Mecanismos moleculares y fisiológicos que participan en el diálogo simbiótico de Rhizobium tropici CIAT 899 y sus leguminosas hospedadoras: reguladores transcripcionales y vesículas de membrana

Mecanismos moleculares y fisiológicos que participan en el diálogo simbiótico de Rhizobium tropici CIAT 899 y sus leguminosas hospedadoras: reguladores transcripcionales y vesículas de membrana. Paula Ayala García Sevilla, 2024 Departamento de Microbiología Facultad de Biología Mi agradecimiento al Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (Becas Formación del Profesorado Universitario 2018) y a la Universidad de Sevilla por hacer posible la realización de este trabajo de investigación. Esta Tesis Doctoral corresponde al siguiente compendio de trabajos previamente publicados: 1) del Cerro, P1*., Ayala-García, P1*., Buzón, P1., Castells-Graells, R2., López-Baena, F. J1., Ollero, F. J1., & Pérez-Montaño, F1. (2020). OnfD, an AraC-type transcriptional regulator encoded by Rhizobium tropici CIAT 899 and involved in Nod factor synthesis and symbiosis. Applied and Environmental Microbiology, 86(19), e01297- 20. DOI: https://doi.org/10.1128/AEM.01297-20 CITATION: 7. Revista Q1 (primer cuartil) en la categoría Applied Microbiology and Biotechnology. (*) Los dos autores han contribuido por igual en este trabajo. (1) Departamento de Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla, Sevilla, España. (2) Department of Biological Chemistry, John Innes Centre, Norwich Research Park, Norwich, United Kingdom. 2) Ayala-García, P1., Jiménez-Guerrero, I1., Jacott, C2. N., López-Baena1, F. J., Ollero, F. J1., del Cerro, P1., & Pérez-Montaño, F1. (2022). The Rhizobium tropici CIAT 899 NodD2 protein promotes symbiosis and extends rhizobial nodulation range by constitutive nodulation factor synthesis. Journal of Experimental Botany, 73(19), 6931-6941. DOI: https://doi.org/10.1093/jxb/erac325 CITATION: 4. Revista D1 (primer decil) en la categoría Plant Sciences. (1) Departamento de Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla, Sevilla, España. (2) Department of Crop Genetics, John Innes Centre, Norwich Research Park, Norwich, United Kingdom. 3) Ayala-García, P1., Moreno-de Castro, N1., Jiménez-Guerrero, I1., Müsken, M2., Arce- Rodríguez, A3., Pérez-Montaño, F1., & Borrero-de Acuña, J. M1. (2024a). Isolation, quantification, and visualization of extracellular membrane vesicles in rhizobia under free-living conditions. En Host-Pathogen Interactions: Methods and Protocols (pp. 219-228). New York, NY: Springer US. ISBN: 978-1-0716-3617-6. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3617-6_14 Capítulo de libro. (1) Departamento de Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla, Sevilla, España. (2) Central Facility for Microscopy, Helmholtz Centre for Infection Research, Braunschweig, Germany (3) Institute of Microbiology, Technische Universität Braunschweig, Braunschweig, Germany 4) Ayala-García, P1., Jiménez-Guerrero, I1., Müsken, M2., Ollero, F. J1., Borrero-De Acuña, J. M1., & Pérez-Montaño, F1. (2024b). Isolation of rhizobial extracellular membrane vesicles from bacteroids. En Host-Pathogen Interactions: Methods and Protocols (pp. 229-236). New York, NY: Springer US. ISBN: 978-1-0716-3617-6. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3617-6_15 Capítulo de libro. (1) Departamento de Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla, Sevilla, España. (2) Central Facility for Microscopy, Helmholtz Centre for Infection Research, Braunschweig, Germany ÍNDICE DE CONTENIDOS ÍNDICE DE CONTENIDOS RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS .......................................... 1 INTRODUCCIÓN ............................................................................... 8 Importancia del nitrógeno ..................................................................................... 9 Historia y filogenia de los rizobios ...................................................................... 11 La simbiosis rizobio-leguminosa ......................................................................... 13 Factores determinantes en el establecimiento de la simbiosis .......................... 18 Los flavonoides ...................................................................................................... 18 Los factores Nod (NFs) .......................................................................................... 19 Reguladores transcripcionales en simbiosis ....................................................... 21 La familia de reguladores LysR: el regulador NodD ............................................. 21 La familia de reguladores AraC/XylS .................................................................... 23 Otros determinantes simbióticos ......................................................................... 26 Polisacáridos de superficie bacteriana .................................................................... 26 Movilidad bacteriana .............................................................................................. 27 Percepción de quorum ............................................................................................ 27 Formación de biopelículas ...................................................................................... 28 Síntesis de ácido indol acético ................................................................................ 28 Sistemas de secreción bacterianos .......................................................................... 29 EL HUÉSPED: Rhizobium tropici CIAT 899 ..................................................... 31 El genoma de Rhizobium tropici CIAT 899 ........................................................... 32 Síntesis y secreción de NFs en presencia de estrés osmótico y flavonoides. ......... 36 Estudios transcriptómicos en Rhizobium tropici CIAT 899 ................................... 38 EL HOSPEDADOR: Las leguminosas ............................................................... 38 Phaseolus vulgaris .................................................................................................. 39 Lotus japonicus y Lotus burttii ............................................................................... 39 Vesículas extracelulares de membrana .............................................................. 39 Ruta de biogénesis y cargo de las MVs en bacterias Gram-negativas ................... 40 Procesos biológicos en los que participa ................................................................ 41 MVs y plantas ......................................................................................................... 43 OBJETIVOS ..................................................................................... 45 CAPÍTULO 1. ................................................................................... 47 CAPÍTULO 2. ................................................................................... 72 CAPÍTULO 3. ................................................................................... 88 CAPÍTULO 4. ................................................................................... 99 DISCUSIÓN GENERAL ................................................................... 108 CONCLUSIONES ............................................................................ 134 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................. 137 ÍNDICE DE FIGURAS ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Primera etapa de la simbiosis rizobio-leguminosa: síntesis y secreción de los factores de nodulación. ................................................................................................... 14 Figura 2. Segunda etapa de la simbiosis rizobio-leguminosa: Colonización de la raíz. (A) Tipos de colonización: vía intercelular y mediante ITs. (B) Desarrollo del IT. ............. 16 Figura 3. Tercera etapa de la simbiosis rizobio-leguminosa: Desarrollo del nódulo y fijación del nitrógeno atmosférico. ................................................................................. 18 Figura 4. Estructura química general de un factor Nod, algunos de los sustituyentes identificados en diferentes especies de rizobio (círculos en color) y ejemplos de las variantes que pueden conformar la cadena de ácido graso. ............................................ 19 Figura 5. Modelo estructural de la proteína reguladora NodD1 de R. tropici CIAT 899. Imagen elaborada en Phyre2.. ......................................................................................... 23 Figura 6. Modelo general de actuación de los reguladores transcripcionales de la familia AraC/XylS. ..................................................................................................................... 25 Figura 7. Otros determinantes importantes en el establecimiento de la simbiosis: movilidad bacteriana, polisacáridos bacterianos, Quorum sensing y formación de biofilm, síntesis de ácido indol acético (AIA) y sistemas de secreción bacterianos. ................... 30 Figura 8. Árbol filogenético basado en la secuenciación del ARNr 16s de R. tropici CIAT 899 y otras especies de Rhizobium. ............................................................................... 32 Figura 9. Genes simbioticos y NBs dentificadas en el plásmido simbiótico de R. tropici CIAT 899. ....................................................................................................................... 34 Figura 10. Cromatografía en capa fina (TLC, del inglés Thin Layer Chromatography) del perfil de NFs liberados por la estirpe silvestre (WT) y los mutantes en los genes nodD1 y nodD2 en diferentes condiciones: C (sin molécula inductora), S (NaCl 300 mM) y A (Apigenina 3,7 µM). ...................................................................................................... 37 Figura 11. Tipos de MVs en base al mecanismo de liberación al medio extracelular y a RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS 2 Los rizobios, son bacterias presentes en el suelo con la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico (N2) en simbiosis con las plantas leguminosas. En esta relación mutualista, la planta ofrece nutrientes y un microambiente óptimo, los denominados nódulos, donde los rizobios llevan a cabo la fijación biológica de nitrógeno (FBN). A cambio; la planta satisface sus requerimientos de nitrógeno asimilando los productos resultantes de la FBN. El nitrógeno es uno de los elementos limitantes más importantes en el crecimiento de las plantas. Así, la simbiosis rizobio-leguminosa contribuye a la mejora del rendimiento de los cultivos de forma natural y sostenible, planteándose como alternativa al uso de fertilizantes y agroquímicos, ya que estos generan un fuerte impacto sobre el medio ambiente. Este proceso biológico requiere de una alta especificidad entre el microsimbionte (los rizobios) y el macrosimbionte (la planta). La proteína reguladora NodD de los rizobios es uno de los elementos claves en esta especificidad y en el reconocimiento de ambos organismos en la rizosfera. Esta proteína censa los flavonoides presentes en los exudados de las raíces de las leguminosas y se activa ante la presencia de un flavonoide compatible. Una vez activa, induce la expresión de los genes nod (genes de nodulación), que codifican para proteínas encargadas de la síntesis y secreción de unas moléculas denominadas factores de nodulación (NFs). Una vez liberados a la rizosfera, los NFs son reconocidos por receptores específicos de la planta, lo que desencadena la entrada del rizobio a la raíz y el desarrollo de los nódulos, donde se generan las condiciones idóneas para que los rizobios se diferencien a formas capaces de fijar el N2. La estirpe Rhizobium tropici CIAT 899 es un organismo idóneo para los estudios simbióticos ya que se trata de una estirpe promiscua, con la capacidad de nodular un amplio rango de plantas hospedadoras, además de tolerar diferentes condiciones estresantes en el medio, como por ejemplo la acidez, sequía y salinidad de los suelos. A nivel genómico, CIAT 899, resulta interesante por portar en su genoma cinco copias diferentes del gen nodD (nodD1, nodD2, nodD3, noD4 y nodD5), una característica atípica en la mayoría de rizobios. Sin embargo, el dato más revelador de esta estirpe es su capacidad para sintetizar NFs en condiciones de estrés osmótico independientemente de la presencia de un flavonoide compatible. La secuenciación del genoma de CIAT 899 y los posteriores estudios transcriptómicos llevados a cabo en esta bacteria, han permitido demostrar que las proteínas reguladoras NodD1 y NodD2 lideran la síntesis y liberación de los NFs en presencia de apigenina y bajo condiciones de estrés osmótico, RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS 3 respectivamente. Además, los últimos estudios de ARN-seq han revelado que, tanto en presencia de apigenina como bajo condiciones de estrés osmótico, se activan el mismo grupo de genes simbióticos, a excepción de los genes nodD2 y rtciat899_pb01075, que se activan únicamente en condiciones de estrés osmótico. Teniendo en cuenta estos antecedentes, uno de los objetivos que se plantean en esta Tesis Doctoral es estudiar el papel del gen rtciat899_pb01075 de CIAT 899, que codifica para un regulador transcripcional de la familia de reguladores AraC y al que se le ha denominado, OnfD. Con este propósito, se ha construido un mutante de CIAT 899 en el gen onfD y se ha estudiado su fenotipo simbiótico mediante diferentes técnicas de análisis de expresión de los genes simbióticos, estudios de secreción de NFs y ensayos de nodulación en plantas. Esto ha permitido demostrar que el regulador OnfD es esencial en la síntesis de NFs ante una condición de estrés osmótico. Además, se han realizado ensayos de interacción proteína-proteína que han demostrado que los reguladores NodD2 y OnfD podrían interaccionar llevando a cabo conjuntamente la activación transcripcional de los genes simbióticos bajo un estrés osmótico. Estos datos se recogen en del Cerro et al., 2020, en el que la doctoranda figura como co-primera autora, y al que corresponde el primer capítulo de esta Tesis Doctoral. Por otro lado, continuando con el estudio de los mecanismos moleculares que regulan la síntesis de NFs en CIAT 899, se ha querido estudiar el papel de cada regulador NodD en solitario, sin la influencia del resto de reguladores NodD. Para ello, se ha construido una batería de estirpes en un fondo mutante afectado en los cinco genes nodD, que portan de forma aislada cada de los genes nodD bajo la influencia de su propio promotor, así como de un promotor constitutivo. De esta forma, se ha llevado a cabo un estudio en el que se integran análisis de expresión de los genes simbióticos, ensayos de nodulación en diferentes plantas leguminosas y ensayos de colonización a microscopía en las diferentes estirpes. Como resultado, se ha demostrado que el regulador NodD2, a diferencia de NodD1, no se activa por la presencia de una molécula inductora en el medio, si no que su papel activando la expresión de los genes nod en condiciones de estrés osmótico es consecuencia de un aumento de sus niveles citoplasmáticos. Además, en este estudio se demuestra que el producto de la sobrexpresión del gen nodD2 de CIAT 899 puede modificar el rango de hospedador en otros rizobios. Sin embargo, sigue sin ser clara la función de los reguladores NodD3, NodD4 y NodD5 en simbiosis. Estos datos se RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS 4 presentan en Ayala-Garcia et al., 2022, trabajo al que corresponde el segundo capítulo de la presente Tesis. Finalmente, la última parte de esta Tesis doctoral aleja el foco de estudio sobre el modo de regulación de los genes simbióticos de CIAT 899. No obstante, se mantiene el objetivo común en la búsqueda de aquellos elementos que participen en la simbiosis rizobioleguminosa. De este modo, los dos últimos capítulos se centran en estudiar el papel de las vesículas de membrana (MVs) liberadas por los rizobios durante el proceso simbiótico. Las MVs son esferas lipídicas que emergen de la envoltura celular y están involucradas en numerosos procesos celulares, como en la respuesta a estrés, en patogenicidad, en la adquisición de nutrientes y metales o en la transferencia horizontal de material genético. En los últimos años ha cobrado protagonismo el estudio de las MVs secretadas por organismos patógenos y su interacción con plantas, lo que ha permitido conocer que estas partículas asumen un papel importante modelando la respuesta inmune de las plantas. Sin embargo, los trabajos destinados al estudio de vesículas rizobianas liberadas durante la simbiosis son muy escasos y limitados. Con el fin de contribuir en este estudio, las dos últimas publicaciones que se recogen en esta Tesis corresponden a dos protocolos que permiten el aislamiento y análisis de las MVs liberadas por los rizobios en diferentes etapas del proceso simbiótico: i) aislamiento de MVs de CIAT 899 en vida libre bajo la influencia de del flavonoide activador apigeinina (Ayala-García et al., 2024a); ii) aislamiento de MVs del espacio peribacteroideo de los nódulos de Phaseolus vulgaris colonizados por CIAT 899 (Ayala-García et al., 2024b). ABSTRACT 5 Rhizobia are soil bacteria with the ability to fix atmospheric nitrogen (N2) in symbiosis with leguminous plants. In this mutualistic relationship,plant provides nutrients and an optimal microenvironment, called nodule, where rhizobia carry out the biological nitrogen fixation (BNF). In return, plant takes the nitrogen as product result of the BNF. Nitrogen is one of the most important limiting elements in plant growth. Thus, rhizobiumlegume symbiosis contributes to the improvement of crop yields in a natural and sustainable way in front of using of fertilizers and agrochemicals, which cause a strong environment impact. This symbiotic process requires a high degree of specificity between the microsymbiont (the rhizobia) and the macrosymbiont (the plant). The rhizobia regulatory protein NodD is one of the keys in the recognition of these organisms in the rhizosphere. This protein senses the flavonoids present in legume root exudates and is activated in the presence of a compatible one. Once activated, it induces the expression of nod (nodulation) genes, which code to proteins that synthesize and secrete molecules called nodulation factors (NFs). In the rhizosphere, the NFs are recognized by specific plant receptors, which triggers the entry of the rhizobia into the root and the nodule development, where rhizobia differentiate into N2fixing forms. Rhizobium tropici CIAT 899 is an excellent organism for symbiotic studies. It is a promiscuous strain, with the ability to nodulate a wide range of host plants. Also, this strain is capable to tolerate different stressful conditions, such as acidity, drought or salinity. The CIAT 899 genome has multiple copies of nodD (nodD1, nodD2, nodD3, noD4 and nodD5), an no common feature in the rhizobia. However, the most revealing feature of this rhizobium is its ability to synthesize NFs under osmotic stress conditions in a flavonoid independent manner. Genome sequencing of CIAT 899 and transcriptomic studies carried out in this bacterium have demonstrated that NFs synthesis in the presence of apigenin and under osmotic stress conditions is regulated by NodD1 and NodD2, respectively. In addition, the latest RNA-seq studies revealed that the same group of symbiotic genes are activated in the presence of both apigenin and under osmotic stress conditions. However, a set of genes located downstream of NB9, nodD2 and rtciat899_PB01075, are only activated under osmotic stress. ABSTRACT 6 Considering this background, one of the objectives of this doctoral Thesis is studying the role of rtciat899_pb01075 gene, which encodes for an AraC transcriptional regulator family, named as OnfD. For this purpose, a CIAT 899 mutant in the onfD gene has been constructed and its symbiotic phenotype has been inspected integrating different symbiotic gene expression analyses, NF secretion studies and nodulation assays. In this manner, it has been demonstrated that OnfD is essential for the NFs synthesis under osmotic stress conditions. Furthermore, protein-protein interaction assays have shown that the NodD2 and OnfD regulators could interact together carrying out the transcriptional activation of symbiotic genes under osmotic stress. These data are shown in del Cerro et al., 2020, in which the PhD candidate is first co-author (first chapter of this PhD Thesis) Additionally, the role of each NodD protein have been studied in a scenario without the influence of the rest of the NodD regulators. For it, each nodD gene alone has been expressed under both its own promoter and a constitutive promoter in a quintuple nodD mutant background. In this way, it has been carried out expression analysis of the symbiotic genes, microscopy colonization experiments and nodulation assays. As a result, it has been demonstrated that NodD2 does not require activation by inducers such as compatible flavonoids or an osmotic stress-dependent molecule, that is, its role carrying out the expression of nod genes under osmotic stress conditions is a consequence of an increase of NodD2 cytoplasmic levels. Moreover, this study demonstrates that the product of nodD2 gene overexpression of CIAT 899 can modify the host range in other rhizobia. Nevertheless, the function of NodD3, NodD4 and NodD5 proteins in symbiosis remains unclear. These data are outlined in Ayala-Garcia et al., 2022, which corresponds to the second chapter of this Thesis. Finally, the present doctoral Thesis moves away the focus from study the regulation of the symbiotic genes of CIAT 899. Nevertheless, the main objective to looking for elements that participate in the rhizobium-legume symbiosis is maintained. Thus, the last two chapters are focused on studying the role of membrane vesicles (MVs) released by rhizobia during the symbiosis. MVs are lipid nanospheres that emerge from the cell envelope. They are involved in numerous cellular processes, such as stress response, pathogenicity, nutrient and metal acquisition or horizontal transfer of genetic material. In recent years, the study of MVs secreted by pathogenic organisms and their interaction ABSTRACT 7 with plants has gained prominence, which has led to know that these particles play an important role modulating the plant immune response. However, works about rhizobial MVs are scarce and limited. In order to contribute to this field, the last two publications included in this doctoral Thesis correspond to two protocols that allow the isolation and analysis of MVs released by rhizobia at different stages of the symbiotic process: i) Isolation, quantification, and visualization of extracellular membrane vesicles in rhizobia under free-living conditions (Ayala-Garcia et al., 2024a); ii) Isolation of rhizobial extracellular membrane vesicles from bacteroids (Ayala-Garcia et al., 2024b). INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 9 Importancia del nitrógeno El nitrógeno forma parte de biomoléculas tan importantes para la vida como los aminoácidos, los ácidos nucleicos (ADN y ARN) o el ATP, convirtiéndose en un elemento indispensable para todos los organismos que habitan la Tierra. Este elemento, se encuentra mayoritariamente en forma de gas (N2) constituyendo casi el 80% de la atmósfera terrestre (Moreau et al., 2019; Sheoran et al., 2021). Sin embargo, la mayoría de los organismos son incapaces asimilar el nitrógeno directamente de la atmósfera. Solo algunas bacterias y arqueas, que portan la enzima nitrogenasa, tienen la capacidad de convertir este nitrógeno atmosférico en amonio (NH4+), en un proceso natural conocido como fijación biológica de nitrógeno (FBN). De esta forma, el nitrógeno queda biodisponible para el resto de los organismos que habitan la tierra, entre ellos, las plantas (Galloway et al., 2008). Las plantas pueden adquirir compuestos nitrogenados a partir de diferentes fuentes: de la descomposición de la materia orgánica del suelo, mediante el uso de fertilizantes nitrogenados o como ya se ha mencionado, a través de la FBN. En el ámbito de la agricultura, el nitrógeno desempeña un papel crítico, siendo uno de los principales factores que limita el crecimiento de los cultivos y su producción (Moreau et al., 2019). En las últimas décadas, nos enfrentamos al reto de satisfacer las necesidades alimenticias de una población en crecimiento exponencial, lo que ha derivado en el uso incontrolado de fertilizantes nitrogenados con el fin maximizar el rendimiento de los cultivos. El problema radica en que el uso excesivo de estos fertilizantes genera un fuerte impacto negativo sobre el medioambiente, contribuyendo a la emisión de gases de efecto invernadero y a la contaminación de suelos y aguas, además del alto coste energético y económico que supone su producción. Por ello, encontrar alternativas al uso de fertilizantes inorgánicos es crucial para garantizar la sostenibilidad y seguridad de la producción agrícola y los ecosistemas sin comprometer las necesidades alimenticias de la población (Graham & Vance, 2000; Liu et al., 2011). Así, la FBN, al tratarse de un proceso natural llevado a cabo por microorganismos presentes en el suelo, se plantea como una vía alternativa al uso de fertilizantes inorgánicos. Entre las bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico, se puede discernir entre aquellas capaces de fijar el nitrógeno en vida libre, como las bacterias de los géneros Azotobacter, INTRODUCCIÓN 10 Azospirillum, Bacillus o Clostridium, de las que lo hacen asociadas a organismos eucarióticos, como hongos o plantas. En estas últimas se encuentran las bacterias del género Frankia, que establecen simbiosis con plantas actinorrícicas como Alnus, Myrica o Eleagnus, y las cianobacterias, que pueden establecer distintas relaciones simbióticas: con hongos, dando lugar a los líquenes, con musgos (Sphagum spp.), hepáticas (Marchitaria spp.), antocerotas (Notothylas spp. y Phaeoceros spp.), helechos (como la simbiosis Anabaena azollae con Azolla spp.), angiospermas (un ejemplo es la asociación entre plantas del género Gunnera spp. y la cianobacteria Nostoc punctiforme) y con plantas gimnospermas (como Cyca o Bowenia con distintas especies de cianobacterias de los géneros Nostoc, Spirulina, Oscillatoria, Anabaena, Rivularia o Calotrhix). Finalmente, se encuentran los rizobios, que fijan el N2 atmosférico al establecer relaciones endosimbióticas con plantas leguminosas (Mayz-Figueroa, 2004). El establecimiento de la simbiosis entre los rizobios y las plantas leguminosas ha sido la relación mutualista más estudiada a lo largo de los años, ya que se trata del modo de fijación de nitrógeno más efectivo, por el que se fija entre 20 y 300 Kg por hectáreas y por año, además de su enorme importancia debido al valor económico y nutricional de las plantas leguminosas (Graham & Vance, 2000). Esta familia de plantas, la Leguminosae o Fabaceae, representan una de las principales fuentes de proteína vegetal para los seres humanos y la alimentación animal en todo el mundo (Soumare et al., 2020). INTRODUCCIÓN 11 Historia y filogenia de los rizobios Hace más de 2.000 años en la antigua China ya se demostró que la rotación de cultivos entre cereales y plantas leguminosas favorecía la producción del grano debido a una mejora de la fertilidad del suelo al cultivar plantas leguminosas, aunque se desconocía la explicación a este fenómeno. Fueron Hellriegel y Wilfarth, a finales del siglo XIX, quienes demostraron que los nódulos presentes en las raíces de las leguminosas eran los responsables de la fijación de nitrógeno atmosférico y de la mejora de los cultivos. Años más tarde, en 1888, el microbiólogo Martinus Willem Beijerinck aisló por primera vez una bacteria de los nódulos de Pisum sativum (guisante), demostrando que eran estos microrganismos los responsables de la fijación de nitrógeno. Está bacteria fue denominada Bacillus radicícola y reclasificada en 1889 como Rhizobium leguminosarum. Es por ello, que desde entonces se conoce de forma general como rizobios a las bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico aisladas de los nódulos de las plantas (Ramírez- Bahena et al., 2016; Velázquez et al., 2017). A lo largo de la historia, clasificar a los rizobios ha supuesto un gran reto para los taxónomos. Los grandes avances en técnicas de caracterización bacteriana junto a los continuos aislados bacterianos de los nódulos conllevan a una continua reclasificación taxonómica (Ferraz et al., 2022). En la actualidad, los rizobios se distribuyen en 8 familias, 7 pertenecen a la clase α-Proteobacteria y una a la clase β-Proteobacteria. Las bacterias de la clase α-Proteobacteria están ampliamente distribuidas geográficamente y establecen simbiosis con un amplio rango de plantas hospedadoras, mientras que las de la clase β-Proteobacteria no están tan extendidas y son más restrictivas en su rango de hospedador. En la clase α-Proteobacteria se sitúa el orden Rhizobiales y dentro de este orden se encuentran las familias Rhizobiaceae, que incluye 7 géneros; Phyllobacteriaceae, con 3 géneros; Methylobacteriaceae, con 2 géneros; y las familias de Nitrobacteraceae, Brucelaceae, Hyphomicrobiaceae y Xanthobacteraceae, que engloban un solo género. En el caso de las β-Proteobacteria se encuentra el orden Burkholderiales con la familia Burkloderiaceae y 3 géneros diferentes (Martínez- Romero, 2009). En la Tabla 1 se clasifican los 19 géneros de rizobios y se indica el número de especies recogidas en cada uno de ellos. INTRODUCCIÓN 18 Factores determinantes en el establecimiento de la simbiosis Los flavonoides Los flavonoides son metabolitos secundarios, de naturaleza fenólica y bajo peso molecular que son exudados por las raíces de las plantas leguminosas junto a otras moléculas de diferente naturaleza. Se han descrito alrededor de 10.000 variantes estructurales de estas moléculas, que se acumulan en los extremos de los pelos radicales y actúan como quimioatrayente de los rizobios e inductores de los genes nod (Panche et al., 2016; Skorupska et al., 2017; Shumilina et al., 2023). Estos compuestos fenólicos son biológicamente activos a concentraciones muy bajas, pudiendo activar la síntesis de los factores de nodulación en la bacteria a concentraciones inferiores a 10-6 M (Schlaman et al., 1998). Sin embargo, no se ha encontrado en la naturaleza un flavonoide que actúe de forma general induciendo la biosíntesis de NFs en todos los rizobios. Así, por ejemplo, el flavonoide genisteína induce la transcripción de los genes de nodulación en S. fredii pero no en Rhizobium tropici (Hungría et al., 1991a; Figura 3. Tercera etapa de la simbiosis rizobio-leguminosa: Desarrollo del nódulo y fijación del nitrógeno atmosférico. INTRODUCCIÓN 19 Folch-Mallol et al., 1998), mientras que, el flavonoide apigenina induce la síntesis de NFs en R. tropici, sin tener tal efecto en S. fredii (Morón et al., 2005). Los factores Nod (NFs) En respuesta a los exudados liberados por la planta, cada rizobio produce no sólo un tipo de NF sino un coctel que pueden contener desde 2 hasta incluso más de 60 variantes de estas moléculas, que actúan conjuntamente para inducir una respuesta en la planta hospedadora (Minami et al., 1996; Spaink, 2000). Los factores Nod o LCOs están constituidos por un esqueleto oligomérico de 2 a 6 subunidades de N-acetil-D- glucosamina (GlcNAc) unidas por enlaces β-1, 4, que portan un ácido graso en su extremo no reductor y que pueden presentar diversos radicales en su estructura (D’Haeze & Holsters, 2002). En la Figura 4 se muestra la estructura química simplificada de una molécula de NF y algunos de los sustituyentes más comunes. Las proteínas que codifican los genes de nodulación nodA, nodB y nodC son conocidos como genes nod comunes, ya que son las enzimas responsables de la biosíntesis del esqueleto oligomérico de los NFs y están presentes en todos los rizobios. En primer lugar, la proteína NodC lleva a cabo la oligomerización de las subunidades de N-acetil-D- glucosamina. Posteriormente, NodB desacetila el azúcar terminal del extremo no Figura 4. Estructura química general de un factor Nod, algunos de los sustituyentes identificados en diferentes especies de rizobio (círculos en color) y ejemplos de las variantes que pueden conformar la cadena de ácido graso. Abreviaturas: Ac, grupo acetilo; Ara, arabinosilo; Cb, carbonilo; Fuc, fucosilo; Me, metilo; S, sulfato. Imagen tomada y modificada de Cullimore et al., 2001. INTRODUCCIÓN 20 reductor, y finalmente la proteína con actividad aciltransferasa NodA incorpora un ácido graso en esa misma posición (Spaink, 2000; D’Haeze & Holsters, 2002). La cadena que constituye este ácido graso puede variar en longitud, número y posición de insaturaciones que presente (Ghantasala, & Roy Choudhury, 2022). Una vez constituido el esqueleto principal de la molécula, otras enzimas se encargan de posicionar diferentes decoraciones en su estructura. Estas enzimas son codificadas por diferentes genes de nodulación, los denominados genes nod específicos, ya que pueden variar entre las diferentes especies de rizobios (Lindstrom & Mousavi, 2019). Por ejemplo, los productos de los genes nodHPQ de R. tropici están involucrados en la sulfatación del extremo reductor de los NFs (Folch- Mallol et al., 1996), mientras que la proteína NodZ de S. fredii sintetiza e incorpora grupos fucosilos al esqueleto de sus NFs (Lamrabet et al., 1999). En la Tabla 2 se muestran algunos de los genes implicados en la ruta de síntesis y secreción de los NFs y su función correspondiente. De esta forma, existe una gran variabilidad de NFs según su longitud, el tipo de ácido graso que porta, así como los diferentes sustituyentes que presentan, dando lugar a uno de los determinantes más importantes en la especificidad rizobio-leguminosa (D´Haeze & Holsters, 2002). Un caso claro es el grupo sulfato presente en el extremo no reductor de los NFs liberados por Sinorhizobium meliloti. Este radical parece ser esencial para establecer simbiosis efectiva con su planta hospedadora Medicago sativa, ya que mutaciones en el gen nodH, implicado en la incorporación de este grupo en los NFs impide la nodulación de la bacteria con esta planta (Roche et al., 1991). Tabla 2. Algunos de los genes de nodulación mejores caracterizados implicados en la síntesis de NFs en los rizobios (Perret et al., 2000; Vance, 2002). Gen Función de la proteína que codifica nodA Aciltransferasa nodB Quitina desacetilasa nodC N-acetilglucosamina transferasa nodEF Síntesis de ácidos grasos poliinsaturados nodH Sulfotransferasa nodL, nodX, nolL O-acetiltransferasa nodM Glucosamina sintasa INTRODUCCIÓN 21 nodPQ Síntesis de sulfato en forma activa nodS N-metiltransferasa nodU, nolO O-carbamoil transferasa nodZ Fucosil transferasa nolK Epimerasa implicada en la síntesis de fucosa nolR Represor de genes de nodulación nodD Regulador transcripcional de genes de nodulación Reguladores transcripcionales en simbiosis La presencia de abundantes reguladores transcripcionales en bacterias permite la optimización de la expresión génica y la respuesta y adaptación a diferentes condiciones ambientales. Así, la presencia de un amplio repertorio de proteínas reguladoras supone una característica ventajosa de los organismos de vida libre y patógenos oportunistas frente a los organismos intracelulares que viven en ambientes muy controlados y estables. Entre los reguladores transcripcionales más abundantes en bacterias se encuentran las familias de reguladores LysR, TetR/AcrR, AraC/XylS, y Lrp (Kotecka et al., 2021). En esta Tesis cobrará protagonismo el estudio de los reguladores transcripcionales pertenecientes a las familias LysR y AraC/XylS. La familia de reguladores LysR: el regulador NodD La proteína NodD, que juega un papel fundamental en simbiosis regulando la expresión de los genes simbióticos, pertenece a la familia de reguladores transcripcionales LysR. En organismos procariotas se encuentran numerosos reguladores que pertenecen a esta familia, ya que además de en simbiosis, están implicados en la regulación de otros procesos biológicos como la virulencia, la movilidad, la percepción de quorum o la regulación del metabolismo celular (Maddocks & Oyston., 2008). Las proteínas de tipo LysR están constituidas por aproximadamente 300 aminoácidos y dos dominios principales: el dominio amino-terminal, altamente conservado, formado por un motivo hélice-giro-hélice que se encarga de la unión al ADN; y el dominio carboxiloterminal, menos conservado, que participa en el reconocimiento del ligando y en la formación de complejos, que pueden ir desde homodímeros a homooctámeros (Schell, 1993; Kostiuk et al., 2013; Peck et al., 2013). En cualquier caso, estos reguladores INTRODUCCIÓN 22 transcripcionales, una vez activados en presencia del ligando, actúan uniéndose a regiones promotoras altamente conservadas, que en su mayoría son independientes de los promotores propios de los genes que regula. En el caso del regulador NodD de rizobios, estas regiones promotoras corresponden a las ya mencionadas cajas de nodulación (NBs), donde se une la proteína NodD para activar la expresión de los genes nod. Aunque inicialmente los reguladores de la familia LysR se identificaron como activadores de la transcripción, en la actualidad se sabe que pueden actuar activando o reprimiendo la transcripción de los genes a los que regula (Maddocks & Oyston., 2008). Por ejemplo, la proteína NodD2 de S. fredii NGR234 es necesaria para la formación de nódulos fijadores de N2, pero al mismo tiempo, actúa como represor de los genes nodABC. En el caso de S. fredii HH103 la mutación en el gen nodD2 conlleva a la síntesis de una mayor cantidad de NFs por activación de los genes nod, lo que permite a este rizobio establecer simbiosis efectiva con L. japonicus, planta en la que la estirpe silvestre no es capaz de inducir la formación de nódulos fijadores de nitrógeno (Fellay et al., 1998; Kobayashi et al., 2004; Acosta-Jurado et al., 2019). A pesar de que la proteína NodD aún no se ha conseguido cristalografiar, estudios de mutagénesis puntuales y aproximaciones bioinformáticas a partir de la cristalografía de otras proteínas similares, han permitido generar modelos predictivos de la estructura tridimensional del regulador NodD (Figura 5) (Peck et al., 2013). A día de hoy, no hay evidencias bioquímicas que demuestren que la activación de la proteína NodD en presencia de un flavonoide inductor sea por la interacción física entre ambos componentes. De hecho, no se ha descrito aún un flavonoide activador del regulador NodD de M. loti, o como en el caso del regulador NodD2 de R. tropici CIAT 899, que actúa activando la transcripción de los genes de nodulación y síntesis de NFs en ausencia de flavonoides, bajo una condición de estrés osmótico en el medio (Kelly et al., 2018; del Cerro et al., 2017). Estos datos llevan a considerar que existan otras moléculas o factores que medien la activación de los reguladores NodD y que el proceso de regulación en las primeras etapas de la simbiosis sea más complejo de lo que se conoce hasta el momento. INTRODUCCIÓN 23 La proteína NodD se ha identificado en todas las estirpes rizobianas, sin embargo, el número de copias del gen nodD pueden variar desde uno a cinco según la especie (Spaink, 2000; Ormeño-Orrillo et al., 2012). Por ejemplo, la especie de R. leguminosarum bv. trifolii posee una sola copia del gen nodD, mientras que las diferentes estirpes de S. fredii poseen dos versiones de este gen (Vinardell et al., 2015). Por otra parte, distintas cepas de R. tropici portan 5 copias de nodD en su genoma (van Rhijn et al., 1993). La familia de reguladores AraC/XylS La familia de reguladores transcripcionales de tipo AraC es otro abundante grupo de reguladores transcripcionales presentes en bacterias, que en su mayoría actúan como activadores de la transcripción (Gallegos et al., 1997). Estas proteínas se caracterizan por presentan un dominio carboxilo-terminal altamente conservado, conformado por dos motivos hélice-giro-hélice, responsable de la unión al ADN, y un dominio aminoterminal, más variable, implicado en el reconocimiento del ligando y en la oligomerización de la proteína (Yang et al., 2011). Figura 5. Modelo estructural de la proteína reguladora NodD1 de R. tropici CIAT 899. Imagen elaborada en Phyre2 (Protein Homology/analogY Recognition Engine V 2.0) (Kelley et al., 2015). INTRODUCCIÓN 24 El regulador transcripcional perteneciente a esta familia y que ha sido mejor caracterizado es el activador/represor transcripcional AraC de Escherichia coli, que regula al operón araBAD implicado en el metabolismo de la L-arabinosa, y cuya activación depende de la presencia de este mismo azúcar en el medio. En la región del operón araBAD se localizan 3 regiones de reconocimiento de AraC: los denominados sitios I1 e I2, localizados próximos al lugar de unión de la ARN polimerasa y, un poco más distante, la región O2 (Figura 6). En ausencia de arabinosa, el dímero AraC está unido a las regiones I1 y O2, causando la formación un loop o lazo en el ADN que impide la unión de la ARN polimerasa a la región promotora del operón araBAD y, por tanto, su expresión. Cuando la arabinosa está presente en el medio se une al dominio de reconocimiento del ligando de la proteína AraC, provocando un cambio conformacional del homodímero que pasa a ocupar las regiones I1 e I2. Este cambio de posición desencadena la disipación del loop de ADN, favoreciendo la unión de la ARN polimerasa a la región promotora y por consiguiente la transcripción de los genes que forman el operón (Seabold & Schleif, 1998). En la Figura 6 se muestra un modelo general del modo de acción de los reguladores de la familia AraC. La activación y cambio conformacional de estos reguladores viene dado en su mayoría por la unión a pequeños compuestos orgánicos, en su mayoría azúcares, como el caso descrito anteriormente del regulador AraC de E. coli. Aunque también pueden reconocer aminoácidos y a sus derivados, como el regulador SouR de Pseudomonas aeruginosa, cuya activación depende de la unión de N-metilglicina (sarcosina), o incluso, reconocer otras moléculas pequeñas como la urea, ligando de unión al regulador UreR de Providencia stuartii (Kotecka et al., 2021). Los reguladores de la familia AraC controlan diversas funciones celulares, siendo algunos de los ejemplos más estudiados el regulador GapR, que controla el metabolismo del carbono en Streptomyces aureofaciens activando la transcripción del gen gao, que codifica para la enzima gliceraldehido-3-fosfato deshidrogena; ExA, que regula la expresión de los genes del sistema de secreción tipo III en P. aeruginosa; la proteína OpiA que media la respuestas a estrés en Erwinia amylovora o el regulador QsvR de Vibrio parahaemolyticus, que modula el fenómeno de percepción de quorum y la virulencia en esta bacteria (Kotecka et al., 2021) INTRODUCCIÓN 25 A pesar de ser muy abundantes en bacterias y participar en diversos procesos biológicos, hasta la fecha, solo se ha descrito una proteína de la familia AraC con implicación directa en la simbiosis rizobio-leguminosa. Se trata del regulador para el que codifica el gen orf816 de la estirpe BR816 de Rhizobium sp. Cuando orf816 junto al gen nodD3 que lo antecede, se expresan de forma heteróloga en un mutante del gen nodD1 de S. fredii NGR234 mejora la habilidad simbiótica de esta estirpe para nodular en P. vulgaris a niveles superiores de lo que resulta la complementación única de nodD3 (Vlassak et al., 1998). Curiosamente, la estirpe R. tropici CIAT 899 presenta en su genoma hasta 21 genes que codifican para reguladores transcripcionales pertenecientes a la familia AraC y cuatro de ellos se localizan en el plásmido simbiótico, por lo que no sería sorprendente que los reguladores de esta familia jugasen un papel importante en simbiosis (Ormeño-Orrillo et al., 2012). Figura 6. Modelo general de actuación de los reguladores transcripcionales de la familia AraC/XylS. INTRODUCCIÓN 26 Otros determinantes simbióticos Aunque esta Tesis Doctoral no se centre de forma explícita en ellos, existen otros factores que van a determinar el grado del éxito simbiótico, como son los polisacáridos de superficie bacteriana, la movilidad de los rizobios, la formación de biopelículas, el fenómeno de percepción de quorum, los sistemas de secreción bacterianos o la síntesis de ácido indol acético (AIA), entre otros. (Figura 7). Polisacáridos de superficie bacteriana Los polisacáridos de superficie de las bacterias actúan como señales moleculares durante la simbiosis y como herramienta de protección frente a los sistemas de defensa de la planta (Downie, 2010). Se han descrito diferentes tipos de polisacáridos en rizobios: los exopolisacáridos (EPS), el polisacárido capsular tipo antígeno K (KPS), los lipopolisacáridos (LPS) y los glucanos cíclicos (CG) (Alías-Villegas et al., 2022). Numerosos estudios demuestran la importancia de estos azúcares en el reconocimiento planta-microorganismo. En el caso de S. fredii HH103, la activación de los genes de nodulación en presencia del flavonoide genisteína reduce la cantidad de KPS y promueve la síntesis de un nuevo tipo de LPS, modelando así la superficie celular de este rizobio en los primeros estadios de la simbiosis (Acosta-jurado et al., 2016b). También, en esta misma estirpe rizobiana, la producción de EPS se reprime en presencia de un flavonoide inductor a través de la proteína reguladora NodD1, y es un proceso que se requiere para una simbiosis optima con sus plantas hospedadoras (Acosta-jurado et al., 2016b). Sin embargo, esta parece ser la excepción, ya que el EPS es crucial para el éxito simbiótico en numerosos rizobios, especialmente en aquellos con un estrecho rango de hospedador, como S. meliloti, R. leguminosarum, y M. loti (Acosta-Jurado et al., 2020). En S. meliloti se ha demostrado que mutantes deficientes en la síntesis de EPS se ven comprometidos a la hora de desencadenar la curvatura de los pelos radicales y la formación de los tubos de infección en alfalfa (Pellock et al., 2000). De hecho, se ha identificado a una familia de proteínas receptoras de oligosacáridos en plantas leguminosas, los receptores EPR3, que mediante su unión a los EPS, facilitan la infección epidérmica de los rizobios, (Kawaharada et al., 2017; Wong et al., 2020; Acosta-Jurado et al., 2021). INTRODUCCIÓN 27 Movilidad bacteriana Los rizobios se pueden mover usando diferentes mecanismos. El tipo de movilidad más estudiada es la de tipo swimming, que permite a la bacteria moverse en medios acuosos mediante el movimiento del flagelo. No obstante, al igual que otras muchas bacterias, los rizobios pueden desplazarse sobre diferentes superficies usando otros mecanismos de movilidad, que pueden ser dependientes o independientes del flagelo (Mattingly et al., 2018; Alías-Villegas et al., 2022; Brito-Santana et al., 2023). La movilidad de los rizobios no es esencial para el establecimiento de la simbiosis, pero sí afecta a la eficiencia del proceso. Numerosos estudios han determinado que mutantes rizobianos afectados en el flagelo presentan defectos a la hora de colonizar las raíces, retrasos en la nodulación y/o reducción la capacidad competitiva de la bacteria (Alías-Villegas et al., 2022). De hecho, Fournier y colaboradores (2008) propusieron que el avance y desarrollo de los tubos de infección viene dado por la movilidad independiente del flagelo de las bacterias combinando con la división celular de los rizobios en el interior del IT. Curiosamente, un estudio reciente ha revelado que la maquinaria de ensamblaje flagelar es importante para el correcto funcionamiento de los bacteroides de R. leguminosarum en nódulos de Pisum sativum (Wheatley et al., 2020). Percepción de quorum La percepción de quorum (QS, del inglés Quorum Sensing) se define como un modo de regulación génica coordinado en respuesta a cambios en la densidad de una población bacteriana, en el que participan pequeñas moléculas señales denominadas autoinductores (AIs) (Phour et al., 2020; Miller & Bassler, 2001). Los genes regulados por QS están implicados en cambios en la fisiología de la población bacteriana, modificando su comportamiento global. Por ejemplo, los sistemas de QS regulan a genes que participan en la formación de biopelículas o biofilms, producción de EPS, movilidad bacteriana, virulencia o transferencia de material genético, siendo muchos de estos procesos decisivos para el correcto establecimiento de la simbiosis (Pérez-Montaño et al., 2014). De hecho, estos sistemas de comunicación bacteriana pueden establecerse incluso entre las poblaciones de bacterias presentes en los suelos a nivel intra e interespecífico. Así, se ha demostrado que la coinoculación de B. japonicum y Azospirillum brasilense en soja incrementa la biomasa de la planta debido a la comunicación interespecífica mediada por INTRODUCCIÓN 34 así como los genes de fijación de nitrógeno que se encuentran agrupados en diferentes operones (nifHDKENX, nifTBAfixXCBA y fixNOPQ). En la Figura 9 se muestra la organización de los genes simbióticos identificados en el pSym de CIAT 899 y en la Tabla 4 se detalla la función que corresponde a cada uno de ellos. Tabla 4. Genes simbióticos presentes en el pSym de R. tropici CIAT 899 y su función. Gen NB que lo antecede Función nodA1 NB1 Aciltransferasa nodB NB1 Quitina desacetilada nodC NB1 N-acetilglucosamina transferasa nodS NB1 N-metiltransferasa nodU NB1 O-carbomoil transferasa nodIJ NB1 Transportador de NFs nodH NB1 Sulfotransferasa nodPQ NB1 Síntesis de sulfato en forma activa nodA2 NB2 Aciltransferasa hsnT NB2 Función desconocida nodF,E NB2 Síntesis de ácidos grasos poliinsaturados Figura 9. Genes simbioticos y NBs dentificadas en el plásmido simbiótico de R. tropici CIAT 899. INTRODUCCIÓN 35 nodM NB3 Glucosamina sintasa y4wG NB4 Síntesis de ácido indol acético (AIA) y4wF NB4 Síntesis de ácido indol acético (AIA) y4wE NB4 Síntesis de ácido indol acético (AIA) rtciat899_pb01550 NB5 Función desconocida rtciat899_pb015545 NB5 Función desconocida rtciat899_pb00370 NB6 Función desconocida rtciat899_pb00375 NB6 Función desconocida rtciat899_pb00455 NB7 Función desconocida rtciat899_pb00495 NB8 Función desconocida nodD2 NB9 Regulador transcripcional de la familia LysR rtciat899_pb01075 NB9 Regulador transcripcional de la familia AraC rtciat899_pb00540 NB10 Función desconocida nodD5 Regulador transcripcional de la familia LysR nodD3 Regulador transcripcional de la familia LysR nodA3 Aciltransferasa fixNOPQG Componente citocromo oxidasa fixI Transportador de tipo ATPasa fixS Proteína de fijación de nitrógeno fixL Sensor histidina quinasa fixJ Proteína reguladora fixK Regulador transcripcional nodD1 Regulador transcripcional de la familia LysR fixA,B,C,X flavoproteína de transferencia de electrones fixX Ferredoxina nifA Regulador transcripcional de otros genes nif nifB Biosíntesis del cofactor Fe-Mo nifZ Proteína de fijación de nitrógeno nifT Proteína de fijación de nitrógeno NifT/FixT/FizU nifW Proteína de fijación de nitrógeno nifS Cisteína desulfurasa nifH Dinitrogenasa reductasa nifD α subunidad de la dinitrogenasa (proteína MoFe) INTRODUCCIÓN 36 nifK β subunidad de la dinitrogenasa (proteína MoFe) nifE,N,X Biosíntesis del cofactor Fe-Mo Síntesis y secreción de NFs en presencia de estrés osmótico y flavonoides. R. tropici CIAT 899 tiene la capacidad de producir un amplio rango de factores de nodulación bajo la influencia de diferentes tipos de estreses abióticos, siendo una característica que hace único a este rizobio. Los primeros estudios, se llevaron a cabo bajo condiciones de estrés por acidez. En ellos se demostraron que el perfil de NFs producidos por CIAT 899 a pH 4,7 y en presencia del flavonoide inductor apigenina es diferente al perfil de NFs liberados en presencia únicamente de apigenina a pH neutro. Concretamente se identificaron más de 50 NFs liberados a pH ácido, 29 a pH neutro y solo 15 de estas estructuras moleculares fueron común en ambas condiciones (Morón et al. en 2005). Es decir, la acidez del medio en presencia de un flavonoide inductor enriquece la producción de NFs. Siguiendo una aproximación similar se estudió la biosíntesis de NFs en CIAT 899 en presencia de un estrés osmótico por altas concentraciones de NaCl en el medio. Estévez y colaboradores (2009) demostraron por primera vez la capacidad de CIAT 899 de producir una mayor cantidad y variabilidad de NFs en presencia de estrés salino (NaCl 300 mM) y el flavonoide inductor apigenina, respecto a los NFs detectados únicamente en presencia del flavonoide apigenina. Años más tarde, fue Guasch-Vidal y colaboradores (2013) quienes demostraron por primera vez en los rizobios, que incluso en ausencia del flavonoide inductor apigenina, CIAT 899 es capaz de sintetizar NFs en presencia de estrés salino. Además, revelaron que la vía de activación de la síntesis de NFs bajo condiciones de estrés osmótico es independiente del regulador NodD1, pues la mutación en el gen nodD1 resultó en la perdida de la capacidad de producir NFs en presencia de apigenina, pero no suprimió la síntesis de estas moléculas en presencia de NaCl 300 mM (Guasch- Vidal et al., 2013) (Figura 10). Posteriormente, se demostró que es la proteína reguladora NodD2 la responsable de llevar a cabo la síntesis de NFs en presencia de estrés osmótico, puesto que la inactivación del regulador NodD2 suprime la capacidad de CIAT 899 de producir NFs en presencia de INTRODUCCIÓN 37 estrés osmótico, pero no en presencia de apigenina. Asimismo, se observó que la pérdida de ambas proteínas, NodD1 y NodD2, es suficiente para abolir la síntesis de NFs en CIAT 899, en ambas condiciones de cultivo (Figura 10) (del Cerro et al., 2017). Existen evidencias que señalan que el proceso simbiótico es altamente sensible al estrés osmótico y que, por ello, numerosos rizobios emplean mecanismos adaptativos para poder sobrevivir en estos ambientes, como por ejemplo la acumulación de osmolitos compatibles, cambios en los polisacáridos de superficie o potenciando la expresión de transportadores de membrana de tipo ABC. Sin embargo, la habilidad de activar la síntesis NFs en condiciones de estrés osmótico únicamente se ha demostrado en CIAT 899 y, muy recientemente, en S. fredii HH103 (Guasch-Vidal et al., 2013; Fuentes-Romero et al., 2023). Respecto a sus capacidades simbióticas, la estirpe CIAT 899 induce nódulos fijadores de nitrógeno en al menos P. vulgaris, L. burttii y L. japonicus. Los mutantes simples en los genes nodD1 y nodD2 mantienen la capacidad de nodular en con las plantas P. vulgaris y L. burttii, aunque la eficiencia del proceso sí se ve comprometida, disminuyendo significativamente el número de nódulos y el peso seco de las plantas. Sin embargo, el regulador NodD1 si es esencial para inducir la formación de nódulos en L. japonicus. Por otro lado, el doble mutante nodD1nodD2 pierde la capacidad de nodular en las tres Figura 10. Cromatografía en capa fina (TLC, del inglés Thin Layer Chromatography) del perfil de NFs liberados por la estirpe silvestre (WT) y los mutantes en los genes nodD1 y nodD2 en diferentes condiciones: C (sin molécula inductora), S (NaCl 300 mM) y A (Apigenina 3,7 µM). Imagen tomada y modificada de del Cerro et al 2017. INTRODUCCIÓN 38 leguminosas hospedadoras, lo que refuerza la importancia de estas proteínas en simbiosis (del Cerro et al., 2015, 2017). Estudios transcriptómicos en Rhizobium tropici CIAT 899 La secuenciación del genoma de CIAT 899 ha permitido realizar estudios transcriptómicos con el fin de entender los mecanismos reguladores que gobiernan la síntesis de NFs en esta bacteria. Los primeros estudios de ARN-seq llevados a cabo en CIAT 899 en presencia de apigenina y bajo condiciones de estrés salino demostraron que el mismo grupo de genes localizados en el plásmido simbiótico se expresan de forma diferencial en ambas condiciones. Estos genes corresponden a los genes nodA1BCSUIJH [controlado por la NB1], nodA2hsnTnodFE [NB2], nodM [NB3], y4wEF [NB4], y a los genes rtciat899_pb01550 y rtciat899_pb01545 [NB5] (Pérez-Montaño et al., 2016). Curiosamente, estos ensayos revelaron que el gen nodD2 y el gen rtciat899_pb01075, que codifica para un regulador transcripcional de la familia AraC, se activan transcripcionalmente únicamente en presencia de NaCl 300 mM. De esta forma, se demostró por primera vez la activación transcripcional de los genes de nodulación en presencia de estrés salino. Posteriormente, estudios de expresión de los genes simbióticos en los mutantes de los genes nodD1 y nodD2 confirmaron que la vía de activación de estos genes simbióticos se debe a la acción de las proteínas NodD1 y NodD2 en presencia de un flavonoide inductor y bajo condiciones de estrés osmótico, respectivamente. Además, las vías de biosíntesis de los NFs mediadas por estos reguladores parecen no ser totalmente independientes, ya que el regulador NodD1, de algún modo, parece ser necesario para una síntesis óptima de los NFs en condiciones de estrés osmótico. Esto se deduce tras observar que la activación transcripcional de los genes simbióticos en presencia de un estrés osmótico es significativamente menor en ausencia de NodD1 (del Cerro et al., 2017). EL HOSPEDADOR: Las leguminosas Las plantas leguminosas utilizadas en esta Tesis Doctoral han sido P. vulgaris (judía), L. japonicus y L. burttii. INTRODUCCIÓN 39 Phaseolus vulgaris P. vulgaris, comúnmente conocida como frijol o judía, es una especie de planta leguminosa originaria del sur y América central. En la actualidad, esta planta se cultiva en todos los continentes debido a su gran valor nutricional, siendo una potente fuente de proteína vegetal, minerales, antioxidantes y compuestos bioactivos (Shamseldin et al., 2020; Karavidas et al., 2022). La leguminosa P. vulgaris puede crecer en diferentes condiciones edafo-climáticas y, dentro de esta especie, encontramos diversas biovariedades que se diferencian en el tiempo de crecimiento y producción de semillas, tamaño, forma y coloración (de Ron et al., 2015). Es, además, considerada una planta promiscua por su capacidad de establecer simbiosis efectiva con un grupo genéticamente muy heterogéneo de rizobios (Laeremans & Vanderleyden, 1998; Martínez-Romero, 2003). Lotus japonicus y Lotus burttii L. japonicus se ha empleado como modelo experimental en el estudio de la simbiosis rizobio-leguminosa debido a su pequeño tamaño, su ciclo de vida corto (2-3 meses) y la disponibilidad de recursos genéticos y moleculares tras la secuenciación de su genoma, que es diploide (n=6) y relativamente pequeño (472 Mb) en comparación con el genoma de otras leguminosas (Sato et al., 2008). En cuanto a L. burttii, se trata de una especie muy cercana filogenéticamente a L. japonicus, lo que permite que se puedan cruzar. Además, florece y semilla en menos tiempo que L. japonicus, convirtiendo a esta planta en otra herramienta importante en investigación a pesar de que su genoma aún no se ha secuenciado (Kawaguchi et al., 2005). Vesículas extracelulares de membrana Las vesículas extracelulares de membrana, abreviadas como MVs (del inglés, Membrane Vesicles), son pequeños compartimentos esféricos formados por una bicapa lipídica, que se originan a partir de evaginaciones de la membrana de las células (Beveridge, 1999). INTRODUCCIÓN 40 La formación de estas vesículas parece ser un proceso común en todos los organismos eucariotas y procariotas, tanto en bacterias como en arqueas (Schwechheimer & Kuehn et al., 2015). El ámbito de estudio de las MVs es muy extenso y diverso, ya que estas nanoesferas lipídicas, que pueden oscilar desde 20 a 400 nm de diámetro, contienen en su interior moléculas de diferente naturaleza bioquímica y están implicadas en numerosos fenómenos celulares (Sartorio et al., 2021). De hecho, son cada vez más los procesos biológicos que se asocian a la liberación de vesículas de membrana. Ruta de biogénesis y cargo de las MVs en bacterias Gramnegativas En bacterias Gram-negativas, las MVs se pueden liberar al medio extracelular mediante eventos de evaginación de la envoltura celular o a partir de la lisis explosiva de la célula, e independientemente al mecanismo que las libera, las MVs pueden estar constituidas por una única membrana, si se han generado a partir de la membrana externa de la bacteria (OMV, del inglés Outer Membrane Vesicle) o pueden englobar ambas membranas, externa e interna (OIMV, del inglés Outer-Inner Membrane Vesicle) (Figura 11) (Toyofuku et al., 2023). En cuanto al cargo de estas vesículas, es decir a las moléculas que contienen en su interior o asociadas a ellas, se puede encontrar una gran variedad de proteínas (citosólicas, periplasmáticas o de membrana), lípidos (LPS, peptidoglicanos o fosfolípidos, entre otros), material genético (ADN o ARN) u otras sustancias como antibióticos, iones, metales, etc. (Lindmark et al., 2009; Koeppen et al., 2016; Vanaja et al., 2016). Incluso, estudios recientes han reportado la presencia de fagos en el interior de estas partículas (Toyofuku et al., 2023). INTRODUCCIÓN 41 Procesos biológicos en los que participa Las MVs liberadas por bacterias participan en una amplia variedad de procesos biológicos, como en la transferencia horizontal de material genético, en la liberación de proteínas mal plegadas originadas ante diferentes tipos de estreses, en el establecimiento de biopelículas, en la adquisición de nutrientes y metales como por ejemplo el hierro, en la resistencia a antibióticos o en la modulación de la respuesta inmune del hospedador en el caso de organismos patógenos (Schwechheimer & Kuehn, 2015; Haurat et al., 2015; Jan, 2017). No es sorprendente que las MVs tomen parte en importantes eventos biológicos, ya que actúan como una potente herramienta en la adaptación de los diferentes organismos al medio (Schwechheimer & Kuehn, 2015). Especialmente, son importantes en la secreción de moléculas hidrofóbicas, por ejemplo, favorecen la solubilización de proteínas asociada a membrana, toxinas o factores de virulencia, que en su mayoría son poco solubles en agua. Además, las MVs actúan como barrera de protección de los elementos que contienen frente a la degradación de enzimas hidrolíticas u otras condiciones fisicoquímicas del medio extracelular, como el choque térmico (Toyofuku et al., 2023). Figura 11. Tipos de MVs en base al mecanismo de liberación al medio extracelular y a su estructura: OIMV (Outer-Inner Membrane Vesicles) y OMV (Outer Membrane Vesicles). INTRODUCCIÓN 42 Otra de las grandes ventajas que supone esta vía de secreción es la capacidad de mantener las moléculas concentradas con el fin de garantizar su actividad a largas distancias. Es decir, si se compara el modo de secreción de una molécula a través de MVs versus difusión pasiva o mediante transportadores, las moléculas secretadas mediante transportadores difunden en el medio de modo que a cierta distancia no alcanzan la concentración suficientemente para mantener su actividad biológica. Sin embargo, las moléculas liberadas en MVs se mantendrán concentradas en el interior de estos compartimentos y, aunque estas vesículas difundan en el medio, una sola de ellas puede contener la concentración suficiente para desencadenar una respuesta en su célula diana, garantizando así la actividad biológica de las moléculas a largo alcance (Figura 12). Este fenómeno se ha descrito recientemente en Paracoccus sp., que libera moléculas hidrofóbicas de percepción de quorum vía MVs, y se ha denominado como “quantal secretion” (Toyofuku et al., 2023). Las MVs también se han descrito como un mecanismo de comunicación en bacterias. Esta comunicación puede ser intraespecífica, interespecífica o incluso, entre organismos de diferentes reinos, pudiendo ser una célula vegetal o animal diana de las vesículas Figura 12. Modelo comparativo de la liberación de una molécula señal al medio extracelular mediante difusión pasiva (A) y a través de vesículas de membrana (B). Imagen tomada y modificada de Toyofuku et al., 2023. INTRODUCCIÓN 43 liberadas por una bacteria. De hecho, muchos autores incluyen a las vesículas dentro de los sistemas de secreción de las células, atribuyéndoles el nombre de sistema de secreción de tipo 0 (T0SS), ya que funcionan como transportadores de biomoléculas desde el interior celular al medio extracelular, interfiriendo con las funciones fisiológicas de su célula diana (Guerrero-Mandujano et al., 2017) El mecanismo por el cual se selecciona el cargo de las MVs es un gran enigma. Del mismo modo, se desconocen las bases que regulan la especificidad de las MVs y sus células dianas (Schwechheimer & Kuehn et al., 2015). Diferentes hipótesis sugieren que puede deberse a cambios en los potenciales de las membranas o por el reconocimiento de ciertos ligandos por receptores específicos de las células dianas (Tashiro et al., 2017; Renelli et al., 2004; Toyofuku et al., 2017, 2023). MVs y plantas En los últimos años, los estudios destinados a las MVs liberadas por bacterias Gramnegativas y su interacción con las plantas han generado un fuerte impacto. En su mayoría, estos trabajos se centran en estudiar papel de las MVs liberadas por organismos patógenos mediando la respuesta inmune de las plantas (Sidhu et al., 2008; Bonnington & Kuehn, 2014; Solé et al., 2015; Katsir & Bahar, 2017; Feitosa-Junior et al., 2019). Así, se ha demostrado que las vesículas liberadas por Xanthomonas campestris pv. vesicatoria y Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 contienen potentes elicitores inmunogénicos, como el antígeno O que conforma el LPS, con la función de evadir la respuesta de defensa de la planta mientras el patógeno transmite factores de virulencia en la célula hospedadora (Chowdhury & Jagannadham, 2013; Solé et al., 2015). En cambio, otros estudios manifiestan que las MVs de ciertos organismos patógenos actúan como activadores de los sistemas de defensa de la planta, como es el caso de las MVs de X. campestris pv. Campestris ATCC 33913 y X. oryzae pv. oryzae PXO99, que portan el factor de elongación EF-Tu que es percibido por receptores del sistema inmune de Arabidosis thaliana (Katsir & Bahar, 2017). En la actualidad, la gran parte de los estudios están destinado a la interacción plantapatógeno y muy pocos están involucrados en el estudio de las vesículas liberadas por microrganismos simbiontes, como es el caso de los rizobios (Sartorio et al., 2021). Así, el estudio de las vesículas de membrana liberadas por rizobios y su implicación en functioning of AraC-like regulator proteins have been poorly investigated in rhizobia. In Sinorhizobium meliloti 2011, an AraC-like transcription factor (CuxR) stimulates exopolysaccharide biosynthesis at elevated c-di-GMP levels (38), and it is also required for the induction of genes needed for ␣ -galactoside utilization (39). In S. meliloti 2011, genes involved in the biosynthesis and transport of a siderophore produced under ironstarving conditions, the rhbABCDEF operon, are positively regulated by the product of the rhrA gene, an AraC-type transcriptional activator (40). In Bradyrhizobium sp. strain HW13, the AraC-type transcriptional regulator CadR controls the expression of the cadABKC cluster, which is involved in the conversion of several phenoxyacetic acids to their corresponding phenol derivatives (41). To our knowledge, there is only one report of an AraC-type protein involved in symbiosis in S. fredii NGR234. This bacterium improves its ability to symbiose with P. vulgaris through the heterologous expression of orf816 (coding for an AraC/XylS-type transcriptional regulator) from Rhizobium sp. strain BR816 (42). We have studied here the role in symbiosis of an undescribed AraC-type transcriptional regulator encoded by the R. tropici CIAT 899 RTCIAT899_PB01075 gene. We determined that this AraC-type regulator is necessary for a successful symbiosis with P. vulgaris and is involved in the transcriptional activation of the nod genes and NF synthesis under salt stress conditions. Bacterial two-hybrid analysis demonstrated that the AraC-type and NodD2 proteins can not only homodimerize but also form an AraC-type/NodD2 heterodimer, which could be responsible for the production of symbiotic molecules in the presence of osmotic stress conditions. In accordance with these findings, we renamed this AraC-type transcriptional regulator as OnfD (osmotic Nod factor regulator). RESULTS The OnfD amino acid sequence is conserved in Rhizobium tropici CIAT 899- related rhizobial strains but not in the other studied AraC-type regulators. OnfD (349 amino acids [aa], AGB73490.1), the deduced protein sequence of the CIAT 899 onfD gene with a predicted molecular mass of 42 kDa, is widespread in rhizobia and is highly conserved among CIAT 899-related strains. Its sequence is identical to the AraC-type regulators of R. freirei PRF 81 (ENN88367.1) and Rhizobium sp. strains CCGE531 (AYG70418.1), CCGE532 (AYG76959.1), and SEMIA 4088 (WP_004112928.1). It shows 94% identity to the Rhizobium sp. strain NXC24 protein (AVA24063.1), 81% identity to that of R. jaguaris CCGE525 (AYG64285.1), and ⬍70% identity to an AraC- type regulator from R. grahamii CCGM3 (RDJ02018.1). As a first approach to understanding the putative function of OnfD, we performed a maximum-likelihood phylogeny analysis where we also included the AraC-type proteins characterized in previous studies (Fig. 1A). As expected, the AraC-type proteins of the strains phylogenetically related to CIAT 899 were grouped with OnfD. Interestingly, AraC/XylS (ORF816) from Rhizobium sp. strain BR816, which is involved in nodule formation, was also included in this group, suggesting that OnfD might be involved also in symbiosis. On the bottom branch of the tree, there were other AraC-like regulators (RhrA, CuxR, CadR, and AraC) that were not related phylogenetically either with OnfD or among themselves. The nodD2 and onfD genes are not cotranscribed but are simultaneously activated in the presence of osmotic stress conditions. The NB9 promoter in the CIAT 899 genome is located 979 and 2,123 bp upstream of the nodD2 (RTCIAT899_ PB01070) and onfD (RTCIAT899_PB01075) start codons, respectively. To determine the regulation of these two genes in the presence of flavonoids (3.7 ␮ M apigenin) and osmotic stress (300 mM salt and 400 mM mannitol), RNA sequencing (RNA-seq) data deposited in public repositories (PRJNA470887,PRJNA326592, and PRJNA305690) were reanalyzed to obtain the fold change values for the nodD2 and onfD genes with respect to noninduced cultures (Table 1). In the wild-type CIAT 899 strain, the transcriptional activation of nodD2 and onfD was detected in cultures supplemented with salt (nodD2 ⫽3.01 and onfD ⫽3.87) or mannitol (nodD2 ⫽2.26 and onfD ⫽3.61) but not with apigenin (nodD2 ⫽⫺1.25 and onfD ⫽1.15) and also not in a nodD1 mutant OnfD Controls Nod Factor Synthesis under Salt Stress Applied and Environmental Microbiology October 2020 Volume 86 Issue 19 e01297-20 aem.asm.org 3 on January 27, 2021 at USE/BCTA.GEN UNIVERSITARIAhttp://aem.asm.org/Downloaded from 50 background (Table 1). Nevertheless, in a nodD2 mutant background, onfD expression in the presence of both osmotic stress conditions remained activated (salt ⫽2.55 and mannitol ⫽3.55), suggesting that NodD2 was not required for the onfD upregulation. To further investigate whether the two genes were cotranscribed, we used reverse transcription-PCR (RT-PCR) to detect putative CIAT 899 mRNAs covering the 3=start site FIG 1 (A) Molecular phylogenetic tree analysis generated by using the maximum-likelihood method. The percentage of trees in which the associated taxa clustered together is shown next to the branches. The tree is drawn to scale, where the branch lengths are measured in the number of substitutions per site. All positions containing gaps and missing data were eliminated. AraC-type regulators (green) are involved in nodulation. ‘, AraC-type regulators with known functions. (B) Cotranscription assays of Rhizobium tropici CIAT 899 nodD2 and onfD genes, including the genetic organization of the nodD1-nodA1-nodB and nodD2-onfD regions. Solid lines show the positions of the nodD1-nodA1 (segment 1), nodA1-nodB (segment 2), and nodD2-onfD (segment 3) fragments that were assayed in PCR (gDNA) and RT-PCR (cDNA) experiments. Agarose gel electrophoresis shows the results from PCR and RT-PCR experiments. Amplicon 1 size, 1,373 bp; amplicon 2 size, 761 bp; amplicon 3 size, 1,022 bp. (C) Identification of the putative inducer (in red) and operator (in pink) sites of the onfD promoter region. Tandem repeat sequences are displayed. TABLE 1 Fold change values of the R. tropici CIAT 899 genes located downstream of the nod box 9 in different genetic backgrounds Locus tag/gene Fold change a CIAT 899 (12, 20, 21) nodD1 mutant (12, 20) nodD2 mutant (12, 20, 21) onfD mutant (this study) A S M NIC A S NIC A S M NIC A S RTCIAT899_PB01570/nodD2 –1.25 3.01 2.26 –1.88 1.45 1.03 – – – – ⫺1.10 1.10 ⫺1.28 RTCIAT899_PB01575/onfD 1.15 3.87 3.61 –1.22 –1.29 1.44 1.27 1.49 2.55 3.51 – – – a Significant transcriptional changes (ⱖ3-fold induction respect to CIAT 899 noninduced cultures) in the presence of apigenin (3.7 ␮ M) (A), salt (300 mM) (S), and mannitol (400 mM) (M) are highlighted in dark gray. NIC, noninduced culture. Slight transcriptional changes (ⱖ2-fold induction/⬍3-fold induction) are highlighted in light gray. Source references are indicated in parentheses. –, gene is mutated on this genetic background. del Cerro et al. Applied and Environmental Microbiology October 2020 Volume 86 Issue 19 e01297-20 aem.asm.org 4 on January 27, 2021 at USE/BCTA.GEN UNIVERSITARIAhttp://aem.asm.org/Downloaded from 51 of nodD2 and the 5=end of onfD (Fig. 1B) that had been obtained in the absence of inducing molecules. As a positive control, we used primer pairs that allow the amplification of fragments of both nodA1 and nodB genes. As a negative control, primer pairs of both nodD1 and nodA genes (divergent orientation) were used. All of these primer pairs allowed the amplification of fragments of the expected size when CIAT 899 gDNA was used as the template. However, when cDNA from a noninduced culture of CIAT 899 was used, only the nodA1-nodB fragment (761 bp) was amplified (Fig. 1B). These results confirm that the R. tropici CIAT 899 nodD2 and onfD genes do not belong to the same transcriptional unit. The intergenic nodD2-onfD region (205 bp) was also investigated for the identification of direct (tandem) repeats, since a consensus sequence formed by tandem repeats is present in all AraC-type promoters, allowing protein binding (araI1 and araI2 inducer sites) (25). Two tandem repeats were identified in the promoter region of onfD (Fig. 1C), which could correspond to onfI1 and onfI2 inducer sites. As previously mentioned, the AraC regulator in E. coli acts as an activator or repressor depending on the presence of the ligand (24). Thus, in the absence of the inducing molecule, one monomer of the AraC occupies araI1 while the other monomer occupies the operator site araO2 (also a tandem repeat) ⬃200 bp upstream (26–30). Interestingly, in CIAT 899, a tandem repeat was also identified 202 bp upstream of the putative onfI1 site, within the nodD2 gene, which could correspond to the onfO2 site (Fig. 1C). This suggests that OnfD may be involved in the transcriptional regulation of the onfD and nodD2 genes. OnfD activates nod gene expression and NF production under salt stress conditions. In a previous report from our research group, we determined that the CIAT 899 NodD2 protein regulates the production of NF under salt stress (21). However, the underlying molecular mechanism remains uncertain. Since both nodD2 and onfD, located downstream of NB9, are activated under osmotic stress, we studied the putative implication of OnfD in nod gene upregulation and NF synthesis under these conditions. Thus, plasmid pMP240, harboring the conserved nodA promoter of R. leguminosarum bv. viciae fused to the lacZ reporter gene, was first transferred by conjugation to the CIAT 899 wild-type strain, as well as to the onfD deletion mutant (ΔonfD) and its complemented strain. ␤ -Galactosidase assays showed similar activation levels in the presence of apigenin (3.7 ␮ M), salt (300 mM), and mannitol (400 mM) in all the strains, with the exception of the onfD mutant, in which the activation of the promoter was detected in cultures supplemented with apigenin but not in the presence of salt or mannitol (Fig. 2A). This assay pointed out that OnfD is involved in the transcriptional activation of nod genes under osmotic stress conditions. To confirm the previous results, plasmids harboring the promoter regions containing the NB of the CIAT 899 nodA1 and nodA2 genes fused to lacZ were obtained and conjugated to the CIAT 899 wild-type strain and the onfD mutant. Then, ␤ -galactosidase assays were performed in the presence or in the absence of apigenin, mannitol, and salt (Fig. 2B). As previously happened, nodA1 and nodA2 promoter activations were detected in both assayed strains in the presence of apigenin, whereas promoter activation under osmotic stress conditions was only detected in the wild-type strain (Fig. 2B). Considering the correlation between ␤ -galactosidase assays and NF production (19–21) and in order to make more feasible the experimental approach, we only used 300 mM salt to induce osmotic stress. Thus, the correlation between upregulation of the nodA1 and nodA2 expression and synthesis of NF in the ΔonfD mutant was demonstrated by reversedphase thin-layer chromatography (RP-TLC) (Fig. 2C). The NF profiles of the wild-type and the ΔonfD mutant strains were obtained radioactively labeling NF with 14 C. The TLC assay showed that in the absence of OnfD, NF production was abolished in the presence of high concentrations of salt but not in the presence of apigenin. For an in-depth analysis, the chemical identification of the NF produced by the ΔonfD mutant was also obtained by UHPLC-MS/MS in the presence of apigenin (3.7 ␮ M) or NaCl (300 mM) (see Table S1 in the supplemental material). In a previous study, 36 and 29 NF were detected in CIAT 899 supernatants in the presence of salt and apigenin, respectively (43). Here, as a positive control of NF production, the supernatant of the CIAT 899 OnfD Controls Nod Factor Synthesis under Salt Stress Applied and Environmental Microbiology October 2020 Volume 86 Issue 19 e01297-20 aem.asm.org 5 on January 27, 2021 at USE/BCTA.GEN UNIVERSITARIAhttp://aem.asm.org/Downloaded from 52 FIG 2 (A and B) ␤ -Galactosidase activities of the CIAT 899 ⌬onfD strain carrying plasmid pMP240 (R. leguminosarum bv. viciae nodA promoter) and pMP220, which contains the CIAT 899 nodA1 and nodA2 promoters fused to the lacZ gene. Assayed conditions included YM medium (–), YM supplemented with 300 mM NaCl (S), YM supplemented with 400 mM mannitol (M) and YM supplemented with 3.7 ␮ M apigenin (A). Parameters were individually compared to that obtained in YM medium (–) by using a Mann-Whitney nonparametric test. Values tagged by asterisks (*) are significantly different at the level ␣ ⫽5%. Error bars represent the standard deviations of data. (C) TLC analysis of Nod factors produced by CIAT 899 and ⌬onfD mutant grown in YM medium (–), YM supplemented with 300 mM NaCl (S), and YM supplemented with 3.7 ␮ M apigenin (A). del Cerro et al. Applied and Environmental Microbiology October 2020 Volume 86 Issue 19 e01297-20 aem.asm.org 6 on January 27, 2021 at USE/BCTA.GEN UNIVERSITARIAhttp://aem.asm.org/Downloaded from 53 wild-type strain grown in the presence of both apigenin and salt was employed (25 different NF). The mass spectrometry analyses showed that the ΔonfD strain synthesizes 29 NF in the presence of apigenin but only 4 NF under salt stress conditions. These results indicated that OnfD is involved in the production of NF in CIAT 899 under salt stress conditions. In our previous transcriptomic studies of CIAT 899, at least 17 genes located in the symbiotic plasmid and controlled by 5 different NB were overexpressed in the presence of both inducer molecules, apigenin and salt (12). To determine whether transcriptional activation of all the symbiosis-related genes under salt stress conditions is mediated by OnfD, 6 RNA-seq libraries (PRJNA605332) were generated from the onfD mutant grown in the presence or absence of apigenin (3.7 ␮ M) and salt (NaCl 300 mM) (two independent biological experiments for each condition). These RNA-seq libraries were compared with an RNA-seq library from the wild-type strain grown in the absence of inducing molecules (PRJNA305690) (see Data Set S1 in the supplemental material). Quality control of each run, sample normalizations and statistical procedures were performed as previously described (12). The data set was validated by quantitative RT-PCR (qRT-PCR), obtaining in all cases positive correlation degrees in fold change values of 7 selected genes between the qRT-PCR and the RNA-seq data (see Data Set S2). Focusing our attention on these 17 symbiosis-related genes upregulated in the presence of both inducing molecules, RNA-seq experiments indicated that their transcriptional activation was detected in cultures of the ΔonfD mutant supplemented with apigenin but not with salt, confirming the role of OnfD in the transcriptional activation of these symbiotic genes under salt stress (Table 2). The fold change values of the nod genes in the onfD mutant in the presence of apigenin (induction) and salt (noninduction) were similar to those previously observed for the nodD2 mutant strain under the same conditions (Fig. 3A). Interestingly, transcriptomic data from CIAT 899 grown in the presence of salt showed that the nodD2 salt-mediated upregulation did not occur in the onfD mutant background, indicating that OnfD is involved in the regulation of nodD2 expression under salt stress condition (Tables 1 and 2). The RNA-seq data also showed that other genes, related to nonsymbiotic biological processes, were differentially regulated in the onfD mutant. Therefore, a functional enrichment from the RNA-seq data in the onfD mutant was carried out to assign the statistically overrepresented biological processes (activated or repressed) using data available at the UniProt database (Gene Ontology [GO]). All the biological processes differentially regulated in the onfD mutant are shown in Data Set S3 in the supplemental material. Remarkably, in the absence of nod gene-inducing molecules, some of the differentially downregulated genes were involved in bacterial-type flagellumdependent cell motility, chemotaxis and polysaccharide transport (Fig. 3B). All of these biological processes were also differentially activated/repressed in the presence of apigenin, indicating that OnfD may be involved in the regulation of several other biological processes. The presence of apigenin exclusively activated a set of biological processes such as hydrogen sulfide biosynthesis, phenylacetate catabolism, and, as expected, nodulation, whereas some biological processes were shared also with salt conditions, such as ATP hydrolysis, coupled proton transport, and polysaccharide synthesis and transport (this last one was downregulated in all tested conditions). Finally, the presence of salt specifically induced other biological processes such as ATP synthesis coupled to electron transport, inositol phosphate dephosphorylation, and protein transport. The activation of the OnfD-mediated NF production under salt stress is necessary for a successful symbiosis with Phaseolus vulgaris.To determine the symbiotic importance of the OnfD regulator, the symbiotic interactions of CIAT 899 and the onfD mutant on P. vulgaris,L. japonicus, and L. burttii were analyzed (Fig. 4A). In our previous study, the absence of NodD1 was enough to abolish nodulation in L. japonicus, while the absence of both NodD1 and NodD2 resulted in a lack of nodules in P. vulgaris and L. burttii roots (16, 21). In line with these previous results, we obtained two new CIAT 899 double-mutant strains for the onfD-nodD1 and onfD-nodD2 genes. The OnfD Controls Nod Factor Synthesis under Salt Stress Applied and Environmental Microbiology October 2020 Volume 86 Issue 19 e01297-20 aem.asm.org 7 on January 27, 2021 at USE/BCTA.GEN UNIVERSITARIAhttp://aem.asm.org/Downloaded from 54 TABLE 2 Fold change values of the R. tropici CIAT 899 genes located downstream of functional nod boxes NB Locus tag/gene(s) Function Fold change a CIAT 899 apigenin (12) nodD2 mutant apigenin (21) onfD mutant apigenin (this study) CIAT 899 salt (12) nodD2 mutant salt (21) onfD mutant salt (this study) 1 RTCIAT899_PB1300 to RTCIAT899_PB01340/nodABCSUIJH NF production 8.73 to 3.09 10.85 to 1.73 6.97 to 1.45 13.66 to 7.6 ⫺1.12 to ⫺1.74 ⫺1.43 to ⫺1.30 2 RTCIAT899_PB01095 to RTCIAT899_PB01110/nodA2 hsnT nodFE NF production 10.3 to 10.37 8.29 to 6.34 9.07 to 6.73 9.81 to 11.94 1.07 to 1.46 ⫺1.42 to ⫺1.30 3 RTCIAT899_PB02710/nodM NF production 2.43 2.79 7.29 5.85 1.31 1.08 4 RTCIAT899_PB00575 to RTCIAT899_PB00565/y4wEF Synthesis of IAA 8.57 to 3.2 4.25 to ⫺1.83 5.16 to 3.50 12.17 to 7.11 ⫺1.12 to ⫺1.3 ⫺1.64 to ⫺1.49 5 RTCIAT899_PB01550 to RTCIAT899_PB01545/HP Unknown 6.75 to 4.26 4.1 to 2.35 2.46 to 1.91 28.65 to 14.37 1.96 to 1.42 1.14 to 1.04 9 RTCIAT899_PB01570/nodD2 Transcriptional regulation ⫺1.25 1.10 3.01 ⫺1.28 a Transcriptional activation (ⱖ3-fold induction with respect to CIAT 899 noninduced cultures) of several NB-controlled operons was demonstrated by RNA-seq experiments in the presence of both inducer molecules (dark gray boxes). Slight transcriptional changes (ⱖ2-fold induction/⬍3-fold induction) are highlighted in light gray. HP, gene that codes for a hypothetical protein. Source references are indicated in parentheses. del Cerro et al. Applied and Environmental Microbiology October 2020 Volume 86 Issue 19 e01297-20 aem.asm.org 8 on January 27, 2021 at USE/BCTA.GEN UNIVERSITARIAhttp://aem.asm.org/Downloaded from 55 FIG 3 (A) Scatterplot representing the fold change values of the nod genes differentially expressed obtained in the RNA-seq assays from R. tropici CIAT 899 and onfD and nodD2 mutants. Vertical and horizontal axis represent the values obtained in apigenin and salt conditions, respectively. Blue and light green circles represent the fold changes in our previous RNA-seq studies of the R. tropici CIAT 899 and nodD2 mutant strains, respectively (12, 21). Orange circles represent the fold change levels observed in RNA-seq of the onfD mutant. (B) Venn diagram showing the biological processes differentially upregulated (in red), downregulated (in blue), or both (in black) in the onfD mutant in the presence or in the absence of apigenin and salt. The statistically overrepresented biological processes are from the data available at the UniProt database (GO) (see Data Set S3 in the supplemental material). OnfD Controls Nod Factor Synthesis under Salt Stress Applied and Environmental Microbiology October 2020 Volume 86 Issue 19 e01297-20 aem.asm.org 9 on January 27, 2021 at USE/BCTA.GEN UNIVERSITARIAhttp://aem.asm.org/Downloaded from 56 number of nodules in the two examined Lotus plants inoculated by the onfD mutant was not statistically different from those obtained in the parental strain CIAT 899, unless both NodD2/OnfD were absent, where significantly fewer nodules were observed. In contrast, both onfD and onfD-nodD2 mutants presented a significantly reduced number of nodules in P. vulgaris in comparison to those plants inoculated with the parental strain. Interestingly, as occurred with the nodD1-nodD2 mutant (21), no plants inoculated with onfD-nodD1 presented nodules, highlighting the similar roles of NodD2 and OnfD in the symbiotic process. In line with these results, a time course nodulation assay in P. vulgaris showed an early delay in the nodulation process of the ΔonfD strain in FIG 4 (A) Plant responses to inoculation of common bean and Lotus plants with different R. tropici CIAT 899 strains. P. vulgaris plants were evaluated 30 days postinfection (dpi). Lotus plants were evaluated 45 dpi. Parameters were individually compared to that obtained with the parental strain CIAT 899 by using the Mann-Whitney nonparametric test. Values tagged with an asterisk (*) are significantly different ( ␣ ⫽5%). The nvalue (number of plants assayed per strain) is indicated within bars. Error bars represent the standard deviations of data. Dots correspond to nodule number developed for each individual plant inoculated with different R. tropici CIAT 899 strains. (B) Nodulation kinetics of P. vulgaris inoculated with R. tropici CIAT 899 and its onfD mutant. Eight to sixteen plants were analyzed for determining nodule number per plant at each point of the time course experiments. The mutant nodule number (orange line) was individually compared to that obtained for the wild-type strain (blue line) by using a Mann-Whitney nonparametric test. Values tagged with asterisks(*) are significantly different at the level of ␣ ⫽5%. Error bars represent the standard deviations of data. (C) Competition for nodulation assays of R. tropici CIAT 899andits onfD mutant derivative in P. vulgaris. Percentages of nodule occupancy were evaluated for both strains harboring (or not) the pFAJDsRed plasmid at 30 dpi. del Cerro et al. Applied and Environmental Microbiology October 2020 Volume 86 Issue 19 e01297-20 aem.asm.org 10 on January 27, 2021 at USE/BCTA.GEN UNIVERSITARIAhttp://aem.asm.org/Downloaded from 57 comparison with the parental strain (Fig. 4B). However, the abilities of both strains for occupying common bean nodules were similar in the nodulation (see Fig. S1 in the supplemental material) and in the competition for nodulation assays (Fig. 4C). Overall, results obtained from nodulation tests indicate that the NF induced by the OnfD protein of CIAT 899 are required for nodule formation in P. vulgaris. OnfD forms dimers and interacts with NodD2 but not with NodD1. We investigated whether the NodD1, NodD2, and OnfD proteins were able to homo- and/or heterodimerize, a property required for the transcriptional activation ability of these regulators (26–28, 44). We used a bacterial two-hybrid system that depends on the reconstitution of adenylate cyclase activity, which is coupled with high ␤ -galactosidase activity. The restoration of the adenylate cyclase activity is triggered by the interaction of two catalytic T25 and T18 subdomains in an adenyl cyclase deletion mutant background (E. coli cya strain) (45). After generating the fusion of our proteins of interest with the T25 and T18 subdomains, the results showed that NodD1, NodD2, and OnfD regulators form homodimers and/or homopolymers (tetramers, octamers, etc.) (Fig. 5A). As a positive control, we used the leucine zipper fused to the two subdomains of adenylate cyclases T25 and T18. The empty vectors harboring the T25 and T18 subdomains alone were used as negative controls of low adenylate cyclase activity levels. By using the same bacterial two-hybrid system, the interactions among NodD1, NodD2, and OnfD were also determined (Fig. 5A). Here, the OnfD-NodD2 two-hybrid combinations reconstitute adenylate cyclase activity, which indicates that both regulatory proteins may form a heterocomplex. In contrast, the interaction between NodD1- OnfD and NodD1-NodD2 was not detected. The formation of NodD2 and OnfD heterodimers was confirmed and quantified by ␤ -galactosidase assays, displaying no FIG 5 (A) Homo- and heterodimerization of Rhizobium tropici CIAT 899 NodD1, NodD2, and OnfD regulators. E. coli BTH101 (cya) was cotransformed with plasmids expressing the indicated T18 and T25 protein fusions. LacZ activity (blue) indicates protein-protein interaction. (B) Quantification of selected E. coli BTH101 (cya) cotransformants. The ␤ -galactosidase activities were individually compared to that obtained with empty vector using a Mann-Whitney nonparametric test. Values tagged with asterisks (*) are significantly different at the level ␣ ⫽5%. Zip, leucine zipper; EV, empty vector. OnfD Controls Nod Factor Synthesis under Salt Stress Applied and Environmental Microbiology October 2020 Volume 86 Issue 19 e01297-20 aem.asm.org 11 on January 27, 2021 at USE/BCTA.GEN UNIVERSITARIAhttp://aem.asm.org/Downloaded from 58 significant differences among binding affinities regarding their respective homodimers (Fig. 5B). These results suggest that OnfD and NodD2 may be acting together during the upregulation of the nod genes under salt stress conditions. A structural model of OnfD predicts the presence of DNA-binding, ligandbinding, and dimerization domains. To understand how OnfD acts during nod gene activation and NF synthesis under salt stress conditions, a prediction of the OnfD secondary structure on the basis of its amino acid sequence was determined (see Fig. S2 in the supplemental material). Surprisingly, the secondary structure of OnfD aligns with the structures of two phylogenetically distanced AraC-type proteins, CuxR protein from S. meliloti and ToxT from V. cholerae, despite their low amino acid sequence conservation (CuxR versus OnfD ⫽23.35% identity; ToxT versus OnfD ⫽27.59% identity) (see Fig. S2). We selected CuxR and ToxT because these proteins have known structures, determined by X-ray crystallography (ToxT PDB 3GBG and CuxR PDB 5NLA). We created two structural models of OnfD by using the CuxR and ToxT structures as references (see Fig. S3). In both OnfD models, we determined the presence of a putative DNA-binding (C-term) and a putative ligand-binding (N-term) domain composed of helix-turn-helix (HTH) and ␤ -strands domains, respectively. These domains are typically present within the AraC family of regulators, and they may explain to some extent the role of OnfD in the activation of a different set of symbiotic genes under osmotic stress conditions. Moreover, the structural model of OnfD that used CuxR as a template showed one interesting finding: the presence of a hairpin domain composed of two ␣ -helices that correspond with a dimerization domain of CuxR. This is another common feature of the AraC-type regulators that may explain the OnfD homodimerization ability observed in bacterial two-hybrid assays (Fig. 5). DISCUSSION R. tropici CIAT 899 is one of the most important microsymbionts of P. vulgaris and is characterized by its ability to produce a large variety of NF not only in the presence of inducing flavonoid (3.7 ␮ M apigenin) but also under osmotic stress conditions (300 mM salt and 400 mM mannitol) by means of the regulator proteins NodD1 and NodD2, respectively (15–17, 21, 22, 46–49). The activation patterns of the symbiotic genes are quite similar in the presence of both apigenin and salt since most of the CIAT 899 NB-controlled genes are activated at similar levels (12). An exception is found in genes located downstream of NB9, nodD2 and RTCIAT899_PB01075 (coding for an AraC-type regulator, renamed as OnfD), which are only activated under salt stress conditions. The transcriptional activation of both genes is absent in a nodD1 mutant background, suggesting that NodD1 is somehow required for the upregulation of both nodD2 and onfD genes (21, 22). However, how salt is inducing the activation of the NodD2 protein and the mechanism by which NodD1 increases the total cytoplasmatic amount of both NodD2 and OnfD proteins remain unknown. According to results presented here, answers to these questions might be explained by the action of OnfD. In our study, we have determined that OnfD is involved, like NodD2, in the transcriptional activation of the CIAT 899 symbiotic genes and in the synthesis of symbiotically active NF under salt stress conditions. First, we demonstrated that the activation of the CIAT 899 nodA1 and nodA2 promoters in the presence of salt or mannitol requires a functional OnfD, which correlates with the absence of NF overproduction under this stressing condition in the onfD mutant background (Fig. 2). Next, RNA-seq studies confirm the role of OnfD in the general activation of all previously defined CIAT 899 symbiotic genes in the presence of salt, since this upregulation was detected in the presence of apigenin but not with salt in the ΔonfD genetic background (Table 2 and Fig. 3). This regulatory role of OnfD is correlated with the presence of a putative DNA-binding domain in its structure, as shown in the structural model (see Fig. S3). In the absence of OnfD, the activation patterns of these symbiotic genes were qualitatively and quantitatively similar to those previously reported for the nodD2 mutant in the presence of salt and apigenin (21). This phenotypic parallelism between del Cerro et al. Applied and Environmental Microbiology October 2020 Volume 86 Issue 19 e01297-20 aem.asm.org 12 on January 27, 2021 at USE/BCTA.GEN UNIVERSITARIAhttp://aem.asm.org/Downloaded from 59 regulatory element of HrpB, the AraC-type regulator of a plant pathogen-like type III secretion system in Burkholderia pseudomallei.J Bacteriol 193:1991–2001. https://doi.org/10.1128/JB.01379-10. 37. Li Y, Hu Y, Francis MS, Chen S. 2015. RcsB positively regulates the Yersinia Ysc-Yop type III secretion system by activating expression of the master transcriptional regulator LcrF. Environ Microbiol 17:1219–1233. https:// doi.org/10.1111/1462-2920.12556. 38. Schäper S, Steinchen W, Krol E, Altegoer F, Skotnicka D, Søgaard- Andersen L, Bange G, Becker A. 2017. AraC-like transcriptional activator CuxR binds c-di-GMP by a PilZ-like mechanism to regulate extracellular polysaccharide production. Proc Natl Acad SciUSA114:E4822–E4831. https://doi.org/10.1073/pnas.1702435114. 39. Bringhurst RM, Gage DJ. 2000. 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The Rhizobium tropici CIAT 899 NodD2 protein promotes symbiosis and extends rhizobial nodulation range by constitutive nodulation factor synthesis. Copyedited by: OUP Journal of Experimental Botany https://doi.org/10.1093/jxb/erac325 Advance Access Publication 28 July, 2022 © The Author(s) 2022. Published by Oxford University Press on behalf of the Society for Experimental Biology. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), which permits unrestricted reuse, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. RESEARCH PAPER The Rhizobium tropici CIAT 899 NodD2 protein promotes symbiosis and extends rhizobial nodulation range by constitutive nodulation factor synthesis PaulaAyala-García1,, IreneJiménez-Guerrero1,, Catherine N.Jacott2,, Francisco JavierLópez-Baena1,, Francisco JavierOllero1,, Pablodel Cerro1,†,*, and FranciscoPérez-Montaño1,*, 1 Departamento de Microbiologia, Facultad de Biologia, Universidad de Sevilla, Seville, Spain 2 Department of Crop Genetics, John Innes Centre, Norwich Research Park, Norwich, UK † Present address: Department of Cell and Developmental Biology, John Innes Centre, Norwich Research Park, Norwich, UK. * Correspondence: pdelcerr[email protected], [email protected], or fper[email protected] Received 13 April 2022; Editorial decision 22 July 2022; Accepted 24 July 2022 Editor: Eloise Foo, University of Tasmania, Australia Abstract In the symbiotic associations between rhizobia and legumes, the NodD regulators orchestrate the transcription of the specific nodulation genes. This set of genes is involved in the synthesis of nodulation factors, which are responsible for initiating the nodulation process. Rhizobium tropici CIAT 899 is the most successful symbiont of Phaseolus vulgaris and can nodulate a variety of legumes. Among the five NodD regulators present in this rhizobium, only NodD1 and NodD2 seem to have a role in the symbiotic process. However, the individual role of each NodD in the absence of the other proteins has remained elusive. In this work, we show that the CIAT 899 NodD2 does not require activation by inducers to promote the synthesis of nodulation factors. A CIAT 899 strain overexpressing nodD2, but lacking all additional nodD genes, can nodulate three different legumes as efficiently as the wild type. Interestingly, CIAT 899 NodD2- mediated gain of nodulation can be extended to another rhizobial species, since its overproduction in Sinorhizobium fredii HH103 not only increases the number of nitrogen-fixing nodules in two host legumes but also results in nodule development in incompatible legumes. These findings potentially open exciting opportunities to develop rhizobial inoculants and increase legume crop production. Keywords: Common bean, infection thread, nodulation, nodulation factor, Lotus, rhizobium–legume symbiosis, Rhizobium tropici. Introduction Nitrogen is an important macronutrient essential for all aspects of plant growth and crop productivity (White and Brown, 2010). Paradoxically, nitrogen has poor availability in soils leading to extensive fertilizer synthesis and application onto agricultural soils: both are highly energy-demanding processes that contribute to climate change and soil pollution (Tilman et al., 2002; Woods et al., 2010; Iyngaran et al., 2011). Legume plants can establish a symbiotic interaction with certain soil This paper is available online free of all access charges (see https://academic.oup.com/jxb/pages/openaccess for further details) Downloaded from https://academic.oup.com/jxb/advance-article/doi/10.1093/jxb/erac325/6651353 by guest on 06 September 2022 73 Copyedited by: OUP Page 2 of 11 | Ayala-García et al. proteobacteria—known as rhizobia—that convert atmospheric nitrogen to ammonia inside specialized root organs called nodules, thereby increasing nitrogen availability to the host plant and improving plant performance (Oldroyd, 2013). Thus, the application of nitrogen-fixing bacteria to legume crops presents an opportunity for sustainable agriculture. Establishing the legume–rhizobium symbiotic interaction requires a complex and evolved molecular exchange of signals between both organisms. Compatible flavonoids exuded from legume roots into the rhizosphere are recognized by rhizobial NodD transcriptional regulators (Cooper, 2007; Hassan and Mathesius, 2012). The flavonoid-activated NodD protein then binds to conserved promoter regions upstream of nodulation (nod) genes, activating their expression (Schlaman et al., 1998; Peck et al., 2006; Long, 2016). The Nod proteins encoded by these genes are involved in the synthesis and export of lipochitooligosaccharides, also known as Nod factors (NF). In exchange, NFs are perceived by specific plant LysM-receptors that trigger a downstream signalling cascade leading to rhizobium-specific intracellular colonization of the root hair via infection thread formation and eventual development of nodules on roots (Dénarié et al., 1996; Radutoiu et al., 2003). An ancient and less sophisticated mechanism of rhizobial intercellular root infection via cracks at emergent lateral roots or between epidermal cells is also widespread in the legume family (Sprent et al., 2007; Montiel et al., 2021). Recent studies suggest that NodD proteins may have additional roles beyond post-initial recognition and that flavonoid-independent inducers may activate NodD. For example, Mesorhizobium loti R7A NodD2 is active in the nodules, unlike NodD1 which is active during the root-hair colonization at the infection thread (Kelly et al., 2018). Interestingly, Rhizobium leguminosarum sv. trifolii strains that harbour a second NodD copy exhibit enhanced nodule colonization and competitiveness (Ferguson et al., 2020). In both M. loti and R. leguminosarum sv. trifolii, protein structural comparisons between these additional NodD regulators and the flavonoid–NodD1 demonstrate low conservation in the predicted flavonoid binding sites. These data suggest that an alternative molecule could act as a NodD protein inducer, particularly since these specific NodD proteins are active when rhizobia are inside the roots or nodules compared with the rhizosphere. The ability to recognize different flavonoids is the primary rhizobial determinant of host range (Walker et al., 2020). Therefore, the presence of more than one nodD in the genome is generally associated with a broader host-range ability. Rhizobium tropici CIAT 899 (hereafter CIAT 899) is a broad host range rhizobial strain that nodulates some legumes, including Phaseolus vulgaris, Lotus japonicus, and Lotus burttii (Martínez-Romero et al., 1991; del Cerro et al., 2015a, b). Genome sequencing of CIAT 899 revealed five different nodD genes located in the symbiotic plasmid (Ormeño-Orrillo et al., 2012). Interestingly, the CIAT 899 nodD2 gene is up-regulated and active in the presence of osmotic stress, resulting in the activation of nod gene expression even in the absence of flavonoids, raising hypotheses that an osmotic stress-dependent molecule could act as a NodD2 inducer or that the increase in nodD2 expression alone could be responsible for NF production (Pérez-Montaño et al., 2016; del Cerro et al., 2017, 2019). A nodD2 mutant exhibited detrimental effects on the symbiotic performance in its natural host, Phaseolus vulgaris, but symbiotic ability in the other host plants, Lotus japonicus and Lotus burttii, was unaffected (del Cerro et al., 2017), which could be due to genetic nodD redundancy. Among additional NodD proteins, NodD1 is active in the presence of compatible flavonoids and its absence abolishes nodulation in L. japonicus and reduces nodulation in P. vulgaris and L. burttii (Ormeño-Orrillo et al., 2012; del Cerro et al., 2015a, b). However, a double mutant in nodD1 and nodD2 genes abolishes nodulation in all three plant species confirming the relevance of the flavonoid-activated NodD1 and osmotic stress-activated NodD2 proteins during symbiosis. Here, we demonstrate that NodD2 does not require activation by inducers such as compatible flavonoids or an osmotic stress-dependent molecule. We show that overexpression of nodD2 alone results in a strong induction of nod genes in any tested condition. Furthermore, we demonstrate that a strain overexpressing nodD2—but lacking all additional nodD genes including nodD1—can nodulate P. vulgaris, L. japonicus and L. burttii as efficiently as the wild-type (WT) strain. Finally, we show that the overexpression of nodD2 in Sinorhizobium fredii HH103 results in nodule development in the incompatible non-host P. vulgaris and increased the number of nitrogenfixing nodules in hosts such as L. japonicus and L. burttii. The finding that overexpression of nodD2 alone can increase host range and symbiotic efficiency in several legume plants could lead to exciting opportunities for developing novel rhizobial inoculants to increase crop production. Material and methods Bacterial growth conditions, plasmids, and obtaining mutant All strains and plasmids used in this work are listed in Supplementary Table S1. Escherichia coli strains were cultured on LB medium (Sambrook et al., 1989) at 37 °C. Rhizobium tropici CIAT 899 strains were grown at 28 °C on tryptone yeast (TY) medium (Beringer, 1974), B− minimal medium (Spaink et al., 1992), or modified yeast extract mannitol (YM3, with 3 g ml−1 of mannitol) medium (Vincent, 1970), supplemented, when necessary, with 3.7 μM apigenin, 300mM NaCl, or 400mM mannitol. The quintuple ∆nodD1–5 deletion mutant was generated using five rounds of overlapping PCR extensions: the double ∆nodD1/∆nodD2 mutant (del Cerro et al., 2017) was used as a recipient to generate ∆nodD123, which was subsequently used to obtain a quadruple mutant, the base for the construction of the quintuple ∆nodD12345 mutant. In total, 919, 328, 756, 930 and 930bp lengths were deleted from nodD1 (RTCIAT899_PB01295), nodD2 (RTCIAT899_PB01070), nodD3 (RTCIAT899_PB00640), nodD4 (RTCIAT899_PB01560), and nodD5 (RTCIAT899_PB00560), respectively. The deleted nodD3–5 genes were first subcloned into the pK18mobsacB vector generating the pK18mobsacB::∆nodD3, pK18mobsacB::∆nodD4, and Downloaded from https://academic.oup.com/jxb/advance-article/doi/10.1093/jxb/erac325/6651353 by guest on 06 September 2022 74 Copyedited by: OUP CIAT 899 NodD2 is constitutively active and allows symbiosis | Page 3 of 11 pK18mobsacB::∆nodD5 vectors. Then, plasmids were transferred by conjugation and integrated into the genome of the corresponding strain by single recombination. A double homologous recombination event, in which the WT copy of the gene together with plasmid pK18mob- sacB were lost, was selected for each nodD gene. Mutated strains were confirmed by PCR and DNA–DNA hybridization. For this, DNA was blotted to Hybond-N nylon membranes (Sigma), and the DigDNA method of Roche (Basel, Switzerland) was employed according to the manufacturer’s instructions. The in cis complementation of the different nodD genes (LE nodD strains) was performed by integration of the different pK18mobsacB::nodD plasmids into the genome of the ∆nodD1–5 mutant, obtaining derivative strains that harbour both WT and deleted versions of the corresponding nodD gene. Complementation in trans (OE nodD strains) nodD versions was carried out by cloning full open reading frame and own promoter sequences into the multicopy vector pBBR-1-MCS-5. The resulting plasmids were individually introduced in ∆nodD1–5 by conjugation, obtaining derivative strains that constitutively overexpress single nodD genes. Complemented strains were confirmed by PCR. Plasmid pMP220::PnodA1, obtained as in del Cerro et al. (2020), bearing the promoter region of the nodA1 gene upstream of the lacZ reporter gene was conjugated into the different CIAT 899 WT and derivative strains. Plasmid pFAJDsRed, which harbours a gene for red fluorescence, was also introduced by conjugation in CIAT 899 and derivatives (Kelly et al., 2013). All plasmids were transferred from Escherichia coli to CIAT 899 by conjugation as previously described using plasmid pRK2013 as the helper (Simon, 1984). Recombinant DNA techniques were performed according to the general protocols of Sambrook et al. (1989). Primers used in this study are listed in Supplementary Table S2. RNA extraction, cDNA synthesis, and quantitative RT-PCR RNA extraction, cDNA synthesis and quantitative RT-PCR (qPCR) experiments were performed as previously described (Pérez-Montaño et al., 2016). Briefly, total RNA was isolated from bacterial cultures grown in TY medium using a High Pure RNA Isolation Kit (Roche) and RNAase Free DNA Set (Qiagen, USA), according to the manufacturer’s instructions. Verification of the amount and quality of RNA samples was carried out using a Nanodrop 1000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, USA) and a Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific). Two independent total RNA extractions were obtained for each condition. This (DNA-free) RNA was reverse transcribed into cDNA using PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Takara, Japan). Quantitative PCR was performed using a LightCycler 480 (Roche) with the following conditions: 95 °C, 10min; 95 °C, 30s; 55 °C, 30s; 72 °C, 20s; 40 cycles, followed by the melting curve profile from 60 to 95 °C to verify the specificity of the reaction. The R. tropici CIAT 899 16S rRNA gene was used as an internal control to normalize gene expression. The fold-changes of two biological samples with three technical replicates of each condition were obtained using the ∆∆Ct method (Pfaffl, 2001). Selected genes and primers are listed in Supplementary Table S2. Determination of β-galactosidase activity To determine β-galactosidase activity, complemented strains were conjugated with the plasmid pMP220::PnodA1 (del Cerro et al., 2020) containing a transcriptional fusion between the CIAT 899 nodA1 promoter and the lacZ gene. Assays of β-galactosidase activity were carried out as described by Zaat et al. (1987) from bacterial cultures grown in YM3 medium. Units of β-galactosidase activity were calculated according to Miller (1972). The experiments were repeated three times. Identification of NF Chemical identification of the NF was carried out with a ultra-high- pressure liquid chromatography system coupled to a mass spectrometer (UHPLC-MS/MS) as previously described by Jiménez-Guerrero et al. (2020a), growing the WT and the derivative mutant strains in B− minimal medium. The NF detected that presented lower area values than 107 in the UHPLC-MS/MS analyses were discarded. Protein alignment and secondary structure modelling The protein sequence alignment of the five NodD proteins was performed with PROMALS3D (Pei et al., 2008) and displayed with Jalview software using the homology colouring scheme (Waterhouse et al., 2009). A percentage identity matrix was created by Clustal 2.1. Models for the secondary structure of NodD1 and NodD2 were made with Phyre2 (Kelley et al., 2015), a web server for protein modelling that uses homology detection methods to build three-dimensional models of proteins, using as a reference the predicted structure of NodD1 from Sinorhizobium meliloti (Peck et al., 2013). Nodulation assays For the evaluation of the symbiotic phenotypes, the different CIAT 899 strains were grown in YM3 medium until the bacterial concentration reached about 109 cells ml−1. Surface-sterilized seeds of P. vulgaris, L. burttii, and L. japonicus were pre-germinated and placed on sterilized jars (for P. vulgaris, Leonard jars) containing vermiculite and perlite substrates (3:1) and Farhaeus N-free solution as previously described (del Cerro et al., 2015a, b). Each pre-germinated and sterilized seed was inoculated with 1ml of bacterial culture. Growth conditions were 16h at 26 °C in the light and 8h and 18 °C in the dark, with 70% of humidity. Nodulation parameters were evaluated after 30 d for P. vulgaris or 50 d for Lotus plants. Nodulation experiments were performed two times. Microscopy Lotus burttii and L. japonicus plants were grown on ¼ B&D medium (Kelly et al., 2018) in 12cm square plates at 21 °C with 16 h–8h day–night cycles. For observing nodules, 21-day-old Lotus nodules induced by the different strains carrying the DsRed fluorescent marker were embedded in 6% agarose in water and sliced in thick layer sections (30–50 μm) using a Leica VT 1000S vibratome. Sections of nodules were stained with 0.04% calcofluor (Kawaharada et al., 2017) and observed using a Zeiss LSM510 META confocal microscope. For observing infection threads (ITs), L. burttii and L. japonicus seedlings grown in square plastic dishes were inoculated with the different strains carrying the DsRed fluorescent marker, 7 d after germination. ITs were observed by Zeiss Axioplan 2 imaging using an Olympus BX53 microscope (Olympus, Japan). Image pictures were merged by using CellSens standard software (Olympus). Results NodD2 strongly induces the expression of the R. tropici CIAT 899 nod genes and NF synthesis in the absence of inducers Rhizobium tropici CIAT 899 has five NodD proteins. NodD1 and NodD2 are the main nod-gene regulators since a double nodD1/nodD2 mutant abolishes NF production and impairs nodule formation in P. vulgaris and L. burttii (del Cerro et al., 2017). It is unknown whether each NodD protein can function Downloaded from https://academic.oup.com/jxb/advance-article/doi/10.1093/jxb/erac325/6651353 by guest on 06 September 2022 75 Copyedited by: OUP Page 10 of 11 | Ayala-García et al. involved in Nod factor synthesis and symbiosis. Applied and Environmental Microbiology 86, e01297-20. del Cerro P, Megías M, López-Baena FJ, Gil-Serrano AM, Pérez- Montaño F, Ollero FJ. 2019. 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These bacteria are capable to fix atmospheric nitrogen into ammonia within specific plant root organs called nodules. The rhizobia-legume interaction is established by a complex molecular dialogue that starts with flavonoids exudated by the plant roots. In response, signaling molecules known as Nod factors (NFs) are secreted by the bacteria. These factors are sensed by specific plant receptors that trigger a downstream signaling cascade leading to rhizobium-specific intracellular colonization of the root hair via the formation of infection threads and the eventual development of nodules on roots. In these organs, rhizobia can fix nitrogen from the atmosphere for the plant in exchange for photosynthates and the appropriate environment for nitrogen fixation. Recently, it has been demonstrated that extracellular membrane vesicles (EMVs) produced by some rhizobia carry NFs. EMVs are proteolipidic structures that are secreted to the milieu from the bacterial membranes and are involved in several important biological processes, including intercellular communication. Thus far, little is known about rhizobia vesicles, and further studies are needed to understand their functions, including their role as transporting vessels of signaling molecules during the process of symbiosis. Here, we present a detailed protocol to isolate high-purity EMVs from free-living cultured rhizobia, test their integrity, and quantify their abundance. Key words Rhizobium, Symbiosis, Flavonoids, Nodulation factors, Extracellular membrane vesicles 1 Introduction Nitrogen is an essential macronutrient for plant growth and crop yields, typically supplied to crops as fertilizers when phytoavailability is low [1]. Despite of their relevance, the industrial synthesis of N-fertilizers contributes to the production of greenhouse gases [2], These two authors contributed equally to this work. Carlos Medina and Francisco Javier Lo ´ pez-Baena (eds.), Host-Pathogen Interactions: Methods and Protocols , Methods in Molecular Biology, vol. 2751, https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3617-6_14, © The Author(s), under exclusive license to Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2024 219 89 and its use in agriculture provokes eutrophication processes in water [3]. Therefore, alternative means are needed to supply crops with nitrogen, such as the use of rhizobia in symbiosis with legume plants. Rhizobia are a group of soil proteobacteria that are able to establish a symbiotic interaction with legumes, in order to fix atmospheric nitrogen into ammonia inside specialized root organs called nodules. By such means, rhizobia increase the nitrogen availability to the host plant and improve plant performance [4], which makes the rhizobial biofertilization of legumes a highly advantageous strategy for a sustainable and environment-friendly agriculture. 220 Paula Ayala-Garcı ´a et al. The rhizobium-legume symbiotic interaction is established by a complex molecular dialogue that starts with flavonoids exuded from legume roots into the rhizosphere. Compatible flavonoids are recognized by rhizobial NodD transcriptional regulators [5] that in turn activates the expression of the bacterial nod genes [6, 7]. These genes encode the Nod proteins that are involved in the synthesis and export of specific lipo-chitooligosaccharides molecules, also known as Nod factors (NFs) [8]. These NFs are then recognized by specific plant LysM receptor-like kinases triggering a downstream transduction cascade. This signaling process leads to root hair tissue differentiation and reorganization, and rhizobium-specific intracellular colonization usually through the formation of infection threads, which culminates with the nodule development [9]. Besides the initial molecular recognition mediated by flavonoids and NFs, other types of bacterial molecules are necessary for a successful nodulation process, such as surface polysaccharides or proteins secreted through the type III secretion system [10]. Although the nodulation process has been extensively studied, additional players of the molecular crosstalk are still to be determined. In this context, several studies have highlighted the essential role of extracellular membrane vesicles (EMVs) in bacterialbacterial communication and bacterial-host interactions [11]. The EMVs are spherical, mono- or bilayer lipidic structures of nanometric size (typically from 20 to 400 nm) that are released into the external milieu, playing a role in several biological processes. For example, EMVs can be fused with membranes of other bacteria or can be internalized into eukaryotic cells, releasing their content and, thus, operating as transport vessels [12–15]. This interplay has recently been proposed to add an additional layer in the molecular dialogue of the holobiont [16]. In the case of the rhizobiumlegume symbiosis, during the infective process many physiological changes take place, some of which might be mediated by these membranous vehicles. Supporting these suggestions, recent studies have discovered the presence of NFs inside of EMVs of Rhizobium etli exclusively when grown in the presence of naringenin, a flavonoid that induce the expression of this bacterium nod genes 90 [17]. This finding could be pointing out a new way of bacteriumplant interaction wherein the NFs are being transported from the rhizobium to the plant. Extracellular Membrane Vesicles Isolation from Rhizobia 221 Here we describe a detailed protocol to isolate high-purity rhizobial EMVs in free-living conditions. The model organism used for developing this protocol is Rhizobium tropici CIAT899, a broad host range rhizobial strain that nodulates some legumes, including Lotus japonicus, Lotus burttii, and the economically relevant crop Phaseolus vulgaris. This bacterium also presents high tolerance to external stress – such as high levels of acidity or high temperatures – and has a great diversity of Nod factors [18]. Besides, this bacterium has the capacity to produce these signaling molecules in acid and saline environments or in the absence of molecular signals from the plant [19–22]. The methodology for EMVs isolation is a stepwise process of centrifugation, filtration, ultrafiltration, and ultracentrifugation, in order to separate the vesicles from the rest of the cellular and culture media constituents and concentrate them. Following the isolation, we apply different techniques to evaluate the vesicles integrity and quantity. 2 Materials The following protocol requires standard equipment found in microbiology and molecular biology laboratories. These include an autoclave, biological laminar flow hood, incubator, shaker, refrigerator, -80 °C and -20 °C freezers, spectrophotometer, centrifuges, plate reader, vacuum pump, pipettes, scale, etc. Special equipment required in this protocol encompass ultracentrifuge, a NanoSight and a transmission electron microscope (see below). In addition, routine microbiology and molecular materials and devices are needed, including pipettors, forceps, plastic tips, tubes with different volumes, laboratory glass bottles, Erlenmeyer flasks, Petri dishes, media components, sterile ultrafiltered water, syringe filters, etc. 2.1 Bacterial Strains and Culture Medium 1. Bacterial strains: Rhizobium tropici CIAT899. 2. Tryptone yeast (TY) medium: dissolve 3 g yeast extract, 5 g tryptone, and 0.65 g CaCl 2 2H 2 O in 1 L of distilled water. Add agar 2% for TY agar plates. Autoclave at 121 °C for 20 min. 3. 3.7 mM apigenin: dissolve 1 mg apigenin in 1 mL of 100% ethanol. 4. 0.5 M NaOH: dissolve 20 g sodium hydroxide in 1 L of distilled water. 91 228 Paula Ayala-Garcı ´a et al. 21. del Cerro P, Pe ´rez-Montan ˜o F, Gil-Serrano A et al (2017) The Rhizobium tropici CIAT899 NodD2 protein regulates the production of Nod factors under salt stress in a flavonoidindependent manner. Sci Rep 7:46712 22. Pe ´rez-Montan ˜o F, del Cerro P, Jime ´nez-Guer- rero I et al (2016) RNA-seq analysis of the Rhizobium tropici CIAT899 transcriptome shows similarities in the activation patterns of symbiotic genes in the presence of apigenin and salt. BMC Genomics 17:198 98 CAPÍTULO 4. Isolation of rhizobial extracellular membrane vesicles from bacteroids Chapter 15 Isolation of Rhizobial Extracellular Membrane Vesicles from Bacteroids Paula Ayala-Garcı ´a, Irene Jime ´nez-Guerrero, Mathias Mu ¨sken, Francisco Javier Ollero, Jose ´ Manuel Borrero-De Acun ˜a, and Francisco Pe ´rez-Montan ˜o Abstract Extracellular-membrane vesicles (EMVs) are spherical buds of the extracellular membrane, commonly produced by Gram-negative bacteria, known to mediate intricate inter-kingdom communication. In this context, comprehensive research dissecting the role of EMVs in one of the most complex nature-occurring molecular dialogues, rhizobium-legume symbiosis, has been so far neglected. During the different stages of the symbiotic process, rhizobia and their host plants establish a very specific and controlled intercellular trafficking of signal molecules. Thus, as conveyors of a broad range of molecules into the target cell, EMVs are gaining weight in the field. Here, we describe a detailed protocol to isolate EMVs from bacteroids of legume nodules, opening a new door for discovering new authors of the symbiotic process. Key words Symbiosis, rhizobium, Legume, Bacteroids, Symbiosome, Extracellular membrane vesicles 1 Introduction Legume plants establish symbiotic interactions with soil-borne bacteria known as rhizobia. In this mutualist relationship, the plant develops specific root organs, termed nodules, where rhizobia convert atmospheric nitrogen to ammonia, a plant-assimilable form of nitrogen. In exchange, legume supplies bacterium with carbon source and a stable and protected environment [1]. A successful symbiotic interaction requires a sophisticated molecular exchange of signals between bacteria and plants. The symbiosis onset occurs when compatible flavonoids exudated by the legume roots are recognized by rhizobia. In response to these flavonoids, bacteria induce the synthesis and secretion of specific molecules, known as Nod factors (NF), which are sensed by appropriate legumes, triggering infection thread (ITs) formation, root cortex cell division, and finally the nodule formation [2–5]. ITs are Carlos Medina and Francisco Javier Lo ´ pez-Baena (eds.), Host-Pathogen Interactions: Methods and Protocols , Methods in Molecular Biology, vol. 2751, https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3617-6_15, © The Author(s), under exclusive license to Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2024 229 100 tubular structures developed by root hair membrane invagination, through which rhizobia are penetrating until they reach the cortex cells, where bacteria are released into the cytoplasm of the plant cell by endocytosis [6, 7]. At this stage, bacteria undergo a differentiation to bacteroids, where the atmospheric nitrogen fixation takes place. Due to endocytosis, bacteroids are encapsulated by the host membrane conforming the so-called symbiosomes, reason why the space between bacteroid and plant cell membrane is named symbiosome space (SS) [8, 9]. Thus, the SS acts as unobstructed interface for material exchange and signal communication between microsymbionts and host cells [10, 11]. 230 Paula Ayala-Garcı ´a et al. EMVs are spherical, bacterial extracellular membrane-based structures with an approximate diameter of 40–150 nm [12]. In general, EMVs are catalogued as transport vehicles for important biological molecules, including lipids, lipopolysaccharides, enzymes, signaling molecules, toxins, and nucleic acids [13]. The formation of EMVs by Gram-negative bacteria seems to be a universal process, participating these evaginations in processes such as quorum sensing, digestion of nutrients, immunomodulation, horizontal DNA transfer, excretion of misfolded proteins, or toxin delivery [14]. In case of rhizobia, insights into the role of EMVs at initial steps of the symbiotic process are emerging in the past years. Along these lines, two recent proteomic studies of EMVs isolated from Rhizobium etli and Sinorhizobium fredii in the presence of their respective nodulation-gene-inducing flavonoids indicate significant differences in protein cargo when comparing with that present in EMVs isolated in the absence of these symbiotic signals [15, 16]. This observation points out the idea that EMVs may be playing a significant role at early stages of the symbiotic process. However, to our knowledge, no reports addressing the characterization of rhizobial EMVs during late stages of symbiosis, i.e., from bacteroids and/or symbiosomes, have been published so far. In this chapter, we detail a protocol to successfully isolate EMVs from nodule bacteroids, which will open a door to analyze and characterize the EMV cargo by different -omic approaches. 2 Materials The following protocol is described for the Rhizobium tropici CIAT899-Phaseolus vulgaris symbiosis, but it could be extended to any other symbiotic partners. This protocol requires standard equipment in microbiology, molecular biology, including autoclave, biological hood, incubators, shakers, refrigerators, -80 °C and -20 °C freezers, spectrophotometer, and centrifuges. In addition, facilities for plant growth as well as routine microbiology and molecular materials and devices are needed. Unless otherwise 101 specified, prepare all solutions with distillate H 2 O, and store all reagents at room temperature. Despite no sterile conditions are required in Subheading 3.4, it is recommended the use of gloves and keep the samples on ice. Extracellular Membrane Vesicles Isolation from Bacteroids 231 2.1 Inoculum Preparation 1. Rhizobium tropici CIAT899 strain. 2. Tryptone yeast (TY) medium: dissolve 3 g yeast extract, 5 g tryptone, and 0.65 g of CaCl 2 ·2H 2 O in 1 L of distilled water. Add agar 2% for TY agar plates. Autoclave at 121 °C for 20 min. 3. Yeast mannitol (YM10) liquid medium: dissolve 500 mg K 2 HPO 4 , 200 mg MgSO 4 7H 2 O, 100 mg NaCl, 400 mg yeast extract, and 10 g mannitol in 1 L of distilled water. Adjust pH to 6.8–7 and autoclave at 121 °C for 20 min. 4. Distillated water. 5. Standard Petri dishes. 6. Autoclave. 7. pH meter. 8. Sterile flasks and tubes. 2.2 Plant Inoculation Assay 1. Phaseolus vulgaris seeds. 2. 1% Agar-water medium: mix 1 g of agar in 100 mL of distilled water. Autoclave at 121 °C for 20 min. 3. 6% sodium hypochlorite. 4. Sterile distilled water. 5. Perlite. 6. Vermiculite. 7. Ropes. 8. Iron citrate solution: dissolve 5 g of iron citrate in 1 L of distilled water with heat. 9. Gibson solution: dissolve 2.86 g of H 3 BO 3 , 2.08 g of MnSO 4 ·H 2 O, 0.22 g of ZnSO 4 ·7H 2 O, 0.08 g of CuSO 4 ·5H 2 O, and 0.13 g of Na 2 MoO 4 in 1 L of distilled water. 10. Fahraeus nitrogen free solution: dissolve 100 mg CaCl 2 ·2H 2 O, 120 mg MgSO 4 ·7H 2 O, 100 mg KH 2 PO 4 , 75 mg Na 2 HPO 4 ·2H 2 O, 1 mL iron citrate, and 1 mL Gibson solutions in 1 L of distilled water. Adjust pH to 6.5–7. 11. Standard Petri dishes. 12. Container to mix perlite and vermiculite. 13. Autoclave. 14. Sterile glass bottle for sterilizing seeds. 15. 2 L glass container. 16. Bottom-excised glass bottle. 102 232 Paula Ayala-Garcı ´a et al. Fig. 1 Schematic view of legumes growth units in nodulation assays, the so-called Leonard jars 17. Leonard jars preparation (Fig. 1):,mix perlite and vermiculate in a proportion 1:3 (see Note 1). Wash the vermiculite-perlite mixture 3 times with water. Add 1.5 L of Fahraeus solution 1X in a 2 L glass container. Fill the bottom-excised glass bottle with the vermiculite-perlite mixture and place over the Fahraeus container, both connected by a rope. Autoclave the jars at 121 °C for 20 min. Once cold, cover the Fahraeus container to avoid microbial contamination. 18. Plant growth chamber or greenhouse. 2.3 Nodule EMV Fraction Collection 1. MMS solution: 40 mM 3-(4-morpholino)-propane sulfonic acid, 20 mM KOH, 2 mM MgSO 4 , and 0.3 M sucrose. Adjust the pH to 7.0 and autoclave at 121 °C for 20 min. 2. Mortar. 3. Pestle. 4. 40 μm filter. 5. 0.2 μm filter. 6. 10 mL syringes. 7. Centrifuge. 8. 15 mL sterile conical tubes. 9. Centrifuge tubes. 10. Precision balance. 103 Extracellular Membrane Vesicles Isolation from Bacteroids 233 2.4 EMV Isolation and Concentration by Ultracentrifugation 1. Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10X: dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na 2 HPO 4 , and 0.245 g KH 2 PO 4 in 1 L of distilled water. Autoclave at 121 °C for 20 min. 2. 0.2 μm filter. 3. 10 mL syringe. 4. Centrifuge. 5. Centrifuge tubes. 6. Optima-MAX Beckman Coulter ultracentrifuge. 7. MLA-80 Beckman ultracentrifuge rotor. 8. 8 mL ultracentrifuge tubes appropriate for MLA-80 rotor. 3 Methods 3.1 Culture Preparation 1. Plate Rhizobium tropici CIAT899 in TY agar plate and incubate at 28 °C for 48 h. 2. Inoculate a single colony in 5 mL of TY liquid media. Grow at 28 °C with continuous shaking to stationary phase. 3. Add 1 mL from this culture to20 mL YM10 liquid medium (see Note 2) and incubate at 28 °C with continuous shaking until the optical density at 600 nm reaches 0.6 (approximately 10 9 cells/mL). 3.2 Plant Inoculation Assay 1. If needed, wash Phaseolus vulgaris seeds with sterile distilled water to remove the bactericide cover (see Notes 3 and 4). 3.2.1 Seed Germination 2. Place seeds in a sterile bottle with 6% sodium hypochlorite solution for 5 min. 3. Wash with sterile distilled water 6 times. 4. Place seeds in 1% agar-water plates and incubate in the dark at 28 °C for 3 days to germinate them (see Note 5). 3.2.2 Seed Inoculation and Nodule Harvesting 1. Place 2 sterilized seedlings per Leonard jar (see Note 6). 2. Add 1 mL of bacterial suspension per seed (OD600 nm 0.6). 3. Place jars in a controlled plant chamber or greenhouse with the following conditions: 16 h/26 °C and light, and 8 h/18 °C dark, with 70% constant humidity. 4. After 30 days post-inoculation (dpi), harvest a total of 100 root nodules from at least 3 different Leonard jars (see Note 7). 3.3 Symbiosome Space Collection 1. Grind nodules using mortar and pestle in 10 mL of MMS solution (Fig. 2a, b). 2. Filter the crushed nodule material using 40 μm filters to discard the plant tissues. 3. Centrifuge the eluents at 0.1 × g for 5 min and discard the pellets to remove plant debris. 104 234 Paula Ayala-Garcı ´a et al. Fig. 2 Workflow described in this chapter for the nodule extracellular membrane vesicles (EMVs) isolation. (a) Legume nodule schematic representation. The symbiosome and bacteroids are indicated by arrows. (b) Nodule EMVs fraction collection. (c) EMVs isolation and concentration by ultracentrifugation 4. Centrifuge the supernatants at 2.2 × g for 5 min. 5. Collect the supernatants in a 15 mL sterile conical tube. 6. Resuspend the pellets from step 4 in Subheading 3.3 in 5 mL MMS solution. 7. Centrifuge at 2.2 × g for 5 min (see Note 8). 8. Add the supernatants to the same tubes of step 5 in Subheading 3.3 (Fig. 2b). 3.4 Isolation and Concentration of EMVs by Ultracentrifugation 1. Centrifuge tubes containing approximately 5.5 mL of symbiosome space samples at 7000 × g and 4 °C for 20 min. 2. Discard the pellets and filter the supernatants using 0.2 μm filters. 3. Place the filtered eluents in ultracentrifuge tubes appropriate for Beckman 70.1 Ti Rotor and balance to 10 -2 × g accuracy. 4. Ultracentrifuge samples at 150,000 × g at 4 °C for 2 h (see Note 9). 5. Carefully remove completely the supernatant with the help of a microtip. 6. Resuspend the pellet in 100 μL of PBS buffer and store EMVs samples at 4 °C (Fig. 2c) (see Note 10). 105 de Extracellular Membrane Vesicles Isolation from Bacteroids 235 3.5 Integrity and Quantification of EMVs 1. Microscopy for EMVs integrity evaluation, lipid dye, and nanoparticle tracking analysis for EMVs quantification are described in detail in the Chapter 14. 4 Notes 1. Make the perlite-vermiculite mix in a ventilated room and use mask to prevent inhalation of dust from the perlite stock. 2. TY is a rich medium to grow optimally R. tropici CIAT899 from -80 °C stock. However, it presents high salt concentration that might interfere with the plant growth. Thus, YM10 medium is used to prepare the inoculant after growing this bacterium on TY plates from -80 °C. 3. P. vulgaris seeds used for this experiment have a red bactericide covert, which is easily removed with water and hand gently rub. 4. Because not all seeds germinate, the number of seeds needed for the experiment should be higher than strictly required. 5. Time required for seed germination is usually 2–3 days. 6. Number of seedlings per Leonard jar depends on the plant and jar size. For small plants such as Lotus japonicus,2–3 seedlings are recommended, while for bigger plants such as Phaseolus vulgaris, sow only one seedling. 7. The nodule harvesting time point varies according to the plant growth period and the number of nodules developed by the legume, which in turn depends on the rhizobia-legume partner. R. tropici CIAT899-P. vulgaris symbiosis provides many nodules (approximately 100 nodules per plant – after 30 dpi). 8. The pellet resulted from this centrifugation corresponds to the bacteroid cells. 9. Before ultracentrifugation, tube weights must be perfectly equalized in a precision balance. 10. EMVs are stable at 4 °C for months. Acknowledgments This work was supported by research grants: EMERGIA20_00048 from the Junta de Andalucı ´a, Consejerı ´a de transformacio ´necono ´- mica, industria, conocimiento y universidades, the ProyExcel_00450 from the Junta de Andalucı ´a, Consejerı ´a Universidad, Investigacio ´n e Innovacio ´n, the PID2021- 122395OA-I00 and PID2020-118279RA-I00 from the Spanish Ministry of Science and Innovation. 106 236 Paula Ayala-Garcı ´a et al. References 1. Oldroyd GE (2013) Speak, friend, and enter: signaling systems that promote beneficial symbiotic associations in plants. Nat Rev Microbiol 11:252–263 2. Cooper JE (2007) Early interactions between legumes and rhizobia: disclosing complexity in a molecular dialogue. J Appl Microbiol 103: 1355–1365 3. 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Por último, el regulador NodD1 podría ayudar al reclutamiento inicial de la ARN polimerasa mediante su unión a la NB9, lo que explicaría el papel parcial que juega esta proteína potenciando la transcripción de los genes nodD2 y onfD bajo condiciones de estrés osmótico (Capítulo 1: Tabla 1). Los reguladores de tipo AraC han sido ampliamente estudiados en bacterias ya que están implicados en la regulación de una gran variedad de procesos bilógicos, como en el Figura 13. Modelo de regulación de los genes nodD2 y onfD de R. tropici CIAT 899 en ausencia ( A) y presencia (B) de un estrés osmótico en el medio. DISCUSIÓN 115 metabolismo del carbono, en la activación de los sistemas de secreción, en virulencia o en la respuesta a diferentes estreses abióticos (Yang et al., 2011; Journet et al., 2016; Mukaihara et al., 2004; Lipscomb et al., 2011; Li et al., 2015). Aunque muchos reguladores de tipo AraC se han descrito en rizobios, como por ejemplo los reguladores CuxR y RhrA de S. meliloti 2011 (Schaper et al., 2017; Bringhurst & Gage, 2000; Lynch et al., 2001) o el regulador CadR de Bradyrhizobium sp. HW13 (Kitagawa et al., 2002), hasta la publicación de los datos recogidos en este capítulo no se había demostrado la implicación directa de esta familia de reguladores en simbiosis. De hecho, hasta la fecha, solo existe un trabajo que hace referencia a un regulador de la familia AraC y su posible implicación en la interacción rizobio-leguminosa. Se trata del regulador codificado por el gen orf816 de Rhizobium sp. BR816. Este gen se sitúa aguas abajo del gen nodD3 en el genoma de la estirpe BR816 y se comprobó que cuando ambos genes se expresan de forma heteróloga en un mutante de S. fredii NGR234 en el gen nodD1 se restaura la habilidad de este rizobio para nodular con sus plantas hospedadoras a niveles superiores de lo que resulta de la complementación única del gen nodD3 de Rhizobium sp. BR816 (Vlassak et al., 1998). Curiosamente, los análisis filogenéticos llevados a cabo en esta Tesis Doctoral, basados en la comparación de las secuencias de los reguladores AraC de diferentes rizobios, sitúan al regulador OnfD de CIAT 899 y al producto del gen orf816 de Rhizobium sp. BR816 muy próximos en el árbol, lo que sugiere que ambas proteínas podrían tener mecanismos de acción similares (Capítulo 1: Figura 1A). Además, estudios de comparaciones de secuencias revelaron la presencia de proteínas en otros rizobios con un porcentaje de identidad muy similar al regulador OnfD de CIAT 899. De este modo, la proteína OnfD presenta una secuencia de aminoácidos idéntica a los reguladores AraC encontrados en los diferentes plásmidos simbióticos de R. freirei PRF 81 (ENN88367.1) y de las estirpes CCGE531 (AYG70418.1), CCGE532 (AYG76959.1) y SEMIA 4088 (WP_004112928.1) de Rhizobium sp. En menor proporción, OnfD comparte un porcentaje de identidad del 94% con la proteína reguladora AraC de Rhizobium sp. NXC24 (AVA24063.1), un 81% de identidad con el regulador de R. jaguaris CCGE525 (AYG64285.1) y un 70% con un regulador AraC localizado en el genoma de R. grahamii CCGM3 (RDJ02018.1). Estos datos indican que el regulador OnfD de tipo AraC está conservado en diferentes rizobios, lo que apoya el posible papel de estos reguladores en la simbiosis entre ciertos rizobios y sus leguminosas hospedadoras. Finalmente, en el genoma de CIAT 899 se han encontrado hasta 21 DISCUSIÓN 116 reguladores de tipo AraC, tres de ellos localizados en el plásmido simbiótico junto a onfD. Por ello, no se puede descartar la implicación de estos reguladores de tipo AraC en la simbiosis entre CIAT 899 y sus plantas hospedadoras (Ormeño-Orrillo et al., 2012). Los hallazgos descritos en el primer capítulo de esta Tesis Doctoral han supuesto un gran avance en el entendimiento del mecanismo regulador y molecular que lleva a la síntesis de NFs en condiciones de estrés osmótico en CIAT 899, pero ¿qué sentido biológico se puede atribuir a que un aumento de osmolaridad lleve a este rizobio a sintetizar NFs? ¿en qué fase del proceso simbiótico se genera una condición que simule al estrés osmótico en el medio? El mantenimiento de un balance osmótico en el espacio peribacteroideo es crítico para una eficiente fijación de N2 en los nódulos. Así, se ha demostrado que las plantas de L. japonicus acumulan polialcoholes como manitol, pinitol, ononitol, treitol y sorbitol en las células simbióticas que albergan los bacteroides (Colebatch et al., 2004; Desbrosses et al., 2005). En esta planta, alguno de estos polialcoholes, como el pinitol, son transportados activamente a través de la membrana del simbiosoma hacia el espacio peribacteroideo a través del transportador LjPLT119, cuya mutación resulta en la producción de bacteroides aberrantes con una disminución en la capacidad de fijar N2 atmosférico (Tian et al., 2022). Teniendo esto en cuenta, los reguladores NodD2 y OnfD de CIAT 899 podrían desempeñar su función en los nódulos ante el aumento de osmolaridad que se genera en el espacio peribacteroideo. Es más, los estudios de ARN- seq llevados a cabo en CIAT 899 en trabajos anteriores revelaron que los genes de fijación de nitrógeno, como ciertos genes nif y fix, se activan ante un estrés osmótico por manitol (del Cerro et al., 2019). Estos datos respaldarían la teoría de que el estrés por manitol pueda simular en parte las condiciones que se establecen en el interior de los nódulos. Ante esta teoría, surgen nuevas cuestiones como por ejemplo ¿Qué sentido tendría la síntesis de NFs en el interior de los nódulos? ¿Actuará NodD2 y OnfD en el desarrollo de los tubos de infección? ¿y en la rizosfera? Para dar respuesta a estas preguntas se requiere seguir avanzando en el estudio de estos reguladores, así como en el resto de los reguladores NodD. Sin embargo, CIAT 899, que presenta 5 copias diferentes del gen nodD, supone un reto para el estudio de cada uno de estos reguladores, pues el efecto resultante de la omisión de un gen nodD podría ser complementado por la acción del resto de las proteínas NodD funcionales (van Rhijn et al., 1993; del Cerro et al., 2015b). DISCUSIÓN 117 El capítulo dos de la presente Tesis Doctoral está dedicado al estudio de cada uno de los reguladores NodD presentes en CIAT 899 sin la influencia del resto de proteínas NodD. Para ello, se utilizó un fondo mutante de los cinco genes nodD de CIAT 899, en el que se complementó cada uno de los genes nodD de forma individual. Dicha complementación se llevó a cabo de forma que se pudiera estudiar el efecto de la presencia única de cada gen nodD bajo su propio promotor, así como el efecto que resulta de la expresión constitutiva de cada uno de estos genes presentes en un elevado número de copias. De esta forma, los estudios de expresión de los genes nod mediante ensayos de qRT-PCR y de actividad β-galactosidasa demostraron, sorprendentemente, que la expresión constitutiva del gen nodD2 de CIAT 899 conlleva a la activación transcripcional de los genes nod en ausencia de un inductor en el medio (Capítulo 2: Figura 1). Así, se demuestra que la activación de los genes nod dependiente de NodD2 observada en trabajos previos a esta Tesis (del Cerro et al., 2017 y 2019) se debe a un aumento de la expresión del gen nodD2 bajo una condición de estrés osmótico, y no a la activación de este regulador por la presencia de un inductor en el medio. Estos resultados coinciden con el modelo hipotético de actuación de los reguladores NodD2 y OnfD que se describió anteriormente (Figura 13). En línea con estos resultados, el alineamiento de secuencia de aminoácidos de los 5 reguladores NodD de CIAT 899 revelaron que el regulador NodD2 está menos conservado que el resto de las proteínas NodD. Mientras que las comparaciones de secuencias entre los pares NodD1-NodD3, NodD1-NodD4, NodD1-NodD5, NodD3- NodD4, NodD3-NodD5 y NodD4-NodD5 muestran porcentajes de similitud que varían desde 67,08% a 77,78%, estos porcentajes se mantienen en un rango entre el 54,81% y el 61,38% al comparar NodD2 con el resto de los reguladores NodD (Capítulo 2: Figura suplementaria 5A). Por otro lado, en el regulador NodD1 se localizan tres dominios predictivos de unión a ligando, que corresponden a las posiciones L133-R143, D154-R163 y A198-I208. Se pudo comprobar que estas secuencias de aminoácidos están menos conservadas en el regulador NodD2 que en el resto de los reguladores NodD de CIAT 899. En concreto, en la misma posición del dominio A198-I208 en el que NodD1porta una arginina (de carga positiva) y NodD2 presenta una glutamina (de carga polar neutra) (Capítulo 2: Figura suplementaria 5B). De hecho, en el caso del regulador NodD1 de S. meliloti, la mutación DISCUSIÓN 118 por sustitución de una lisina (de carga positiva) por una asparagina (neutra) en el sitio de predicción de unión a flavonoides derivó en la activación constitutiva de la proteína NodD1 (Peck et al., 2013). Curiosamente, los reguladores NodD2 de M. loti R7A y R. leguminosarum bv. trifolii difieren en los sitios de unión a ligando con sus respectivos reguladores NodD1, que se activan en presencia de un flavonoide inductor (Kelly et al., 2018; Ferguson et al., 2020). De la misma manera que en CIAT 899, la inducción de los genes nod en la estirpe R7A de M. loti está preferentemente controlada por NodD1 y NodD2 en etapas específicas de la infección simbiótica: NodD2 es responsable de la inducción de estos genes en la rizosfera y dentro de los nódulos, mientras que NodD1 es el principal responsable de la inducción de los genes nod dentro de los tubos de infección de los pelos radicales. Ambos mutantes son significativamente menos competitivos para nodular que la estirpe silvestre, lo que indica que ambas proteínas son necesarias para una infección simbiótica competente. Además, estos resultados sugieren una activación preferencial de NodD1 y NodD2 por diferentes compuestos inductores producidos en etapas definidas de la infección simbiótica (Kelly et al., 2018). Por su parte, en la estirpe TA1 de R. leguminosarum bv. trifolii se ha comprobado que existe una copia de NodD2 funcional que mejoraba la competitividad por la nodulación. Sin embargo, NodD1 mostró una capacidad significativamente mayor para inducir la expresión de genes nod y la formación de tubos de infección (Ferguson et al., 2020). Así, las diferencias en los sitios predictivos de unión a ligando entre los reguladores NodD1 y NodD2 de CIAT 899, así como los resultados descritos para otras estirpes de rizobios, podrían explicar las diferentes vías de activación de estos reguladores y su posible implicación en diferentes estadios simbióticos. En cuanto a los ensayos del fenotipo simbiótico de cada una de las estirpes de CIAT 899 que portan de forma independiente los diferentes genes nodD, se pudo observar que la presencia única del gen nodD1, ya sea en bajo o alto número de copias, es suficiente para que se establesca una simbiosis efectiva con P. vulgaris y L. burttii.. Sin embargo, la variación de carga citoplasmática de NodD2 sí que afecta a la formación de nódulos en estas dos plantas, ya que solo cuando se sobreexpresa el gen nodD2 se restaura el número de nódulos al mismo nivel que la estirpe silvestre, mientras que la complementación del gen nodD2 en bajo número de copias conduce a una reducción en la formación de nódulos en judía y L. burttii (Capítulo 2: Figura 2A). Este resultado indica que alguna de las proteínas NodD ausentes puedan ser las responsables de potenciar la expresión del gen DISCUSIÓN 119 nodD2 en la estirpe silvestre y por tanto, cuando nodD2 se encuentra regulado bajo su propio promotor en ausencia del resto de NodD no se alcanzan los valores de expresión suficientes para restaurar el fenotipo simbiótico. En L. japonicus el escenario simbiótico parece ser diferente. En esta planta, la estirpe que sobreexpresa el gen nodD2 induce un número de nódulos al mismo nivel que la estirpe silvestre. Sin embargo, esta sobreexpresión no restaura completamente los valores de masa seca de la parte aérea, lo que indicaría que altos niveles del regulador NodD2 potencian la entrada del rizobio y el desarrollo de los nódulos, pero no es suficiente para restaurar por completo la fijación de N2 en L. japonicus (Capítulo 2: Figura suplementaria 3). En el caso de nodD1, ninguna de las cepas que portan este gen de forma independiente, ya sea en bajo o elevado número de copias, es capaz de nodular de forma eficiente. Teniendo en cuenta que un mutante simple de CIAT 899 en el gen nodD1 no nodula en plantas de L. japonicus (del Cerro et al., 2017), se puede concluir que NodD1 es esencial y a su vez depende de otro u otros reguladores NodD para establecer simbiosis con L. japonicus. Los resultados anteriores indican que el regulador NodD2 de CIAT 899 es importante en todos los estadios simbióticos: en la rizosfera, durante la colonización de la raíz y en el desarrollo de los nódulos de sus plantas hospedadoras L. burttii, L. japonicus y P. vulgaris. Es más, la importancia de NodD2 y su independencia respecto a moléculas inductoras en todos los estadios de la simbiosis se confirma cuando se sobreexpresa el gen nodD2 de CIAT 899 en la estirpe HH103 de S. fredii. Esta sobreexpresión heteróloga del gen nodD2 promueve la formación de nódulos no fijadores en judía, planta con la que naturalmente HH103 es incapaz de nodular. Además, HH103 con el gen nodD2 de CIAT 899 sobreexpresado es capaz de inducir la formación de nódulos fijadores de nitrógeno en L. japonicus, planta en la que la estirpe silvestre solo es capaz de formar nódulos no fijadores sin bacterias en su interior (Acosta-Jurado et al., 2019). Del mismo modo, la expresión heteróloga en L. burttii causa un aumento en el número de nódulos fijadores a niveles superiores que la estirpe silvestre de HH103 (Capítulo 2: Figura 3). Sin embargo, pese a la espectacularidad de estos hallazgos, una cuestión importante que queda por dilucidar es entender cómo el regulador NodD2 de CIAT 899 es capaz de tener un efecto en HH103 sin necesitar la acción del regulador OnfD, ya que como se ha demostrado previamente, ambos reguladores son esenciales y actúan de forma conjunta en CIAT 899. Curiosamente, en S. fredii HH103 encontramos una proteína, codificada por el gen DISCUSIÓN 120 SFHH103_06433, que presenta una similitud del 64% con el regulador OnfD de CIAT 899, por lo que podría actuar de manera similar que OnfD. Por otro lado, los ensayos de colonización e infección de la raíz llevados a cabo en L. burttii y L. japonicus mediante microscopía confocal han permitido conocer más sobre el modo de entrada de CIAT 899 en estas plantas. Hasta la fecha se conocen diferentes modos de colonización e infección de la raíz por los rizobios. El modo de infección mejor estudiado y más sofisticado por el que los rizobios colonizan e infectan las raíces de sus plantas hospedadoras es a través de la formación de ITs hasta alcanzar las células del córtex radicular, donde las bacterias se liberan. Esta forma de infección es dependiente de NFs y está asociada a altos niveles de compatibilidad entre la bacteria y la planta. L. japonicus y M. truncatula así como otras leguminosas de interés agronómico como G. max (soja) o P. vulgaris son algunos ejemplos en los que se han identificado este modo de infección (Acosta-Jurado et al., 2019; Rodríguez-López et al., 2019; Montiel et al., 2021). Además de la entrada por ITs, se conoce otro modo de infección menos evolucionado, denominado infección intracelular. Esta vía consiste en la entrada de los rizobios a través de las roturas que se generan por el desarrollo de las raíces laterales que emergen (denominado en inglés crack entry) o bien porque los rizobios logran penetrar a través de las células de la epidermis radicular. Una vez dentro, las bacterias avanzan y se desarrollan entre las células de la epidermis hasta alcanzar las células del córtex (González-Sama et al., 2004; Goormachtig et al., 2004; Sprent, 2007). Los ensayos de microscopía realizados indican que CIAT 899 coloniza las raíces de L. burttii mediante el desarrollo de ITs así como por la vía de infección de tipo intercelular. Es más, los resultados indican que la vía intercelular es predominante, ya que en solo 5 de las 20 plantas de L. burttii inoculadas con CIAT 899 silvestre se pudo observar la presencia de ITs, a pesar de que todas ellas presentaban nódulos colonizados (Capítulo 2: Figura 2D). Previamente, se había descrito la posibilidad de ambos tipos de infección en esta planta, puesto que M. loti penetra mediante la formación de ITs y la estirpe HH103 de S. fredii lo hace por la vía intercelular (Kelly et al., 2018; Acosta-Jurado et al., 2016; Acosta-Jurado et al., 2019; Jiménez- Guerrero et al., 2020). Por ello, no solo no es sorprendente que CIAT 899 haya evolucionado desarrollando ambos tipos de infección para colonizar las raíces de L. burttii, sino que este escenario es ideal para estudiar qué proteínas NodD pueden estar implicadas en un modo u otro de colonización. Además, el regulador NodD1 de CIAT 899 parece ser esencial para la formación de ITs en las raíces DISCUSIÓN 121 de L. burttii, pues un mutante en este gen forma nódulos colonizados, pero no promueve la formación de ITs (Capítulo 2: Figura 2D). Este hecho podría explicar por qué este mutante reduce de forma significativa la formación nódulos en L. burttii, ya que se estaría suprimiendo una de las vías de entrada a la raíz (del Cerro et al., 2015a). Por otra parte, la sobreexpresión del gen nodD2 en el quíntuple mutante induce la formación de ITs en L. burttii, datos que concuerdan con el aumento del número de nódulos observados en los ensayos de nodulación (Capítulo 2: Figura 2B, D). Por último, en plantas de L. japonicus no se pudo identificar la formación de ITs en ninguna de las plantas inoculadas con la estirpe silvestre, ni tampoco con el resto de las estirpes mutantes (Capítulo 2: Figura 2E), concluyendo que la forma por la que CIAT 899 infecta a esta planta es únicamente mediante la vía intercelular. Respecto al resto de proteínas NodD, estudios previos basados en mutantes simples de los genes nodD3, nodD4 y nodD5 de CIAT 899 mostraron que la ausencia de estos reguladores no supone ninguna gran desventaja a la hora de establecer simbiosis con sus plantas hospedadoras P. vulgaris y L. burttii (del Cerro et al., 2015b). Sin embargo, los mutantes en los genes nodD3 y nodD5 disminuyeron ligera pero significativamente el número de nódulos, así como el peso seco de la parte aérea en plantas de L. japonicus (del Cerro et al., 2015b). En estas investigaciones iniciales, probablemente la presencia del resto de proteínas NodD dificultase el estudio del papel de estos reguladores transcripcionales de manera individual. Sin embargo, a pesar de que en el presente estudio cada regulador NodD se encuentra en un escenario óptimo para su estudio, es decir, sin la influencia del resto de proteínas NodD, sigue sin concretarse el papel individual que juegan NodD3 y NodD5 en la simbiosis entre CIAT 899 y las diferentes plantas hospedadoras ensayadas. Únicamente, en el caso de NodD4, cuando se sobreexpresa en ausencia del resto de reguladores NodD, se detecta cierta actividad en la expresión de los genes nod en los ensayos de actividad β-galactosidasa en presencia de apigenina. Curiosamente, esta misma estirpe sí que es capaz de inducir la formación de un escaso número de nódulos fijadores de nitrógeno en L. burttii (Capítulo 2: Figura 2B). Estos resultados indican que NodD4 podría reconocer flavonoides específicos en el medio e inducir ligeramente la expresión de los genes nod y la síntesis de NFs. En el caso de las proteínas NodD3 y NodD5, no se puede descartar que desempeñen un papel en simbiosis, ya que las condiciones inductoras (estrés osmótico y apigenina) y las plantas que se emplean en estos estudios podrían no ser las adecuadas para desvelar sus funciones. DISCUSIÓN 122 Además, no es descartable que la función ejercida por estas proteínas NodD requiera de la presencia de alguna de las proteínas NodD restantes, por lo que los ensayos presentados en este capítulo no serían los idóneos para identificar su posible papel durante el proceso simbiótico. Como ya se ha mencionado, las proteínas NodD son uno de los elementos clave en la especificidad planta-microorganismo en la simbiosis. Sin embargo, esta compatibilidad está a menudo limitada a la capacidad de estas proteínas de reconocer solo ciertos flavonoides (Walker et al., 2020). Debido a ello, a lo largo de los años numerosos estudios se han centrado en tratar de reducir la especificidad de las interacciones simbióticas con el fin de encontrar elementos claves que permitan modificar el rango de hospedador de un rizobio, ya que incrementar la compatibilidad entre los rizobios y las plantas leguminosas pueden tener beneficios muy importantes en agricultura (Jiménez-Guerrero et al., 2020). Así, se han realizado mutaciones específicas o sustituciones de ciertos aminoácidos en los reguladores NodD para determinar si se produce una activación constitutiva de estas proteínas y por consiguiente la expresión constitutiva de los genes nod y la síntesis de NFs. Estas mutaciones se conocen con el nombre de FITAs, del inglés Flavonoid-Independent Transcriptional Activation (McIver et al., 1989; Vinardell et al., 2004; Hou et al., 2009; Peck et al., 2013). La importancia del trabajo recogido en el segundo capítulo de esta Tesis Doctoral estriba en el hallazgo de que la simple sobreexpresión del gen nodD2, sin requerir de ninguna molécula inductora, es capaz de activar constitutivamente la expresión de los genes nod y la síntesis de NFs en CIAT 899. Además, la expresión heteróloga de este regulador en otro rizobio, S. fredii HH103, no solo mejora la eficiencia de la simbiosis con L. burttii, si no que permite ampliar su rango de hospedador, como en el caso de L. japonicus, e incluso inducir la formación de nódulos en plantas no compatibles, como P. vulgaris. También, cabe mencionar que el hecho de que la actividad de la proteína NodD2 de CIAT 899 dependa de sus niveles transcripcionales y no de la activación del regulador por acción de una molécula inductora, como sí ocurre en el caso del regulador NodD1, supone una ventaja para poder estudiar en qué punto de la simbiosis es clave su actuación. De este modo, una de las perspectivas futuras sería realizar estudios de ARN-seq en los nódulos de sus plantas hospedadoras, así como en las raíces para confirmar la función de NodD2 en otros estadios simbióticos. DISCUSIÓN 123 A pesar de que la simbiosis rizobio-leguminosa se ha estudiado ampliamente a lo largo de la historia, aún nos encontramos muy lejos de conocer todos los elementos que participan en el éxito de esta interacción planta-microrganismo. Hasta la fecha, siguen aflorando nuevos factores determinantes o que influyen de cierta forma en el establecimiento de la simbiosis. En este contexto, se sitúan las vesículas de membrana (MVs) liberadas por los rizobios. Estas nanoesferas lipídicas se han estudiado ampliamente en las dos últimas décadas, siendo abundantes los estudios destinados a las MVs liberadas por organismos patógenos, ya que se ha demostrado que asumen un papel crucial a la hora de modelar la respuesta fisiológica de las células hospedadoras (Li et al., 2016; Sartorio et al., 2021). Más recientemente, ha cobrado protagonismo el estudio de las MVs en la interacción plantapatógeno, lo que ha permitido conocer que las vesículas liberadas por patógenos de plantas portan toxinas, así como de elicitores inmunogénicos que parecen ser claves en el proceso de infección del hospedador (Chowdhury & Jagannadham, 2013; Villageliu & Samuelson, 2022). Sin embargo, poco o nada se sabe acerca del papel de las vesículas liberadas por los rizobios y su implicación en el establecimiento de la simbiosis con las leguminosas. No obstante, es de presuponer que debido a que el proceso simbiótico requiere de un continuo y coordinado intercambio de señales entre ambos organismos, las MVs liberadas por los rizobios puedan estar jugando un papel importante en las diferentes fases del proceso simbiótico. El tercer capítulo de esta Tesis Doctoral versa sobre el aislamiento y análisis de las MVs liberadas por R. tropici CIAT 899 durante el reconocimiento planta-microorganismo que se establece en la rizosfera. En este capítulo se describe de forma detallada un protocolo que ha permitido aislar de forma eficiente las vesículas contenidas en los cultivos de R. tropici CIAT 899 en presencia y ausencia del flavonoide apigenina. Esto ha permitido el análisis de las MVs liberadas en dichas condiciones con el fin de averiguar cómo estas partículas podrían afectar en la primera etapa del proceso simbiótico. El protocolo consiste en una serie de pasos secuenciales de centrifugación, filtración y ultracentrifugación a partir de un cultivo bacteriano, hasta la obtención de un volumen de muestra donde se mantienen concentradas las vesículas procedentes de los cultivos (Capítulo 3: Figura 1) Posteriormente, el análisis integrativo de diferentes técnicas de microscopía electrónica, Nano-sight y tinción de lípidos van a permitir conocer la DISCUSIÓN 130 MVs presentes en las muestras correspondan a una mezcla de vesículas procedentes de ambos organismos, lo que cabría esperar al establecerse una comunicación bidireccional entre la célula simbiótica y los bacteroides. Por otro lado, se han realizado análisis proteómicos que han permitido confirmar la presencia de proteínas bacterianas en las MVs procedentes del espacio peribacteroideo de los nódulos de judía. Cabe mencionar que la escasez de proteínas identificadas en estos aislados vesiculares (de tan solo 74 proteínas diferentes), y sobre todo, la ausencia de proteínas ribosomales y de otras proteínas que son muy abundantes en el citoplasma han permitido confirmar la ausencia de contaminantes por bacteroides en las muestras. Otro dato que destacar es que aproximadamente el 40% de las proteínas identificadas corresponden a proteínas de membrana de la bacteria, principalmente destinadas al transporte, lo que corrobora que al menos, parte de las vesículas aisladas proceden de la membrana de los bacteroides de CIAT 899. Sin embargo, estos resultados proteómicos se han obtenido después de la publicación del protocolo de aislamiento de MVs a partir Figura 16. Análisis mediante microscopía de transmisión electrónica (TEM) de las muestras de MVs aisladas del espacio peribacteroideo de los nódulos desarrollados en la simbiosis entre P. vulgaris y R. tropici CIAT 899. DISCUSIÓN 131 de bacteroides al que corresponde el último capítulo de esta Tesis Doctoral. Por este motivo, y con vistas a poder ser publicados próximamente, no se muestra el listado detallado de todas las proteínas identificadas en las muestras, sino algunos ejemplos de aquellas proteínas rizobianas cuyo papel podría estar relacionado con el éxito simbiótico y la interacción directa con la célula eucariota hospedadora (Tabla 5). Entre las proteínas identificadas, predominan las proteínas de la bomba de eflujo de tipo RND (del inglés, Resistance Nodulation and cell Division). Esta familia de transportadores de membrana está implicada en la resistencia a metales pesados ®, en nodulación (N) o en la división celular (D), de ahí su siglas RND (Saier et al., 1994; Tseng et al., 1999). Una de las proteínas detectadas en las muestras de MVs aisladas de los nódulos corresponde a la proteína codificada por gen nolG de CIAT 899 (con acceso AGB73763.1). Curiosamente, el gen nolG de S. meliloti se activa en respuesta al flavonoide inductor luteolina y se requiere para nodular de forma óptima en la alfalfa (Baev et al., 1991). Sin embargo, a pesar de numerosos y profundos estudios sobre el funcionamiento de NolG y el sistema de transporte al que pertenece, como realizó Alías- Villegas en su Tesis Doctoral (2016), la función concreta de esta proteína sigue sin ser clara. Tabla 5. Algunas de las proteínas identificadas en las MVs liberadas por los bacteroides de R. tropici CIAT 899 de los nódulos desarrollados en P. vulgaris. Se indica el número de identificación de la base de datos GEO (del inglés, Gene Expression Omnibus) de cada una de estas proteínas. DISCUSIÓN 132 Otra de las proteínas identificadas es el factor de maduración de la hidrogenasa HypF de CIAT 899 (AGB73463.1). Un estudio reciente ha revelado que la proteína de maduración de hidrogenasa HypE de Mesorhizobium huakuii es esencial en el proceso de fijación de nitrógeno, además de desempeñar otros papeles importantes en bacterias, como el aporte de energía, la detoxificación, o la diferenciación a bacteroides y senescencia del nódulo (Long et al., 2023). Además de diversas proteínas implicadas en defensa y en la respuesta a estrés, resulta llamativo que un 10% de las proteínas identificadas estén relacionadas con el metabolismo del ARN. Un ejemplo es la proteína AGB72042.1, que corresponde a una helicasa de ARN de la familia de helicasas DEAD/DEAH-box. Esta familia de helicasas esta implicadas en todas las facetas del metabolismo de ARN, incluyendo la maduración del ARN mensajero (ARNm), el procesamiento de ARN pequeños (ARNs) o la transcripción y traslocación del ARN (Linder & Jankowsky, 2011; Perčulija & Ouyang, 2019). Con relación a los ARNs, se ha demostrado que estas moléculas pueden viajar de un organismo a otro con el fin de inducir el silenciamiento de genes en otras células, lo que se conoce como comunicación entre reinos mediante ARN interferente (Cheng et al., 2023). Concretamente, estos ARN pequeños juegan un papel muy importante en la regulación de la respuesta inmune y en los procesos de virulencia de las plantas. Por ejemplo, en la interacción planta-hongo, los ARNs procedentes de hongos patógenos viajan hacia las células de su planta hospedadora para silenciar la respuesta inmunológica de la planta, y del mismo modo, los ARNs de la planta son conducidos hacia el hongo para suprimir el sistema de virulencia del patógeno (Cai et al., 2018; Weiberg et al., 2013). Posteriormente, se ha descubierto que la planta libera estos ARNs a través de vesículas y que son las proteínas de unión a ARN las encargadas de cargar estos ARNs específicos en las vesículas de la planta (Cai et al., 2019; He et al., 2021). Respecto al papel de los ARNs en la simbiosis rizobio-leguminosa, en la literatura reciente se encuentran algunos estudios en los que se demuestra la importancia y el papel regulador de los ARNs sintetizados por las plantas durante el establecimiento de la simbiosis (Nhung et al., 2019; Chand et al., 2021; Castaingts et al., 2022; Jing et al., 2022). Sin embargo, la investigación acerca de la regulación de los ARNs en rizobios es muy limitada, y hasta el momento estos estudios se han centrado casi exclusivamente en la especie S. meliloti, donde se ha hipotetizado que un gran número de ARNs podrían afectar al proceso de nodulación, aunque aún se conocen muy pocos aspectos sobre el DISCUSIÓN 133 mecanismo de biosíntesis y la función de estos ARNs (Jiménez-Zurdo et al., 2013; Jiménez-Zurdo & Robledo, 2015; del Val et al., 2012; Robledo et al., 2020). Un ejemplo es el ARNs NfeR1 de S. meliloti, cuyos niveles de expresión son máximos en condiciones de estrés por hambre de nitrógeno y en los bacteroides (García-Tomsig et al., 2023). También se ha descrito que ARNs que derivan de los ARN transferentes (ARNt) de B. japonicum se inducen durante el proceso de infección en los bacteroides de los nódulos de soja. Es más, se ha especulado que estos ARNs podrían tener como diana diferentes genes del genoma de la planta (Ren et al., 2019). Teniendo en cuenta todos estos antecedentes, una hipótesis plausible sería que las helicasas de ARN identificadas en las MVs aisladas de los bacteroides ayudasen a cargar ciertos ARNs con el fin último de actuar como vía para el transporte de ARNs desde el bacteroide hacía el genoma de la célula simbiótica. Para comprobar esta hipótesis, sería realmente interesante llevar a cabo estudios transcriptómicos comparativos de la MVs aisladas del espacio peribacteroideo de los nódulos de P. vulgaris colonizados por una estirpe mutante en el gen que codifica para la helicasa HypF de CIAT 899 y la estirpe silvestre, con el fin de identificar aquellos ácidos ribonucleicos cargados específicamente en las MVs por acción de esta helicasa. En resumen, estos ejemplos demuestran que el establecimiento de un protocolo que permite purificar de forma fácil y satisfactoria las vesículas de membrana del espacio peribacteroideo es una potente y novedosa herramienta para seguir avanzando en el estudio de los mecanismos que gobiernan el funcionamiento de los nódulos y, sobre todo, permitir identificar nuevos actores implicados en el proceso simbiótico. 134 CONCLUSIONES CONCLUSIONES 135 1. El gen onfD de R. tropici CIAT 899 codifica para un regulador transcripcional de la familia AraC que resulta esencial en la síntesis y liberación de factores de nodulación en esta bacteria bajo condiciones de estrés osmótico. 2. Los reguladores NodD2 y OnfD de R. tropici CIAT 899 interaccionan entre sí y actúan conjuntamente en la activación de los genes simbióticos y la síntesis de factores Nod en condiciones de estrés osmótico. 3. La activación transcripcional de los genes simbióticos de R. tropici CIAT 899 por acción del regulador NodD2 bajo una condición de estrés osmótico en el medio es consecuencia de un aumento de expresión del gen nodD2 y no por la presencia de una molécula inductora en el medio. 4. La sobreexpresión heteróloga del gen nodD2 de R. tropici CIAT 899 en otros rizobios puede expandir su rango de hospedador. 5. El regulador NodD4 de R tropici CIAT 899 induce levemente la expresión del gen nodA en presencia de apigenina, lo que resulta la formación de un bajo número nódulos en L. burttii. 6. Se confirma con éxito el aislamiento y análisis de las vesículas de membrana liberadas por la estirpe CIAT 899 en presencia y ausencia del flavonoide apigenina, permitiendo el estudio de estas partículas en la primera etapa del proceso simbiótico. 7. Se confirma la presencia de vesículas de membrana en el espacio peribacteroideo de los nódulos desarrollados en la simbiosis de R. tropici CIAT 899 y P. vulgaris. CONCLUSIONS 136 1. The onfD gene of R. tropici CIAT 899 encodes for a AraC family transcriptional regulator that is essential in the synthesis and secretion of NFs under osmotic stress conditions. 2. The R. tropici CIAT 899 NodD2 and OnfD regulators could interact and carry out together the symbiotic gene activation and Nod factors synthesis under osmotic stress conditions. 3. The transcriptional induction of the symbiotic genes by NodD2 in R. tropici CIAT 899 under an osmotic stress is consequence of an increase in the nodD2 expression and not by the presence of a signal molecule. 4. The heterologous overexpression of the R. tropici CIAT 899 nodD2 gene in other rhizobia may expand their host range. 5. The NodD4 protein of CIAT 899 slightly induces the expression of nodA genes in the presence of apigenin and a low number of nodules in L. burttii plants. 6. The successful isolation and analysis of membrane vesicles released by R. tropici CIAT 899 in the presence and absence of the flavonoid apigenin is confirmed. In this way, the roll of these particles in the first stage of the symbiotic process can be studied. 7. The presence of membrane vesicles in the peribacteroid space of the nodules developed in the symbiosis of R. tropici CIAT 899 and P. vulgaris is confirmed. 137 BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFÍA 138 Acosta-Jurado, S., Rodríguez-Navarro, D. N., Kawaharada, Y., Perea, J. F., Gil-Serrano, A., Jin, H., et al. (2016a). Sinorhizobium fredii HH103 invades Lotus burttii by crack entry in a Nod Factor and surface polysaccharide dependent manner. Molecular Plant- Microbe Interactions, 29, 925-937. Acosta-Jurado, S., Navarro-Gómez, P., Murdoch, P. D. S., Crespo-Rivas, J. 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