Síntesis y evaluación de nuevas moléculas multidiana en la prevención de enfermedades degenerativas

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA FACULTAD DE QUÍMICA UNIVERSIDAD DE SEVILLA Síntesis y evaluación de nuevas moléculas multidiana en la prevención de enfermedades degenerativas Jesús Miguel Roldán Peña Sevilla, enero de 2020 DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA FACULTAD DE QUÍMICA UNIVERSIDAD DE SEVILLA Síntesis y evaluación de nuevas moléculas multidiana en la prevención de enfermedades degenerativas Memoria presentada por el Graduado en Química Jesús Miguel Roldán Peña para optar al grado de Doctor en Química Fdo. Jesús Miguel Roldán Peña Sevilla, enero de 2020 DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA FACULTAD DE QUÍMICA UNIVERSIDAD DE SEVILLA VºBº de los Directores de la Tesis Doctoral Fdo.: José María Fernández-Bolaños Guzmán Fdo.: Inés Maya Castilla Catedrático de la Universidad de Catedrática de Escuela Universitaria Sevilla de la Universidad de Sevilla Fdo.: Óscar López López Profesor Titular de la Universidad de Sevilla Merecen un profundo agradecimiento las siguientes personas: A mi familia, y amigos, por estar siempre ahí, en lo bueno y en lo malo. A mi padre. Gracias por demostrarme lo inmenso que puede ser el amor que un padre puede tener hacia su hijo. A mi mujer, Irene. Gracias por todo y mucho más. Tú más que nadie sabes lo duro que ha sido realizar todo este trabajo. El que haya conseguido llegar donde estoy es gracias a ti y una parte importantísima de este trabajo también es tuyo. Cabe añadir otros agradecimientos en referencia a esta Tesis Doctoral: A la Fundación Cámara por la concesión de una beca para la realización de la presente Tesis Doctoral, y al Ministerio de Educación, por la concesión de la Beca de Formación para Profesorado Universitario (FPU) también para la realización de la presente Tesis Doctoral. Al Ministerio de Economía y Competitividad por la financiación al grupo de investigación concedida al proyecto “Moléculas y Macromoléculas con Actividad Multidiana frente a enfermedades Degenerativas (CTQ2016-78703-P)” dentro del cual se ha realizado la presente Tesis. A mis directores de Tesis, José Mª Fernández-Bolaños Guzmán, Inés Maya Castilla y Óscar López López por darme la oportunidad de realizar esta Tesis Doctoral dentro de su grupo de investigación. Al personal del servicio de RMN del y al servicio de Espectrometría de Masas CITIUS por sus labor. A los grupos de investigación del profesores José Manuel Padrón (Universidad de la Laguna, Canarias), María Laura Bolognesi, Manuela Bartolini y Bárbara Monti (Universidad de Bolonia), por su colaboración en la evaluación biológica de algunos de los compuestos sintetizados, así como al doctor Antonio Franconetti, actualmente investigador del CIC bioGUNE (Vizcaya) por su colaboración en los con los estudios de modelización molecular realizados. Por último, agradecer a la Universidad de Sevilla dentro de la cual se ha realizado la presente Tesis Doctoral dentro de su programa de Doctorado en Química. ÍNDICE Abreviaturas y acrónimos 1 Reactivos y disolventes comerciales usados 4 1. Resumen 7 2. Relación de compuestos 11 3. Introducción general 18 4. Objetivos 25 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 28 5.1. Introducción y antecedentes 29 5.1.1. Alzheimer, características y causas 29 5.1.2. La tacrina y otros inhibidores de colinesterasas para el tratamiento del Alzheimer 37 5.2. Resultados y discusión 42 5.2.1. Síntesis y evaluación de nuevos tioderivados de tacrina 42 5.2.1.1. Síntesis de nuevos tioderivados de tacrina 42 5.2.1.2. Evaluación in vitro de nuevos tioderivados de tacrina 45 A) Ensayo de inhibición de colinesterasas (AChE y BuChE) 45 B) Ensayo de inhibición de autoagregación de polipéptidos β-amiloides 50 C) Ensayo de neurotoxicidad 51 D) Ensayo como miméticos de glutatión peroxidasa 52 E) Ensayo de capacidad antiproliferativa 56 5.2.2. Síntesis y evaluación de nuevas moléculas duales obtenidas a partir de tacrina y derivados de fenoles 59 5.2.2.1. Síntesis de nuevas moléculas duales a partir de tacrina y derivados de fenoles 59 5.2.2.2. Evaluación in vitro y modelización molecular de nuevas moléculas duales obtenidas a partir de tacrina y derivados de fenoles 68 A) Ensayo de DPPH 68 B) Ensayo de inhibición de colinesterasas (AChE y BuChE) 69 C) Modelización molecular 76 D) Ensayo de inhibición de autoagregación de polipéptidos β-amiloides 80 E) Ensayo de neurotoxicidad 81 F) Ensayo de hepatotoxicidad 83 G) Ensayo de neuroprotección 84 H) Ensayo de estabilidad en plasma sanguíneo 85 6. Síntesis de nuevos derivados organocalcógenos y evaluación de su actividad anticancerígena 86 6.1. Introducción y antecedentes 87 6.1.1. El cáncer. Causas y características 87 6.1.2. Interés de los derivados fenólicos y derivados calcógenos frente al cáncer y búsqueda de selectividad en fármacos 88 6.1.3. Interés biológico del selenio y aplicación de compuestos organoselénicos como inhibidores de HADC frente al cáncer 93 6.2. Resultados y discusión 98 6.2.1. Síntesis y evaluación de nuevos tio- y selenoderivados de tirosol e hidroxitirosol 98 6.2.1.1. Síntesis de nuevos tio- y selenoderivados de tirosol e hidroxitirosol 98 6.2.1.2. Evaluación de capacidad antiproliferativa 101 6.2.2. Síntesis y evaluación de nuevos tio- y selenoderivados de biotina 103 6.2.2.1. Síntesis de nuevos tio- y selenoderivados de biotina 103 6.2.2.2. Evaluación de capacidad antiproliferativa 117 7. Conclusiones 121 8. Parte experimental 124 8.1. Métodos generales 125 8.1.1. Ensayo de inhibición de AChE y BuChE en derivados organocalcógenos empleando enzimas modelo de origen animal 126 8.1.2. Ensayo de inhibición de AChE y BuChE en compuestos sin calcógenos empleando enzimas modelo de origen animal 131 8.1.3. Ensayo inhibición de AChE y BuChE empleando enzimas humanas 134 8.1.4. Ensayo de inhibición de autoagregación de polipéptidos β-amiloides 134 8.1.5. Ensayo de DPPH 135 8.1.6. Ensayo de evaluación de compuestos como miméticos de GPx 135 8.1.7. Ensayo de neurotoxicidad 136 8.1.8. Ensayo de hepatotoxicidad 137 8.1.9. Ensayo de neuroprotección 138 8.1.10. Ensayo de estabilidad en plasma sanguíneo 138 8.1.11. Estudio de modelización molecular 139 8.1.12. Ensayo de antiproliferación 140 8.1.13. Análisis estadístico 142 8.2. Síntesis de materias primas 143 8.3. Síntesis por una nueva ruta de compuestos conocidos 154 8.4. Síntesis de nuevos compuestos 163 9. Espectros de RMN representativos 217 Abreviaturas y acrónimos 1 ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS  5-FU 5-Fluorouracilo  Aβ β-amiloides  AChE Acetilcolinesterasa  Ala Alanina  AMPc Adenosín monofosfato cíclico  Anh. Anhidro/a  AOVE Aceite de oliva virgen extra  APP Proteína precursora amiloidea  Asn Asparagina  Asp Ácido aspártico  BuChE Butirilcolinesterasa  BHT Butilhidroxitolueno  BSSE Error por superposición de la base  Cat. Catalizador  CCF Cromatografía de capa fina  CE50 Concentración efectiva para lograr un 50% de la máxima respuesta  ChAT Colina acetiltransferasa  CI50 Concentración para inhibir un proceso al 50%  Desc. Descomposición  DMF N,N-Dimetilformamida  DFT Density functional theory  DO Densidad óptica  DPPH Radical 1,1-difenil-2-picrilhidracilo  DTNB Ácido 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoico)  Esq. Esquema  Equiv. Equivalente  ESI Electrospray ionization  FA Ácido fórmico  FDA Food and Drug Administration 1. Resumen 8 Entre las enfermedades más preocupantes actualmente en cuanto al número de casos así como a la importancia de los efectos producidos por las mismas están las enfermedades crónicas degenerativas tales como el cáncer, el Alzheimer o el Parkinson. La etiología compleja y multifactorial de estas enfermedades es el principal problema que existe a la hora de combatirlas, sobre todo cuando se comienza su tratamiento en fases ya avanzadas de la enfermedad. Es por ello que el desarrollo de fármacos multidiana es una posible solución que ha emergido en la Química Medicinal como forma de hacer frente a dichas enfermedades de manera más eficaz que empleando la concepción clásica de fármacos que interactúan con una única diana terapéutica. Esta Tesis Doctoral se encuadrada dentro del proyecto de título “Moléculas y Macromoléculas con Actividad Multidiana frente a enfermedades Degenerativas” (CTQ2016-78703-P) concedido por el Ministerio de Economía y Competitividad del Gobierno de España. En la presente Tesis se sintetizaron y evaluaron nuevos compuestos orgánicos como fármacos multidiana con objeto de combatir el Alzheimer y el cáncer como alternativa al tratamiento de estas enfermedades con cócteles de fármacos. De manera clara se distinguen en esta Tesis Doctoral los dos bloques descritos a continuación:  En primer lugar, se describe la síntesis de diferentes moléculas orgánicas derivadas del compuesto denominado tacrina, usado durante cierto tiempo como fármaco para combatir el Alzheimer en determinadas fases de la enfermedad. Dentro de los nuevos derivados sintetizados podemos distinguir dos familias: por un lado una serie de tioderivados de tacrina heterodiméricos y homodiméricos, y por otro lado una familia de compuestos con tacrina obtenidos a partir de moléculas derivadas de fenoles que presentan distinto número de grupos hidroxilos libres y protegidos. Además, en esta segunda familia se buscó alterar la naturaleza y la longitud del espaciador empleado entre los dos farmacóforos, estudiándose como afectan estas modificaciones estructurales a la actividad biológica de las nuevas moléculas. Dichos compuestos se evaluaron frente a determinadas dianas terapéuticas relacionadas con el Alzheimer, midiéndose su capacidad como inhibidores de las enzimas acetilcolinesterasa y butirilcolinesterasa, su actividad como inhibidores de la formación de placas β-amiloides, su capacidad para reducir especies oxidantes y su capacidad neuroprotectora, así como su neurotoxicidad, hepatotoxicidad y 1. Resumen 9 estabilidad en plasma sanguíneo, demostrando en dichos ensayos resultados para algunas de las moléculas obtenidas mejores a los de la tacrina usada de partida, obteniéndose con ello prometedores posibles fármacos para combatir el Alzheimer. Además de ello y debido a la conocida capacidad antiproliferativa frente a células cancerosas de moléculas con un grupo calcógeno en su estructura, se realizaron también este tipo de ensayos en los nuevos tioderivados de tacrina sintetizados, obteniéndose resultados de interés en dichos compuestos en lo que a capacidad antitumoral se refiere.  En un segundo capítulo se desarrolló la síntesis de nuevos tio- y selenoderivados y se evaluó su actividad contra determinados tipos de cáncer. Por un lado se sintetizaron diferentes homodímeros y heterodímeros a partir de tirosol e hidroxitirosol en los que los grupos fenólicos estaban metilados con objeto de tener una menor polaridad en dichos compuestos y una mayor biodisponibilidad que si dichos hidroxilos se encontrasen libres. En los compuestos sintetizados se observó la importancia del número de metoxilos presentes en el anillo aromático con respecto a la actividad antiproliferativa frente a células tumorales. Además, se observó también la importancia de la presencia de un fragmento calcógeno en la estructura de dichos compuestos, destacando la actividad de aquellos que presentaban selenio en su estructura. Dichos compuestos no solo destacaron en cuanto a su potente actividad frente a células tumorales, sino en cuanto a su selectividad hacia las mismas, no afectando de manera apreciable al crecimiento de células sanas. Por otro lado, basándonos en que determinadas células tumorales presentan sobreexpresados ciertos receptores, debido a la necesidad de un mayor aporte de ciertas especies entre las que se encuentras determinadas vitaminas como la D- biotina (vitamina H), se sintetizaron de manera exitosa diferentes derivados organocalcógenos de D-biotina con grupos funcionales de tipo isotiocianato, tiosemicarbazona, tiourea, tiocianato, disulfuro, selenourea y selenocianato. Una vez medida la actividad antiproliferativa de dichas moléculas, se encontraron en varias de ellas valores frente a determinadas líneas celulares tumorales situados en el rango nanomolar, superándose ampliamente los valores obtenidos en dichos ensayos para los fármacos quimioterápicos cisplatino y 5-fluorouracilo. Unido a ello, se realizaron ensayos de antiproliferación en células sanas en aquellos 1. Resumen 10 compuestos con valores de actividad más relevante, observándose en varios ellos valores muy elevados de selectividad, destacando dos de los selenocianatos sintetizados en esta familia con valores de selectividad muy superiores a los antes mencionados cisplatino y 5-fluorouracilo tomados como referencia. Todo ello supone un conjunto de resultados prometedores para los compuestos cabeza de serie como posibles fármacos anticancerígenos. 11 2. RELACIÓN DE COMPUESTOS 2. Relación de compuestos 12 Derivados de tacrina e intermedios de su síntesis 2. Relación de compuestos 13 2. Relación de compuestos 14 Derivados de 2-feniletanol, tirosol e hidroxitirosol 2. Relación de compuestos 15 Derivados organocalcógenos de biotina intermedios de su síntesis 2. Relación de compuestos 16 2. Relación de compuestos 17 3. Introducción general 24 multidiana de abarcar varios de esos factores simultáneamente los hace prometedores como futuros fármacos para combatir dichas enfermedades multifactoriales. 25 4. OBJETIVOS 4. Objetivos 26 La búsqueda de soluciones más exitosas que las actuales para combatir la enfermedad de Alzheimer y el cáncer mediante la síntesis de nuevos fármacos supone el objetivo principal de la presente Tesis Doctoral, abordándose la obtención y evaluación de nuevas moléculas con diversos farmacóforos en su estructura, de manera que actúen como fármacos multidiana frente a estas enfermedades. En este contexto se elaboró el primer capítulo de esta Tesis en el que se planteó la obtención de compuestos derivados de la tacrina, molécula usada durante un tiempo para combatir el Alzheimer en las primeras etapas de la enfermedad. De manera específica, los objetivos en este primer capítulo se pueden describir como:  Síntesis de nuevas moléculas derivadas de tacrina con fragmentos organocalcógenos en su estructura de tipo tiocianato y disulfuro.  Síntesis de nuevas moléculas duales de tacrina con derivados de fenoles en las que ambos fragmentos están unidos mediante enlaces de tipo imino y amino de longitud corta, empleándose para su obtención reacciones de formación de iminas y de aminación reductiva entre la tacrina y aldehídos aromáticos con sustituyentes hidroxílicos, metoxilicos y de tipo benciloxi.  Síntesis de moléculas duales empleando los dos farmacóforos anteriores (tacrina y fragmentos derivados de fenoles), alargando la longitud del espaciador usado, así como variando la naturaleza del mismo.  Valoración de capacidad inhibitoria de los nuevos compuestos sintetizados frente a las enzimas acetilcolinesterasa (AChE) y butirilcolinesterasa (BuChE), relacionadas con la enfermedad de Alzheimer, y estudio de cómo influye la estructura de las diferentes moléculas obtenidas en dicha actividad inhibitoria.  Evaluación de los compuestos cabezas de serie con respecto a otros factores que también influyen en la aparición y desarrollo de la enfermedad de Alzheimer o que son relevantes a la hora de tratarla, tales como la inhibición de la deposición de placas β-amiloides en el cerebro, reducción de especies oxidantes, capacidad neuroprotectora, neurotoxicidad y hepatotoxicidad.  Evaluación de la capacidad antiproliferativa de los derivados calcógenos frente a determinadas líneas celulares tumorales. 4. Objetivos 27 Posteriormente, en un segundo capítulo se planteó como objetivo la búsqueda de nuevos derivados sintéticos organocalcógenos para evaluar su capacidad antiproliferativa, basándonos en resultados obtenidos en otros compuestos ya estudiados de azufre y selenio. De manera más concreta, los objetivos perseguidos en este segundo capítulo pueden describirse como:  Síntesis de nuevos compuestos organocalcógenos obtenidos a partir de derivados metilados de tirosol e hidroxitorosol de carácter monomérico y dimérico.  Síntesis de nuevos derivados organocalcógenos de D-biotina con objeto de obtener compuestos con capacidad antiproliferativa selectiva frente a determinadas líneas celulares cancerosas.  Evaluación de la actividad antiproliferativa de los nuevos compuestos obtenidos frente a diferentes líneas celulares tumorales y comprobación de sus efectos sobre células sanas en aquellos que presentan mayor actividad. 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 28 5. SÍNTESIS Y EVALUACIÓN DE NUEVOS DERIVADOS ANTIOXIDANTES DE TACRINA 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 29 5.1. Introducción y antecedentes 5.1.1. Alzheimer, características y causas Se entiende por enfermedades crónicas aquellas enfermedades de larga duración y por lo general de progresión lenta. En cuanto al concepto de enfermedades degenerativas se entiende por aquellas enfermedades en las que se producen alteraciones de los tejidos o elementos anatómicos con cambios químicos de las sustancias constituyentes y pérdidas de los caracteres esenciales y funcionales. 24 Dentro de este grupo podríamos encuadrar algunas como las enfermedades cardíacas, el cáncer, la diabetes o el Alzheimer. Cabe añadir también que estas enfermedades son las principales causas de mortalidad en el mundo, siendo responsables del 63% de las muertes. Según la OMS, en 2008, 36 millones de personas murieron de una enfermedad crónica. 25 La enfermedad de Alzheimer es el tipo más frecuente de demencia en la actualidad, descubierta y descrita por Alois Alzheimer en el año 1907, 26 caracterizada por un fuerte deterioro cognitivo, acompañado de otros síntomas, como son confusión, retraimiento, alucinaciones, e incluso características Parkinsonianas. Según el World Alzheimer Report 2018, se estima que unos 50 millones de personas en todo el mundo sufren algún tipo de demencia. Cada año que pasa, es mayor el número de afectados por estas enfermedades, siendo las estimaciones de padecerlas en el futuro cada vez mayores. Mientras que en 2015 se estimaba que para 2050, el número de afectados por estas enfermedades sería de 131.5 millones de personas, 27 en el último World Alzheimer Report (2018) se elevó la estimación del número de afectados sería de 152 millones de personas en 2050, 28 constituyendo un aumento alarmante. Según este informe de 2018 cada 3 segundos una persona en el mundo desarrolla algún tipo de demencia. Cabe 24 . Diccionario Médico, Ed. Masson, 4ª edición, 2005. 25 . http://www.who.int/topics/chronic_diseases/es/ Última consulta el 11/1/2020. 26 . A. Tanovic, V. Alfaro. Glutamate-related excitotoxicity neuroprotection with memantine, an uncompetitive antagonist of NMDA-glutamate receptor, in Alzheimer's disease and vascular dementia. Rev. Neurol. 2006, 42, 607-616. 27 . https://www.alz.co.uk/research/WorldAlzheimerReport2015.pdf Última consulta el 11/1/2020. 28 https://www.alz.co.uk/research/worldalzheimerreport2018-spanish.pdf Última consulta el 11/1/2020. 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 30 destacar además que ya es una enfermedad que incluso en países como Gales o Inglaterra se ha convertido en la principal causa de mortalidad. Actualmente sólo existen cuatro fármacos usados frente al Alzheimer: donepezilo, rivastigmina, galantamina y memantina. (Fig. 2). Figura 2. Estructura química de los fármacos donepezilo, galantamina, rivastigmina y memantina. Los tres primeros, fundamentados en la hipótesis colinérgica, buscan la inhibición de las colinesterasas AChE y BuChE para evitar la reducción de los niveles de acetilcolina en el cerebro.28 La memantina por otro lado se basa en la hipótesis glutamatérgica, según la cual en el Alzheimer se dan niveles de glutamato superiores a los normales que ocasionan por interacción con el receptor glutamatérgico NMDA unos niveles también anormalmente altos de calcio que producen daños neuronales. El bloqueo de estos receptores NMDA para reducir estos niveles de calcio constituye una diana terapéutica para combatir esta enfermedad, siendo este el mecanismo de acción de la memantina. 29 29 . D. Bowie. Ionotropic glutamate receptors & CNS disorders. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 2008, 7, 129-143. 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 31 En los pacientes con Alzheimer son diversos los efectos observados, tales como un daño progresivo en las fibras colinérgicas. Esto produce alteraciones en la actividad de enzimas como la colina acetiltransferasa (ChAT) y la acetilcolinesterasa (AChE), 30 así como de la butilrilcolinesterasa (BuChE). 31 La alteración de estas dos enzimas colinesterasas produce un descenso de la concentración del neurotransmisor acetilcolina (Fig. 3), molécula que interactua con los denominados receptores muscarínicos (receptores acoplados a la proteína G) y nicotínico (canales iónicos).21 El descenso de dicho neurotransmisor está muy relacionado con la perdida de funciones cognitivas y muy particularmente de la memoria. Figura 3. Hidrolisis de acetilcolina catalizada por enzimas colinesterasas. La hipótesis colinérgica surgida hace varias décadas, constituyó una revolución, pues fue la primera en explicar las posibles causas del Alzheimer y como influía el descenso de la acetilcolina en la perdida de funciones cognitivas del cerebro (Fig. 4). 32 Sin embargo esta teoría resulto escasa pues se observó que mantener los niveles de acetilcolina en rangos normales sólo servía para paliar los efectos de la enfermedad al comienzo de la misma, produciéndose aún así la evolución de la enfermedad. 30 . E. Orta-Salazar, C.A. Cuellar-Lemus, S. Díaz-Cintra, A.I. Feria-Velasco. Cholinergic markers in the cortex and hippocampus of some animal species and their correlation to Alzheimer’s disease. Neurologia. 2014, 29, 497-503 31 . M.A. Santos, K. Chand, S. Chaves. Recent progress in repositioning Alzheimer’s disease drugs based on a multitarget strategy. Future Med. Chem. 2016, 8, 2113-2142 32 . H. Hampel, M.-M. Mesulam, A.C. Cuello, M.R. Farlow, E. Giacobini, G.T. Grossberg, A. S. Khachaturian, A. Vergallo, E. Cavedo, P.J. Snyder, Z.S. Khachaturian. The cholinergic system in the pathophysiology and treatment of Alzheimer’s disease. Brain. 2018, 141, 1917-1933. 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 32 Figura 4. Fisiología de la sinapsis colinérgica.32 Por otro lado, también se observa el depósito y la acumulación anormal de placas β-amiloides, 33 que son polipéptidos constituidos por unos 40 o 42 aminoácidos originados a partir de la APP (proteína precursora amiloidea). La acumulación del polipéptido de 42 aminoácidos Aβ-42 es la que está asociada a daños neuronales, creyéndose que la β- y γsecretasa y su regulación son importantes para evitar la deposición de estos polipéptidos en el cerebro. 34 Sin embargo, ciertos estudios han observado que la inhibición de estas enzimas conduce a efectos secundarios tóxicos, observados en ensayos clínicos, los cuales se creen que son debidos al hecho de que las secretasas procesan gran multitud de sustratos (la γ-secretasa por ejemplo entorno a 100 sustratos diferentes) además de la APP.17 Por ello se cree necesario inhibir la formación de placas β-amiloides sin afectar de manera significativa a la actividad de las enzimas secretasas, siendo una posible opción la inhibición de MAOs, ya que ciertos estudios defienden que dichas enzimas estan relacionadas con los niveles de placas β-amiloides.17 33 . Z. Wang, Y. Wang, B. Wang, W. Li, L. Huang, X. Li. Design, synthesis, and evaluation of orally available clioquinol-moracin M hybrids as multitarget-directed ligands for cognitive improvement in a rat model of neurodegeneration in Alzheimer’s disease. J. Med. Chem. 2015, 58, 8616-8637. 34 . D. Galimberti, E. Scarpini. New perspectives for the treatment of Alzheimer’s disease. Open Geriatr. Med. J. 2008, 1, 33-42. 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 33 Además de estas enzimas, también se cree que la región aniónica periférica de la acetilcolinesterasa tiene un papel relevante en la acumulación de los polipéptidos βamiloides. 35 , 36 Se han observado también incrementos de los niveles de las enzimas MAOs, mencionadas anteriormente, como otro de los factores determinantes en dicha enfermedad y de manera más concreta con la MAO-B (monoamino oxidasa B) de la que se observan niveles anormalmente elevados en el cerebro y plaquetas de pacientes con la enfermedad de Alzheimer.17 Dicha enzima produce la desaminación oxidativa generando el aldehído correspondiente, amoníaco y peróxido de hidrogeno (Figura 5), encontrándose entre los sustratos de dicha enzima la epinefrina, norepinefrina, dopamina, serotonina y la feniletilamina. 37 Figura 5. Reacción de desaminación oxidativa de aminas primarias catalizada por MAO Mientras que en el caso de la inhibición de colinesterasas se ha demostrado su utilidad para el tratamiento del Alzheimer durante el transcurso de la enfermedad, aliviando sus síntomas, la inhibición de la MAO-B ha demostrado carácter preventivo frente a esta enfermedad, 38 ya que ha observado en recientes estudios de neuroimagen que el aumento de la expresión de MAO-B en el cerebro de personas con Alzheimer comienza varios años antes del inicio de la enfermedad.17 Además se ha detectado la 35 . N.C. Inestrosa, A. Alvarez, C. A. Pérez, R.D. Moreno, M. Vicente, C. Linker, O.I. Casanueva, C. Soto, J. Garrido. Acetylcholinesterase accelerates assembly of amyloid-β-peptides into Alzheimer’s fibrils: possible role of the peripheral Site of the Enzyme. Neuron, 1996, 16, 881–891. 36 . G.V. Ferrari, M.A. Canales, I. Shin, L.M. Weiner, I. Silman, N.C. Inestrosa. Structural motif of acetylcholinesterase that promotes amyloid β-peptide fibril formation. Biochemistry 2001, 40, 10447- 10457. 37 . Z. Cai. Monoamine oxidase inhibitors: promising therapeutic agents for Alzheimer's disease (Review). Mol. Med. Rep. 2014, 9, 1533-1541. 38 . U. Košak, D. Knez, N. Coquelle, B. Brus, A. Pišlar, F. Nachon, X. Brazzolotto, J. Kos, J.P. Colletie, S. Gobec. N-Propargylpiperidines with naphthalene-2-carboxamide or naphthalene-2-sulfonamide moieties: Potential multifunctional anti-Alzheimer's agents. Bioorg. Med. Chem. 2017, 25, 633-645. 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 40 Algunos de los múltiples fenoles y polifenoles bioactivos que podemos encontrar en la naturaleza son el hidroxitirosol, compuesto presente en el aceite de oliva virgen extra, 61 la quercetina 62 o la punicalagina, 63 esta última presente en la granada y que ha demostrado cierta capacidad antitumoral, 64 , 65 o algunos isocromanos, 66 presentes en fuentes de origen vegetal como el aceite de oliva virgen extra (AOVE) 67 , así como en fuentes de origen animal, como la especie de escarabajo Blaps japanensis66 (Fig. 9). 61 . J.G. Fernández-Bolaños, Ó. López, M.Á. López-García, A. Marset. Biological properties of hydroxytyrosol and its derivatives in Olive oil – Constituents, quality, health properties and bioconversions. Boskou Dimitrios (Ed.), Intech. 2012, 375-396. 62 . A.S. Dias, M. Porawski, M. Alonso, N. Marroni, P.S. Collado, J. González-Gallego. Quercetin decreases oxidative stress, NF-kappaB activation, and iNOS overexpression in liver of streptozotocininduced diabetic rats. J. Nutr. 2005, 135, 2299-2304. 63 . F. Aqil, R. Munagala, M.V. Vadhanam, H. Kausar, J. Jeyabalan, D.J. Schultz, R.C. Gupta. Antiproliferative activity and protection against oxidative DNA damage by punicalagin isolated from pomegranate husk. Food Res. Int. 2012, 49, 345-353. 64 . X. Cheng, X. Yao, S. Xu, J. Pan, H. Yu, J. Bao, H. Guan, R. Lu, L. Zhang. Punicalagin induces apoptosis-independent autophagic cell death in human papillary thyroid carcinoma BCPAP cells. RSC Advances. 2016, 6, 68485-68493. 65 . Y. Li, T. Ye, F. Yang, M. Hu, L. Liang, H. He, Z. Li, A. Zeng, Y. Li, Y. Yao, Y. Xie, Z. An, S. Li. Punica granatum (pomegranate) peel extract exerts potent antitumor and anti-metastasis activity in thyroid cancer. RSC Advances. 2016, 6, 84523-84535. 66 .Y.-M. Yang, H.Q. Da, Y. Du, B. Schneider, H. Guo, D.P. Li, L.X. Zhang, H. Fu, X.P. Dong, Y.X. Cheng. Identification of blapsins A and B as potent small-molecule 14-3-3 inhibitors from the insect Blaps japanensis. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2012, 22, 4179–4181. 67 . A. Bianco, F. Coccioli, M. Guiso, C. Marra. The occurrence in olive oil of a new class of phenolic compounds: hydroxy isochromans. Food Chem. 2001, 77, 405–411. 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 41 Figura 9. Estructuras de diversos fenoles y polifenoles naturales Además, estudios recientes han demostrado el interés de algunos polifenoles para el tratamiento del Alzheimer debido a la actividad antioxidante y antiinflamatoria presente en ellos, habiéndose encontrado también en algunos actividad como inhibidores en la formación de placas β-amiloides.31, 68 68 . C. Angeloni, M. Malaguti, M.C. Barbalace, S. Hrelia. Bioactivity of olive oil phenols in neuroprotection. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 2230 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 42 5.2. Resultados y discusión En el presente capítulo de la Tesis Doctoral se ha planteado la preparación de dos nuevas familias de derivados de tacrina como moléculas multidiana frente a la enfermedad de Alzheimer. En la primera de estas familias se ha llevado a cabo la preparación de tioderivados de tacrina, y la evaluación de los mismos como agentes anti-Alzheimer. En dichos compuestos, el fragmento con azufre (tiocianato, disulfuro), debido a su carácter antioxidante podría combatir el estrés oxidativo asociado al Alzheimer a la par que reducir el carácter hepatotóxico de la tacrina, consecuencia del carácter pro-oxidante de dicho fármaco. Además se ha evaluado la toxicidad del compuesto cabeza de serie con objeto de comprobar que la misma es inferior a la de su análogo con selenio previamente sintetizado en nuestro grupo de investigación. Simultáneamente se evaluó la actividad antiproliferativa frente a diferentes tipos de cáncer de los nuevos tioderivados obtenidos, debido a que se preveían valores significativamente relevantes. Por otro lado, también se abordó la preparación de híbridos de tacrina con compuestos derivados de fenoles. En esta familia se ha modificado el tipo y posición de los sustituyentes en el anillo aromático, así como la naturaleza y longitud del espaciador entre los dos farmacóforos, pudiéndose establecer tras realizar diferentes ensayos de actividad anti-Alzheimer una relación estructura-actividad entre las nuevas moléculas obtenidas. 5.2.1. Síntesis y evaluación de nuevos tioderivados de tacrina 5.2.1.1. Síntesis de nuevos tioderivados de tacrina En este apartado se llevó a cabo la síntesis de dos tipos de tioderivados de tacrina (tiocianatos y disulfuros), utilizando espaciadores de diferente longitud entre la tacrina y el fragmento calcógeno. En este capítulo dedicado a fármacos anti-Alzheimer derivados de tacrina, se empleó la misma en su forma de amina neutra en las reacciones realizadas, obtenida por desprotonación del hidrocloruro de tacrina polihidratado comercial (65) (Esq. 1). 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 43 Esquema 1. Desprotonación de hidrocloruro de tacrina polihidratado La síntesis de los nuevos tioderivados de tacrina se llevo a cabo mediante una reacción de tipo SN2 entre el grupo amino de la tacrina y el α,ω-dibromoalcano correspondiente, utilizando el procedimiento descrito por Y. Suna et al. 69 Se empleó un exceso de dibromoalcano con objeto de favorecer la monosustitución. Tras dicha reacción y obtenidos 67 y 68, se sustituyó el bromo restante en ambas moléculas por la función tiocianato (compuestos 1 y 2), y mediante el posterior tratamiento con NaBH4, que permitió la reducción del grupo tiocianato a un tiolato intermedio, y posterior oxidación espontánea en presencia de oxígeno atomósferico, se originaron los correspondientes disulfuros 3 y 4 (Esq. 2). Esquema 2. Síntesis de tiocianatos y disulfuros derivados de tacrina 69 . Y. Suna, J. Chena, X. Chenb, L. Huanga, X. Lia. Inhibition of cholinesterase and monoamine oxidase- B activityby tacrine–homoisoflavonoid hybrids. Bioorg. Med. Chem. 2013, 21, 7406-7417. 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 44 La síntesis de los nuevos tioderivados de tacrina preparados en el presente capítulo se realizó en base a una serie de estudios previos realizados por nuestro grupo de investigación de obtención de selenoderivados de tacrina (Fig. 10), 70 en alguno de los cuales se obtuvo una muy buena actividad como inhibidores de acetilcolinesterasa, superándose en algunos casos los valores de inhibición obtenidos para la tacrina usada de referencia. Figura 10. Estructura de selenoderivados de tacrina Se observaron valores muy buenos para los diselenuros y selenocianatos, pero sin embargo, conocida la toxicidad presente en compuestos de selenio y con objeto de analizar la influencia de un cambio en el calcógeno usado, se planteó y realizó la síntesis de los derivados con azufre descritos con anterioridad. 70 . J.M. Roldán-Peña, D. Alejandre-Ramos, Ó. López, I. Maya, I. Lagunes, J. M. Padrón , L.E. Peña- Altamira, M. Bartolini, Barbara Monti, M.L. Bolognesi, J.G. Fernández-Bolaños. New tacrine dimers with antioxidant linkers as dual drugs: anti-Alzheimer's and antiproliferative agents. Eur. J. Med. Chem. 2017, 138, 761-773. 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 45 Obtenidos los compuestos 1-4 de manera exitosa, se realizaron con los mismos diferentes ensayos de actividad biológica en relación a la enfermedad de Azlheimer, resultando de elevado interés los compuestos diméricos puesto que en estudios previos se han descrito dímeros de tacrina que interaccionan simultáneamente con el sitio activo de la enzima AChE, así como con su región aniónica periférica, 71 relacionada con la acumulación de placas β-amiloides.35,36 Para interactuar con dicha región periférica, se ha observado la importancia de compuestos con fragmentos aromáticos que interactúen con la misma, inhibiendo su capacidad para inducir la agregación de péptidos β-amiloides. 72 5.2.1.2. Evaluación in vitro de nuevos tioderivados de tacrina Se llevó a cabo un amplio estudio de las propiedades biológicas que los derivados 1-4 exhiben en relación con el Alzheimer: capacidad inhibitoria de colinesterasas (acetil y butirilcolinesterasa), tanto en enzimas modelo (anguila eléctrica y suero equino, respectivamente) como en enzimas humanas, capacidad de inhibición de la autoagregación de placas amiloides, neurotoxicidad y actividad antioxidante. A) Ensayo de inhibición de colinesterasas (AChE y BuChE) Como se mencionó con anterioridad, la enfermedad del Alzheimer está relacionada con una alteración de la actividad de las enzimas colinesterasas encargada de desacetilar el neurotransmisor acetilcolina para formar colina, produciéndose un descenso anormal de la concentración de dicho neurotransmisor implicado en procesos cognitivos. Es por ello que una de las estrategias en la búsqueda de un tratamiento para la enfermedad de Alzheimer sea el uso de compuestos capaces de inhibir estas enzimas con objeto de incrementar los niveles de acetilcolina en el cerebro. No en vano, tres de los cuatro fármacos aprobados en la actualidad contra el Alzheimer son inhibidores de dichas enzimas. 71 . D. Muñoz-Torrero, P. Camps. Dimeric and hybrid anti-Alzheimer drug candidates. Curr. Med. Chem. 2006, 13, 399-422. 72 . N. Khunnawutmanotham, N. Chimnoi, P. Saparpakorn, S. Techasakul. Synthesis and antiacetylcholinesterase activity of scopoletin derivatives. Bioorg. Chem. 2016, 65, 137-145. 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 46 Para la evaluación como inhibidores de dichas enzimas de los compuestos sintetizados en esta Tesis Doctoral, empleándose en primer lugar las enzimas de modelos animales, se utilizó el ensayo de Ellman 73 con algunas modificaciones para su uso con compuestos con azufre y selenio. 74 En el ensayo de Ellman tradicional, la cinética enzimática es seguida de manera indirecta usándose yoduro de acetiltiocolina o de butiriltiocolina que al hidrolizarse forma un tiolato que ataca al reactivo DTNB (ácido 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoico)), obteniéndose la especie química que es medida por espectrofotometría. Sin embargo al usar como inhibidor un compuesto con azufre o selenio, este puede actuar como nucleófilo sobre el reactivo DTNB, dando lugar a la degradación del mismo antes incluso de añadir la enzima a la mezcla usada en el ensayo. Es por ello que el método de Ellman es modificado, usándose para compuestos con azufre o selenio una medida espectrofotométrica directa, usándose acetato de p-nitrofenilo y butirato de p-nitrofenilo, trabajándose con un buffer de pH 6.8, a 25 ºC y usando AChE procedente de Electrophorus electricus como modelo por su similitud con esta enzima en mamíferos 75 y BuChE procedente de suero equino. La inhibición es evaluada mediante la medida de la formación de p-nitrofenolato, midiéndose la absorbancia a 400 nm del anión formado (Esq. 3). Esquema 3. Hidrolisis enzimática de esteres de p-nitrofenilo 73 . G.L. Ellman, K.D. Courtney, V. Andres jr., R.M. Featherstone. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol. 1961, 7, 88-95. 74 . A. Forsberg, G. Puu. Kinetics for the inhibition of acetylcholinesterase from the electric eel by some organophosphates and carbamates. Eur. J. Biochem. 1984, 140, 153-156. 75 . S. Bon, M. Vigny, J. Massoulié. Asymmetric and globular forms of acetylcholinesterase in mammals and birds. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1979, 76, 2546-2550. 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 47 Para dicho ensayo se trabajó con entre 4 y 5 concentraciones diferentes de acetato de p-nitrofenilo (35-560 µM) y butirato de p-nitrofenilo (70-560 µM), analizándose la cinética enzimática mediante representaciones de Lineweaver-Burk o de dobles inversos (1/v vs. 1/[S]). A modo de ejemplo, en la figura 11 se muestra la representación de Linweaver-Burk para la inhibición de AChE por parte del compuesto 3. Figura 11. Representación de Lineweaver-Burk para la inhibición de AChE producida por el compuesto 3 La representación de Lineweaver-Burk, realizada para varias concentraciones del inhibidor, permite determinar el tipo de inhibición, así como la constante de Michaelis- Menten (KM) y Vmax, que a su vez se emplean para el cálculo de las constantes de inhibición. Una descripción más detallada de esta representación, así como de las ecuaciones empleadas para el cálculo de las constantes de inhibición puede encontrarse en la sección de Métodos Generales (capítulo 8.1.). Así pues, a modo de ejemplo, a partir de la representación mostrada en la figura 11 se puede observar que las líneas correspondientes a las distintas concentraciones de inhibidor se intersectan en el segundo cuadrante. Esto es indicativo de una inhibición de tipo mixto por parte del compuesto 3, lo cual significa que este interacciona tanto con la enizma libre como con el complejo enzima-sustrato, haciendolo en este último caso a través de una región distinta a la región del sitio catalítico de la enzima. -3000 -1000 1000 3000 5000 7000 9000 11000 13000 15000 -10 0 10 20 30 40 1/v (Abs-1 · s) 1/[S] (mM-1) [I] = 0 [I] = 5 nM [I] = 7.5 nM 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 48 Tras analizar la capacidad inhibitoria de los tioderivados 1-4, así como de los compuestos de selenio 74-77, se obtuvieron los siguientes resultados de inhibición frente a AChE y BuChE (Tabla 1): Tabla 1. Constantes de inhibición para AChE y BuChE e índices de selectividad para tio- y selenoderivados de tacrina AChE (electrophorus electricus) BuChE (suero equino) Compuesto Espaciador Grupo funcional Kia (nM) Kib (nM) Kia (nM) Kib (nM) IS (BuChE)/(AChE) 1 n = 5 SCN 50 ± 12 50 ± 12 228 ± 57 - 4.6 2 n = 6 SCN 19 ± 7 - 252 ± 64 673 ± 249 13 3 n = 5 -S-S- 3.1 ± 1.4 5.7 ± 1.5 166 ± 22 422 ± 104 54 74 4 n = 6 -S-S- 15 ± 4 15 ± 4 243 ± 45 70 ± 16 16 4.7 74 n = 5 SeCN 35 ± 8 - 206 ± 42 - 6.0 75 n = 6 SeCN 6.5 ± 3.7 - 336 ± 131 672 ± 218 52 76 n = 5 -Se-Se- 1.2 ± 0.3 1.2 ± 0.3 350 ± 72 92 ± 42 292 77 77 n = 6 -Se-Se- 26 ± 10 26 ± 10 43 ± 9 73 ± 9 1.6 2.8 Tacrina - - 23 ± 10 - 17 ± 3 - 0.7 Como puede observarse en la tabla anterior, destacan los valores obtenidos para el disulfuro 3 y el diselenuro 76 que se comportan como potentes inhibidores de la acetilcolinesterasa, obteniéndose constantes de inhibición entorno al rango nanomolar bajo, siendo el valor obtenido para el compuesto 3 hasta 7 veces mejor al valor obtenido para la tacrina empleada como referencia. Se obtuvo además un alto índice de selectividad de AChE frente a BuChE. Es por ello que se midió la inhibición de acetilcolinesterasa humana, en colaboración con la profesora M. Bartolini de la Universidad de Bolonia, de estos dos compuestos, comparándose los valores obtenidos con los de la tacrina de referencia, así como con el dímero cistamina-tacrina (Fig. 12). 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 49 Figura 12. Estructura de cistamina-tacrina Se obtuvo en el ensayo realizado los siguientes valores (Tabla 2): Tabla 2. CI50 para tioderivados de tacrina usando AChE humana AChE humana Compuesto CI50 (nM) 3 1.62 ± 0.10 76 2.64 ± 0.15 Tacrina 412 ± 15 Galantamina 2010 ± 15076 Cistamina-tacrina 5.04 ± 0.4871 Se observa con los resultados obtenidos en esta última tabla que el compuesto 3 destaca sobre el resto también al medir su capacidad como inhibidor en este caso frente a AChE humana, obteniéndose un valor de CI50 de 1.6 nM, siendo 257 veces más potente que la tacrina, 1256 veces más que la galantamina y 3 veces más que el híbrido cistaminatacrina. 76 . M.L. Bolognesi, R. Banzi, M. Bartolini, A. Cavalli, A. Tarozzi, V. Andrisano, A. Minarini, M. Rosini, V. Tumiatti, C. Bergamini, R. Fato, G. Lenaz, P. Hrelia, A. Cattaneo, M. Recanatini, C. Melchiorre, Novel class of quinone-bearing polyamines as multi-target-directed ligands to combat Alzheimer's disease. J. Med. Chem. 2007, 50, 4882-4897. 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 56 Tabla 4. Actividad de tioderivados de tacrina como miméticos de GPx Compuesto v (µM/min)* t1/2 (min) 1 23.1 ± 1.6 108.2 2 21.6 ± 1.0 115.7 3 35.5 ± 2.2 70.4 4 32.8 ± 0.9 76.2 (PhSe)2 14.8 ± 0.3 168.9 Ebselen 2.0 ± 0.7 1250 *La velocidad está corregida con respecto al valor de velocidad observado en el control Como puede observarse en la tabla realizada a partir de dicho ensayo, destacan los dímeros 3 y 4, obteniéndose en ellos valores sensiblemente mejores a los obtenidos para el (PhSe)2 y ebselen (Fig. 16), dos potentes agentes antioxidante usados como compuestos de referencia. Figura 16. Estructura del ebselen E) Ensayo de capacidad antiproliferativa Puesto que existen multitud de compuestos de azufre con capacidad anticancerígena, se evaluó en colaboración con el profesor J.M. Padrón de la Universidad de la Laguna (Tenerife), la capacidad antiproliferativa de los nuevos compuestos frente a 6 líneas celulares de diferentes tipos de cáncer, estudiándose si existía selectividad frente a células tumorales en lugar de hacia células sanas. Los resultados obtenidos se muetran en la tabla 5. En dicha tabla se han representado los valores del GI50, que es la concentración necesaria en el ensayo utilizado para inhibir el crecimiento celular en un 50%, en unidades de concentración µM. 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 57 Tabla 5. Ensayos antiproliferativos en tioderivados de tacrina Compuesto A549 HBL-100 HeLa SW1573 T-47D WiDr BJ-hTert 1 14 ±2 15 ±2 11 ±1 15 ± 4 8.3 ± 1.7 4.1 ± 2.4 NT* 2 8.3 ± 3.3 11 ± 2 8.1 ± 2.9 5.1 ± 0.9 5.5 ± 2.0 2.4 ± 0.7 NT* 3 1.4 ± 0.1 1.2 ± 0.1 1.0 ± 0.2 0.29 ± 0.01 0.95 ± 0.11 0.30 ± 0.06 1.4 ± 0.3 4 1.1 ± 0.1 0.99 ± 0.10 0.33 ± 0.01 0.24 ± 0.01 0.37 ± 0.06 0.20 ± 0.03 0.22 ± 0.05 Tacrina >100 50 ±4 51 ±4 50 ±6 46 ± 16 34 ± 1 NT* 5-FU NT* 5.5 ± 2.3 15 ± 4.7 4.3 ± 1.6 47 ± 18 49 ± 6.7 5.5 ± 0.5 Cisplatino 4.9 ± 0.2 1.9 ± 0.2 2.0 ± 0.3 3.4 ± 0.7 15 ± 2.3 26 ± 5.6 14 ± 2.4 *NT: no testado A549: cáncer de pulmón HBL-100: cáncer de mama HeLa: cáncer cérvico-uterino SW1573: cáncer de pulmón T-47D: cáncer de mama WiDr: cáncer de colon BJ-hTert: fibroblasto humano (célula sana) inmortalizado Se observa en los resultados descritos para los nuevos tioderivados de tacrina que los disulfuros 3 y 4 son los más activos frente a las células tumorales estudiadas, con valores de actividad en el rango micromolar y submicromolar, mejores a los de fármacos ampliamente usados como el cisplatino y el 5-fluorouracilo, haciendo a estos compuestos de interés no sólo frente al Alzheimer, sino también frente al cáncer, aunque desafortunadamente no se observa selectividad en ellos hacia las células tumorales. La dualidad de compuestos inhibidores de colinesterasas y con capacidad antiproliferativa frente a ciertas líneas celulares tumorales ha sido observada previamente en otros compuestos como el tandutinib (Fig. 17), compuesto de interés para el tratamiento del glioblastoma y la leucemia mieloide que a su vez actúa como un inhibidor de tipo mixto de la AChE, 86 o el donepezilo, que además de presentar conocidas propiedades anti-Alzheimer se ha observado que posee la capacidad de inducir apoptosis en las células de leucemia HL-60 humanas. 87 86 Y. Chen, X. Xu, T. Fu, W. Li, Z. Liu, H. Sun. Discovery of new scaffolds from approved drugs as acetylcholinesterase inhibitors. RSC Adv. 2015, 5, 90288-90294. 87 Y.S. Ki, E.Y. Park, H.-W. Lee, M.S. Oh, Y.-W. Cho, Y.K. Kwon, J.H. Moon, K.T. Lee. Donepezil, a potent acetylcholinesterase inhibitor, induces caspasedependent apoptosis in human promyelocytic leukemia HL-60 cells. Biol. Pharm. Bull. 2010, 33 1054-1059. 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 58 Figura 17. Estructura química de tandutinib A partir de la estructura de los nuevos tioderivados de tacrina, podría correlacionarse su potente actividad antiproliferativa con la presencia de los siguientes elementos estructurales: - En primer lugar, la presencia de un calcógeno como azufre en sus estructuras, ya que se ha observado con anterioridad que numerosos compuestos organocalcógenos presentan buenas propiedades antiproliferativas para ciertos tipos de cáncer. 88 - 90 - La estructura aromática de 1,2,3,4-tetrahidro-9-acridinamina. Dicha estructura es muy similar a la 9-aminoacridina, que tiene la capacidad de intercalarse en el ADN, desorganizando la estructura de doble hélice, e impide su replicación y transcripción por inhibición de topoisomerasas y telomerasas. 91 , 92 88 . E. Zeslawska, A. Kincses, V. Unger, V. Toth, G. Spengler, W. Nitek, W. Tejchman. Exocyclic sulfur and selenoorganic compounds towards their anticancer effects: crystallographic and biological studies. Anticancer Res. 2018, 38, 4577-4584. 89 . A. Marset, P. Begines, Ó. López, I. Maya, N. García-Aranda, S. Schwartz Jr, I. Abasolo, J.G. Fernández- Bolaños. Design of chalcogen-containing norepinephrines: efficient GPx mimics and strong cytotoxic agents against HeLa cells. Future Med. Chem. 2016, 8, 2185-2195. 90 . J.-L. Li, W. Zhao, C. Zhou, Y.-X. Zhang, H.-M. Li, Y.-L. Tang, X.-H. Liang, T. Chen, Y.-J. Tang. Comparison of carbon-sulfur and carbon-amine bond in therapeutic drug: 4β-S-aromatic heterocyclic podophyllum derivatives display antitumor activity. Sci. Rep. 2015, 5, 14814. 91 . P. Belmont, J. Bosson, T. Godet, M. Tiano. Acridine and acridone derivatives, anticancer properties and synthetic methods: where are we now? Anti-Cancer Agents Med. Chem., 2007, 7, 139-169. 92 . F. Charmantray, M. Demeunynck, D. Carrez, A. Croisy, A. Lansiaux, C. Bailly, P. Colson. 4- Hydroxymethyl-3-aminoacridine derivatives as a new family of anticancer agents. J. Med. Chem. 2003, 46, 967-77. 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 59 5.2.2. Síntesis y evaluación de nuevas moléculas duales obtenidas a partir de tacrina y derivados de fenoles 5.2.2.1. Síntesis de nuevas moléculas duales a partir de tacrina y derivados de fenoles En este capítulo de la presente Tesis Doctoral, también se ha llevado a cabo la obtención de nuevas moléculas multidiana con actividad anti-Alzheimer, obtenidas a partir de tacrina y diferentes derivados de compuestos fenólicos como segundo farmacóforo. La modificación del número, tipo y posición de los sustituyentes sobre el anillo aromático del derivado de compuesto fenólico, así como el tipo y longitud del espaciador que conecta ambas unidades bioactivas nos ha permitido establecer interesantes relaciones estructura-actividad. Las distintas familias de compuestos sintetizadas en el presente apartado son las que se indican a continuación (Fig. 18): Figura 18. Nuevos derivados fenólicos de tacrina 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 60 Las primeras dos familias se sintetizaron mediante reacciones de condensación entre el grupo amino de la tacrina y un aldehído fenólico O-protegido para formar diferentes iminas, y mediante reacciones de aminación reductiva (condensación+reducción) para formar las aminas correspondientes. Tradicionalmente aparece descrita la formación de iminas en diferentes libros de texto mediante el uso de una catálisis ácida (pH = 4-5) o incluso en ausencia de catalizador. 93 - 95 Sin embargo, se comprobó tras diversos ensayos utilizando ácido acético como catalizador, que el tiempo de reacción era muy prolongado y los rendimientos obtenidos bajos. Sin embargo, partiéndose del método descrito por Shutske y Kapples, 96 utilizando tolueno como disolvente y dietilamina como catalizador básico, se obtuvieron menores tiempos de reacción y mejores rendimientos. Hay que tener en cuenta que los hidroxilos aromáticos son inestables en medio básico, por lo que los aldehídos utilizados en esta síntesis fueron el 3,4- dimetoxibenzaldehido (79), 4-benzoxibenzaldehido (80), 3,4-dibenzoxibenzaldehido (81) y 3,4,5-tribenzoxibenzaldehido (82). Para la obtención de 80-82 se llevaron a cabo bencilaciones usando empleando el método descrito por S.J. Mills et al. 97 con ligeras variaciones (Esq. 6). 93 . Wade L.G., Jr. Química Orgánica, 5ª edición, editorial Pearson Prentice Hall. 2007. 94 . J. Clayden, N. Greeves, S. Warren, P. Wothers. Organic Chemistry, editorial Oxford University Press. 2001. 95 . F.A. Carey, R.M. Giuliano.vQuímica Orgánica, 9ª edición, editorial McGrawHill. 2014. 96 . G.M. Shutske. K.J. Kapples. N-(substituted alkylidene)-1,2,3,4,-tetrahydro-9-acridinamines, a process for their preparation and their use as medicaments. EP0306825 B1, 1994. 97 S.J. Mills, F. Vandeput, M.N. Trusselle, S.T. Safrany, C. Erneux, B.V.L. Potter. Benzene polyphosphates as tools for cell signalling: inhibition of inositol 1,4,5-trisphosphate 5-Phosphatase and interaction with the pH domain of protein kinase Bα. ChemBioChem. 2008, 9, 1757-1766. 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 61 Esquema 6. Síntesis de benzoxibenzaldehidos Una vez protegidos los alcoholes fenólicos, se pudo proceder con la formación de las iminas 5-8 (Esq. 7). Esquema 7. Síntesis de nuevas iminas derivadas de tacrina Con posterioridad, se obtuvieron mediante hidrogenolisis diferentes iminas con grupos alcoholes libres (9-11), y manteniendo las reacciones en dichas condiciones reductoras durante más tiempo, se obtuvieron también las correspondientes aminas (12- 14) (Esq. 8): 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 62 Esquema 8. Síntesis de iminas y aminas derivadas de tacrina Con ello pues, se pudo obtener de manera exitosa las nuevas moléculas 5-8, 10, 11, 13 y 14, así como 9 y 12 con metodologías distintas a las ya descritas.96, 98 Los compuestos 10 y 14 se obtuvieron y aislaron tras una misma reacción de manera simultánea (rendimiento global = 75%). No se consiguió obtener la amina con tres hidroxilos libres derivada del compuesto 11, debido que en su proceso de síntesis se observó la formación de mezclas complejas por CCP que impidió su obtención. En cuanto a los catalizadores empleados, observamos que la velocidad de reacción era mayor al usar Pd(OH)2/C en lugar de Pd/C. Cambiando el catalizador usado, así como el tiempo de reacción en los derivados bencilados, podemos obtener mayor o menor cantidad de la imina con hidroxilos libres o de la amina con hidroxilos libres. 98 . W. Osman, T. Mohamed, V.M. Sit, M.S. Vasefi, M.A. Beazely, P.P.N. Rao. Structure–activity relationship studies of benzyl‐, phenethyl‐, and pyridyl‐substituted tetrahydroacridin‐9‐amines as multitargeting agents to treat Alzheimer's disease. Chem. Biol. Drug. Des. 2016, 88, 710-723. 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 63 Con objeto de estudiar como afecta el espaciador entre los dos farmacóforos a la actividad de estos compuestos, se sintetizaron compuestos a partir de tacrina y derivados de fenoles, utilizando espaciadores de distinta longitud y naturaleza. Los primeros derivados con ampliación de la longitud de cadena se sintetizaron a partir de las materias primas 83, obtenida por el procedimiento descrito por R.S. Keri et al. 99 y 86, a partir de las reacciones descritas por I.M. Khalil et al. 100 y H. Wang et al. 101 , y cuya síntesis se describe a continuación (Esq. 9): Esquema 9. Síntesis de materias primas 83 y 86 99 . R.S. Keri, C. Quintanova, S.M. Marques, A.R. Esteves, S.M. Cardoso, M.A. Santos. Design, synthesis and neuroprotective evaluation of novel tacrine–benzothiazole hybrids as multi-targeted compounds against Alzheimer’s disease. Bioorg. Med. Chem. 2013, 21, 4559-4569. 100 . I.M. Khalil, D. Barker, B.R. Copp. Bioinspired syntheses of the pyridoacridine marine alkaloids demethyldeoxyamphimedine, deoxyamphimedine, and amphimedine. J. Org. Chem. 2016, 81, 282-289. 101 . H. Wang, T. B. Shrestha, M. T. Basel, M. Pyle, Y. Toledo, A. Konecny, P. Thapa, M. Ikenberry, K. L. Hohn, V. Chikan, D. L. Troyerb, S. H. Bossmann. Hexagonal magnetite nanoprisms: preparation, characterization and cellular uptake. J. Mater. Chem. B. 2015, 3, 4647-4653. 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 64 Una vez obtenidas las materias primas 83 y 86, mediante una reacción de SNAr se llegó al intermedio 15 basándonos en el procedimiento descrito por K. Czarnecka et. al. 102 para sustituir el cloro de la 9-cloro-1,2,3,4-tetrahidroacridina empleando una amina como nucleófilo. Obtenido el compuesto 15, tras realizar una posterior hidrogenolisis se obtuvo al compuesto buscado, 16 (Esq. 10). Esquema 10. Síntesis de nuevos derivados de dopamina con tacrina Con objeto de incrementar la distacia entre los dos farmacóforos usados, se emplearon diferentes α,ω-dibromoalcanos, con intención de obteniendo los intermedios 67 y 68, acceder a los derivados 19-21. Al usar el dibromoalcano de 4 y 5 carbonos se obtuvieron además los compuestos 17 y 18 por una nueva ruta diferente a la descrita por E.T. Michalson et al. 103 Esta nueva ruta consiste en una reacción SN2 intramolecular entre el grupo amino y el metileno terminal de los productos resultantes de la monoalquilación de la tacrina. Este tipo de derivados no se observó al usar el dibromoalcano de 6 átomos de carbono, ya que en ese caso se obtendría un anillo de 7 miembros mucho menos favorecido. Una vez obtenidos los compuestos 67 y 68, se sustituye el bromo por un grupo azido, y posteriormente dicho grupo es reducido a grupo amino mediante hidrogenación catalítica. Por último mediante aminación reductiva usándose diferentes aldehídos (79 y 81) se obtuvieron los compuestos 19-21 (Esq. 11). 102 . K. Czarnecka, P. Szymanski, M. Girek, E. Mikiciuk-Olasik, R. Skibinski, J. Kabziński, I. Majsterek, B. Malawska, J. Jonczyk, M. Bajd. Tetrahydroacridine derivatives with fluorobenzoic acid moiety as multifunctional agents for Alzheimer’s disease treatment. Bioorg. Chem. 2017, 72, 315-322. 103 . E.T. Michalson, S. D’Andrea, J.P. Freeman, J. Szmuszkovicz. The synthesis of 9-(1-azetidinyl)- 1,2,3,4-tetrahydroacridine. Heterocycles. 1990, 30, 415-425. 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 65 Esquema 11. Síntesis de los derivados de tacrina 17-21 Con esta ruta se obtuvo el nuevo compuesto 20 y los compuestos 17, 18, 19 y 21 preparados por una nueva ruta sintética a otras descritas 104 - 107 con objeto de analizar su capacidad como inhibidores de colinesterasas y compararlos con los valores de los nuevos compuestos. En cuanto a la última de las estructuras de los compuestos descritos en la figura 18, se trataron de obtener mediante la alquilación de la tacrina en primer lugar con un 104 . E.T. Michalson, S. D'Andrea, J.P. Freeman, J. Szmuszkovicz. The synthesis of 9-(1-azetidinyl)-1,2,3, 4-tetrahydroacridine. Heterocycles. 1990, 30, 415-425. 105 P. Mignona, M. Tianob, P. Belmont, A. Favre-Réguillond, H. Chermettea, F. Fachee. Unusual reactivities of acridine derivatives in catalytic hydrogenation. A combined experimental and theoretical study. J. Mol. Catal. A Chem. 2013, 371, 63-69. 106 . W. Luo, Y.-P. Li, Y. He, S.-L. Huang, J.-H. Tan, T.-M. Ou, D. Li, L.-Q. Gu, Z.-S. Huang. Design, synthesis and evaluation of novel tacrine-multialkoxybenzene hybrids as dual inhibitors for cholinesterases and amyloid β aggregation. Bioorg. Med. Chem. 2011, 19, 763-770. 107 . W. Luo, Y.-P. Li, Y. He, S.-L. Huang, D. Li, L.-Q. Gu, Z.-S. Huang. Synthesis and evaluation of heterobivalent tacrine derivatives as potential multi-functional anti-Alzheimer agents. Eur. J. Med. Chem. 2011, 46, 2609-2616. 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 72 Dentro de esta segunda agrupación de compuestos en los que en el espaciador encontramos como grupo funcional únicamente un grupo amino, observamos en primer lugar en cuanto a su actividad como inhibidores de AChE que la actividad de las aminas 12-14 resulta mejor a la de las iminas de las que proceden (5, 9 y 10). En cuanto a la longitud de cadena muestran mejores resultados los compuestos con un único fragmento de metilideno en su espaciador, destacando en esta tabla los compuestos 13 y 14 como inhibidores de AChE, con valores entorno al mismo orden de magnitud que la tacrina. Como inhibidores de BuChE sin embargo no se observa una tendencia clara en estos compuestos en lo que se refiere a su relación estructura-actividad. Podemos destacar en cuanto a su actividad frente a esta enzima los valores obtenidos por 13, y nuevamente una selectividad desde moderada hasta elevada en estos compuestos como inhibidores de BuChE. Tabla 9. Inhibición de colinesterasas producida por aminas cíclicas derivadas de tacrina AChE (Electrophorus electricus) BuChE (suero equino) Compuesto n Kia (µM) Kib (µM) Kia (nM) Kib (nM) IS* 17 2 1.8±1,2 2.5±1,5 1898±590 275±105 0.95 9.1 18 1 3.2±0.8 - 1203±130 304±81 2.7 Tacrina - 0.12±0.03 0.035±0.005 12±1 3,0±0,5 10 12 *IS: índice de selectividad = Ki (AChE)/Ki (BuChE) En lo que a los derivados pirrolidinico y piperidinico de tacrina se refiere, no se observaron buenos valores de inhibición enzimática. 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 73 Tabla 10. Inhibición de colinesterasas producida por diaminas y éteres derivados de tacrina AChE (Electrophorus electricus) BuChE (suero equino) Compuesto n m n+m X R1 R2 Kia (µM) Kib (µM) Kia (nM) Kib (nM) IS* 19 6 1 7 NH OMe OMe 0.10±0.03 0.090±0.050 3.9±0.4 0.82±0.23 26 110 20 6 1 7 NH OH OH 0.12±0.05 0.058±0.023 7.9±1.0 1.7±0.4 15 34 21 5 1 6 NH OMe OMe 0.16±0.10 0.12±0.03 30±20 9.9±3.7 5.3 12 24 5 2 7 O OMe H 0.075±0.028 0.075±0.028 29±5 2.9±1.1 2.6 26 25 5 2 7 O OMe OMe 0.17±0.01 0.055±0.011 7.0±0.4 1.9±0.8 24 29 26 5 2 7 O OBn H 0.11±0.02 0.11±0.02 1.9±0.9 1.5±1.2 58 73 27 5 2 7 O OBn OBn 0.34±0.05 0.13±0.03 4.6±0.6 2.7±0.9 74 48 28 5 2 7 O OH H 0.13±0.02 0.10±0.05 - 4.5±1.5 22 29 5 2 7 O OH OH 0.21±0.02 0.077±0.016 43±7 9.0±2.2 4.9 8.6 Tacrina - - - - - - 0.12±0.03 0.035±0.005 12±1 3.0±0.5 10 12 *IS: índice de selectividad = Ki (AChE)/Ki (BuChE) En esta última agrupación de compuestos en las que se empleo espaciadores de una mayor longitud, se observó en todos ellos una muy buena capacidad de inhibición de la enzima acetilcolinesterasa, obteniéndose valores de constantes de inhibición del mismo orden de magnitud que para la tacrina usada como referencia, y en la mayoría de ellos también valores como inhibidores de butirilcolinesterasa mejores a los obtenidos en la tacrina. Con ello queda patente la importancia del espaciador entre los dos farmacóforos, que pese a no ser exactamente el mismo en toda este grupo, presenta el mismo número de grupos metilidenos (7) y heteroátomos (1) en todos los compuestos salvo el derivado 21. Destaca todo este grupo descrito en la tabla 10 sobre los otros al ser el de mejor 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 74 actividad inhibitoria de AChE y BuChE, observándose nuevamente una elevada selectividad de inhibición de esta segunda enzima. Destacan entre estos compuestos, los derivados 19, 20 y 24-28, todos ellos con valores de constantes de inhibición de la AChE próximos a los de la tacrina y constantes de inhibición de BuChE similares e incluso mejores a los de la tacrina. A partir de todos los compuestos anteriores, aquellos que mostraron una mejor inhibición de las enzimas modelo se evaluaron también frente a las correspondientes enzimas humanas en colaboración con la profesora M. Bartolini de la Universidad de Bolonia, obteniéndose los siguientes resultados (Tabla 11): 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 75 Tabla 11. Inhibición enzimática de derivados de tacrina usando colinesterasas humanas Compuesto Estructura R1 R2 R3 hAChE CI50 (nM) hBuChE CI50 (nM) IS* 9 H OH H 1475±311 194±15 7.6 10 H OH OH 609±26 41.5±4.06 14.8 11 OH OH OH 1040±40 120±49 8.7 14 H OH OH 100±13 74.8±3.4 1.3 20 H OH OH 29.0±1.3 22.9±1.2 1.3 24 H OMe H 216±45 2.92±0.26 74.5 25 H OMe OMe 168±37 0.515±0.050 323.1 26 H OBn H 454±69 6.95±0.21 65.8 27 H OBn OBn 506±64 0.497±0.059 1012 28 H OH H 142±16 6.06±0.59 23.3 29 H OH OH 542±16 35.6±2.1 15.2 Tacrina - - - 412±15 44.2±1.7 9.3 Galantamina - - - 2010 ± 15076 20700 ± 150076 0.176 *IS: índice de selectividad = CI50 (AChE)/CI50 (BuChE) 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 76 Como puede observarse en la tabla 11, muchos de los compuestos obtuvieron mejores valores de CI50 que los de la molécula de tacrina y todos ellos mejores que los obtenidos por la galantamina. De este grupo, destacó como inhibidor de ambas enzimas el compuesto 20, siendo 14 veces mejor inhibidor de AChE que la tacrina y 1.5 veces mejor inhibidor de BuChE que dicho fármaco. Esto resulta de interés para las primeras etapas de la enfermedad de Alzheimer.77 En segundo lugar, cabe destacar los compuestos 24-29 como inhibidores altamente selectivos de la enzima BuChE. En ellos se obtuvieron valores de inhibición de la AChE del mismo orden de magnitud que el obtenido para la tacrina e incluso mejores (hasta 2.9 mejores), y valores como inhibidores de la BuChE muchos mejores que los obtenidos para este fármaco usado como referencia (hasta 88 veces mejores), alcanzándose valores de inhibición del orden del rango picomolar (515 y 497 pM) en los compuestos que presentan dos grupos metoxilos (25) y dos grupos becilo (27) e índices de selectividad de 323 y 1012 respectivamente. Dichos resultados presentan un elevado interés para etapas avanzadas de la enfermedad.78 C) Modelización molecular En colaboración con el Dr. A. Franconetti, actualmente investigador en el CIC bioGUNE (Vizcaya), se llevó a cabo un estudio en el que se analizaron las interacciones inhibidor-enzima dadas entre el sitio activo de la enzima butirilcolinesterasa y la tacrina y los derivados 25, 27-29. Las coordenadas cristalográficas código 4bds (PDB) se utilizaron como punto de partida para estudiar la conformación molecular de los compuestos 25, 27-29 en el sitio de unión con la BuChE. El análisis de las interacciones de la tacrina revela que la estabilización principal de esta molécula en el sitio activo de la enzima BuChE se debe a las interacciones de apilamiento de tipo π-π que involucran el residuo Trp82 (Fig. 21). Se encontraron dos estados diferentes, protonado y no protonado, para la tacrina. Estos estados modifican la fuerza de las interacciones π-π de - 18.5 (no protonada) a - 21.9 kcal / mol (protonada). Por ello, el estado protonado sería predominante a pH fisiológico. 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 77 Figura 21. (a) Coordenadas cristalográficas de la tacrina en el sitio activo de la BuChE y (b) intereacciones moleculares implicadas en la interacción de la tacrina con el sitio activo de la BuChE El valor de estas energías de interacción es demasiado alto para un apilamiento individual de π-π (6 kcal / mol). Esto se debe a que la interacción de apilamiento π-π funciona junto con las interacciones CH-π en las que dos protones apuntan claramente hacia el anillo aromático del Trp. Esta interacción de apilamiento de tacrina también se encuentra en todos los derivados sujetos a modelización. Sin embargo, los valores de las energías de interacción se modifican ligeramente debido a los contactos hidrofóbicos adicionales y la unión de CH-π con His438. Centrando nuestra atención en las otras interacciones que los derivados de tacrina podrían establecer, la introducción de una cadena de alquilo proporciona suficiente flexibilidad conformacional para maximizar las interacciones. Para comprender el papel de ambos grupos hidroxilo del híbrido 29 (IC50 = 35.6 ± 2.1 nM), se analizaron los contactos no covalentes que implican este resto. El fragmento de catecol permite interacciones adicionales de enlace de hidrógeno que involucran a Gln119 y Ser287 (Fig. 22). La estabilización (15.3 kcal / mol) de estos enlaces de hidrógeno combinados se estimó mediante modelos basados en DFT. (a) (b) Trp82 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 78 Figura 22. (a) Modelización molecular del heterodimero 29 en el sitio de union de la BuChE e (b) interacciones moleculares involucradas Los resultados del modelado molecular resaltaron el papel de los grupos hidroxilo del anillo aromático. Cuando estos grupos hidroxilo están protegidos (OBn, compuesto 27), aunque se pierde el enlace de hidrógeno con Gln119 y Ser287, se observa un aumento en la potencia de inhibición (IC50 = 0.50 ± 0.06 nM). De hecho, la flexibilidad conformacional permite que el anillo aromático se oriente hacia la superficie de la proteína, mostrando interacciones intramoleculares de tipo CH-π y dos contactos tipo CH- π intermoleculares (ΔEint = - 8.0 kcal / mol para cada uno de ellos) con el residuo Ala277 (Fig. 23). Además, las interacciones de van der Waals con los residuos Ile69 y Asp70 y la cadena alquílica estabilizan el complejo. Sorprendentemente, la potencia inhibitoria del compuesto 28 (IC50 = 6.1 ± 0.6 nM) que tiene un solo grupo hidroxilo es significativamente mayor que la del derivado 29. Aunque 28 no puede establecer el enlace de hidrogeno con Ser287 (ΔEcorr = - 8,7 kcal / mol), se encuentran interacciones entre dos enlaces de hidrógeno más fuertes (ΔEint = - 17.5 kcal / mol) que involucran el carboxilato (–COO-) cargado negativamente de Glu276 y Gln119, así como un nuevo contacto NH-π (ΔEint = - 14.1 kcal / mol) entre el anillo de fenol y Asn68 (Fig. 23) las cuales son probablemente responsables de la actividad inhibitoria más fuerte de dicho compuesto, proporcionando dichas interacciones una mejor estabilización. (a) (b) Gln119 His438 Ser287 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 79 Figura 23. Interacciones enzima-inhibidor encontradas entre la BuChE y los compuestos 27 (a) y 28 (b) La comparación entre el compuesto 27 y 25 (R1 = R2 = OMe, IC50 = 0.515 ± 0.050 nM) proporciona información sobre diferencias sutiles. La penalización causada por los grupos bencilo de alto impedimento estérico en el compuesto 27 está equilibrada por las interacciones CH-π mencionadas anteriormente, pero sin embargo, este tipo de contactos faltan en el compuesto 25 que lleva sustituyentes metoxílicos. A pesar de esto, se observan dos nuevos contactos CH-π con restos de dipéptidos Gln69-Asn68 (ΔEint = - 8.5 kcal / mol) y Leu88-Ser89 (ΔEint = - 2.3 kcal / mol). Las diferencias significativas entre ambas energías de unión de los contactos CH-π pueden explicarse a partir de las diferencias de la superficie MEP (Potencial Electroestático Molecular) calculada (- 19 frente a - 17 kcal / mol, respectivamente para cada cara de 3,4-dimetoxifenilo). Para obtener más información sobre la selectividad del compuesto 25 hacia BuChE en lugar de AChE, también se realizó un estudio de modelización de dicho compuesto con respecto al sitio activo de dicha enzima (código PDB: 4w63). Con ello se estimaron aproximadamente los valores globales calculados de energía de unión en los sitios de unión (Fig. 24) de la AChE (ΔEint = - 10.2 kcal / mol) y BuChE (ΔEint = -33.4 kcal / mol), observándose una clara relación entre una mejor inhibición en cuanto a un valor de energía de unión más favorable. (a) Gln119 Glu276 Asn68 (b) Ala277 Trp82 Trp82 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 80 Figura 24. (a) Modelización molecular del derivado 25 en el sitio de unión con AChE y (b) en el sitio de unión de BuChE D) Ensayo de inhibición de autoagregación de polipéptidos β-amiloides Al igual que se hizo anteriormente con otros derivados de tacrina, se evaluó en aquellos compuestos sintetizados con una mayor actividad inhibitoria de colinesterasa su actividad como inhibidores de la formación de placas β-amiloides en colaboración con la profesora M. Bartolini, de la Universidad de Bolonia. En este caso, los compuestos tomados como cabeza de serie fueron los éteres 24-29, que presentaron una alta selectividad como inhibidores de BuChE. Para ello se empleó nuevamente el ensayo de tioflavina T descrito por Naiki et al.79 obteniéndose los siguientes resultados (Tabla 12): 5. Síntesis y evaluación de nuevos derivados antioxidantes de tacrina 81 Tabla 12. Porcentaje de inhibición de autoagregación de polipéptidos Aβ42 Compuesto % de inhibición de autoagregación de Aβ42 24 63.5 ± 1.0 25 63.8 ± 4.8 26 70.0 ± 4.8 27 75.3 ± 0.4 28 54.4 ± 6.6 29 (*) Tacrina <5 Galantamina <576 Cistamina-tacrina 66.3 ± 0.371 *No testado debido a aparición de interferencia significativa observada en el ensayo de tioflavina T. Como puede observarse, todos los derivados testados ejercieron una inhibición significativa de la autoagregación de Aβ42 con porcentajes de inhibición de interés (54.4- 75.3%). A pesar del número limitado de compuestos probados, se podrían establecer algunas consideraciones, entre las que se encuentran el hecho de que el tipo de sustituyente en el anillo aromático parece influir en la actividad, observándose la siguiente tendencia: OBn> OMe> OH. Además, el patrón de mono o disustitución no parece influir en la actividad inhibitoria de manera significativa. En conjunto, los derivados mono- y dibencilados 26 y 27 fueron los derivados más potentes, con una capacidad inhibitoria de la autoagregación de polipéptidos Aβ42 mejor a la de la tacrina y cistamina-tacrina usadas como referencia. Además, los derivados metoxilados 24 y 25 también precentaron muy buenos valores en este ensayo muy próximos a los de las cistamina-tacrina. E) Ensayo de neurotoxicidad En base a los ensayos anteriores, en los que destacaron los compuestos 25 (dimetoxilado) y 27 (dibencilado) tanto por su capacidad como inhibidores selectivos de BuChE a la vez que como inhibidores de formación placas β-amiloides, se estudió en dichos compuestos su neurotoxicidad. Para dicho estudio, se usó el ensayo de viabilidad 6. Síntesis de nuevos derivados organocalcógenos y evaluación de su actividad anticancerígena 88 organismo distintas de la de origen. Presenta diferentes orígenes, pudiendo ser las causas agentes físicos, así como químicos, genéticos e incluso víricos. 118 , 119 Al igual que en otras enfermedades crónicas degenerativas, el número de afectados por esta enfermedad va año tras año en aumento debido al crecimiento de la población mundial y de la esperanza de vida media de la misma. Así, la Sociedad Española de Oncología Médica (SEOM) prevé que el número de nuevos casos anuales de cáncer en España aumente con los años, pasando de la cifra alcanzada en el año 2017 de 228482 nuevos casos de cáncer a más de 315000 nuevos casos en el año 2035. 120 Como se dijo anteriormente, el mayor factor de riesgo en lo que se refiere al cáncer es la edad. Esto se refleja en que la mayoría de los casos de cáncer los encontramos en la población mayores de 65 años (dos terceras partes). De todos los casos de cáncer, los más comunes son el cáncer de pulmón, próstata y cáncer de mama. 121 Entre los posibles tratamientos contra el cáncer más usados en la actualidad, están la quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia y la cirugía. En este segundo capítulo de la Tesis Doctoral se aborda la preparación y evaluación in vitro de nuevos derivados organocalcógenos como potenciales agentes quimioterápicos. 6.1.2. Interés de los derivados fenólicos y derivados calcógenos frente al cáncer y búsqueda de selectividad en fármacos Como ya se mencionó, existen multitud de fenoles y polifenoles naturales que presentan una marcada capacidad anticancerígena, como sería el caso de la punicalagina,64,65 o algunos isocromanos.66Además de ellos, existen otros compuestos fenólicos de origen natural como el tirosol e hidroxitirosol (Fig. 29) que podemos 118 . Asociación Española contra el Cáncer. https://www.aecc.es/es/todo-sobre-cancer/que-es-cancer Última consulta el 11/1/2020. 119 . Manual de Enfermería Oncológica, Instituto Nacional del Cáncer (Argentina). http://www.msal.gob.ar/images/stories/bes/graficos/0000000510cnt-38- ManualEnfermeriaOncologica2014.pdf Última consulta el 11/1/2020. 120 . https://seom.org/es/noticias/106525-las-cifras-del-cancer-en-espana-2018 Última consulta el 11/1/2020. 121 . A.S. Fauci, D.L. Karper, D.L. Longo, E. Braunwald, S. Hauser, J.L. Jameson, J.L. Loscalzo. Harrison. Principios de Medicina Interna. 17ª edición. Editorial McGrawHill. 2009. 6. Síntesis de nuevos derivados organocalcógenos y evaluación de su actividad anticancerígena 89 encontrar en el aceite de oliva virgen, así como derivados de los mismos, que presentan diferentes propiedades biológicas de interés entre las que se encuentran la capacidad de combatir ciertos tipos de cáncer como la leucemia (HL-60) y el cáncer de páncreas (PaCa- 2) entre otros. 122 - 124 Figura 29. Estructura química de tirosol e hidroxitirosol Es por ello que en diferentes fenoles y polifenoles se realizan actualmente modificaciones de su estructura mediante la unión a otros fragmentos farmacóforos con interés de evaluar la actividad biológica de los nuevos compuestos frente a células cancerosas. Dentro de los compuestos que presentan un grupo organocalcógeno, se ha observado que ciertos tio-, seleno- y teluroderivados orgánicos presentan interesantes 122 . R. Fabiani. Anti-cancer properties of olive oil secoiridoid phenols: a systematic review of in vivo studies. Food Funct. 2016, 7, 4145-4159. 123 . J. Anter, I. Tasset, S. Demyda-Peyrás, I. Ranchal, M. Moreno-Millán, M. Romero-Jimenez, J. Muntané, M.D. Luque de Castro, A. Muñoz-Serrano, Á. Alonso-Moraga. Evaluation of potential antigenotoxic, cytotoxic and proapoptotic effects of the olive oil by-product "alperujo", hydroxytyrosol, tyrosol and verbascoside. Mutat. Res. 2014, 772, 25-33. 124 . C.D. Goldsmith, D.R. Bond, H. Jankowski, J. Weidenhofer, C.E. Stathopoulos, P.D. Roach, C.J. Scarlett. The olive biophenols oleuropein and hydroxytyrosol selectively reduce proliferation, influence the cell cycle, and induce apoptosis in pancreatic cancer cells. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1937. 6. Síntesis de nuevos derivados organocalcógenos y evaluación de su actividad anticancerígena 90 propiedades antiproliferativas frente a determinados tipos de cáncer, 125 - 127 observándose en algunos de ellos, de manera concreta, citotoxicidad al inducir apoptosis en ciertas células tumorales. 128 Determinados estudios además demuestran el interés de su uso no solo de manera individual, sino en ocasiones en combinación con otras moléculas, dando lugar a una sinergia que produce una mejora significativa de la actividad anticancerígena de estos compuestos. 129 , 130 Debido a lo anterior, la combinación de las propiedades de fenoles y derivados organocalcógenos resulta de elevado interés en la búsqueda de nuevas moléculas bioactivas, observándose buenos resultados en recientes estudios realizados por nuestro grupo de investigación con derivados organocalcógenos de diferentes fenoles entre los que se encuentran la (±)-norepinefrina,89,125 dopamina125, R-epinefrina,125 el hidroxitirosol, 131 y diferentes aldehídos aromáticos 132 (Fig. 30). 125 . P. Begines, A. Oliete, Ó. López, I. Maya, G.B. Plata, J.M. Padrón, J.G. Fernández-Bolaños. Chalcogen-containing phenolics as antiproliferative agents. Future Med. Chem. 2018, 10, 319-334. 126 . L.L. Romero-Hernández, P. Merino-Montiel, S. Montiel-Smith, S. Meza-Reyes, J.L.Vega-Báez, I. Abasolo, S. SchwartzJr., Ó. López, J.G. Fernández-Bolaños. Diosgenin-based thio(seleno)ureas and triazolyl glycoconjugates as hybrid drugs. Antioxidant and antiproliferative profile. Eur. J. Med. Chem. 2015, 99, 67-81. 127 . L. Engman, N. Al-Maharik, M. McNaughton, A. Birmingham, G. Powis. Thioredoxin reductase and cancer cell growth inhibition by organotellurium compounds that could be selectively incorporated into tumor cells. Bioorg Med Chem. 2003, 11, 5091-5100. 128 . S. Khandelwal, M. Boylan, J.E. Spallholz, L. Gollahon. Cytotoxicity of selenium immunoconjugates against triple negative breast cancer cells. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 3352. 129 . C Fan, W Zheng, XFu ,Xli, Y-S Wong, T. Chen. Enhancement of auranofin-induced lung cancer cell apoptosis by selenocystine, a natural inhibitor of TrxR1 in vitro and in vivo. Cell Death Dis. 2014, 5, e1191. 130 . P. Chakraborty, S. Singha Roy, S. Bhattacharya. Molecular mechanism behind the synergistic activity of diphenylmethyl selenocyanate and cisplatin against murine tumor model. Anticancer Agents Med. Chem. 2015, 15, 501. 131 . M.V. Sepporta, M.Á. López-García, R. Fabiani, I. Maya, J.G. Fernández-Bolaños. Enhanced chemopreventive activity of hydroxytyrosol on HL60 and HL60R cells by chemical conversion into thio derivatives. Eur. J. Pharm. Sci. 2013, 48, 790–798. 132 . V. Calcatierra, Ó. López J.G. Fernández-Bolaños, G.B. Plata, J.M.Padrón. Phenolic thio- and selenosemicarbazones as multi-target drugs. Eur. J. Med. Chem. 2015, 94, 63-72. 6. Síntesis de nuevos derivados organocalcógenos y evaluación de su actividad anticancerígena 91 Figura 30. Estructura química de tio- y selenoderivados fenólicos Sin embargo, pese a los buenos valores obtenidos en varios de estos compuestos en cuanto a actividad antiproliferativa y citotoxicidad, es frecuente la ausencia de selectividad, ya que muchos de estos compuestos no solo atacan a células cancerosas sino también a células sanas. El problema de selectividad ha estado presente desde los primeros fármacos quimioterápicos estudiados, tales como diferentes sulfuros de gas mostaza cuyo efecto se estudió a partir de la primera guerra mundial, hasta fármacos usados en la actualidad como es el cisplatino, carboplatino o 5-fluorouracilo (5-FU) (Fig. 31).70, 133 - 135 133 . N. Rashtchizadeh, H. Argani, A. Ghorbanihaghjo, D. Sanajou, V. Hosseini, S. Dastmalchi, S.N. Soltan Ahmad. AMPK: A promising molecular target for combating cisplatin toxicities. Biochem. Pharmacol. 2019, 163, 94-100. 134 . A. Ruggiero, G. Trombatore, S. Triarico, R. Arena, P. Ferrara, M. Scalzone, F. Pierri, R. Riccardi. Platinum compounds in children with cancer: toxicity and clinical management. Anti-Cancer Drugs, 2013, 24, 1007-1019. 135 . Topics in Medicinal Chemistry, Cancer. R.H. Bradbury (Ed.), editorial Springer, 2007. 6. Síntesis de nuevos derivados organocalcógenos y evaluación de su actividad anticancerígena 92 Figura 31. Estructura de cisplatino, carboplatino y 5-fluorouracilo Teniendo en cuenta estos problemas, se hace necesario aumentar la selectividad de los posibles fármacos que vayan a ser empleados en el tratamiento contra el cáncer. Una manera de conseguir esto es mediante la introducción de fragmentos que actúen en nuestros derivados calcógenos dirigiéndolos de manera selectiva hacia las células tumorales. Para ello es necesario aprovechar las diferencias que existen entre las células tumorales y las células sanas Es conocido que las células tumorales muestran un metabolismo mucho más activo que las células normales, multiplicándose mucho más rápidamente que estas en el organismo, lo que requiere en ellas un mayor aporte de ciertos nutrientes. Por ello, las células cancerosas requieren entre otras cosas un mayor aporte vitamínico que las sanas, como sería el caso de la vitamina H o D-biotina (Fig. 32), encontrándose en ciertos tipos de cáncer que aparecen sobreexpresados los receptores de dicha vitamina en las células tumorales. 136 , 137 Figura 32. Estructura de la D-biotina (vitamina H) 136 . G. Tripodo, D. Mandracchia, S. Collina, M. Rui, D. Rossi. New perspectives in cancer therapy: the biotin-antitumor molecule conjugates. Med. Chem. 2014, S1:004. 137 . S. Maiti. P. Paira. Biotin conjugated organic molecules and proteins for cancer therapy: a review. Eur. J. Med. Chem. 2018, 145, 206-223. 6. Síntesis de nuevos derivados organocalcógenos y evaluación de su actividad anticancerígena 93 Es por ello que estos receptores se consideran en la actualidad interesantes dianas terapéuticas, pudiendo permitir una mejora de la selectividad de los fármacos antitumorales la presencia de un fragmento de D-biotina en su estructura. 6.1.3. Interés biológico del selenio y aplicación de compuestos organoselénicos como inhibidores de HADC frente al cáncer Dentro de los organocalcógenos, al centrarnos en el selenio, observamos que pese a ser un elemento que durante mucho tiempo estuvo asociado a efectos tóxicos en lo que se refiere a su presencia en el organismo, tras en el año 1957 al identificarse como un micronutriente esencial en mamíferos, 138 cambió de alguna manera la concepción sobre dicho elemento, conociéndose hoy en día su importancia en determinados procesos del organismo como la reducción de especies oxidantes a través del ciclo catalítico de la enzima glutatión peroxidasa (GPx)83 y los efectos perjudiciales que puede producir su déficit en el organismo, asociado a enfermedades como la enfermedad de Keshan, la enfermedad de Kashin−Beck o la enfermedad del corazón de mora. 139 Si bien durante el siglo XIX el selenio comenzó a usarse por sus propiedades fotoconductoras, con el tiempo comenzó a usarse en diferentes áreas como la industria del vidrio, pigmentos y metalurgia entre otras, adquiriendo durante las últimas décadas interés desde el punto de vista biológico. 140 En la actualidad son muchos los estudios de nuevas moléculas con selenio en las que se busca actividad anticancerígena, sintetizándose amplias familias de compuestos con diferentes grupos funcionales selénicos tales como selenoesteres, 141 , 142 138 . K. Schwarz, C.M. Foltz. Selenium as an integral part of factor 3 against dietary necrotic liver degeneration. Nutrition. 1999, 15, 254-256. 139 . H.J. Reich, R.J. Hondal. Why nature chose selenium. ACS Chem. Biol. 2016, 11, 821-841. 140 . V.K. Jain. An overview of Organoselenium Chemistry: from fundamentals to synthesis. Organoselenium Compd. Biol. Med. Synth. Biol. Ther. Treat. The Royal Society of Chemistry. 2018, 1- 34. 141 . E. Domínguez-Álvarez, D. Plano, M. Font, A. Calvo, C. Prior, C. Jacob, J.A. Palop, C. Sanmartín. Synthesis and antiproliferative activity of novel selenoester derivatives. Eur. J. Med. Chem. 2014, 73, 153-66. 142 . D. Plano, D.N. Karelia, M.K. Pandey, J.E. Spallholz, S. Amin, A.K. Sharma. Design, synthesis, and biological evaluation of novel selenium (Se-NSAID) molecules as anticancer agents. J. Med. Chem. 2016, 59, 1946-1959. 6. Síntesis de nuevos derivados organocalcógenos y evaluación de su actividad anticancerígena 94 selenoamidas 143 y selenocarbamatos 144 , 145 además de selenoureas y selenosemicarbazonas mencionadas con anterioridad125,132 (Fig. 33). Figura 33. Estructura de compuestos organoselénicos con actividad antitumoral Entre de los compuestos organoselénicos con actividad frente al cáncer, encontramos los inhibidores de histona desacetilasas (iHDAC). Estas enzimas tienen un papel relevante en la regulación de la transcripción genética, controlando junto con las 143 . A.I. Gutiérrez-Hernández, J.G. López-Cortés, M.C. Ortega-Alfaro, M.T. Ramírez-Apan, J.J. Cázares- Marinero, R.A. Toscano. Ferrocenylselenoamides: synthesis, characterization and cytotoxic properties. J. Med. Chem. 2012, 55, 4652-4663. 144 M. Font, E. Lizarraga, E. Ibáñez, D. Plano, C. Sanmartín, J.A. Palop. Structural variations on antitumour agents derived from bisacylimidoselenocarbamate. A proposal for structure-activity relationships based on the analysis of conformational behaviour. Eur. J. Med. Chem. 2013, 66, 489-498. 145 . B. Romano, M. Font, I. Encío, J. A. Palop, C. Sanmartín. Synthesis and antiproliferative activity of novel Methylselenocarbamates. Eur. J. Med. Chem. 2014, 83, 674-684. 6. Síntesis de nuevos derivados organocalcógenos y evaluación de su actividad anticancerígena 95 histona acetilasas el estado de acetilación de las cadenas laterales de lisina de las proteínas histónicas de la cromatina. 146 Estas enzimas se agrupan en cuatro clases en función de su estructura, distinguiendo las de clase I que incluyen HDAC1, HDAC2, HDAC3 y HDAC8, las de clase IIa que incluyen HDAC4, HDAC5, HDAC7 y HDAC9, las de clase IIb HDAC6 y HDAC10 y la clase IV en la que se encuentra HDAC11. 147 Además de estas clases, las cuales son Zn2+-dependientes, existen otras de clase III en las que encontramos enzimas desacetilasas Zn2+-independientes NAD+-dependientes, con proteínas no histonas como sustratos. 148 Desde hace ya varias decadas se han observado moléculas que presentaban actividad como como inhibidoras de HDAC y capacidad antitumoral como fue el caso del butirato. 149 Durante los últimos años multitud de inhibidores de HDAC has sido estudiados. 150 , 151 Varios de estos compuestos han sido aprobados durante los últimos años por la FDA, como sería el caso del SAHA (Vorinostat), Belinostat y la Romidepsina (Fig. 34). La actividad inhibitoria de los ácidos hidroxámicos esta basada en el efecto de estos como quelatantes con el ión Zn2+, fundamental en las enzimas HDAC de clase I, II y IV para que se produzca la reacción enzimática. 152 En el caso de la Romidepsina sin embargo existen indicios que explican que la inhibición se produce por el grupo disulfuro, 146 N.L. Wiech, J.F. Fisher, P. Helquist, O. Wiest. Inhibition of histone deacetylases: a pharmacological approach to the treatment of non-cancer disorders. Curr. Top. Med. Chem. 2009, 9, 257-271. 147 . S.Y. Choi, H.J. Kee, L. Jin, Y. Ryu, S. Sun, G.R. Kim, M.H. Jeong. Inhibition of class IIa histone deacetylase activity by gallic acid, sulforaphane, TMP269, and panobinostat. Biomed. Pharmacother. 2018, 101, 145-154. 148 . D. Desai, U. Salli, K.E. Vrana, S. Amin. SelSA, selenium analogs of SAHA as potent histone deacetylase inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2010, 20, 2044-2047. 149 . L.C. Boffa, G. Vidali, R.S. Mann, V.G. Allfrey. Suppression of histone deacetylation in vivo and in vitro by sodium butyrate. J. Biol. Chem. 1978, 253, 3364-3366. 150 . D.M. Vigushin, R.C. Coombes. Histone deacetylase inhibitors in cancer treatment. Anti-Cancer Drugs. 2002, 13, 1-13. 151 . M. Huang, J. Zhang, C. Yan, X. Li, J. Zhang, R Ling. Histone deacetylase inhibitors as a novel targeted therapy against non-small cell lung cancer: Where are we now and what should we expect? Anticancer Res. 2018, 38, 37-43. 152 . L. Zhang, J. Zhang, Q. Jiang, L. Zhang, Weiguo Song. Zinc binding groups for histone deacetylase inhibitors. J. Enzyme. Inhib. Med. Chem. 2018, 33, 714-721. 6. Síntesis de nuevos derivados organocalcógenos y evaluación de su actividad anticancerígena 96 el cual dentro de las células es reducido a tioles, siendo dicho grupo funcional el que interactua con el Zn2+, inhibiendo a estas enzimas. 153 Figura 34. Estructura química de diferentes inhibidores de HDAC El primero de ellos, en ser aprobado por la FDA fue el Vorinostat en el año 2006 para el tratamiento de linfoma cutáneo de células T. 154 Además, el Vorinostat presenta cierta actividad también hacia otros tipos de cáncer. 155 Sin embargo tiene ciertas limitaciones debido a su toxicidad, produciéndose 153 R. Furumai, A. Matsuyama, N. Kobashi, K.-H. Lee, M. Nishiyama, H. Nakajima, A. Tanaka, Y. Komatsu, N. Nishino, M. Yoshida, S. Horinouchi. FK228 (depsipeptide) as a natural prodrug that inhibits class I histone deacetylases. Cancer. Res. 2002, 62, 4916-4921. 154 . T. Eckschlager, J. Plch, M. Stiborova, J. Hrabeta. Histone deacetylase inhibitors as anticancer drugs. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 1414. 155 . R. Gowda, S.V. Madhunapantula, D. Desai, S. Amin, G.P. Robertson. Selenium-containing histone deacetylase inhibitors for melanoma management. Cancer Biol. Ther. 2012, 13, 756-765. 6. Síntesis de nuevos derivados organocalcógenos y evaluación de su actividad anticancerígena 97 diversos efectos secundarios tales como diarrea, fatiga, nauseas, hipercolesterolemia e hiperglucemia entre otros.151, 156 En ciertos estudios, se han elaborado compuestos organocalcógenos con similaridad estructural al fármaco SAHA.148, 157 Dentro de estas moléculas, centrándonos en los compuestos organoselénicos, encontramos los derivados denominados SelSA-1 (5- fenilcarbamoilpentilselenocianato) y SelSA-2 (bis(5-fenilcarbamoilpentil)diselenuro (Fig. 35).148 Figura 35. Estructura química de SelSA-1 y SelSA-2 Dichas moléculas demostraron interesantes valores de inhibición de histona desacetilasas, demostrando mejores valores que los obtenidos por el fármaco SAHA. Se postula que la actividad de estas moléculas puede deberse bien a la unión reversible del selenio con el sitio activo de las HDAC, o a la modificación de los residuos de cisteína de estas enzimas debido a las propiedades redox de dichos compuestos.155 Dichos compuestos demostraron también actividad inhibitoria frente a ciertas kinasas, también implicadas en algunos tipos de cáncer. Además de frente a estas enzimas, al evaluarse frente a diferentes modelos de células cancerosas se obtuvieron 156 . C.M. Marson. Histone deacetylase inhibitors: design, structure-activity relationships and therapeutic implications for cancer. Anticancer agents Med. Chem. 2009, 9, 661-692. 157 . T. Suzuki, A. Kouketsu, A. Matsuura, A. Kohara, S. Ninomiya, K. Kohda, N. Miyata. Thiol-based SAHA analogues as potent histone deacetylase inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 3313- 3317. 6. Síntesis de nuevos derivados organocalcógenos y evaluación de su actividad anticancerígena 104 Figura 37. Derivado de biotina con fluoresceina Estos resultados han estimulado en los últimos años la preparación de diferentes derivados de biotina que presentan propiedades anticancerígenas. Ejemplo de ellos serían los derivados del antineoplásico paclitaxel, 162 , 163 como el sintetizado por S. Chen et al. 164 , los derivados de la gemcitabina 165 , 166 como los sintetizados por S. Maiti et al. 167 o los derivados de la doxorubicina 168 como los preparados por S. Park et al. 169 (Fig. 38). 162 . https://www.vademecum.es/principios-activos-paclitaxel-l01cd01 Revisado el 11/1/2020. 163 . D. Gischewski, M. Manzano, V. Faria, L. Barbosa, L.E. Quintas. Antagonistic anticancer effect of paclitaxel and digoxin combination. Anticancer Res. 2018, 38, 219-225. 164 . S.Chen, X. Zhao, J. Chen, J. Chen, L. Kuznetsova, S.S. Wong, I. Ojima. Mechanism-based tumortargeting drug delivery system. Validation of efficient vitamin receptor-mediated endocytosis and drug release. Bioconjugate Chem. 2010, 21, 979-987. 165 . https://www.vademecum.es/principios-activos-gemcitabina-l01bc05 Revisado el 11/1/2020. 166 . S. Noble, K.L. Goa. Gemcitabine. A review of its pharmacology and clinical potential in non-small- cell lung cancer and pancreatic cancer. Drugs. 1997, 54, 447-472. 167 . S. Maiti, N. Park, J.H. Han, H.M. Jeon, J.H. Lee, S. Bhuniya, C. Kang, J.S. Kim. Gemcitabinecoumarin-biotin conjugates: a target specific theranostic anticancer prodrug. J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 4567-4572. 168 . J. Armstrong, C.R. Dass. Doxorubicin action on mitochondria: relevance to osteosarcoma therapy? Curr. Drug Targets. 2018, 19, 432-438. 169 . S. Park, E. Kim, W.Y. Kim, C. Kang, J.S. Kim. Biotin-guided anticancer drug delivery with aciditytriggered drug release. Chem. Comm. 2015, 51, 9343-9345. 6. Síntesis de nuevos derivados organocalcógenos y evaluación de su actividad anticancerígena 105 Figura 38. Derivado de biotina de paclitaxel (a), gemcitabina (b) y doxorubicina (c). En base a estos estudios, en esta segunda parte del segundo capítulo de la presente Tesis Doctoral se sintetizaron una serie de derivados de biotina con el objetivo de desarrollar nuevos agentes antiproliferativos dotados de una mejor selectividad hacia las células tumorales. Debido a los excelentes valores de actividad antiproliferativa obtenidos previamente en nuestro grupo de investigación en compuestos organocalcógenos, se decidió preparar híbridos de biotina con fragmentos que contuvieran azufre o selenio. De esta forma, la biotina actuaría como vehículo selectivo hacia las células tumorales, mientras que el fragmento organocalcógeno aportaría la actividad antiproliferativa (Fig. 39). 6. Síntesis de nuevos derivados organocalcógenos y evaluación de su actividad anticancerígena 106 Figura 39. Estructura general de nuevos derivados de biotina En el diseño de los derivados preparados se han incluido numerosas funciones organocalcógenas (isotiocianato, tiosemicarbazona, disulfuro, tio- y selenocianato y tio- y selenourea) modificándose en algunos casos el tipo y longitud del espaciador, así como ciertos sustituyentes del farmacóforo empleado. Todo esto nos permitió preparar una amplia librería de compuestos derivados de biotina. Como inicio para nuestra familia de compuestos, se partió de las estructuras de diferentes tio- y selenosemicarbazonas preparadas en nuestro grupo de investigación previamente (Fig. 40). Este tipo de productos, han sido descritos en nuestro grupo como buenos agentes antiproliferativos, alcanzándose en algunos de ellos actividades en el rango micromolar bajo, obteniendose mejores valores que los de los fármacos de referencia cisplatino y 5-FU.132 Figura 40. Estructura general de tio y selenosemicarbazonas tomadas como referencia Debido a estos buenos resultados, se buscó sintetizar primero diferentes tio- y selenosemicarbazonas derivadas de biotina, comenzándose por los compuestos de azufre. Para ello se planteó en primer lugar usar como espaciador entre la D-biotina y el fragmento organocalcógeno la 1,4-fenilendiamina, siendo necesaria la formación de la amida correspondiente (41) mediante una reacción de tipo SNAc. Dicha amida se obtuvo mediante una ruta sintética diferente a otra ya existente. La activación del grupo ácido de 6. Síntesis de nuevos derivados organocalcógenos y evaluación de su actividad anticancerígena 107 la biotina transformándolo en un haluro de acilo fue descartado, pues al ser el derivado de acido más reactivo es bastante inestable y resulta difícil trabajar con él. Por ello, se optó por formar un anhídrido mixto que posteriormente al recibir el ataque nucleofilico de la 1,4-fenilendiamina de manera selectiva sobre el carbono carbonílico de la biotina, daría lugar a la correspondiente amida. Se usó para ello el método empleado por Zheng et al. 170 para unir biotina y ácido γ-aminobutirico, obteniéndose en nuestro caso el compuesto 41 (Esq. 17). Esquema 17. Síntesis de amida derivada de biotina a partir de fenilendiamina Al formar el anhídrido mixto tras tratar la biotina con cloroformiato de isobutilo en presencia de Et3N, este es adicionado a una de disolución de 1,4-fenilendiamina disuelta en DMF anhidra, dándose de manera regioselectiva la reacción de sustitución nucleofílica acílica sobre el carbono carbonílico de la biotina (carbono más electrófilo), obteniéndose el compuesto 41, mediante una metodoligía diferente a las ya descritas, 171 , 172 con un rendimiento del 72%. Cabe añadir además que no se produce una doble SNAc en la que los dos grupos amino de la fenilendiamina actúen como nucleófilos, debido a que al formarse la amida en el compuesto 41, el grupo amino libre de dicho compuesto reduce su nucleofilia por efecto –R. 170 . Y.-G. Zheng, X.-Q. Wu, J. Su, P. Jiang, L. Xu, J. Gao, B. Cai, M. Ji. Design and synthesis of a novel photoaffinity probe for labelling EGF receptor tyrosine kinases. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2017, 32, 954-959. 171 . H.-G. Lerchen, H.-U. Siegmund, D. Immler, A. Schumacher, D. Auriel. WO 2003040288 A2, 2003. 172 . A. Wibowo, E.C. Peters, L.C. Hsieh-Wilson. Photoactivatable glycopolymers for the proteome-wide identification of fucose-α(1-2)-galactose binding proteins. J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 9528-9531. 6. Síntesis de nuevos derivados organocalcógenos y evaluación de su actividad anticancerígena 108 Una vez obtenido el compuesto 41, se procedió a la obtención del correspondiente isotiocianato (94) mediante una metodología diferente a la ya descrita,171 tratando 41 con tiofosgeno en un medio trifásico (CH2Cl2-H2O, CaCO3). Tras ello, el compuesto 94 es tratado con hidracina dando lugar esta mediante un ataque nucleófilo a la correspondiente tiosemicarbazida no aislada, que mediante una reacción de condensación con diferentes aldehídos aromáticos dio lugar a las tiosemicarbazonas 42-44 (Esq.18). Esquema 18. Síntesis de tiosemicarbazonas fenólicas derivadas de biotina Con objeto de analizar la posible influencia del fragmento de biotina en las propiedades biológicas, se sintetizó también una tiosemicarbazona en la que el fragmento de biotina fue sustituido por un fragmento de Boc. Para ello en primer lugar se protegió la fenilendiamina de manera selectiva en uno de sus dos grupos aminos con anhídrido de Boc utilizando el método descrito por L. Yao et al. 173 Posteriormente se emplearon las mismas condiciones descritas en el esquema 18 para obtener la correspondiente tiosemicarbazona 46 (Esq. 19). 173 . L. Yao, N. Mustafa, E.C. Tan, A. Poulsen, P. Singh, M.-D. Duong-Thi, J.X.T. Lee, P.M. Ramanujulu, W.J. Chng, J.J.Y. Yen, S. Ohlson, B.W. Dymock. Design and synthesis of ligand efficient dual inhibitors of Janus kinase (JAK) and histone deacetylase (HDAC) based on ruxolitinib and vorinostat. J. Med. Chem. 2017, 60, 8336-8357. 6. Síntesis de nuevos derivados organocalcógenos y evaluación de su actividad anticancerígena 109 Esquema 19. Síntesis de la tiosemicarbazona 46 Tras la síntesis y evaluación de estos nuevos compuestos se observó que estos no presentaban actividad antiproliferativa en las líneas tumorales investigadas, salvo 46 con una actividad moderada, por lo que se procedió tras ello a sintetizar nuevos derivados cambiando su estructura con respecto a la de los compuestos ya sintetizados. La primera alternativa planteada fue la acetilación de los hidroxilos fenólicos del 3,4-dihidroxibenzaldehido mediante el método descrito por Y. Zhu et al. 174 De esta manera tras obtenerse el aldehído 97 y mediante reacción con la tiosemicarbazida resultante de la reacción del isotiocianato 94 con hidracina, se sintetizó exitosamente la tiosemicarbazona 47 con un rendimiento del 80% (Esq. 20). Con ello se buscó evaluar si al reducir la polaridad de nuestro compuesto era posible mejorar la capacidad antiproliferativa en células tumorales de este tipo de compuestos, ya que la reducción de la polaridad del fragmento fenólico podría permitir una mayor biodisponibilidad de nuestro compuesto. 174 Y. Zhu, P. Wang, Y. Zhao, C. Yanga, A. Clark, T.C. Leung, X. Chen, S. Sang. Synthesis, evaluation, and metabolism of novel [6]-shogaol derivatives as potent Nrf2 activators. Free Radic. Biol. Med. 2016, 95, 243-254. 6. Síntesis de nuevos derivados organocalcógenos y evaluación de su actividad anticancerígena 110 Esquema 20. Síntesis de tiosemicarbazona derivada de biotina Una segunda alternativa de modificación estrucural fue la utilización de un espaciador de mayor longitud entre la biotina y el fragmento organocalcógeno que aportara una mayor flexibilidad a la molécula. Para ello se usó ácido 5-aminovalérico, protegiéndose su grupo amino con Boc 175 (Esq. 21). Esquema 21. Síntesis de compuesto 98 Posteriormente se forma la amida correspondiente mediante el uso del cloroformiato de isobutilo para crear un anhídrido mixto que a continuación es atacado de manera selectiva en el carbono carbonílico procedente del ácido aminovalérico por un grupo amino de la 1,4-fenilendiamina. En dicha amida se elimina posteriormente el grupo protector Boc, obteniéndose la 5-Amino-N-(4-aminofenil)pentanamida. 175 . M. Grazia, P. Vitale, A. Panella, S. Ferorelli, M. Contino, A. Lavecchia, A. Scilimati. Isoxazole‐based‐ scaffold inhibitors targeting cyclooxygenases (COXs). Chem. Med. Chem. 2016, 11, 1172-1187. 6. Síntesis de nuevos derivados organocalcógenos y evaluación de su actividad anticancerígena 111 Una vez obtenida esta molécula, y aprovechando la mayor nucleofília del grupo amino alifático, se llevó a cabo el acoplamiento quimioselectivo de este con la biotina usando el procedimiento basado en el uso del cloroformiato de isobutilo. La posterior reacción del grupo amino aromático con tiofosgeno originó el isotiocianato 48 (Esq. 22). Sin embargo, el posterior intento de obtención de una tiosemicarbazona mediante el tratamiento de 48 con hidracina y posteriormente con 3,4-dihidroxibenzaldehido resulto infructuoso. Esquema 22. Síntesis del isotiocianato 48 Como tercera opción de modificación estructural, se llevó a cabo la sustitución de la función tiosemicarbazona por una función de tipo tiourea. Así pues, empleando como intermedio clave el isotiocianato 94, se llevó a cabo el acomplamiento de este con tres catecolaminas (dopamina, R-epinefrina, β-metoxidopamina), así como con pmetoxianilina, dando lugar a las tioureas 49-52 (49-51 obtenidas en colaboración con la alumna de trabajo de fin de grado Inés Romero). Los rendimientos obtenidos fueron de buenos a muy buenos (67-82%) (Esq. 23). 6. Síntesis de nuevos derivados organocalcógenos y evaluación de su actividad anticancerígena 112 Esquema 23. Síntesis de tioureas derivadas de biotina Con posterioridad a ello, también se abordó la síntesis de tiocianatos y disulfuros derivados de biotina. Para ello una primera opción fue partir de 1,4-fenilendiamina que previamente se protegió de manera selectiva en un nitrógeno con (Boc)2O (compuesto 95). Tras esto se alquiló el grupo amino libre con un exceso de 1,6-dibromohexano para facilitar la monosustitución, y posteriormente, mediante desplazamiento nucleofílico del segundo bromo con KSCN se obtuvo el tiocianato 53 (Esq. 24). Esquema 24. Síntesis del tiocianato 53 a partir de 1,4-fenilendiamina 6. Síntesis de nuevos derivados organocalcógenos y evaluación de su actividad anticancerígena 113 Sin embargo, una vez obtenido 53, los intentos de eliminar el grupo protector mediante el uso de ácido trifluoroacético (CF3COOH) fueron infructuosos, ya que se observó degradación del compuesto. Debido a esto se optó por proteger uno de los grupos amino con etoximetilenmalonato de dietilo en forma de enamina. 176 En esta ocasión si se obtuvo de manera exitosa el tiocianato deseado (56), mediante alquilación del intermedio 99 con 1,6-dibromohexano, un posterior desplazamiento nucleófilico del bromo restante con KSCN y finalmente mediante eliminación del grupo protector del compuesto 55 usando etilendiamina (Esq. 25). Esquema 25. Síntesis de tiocianato 56 a partir de fenilendiamina Una vez obtenido el tiocianato 56, se acopló a un fragmento de biotina mediante el uso de cloroformiato de isobutilo para dar lugar al derivado 57, el cual tras ser tratado con NaBH4 en presencia de oxígeno atmosférico, dio lugar al disulfuro simétrico 58 (Esq. 26). 176 . A. Ilangovan, R.G. Kumar. 2,2-Bis(ethoxycarbonyl)vinyl (BECV) as a versatile amine protecting group for selective functional-group transformations. Chem. Eur. J. 2010, 16, 2938-2943. 6. Síntesis de nuevos derivados organocalcógenos y evaluación de su actividad anticancerígena 120 Tabla 16. Índice de selectividad en ensayos antiproliferativos en los cabezas de serie 55, 56, 61-64 IS* Compuesto A549 HBL-100 HeLa SW1573 T-47D WiDr 55 >37 > 29 >29 >56 >25 >20 56 >36 >25 >21 >45 >5.9 >6.7 61 >26 >21 >42 >40 >28 >19 62 >29 >8.3 >7.7 >40 >6.3 >5.6 63 433 506 1058 700 3500 758 64 >1515 >1961 >7692 >5882 >1695 >4348 5-FU NT** 1.0 0.37 1.3 0.11 0.11 Cisplatino 2.9 7.4 7.0 4.1 0.93 0.54 *IS: índice de selectividad (GI50 (célula sana)/ GI50 (célula tumoral)) **NT: no testado 121 7. CONCLUSIONES 7. Conclusiones 122 1) La obtención de nuevos tioderivados de tacrina se llevó a cabo de manera exitosa, obteniéndose en la evaluación biológica de los compuestos 3 y 4 excelentes valores como inhibidores selectivos de acetilcolinesterasa en modelos animales empleados comúnmente en este ensayo. De ellos, destacó el compuesto 3, en el cual se observó una elevada actividad como inhibidor de AChE humana, 257 veces más potente que la de la tacrina usada como referencia. 2) Del compuesto 3 se evaluó su actividad como inhibidor de la formación de placas βamiloides, su neurotoxicidad y su capacidad antioxidante, obteniéndose valores muy positivos en dichos ensayos, lo que hace interesante dicho compuesto como potencial fármaco anti-Alzheimer. 3) Los nuevos tioderivados de tacrina 1-4 demostraron además buenos valores de actividad antiproliferativa en las seis líneas celulares tumorales estudiadas. Destacan los compuestos 3 y 4, con valores de antiproliferación mejores que los de fármacos conocidos como el cisplatino o el 5-fluorouracilo. 4) Por otro lado, se sintetizaron de manera exitosa nuevos derivados de tacrina a partir de diferentes derivados de fenoles. Se observó en ellos que la actividad como inhibidores de AChE y BuChE era dependiente de la naturaleza y longitud del espaciador usado, del número de grupos hidroxilos presentes en el fragmento fenólico y de si dichos grupos hidroxilos se encuentran protegidos a no. 5) En esta familia de compuestos, destacaron como buenos inhibidores de colinesterasas aquellos que poseían un espaciador de 8 átomos entre los dos fragmentos farmacóforos. Tienen especial interés la diamina 20, la cual presento excelente actividad como inhibidor de AChE y BuChE humanas, útil para primeras etapas del Alzheimer, y los éteres 24-29 con excelentes valores como inhibidores selectivos de BuChE humana, lo cual resulta útil para etapas más avanzadas de la enfermedad. 6) Atendiendo a la actividad de los compuestos 24-29 anteriormente mencionada, y unida a los ensayos realizados en los mismos de medida de inhibición de formación de placas β-amiloides, destacaron las moléculas 25 y 27. Tras evaluarse en estos dos compuestos su capacidad neuroprotectora, así como su neurotoxicidad y 7. Conclusiones 123 hepatotoxicidad, destacó el compuesto 25 como cabeza de serie, resultando de interés frente al Alzheimer. 7) En cuanto a la síntesis de nuevos derivados O-metilados de tirosol e hidroxitirosol, se llevó a cabo de manera exitosa obteniendo diferentes monómeros y dímeros con valores de actividad antiproliferativa frente a diferentes tipos de cáncer desde moderados hasta muy buenos, destacando las moléculas con calcógenos en su estructura. 8) De entre todos ellos, destacó ampliamente la actividad del selenocianato 39 y del diselenuro 40. En ambos se observaron valores de GI50 mejores a los del cisplatino y 5-FU usados como referencia, situándose los valores obtenidos en el rango nanomolar para los 6 modelos tumorales humanos estudiados (68 nM – 960 nM), no observándose inhibición del crecimiento en células humanas sanas a las concentraciones estudiadas. 9) En lo que se refiere a los nuevos derivados de biotina, se consiguieron sintetizar de manera exitosa una amplia serie de compuestos con diferentes grupos funcionales calcógenos (isotiocianato, tiosemicarbazona, tiourea, tiocianato, disulfuro, selenourea y selenocianato). 10) En dichos derivados de biotina se observó que los que presentaban azufre carecían prácticamente de actividad antiproliferativa frente a diferentes células tumorales estudiadas, mientras que los derivados con selenio presentaban una actividad más marcada. De todos los derivados de biotina y compuestos intermedios sintetizados, destacaron por su actividad antiproliferativa frente a células tumorales los tiocianatos 55, 56 y los selenocianatos 61-64, observándose valores de GI50 para las células tumorales estudiadas desde buenos hasta excelentes, situados estos últimos en el rango nanomolar. Además se observó en todos ellos o ninguna o muy escasa inhibición del crecimiento de células humanas sanas. 11) De esta última familia se tomó como cabeza de serie el compuesto 64, destacando con valores de GI50 en células cancerosas desde 66 nM hasta 13 nM y un valor de GI50>100 µM en fibroblastos humanos (células sanas), lo que se tradujo en índices de selectividad desde valores mayores a 1515 hasta valores mayores a 7692. 124 8. PARTE EXPERIMENTAL 8. Parte experimental - 8.1. Métodos generales 125 8.1. Métodos generales Los reactivos y disolventes usados en el desarrollo experimental de esta Tesis Doctoral proceden de casas comerciales entre las que se encuentran Sigma-Aldrich, TCI o VWR entre otras previamente especificadas. Los espectros de 1H-RMN y 13C-RMN fueron realizados en el Centro de Investigación, Tecnología e Innovación de la Universidad de Sevilla (CITIUS); se han registrado en espectrómetros Bruker Avance-300 (300.1 MHz para 1H y 75.5 MHz para 13C), y Avance-500 (500.1 MHz para 1H y 125.8 para 13C). Se emplearon como disolventes en la preparación de muestras CD3OD, CDCl3, (CD3)2CO y (CD3)2SO. Se utilizó como referencia las señales generada por el TMS, así como las señales características de los mismos disolventes en el espectro. Los espectros de masas también se realizaron en el Centro de Investigación, Tecnología e Innovación (CITIUS). La fuente de ionización empleada fue una fuente de ionización por electrospray y el equipo utilizado fue un QTRAP. La cromatografía de capa fina se utilizó para llevar a cabo el seguimiento cualitativo de las diferentes reacciones llevadas a cabo utilizando láminas de aluminio cubiertas de gel de sílice (E. Merck Sílica Gel 60 F254) de 0.25 mm de espesor. Los diferentes compuestos fueron observados mediante luz UV (λ=254 nm), y mediante revelado en disoluciones de H2SO4 al 10% en EtOH, vainillina al 1% en EtOH con un 1% de H2SO4 (96%), así como ninhidrina al 0.6% en EtOH, ácido fosfomolíbdico al 3% en EtOH, y 4-dimetilaminocinamaldehido al 0.5% en una disolución de HCl (6M) – isopropanol (1:1), y posterior calentamiento. La cromatografía en columna se utilizó para la separación y purificación de los compuestos formados en las diferentes reacciones. Como fase estacionaria se utilizó gel de sílice (tamaño de partícula 0.063–0.200 mm) y como fase móvil las mezclas ciclohexano-AcOEt, CH2Cl2-MeOH, Et2O-ciclohexano, AcOEt-ciclohexano-TEA, CH2Cl2-MeOH-NH3 (28% en H2O) y CH2Cl2-MeOH-AcOH glacial. La polarimetría se empleó para la medida de la rotación óptica específica de los compuestos con quiralidad en un equipo Jasco P-2000. La medida se realizó utilizándose una lámpara de sodio con la que se trabajó a una longitud de onda de 589 nm, 8. Parte experimental - 8.1. Métodos generales 126 empleándose una celda de 0.5 mL de volumen con una longitud de paso de luz de 10 mm y usándose concentraciones entre 6.4 y 11.5 mg/mL empleándose DMSO como disolvente. Los ensayos de inhibición de la acetilcolinesterasa (Electrophorus electricus) y butirilcolinesterasa (suero equino) (ensayo de Ellman), así como la determinación de la actividad antirradicalaria (ensayo de DPPH) y la evaluación de compuestos como miméticos de glutatión peroxidasa, se llevaron a cabo utilizando un espectrofotómetro UV-Visible Hitachi U-2900, y cubetas de poliestireno y de cuarzo de dimensiones 10 x 4 x 45 mm y 10 x 12 x 45 mm (paso de luz de 10 mm). 8.1.1. Ensayo de inhibición de AChE y BuChE en derivados organocalcógenos empleando enzimas modelo de origen animal El ensayo se realizó siguiendo el método de Ellman con pequeñas variaciones.73,74 Se llevó a cabo la preparación de disoluciones de 1.2 mL en cubetas de poliestireno (PS). Como sustrato se emplea acetato de p-nitrofenilo o butirato de p-nitrofenilo (5 concentraciones diferentes, 35-560 µM para AChE y 70-560 µM para BuChE). Para la preparación de las disoluciones de dichos compuestos se preparan primeramente disoluciones metanólicas de los mismos de concentraciones 34.7 mM, de las cuales se diluye 1 mL en H2O hasta obtener un volumen de 25 mL de concentración 1.39 mM, que es la usada en estos ensayos. Además, se usa también un medio tamponado (fosfato 0.1 M, pH = 6.8) en dicho ensayo y disoluciones metanólicas o de DMSO de nuestros derivados de tacrina (2 o 3 concentraciones diferentes y para el control usamos MeOH o DMSO en ausencia de inhibidor), siendo la [MeOH] o [DMSO] del 5% v/v con respecto al 1.2 mL total usado. Adicionados estos componentes a la cubeta, se completa la mezcla con agua destilada hasta un volumen de 1.14 mL y con posterioridad se agregan 60 µL de disolución acuosa de la enzima (AChE de Electroforus electricus y BuChE de suero equino). La disolución de AChE fue preparada de manera que en ausencia de inhibidor en la cubeta con una mayor concentración de acetato de p-nitrofenilo, la variación de la absorbancia a lo largo del tiempo fuera entre 0.1 y 0.15 unidades de absorbancia por 8. Parte experimental - 8.1. Métodos generales 127 minuto. En cuanto a la disolución empleada de BuChE se preparó de la misma manera, empleándose una concentración de 66.5 unidades de enzima/mL. A continuación se representa mediante cuatro tablas las proporciones de cada una de las disoluciones usadas en el presente ensayo, aparenciendo en primer lugar las tablas para la receta del ensayo de inhibición AChE (Tabla 17 y 18) y en segundo lugar las tablas para la receta del ensayo de inhibición de BuChE (Tabla y 19 y 20): Tabla 17. Proporciones de cada componente usadas en ensayo de Ellman con organocalcógenos para el cálculo de KM con AChE V (µL) Cubeta 1 Cubeta 2 Cubeta 3 Cubeta 4 Cubeta 5 Disolución tamponada 600 600 600 600 600 Sustrato 30 60 120 240 480 H2O 451.2 422.4 364.8 249.6 19.2 MeOH/DMSO 58.8 57.6 55.2 50.4 40.8 Enzima 60 60 60 60 60 Tabla 18. Proporciones de cada componente usadas en ensayo de Ellman con organocalcógenos para el cálculo de Ki con AChE V (µL) Cubeta 1 Cubeta 2 Cubeta 3 Cubeta 4 Cubeta 5 Disolución tamponada 600 600 600 600 600 Sustrato 30 60 120 240 480 H2O 451.2 422.4 364.8 249.6 19.2 MeOH/DMSO 28.8 27.6 25.2 20.4 10.8 Inhibidor 30 30 30 30 30 Enzima 60 60 60 60 60 8. Parte experimental - 8.1. Métodos generales 128 Tabla 19. Proporciones de cada componente usadas en ensayo de Ellman con organocalcógenos para el cálculo de KM con BuChE V (µL) Cubeta 1 Cubeta 2 Cubeta 3 Cubeta 4 Cubeta 5 Disolución tamponada 600 600 600 600 600 Sustrato 60 80 120 240 480 H2O 422.4 403.2 364.8 249.6 19.2 MeOH/DMSO 57.6 56.8 55.2 50.4 40.8 Enzima 60 60 60 60 60 Tabla 20. Proporciones de cada componente usadas en ensayo de Ellman con organocalcógenos para el cálculo de Ki con BuChE V (µL) Cubeta 1 Cubeta 2 Cubeta 3 Cubeta 4 Cubeta 5 Disolución tamponada 600 600 600 600 600 Sustrato 60 80 120 240 480 H2O 422.4 403.2 364.8 249.6 19.2 MeOH/DMSO 27.6 26.8 25.2 20.4 10.8 Inhibidor 30 30 30 30 30 Enzima 60 60 60 60 60 Las medidas se realizaron tras adición de enzima y agitación de la disolución a 25ºC, empleándose para ello un Peltier (± 0.1 ºC), y registrándose la formación de pnitrofenolato, que se monitoriza a λ=400 nm durante 175 segundos en intervalos de 25 segundos. Mediante el cálculo de la velocidad (pendiente de la representación de la absorbancia frente al tiempo), se obtienen representaciones de Lineweaver-Burk o de dobles inversos (1/v frente a 1/[S]). Con las mismas se obtuvieron los parámetros KM, vmax, KM’ y vmax’, utilizados para estimar los valores de las constantes de inhibición 8. Parte experimental - 8.1. Métodos generales 129 enzimática de los compuestos analizados. Con la representación de Lineweaver-Burk además se obtiene el tipo de inhibición enzimática producida. Según el tipo de interacción de nuestro inhibidor con la enzima, se pueden dar diferentes tipos de inhibición (Fig. 42): Figura 42. Representación de los posibles equilibrios producidos en una inhibición enzimática 178 Con Kia representamos la constante de inhibición en la interacción del inhibidor con la enzima libre, mientras que con Kib designamos la constante de inhibición de la interacción del inhibidor con el complejo enzima-sustrato. Además, se definen los parámetros de la velocidad máxima (Vmax) y la constante de Michaelis-Menten (KM) como la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción enzimática es la mitad de la velocidad máxima. Según el tipo de interacción dado, tendremos una inhibición competitiva (el inhibidor interacciona con el sitio activo de la enzima formando un complejo enzimainhibidor), incompetitiva (el inhibidor únicamente interacciona con el complejo enzimasustrato formando un complejo inhibidor-enzima-sustrato), mixta (el inhibidor interacciona tanto con la enzima libre como con el complejo enzima-sustrato) o no competitiva (caso especial de inhibición mixta en el que Kia = Kib) (Fig. 43).178 178 . https://www.rose-hulman.edu/~brandt/Chem330/Inhibition_kinetics.pdf Última consulta el 11/1/2020. 8. Parte experimental - 8.1. Métodos generales 136 En dicho ensayo se prepararon disoluciones metanólicas de PhSH (25 mM) y H2O2 (256 mM) y una disolución en MeOH o DMSO de los compuestos estudiados como miméticos de GPx (10 mM), utilizándose en la medida cubetas de cuarzo. Para el control se utilizan 1562 µL de MeOH, 440 µL de disolución de PhSH, 22 µL de disolvente usado para disolver las muestras y 176 µL de disolución de H2O2, y por otro lado para las medidas de las muestras se emplean 1562 µL de MeOH, 440 µL de disolución de PhSH, 22 µL nuestra muestra y 176 µL de disolución de H2O2, El blanco usado estuvo compuesto de 2178 µL de MeOH y 22 µL del disolvente usado para las muestras. El ensayo se realiza midiendo la variación de la absorbancia a 305 nm debido a la variación de la concentración del PhSSPh formado. Con ello se mide la variación de la concentración de PhSH a lo largo del tiempo, utilizándose un intervalor de 180 segundos. Dichas concentraciones se calcularon mediante la siguiente expresión: 179 [PhSH]=co−2A ε1 Usándose un coeficiente de extinción molar para el (PhS)2, denominado ε1, con un valor de 1.24·10-3 M-1 · cm-1.85 Tras la corrección de fondo, se representó la variación de la concentración de PhSH en función del tiempo, obteniéndose mediante dicha representación la velocidad de reacción de la oxidación del PhSH, así como el tiempo de vida media de dicho compuesto. 8.1.7. Ensayo de neurotoxicidad En colaboración con el grupo de investigación de la profesora B. Monti, de la Universidad de Bolonia, se llevó a cabo la medida de la neurotoxicidad de los compuestos cabeza de serie. Para medir la neurotoxicidad se utilizaron neuronas corticales inmortalizadas de ratones Neuro2A (N2A de American Type Culture Collection (ATCC), a través de LGC Standards S.r.l., Sesto San Giovanni, MI, Italia). Dichas células se mantuvieron en medio 179 . G. Mugesh, A. Panda, H.B. Singh, N.S. Punekar, R.J. Butcher. Glutathione peroxidase-like antioxidant activity of diaryl diselenides: a mechanistic study. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 839-850. 8. Parte experimental - 8.1. Métodos generales 137 de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con un 10% de suero bovino fetal, suplementado con L-glutamina 2 mM y 50 unidades/ml de penicilina/estreptomicina. Las condiciones para la incubación de la muestra fueron de 37 ºC y una atmosfera constituida por un 5% de CO2 y un 95% de aire humidificado. Para la medida, las células se colocaron en placas de 96 pocillos con una densidad de 0.1·106 células por pocillo, sometiéndose a diferenciación mediante tratamiento con dibutiril AMPc 1 mM en el medio con un 1% de suero bovino fetal y AMPc a una concentración 1 mM durante 3 días. Para probar la neurotoxicidad, las células N2A diferenciadas se expusieron a cada uno de los compuestos durante 24 h a una concentraciones entre 0 y 50 µM. Se realizó en ensayo de MTT por triplicado. En dicho ensayo se añadió azul de tiazolilo a una concentración de 0.1 mg/mL, incubándose tras esto durante 20 minutos a 37 ºC en oscuridad. Tras esto, el precipitado de MTT se disolvió en una disolución tampón Tris- HCl 0.1 M que contiene 5% de Triton X-100. La medida para cuantificar la supervivencia celular se realizó a 570 nm en un espectrofotómetro de lectura multiple (Bio-Rad Laboratories S.r.l., Segrate, MI, Italia). 8.1.8. Ensayo de hepatotoxicidad Las medidas de hepatotoxicidad de llevaron a cabo en el grupo de investigación de la profesor B. Monti. Para dicho ensayo, se utilizaron células HepG2, cultivadas en medio de Eagle modificado por Dulbecco, con un suplemento de suero fetal bovino (10%) inactivado por calor, con un 1% de penicilina/estreptomicina y glutamina 2 mM. Las células se tripsinizaron durante 5 minutos a 37 ºC, inactivándose posteriormente la tripsina. Las células separadas se recogieron y centrifugaron durante 5 minutos a 300xg, y se resuspendieron para contabilizarlas. Para dicho experimento los hepatocitos se colocaron en placas de 96 pocillos previamente recubiertas con poli-L-lisina a una concentración de 2·104 / 0.2 mL de medio por pozo en ausencia o en presencia del compuesto testado a diferentes concentraciones crecientes (0, 1, 2.5, 5, 10 y 25 µM) en medio sin suero durante 24 horas. Tras esto se realizó el ensayo de viabilidad celular con MTT. 8. Parte experimental - 8.1. Métodos generales 138 8.1.9. Ensayo de neuroprotección Para este ensayo, realizado por el grupo de la profesora B. Monti, la viabilidad neuronal se cuantificó mediante el ensayo de MTT. En dicho ensayo se indujo neurodegeneración mediante privación de K+. En dicho ensayo, los cultivos diferenciados de NGC (neuronas granulares del cerebelo) primarios se mantuvieron en un medio libre de suero con KCl 25 mM (condición de control) o KCl 5 mM (suero con privación de potasio) en presencia de concentraciones crecientes de los compuestos evaluados (0, 1, 2.5, 5, 10 y 25 µM) durante 48 horas, midiendose la capacidad neuroprotectora de estos mediante el ensayo de viabilidad celular con MTT.113, 180 8.1.10. Ensayo de estabilidad en plasma sanguíneo La medida de la estabilidad en plasma fue realizada en colaboración con el grupo de investigación de la profesora B. Monti. En dicho ensayo, se añadieron 5 µL de la disolución madre del compuesto evaluado (210 µM en tampón PBS) a 100 µL de plasma de un voluntario sano para alcanzar la concentración final de inhibidor de 10 µM. Las muestras se incubaron a 37 ºC, bajo agitación suave (300 rpm, Thermomixer Comfort, Eppendorf). A determinados tiempos (0, 60, 180 y 360 min), las proteínas plasmáticas se precipitaron mediante la adición de 400 µL de acetonitrilo helado que contenía propranolol como estándar interno (6.25 µM). Cada punto de tiempo se ensayó por triplicado. Las muestras se centrifugaron a 13000 rcf durante 10 min a 4 ºC, tras lo cual se recogieron 350 µl del líquido sobrenadante y se secó bajo una corriente de nitrógeno. Finalmente, el residuo se resuspendió en 1 ml de H2O/AcCN (65/35, v/v) y se analizó por cromatografía líquida - espectrometría de masas (LC-MS). El análisis cromatográfico se llevó a cabo mediante un equipo Agilent serie 1200 (Walbronn, Alemania) equipada con un inyector automático. Los análisis se realizaron en una columna C18 (Aeris; 150 × 2.1 mm i.d., 3.6 μm; Phenomenex) termostatizada a 60°C en un horno de columna (horno de columna SICO-300, LabService Analytica). Se usó una fase móvil H2O/AcCN/FA, (65/35/0.1, (v/v/v)), un caudal de 0.3 ml/min y el volumen de inyección fue de 5 µL. Los 180 . E. Uliassi, L.E. Peña-Altamira, A.V. Morales, F. Massenzio, S. Petralla, M. Rossi, M. Roberti, L. Martínez González, A. Martínez, B. Monti, M.L. Bolognesi. A focused library of psychotropic analogues with neuroprotective and neuroregenerative potential. ACS Chem. Neurosci. 2019, 10, 279-294. 8. Parte experimental - 8.1. Métodos generales 139 análisis de espectrometría de masas se realizaron en un espectrómetro Q-ToF (Micromass, Manchester, Reino Unido) equipado con una fuente de iones Z-spray. La temperatura de la fuente de ESI se ajustó a 120°C, la temperatura de desolvatación a 280°C, la tensión capilar a 3.0 kV y el voltaje del cono a 35 V. Las adquisiciones de monitorización selectiva de iones (SIM) en polaridad positiva se realizaron a 449 y 260 m/z para el compuesto testado y el patrón interno respectivamente. La relación entre el compuesto testado y el área del pico del patrón interno se representó en función del tiempo para evaluar la estabilidad de nuestro compuesto en plasma. 8.1.11. Estudio de modelización molecular La enzima BuChE complejada con tacrina se obtuvo de Protein Data Bank (código PDB: 4bds). 181 Esta proteína se preparó con el paquete de software MAESTRO. 182 Luego, cada derivado de tacrina se construyó modificando el fragmento de tacrina de la estructura 4bds. Se aplicó una metodología análoga para AChE complejado con inhibidor de tacrina-benzofurano (código PDB: 4w63). 183 Las simulaciones de dinámica molecular se llevaron a cabo utilizando el programa Chem3D. El protocolo de equilibrio consistió en una minimización inicial de mecánica molecular usando el campo de fuerza MM2 (gradiente RMS 0.01), seguido de una minimización que solo movía el derivado de tracrina (10000 pasos) mientras que el sistema se calentó a un volumen constante hasta 300 K. Las interacciones no covalentes entre los derivados de tacrina y los sitios de unión se evaluaron utilizando las coordenadas cristalográficas a nivel de teoría M06-2X / def2- 181 . F. Nachon, E. Carletti, C. Ronco, M. Trovaslet, Y. Nicolet, L. Jean, P.Y. Renard. Crystal structures of human cholinesterases in complex with huprine W and tacrine: elements of specificity for anti- Alzheimer’s drugs targeting acetyl- and butyryl-cholinesterase. Biochem. J. 2013, 453, 393-399. 182 . Maestro, Version 9.1, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2010. 183 . X. Zha, D. Lamba, L. Zhang, Y. Lou, C. Xu, D. Kang, L. Chen, Y. Xu, L. Zhang, A. De Simone, S. Samez, A. Pesaresi, J. Stojan, M.G. Lopez, J. Egea, V. Andrisano, M. Bartolini. Novel tacrine−benzofuran hybrids as potent multitarget-directed ligands for the treatment of Alzheimer’s disease: design, synthesis, biological evaluation, and X‑ray Crystallography. J. Med. Chem. 2016, 59, 114-131. 8. Parte experimental - 8.1. Métodos generales 140 TZVP con el paquete Gaussian 09. 184 Además, la corrección de dispersión de Grimme 185 también se incluyó en Gaussian 09. El error de superposición del conjunto de bases para el cálculo de las energías de interacción se ha corregido utilizando el método de contrapeso 186 como sigue: ΔEint = Esistema - E1 - E2 ΔEcorr = ΔEint - EBSSE Los modelos de los compuestos estudiados fueron completamente optimizados en el mismo nivel de teoría. El análisis de frecuencia se realizó para caracterizar estas estructuras como mínimas (Nimag = 0). Los efectos del disolvente (H2O) se evaluaron durante la optimización aplicando el modelo de polarización continua (PCM) con la variante de formalismo de ecuaciones integrales (IEFPCM). 8.1.12. Ensayo de antiproliferación La medida de la actividad antiproliferativa, llevadas a cabo en colaboración con el profesor J.M. Padrón y su grupo de investigación del Instituto de Bio-Orgánica Antonio González de la Universidad de La Laguna, se realizaron utilizando el protocolo con 184 . M.J. Frisch, G.W. Trucks, H.B. Schlegel, G.E. Scuseria, M.A. Robb, J.R. Cheeseman, G. Scalmani, V. Barone, B. Mennucci, G.A. Petersson, H. Nakatsuji, M. Caricato, X. Li, H.P. Hratchian, A.F. Izmaylov, J. Bloino, G. Zheng, J.L. Sonnenberg, M. Hada, M. Ehara, K. Toyota, R. Fukuda, J. Hasegawa, M. Ishida, T. Nakajima, Y. Honda, O. Kitao, H. Nakai, T. Vreven, J.A. Montgomery Jr., J.E. Peralta, F. Ogliaro, M. Bearpark, J.J. Heyd, E. Brothers, K.N. Kudin, V.N. Staroverov, R. Kobayashi, J. Normand, K. Raghavachari, A. Rendell, J.C. Burant, S.S. Iyengar, J. Tomasi, M. Cossi, N. Rega, J.M. Millam, M. Klene, J.E. Knox, J.B. Cross, V. Bakken, C. Adamo, J. Jaramillo, R. Gomperts, R.E. Stratmann, O. Yazyev, A.J. Austin, R. Cammi, C. Pomelli, J.W. Ochterski, R.L. Martin, K. Morokuma, V.G. Zakrzewski, G.A. Voth, P. Salvador, J.J. Dannenberg, S. Dapprich, A.D. Daniels, €O. Farkas, J.B. Foresman, J.V. Ortiz, J. Cioslowski, D.J. Fox, Gaussian 09 C.01, Gaussian, Inc., Wallingford, CT, 2009. 185 . S. Grimme, J. Antony, S. Ehrlich, H. Krieg. A consistent and accurate ab initio parametrization of density functional dispersion correction (DFT-D) for the 94 elements H-Pu. J. Chem. Phys. 2010, 132, 154104. 186 . S.F. Boys, F. Bernardi, The calculation of small molecular interactions by the differences of separate total energies. Some procedures with reduced errors. Mol. Phys. 1970, 19, 553-566. 8. Parte experimental - 8.1. Métodos generales 141 ligeras modificaciones 187 del Instituto Nacional del Cáncer (INC) de los Estados Unidos 188 contra seis líneas celulares de tumores sólidos humanos (A549, HBL-100, HeLa, SW1573, T-47D y WiDr) y una línea celular no tumoral (BJ-hTert, fibroblastos humanos). Las células se mantuvieron en matraces de cultivo de 25 cm3 en RPMI 1640 suplementado con suero de ternera fetal inactivado por calor al 5% y L-glutamina 2 mM en una incubadora a 37 ºC, 5% de CO2, 95% de aire humidificado. Las células que crecieron exponencialmente se tripsinizaron y se resuspendieron en medio que contenía antibiótico (100 unidades de penicilina G y 0.1 mg de estreptomicina por ml). Posteriormente se contaron las suspensiones de células individuales que mostraban > 97% de viabilidad por exclusión de colorante azul de tripano. Después del conteo, se hicieron diluciones para dar las densidades celulares apropiadas para la inoculación en placas de microtitulación de 96 pocillos. Las células se inocularon en un volumen de 100 µL por pocillo a densidades de 10,000 (A549, HBL-100, HeLa y SW1573), 15000 (T-47D) y 20000 (WiDr) por pocillo, en función de sus tiempos de duplicación. Los compuestos a ensayar se disolvieron en DMSO a una concentración inicial de 40 mM. Las células de control se expusieron a una concentración equivalente de DMSO (0.25% v/v, control negativo). Cada agente se probó por triplicado a diferentes diluciones en el rango de 1-100 µM. El tratamiento farmacológico se inició el día 1. Los tiempos de incubación del fármaco fueron de 48 h, después de lo cual las células se precipitaron con 25 µl de ácido tricloroacético helado (50% p/v) y se mantuvieron durante 60 minutos a 4 ºC. Luego se realizó el ensayo de sulforodamina B (SRB). La densidad óptica (DO) de cada pocillo se midió a 492 nm, utilizando el lector de microplacas de absorción PowerWave XS de BioTek. Se corrigieron los valores con la densidad óptica de fondo de los pocillos que solo contenían medio de cultivo. 187 . P.O. Miranda, J.M. Padron, J.I. Padron, J. Villar, V.S. Martín. Prins-type synthesis and SAR study of cytotoxic alkyl chloro dihydropyrans, ChemMedChem. 2006, 1, 323-329. 188 . P. Skehan, R. Storeng, D. Scudiero, A. Monks, J. McMahon, D. Vistica, J.T. Warren, H. Bokesch, S. Kenney, M.R. Boyd. New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening, J. Natl. Cancer Inst. 1990, 82, 1107-1112. 8. Parte experimental - 8.1. Métodos generales 142 8.1.13. Análisis estadístico Los valores se expresan como el intervalo de confianza, que se calculó para P=0.95 usando la distribución t de Student para los ensayos de inhibición de AChE y BuChE de modelos animales para derivados calcógenos de tacrina y para el ensayo de mimético de GPx. Se empleó el cálculo de la media y la desviación estándar para el resto de ensayos realizados. 8. Parte experimental - 8.2. Síntesis de materias primas 143 8.2. Síntesis de materias primas Tacrina (66) Una disolución del hidrocloruro de tacrina polihidratada comercial (351.4 mg) en una mezcla 1:1 de CH2Cl2-NaOH 1M (60 mL) se deja agitando a temperatura ambiente hasta observar la total disolución del sólido blanco. A continuación se lleva a cabo una separación líquido-líquido, lavando la fase acuosa con CH2Cl2 (2x15 mL). Para terminar, la fase orgánica se concentra hasta sequedad, obteniéndose la tacrina (66) como un sólido blanco. Sólido blanco. Rendimiento: 285.5 mg; Rf = 0.24 (AcOEt-ciclohexano-Et3N (6:4:1)). N-(5-Bromopentil)-1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-amina (67)69 Una mezcla de tacrina (400.3 mg, 2.02 mmol), 1,5-dibromopentano (1.62 g, 0.96 mL, 6.83 mmol, 97% p/p, 3.4 equiv.) y KOH (452.2 mg, 6.85 mmol, 85% p/p, 3.4 equiv.) en acetonitrilo (20 mL) se mantiene a temperatura ambiente con agitación bajo atmosfera de argón durante 23 horas. Tras este tiempo, se concentra hasta sequedad y se realiza una separación líquido-líquido con 30 mL de AcOEt y 30 mL de H2O, seguido con posterioridad de dos extracciones con 30 mL de AcOEt. El conjunto de fases orgánicas se concentra hasta sequedad y el residuo resultante se purifica mediante cromatografía en columna de gel de sílice (ciclohexano → AcOEt-ciclohexano (6:4)). Sirupo amarillo. Rendimiento: 312.8 mg, 45%; Rf = 0.51 (AcOEt-ciclohexano-TEA (6:4:1)). 8. Parte experimental - 8.2. Síntesis de materias primas 144 N-(6-Bromohexil)-1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-amina (68)69 Una mezcla de tacrina (400.6 mg, 2.06 mmol), 1,6-dibromohexano (1.72 g, 1.085 mL, 6.83 mmol, 96% p/p, 3.3 equiv.) y KOH (450.4 mg, 6.82 mmol, 85% p/p, 3.3 equiv.) en acetonitrilo (20 mL) se mantiene a temperatura ambiente con agitación bajo atmosfera de argón durante 22.5 horas. Tras este tiempo, se concentra hasta sequedad la mezcla y se realiza una extracción con 30 mL de AcOEt y 30 mL de H2O, seguido con posterioridad de dos extracciones con 30 mL de AcOEt. El conjunto de fases orgánicas se concentra hasta sequedad y el residuo resultante se purifica mediante cromatografía en columna de gel de sílice (ciclohexano → AcOEt-ciclohexano 6:4). Sirupo amarillo. Rendimiento: 346.4 mg, 47%; Rf = 0.51 (AcOEt-ciclohexano-TEA 6:4:1). 4-(Benciloxi)benzaldehído (80) La síntesis se realizó empleando la metodología de bencilación de aldehídos fenólicos descrita por S.J. Mills et al.97 Una mezcla de 4-hidroxibenzaldehído (495.5 mg, 98% p/p 4.0 mmol), bromuro de bencilo (994 µL, 7.9 mmol, 98% p/p 2.0 equiv.) y K2CO3 (1.71 g, 99% p/p, 12.2 mmol, 3.0 equiv.) en DMF anhidra (15 mL) se calienta a 70 ºC bajo atmosfera inerte (Ar) durante 17.5 horas. La mezcla se filtra para eliminar el K2CO3, y la disolución se concentra hasta sequedad. La mezcla obtenida se purifica mediante cromatografía en columna de gel de sílice (ciclohexano → AcOEt - ciclohexano 1:10). Cera amarilla. Rendimiento: 842.5 mg, 100%. Rf = 0.57 (AcOEt-ciclohexano 1:2) 8. Parte experimental - 8.2. Síntesis de materias primas 145 3,4-Bis(benciloxi)benzaldehído (81) La síntesis se realizó empleando la metodología de bencilación de aldehídos fenólicos descrita por S.J. Mills et al.97 Una mezcla de 3,4-dihidroxibenzaldehído (251.5 mg, 98% p/p, 1.8 mmol), bromuro de bencilo (880 µL, 7.26 mmol, 98% p/p, 4.0 equiv.) y K2CO3 (1.05 g, 7.53 mmol, 99% p/p, 4.1 equiv.) en DMF anhidra se calienta a 70 ºC bajo atmosfera inerte (Ar) durante 21 horas. La mezcla se filtra para eliminar el K2CO3 y la disolución se concentra hasta sequedad. La mezcla obtenida se purifica mediante cromatografía en columna de gel de sílice (ciclohexano → AcOEt-ciclohexano 1:8). Cera amarilla. Rendimiento: 558.4 mg, 98%. Rf = 0.51 (AcOEt-ciclohexano 1:2) 3,4,5-Tris(benciloxi)benzaldehído (82)97 Una mezcla de 3,4,5-trihidroxibenzaldehído (61.3 mg, 98% p/p, 0.39 mmol), bromuro de bencilo (260 µL, 2.14 mmol, 98% p/p, 5.5 equiv.), y K2CO3 (272.7 mg, 1.95 mmol, 99% p/p, 5.0 equiv.) en DMF anhidra se calienta a 80 ºC bajo atmosfera inerte (Ar) durante 21.5. La mezcla se filtra para eliminar el K2CO3 y la disolución se concentra hasta sequedad. La mezcla se purifica en columna cromatográfica de gel de sílice (ciclohexano → AcOEt-ciclohexano 1:8). Cera amarilla. Rendimiento: 126.5 mg, 76%. Rf = 0.32 (AcOEt-ciclohexano 1:6). 9. Espectros de RMN representativos 248 Compuesto 16 1H-RMN (300 MHz, CD3OD) de 16 9. Espectros de RMN representativos 249 13C-RMN DEPT (125.8 MHz, CD3OD) de JRP 16 9. Espectros de RMN representativos 250 HSQC-RMN (300 MHz (1H), 75.5 MHz (13C), CD3OD) de 16 9. Espectros de RMN representativos 251 Compuesto 17 1H-RMN (300 MHz, (CD3)2CO) de 17 9. Espectros de RMN representativos 252 13C-RMN (75.5 MHz, (CD3)2CO) de 17 9. Espectros de RMN representativos 253 Compuesto 18 1H-RMN (300 MHz, MeOD) de 18 9. Espectros de RMN representativos 254 13C-RMN (75.5 MHz, MeOD) de 18 9. Espectros de RMN representativos 255 Compuesto 19 1H-RMN (300 MHz, MeOD) de 19 9. Espectros de RMN representativos 256 13C-RMN (75.5 MHz, MeOD) de 19 9. Espectros de RMN representativos 257 Compuesto 20 1H-RMN (500 MHz, (CD3)2SO) de 20 9. Espectros de RMN representativos 264 Compuesto 23 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) de 23 9. Espectros de RMN representativos 265 13C-RMN (75.5 MHz, CDCl3) de 23 9. Espectros de RMN representativos 266 Compuesto 24 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) de 24 9. Espectros de RMN representativos 267 13C-RMN (75.5 MHz, CDCl3) de 24 9. Espectros de RMN representativos 268 Compuesto 25 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) de 25 9. Espectros de RMN representativos 269 13C-RMN (75.5 MHz, CDCl3) de 25 9. Espectros de RMN representativos 270 Compuesto 26 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) de 26 9. Espectros de RMN representativos 271 13C-RMN (75.5 MHz, CDCl3) de 26 9. Espectros de RMN representativos 272 Compuesto 27 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) de 27 9. Espectros de RMN representativos 273 13C-RMN (75.5 MHz, CDCl3) de 27 9. Espectros de RMN representativos 280 Compuesto 31 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) de 31 9. Espectros de RMN representativos 281 13C-RMN (75.5 MHz, CDCl3) de 31 9. Espectros de RMN representativos 282 Compuesto 32 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) de 32 9. Espectros de RMN representativos 283 Compuesto 33 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) de 33 9. Espectros de RMN representativos 284 13C-RMN (75.5 MHz, CDCl3) de 33 9. Espectros de RMN representativos 285 Compuesto 34 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) de 34 9. Espectros de RMN representativos 286 13C-RMN (75.5 MHz, CDCl3) de 34 9. Espectros de RMN representativos 287 Compuesto 35 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) de 35 9. Espectros de RMN representativos 288 13C-RMN (75.5 MHz, CDCl3) de 35 9. Espectros de RMN representativos 289 Compuesto 36 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) de 36 9. Espectros de RMN representativos 296 13C-RMN (75.5 MHz, (CD3)2SO) de 39 9. Espectros de RMN representativos 297 Compuesto 40 1H-RMN (300 MHz, (CD3)2SO) de 40 9. Espectros de RMN representativos 298 13C-RMN (75.5 MHz, (CD3)2SO) de 40 9. Espectros de RMN representativos 299 Compuesto 41 1H-RMN (300 MHz, (CD3)2SO) de 41 9. Espectros de RMN representativos 300 13C-RMN (75.5 MHz, (CD3)2SO) de 41 9. Espectros de RMN representativos 301 Compuesto 42 1H-RMN (300 MHz, (CD3)2SO) de 42 9. Espectros de RMN representativos 302 13C-RMN (75.5 MHz, (CD3)2SO) de 42 9. Espectros de RMN representativos 303 Compuesto 43 1H-RMN (300 MHz, (CD3)2SO) de 43 9. Espectros de RMN representativos 304 13C-RMN (75.5 MHz, (CD3)2SO) de 43 9. Espectros de RMN representativos 305 Compuesto 44 1H-RMN (300 MHz, (CD3)2SO) de 44 9. Espectros de RMN representativos 312 13C-RMN (75.5 MHz, (CD3)2SO) de 47 9. Espectros de RMN representativos 313 Compuesto 48 1H-RMN (300 MHz, (CD3)2SO) de 48 9. Espectros de RMN representativos 314 13C-RMN (75.5 MHz, (CD3)2SO) de 48 9. Espectros de RMN representativos 315 Compuesto 49 1H-RMN (300 MHz, (CD3)2SO) de 49 9. Espectros de RMN representativos 316 13C-RMN (125.8 MHz, (CD3)2SO) de 49 9. Espectros de RMN representativos 317 Compuesto 50 1H-RMN (300 MHz, (CD3)2SO) de 50 9. Espectros de RMN representativos 318 13C-RMN (75.5 MHz, (CD3)2SO) de 50 9. Espectros de RMN representativos 319 Compuesto 51 1H-RMN (300 MHz, CD3OD) de 51 9. Espectros de RMN representativos 320 13C-RMN (75.5 MHz, CD3OD) de 51 9. Espectros de RMN representativos 321 Compuesto 52 1H-RMN (300 MHz, (CD3)2SO) de 52 9. Espectros de RMN representativos 328 13C-RMN (75.5 MHz, CDCl3) de 55 9. Espectros de RMN representativos 329 Compuesto 56 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) de 56 9. Espectros de RMN representativos 330 13C-RMN (75.5 MHz, CDCl3) de 56 9. Espectros de RMN representativos 331 Compuesto 57 1H-RMN (500 MHz, (CD3)2SO) de 57 9. Espectros de RMN representativos 332 13C-RMN (125.8 MHz, (CD3)2SO) de 57 9. Espectros de RMN representativos 333 Compuesto 58 1H-RMN (300 MHz, (CD3)2SO) de 58 9. Espectros de RMN representativos 334 13C-RMN (75.5 MHz, (CD3)2SO) de 58 9. Espectros de RMN representativos 335 Compuesto 59 1H-RMN (300 MHz, (CD3)2SO) de 59 9. Espectros de RMN representativos 336 13C-RMN (75.5 MHz, (CD3)2SO) de 59 9. Espectros de RMN representativos 337 Compuesto 60 1H-RMN (300 MHz, (CD3)2SO) de 60 9. Espectros de RMN representativos 344 13C-RMN (75.5 MHz, (CD3)2SO) de 63 9. Espectros de RMN representativos 345 Compuesto 64 1H-RMN (300 MHz, (CD3)2SO) de 64 9. Espectros de RMN representativos 346 13C-RMN (75.5 MHz, (CD3)2SO) de 64