Bioaccesibilidad in vitro de carotenoides desde matrices lipofílicas e hidrofílicas. Competitividades y sinergias

CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS Instituto de la Grasa BIOACCESIBILIDAD in vitro DE CAROTENOIDES DESDE MATRICES LIPOFÍLICAS E HIDROFÍLICAS. COMPETITIVIDADES Y SINERGIAS Elisabet Fernández García Sevilla a 23 de Julio de 2010 CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS Instituto de la Grasa BIOACCESIBILIDAD in vitro DE CAROTENOIDES DESDE MATRICES LIPOFÍLICAS E HIDROFÍLICAS. COMPETITIVIDADES Y SINERGIAS Memoria que presenta Lda. Dª. Elisabet Fernández García para optar al Grado de Doctor en Ciencias Químicas dentro del Programa de Doctorado Estudio Avanzados en Alimentos. Departamento de Ingeniería Química Facultad de Química Universidad de Sevilla Sevilla a 23 de Julio de 2010 La Tesis titulada “BIOACCESIBILIDAD in vitro DE CAROTENOIDES DESDE MATRICES LIPOFÍLICAS E HIDROFÍLICAS. COMPETITIVIDADES Y SINERGIAS”, presentada por la Licenciada en CIENCIAS QUÍMICAS Dª ELISABET FERNÁNDEZ GARCÍA para optar al grado de Doctor, ha sido realizada en el Departamento de Biotecnología de Alimentos, del Instituto de la Grasa (CSIC), bajo la dirección de los Doctores D. Antonio Pérez Gálvez y D. Juan Garrido Fernández. Considerando que se han alcanzado los objetivos inicialmente previstos, y que el trabajo reúne los requisitos necesarios, autorizan su presentación. En Sevilla a 23 Julio de 2010 Los directores y el tutor Fdo. Antonio Pérez Gálvez Fdo. Juan Garrido Fernández Fdo. Isabel Mª Vicario Romero ÍNDICE ÍNDICE -i- INTRODUCCIÓN............................................................................................................................................. 3 ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS ....................................................................................................... 9 CAROTENOIDES: ESTRUCTURA .................................................................................................................... 9 CAROTENOIDES: PRESENCIA Y DISTRIBUCIÓN EN LA NATURALEZA ......................................................... 11 CONTENIDO CAROTENOIDE EN ALIMENTOS Y VALORES DE INGESTA MEDIA ............................................. 17 CAROTENOIDES COMO COLORANTES EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA ..................................................... 20 FUNCIONES Y ACCIONES BIOLÓGICAS DE LOS CAROTENOIDES ................................................................. 23 Funciones biológicas ....................................................................................................................... 23 Acciones biológicas ......................................................................................................................... 25 CAROTENOIDES EN EL CONTEXTO DE LA DIETA FUNCIONAL ..................................................................... 34 BIODISPONIBILIDAD DE CAROTENOIDES ..................................................................................................... 37 Digestibilidad: solubilización y micelarización ................................................................................. 39 Asimilación ............................................................................................................................................ 43 BIOACCESIBILIDAD DE CAROTENOIDES DESDE MATRICES HIDROFÍLICAS ................................................. 45 MODELOS DE DIGESTIÓN IN VITRO .............................................................................................................. 46 MODELOS DE ASIMILACIÓN IN VITRO .......................................................................................................... 51 OBJETIVOS ................................................................................................................................................... 59 MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................................................... 63 MATERIAS PRIMAS ...................................................................................................................................... 63 Extractos vegetales concentrados en carotenoides ....................................................................... 63 Emulgentes ........................................................................................................................................... 63 Mantequillas y margarinas.................................................................................................................. 64 REACTIVOS Y DISOLVENTES ....................................................................................................................... 66 DISEÑO EXPERIMENTAL (1) ........................................................................................................................ 67 Definición y cálculo de la eficiencia de la micelarización (EM) ..................................................... 67 Factores implicados en la micelarización de carotenoides en matrices lipofílicas .................... 68 Formulación de la matriz hidrofílica para maximizar la EM de carotenoides.............................. 69 Fase de barrido experimental: detección de factores críticos ................................................................... 70 Optimización de la mezcla de factores críticos ........................................................................................... 70 DISEÑO EXPERIMENTAL (2) ........................................................................................................................ 72 MÉTODOS .................................................................................................................................................... 73 Determinación de la actividad de triacilglicerol acil hidrolasa ....................................................... 73 Determinación de la concentración de proteínas ............................................................................ 73 Determinación de la actividad de sacarasa en vesículas de membrana de borde en cepillo (VMBC) .................................................................................................................................................. 74 Aislamiento de lipoproteínas de alta densidad del suero de oveja .............................................. 74 Determinación de la concentración carotenoide en los extractos vegetales concentrados y materias grasas para untar ................................................................................................................ 75 Elaboración de emulsiones ................................................................................................................ 77 ÍNDICE -ii- Determinación de la concentración carotenoide en emulsiones .................................................. 77 Procedimiento de separación y purificación aplicado a extractos oleosos concentrados de licopeno, luteína libre y  -caroteno ................................................................................................... 77 Preparación de suspensiones Tween carotenoide y de complejos de inclusión  - ciclodextrina:carotenoide .................................................................................................................... 78 Determinación de la concentración carotenoide en suspensiones Tween carotenoide y complejos de inclusión  -ciclodextrina:carotenoide ....................................................................... 78 Proceso de digestión in vitro .............................................................................................................. 79 Separación de la fracción micelar ..................................................................................................... 79 Extracción y cuantificación de carotenoides en la fracción micelar ............................................. 80 Obtención de vesículas de membrana de borde en cepillo (VMBC) ........................................... 83 Proceso de asimilación in vitro e inhibición del transporte de carotenoides mediante lipoproteínas AP1................................................................................................................................. 84 Extracción y cuantificación de carotenoides asimilados por VMBC e inhibidos por apolipoproteínas A1 ............................................................................................................................. 85 Espectrometría de masas ................................................................................................................... 85 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................................................... 91 FACTORES IMPLICADOS EN LA MICELARIZACIÓN DE CAROTENOIDES EN MATRICES LIPOFÍLICAS ............ 92 EFICIENCIA DE LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA SOBRE ÉSTERES DE LUTEÍNA Y SU INCORPORACIÓN MICELAR ................................................................................................................................................................... 113 ESTIMACIÓN DE LA DIGESTIBILIDAD DE -CAROTENO DESDE MATERIAS GRASAS PARA UNTAR. APLICACIÓN DEL MODELO DE DIGESTIÓN IN VITRO .................................................................................. 119 Fitoesteroles ....................................................................................................................................... 123 Fibra ..................................................................................................................................................... 123 Grasa ................................................................................................................................................... 124 ENRIQUECIMIENTO DE LAS MATRICES CON -CAROTENO Y EFECTO EN LA DIGESTIBILIDAD .................. 125 SELECCIÓN Y OPTIMIZACIÓN DE LA COMPOSICIÓN DE UNA EMULSIÓN O/W QUE MAXIMICE LA DIGESTIBILIDAD DE CAROTENOIDES ......................................................................................................... 128 Fase de barrido experimental: detección de factores críticos ..................................................... 129 Optimización de la mezcla de factores críticos ............................................................................. 136 EFICIENCIA DE LA ASIMILACIÓN DE CAROTENOIDES SUMINISTRADOS COMO COMPLEJOS DE INCLUSIÓN CON -CICLODEXTRINA EN UN MODELO IN VITRO. EFECTO DE INHIBIDORES LIPOPROTEICOS ................ 143 CONCLUSIONES ....................................................................................................................................... 165 AGRADECIMIENTOS ................................................................................................................................ 169 BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................................... 173 INTRODUCCIÓN ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -9- ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS Carotenoides: estructura Los pigmentos vegetales se pueden agrupar en cinco grupos: tetrapirroles, carotenoides, compuestos fenólicos, flavonoides, y compuestos N-heterocíclicos. De estos grupos destaca el de carotenoides debido a su amplia presencia y distribución, diversidad estructural y por las funciones y acciones biológicas que desempeñan. Estructuralmente, este grupo de pigmentos naturales se consideran derivados isoprenoides, ya que se generan mediante la ruta anabólica que utiliza como unidad básica a isopentenil pirofosfato (Bach, 1995). El sucesivo ensamblaje de esta unidad da lugar a geranil pirofosfato, farnesil pirofosfato y geranil-geranil pirofosfato. La unión de dos moléculas de geranil-geranil pirofosfato para dar lugar a fitoeno, en un proceso que consta de dos etapas, constituye el primer paso específico en la biosíntesis de carotenoides (Cunningham y Gantt, 1998). Este esqueleto estructural básico de 40 átomos de carbono (Figura 1) puede experimentar varias modificaciones estructurales, siguiendo diferentes rutas biosintéticas que introducen nuevas insaturaciones, ciclan uno o los dos extremos de la cadena, incorporan grupos funcionales oxigenados (hidroxilo, epóxido, ceto) e incluso producen reorganizaciones del grupo cíclico del extremo de la cadena, modificaciones estructurales que dan lugar a la amplia variedad de compuestos carotenoides descritos en la Naturaleza (Figuras 2 y 3). En la estructura carotenoide se distinguen dos zonas bien diferenciadas. La cadena polienoica es la zona más representativa e importante de su estructura. Contiene un total de 22 átomos de carbono con 9 insaturaciones y cuatro grupos metilos laterales. El sistema de dobles y simples enlaces alternados que forma la parte central de la molécula está conjugado y los electrones situados en orbitales enlazantes tipo , están deslocalizados a lo largo de la cadena. Esta disposición convierte a los pigmentos carotenoides en un grupo de componentes peculiares, dando lugar a sus propiedades y comportamiento físico-químico (Britton, 1995). Los grupos colocados en los extremos de la cadena polienoica constituyen otra zona de la molécula. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -10- unidad isoprenoide polimerización enzimática fitoeno desaturación licopeno Figura 1.- Generación del esqueleto estructural básico, fitoeno, mediante la polimerización enzimática de la unidad isoprenoide, y su posterior conversión a licopeno por la introducción de insaturaciones. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -11- Existen 7 grupos diferentes, y para su designación se utiliza una letra del alfabeto griego que aparece como prefijo a la palabra raíz caroteno (Figura 2). Generalmente, estos grupos incluyen grupos funcionales oxigenados cuya presencia distingue a las xantofilas de los carotenos (hidrocarburos exclusivamente). También es posible encontrar carotenoides con un número superior a 40 átomos de carbono (homo-carotenoides) o con un número inferior (apocarotenoides si se han eliminado de los extremos, o nor-carotenoides si se han eliminado de la cadena). Todas estas particularidades y posibles combinaciones estructurales son el origen de la afirmación con la que comienza el siguiente apartado. Carotenoides: presencia y distribución en la Naturaleza De todos los pigmentos naturales, los carotenoides son los más ampliamente distribuidos y por el conjunto de funciones y acciones que realizan, los más importantes. Este grupo de compuestos, hidrocarburos (carotenos) y sus derivados oxigenados (xantofilas), son esenciales en la fotosíntesis oxigénica y también están implicados en la prevención o protección contra enfermedades coronarias y cáncer (Ames, 1983; Malone, 1991; Britton, 1995). Estas funciones no resultan tan obvias como sus colores, por los cuales los carotenoides son tan llamativos. El rango de colores de estos pigmentos va desde el rojo hasta el amarillo, y cuando se acomplejan con proteínas producen coloraciones verdes y azules. De esta forma una gran variedad de organismos debe su color principalmente a los carotenoides. Se pueden encontrar en todos los filos tanto del reino vegetal como animal aunque son únicamente sintetizados de novo en las plantas superiores y por organismos procariotas. La presencia de carotenoides en los animales se debe exclusivamente a su incorporación por la dieta, ya que no pueden sintetizarlos de novo, hecho de especial trascendencia si se tiene en cuenta que algunos carotenoides muestran actividad de provitamina A (Pfander, 1992). ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -12- H H H a b c H H H a b c H H H a b c H H H a b c Ha R R anillo tipo  R anillo tipo  anillo tipo  Hb Hc R grupo ψ R R R R R R R R anillo tipo  anillo tipo  anillo tipo  Figura 2.- Configuración de los diferentes grupos presentes a ambos lados de la cadena polienoica para conformar la estructura de carotenoides C40. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -13- OH OH OH OH O O licopeno OH OH 1 1, 2 -caroteno zeaxanteno violaxanteno -caroteno luteína 3 3 4 5 Figura 3.- Generación de diferentes carotenos y xantofilas a partir de licopeno, mediante la participación de enzimas -ciclasa (1), -ciclasa (2), hidroxilasa (3), epoxidasa (4), de-epoxidasa (5). ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -14- A pesar de su amplia distribución, y de que se han descrito más de 700 pigmentos carotenoides diferentes, lo normal es encontrar una mezcla común, más o menos compleja, de algunos de ellos. En los cloroplastos de las plantas superiores, la mezcla de pigmentos estaría formada generalmente, por - y -caroteno, -criptoxanteno, zeaxanteno, luteína, violaxanteno y neoxanteno. Algunos pigmentos menos frecuentes como rodoxanteno, y semi--carotenona se han descrito en los cloroplastos de las hojas de algunos miembros de las cupresáceas y taxáceas (Goodwin y Britton, 1988). Se encuentran también en diversos frutos, siendo los responsables de su color, de composición cualitativa simple o compleja. Así, el tomate (Lycopersicon esculentum) debe su color rojo a licopeno que constituye el 90% de su composición total carotenoide, mientras que el fruto del pimiento (Capsicum annuum L.) contiene una mezcla más compleja, con 8 carotenoides, siendo capsanteno el pigmento mayoritario. Otros frutos como la piña (Ananas comosus L.) contiene hasta 21 pigmentos incluyendo isómeros, con violaxanteno, luteoxanteno, neoxanteno y -caroteno como pigmentos mayoritarios. La naranja (Citrus sinensis L.) también tiene un amplio perfil carotenoide con luteoxanteno y auroxanteno como pigmentos más representativos (Gross, 1987). En los tejidos reproductivos de las plantas superiores es posible encontrar pigmentos carotenoides muy específicos como lilixanteno en especies de lirio, o crocetina en especies de crocus. Hasta 40 pigmentos se han encontrado en los pétalos de flores, muchas veces en forma de isómeros cis. Eschscholxanteno es un ejemplo de un carotenoide específico, en este caso de la amapola californiana. Resulta habitual que las xantofilas presentes en frutos y vegetales no estén en sus formas libres sino esterificadas por ácidos grasos. Este hecho se puso de manifiesto por Kuhn y Winterstein en 1930 al aislar ésteres de luteína de los pétalos del girasol (Helianthus annuus). La ruta y mecanismos que conducen a la esterificación de xantofilas no están establecidos, aunque se asume la participación de la enzima acil-CoA a pesar de que no se han realizado estudios detallados sobre este tema. Con la esterificación, el sistema metabólico de la planta consigue aumentar la liposolubilidad de las xantofilas, lo que se asocia con distintos propósitos. Primero, el proceso de esterificación coincide con la senescencia del vegetal y maduración de ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -15- sus frutos (Goodwin, 1980). En segundo lugar, puesto que las enzimas que metabolizan la síntesis de nuevos carotenoides están asociadas a la membrana de los plastoglóbulos, el transporte de compuestos intermedios resulta más fácil si éstos están esterificados (Yamamoto y Higashi, 1978; Spurgeon y colaboradores, 1979). Finalmente, la mayor liposolubilidad de los ésteres promueve su acumulación en plastoglóbulos ricos en triglicéridos lo que incrementa la intensidad colorante del tejido y aumenta el atractivo de la flor o el fruto acentuando las posibilidades de diseminación de su polen y semillas (Britton, 1998). Se pueden encontrar varios estudios sobre la presencia de ésteres de xantofilas en alimentos (Khachik y Beecher, 1988; Breithaupt y Schwack, 2000; Breithaupt y colaboradores, 2002a; Mezadri y colaboradores, 2005). Incluso se podrían distinguir alimentos naturales con un perfil de xantofilas libre, o esterificado. Ejemplos de frutas y verduras cuyo contenido en xantofilas está esterificado serían la piña (Ananas comosus L.), albaricoque (Prunus armeniaca L.), aguacate (Persea americana Mill.), variedades de pimiento dulce y picante (Capsicum frutescens L.; Capsicum annuum L.), naranja clementina (Citrus reticulata Blanco), mango (Mangifera indica L.), naranja (Citrus sinensis Pers.), papaya (Carica papaya L.), melocotón (Prunus persica L.), patata (Solanum tuberosum L.), y calabaza (Cucurbita pepo L.). Entre las frutas y verduras de contenido en xantofilas libre destacan el plátano (Musa  paradisiaca L.), brócoli (Brassica oleracea L.), zanahoria (Daucus carota L.), maíz (Zea mays L.), limón (Citrus limon L.), espinaca (Spinacea oleracea L.), y tomate. La presencia de ésteres de xantofilas en nuestra dieta resulta pues importante lo que incrementa el interés sobre el estudio del efecto de la esterificación en la absorción de xantofilas. Al contrario de lo que sucede en los cloroplastos de las plantas superiores, en los de las algas se presentan en mezclas complejas, que tienden a ser características de cada clase. La excepción es la clase clorofita, cuyos miembros tienden a acumular los mismos pigmentos que las plantas superiores pero con la inclusión de algunos muy específicos como el sifonaxanteno presente en varias caulerpales. Los carotenoides sintetizados por bacterias fotosintéticas se caracterizan por ser acíclicos con grupos hidroxilo terciarios frecuentemente metilados en las posiciones C1 y C1', como por ejemplo el espirilloxanteno. En el caso de las bacterias no fotosintéticas la aparición ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -16- de carotenoides es esporádica destacando la síntesis de carotenoides con más de 40 carbonos en flavobacterias y de menos de 40 en algunos estafilococos. En los hongos, la síntesis de pigmentos suele ser muy caprichosa, aunque se destaca ficomicetes por la síntesis predominante de -caroteno. No es habitual la presencia de xantofilas estructuralmente similares a las sintetizadas por las plantas superiores (Goodwin, 1992). En los animales, como se ha comentado anteriormente, es posible encontrar carotenoides en diversos tejidos, cuya procedencia es la dieta. Existen tanto en forma inalterada, como oxidados o reducidos. Hasta hace poco la ruta oxidativa era la única que explicaba la amplia distribución de carotenoides oxigenados en animales marinos. Sin embargo es posible que en pescado, pollo y otros animales, pigmentos como astaxanteno y cantaxanteno puedan ser reducidos, previa transformación en derivados hidroxilados, a - caroteno. Esta hipótesis explicaría cómo obtienen los animales marinos una fuente de vitamina A, pues acumulan grandes cantidades de ceto-carotenoides (que no tienen actividad de provitamina A) pero no -caroteno como tal, que sí es precursor de vitamina A. La asociación de pigmentos carotenoides y proteínas origina el color azul oscuro del caparazón del cangrejo y el rojo de los huevos de pomácea. Los pigmentos verdes del exoesqueleto del cangrejo de río turco son resultado de la coexistencia de carotenoproteínas verdes y amarillas. La coloración de las plumas de diversos pájaros como el flamenco, el verderón, el jilguero, se debe a la presencia de pigmentos carotenoides (Stradi y colaboradores, 1995). En el plasma humano se ha descrito la presencia de hasta 14 carotenoides entre ellos, - y -caroteno, licopeno,- criptoxanteno, zeaxanteno y luteína, astaxanteno y cantaxanteno (Krinsky y colaboradores, 1958; Ohmacht y colaboradores, 1987). Zeaxanteno y luteína son los pigmentos mayoritarios en la retina del ojo humano (Handelman y colaboradores, 1988). ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -17- Contenido carotenoide en alimentos y valores de ingesta media A pesar de que el número de carotenoides descritos en la Naturaleza alcanza una cifra superior a 700, no todas las fuentes naturales que los contienen están presentes en nuestra dieta habitual. Se estima que sólo tenemos acceso a unos 40 carotenoides, que pueden ser absorbidos, metabolizados y/o utilizados en nuestro organismo. El número se reduce a 5 si consideramos el perfil carotenoide que generalmente se detecta en el plasma sanguíneo humano. Este grupo incluye - y -caroteno, licopeno, -criptoxanteno, y luteína, presentes de forma habitual en los alimentos que se exponen en la Tabla 1. El contenido carotenoide en los alimentos reflejados en dicha tabla y en otros se puede consultar en bases de datos elaboradas a tal efecto. La base de datos de Mangels y colaboradores, publicada en 1993, sólo incluía a frutas y vegetales como alimentos proveedores de carotenoides. Posteriormente, se elaboró una nueva base de datos que también incluía otros alimentos como aceites vegetales, mantequilla, huevos, quesos, y otros productos elaborados a base de vegetales (pizzas, ensaladas, etc.) publicada por Holden y colaboradores en 1999. Evalúa hasta 200 referencias sobre el contenido carotenoide de 215 alimentos, tabulando el contenido medio y desviación estándar así como el número de estudios realizados por cada alimento. Está disponible en la siguiente dirección, www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp. Uno de los principales usos de esta base de datos es la estimación del aporte de provitamina A que suministra una determinada ingesta. La actividad de provitamina A y la posterior conversión a retinol en nuestro organismo es la principal función que desempeñan los carotenoides, entre otras, como se detalla más adelante. Otra base de datos sobre el contenido medio de carotenoides en alimentos es la que ofrece el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA Agricultural Research Service, 2005). En la lista de nutrientes incluidos en esta base de datos, que se puede consultar en la siguiente dirección, www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp/Data/SR18/nutrlist/sr18list.html, se incluyen datos sobre - y -caroteno, licopeno, -criptoxanteno, zeaxanteno y luteína. A pesar de la correlación entre un alto contenido de carotenoides en plasma, que proceden exclusivamente de la ingesta de alimentos ricos en carotenoides, y un menor riesgo a ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -18- desarrollar procesos degenerativos severos, no se han establecido niveles de ingesta adecuados de estos componentes, ya que el efecto positivo en la salud se puede deber a otros constituyentes que acompañan a los carotenoides en la ingesta. Ni las acciones biológicas que estos compuestos pueden realizar en nuestro organismo en beneficio para la salud (capacidad antioxidante, potenciación del sistema inmune, incremento de la comunicación intercelular) ni el hecho de que algunos de ellos muestren actividad de provitamina A, han sido razones suficientes para establecer, de momento, una recomendación sobre la cantidad apropiada de carotenoides a ingerir. Sin embargo, sí se pueden establecer valores habituales de ingesta de carotenoides, que podrían asociarse con un menor riesgo a desarrollar procesos degenerativos (cáncer, enfermedades cardiovasculares, etc.), utilizando datos de los estudios epidemiológicos realizados sobre el consumo de frutas y vegetales y su efecto en la salud. Aún así, existen discrepancias en el valor medio de ingesta, según las referencias consultadas. De esta forma, los individuos que siguen una dieta rica en ese tipo de alimentos, ingieren aproximadamente 6 mg/día según los estudios de Lachance (1997) o el publicado en la guía Health Canada (1997). Sin embargo, el estudio publicado por el WCRF/AICR (1997) eleva el valor de ingesta media a 9-18 mg/día. Por los estudios de intervención realizados con dietas de contenido controlado en carotenoides se sugiere que una ingesta de 3 a 6 mg/día de carotenoides es suficiente para mantener los niveles en plasma de estos componentes (Micozzi y colaboradores, 1992; Yong y colaboradores, 1994; Zino y colaboradores, 1997). ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -25- Acciones biológicas Una de las primeras acciones descritas fue la caracterización de los carotenoides como quenchers muy eficaces de oxígeno singulete (Foote y Denny, 1968). El mecanismo se basa en un proceso físico por el cual, el exceso energético de la molécula de oxígeno es absorbido por el pigmento, devolviendo a la molécula de oxígeno a su estado energético basal. El pigmento, dispersa térmicamente el exceso energético adquirido, sin provocar daños a otras moléculas vecinas. La reiteración de este proceso termina destruyendo al pigmento mediante reacciones químicas que implican la adición del oxígeno singulete a la estructura del carotenoide dando lugar a endoperóxidos y derivados carbonílicos. Aunque una sola molécula de -caroteno puede desactivar a 1000 moléculas de oxígeno singulete antes de ser oxidado, dicha oxidación irreversible tiene lugar, lo que pone límites a la efectividad como quencher del pigmento (Liebler, 1993). No obstante, el efecto positivo de la acción queda fuera de dudas y existe un enorme interés en el desarrollo de compuestos químicos de síntesis en los que se combinen la excelente eficiencia de los carotenoides como quenchers con la habilidad de los flavonoides de estabilizar a los radicales intermedios formados en este proceso. Es posible sintetizar componentes que resultan de la fusión de esos dos grupos de constituyentes originando carotenilflavonoides que presentan una mayor capacidad quencher y mejor estabilidad, con aplicaciones potenciales en cremas solares (Beutner y colaboradores, 2007). Posiblemente, ninguna otra acción biológica de los carotenoides suscite mayor interés y controversia que la actividad/capacidad antioxidante. Para aclarar el concepto y dónde pueden surgir las dudas sobre la eficiencia de carotenoides como antioxidantes, se debe distinguir la actividad antioxidante, asociada a procesos oxidativos in vitro o formalmente químicos, de la capacidad antioxidante, asociada a procesos oxidativos in vivo que implica realmente una acción biológica. El término actividad antioxidante se define como la constante de velocidad de la reacción entre un antioxidante y un radical libre. Este concepto se correlaciona con el proceso químico de reacción del par antioxidante/radical, la estructura de ambas sustancias y el mecanismo o mecanismos de reacción que tienen lugar. Los antioxidantes pueden reaccionar con los radicales principalmente mediante dos mecanismos, abstracción de hidrógeno, o transferencia ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -26- electrónica, cesión que se realiza en ambos casos desde la especie antioxidante al radical. Los dos mecanismos pueden transcurrir en paralelo y el proceso dominante dependerá de la estructura del antioxidante y de las características del entorno de reacción, así como de la especie radicalaria. Los métodos de determinación de la actividad antioxidante se pueden basar en uno u otro mecanismo, o incluso en ambos. Para los carotenoides, los métodos de determinación de actividad antioxidante generalmente aplicados son el método de Terao (1989) y el método TRAP (Bartosz y colaboradores, 1998), métodos que utilizan radicales que reproducen los procesos de auto-oxidación lipídica. Los carotenoides muestran actividad antioxidante frente a radicales lipofílicos, que son especies reactivas de oxígeno (EROS) producidas durante la oxidación de lípidos. Cada pigmento carotenoide presentará una actividad antioxidante diferente en función de sus peculiaridades estructurales, que le permitirán reaccionar según alguno de los dos mecanismos de reacción posibles, transferencia electrónica, abstracción de hidrógeno, y un tercer proceso denominado reacciones de adición. En el primer proceso, radicales como el triclorometil peroxilo (un radical que causa toxicidad en el hígado) y el radical dióxido de nitrógeno (un radical procedente del humo del tabaco) convierten a los carotenoides en radicales catiónicos que pueden reaccionar con sustratos biológicos y producir daño oxidativo (Everett y colaboradores, 1996; Miller y colaboradores, 1996). Este proceso tiene lugar, preferentemente, cuando el potencial redox del radical es lo suficientemente alto para producir la transferencia electrónica (Everett y colaboradores, 1996). En el caso de radicales formados durante los procesos de auto-oxidación lipídica la transferencia electrónica no es el mecanismo de reacción sino que ésta transcurre mediante la abstracción de hidrógeno y un tercer proceso, la adición radicalaria en la cadena polienoica. El proceso de adición implica que la oxidación tiene lugar mediante la doble adición de las especies radicalarias a la cadena polienoica, lo que genera un aducto bis-peroxilo que puede experimentar un proceso de rotura heterolítica u homolítica (Liebler, 1993; Ríos y colaboradores, 2008). En el proceso heterolítico no se regeneran radicales, mientras que la rotura homolítica produce dos nuevas especies reactivas lo que implica un proceso autooxidativo. Si la adición se produce en el anillo se genera el correspondiente epóxido 5,6 y un ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -27- radical lo que supone de nuevo un proceso auto-oxidativo. El otro proceso de reacción es el mecanismo de abstracción de hidrógeno que afecta a los átomos en posiciones alílicas a un doble enlace y por tanto más susceptibles de ser abstraídos por radicales peroxilo. Este proceso genera una especie reactiva que continúa la cadena de propagación radicalaria. Aunque los mecanismos de reacción sean comunes la velocidad a la que transcurren está determinada por la presencia de grupos funcionales por lo que las características estructurales de cada carotenoide condicionarán su oxidación y por tanto la actividad antioxidante que presenta. En concreto resulta clave el radical intermedio caroteno-peroxilo, cuya estabilización por deslocalización electrónica es distinta en función de los grupos funcionales que se sitúan en los extremos de la cadena polienoica. Además dichos grupos pueden impedir el transcurso oxidativo a través de alguno de los mecanismos de reacción comentados y por tanto disminuir la tendencia a la auto-oxidación (Liebler, 1993; Pérez-Gálvez y Mínguez-Mosquera, 2002). En la Figura 4 se reproducen los mecanismos de reacción comentados anteriormente. Se puede observar cómo la posibilidad de que durante el desarrollo del proceso antioxidante, el compuesto carotenoide produzca nuevas especies radicalarias que incrementen el potencial oxidativo del entorno. Cuando la generación de especies radicalarias supera a la velocidad con que el antioxidante las elimina, se produce la auto-oxidación del mismo. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -28- Figura 4.- Mecanismos de reacción de carotenoides con radicales libres. Procesos de auto-oxidación generados y efecto que produce la reacción en su entorno. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -29- El concepto actividad antioxidante está más asociado a los procesos formalmente químicos que ocurren en la reacción del par antioxidante/radical. No cabe duda que las propiedades de estos procesos repercuten en la capacidad antioxidante, que es el segundo concepto a definir. Ésta se define como la cantidad de especies radicalarias que es eliminada o neutralizada del medio de reacción, por la acción de una determinada cantidad de antioxidante. Este concepto es el que se aplica a la acción de antioxidantes en tejidos y muestras biológicas como plasma, epitelio, cultivos celulares, etc. Los métodos de medida de capacidad antioxidante que se han aplicado a carotenoides son el método TEAC (Re y colaboradores, 1999), el método DPPH (Brand-Williams y colaboradores, 1995) y el método de oxidación ex vivo de lipo-proteínas de baja densidad (LDL). Estas medidas constituyen una aproximación (más o menos realista) a la capacidad antioxidante de carotenoides, su principal acción biológica. En los sistemas biológicos, los lípidos constituyen gran parte de la membrana celular y de otras estructuras subcelulares. La oxidación lipídica tiene consecuencias negativas en la funcionalidad de la membrana y su integridad. Puesto que los carotenoides se alojan en esas mismas estructuras van a cortar la cadena de propagación radicalaria generada por la oxidación lipídica, por lo que estos compuestos, junto con los tocoferoles son denominados antioxidantes de membrana. El efecto antioxidante de carotenoides in vivo se observa en LDL y membranas celulares donde ejercen su capacidad mediante los mecanismos de reacción anteriormente mencionados (Ringer y colaboradores, 1991). El hecho de que los carotenoides ejerzan esta capacidad en los sistemas biológicos es el principal apoyo a la teoría antioxidante sobre una ingesta elevada en alimentos ricos en carotenoides y un menor riesgo a desarrollar procesos degenerativos. Y aquí es donde surge la controversia, puesto que no todos los estudios de intervención apoyan esta hipótesis. Muchos de estos estudios arrojan resultados inconsistentes (Krinsky, 1994; Rock y colaboradores, 1996) debido al concurso de varios factores que determinan la falta de correlación. Algunos factores a mencionar son los niveles de asimilación de los antioxidantes presentes en la dieta, es decir, qué proporción de lo ingerido es asimilado y por tanto biodisponible, su posible biotransformación en otros compuestos de menor eficiencia antioxidante o la generación de nuevos radicales libres, tal y como se ha indicado en la exposición del concepto actividad antioxidante, la cantidad que se deposita en el tejido donde ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -30- va a desarrollar su acción, y el marcador de estrés oxidativo utilizado para determinar la correlación. La conjunción de estos factores propicia que se puedan encontrar resultados que apoyan la correlación (Upritchard y colaboradores, 2003) o todo lo contrario (Alpha tocopherol, beta carotene cancer prevention study group, 1994; Omenn y colaboradores, 1996). Como se ha mencionado anteriormente, la mayoría de los estudios epidemiológicos indican que el consumo de alimentos ricos en carotenoides está correlacionado con un menor riesgo a desarrollar procesos degenerativos, entre los que se encuentran algunos tipos de cáncer. La implicación de los carotenoides en limitar la aparición de esta enfermedad deriva de su interacción con tres marcadores biológicos relacionados con el cáncer: estrés oxidativo radicalario, actividad del sistema inmune, y modulación de la comunicación intercelular (Figura 5). Si la iniciación y progresión de procesos cancerosos está relacionada con la presencia de radicales libres, resulta lógico suponer que la incorporación de antioxidantes como los carotenoides a nuestro organismo contribuirá positivamente a disminuir las posibilidades de aparición de este proceso degenerativo. Existen evidencias acerca de la implicación de radicales libres en la iniciación y progresión de la carcinogénesis. Las EROS actúan directamente como mutágenos al oxidar las bases del ADN y también son capaces de activar pre-carcinógenos convirtiéndolos en compuestos reactivos que modifican el ADN (Marnett, 1987). El descenso continuado en la defensa antioxidante que provoca la actividad de la EROS es otra evidencia de su implicación en la carcinogénesis ya que este efecto también ocurre por la actividad de auténticos carcinógenos (Cerutti, 1985; Kensler y Taffe, 1986). Consecuentemente, si los carotenoides intervienen como antioxidantes frenando la actividad de EROS, su acción puede disminuir el riesgo a desarrollar cáncer (Malone, 1991; Byers y Perry, 1992; Voorrips y colaboradores, 2000; Holick y colaboradores, 2002). ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -31- Figura 5.- Procesos degenerativos derivados de la actividad de radicales libres paliados por la bioactividad de compuestos antioxidantes como los carotenoides y otros posibles mecanismos de control. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -32- De la capacidad antioxidante de carotenoides también resulta otro efecto beneficioso, la potenciación del sistema inmune. La radiación ultravioleta (UV) produce un incremento en la concentración de radicales libres que deteriora el sistema inmunológico, por lo que la intervención de antioxidantes naturales limita el efecto negativo y retrasa la aparición de marcadores sensibles a la disminución del sistema inmunológico. Los estudios de Fuller y colaboradores (1992) y Herraiz y colaboradores (1998) muestran el efecto de la ingesta de suplementos de -caroteno en el sistema inmune de personas sometidas a radiación UV. El efecto positivo observado, resultado de un proceso antioxidante, se incrementa cuantitativamente en personas de mayor edad. Pero los carotenoides pueden modificar la función del sistema inmune mediante mecanismos no antioxidantes lo cual también tiene su trascendencia positiva, en el riesgo a desarrollar cáncer, debido al rol esencial que cumple el sistema inmunológico en la prevención de este proceso degenerativo. Se ha demostrado que la ingesta de suplementos de -caroteno incrementa la actividad de células tipo NK, naturalkillers, que reducen la posibilidad de formación de tumores (Santos y colaboradores, 1996). En este caso el mecanismo por el que -caroteno modula la actividad celular no se conoce. También se ha sugerido que la regulación de la biosíntesis de la prostaglandina E2, reconocido inmuno-supresor, se debe a la intervención de -caroteno en la potenciación del sistema inmune (Halevy y Sklan, 1987). Se puede observar que la mayoría de los estudios realizados se centran exclusivamente en -caroteno. La experimentación con otros carotenoides y su efecto en la función inmune son muy escasas y no han arrojado resultados concluyentes ni positivos (Hughes y colaboradores, 2000). La mejora de la comunicación intercelular es el tercer marcador que correlaciona inversamente la concentración plasmática de carotenoides con la progresión del cáncer. En este caso el mecanismo de acción no se basa en la acción antioxidante ya que en diversos estudios realizados sobre el efecto inhibidor de carotenoides en la proliferación de células neoplásicas no se encontró correlación entre ese efecto y la capacidad antioxidante. De hecho, la adición de otros antioxidantes de membrana como -tocoferol no mostró efecto inhibidor alguno lo que parece corroborar la presencia de un mecanismo de acción diferente. En este ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -33- caso el mecanismo de acción está ligado a la capacidad de los carotenoides de aumentar, o restablecer, la comunicación intercelular que tiene lugar a través de canales o poros denominados conexones. A través de estos poros las células intercambian diversas moléculas señalizadoras, entre ellas agentes antiproliferativos. En las células cancerosas la comunicación intercelular está interrumpida debido a que la expresión génica de la proteína que forma parte estructural de esos poros o canales de comunicación, la conexina 43, está disminuida. A consecuencia de ello las células cancerosas se comunican poco con las células normales que la rodean, por lo que no reciben información de su entorno, lo que supone la pérdida de control de la proliferación sobre las células transformadas (Loewenstein, 1979). Por el contrario, si se restablece la comunicación intercelular entre las células normales y las cancerosas, se tendría la oportunidad de frenar su proliferación. En varios estudios se ha demostrado que los carotenoides incrementan la expresión del gen que codifica la conexina 43, lo que aumenta la comunicación intercelular con el tejido sano y disminuye la proliferación de células transformadas. El mecanismo de regulación de la expresión génica por mediación de los carotenoides se desconoce. La hipótesis más extendida es que los carotenoides, y particularmente algunos productos de su metabolismo, son capaces de activar una serie de receptores nucleares (RAR- y RXR-) que activan la expresión génica. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -34- Carotenoides en el contexto de la dieta funcional Existe una gran variedad de evidencias epidemiológicas sobre el efecto protector de la ingesta de frutas y vegetales frente a varios procesos degenerativos a partir de los estudios realizados en diversas poblaciones, que presentan preferencias diferentes por varios tipos de frutas y vegetales (Gramenzi y colaboradores, 1990; Hertog y colaboradores, 1993; Knekt y colaboradores, 1994; Key y colaboradores, 1996; Law y Morris, 1998; Fung y colaboradores, 2001; Hirvonen y colaboradores, 2001; Joshipura y colaboradores, 2001; Sasazuki, 2001). Estas circunstancias han conducido a los organismos de salud pública a realizar campañas de promoción para incrementar el consumo de estos alimentos, siendo la más conocida de todas la campaña five-a-day, cinco-al-día, cuya promoción en España se puede consultar en la página www.5aldia.com. Al incrementar el consumo de frutas y vegetales se consigue aumentar la ingesta diaria de componentes que caracterizan a este tipo de alimentos como vitaminas hidro- y liposolubles, fibra y fitoquímicos (carotenoides, glucosinolatos, fenoles y clorofilas), que son los que producen el efecto beneficioso en la salud. El fundamento científico de este objetivo está, aparte de los estudios epidemiológicos citados anteriormente, en las conclusiones de algunas publicaciones que hacen referencia al efecto beneficioso de alguno de aquellos componentes. Concretamente, el interés en incrementar el consumo de carotenoides, y por ende de los alimentos que los contienen, aparece desde la publicación en el año 1981 del trabajo de Peto y colaboradores, sobre la posibilidad de que -caroteno disminuyera la incidencia de algunos tipos de cáncer. Estas campañas de promoción han logrado concienciar al consumidor de que a través de la alimentación se puede mejorar o incrementar las expectativas de una vida saludable lo que ha tenido un impacto positivo en el consumo de frutas y vegetales. Así, desde la década de los 70 el incremento en el consumo de estos alimentos ha sido continuado pasando de una media de 2 a 3 raciones a la media actual de 5. En algunos países ya se está lanzando la nueva versión de la campaña cinco-al-día, con el lema fruits and veggies – more matters, www.fruitsandveggiesmorematters.org, que incluye la promoción del consumo de frutos secos. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -41- Figura 6.- Representación de las etapas de bioaccesibilidad (solubilización, micelarización y asimilación) de compuestos lipídicos en el epitelio intestinal. micela mixta ASIMILACIÓN Transporte hasta la membrana del enterocito 1. Re-acilación de monoglicéridos. 2. Re-acilación de colesterol y retinol. 3. Ensamblaje en quilomicrones. Difusión simple 1. Liberación desde la matriz alimentaria. 2. Hidrólisis enzimática (lipasas pancreáticas, colesterol esterasa). 3. Interacción con sales biliares y formación de micelas mixtas Quilomicrones Difusión facilitada SOLUBILIZACIÓN MICELARIZACIÓN Transporte hacia el hígado por el sistema linfático ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -42- Una particularidad estructural que puede alterar la liposolubilidad y, por tanto, la eficiencia de esta fase es la esterificación de xantofilas con ácidos grasos. Esta particularidad no ha sido considerada ampliamente en los estudios de bioaccesibilidad aunque las xantofilas que ingerimos estén habitualmente esterificadas. Este hecho va a aumentar la liposolubilidad en comparación con la correspondiente xantofila libre e incluso con carotenos, lo que puede disminuir la eficiencia del proceso de micelarización como se ha sugerido en algunos estudios post-prandiales (Roodenburg y colaboradores, 2000; Pérez-Gálvez y colaboradores, 2003). Pero además, en los estudios de bioaccesibilidad carotenoide tras la ingesta de alimentos ricos en ésteres, sólo se detectan en plasma las correspondientes formas libres, lo que implica que en algún punto del proceso de absorción se ha producido su desesterificación, y lo lógico es asumir que esta reacción se ha realizado por la acción de las lipasas pancreáticas, durante la fase de micelarización (Olson, 1984; Khachik y colaboradores, 1992). De entrada, estas dos particularidades (mayor liposolubilidad y proceso de desesterificación) aumentan los requerimientos de sales biliares y enzimas digestivas para garantizar la asimilación de ésteres de xantofilas. De hecho los estudios de bioaccesibilidad realizados indican que los requerimientos de ingesta de grasa para alcanzar una eficiencia de absorción de ésteres de xantofilas similar a la de sus correspondientes formas libres son superiores (Roodenburg y colaboradores, 2000; Bowen y colaboradores 2002, Aman y colaboradores, 2004). Mención especial merece la cuestión sobre qué enzima es la responsable de realizar el proceso de desesterificación. Se ha expresado que las lipasas pancreáticas podrían realizar de forma eficiente la hidrólisis de los ésteres y convertirlos a las correspondientes formas libres. Sin embargo, Breithaupt y colaboradores (2002b) demostraron que la lipasa pancreática humana (EC 3.1.1.3) no hidroliza de forma eficiente a los ésteres de xantofilas como - criptoxanteno, zeaxanteno, luteína, y capsanteno, mientras que la lipasa pancreática porcina y la lipasa de Candida rugosa sí mostraron actividad sobre dichos ésteres. Puede parecer difícil asumir que la lipasa pancreática humana no presente actividad sobre los ésteres de xantofilas pero también se ha demostrado esta falta de actividad sobre otros sustratos (Rigtrup y colaboradores, 1994). En el estudio también se incluyó a la enzima carboxil-éster lipasa (EC 3.1.1.13, denominada colesterol esterasa en el trabajo), que presentó la mayor eficiencia. Esta ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -43- enzima es una lipasa no específica, cuya actividad depende de la presencia de sales biliares, e hidroliza ésteres de colesterol, tridi- y mono-acilglicéridos, fosfolípidos, lisofosfolípidos y ceramida (Hui y Howles, 2002). El rol de esta enzima es compensar o suplir la actividad hidrolítica de otras lipasas sobre esos sustratos (Harrison, 1998) e incluso se ha sugerido que su actividad está implicada directamente en la hidrólisis de ésteres de vitamina A (Rudd y Brockman, 1984; Rigtrup y colaboradores, 1994). Si la enzima responsable de la hidrólisis de ésteres de carotenoides es la carboxil-éster lipasa habría que realizar una consideración importante, referida a la zona donde se localiza la actividad de esta enzima. Existen evidencias de que es en la membrana de las células del epitelio intestinal donde se desarrolla su actividad (Gallo y colaboradores, 1977; Lechene De la Porte y colaboradores, 1987). Consecuentemente sólo el material lipídico que es finamente emulsionado y micelarizado y que, por tanto, llega a la membrana de las células epiteliales es susceptible de ser hidrolizado por esta enzima. En el caso concreto de los ésteres de carotenoides, aunque se haya demostrado que son sustratos para la carboxil-éster lipasa no se ha probado que las formas esterificadas se incorporen de forma eficiente a las micelas, hecho necesario para que puedan alcanzar la membrana de los enterocitos donde entonces serán hidrolizados. Asimilación La etapa de asimilación culmina el proceso de absorción carotenoide, implicando el contacto entre el material asimilable de las micelas y los enterocitos del epitelio intestinal, tejido que actúa como filtro selectivo de nutrientes. El conocimiento sobre los eventos que tienen lugar en esta etapa se ha ampliado sustancialmente en los últimos años, demostrando la existencia de mecanismos de absorción diferentes a los considerados inicialmente. Se suponía que la asimilación del contenido lipídico micelar, incluidos los carotenoides, ocurría mediante un proceso de difusión pasiva en el que las micelas colisionaban con la membrana celular y difundían su contenido hacia el citosol de la célula (El-Gorab y colaboradores, 1975; Hollander y Ruble, 1978). Parker (1996) sugería que el gradiente de concentración entre el contenido micelar y el celular determinaba la velocidad de difusión, e incluso explicaba cómo a partir de una determinada concentración micelar carotenoide se podría saturar la asimilación, al ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -44- reducirse el gradiente de concentración. Sin embargo, los estudios realizados por Hauser y colaboradores (1980) han modificado sustancialmente la teoría sobre el mecanismo de absorción de colesterol, carotenoides y otros compuestos lipídicos. El perfil biocinético de absorción, obtenido con sistemas modelo como vesículas de membrana de borde en cepillo (VMBC) y cultivos de células del epitelio intestinal (Caco-2), muestra las características de una difusión facilitada (Thurnhofer y Hauser, 1990; Compassi y colaboradores, 1997). De esta forma, se ha identificado a los receptores SR-BI y CD36, como implicados en la absorción de colesterol y carotenoides, aunque esta asignación es todavía tema de debate e investigación (van Bennekum y colaboradores, 2005). La identificación de estos receptores y el propio mecanismo de absorción están sustentados en el hallazgo de macromoléculas como - y -péptidos o ezetimiba que inhiben la absorción de compuestos lipídicos (Boffelli y colaboradores, 1997; Altmann y colaboradores, 2002). El mecanismo, además, es consistente con la significativa variabilidad sobre la eficiencia de absorción de lípidos como el colesterol entre individuos de una misma población lo que se atribuye a diferencias genéticas expresadas en el epitelio intestinal (Wang y colaboradores, 2001), hecho que también se ha observado en estudios de absorción post-prandial de carotenoides (Paetau y colaboradores, 1997; Pérez-Gálvez y colaboradores, 2005). Sin lugar a dudas, la consecución de estos recientes logros se debe en gran medida al desarrollo de modelos de absorción in vitro, basados en la obtención de vesículas de membrana de borde en cepillo, o cultivos celulares, que se han utilizado como herramienta analítica para el diseño de experimentos encaminados a la determinación de la biocinética de absorción de lípidos en general y de los carotenoides en particular (Wilson, 1990). El establecimiento de este mecanismo abrió la puerta al desarrollo de fármacos específicos que inhiben la actividad de las proteínas que facilitan la absorción de lípidos como colesterol a aquellos grupos de población afectados por trastornos en la bio-síntesis y/o absorción del mismo. Como nota curiosa, y en relación con ello, el investigador responsable de estos descubrimientos (Helmut Hauser) creó una empresa spin-off (llamada Lipideon Biotechnology AG) que se dedica al desarrollo de esos fármacos. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -45- Una vez que el material lipídico es interiorizado por las células, se empaqueta en lipoproteínas denominadas quilomicrones. Estos agregados moleculares que se ensamblan en el aparato de Golgi, alcanzan un tamaño de 75 a 1200 nm y se caracterizan por contener a la apoproteína B-48, imprescindible para el ensamblaje de estas partículas. Los quilomicrones se excretan al sistema linfático y posteriormente se dirigen al hígado degradándose antes de llegar a dicho órgano, por la actividad de la lipo-proteína lipasa, en partículas remanentes de quilomicrones, proceso que implica la liberación de parte del contenido lipídico de estas partículas y su absorción en tejido endotelial. Pero la mayor parte logra alcanzar el hígado donde se almacenan o re-excretan al sistema circulatorio empaquetados en lipo-proteínas de muy baja densidad que, durante su circulación, se transforman en LDL y finalmente en lipoproteínas de alta densidad (HDL). Los carotenoides apolares como -caroteno y licopeno, al estar concentrados en el corazón de las partículas lipo-proteicas experimentan un menor intercambio con otras lipo-proteínas por lo que las LDL aumentan su contenido carotenoide apolar, mientras que las HDL albergan mayoritariamente las xantofilas, de carácter más polar (Paetau y colaboradores, 1998). Esta cuestión es relevante puesto que va a marcar el depósito preferente de carotenos o xantofilas en determinados tejidos, en función de su densidad de receptores para LDL o HDL (Schmitz y colaboradores, 1991; Handelman y colaboradores, 1992). Bioaccesibilidad de carotenoides desde matrices hidrofílicas La bioaccesibilidad de carotenoides es, como se ha comentado previamente, limitada y está condicionada por diferentes factores, principalmente el grado de procesado del alimento y la composición de la matriz (Deming y Erdman, 1999). La grasa (tipo y cantidad) es un factor relevante, requerido en unas proporciones mínimas para asegurar la bioaccesibilidad. Sin embargo, se ha demostrado que la bioaccesibilidad de carotenoides desde alimentos grasos no es tan elevada como se podría esperar, como por ejemplo en el caso de concentrados oleosos como la oleorresina de tomate y pimiento, si se compara con la bioaccesibilidad que proporcionan matrices hidrofílicas elaboradas a partir de esos frutos (Oshima y colaboradores, 1997; Richelle, 2002; Pérez-Gálvez y colaboradores, 2003). ¿Se podrían considerar las matrices hidrofílicas como una alternativa a las formulaciones oleosas para incrementar la ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -46- bioaccesibilidad de carotenoides? La formulación de compuestos lipofílicos en una matriz hidrofílica requiere de una técnica de solubilización adecuada (emulsión, encapsulación…), pero de esta forma se conseguiría diversificar las fuentes tradicionales de estos compuestos bioactivos. En este sentido la aplicación de cualquiera de las técnicas apropiadas podría ser una estrategia adecuada para conseguir diferentes objetivos, no sólo la estabilidad de los compuestos bioactivos, sino también su digestibilidad/asimilación. Con este objetivo se han desarrollado formulaciones líquidas en las que los carotenoides se han incorporado en forma de emulsiones aceite en agua (O/W) (Spernath y colaboradores, 2002; Amar y colaboradores, 2003) con la idea de que una buena incorporación o emulsión de carotenoides en un entorno hidrofílico incrementaría la bioaccesibilidad, aunque la estimación de este parámetro nunca se ha determinado en estas formulaciones. Sólo si durante el proceso de optimización de la formulación se incorpora la estimación de la digestibilidad/asimilación como criterio de diseño, se conseguirá completar las cualidades o propiedades de la formulación desde una perspectiva más amplia. Modelos de digestión in vitro La información sobre la bioaccesibilidad de carotenoides obtenida en las últimas décadas se ha logrado por la aplicación de estudios de absorción post-prandiales y de suplementación. Esta aproximación, si bien ha resultado muy valiosa, no permite realizar análisis en detalle del efecto de la composición de la matriz alimentaria y de otros factores implicados en la absorción de carotenoides, en cada una de las etapas en las que, según se ha desarrollado anteriormente, se divide el proceso de absorción de estos compuestos lipofílicos (bioaccesibilidad). Pero además de proporcionar una información no exhaustiva, se trata de procedimientos caros y al utilizar modelos de experimentación animal o humano se requiere obligatoriamente el cumplimiento de una serie de normas éticas y de bioseguridad. ¿Por qué no se recurría a modelos de experimentación in vitro? Sí existían modelos de digestión in vitro que se habían puesto a punto para la estimación de la digestibilidad de minerales como hierro y fósforo (Miller y colaboradores, 1981; Liu y colaboradores, 1998), colesterol (Fouad y colaboradores, 1991) y vitaminas hidrosolubles (Ekanayake y Nelson, 1986), pero estos modelos no resultaban completamente aplicables al estudio de la digestibilidad de compuestos ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -47- liposolubles ya que no incluían una etapa de separación de la fracción micelar, donde se aloja todo el material lipídico que es potencialmente asimilable. Se trata de modelos gastrointestinales estáticos que simulan el tránsito a través del tracto digestivo humano, reproduciendo las condiciones fisiológicas de la digestión gástrica e intestinal. Son modelos simples, fáciles de aplicar a un amplio número de muestras y que permiten estimar el efecto, tanto de las condiciones de digestión como de otros factores ligados a la matriz alimentaria, en la bioaccesibilidad (digestibilidad y asimilación) de un nutriente. El procedimiento consiste en someter al alimento al proceso digestivo, dividido en dos etapas, gástrica e intestinal, cuyas condiciones estándar podrían ser las que se exponen a continuación que se basan en el trabajo de Miller y colaboradores (1981). En la fase gástrica, una porción del alimento homogeneizado se acidifica a pH 2 con HCl 1 M y se añade una suspensión de pepsina porcina. El homogeneizado se transfiere a un tubo de ensayo y se incuba en un baño termostatizado a 37 ºC con agitación circular. A continuación, y para efectuar la fase intestinal, el pH se eleva hasta 5,3 mediante la adición de bicarbonato sódico, junto con una suspensión de pancreatina y extracto biliar en solución de bicarbonato sódico. Nuevamente se eleva el pH, ahora hasta 7,5, y la mezcla se incuba durante 2 horas en las mismas condiciones de temperatura y agitación anteriores. Cuando el procedimiento de digestión se aplicaba al objeto de estimar la digestibilidad de un nutriente hidrosoluble no era necesario aislar el contenido micelarizado del resto del alimento no digerido o que había sido parcialmente emulsionado, separación imprescindible si se pretende analizar la digestibilidad y/o asimilación de material liposoluble, procedimiento que no se puso a punto hasta 1990. En el trabajo de Hernell y colaboradores (1990) se estudiaron pormenorizadamente las propiedades físico-químicas del contenido duodenal durante la digestión de una comida rica en triglicéridos, ingerida por los voluntarios que participaron en el ensayo de los que, por aspiración, se tomó el contenido duodenal para su análisis. La aplicación de un proceso de ultracentrifugación permitió separar las distintas fracciones, triglicéridos no digeridos, fracción micelar y un precipitado, tal y como se representa en la Figura 7. La conjunción de un modelo de digestión in vitro con el método de separación de la fracción micelar por ultracentrifugación sí implica una herramienta experimental completa con la que se pueden realizar estimaciones de la ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -48- digestibilidad de componentes liposolubles ya que se logra separar el contenido lipídico micelar, que es el susceptible de ser asimilado por las células del tejido epitelial. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -49- Figura 7.- Fracciones obtenidas tras la aplicación del proceso de ultracentrifugación descrito por Hernell y colaboradores (1990) a un digestato. Capa de aceite Interfase Fracción micelar Precipitado ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS -50- Las condiciones experimentales de cualquier modelo de digestión no se alejarán demasiado de las comentadas anteriormente, ya que se trata de reproducir las etapas y condiciones fisiológicas del proceso digestivo humano. Sí es posible encontrar adaptaciones del modelo anterior, pero se trata de cambios o modificaciones puntuales del modelo básico expuesto, en función del problema o aplicación que se pretende desarrollar. Y es que los modelos de digestión in vitro tienen múltiples aplicaciones y pueden aportar conocimientos en áreas que incluyen desde el análisis de aspectos toxicológicos de posibles contaminantes en los alimentos (Oomen y colaboradores, 2003), el estudio de factores de la dieta que intervienen en la bioaccesibilidad de un nutriente o componente determinado, el efecto que las condiciones hepato-biliares diferentes o no habituales tienen en la bioaccesibilidad de compuestos lipídicos (Leo y colaboradores, 1995) hasta el diseño de matrices alimentarias en las que el concepto de bioaccesibilidad es un criterio de selección de componentes de la matriz de igual importancia que otros como la estructura física, la estabilidad o la palatabilidad (Manzocco y Nicoli, 2002). En el contexto de los alimentos funcionales el concepto de bioaccesibilidad es un criterio a considerar en el diseño de este tipo de alimentos ya que cualquier alegación de beneficio para la salud que se establezca por la ingesta de un alimento funcional no resulta válida si no se certifica que el componente bioactivo se absorbe de forma eficiente (Aggett y colaboradores, 2005). Por ello, los modelos de digestión in vitro constituyen una herramienta analítica eficaz con la que avalar la digestibilidad del compuesto bioactivo desde diferentes matrices, y son punto de partida para posteriormente analizar la asimilación sin recurrir a modelos de experimentación in vivo. En el caso particular de pigmentos carotenoides, se ha aplicado la digestión in vitro para la estimación de la digestibilidad de estos compuestos desde los alimentos naturales que los contienen. El trabajo de Garrett y colaboradores (1999) constituye la primera aplicación de un modelo de digestión in vitro en combinación con un modelo de asimilación intestinal basado en la línea celular Caco-2, para determinar la bioaccesibilidad de carotenoides en alimentos. El procedimiento experimental sigue las etapas comentadas anteriormente, una fase gástrica, una fase intestinal y la separación de la fracción micelar. En el estudio se emplearon alimentos infantiles elaborados a base de frutas y verduras, y pasta de tomate, analizando diversos OBJETIVOS OBJETIVOS -59- OBJETIVOS 1. Determinar la significación de los factores cantidad de aceite en la matriz, tipo y mezcla de carotenoides y cantidad de colesterol en la matriz en la digestibilidad de carotenoides. El desarrollo experimental de modelos de digestión in vitro permite analizar con detalle los factores implicados en la etapa de digestibilidad de componentes lipídicos, y que están relacionados con la constitución de la matriz alimentaria en la que se integran esos componentes. Los factores considerados en este objetivo están relacionados con el entorno lipídico que compone la matriz y que va a formar parte del contenido micelar, por lo que son factores que pueden actuar como coadyuvantes o interferentes del proceso de micelarización. De esta forma, una mayor cantidad de materia grasa en la matriz puede cooperar en el proceso de micelarización aunque este factor podría afectar de forma diferente a cada carotenoide en función de su polaridad, factor también implicado en la eficiencia del proceso de micelarización. Así, la competencia entre carotenoides de diferente polaridad se considera como factor a tener en cuenta en este proceso determinando su importancia en esta etapa. Finalmente, el tercer factor incluido en el estudio, la cantidad de colesterol en la matriz tiene por objeto completar la perspectiva actual que se tiene sobre el proceso conjunto de asimilación de carotenoides y colesterol, con un análisis de la participación de colesterol en el proceso de digestibilidad de carotenoides. 2. Selección y optimización de la composición de una emulsión O/W que maximice la digestibilidad de carotenoides. La transferencia de compuestos lipofílicos a una matriz hidrofílica mediante la participación de emulgentes que dispersen finamente el contenido lipídico es una estrategia adecuada para incrementar la digestibilidad de lípidos bioactivos como los carotenoides, haciendo posible su inclusión en otro tipo de alimentos que reúnan características atractivas para el consumidor. La distinción de los componentes de la emulsión que aportan sinergias de aquellos que muestran antagonismos en la respuesta se realizará mediante la aplicación de un modelo de digestión in vitro como herramienta analítica con la que examinar la eficiencia de la digestibilidad. Considerando el amplio número de emulgentes que participan en este objetivo, OBJETIVOS -60- el uso del diseño experimental es imprescindible para alcanzarlo habiendo realizado el adecuado número de experimentos y optimizado los recursos disponibles. 3. Inhibición del transporte de carotenoides. Como se ha comentado anteriormente, el conocimiento actual sobre los eventos que tienen lugar en la etapa de asimilación se ha ampliado sustancialmente en los últimos años, modificando la teoría existente sobre el mecanismo de absorción de colesterol, carotenoides y otros compuestos lipídicos. Se suponía que la asimilación del contenido lipídico micelar, incluidos los carotenoides, ocurría mediante un proceso de difusión pasiva. Sin embargo, el perfil biocinético de absorción, obtenido con sistemas modelo muestra las características de una difusión facilitada. Focalizando la observación sobre los eventos que tienen lugar durante la asimilación, se analizará el efecto inhibidor que las apolipoproteínas tienen sobre la absorción de carotenoides, empleando como sistema modelo de absorción in vitro las vesículas de membrana de borde en cepillo. Con la inhibición se busca reproducir situaciones de baja asimilación intestinal como las que ocurren en individuos que presentan una baja densidad de transportadores residuales, inflamación intestinal crónica o un estatus oxidativo del epitelio que modifique la necesidad de incorporar antioxidantes liposolubles. Si existe efecto de inhibición se estudiará si un cambio en el entorno molecular de los carotenoides, mediante su integración en complejos de inclusión permite modificar sustancialmente el proceso de inhibición del transporte. MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Y MÉTODOS -63- MATERIALES Y MÉTODOS Materias primas Extractos vegetales concentrados en carotenoides Para la realización de los experimentos de micelarización de carotenoides a partir de una matriz lipofílica, se utilizaron aquellos extractos oleosos concentrados en carotenoides, obtenidos de la fuente vegetal apropiada. El extracto oleoso de licopeno, obtenido a partir de un concentrado de tomate (Lycopersicon esculentum) fue suministrado por Lycored (Beer- Sheva, Israel) y se utilizó como fuente de licopeno. El extracto oleoso de luteína, obtenido a partir de un concentrado de pétalos de marigold (Tagetes erecta) fue suministrado por Kemin Foods (Des Moines, Iowa, EEUU). En este caso se dispone de dos formatos, el extracto oleoso directo que contiene luteína esterificada y el extracto oleoso saponificado, que se utiliza como fuente de luteína libre. Se dispone de un extracto oleoso de -caroteno, suministrado por Extractos Vegetales S. A. (La Línea de la Concepción, Cádiz, España), obtenido a partir de zanahoria (Daucus carota) y un extracto oleoso de carotenoides del pimiento (Capsicum annuum L.) también suministrado por Extractos Vegetales S. A. (La Línea de la Concepción, Cádiz, España). Como fuente de aceite vegetal para modificar el entorno lipofílico en el que se desarrolla la digestión se utilizó un aceite de girasol refinado comercial, libre de carotenoides. Estos extractos oleosos se utilizaron como fuente de carotenoides para, tras una etapa de purificación (como se detallará en los apartados correspondientes), la elaboración de complejos de inclusión. Emulgentes Para la realización de los experimentos de micelarización de carotenoides a partir de emulsiones, se empleó un grupo de compuestos emulgentes seleccionados entre diferentes productos diseñados para emulsionar sustancias oleosas y mejorar su bioaccesibilidad. Los productos utilizados fueron suministrados por la empresa Gattefossé (Gennevilliers, Francia) y se detallan a continuación: Diestearato de sacarosa, CAS: 25168-73-4 (EMF-1); mezcla de mono y diestearato de sacarosa, CAS: 25168-73-4 (EMF-2); monopalmitato de sacarosa, CAS: 26446-38-8 (EMF-3); 2,3-dihidroxipropil-docosanoato, CAS: 30233-64-8 (EMF-4); gliceril-palmito-estearato, CAS: MATERIALES Y MÉTODOS -64- 8067-32-1 (EMF-5); poligliceril-oleato, CAS: 76009-37-5 (EMF-6); propilenglicol-laurato, CAS: 27194-74-7 (EMF-7); gliceril-monoestearato, CAS: 31566-31-1 (EMF-8); hexaglicerildiestearato, CAS: 34424-97-0 (EMF-9). Todos estos productos están comercialmente disponibles y tienen la calificación GRAS. Mantequillas y margarinas El modelo de digestión in vitro se aplicó a diferentes materias grasas para untar adquiridas en supermercados locales. Su composición nutricional aparece indicada en la Tabla 4. MATERIALES Y MÉTODOS -65- Tabla 4.- Composición media por cada 100 gramos de producto en las materias grasas para untar utilizadas en el estudio. Declarado por el fabricante Grasa (g) Esteroles (g) Fibra (g) ER (g) M1 32 8 -1 800 M22 35 7,5 - 800 M32 41 - 2 - M42 40 - - 560 M52 41 - - 275 M6 55 - - 600 M72 60 - - 800 M8 73 - - 751 1 Ausente. 2 En la etiqueta del producto consta el uso de -caroteno como colorante añadido. MATERIALES Y MÉTODOS -66- Reactivos y disolventes Acetona, metanol, hexano, etanol absoluto, cloruro de metileno, y N,N-dimetilformamida de calidad HPLC de la marca Romyl, fueron suministrados por Teknokroma (Barcelona, España). El agua purificada se obtuvo mediante un sistema de purificación Milli-Q (Millipore, Milford, MA, EEUU). Extracto biliar, lipasa pancreática porcina (tipo II), con una actividad de 100-400 U/mg (actividad determinada usando aceite de oliva; 1 unidad hidroliza 1 microequivalente de ácido graso en 1 hora), pepsina, con una actividad de 800-2500 U/mg (actividad determinada usando hemoglobina como sustrato) y -apo-8’-carotenal fueron suministrados por Sigma (St. Louis, MO, EEUU). Colesterol fue suministrado por Panreac (Lyon, Francia). La -ciclodextrina (98% de pureza) fue proporcionada por Sigma (St. Louis, MO, EEUU). Para la determinación de la actividad de lipasa pancreática se utilizó pnitrofenilpalmitato y p-nitrofenol, adquiridos a Sigma (St. Louis, MO, EEUU). Roche Diagnostics (Mannheim, Alemania) suministró un extracto enzimático de co-lipasa pancreática de cerdo, (98% de pureza), con una actividad de 97533 U/mg (actividad determinada usando tributirina; 1 unidad hidroliza 1 microequivalente de ácido graso en 1 hora). Para la determinación de la concentración de proteínas se empleó sal disódica del ácido 2,2’-biquinolina-4,4’-dicarboxílico proporcionada por Fluka (St. Louis, MO, EEUU) y seroalbúmina bovina pura suministrada por Sigma (St. Louis, MO, EEUU). Para la determinación de la actividad de sacarasa intestinal se utilizó glucosa (pureza ≥ 99,5%), glucosa oxidasa de Aspergillus niger (tipo VII), con una actividad de 180,2 U/mg sólido (actividad determinada usando glucosa como sustrato), peroxidasa de rábano (tipo II), con una actividad de 150-250 U/mg (actividad determinada usando pirogalol como sustrato), ácido-3-dimetil-aminobenzoico y 3-metil-2-benzotiazolinona, adquiridos todos ellos a Sigma (St. Louis, MO, EEUU). Suero bovino y sal sódica de heparina procedente de mucosa intestinal de cerdo Grado I-A ≥ 140 unidades USP/mg, fueron suministrados por Sigma (St. Louis, MO, EEUU). El resto de reactivos y disolventes empleados fueron de calidad analítica. MATERIALES Y MÉTODOS -73- Métodos Determinación de la actividad de triacilglicerol acil hidrolasa Se utiliza el método descrito por Lehner y Verger (1997). La hidrólisis de pnitrofenilpalmitato a su correspondiente forma libre, p-nitrofenol, es una medida de la actividad enzimática. El ensayo se realiza de la siguiente forma: 40 L de una disolución 125 mM de pnitrofenilpalmitato se mezclan con 860 L de búfer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, y 0,01% de Tritón X-100), mezcla a la que se añaden 100 L de la muestra que contiene la suspensión de lipasa pancreática. La reacción de hidrólisis se lleva a cabo durante una hora a 37 ºC, y una vez finalizada, se determina el valor de absorbancia a 405 nm. Con la correspondiente recta de calibrado (elaborada previamente con p-nitrofenol estándar) se determina la cantidad de p-nitrofenol hidrolizado por el enzima. La actividad enzimática, U, se calcula a partir de la cantidad de producto formado, expresada en moles por mg de proteína y minuto. Determinación de la concentración de proteínas Se utiliza el método del ácido bicinconínico (BCA) descrito por Smith y colaboradores (1985). Este ácido constituye el fundamento de un procedimiento analítico capaz de monitorizar iones Cu+ formados tras la reacción de proteínas con iones Cu2+ (medio alcalino). Los iones Cu+ originados, reaccionan con la sal disódica del ácido bicinconínico dando lugar a un compuesto de color violeta. El color producido es estable y su intensidad incrementa proporcionalmente con la concentración de proteínas existentes. El ácido bicinconínico utilizado se prepara según el siguiente protocolo: 100 volúmenes de reactivo A (solución acuosa al 1% Na2-BCA, 2% Na2CO3 (monohidrato), 0,16% tartrato sódico, 0,4% hidróxido sódico y 0,95% NaHCO3, ajustada a pH 11,25 con disolución acuosa de hidróxido sódico 1 M) se mezcla con 2 volúmenes de reactivo B (solución acuosa al 4% CuSO4.5H20). El ensayo se realiza de la siguiente forma: 1 mL de ácido bicinconínico (BCA) se mezcla con 75 L de agua desionizada y, a continuación se añade 25 L de la muestra que contiene proteínas. La reacción se lleva a cabo durante 10 minutos a 60 ºC, y una vez finalizada, se determina el valor de absorbancia a 562 nm. Con la correspondiente recta de calibrado (elaborada previamente con seroalbumina MATERIALES Y MÉTODOS -74- bovina en concentraciones de 0 ppm a 10 ppm) se determina la cantidad de proteínas expresada en mg de proteínas por mL de preparación de vesículas de membrana de borde en cepillo. Determinación de la actividad de sacarasa en vesículas de membrana de borde en cepillo (VMBC) En un baño termostatizado a 37 ºC, una alícuota de VMBC (100 L) se incuba durante una hora con 200 L de sacarosa 0,28 M. Transcurrido dicho período de tiempo, se interrumpe la reacción diluyendo la muestra con agua (1 mL) y calentamiento a 100 ºC. La cantidad de glucosa liberada se determina siguiendo el método de medida a tiempo fijo descrito por Ngo y Lenhoff (1980). Los reactivos empleados fueron los siguientes: glucosa oxidasa y peroxidasa (1000 U y 300 U respectivamente, se disuelven en 10 mL de búfer fosfato sódico 0,1 M, pH 6,5, y posteriormente se diluyen a 100 mL con el mismo búfer), ácido-3-dimetilaminobenzoico (DMAB) (3 mmoles se disuelven en 100 mL del búfer fosfato sódico 0,1 M, pH 6,5), 3-metil-2- benzo-tiazolinona (MBTH) (60 moles se disuelven en 100 mL del búfer fosfato sódico 0,1 M, pH 6,5). Una vez preparados se mezclan en proporciones 1:1:1 (v/v/v) y se preincuban a 25 ºC durante 5 minutos antes de adicionarle 20 L de la muestra a analizar. Después de 15 minutos de incubación a 37 ºC, se mide la absorbancia a 590 nm. Con la correspondiente recta de calibrado (elaborada previamente con glucosa estándar, concentraciones de 0 a 30 M) se determina la cantidad de glucosa liberada. La actividad de sacarasa se calcula a partir de la cantidad de glucosa libre, expresada en moles de glucosa por mg de proteína y minuto. Aislamiento de lipoproteínas de alta densidad del suero de oveja Para obtener una fracción enriquecida en lipoproteínas de alta densidad, éstas se separan del resto de lipoproteínas del suero mediante precipitación y centrifugación (Warnick y colaboradores, 1985). Una alícuota de suero de oveja (2 mL) se mezclan con 0,2 mL de la solución de trabajo mezcla de heparina-cloruro de manganeso (0,6 mL de disolución de heparina con 40000 unidades USP/mL se mezclan con 10 mL de disolución de cloruro de manganeso (II) 1,06 M). La mezcla se agita y se deja reposar 10 minutos a temperatura MATERIALES Y MÉTODOS -75- ambiente. Finalmente se centrifuga a 1500  g durante 30 minutos. El sobrenadante contiene la fracción de HDL enriquecida en apoproteínas tipo A1-A2. Determinación de la concentración carotenoide en los extractos vegetales concentrados y materias grasas para untar Se utiliza el procedimiento descrito por Mínguez-Mosquera y Pérez-Gálvez (1998). Una cantidad de materia prima (0,02 gramos en el caso de extractos vegetales, o 1 gramo de mantequilla/margarina) se mezclan con 50 mL de éter etílico. La mezcla se coloca en un embudo de decantación al que se añaden 10 mL de KOH en metanol (20%, p/v) para hidrolizar la materia grasa, reacción que se completa en una hora. A continuación se añaden 200 mL de solución acuosa de NaCl (10%, p/v), se agita suavemente permitiendo la separación de fases. La hipofase se descarta y la epifase se lava con agua destilada hasta que las aguas de lavado sean neutras. Finalmente la fase orgánica se lava 2 veces con 200 mL de solución acuosa de Na2SO4 (2%, p/v) y se filtra a través de un lecho sólido de Na2SO4. El filtrado se evapora en un rotavapor y el residuo se redisuelve en un volumen exacto y conocido de disolvente orgánico. La absorbancia de una alícuota de la disolución obtenida se determina espectrofotométricamente a la longitud de onda máxima y se calcula la concentración de pigmento utilizando el coeficiente de extinción adecuado. En la Tabla 6 se exponen los valores de E1%1cm, la longitud de onda máxima y el disolvente en el que se realiza la determinación para los carotenoides utilizados en este estudio. MATERIALES Y MÉTODOS -76- Tabla 6.- Coeficientes de absorción específicos (E1%1cm) utilizados para la determinación cuantitativa de la concentración carotenoide mediante medida espectrofotométrica1. Carotenoide E1%1cm  (nm) disolvente -caroteno 26202 450 acetona Licopeno 34503 472 éter de petróleo luteína (libre o esterificada) 23402 446 acetona extracto de Capsicum annuum L. 26544 456 acetona 1La concentración se calcula aplicando la siguiente expresión: 2 Mínguez-Mosquera, 1997. 3 Davies, 1976. 4 Mínguez-Mosquera y Pérez-Gálvez, 1998. unidades de absorbancia a max 100 × E1%1cm c (g/mL) = MATERIALES Y MÉTODOS -77- Elaboración de emulsiones La elaboración de las emulsiones se realiza mediante la aplicación de la técnica hot-melt coating ya que los emulgentes suministrados funden fácilmente sin necesidad de elevar la temperatura de la mezcla en exceso. Los componentes, en las cantidades descritas en el apartado de diseño experimental (Tabla 5), se agitan en un baño calefactor agitador, durante una hora a 40 ºC y posteriormente la emulsión se homogeneiza con un homogeneizador para líquidos (Ultra-Turrax, modelo T-25, IKA Labortechnik, Staufen, Alemania) durante dos minutos a velocidad máxima. Determinación de la concentración carotenoide en emulsiones En un tubo de ensayo de 15 mL se pesan 0,1 gramos de emulsionado cuyo contenido carotenoide se extrae mediante la adición de 2 mL de N,N-dimetilformamida, 4 mL de Na2SO4 (2%, p/v) y 4 mL de hexano. La mezcla se sonica en un baño de ultrasonidos durante cinco minutos, se agita dos minutos en vórtex, y se centrifuga a 4400 rpm durante cinco minutos. Una alícuota de la epifase se evapora en rotavapor y el residuo se redisuelve en un volumen exacto y conocido de acetona, para la determinación del valor de la absorbancia y cálculo de la concentración en las condiciones expresadas en la Tabla 6. Procedimiento de separación y purificación aplicado a extractos oleosos concentrados de licopeno, luteína libre y  -caroteno Para la obtención de disoluciones stock de los pigmentos mencionados (empleadas posteriormente en la elaboración de complejos de inclusión) se aplicó el procedimiento siguiente. Se solubilizan 0,02 gramos de la oleorresina en 25 mL de éter etílico. La disolución se introduce en un embudo de decantación y se añaden 10 mL de KOH en metanol al 10% (p/v). La reacción de saponificación transcurre durante 1 hora, al objeto de eliminar la materia grasa. Finalizada la reacción se añaden 200 mL de solución acuosa de NaCl (10%, p/v). Las fases, orgánica y acuosa, se separan desechándose la acuosa. La fase orgánica se lava con agua hasta neutralidad y dos veces con 200 mL de solución acuosa de Na2SO4 (2%, p/v). La fase orgánica se filtra a través de un lecho sólido de Na2SO4 y se evapora en rotavapor. El residuo se solubiliza con un volumen exacto de acetona (luteína y -caroteno) o éter de MATERIALES Y MÉTODOS -78- petróleo ligero (licopeno). En cada uno de los casos se utiliza la expresión para el cálculo de la concentración que aparece reflejada en la Tabla 6. Preparación de suspensiones Tween carotenoide y de complejos de inclusión  - ciclodextrina:carotenoide La suspensión Tween carotenoide se preparó según el procedimiento descrito por During y colaboradores (1998). Una alícuota de la disolución stock carotenoide se mezcla con 50 L de suspensión Tween 40 en acetona (20%, p/v) y se evaporan los disolventes bajo corriente de gas N2. El residuo se disuelve en el volumen adecuado de búfer (2 mM Tris-HCl, 0,05 M D- manitol, 5 mM EGTA, pH 7,1) y se agita en vórtex durante 1 minuto. La solución se prepara diariamente y se mantiene en cámara a 4 ºC hasta su uso, momento en el que se vuelve a agitar en vórtex durante 1 minuto. Para la obtención de complejos de inclusión - ciclodextrina:carotenoide se empleó el procedimiento descrito por Pfitzner y colaboradores (2000) con ligeras modificaciones. Una alícuota de la disolución estándar carotenoide se evapora y el residuo se redisuelve en 2 mL de cloruro de metileno. A continuación se adicionan 48 mL de etanol y -ciclodextrina. La relación molar entre -ciclodextrina y carotenoide se mantuvo en 20. La mezcla resultante se agita a 100 rpm en un baño termostatizado a 37 ºC con agitación magnetica durante 24 horas. Finalizado el proceso, se evapora en rotavapor y se lleva a sequedad utilizando una corriente de gas N2. El residuo sólido se homogeneiza y se almacena a -30 ºC hasta su empleo. Determinación de la concentración carotenoide en suspensiones Tween carotenoide y complejos de inclusión  -ciclodextrina:carotenoide La concentración final de pigmento en solución se determina aplicando el siguiente procedimiento. Se solubilizan en agua (3 mL) 50 mg de complejos de inclusión - ciclodextrina:carotenoide, o 1 mL de suspensión Tween y se añaden 8 mL de la mezcla N,N- dimetilformamida:hexano 1:1 (v/v). Para favorecer la separación de fases se añaden 5 mL de solución acuosa de NaCl (10%, p/v). La mezcla se agita durante 1 minuto en un agitador vórtex y se centrifuga a 4400 rpm durante 5 minutos. Se retira la fase orgánica y la fase acuosa se vuelve a extraer en las mismas condiciones. Las dos fases orgánicas se combinan y se MATERIALES Y MÉTODOS -79- procede a la determinación espectrofotométrica, evaporando el hexano y redisolviendo en el disolvente adecuado, a la max correspondiente (Tabla 6). Proceso de digestión in vitro Se parte de una alícuota del extracto vegetal concentrado que contenga 100 g de pigmento (-caroteno, licopeno, luteína, o ésteres de luteína), o de 0,25 gramos de emulsión, o de 1 gramo de mantequilla/margarina. La muestra se coloca en un tubo de ensayo al que se añaden 5 mL de disolución de pepsina (0,05%, pH 2) y se incuba en un baño calefactor con agitación magnética durante una hora, a 37 ºC, temperatura que se mantendrá constante durante todo el proceso de digestión in vitro. A continuación, el pH de la mezcla parcialmente digerida se ajusta a 7,4 adicionando 5 mL de búfer fosfato (0,1 M, pH 7,4), 30 mg de sales biliares y 250 L de solución salina (NaCl 3 M, CaCl2 75 mM). Esta mezcla se sonica durante diez minutos y posteriormente se incuba treinta minutos. Finalmente, se añaden 100 L de una suspensión de lipasa pancreática porcina (50 mg/mL CaCl2 5 mM), manteniendo la mezcla en agitación durante dos horas. El procedimiento descrito se corresponde con las condiciones estándar de digestión, con las que se logra una eficiencia de micelarización del pigmento que se toma como referencia. Las condiciones de digestión (temperatura, agitación, tiempos de incubación, cantidad de enzimas) se mantienen constantes. Sí se introducirán cambios en la composición de la matriz a digerir (descritas en las secciones de diseño experimental 1 y 2). Estas modificaciones producirán (o no) una alteración en el valor de la eficiencia de micelarización, que se contrastará con el valor de referencia para determinar su importancia. De esta forma, se podrá determinar si la modificación introducida en el proceso de digestión es un factor significativo o no. Separación de la fracción micelar Se utiliza el método descrito por Hernell y colaboradores (1990). Una vez concluido el proceso de digestión, la mezcla se transfiere a tubos de policarbonato para ultracentrífuga (modelo L8-70M, Beckman Instruments Inc., Palo Alto, CA, EEUU) que se colocan en un rotor tipo 70.1 Ti. Las condiciones de ultracentrifugación son 49300 rpm durante 100 minutos a 4 ºC. MATERIALES Y MÉTODOS -80- Finalizado el proceso se toma una alícuota de 10 mL con una aguja (18 AWG) acoplada a una jeringa de 20 mL. Extracción y cuantificación de carotenoides en la fracción micelar Cuando la fracción micelar procede de la digestión de matrices lipofílicas (extractos vegetales y mantequillas/margarinas) se aplica el siguiente procedimiento. Una alícuota (5 mL) se vierte en un embudo de decantación y se procede a la extracción de la fracción carotenoide añadiendo 50 mL de éter etílico y 200 mL de una solución acuosa de NaCl (10%, p/v). Se añade una cantidad exacta y conocida de -apo-8’-carotenal, como patrón interno para la posterior cuantificación. La mezcla se agita suavemente permitiendo la separación de fases por decantación, descartando la fase acuosa. La epifase se lava dos veces con Na2SO4 (2%, p/v) y se filtra sobre un lecho sólido de Na2SO4 evaporando el filtrado en un rotavapor. El residuo seco se redisuelve con 200 L de acetona de HPLC almacenando la muestra a -30 ºC hasta su análisis. La cuantificación carotenoide se realiza mediante la aplicación del método desarrollado por Mínguez-Mosquera y Hornero-Méndez (1993). Se trata de un sistema de separación cromatográfica en fase reversa (columna C18 Spherisorb ODS2, 250 mm × 4 mm, tamaño de partícula de 5 m). El método emplea un gradiente binario acetona:agua en la proporción inicial de 75:25, a una velocidad de flujo de 1,5 mL/min. La cantidad de muestra inyectada es de 50 L. El cromatógrafo está controlado por un software de gestión de la señal y de los datos cromatográficos, que contiene la información necesaria (rectas de calibrado y factores de respuesta) para la cuantificación de las muestras en base a la cantidad de patrón interno que se adiciona durante el proceso de extracción. Cuando la fracción micelar procede de la digestión de matrices hidrofílicas (emulsionados) se aplica el siguiente procedimiento. Una alícuota (4 mL) se mezcla con 26 mL de N,N-dimetilformamida, 4 mL de Na2SO4 (2%, p/v) y 4 mL de hexano. La mezcla se sonica en un baño de ultrasonidos durante cinco minutos, se agita dos minutos en vórtex, y se centrifuga a 4400 rpm durante cinco minutos. Una alícuota de la epifase se evapora en rotavapor y el residuo se redisuelve en un volumen exacto y conocido de acetona, para la determinación del valor de la absorbancia y cálculo de la concentración en las condiciones expresadas en la MATERIALES Y MÉTODOS -81- Tabla 6. En la Figura 9 se representa un esquema del procedimiento experimental, así como los métodos aplicados en cada etapa. MATERIALES Y MÉTODOS -82- DIGESTIÓN IN VITRO SEPARACIÓN FRACCIÓN MICELAR MEZCLA EMULSIÓN CANTIDAD TOTAL CAROTENOIDE 2 1 CANTIDAD TOTAL CAROTENOIDE 3 3 DIGESTIÓN IN VITRO SEPARACIÓN FRACCIÓN MICELAR CANTIDAD MICELAR CAROTENOIDE CANTIDAD MICELAR CAROTENOIDE EM (%) (%(%> (%) EM (%) Figura 9.- Esquema del procedimiento experimental, aplicado a mezclas modelo y a emulsiones para la obtención de valores de eficiencia de micelarización (EM) aplicando las metodologías descritas en los siguientes apartados: 1: Determinación de la concentración carotenoide en los extractos vegetales concentrados y materias grasas para untar. 2: Determinación de la concentración carotenoide en matrices hidrofílicas (emulsiones). 3: Extracción y cuantificación de carotenoides en la fracción micelar. RESULTADOS Y DISCUSIÓN RESULTADOS Y DISCUSIÓN -91- RESULTADOS Y DISCUSIÓN Es difícil que la Naturaleza se ajuste a un prototipo. La teoría atómica de Dalton, la teoría de la evolución de Darwin, la teoría de la relatividad de Einstein, son eso, teorías, más o menos comprensibles, más o menos elaboradas, más o menos ciertas. Pero gracias a ellas conseguimos observar la realidad desde nuestra perspectiva, e incluso, en el marco de las condiciones experimentales que indica la teoría o modelo, reproducirla. Con toda seguridad los enigmas de la ciencia normal son complicados, pero también es cierto que las mediciones tomadas sin un prototipo conducen muy raramente a alguna conclusión definida. No se puede pretender que los modelos no tengan fallas, o que, a medida que los recursos y conocimientos avancen, aquellos no queden obsoletos y se sustituyan por otros más realistas aunque no necesariamente por ello, más reproducibles y fiables que el modelo primitivo. En cada época, el experimentador debe dar respuesta a las incógnitas que se plantea, o que le plantean, con las habilidades y destrezas adquiridas y con los recursos y métodos de los que dispone. Y en ocasiones, un procedimiento experimental sencillo, se convierte en un buen método para: 1, contrastar la realidad y comprender cómo ciertos factores participan de ella y 2, obtener datos experimentales modelo, fiables, reproducibles, realistas pero no necesariamente idénticos a la realidad, con los que elaborar una hipótesis, un producto, o incluso un nuevo modelo sin que necesariamente se tenga que recurrir de forma continua a la realidad para ello. No hay que olvidar que, como expresa Hegel, la realidad objetiva es como es y el único soporte relativo que poseen nuestras ideas es el que nos reporta la práctica humana, que por desgracia también pasa a nuestro acervo por un proceso de interpretación. Con los modelos de digestión y asimilación in vitro que se han utilizado en este estudio se han obtenido una serie de datos de cuyo análisis se ha elaborado una visión de cómo ciertos factores modulan la digestibilidad y asimilación de los compuestos bioactivos en estudio, los carotenoides. Durante la exposición de resultados y su discusión el lector encontrará referencias a resultados obtenidos con modelos de experimentación in vivo, (humanos o animales). Con ello no se pretende tranquilizar las inquietudes de los más críticos, ni garantizar y comprobar la validez del modelo in vitro, aunque al comparar resultados con los RESULTADOS Y DISCUSIÓN -92- obtenidos con otros modelos ésta queda en parte justificada, sino, como todo buen experimentador, buscar contrastes, complementariedades, excepciones, e incluso confrontaciones, para comprender una realidad y concluir que de ambas formas ad verum ducit. Factores implicados en la micelarización de carotenoides en matrices lipofílicas Si se puede destacar alguno de los factores que modifican la eficiencia de la micelarización (EM) de carotenoides, incluidos en este estudio, el factor tipo y mezcla de carotenoides puede resultar el más llamativo. Si consideramos la estructura química de los carotenoides, evidentemente, ésta tiene una importante zona común a todos estos pigmentos, la cadena polienoica, por la que se podría asumir un comportamiento similar frente a diferentes procesos físico-químicos. Sin embargo, las particularidades estructurales (grupos colocados en ambos extremos de la cadena) modifican sustancialmente la conducta de estos compuestos y son el origen de las interacciones detectadas. En la Figura 11 se representan la EM de licopeno obtenida aplicando el proceso de digestión in vitro en condiciones estándar y cuando, a la mezcla a digerir con licopeno, se añadió una cantidad idéntica de luteína o de ésteres de luteína. En estos dos últimos experimentos se produce un descenso significativo de la EM de licopeno, más acusado en el caso de la adición de ésteres de luteína, respecto a la observada en el experimento control. En el presente estudio, in vitro, se puede concretar que en la fase de micelarización se produce una interacción entre carotenoides por la incorporación a las micelas. Algunos autores ya habían apuntado que en la fase de micelarización se podía producir una competencia entre diversos carotenoides por su incorporación micelar, (White y colaboradores, 1993; Brown y colaboradores, 1997; O´Neill y Thurnham, 1998) aunque al tratarse de estudios in vivo, no se podía descartar que la competencia también se produjera durante la posterior fase de asimilación (van den Berg, 1999). Cuando se parte de una emulsión de dos tipos de carotenoides, su disposición en gotas lipídicas será diferente en función de la polaridad de cada uno. La diferente configuración estructural de los grupos laterales (lineales en el caso de licopeno y cíclicos en el caso de luteína) y la presencia de hidroxilos provee a luteína de una mayor polaridad lo que provoca su colocación en la zona exterior de las gotas lipídicas facilitando su trasvase desde la matriz lipofílica a las micelas RESULTADOS Y DISCUSIÓN -93- donde también se van a incorporar en la zona exterior y no en su corazón que alberga a compuestos de menor polaridad. Por el contrario, los carotenoides apolares parten de la zona interna de las gotas lipídicas y tienen que alcanzar el interior de la micela. A pesar de este efecto de competencia detectado, la EM de licopeno es siempre superior a la de luteína y a la de los ésteres de luteína tanto en los experimentos control como en los experimentos mezcla, es decir, la interacción de luteína o ésteres de luteína con licopeno no consigue decantar el valor de EM a favor de los primeros. El estudio de Tyssandier y colaboradores (2001) también había demostrado que la presencia de luteína en el medio tenía un efecto negativo sobre la micelarización de carotenos, pero estos últimos no tenían ningún efecto sobre el primero. Sin embargo, en este trabajo se ha observado que al partir de una mezcla licopeno:luteína, además de disminuir, la EM de licopeno, se incrementa la EM de luteína tal y como se representa en la Figura 12. La digestibilidad depende en gran medida de la polaridad de los carotenoides. La excepción a este supuesto se materializa cuando se analizan los resultados de la mezcla licopeno:ésteres de luteína. En este caso, y como se ha expuesto anteriormente, es cuando la EM de licopeno registra un mayor descenso respecto al experimento control (Figura 11) y sin que ello suponga efecto alguno (ni incremento ni descenso) en la EM de los ésteres de luteína (Figura 12). La esterificación de la xantofila implica la presencia de un entorno lipídico molecular que, a efectos de la micelarización, elimina las características que surgen de la estructura del pigmento y lo hacen comportarse como un lípido más, y como tal tiene un efecto negativo sobre la EM de licopeno. De hecho, este caroteno tampoco muestra ningún efecto sobre la EM de ésteres de luteína. Esta misma observación se denota cuando se incrementa la cantidad de materia grasa en la digestión de licopeno (Figura 13), efecto que se comentará a continuación. RESULTADOS Y DISCUSIÓN -94- 0 5 10 15 20 25 Exp. control + luteína + ésteres de luteína Eficiencia de la digestibilidad de licopeno (%) Figura 11.- Datos correspondientes a la eficiencia de micelarización (valores porcentuales) de licopeno en los experimentos control, mezcla con luteína y mezcla con ésteres de luteína. RESULTADOS Y DISCUSIÓN -95- 2 3 4 5 Exp. control + licopeno Exp. control + licopeno 0 1 2 3 4 5 Eficiencia de la digestibilidad de luteína (%) Figura 12.- Datos correspondientes a la eficiencia de micelarización (valores porcentuales) de luteína (diagonal hacia arriba) o ésteres de luteína (diagonal hacia abajo) en los experimentos control, mezcla con licopeno. RESULTADOS Y DISCUSIÓN -96- Las Figuras 13, 14 y 15 representan la EM de licopeno, luteína y ésteres de luteína, respectivamente, cuando distintas cantidades de aceite se adicionan a la matriz. Esta adición causó cambios en la EM de diferente magnitud en cada caso. Se observa como la eficiencia de micelarización de luteína es independiente de la cantidad de aceite añadido inicialmente. No obstante, este comportamiento no se extiende a licopeno y ésteres de luteína, que modifican su EM cuando se incorpora una mayor cantidad de materia grasa, aunque el efecto tiene un signo opuesto para cada pigmento. La EM de licopeno se reduce prácticamente un 50% al incorporar 100 L de aceite a la mezcla a digerir (en el experimento control se alcanza un valor de EM = 21,47% y se pasa a un valor de EM = 11,51%). Por el contrario, la EM de ésteres de luteína incrementa su valor al incorporar aceite a la mezcla a digerir (en el experimento control se alcanza un valor de EM = 3,03% y se pasa a un valor de EM = 6,95%). Independientemente de la clase de carotenoide, la adición de 300 L de aceite no supuso una modificación de los cambios observados en el valor de EM respecto a los experimentos con 100 L de aceite. En los experimentos realizados al efecto de controlar la interacción entre los factores cantidad de aceite en la matriz y tipo y mezcla de carotenoides (partiendo de mezclas binarias de carotenoides en proporción 1:1 y adicionando aceite) también se observaron cambios de diferente intensidad en la EM. En las Figuras 16 y 17 se representan los valores de EM para licopeno en mezcla con luteína, y licopeno en mezcla con ésteres de luteína, respectivamente, mientras que en las Figuras 18 y 19 se representan los valores de EM para luteína y ésteres de luteína ambos en mezcla con licopeno, respectivamente. RESULTADOS Y DISCUSIÓN -97- 0 5 10 15 20 25 Exp. control + 100 + 300 Eficiencia de la digestibilidad de licopeno (%) Figura 13.- Datos correspondientes a la eficiencia de micelarización (valores porcentuales) de licopeno en los experimentos control, y adición de aceite. RESULTADOS Y DISCUSIÓN -98- 0 1 2 3 4 5 Exp. control + 100 + 300 Eficiencia de la digestibilidad de luteína (%) Figura 14.- Datos correspondientes a la eficiencia de micelarización (valores porcentuales) de luteína en los experimentos control, y adición de aceite. RESULTADOS Y DISCUSIÓN -105- de los datos experimentales, éstos se ajustan a un modelo factorial, con los siguientes factores (o efectos) significativos cantidad de aceite en la matriz, tipo y mezcla de carotenoides y la interacción entre ambos. El valor F del modelo (71,71) implica que el modelo es significativo con una probabilidad del 0,01% de que éste pudiera deberse al ruido experimental. En la tabla no se incluyen valores estadísticos que indican la bondad del modelo pero que se detallan a continuación. Las cantidades de R2 y R2adj se corresponden con 0,926 y 0,913 respectivamente. La precisión adecuada alcanza un valor de 22,89. La interacción de los factores cantidad de aceite en la matriz y tipo y mezcla de carotenoides resulta estadísticamente significativa (más adelante se comentarán la significación estadística del resto de interacciones). Como se ha indicado en la exposición de resultados, el factor cantidad de aceite en la matriz es significativo pero la tendencia de los cambios que éste provoca en los valores de EM depende del tipo de pigmento. Por otro lado, esta interacción va a incrementar el efecto observado de competencia entre pigmentos, expuesto en las Figuras 11 y 12, en el mismo sentido que aquel hubiera sido. La competencia entre pigmentos, observada en ese conjunto de experimentos, se combina con la presencia de aceite en la solución inicial de pigmentos a digerir. Así, si para licopeno la adición de otro pigmento supuso un descenso en la EM, cuando además se adicionó aceite la EM disminuyó aún más. Por el contrario, para luteína la adición de otro pigmento supuso un aumento en la EM, y cuando además se adicionó aceite, la EM incrementó aún más. No sólo es importante la cantidad de grasa sino también el tipo de pigmento y la mezcla. En estudios in vivo se había observado una interacción entre los factores cantidad de aceite en la matriz y tipo y mezcla de carotenoides, estudios en los que se analizó el efecto de la presencia de grasa en la dieta sobre la absorción de carotenoides, aunque la mayoría de estos ensayos se centraban sólo en -caroteno (Jayarajan y colaboradores, 1980; Prince y Frisoli, 1993; Jalal y colaboradores, 1998; Roodenburg y colaboradores, 2000). Estos estudios sugieren que se necesita una mínima cantidad de grasa (3-5 gramos) en la matriz a digerir, para asegurarnos la absorción intestinal del caroteno. Sin embargo, Roodenburg y colaboradores (2000) concluyeron que añadir a la matriz más cantidad de grasa que la mínima necesaria para la absorción, no nos asegura un aumento de la bioaccesibilidad final del RESULTADOS Y DISCUSIÓN -106- pigmento. Nuestros resultados claramente apoyan esta conclusión. La presencia de 300 L de aceite en la solución inicial del carotenoide a digerir, en solución inidividual, ofrece la misma accesibilidad final para el pigmento que la solución que contiene sólo 100 L de aceite. Pero los resultados obtenidos también indican que en función del tipo de pigmento considerado, su EM, es decir, su digestibilidad potencial, incrementará o disminuirá en función de sus características físico-químicas. La presencia en la mezcla de otro pigmento es la que promueve las modificaciones debido al proceso de interacción. RESULTADOS Y DISCUSIÓN -107- Tabla 7.- Análisis de varianza del experimento factores implicados en la micelarización de carotenoides en matrices lipofílicas. factor ∑ cuadrados GL cuadrado medio valor F p modelo 7,73 7 1,10 71,71 <0,0001 1 1,88 1 1472,14 122,36 <0,0001 2 2,67×10-4 1 1,22 0,017 0,8959 3 0,38 1 1090,24 24,50 <0,0001 interacción 1/2 0,01 1 23,35 0,66 0,4220 interacción 1/3 5,24 1 2674,96 340,23 <0,0001 interacción 2/3 0,11 1 35,41 7,46 0,0094 interacción 1/2/3 0,10 1 7,68 6,77 0,0130 1, tipo y mezcla de carotenoides; 2, cantidad de colesterol en la matriz; 3, cantidad de aceite en la matriz RESULTADOS Y DISCUSIÓN -108- Se ha expuesto que para ésteres de luteína, un incremento de la cantidad de aceite supuso un aumento significativo en la proporción del pigmento micelarizado. En el estudio de Roodenburg y colaboradores (2000), la bioaccesibilidad de ésteres de luteína también se incrementó significativamente cuando aumentó la cantidad de grasa en la dieta. Según ese estudio, este aumento en la cantidad de grasa ingerida incrementaría la capacidad de emulsionar a los ésteres de luteína, lo que es necesario y fundamental para su posterior incorporación micelar, debido a su mayor liposolubilidad en comparación a la de carotenos y xantofilas. Nuestros resultados demuestran que la adición de 100 L de aceite, proporciona las condiciones más adecuadas para facilitar la emulsión de ésteres de luteína y su posterior micelarización. Pero el comportamiento detectado para ésteres de luteína no se reproduce con licopeno y luteína. Se observa como la eficiencia de micelarización de licopeno disminuyó cuando se adicionó aceite en la solución inicial a digerir. Es posible que las necesidades físico-químicas en cuanto a concentración de sales biliares y actividad de la lipasa, para emulsionar licopeno, sean muy diferentes a las empleadas para emulsionar ésteres de luteína, cuando se incrementa la cantidad de aceite en la solución. En el estudio de Roodenburg, el incremento de grasa en la ingesta supuso una disminución en la bioaccesibilidad final de carotenos como - y -caroteno, aunque las diferencias no fueron significativas respecto a las observadas cuando se ingiere una comida de menor contenido en grasas. Esta disminución podría correlacionarse con la obtenida, en nuestro caso para licopeno, cuando se incrementa la cantidad de aceite en la solución inicial a digerir. La introducción de colesterol en el proceso de micelarización de carotenoides fue la principal novedad en este estudio y, el factor de cuya interacción con el resto (cantidad de aceite en la matriz y tipo y mezcla de carotenoides) se derivan los cambios más significativos en la eficiencia de micelarización. La Tabla 8 muestra los resultados correspondientes a la EM observada para soluciones de licopeno y luteína sometidos al proceso de digestión in vitro con diferentes cantidades de colesterol y aceite. La adición de 50 mg o 150 mg de colesterol en la solución inicial a digerir, no produjo ninguna variación en los niveles de micelarización de RESULTADOS Y DISCUSIÓN -109- luteína y licopeno respecto a los obtenidos en ausencia de dicho compuesto lipofílico. De hecho, el análisis de varianza (Tabla 7) mostró que el factor cantidad de colesterol en la matriz no es significativo en la EM. Tabla 8.- Efecto de la adición de colesterol y aceite en la EM de licopeno y luteína. cantidad de colesterol (mg) cantidad de aceite (L) EM (%) licopeno luteína 50 0 29,66±1,83 3,058±0,69 50 100 4,162±0,75 5,939±0,96 150 0 27,67±1,27 2,254±0,30 150 100 4,120±0,72 10,17±1,41 RESULTADOS Y DISCUSIÓN -110- Sin embargo, cuando colesterol y aceite vegetal se adicionaron inicialmente, sí se produjeron diferencias significativas respecto a los niveles de micelarización iniciales. Esto puede deberse a que las necesidades físico-químicas en cuanto a concentración de sales biliares y actividad de la lipasa pancreática, para emulsionar pigmentos y colesterol, sean muy diferentes a las necesitadas para facilitar la emulsión de ambos compuestos lipofílicos, cuando se incrementa la cantidad de aceite en la solución. Según los datos expuestos en la Tabla 8, la EM de licopeno disminuyó en presencia de colesterol y 100 L de aceite, alcanzando valores similares con 50 mg y con 150 mg (4,16% y 4,12%, respectivamente). Esta disminución fue significativamente mayor que la observada para este pigmento con 100 L de aceite (11,51%). El efecto opuesto se observó para luteína. La adición de colesterol, a ambos niveles, y 100 L de aceite, incrementó significativamente su incorporación micelar en comparación a la obtenida por una solución de luteína con 100 L de aceite sólo (3,20%). El nivel de micelarización obtenido al añadir 50 mg de colesterol y 100 µL de aceite a la solución de pigmento (5,94%) fue significativamente menor que el obtenido al adicionar al medio 150 mg de colesterol y 100 µL de aceite (10,17%). El análisis de la varianza confirmó la interacción entre los factores cantidad de aceite en la matriz y cantidad de colesterol en la matriz (Tabla 7), con diferentes resultados sobre la eficiencia de micelarización en función de la polaridad del pigmento. La Figura 20 representa el efecto de los factores colesterol y presencia de aceite sobre licopeno (Figura 20a) y luteína (Figura 20b). La orientación y forma de las curvas difiere para cada pigmento, puesto que la interacción entre los factores tiene consecuencias sinérgicas pero de sentido contrario para cada uno de ellos. RESULTADOS Y DISCUSIÓN -111- 50,0 100,0 150,0 0,0 50,0 100,0 6 10 14 18 22 Cantidad de aceite (  L) Cantidad de colesterol (mg) moles de luteína en micelas Figura 20.- Representación de la superficie-respuesta de licopeno (a) y luteína (b) en los experimentos de micelarización con la adición de distintas cantidades de aceite y colesterol. a 50,0 100,0 150,0 0.0 50,0 100,0 6 12 18 24 30 36 moles de licopeno en micelas Cantidad de colesterol (mg) Cantidad de aceite (  L) a b RESULTADOS Y DISCUSIÓN -112- La interacción entre los factores cantidad de aceite en la matriz y cantidad de colesterol en la matriz, y su diferente efecto sobre la micelarización de xantofilas y carotenos podría deberse a diversas razones. Hay que tener muy en cuenta la localización de colesterol en las micelas para poder dar una explicación a los resultados obtenidos. Como consecuencia de su carácter débilmente polar, tiende a solubilizarse en el centro de las micelas, donde interaccionan las regiones hidrofóbicas de ácidos biliares y fosfolípidos. Por lo tanto, una adición de colesterol a la solución inicial de carotenoide a digerir puede causar un desplazamiento de los carotenoides que se incorporan en el interior de las micelas debido a sus características hidrofóbicas, como es el caso de licopeno. El nivel de micelarización de un pigmento apolar se minimizaría incorporándose preferentemente colesterol y triglicéridos a las micelas, implicando por tanto una incorporación competitiva. Una segunda razón podría deberse a un aumento de la rigidez del centro de las micelas debida al colesterol, que formaría una barrera que impediría el paso de carotenos al interior de las micelas. Un efecto similar se ha observado en la incorporación micelar de carotenos a membranas celulares con un alto contenido en colesterol (Lancrajan y colaboradores, 2001). Socaciu y colaboradores (2000), también demostraron que la incorporación de -caroteno a liposomas enriquecidos con colesterol fue mucho menor que la cantidad incorporada cuando el caroteno se añadió a liposomas libres de colesterol. Para las xantofilas la situación es diferente, se localizan en la zona más externa de las micelas debido a la polaridad que le proporciona los grupos hidroxilo de su estructura. Estos grupos funcionales también facilitan una orientación diferente del pigmento en las micelas que incrementa su agregación próxima a fosfolípidos y sales biliares. En este caso la presencia inicial de colesterol en la matriz favorece la incorporación de compuestos polares que se sitúan en la zona más externa de las micelas. Las diferencias físico-químicas de los carotenoides (consecuencia de sus características estructurales), origina la necesidad de un entorno lipofílico distinto para facilitar la emulsión de estos pigmentos y su posterior incorporación micelar. La modificación en la composición de la matriz lipofílica causa cambios cualitativos y cuantitativos en la eficiencia de micelarización, en función de la clase de pigmento, subrayando la interacción entre colesterol y presencia de RESULTADOS Y DISCUSIÓN -113- aceite como los factores que modifican sustancialmente las características lipofílicas del medio donde tiene lugar la micelarización de carotenoides. Eficiencia de la hidrólisis enzimática sobre ésteres de luteína y su incorporación micelar Como particularidad estructural de las xantofilas hidroxiladas, la esterificación supone un incremento de la apolaridad de la xantofila respecto a su correspondiente forma libre, lo que modifica completamente su comportamiento durante la fase de micelarización así como los requerimientos físico-químicos del proceso digestivo (composición de la matriz lipofílica, enzimas y sales biliares) para aumentar la EM, haciendo un énfasis especial en el hecho de que las xantofilas esterificadas tienen que ser hidrolizadas para que se absorban eficientemente por los enterocitos (ver página 42). Cuando se han expuesto los resultados sobre la EM de ésteres de luteína y los factores que la modulan, no se ha mencionado el estado, si libre o esterificado, en el que dicho pigmento se incorpora a micelas y por tanto en el que es potencialmente bioaccesible a las células del epitelio intestinal. En la Figura 21 se representa el cromatograma correspondiente al análisis por HPLC de un extracto carotenoide obtenido tras someter al proceso de digestión in vitro a una disolución de ésteres de luteína, (sin separar la fracción micelar). La mayor parte de luteína se mantiene en su forma esterificada y sólo un 1% es eficientemente hidrolizado por la lipasa pancreática que se añade durante la fase intestinal de la digestión in vitro. Se confirma la escasa afinidad de la lipasa pancreática sobre los ésteres xantofílicos, hecho ya apreciado por Breithaupt y colaboradores (2002b). Este grupo de investigación demostró que la lipasa pancreática humana no hidroliza de forma eficiente a los ésteres de xantofilas como -criptoxanteno, zeaxanteno, luteína y capsanteno, mientras que la lipasa pancreática porcina y la lipasa de Candida rugosa sí mostraron una cierta actividad sobre dichos ésteres, aunque la eficiencia no llegue a ser significativa. RESULTADOS Y DISCUSIÓN -114- 1 2 EL 3 uni. absorbancia ( = 450 nm) tiempo Figura 21.- Cromatograma correspondiente al análisis por HPLC de un extracto carotenoide obtenido tras someter al proceso de digestión in vitro a una disolución de ésteres de luteína, (sin separar la fracción micelar). 1, luteína libre; 2, isómeros de luteína libre; 3, patrón interno; EL, ésteres de luteína. RESULTADOS Y DISCUSIÓN -121- gramos de producto según consta en el etiquetado sino la mitad, siempre y cuando supongamos que la eficiencia de las etapas de absorción (digestibilidad y asimilación) sean máximas, hecho del cual probablemente el lector ya dude. Son precisamente estas dos aclaraciones (1, si retinol está presente en el producto como tal o el valor de vitamina A se refiere al compuesto provitamínico -caroteno, y 2, la no equivalencia directa entre retinol y - caroteno en el cálculo de ER) las que serían necesarias para completar el etiquetado del producto. En esa misma tabla también se exponen los datos de la cantidad de -caroteno incorporado a micelas, expresada en microgramos de -caroteno por cada 100 gramos de producto digerido, según las condiciones de digestión in vitro expuestas en la sección de Materiales y Métodos. De la digestión de las muestras M1, M3, y M8 no se produjo incorporación de -caroteno a la fracción micelar mientras que se observó una incorporación relativamente baja en el caso de la muestra M2 (4 g de -caroteno/100 g) y para el resto de muestras se obtuvieron valores similares de micelarización (20 g de -caroteno/100 g). La EM de -caroteno es pequeña con valores en un rango del 0,5 al 4%. Olson (1994) indica un valor máximo de eficiencia en la absorción de carotenoides del 30%. Varios estudios de bioaccesibilidad in vivo de -caroteno, indican valores diversos según el tipo de alimento utilizado en el estudio, pero que son siempre superiores al valor de digestibilidad aquí encontrado (6%-34%). Hay que destacar que estos valores se corresponden con la bioaccesibilidad, que comprende la etapa de micelarización (digestibilidad) y la etapa de asimilación. RESULTADOS Y DISCUSIÓN -122- Tabla 10.- Composición media y cantidad de -caroteno micelar por cada 100 gramos de producto en las materias grasas para untar utilizadas en el estudio. Declarado por el fabricante Valores experimentales Grasa (g) Esteroles (g) Fibra (g) ER (g) -caroteno (g)1 -caroteno micelar (g)2 M1 32 8 -3 800 587 ND4 M25 35 7,5 - 800 840 3,78 M35 41 - 2 - 411 ND M45 40 - - 560 512 21,7 M55 41 - - 275 621 18,4 M6 55 - - 600 ND NE6 M75 60 - - 800 753 19,7 M8 73 - - 751 237 ND 1Microgramos de -caroteno por cada 100 gramos de producto según determinación experimental. 2Microgramos de -caroteno incorporado a micelas por cada 100 gramos de producto según determinación experimental. 3Ausente. 4ND, no detectado. 5En la etiqueta consta el uso de -caroteno como colorante añadido. 6NE, no efectuado al no contener -caroteno en la muestra original. RESULTADOS Y DISCUSIÓN -123- Pero, la eficiencia determinada en este estudio se corresponde sólo con la etapa de digestibilidad con lo que es de suponer que la bioaccesibilidad de -caroteno a partir de las materias grasas utilizadas en este estudio será inferior. A continuación se consideran aquellos constituyentes de la matriz alimentaria que pueden haber limitado la incorporación de - caroteno desempeñando un rol de compuestos interferentes. Fitoesteroles Según el etiquetado, las muestras M1 y M2 contienen 8 y 7,5 gramos de fitoesteroles por cada 100 gramos de producto. A pesar del contenido significativo de -caroteno inicial, la digestibilidad de éste fue de las más bajas (nula en el caso de M1 y 3,78 g/100 g para M2). El hecho de que la presencia de fitoesteroles en la ingesta disminuye sensiblemente la absorción de colesterol, es conocido, al interferir en la solubilización y micelarización de éste (De Jong y colaboradores, 2003; Rozner y Garti, 2006). Los fitoesteroles actúan como interferentes en el proceso de micelarización desplazando a los compuestos liposolubles que necesitan incorporarse a micelas para poder ser transportados de forma eficiente al epitelio intestinal. Para las vitaminas liposolubles y carotenoides, esta interferencia representa una desventaja ya que se evita la incorporación de estos compuestos de propiedades beneficiosas para la salud (Quilez y colaboradores, 2003). Por ello se recomienda controlar la ingesta de alimentos enriquecidos en fitoesteroles en aquellos grupos de población con necesidades nutritivas elevadas (niños y adolescentes, que están en período de crecimiento, embarazadas, madres lactantes y personas que sufren de alteraciones en el aparato digestivo, atletas, etc). Fibra La muestra M3 indica en su etiquetado la presencia de 2 gramos de fibra por cada 100 gramos de producto. Los resultados obtenidos nos indican una digestibilidad nula del - caroteno que contiene. Varios estudios anteriores ya habían observado el efecto negativo de la fibra en la absorción de carotenoides (Riedl y colaboradores, 1999). La fibra va a actuar como interferente en la formación de micelas, hecho que resulta imprescindible para el transporte de componentes liposolubles desde la matriz alimentaria a la pared del epitelio. En este caso no se trata de un desplazamiento de compuestos como en el caso de los fitoesteroles sino que la RESULTADOS Y DISCUSIÓN -124- formación de micelas no tiene lugar, o bien éstas no están lo suficientemente estabilizadas y tienden a disgregarse. La fibra forma enlaces con los ácidos biliares, imprescindibles en el proceso de micelarización, ralentiza el proceso de difusión desde la matriz formando geles que en definitiva evitan la formación de micelas y la transferencia de compuestos liposolubles a las mismas. Grasa La grasa es el factor clave en la digestibilidad de carotenoides. Tanto la cantidad como el tipo de grasa presente en la matriz delimitan la eficiencia de la digestibilidad de estos compuestos. En estudios anteriores se ha comprobado que se necesita una mínima cantidad de grasa para asegurar la incorporación de carotenoides a micelas ya que facilita la transferencia desde la matriz alimentaria, solubilizando a los carotenoides en glóbulos lipídicos, y posteriormente, participan en la formación de las micelas. Se ha establecido la cantidad mínima de grasa que se requiere (3 a 6 gramos) para alcanzar una eficiente digestibilidad de carotenoides (van het Hof y colaboradores, 2000). También se ha comprobado que un aumento en la cantidad de grasa ingerida no implica un aumento en la digestibilidad de carotenoides e incluso puede llegar a ser interferente (Roodenburg, 2000; resultados del presente estudio). Los datos obtenidos indican una digestibilidad muy similar en muestras con diferente contenido en grasa (exceptuando a las muestras comentadas M1, M2 y M3 que contienen otros componentes interferentes). Esta afirmación se verifica en las muestras M4, M5, y M7 en las que se alcanzó una cantidad de -caroteno micelar muy parecida, quizás con tendencia a disminuir a medida que aumenta el contenido graso, pero las diferencias no llegan a ser significativas. Sin embargo, para la muestra M8, la de mayor contenido graso, no se observó la incorporación de -caroteno a las micelas. Es cierto que esta muestra, a excepción de la muestra M6, es la de menor contenido en -caroteno (237 g/100 g) pero este hecho no debería haber supuesto ningún impedimento. Más bien, es el elevado contenido en grasa el que debe haber desempeñado un papel negativo por las siguientes causas. Un alto contenido en grasa puede impedir una eficiente solubilización desde la matriz a los glóbulos lipídicos y posteriormente a las micelas saturando de material lipídico la composición de éstas y RESULTADOS Y DISCUSIÓN -125- desplazando a -caroteno. Una segunda posible causa es la cantidad necesaria de sales biliares y enzimas hidrolíticas para digerir una matriz de alto contenido graso. En estos ensayos, las condiciones de digestión se han mantenido constantes (el modelo de digestión es de tipo estático), por lo que es posible que se haya producido un descenso en la eficiencia de la micelarización debido a una escasa digestión de la matriz. Por tanto parece que una matriz de elevado contenido graso no facilita, en las condiciones de digestión ensayadas, la micelarización del -caroteno que contiene, o requiere de unas condiciones de digestión adaptadas a esa composición. Enriquecimiento de las matrices con -caroteno y efecto en la digestibilidad A la vista de los resultados de digestibilidad de -caroteno obtenidos con las muestras originales, y considerando la escasa incorporación a micelas, se planteó si un incremento en la cantidad de -caroteno inicialmente presente en la matriz produciría un aumento en la cantidad de -caroteno micelar, compensando en parte el efecto negativo que los compuestos interferentes ejercen en su digestibilidad. Para ello una sub-muestra de cada materia grasa en estudio se enriqueció con -caroteno hasta alcanzar una concentración de 50 g de - caroteno/g de producto. Tras someter cada matriz enriquecida al proceso de digestión se calculó la cantidad de -caroteno micelar, datos que se presentan en la Tabla 11. En todos los casos se observó un incremento en la cantidad de -caroteno micelar, incluso en aquellas muestras en las que originalmente éste no se incorporó a las micelas a pesar de que la matriz sí lo contenía (M1, M3 y M8). En el caso de la muestra M6, sin -caroteno en la matriz original, se produjo una incorporación eficiente de -caroteno desde la matriz enriquecida. Un aumento del contenido de -caroteno en la matriz, supone por tanto un aumento en la cantidad de - caroteno micelar. Sin embargo, este hecho no implica que el enriquecimiento suponga una mejora cualitativa de la digestibilidad, puesto que los factores de la matriz siguen interfiriendo en la incorporación de -caroteno a las micelas. Para constatar este argumento, se calculó la EM (datos indicados entre paréntesis en la Tabla 11). Así, en el caso de la muestra M2 se alcanzó una eficiencia del 0,45% y 0,41% en la matriz original y enriquecida, respectivamente. Es decir, un aumento de la cantidad de -caroteno en la matriz, supone un aumento de la RESULTADOS Y DISCUSIÓN -126- cantidad de -caroteno micelar pero la eficiencia es la misma, lo que indica que el enriquecimiento con -caroteno no es la estrategia más adecuada para aumentar la EM desde esta matriz ya que se estaría desaprovechando gran parte del -caroteno añadido. Esta situación se reproduce en las muestras M4, M5 y M7. El caso particular de la muestra M4 es llamativo por el descenso significativo en la eficiencia de la digestibilidad que supone el enriquecimiento con -caroteno de la matriz, máxime cuando en ésta no existen factores interferentes (fitoesteroles y/o fibra). Al mantenerse constantes las condiciones de digestión es posible que se haya producido un descenso en la EM debido a una menor digestión de la matriz. Distinta es la consideración de las muestras M1, M3 y M8 que a pesar de presentar - caroteno en la matriz original, éste no se incorporó. Cuando se realizó el experimento con estas matrices, enriquecidas con -caroteno se observó que éste se incorporaba, pero obteniendo valores similares de eficiencia a los de las muestras M4, M5 y M7. Se puede concluir entonces que el enriquecimiento de -caroteno de esas matrices (M1, M3, M8) no supone un salto cualitativo en la eficiencia de la micelarización. Tampoco lo es en el caso de la muestra M6, que no contiene -caroteno originalmente. El enriquecimiento, estrictamente adición en esta muestra, sí produjo la incorporación de -caroteno a micelas alcanzando la mayor EM de todas las muestras analizadas (4,83%). Con los resultados obtenidos se puede indicar que ninguna de las materias grasas analizadas representa un vehículo idóneo para la digestibilidad de -caroteno considerando la baja eficiencia alcanzada en la micelarización. Varias muestras presentan diversos componentes claramente interferentes en el proceso de micelarización como fitoesteroles y fibra. Estos compuestos limitan extraordinariamente la digestibilidad de componentes liposolubles como los carotenoides llegando a impedir en algunos casos su micelarización. Por último, el enriquecimiento de estos productos como estrategia para aumentar la digestibilidad de -caroteno no es lo más adecuado, ya que la presencia de compuestos interferentes continúa siendo determinante en la eficiencia del proceso. RESULTADOS Y DISCUSIÓN -127- Tabla 11.- Cantidad de -caroteno micelar por cada 100 gramos de producto digerido partiendo de la matriz original (MO) o la matriz enriquecida (ME) con 50 g de -caroteno/gramo de producto. -caroteno micelar. MO (g)1 -caroteno micelar. ME (g)1 M1 ND2 - 63,0 (1,38)3 M24 3,78 (0,45) 19,5 (0,41) M34 ND - 82,4 (1,81) M44 21,7 (4,24) 115,5 (2,78) M54 18,4 (2,96) 137,6 (2,62) M6 NE5 - 147,0 (4,83) M74 19,7 (2,61) 97,8 (2,00) M8 ND - 60,8 (2,14) 1 Microgramos de -caroteno por cada 100 gramos de producto según determinación experimental. 2ND, no detectado. 3Eficiencia de la micelarización (%). 4En la etiqueta consta el uso de -caroteno como colorante añadido. 5NE, no efectuado al no contener -caroteno en la muestra original. RESULTADOS Y DISCUSIÓN -128- Selección y optimización de la composición de una emulsión O/W que maximice la digestibilidad de carotenoides El estudio realizado sobre la digestibilidad de -caroteno desde materias grasas para untar, y los resultados en él obtenidos, conducen a una reflexión que se puede exponer desde dos puntos de vista. Realizando un análisis dirimente, utilizando el modelo experimental de digestión in vitro se puede sugerir que las matrices lipofílicas si bien son necesarias para asegurar la eficiencia de la micelarización y posteriormente la captación de compuestos lipofílicos bioactivos como los carotenoides, no son las más adecuadas para maximizar la EM. La formulación de unas materias grasas permite una EM superior a otras pero en ningún caso se llega a valores importantes o de referencia (30% según Olson, 1994). Pero si detenemos el análisis aquí quizás se está obviando la parte más interesante del estudio, que es realizar una reflexión de carácter constructivo y desde un punto de vista intervencionista. ¿Cómo aumentar la EM de carotenoides? Las características de la herramienta analítica que se ha utilizado en el estudio, que mimetiza el proceso digestivo, indican el camino. Gran parte del esfuerzo físico y químico del proceso digestivo se invierte en emulsionar la fracción lipídica de los alimentos ingeridos, micelarizarla y conducirla a la proximidad de la pared epitelial. Para facilitar el proceso de transferencia hasta la fracción micelar, lo más conveniente sería partir de una matriz hidrofílica en la que el material lipofílico de interés estuviera emulsionado. Esta alternativa se había expuesto en los antecedentes bibliográficos (Richelle, 2002; Pérez-Gálvez y Mínguez-Mosquera, 2004). Este tipo de formulaciones presentan varias ventajas para el consumidor, permiten la combinación selectiva de varios compuestos funcionales y en la concentración adecuada y, aplicando el criterio de diseño necesario, podrían aumentar la asimilación de dichos compuestos. El criterio de diseño adecuado es el de medir o determinar la EM puesto que no todos los agentes emulgentes facilitarán la transferencia del compuesto lipídico a las micelas. Y es aquí donde de nuevo se utiliza la herramienta analítica del modelo de digestión in vitro para llegar a la formulación adecuada, utilizando también el planteamiento experimental adecuado. Quizás el primer objetivo de este estudio tenía un marcado carácter de observación experimental mientras que el segundo necesita de un mayor esfuerzo creativo. RESULTADOS Y DISCUSIÓN -129- Como se expuso en la sección de Materiales y Métodos, la consecución de este objetivo se realizó en dos etapas de experimentación. De igual forma la exposición de resultados y discusión responde a esas dos etapas. Fase de barrido experimental: detección de factores críticos En esta fase se trataba de identificar aquellos factores (emulgentes) que producen un efecto relevante en la respuesta, es decir, maximizan la EM del perfil carotenoide presente en la matriz hidrofílica. Los resultados obtenidos tras la aplicación del diseño experimental aplicado (SL) en la primera fase se muestran en la Tabla 12, mientras que los correspondientes coeficientes de regresión estimados por el método de los mínimos cuadrados se exponen en la Tabla 13. Los emulgentes empleados en este estudio, desde el punto de vista de su estructura química, se pueden clasificar en tres grupos diferentes; ésteres de sacarosa o lipoazúcares (EMF-1, EMF-2 y EMF-3), acilglicéridos (EMF-4, EMF-5, EMF-7 y EMF-8), y poliacilglicéridos (EMF-6 y EMF-9). Antes de comentar los resultados obtenidos en este apartado, se debe realizar una breve reflexión. Tradicionalmente, en una investigación científica se aplica un nivel de confianza del 95% con un 5% de probabilidad de error (nivel de significación, p < 0,05), pero esto es un criterio convencional. En esta fase de barrido, si se tiene en cuenta ese nivel de significación, ninguno de los factores examinados podría ser considerado como crítico ya que no presentan un nivel de significación, p, inferior a 0,05 (Tabla 13). Sin embargo, diversos estudios han aplicado en experimentos de detección de factores críticos un criterio diferente, considerando un nivel de confianza del 85% con un nivel de significación, p, inferior a 0,15 (Rincón y colaboradores, 2003; Periago y colaboradores, 2004). Aún así tan solo uno de los factores analizados en el presente estudio cumpliría con este criterio (Tabla 13, término número 28, 3x4, -374,7, p = 0,08). El análisis de regresión de los datos experimentales, indican que el modelo cuadrático es el que mejor ajuste presenta aunque no llega a ser significativo (grados de libertad 54, F = 2,05, p = 0,1065). Las cantidades de R2 y R2adj se corresponden con 0,918 y 0,474, respectivamente. Existe por tanto un elevado ruido experimental y de hecho, la precisión adecuada alcanza un valor de 5,412, ligeramente superior a 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN -130- Parece difícil aplicar este criterio para reducir el modelo experimental y eliminar aquellos factores no críticos en la respuesta. Pero se puede utilizar un sistema de reducción del modelo más obvio, eliminando aquellos términos de acuerdo a otro criterio estadístico (Cornell, 2002b). Así, el criterio que se seguirá para la reducción del modelo consistirá en atender al valor absoluto del término asociado a cada factor, seleccionando aquellos factores que presenten un valor absoluto elevado. Como además el objetivo es maximizar la respuesta (EM), se atenderá a los factores e interacciones que presenten un valor de su coeficiente de participación en el modelo elevado y positivo. Antes de realizar el análisis numérico de los resultados expuestos en la Tabla 13, para seleccionar los componentes más adecuados para la fase de optimización, se realizará un estudio del efecto de cada componente en la respuesta (EM) combinando los datos experimentales de la Tabla 12 con los valores de los coeficientes de la Tabla 13. RESULTADOS Y DISCUSIÓN -137- de R2 y R2adj se corresponden con 0,902 y 0,727, respectivamente. La precisión adecuada alcanza un valor de 8,070. Tabla 14.- Diseño experimental aplicado en la fase de optimización a los emulgentes seleccionados en la primera fase. emulgente1 Niveles (%) EMF-2 0 25 33,3 50 100 EMF-5 0 25 33,3 50 100 EMF-7 0 25 33,3 50 100 EMF-9 0 25 33,3 50 100 1mezcla de mono y diestearato de sacarosa, CAS: 25168-73-4 (EMF-2) gliceril-palmito-estearato, CAS: 8067-32-1 (EMF-5) propilenglicol-laurato, CAS: 27194-74-7 (EMF-7) hexagliceril-diestearato, CAS: 34424-97-0 (EMF-9). RESULTADOS Y DISCUSIÓN -138- Tabla 15.- Datos experimentales de la EM obtenidos a partir de la aplicación del diseño experimental (SC) en la fase de optimización. prueba emulgente1 EM (%) EMF-2 EMF-5 EMF-7 EMF-9 1 50 0 50 0 20,6 2 33,3 33,3 33,3 0 13,8 3 0 100 0 0 11,3 4 25 25 25 25 17,3 5 50 0 0 50 5,71 6 33,3 0 33,3 33,3 19,9 7 0 0 50 50 13,1 8 0 0 100 0 7,89 9 0 33,3 33,3 33,3 11,4 10 100 0 0 0 5,98 11 0 0 0 100 3,39 12 33,3 33,3 0 33,3 5,10 13 0 50 0 50 5,96 14 50 50 0 0 4,30 15 0 50 50 0 4,28 1mezcla de mono y diestearato de sacarosa, CAS: 25168-73-4 (EMF-2) gliceril-palmito-estearato, CAS: 8067-32-1 (EMF-5) propilenglicol-laurato, CAS: 27194-74-7 (EMF-7) hexagliceril-diestearato, CAS: 34424-97-0 (EMF-9). RESULTADOS Y DISCUSIÓN -139- Tabla 16.- Valores y significación de los coeficientes de los factores e interacciones entre factores del modelo experimental generado a partir de los resultados experimentales expuestos en la Tabla 15. Número término modelo1 valor coeficiente p 1 2 5,3 0,14 2 5 10,6 0,02 3 7 6,9 0,07 4 9 2,7 0,41 5 2  5 -10,6 0,45 6 2  7 66,9 0,00 7 2  9 11,7 0,40 8 5  7 -9,9 0,48 9 5  9 1,0 0,94 10 7  9 42,2 0,02 1Cada número se corresponde con un emulgente: 2: mezcla de mono y diestearato de sacarosa, CAS: 25168-73-4 (EMF-2) 5: gliceril-palmito-estearato, CAS: 8067-32-1 (EMF-5) 7: propilenglicol-laurato, CAS: 27194-74-7 (EMF-7) 9: hexagliceril-diestearato, CAS: 34424-97-0 (EMF-9). RESULTADOS Y DISCUSIÓN -140- Todavía se puede ajustar la formulación óptima de la emulsión que origina una respuesta máxima si se observan las interacciones entre emulgentes de la Tabla 16. Así, el emulgente EMF-5 está implicado en dos medios antagónicos con EMF-2 y EMF-7, así que este ingrediente puede ser eliminado de la mezcla final para no disminuir el valor de la respuesta máxima optimizado. Con ello, parece que la mezcla de componentes que proporcionará la respuesta máxima incluye a EMF-2, EMF-7 y EMF-9 (EMF-2: mezcla de mono y diestearato de sacarosa, CAS: 25168-73-4; EMF-7: propilenglicol-laurato, CAS: 27194-74-7; EMF-9: hexagliceril-diestearato, CAS: 34424-97-0). Es el momento de calcular la composición de la formulación que, con los tres componentes seleccionados maximiza la respuesta según el modelo. Se trata de calcular el punto estacionario del sistema (matemáticamente, un punto de la función cuadrática cuya derivada es cero, y que, desde un punto de vista práctico muestra la mejor combinación de los ingredientes, para obtener el máximo nivel de micelarización). Este punto se obtuvo a través de una mezcla de los siguientes compuestos: EMF-2 (36,73%), EMF-7 (45,26%) y EMF-9 (18,01%), alcanzando la máxima respuesta, EM = 23,07% (Figura 23). La presencia de EMF-2 en la formulación óptima es un ejemplo de porqué los efectos individuales de la fase de barrido no se deben considerar definitivos. Si se hubieran considerado los efectos individuales como criterio para descartar componentes (Tabla 13), se habría eliminado al componente EMF-2 de la lista de ingredientes para realizar la fase de optimización pero, como se mencionó anteriormente, en esta etapa del experimento aquellos efectos individuales no debían utilizarse como criterio discriminativo. Es posible encontrar referencias bibliográficas sobre fármacos elaborados con alguno de los ingredientes que maximizan la EM. Okamoto y colaboradores (2005) emplearon EMF-7 para incrementar la transferencia del compuesto activo al tejido diana. El empleo de EMF-7 produciría un efecto denominado salting-in, incrementando la fluidez de la interfase y disminuyendo la polaridad del entorno acuoso. Este efecto mejoraría la transferencia de los compuestos lipofílicos a las micelas (Garti y colaboradores, 2001; Yaghmur y colaboradores, 2002). La adición de EMF-9 también facilitaría la solubilización de los carotenoides y su RESULTADOS Y DISCUSIÓN -141- posterior transferencia a las micelas. Su uso en medicamentos se ha descrito recientemente (El-Kamel y colaboradores, 2007). La aplicación de un diseño experimental permitió la creación de una formulación con el objetivo de maximizar la digestibilidad de compuestos bioactivos (como los carotenoides). Este procedimiento ofrece la posibilidad de obtener la composición de una formulación que proporcione la máxima digestibilidad de carotenoides. El diseño de alimentos funcionales necesita la estimación de la digestibilidad de estos compuestos bioactivos como criterio de control, por lo que la investigación analítica llevada a cabo en este trabajo puede ser de gran interés en la industria alimentaria para examinar y controlar aquellos factores y componentes de la matriz que modifiquen la digestibilidad de componentes bioactivos y, consecuentemente, seleccionar aquella composición óptima que facilite la mayor disponibilidad. RESULTADOS Y DISCUSIÓN -142- Figura 23.- Contorno para la respuesta EM en la mezcla compuesta por los emulgentes EMF-2, EMF-7 y EMF-9 y localización del punto estacionario que maximiza la respuesta. 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 EMF-9 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 6 20 8 10 12 14 16 18 EMF-2 EMF-7 Punto estacionario (18,01; 36,73; 45,26) EM = 23,07 RESULTADOS Y DISCUSIÓN -143- Eficiencia de la asimilación de carotenoides suministrados como complejos de inclusión con -ciclodextrina en un modelo in vitro. Efecto de inhibidores lipoproteicos El modelo de difusión pasiva que explica la absorción de compuestos lipídicos a través de la membrana de los enterocitos, presente en la mayoría de revisiones y volúmenes científicos dedicados a la absorción de nutrientes, está siendo sometido a una extensa revisión en los últimos años. Los resultados obtenidos con diferentes modelos experimentales, in vitro e in vivo, están proporcionando evidencias acerca de la existencia de transportadores que facilitan la absorción de compuestos lipofílicos como colesterol (libre o esterificado), triacilglicéridos y fosfolípidos (Compassi y colaboradores, 1995; Werder y colaboradores, 2001; von Bergmann y colaboradores, 2005). Alguno de los transportadores identificados son los receptores residuales tipo B, determinante de grupo 36 (CD36) y la proteína Niemann-Pick C1- Like 1 (NPC1L1). El modelo de difusión facilitada da explicación a la significativa variabilidad entre individuos de la eficiencia en absorción de compuestos lipídicos (Borel y colaboradores, 1998; Pérez-Gálvez y colaboradores, 2005) y conjuga diferentes situaciones patofisiológicas del epitelio intestinal con deficientes niveles de absorción de lípidos, situaciones que no eran totalmente compatibles con el modelo de absorción de difusión simple. La implicación de los transportadores mencionados anteriormente, en el proceso de asimilación de lípidos se ha demostrado utilizando inhibidores competitivos como apolipoproteínas y lipoproteínas del suero, péptidos -helicoidales anfipáticos, y fármacos de síntesis como la ezetimiba. Algunos de los indicios que promovieron la búsqueda del actual mecanismo de absorción para colesterol y otros compuestos lipofílicos también se intuían para otros compuestos como los carotenoides. Esta familia de isoprenoides, cuya presencia en el organismo de los mamíferos se debe exclusivamente a la dieta, desarrolla una serie de funciones y acciones biológicas de significativo interés en la salud humana, por lo que los eventos asociados a su asimilación se estudian con atención. Los ensayos clínicos in vivo mostraban una gran variabilidad de la eficiencia de absorción entre individuos, apareciendo el concepto de norespondedores; también se demostraba la competencia por la absorción entre diferentes RESULTADOS Y DISCUSIÓN -144- compuestos, la tendencia a acumular en tejidos biológicos un grupo reducido de carotenoides a pesar de que la ingesta de frutas y vegetales aporta un número más amplio, e incluso la existencia de esteroespecificidad en la absorción (Khachik y colaboradores, 1991; 1992; van den Berg, 1999; During y colaboradores, 2002). Todos estos indicios hacían pensar en la posibilidad de un mecanismo de transporte de difusión facilitada, similar o incluso coincidente con el de colesterol. La prueba definitiva llegó con el estudio de Kiefer y colaboradores (2002) en el que se demostró que un receptor residual, denominado ninaD, es esencial para la absorción de carotenoides y que la secuencia que codifica ese receptor es significativamente homóloga al receptor residual tipo B presente en mamíferos. Posteriormente, se han publicado estudios que sustentan la anterior evidencia y la analogía con el mecanismo de absorción propuesto para colesterol y otros lípidos. El receptor residual tipo B, es esencial para la absorción de - caroteno como lo demuestra el estudio de van Bennekum y colaboradores (2005) en el que, utilizando ratones SR-BI knock-out, se observó un descenso significativo de la absorción intestinal de la provitamina A, en comparación con el grupo control. Reboul y colaboradores (2005) extienden la implicación de SR-BI al transporte de luteína. Pero, al igual que para colesterol, el receptor residual SR-BI no es el único implicado en la asimilación celular de carotenoides como lo demuestra el estudio de During y colaboradores (2005). Utilizando un modelo experimental in vitro y tratando las células con un inhibidor del transporte para colesterol, ezetimiba, se observa cómo la eficiencia de la absorción disminuye significativamente aunque no por igual para todos los carotenoides incluídos en el estudio y que el tratamiento con ezetimiba disminuye la expresión de los genes que codifican transportadores de lípidos como SR-BI, NPC1L1 y ABCA1. En la absorción de carotenoides existe más de un transportador implicado aunque es posible que la afinidad de cada uno de ellos por los diferentes carotenoides de la dieta no sea la misma. Recientemente, el trabajo de Moussa y colaboradores (2008) especifica la preferencia del receptor SR-BI en la asimilación de licopeno frente al transportador NPC1L1. La reconstrucción del proceso de absorción de lípidos, en lo referente al mecanismo de asimilación por las células del epitelio intestinal ha abierto nuevas vías para inhibir RESULTADOS Y DISCUSIÓN -145- intencionadamente la asimilación de colesterol. A las alternativas ya existentes del uso de esteroles vegetales, que compiten con el colesterol por la incorporación a micelas, y las resinas poliméricas que secuestran las sales biliares (cholestyramine, colestipol) se unen los fármacos que bloquean los transportadores que facilitan la asimilación (Norata y Catapano, 2004). La interferencia a cualquier nivel del proceso de asimilación de colesterol afectará a la asimilación de otros lípidos de la dieta como las vitaminas liposolubles y los carotenoides. De hecho, se recomienda un incremento del consumo de frutas y vegetales cuando se ingieren fitoesteroles para evitar un descenso en los niveles plasmáticos de vitaminas liposolubles y carotenoides (Noakes y colaboradores, 2002; Colgan y colaboradores, 2004). Esta recomendación resulta efectiva puesto que la interferencia en el proceso de micelarización y asimilación tiene lugar sólo cuando se ingieren los fitoesteroles, y su efecto no se perpetúa (Heinemann y colaboradores, 1991). Sin embargo, el tratamiento con fármacos puede tener un efecto más prolongado debido a su metabolismo y modus operandi. Por ejemplo la ezetimiba se metaboliza en el hígado mediante enzimas de fase II generando el compuesto glucuronidizado, que retorna al intestino donde desarrolla una acción más potente que la ezetimiba inicial (van Heek y colaboradores, 2000). Si la opción escogida para disminuir la absorción de colesterol es el tratamiento con fármacos que bloqueen su transporte en el epitelio intestinal e incluso disminuyan la expresión génica de los transportadores implicados en la difusión facilitada, no está claro si un incremento en la dieta del consumo de frutas y vegetales podría compensar el descenso en los niveles plasmáticos de vitaminas liposolubles y carotenoides. Las ciclodextrinas son oligomaltosacáridos cíclicos obtenidos a partir del almidón mediante una reacción de ciclación enzimática por la ciclodextrin glucosiltransferasa. La extraordinaria habilidad para formar complejos de inclusión con moléculas hidrofóbicas que son albergadas en el interior de la cavidad tórica de la ciclodextrina, ha generado una amplia diversidad de usos en áreas como la agricultura, la química analítica, la alimentación, el sector farmacéutico y productos de higiene, cosmética y limpieza (Singh y colaboradores, 2002). En alimentación sus usos más extendidos incluyen la protección y liberación controlada de compuestos flavorizantes, la eliminación de sabores y la estabilización de emulsiones como salsas, cremas, mantequillas y mayonesas. Dentro de la serie de ciclodextrinas (-, -, , y - RESULTADOS Y DISCUSIÓN -146- ciclodextrina) es la -ciclodextrina la que más comúnmente se aplica en formulaciones farmacéuticas y la que más ha sido estudiada en humanos (Martin Del Valle, 2004). La propiedad de las ciclodextrinas que las convierte en compuestos relevantes en el ámbito farmacéutico, consiste en su habilidad de aumentar la asimilación de fármacos hidrofóbicos, actuando como transportadores hasta la proximidad de la membrana biológica (piel, mucosa, córnea) incrementando la disponibilidad del fármaco complejado y su asimilación (Rajewski y Stella, 1996). El modelo de absorción in vitro basado en las VMBC se ha utilizado con éxito para evaluar la asimilación de diferentes compuestos liposolubles, incluyendo a los carotenoides (Moore y colaboradores, 1996; Lancrajan y colaboradores, 2001), así como para determinar la existencia del mecanismo de difusión facilitada mediante el uso de distintos inhibidores que bloquean la actividad de las proteínas que intervienen en el mencionado mecanismo de absorción (van Bennekum y colaboradores, 2005). En la Figura 24 se representa la cantidad carotenoide, expresada en pmol/mg proteína, incorporada a la membrana plasmática de VMBC después de 20 minutos de incubación a 37 ºC para -caroteno, luteína y licopeno, desde la suspensión Tween o desde la solución acuosa de complejos de inclusión, en función de la concentración inicial carotenoide (0,5 M, 1 M, 2,5 M). En algunos casos se puede observar una amplia desviación estándar del valor medio de absorción, a consecuencia de la dispersión de datos. Este hecho puede ser indicativo de variaciones en la composición y densidad de transportadores disponibles en las preparaciones de VMBC como ya se ha indicado anteriormente (Werder y colaboradores, 2001) al igual que ocurre in vivo (Wilson y Rudel, 1994; Carter y colaboradores, 1997).