Desarrollo de matrices con base proteica de soja para horticultura conteniendo zinc como micronutriente

111 C12 DESARROLLO DE MATRICES CON BASE PROTEICA DE SOJA PARA HORTICULTURA CONTENIENDO ZINC COMO MICRONUTRIENTE Jiménez Rosado, Mercedes; Cordobés Carmona, Felipe; Guerrero Conejo, Antonio; Ruiz Domínguez, Manuela. Tecnología y Diseño de Productos Multicomponentes (TEP-229). Departamento de Ingeniería Química. Escuela Politécnica Superior. Universidad de Sevilla. RESUMEN Los bioplásticos de base proteica son un nuevo tipo de materiales que se basan en componentes naturales renovables con un bajo precio. Debido a los beneficios tecnológicos, económicos y ambientales, estos sistemas son altamente atractivos para la incorporación y posterior liberación de micronutrientes que son esenciales para el desarrollo y salud de las plantas, evitando el típico exceso de fertilizantes convencionales. El objetivo de este trabajo es evaluar el potencial de aplicación de materiales absorbentes con base proteica de soja en horticultura. Para la incorporación del micronutriente seleccionado (zinc) en las matrices con base proteica de soja, se seleccionó sulfato de zinc monohidratado, y posteriormente se evaluaron las propiedades mecánicas, la capacidad de absorción de agua, la microestructura y el nivel de zinc incorporado en la matriz. Finalmente, se observó que la incorporación de la sal provoca una importante reducción de la capacidad absorbente de la matriz de proteína de soja, debido al efecto negativo del aumento de la fuerza iónica. Además, las propiedades mecánicas y la microestructura de las matrices están muy influenciadas por la presencia de la sal. Palabras clave: Bioplástico, Soja, Zinc, Micronutrientes, Horticultura. ABSTRACT Protein-based bioplastics are a good example of new type of materials, being based on renewable natural components with a lower cost. Due to their technological, economic and environmental benefits, these systems are an attractive proposal for the incorporation and subsequent release of micronutrients essential for the development and health of plants, avoiding the typical excesses of conventional fertilization. The aim of this work was to evaluate the application potential of absorbent materials, based on proteins, in horticulture. Zinc sulfate monohydrate was assessed with the objective of incorporation the selected micronutrient (zinc) in the soy protein-based matrix, evaluating the mechanical properties, the water uptake capacity and loading level of zinc into the matrix. An important amount of an essential nutrient for a plant (Zn) was incorporated to the matrix. However, the incorporation of salt to the matrix involves some reduction in water uptake capacity, due to the negative effect of ionic strength on water absorption. In addition, mechanical properties and microstructure of the matrices are highly influenced by the presence of the salt. Keywords: Bioplastic, Soybean, Zinc, Micronutrient, Horticulture. 112 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS El hombre ha explotado los polímeros de origen natural desde tiempo remotos. Algunos ejemplos los podemos encontrar en el uso de pieles para vestimenta y refugio, el papiro y la celulosa como material de escritura, la cornamenta de animales para hacer herramientas o bisutería, etc. Desde la década de 1950 los avances en esta ciencia han consolidado el progreso científico e industrial. De tal manera que en el siglo XXI los estudios poliméricos se han especializado en funcionalidades de biomedicina, óptica y electrónica entre otras. La producción mundial de plásticos alcanzó 322 millones de toneladas en 2015, liderando China el mercado (27,8% de la producción) seguida por Europa (18,5% de la producción).En el continente europeo se produjeron 59 millones de toneladas, siendo así uno de los sectores que más empleo genera, centrándose sobre todo en Alemania (24,6%), Italia (14,3%), Francia (9,6%), España (7,7%), Reino Unido (7,5%) y Polonia (6,3%) (Plastics Europe, 2016). Sin embargo, esta elevada producción de materiales plásticos tiene importantes inconvenientes derivados de su baja biodegradabilidad, que conlleva una elevada contaminación, y su ínfima capacidad de renovación, ya que la mayoría de ellos vienen del petróleo, siendo los recursos petrolíferos no renovables. En 2014, el reciclaje y recuperación de plásticos alcanzó el 69,2% siendo el resto desechado en vertederos, provocando acumulación de basura (Plastics Europe, 2016). En este contexto, sustituir los plásticos provenientes del petróleo por plásticos de origen natural (bioplásticos) es una alternativa cada vez más prometedora. Los bioplásticos hacen referencia a una doble sostenibilidad, por un lado se consideran bioplásticos a aquellos provenientes de fuentes renovables, y por otro lado atienden a aquellos que tienen una degradabilidad natural eliminando así las acumulaciones de basura. Hay bioplásticos que combinan ambas características, procediendo así de fuentes renovables y teniendo alta biodegradabilidad. Ejemplos de estos son el PHA (Polihidroxialcanoato) o el PLA (Ácido Poliláctico), siendo 100% degradables, resistentes y versátiles. Estos bioplásticos son desarrollados en biotecnología y se usan en sectores como la agricultura, industria textil, medicina, industria alimentaria y en el mercado de embalajes y envases, aunque su uso es aún limitado (Neila, 2016). Según el instituto de Bioplásticos y Biocomposites en 2015 la producción de bioplásticos rondó los 1,5 millones de toneladas, previéndose un alcance cercano a los 6 millones de toneladas en años posteriores (AIMPLAS, 2015). Generalmente los bioplásticos se componen de una matriz polimérica, un plastificante (con el fin de mejorar la movilidad y disminuir la temperatura de transición vítrea) y, adicionalmente, aditivos para mejorar las propiedades del bioplástico. En este estudio se usará como matriz polimérica la proteína de soja debido a su carácter hidrofílico derivado de su alto contenido de ácido glutámico y aspártico, que la hace más hidrofílica que otras proteínas; y como plastificante se usará la glicerina. Las propiedades de estos bioplásticos pueden ser controlables mediante la relación soja-glicerina que se use, además de mediante otros parámetros elegidos en el proceso de moldeo (temperatura, presión y tiempo). (Liu et al., 2010). En el sector agrícola, se entiende que el uso de estos materiales aportará grandes ventajas en cuanto a su nula toxicidad y alta biodegradabilidad, así como el aporte extra de nutrientes tras su degradación. Todo ello hace de estas matrices una atractiva propuesta con potencial para la incorporación de micronutrientes esenciales para el desarrollo y salud de las plantas en horticultura. Esta incorporación y su posterior liberación evitarán los típicos excesos de la fertilización convencional, causante de la contaminación de suelos, al mismo tiempo que aumentará la eficacia de asimilación por parte de la planta. Además, debido a su capacidad superabsorbente pueden almacenar agua disponiéndola en los cultivos aumentando la eficacia del uso del agua. (Mortain et al., 2004). 113 El objetivo global de esta investigación es el desarrollo de materiales bioplásticos con base de soja (proteína) con el micronutriente seleccionado (zinc), incorporado en forma de sulfato de zinc monohidratado, para su uso en horticultura sustituyendo a un fertilizante convencional. Además, se evaluará su capacidad absorbente, propiedades mecánicas y reológicas, microestructura y nivel de micronutriente incorporado. METODOLOGÍA Materiales Un aislado proteico de soja (SPI) con un porcentaje mínimo del 91% en peso de proteína fue utilizado, siendo suministrado por Protein Technologies International (SUPRO 500E, Bélgica). El plastificante seleccionado fue glicerol (Gly), suministrado por Panreac Química S.A. (España). El zinc es incorporado en la matriz como sulfato de zinc monohidratado (ZnSO4·H2O) el cual es suministrado por Panreac Química S.A. (España). Preparación de matrices bioplásticas El proceso seguido para la preparación de las matrices con base proteica de soja consiste en varias etapas, como se puede ver en la Figura 1. Figura 16: Etapas del proceso de preparación de matrices. El micronutriente (MN) es sulfato de zinc monohidratado incorporado en la etapa de mezclado (F). En primer lugar, una relación SPI/Gly de 1:1, con o sin ZnSO4·H2O, se mezclaron en un mezclador giratorio de dos palas Polylab QC (ThermoHaake, Alemania) a temperatura ambiente y 50 rpm durante 10 min, bajo condiciones adiabáticas, siguiendo el mismo protocolo que en trabajos anteriores desarrollados por el equipo de trabajo (Fernández-Espada et al., 2016 y Félix et al., 2016) Una descripción detallada de este equipo y sus condiciones de operación se pueden encontrar en la bibliografía (Van Wazer et al., 1963 y Dealy, 1982). En esta etapa se toman medidas del par de torsión (M) y la temperatura (T) durante los 10 min de procesado de la mezcla. A continuación, las muestras obtenidas se procesaron mediante moldeo por inyección usando una inyectora MiniJet Piston Injection Moulding Sistem II (ThermoHaake, Alemania), obteniéndose bioplásticos con proteína de soja (BP). En esta etapa, los parámetros seleccionados son los mostrados en la tabla 1. 114 Parámetros Proceso IM Tcil (0C) 40 Piny (bar) 600 tiny (s) 20 Tmold (0C) 90 Phold (bar) 200 thold (s) 300 Tabla 4: Parámetros de inyección por moldeo. Donde Tcil es la temperatura del cilindro, Piny es la presión de inyección, tiny es el tiempo de inyección, Tmold es la temperatura de moldeo y Phold y thold son la presión y el tiempo al que son sometidas las muestras una vez inyectadas. Posteriormente, los BP pasaron por un tratamiento deshidrotérmico que consiste en una etapa de calentamiento en una estufa convencional a una temperatura de 500C durante 24 h. Esta etapa es necesaria para mantener la integridad física de las matrices en la siguiente etapa de absorción con agua. La etapa siguiente, es una absorción con agua, que se lleva a cabo en un recipiente cerrado con 300 mL de agua destilada durante 24 h. En esta etapa la glicerina se libera al agua y el bioplástico se convierte en una matriz con capacidad absorbente. Finalmente, las matrices se introdujeron en un liofilizador (LyoQuest, Teslar, España) con el propósito de eliminar el agua introducida en las matrices durante la etapa de absorción y obtener así las matrices secas. Caracterización de matrices bioplásticas Ensayos de tracción hasta la rotura Los ensayos de tensión se realizaron en un analizador dinámico mecánico RSA3 (TA Instruments, EE.UU.), con el fin de evaluar algunas de sus propiedades mecánicas. En los ensayos de tensión, los BP fueron sometidos a un esfuerzo axial creciente a una velocidad de 0,1 mm/min hasta llegar a la rotura del material. Se mide el esfuerzo aplicado (σ) frente a la deformación producida (Ɛ) hasta que el material se rompe. Como parámetros mecánicos se obtuvieron los valores de tensión máxima (σmax), deformación máxima (Ɛmax) y módulo de Young. Ensayos reológicos Los ensayos de flexión se llevaron a cabo en un analizador dinámico mecánico RSA3 (TA Instruments, EE.UU.). Con el fin de analizar la respuesta viscoelástica lineal de las muestras procesadas. En los ensayos de flexión, los BP se sometieron a una deformación o esfuerzo de flexión oscilatorio de amplitud pequeña. En primer lugar, se realizó un barrido de deformación, a una frecuencia constante de 1 Hz, para determinar la región viscoelástica lineal. El barrido de frecuencia (0,02-20 Hz) se realizó dentro de la región viscoelástica lineal. Estas pruebas se realizan con frecuencia para intentar relacionar las propiedades viscoelásticas con la microestructura de la matriz sin cambios (Fernández-Espada et al., 2016; Félix et al., 2016; Van Wazer et al., 1963; Dealy, 1982 y Zaráte et al., 2010). Se obtuvieron medidas del módulo elástico (E’) y el módulo viscoso (E’’) en el rango de frecuencia estudiado (ω), y se analizaron los valores de E’ y la tangente de pérdidas (tan (δ)) a la frecuencia de 1 Hz. Capacidad de absorción de agua y pérdida de material soluble. Los ensayos de absorción de agua se llevaron a cabo acorde a una modificación de la norma ASTM D570 (2005), usando BP de forma rectangular (55 x 10 x 1 mm) inmersos en 300 mL de agua destilada durante 24 h. La capacidad de absorción de agua fue calculada con la siguiente ecuación: 115 Donde 𝑚3 es el peso de la matriz después de la etapa de liofilizado y 𝑚2 es el peso de la matriz después de la etapa de absorción. Además, la pérdida de material soluble fue estimada con la siguiente ecuación: 𝑃é𝑟𝑑𝑖𝑑𝑎 𝑑𝑒 𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑙𝑒 (%)=𝑚1−𝑚3 𝑚3·100 (2) Donde 𝑚1es el peso de la matriz después de la etapa de tratamiento deshidrotérmico. Medidas de espectrometría de emisión atómica mediante fuente de acoplamiento inductivo (ICP-AES) Las medidas de ICP-AES fueron llevadas a cabo usando un SpectroBlue TI en colaboración con el Servicio de Microanálisis (CITIUS, Universidad de Sevilla, España). Las muestras de bioplásticos y matrices se sometieron a un tratamiento previo de digestión. Por otro lado, las muestras de agua tras la absorción fueron sometidas a un tratamiento de filtrado. Después de los tratamientos previos todas las muestras fueron sometidas a estas medidas con el fin de determinar la cantidad de zinc que contienen. Microscopía electrónica de barrido (SEM) La microestructura de las matrices seleccionadas se determinó en colaboración con el Servicio de Microscopía (CITIUS, Universidad de Sevilla, España) según lo descrito por Orawan et al. (2006). Las muestras recubiertas con paladio/oro fueron montadas sobre un talón de bronce. Las matrices se observaron con un microscopio Philips XL30 (Países Bajos) a una tensión de aceleración de 8 kV. Análisis estadístico Fueron llevadas a cabo al menos tres réplicas de cada medida. El análisis estadístico es llevado a cabo usando t-test y un análisis de varianza (ANOVA, p<0,05) del pack estadístico SPSS 18. Se calcularon también la desviación estándar de algunos parámetros seleccionados. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Preparación de matrices bioplásticos Como se puede ver en la Figura 1, el mezclado es la primera etapa del proceso termoquímico para la formación de matrices bioplásticas con base de proteína. El SPI, Gly y ZnSO4·H2O fueron introducidos en la mezcladora en las proporciones indicadas en la Tabla 2. Como se puede observar, las masas fueron preparadas con una relación 1:1 constante entre SPI y Gly, añadiendo diferentes porcentajes de ZnSO4·H2O (2,5; 5,0; 10 y 15%). Nomenclatu ra SPI (%) Gly (%) ZnSO4·H2O (%) 0,0% 50,00 50,00 0 2,5% 48,75 48,75 2,5 5,0% 47,50 47,50 5,0 10% 45,00 45,00 10 15% 42,50 42,50 15 Tabla 2: Porcentajes y nomenclatura para las diferentes masas SPI/Gly/ZnSO4·H2O en la etapa de mezclado. La Figura 2 muestra los perfiles del par de torsión (M) y temperatura (T) en las masas en función del tiempo de mezclado durante los 10 min de mezcla. En el caso de los valores del para de torsión, no aparecen diferencias significativas para las diferentes mezclas. Todos los perfiles presentan un aumento inicial, correspondiente con el cierre de la mezcladora, bajando hasta un valor constante que se mantiene 116 durante el resto del mezclado. Hay un máximo en el par de torsión en 2,5% bajando para mayores porcentajes de sal. Por lo que respecta a los perfiles de de temperatura, en todos los casos se obtiene un suave incremento, siendo en todos los casos la temperatura inferior a 350C. La introducción del ZnSO4·H2O implica un descenso en la temperatura con respecto a la masa que no contiene ZnSO4·H2O, con un mínimo en 5,0%. Figura 2: Perfiles de temperatura (T) y par de torsión (M) para las masas SPI/Gly/ZnSO4·H2O. Caracterización de matrices bioplásticas Ensayos de tracción hasta la rotura Las ensayos de tensión para los BP SPI/Gly/ZnSO4·H2O se presentan en la Figura 3. Figura 3: Ensayos de tensión para BP SPI/Gly/ZnSO4·H2O. A: Curvas esfuerzo-deformación. B: Propiedades de tracción. La Figura 3A muestra los resultados de las curvas de esfuerzo-deformación obtenidas. En todos los casos, las curvas esfuerzo-deformación muestran un comportamiento inicial elástico lineal con una pendiente constante, lo que permite obtener los valores del módulo de Young. El comportamiento lineal es seguido por una etapa de deformación plástica con un continuo descenso de la pendiente después del límite elástico. Todas las curvas alcanzaron finalmente un valor máximo para la tensión (σmax) y la deformación (Ɛmax), que fue seguida inmediatamente por la rotura de la muestra. Estos BP tienen comportamientos similares a los BP con base de soja previamente estudiados (Fernández-Espada et al., 2016). Los valores de estos parámetros (Módulo de Young, σmax y Ɛmax) y su correspondiente desviación estándar están marcados en la Figura 3B para todos los sistemas estudiados. Como se puede observar, la incorporación de la sal en la matriz produce un incremento en el módulo de Young hasta un valor máximo (aproximadamente en el 5,0%) y una deformación en la rotura progresivamente menor. Esto indica que A B 117 los BP son más rígidos tras la incorporación del ZnSO4·H2O. Finalmente, se puede observar como la σmax tiene prácticamente el mismo valor en todos los casos excepto en el 10% donde esta σmax disminuye significativamente. Precisamente, la menor proporción de SPI disponible durante el moldeo por inyección para los sistemas 10% parece contribuir decisivamente al empeoramiento de los parámetros mecánicos obtenidos, que refleja una menor tenacidad de la matriz. Esta puede ser la razón por la que no puedan ser obtenidos BP cargados con un mayor porcentaje de ZnSO4·H2O. Ensayos reológicos La Figura 4 muestra las propiedades reológicas obtenidas mediante pruebas de barrido de frecuencia de flexión de pequeña amplitud. Figura 4: Ensayos de flexión para BP SPI/Gly/ZnSO4·H2O. A: Módulo elástico y viscoso frente a la frecuencia. B: Propiedades de flexión a 1 Hz. En primer lugar, se realizaron barridos de deformación para determinar el rango viscoelástico lineal de cada BP estudiado. Estos ensayos no mostraron diferencias significativas en la deformación crítica (resultados no presentados). Se obtuvo una deformación crítica de 0,20% usando una deformación de 0,02% en los barridos de frecuencia. La Figura 4A muestra la evolución de los parámetros viscoelásticos lineales, E’ y E’’ con la frecuencia para todos los BP estudiados. Todos los sistemas estudiados muestran una respuesta predominantemente elástica (E’>E’’) durante todo el rango de frecuencia, lo que es típico de los materiales sólidos que tienen una dependencia suave con la frecuencia. En la Figura 4B se presenta los valores de E’ y tan (δ) a 1 Hz (E’1 y tan (δ)1). Como se puede observar, la incorporación de la sal produce un incremento en el módulo elástico (E’1) y una consecuente disminución de los valores de tan (δ)1. Aunque la presencia de ZnSO4·H2O mejora las propiedades reológicas de los BP, el BP con el menor contenido de ZnSO4·H2O (2,5%) muestra la mayor respuesta elástica. Estos resultados refuerzan la idea de la importancia de la proporción de proteína disponible en el moldeo por inyección de las masas SPI/Gly/ZnSO4·H2O. Además, parece que un incremento en el contenido de ZnSO4·H2O puede interferir en la formación de la matriz proteica, y puede empeorar la respuesta viscoelástica. Capacidad de absorción de agua y pérdida de material soluble. La Figura 5 muestra la capacidad de absorción de agua y pérdida de material soluble para los BP SPI/Gly/ZnSO4·H2O. Como se puede observar, la incorporación de la sal produce un remarcable descenso de la capacidad de absorción de agua, siendo esta capacidad independiente del contenido de ZnSO4·H2O (2,5 a 10%). Estos resultados indican que las matrices con sal incorporada no son buenas absorbentes. Este descenso puede ser debido a un menor grado de hinchamiento producido por la rigidez de las matrices que incorporan el ZnSO4·H2O, adicionado a la alta fuerza iónica producida por la sal. En cuanto a los resultados de pérdida de material soluble, parece que la Gly se difunde completamente en el medio como material soluble. Sin ZnSO4·H2O una pequeña proporción de SPI también se difunde. Esta pérdida de SPI se inhibe cuando la matriz incorpora el ZnSO4·H2O. De hecho, la A B 118 pérdida de material soluble presenta un mínimo en el 2,5%, que indica que solo la Gly es solubilizada. No obstante, cuando el contenido de ZnSO4·H2O incrementa desde el 2,5% al 5,0 o 10% se produce un nuevo incremento de la pérdida de material soluble. Una posible explicación para este desarrollo podría ser que este incremento es debido a la suma de Gly y ZnSO4·H2O que la matriz no es capaz de retener. De acuerdo con estos resultados, la cantidad de ZnSO4·H2O que la matriz podría retener estaría entre el 2,5 y 5,0%. Esta explicación también justificaría la pequeña o nula diferencia encontrada en la capacidad de agua absorbida de los BP con diferentes concentraciones de ZnSO4·H2O. Figura 5: Capacidad de absorción de agua y pérdida de material soluble para BP SPI/Gly/ZnSO4·H2O. Medidas de espectrometría de emisión atómica mediante fuente de acoplamiento inductivo (ICP-AES) Las medidas de ICP-AES fueron obtenidas para los BP 2,5 y 10%, las matrices 2,5 y 10% y para el agua después de la absorción de las matrices 2,5 y 10%. Estos resultados se muestran en la Tabla 3. Muestra Zn en BP (%, mg) Zn en ML (%, mg) Zn en A (%, mg) 2,5% 100 82±3 18±3 6,8±0,2 5,5±1,0 1,3±1,0 10% 100 22±2 78±2 31±3 6,5±0,8 24±1 Tabla 3: Porcentaje en peso de zinc obtenido en las medidas de ICP-AES para 2,5 y 10% BP y matrices (ML) y agua tras la absorción (A) de estas matrices. El porcentaje en peso de zinc retenido en la matriz del 2,5% es mayor que en la matriz del 10%. Este resultado confirma los resultados obtenidos en los ensayos de capacidad de absorción de agua y pérdida de material soluble. Así, la matriz del 10% tiene una rápida liberación del ZnSO4·H2O en la primera absorción, que la matriz no es capaz de retener, convirtiéndose en una matriz similar a la matriz del 2,5%. Microscopía electrónica de barrido (SEM) Las imágenes de microscopía electrónica mostradas en la Figura 6 fueron obtenidas para matrices sin sal y matrices que incorporan un 10%. Se puede observar como la matriz que no incorpora sal tiene poros más grandes que la matriz que la incorpora. 0 119 Figura 6: Imágenes SEM para matrices SPI/Gly/ZnSO4·H2O. A: Matriz sin sal a 50x. B: Matriz sin sal a 200x. C: Matriz con 10% de sal a 50x. D: Matriz con 10% de sal a 200x. El tamaño de poro para la matriz sin sal es heterogéneo y entre 10 y 110 µm, siendo el tamaño más repetido 20 µm. Por otro lado, el tamaño de poro para la matriz 10% es más homogéneo entre 5 y 10 µm, siendo 5 µm el tamaño más repetido (medidas de porosimetría no presentadas). Estos resultados indican que la incorporación del ZnSO4·H2O en la matriz acarrea la reducción del tamaño de poro, siendo estos poros más homogéneos. Éste es otro factor que reduce la capacidad de absorción de agua de estas matrices. CONCLUSIONES Las matrices con base proteica de soja han demostrado su alto potencial en horticultura debido a que se ha logrado incorporar el micronutriente seleccionado (zinc) en ellos en una cantidad adecuada para la captación de las plantas. Además, la capacidad de absorción de agua de las matrices es suficiente para la correcta liberación del micronutriente. Aun así, la incorporación del micronutriente restringe la capacidad superabsorbente de las matrices debido a su mayor rigidez y menor tenacidad. Por último, las propiedades mecánicas y reológicas de las matrices también se ven afectadas con la introducción del ZnSO4·H2O, limitando su incorporación a porcentajes en peso mayor al 10%. No obstante, es posible el correcto procesado de las matrices bioplásticas contenido hasta un 10% de ZnSO4·H2O. AGRADECIMIENTOS Este trabajo forma parte de un proyecto financiado por MINECO/FEDER, EU (CTQ2015-71164-P). Los autores también agradecen el acceso y la asistencia al servicio de microscopía y microanálisis del CITIUS (Universidad de Sevilla).