Arthrocnemum macrostachyum y su microbioma como herramienta para la recuperación de suelos degradados

Arthrocnemum macrostachyum y su microbioma como herramienta para la recuperación de suelos degradados TESIS DOCTORAL Salvadora Navarro de la Torre Sevilla, 2017 DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA FACULTAD DE FARMACIA UNIVERSIDAD DE SEVILLA ARTHROCNEMUM MACROSTACHYUM Y SU MICROBIOMA COMO HERRAMIENTA PARA LA RECUPERACIÓN DE SUELOS DEGRADADOS SALVADORA NAVARRO DE LA TORRE SEVILLA, 2017 La Tesis Doctoral titulada “Arthrocnemum macrostachyum y su microbioma como herramienta para la recuperación de suelos degradados”, realizada por la Licenciada en Biología Dña. Salvadora Navarro de la Torre para optar al grado de Doctor en Biología Molecular y Biomedicina con Mención Internacional por la Universidad de Sevilla, se presenta con la aprobación de los Directores y el Departamento de Microbiología y Parasitología de la Universidad de Sevilla. Los directores, Fdo. Dr. Ignacio D. Rodríguez Llorente Fdo. Dra. Eloísa Pajuelo Domínguez El Director del Departamento, La doctoranda, Fdo. Dr. Miguel Ángel Caviedes Formento Fdo. Salvadora Navarro de la Torre A todas las personas que han formado parte de esta etapa de aprendizaje momento se creó en la residencia un grupo genial formado por personas de diferentes países, y ese grupo hizo que se me pasara la estanca super rápida y me quedara con muy buenos recuerdos. En el ámbito del trabajo, todo fue extraño. Me hubiera gustado aprender todo de una manera más pausada, pero la situación se dio así y el grupo se portó muy bien conmigo. Gracias a la doctora María del Carmen por acogerme en el grupo y dirigir mi estancia allí. Gracias a Lorena por pasar conmigo las dos últimas semanas a tope y enseñarme todas las técnicas quimiotaxonómicas. La realización tanto de la Tesis como de la estancia tengo que agradecérselo a la Junta de Andalucía, por darme financiación para poder realizarlas a través del proyecto P11-RNM-7274MO. Por último, quiero dar las gracias a mi familia, porque, aunque no entiendan muy bien que hago, para ellos es lo mejor. A mis padres y mi hermana, por escucharme hablar sobre mi día a día en el laboratorio, tragarse todas mis presentaciones cada vez que ensayo e intentar ayudarme, aún sin saber cómo. A Óscar, mi fei, por escuchar todos mis problemas y agobios y saber lo que hago en el laboratorio a la “perfección”: Hacer PCR de “Halomonitas” y “Halomasofitos” y ayudar a crecer a “Artronemus macroestaquea”. Gracias por quererme y apoyarme en todo momento. En definitiva, gracias a todas las personas que han estado conmigo en este periodo y me han ayudado a que sea más fácil algo que ya me era fácil por el simple hecho de que me encanta. Creo que he tenido la suerte de entrar en el mejor grupo. Gracias a todos. I ÍNDICE GENERAL Página Índice de Tablas ................................................................................................ IX Índice de Figuras ............................................................................................... XI Aportaciones a congresos y revistas ................................................................. XV Abreviaturas .................................................................................................. XVII ABSTRACT ......................................................................................................... 1 RESUMEN .......................................................................................................... 7 INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 13 1. La contaminación por metales pesados ....................................................... 15 2. La salinidad, un problema agrícola ............................................................... 20 3. Técnicas para la eliminación de contaminantes en suelos afectados .......................................................................................................... 22 3.1. Fitorremediación de metales pesados ......................................... 24 3.2. Fitorremediación de suelos salinos .............................................. 28 4. Las plantas halófitas: Arthrocnemum macrostachyum y su utilidad en fitorremediación ............................................................................. 29 5. El papel de las bacterias rizosféricas y endofíticas en la adaptación de las plantas a los ecosistemas contaminados ............................ 33 5.1. Propiedades PGP, una ayuda para la planta ................................. 35 II Página 5.2. Modificación de la rizosfera ......................................................... 38 6. Fitorremediación en las marismas del río Odiel y en las de Lebrija ............................................................................................................... 39 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................. 43 1. Recolección de muestras y análisis químicos ............................................... 45 2. Aislamiento de las bacterias cultivables ....................................................... 46 3. Extracción de ADN y amplificación del gen del ARNr 16S ............................ 48 4. Creación de árboles filogenéticos para las especies nuevas ........................ 49 5. Determinación de las condiciones del crecimiento óptimo de las posibles especies nuevas ............................................................................. 50 5.1. Rango de temperatura ................................................................. 50 5.2. Rango de pH ................................................................................. 51 5.3. Rango de sal .................................................................................. 51 5.4. Crecimiento en anaerobiosis ........................................................ 52 6. Análisis de diversidad por Box-PCR .............................................................. 52 7. Amplificación de genes relacionados con la síntesis de osmoprotectores .............................................................................................. 53 8. Actividades enzimáticas ................................................................................ 55 8.1. Actividad ADNasa ......................................................................... 55 8.2. Actividad amilasa .......................................................................... 55 8.3. Actividades catalasa y oxidasa ...................................................... 56 III Página 8.4. Actividad celulasa ......................................................................... 56 8.5. Actividad lipasa ............................................................................. 57 8.6. Actividad pectinasa ....................................................................... 57 8.7. Actividad proteasa ........................................................................ 58 8.8. Actividad quitinasa ....................................................................... 58 9. Caracterización enzimática, bioquímica y nutricional de las bacterias aisladas .............................................................................................. 60 10. Estudios quimiotaxonómicos de las bacterias seleccionadas como nuevas especies ...................................................................................... 61 10.1. Estudios del ácido diaminopimélico ........................................... 61 10.2. Análisis de los azúcares de membrana ....................................... 63 10.3. Estudio de los lípidos polares ..................................................... 64 10.4. Análisis de las quinonas .............................................................. 66 10.5. Análisis de los ácidos grasos ....................................................... 68 11. Resistencia a sal y a metales pesados ........................................................ 69 12. Propiedades PGP ........................................................................................ 70 12.1. Producción de IAA ...................................................................... 70 12.2. Producción de sideróforos ......................................................... 72 12.3. Solubilización de fosfato ............................................................. 73 12.4. Fijación de nitrógeno .................................................................. 73 12.5. Presencia de actividad ACC desaminasa .................................... 74 12.6. Formación de biopelículas .......................................................... 75 13. Selección de consorcios bacterianos .......................................................... 76 IV Página 14. Inoculación de semillas de A. macrostachyum ........................................... 77 14.1. Preparación de los inóculos bacterianos ......................................... 77 14.2. Germinación de las semillas en presencia de metales ..................... 77 14.3. Germinación de las semillas en presencia de sal ............................ 78 15. Ensayo de las plantas en suelos contaminados .......................................... 80 16. Ensayo de las plantas en presencia de sal .................................................. 81 17. Análisis del crecimiento .............................................................................. 82 18. Concentración de iones en los tejidos de las plantas ................................. 83 19. Intercambio de gases y análisis de fluorescencia de la clorofila ............................................................................................................. 83 20. Análisis de enzimas antioxidantes .............................................................. 85 20.1. Ensayo de la actividad catalasa .................................................. 86 20.2. Ensayo de la actividad ascorbato peroxidasa ............................. 88 20.3. Ensayo de la actividad superóxido dismutasa ............................ 88 20.4. Ensayo de la actividad guaiacol peroxidasa ............................... 89 21. Análisis estadísticos .................................................................................... 90 CAPÍTULO 1: Arthrocnemum macrostachyum como herramienta de fitorremediación de metales pesados ......................................................... 91 Objetivos ........................................................................................................... 93 Resultados ........................................................................................................ 95 1. Aislamiento e identificación de las bacterias cultivables de la rizosfera y los tejidos de A. macrostachyum .................................................... 95 V Página 2. Caracterización de las cepas aisladas de A. macrostachyum ....................... 98 2.1. Cribado de las actividades enzimáticas y la movilidad ............................................................................................. 98 2.2. Resistencia a sal y a metales pesados ........................................ 100 3. Cribado para las propiedades PGP in vitro ................................................. 105 4. Efecto de los metales pesados en las propiedades PGP in vitro .................. 107 5. Selección de bacterias para la formación de consorcios bacterianos ..................................................................................................... 111 6. Efecto de los consorcios seleccionados en la germinación de semillas ........................................................................................................... 112 7. Impacto de la bioaumentación de los sedimentos en la captación de iones y la capacidad de transporte de los mismos por la planta .................................................................................................... 113 8. Impacto de la bioaumentación de los sedimentos en la tolerancia de la planta al estrés por metales ................................................. 116 8.1. Efectos sobre el crecimiento de las plantas crecidas en sedimentos contaminados ........................................................... 116 8.2. Efectos sobre el aparato fotosintético de A. macrostachyum ................................................................................. 117 8.3. Efectos sobre las actividades de las enzimas antioxidantes de la planta ................................................................. 117 VI Página CAPÍTULO 2: Arthrocnemum macrostachyum como herramienta de fitodesalinización ....................................................................................... 121 Objetivos ......................................................................................................... 123 Resultados ...................................................................................................... 125 1. Aislamiento e identificación de bacterias endofitas de A. macrostachyum .............................................................................................. 125 2. Resistencia bacteriana a la sal y presencia de genes relacionados con la tolerancia a sal ................................................................ 125 3. Actividades enzimáticas y propiedades PGP mostradas por las cepas en presencia de NaCl ............................................................................ 127 4. Formación del consorcio bacteriano .......................................................... 128 5. Respuesta de la germinación de las semillas a la inoculación bacteriana ....................................................................................................... 129 6. Respuesta de la planta al combinar el efecto de la salinidad y la inoculación bacteriana ................................................................................ 131 CAPÍTULO 3: Descripción de posibles nuevas especies pertenecientes al microbioma de Arthrocnemum macrostachyum .............................................................................................. 135 Objetivos ......................................................................................................... 137 Resultados ...................................................................................................... 139 1. Morfología y caracterización fenotípica ..................................................... 139 VII Página 1.1. Género Kushneria ....................................................................... 139 1.2. Género Vibrio .............................................................................. 141 1.3. Género Pseudoalteromonas ....................................................... 141 1.4. Género Halomonas ..................................................................... 142 1.5. Género Bacillus ........................................................................... 143 1.6. Género Staphylococcus ............................................................... 143 2. Análisis filogenéticos, composición base del ADN e hibridación ADN-ADN ....................................................................................... 144 2.1. Género Kushneria ....................................................................... 144 2.2. Género Vibrio .............................................................................. 145 2.3. Género Pseudoalteromonas ....................................................... 146 2.4. Género Halomonas ..................................................................... 146 2.5. Género Bacillus ........................................................................... 149 2.6. Género Staphylococcus ............................................................... 149 3. Análisis bioquímicos y nutricionales ........................................................... 150 3.1. Género Kushneria ....................................................................... 150 3.2. Género Vibrio .............................................................................. 158 3.3. Género Pseudoalteromonas ....................................................... 158 3.4. Género Halomonas ..................................................................... 159 3.5. Género Bacillus ........................................................................... 160 3.6. Género Staphylococcus ............................................................... 161 4. Análisis quimiotaxonómicos ....................................................................... 161 4.1. Género Kushneria ....................................................................... 163 VIII Página 4.2. Género Vibrio .............................................................................. 163 4.3. Género Pseudoalteromonas ....................................................... 163 4.4. Género Halomonas ..................................................................... 164 4.5. Género Bacillus ........................................................................... 164 4.6. Género Staphylococcus ............................................................... 167 DISCUSIÓN ...................................................................................................... 169 1. Arthrocnemum macrostachyum como herramienta de fitorremediación de metales pesados ............................................................ 171 2. Arthrocnemum macrostachyum como herramienta de fitodesalinización ............................................................................................ 180 3. La microbiota de Arthrocnemum macrostachyum como fuente de nuevas especies bacterianas ........................................................... 186 CONCLUSIONES ............................................................................................... 191 CONCLUSIONS ................................................................................................ 195 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................. 199 XV APORTACIONES A CONGRESOS Y REVISTAS PUBLICACIONES EN REVISTAS Los resultados del Capítulo 1 están publicados en la revista Marine Pollution Bulletin: Navarro-Torre, S., Barcia-Piedras, J.M., Caviedes, M.A., Pajuelo, E., Redondo-Gómez, S., Rodríguez- Llorente, I.D., Mateos-Naranjo, E. (2017). Bioaugmentation with bacteria selected from the microbiome enhances Arthrocnemum macrostachyum metal accumulation and tolerance. Marine Pollution Bulletin. http://dx.doi.org/10.1016/j.marpolbul.2017.02.008. Navarro-Torre S., Mateos-Naranjo E., Caviedes M.A., Pajuelo E., Rodríguez-Llorente I.D. (2016). Isolation of plant-growth promoting and metal resistant cultivable bacteria from Arthrocnemum macrostachyum in the Odiel marshes with potential use in phytoremediation. Marine Pollution Bulletin 110: 133-142. doi: 10.1016/j.marpolbul.2016.06.070. Los resultados del Capítulo 2 están publicados en la revista Plant Biology: Navarro-Torre, S., Barcia-Piedras, J.M., Mateos-Naranjo, E., Redondo-Gómez, S., Camacho, M., Caviedes, M.A., Pajuelo E., Rodriguez-Llorente, I.D. (2017). Assesing the role of endophytic bacteria in the halophyte Arthrocnemum macrostachyum salt tolerance. Plant Biology 19(2):249-256. doi:10.1111/plb.12521. Parte de los resultados del Capítulo 3 están publicados en la revista International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology: Lucena, T., Arahal, D.R., Ruvira, M.A., Navarro-Torre, S., Mesa, J., Pajuelo, E., Rodriguez-Llorente, I.D., Rodrigo-Torres, L., Piñar, M.J., Pujalte, M.J. (en prensa). Vibrio palustris sp. nov. and Vibrio spartinae sp. nov., two new members of the Gazogenes clade, isolated from salt-marsh plants (Arthrocnemum macrostachyum and Spartina maritima). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. APORTACIONES A CONGRESOS Navarro-Torre, S., Barcia-Piedras, J.M., Mateos-Naranjo, E., Redondo-Gómez, S., Camacho, M., Caviedes, M.A., Pajuelo, E., Rodríguez-Llorente, I.D. Evaluación del papel de los endofitos en la tolerancia a la sal de Arthrocnemum macrostachyum. VII Reunión del Grupo Especializado de Microbiología de Plantas (MIP-17). Mayo 2017, Salamanca (España). Navarro-Torre, S., Barcia-Piedras, J.M., Caviedes, M.A., Pajuelo, E., Redondo-Gómez, S., Rodríguez- Llorente, I.D., Mateos-Naranjo, E. Bioaugmentation with bacteria selected from the microbiome XVI enhances Arthrocnemum macrostachyum germination, metal accumulation and tolerance. BioRemid 2017. Marzo 2017, Granada (España). Redondo-Gómez, S., Navarro-Torre, S., Barcia-Piedras, J.M., Mateos-Naranjo, E., Perez-Romero, J.A., Parra, R., Camacho, M., Caviedes, M.A., Pajuelo, E., Rodríguez-Llorente, I.D. Endophyte bacteria from phyllosphere of Arthrocnemum macrostachyum seem to play an important role in the tolerance to stressing concentrations of NaCl. XIV MEDECOS & XII AEET meeting. Enero/Febrero 2017, Sevilla (España). Navarro-Torre S., Mateos-Naranjo E., Caviedes M.A., Pajuelo E., Rodríguez-Llorente I.D. Isolation and characterization of endophytic and rhizospheric bacteria of Arthrocnemum macrostachyum in the Odiel marshes and the heavy metals effects in their PGP properties. 7th World Congress on Microbiology. Noviembre 2016, Valencia (España). Navarro-Torre, S., Barcia-Piedras, J.M., Pajuelo, E., Caviedes, M.A., Redondo-Gómez, S., Camacho, M., Rodríguez-Llorente, I.D. Diversity and abundance of genes for the synthesis of osmoprotectants in the rhizosphere of the halophyte Arthrocnemum macrostachyum. Rhizosphere 4. Junio 2015, Maastricht (Holanda). XVII ABREVIATURAS ACC: ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico ADN: ácido desoxirribonucleico AGL: aminoglicolípido no identificado AMA: agar mineral de amonio AN: tasa fotosintética neta APL: aminofosfolípido no identificado APx: ascorbato peroxidasa ARNr: ácido ribonucleico ribosómico atm: atmósfera BSA: albúmina de suero bovino Ca: concentración de CO2 del ambiente CAS: sulfuro de azuro de cromo CAT: catalasa CE: consorcio endofitos CECT: colección española de cepas tipo Ci: concentración intracelular de CO2 cm: centímetro CMC: carboximetil celulosa CR: consorcio rizosféricos CSIC: consejo superior de investigaciones científicas CTAB: bromuro de cetil trimetilamonio DF: Dworkin y Foster DGGE: electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante DPG: difosfatidilglicerol DSM: denominación cepas tipo alemanas. (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) DSMZ: colección alemana de cepas tipo (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) E: este EA: endofitos de hoja de Arthrocnemum Lebrija EAod: endofitos de hoja de Arthrocnemum Odiel EAR: endofitos Arthrocnemum de raíz EDTA: ácido etilendiaminotetraacético et al.: et allii (y otros) F’m: fluorescencia máxima inhibiendo el PSII F0: fluorescencia en estado de oscuridad fig: figura Fm: máxima fluorescencia Fs: fluorescencia en estado estacionario Fv/Fm: máxima eficiencia cuántica de la fotoquímica del PSII g: gramo GGDC: calculador de distancias genomagenoma GPx: guaiacol peroxidasa gS: conductancia estomática h: hora HPLC: cromatografía líquida de alto rendimiento i.e.: id est (esto es) IAA: ácido indol acético IARC: agencia internacional para la investigación en cáncer ICP-OES: espectroscopía de emisión atómica acoplada a plasma inducido IRGA: analizador de gas infrarrojo JCM: colección japonesa de cepas tipo (Japan Collection of Microorganisms) kb: kilobase KCTC: colección koreana de cepas tipo (Korean Collection for Type Cultures) Kg: kilogramo kPa: kilopascal l: litro LMG: colección belga de cepas tipo (Laboratorium voor Microbiologie Universiteit Gent) ln: logaritmo neperiano M: molar m2: metro cuadrado MA: agar marino mg: miligramo MIDI: sistema de identificación microbiana min: minuto ml: mililitro mm: milímetro mM: milimolar ms: milisegudo mS: milisiemens MTC: máxima concentración tolerable mV: milivoltios N: normal (concentración) o norte (punto cardinal) XVIII n: número de muestras NB: caldo nutritivo NBRIP: medio de fosfato del Instituto Nacional de Investigaciones Botánicas NCBI: centro nacional de información biotecnológica NFB: caldo libre de nitrógeno ng: nanogramo nm: nanómetro Nº: número O: oeste ˚C: grados Celsius ONPG: orto-nitrofenil-β-galactosidasa p/v: peso/volumen P: probabilidad pb: pares de bases PCR: reacción en cadena de la polimerasa PE: fosfatidiletanolamina PG: fosfatidilglicerol PGP: promotor del crecimiento de la planta PGPB: bacterias promotoras del crecimiento de la planta PIPES: ácido 1:4-piperazindietanosulfónico pp: partes por millón PPFD: densidad de flujo de fotones fotosintéticos PSII: fotosistema II PX: peroxidasa RA: rizosféricos de Arthrocnemum RGR: tasa de crecimiento relativo ROS: especies reactivas de oxígeno rpm: revoluciones por minuto s: segundos S.D.: desviación estándar S.E.: error estándar S: sur s2: segundo cuadrado SOD: superóxido dismutasa sp.: especie SW30: agua de mar al 30% TAE: Tris, ácido acético y EDTA. TCBS: tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa TSA: agar triptona de soja TSB: caldo triptona de soja U: unidad UV: ultravioleta v/v: volumen/volumen V: voltio vs: versus (contra: frente a) PSII: eficiencia cuántica del PSII <: menor que >: mayor que ≥: mayor o igual que µg: microgramo µl: microlitro µm: micrómetro µM: micromolar µmol: micromol µs: microsegundo ABSTRACT ABSTRACT 3 Salt marshes soils are often affected by anthropogenic contamination of both organics and heavy metals, in addition to the frequent excess of salinity. Degradation of these ecosystems has ecological, agricultural and human health consequences. In this work, the use of Arthrocnemum macrostachyum and its microbiome has been explored as a tool for phytoremediation in contaminated marshes. Arthrocnemum macrostachyum is a Cdhyperaccumulator and hypertolerant halophyte plant, which has been proposed as phytoremediation tool. This plant grows naturally in the Odiel marshes, a polluted ecosystem with high levels of heavy metals. A total of 48 bacteria were isolated from plants (18 from the rhizosphere and 30 endophytes), all of them could grow in presence of high concentrations of heavy metals and salt. At least one of the plant growth promoting (PGP) properties tested was present in the isolated bacteria and there were several strains that showed high values of these properties. The presence of heavy metals affected the PGP production by the in a variable manner. On the other hand, the possibility of a high number of isolated bacteria could be new species was investigated. The results suggested that the isolated bacteria could promote plant growth even in the presence of heavy metals, in the way that the synergic interaction of plant and bacteria could be an interesting tool for phytoremediation. Two bacterial consortia with the best-performing endophytic (CE) or rhizospheric strains (CR) were selected on the basis of heavy metals resistance and PGP properties. Germination kinetics was recorded in the presence and absence of heavy metals using both bacterial consortia. On the other hand, a glasshouse experiment was designed to investigate the role of bacterial consortia on metal uptake capacity and tolerance in plants grown on metal polluted sediments. Plants were assigned to three inoculation treatments (with CR, CE and without ABSTRACT 4 inoculation). Bacterial inoculation accelerated germination of A. macrostachyum seeds both in the absence and presence of heavy metals. Bioaugmentation with both bacterial consortia enhanced A. macrostachyum capacity to accumulate ions in its roots, without significantly increasing metal translocation to shoots. Furthermore, bioaugmentation alleviated the phytotoxicity due to metal exposure. These effects could be a ascribed to a beneficial effect on the photosynthetic apparatus and on the modulation of plant oxidative stress machinery. These results suggest that inoculation of A. macrostachyum with the selected bacteria could ameliorate plant establishment and growth in contaminated marshes and improve the metal remediation efficiency of this halophyte. During the isolation of bacteria, some strains had a low identity of their 16S RNA sequences as compared to the sequences available in databases. The phenotypic and chemotaxonomic characteristics were studied in these strains and the results obtained indicated that some studied bacteria could be new species. One of these strains has just been described as a new species within the genus Vibrio, under the name Vibrio palustris EAod9T Concerning salinity, there is an increasing interest to use halophytes for revegetation of salt affected ecosystems, as well as in understanding their mechanisms of salt tolerance. Eight endophytic bacteria belonging to Bacillus and closely related genera were isolated from the phyllosphere of A. macrostachyum growing in saline agricultural soils. The presence of PGP properties, enzymatic activities and tolerance towards NaCl were determined. Effects of inoculation on seeds germination and adult plants growth under experimental NaCl treatments (0, 510 and 1030 mM NaCl) were studied. Inoculation with a consortium including the best performing bacteria considerably improved considerably the kinetics of germination and the final germination percentage of A. macrostachyum seeds. ABSTRACT 5 Moreover, inoculation of plants with selected consortium mitigated the effects of high salinity on plant growth and physiological performance and, in addition, this consortium appears to have increased the potential of A. macrostachyum to accumulate Na+ in its shoots. Results suggest that bacteria isolated from A. macrostachyum phyllosphere seem to play an important role in plant salt tolerance under stressing salt concentrations, improving seed germination and plant development. INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 15 1. La contaminación por metales pesados. Los metales pesados forman parte de la naturaleza del planeta en muy bajas concentraciones, siendo inofensivos para los organismos vivos. Algunos de estos metales son requeridos por las células (en cantidades inferiores al 0,1%) para la realización de numerosas actividades vitales, como es el caso de los oligoelementos (Fe, Zn, Cu, Co, F, Cr, Mn, I, Mo, Se, V), pero en mayores cantidades se vuelven tóxicos (Nagajyoti et al., 2010). Sin embargo, desde hace décadas, ciertas actividades humanas, como la agricultura o la industria, han cambiado la distribución y han aumentado la cantidad de estos metales pesados, convirtiendo este grupo de químicos ambientales no bio-degradables en ubicuos (Wu et al., 2016) y originando un problema de contaminación. Esta contaminación por metales pesados es un problema global que afecta profundamente al medio ambiente y a la salud pública (Vangronsveld et al., 2009), principalmente por su baja solubilidad y biodisponibilidad y por su capacidad como agentes mutagénicos y cancerígenos (Davis et al., 2000). Otras típicas respuestas a la contaminación por metales pesados son la inhibición del crecimiento, la supresión del consumo de oxígeno y los impedimentos en la reproducción y reparación de tejidos (Air Pollution Information System, 2016). Dentro de los metales o metaloides más importantes, en base a su toxicidad ambiental, se encuentran As, Cd, Cu, Pb y Zn (Hogan, 2010). La Agencia Internacional para la Investigación en Cáncer (IARC) ha clasificado los metales pesados en tres categorías, basadas en estudios de carcinogenicidad en los seres humanos: • En el grupo 1 se encuentran aquellos metales que son carcinogénicos para el ser humano. El As y sus compuestos, el Cd y sus compuestos, el Cr INTRODUCCIÓN 16 hexavalente y el Ni y sus compuestos se encuentran en este grupo y están asociados con el cáncer de pulmón, hígado, nariz y riñón (IARC, 2012). • El grupo 2 se divide a su vez en dos. El grupo 2A es para los metales que probablemente sean carcinogénicos, donde se encuentran los compuestos inorgánicos de Pb (IARC, 2006) y el Pb metálico (IARC, 1987). El grupo 2B está formado por aquellos metales que posiblemente sean carcinogénicos y en él se encuentra el metilmercurio (IARC, 1993). • En el grupo 3 se encuentran los metales pesados que no son carcinogénicos para el ser humano. Los metales pesados también originan daños en las plantas que viven en los suelos contaminados, ya que inhiben el crecimiento, afectan al estrés hídrico de la planta y a la fotosíntesis e inducen la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS), responsables de numerosos desórdenes fisiológicos que conducen a la planta hacia la muerte (Barceló y Poschenrieder, 1990; Greger y Ögren, 1991; Hossain et al., 2012; Lombi et al., 2001). Otro grupo de seres vivos que se ven afectados por los metales pesados son los microorganismos presentes en los suelos. Este tipo de contaminación provoca graves daños en las comunidades microbianas del suelo, ya que reducen la biomasa microbiana total y el tamaño de las poblaciones de grupos microbianos con funciones específicas (Zhuang et al., 2007). Los metales pesados tóxicos, como Cd, Al, Hg y Pb, se unen a grupos -SH, inhibiendo la actividad de muchas enzimas que participan en procesos celulares fundamentales, como la transcripción y la traducción. Estas modificaciones originan daños en la membrana y el ADN (Nies y Silver, 2007). Para tener estos efectos tóxicos sobre los microorganismos, los metales deben atravesar la membrana plasmática y esto ocurre debido a la similitud química entre los diferentes metales, de manera que a veces se INTRODUCCIÓN 17 transportan metales tóxicos al interior de la bacteria a través de los sistemas de transporte creados para incorporar microelementos (Cervantes et al., 2006). Mediante estudios biomonitorizados se ha observado que la concentración de Pb ha disminuido más del 126% en el 2012, mientras que las concentraciones de Cd, Ni y Cr son 10, 3 y 16 veces mayores, respectivamente, que en 1941 (Rodríguez Martin et al., 2015). Por otro lado, las concentraciones de As también han aumentado durante el 2012 (Rodas et al., 2007). En Europa, las actividades contaminantes afectan a alrededor de 3 millones de sitios (Sirguey y Ouvrad, 2013), siendo los suelos agrícolas del oeste de Europa y la región mediterránea las áreas más contaminadas (Figura 1) (Tóth et al., 2016). En muchas áreas, la enorme cantidad de metales pesados disponibles en el suelo está asociada a la alta concentración de sal soluble. La salinidad incrementa la movilidad de los metales debido a la formación de complejos de aniones derivados de la sal con los metales pesados y a la competición entre cationes derivados de la sal y los iones metálicos por los sitios de adsorción en la fase sólida (Acosta et al., 2011; Hatje et al., 2003). El Ca2+ y el Mg2+ inducen mayor movilidad de los metales que el Na+ (Lutts y Lefèvre, 2015). El efecto de las sales clorhídricas (NaCl, CaCl2, MgCl2) y NaSO4, en la movilidad de Cd, Cu, Pb y Zn indican que los principales mecanismos que regulan la movilidad del metal son la competición del Ca2+ y el Mg2+ por los sitios de absorción, la formación de complejos con el cloro y/o con los sulfatos (Acosta et al., 2011). Normalmente Cd, Pb y Zn tienen competencia con el Ca2+, mientras que el Cu suele formar CuSO4. Este efecto de la sal ocurre, principalmente, en áreas costeras o estuarios situados cerca de grandes poblaciones y/o áreas industriales. INTRODUCCIÓN 18 Un importante problema de contaminación por metales pesados que nos afecta directamente es la contaminación de las marismas del Odiel. Las marismas del Odiel son un paraje natural localizado en el sur de la provincia de Huelva y constituye una fuente alimenticia de las aves que pueblan este espacio natural, gracias a los nutrientes presentes en los sedimentos que se acumulan en la Figura 1. Nivel de contaminación por encima de los valores umbrales en Europa (modificada de Tóth et al., 2016). INTRODUCCIÓN 19 desembocadura del río. Además, presenta una gran riqueza mineral, salina y pesquera. Durante más de cien años, se ha estado desarrollando en esta área una intensa actividad minera, debido a que en la cuenca de este río se encuentran materiales del Paleozoico y más específicamente, es donde ocurre la formación de las llamadas formaciones vulcano-sedimentarias (Grande et al., 2003). El drenaje ácido minero es uno de los mayores problemas ambientales causados por los Figura 2. Marismas del Odiel. En la foto superior se ven las marismas y en la inferior el área industrial presente en dichas marismas. INTRODUCCIÓN 20 depósitos de sulfuro de la minería (Akcil y Koldas, 2006). Estos depósitos provocan la disminución del pH y esto hace que los elementos traza aumenten. Además, en los años sesenta, comenzó la industrialización en dicha zona (Davis et al., 2000; Leblanc et al., 2000; Nelson y Lamothe, 1993), contribuyendo a la contaminación que hace de este lugar una de las áreas más contaminadas del mundo por la alta concentración de metales, principalmente As, Cu, Pb y Zn, presentes en sus sedimentos (Mesa et al., 2015a; Nelson y Lamothe, 1993; Sáinz et al., 2004). 2. La salinidad, un problema agrícola. Los suelos afectados por la sal pueden ser definidos como aquellos con altos niveles de sal disuelta y/o altas concentraciones de iones de sodio en la matriz del suelo (Qadir et al., 2000). Se ha estimado que de 1 a 10 billones de hectáreas de suelo en el mundo están afectadas por la sal (Yensen y Biel, 2006) y que existe una subida potencial del 10 al 16% al año (Aydemir y Süngerm, 2011) debido al cambio climático. Este aumento de áreas afectadas conducirá al uso de un agua de baja calidad, a un aumento de la salinización por la irrigación, a una expansión de tierras áridas, semi- Figura 3. Ambientes hipersalinos. En la imagen de la derecha se encuentra el Mar Muerto, en el centro un estanque de evaporación salina (Atlit, Israel) y en la imagen de la izquierda, un estanque de cristalización salina (Eilat, Israel) (Oren, 2015). INTRODUCCIÓN 21 áridas y desérticas y a un aumento del nivel del mar, contribuyendo a la intrusión salina en los acuíferos (Jesus et al., 2015). Si se continúa de esta manera, el 50% de las tierras cultivables estarán agotadas a mitad del siglo XI (Mahajan y Tuteja, 2005). Además de la pérdida de tierras cultivables, las altas concentraciones de sal en los suelos tienen efectos fisiológicos en las plantas, como el cierre de los estomas, el “shock” hiperosmótico y la inhibición de la división celular y la fotosíntesis. Sin embargo, los efectos más comunes son el desequilibrio de los nutrientes y la toxicidad de ciertos iones, como Na+ y Cl-. Esto conduce a una inhibición del crecimiento o a la muerte de la planta (Aslam et al., 2011). Las altas concentraciones de sal también afectan a las bacterias presentes en dichos suelos. Existen numerosas bacterias (Ventosa, 2006) que se han adaptado a vivir en ambientes con alta salinidad gracias a la acumulación de moléculas orgánicas de bajo peso molecular llamados solutos compatibles. Estas moléculas equilibran la presión osmótica externa y mantienen la turgencia intracelular (Reshetnikov et al., 2011). Dentro de estos solutos compatibles se encuentran las ectoínas y las betaínas entre otras moléculas. La salinidad, y especialmente la sodicidad, también contribuyen a la degradación del suelo desestabilizando la agregación del mismo, que conduce, en última instancia, a la reducción de la conductividad hidráulica, el deterioro en el movimiento del aire y del agua, a la escorrentía y a la exposición a la erosión (Jesus et al., 2015). Estos daños en el suelo ocasionan una baja disponibilidad de agua para las plantas y reducen la penetración de las raíces, el contenido de oxígeno y la emergencia de las plántulas (Qadir y Oster, 2002). INTRODUCCIÓN 22 El problema de la salinidad se debe tanto a motivos naturales (inundación de las tierras costeras, por ejemplo) como a las actividades antropogénicas (subida del nivel freático, riego con agua salada, etc.) (Hasanuzzaman et al., 2013; Marchanda y Garg, 2008; Munns, 2005). Un ejemplo de este problema ambiental se encuentra en las marismas del Guadalquivir. Estas marismas son una formación geológica que ocupa una antigua laguna costera situada cerca de la desembocadura del río. Dentro de la provincia de Sevilla, las marismas del Guadalquivir comprenden las poblaciones de Aznalcázar, Las Cabezas de San Juan, Dos Hermanas, Lebrija, Isla Mayor, Los Palacios y Villafranca, La Puebla del Río y Utrera. Los suelos de estas poblaciones presentan una naturaleza arcillosa (Moreno et al., 1980) y, como se ha dicho anteriormente, debido al uso de aguas de riego con altos contenidos en sal y a la evaporación, estos suelos han ido aumentando su salinidad y sodicidad presentando dificultades para su uso agrícola. 3. Técnicas para la eliminación de contaminantes en suelos afectados. Dado el aumento de suelos contaminados por metales y por la sal, y las consecuencias de dicha contaminación, se han ido desarrollando técnicas encaminadas a la eliminación o paliación de estos contaminantes en los suelos. Para la eliminación de metales pesados, un método comúnmente empleado consistía en devolver los residuos a la mina de donde habían sido extraídos, verterlos al mar o a un cuerpo de agua dulce, o confinarlos en una piscina o batería de almacenamiento (Méndez et al., 2007). Posteriormente, estas aguas contaminadas almacenadas eran procesadas para la eliminación de los metales que contenían, mediante la precipitación química, el intercambio iónico o la adsorción (Peng et al., 2009; Schmidt et al., 2008). También se han ido desarrollando INTRODUCCIÓN 29 utilizadas en el proceso se puede usar en procesos industriales tales como la obtención de bioenergía o de celulosa (Abideen et al., 2011; Glenn et al., 2013). 4. Las plantas halófitas: Arthrocnemum macrostachyum y su utilidad en fitorremediación. Las plantas halófitas son aquellas que pueden sobrevivir y reproducirse en ambientes cuyas concentraciones de sal exceden los 200 mM de NaCl (Flowers y Colmer, 2008) y constituyen aproximadamente el 1% de la flora del planeta. Algunas de estas plantas aumentan su productividad con el incremento de la sal y crecen mejor en presencia que en ausencia de sal. Estas plantas reciben el nombre de euhalófitas (Yensen, 2008). Las especies halófitas se encuentran diversificadas por todo el planeta en marismas, manglares, humedales, terrenos pantanosos, zonas áridas y semiáridas y campos agrícolas (Lokhande y Suprasanna, 2012). Las plantas halófitas se clasifican, según aspectos ecológicos, en: halófitas obligadas, halófitas facultativas y halófitas de hábitats indiferentes, separándolas de las glicófitas (von Sengbusch, 2003). Las plantas glicófitas son plantas que no se encuentran en ambientes salinos de manera natural, pero pueden tolerar cierta cantidad de sal, pero no son consideradas halófitas. Las halófitas obligadas son aquellas que crecen solo en presencia de sal y dentro de este grupo se encuentran algunas especies de la familia Chenopodiaceae. Las facultativas son capaces de establecerse en suelos salinos, pero su óptimo de crecimiento es sin sal o en baja concentración de sal. Dentro de este grupo se encuentran muchas especies de las familias Poaceae, Ciperaceae y Brassicaceae. Por último, se encuentran aquellas especies halófitas que son indiferentes hacia su hábitat y son capaces de hacer frente a los suelos salados en la naturaleza. INTRODUCCIÓN 30 Sin embargo, por lo general crecen en suelos libres de sal. Estas plantas pueden competir con especies que son sensibles a la sal y a la vez son capaces de vivir en suelos salados. Algunas de las especies de este grupo pueden crecer en cualquier hábitat. En comparación, los tres tipos de halófitas tienen un mejor crecimiento que las glicófitas (Figura 5) (Hasanuzzaman et al., 2014). Estas plantas presentan una serie de características morfológicas y anatómicas para tratar con los suelos salinos como la compartimentación de iones, ajustes osmóticos, suculencia, transporte y captura de iones, sistemas antioxidantes, mantenimiento del estado redox y excreción e inclusión de sal (Lokhande y Suprasanna, 2012). El principal mecanismo que presentan estas plantas a la hora de crecer en suelos con altas concentraciones de sal es la acumulación de las sales inorgánicas en el interior de las vacuolas y la acumulación de solutos orgánicos en el citoplasma Figura 5. Posible patrón de crecimiento de halófitas bajo condiciones salinas (modificada de Hasanuzzaman et al., 2014). INTRODUCCIÓN 31 de las células vegetales (Hasanuzzaman et al., 2014). Las vacuolas de estas plantas podrían tener una modificación lipídica para evitar que el Na+ vuelva al citoplasma, además de ser más grandes que en el resto de plantas (Glen et al., 1999). Además, estas plantas poseen un gran control estomático que permite una optimización del uso del agua bajo condiciones de estrés salino (Redondo-Gómez et al., 2010b; Shabala, 2013). También pueden tener sistemas antioxidantes que disminuyan el nivel de las especies reactivas de oxígeno (ROS), reduciendo así el estrés oxidativo. Los principales mecanismos de eliminación de ROS son las metaloproteínas, dentro de las que se encuentran las enzimas superóxido dismutasa (SOD), ascorbato peroxidasa (APx), guaiacol peroxidasa (GPx) y catalasa (CAT). El balance de estas enzimas es crucial para mantener los niveles de O-2 y H2O2 y la prevención en la formación del tóxico HO. (Gil y Tuteja, 2010; Hossain et al., 2012). Las plantas halófitas tienen tres mecanismos de adaptación principales: exclusión de sal, excreción de sal o acumulación de sal (Flowers y Colmer, 2015). Las plantas excluyentes de sal presentan un mecanismo de ultrafiltración en las raíces, de esta manera dejan toda la sal fuera de sus raíces. Las excretantes de sal presentan glándulas foliares y tricomas que regulan los niveles internos de sal y, por último, se encuentran las plantas acumuladoras de sal que han desarrollado suculencia para acumular altas concentraciones de sal. Estas últimas han desarrollado un buen sistema de transporte capaz de traspasar la sal a la parte aérea de la planta, especialmente a las hojas (Dajic, 2006). Las plantas halófitas son capaces de tratar con múltiples factores de estrés. Muchas dianas fisiológicas que son afectados por la sal también lo son por metales, por lo que algunas plantas que resisten a la sal de manera natural pueden tener la INTRODUCCIÓN 32 capacidad de crecer en presencia de metales e incluso de la acumulación de los mismos en sus tejidos (Anjum et al., 2014; Hasanuzzaman et al., 2014). Arthrocnemum macrostachyum (Moric) C. Koch es un arbusto C3 halófito que pertenece a la familia Amaranthaceae con hojas muy pequeñas en forma de escama y la filosfera está compuesta por tallos articulados y suculentos. Estos tallos son verdes, y durante las estaciones secas tienen un color rojizo. Este color se genera por la acumulación de fotopigmentos como antocianina y betacianina (Wang et al., 2006) entre otros, que protegen la integridad del aparato fotosintético en presencia de ambientes salinos (Flowers et al., 2014). Está distribuida por la región Mediterránea y es abundante en las marismas del Odiel y en las marismas del Guadalquivir en la región de Lebrija. Esta planta se ha utilizado en diversos trabajos de fitorremediación, donde se observa la absorción de Cu, Pb y Zn en residuos mineros (Conesa y Schulin, 2010). También se ha estudiado la acumulación de elementos traza en tejidos de plantas de A. macrostachyum crecidas en estuarios contaminados, en sus tejidos (Madejón et al., Figura 6. Planta de Arthrocnemum macrostachyum. INTRODUCCIÓN 33 2009). Además, A. macrostachyum es una planta hipertolerante al estrés por Cd e hiperacumuladora de Cd en sus raíces (Redondo-Gómez et al., 2010a). Por otro lado, esta planta ha demostrado una alta capacidad para la acumulación de Na+ ya que debido al hábitat que ocupa está sujeta a inundaciones de las mareas y a hipersalinidad estacional llegando crece a concentraciones salinas de hasta 1030 mM de NaCl (Redondo-Gómez et al., 2010b). Todas estas características, planta halófita, hiperacumuladora de sal y metales, hipertolerante al estrés con metales y sal y, además, autóctona de las áreas de interés, hacen de A. macrostachyum una planta ideal para los estudios que se plantean como objetivo de la presente Tesis Doctoral. 5. El papel de las bacterias rizosféricas y endofíticas en la adaptación de las plantas a los ecosistemas contaminados. Como se ha comentado anteriormente, las plantas empleadas en fitorremediación deben ser capaces de eliminar grandes cantidades de metales pesados y, al mismo tiempo, incrementar su biomasa. Esto muchas veces está limitado en presencia de altas concentraciones de metales pesados, por lo que las plantas pueden perder su capacidad fitorremediadora (Ali et al., 2013). Por esta razón es importante el estudio de los microorganismos asociados a las plantas, que podrían favorecer el crecimiento y la adaptación de las mismas. Las poblaciones microbianas son fundamentales para preservar la calidad del suelo a través de procesos de rotación de la materia orgánica y por participar en el ciclo de los nutrientes (Jeffries et al., 2003). Además, diversos estudios demuestran que la biodisponibilidad de los metales está influenciada por los metabolitos excretados por las bacterias (Langella et al., 2014; Tak et al., 2013). Los INTRODUCCIÓN 34 microorganismos presentan numerosas respuestas a los iones metálicos en las que se incluyen la biosorción de metales, la precipitación de los mismos y su transformación enzimática (Valls y de Lorenzo, 2002). Se ha sugerido que la interacción entre halófitas y microorganismos podría ser útil en estrategias de fitorremediación en ecosistemas costeros (Andrades-Moreno et al., 2014; Mesa et al., 2015b; Reboreda y Caçador, 2008). La rizosfera de una planta es el área de suelo más cercano a la raíz y es una zona de máxima actividad microbiana, debido a la presencia de exudados por parte de la raíz que funcionan como una fuente de nutrientes para el crecimiento microbiano (Burdman et al., 2000). Los microorganismos rizosféricos, en su mayoría bacterias (Kaymak, 2010), colonizan la raíz de la planta y muchos de ellos contribuyen a ayudar a la planta a tolerar el estrés abiótico (Yang et al., 2009). En los suelos contaminados estas bacterias tienen un papel crucial en ayudar a la planta contra el estrés producido por los metales pesados (Gamalero et al., 2009). Por otro lado, los endofitos son bacterias que habitan en el interior de los tejidos de las plantas sin causar daños en las mismas (Kuklinsky-Sobral et al., 2004). El conocimiento acerca de la diversidad de los endofitos ha ido aumentando conforme se ha incrementado el interés de estudio de dichas bacterias. Además, la introducción de técnicas independientes de cultivo ha permitido ampliar el conocimiento sobre las especies bacterianas que colonizan la planta. Los endofitos son muy diversos taxonómicamente y se encuentran tanto en plantas como en árboles y contribuyen a la salud de la planta y a la productividad (Berg et al., 2014). Estas bacterias tienen el ambiente preparado por la planta, ya que hay un ambiente más uniforme y protegido, sin exposición a condiciones ambientales INTRODUCCIÓN 35 extremas como la temperatura, la radiación ultravioleta o la competencia microbiana, por lo que pueden ser mejores protectores de la planta contra el estrés biótico y abiótico que las rizosféricas (Glick, 2010; Newman y Reynolds, 2005). Las vías de entrada de los endofitos al interior de la planta incluyen a los estomas, las lenticelas y las heridas, pero la principal entrada es la zona de emergencia de las raíces secundarias (Dong et al., 2003; Lamb et al., 1996; Reinhold-Hurek y Hurek, 1998). De hecho, la rizosfera es la fuente más importante de endofitos. Se ha descrito la presencia de enzimas celulolíticas y pectinolíticas en estas bacterias (Compant et al., 2010) y, de esta forma, pueden entrar en el interior de las plantas degradando las paredes celulares vegetales. Para establecerse, los endofitos deben hacer frente a los sistemas de defensa e inmunidad frente a patógenos presentes en el hospedador (Zeidler et al., 2004) y, además, deben tener reconocimiento de señales, movilidad, capacidad de penetración y capacidad de ajustar su metabolismo y comportamiento (Mitter et al., 2013). Una vez dentro, los endofitos se pueden establecer en distintos tejidos de la planta como la raíz, las hojas, el tallo o las semillas (Benhizia et al., 2004; Hallman et al., 1997), aunque, en la mayoría de las plantas, es en las raíces donde se encuentran más endofitos. Los endofitos aislados de plantas hiperacumuladoras muestran una alta tolerancia a metales y son útiles en fitorremediación porque reducen la fitotoxicidad de estos metales (Mastretta et al., 2009) y promueven el crecimiento de la planta (Chen et al., 2010). 5.1 Propiedades PGP, una ayuda para la planta. Tanto las bacterias rizosféricas como los endofitos pueden presentar propiedades que promueven el crecimiento de la planta (PGP) (Mesa et al., 2015a; INTRODUCCIÓN 36 Rajkumar et al., 2009) a través de diversos mecanismos (Ahemad y Khan, 2011; Bhattacharyya y Jha, 2012). Dentro de los beneficios de las propiedades PGP sobre las plantas se encuentran la tolerancia a estrés abiótico, mayor facilidad en la fijación de nutrientes e hierro, regulación del crecimiento y protección frente a patógenos (Choudhary et al., 2011; García-Fraile et al., 2015). El nitrógeno es el factor más limitante en las plantas y es necesario para la síntesis de proteínas, ácidos nucleicos y metabolitos secundarios, entre otros. Los mecanismos por los que el nitrógeno atmosférico se añade a las formas orgánicas que pueden ser asimilados por las plantas es exclusivo de procariotas (Lloret y Martinez-Romero, 2005; Raymond et al., 2004), y existen bacterias fijadoras de nitrógeno que pueden ayudar a las plantas. Figura 7. Mecanismos de acción por bacterias que promueven el crecimiento de la planta (modificada de Vacheron et al., 2013). INTRODUCCIÓN 37 Por otro lado, también existen bacterias que son capaces de solubilizar fosfato (Wani et al., 2007), incrementando la disponibilidad de iones fosfato en el suelo, siendo más fáciles de captar para las plantas. Otro elemento no disponible para las plantas en el suelo es el hierro. Normalmente, se encuentra en la naturaleza en forma de Fe3+, que es altamente insoluble. Los sideróforos son moléculas de bajo peso molecular que quelan el Fe3+ del ambiente. La presencia de bacterias productoras de sideróforos facilita la captación de hierro por las plantas (Flores-Felix et al., 2015). Con respecto a la regulación del crecimiento de la planta, se encuentran bacterias fitoestimuladoras, que producen auxinas, giberelinas, etc. (Lugtenberg et al., 2002; Somers et al., 2004). Las auxinas regulan la mayoría de los procesos de la planta directa o indirectamente (Tanimoto, 2005). La auxina más activa y conocida en las plantas es el ácido indol acético (IAA) (Hayat et al., 2010). Bajos niveles de IAA estimulan la elongación de la raíz primaria, mientras que altos niveles de IAA disminuyen la longitud de la raíz principal, incrementan la formación de pelos radicales y estimulan la formación de raíces secundarias. De esta manera, las plantas pueden tener un mayor acceso a los nutrientes del suelo (Spaepen et al., 2007; Vacheron et al., 2013). Una hormona presente en la planta es el etileno que regula procesos como la maduración de frutos, la caída de las hojas, etc. (Wang et al., 2013). Las plantas sintetizan 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC), un precursor del etileno que se forma en respuesta a varios tipos de estrés ambiental (Glick, 2012). Hay bacterias que presentan la enzima ACC desaminasa, utilizada en la degradación de etileno (Glick, 2014), disminuyendo así el estrés en la planta. INTRODUCCIÓN 38 Por último, las bacterias también pueden presentar enzimas que ayudan a la planta contra el ataque de patógenos como, por ejemplo, las quitinasas o las glucanasas (Arora et al., 2008; Kumar et al., 2010). 5.2. Modificación de la rizosfera. En el apartado anterior ya se comentó la importancia que tienen las bacterias ayudando a las plantas en los procesos de fitorremediación. Por este motivo, se han desarrollado técnicas asociadas a la fitorremediación que tienen como finalidad aumentar la cantidad de bacterias presentes en la rizosfera, pudiendo mejorar así la capacidad fitorremediadora de las plantas. Estas técnicas son la adición de enmiendas, la bioestimulación de las poblaciones microbianas y la bioaumentación de las bacterias asociadas a la planta (Pajuelo et al., 2014). • Adición de enmiendas: Consiste en añadir algunas sustancias a los suelos para alterar la disponibilidad de los contaminantes. Para los suelos contaminados con metales, la adición de enmiendas orgánicas es una práctica común, junto con el uso de la fitoestabilización. Estas enmiendas ayudan inmediatamente a disminuir la biodisponibilidad de los metales, proporcionando un fertilizante de liberación lenta que mejora el crecimiento de la planta, y sirve como un inóculo microbiano (Park et al., 2011). Además, se mejora la estructura del suelo, reduce la erosión e incrementa la infiltración (Méndez y Maier, 2008). Algunos ejemplos de enmiendas orgánicas son la paja, el estiércol, ácidos húmicos, etc. • Bioestimulación: Consiste en la adición de aceptores/donadores de electrones o nutrientes para estimular las poblaciones microbianas existentes en los suelos, con el fin de mejorar la actividad de microorganismos indígenas degradadores o promover el co-metabolismo MATERIALES Y MÉTODOS 45 1. Recolección de muestras y análisis químicos. En diciembre de 2015 se recogieron tres plantas de A. macrostachyum de un suelo agrícola en Lebrija (Sevilla, España) (36˚ 54’N-6˚ 12’E). En febrero de 2015 se recogieron tres plantas de A. macrostachyum sin senescencia aparente y con una edad y tamaño similar junto con su suelo rizosférico (entre 10 y 20 cm de profundidad, que corresponde al área de mayor biomasa de raíces) de las marismas del río Odiel (Huelva, España) (37˚ 13’N-6˚ 57’O). Las muestras se tomaron utilizando pala o guantes de plástico y se transportaron inmediatamente al laboratorio en bolsas de plástico individuales, usando una para las muestras de rizosedimentos y otra para las plantas. Posteriormente se almacenaron a 4 ˚C hasta su procesamiento. Para los análisis químicos de los rizosedimentos y los tejidos de las plantas, las muestras se secaron a 80 ˚C durante 48 horas, se molieron y homogeneizaron mediante tamizado a través de redes de nailon de 2 mm, con el fin de eliminar piedras grandes y material muerto (Redondo-Gómez et al., 2007). Posteriormente, 0,5 g de las muestras se sometieron a una digestión ácida con 6 ml de HNO3, 0,5 ml de HF y 1 ml de H2O2. La concentración de los elementos se midió por espectroscopía de emisión atómica acoplada a plasma inducido (ICP-OES) (ARLFisons3410). La conductividad se determinó utilizando un medidor de conductividad Crison-522 y el potencial redox y el pH con un medidor portátil Crison pH/mVp-506, después de diluir los sedimentos con agua destilada (1:1). Finalmente, el análisis de la textura del suelo se realizó determinando los porcentajes de arena, limo y arcilla mediante el método del hidrómetro de Bouyoucos (Bouyoucos, 1936). MATERIALES Y MÉTODOS 46 2. Aislamiento de las bacterias cultivables. Para el aislamiento de los endofitos, la parte aérea y las raíces de las plantas se separaron para desinfectar su superficie de la siguiente manera: las muestras fueron sumergidas en etanol al 70% (v/v) y agitadas durante 1 minuto. Posteriormente, pasaron a sumergirse en hipoclorito sódico al 3% (v/v) durante 15 minutos en agitación suave. Finalmente, se lavaron cuatro veces con agua destilada estéril. Una vez desinfectada la superficie, tres muestras de las raíces y tres de la parte aérea de cada planta, de 2-3 cm de longitud, se trituraron por separado con un mortero estéril en 1 ml de solución salina estéril al 0,9% (p/v). La mezcla generada se sembró directamente (100 µl por placa) en tres placas de Petri con medio TSA (Intron Biotechnology) suplementado con una mezcla de sales correspondientes a una fuerza iónica total de 0,3 M (TSA 0,3 M) y en otras tres placas de Petri con medio TSA suplementadas con una mezcla de sales correspondientes a una fuerza iónica total de 0,6 M (TSA 0,6 M). Las placas se incubaron a 28 ˚C durante 72 horas. Con el fin de aislar las bacterias rizosféricas, las muestras de suelo (cercanas a las raíces de las plantas) se agitaron en una solución salina estéril al 0,9% (p/v) durante 5 minutos y la suspensión se sembró (100 µl por placa) en tres placas con medio TSA 0,3 M y otras tres placas con medio TSA 0,6 M, e incubadas durante 72 horas a 28 ˚C. El TSA 0,3 M y el TSA 0,6 M se prepararon añadiendo 54,5 ml y 129,5 ml, respectivamente, de una solución stock de sales SW30 al preparar 1 litro de los medios. Este mismo procedimiento se llevó a cabo con las plantas y los sedimentos recolectados después de los experimentos. MATERIALES Y MÉTODOS 47 Las bacterias se aislaron en base a la diferente morfología de las colonias, la tinción de Gram y la movilidad. La morfología de las colonias se observó con mayor detalle en aquellas cepas que pudieran ser nuevas especies. Para ello, se dejaron crecer las cepas en las condiciones óptimas. Pasado el tiempo de incubación, las colonias aisladas fueron observadas utilizando un microscopio estereoscópico Olympus SZ61. Se observó la forma y el tamaño de la colonia (diámetro en mm), la elevación, la forma del margen y el color de las colonias. El tamaño (ancho x largo en µm) y la forma de las bacterias se observaron mediante la tinción de Gram usando un microscopio Olympus CX41 con el objetivo de 100X. Para detectar la movilidad, las colonias aisladas se transfirieron a 5 ml de medio TSB (Intron Biotechnology) 0,3 M e incubadas a 28 ˚C durante 30 minutos en agitación. Se depositó una gota del cultivo se depositó sobre un portaobjetos, se cubrió con un cubreobjetos y se observó en un microscopio Olympus CX41 con el objetivo de 100X. TSA: 17 g de peptona de caseína; 3 g de peptona de soja; 5 g de NaCl; 2,5 g de KH2PO4; 2,5 g de glucosa; 15 g de agar y agua destilada hasta completar 1 litro. pH ajustado a 7,3. Se esteriliza en autoclave 20 min a 121 ˚C y 1 atm de sobrepresión. TSB: 17 g de peptona de caseína; 3 g de peptona de soja; 5 g de NaCl; 2,5 g de KH2PO4; 2,5 g de glucosa y agua destilada hasta completar 1 litro. pH ajustado a 7,3. Se esteriliza en autoclave 20 min a 121 ˚C y 1 atm de sobrepresión. SW30: 234 g de NaCl; 39 g de MgCl2·6H2O; 61 g de MgSO4·7H2O; 0,2 g de NaHCO3; 0,7 g de NaBr; 6 g de KCl; 1 g de CaCl2 y agua destilada hasta completar 1 litro. La fuerza iónica total es de 4 M. pH ajustado a 8. MATERIALES Y MÉTODOS 48 3. Extracción de ADN y amplificación del gen del ARNr 16S. Las bacterias se cultivaron en 3 ml de medio TSB 0,3 M durante 48 horas a 28 ˚C en agitación continua. El ADN genómico fue extraído utilizando el kit igenomic BYF DNA Extraction kit (Intron Biotechnology), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La amplificación del gen del ARNr 16S se llevó a cabo utilizando los cebadores 16F27 (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′) y 16R1488 (5′- CGGTTACCTTGTTAGGACTTCACC-3′), y la enzima i-Taq polimerasa (Maxime PCR PreMix Kit, Intron Biotechnology) bajo las siguientes condiciones de amplificación: desnaturalización inicial a 94 ˚C durante 2 minutos, 30 ciclos de desnaturalización a 94 ˚C durante 20 segundos, alineamiento a 58 ˚C durante 10 segundos y extensión a 72 ˚C durante 50 segundos, seguido de una extensión final a 75 ˚C durante 5 minutos. Posteriormente, con 5 µl de los productos obtenidos en la PCR se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1%, teñido con RedSafeTM (Intron Biotechnology), en tampón TAE 1X a 100 V durante 30 minutos. El gel se visualizó bajo luz UV y los restos de los productos de la PCR se purificaron usando la enzima ExoSAP-IT (Affymetrix USB) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los ADN purificados se enviaron a la empresa StabVida (Portugal) para su secuenciación. Las secuencias amplificadas del gen del ARNr 16S se compararon con las depositadas en las bases de datos, usando el servidor EzTaxon (Chun et al., 2007). Las secuencias del gen del ARNr 16S de los aislados se depositaron en la base de datos GenBank del NCBI, bajo los números de acceso mostrados en las Tablas 4 y 10. Aquellas bacterias que mostraron un porcentaje de identidad de menos del 99% con las secuencias presentes en las bases de datos, se consideraron como posibles nuevas especies. Las cepas estudiadas como especies nuevas en esta Tesis Doctoral han sido Kushneria sp. EAod3, Kushneria sp. EAod4, Kushneria sp. EAod7, MATERIALES Y MÉTODOS 49 Bacillus sp. EAR8, Halomonas sp. EAR18, Pseudoalteromonas sp. RA15 y Staphylococcus sp. RA18. Las cepas Vibrio sp. RA1 y Vibrio sp. EAod9 se estudiaron también como especies nuevas, pero en colaboración con el grupo de la doctora María J. Pujalte de la Universidad de Valencia y el personal de la Colección Española de Cepas Tipo (CECT) (Valencia). 4. Creación de árboles filogenéticos para las especies nuevas. Se realizaron árboles filogenéticos basados en la comparación de las secuencias del gen del ARNr 16S de las bacterias que pudieran ser especies nuevas. Para ello, se utilizó un servidor de la DSMZ llamado GGCD (Genome-to-genome Distance Calculator) (http://ggdc.dsmz.de/phylo_form.php). Para hacer los árboles de las especies de Kushneria y Halomonas se introdujeron en el servidor todas las secuencias del gen del ARNr 16S de la familia Halomonadaceae; para las especies de Pseudoalteromonas se necesitaron todas las secuencias del género, incluyendo las subespecies; para la cepa de Bacillus se necesitaron las secuencias de las 30 primeras especies que aparecieron en el EzTaxon; y para la cepa de Staphylococcus, las secuencias de todo el género incluyendo las subespecies. Una vez introducidas las secuencias, el servidor envió los resultados, dentro de los que se encuentran los árboles filogenéticos. Los análisis filogenéticos se realizaron de acuerdo a Montero- Calasanz et al. (2012) y las similitudes entre parejas se calcularon como recomendaron Meier-Kolthoff et al. (2013). Con la ayuda de los árboles filogenéticos se determinaron las cepas tipo que se utilizaron como referencia para cada especie nueva. MATERIALES Y MÉTODOS 50 5. Determinación de las condiciones del crecimiento óptimo de las posibles especies nuevas. Para la descripción de las especies nuevas, se determinaron las condiciones de crecimiento óptimo para cada cepa. Para ello, las bacterias se cultivaron a diferentes rangos de temperatura, pH y sal. Además, se probó el crecimiento de las bacterias en diferentes medios como MA (Difco), Agar cetrimida (Scharlau) y Agar MacConkey (Sigma), estos dos últimos suplementados con SW30 hasta alcanzar una fuerza iónica de 0,3 M. 5.1. Rango de temperatura. Las bacterias se cultivaron en placas con medio TSA 0,3 M a 4, 15, 20, 25, 28, 30, 32, 37 y 45 ˚C durante 6 días. Pasado este tiempo, se observó el crecimiento de MA: 5 g de peptona; 1 g de extracto de levadura; 0,1 g de citrato férrico; 19,45 g de NaCl; 8,8 g de MgCl2; 3,25 g de Na2S; 1,8 g de CaCl2; 0,55 g de KCl; 0,16 g de NaHCO3; 0,08 g de KBr; 34 mg de SrCl2; 22 mg de H3BO3; 4 mg de Na2O3Si; 2,4 mg de NaF; 1,6 mg de NH4NO3; 8 mg de Na2HPO4; 15 g de agar y agua destilada hasta completar 1 litro. pH ajustado a 7. Se esteriliza en autoclave 20 min a 121 ˚C y 1 atm de sobrepresión. Agar cetrimida: 0,3 g de cetrimida; 20 g de peptona de gelatina; 1,4 g de MgCl2; 10 g de K2SO4; 15 g de agar; 10 ml de glicerina y agua destilada hasta completar 1 litro. pH ajustado a 7,2. Se esteriliza en autoclave 15 min a 121 ˚C y 1 atm de sobrepresión. Agar MacConkey: 17 g de digerido pancreático de gelatina; 1,5 g de digerido pancreático de caseína; 1,5 g de digerido péptico de tejido animal; 10 g de lactosa; 1,5 g de sales biliares; 5 g de NaCl2; 30 mg de rojo neutro; 1 mg de cristal violeta; 13,5 g de agar y agua destilada hasta completar 1 litro. pH ajustado a 7,1. Se esteriliza en autoclave 15 min a 121 ˚C y 1 atm de sobrepresión. MATERIALES Y MÉTODOS 51 las bacterias a cada temperatura. En base al mejor crecimiento, se determinó la temperatura óptima de cada bacteria. 5.2. Rango de pH. Para determinar el pH óptimo, las bacterias se cultivaron en placas con medio TSA 0,3 M a distintos valores de pH durante 6 días. Los valores ensayados fueron desde pH 5 a pH 9. El valor de pH en el que hubo mejor crecimiento de cada bacteria se consideró el pH óptimo. Los valores de pH se ajustaron a la hora de hacer el medio con los tampones citrato-fosfato para el rango de pH de 2,6 a 7 (ácido cítrico 0,1 M y fosfato de sodio dibásico 0,2 M) y Tris-HCl para el rango de pH de 7,2 a 9 (Tris (hidroximetil) aminometano 0,1 M y HCl 0,1 M). 5.3. Rango de sal. Para determinar el rango de sal, se utilizaron placas con medio mTGE. Los valores de sal ensayados fueron: 0, 0,5, 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5, 17,5, 20, 25 y 30%. Las placas se incubaron durante 6 días. Se consideró óptimo aquel porcentaje de sal donde se obtuvo un mejor crecimiento para cada bacteria. Las placas con las diferentes concentraciones de sal se obtuvieron añadiendo al medio mTGE la cantidad correspondiente de SW30 para conseguir la concentración final. mTGE: 6 g de extracto de carne; 10 g de triptona; 2 g de dextrosa; 15 g de agar y agua destilada hasta completar 1 litro. pH ajustado a 7. Se esteriliza en autoclave 20 min a 121 ˚C y 1 atm de sobrepresión (Bangash et al., 2015). MATERIALES Y MÉTODOS 52 5.4. Crecimiento en anaerobiosis. Para ver si había crecimiento en anaerobiosis, las posibles especies nuevas se sembraron en picadura en tubos con medio TSA 0,3 M semisólido (0,6% de agar). A continuación, se sellaron los tubos con 2 ml de agar al 2% (p/v) y, cuando solidificaron, se añadió a cada tubo 2 ml de parafina estéril (Zou y Wang, 2010) (Figura 9). Estos tubos bien cerrados se incubaron durante 10 días a 28 ˚C. La presencia de crecimiento en los tubos indica que las cepas son capaces de crecer en condiciones de anaerobiosis. 6. Análisis de diversidad por Box-PCR. Para evaluar la diversidad genética de las bacterias aisladas, se realizaron los análisis de Box-PCR utilizando el cebador BOX A1R (5’- CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’) y la enzima i-Taq polimerasa. La concentración Figura 9. Sistema para estudiar el crecimiento en condiciones de anaerobiosis. semisólido MATERIALES Y MÉTODOS 53 de las muestras de ADN para la amplificación por PCR fue de 40 ng y los pasos de amplificación programados fueron los siguientes: activación de la enzima a 94 ˚C durante 2 minutos, 35 ciclos de desnaturalización a 94 ˚C durante 20 segundos, alineamiento a 52 ˚C durante 20 segundos y extensión a 72 ˚C durante 1 minuto, y una extensión final a 72 ˚C durante 5 minutos. Con los productos de la PCR se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1,5%, teñido con RedSafeTM, en tampón TAE 1X a 75 V durante 2 horas. El gel se visualizó bajo luz UV y se fotografió. Posteriormente, se analizó con el programa CLIQS 1D Pro (TotalLab) y se determinaron los dendrogramas y las similitudes mediante el cálculo del coeficiente de correlación de Pearson (Jobson, 1991). 7. Amplificación de genes relacionados con la síntesis de osmoprotectores. Los genes amplificados relacionados con la síntesis de osmoprotectores fueron ectBC y betB. Para la amplificación de los genes ectBC se utilizaron los cebadores Tra3 (5’ ACCGGYACITTYTTYAGITTYGA 3’) y CR (5’ GGIGGRTTRAANACRCA 3’) (Reshetnikov et al., 2011) y la enzima i-Taq polimerasa bajo las siguientes condiciones de PCR: desnaturalización inicial a 94 ˚C durante 2 minutos, 40 ciclos de desnaturalización a 94 ˚C durante 20 segundos, alineamiento a 48,5 ˚C durante 10 segundos y extensión a 72 ˚C durante 50 segundos, seguido de una extensión final a 75 ˚C durante 5 minutos. Para la amplificación del gen betB, se usaron los cebadores degenerados betBF (5’ ATYGGYGMTGGAACTAYCC 3’) y betBR (5’ ACCGGBCCRAARATYTCYTC 3’) junto con la enzima i-Taq polimerasa. Los cebadores se diseñaron en base a las secuencias de varios genes betB de diferentes géneros, depositadas en la base de datos GenBank del NCBI, como Pseudomonas putida W619, Marinomonas sp., MATERIALES Y MÉTODOS 54 Mesorhizobium ciceri biovar. biserrulae WSM1271, Halomonas elongata, Chromohalobacter sp., Escherichia coli CFT073, Sinorhizobium meliloti M11 y Labrenzia alexandrii DFL-11 (secuencias con los números de acceso CP000949.1, CP000749.1, CP002447.1, AJ238780.1, JN426961.1, AE014075.1, CP001830.1 y EQ973121.1, respectivamente) utilizando el programa CLUSTAL Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/; Figura 10). Las condiciones de la amplificación por PCR fueron: desnaturalización inicial a 94 ˚C durante 2 minutos, 34 ciclos de desnaturalización a 94 ˚C durante 20 segundos, alineamiento a 57,2 ˚C durante 10 segundos y extensión a 72 ˚C durante 50 segundos, seguido de una extensión final a 75 ˚C durante 5 minutos. Figura 10. Alineamiento de las secuencias del gen de la betaína aldehído deshidrogenasa (betB) de diferentes géneros, mostrando las regiones conservadas elegidas para diseñar los cebadores degenerados betBF (recuadro rojo) y betBR (recuadro negro). MATERIALES Y MÉTODOS 61 Para determinar las características nutricionales, así como la resistencia frente a algunos antibióticos se usaron las microplacas GEN III (Biolog). Para ello, se sembraron las bacterias en placas con medio TSA 0,3 M y se incubaron durante 24 horas a 28 ˚C. A partir de este cultivo, se realizó una suspensión de cada bacteria en un líquido inoculante viscoso llamado IF C, suplementado con SW30 estéril hasta una fuerza iónica de 0,3 M, hasta llegar a una transmitancia del 90-95%. Esta se añadió a las microplacas y se incubaron durante 3 días a 30 ˚C en un dispositivo Omnilog (Biolog). Los resultados se analizaron con el paquete opm para R (Vaas et al., 2012; 2013) v.0.9.23. A las cepas tipo de referencia también se les realizaron estas pruebas para poder comparar los resultados obtenidos. 10. Estudios quimiotaxonómicos de las bacterias seleccionadas como nuevas especies. Para poder realizar los estudios quimiotaxonómicos (excepto para los ácidos grasos), primero se tuvieron que liofilizar los cultivos bacterianos. Para ello, las bacterias se incubaron en 1 litro de medio TSB 0,3 M durante 3 días a 28 ˚C en agitación continua. Posteriormente, los cultivos se centrifugaron durante 10 minutos a 8500 rpm. Se recogieron los sedimentos en tubos Falcon de 50 ml y se guardaron a -20 ˚C durante 48 horas. Una vez congeladas las biomasas bacterianas se liofilizaron durante 48 horas. Todas las pruebas quimiotaxonómicas fueron realizadas bajo una campana de extracción de gases. 10.1. Estudios del ácido diaminopimélico. Este estudio sólo se realizó para las cepas Gram positivas, siguiendo el método descrito en Staneck y Roberts (1974). El protocolo realizado se divide en dos partes: una hidrólisis y una cromatografía en capa fina. MATERIALES Y MÉTODOS 62 Para la hidrólisis, se pesaron 10 mg de la biomasa liofilizada en tubos eppendorf, y se mezclaron con 200 µl de HCl 6 N. La mezcla se incubó a 100 ˚C durante 12-16 horas, tapando los eppendorf con papel de parafina. Luego se centrifugaron los tubos durante 5 minutos a 5000 rpm y el sobrenadante se transfirió a un tubo de cristal. Estas muestras se secaron en un evaporador durante 20 minutos, aproximadamente, a 40 ˚C. Una vez completamente secas, el residuo final se disolvió en 100 µl de agua destilada y se volvió a evaporar. Por último, los residuos se disolvieron en 20 µl de agua destilada y se guardaron a 4 ˚C hasta su uso. Una vez utilizada, el resto de la solución se guarda a -20 ˚C. El siguiente paso es la realización de la cromatografía en capa fina. A la placa de celulosa 20 x 20 cm (Merk 1.0576.0001) se le practicaron dos líneas a cada lado a 0,5 cm del borde. Luego, se dibujó una línea a 1 cm del borde inferior con un lápiz. Las muestras se colocaron con una pipeta Pasteur sobre esta línea y se secaron al aire. Las muestras se repartieron en líneas de 1 cm y separadas unas de otras por 1,5 cm (Figura 13A). Junto con las muestras, también se depositó en la placa de celulosa una solución estándar que sirvió como marcador. Una vez preparada la placa de celulosa, se introdujo en una cubeta de cristal con 120 ml del solvente, formado por metanol: agua destilada: HCl 6 N: piridina (80:26:4:10 v/v), y dos papeles de filtro a ambos lados de la cubeta, hasta que el solvente llegara, aproximadamente, a 2 cm del final de la placa (alrededor de 3 horas). Después, la placa se dejó secar durante 30 minutos fuera de la cubeta y se roció con un espray de ninhidrina (ninhidrina 0,2% en acetona) y se calentó a 100 ˚C durante 5 minutos. Los aminoácidos fueron visibles después de este paso y se determinó el tipo de isómero por comparación con el estándar. El solvente utilizado debe ser preparado un día antes de su uso. MATERIALES Y MÉTODOS 63 10.2. Análisis de los azúcares de membrana. Este análisis también se llevó a cabo sólo en las bacterias Gram positivas, siguiendo el protocolo descrito en Lechevalier y Lechevalier (1970). Lo primero fue pesar 25 mg de la biomasa liofilizada, en un tubo de cristal con rosca forrado con teflón, y se le adicionó 1 ml de H2SO4 1 N. Estos tubos se calentaron a 95 ˚C durante 2 horas y, posteriormente, se enfriaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se le añadió el volumen de una pipeta Pasteur de Ba(OH)2 saturado y la mezcla se transfirió a un vaso de precipitado de 10 ml. El pH se ajustó a 5-5,5 usando Ba(OH)2 saturado o H2SO4 1 N. Se transfirió la muestra a un tubo de hidrólisis y se centrifugó a 1800 rpm durante 5 minutos. La fase líquida se pasó a un tubo de cristal tapado con algodón y se congelaron con una inclinación de 45 ˚ a -20 ˚C durante 2-3 horas. Pasado este tiempo, la muestra se liofilizó durante toda la noche. Finalmente, se disolvió en 0,5 ml de agua destilada y se transfirió a un tubo eppendorf. Como en el caso anterior, en este estudio también se realizó una cromatografía en capa fina. La placa de celulosa se preparó de la misma manera que en el caso del ácido diaminopimélico, con la diferencia de que se colocaron 5 µl de la muestra con una jeringuilla a lo largo de 2 cm. También se utilizó un estándar de azúcares, cada uno a una concentración del 1% (ramnosa, ribosa, xilosa, arabinosa, D-manosa, D-(+) glucosa y galactosa). La cromatografía se realizó, como se ha descrito en el apartado anterior, durante 2 horas, utilizando el solvente etilacetato: piridina: agua destilada (100:35:25 v/v). Una vez terminada la cromatografía, la placa se secó durante 15-30 minutos y, posteriormente, se roció con un espray de ftalato de anilina y se calentó a 105 ˚C durante 5 minutos. Los puntos de azúcares fueron visibles después de este paso y se determinó el tipo de azúcar en comparación con la solución estándar. MATERIALES Y MÉTODOS 64 10.3. Estudio de los lípidos polares. Los lípidos polares se analizaron según el protocolo de Minnikin et al. (1984) siguiendo las modificaciones del protocolo descritas en Kroppenstedt y Goodfellow (2006). Se necesitaron 100 mg de biomasa liofilizada de las bacterias que se colocaron en un tubo de teflón de 10 ml. Se les añadió 2 ml de metanol acuoso y 2 ml de éter de petróleo y se mezcló durante 15 minutos en un rotador. Luego, se centrifugaron durante 5 minutos a 1800 rpm a temperatura ambiente y se formaron dos capas. La capa superior se recuperó en tubos de cristal tapados con papel de aluminio para el análisis de las quinonas y se guardó a -20 ˚C en oscuridad. A la capa inferior se le añadió 1 ml de éter de petróleo, se mezcló durante 5 minutos y se volvió a centrifugar con las mismas condiciones. Se volvieron a formar dos capas y la superior se volvió a guardar para el análisis de las quinonas. La capa inferior se mezcló con un agitador y se calentó durante 5 minutos en un baño a 99 ˚C. A continuación, los tubos se enfriaron a 37 ˚C durante 5 minutos. Se les añadió 2,3 ml de cloroformo: metanol: NaCl al 0,3% (p/v) (90:100:30 v/v) y se mezclaron durante 1 hora en un rotador. Pasado este tiempo, se centrifugaron los tubos durante 5 minutos a 1800 rpm y el sobrenadante se pasó a tubos limpios. Posteriormente, se les añadió a los sedimentos 2,3 ml de cloroformo: metanol: NaCl al 0,3% (p/v) (50:100:40 v/v), se mezclaron durante 30 minutos y se volvió a centrifugar, unificando los sobrenadantes con los del paso anterior. A los sobrenadantes recopilados se les añadió 1,3 ml de Cloroformo y 1,3 ml de NaCl al 0,3% (p/v) y se mezcló cuidadosamente durante 20 segundos, se volvieron a centrifugar los tubos y la fase inferior se pasó a un tubo de cristal y se concentró usando un evaporador a 40 ˚C durante 20-30 minutos. El residuo final se disolvió en 0,4 ml de cloroformo: metanol (2:1) y se guardó a -20 ˚C. MATERIALES Y MÉTODOS 65 A las muestras obtenidas se les hizo una cromatografía, utilizando placas de aluminio 10 x 10 (Macherey-Nagel). Se cargaron 20 µl de las muestras con una jeringuilla en la esquina inferior izquierda de la placa y se secaron con aire caliente seco. Se hicieron 4 placas por muestra y se rotularon en la esquina superior izquierda (Figura 13C). Las muestras corrieron dos veces en distintas posiciones. La primera cromatografía se realizó utilizando el solvente cloroformo: metanol: agua destilada (195:75:12) durante 30 minutos, aproximadamente, (hasta que el solvente llegue al final de la placa). Las placas se colocaron en la posición en la que el punto donde se pusieron las muestras quedara en la esquina inferior derecha y el nombre de la muestra en la esquina inferior izquierda (Figura 13B). Posteriormente, se secaron durante 30 minutos y se introdujeron en otra cubeta para la segunda cromatografía. Esta cubeta contenía el solvente cloroformo: ácido acético glacial: metanol: agua destilada (80:12:15:4). Las muestras se sometieron a cromatografía durante 30 minutos, aproximadamente, (hasta que el solvente llegue al final de la placa), con las placas en la posición en la que el nombre de la muestra quedara en la esquina superior izquierda y el punto de la muestra en la inferior izquierda (Figura 13C). Por último, se dejaron secar durante 30 minutos. La detección de los lípidos se realizó de la siguiente manera: • Detección de los grupos amino: se roció la placa 1 con un espray de ninhidrina 0,2%, calentada a 80 ˚C durante 10 minutos y enfriada a temperatura ambiente. Después de este paso, aparecieron puntos de color rosa que se marcaron con un lápiz y, finalmente, se escanearon las placas. • Detección de los grupos glico: la placa 2 se roció con un espray de ácido αnafto-sulfúrico y se trató como en el caso anterior. Se escanearon los puntos marrones que aparecieron. • Detección de los grupos fosfato: la placa 1 se roció con el espray de ninhidrina 0,2% con azul molibdeno al 1,3% diluido en ácido sulfúrico 4,5 M MATERIALES Y MÉTODOS 66 (1:1). La placa se secó a temperatura ambiente y aparecieron puntos azules. • Detección de lípidos totales: se roció la placa 3 con un espray de ácido molibdatofosfórico al 5% en etanol, se calentó a 150 ˚C durante 20 minutos, luego a 170 ˚C durante otros 20 minutos y finalmente, se enfriaron a temperatura ambiente. Después de estos pasos aparecieron puntos de color negro. • Detección de los grupos colina: se roció suavemente la placa 4 con un espray con el reactivo Dragendorff. La placa se secó a temperatura ambiente y aparecieron puntos de color amarillo-naranja (Tindall, 1990). 10.4. Análisis de las quinonas. Para los análisis de las quinonas se recuperaron las muestras recogidas durante la extracción de los lípidos polares, guardadas en oscuridad a -20 ˚C. Estas muestras se secaron completamente en el evaporador y el residuo formado se disolvió en 400 µl de acetona. Los extractos se cargaron en placas pequeñas TLC (gel de sílice TLC 60 F254.1.05735.0004 Merk), usando una pipeta Pasteur. En cada placa se cargaron dos muestras en 2 cm, a 1 cm del borde inferior. Se hizo una cromatografía de estas placas durante 30 minutos, aproximadamente, (el solvente no debe llegar al final de la placa) en una cubeta que contenía el solvente éter de petróleo: dietil éter (85:15 v/v), siempre fresco. Posteriormente, las placas se Metanol acuoso: 10 ml de una solución de NaCl al 0,3% en 90 ml de metanol. Espray con ácido α-nafto-sulfúrico: 40,5 ml de etanol; 4 ml de agua destilada; 6,5 ml de ácido sulfúrico concentrado y 10,5 ml de α-naftol (15 g/l en etanol). Reactivo Dragendorff: yoduro de potasio 0,11 M y subnitrato de bismuto 0,6 mM en ácido acético 3,5 M. MATERIALES Y MÉTODOS 67 dejaron secar a temperatura ambiente durante 30 minutos y se observaron bajo luz UV. Las marcas negras fuertes se marcaron con un lápiz, se rasparon y el sílice raspado se introdujo en una jeringuilla de cristal con un filtro. A la jeringuilla se le añadieron dos volúmenes de una pipeta Pasteur de dietil éter para la elución de las quinonas. El producto obtenido se secó completamente en el evaporador a 40 ˚C y el residuo final se disolvió con 200 µl de isopropanol para HPLC y se transfirió a un vial pequeño. Las quinonas se identificaron por HPLC. Figura 13. Diseño de las placas usadas en la cromatografía durante los análisis quimiotaxonómicos. (A) Placa de celulosa 20 x 20 para realizar los estudios de los ácidos diaminopimélicos y los azúcares de membrana; (B) placa de aluminio 10 x 10 para el análisis de los lípidos polares en la posición de la primera cromatografía; (C) placa de aluminio 10 x 10 para el análisis de los lípidos polares en la posición de la segunda cromatografía. MATERIALES Y MÉTODOS 68 10.5. Análisis de los ácidos grasos La extracción de los ácidos grasos se realizó en todas las cepas estudiadas como especies nuevas y en las cepas tipo de referencia de cada una, siguiendo el protocolo descrito por Sasser (1990). En primer lugar, se sembraron las bacterias problema y las de referencia con las mismas condiciones en placas de medio TSA 0,3 M a 28 ˚C. Para las cepas de Pseudoalteromonas y Bacillus, las placas se incubaron durante 24 horas, mientras que para el caso de Kushneria, Halomonas y Staphylococcus fueron necesarias 48 horas. Pasado el tiempo de incubación se recogieron de estas placas 40 mg de biomasa, y se pasaron a un tubo de cristal con tapón de rosca, y se guardaron a -20 ˚C. Para la realización de la extracción, se siguieron 4 pasos: saponificación, metilación, extracción y lavado. Para la saponificación, se añadió 1 ml del Reactivo 1 a cada tubo con las bacterias, se mezclaron con el agitador y se calentaron en agua a 99 ˚C durante 5 minutos. Pasado este tiempo, se volvieron a agitar las muestras durante 5-10 segundos y se devolvieron al baño durante 30 minutos más. Finalmente, se enfriaron en agua helada durante 5 minutos. Para la metilación, se les añadió a los tubos 2 ml del Reactivo 2, se mezclaron brevemente con el agitador, se calentaron a 80 ˚C durante 10 minutos (este paso es crítico en el tiempo y la temperatura) y, por último, se enfriaron en agua helada durante 5 minutos. Para realizar la extracción de los ácidos grasos, se añadió a las muestras 1,25 ml de Reactivo 3, se voltearon en un rotador durante 5 minutos. A continuación, se centrifugaron los tubos a 1800 rpm durante 5 minutos y se descartó la fase acuosa (la inferior). MATERIALES Y MÉTODOS 69 El último paso fue el lavado. Para ello, se añadió 4 ml del Reactivo 4 a los tubos y se voltearon durante 5 minutos en el rotador. Posteriormente, se les añadió un volumen de una pipeta Pasteur del Reactivo 5 y se transfirió la capa superior a un vial y se guardó a 4 ˚C hasta su análisis. Para el análisis e identificación de los ácidos grasos, los viales con las muestras se enviaron a una compañía externa, que usaron el sistema MIDI para la identificación. 11. Resistencia a sal y a metales pesados. Con el fin de determinar la resistencia a NaCl, las bacterias se sembraron en placas de medio TSA suplementadas con concentraciones crecientes de SW30 desde una fuerza iónica de 0,5 M hasta 4 M (preparadas añadiendo la cantidad correspondiente de SW30). Estas placas se incubaron a 28 ˚C durante 3 días. De manera similar, la resistencia a metales pesados se realizó en placas de medio TSA 0,3 M. Las placas se prepararon añadiendo cantidades crecientes de metales pesados a partir de soluciones stock de los metales probados: NaAsO2 0,5 M; CdCl2 1 M; CuSO4 1 M; CoCl2 1 M; NiCl2 0,5 M; Pb(NO3)2 0,5 M y ZnSO4 1 M. Las concentraciones finales de los metales en las placas fueron del rango de 0,1 a 60 Reactivo 1: 45 g de NaOH; 150 ml de metanol (para HPLC) y 150 ml de agua destilada. Reactivo 2: 325 ml de HCl 6N y 275 ml de metanol (para HPLC). Reactivo 3: 200 ml de hexano (para HPLC) y 200 ml de metil terc-butil éter. Reactivo 4: 10,8 g de NaOH y 900 ml de agua destilada. Reactivo 5: 40 g de NaCl y 100 ml de agua destilada. MATERIALES Y MÉTODOS 70 mM de As; de 0,1 a 3,5 mM de Cd y Cu; de 0,1 a 25 mM de Co, Ni, y Pb; y de 0,1 a 5 mM de Zn. Las bacterias se incubaron en estas placas durante 3-4 días a 28 ˚C. 12. Propiedades PGP. Las propiedades PGP estudiadas fueron la producción de auxinas, la producción de sideróforos, la solubilización de fosfato, la fijación de nitrógeno, la presencia de la actividad ACC desaminasa y la formación de biopelículas. Todos los medios utilizados se suplementaron con SW30 hasta alcanzar una fuerza iónica de 0,3 M. Estas propiedades también se estudiaron en presencia de metales pesados, y para ello, a los medios utilizados se les añadió el metal correspondiente a partir de las soluciones stock descritas en el apartado anterior, hasta llegar a 1 mM para As, Co, Cu, Ni, Pb, Zn y a 0,25 mM para el Cd. La producción de auxinas y la fijación de nitrógeno no se pudieron realizar en presencia de Pb debido a que la solución stock lleva nitrógeno y daría un falso positivo en la fijación de nitrógeno y, en el caso de las auxinas, el Pb precipitaba en presencia del reactivo de Salkowski. 12.1. Producción de IAA. Para la producción de IAA, las bacterias se sembraron en 4 ml de NB (Biolife) con L-triptófano (añadir 100 mg/l) durante 72 horas en agitación continua a 28 ˚C. Pasado este tiempo de incubación, se centrifugaron 1,5 ml de los cultivos durante 5 minutos a 13000 rpm y 1 ml del sobrenadante formado se transfirió a un tubo de cristal al que, posteriormente, se le añadió 4 ml del reactivo de Salkowski. Las mezclas se agitaron e incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. La aparición de un color rojo indica que la prueba es positiva (Figura 14A). Ese cambio de coloración se cuantificó en un espectrofotómetro (Lambda25; PerklinElmer) a 535 nm de longitud de onda, utilizando como blanco la mezcla del medio NB con el MATERIALES Y MÉTODOS 77 14. Inoculación de las semillas de A. macrostachyum. 14.1. Preparación de los inóculos bacterianos. Para poder inocular tanto las semillas como las plantas de A. macrostachyum, las cepas seleccionadas se incubaron por separado en 50 ml de TSB 0,3 M durante 18-24 horas a 28 ˚C en agitación continua hasta alcanzar la concentración de 108 células/ml. Para ello, se midió la densidad óptica de una muestra de cada cultivo con el espectrofotómetro a 600 nm y se comprobó que la densidad fuera alrededor de 0,9-1,0. Después, los cultivos se centrifugaron a 8000 rpm durante 10 minutos. Los sedimentos se lavaron con 50 ml de solución salina estéril al 0,9% (p/v) y se volvieron a centrifugar en las mismas condiciones. El sedimento formado se resuspendió en 5 ml de solución salina estéril al 0,9% (p/v). Los cultivos de las bacterias que formaban el mismo consorcio se mezclaron en un tubo Falcon de 50 ml. 14.2. Germinación de las semillas en presencia de metales. Las semillas de A. macrostachyum se recolectaron en marzo de 2015 de las marismas del Odiel (Huelva, España) (37˚ 13’N-6˚ 57’O). Se utilizaron para el experimento 600 semillas y, en primer lugar, se desinfectaron superficialmente. Para ello, se sumergieron en hipoclorito de sodio al 10% (p/v) durante 10 minutos en agitación. Pasado este tiempo, se lavaron 6 veces con agua destilada estéril. Una vez desinfectadas, se preinocularon 200 semillas con el consorcio CE y otras 200 con el consorcio CR. La preinoculación se realizó sumergiendo las semillas en 20 ml del cultivo de las bacterias (que contenía 5 ml de cada bacteria) durante 1 hora en agitación continua. Las 200 semillas restantes fueron utilizadas como control, para lo que se sumergieron durante 1 hora en agitación continua en 20 ml de solución salina estéril al 0,9% (p/v). MATERIALES Y MÉTODOS 78 Se prepararon 12 placas de agar-agua al 9% (p/v) y otras 12 placas de agar-agua al 9% (p/v) suplementadas con una mezcla de metales pesados, conteniendo 25 µM de cada metal (As, Cu, Pb y Zn). De esta manera, se crearon 6 condiciones de germinación: germinación de las semillas en presencia de metales, inoculadas con el consorcio CE, con el consorcio CR y sin inocular; y germinación en ausencia de metales pesados, inoculadas con el consorcio CE, con el consorcio CR y sin inoculación. Las semillas se germinaron en estas placas (25 semillas por placa y 4 placas por condición) en una cámara de germinación AGP-700-HR ESP (Radiber, Barcelona, España) durante 21 días en las siguientes condiciones: 10 horas a 20 ˚C, 50% de humedad y 100% de iluminación (400-700 nm, 35 µmol·m-2·s-2) y 14 horas a 5 ˚C, 50% de humedad y 0% de iluminación. La germinación de las semillas se observó cada día durante 3 semanas para poder determinar la cinética de germinación. 14.3. Germinación de las semillas en presencia de sal. Para este ensayo las semillas se recogieron en marzo de 2015 en Lebrija (Sevilla, España) (36˚ 54’N-6˚ 12’E) y se guardaron a 4 ˚C en oscuridad hasta que se utilizaron. El experimento de germinación comenzó en mayo de 2015. En primer lugar, se esterilizaron superficialmente 600 semillas de la misma manera que se describe en el apartado anterior. A continuación, se preinocularon 300 semillas con el consorcio de bacterias y las otras 300 se utilizaron como control, siguiendo el procedimiento descrito en el apartado anterior. Se prepararon 8 placas de agar-agua al 9% (p/v), 8 placas de agar-agua al 9% (p/v) suplementadas con 510 mM de NaCl y otras 8 placas de agar-agua al 9% (p/v) suplementadas con 1030 mM de NaCl. De esta manera, se crearon 6 condiciones MATERIALES Y MÉTODOS 79 de germinación: germinación de las semillas en ausencia de sal inoculadas con el consorcio y sin inocular; germinación en presencia de 510 mM de NaCl inoculadas con el consorcio y sin inocular; y germinación de semillas en presencia de 1030 mM de NaCl inoculadas con el consorcio y sin inocular. Las semillas germinaron en estas placas de manera similar a como se describe en el apartado anterior y en las mismas condiciones de crecimiento. La germinación de las semillas se observó cada día para poder determinar la cinética de germinación. Figura 15. Semillas germinadas de A. macrostachyum en una placa de Petri con agar-agua al 9% (p/v). MATERIALES Y MÉTODOS 80 15. Ensayo de las plantas en suelos contaminados. Las semillas germinadas en ausencia de metales (n=30) se traspasaron a macetas individuales con perlita y se mantuvieron en las mismas condiciones que las plántulas del apartado anterior durante 4 meses. Transcurrido este tiempo, las plantas se traspasaron de nuevo a macetas individuales, pero con sedimentos homogenizados de las marismas del Odiel. Las plantas se asignaron de forma aleatoria en 3 bandejas dependiendo del tratamiento de inoculación (sin inocular, inoculadas con el consorcio CE e inoculadas con el consorcio CR) y mantenidas en las mismas condiciones de invernadero durante 4 meses. Figura 16. Bandeja del tratamiento sin inocular con macetas de A. macrostachyum con suelo de las marismas del Odiel. MATERIALES Y MÉTODOS 81 Durante el experimento, las plantas se inocularon con los consorcios una vez a la semana durante el primer mes, y luego, dos veces al mes. Esta inoculación se hizo mezclando los inóculos con 500 ml de agua corriente y cada maceta se regó con 50 ml de la mezcla. Las plantas no inoculadas se regaron con 50 ml de agua corriente por maceta. Las plantas estuvieron inundadas todo el tiempo en un litro de agua corriente, dejando 1 cm de profundidad, y los niveles se monitorizaron durante todo el experimento. Además, cada semana se cambió el agua de las bandejas. Una vez acabado el experimento, se reaislaron las bacterias de los tejidos de las plantas y de los sedimentos como se describe en el aparatado 2, con el fin de observar la presencia de las bacterias utilizadas en los consorcios. 16. Ensayo de las plantas en presencia de sal. Las semillas germinadas en las placas sin sal se transfirieron a macetas individuales con perlita y separadas en diferentes bandejas según su tratamiento de inoculación. Los semilleros se mantuvieron en una temperatura controlada entre 21 ˚C y 25 ˚C, 46-60% de humedad relativa, luz diurna natural de 35 µmol·m-2·s-2 como mínimo y 1000 µmol·m-2·s-2 como luz máxima. Las bandejas siempre estuvieron inundadas por una solución Hoagland al 20%. En septiembre de 2015, las macetas con plantas de 4 meses se traspasaron a diferentes bandejas, asignadas aleatoriamente, para comenzar con los tratamientos de sal (0, 510 y 1030 mM de NaCl), manteniendo las inoculaciones (n=54, 9 plantas x 3 concentraciones de sal x 2 tratamientos de inoculación). Para mantener los tratamientos de inoculación, las plantas derivadas de las semillas preinoculadas se reinocularon con 200 µl del inóculo bacteriano cada MATERIALES Y MÉTODOS 82 semana durante las 3 primeras semanas del experimento, y una vez al mes durante el resto del experimento (3 meses). Las macetas estuvieron inundadas por la solución Hoagland al 20% suplementadas con la cantidad de NaCl correspondiente según el tratamiento. Así, al principio, se vertieron 3 litros de cada solución (0, 510 y 1030 mM) en cada bandeja, dejando una profundidad de 1 cm, y este nivel se monitorizó y se mantuvo durante todo el experimento. Además, la solución de cada bandeja se cambió cada semana. Una vez finalizado el experimento, se reaislaron las bacterias de las filosferas de las plantas como se describe en el aparatado 2, con el fin de observar la presencia de las bacterias usadas en el consorcio. 17. Análisis del crecimiento. Se utilizaron 3 plantas al principio de los experimentos para poder estimar la biomasa seca inicial que tenían las plantas antes de los tratamientos. Al final de los experimentos, se cosecharon 7 plantas de cada tratamiento para obtener la masa seca final. Para ello, se separaron las raíces y la parte aérea de las plantas y se secaron a 60 ˚C durante 48 horas y luego se pesaron en una balanza. La tasa de Solución Hoagland al 20% (Hoagland y Arnon, 1938): 0,115 g de NH4(H2PO4) 1 M; 0,606 g de KNO3 1 M; 0,944 g de Ca(NO3)·4 H2O 1 M; 0,492 g de MgSO4·7 H2O 1 M; 1 ml de solución de micronutrientes; 2 ml de solución de hierro y agua destilada hasta completar 1 litro. Esta solución se diluyó en agua destilada al 20%. La solución de micronutrientes consta de 2,86 g de H3BO3; 0,18 g de MnCl2·4 H2O; 0,22 g de ZnSO4·7 H2O; 0,08 g de CuSO4·5 H2O; 0,02 g de H2MoO4· H2O y agua destilada hasta completar 1 litro. La solución de hierro es 5 mg de quelato y agua destilada hasta completar 1 litro. MATERIALES Y MÉTODOS 83 crecimiento relativo (RGR) de las plantas completas se calculó usando la siguiente fórmula con la media de los pesos obtenidos: RGR = (ln Bf – ln Bi) · D-1 (g g-1día-1) donde Bf= la masa seca final, Bi= masa seca inicial y D= la duración del experimento (días). 18. Concentración de iones en los tejidos de las plantas. Al final de los experimentos, los tallos y las raíces de 7 plantas de cada tratamiento se lavaron cuidadosamente con agua destilada antes de los análisis y se secaron a 60 ˚C durante 48 horas. Luego, las muestras secas se molieron y se enviaron al Centro de Edafología y Biología aplicada del Segura-CSIC (Murcia, España) para medir la concentración total de As, Cr, Cu, Ni, Pb, Zn y Na por ICP-OES, mediante el servicio de ionómica. 19. Intercambio de gases y análisis de fluorescencia de la clorofila. Las medidas de intercambio de gas instantáneo se tomaron de ramas primarias seleccionadas aleatoriamente de cada planta en los diferentes tratamientos. Las medidas se hicieron usando un analizador de gas infrarrojo (IRGA) en un sistema abierto (LI-6400XT, LI-COR Inc., Nev., EEUU) equipado con una cámara de luz para la hoja (Li-6400-02B, Li-Cor Inc.) para obtener la tasa fotosintética neta (AN), la conductancia estomática (gs) y la concentración intracelular de CO2 (Ci). Las medidas se realizaron entre las 10 de la mañana y las 2 de la tarde, bajo una densidad de flujo de fotones fotosintéticos de 1000 µmol·m-2·s-1 (con un 15% de luz azul para maximizar la apertura estomática), un déficit de presión de vapor de 2-3 kPa, una temperatura de alrededor de 25 ˚C y un ambiente de concentración MATERIALES Y MÉTODOS 84 de CO2 (Ca) de 400 µmol·mol-1 de aire y, antes de cada medida, se permitió que el intercambio de gases se equilibrara (120 s). El área fotosintética usada en cada medida fue aproximadamente como media área de las ramas cilíndricas, ya que solo la mitad de arriba recibió iluminación unilateral en la cámara de hojas (Redondo-Gómez et al., 2010b). Para saber el área fotosintética, se midió el ancho de cada rama medida. En paralelo al análisis del intercambio de gases, la fluorescencia de la clorofila se midió en ramas primarias aleatorias de todas las plantas de los experimentos, usando un fluorímetro modulado portátil (FMS-2, Hansatech Instrument Ltd., Inglaterra). Los parámetros de fluorescencia adaptados a la oscuridad y a la luz se midieron a medio día (1500 µmol·m-2·s-1). Las ramas se adaptaron a la oscuridad durante 30 minutos usando unos clips de hojas diseñados para este propósito. Los niveles mínimos de fluorescencia en el estado de oscuridad adaptada (F0) se midieron usando un pulso modulado de <0,05 µmol·m-2·s-1 durante 1,8 µs. Este pulso es tan pequeño como para inducir los cambios fisiológicos significativos en la planta (Schreiber et al., 1986). Los datos que se almacenaron fueron un promedio tomados en un periodo de 1,6 s. La máxima fluorescencia es este estado (Fm) se midió después de aplicar un pulso luminoso actínico saturante de 15000 µmol·m-2·s-1 durante 0,7 s (Bolhàr- Nordenkampf y Öquist, 1993). Los valores de Fm se grabaron como la media más alta de dos puntos consecutivos. Se utilizó la misma rama para medir los parámetros adaptados a la luz. El rendimiento de fluorescencia en estado estacionario (Fs) se almacenó después de adaptar las ramas a un ambiente de luz durante 30 minutos. Se utilizó un pulso luminoso actínico saturante de 15000 µmol·m-2·s-1 durante 0,7 s para producir el máximo rendimiento de fluorescecia (F’m) inhibiendo temporalmente la fotoquímica del fotosistema II (PSII). MATERIALES Y MÉTODOS 85 Utilizando los parámetros de fluorescencia determinados en estados adaptados a la oscuridad y a la luz, se calculó la máxima eficiencia cuántica de la fotoquímica del PSII (Fv/Fm= (Fm-F0) /Fm) y la eficiencia cuántica del PSII (  PSII= (F’m- Fs) /F’m; (Genty et al., 1989)). 20. Análisis de enzimas antioxidantes. Para estimar el efecto de la presencia de metales pesados sobre el sistema antioxidante, se determinaron las actividades enzimáticas en las plantas cultivadas en sedimentos contaminados. Para este análisis, se recogieron 500 mg de los tejidos frescos de los tallos y de las raíces de plantas seleccionadas aleatoriamente de cada tratamiento al final del experimento en tubos Falcon, y se introdujeron en un tanque con nitrógeno líquido al momento de cortarlos. Después de recoger todas las muestras, estas se mantuvieron a -80 C ˚hasta su utilización. En primer lugar, se homogeneizaron las muestras en 8 ml de tampón de extracción frío con un homogenizador y se centrifugaron a 9000 rpm durante 20 minutos a 4 ˚C. El sobrenadante se repartió en tubos eppendorf enfriados previamente y se guardaron a -80 ˚C hasta su uso. Se utilizó un tubo eppendorf para cada enzima que se midió. Las actividades enzimáticas obtenidas se expresaron como unidades (U) por µg de proteína y se hicieron tres réplicas para cada actividad enzimática. Para conocer la cantidad de proteínas presentes en las muestras, se mezclaron 750 µl de tampón de extracción con 50 µl del extracto vegetal y 200 µl de reactivo de Bradford (Sigma Aldrich) y se incubó la mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos. Al mismo tiempo se mezclaron 800 µl de tampón de extracción con 200 µl de Bradford para obtener el blanco y también se incubó MATERIALES Y MÉTODOS 86 durante 5 minutos a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo, las muestras se midieron en el espectrofotómetro a 595 nm. Las medidas se realizaron por triplicado y la cantidad de proteínas se calculó usando una fórmula creada a partir de una curva patrón. La curva patrón se realizó creando 10 concentraciones diferentes de la proteína albúmina de suero bovino (BSA) (Tabla 2), y mezclando 50 µl de cada concentración conocida con 750 µl de tampón de extracción y 200 µl de reactivo de Bradford (Bradford, 1976). La mezcla se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente y se midió en el espectrofotómetro y con los datos se creó una recta de regresión y su fórmula correspondiente. 20.1. Ensayo de la actividad catalasa. Para determinar la actividad catalasa en las muestras se midió la desaparición de H2O2 viendo la absorbancia a 240 nm, utilizando el programa Tabla 2. Datos para crear las diferentes concentraciones de BSA usadas para construir una curva patrón de proteínas. Concentración de BSA (mg/ml) 0 0,025 0,05 0,075 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Volumen de BSA (1 mg/ml) (µl) 0 1,25 2,5 3,75 3,75 5 10 20 40 50 Volumen de tampón de extracción (µl) 50 50 50 50 45 40 30 20 10 0 Tampón de extracción (fosfato 50 mM): 1,073 g de fosfato de sodio monohidratado; 10,13 g de fosfato disódico heptahidratado; 0,034 g de Na-EDTA y agua destilada hasta completar 1 litro. Ajustar el pH a 7,6. Conservar a 4 ˚C. CAPÍTULO 1 93 OBJETIVOS El objetivo principal que se persigue en este Capítulo es aislar bacterias del microbioma de plantas de Arthrocnemum macrostachyum crecidas en sedimentos contaminados con metales pesados de las marismas del Odiel y estudiar el efecto de las mismas en la capacidad fitoestabilizadora de la planta. Para ello, se han abordado los siguientes objetivos específicos: • Aislar bacterias rizosféricas y endofíticas de plantas de A. macrostachyum crecidas en las marismas del Odiel. • Caracterizar las bacterias aisladas: resistencia a metales pesados y a sal, presencia de propiedades que promuevan el crecimiento de la planta (PGP) y efectos de los metales pesados sobre las propiedades PGP presentes en las bacterias. • Seleccionar las mejores bacterias aisladas en base a sus propiedades PGP y su resistencia a metales, tanto de la rizosfera como del interior de la planta, para formar consorcios bacterianos. • Observar el efecto de los consorcios bacterianos sobre la germinación de las semillas de A. macrostachyum, en presencia y ausencia de metales, y sobre el desarrollo de plantas de A. macrostachyum cultivadas en suelo contaminado de las marismas del Odiel en condiciones de invernadero. CAPÍTULO 1 95 RESULTADOS 1. Aislamiento e identificación de las bacterias cultivables de la rizosfera y los tejidos de A. macrostachyum. Las propiedades fisicoquímicas de las muestras de suelo procedentes de las marismas del Odiel se muestran en la Tabla 3. Se midieron también la concentración de los metales/metaloides en los tejidos de A. macrostachyum y en el suelo rizosférico recogido del estuario del río Odiel (Tabla 3). Los datos del suelo fueron similares a los publicados por Mesa et al. (2015a). De acuerdo con la morfología de las colonias y la tinción de Gram, se aislaron 48 bacterias cultivables diferentes de la parte aérea, raíces y rizosfera de plantas de A. macrostachyum crecidas en las marismas del río Odiel (Tabla 4). Once cepas bacterianas fueron endofitos aislados de la filosfera (parte aérea de las plantas; nombradas como EAod) y 19 de las raíces de las mismas plantas (nombradas como EAR), mientras que 18 aislamientos diferentes se recuperaron de sus rizosferas (nombradas como RA). Casi el 50% de las especies aisladas de la rizosfera se recuperaron de las raíces como endofitos. Tabla 3. Propiedades fisicoquímicas del suelo y concentraciones finales de arsénico (As), cadmio (Cd), cobalto (Co), cobre (Cu), níquel (Ni), plomo (Pb) y zinc (Zn) en el suelo y en las raíces y tallos de las plantas de A. macrostachyum de las marismas del Odiel. Propiedades fisicoquímicas Textura (%) Conductividad (mS·cm-1) Potencial redox (mV) pH Suelo 71/20/9 11,2 ± 0,4 135 ± 13 6,8 ± 0,2 Concentración de metales pesados (mg·kg-1) As Cd Co Cu Ni Pb Zn Suelo 253,8 ± 5,1 2,4 ± 0,1 9,5± 0,2 856,1 ± 17,1 18,0 ± 0,4 319,6 ± 6,4 1516,3 ± 30,03 Raíces 52,8 ± 1,1 0,3 ± 0,0 1,5 ± 0,0 117,9 ± 2,4 16,8 ± 0,3 29,5 ± 0,6 137 ± 2,8 Tallos 7,2 ± 0,5 <0,1 <0,5 32,1 ± 0,6 1,9 ± 0,0 5,0 ± 0,0 61,1 ± 1,2 Los valores son la media ± S.E. de cinco réplicas. Textura (porcentajes de limo/arcilla/arena). CAPÍTULO 1 96 Los bacilos Gram negativos representaron el 75% de los aislados, mientras que el 21% fueron bacilos Gram positivos y el 4% cocos Gram positivos. Cabe destacar que la mayoría de las bacterias Gram positivas fueron aisladas de la rizosfera de las plantas. Las secuencias del gen del ARNr 16S apuntaban a los géneros Bacillus, Pseudoalteromonas, Vibrio, Staphylococcus, Kushneria y Halomonas como los más abundantes (Tabla 4), pero el género Kushneria estuvo solo presente en la filosfera. Se obtuvieron las secuencias parciales del gen del ARNr 16S de algunos aislados y las secuencias casi completas de las cepas seleccionadas para los experimentos de inoculación de semillas y plantas (Tabla 4). Distancia Figura 17. Patrones de la Box-PCR comparados usando un dendrograma, en las bacterias rizosféricas (A) y endofíticas (B), aisladas de plantas de A. macrostachyum crecidas en las marismas del Odiel. Las escalas encima de cada dendrograma representan la similitud. A B Distancia Distancia CAPÍTULO 1 97 Tabla 4. Especies cercanas a las cepas aisladas de A. macrostachyum en base a la secuencia parcial del gen ARNr 16S. En negrita: cepas seleccionadas para los ensayos en plantas. Cepa Nº de acceso Especies relacionadas Fragmento secuenciado (pb) Identidad (%) EAod1 KU320854 Halomonas songnenensis 1186 75,76 EAod2 KU320855 Halomonas arcis 1402 96,43 EAod3 KU320856 Kushneria marisflavi 1467 98,63 EAod4 KU320857 Kushneria marisflavi 1413 98,08 EAod5 KU320858 Halomonas arcis 1404 95,50 EAod6 KU320859 Halomonas songnenensis 1151 85,39 EAod7 KU320860 Kushneria marisflavi 1418 97,23 EAod8 KU320861 Kushneria indalinina 1423 98,58 EAod9 KU320862 Vibrio sagamiensis 1410 95,14 EAod10 KX446974 Micrococcus aloeverae 1421 97,97 EAod11 KU320864 Halomonas arcis 1403 97,50 EAR1 KU320865 Vibrio kanaloae 1253 96,93 EAR2 KU320866 Bacillus thuringiensis 1110 98,10 EAR3 KU320867 Pseudoalteromonas undina 1327 96,64 EAR4 KU320868 Pseudoalteromonas prydzensis 1187 98,12 EAR5 KU320869 Pseudoalteromonas agarivorans 1158 88,16 EAR6 KU320870 Pseudoalteromonas tetraodonis 1030 83,67 EAR7 KU320871 Pseudoalteromonas tetraodonis 1136 84,24 EAR8 KU320872 Bacillus vietnamensis 1374 97,80 EAR9 KU320873 Halomonas zincidurans 1364 94,49 EAR10 KU320874 Alteromonas halophila 1367 94,72 EAR11 KU320875 Pseudoalteromonas prydzensis 1131 96,55 EAR12 KU320876 Pseudoalteromonas agarivorans 947 98,40 EAR13 KU320877 Pseudoalteromonas agarivorans 1076 98,23 EAR14 KU320878 Halomonas zincidurans 1085 97,51 EAR15 KU320879 Bacillus hwajinpoensis 1385 97,07 EAR16 KU320880 Pseudoalteromonas tetraodonis 877 83,47 EAR17 KU320881 Pseudoalteromonas espejiana 1337 95,14 EAR18 KU320882 Halomonas zincidurans 1262 96,59 EAR19 KU320883 Marinobacter nanhaiticus 1358 97,54 RA1 KU588386 Vibrio kanaloae 1425 96,54 RA2 KU588387 Bacillus thuringiensis 1324 97,86 RA3 KU588388 Acinetobacter ursingii 912 86,70 RA4 KU588389 Pseudoalteromonas undina 1365 98,14 RA5 KU588390 Pseudoalteromonas prydzensis 805 95,30 RA6 KU588391 Pseudoalteromonas tetraodonis 1129 98,05 RA7 KU588392 Bacillus vietnamensis 976 88,82 RA8 KU588393 Pseudoalteromonas distinct 1366 98,76 RA9 KU588394 Bacillus hwajinpoensis 1148 94,12 RA10 KU588395 Pseudoalteromonas tetraodonis 957 95,09 RA11 KU588396 Halomonas alkaliantarctica 628 78,12 RA12 KU588397 Bacillus timonensis 1235 91,84 RA13 KU588398 Bacillus cereus 1260 97,21 RA14 KU588399 Bacillus enclensis 1122 79,87 RA15 KU588400 Pseudoalteromonas prydzensis 1389 97,55 RA16 KU5883401 Bacillus anthracis 488 96,61 RA17 KU5883402 Pseudoalteromonas issachenkonii 997 89,90 RA18 KU5883403 Staphylococcus warneri 1428 97,53 CAPÍTULO 1 98 La diversidad genética se estudió mediante Box-PCR (Figura 17). Solo las cepas EAod3 y EAod4, relacionadas con especies de Kushneria marisflavi, mostraron el mismo perfil de bandas. Aunque las secuencias del gen del ARNr 16S y los perfiles de la Box-PCR sugieren que varios de los aislados pertenecían a la misma especie, podrían ser consideradas como cepas distintas, ya que mostraron diferentes propiedades y características a lo largo de estos estudios. No se caracterizaron las cepas RA16 (Tabla 4), RA2, RA13 y EAR2 (datos no mostrados) debido a que las secuencias preliminares del gen del ARNr 16S revelaron una alta identidad con el patógeno Bacillus anthracis. 2. Caracterización de las cepas aisladas de A. macrostachyum. 2.1. Cribado de las actividades enzimáticas y la movilidad. Para la caracterización de las bacterias aisladas, se estudió en primer lugar, la presencia de varias actividades enzimáticas, incluyendo proteasa, lipasa, amilasa, ADNasa, celulasa, pectinasa y quitinasa (Tabla 5 y Figura 18). La mayoría de las cepas presentaron la actividad ADNasa y, en menor medida, la actividad proteasa, mientras que las actividades lipasa y amilasa aparecieron en el 50% de los aislados, aproximadamente. Se observaron pequeñas diferencias en la presencia de estas actividades entre las bacterias endofitas y las rizosféricas. Por el contrario, fue menos frecuente la presencia de celulasa, pectinasa y quitinasa entre los aislados. CAPÍTULO 1 99 Tabla 5. Actividades enzimáticas mostradas por las cepas aisladas (+: presencia de la actividad; -: ausencia de la actividad). M: movilidad. EAod: endofitos aislados de la filosfera, EAR: endofitos aislados de las raíces, RA: aislados de la rizosfera. Cepa proteasa lipasa amilasa ADNasa celulasa pectinasa quitinasa M EAod1 - - - + + - - + EAod2 + - - - + - - + EAod3 + - + + - - - + EAod4 + - + + - - - + EAod5 + - - + + - - + EAod6 - - - + - - - - EAod7 - - + + - - - + EAod8 - - + + - - - + EAod9 + - + + + - - + EAod10 + - + - - - - - EAod11 + - - + - - - + EAR1 + - + + - - + + EAR3 + + + + - - - + EAR4 + + - + - + + - EAR5 + + + + - - + + EAR6 + + - + - - + + EAR7 + + + + - - + + EAR8 + - - + - - - - EAR9 - + + + - - - + EAR10 + + - + - - - + EAR11 + - - + + + + + EAR12 + + - + - - - + EAR13 + + - + - - - + EAR14 - - + - - - - + EAR15 + - + + - - - - EAR16 + + + + - - - + EAR17 + + + + + - - + EAR18 - - - - - - - + EAR19 + + - + - - + + RA1 + - + + - - + + RA3 + + - + - + + - RA4 + + + + - - - + RA5 + + + + - + + + RA6 + + - + - - - - RA7 + - - + - - - - RA8 + + + + - - - - RA9 + - - + - - - - RA10 + + - + + - - - RA11 - - + + - - - + RA12 - - - + - + - + RA14 + - - + - - - - RA15 + + + + - + + - RA17 + + - + - - + - RA18 - - - - - - - - CAPÍTULO 1 100 La actividad celulasa apareció de manera más habitual en los endofitos, mientras que un mayor número de cepas mostraron la actividad pectinasa en la rizosfera. Finalmente, el número de bacterias con quitinasa fue similar tanto en las bacterias de la rizosfera como en las aisladas del interior de la planta (Figura 18). Con respecto a la movilidad, el 83% de los endofitos eran móviles, frente al 33% de las bacterias rizosféricas. 2.2. Resistencia a sal y a metales pesados. Una característica importante para el uso de estas bacterias en suelos contaminados con metales pesados es la resistencia a estos metales. La mayoría de las bacterias presentaron multirresistencia a varios metales pesados (Tabla 6), creciendo alguna de ellas a concentraciones tan altas como 56 mM de As (EAod10), 23 mM de Ni (EAod7), 21 mM de Co (EAR1 y RA1), 20 mM de Pb (EAod3, 4 y 10), 4,5 mM de Zn (EAR11) o 3 mM de Cd (RA3). Figura 18. Actividades enzimáticas presentes en las cepas aisladas. Se comparan los porcentajes de cada actividad presente en los grupos de los aislados. CAPÍTULO 1 101 En general, los valores más altos de la resistencia para un determinado metal se encontraron en cepas de endofitos. La abundancia de cepas resistentes a diferentes metales entre los tres grupos de aislados se muestra en la Figura 19A. Todos los aislados de las raíces de las plantas y de la rizosfera crecieron en un rango de concentración de Cu de 2-3 mM (Figura 20). Sin embargo, el 64% de los endofitos aislados de la filosfera no crecieron a 0,1 mM de Cu y el 36% de ellos fueron capaces de crecer a la máxima concentración de 1 mM (Figura 20 y Tabla 6). Figura 19. Resistencias de las cepas aisladas a metales pesados (A) y NaCl (B). El porcentaje de bacterias capaces de crecer a concentraciones superiores a 1 mM de As, Cu, Pb, Zn, Co o Ni y superiores a 0,5 mM de Cd o Hg fueron consideradas como resistentes en (A). El porcentaje de bacterias capaces de crecer a cada MTC está representado en (B). CAPÍTULO 1 102 Tabla 6. Concentraciones máximas tolerables (MTC) para los metales pesados y el NaCl para cada aislado. H: cepa halófila (+). EAod: endofitos aislados de la filosfera, EAR: endofitos aislados de las raíces, RA: aislados recuperados de la rizosfera. Cepa As (mM) Cu (mM) Pb (mM) Zn (mM) Cd (mM) Co (mM) Hg (mM) Ni (mM) NaCl (M) H EAod1 2 <0,1 16 1,2 0,8 3 <0,1 8 3 - EAod2 1,2 <0,1 16 1,2 0,4 5 <0,1 4 3 + EAod3 2 1 20 1,2 1,3 2 <0,1 2 3 - EAod4 4 1 20 1,2 1,3 2 <0,1 4 3 - EAod5 2 <0,1 16 1,2 0,5 3 <0,1 8 3 - EAod6 2 <0,1 16 1,2 0,5 4 <0,1 4 3 - EAod7 2 1 16 1,2 1,3 2 <0,1 23 3 - EAod8 2 <0,1 16 1,2 <0,1 2 <0,1 10 3 - EAod9 <0,1 <0,1 11 1,2 0,4 2 <0,1 19 3 + EAod10 56 1 20 2 1,3 11 <0,1 19 1 - EAod11 2 <0,1 16 1,2 0,3 4 <0,1 8 2 - EAR1 14 2 8,4 0,3 0,3 21 0,3 0,3 0,6 + EAR3 <0,1 2 8,4 4 0,3 7,7 <0,1 8,5 1,5 + EAR4 <0,1 2 0,5 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,6 - EAR5 13 2 0,5 0,3 0,3 8,7 0,3 0,3 1,5 + EAR6 <0,1 2 8,2 3,3 0,3 14 0,2 7,5 1,5 - EAR7 5 2 8,6 1 1,3 7,6 0,6 8,5 1,5 - EAR8 8 2 9 4 2 8,4 0,6 15 1,5 - EAR9 0,3 3 0,3 0,3 0,3 0,3 <0,1 0,3 2 + EAR10 0,3 2 0,3 0,3 0,3 0,3 <0,1 0,3 0,6 + EAR11 <0,1 2 0,5 4,5 1,9 0,3 0,3 0,3 0,6 - EAR12 <0,1 2 8,2 4 0,3 14 0,3 8,5 1,5 + EAR13 <0,1 2 9 4 0,7 18 0,3 7,5 2 + EAR14 0,3 2 0,3 0,8 2 0,3 0,1 0,3 2 + EAR15 32 2 8,2 0,9 0,3 8,4 0,6 8,5 1,5 - EAR16 6 2 8,2 4 1,2 16 0,8 8,5 1 - EAR17 <0,1 2 0,3 0,3 0,2 0,3 <0,1 0,3 2 - EAR18 0,3 2 0,5 0,3 2 0,3 <0,1 0,2 1,5 + EAR19 7 3 9 1 <0,1 0,3 <0,1 7 0,6 + RA1 0,3 2 8,2 0,3 2,5 21 0,3 7 0,6 + RA3 12 2 8,2 4 3 11 <0,1 8,5 1,5 + RA4 6 2 8,2 4 0,1 11 0,4 7,8 0,6 - RA5 18 2 0,5 4 1,9 0,3 0,8 13 1,5 - RA6 6 2 8,6 4 0,3 8,7 0,3 7 1,5 - RA7 20 2 8,2 0,9 0,3 7,7 <0,1 7,8 1,5 - RA8 16 2 0,5 4 0,1 8,5 0,3 7,8 2 + RA9 18 2 8,2 3 0,2 7,7 <0,1 7 1,5 - RA10 <0,1 2 0,2 0,3 0,3 0,3 0,3 0,1 1,5 + RA11 <0,1 3 8,9 3 0,7 8,5 0,8 9 0,6 - RA12 12 3 8,2 0,3 1,2 5 0,8 5 1,5 - RA14 18 3 8,2 3 2,5 7,7 0,6 7,8 1 - RA15 12 3 8,2 3,3 0,2 7,6 0,2 0,8 1,5 - RA17 <0,1 2 8,2 4 0,4 16 0,2 7,8 1,5 + RA18 3 3 11,6 0,8 0,3 7,5 <0,1 15 1,5 - CAPÍTULO 1 109 Tabla 8. Propiedades PGP de las bacterias aisladas en presencia de As (1 mM), Cd (0,25 mM), Cu (1 mM), Pb (1 mM) o Zn (1 mM). (+: presencia de la propiedad; -: ausencia de la propiedad) EAod: endofitos aislados de la filosfera, EAR: endofitos aislados de las raíces, RA: aislados recuperados de la rizosfera. Producción de sideróforos Fijación de N2 Solubilización de fosfato Cepa As Cd Cu Pb Zn As Cd Cu Pb Zn As Cd Cu Pb Zn EAod3 + + + + + - - - - - - + + + + EAod4 + + + + + - - - - - - + + + + EAod7 - + - - - - - - - - - + - - - EAod9 - - + - - - - - - - - - + + + EAod10 + + + - - + - - - - - + - - + EAR1 + + + - - - - - - - - - - - - EAR3 + + + + + - - - - - - - - - - EAR4 + + + + + - - - - - - - - - - EAR5 - - - + + - - - - - - - - - - EAR6 - - + + + - - - - - - - - - - EAR7 + + - + + - - - - - - + - - - EAR8 - + - + - - - - - - - - - - - EAR9 + + + + + - - - - - - + - - - EAR10 + + + + + - - - - - - - - - - EAR11 - + - + + - - - - - - - - - - EAR12 - - + + + - - - - - + - - - - EAR13 - - + + + - - - - - - - - - - EAR14 + + + + + - - - - - - - - - - EAR15 + + - + - - - - - - - - - - - EAR16 + + - + + - - - - - - - - - - EAR17 - - - + + - - - - - - - - - - EAR18 - + + + + - - - - - - - - - - EAR19 - - - + - - - - - - - - - - - RA1 + - + + - + + + + + - + - - - RA3 - - + - - - - - - - - - - - - RA4 + - + + + - - - - - - - - - - RA5 + - - - - - - - - - - - - - - RA6 + - - + + - - - - - - - - - - RA7 - - - + + - - - - - - - - - - RA8 - - - + + - - - - - - + - - - RA9 - - - + + - - - - - - + - - - RA10 - - + - + - - - - - - - - - - RA11 - + + + - - - - - - - - - - - RA15 + + - + + - - - - - - + - - - RA17 - - + + + - - - - - - - - - - RA18 + - + + - - - - - - + - - - - CAPÍTULO 1 110 Tabla 9. Producción de IAA (mg·l-1) por las bacterias aisladas en presencia de metales pesados. EAod: endofitos aislados de la filosfera. (-: ausencia de producción). EAR: endofitos aislados de las raíces, RA: aislados recuperados de la rizosfera. Cepa As (1mM) Cd (0.25mM) Cu (1mM) Zn (1mM) EAod1 - 3,79 - - EAod2 - 1,68 - - EAod3 3,11 - 3,74 5,19 EAod4 2,05 - - - EAod5 - 3,47 - - EAod7 - 1,53 - - EAod9 1,92 - - 2,51 EAod10 33,54 5,32 - 6,51 EAR3 3,84 - - 2,09 EAR4 1,08 - - - EAR5 3,01 - - - EAR6 - - - 1,11 EAR7 8,17 - - - EAR8 1,64 - - - EAR9 9,39 - - - EAR10 9,35 - - - EAR11 10,27 4,60 - 1,75 EAR12 4,79 - - - EAR13 3,81 1,33 - 1,22 EAR14 8,09 6,84 - - EAR15 1,27 - - - EAR16 3,18 1,77 - - EAR17 5,16 - - - EAR18 5,10 3,78 - - EAR19 1,96 - - - RA1 2,21 - - - RA3 5,03 - 1,33 - RA4 3,63 - 1,72 - RA5 7,37 - - - RA6 4,16 - - - RA7 2,66 - - - RA8 5,79 - - 2,24 RA10 1,22 - - - RA11 - - - - RA12 3,10 - - - RA14 - 2,41 - - RA15 8,21 - - - RA17 2,47 - 1,13 1,13 CAPÍTULO 1 111 La propiedad PGP más sensible a la presencia de metales fue la fijación de nitrógeno. De hecho, solo RA1 fijó nitrógeno en presencia de todos los metales pesados y EAod10 en presencia de As (Figura 22). Finalmente, el número de bacterias que solubilizaron fosfato se incrementó en presencia de Cd (Figura 22). Cepas como RA8, RA9, RA15, EAR4 y EAR7, incapaces de solubilizar fosfato en ausencia de Cd, mostraron esta propiedad en presencia de dicho metal (Tabla 8). 5. Selección de bacterias para la formación de consorcios bacterianos. Para el posterior estudio del efecto de la inoculación sobre el desarrollo de las plantas, se seleccionaron las bacterias con mejores características y se constituyeron dos consorcios: CE (consorcio de bacterias endofitas) y CR (consorcio de bacterias rizosféricas). El consorcio CE se formó con los mejores endofitos aislados de las plantas de A. macrostachyum: Kushneria sp. EAod3, Micrococcus sp. EAod10, Bacillus sp. EAR8 y Halomonas sp. EAR18. EAod3 fue capaz de producir sideróforos tanto en presencia como en ausencia de metales pesados. También produjo auxinas en presencia de metales pesados. Además, esta cepa es la que toleró la mayor cantidad probada de Pb, Cu y Cd. EAod10 es posiblemente la mejor cepa de todos los aislados porque presentaba casi todas las propiedades PGP en presencia de metales (fijación de nitrógeno, producción de sideróforos e IAA y solubilización de fosfato) y tenía los mejores valores de MTC en la resistencia a todos los metales. Además, esta cepa le aporta al consorcio la formación de biopelículas. También se seleccionaron EAR8 y EAR18, presentando así el consorcio una mezcla de bacterias aisladas de las raíces y de la parte aérea de las plantas. EAR8 fijaba nitrógeno, solubilizaba fosfato en CAPÍTULO 1 112 presencia de Pb y es una de las cepas que mayor cantidad de sideróforos produjo, además de crecer en altas concentraciones de metales pesados. EAR18, por su parte, fue capaz de formar biopelículas y producir auxinas en presencia y ausencia de metales pesados. Para formar el consorcio CR, se seleccionaron las cepas Vibrio sp. RA1, Pseudoalteromonas sp. RA8, Pseudoalteromonas sp. RA15 y Staphylococcus sp. RA18, a partir de los aislados de la rizosfera. Estas cepas eran capaces de producir sideróforos con y sin metales en el medio (excepto RA18 que solo produce en presencia de metales pesados) y RA1 produjo la mayor cantidad de sideróforos de todos los aislados. RA1 y RA8 producían también IAA en presencia de metales pesados, mientras que RA15 y RA18 lo hicieron en ausencia de metales en el medio. Además, RA15 y RA18 fueron capaces de solubilizar fosfato cuando había metales en el medio. La fijación de nitrógeno es proporcionada por RA1 y la formación de biopelículas por RA18. Finalmente, estas cepas toleraban grandes concentraciones de metales pesados. 6. Efecto de los consorcios seleccionados en la germinación de semillas. Para estudiar el efecto de las bacterias seleccionadas en la germinación, se inocularon semillas de A. macrostachyum con ambos consorcios por separado. Además, las semillas germinaron en medios con y sin metales pesados. Aunque la germinación fue monitorizada durante 21 días, no se observó ningún cambio en el número de semillas germinadas después de 1 semana (Figura 23). En ausencia de metales pesados, no hubo diferencias significativas en la cinética de germinación entre las semillas no inoculadas y las inoculadas con el consorcio CE (Figura 23A). Sin embargo, la germinación se aceleró en las semillas CAPÍTULO 1 113 inoculadas con el consorcio CR, ya que ésta comenzó entre los días 2 y 3, con más del 80% de semillas germinadas en 4 días y cerca del 100% en 5 días (Figura 23A). Por el contrario, la cinética de germinación de las semillas inoculadas tanto con los consorcios CE y CR fue muy similar en presencia de pequeñas concentraciones de metales pesados (Figura 23B). En este caso, ambos grupos de inoculantes aceleraron la germinación cuando se comparan con las semillas no inoculadas, con un 70% vs. 20% de semillas germinadas en 4 días, o el 85% vs. 55% en 5 días (Figura 23B). Después de una semana, el 97% de las semillas inoculadas habían germinado, y cerca del 90% de las semillas no inoculadas también. 7. Impacto de la bioaumentación de los sedimentos en la captación de iones y la capacidad de transporte de los mismos por la planta. Para dilucidar el papel de los dos consorcios en la captación de metales por A. macrostachyum y en la capacidad de esta planta de transportarlos desde las Figura 23. Cinética de germinación de las semillas de A. macrostachyum en ausencia (A) y presencia (B) de metales pesados. Control: semillas no inoculadas; +CR: semillas inoculadas con el consorcio CR; +CE: semillas inoculadas con el consorcio CE. Los resultados son la media ± S.D. de cuatro placas independientes con 25 semillas por placa. CAPÍTULO 1 114 raíces hasta las hojas, se determinó la concentración de diferentes metales en los tejidos de plantas inoculadas crecidas en sedimentos de las marismas del Odiel y se comparó con los resultados obtenidos en plantas sin inocular. Los resultados de los análisis confirmaron que A. macrostachyum fue capaz de acumular grandes cantidades de metales en sus tejidos. De esta manera, al final del experimento (120 días), la concentración de iones fue mayor en las raíces que en los tallos en todos los tratamientos (t-test, P<0,01; Figura 24), y el contenido de As, Cr, Cu, Pb y Zn superó los umbrales de toxicidad crítica para estas concentraciones de metales en los tejidos de las plantas (Kabata-Pendias y Pendias, 2001). Además, los resultados indicaron que los sedimentos bioaumentados con ambos consorcios bacterianos favorecieron la capacidad de A. macrostachyum de acumular iones en sus raíces, aunque sin grandes diferencias entre ellas (ANOVA de una variable, P<0,05; Figura 24). Así, los aumentos en la concentración de iones en las raíces para los tratamientos CE y CR fueron de 112% y 61% para As, de 33% y 37% para el Cr, de 89% y 30% para el Cu, de 114% y 84% para el Pb, de 34% y 42% para el Ni y de 117% y 69% para el Zn, respectivamente. Por otro lado, la concentración de iones en la parte aérea se incrementó en las plantas inoculadas con el consorcio CE, mejorando cerca del 335%, 107%, 133%, 267%, 185% y 46% para el As, Cr, Cu, Pb, Ni y Zn, respectivamente, respecto a las plantas no inoculadas y las inoculadas con el consorcio CR (ANOVA de una variable, P<0,05; Figura 24). Estos resultados sugieren que el consorcio formado por endofitos parece tener un efecto positivo en la habilidad de A. macrostachyum de transferir metales desde las raíces hasta las hojas, hecho que podría contribuir en la mejora de su potencial acumulador. CAPÍTULO 1 115 Figura 24. Efecto de los tratamientos de bioaumentación (control, sin inoculación; CR, inoculación con consorcio CR; CE, inoculación con el consorcio CE; detalles en Materiales y Métodos) en el total de As (A), Cr (B), Cu (C), Pb (D), Ni (E) y Zn (F) para los tallos y las raíces de las plantas de A. macrostachyum crecidas en sedimentos naturales de las marismas del Odiel durante 120 días. Los valores son la media ± S.E. (n=7). Las distintas letras indican resultados que son significativamente diferentes (P<0,05). CAPÍTULO 1 116 8. Impacto de la bioaumentación de los sedimentos en la tolerancia de la planta al estrés por metales. 8.1. Efectos sobre el crecimiento de las plantas en sedimentos contaminados. El incremento de la concentración de metales en los tejidos de las plantas inoculadas con ambos consorcios, descrito en el apartado anterior, no llevó aparejado una inhibición del crecimiento de las plantas. De hecho, la RGR de las plantas de A. macrostachyum crecidas en sedimentos contaminados de las marismas del Odiel tendió a aumentar de manera similar con los dos tratamientos de bioaumentación (ANOVA, P>0,05; Figura 25A). Además, esta tendencia positiva se vio reflejada en el peso seco tanto de los tallos como de las raíces, que mostraron un incremento significativo del 37% y 53% a a a b b b b ab ab Figura 25. Efecto de los tratamientos de bioaumentación (control, sin inoculación; CR, inoculación con el consorcio CR y CE, inoculación con el consorcio CE; detalles en Materiales y Métodos) sobre la RGR (A) y sobre la masa seca total (B) en las plantas de A. macrostachyum crecidas en sedimentos naturales procedentes de las marismas del Odiel durante 120 días. Los valores son la media ± S.E. (n=7). Las distintas letras indican resultados que son significativamente diferentes (P<0,05). CAPÍTULO 1 117 para los tallos y del 34% y 49% para las raíces en las plantas inoculadas con los consorcios CE y CR, respectivamente (Figura 25B). 8.2. Efectos sobre el aparato fotosintético de A. macrostachyum. Con respecto al impacto de la bioaumentación sobre el aparato fotosintético de A. macrostachyum, los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral revelaron que los valores de la AN fueron mayores en las plantas crecidas en los sedimentos bioaumentados con los consorcios bacterianos, mostrando en ambos casos (tratamiento CE y CR) un incremento del 60% respecto a las plantas no inoculadas después de 120 días de tratamiento (ANOVA de una variable, P<0,01; Figura 26A). La gs y la Ci mostraron tendencias que eran muy similares a la AN, con incrementos de alrededor del 60% y del 30% para la gs y la Ci, respectivamente (ANOVA de una variable, P<0,01; Figura 26B y C). Además, los valores de Fv/Fm y de  PSII a medio día no variaron con los tratamientos de bioaumentación respecto al control después de 120 días del experimento, con valores alrededor de 0,82 y 0,57 para la Fv/Fm y la  PSII, respectivamente (datos no mostrados). 8.3. Efectos sobre las actividades de las enzimas antioxidantes de la planta. En relación al efecto provocado sobre las enzimas antioxidantes presentes en la planta durante este experimento, los estudios mostraron que las actividades de estas enzimas se vieron afectadas significativamente por la inoculación con los consorcios bacterianos, tanto en los tallos como en las raíces (ANOVA de una variable, P<0,01; Figura 27). De esta forma, la actividad APx mejoró de forma significativa en los tallos con la inoculación con ambos consorcios, y las actividades de la GPx y la SOD se CAPÍTULO 1 118 incrementaron solo en las plantas crecidas en sedimentos bioaumentados con el consorcio CE. Por su parte, la actividad de la CAT no varío significativamente con los tratamientos de bioaumentación (Figura 27A-D). Por otro lado, los datos de las actividades de las cuatro enzimas en las raíces fueron significativamente menores en las plantas que habían crecido en presencia del consorcio CE, comparadas con el control y la inoculación con CR (ANOVA de una variable, P<0,01; Figura 27). Figura 26. Efecto de los tratamientos de bioaumentación (control, sin inoculación; CR, inoculación con el consorcio CR y CE, inoculación con el consorcio CE; detalles en Materiales y Métodos) sobre la tasa la AN (A), la gs (B) y la Ci (C) en ramas primarias aleatorias de las plantas de A. macrostachyum crecidas en sedimentos naturales procedentes de las marismas del Odiel durante 120 días. Los valores son la media ± S.E. (n=7). Las diferentes letras indican resultados que son significativamente diferentes (P<0,05). 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