H, H-5 Glc 13 y 14), 3.45 (m, 4H, CH 2 N 3 a y b), 2.82, 2.78 (2 t, 2x2H, CH 2 Ar 13 y 14), 2.47, 2.46 (2 s, 2x3H, CH 3 13 y 14), 2.11, 2.10, 2.08, 2.07, 2.04 (s, 24H, CH 3 Ac 13 y 14) ppm. 13 C-RMN (125.7 MHz,CDCl 3 ) δ 170.4, 170.1, 169.6, 169.4 ( C=O), 149.1, 147.9, (C-1 y C-2 13 y 14), 145.4, 145.3 (C-1 Ts 13 y 14) 139.5 y 138.4 (C-4 Ts 13 y 14), 134.2, 132.8 (C-5 13 y C-4 14), 129.9 (C-3 y C-5 Ts 13 y 14), 128.9 (C-2 y C-6 Ts 13 y 14), 128.2, 124.3 (C-4 13 y C-5 14), 125.7, 119.6 (C-6 13 y C-3 14), 124.2, 119.0 (C-3 13 y C-6 14), 99.8 (C-1 Glc 13 y 14), 72.3 (C-3 Glc 13 y 14), 72.2 (C-5 Glc 13 y 14), 70.8 (C-2 Glc 13 y 14), 68.3 (C-4 Glc 13 y 14), 62.1 (C-6 Glc 13 y 14), 52.1, 51.9 (CH 2 N 3 13 y 14), 35.2, 34.5 (CH 2 Ar 13 y 14), 21.9 (CH 3 Ts 13 y 14), 20.8 (CH 3 Ac 13 y 14) ppm. FABMS m/z 663 ([M] + , 5%), 686 ([M+Na] + , 15%).
8. Materiales y métodos 342 HRFABMS Calc. para C 29 H 33 N 3 O 13 NaS ([M+Na] + ): 686.1632. Encontrado: 686.1646. 8.6.1.12. 5-(2-Azidoetil)-2-tosiloxifenil 2,3,4,6-tetra-O-acetil-ȕ-D- galactopiranósido (15) y 4-(2-azidoetil-2)-tosiloxifenil 2,3,4,6-tetra-O- acetil-ȕ-D-galactopiranósido (16). O O A c AcO O OAc O A c TsO N 3 O OAc AcO O OAc OAc TsO N 3 15 16 Se obtuvo a partir de Į-acetobromo galactosa. El bruto de reacción se purificó por cromatografía en columna (Et 2 O-Hexano 1:4ĺ Et 2 O- Hexano 2:1), obteniéndose la mezcla de 15 y 16 como un sólido de color blanco. Rendimiento 1.12 g, 94 %. R F 0.30 (Et 2 O/Hexano 5:1). p.f.: 42-48 ºC. ሾߙሿ ଶସ : -24 (c 1.0, CH 2 Cl 2 ). IR (KBr) ν max : 3471, 2932, 2876, 2103, 1751, 1602, 1510, 1374, 1228, 1071, 810 cm -1 . 1 H-RMN (500 MHz, CDCl 3 ) į 7.76 (m, 4H, H-2 y H-6 Ts 15 y 16), 7.32 (m, 4H, H-3 y H-5 Ts 15 y 16), 7.08 y 7.03 (2d, 2x1H, J 5,6 8.4 Hz, H-3 15 y H-6 16), 7.01 y 6.85 (2dd, 2x1H, J 5,6 8.4 Hz, H-4 15 y H-5 16), 7.00 y 6.94 (2d, 2x1H, J 3,5 2 Hz, H-6 15 y H-6 16), 5.43 (m, 4H, H-3 y H-2 Gal 15 y 16), 5.07 y 5.05 (2dd, 2x1H, J 3,4 3.3 Hz, J 4,5 0.9 Hz, H-4 Gal 15 y 16),
8. Materiales y métodos 343 4.91 y 4.89 (2d, 2x1H, J 1,2 8.0 Hz, H-1 Gal 15 y 16 ), 4.18, 4.17, 4.12 (m, 4H, H-6a y H-6b Gal 15 y 16), 3.99 (m, 2H, H-5 Gal 15 y 16), 3.47 y 3.42 (m, 4H, CH 2 N 3 15 y 16), 2.82, 2.77 (t, 2x2H, CH 2 Ar 15 y 16), 2.46, 2.45 (s, 2x3H, CH 3 15 y 16), 2.20, 2.12, 2.05, 2.04, 2.01 (s, 24H, CH 3 Ac 15 y 16) ppm. 13 C-RMN (125.7 MHz,CDCl 3 ) δ 170.3, 170.1, 170.0, 169.7 ( C=O 15 y 16), 149.1, 147.9, (C-1 y C-2 15 y 16), 145.4, 145.3 (C-1 Ts 15 y 16) 139.3 y 138.2 (C-4 Ts 15 y 16), 134.0, 132.5 (C-5 15 y C-4 16), 129.6 (C-3 y C-5 Ts 15 y 16), 128.8 (C-2 y C- 6 Ts 15 y 16), 128.0 y 124.0 (C-4 15 y C-5 16), 124.0 y 119.6 (C-6 15 y C-3 16), 124.0 y 119.1 (C-3 15 y C-6 16), 100.3 (C-1 Gal 15 y 16), 71.2 y 71.0 (C-3 Glc 15 y 16), 70.9 y 70.8 (C-5 Gal 15 y 16), 68.0 (C-2 Glc 15 y 16), 66.9 y 66.8 (C-4 Gal 15 y 16), 61.5 y 61.2 (C-6 Gal 15 y 16), 52.3, 52.1 (CH 2 N 3 a y b), 35.0 y 34.4 (CH 2 Ar 15 y 16), 21.7 (CH 3 Ts a y b), 20.8, 20.7, 20.6 y 20.5 (CH 3 Ac 15 y 16) ppm. FABMS m/z 662 ([M-H] + , 2%), 686 ([M+Na] + , 20%). HRFABMS Calc. para C 29 H 33 N 3 O 13 NaS ([M+Na] + ): 686.1632. Encontrado: 686.1627. Procedimiento general para la obtención de los derivados glicosilados 17, 18 y 19, 20.
8. Materiales y métodos 344 A una disolución mezcla de regioisómeros 17 y 18, ó 19 y 20 (500 mg, 0.753 mmol) en metanol (12 mL), bajo atmósfera de nitrógeno, se añadió una disolución desoxigenada de KOH 0.47 M en metanol (4.9 mmol, 10.4 mL), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 7 horas. Pasado ese tiempo se neutralizó a pH próximo a 6 con ácido clorhídrico diluido en etanol, y se concentró a sequedad. 8.6.1.13. 5-(2-Azidoetil)-2-hidroxifenil ȕ-D-glucopiranósido (17) y 4-(2- azidoetil)-2-hidroxifenil ȕ-D-glucopiranósido (18). O HO HO O OH O H HO N 3 O HO HO O OH OH HO N 3 17 18 Se obtuvo a partir de la desprotección de la mezcla de regiosiómeros 13 y 14. El bruto de reacción se purificó por cromatografía en columna (CH 2 Cl 2 ĺCH 2 Cl 2 -MeOH 20:1), obteniéndose 17 y 18 como un aceite muy viscoso. Rendimiento 159 mg, 62 %. R F 0.50 (CH 2 Cl 2 /MeOH 5:1). ሾߙሿ ଶ : -44.0 (c 1.1, MeOH). IR (KBr) ν max : 3377, 2925, 2876, 2102, 1654, 1593, 1512, 1439, 1280, 1071, 1038, 1014, 805 cm -1 . 1 H-RMN (500 MHz, MeOH-d 4 ) į 7.12 y 6.78 (2d, 2x1H, J 5,6 8.2 Hz, H-3 17 y H-6 18), 7.11 y 6.76 (2d, 2x1H, J 3,5 2.1 Hz, H-6 17 y H-3 18), 6.81 y 6.67 (2dd, 2x1H, H-4 17 y H-5 18), 4.75 y
8. Materiales y métodos 345 4.72 (2d, 2x1H, J 1,2 7.5 Hz, H-1 Glc 17 y 18 ), 3.90 (m, 2H, J 5,6a 1.9 Hz, J 6a,6b 12.1 Hz, H-6a Glc 17 y 18), 3.72 (m, 2H, J 5,6b 4.9 Hz, H-6b 17 y 18), 3.44 (m, 12H, H-2, H-3, H-4, H- 5 Glc y CH 2 N 3 17 y 18), 2.77, 2.76 (2t, 2x2H, CH 2 Ar 17 y 18) ppm. 13 C-RMN (125.7 MHz, MeOH-d 4 ) 148.5, 147.1, 146.7, 145.6, (C-1 y C-2 17 y 18), 135.6, 131.5 (C-5 17 y C-4 18), 125.1 y 121.2 (C-4 17 y C-5 18), 119.4, 119.1, 117.6, 117.1 (C-3 y C-6 17 y 18), 104.6 y 104.4 (C-1 Glc 17 y 18), 78.3, 77.6 (C-3 y C- 5 Glc 17 y 18), 74.9, (C-2 Glc 17 y 18) 71.4 y 71.3 (C-4 Glc 17 y 18), 62.5 y 62.4 (C-6 Glc 17 y 18), 53.6 (CH 2 N 3 17 y 18), 35.7 y 35.6 (CH 2 Ar 17 y 18) ppm. FABMS m/z 364 ([M+Na] + , 23%), 341 ([M] + , 6%). HRFABMS Calc. para C 14 H 19 N 3 O 7 Na ([M+Na] + ): 364.1121. Encontrado: 364.1118 8.6.1.14. 5-(2-Azidoetil)-2-hidroxifenil ȕ-D-galactopiranósido (19) y 4-(2- azidoetil)-2-hidroxifenil ȕ-D-galactopiranósido (20). O OH HO O OH O H HO N 3 O OH HO O OH O H HO N 3 19 20 Se obtuvo a partir de la desprotección de 15 y 16 siguiendo el procedimiento descrito en el apartado anterior. El bruto de reacción se
8. Materiales y métodos 346 purificó por cromatografía en columna (CH 2 Cl 2 ĺCH 2 Cl 2 /MeOH 20:1), obteniéndose la mezcla 19 y 20 como un sólido de color blanco. Rendimiento 111 mg, 43 %. R F : 0.48 (CH 2 Cl 2 -MeOH 5:1). p.f.: 47-50 ºC. ሾߙሿ ଶ : -39 (c 1.1, MeOH). IR ν max : 3330, 2928, 2874, 2100, 1595, 1508, 1439, 1274, 1044, 807 cm -1 . 1 H-RMN (500 MHz, MeOH-d 4 ) į 7.13 y 6.78 (2d, 2x1H, J 5,6 8.2 Hz, H-3 19 y H-6 20), 7.12 y 6.75 (2d, 2x1H, J 3,5 2.1 Hz, H-6 19 y H-3 20), 6.81 y 6.67 (2dd, 2x1H, H-4 19 y H-5 20), 4.70 y 4.67 (2d, 2x1H, J 1,2 7.8 Hz, H-1 Gal 19 y 20), 3.89 (2dd, 2x2H, J 3,4 3.5 Hz, J 4,5 0.9 Hz, H-4 Gal 19 y 20), 3.83 y 3.82 (m,2H, J 2,3 9.7 Hz, H-2 Gal 19 y 20), 3.81 y 3.79 (m, 2H, J 5,6a 7.0 Hz, J 6a,6b 11.5 Hz, H-6a Gal 19 y 20), 3.75 (m, J 5,6b 7.0 Hz, H-6b Gal 19 y 20), 3.66 y 3.63 (m, 2H, H-5 Gal 19 y 20), 3.45 (t, 4H, J CH2,CH2 7.0 Hz, CH 2 N 3 ), 2.77, 2.76 (t, 2x2H, CH 2 Ar 19 y 20) ppm. 13 C-RMN (125.7 MHz, MeOH-d 4 ) 148.7, 147.3, 146.8, 145.6, (C-1 y C-2 19 y 20), 135.6, 131.4 (C-5 19 y C-4 20), 125.1 y 121.2 (C-4 19 y C-5 20), 119.6, 119.3, 117.6, 117.1 (C-3 y C-6 19 y 20), 105.4 y 105.1 (C-1 Gal 19 y 20), 77.2 y 77.1 (C-5 Gal 19 y 20), 74.6 (C-3 Gal 19 y 20), 72.4, (C-2 Gal 19 y 20), 70.2 (C-4 Gal 19 y 20), 62.4 y 62.3 (C-6 Gal 19 y 20), 53.6 (CH 2 N 3 19 y 20), 35.7 y 35.6 (CH 2 Ar 19 y 20) ppm.
8. Materiales y métodos 347 FABMS m/z 364 ([M+Na] + , 100%), 341 ([M] + , 3%). HRFABMS Calc. para C 14 H 19 N 3 O 7 Na ([M+Na] + ): 364.1121. Encontrado: 364.1133 Procedimiento general para la obtención de los O-glicósidos de dopamina 21, 22 y 23, 24. La mezcla de regioisómeros 17 y 18 ó 19 y 20 (150 mg, 0.438 mmol) se disolvió en EtOH (4 mL), se añadió paladio sobre carbón (40 mg), y se desgasificó con nitrógeno. Se hidrogenó a temperatura ambiente durante 3 horas. Transcurrido ese tiempo se filtró sobre Celita, se añadió HCl 2N (0,438 mmol, 219 µL, 1 equiv) y se concentró a sequedad. 8.6.1.15. 5-(2-Aminoetil)-2-hidroxifenil ȕ-D-glucopiranósido hidrocloruro (21) y 4-(2-aminoetil)-2-hidroxifenil ȕ-D-glucopiranósido hidrocloruro (22). O HO HO O OH O H HO NH 2 .HCl O HO HO O OH OH HO NH 2 .HCl 2 1 2 2 Se obtuvo a partir de la mezcla de regiosiómeros 17 y 18. El producto obtenido no precisó más purificación, obteniéndose un sólido de color blanco. Rendimiento 128 mg, 83 %. R F : 0.23 (AcOEt/MeOH/AcOH/H 2 O 6:2:1:1). p.f.: 72-74 ºC. ሾߙሿ ଶସ : -37 (c 1.0, MeOH).
8. Materiales y métodos 348 IR ν max : 3277, 2928, 1653, 1513, 1440, 1385, 1228, 1070, 1036, 805 cm -1 . 1 H-RMN (500 MHz, MeOH-d 4 ) į 7.17 y 6.82 (2d, 2x1H, J 5,6 8.2 Hz, H-3 21 y H-6 22), 7.11 y 6.79 (2d, 2x1H, J 3,5 2.0 Hz, H-6 21 y H-3 22), 6.84 y 6.70 (2dd, 2x1H, H-4 21 y H-5 22), 4.75 y 4.72 (2d, 2x1H, J 1,2 7.5 Hz, H-1 Glc 21 y 22), 3.92 y 3.93 (2dd, 2H, J 5,6a 2.2 Hz, J 6a,6b 11.9 Hz, H-6a Glc 21 y 22), 3.70 (m, 2H, J 5,6b 6.5 Hz, H-6b Glc 21 y 22), 3.49 (m, 2H, J 2,3 9.2 Hz, H-2 Glc 21 y 22), 3.47 (m, J 3,4 8.6 Hz, H-3 Glc 21 y 22), 3.39 (m, 2H, H-5 Glc 21 y 22), 3.34 (m, 2H, H-4 Glc 21 y 22) y 3.14 y 3.13 (2t, 2x2H, J CH2CH2 7.0 Hz, CH 2 NH 2 a y b), 2.86, 2.85 (2t, 2x2H, CH 2 Ar 21 y 22) ppm. 13 C-RMN (125.7 MHz, MeOH-d 4 ) 148.9, 147.6, 146.9, 146.0, (C-1 y C-2 21 y 22), 133.4, 129.3 (C-5 21 y C-4 22), 124.6 y 121.1 (C-4 21 y C-5 22), 119.4, 119.0, 117.4, 116.7 (C-3 y C-6 21 y 22), 104.5 y 104.1 (C-1 Glc 21 y 22), 78.5, 78.4, 77.6 (C-3 y C-5 Glc 21 y 22), 74.8 (C-2 Glc 21 y 22) 71.6 y 71.3 (C-4 Glc 21 y 22), 62.7 y 62.4 (C-6 Glc 21 y 22), 43.0 (CH 2 NH 2 21 y 22), 34.0 y 33.9 (CH 2 Ar 21 y 22) ppm. FABMS m/z 316 ([M+H] + , 34%), 338 ([M+Na] + , 42%). HRFABMS Calc. para C 14 H 22 NO 7 ([M+H] + ): 316.1396. Encontrado: 316.1394.
8. Materiales y métodos 349 8.6.1.16. 5-(2-Aminoetil)-2-hidroxifenil ȕ-D-galactopiranósido hidrocloruro (23) y 4-(2-aminoetil)-2-hidroxifenil ȕ-D-galactopiranósido hidrocloruro (24). O O H HO O OH O H HO NH 2 .HCl O O H HO O OH OH HO NH 2 .HC l 2 3 24 Se obtuvo a partir de la mezcla de 19 y 20 siguiendo el procedimiento descrito en el apartado anterior. El sólido blanco obtenido no precisó más purificación, aunque se obtuvo cristalino por recristalización de EtOH-Éter. Rendimiento 151 mg, 98 %. R F : 0.23 (AcOEt/MeOH/AcOH/H 2 O 6:2:1:1). p.f.: 117-120 ºC. ሾߙሿ ଶସ : -19 (c 1.1, MeOH). IR ν max : 3326, 2966, 2924, 2894, 1599, 1512, 1439, 1390, 1279, 1065, 1041, 881 cm -1 . 1 H-RMN (500 MHz, MeOH-d 4 ) įҏ7.20 y 6.77 (2d, 2x1H, J 5,6 8.0 Hz, H-3 23 y H-6 24), 7.15 y 6.73 (2d, 2x1H, J 3,5 2.0 Hz, H-6 23 y H-3 24), 6.81 y 6.73 (2dd, 2x1H, H-4 23 y H-5 24), 4.72 y 4.70 (2d, 2x1H, J 1,2 7.5 Hz, H-1 Gal 23 y 24), 3.92 (dd, 2x2H, J 3,4 3.5 Hz, J 4,5 0.9 Hz, H-4 Gal 23 y 24), 3.86 y 3.85 (m, 2H, J 2,3 9.7 Hz, H-2 Gal 23 y 24), 3.80 y 3.79 (m, 2H,
8. Materiales y métodos 350 J 5,6a 7.0 Hz, J 6a,6b 11.5 Hz, H-6a Glc a y b ), 3.73 (m, J 5,6b 7.0 Hz, H-6b Gal 23 y 24), 3.63 y 3.64 (m, 2H, H-5 Gal 23 y 24), 3.16 y 3.15 (t, 4H, J CH2,CH2 7.0 Hz, CH 2 N 3 ), 2.89 y 2.88 (t, 2x2H, CH 2 Ar 23 y 24) ppm. 13 C-RMN (125.7 MHz, MeOH-d 4 ) 149.1, 147.8, 146.8, 146.0 (C-1 y C-2 23 y 24), 133.5, 131.4 (C-5 23 y C-4 24), 125.0 y 121.1 (C-4 23 y C-5 24), 119.7, 119.4, 116.8, 116.7 (C-3 y C-6 23 y 24), 105.2 y 104.8 (C-1 Gal 23 y 24), 77.4 y 77.2 (C-5 Gal 23 y 24), 74.6 (C-3 Gal 23 y 24), 72.4, (C-2 Gal 23 y 24) 70.3, 70.2 (C-4 Gal 23 y 24), 66.1 y 64.5 (C-6 Gal 23 y 24), 42.2, 42.0 (CH 2 NH 2 23 y 24), 34.0 y 33.9 (CH 2 Ar 23 y 24) ppm. FABMS m/z 316 ([M+H] + , 15%), 338 ([M+Na] + , 23%). HRFABMS Calc. para C 14 H 22 NO 7 ([M+H] + ): 316.1396. Encontrado: 316.1394. 8.6.2. SÍNTESIS DE SELENOUREAS, SELENUROS Y DISELENUROS DE HIDROXITIROSOL Procedimiento general para la obtención de selenoureas derivadas del hidroxitirosol A una disolución de clorhidrato de dopamina (300 mg, 1.582 mmol) y del isoselenocianato correspondiente (1.2 equiv), en metanol (20 mL) se añadió trietilamina (1.582 mmol, 220 µL) y la mezcla se agitó en oscuridad a temperatura ambiente y bajo atmósfera de argón durante una hora. Se
8. Materiales y métodos 357 30. Rendimiento 219 mg, 50 %. R F 0.06 (CH 2 Cl 2 :MeOH 5:1). IR ν max : 2995, 2914, 2836, 1683, 1574, 1512, 1400, 1240, 1026, 804, 653 cm -1 . 1 H-RMN (300 MHz, MeOH-d 4 ): δ 6.91 (d, J 5,6 8.1 Hz, 1H, H-6), 6.88 (d, J 3,5 2.0 Hz, 1H, H-3), 6.81 (dd, J 3,5 2.0 Hz, 1H J 5,6 8.1 Hz, 1H, H-5), 3.83 y 3.80 (2s, 2x3H, OMe), 3.13 (m, 2H, CH 2 NH 2 ), 2.89 (m, 2H, CH 2 Ar) ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, MeOH-d 4 ): 150.7 (C-2), 149.6 (C-1), 130.8 (C- 4), 122.2 (C-5), 113.6 y 113.4 (C-6 y C-3), 55.9 (2 OMe), 42.1 (CH 2 NH 2 ), 34.4 (CH 2 Ar) ppm. CIMS m/z 181 ([M] + , 18%). HRCIMS Calc. para C 10 H 15 NO 2 (M + ): 181.1098 Encontrado: 181.1103 31. Rendimiento 167 mg, 40 %; R F 0.73 CH 2 Cl 2 /MeOH (5:1); p.f.: 76-78 ºC. IR (KBr): ν max : 3314, 2995, 2934, 2829, 2360, 1699, 1590, 1517, 1451, 1334, 1260, 1141, 1028, 807, 764 cm -1 . 1 H-RMN (300 MHz, DMSO-d 6 ): δ 6.81 (d, J 5,6 8.1 Hz, 2H, H-5), 6.78 (d, J 2,6 1.9 Hz, 2H, H-2), 6.67 (dd, J 5,6 8.1 Hz, J 3,5 1.9 Hz, 2H, H-6), 3.71 y 3,70 (2 s, 12H, OMe), 2,74 (t, J CH2,CH2 7.0 Hz, 4H, CH 2 NH), 2.71 (t, J CH2,CH2 7.0 Hz, 4H, CH 2 Ar), 1.24
8. Materiales y métodos 358 (s.a., 1H, NH) ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, CDCl 3 ): 148.9 (C-3), 147.4 (C-4), 132.4 (C-1), 120.5 (C-6), 111.9 (C-5), 111.3 (C-2), 55.9 y 55.8 (OMe), 51.2 (CH 2 NH), 35.8 (CH 2 Ar) ppm. FABMS m/z 346 ([M+H] + , 89%), 368 ([M+Na] + , 46%). HRFABMS Calc. para C 20 H 27 NO 4 Na ([M+Na] + ): 368.1838. Encontrado: 368.1827. Procedimiento general para la obtención de las selenoureas O-metiladas derivadas de hidroxitirosol 32-34. A una disolución de 4-(2-aminoetil)-1,2-dimetoxibenceno 30 (100 mg, 0.552 mmol) en diclorometano (5 mL) se añadió el isolenocianato correspondiente (1.01 equivalentes), la mezcla se agitó en oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos y se concentró a sequedad. 8.6.2.7. 1-(3,4-Dimetoxifenetil)-3-fenil selenourea (32) MeO MeO N Se N H H Se obtuvo a partir de isoselenocianato de fenilo 129. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (CH 2 Cl 2 ĺCH 2 Cl 2 -MeOH 80:1), obteniéndose un sólido de color rosa pálido.
8. Materiales y métodos 359 Rendimiento 158 mg, 79 %; R F 0.33 CH 2 Cl 2 /MeOH (80:1); p.f.: 128-132 ºC. IR (KBr): ν max : 3346, 3151, 2997, 2834, 1591, 1541, 1516, 1451, 1398, 1291, 1265, 1158, 1140, 1028, 885 cm -1 1 H-RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ 8.02 (s.a., 1H, NHAr), 7.30 (m, 3H, H-3’, H-4’ y H-5’), 6.98 (m, 2H, H-2’y H-6’), 6.74 (d, J 5,6 7.8 Hz, 1H, H-5), 6.64 (m, 2H, H-2 y H-6), 6.23 (s.a., 1H, NHCH 2 ), 3.95 (c, J CH2,NH 6.3 Hz, J CH2,CH2 6.6 Hz, 2H, CH 2 NH), 3.86 y 3.81 (2 s, 2x3H, OMe), 2.87 (t, J CH2,CH2 6.6 Hz, 2H, CH 2 Ar), ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, CDCl 3 ): 178.7 (C=Se), 149.2 (C-3), 147.9 (C-4), 130.6 (C-1), 130.2 (C-3’ y C-5’), 127.7 (C-1’ y C-4’), 125.1 (C-2’ y C-6’), 120.6 (C-6), 111.8 y 111.4 (C-2 y C-5), 56.0 y 55.8 (2xOMe), 49.1 (CH 2 NH), 34.3 (CH 2 Ar) ppm. FABMS m/z 365 ([M+H] + , 32%), 387 ([M+Na] + , 25%). HRFABMS Calc. para C 17 H 20 N 2 O 2 80 Se ([M+H] + ): 365.0768. Encontrado: 365.0765. 8.6.2.8. 1-(3,4-Dimetoxifenetil)-3-(p-tolil) selenourea (33). MeO M e O H N H N Se M e
8. Materiales y métodos 360 Se obtuvo a partir de isoselenocianato de p-metilfenilo 130. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (CH 2 Cl 2 ĺ CH 2 Cl 2 - MeOH 40:1), obteniéndose un sólido de color blanco. Rendimiento 175 mg, 84 %; R F : 0.35 CH 2 Cl 2 /MeOH (80:1); p.f.: 114-118 ºC. IR (KBr): ν max : 3491, 3342, 3146, 2979, 2834, 1591, 1540, 1459, 1256, 1158, 1026, 809 cm -1 1 H-RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ 8.43 (s.a., 1H, NHAr), 7.08 (m, J o,m 8.1 Hz, 2H, H-3’ y H-5’), 6.86 (m, J o,m 8.1 Hz, 2H, H-2’y H- 6’), 6.71 (d, J 5,6 8.4 Hz, 1H, H-5), 6.62 (m, 2H, H-2 y H-6), 6.17 (s.a., 1H, NHCH 2 ), 3.89 (c, J CH2,NH 6.3 Hz, J CH2,CH2 6.4 Hz, 2H, CH 2 NH), 3.87 y 3.82 (2 s, 2x3H, OMe), 2.82 (t, J CH2,CH2 6.4 Hz, 2H, CH 2 Ar), ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, CDCl 3 ): 178.2 (C=Se), 149.0 (C-3), 147.7 (C-4), 137.6 (C-1’), 132.7 (C-1), 130.6 (C-3’, C-1 y C-5’), 125.1 (C-2’ y C-6’), 120.5 (C-6), 111.7 y 111.3 (C-2 y C-5), 55.8 y 55.7 (2xOMe), 48.8 (CH 2 NH), 34.3 (CH 2 Ar), 20.9 (CH 3 Ar) ppm. FABMS m/z 379 ([M+H] + , 42%), 401 ([M+Na] + , 33%) HRFABMS Calc. para C 18 H 23 N 2 O 2 80 Se ([M+H] + ): 379.0925. Encontrado: 379.0928.
8. Materiales y métodos 361 8.6.2.9. 1-(3,4-Dimetoxifenetil)-3-(p-metoxifenil) selenourea (34). MeO MeO H NH N Se OMe Se obtuvo a partir del isoselenocianato de p-metoxifenilo 131. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (CH 2 Cl 2 ĺCH 2 Cl 2 - MeOH 40:1), obteniéndose un sólido amarillento. Rendimiento 180 mg, 83 %; R F 0.15 CH 2 Cl 2 /MeOH (40:1); p.f.: 124-126 ºC. IR (KBr): ν max : 3485, 3343, 3150, 2962, 2837, 1691, 1514, 1461, 1241, 1147, 1029, 806 cm -1 . 1 H-RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ 8.03 (s.a., 1H, NHAr), 6.93 (m, J o,m 8.8 Hz, 2H, H-3’ y H-5’), 6.82 (m, J o,m 8.8 Hz, 2H, H-2’y H- 6’), 6.71 (d, J 5,6 8.0 Hz, 1H, H-5), 6.63 (s, 1H, H-2), 6.60 (d, J 5,6 8.0 Hz, 1H, H-6) 6.01 (s.a., 1H, NHCH 2 ), 3.90 (c, J CH2,NH 6.3 Hz, J CH2,CH2 6.4 Hz, 2H, CH 2 NH), 3.84, 3.81 y 3.79 (3 s, 2x3H, 3OMe), 2.84 (t, J CH2,CH2 6.4 Hz, 2H, CH 2 Ar), ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, CDCl 3 ): 178.9 (C=Se), 159.1 (C-4’), 149.1 (C- 3), 147.8 (C-4), 130.6 (C-1’), 127.7 (C-1), 127.4 (C-2’ y C- 6’), 120.6 (C-6), 115.2 (C-3’ y C-5’), 111.7 y 111.3 (C-2 y C-5), 55.9, 55.8 y 55.4 (3xOMe), 48.8 (CH 2 NH), 34.4
8. Materiales y métodos 362 (CH 2 Ar) ppm. FABMS m/z 395 ([M+H] + , 29%), 417 ([M+Na] + , 34%). HRFABMS Calc. para C 18 H 23 N 2 O 3 80 SeNa ([M+H] + ): 379.0874. Encontrado: 379.0872. 8.6.2.10. 1,1’-(1,4 Fenileno)bis[3-(3,4-dimetoxifenetil) selenoureido] (35) MeO MeO N Se N H H N N Se OMe OMe H H A una disolución de 4-(2-aminoetil)-1,2-dimetoxibenceno 30 (100 mg, 0.483 mmol) en diclorometano (5 mL), se añadió benceno 1,4- diisoselenocianato 134 (0.215 mmol, 61.6 mg) y la mezcla se agitó en oscuridad a temperatura ambiente y bajo atmósfera de argón durante 3 horas. Se concentró a sequedad, y el bruto de reacción se purificó por cromatografía en columna (CH 2 Cl 2 ĺCH 2 Cl 2 /MeOH 20:1), obteniéndose 35 como un sólido amarillento. Rendimiento 93 mg, 67 %. R F 0.28 CH 2 Cl 2 /MeOH (20:1). p.f.: 167-169 ºC. IR ν max : 3258, 3136, 2936, 2830, 1700, 1593, 1536, 1512, 1463, 1337, 1241, 1158, 1129, 1027, 804 cm -1 . 1 H-RMN (300 MHz, DMSO-d 6 ): δ 9.93 (sa, 2H, NHAr), 7.96 (sa, 2H, NHCH 2 ), 7.18 (s, 4H, H-4’y H-5’), 6.88 (d, J 5,6 8.1 Hz, 2H,
8. Materiales y métodos 363 H-5), 6.86 (d, J 2,6 1.3 Hz, 2H, H-2), 6.75 (dd, J 2,6 1.3 Hz, J 5,6 8.1 Hz, 2H, H-6), 3.74 (m, 16H, CH 2 NH y 4 OMe), 2.83 (m, 4H, CH 2 Ar), ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, DMSO-d 6 ): 178.5 (C=Se), 148.7 (C-3), 147.3 (C-4), 135.4 (C-1’ y C-4’), 131.5 (C-1), 124.3 (C-2’, C-3’, C-5’ y C-6’), 120.6 (C-6), 112.5 y 111.0 (C-2 y C-5), 55.4 y 55.6 (OMe), 48.2 (CH 2 NH), 34.0 (CH 2 Ar) ppm. 8.6.2.11. 1,2-Diacetoxi-4-(2-bromoetil) benceno (36). AcO AcO Br A una disolución del 4-(2-bromoetil)benceno-1,2-diol 1 (250 mg, 0.856 mmol) en piridina (2 mL) a 0 ºC, se fue añadiendo gota a gota anhídrido acético (2 mL). Se agitó a 0 ºC durante una hora, y se dejó en congelador toda la noche. Se concentró a sequedad a presión reducida, se disolvió en agua destilada (40 mL) y se extrajo con 3x40 mL de diclorometano. La fracción orgánica se secó sobre MgSO 4 y se concentró a sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (AcOEt-hexano 1:20ĺAcOEt-hexano 1:5), obteniéndose 36 como un aceite amarillento. Rendimiento 237.1 mg, 92 %. R F : 0.42 AcOEt/hex (1:2). IR ν max : 2925, 2848, 1766, 1591, 1507, 1427, 1368, 1256, 1203,
8. Materiales y métodos 364 1175, 1107, 1010, 901 cm - 1 . 1 H-RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ 7.14 (d, J 5,6 8.1 Hz, 1H, H-6), 7.10 (d, J 3,5 1.7 Hz, 1H, H-3), 7.06 (dd, J 3,5 1.7 Hz, J 5,6 8.1 Hz, 1H, H-5), 3.54 (t, J 1’,2’ 7.6 Hz, 2H, CH 2 Br), 3.15 (t, J 1’,2’ 7.6 Hz, 2H, CH 2 Ar), 2.28 (2 s, 2 x 3H, OAc) ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, CDCl 3 ): 168.2 y 168.1 (2 C=O, OAc) 142.0 (C- 2), 140.9 (C-1), 137.6 (C-4), 126.7 (C-5), 123.6 y 123.4 (C-3 y C-6), 38.6 (CH 2 Br), 32.0, (CH 2 Ar) 20.6 (2 CH 3 , OAc) ppm. FABMS m/z 301 ([M+H] + , 45%), 221 ([M-Br] + , 20%). HRFABMS Calc. para C 12 H 14 79 BrO 4 ([M+H] + ): 301.0075. Encontrado: 301.0078. 8.6.2.12. Selenuro de bis(3,4-dimetoxifenetilo) (37) MeO MeO Se OMe OMe A una suspensión enfriada a 0 ºC de selenio negro (150 mg, 1.90 mmol) y NaOH (4.18 mmol, 167.2 mg) en tetrahidrofurano-agua 100:1 (12 mL), bajo atmósfera de argón, se fue añadiendo borohidruro sódico (4.18 mmol, 158.7 mg) en pequeñas porciones. Finalizada la adición se agitó a 0 ºC durante 45 minutos, y otros 45 minutos a temperatura ambiente. Se adicionó bromuro de 3,4-dimetoxifenetilo (1.726 mmol, 436.4 mg) y la reacción se agitó en oscuridad a temperatura ambiente en atmósfera de
8. Materiales y métodos 365 argón durante 3 horas. Se concentró a sequedad, se disolvió en agua (75 mL) y diclorometano (75 mL). Se separó la capa orgánica, y la acuosa se extrajo con 2x75 mL de CH 2 Cl 2 . La fracción orgánica se lavó con 75 mL de cloruro sódico saturado, se secó con sulfato magnésico y se concentró a sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (AcOEt-hexano 1:20ĺAcOEt-hexano 1:3), obteniéndose 37 como un sólido amarillento. Rendimiento 311 mg, 90 %. R F 0.22 AcOEt-hex (1:3). p.f.: 69-72 ºC. IR ν max : 2926, 2838, 1587, 1510, 1441, 1240, 1138, 1024, 857, 807, 765 cm -1 . 1 H-RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ 6.80 (d, J 5,6 8.1 Hz, 2H, H-5), 6.73 (m, 4H, H-2 y H-6), 3.87 y 3.85 (2 s, 4x3H, OMe), 2.90 (m, 4H, CH 2 Ar), 2.78 (m, 4H, CH 2 Se), ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, CDCl 3 ): 148.9 (C-3), 147.6 (C-4), 133.9 (C-1), 120.2 (C-6), 111.7 y 111.3 (C-5 y C-2), 55.9 (OMe), 36.8 (CH 2 Ar), 25.4, (CH 2 Se) ppm. EIMS m/z 409 ([M - H] + , 10%), 433 ([M+Na] + , 30%). HREIMS Calc. para C 20 H 26 O 4 Se ([M+Na] + ): 433.0888. Encontrado: 433.0894.
8. Materiales y métodos 366 8.6.2.13. Diselenuro de bis(3,4-dimetoxifenetilo) (38). MeO MeO OMe OMe Se Se A una suspensión enfriada a 0 ºC de selenio negro (300 mg, 3.800 mmol) y NaOH (8.360 mmol, 334.4 mg) en tetrahidrofurano-agua 100:1 (13.5 mL), bajo atmósfera de argón, se fue añadiendo borohidruro sódico (8.360 mmol, 316.2 mg) en pequeñas porciones. Finalizada la adición se agitó a 0 ºC durante 30 minutos, y otros 30 minutos a temperatura ambiente. Se agregó selenio negro (3.800 mmol, 300 mg), y se continuó la agitación en oscuridad durante 3 horas. Se añadió el bromuro de 3,4-dimetoxifenetilo (1.902 mmol, 480.1 mg) disuelto en tetrahidrofurano (9 mL) y se agitó a temperatura ambiente en oscuridad y atmósfera inerte 2 horas más. Se concentró a sequedad, se disolvió en agua (75 mL) y diclorometano (75 mL), se separó la capa orgánica, y la acuosa se extrajo con 2x75 mL de CH 2 Cl 2 . La fracción orgánica se lavó con 75 mL de cloruro sódico saturado, se secó con sulfato magnésico y se concentró a sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (AcOEt-hexano 1:20ĺAcOEt- hexano 1:3), obteniéndose 38 como un sólido amarillento. Rendimiento 437 mg, 94 %. R F : 0.22 AcOEt-hexano (1:3). p.f.: 74-76 ºC. IR ν max : 2938, 2838, 1587, 1515, 1451, 1418, 1233, 1140, 1025, 852, 814, 766 cm -1 . 1 H-RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ 6.80 (d, J 5,6 7.9 Hz, 2H, H-5), 6.74 (m,
8. Materiales y métodos 373 13 C-RMN (75.5 MHz, MeOH-d 4 ): 146.3 (C-3), 144.8 (C-4), 134.0 (C- 1), 120.6 (C-6), 111.6 y 111.4 (C-2, C-5), 38.0 (CH 2 Ar), 32.3, (CH 2 Se) ppm. CIMS m/z 435 ([M + H] + , 2%, 217 ([M/2] + , 30%). HRCIMS Calc. para C 8 H 9 O 2 80 Se ([M/2] + ): 216.9776. Encontrado: 216.9768. 8.6.2.17. Bromuro de tris(3,4-dihidroxifenetil)selenonio (43). HO H O Se OH O H HO O H Br A una disolución enfriada a -78 ºC de selenuro de bis(3,4- dimetoxifenetilo) 37 (250 mg, 0.623 mmol) en diclorometano seco (8.5 mL), en atmósfera de argón y con tamiz molecular de 4 Å, se añadió tribromuro de boro (2.489 mmol, 235 µL) y la mezcla se agitó en oscuridad a -78 ºC durante 30 minutos, y una hora a temperatura ambiente. Se adicionó 1 mL de agua y se agitó 15 miuntos más. Se concentró a sequedad y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna (CH 2 Cl 2 ĺCH 2 Cl 2 -MeOH 25:1), obteniéndose 43 como un aceite marrón muy viscoso. Rendimiento 238 mg, 67 %. R F : 0.39 CH 2 Cl 2 -MeOH (10:1).
8. Materiales y métodos 374 IR ν max : 3325, 2928, 2825, 1701, 1604, 1507, 1438, 1347, 1278, 1182, 1104, 1012, 783 cm -1 . 1 H-RMN (300 MHz, MeOD): δ 6.67 (d, J 5,6 8.0 Hz, 3H, H-5), 6.63 (d, J 3,5 2.0 Hz, 3H, H-2), 6.50 (dd, J 3,5 2.0 Hz, J 5,6 8.0 Hz, 3H, H-6), 2.76 (m, 6H, CH 2 Se), 2.68 (m, 6H, CH 2 Ar), ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, MeOD): 146.1 (C-3), 144.6 (C-4), 134.6 (C-1), 120.7 (C-6), 116.6 y 116.3 (C-2 y C-5), 37.9 (CH 2 Ar), 26.1, (CH 2 -Se) ppm. CIMS m/z 491 ([M + ], 10%). HRFABMS Calc. para C 24 H 27 O 6 80 Se ([M] + ): 491.0967. Encontrado: 491.0973. 8.6.2.18. Bromuro de tris(3,4-diacetoxifenetil)selenonio (44). Se AcO OAc OAc OAc AcO AcO Br A una disolución de bromuro de tris(3,4-diacetoxifenetil)selenonio 43 (50 mg, 0.0877 mmol) y en piridina (1 mL), enfriada a 0 ºC se añadió anhídrido acético (1 mL) y la mezcla se agitó en oscuridad a durante 15 minutos. Se guardó en el congelador durante toda la noche. Se añadió 1 mL
8. Materiales y métodos 375 de H 2 O y se concentró a sequedad. Se purificó por cromatografía en columna (hexanoĺAcOEt-hexano 1:3), obteniéndose 44 como un aceite viscoso amarillento. Rendimiento 55 mg, 76 %. R F 0.50 AcOEt-hexano (1:1). IR ν max : 2928, 2851, 1763, 1502, 1426, 1370, 1254, 1203, 1173, 1104, 1008, 828 cm -1 . 1 H-RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ 7.09 (m, 6H, H-5 y H-2), 7.02 (m, 3H, H-6), 2.94 (m, 6H, CH 2 Ar), 2,78 (m, 6H, CH 2 Se), 2.28 (s, 6x3H, OAc) ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, CDCl 3 ): 168.3 y 168.2 (2 C=O, OAc) 141.9 (C- 3), 140.5 (C-4), 140 (C-1), 126.6 (C-6), 123.3 (C-2 y C-5), 36.5 (CH 2 Ar), 24.6 (CH 2 Se) 20.6 (6 CH 3 , OAc) ppm. CIBMS m/z 743 ([M] + , 10%). HREIMS Calc. para C 36 H 39 O 12 80 Se ([M] + ): 743.1607. Encontrado: 743.1660
8. Materiales y métodos 376 8.6.3. TIOUREAS DERIVADAS DE DOPAMINA. REACCIONES CON DDQ Y FORMACIÓN DE 2-AMINO-1,3-BENZOTIAZEPINAS. Procedimiento general para la obtención de las tioureas derivadas de dopamina 45-49. A una disolución de clorhidrato de dopamina (300 mg, 1.582 mmol) y del isotiocianato comercial correspondiente (1.2 equivalentes) en metanol (20 mL) se añadió trietilamina (1.582 mmol, 220 µL) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente y bajo atmósfera de argón durante una hora. Se concentró a sequedad, y el crudo de reacción se purificó por cromatografía en columna. 8.6.3.1. 1-(3,4-Dihidroxifenetil)-3-metiltiourea (45). HO H O H N H N S Me Se obtuvo a partir de metilisotiocianato comercial. Se purificó por cromatografía en columna (CH 2 Cl 2 ĺCH 2 Cl 2 /MeOH 20:1), obteniéndose 45 como un sólido blanco. Rendimiento 226 mg, 63 %. R F 0.16 CH 2 Cl 2 /MeOH (20:1). p.f.: 105-107 ºC. IR ν max : 3326, 3258, 2928, 2860, 1696, 1604, 1560, 1519, 1439, 1352, 1284, 1187, 1114, 1017, 813 cm -1 . 1 H-RMN (300 MHz, MeOD): δ 6.68 (m, 2H, H-2 y H-5), 6.54 (dd, J 2,6 2.0 Hz, J 5,6 8.0 Hz, 1H, H-6), 3.60 (sa, 2H, CH 2 NH), 2,89
8. Materiales y métodos 377 (sa, 3H, CH 3 ), 2.72 (m, 2H, CH 2 Ar), ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, MeOD): 183.2 (C=S), 146.3 (C-3), 144.8 (C-4), 132.0 (C-1), 121.1 (C-6), 116.9 y 116.4 (C-2 y C-5), 47.0 (CH 2 NH), 35.7 (CH 2 Ar), 30.7 (CH 3 ) ppm. CIMS m/z 227 ([M+H] + , 24%), 211 ([M-CH 3 ] + , 22%). HRCIMS Calc. para C 10 H 15 N 2 O 2 S ([M+H] + ): 227.0854. Encontrado: 227.0856 8.6.3.2. 1-Butil-3-(3,4-dihidroxifenetil)tiourea (46). HO HO N S N H H Se obtuvo a partir de butilisotiocianato comercial. Se purificó por cromatografía en columna (CH 2 Cl 2 ĺCH 2 Cl 2 /MeOH 25:1), obteniéndose 46 como un sólido blanco. Rendimiento 177 mg, 42 %. R F : 0.16 CH 2 Cl 2 -MeOH (20:1). p.f.: 95-96 ºC. IR ν max : 3220, 3055, 2959, 2923, 2866, 1607, 1571, 1514, 1455, 1347, 1278, 1199, 966, 781 cm -1 . 1 H-RMN (300 MHz, MeOH-d 4 ): δ 6.68 (m, 2H, H-2 y H-5), 6.54 (dd, J 2,6 2.0 Hz, J 5,6 8.0 Hz, 1H, H-6), 3.62 (m, 2H, ArCH 2 CH 2 NH), 3.38 (m, 2H, CH 3 (CH 2 ) 2 CH 2 ), 2.71 (t, J CH2,CH2 7.2 Hz, 2H, CH 2 Ar), 1.51 (m, 2H, CH 3 CH 2 CH 2 ,
8. Materiales y métodos 378 1.34 (m, 2H, CH 3 -CH 2 ), 0.94 (t, 3H, J CH3,CH2 7.3 Hz, CH 3 ) ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, MeOH-d 4 ): 182.8 (C=S), 146.3 (C-3), 144.8 (C- 4), 132.0 (C-1), 121.1 (C-6), 116.9 y 116.4 (C-2 y C-5), 46.9 (ArCH 2 CH 2 NH), 44.9 (NHCH 2 -Alifático), 35.7 (CH 2 Ar), 32.9 (CH 2 -CH 2 -CH 3 ), 21.1 (CH 2 -CH 3 ) ppm. CIMS m/z 269 ([M+H] + , 100%), 211 ([M-Bu] + , 3%). HRCIMS Calc. para C 13 H 21 N 2 O 2 S ([M+Na] + ): 269.1324. Encontrado: 269.1324 8.6.3.3. 1-(3,4-Dihidroxifenetil)-3-(p-tolil)tiourea (47). HO HO N S N H H Me Se obtuvo a partir de p-tolilisotiocianato comercial. Se purificó por cromatografía en columna (CH 2 Cl 2 ĺCH 2 Cl 2 -MeOH 25:1), obteniéndose 47 como un sólido blanco. Rendimiento 354 mg, 74 %. R F .: 0.25 CH 2 Cl 2 -MeOH (20:1). p.f.: 151-153 ºC. IR (KBr): ν max : 3351, 3190, 2971, 2922, 2870, 1598, 1542, 1509, 1448, 1349, 1276, 1188, 781 cm -1 .
8. Materiales y métodos 379 1 H-RMN (300 MHz, MeOH-d 4 ): δ 7.13 (m, 2H, H-3’y H-5’), 6.99 (m, 2H, H-2’y H-6’), 6.67 (d, J 5,6 8.0 Hz, 1H, H-5), 6.65 (d, J 2,6 2.0 Hz, 1H, H-2), 6.50 (dd, J 2,6 2.0 Hz, J 5,6 8.0 Hz, 1H, H-6), 3.72 (t, J CH2,CH2 7.0 Hz, 2H, CH 2 NH), 2.74 (t, J CH2,CH2 7.0 Hz, 2H, CH 2 Ar), 2.31 (s, 3H, CH 3 ) ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, MeOH-d 4 ): 181.7 (C=Se), 146.4 (C-3), 144.9 (C-4), 137.3 (C-1’), 136.2 (C-4’), 131.8 (C-1), 131.0 (C-3’ y C-5’), 126.0 (C-2’ y C-6’), 121.1 (C-6), 116.9 y 116.5 (C-2 y C-5), 47.2 (CH 2 NH), 35.2 (CH 2 Ar) 21.0 (CH 3 ), ppm. CIMS m/z 303 [M+H] + , 18%. HRCIMS Calc. para C 16 H 19 N 2 O 2 S ([M+H] + ): 303.1167. Encontrado: 303.1156 8.6.3.4. 1-Bencil-3-(3,4-dihidroxifenetil)tiourea (48). HO HO N S N H H Se obtuvo a partir de bencilisotiocianato comercial. Se purificó por cromatografía en columna (CH 2 Cl 2 ĺCH 2 Cl 2 -MeOH 25:1), obteniéndose 48 como un sólido blanco. Rendimiento 297 mg, 62 %. R F : 0.25 CH 2 Cl 2 -MeOH (20:1). p.f.: 136-138 ºC.
8. Materiales y métodos 380 IR ν max : 3319, 3267, 2929, 2860, 1599, 1572, 1510, 1450, 1337, 1281, 1107, 1013, 804 cm -1 . 1 H-RMN (300 MHz, MeOH-d 4 ): δ 7.28 (m, 5H, Ph), 6.68 (m, 2H, H-2 y H-5), 6.52 (dd, J 2,6 1.8 Hz, J 5,6 8.0 Hz, 1H, H-6), 4.66 (sa, 2H, PhCH 2 NH) 3.66 (sa, 2H, CH 2 NH), 2.71 (t, J CH2,CH2 7.2 Hz, 2H, CH 2 Ar), ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, MeOH-d 4 ): 183.4 (C=S), 146.3 (C-3), 144.8 (C- 4) 139.9 (C-1’), 131.9 (C-1), 129.5 y 128.4 (C-2’, C-3’, C-5’ y C-6’), 128.2 (C-4’), 121.1 (C-6), 116.9 y 116.4 (C-2 y C- 5), 48.2 (PhCH 2 NH), 46.9 (CH 2 NH), 35.7 (CH 2 Ar) ppm. CIMS m/z 303 ([M+H] + , 27%) HRCIMS Calc. para C 16 H 19 N 2 O 2 S ([M+H] + ): 303.1167. Encontrado: 303.1167. 8.6.3.5. 1-(3,4-dihidroxifenetil)3-feniltiourea (49). HO HO H NH N S Se obtuvo a partir de fenilisotiocianato comercial. Se purificó por cromatografía en columna (CH 2 Cl 2 ĺCH 2 Cl 2 -MeOH 40:1), obteniéndose 49 como un sólido blanco. Rendimiento 420 mg, 92 %. R F : 0.30 CH 2 Cl 2 -MeOH (20:1). p.f.: 98-100 ºC.
8. Materiales y métodos 381 IR ν max : 3340, 3220, 2938, 1706, 1599, 1517, 1493, 1444, 1351, 1279, 1177, 1109, 1022, 809 cm -1 . 1 H-RMN (300 MHz, MeOH-d 4 ): δ 7.31 (m, 2H, H-3’y H-5’), 7.16 (m, 3H, H-2’, H-4’ y H-6’), 6.68 (m, 2H, H-2 y H-5), 6.53 (dd, J 2,6 2.0 Hz, J 5,6 8.0 Hz, 1H, H-6), 3.74 (t, J CH2,CH2 7.0 Hz, 2H, CH 2 NH), 2.76 (t, J CH2,CH2 7.0 Hz, 2H, CH 2 Ar) ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, MeOH-d 4 ): 181.8 (C=Se), 146.4 (C-3), 144.9 (C-4), 139.2 (C-1’), 131.9 (C-1), 130.4 (C-3’ y C-5’), 126.9 (C-2’ y C-6’), 125.7 (C-4’), 121.1 (C-6), 117.0 y 116.5 (C-2 y C-5), 47.3 (CH 2 NH), 35.2 (CH 2 Ar) ppm. CIMS m/z 289 ([M+H] + , 14%), 271 ([M - OH] + , 2%). HRCIMS Calc. para C 15 H 17 N 2 O 2 S ([M+H] + ): 289.1011. Encontrado: 289.1008 8.6.3.6. 3,6-diacetoxi-4,5-dicloroftalonitrilo (50). OAc OAc Cl Cl NC NC A una disolución de 2,3-diciano-5,6-diclorobenceno-1,4-diol 152 (25 mg, 0.109 mmol) en piridina (300 µL) enfriada a 0 ºC, se añadió anhídrido acético (300 µL), y la mezcla se agitó a 0 ºC durante 30 minutos, y posteriormente se dejó en el congelador toda la noche. Se concentró a
8. Materiales y métodos 382 sequedad, y el residuo obtenido se suspendió en agua desioniazada (10 mL) y se extrajo con 3x10 mL de CH 2 Cl 2 . Los extractos orgánicos se unieron, se secaron sobre MgSO 4 , y se concentraron a sequedad, obteníendose 50 como sólido blanco que no necesitó purificación adicional. Rendimiento 25 mg, 58 %. R F 0.82 AcOEt-Hex (2:1). IR 2938, 2243, 1793, 1415, 1371, 1318, 1139, 1134, 1012, 915, 828, 789, 687 cm -1 . 1 H-RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ 2.49 (s, 6H, OAc) ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, CDCl 3 ): 166.2 (C=O, OAc), 148.7 (C-3 y C-6), 135.3 (C-4 y C-5), 110.6 (C-1 y C-2), 20.3 (CH 3 , OAc) ppm. CIMS m/z 312 ([M+H] + , 20 %), HRCIMS Calc. para C 12 H 7 N 2 O 4 Cl 2 (M + ): 312.9783 Encontrado: 312.9778. Procedimiento general para la obtención de las 3-acetil-7,8-diacetoxi- benzo[f][1,3]tiazepinas. A una disolución de las tioureas 45-49 (0.500 mmol) en THF (5 mL) se añadió dicloro-diciano-quinona (0.625 mmol, 141.9 mg, 1.25 equivalentes) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. La reacción se siguió mediante cromatografía en capa fina, y cuando fue necesario se añadió más DDQ hasta consumir todo el producto de partida. El medio de reacción se concentró a sequedad y se disolvió en piridina (3 mL) y anhídrido acético (3 mL), la mezcla se agitó a 0ºC durante
8. Materiales y métodos 389 13 C-RMN (75.5 MHz, MeOH-d 4 ): 170.2 (C=O, NAc 55 ), 169.0 (C=O, NAc 56), 168.1 y 168.0 (C=O, OAc 55), 167.8 (C=O, OAc 56), 154.2 (C=N 56), 147.3 (C=N, 55), 142.7 (C-8 56), 141.9 (C-7 55), 141.6 (C-8, 55), 141.0 (C-7 56), 140.3 (C-11 55), 139.2 (C-11 56), 128.4 (C-10 55), 127.6 (C-10 56), 126.1 (C-9 56), 124.7 (C-9 55 y C-6 56), 124.4 (C-6 55), 50.5 (C- 4 55), 46.7 (C-4 56), 39.3 (CH 3 56), 34.0 (CH 3 55), 33.6 (C-5 56), 31.8 (C-5 56), 22.4 (CH 3 , NAc 55), 21.8 (CH 3 , NAc 56), 20.6 y 20.5 (4 CH 3, OAc, 55 y 56) ppm. CIMS m/z 351 ([M+H] + , 100%), 350 ([M] + , 47%). HRCIMS Calc. para C 16 H 19 N 2 O 5 S ([M+H] + ): 351.1015. Encontrado: 351.1007. Procedimiento general para la obtención de las 1,3-benzotiazepinas 57- 61. A una disolución de las tiazepinas 51-56 (0.25 mmol) en diclorometano:metanol 1:1 (8 mL) se añadió una cantidad catalítica de carbonato potásico, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una hora. Se neutralizó con ácido acético diluído y se concentró a sequedad.
8. Materiales y métodos 390 8.6.3.12. 3-Acetil-2-(butilimino)-2,3,4,5-tetrahidrobenzo[f][1,3] tiazepina-7,8-diol (57). H O HO S N N Ac Se obtuvo a partir de la tiazepina 51. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (CH 2 Cl 2 ĺCH 2 Cl 2 -MeOH 30:1), obteniéndose 57 como un sólido de ligera tonalidad marrón. Rendimiento 50 mg, 65 %; R F 0.20 CH 2 Cl 2 /MeOH (20:1). p.f. 137-138 ºC. IR ν max : 3297, 2947, 2912, 2864, 1653, 1614, 1581, 1512, 1426, 1386, 1357, 1318, 1270, 1215, 1138, 1037, 1003, 881, 819, 648 cm -1 1 H-RMN (300 MHz, MeOH-d 4 ): δ 6.84 (s, 1H, H-9), 6.79 (s, 1H, H- 6), 3.96 (m, 2H, H-4), 3.46 (t, J CH2,CH2 6.9 Hz, 2H, CH 2 N=C) 2.95 (t, J CH2,CH2 6.8 Hz, 2H, H-5), 1.88 (s, CH 3 NAc), 1.75 (m, 2H, CH 2 CH 2 CH 3 ), 1.46 (m, 2H, CH 2 CH 3 ), 0.99 (t, 3H, CH 3 ) ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, MeOH-d 4 ): 168.8 (C=O, NAc), 158.0 (C=N), 148.3 (C-8), 146.0 (C-7), 133.6 (C-11), 119.6 (C-9), 118.9 (C-10), 118.1 (C-6), 52.2 (CH 2 N=C), 49.0 (C-4), 32.8 (CH 2 CH 2 CH 3 ) , 32.3 (C-5), 21.7 (CH 3 , NAc y CH 2 CH 3 ) 14.1
8. Materiales y métodos 391 (CH 3 ) ppm. CIMS m/z 308 ([M] + , 11 %). HRCIMS Calc. para C 15 H 20 N 2 O 3 S ([M] + ): 308.1195. Encontrado: 308.1193. 8.6.3.13. 3-Acetil-2,3,4,5-tetrahidro2-(p-tolilimino)-benzo[f][1,3] tiazepina-7,8-diol (58). H O HO S N N Ac Me Se obtuvo a partir de la tiazepina 52. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (CH 2 Cl 2 ĺCH 2 Cl 2 -MeOH 30:1), obteniéndose un sólido marrón. Rendimiento 37 mg, 43 %; R F 0.23 CH 2 Cl 2 /MeOH (20:1). p.f. 96-100 ºC. IR ν max : 3234, 2924, 2850, 1653, 1614, 1497, 1434, 1357, 1259, 1153, 1037, 1007, 869, 812, 629 cm -1 1 H-RMN (300 MHz, MeOH-d 4 ): δ 7.25 (m, J o,m 8.1 Hz, 2H, H-2’ y H- 6’), 6.93 (m, J o,m 8.1 Hz, 2H, H-3’ y H-5’), 6.80 (s, 1H, H- 6), 6.75 (s, 1H, H-9), 4.07 (t, J CH2,CH2 6.7 Hz, 2H, H-4), 3.03 (t, J CH2,CH2 6.7 Hz, 2H, H-5), 2.37 (s, 3H, CH 3 Ar), 2.06 (s, CH 3 NAc) ppm.
8. Materiales y métodos 392 13 C-RMN (75.5 MHz, MeOH-d 4 ): 170.7 (C=O, NAc), 160.7 (C=N), 148.4 (C-8), 148.6 (C-1’), 145.9 (C-7), 136.6 (C-4’), 133.5 (C-11), 131.0 (C-2’ y C-6’), 120.6 (C-10, C-3’ y C-5’), 119.6 (C-9), 118.0 (C-6), 48.7 (CH 2 NAc), 32.3 (CH 2 Ar), 22.0 (CH 3 NAc), 21.0 (CH 3 Ar) ppm. CIMS m/z 342 ([M] + , 40 %), m/z 343 ([M+H] + , 42 %), HRCIMS Calc. para C 18 H 18 N 2 O 3 S ([M] + ): 342.1038. Encontrado: 342.1041. 8.6.3.14. 3-Acetil-2-(bencilimino)-2,3,4,5-tetrahidrobenzo[f][1,3] tiazepina-7,8-diol (59). H O HO S N N Ac Se obtuvo a partir de la tiazepina 53. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (CH 2 Cl 2 ĺCH 2 Cl 2 -MeOH 25:1), obteniéndose 59 como un sólido de ligera tonalidad marrón. Rendimiento 69 mg, 65 %; R F 0.21 CH 2 Cl 2 /MeOH (20:1). p.f. 167-168 ºC. IR ν max : 3199, 2874, 1650, 1606, 1579, 1507, 1424, 1391, 1357, 1319, 1279, 1216, 1136, 1041, 1015, 876, 814, 735, 648 cm -1
8. Materiales y métodos 393 1 H-RMN (300 MHz, MeOH-d 4 ): δ 7.37 (m, 5H, Ph), 6.87 (s, 1H, H-9), 6.81 (s, 1H, H-6), 4.67 (s, 2H, CH 2 bencilo), 3.98 (m, 2H, H-4), 2.98 (t, J CH2,CH2 6.8 Hz, 2H, H-5), 1.88 (s, CH 3 NAc) ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, MeOH-d 4 ): 171.0 (C=O, NAc), 158.8 (C=N), 148.4 (C-8), 146.0 (C-7), 139.3 (C-1’), 133.7 (C-11), 129.7 (C-2’ y C-6’), 129.2 (C-3’ y C-5’), 128.4 (C-4’), 119.5 (C-9), 118.8 (C-10), 118.1 (C-6), 59.6 (CH 2 N=C), 48.7 (C-4), 32.3 (C-5), 21.8 (CH 3 NAc) ppm. CIMS m/z 342 ([M] + , 48 %). HRCIMS Calc. para C 18 H 18 N 2 O 3 S ([M] + ): 342.1038. Encontrado: 342.1045. 8.6.3.15. 3-Acetil-2-(fenilimino)-2,3,4,5-tetrahidrobenzo[f][1,3]tiazepina- 7,8-diol (60). H O HO S N N Ac Se obtuvo a partir de la tiazepina 54. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (CH 2 Cl 2 ĺCH 2 Cl 2 -MeOH 40:1), obteniéndose 60 como un sólido anaranjado. Rendimiento 49 mg, 60 %; R F 0.21 CH 2 Cl 2 /MeOH (20:1). p.f. 185-188 ºC.
8. Materiales y métodos 394 IR ν max : 3420, 3146, 2930, 1638, 1594, 1512, 1483, 1431, 1348, 1260, 1197, 1143, 1044, 1094, 1010, 915, 813, 692 cm -1 1 H-RMN (300 MHz, MeOH-d 4 ): δ 7.45 (m, 2H, H-2’ y H-6’), 7.20 (m, H-4’), 7.03 (m, 2H, H-3’ y H-5’), 6.81 (s, 1H, H-9), 6.75 (s, 1H, H-3), 4.08 (t, J CH2,CH2 6.7 Hz, 2H, H-4), 3.03 (t, J CH2,CH2 6.7 Hz, 2H, H-5), 2.08 (s, CH 3 NAc) ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, MeOH-d 4 ): 170.9 (C=O, NAc), 160.7 (C=N), 148.6 (C-1’), 148.3 (C-8), 145.9 (C-7), 133.5 (C-11), 130.6 (C-2’ y C-6’), 126.6 (C-3’ y C-5’), 120.6 (C-10 y C-4’), 119.6 (C-9), 118.0 (C-6), 48.7 (C-4), 32.3 (C-5), 22.0 (CH 3 NAc) ppm. CIMS m/z 328 ([M] + , 23 %), m/z 329 ([M+H] + , 23 %), HRCIMS Calc. para C 17 H 16 N 2 O 3 S ([M] + ): 328.0882. Encontrado: 328.0886. 8.6.3.16. 3-Acetil-2,3,4,5-tetrahidro-2-(metilimino)benzo[f][1,3] tiazepina-7,8-diol (61) H O HO S N N A c H 3 C Se obtuvo a partir de las tiazepinas 55 y 56. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (CH 2 Cl 2 ĺCH 2 Cl 2 -MeOH 30:1), obteniéndose 61 como un sólido marrón.
8. Materiales y métodos 395 Rendimiento 31 mg, 46 %; R F 0.23 CH 2 Cl 2 /MeOH (20:1). p.f. 184-188 ºC. IR ν max : 3203, 2894, 1658, 1619, 1500, 1427, 1391, 1264, 1153, 1038, 1001, 871, 814, 628 cm -1 1 H-RMN (300 MHz, MeOH-d 4 ): δ 6.85 (s, 1H, H- 6), 6.80 (s, 1H, H-9), 3.95 (t, J CH2,CH2 6.7 Hz, 2H, H-4), 3.30 (s, 3H, CH 3 ), 2.95 (t, J CH2,CH2 6.7 Hz, 2H, H-5), 1.87 (s, CH 3 NAc) ppm. 13 C-RMN (75.5 MHz, MeOH-d 4 ): 171.0 (C=O, NAc), 159.9 (C=N), 148.4 (C-8), 146.0 (C-7), 133.7 (C-11), 119.6 (C-9), 118-9 (C-10) 118.1 (C-6), 48.7 (C-4), 39.1 (CH 3 ), 32.2 (C-5), 21.6 (CH 3 NAc) ppm. CIMS m/z 266 ([M] + , 21 %), m/z 267 ([M+H] + , 30 %), HRCIMS Calc. para C 12 H 15 N 2 O 3 S ([M+H] + ): 267.0803. Encontrado: 267.0809. 8.6.4. FORMACIÓN DE ISOXAZOLES CON EL CATALIZADOR CeCl 3 ·7H 2 O/NaI-SiO 2 Preparación del catalizador CeCl 3 ·7H 2 O/NaI-SiO 2 Una suspensión de CeCl 3 ·7H 2 O (113 mg, 0.3 mmol), NaI (0.3 mmol, 46 mg) y SiO 2 (0.5 g) en acetonitrilo (7 mL) se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas, y se evaporó el disolvente a sequedad. El sólido obtenido se almacenó en el desecador hasta su posterior uso.
8. Materiales y métodos 396 8.6.4.1. 3,5-Dietoxicarbonil-4-(p-nitrofenil)isoxazol (62). O 2 N N O COOEt EtOOC A una suspensión del catalizador previamente preparado de CeCl 3 ·7H 2 O/NaI-SiO 2 en acetonitrilo (7 mL) se añadió p-nitrobenzaldehído (1 mmol, 154.2 mg) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El acetonitrilo se evaporó a sequedad y sobre el sólido resultante se añadió nitroacetato de etilo (2.2 mmol, 251.7 µL), agitando a 70 ºC durante 24 horas, siguiendo el avance de la reacción por cromatografía en capa fina y cromatografía de gases-masas. Se añadió diclorometano (15 mL), se agitó durante 15 minutos, y posteriormente se adicionó HCl 1N (10 mL), agitando durante 1 horas más. El sistema bifásico se filtró sobre celita, se separó la fase orgánica que se lavó con 2x40 mL de HCl 1N, se neutralizó con 2x40 mL de una disolución de NaHCO 3 saturado, se secó sobre MgSO 4 y se concentró a sequedad. El residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna (CH 2 Cl 2 -hexano 1:2), obteníendose 62 como un sólido blanco. Rendimiento 78 mg, 23 %. p.f. 110-112 ºC. IR ν max : 2923, 2724, 1732, 1604, 1455, 1377, 1317, 1211, 1169, 1109, 1018, 971, 866, 756 cm -1 . 1 H-RMN (400 MHz, CDCl 3 ): δ 8.30 (m, J o,m 8.2 Hz, 2H, H-3’ y H-5’), 7.56 (m, J o,m 8.2 Hz, 2H, H-2’ y H-6’), 4.36 (m, 4H, CH 2
8. Materiales y métodos 397 Et), 1.29 (m, 6H, CH 3 Et) ppm. 13 C-RMN (100 MHz, CDCl 3 ): 158.8 y 157.7 (C=O), 155.9 (C-3), 154.9 (C-5), 133.6 (C-1’ y C-4’), 131.3 (C-2’ y C-6’), 123.0 (C-4, C-3’ y C-5’), 63.0 (CH 2 ), 14.1 (CH 3 ) ppm. CIMS m/z 334 ([M] + , 30 %), 8.6.4.2. 3,5-Dietoxicarbonil-4-(piridin-3-il)isoxazol (63). N O COOE t EtOOC N A una suspensión del catalizador previamente preparado de CeCl 3 ·7H 2 O/NaI-SiO 2 en acetonitrilo (7 mL) se añadió piridina-3- carboxaldehído (1 mmol, 96.3 µL) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El acetonitrilo se evaporó a sequedad y sobre el sólido resultante se añadió nitroacetato de etilo (2.2 mmol, 251.7 µL), agitando a 70 ºC durante 25 horas, siguiéndose el avance de la reacción por cromatografía en capa fina y cromatografía de gases-masas. Se añadió diclorometano (15 mL), se agitó durante 15 minutos, y posteriormente se adicionó HCl 1N (10 mL), agitando durante 1 horas más. El sistema bifásico se filtró sobre celita, se separó la fase orgánica que se lavó con 2x40 mL de HCl 1N, se neutralizó con 2x40 mL de una disolución de NaHCO 3 saturado, se secó sobre MgSO 4 y se concentró a sequedad. El residuo obtenido se
8. Materiales y métodos 398 purificó por cromatografía en columna (AcOEt/hexano 1:2), obteníendose 63 como un aceite. Rendimiento 109 mg, 38 %. IR ν max : 2985, 2938, 1741, 1618, 1581, 1483, 1450, 1412, 1389, 1369, 1320, 1242, 1211, 1055, 1023, 996, 848 cm -1 . 1 H-RMN (400 MHz, CDCl 3 ): δ 8.67 (dd, J 2,6 2.0 Hz, J 5,6 4.8 Hz, 1H, H-6’), 8.59 (d, J 2,6 2.0 Hz, 1H, H-2’), 7.74 (dd, J 2,4 2.0 Hz, J 4,6 2.0 Hz, J 4,5 8.0 Hz, 1H, H-4’), 7.38 (ddd, J 4,5 8.0, J 5,6 4.8 Hz, 1H, H-5’), 4.36 (m, 4H, CH 2 Et), 1.28 (m, 6H, CH 3 Et) ppm. 13 C-RMN (100 MHz, CDCl 3 ): 159.0 y 158.1 (C=O), 156.3 (C- 3), 155.4 (C-5), 150.6 (C-2’), 150.1 (C-6’), 137.8 (C-3’ y C-4’), 123.6 (C-4), 122.8 (C-5’), 62.9 (CH 2 ), 14.1 (CH 3 ) ppm. CIMS m/z 290 ([M] + , 30 %),